特許 6759506 ラミナリペンタオース生成ベータ−１，３−グルカナーゼで酵母細胞壁を処理する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6759506

(24)【登録日】2020年9月7日

(45)【発行日】2020年9月23日

(54)【発明の名称】ラミナリペンタオース生成ベータ−１，３−グルカナーゼで酵母細胞壁を処理する方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/04 20060101AFI20200910BHJP

   A23K 20/163 20160101ALN20200910BHJP

   A23K 20/147 20160101ALN20200910BHJP

   C08B 37/00 20060101ALN20200910BHJP

   A61K 31/716 20060101ALN20200910BHJP

   A61K 36/064 20060101ALN20200910BHJP

   A61P 37/04 20060101ALN20200910BHJP

   C12N 9/24 20060101ALN20200910BHJP

   C12N 15/56 20060101ALN20200910BHJP

【ＦＩ】

   C12P19/04 AZNA

   !A23K20/163

   !A23K20/147

   !C08B37/00 C

   !A61K31/716

   !A61K36/064

   !A61P37/04

   !C12N9/24

   !C12N15/56

【請求項の数】6

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2016-556002(P2016-556002)

(86)(22)【出願日】2015年3月20日

(65)【公表番号】特表2017-511122(P2017-511122A)

(43)【公表日】2017年4月20日

(86)【国際出願番号】EP2015055986

(87)【国際公開番号】WO2015140318

(87)【国際公開日】20150924

【審査請求日】2018年1月30日

(31)【優先権主張番号】14161040.2

(32)【優先日】2014年3月21日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】503220392

【氏名又は名称】ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ．

【氏名又は名称原語表記】ＤＳＭ ＩＰ ＡＳＳＥＴＳ Ｂ．Ｖ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(72)【発明者】

【氏名】ランクホルスト， ピーター， フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】スペッチェンス， エレン

【審査官】 野村 英雄

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００４−５２５６４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０９−２６２０９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０７−２８４３９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０２−２４３６９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−１６９６０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５１９７１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−２６２７７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 土井健二、外２名，「Arthrobacterグルカナーゼ-Iが酵母グルカンおよびパキマンに作用した際に生じるオリゴ糖の同定」，澱粉科学，１９７２年，Vol.19, No.4，pp.186-191，doi: 10.5458/jag1972.19.186

【文献】 DOI, K. et al.，"CLONING AND EXPRESSION IN ESCHERICHIA COLI OF THE GENE FOR AN ARTHROBACTER BETA-(1->3)-GLUCANASE."，JOURNAL OF BACTERIOLOGY，AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY，１９８６年１２月，Vol.168, No.3，pp.1272-1276，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1128/jb.168.3.1272-1276.1986

【文献】 VRSANSKA, M. et al.，"ENZYMES OF THE YEAST LYTIC SYSTEM PRODUCED BY ARTHROBACTER GJM-1 BACTERIUM AND THEIR ROLE IN THE LYSIS OF YEAST CELL WALLS."，ZEITSCHRIFT FUER ALLGEMEINE MIKROBIOLOGIE，AKADEMIE VERLAG，１９７７年，Vol.17, No.6，pp.465-480

【文献】 VRSANSKA, M. et al.，"LYSIS OF INTACT YEAST CELLS AND ISOLATED CELL WALLS BY AN INDUCIBLE ENZYME SYSTEM OF ARTHROBACTER GJM-1."，ZEITSCHRIFT FUER ALLGEMEINE MIKROBIOLOGIE，AKADEMIE VERLAG，１９７７年，Vol.17, No.5，pp.391-402，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1002/jobm.3630170509

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １／００− ３／００

Ｃ１２Ｎ ９／００− ９／９９

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０８Ｂ ３７／００−３７／１８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

水で抽出する場合には不溶であり、ＤＭＳＯで抽出する場合には部分的に可溶であるβ−１，３−グルカンを含む酵母細胞壁を含む組成物を処理する方法であって、前記組成物とラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼとを接触させること、および前記ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼを不活性化させることを含み、酵母細胞壁を含む組成物であり、前記β−１，３−グルカンのＤＭＳＯへの可溶性が改善されており、水に対するＤＭＳＯに可溶なβ−グルカンの比が２以上であり、前記ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼは、配列番号６で示すアミノ酸配列または配列番号６と９０％以上同一であるアミノ酸配列を有するストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３に由来し、本発明の方法を４〜７のｐＨで行い、本発明の方法を４０℃〜７０℃の温度で行い、前記ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼを、ラミナリペンタオース等のグルコースオリゴマーが生成される前に不活性化させる、組成物を得る方法。

【請求項2】

前記不活性化させることが、前記組成物を、前記ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼを不活性化するのに十分な時間にわたり、７０℃超の温度まで加熱することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

本発明の方法を５〜６のｐＨで行う、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

本発明の方法を５０℃〜６０℃の温度で行う、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記組成物がスターター飼料組成物中の飼料成分として使用される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記組成物が動物の飼料要求率を改善するために使用される、請求項５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

［発明の分野］
本発明は、β−１，３−グルカンを含む酵母細胞壁を含む組成物を処理する方法であって、前記組成物とラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼ（ｌａｍｉｎａｒｉｐｅｎｔａｏｓｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ−β−１，３−ｇｌｕｃａｎａｓｅ）とを接触させることを含む方法に関する。

【0002】

［発明の背景］
β−グルカンは、サイズ、可溶性および分子構造が不均一である多糖のファミリである。β−グルカンはグルコースのポリマーであり、連結は１，３、１，４および１，６であることができる。β−グルカンポリマー中のグルコース鎖は、１つのタイプの連結（例えば１，３）または２つ以上の混合（例えば１，３−１，４もしくは１，３−１，６）を有する直鎖または分枝であることができる。β−グルカンの構造は物理的性質および化学的性質に高度に影響を及ぼす。

【0003】

グルコースで構成されている最も公知の多糖はデンプンおよびセルロースである。デンプンは、アミロース（α−１，４連結を有する直鎖の多糖である）およびアミロペクチン（α−１，４連結とα−１，６連結を有する分枝とを有する多糖である）で構成されている。セルロースは、β−１，４連結のみを有する直鎖のβ−グルカンである。

【0004】

その他の公知の多糖は、不溶性β−１，３グルカンであるパキマンおよびカードランである。パキマンは、ポリア・ココス（Ｐｏｒｉａ ｃｏｃｏｓ）（バシディオマイセテス（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）種）の菌核に由来するβ−１，３−グルカンであり、カードランはアルカリゲネス・フェカリス・バール・ミキソゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ｖａｒ．ｍｙｘｏｇｅｎｅｓ）１０Ｃ３Ｋにより産生される。ラミナリンは褐藻類で発見された貯蔵グルカンであり、１，６連結を有する１，３−グルカンで構成された直鎖の多糖である。１，３対１，６の比は３：１である（Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ−ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｌａｍｉｎａｒｉｎ）。

【0005】

β−グルカンカラスムギおよびオオムギは、β−グルカンの工業用供給に関して２種の主な穀類である。カラスムギβ−グルカンは水溶性であり、その健康への効果に関して広く研究されている。繊維はβ−１，３連結およびβ−１，４連結で作られている。オオムギグルカンは同じ連結を含み、水溶性でもある。

【0006】

酵母β−グルカンの構造は穀類β−グルカンとは異なり、そのため特性が異なる。１，３連結グルコース単位および１，４連結グルコース単位の鎖の代わりに、酵母β−グルカンは、１，３連結モノマーおよび１，６連結モノマーで構成されている。酵母グルカンは酵母細胞壁中で主に見られる。酵母細胞壁は、細胞の総乾燥重量の１５〜３０％を占める。

【0007】

酵母細胞壁の主成分は多糖、タンパク質および少しのキチンである。多糖を、β−グルカンと、マンノースモノマーで構成されているマンナンとに分けることができる。細胞壁の構造は層で構成されている。大まかには、細胞壁を３層に分けることができる（Ｋｌｉｓ，Ｆ．Ｍ．，Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎ Ｙｅａｓｔ，Ｙｅａｓｔ １０，８５１−８６９，１９９４）。第１の層は細胞の表面であり、主にマンノタンパク質で構成されている。第１の層の下には表面と原形質膜との間の内層が存在しており、この内層は２層からなる。原形質膜に最も近い内層は、β−１，３−グルカンで形成された原線維層であり、内層および表面に連結する外層は、より無定形な層であり、ネットワークを形成するためにβ−１，６−グルカン鎖に富んでいる。これらの成分は様々な方法で架橋しており、より高い次元の複合体を形成する。これらの成分それぞれの間には共有結合が存在する。β−１，３−グルカンは螺旋で構成されており、β−グルカンの１本の鎖または３本の鎖のいずれかで形成されている。ネットワーク中には分枝点（β−１，６−連結）がほんのわずかに存在する。この螺旋により、低水溶性のグルカンの可溶性は更に低下する。繊維の不溶性に寄与する少量のキチンも存在している。

【0008】

天然に存在する様々な多糖を分解するために、多種多様な酵素が同定されている。これらのいわゆるグリコシダーゼまたはグリコシドヒドロラーゼ（ＥＣ ３．２．１．ｘ）は、オリゴ中のおよび多糖中のグリコシド結合の加水分解を触媒する酵素の大きなグループを形成する。ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ上で、現在は１３１種のグリコシドヒドロラーゼファミリに分類される全ての糖質関連酵素（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ）の継続的に更新されているデータベースを見出すことができる。Ｃａｎｔａｒｅｌ ＢＬ，Ｃｏｕｔｉｎｈｏ ＰＭ，Ｒａｎｃｕｒｅｌ Ｃ，Ｂｅｒｎａｒｄ Ｔ，Ｌｏｍｂａｒｄ Ｖ，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ Ｂ（２００９）Ｔｈｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ ＥｎＺｙｍｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＡＺｙ）：ａｎ ｅｘｐｅｒｔ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ Ｇｌｙｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３７：Ｄ２３３−２３８［ＰＭＩＤ：１８８３８３９１］を参照されたい。

【0009】

酵母細胞および酵母細胞壁の酵素的分解が既に長期にわたり調べられている。細菌、抗酸菌、放線菌およびカビにより溶菌酵素が産生される。酵母細胞を溶解させるためにまたは形質転換させるために、およびプロトプラストを生成するために、いくつかの商業的に入手可能な酵素製品（混在した酵素活性を含むことが多い）が酵母遺伝子実験（ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）に広く使用されている。Ａｍｓｂｉｏの酵素製品Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ（登録商標）（アルスロバクター・ルテウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｔｅｕｓ）の培養液から精製されている）は、必須の活性としてβ−１，３−グルカン−ラミナリペンタオヒドロラーゼを含む。ＮｏｖｏｚｙｍｅｓのＧｌｕｃａｎｅｘ（登録商標）は、酵母プロトプラストを製造するために使用される別の製品であり、ＳｉｇｍａのＬｙｔｉｃａｓｅも同様である。３種の製品全てが、プロテアーゼ活性およびマンナナーゼ活性等のグルカナーゼに加えて、その他の活性を含む。より詳細には、これらの製品は、グルカンの内部加水分解だけでなく、グルカンがオリゴ糖およびグルコースへと完全に分解される外部加水分解も実施する。

【0010】

ラミナリペンタオース生成グルカナーゼ（ＬＰＨａｓｅ）は、ラミナリン、パキマンまたはカードラン等の多糖から主生成物としてラミナリペンタオースを遊離させるβ−１，３−グルカナーゼである。Ｖｒｓａｎｓｋａら（１９７７，Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ ｆｕｅｒ Ａｌｌｇｅｍｅｉｎｅ Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ，１７（６），４６５−４８０）は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＧＪＭ−１由来のラミナリペンタオース生成グルカナーゼ（グルカナーゼＩ）が酵母溶解系の酵素の１種であることを示している。単離された酵母細胞とグルカナーゼＩとのインキュベーションにより、酵母細胞壁が完全に可溶化されてラミナリペンタオースのみが形成される。

【0011】

日本国特許第６１９２５８９号明細書（１９８６−ＤＩＣ株式会社）では、ストレプトマイセス・マテンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍａｔｅｎｓｉｓ）ＤＩＣ−１０８のラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼ（ＬＰＨａｓｅ）が開示されている。この酵素は、多糖であるカードラン、パキマンおよび／またはラミナリンからラミナリペンタオースを生成するプロセスで使用される。日本国特許第８１７３１５３号明細書では、ストレプトマイセス・マテンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍａｔｅｎｓｉｓ）ＤＩＣ−１０８のグルカナーゼの生成が開示されている。日本国特許第９２６２０９０号明細書およびＮａｋａｂａｙａｓｈｉら（１９９８−Ｊ．Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｅｎｇ．８５（５），４５９−４６４）は、ストレプトマイセス・マテンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍａｔｅｎｓｉｓ）ＤＩＣ−１０８のグルカナーゼをコードする遺伝子のクローニングおよび配列決定を開示している。著者らは、この遺伝子からアミノ酸配列も導き出した。ストレプトマイセス・マテンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍａｔｅｎｓｉｓ）ＤＩＣ−１０８のＬＰＨａｓｅは独特な酵素であると思われる。なぜならば、この酵素は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）種ＹＣＷＤ３由来のおよびエルスコビア・キサンチンオリチカ（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ ｘａｎｔｈｉｎｅｏｌｙｔｉｃａ）由来の２種のその他のβ−１，３−グルカナーゼ（それぞれタンパク質レベルで互いに９９％同一であった）とわずかに少しのアミノ酸配列類似性（約６０％）を示すからである（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６６（２）ｐｐ．１０５８−１０６３およびこの文献で引用されている参考文献）。ＬＰＨａｓｅの結晶構造が１．６２Åの分解能で解明されており、ＬＰＨａｓｅがグリコシドヒドロラーゼファミリ６４に属することが判明した（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（３９），．２６７０８−２６７１５“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ Ａｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ａ ＧＨ−６４ Ｅｎｚｙｍｅ，Ｌａｍｉｎａｒｉｐｅｎｔａｏｓｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇβ−１，３−Ｇｌｕｃａｎａｓｅ”）。近年の研究では、Ｓｈｒｅｓｔａらが、この酵素において触媒作用に必須のアミノ酸を決定した（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌ．２４ ｎｏ．８ ｐｐ．６１７−６２５，２０１１−Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ６４ ｌａｍｉｎａｒｉｐｅｎｔａｏｓｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ−β−１，３−ｇｌｕｃａｎａｓｅ）。

【0012】

（食物繊維の一部としての）インタクトなβ−グルカンは、哺乳動物の免疫系の刺激等の興味深い健康特性を有しており、β−グルカンは、経口投与された場合には哺乳動物の酵素により消化されず、小腸で吸収され、先天免疫および適応免疫の両方を活性化して粘膜免疫および全身免疫を刺激する。β−グルカンの報告された最初の重要な機能は抗腫瘍活性であった。その後に報告された生物活性として、抗真菌活性、抗感染活性、放射線防護活性、コレステロール低下活性および食後グルコース代謝活性が挙げられる。

【0013】

水溶性のおよび粒状のβ−グルカンの生物活性の効力は議論の余地があるが、粒状のβ−グルカンは水溶性βグルカンと比べて強い免疫刺激活性を有することが近年報告されている。更に、グルコースおよびオリゴ糖を生じる酵素混合物またはラミナリペンタオースを生じるラミナリペンタオース生成グルカナーゼのどちからによる酵母細胞壁のグルカンの完全な分解は、健康特性の喪失という欠点を有する。

【0014】

本発明者らは、酵母細胞壁マトリクス中に存在したままのインタクトなβ−グルカンは、消化管中で消化された場合に哺乳動物に対して限定的な生物学的利用能を有するのみであることを発見した。従って、一方では酵母細胞壁中のβ−グルカンの生物学的利用能を高め、他方では免疫系の刺激等の健康特性を可能な限り保持することが長年にわたり切望されている。本発明は、酵母細胞壁中のβ−グルカンがラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼにより部分的にのみ分解され、そのため、一方ではβ−グルカンの生物学的利用能が高められ、他方では免疫系の刺激等の健康特性が保持される方法を提供する。

【0015】

［本発明の詳細な説明］
第１の態様では、本発明は、水で抽出する場合には不溶であり、ＤＭＳＯで抽出する場合には部分的に可溶であるβ−１，３−グルカンを含む（またはβ−グルカンを含む）酵母細胞壁を含む組成物を処理する方法であって、前記組成物とラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼとを接触させること、およびラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼを不活性化させることを含み、酵母細胞壁を含む組成物であり、β−１，３−グルカン（またはβ−グルカン）のＤＭＳＯへの可溶性が改善されており、水に対するＤＭＳＯに可溶な総β−グルカンの比が２以上である、組成物を得る方法を提供する。

【0016】

本発明の方法の利点は、酵母細胞壁中に存在するβ−グルカンのＤＭＳＯへの可溶性を改善することにより生物学的利用能が改善され、その結果、本発明の方法に従って処理された酵母細胞壁を動物に給餌すると動物の健康状態が改善されることである。従って、驚くべきことに、水に対するＤＭＳＯに可溶なβ−グルカンの比と組み合わせたＤＭＳＯへの可溶性の程度は、酵母細胞壁中に存在するβ−グルカンの生物学的利用能の予測に役立つことが本発明者らにより示されている。

【0017】

ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼは、本明細書において、ラミナリン、パキマンまたはカードラン等の多糖から、および酵母細胞壁中に存在するグルカンから、主生成物としてラミナリペンタオースを遊離させるグルカナーゼと定義される。例としてＮａｋａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）を参照されたい。ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼは、ラミナリナーゼ等のその他のβ−１，３−グルカナーゼとは異なる。なぜならば、このその他のβ−１，３−グルカナーゼは、生成物として様々なオリゴ糖を生成するからである。

【0018】

ＤＭＳＯで抽出する場合に部分的に可溶であるとは、本文脈で使用される場合、酵母細胞壁中に存在する総β−グルカンの＜１５％がＤＭＳＯに可溶であると定義される。

【0019】

ＤＭＳＯへの可溶性の改善とは、本文脈で使用される場合、酵母細胞壁中に存在する総β−グルカンの１５％超がＤＭＳＯに可溶であると定義される。

【0020】

β−グルカンは、本文脈で使用される場合、β−グリコシド結合により連結されたＤ−グルコースモノマーの多糖と定義され、少なくとも１０個のＤ−グルコースモノマーを含む。

【0021】

前記組成物とラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼとを接触させることとは、本文脈で使用される場合、好ましくは、前記組成物とラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼとを、酵母細胞壁を含む組成物であって、β−１，３−グルカン（またはβ−グルカン）のＤＭＳＯへの可溶性が改善されており、水に対するＤＭＳＯに可溶な総β−グルカンの比が２以上である、組成物を得るのに十分な期間にわたり接触させることまたはインキュベートすることである。

【0022】

好ましい実施形態では、本発明は、水で抽出する場合には不溶であり、ＤＭＳＯで抽出する場合には部分的に可溶である（酵母細胞壁中に存在するβ−グルカンの＜１５％が可溶である）β−１，３−グルカンを含む酵母細胞壁を含む組成物を処理する方法であって、前記組成物とラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼとを接触させて、酵母細胞壁を含む組成物であり、β−１，３−グルカンのＤＭＳＯへの可溶性が改善されており（酵母細胞壁中に存在するβ−グルカンの１５％超がＤＭＳＯに可溶であり）、水に対するＤＭＳＯに可溶なグルカンの比が２以上である、組成物を得ることを含む方法に関する。好ましくは、この方法の後に、ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼを不活性させてラミナリペンタオースの形成を回避することが続く。

【0023】

好ましくは、本方法は、前記組成物とラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼとを接触させること、およびラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼを不活性化させることを含み、酵母細胞壁を含む組成物であって、β−１，３−グルカンのＤＭＳＯへの可溶性が改善されており（酵母細胞壁中に存在するβ−グルカンの１５％超がＤＭＳＯに可溶であり）、水に対するＤＭＳＯに可溶なβ−グルカンの比が２以上であり、ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼにより生成されるラミナリペンタオースの量が、この組成物中に存在する総グルコース単位の３０％未満であり、より好ましくは２０％未満であり、最も好ましくは１０％（ｗ／ｗ）未満または７．５％（ｗ／ｗ）未満である、組成物を得る。

【0024】

本方法では、β−グルカンの加水分解の程度は、β−グルカンのＤＭＳＯへの可溶性が改善されているが、β−グルカンがラミナリペンタオース等の糖にまで分解されていないまたは実質的に分解されていない程度である。好ましくは、本方法では、本ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼを、ラミナリペンタオース等のグルコースオリゴマーが生成される前に不活性化させる。本発明者らは、β−グルカンの部分的加水分解により、免疫系の刺激等の有益な健康特性が増大することを発見した。

【0025】

好ましい実施形態では、ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼを不活性化させる本工程は、ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼを不活性化させるのに十分な時間にわたり、得られた本組成物を７０℃超の温度まで加熱することを含む。より好ましくは、ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼを不活性化させるのに十分な時間にわたり、得られた組成物を８０℃超の温度まで加熱し、より好ましくは８５％超の温度まで加熱し、更により好ましくは９０℃超または９５℃超の温度まで加熱し、最も好ましくは１００℃超の温度まで加熱する。

【0026】

好ましい実施形態では、本ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列またはこれらの配列と６０％以上同一のアミノ酸配列を含んでいる。

【0027】

好ましくは、本発明の方法により、酵母細胞壁を含む組成物であって、この酵母細胞壁中に存在するβ−グルカンの２０％超または２５％超がＤＭＳＯに可溶であり、この酵母細胞壁中に存在するβ−グルカンのより好ましくは３０％超がＤＭＳＯに可溶であり、より好ましくは３５％超がＤＭＳＯに可溶であり、より好ましくは４０％超がＤＭＳＯに可溶であり、最も好ましくは４５％超がＤＭＳＯに可溶である、組成物が得られる。

【0028】

同時に、水に対するＤＭＳＯに可溶なβ−グルカンの比は２以上であり、好ましくは３以上であり、４以上であり、５以上であり、１０以上であり、５０以上であり、１００以上であり、５００以上であり、１，０００以上であり、５，０００以上であり、１０，０００以上である。

【0029】

水に対するＤＭＳＯに可溶なβ−グルカンの比の代わりに、本発明を定義するために逆比を使用することもできる。ＤＭＳＯに対する水に可溶なβ−グルカンの比は０．５以下であり、好ましくは１／３以下であり、０．２５以下であり、０．２以下であり、０．１以下であり、０．０２以下であり、０．０１以下であり、０．００１以下であり、０．０００５以下である。ＤＭＳＯに対する水に可溶なβ−グルカンの最も好ましい比は０付近である、または０である。

【0030】

好ましい実施形態では、ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１と６０％以上同一であり、好ましくは６５％以上同一であり、好ましくは７０％以上同一であり、好ましくは７５％以上同一であり、好ましくは８５％以上同一であり、好ましくは９０％以上同一であり、好ましくは９５％以上同一であるアミノ酸配列を含む。

【0031】

別の好ましい実施形態では、ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼは、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と６０％以上同一であり、好ましくは６５％以上同一であり、好ましくは７０％以上同一であり、好ましくは７５％以上同一であり、好ましくは８５％以上同一であり、好ましくは９０％以上同一であり、好ましくは９５％以上同一であるアミノ酸配列を含む。

【0032】

別の好ましい実施形態では、ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼは、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３と６０％以上同一であり、好ましくは６５％以上同一であり、好ましくは７０％以上同一であり、好ましくは７５％以上同一であり、好ましくは８５％以上同一であり、好ましくは９０％以上同一であり、好ましくは９５％以上同一であるアミノ酸配列を含む。

【0033】

別の好ましい実施形態では、ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼは、配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４と６０％以上同一であり、好ましくは６５％以上同一であり、好ましくは７０％以上同一であり、好ましくは７５％以上同一であり、好ましくは８５％以上同一であり、好ましくは９０％以上同一であり、好ましくは９５％以上同一であるアミノ酸配列を含む。

【0034】

別の好ましい実施形態では、ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼは、配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号５と６０％以上同一であり、好ましくは６５％以上同一であり、好ましくは７０％以上同一であり、好ましくは７５％以上同一であり、好ましくは８５％以上同一であり、好ましくは９０％以上同一であり、好ましくは９５％以上同一であるアミノ酸配列を含む。

【0035】

別の好ましい実施形態では、ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５からなる群のアミノ酸配列の内の２種以上またはこれらの配列と６０％以上同一のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態は、下記のアミノ酸配列の組み合わせを含むβ−１，３−グルカナーゼである：配列番号１＋２、配列番号１＋３、配列番号１＋４、配列番号１＋５、配列番号２＋３、配列番号２＋４、配列番号２＋５、配列番号３＋４、配列番号３＋５、配列番号４＋５、配列番号１＋２＋３、配列番号１＋２＋４、配列番号１＋２＋５、配列番号１＋３＋４、配列番号１＋３＋５、配列番号２＋３＋４、配列番号２＋３＋５、配列番号３＋４＋５、配列番号１＋２＋３＋４、配列番号２＋３＋４＋５、配列番号１＋２＋３＋４＋５。

【0036】

別の好ましい実施形態は、配列番号６もしくは図２に示すアミノ酸配列または配列番号６もしくは図２と６０％以上同一であり、好ましくは６５％以上同一であり、好ましくは７０％以上同一であり、好ましくは７５％以上同一であり、好ましくは８５％以上同一であり、好ましくは９０％以上同一であり、好ましくは９５％以上同一であるアミノ酸配列を有する、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３由来のラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼである。

【0037】

更に好ましい実施形態は、配列番号７もしくは図３に示すアミノ酸配列または配列番号７もしくは図３と６０％以上同一であり、好ましくは６５％以上同一であり、好ましくは７０％以上同一であり、好ましくは７５％以上同一であり、好ましくは８５％以上同一であり、好ましくは９０％以上同一であり、好ましくは９５％以上同一であるアミノ酸配列を有する、ストレプトマイセス・マテンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍａｔｅｎｓｉｓ）ＤＩＣ−１０８由来のラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼである。

【0038】

整列させた２つの配列の間の同一性は、アラインメント中のギャップの総数の減算後に、アラインメントの全長で除算した、両方の配列中で同一のアミノ酸を示すアラインメント中の対応する位置の数として定義される。本明細書で定義される同一性を、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用することによりコンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥから得ることができ、この同一性は、プログラムのアウトプット中において「最長同一性」と呼ばれる。本発明の目的のために、２つの配列（アミノ酸またはヌクレオチド）の間の同一性（相同性）のレベルを、ＮＥＥＤＬＥ（ＥＭＢＯＳＳパッケージ（バージョン２．８．０以上）からのＮＥＥＤＬＥプログラム、ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ．ｌ．ａｎｄ ＢｌｅａｓｂｙＡ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，（６）ｐｐ２７６−２７７、ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）を使用して実行され得る「最長同一性」の定義に従って算出する。

【0039】

好ましくは、本発明の方法を、本明細書で先に定義されたラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼが本発明の方法を触媒することができるおよび上記で定義されたグルカンを処理することができるｐＨおよび温度で実行する。このｐＨは好ましくは２以上であり、より好ましくは３以上であり、より好ましくは４以上であり、最も好ましくは５以上であり、同時に、このｐＨは好ましくは９以下であり、好ましくは８以下であり、好ましくは７であり、最も好ましくは６以下である。好ましいｐＨの範囲は２〜９であり、より好ましくは３〜８であり、より好ましくは４〜７であり、最も好ましくは５〜６である。

【0040】

本組成物とラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼとの接触中の温度は、好ましくは２０℃以上であり、より好ましくは３０℃以上であり、より好ましくは４０℃以上であり、最も好ましくは５０℃以上であり、同時に、温度は好ましくは９０℃以下であり、より好ましくは８０℃以下であり、より好ましくは７０℃以下であり、最も好ましくは６０℃以下である。好ましい温度の範囲は２０℃〜９０℃であり、より好ましくは３０℃〜８０℃であり、より好ましくは４０℃〜７０℃であり、最も好ましくは５０℃〜６０℃である。

【0041】

酵素触媒反応に最適なｐＨおよび温度、従って本発明の方法にも最適なｐＨおよび温度は、使用されるラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼの種類によって決まることが当分野で一般的に知られている。反応時間は当業者により容易に決定され得、酵素細胞壁調製物、使用されるラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼの種類および投与量、ｐＨおよび温度、ならびにＤＭＳＯへの所望の可溶化を得るためのβ−１，３−グルカンの所望の処理によって決まるだろう。当業者は、酵母細胞調製物に関して、酵母細胞壁中のグルカンのＤＭＳＯへの可溶性が最大化されるが、ｐＨ６〜７の水への酵母細胞壁中のグルカンの水溶性が最小化されるようなプロセス条件を、過度な負担なしに確実に決定することができる。

【0042】

第２の態様では、本発明は、水で抽出する場合には不溶であり、ＤＭＳＯで抽出する場合には部分的に可溶である（酵母細胞壁中に存在するグルカンの＜１５％が可溶である）β−１，３−グルカンを含む酵母細胞壁を含む組成物を処理する方法であって、１〜５の範囲のｐＨで前記組成物をインキュベートして、酵母細胞壁を含む組成物であり、β−１，３−グルカンのＤＭＳＯへの可溶性が改善されており（酵母細胞壁中に存在するグルカンの１５％超がＤＭＳＯに可溶であり）、水に対するＤＭＳＯに可溶なグルカンの比が２以上である、組成物を得ることを含む方法を提供する。好ましくは、本発明の第２の態様の方法を１〜４の範囲のｐＨで行い、より好ましくは１〜３の範囲のｐＨで行い、最も好ましくは２〜３の範囲のｐＨで行う。

【0043】

温度は好ましくは４０℃以上であり、より好ましくは５０℃以上であり、より好ましくは６０℃以上であり、より好ましくは７０℃であり、最も好ましくは８０℃以上であり、同時に、温度は好ましくは１２５℃以下であり、より好ましくは１２０℃以下であり、より好ましくは１１５℃以下であり、より好ましくは１１０℃以下であり、より好ましくは１０５℃であり、最も好ましくは１００℃以下である。好ましい温度範囲は４０〜１２５℃であり、より好ましくは５０〜１２０℃であり、より好ましくは６０〜１１５℃であり、より好ましくは７０〜１１０℃であり、最も好ましくは８０〜１００℃である。

【0044】

反応時間は当業者により容易に決定され得、酵素細胞壁調製物、ｐＨおよび温度、ならびにＤＭＳＯへの所望の可溶化を得るためのβ−１，３−グルカンの所望の処理によって決まるだろう。当業者は、酵母細胞調製物に関して、酵母細胞壁中のグルカンのＤＭＳＯへの可溶性が最大化されるが、水への酵母細胞壁中のグルカンの水溶性が最小化されるようなプロセス条件を、過度な負担なしに確実に決定することができる。

【0045】

好ましい実施形態では、１〜５のｐＨでのまたは好ましくは１〜３もしくは２〜３のｐＨでのインキュベーション中の温度を、水に対するＤＭＳＯに可溶なβ−グルカンの比が２以上であることが達成された際に、５０℃未満の温度まで、好ましくは４０℃未満の温度まで、より好ましくは３０℃未満の温度まで、更により好ましくは２５℃未満または２０℃未満の温度まで、最も好ましくは１０℃未満の温度まで低下させる。この酸性インキュベーションを適宜に停止させる利点は、β−グルカンがその生物学的に有益な特性を保持することであり、なぜならば、β−グルカンが完全に加水分解されないからである。

【0046】

本発明の第１の態様および第２の態様の方法で使用される酵母細胞壁を含む組成物は、あらゆる起源であることができる。酵母細胞壁は様々な供給業者から商業的に入手可能であり、特にサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から商業的に入手可能である。酵母細胞壁は、工業規模で生成される市販の酵母抽出物の側流であってもよい。酵母細胞壁が由来する酵母は、あらゆる適切な酵母であることができる。適切な酵母は、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属からの酵母等の全ての食品グレードの酵母（Ｂｅｋａｔｏｒｏｕ ｅｔ ａｌ ２００６，Ｆｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４（３），４０７−４１５を参照されたい）である。酵母抽出物の生成にはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）が使用されることが多く、特にサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が使用されることが多い。

【0047】

第３の態様では、本発明は、β−グルカンの１５％超がＤＭＳＯに可溶であり、水への可溶に対するＤＭＳＯに可溶なβ−グルカンの比が２以上であることを特徴とする、β−１，３−グルカンを含む酵母細胞壁を含む組成物を提供する。好ましくは、この組成物を本発明の第１の態様または第２の態様の方法により得ることができる。好ましくは、本発明は、β−１，３−グルカンを含む酵母細胞壁を含む組成物であって、酵母細胞壁中に存在するβ−グルカンの２５％超がＤＭＳＯに可溶であり、酵母細胞壁中に存在するβ−グルカンのより好ましくは３０％超がＤＭＳＯに可溶であり、より好ましくは３５％超がＤＭＳＯに可溶であり、より好ましくは４０％超がＤＭＳＯに可溶であり、最も好ましくは４５％超がＤＭＳＯに可溶である、組成物を提供する。同時に、水に対するＤＭＳＯに可溶なβ−グルカンの比は２以上であり、好ましくは３以上であり、４以上であり、５以上であり、１０以上であり、５０以上であり、１００以上であり、５００以上であり、１，０００以上であり、５，０００以上であり、１０，０００以上である。水に対するＤＭＳＯに可溶なβ−グルカンの比の代わりに、本発明を定義するために逆比を使用することもできる。ＤＭＳＯに対する水に可溶なβグルカンの比は０．５以下であり、好ましくは１／３以下であり、０．２５以下であり、０．２以下であり、０．１以下であり、０．０２以下であり、０．０１以下であり、０．００１以下であり、０．０００５以下である。ＤＭＳＯに対する水に可溶なグルカンの最も好ましい比は０付近である、または０である。

【0048】

好ましくは、本組成物は、この組成物中に存在する総グルコース単位の３０％（ｗ／ｗ）未満のラミナリペンタオースを含み、より好ましくは２０％（ｗ／ｗ）未満のラミナリペンタオースを含み、最も好ましくは１０％（ｗ／ｗ）未満または７．５％（ｗ／ｗ）未満のラミナリペンタオースを含む。より好ましくは、本組成物はラミナリペンタオースを含まない、または、実質的な量のラミナリペンタオースを含まない。ラミナリペンタオースが存在しない場合に有利である。なぜならば、部分的に分解されたβ−グルカンの量がより高くなり、そのため、生物学的に有益な効果が増大するからである。

【0049】

更に、本発明は、本組成物を含むスターター飼料（ｓｔａｒｔｅｒ ｆｅｅｄ）であって、１０〜３０％（ｗ／ｗ）のタンパク質を更に含むスターター飼料に関する。スターター飼料は有益であり、なぜならば、ヒヨコのような成長中の動物に適切な栄養素を供給するからである。通常、スターター飼料を０〜１０週齢の動物に給餌する。好ましくは、そのようなスターター飼料は、ＤＭＳＯに可溶なβ−グルカンを含む本発明の組成物、１０〜２０％（ｗ／ｗ）のタンパク質、３０〜４０％（ｗ／ｗ）のデンプン、カルシウムおよび／またはリン光体を含む。スターター飼料中の本発明の組成物中に存在するβ−グルカンの量は、好ましくはスターター飼料１ｋｇ当たり１〜５００ｍｇの範囲内であり、より好ましくはスターター飼料１ｋｇ当たり１〜２００ｍｇの範囲内であり、最も好ましくはスターター飼料１ｋｇ当たり１〜５０ｍｇの範囲内である。本発明者らは、本発明のスターター飼料を使用することにより、飼料要求率（ｆｅｅｄ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｒａｔｉｏ）が改善されることおよび死亡率が低下することを発見した。

【0050】

本β−グルカンの有益な生物学的健康特性を前提として、第４の態様によれば、本発明は、本発明の第２の態様の本組成物または本スターター飼料の使用に関し、好ましくは、飼料または飼料成分としての本発明の第１の態様または第３の態様の方法により得られる本組成物または本スターター飼料の使用に関する。

【0051】

好ましい実施形態では、本発明は、動物の飼料要求率を改善するための、好ましくは家畜の飼料要求率を改善するための、より好ましくはブタまたはブロイラー鶏（ｂｒｏｉｌｅｒ ｃｈｉｃｋｅｎ）等のニワトリの飼料要求率を改善するための、本組成物の使用または本スターター飼料の使用に関する。本発明者らは、ＤＭＳＯへの可溶性が増加しているグルカンは、飼料要求率を下げてブロイラー鶏の成長に有益な効果をもたらすことを発見した。更に、本発明者らは、ＤＭＳＯへの可溶性が増加しているグルカンを含む本組成物を給餌することにより、ブロイラー鶏の死亡率が低下することを発見した。従って、好ましい実施形態では、本発明は、ブロイラー鶏の死亡率を低下させるための、より好ましくは生後最初の３５日間の成長の間のブロイラー鶏の死亡率を低下させるための、本組成物の使用に関する。

【0052】

別の態様によれば、本発明は、薬剤として使用するための、β−１，３−グルカンを含む酵母細胞壁を含む本組成物であって、β−１，３−グルカンの１５％超がＤＭＳＯに可溶であり、水への可溶に対するＤＭＳＯに可溶なβ−１，３−グルカンの比が２以上であることを特徴とする本組成物に関する。

【0053】

好ましい実施形態では、本発明は、動物の成長を刺激するためのおよび／または動物の免疫系を刺激するための、β−１，３−グルカンを含む酵母細胞壁を含む本組成物であって、β−１，３−グルカンの１５％超がＤＭＳＯに可溶であり、水への可溶に対するＤＭＳＯに可溶なβ−１，３−グルカンの比が２以上であることを特徴とする本組成物に関する。好ましい動物は、ブタまたはブロイラー鶏等のニワトリである。好ましくは、本発明は、ブタにおけるＩＬ−６およびＩＬ−１０の分泌を増加させるためのまたは誘発するための本組成物に関する。好ましくは、本発明は、ＩｇＭおよびＩｇＧの分泌を増加させるためのまたは誘発するための本組成物に関し、好ましくは、ニワトリにおけるＩｇＭおよび／またはＩｇＧの分泌を増加させるためのまたは誘発するための本組成物に関する。

【0054】

更に好ましい実施形態では、本発明は、動物の成長を刺激するためのおよび／または動物の免疫系を刺激するための本組成物であって、生後最長で１５週または生後最長で１０週の期間にわたり、より好ましくは生後最長で５週の期間にわたり、より好ましくは生後最長で３週または生後最長で２週の期間にわたり動物に給餌される本組成物に関する。

【0055】

より好ましくは、動物の成長を刺激するためのおよび／または動物の免疫系を刺激するための本組成物は、スターター飼料１ｋｇ当たりβ−グルカン１〜５００ｍｇの量で、より好ましくはスターター飼料１ｋｇ当たりβ−グルカン１〜２００ｍｇの量で、最も好ましくはスターター飼料１ｋｇ当たりβ−グルカン１〜５０ｍｇの量でスターター飼料に添加される。

【図面の簡単な説明】

【0056】

【図1】図１Ａは上方のパネルであり、Ｄ_２ＯでのＮＭＲスペクトルを示す。ｔ＝末端単位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｕｎｉｔ）、１，３＝β−１，３−グルカン、１，６＝β−１，６−グルカン。更なる説明に関しては、水に可溶なグルカンでの材料および方法を参照されたい。図１Ｂは下方のパネルであり、ＤＭＳＯでのＮＭＲスペクトルを示す。ｔ＝末端単位、１，３＝β−１，３−グルカン、１，６＝β−１，６−グルカン、ｂ＝分枝単位。更なる説明に関して、ＤＭＳＯに可溶なグルカンでの材料および方法を参照されたい。

【図2】図２は、配列番号６、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３由来のラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼを示す。

【図3】図３は、配列番号７、ストレプトマイセス・マテンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍａｔｅｎｓｉｓ）ＤＩＣ−１０８由来のラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼを示す。

【図4】図４は、実施例２の未処理酵素細胞壁由来のβ−グルカン２０μｇ／ｍｌまたは２００μｇ／ｍｌによる刺激後のＩＬ６の生成（未処理）、実施例２、インキュベーション２のｐＨ３で酸処理した酵母細胞壁由来のβ−グルカン２０μｇ／ｍｌまたは２００μｇ／ｍｌによる刺激後のＩＬ６の生成（酸）、および陰性コントロール２０μｇ／ｍｌまたは２００μｇ／ｍｌよる刺激後のＩＬ６の生成（ｎｅｇコントロール）を示すグラフである。２０μｇ／ｍｌ（ブタ１）で酸処理した酵母細胞壁で得た最大応答に基づいて、応答を相対的に算出する。

【図5】図５は、実施例２の未処理酵素細胞壁由来のβ−グルカン２０μｇ／ｍｌまたは２００μｇ／ｍｌによる刺激後のＩＬ１０の生成（未処理）、実施例２、インキュベーション２のｐＨ３で酸処理した酵母細胞壁由来のβ−グルカン２０μｇ／ｍｌまたは２００μｇ／ｍｌによる刺激後のＩＬ１０の生成（酸）、および陰性コントロール２０μｇ／ｍｌまたは２００μｇ／ｍｌによる刺激後のＩＬ１０の生成（ｎｅｇコントロール）を示すグラフである。２０μｇ／ｍｌ（ブタ１）で酸処理した酵母細胞壁で得た最大応答に基づいて、応答を相対的に算出する。

【図6】図６は、４種の異なる投与量の陰性コントロール（ｎｅｇコントロール）、酸処理した細胞壁（酸）、酵素処理した細胞壁（酵素）および小麦酵母（ｗｈｅａｔ ｙｅａｓｔ）濃縮物（ＷＹＣ）に関して、酸処理した酵母細胞壁を２００μｇ／ｍｌの投与量で添加した後に測定した最大値に対するブタ（ブタ１）から単離した好中球の相対的ＲＯＳ生成を相対的に示す。

【図7】図７は、４種の異なる投与量の陰性コントロール（ｎｅｇコントロール）、酸処理した細胞壁（酸）、酵素処理した細胞壁（酵素）および小麦酵母濃縮物（ＷＹＣ）に関して、酸処理した酵母細胞壁を２００μｇ／ｍｌの投与量で添加した後に測定した最大値に対するブタ（ブタ２）から単離した好中球の相対的ＲＯＳ生成を相対的に示す。

【図8】図８は、４種の異なる投与量の陰性コントロール（ｎｅｇコントロール）、酸処理した細胞壁（酸）、酵素処理した細胞壁（酵素）および小麦酵母濃縮物（ＷＹＣ）に関して、酸処理した酵母細胞壁を１２．５μｇ／ｍｌの投与量で添加した後に測定した最大値に対するブタ（ブタ１）から単離した好中球の相対的ＲＯＳ生成を相対的に表す。

【図9】図９は、４種の異なる投与量の陰性コントロール（ｎｅｇコントロール）、酸処理した細胞壁（酸）、酵素処理した細胞壁（酵素）および小麦酵母濃縮物（ＷＹＣ）に関して、酸処理した酵母細胞壁を２００μｇ／ｍｌの投与量で添加した後に測定した最大値に対するブタ（ブタ２）から単離した好中球の相対的ＲＯＳ生成を相対的に表す。

【0057】

［材料および方法］
［デナザイム（Ｄｅｎａｚｙｍｅ）Ｇｅｌ−Ｌ１］
デナザイムＧｅｌ−Ｌ１ロットＮｏ．Ｔ２をナガセケムテックス株式会社（日本、京都）から得た。メーカーの技術データシートによれば、デナザイムＧｅｌ−Ｌ１は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の深部発酵により産生された精製済液状グルカナーゼ調製物である。下記に記載のラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼの酵素アッセイによれば、デナザイムＧｅｌ−Ｌ１ロットＮｏ．Ｔ２の活性は約１３００ユニット／ｍｌである。

【0058】

［ラミナリナーゼ］
ラミナリナーゼをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（Ｌ９２５９）。この粉末を溶解させて約１３００ユニット／ｍｌの溶液にした。

【0059】

［ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼ活性に関する酵素アッセイ］
カードラン溶液−カードランを１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５に溶解させ、磁気撹拌子を使用して連続的に撹拌しつつ、室温（約２０℃）で１時間にわたりインキュベートし、続いて６０℃で１５分にわたりインキュベートして、０．５％ｗｔ／ｖｏｌのカードラン（Ｓｉｇｍａ Ｃ７８２１、ロット０４２Ｍ４０４０Ｖ）の溶液１００ｍｌを作った。この懸濁液を更に均質化するために、ＩＫＡ Ｔ−２５ ｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘ ｔｙｐｅ Ｓ２５−２５Ｆ（歯固定子（ｔｅｅｔｈ ｓｔａｔｏｒ）１２、ローター８）により９５００ｒｐｍで６０秒にわたり懸濁液を処理した。

【0060】

Ｈｏｆｆｍａｎ試薬−１ｌ容量フラスコ中の約９００ｍｌの水にヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム（分析試薬）１．１７ｇを溶解させ、続いて無水炭酸ナトリウム（分析試薬）１９．５ｇを溶解させる。水で体積を調整して混合する。調製したばかりの溶液を常に使用する。

【0061】

酵素アッセイ−カードラン溶液２ｍｌを、（１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５で）希釈した酵素溶液１ｍｌを添加した後に水浴中にて３７℃で加熱した。この混合物を、１Ｍ ＮａＯＨ ２ｍｌを添加し、続いてＨｏｆｆｍａｎ試薬４ｍｌを添加して反応を停止させた後に３０分にわたりインキュベートした。この混合物を、沸騰している水浴中で１５分にわたりインキュベートした。室温まで冷却した後、不溶なカードランを遠心分離で除去し、上清の光学密度を４２０ｎｍで測定した。対応する試料の吸収を補正するためにブランク試料を使用する。試料に関して上記に記載したのと同じ方法でブランク試料を測定するが、但し、最初に停止試薬を添加し、次いで試料を添加する。酵素試料に関して上記に記載したのと同じ方法でアッセイ混合物中における還元糖の濃度を測定するために、０．３〜１．４ｍＭグルコースの希釈による較正曲線を作成した。較正線用のブランクとして、希釈したグルコース溶液の代わりに水を使用した。

【0062】

アッセイ混合物に添加する酵素溶液は、酵素アッセイの線形範囲内であるために約０．２５〜約０．５ユニット／ｍｌでなければならない。

【0063】

ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼの１ユニットは本明細書において、上記に記載のアッセイの条件（０．５％カードラン、ｐＨ＝５、３７℃）で１分当たり１μモルのグルコースに等価な量の還元糖を遊離させるのに必要な酵素の量として定義される。

【0064】

［Ｓａｅｍａｎ加水分解］
改変Ｓａｅｍａｎ加水分解（Ｊ．Ｆ．Ｓａｅｍａｎ，Ｗ．Ｅ．Ｍｏｏｒｅ，Ｒ．Ｌ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｍ．Ａ．Ｍｉｌｌｅｔｔ（１９５４）Ｔａｐｐｉ，３７（８），３３６−３４３）に従って細胞壁を加水分解した。単離されている酵母細胞壁約１２ｍｇを正確に秤量し、この試料に７２％（ｗ／ｗ）のＤ_２ＳＯ_４ ０．３００ｍｌを添加した。この試料を冷蔵庫中で４℃にて４８時間にわたり保存した（一次加水分解）。次に、Ｄ_２Ｏ １．７００ｍｌを添加し、マレイン酸のＤ_２Ｏストック溶液１．０００ｍｌを添加した。十分に混合した後、溶液０．５００ｍｌをピペットで量り取り、Ｄ_２Ｏ ０．５００ｍｌを添加した。不溶性物質を遠心分離で除去し、透明な上清をＮＭＲ管に移した。このＮＭＲ管を、１００分にわたり沸騰水中に置いた（二次加水分解）。

【0065】

ＮＭＲスペクトルを、５ｍｍのクライオプローブを備えたＢｒｕｋｅｒ ＡｖａｎｃｅＩＩＩ ６００ＭＨｚ ＮＭＲ分光器で記録した。試料温度は２８０Ｋであった。捕捉時間は２秒であり、３０秒のパルス間遅延を選択した。１６回のスキャンを平均化し、スペクトルを注意深く同調させてベースラインを調整した。マレイン酸のシグナル（６．５ｐｐｍ）、α−グルコースおよびβ−グルコースのシグナル（５．２２ｐｐｍおよび４．６２ｐｐｍ）、ならびにα−マンノースおよびβ−マンノースのシグナル（５．１８ｐｐｍおよび４．９０ｐｐｍ）を積分し、定量ＮＭＲ（ｑＮＭＲ）に従ってマンナンおよびグルカンの量を算出した。下記方程式１を参照されたい。

【数1】

【0066】

単量体グルコースの分解に関する補正係数（０．９８４）および単量体マンノースの分解に関する補正係数（０．９６６）を使用した。

【0067】

［ＤＭＳＯに可溶なグルカン］
約１００ｍｇの試料を（０．０１ｍｇまで）正確に秤量した。正確に秤量した量のマレイン酸を含むＤＭＳＯ−ｄ６のストック溶液を調製し、この溶液１．０００ｍｌを細胞壁に添加した。懸濁液を、３０分にわたり５０℃にて水浴中に置いた。不溶性物質を遠心分離で除去した。透明な上清にＤ_２Ｏ ５０μｌを添加してＯＨプロトンを確実に変換させ、ＮＭＲスペクトルを、５ｍｍのクライオプローブを備えたＢｒｕｋｅｒ ＡｖａｎｃｅＩＩＩ ６００ＭＨｚ分光器で記録した。試料温度は３２０Ｋであった。捕捉時間は１．７秒であり、１０秒のパルス間遅延を選択した。３２回のスキャンを平均化し、注意深く同調させてベースラインを調整した後、４．５７ｐｐｍでのβ−（１，３）グルカンのシグナルを積分し、４．３１ｐｐｍでのβ−（１，６）グルカンのシグナルを積分し、５．０２ｐｐｍおよび４．４４ｐｐｍでの末端残基のシグナルを積分し、４．５０ｐｐｍおよび４．４２ｐｐｍでの分枝単位のシグナル（図１Ｂを参照されたい）を積分し、６．１ｐｐｍでのマレイン酸のシグナルを積分した。標準的なｑＮＭＲ法（方程式１）を適用することにより、遊離したグルカンの量（全てのタイプの合計）を、積分比、既知の分子量および試料重量から算出した。

【0068】

ＤＭＳＯに可溶なグルカンを乾燥物（ｗ／ｗ％ｏｎ ｄｍ）で報告する。ＤＭＳＯに可溶なグルカンの相対量を総グルカンの％として定義し、下記方程式２に従って算出する。

【数2】

【0069】

［水に可溶なグルカン］
全ての試料（１５ｍｇ）を、０．５ｍｌのＤ_２Ｏと１０．９１ｍｇ／ｍｌのリンゴ酸を含む０．５ｍｌのＤ_２Ｏとに溶解させ、その後、２００μｌの１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８．５を添加してｐＨを調整した。例えば酵母細胞のバッチの場合、ｐＨを６〜７の範囲にする。

【0070】

試料を１０分にわたり遠心分離し、上清を分析した。スペクトルを２８０Ｋで記録した。ＮＭＲスペクトルを、５ｍｍのクライオプローブを備えたＢｒｕｋｅｒ ＡｖａｎｃｅＩＩＩ ６００ＭＨｚ分光器で記録した。試料温度は２８０Ｋであった。捕捉時間は２秒であり、３０秒のパルス間遅延を選択した。１６回のスキャンを平均化した。注意深く同調させてベースラインを補正した後、６．１ｐｐｍでのマレイン酸のシグナルを積分した。グルカンの量を、４．８２〜４．７０ｐｐｍでのβ（１，３）グルカンのシグナル面積、５．２３ｐｐｍおよび４．６７ｐｐｍでの末端残基のシグナル面積、ならびに４．５８〜４．５１ｐｐｍでのβ（１，６）グルカンのシグナル面積から評価した。図１Ａに示す全ての積分値を加算して、水に可溶なグルカンの合計を得た。標準的なｑＮＭＲ法（方程式１）を適用することにより、水に可溶なグルカンの量を、積分比、既知の分子量および試料重量から算出した。

【0071】

水に可溶なグルカンを乾燥物（ｗ／ｗ％ｏｎ ｄｍ）で報告する。水に可溶なグルカンの相対量を総グルカンの％として定義し、下記方程式３に従って算出する。

【数3】

【0072】

［ｉｎ−ｖｉｔｒｏアッセイ］
［好中球または単球による活性酸素種（ＲＯＳ）の産生］
未処理の酵母細胞壁由来のβ−グルカン、酸処理した酵母細胞壁由来のβ−グルカン、酵素処理した酵母細胞壁由来のβ−グルカンおよび小麦酵母濃縮物（市販の参照物）由来のβ−グルカンの、活性酸素種（ＲＯＳ）を産生することが可能な２匹のブタから単離した好中球および単球に対する免疫調節効果を試験した。試料の様々な濃度での細胞培地への添加後の活性酸素種（ＲＯＳ）の産生は、病原体に対する非特異的な防御の指標である。Ｄｏｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０７，２０５−２１４に記載されているような化学発光アッセイを使用してＲＯＳの量を測定した。Ｈａｎｋｓ平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）を陰性コントロールとして使用した。活性酸素種の産生を試験するために、細胞をホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）で刺激した。マイクロタイタープレートの分離壁のプラスチック表面上に好中球または単球を塗布した。ＣＯ_２雰囲気中での３７℃における２時間にわたるインキュベーション後、上清を除去してルミノールを添加した。５分後にバックグラウンド測定を行い、β−グルカンを様々な濃度で添加し、陰性コントロールも添加した。１２０分にわたりＲＯＳの産生を測定した。ＲＯＳの産生を、１００％で表される最大値に対する相対的な応答値で表した。

【0073】

［炎症性（インターロイキン（ＩＬ）−６）サイトカインおよび抗炎症性（ＩＬ−１０）サイトカインの産生］
２匹のブタ由来の単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＳ）（マクロファージ、単球、Ｂ細胞およびＴ細胞）を、未処理の酵母細胞壁由来のβ−グルカンまたは酸処理した酵母細胞壁由来のβ−グルカンを含む培地中でインキュベートした。２種の異なる濃度のβ−グルカン（２０μｇ／ｍｌおよび２００ｇ／ｍｌ）の細胞に対する効果を、ＩＬ−６発現およびＩＬ−１０発現の測定により分析する。商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、米国、ミネソタ州、ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ））を使用し、メーカーが推薦するプロトコルに従ってＩＬ−６およびＩＬ−１０の濃度を測定した。

【0074】

［ブロイラー鶏によるｉｎ−ｖｉｖｏ研究］
いくつかの群のブロイラー鶏によるｉｎ−ｖｉｖｏ研究を実施して、ブロイラー鶏の平均鶏重量（方程式４）、飼料要求率１５００ｇ（方程式５）、免疫応答（Ｅｌｉｓａ）および死亡率（方程式６）を測定した。この試験中、鶏に、標準的なスターター飼料（コントロール）とβ−グルカンを含む標準的なスターター飼料（化学組成 表１）とを給餌した。β−グルカンを含むスターター飼料を、飼料１ｋｇ当たりβ−グルカン５０ｍｇを添加したコントロールスターター飼料で構成した。このβ−グルカンは、標準的な小麦酵母濃縮物由来のβ−グルカン（２５ｍｇ）および酸処理した酵母細胞壁由来のβ−グルカン（２５ｍｇ）の組み合わせに由来した。β−グルカンを含むスターター飼料は、給餌試験の開始期間（最初の１０日）中のみであった。給餌試験を３５日にわたり継続した。

【0075】

給餌試験の終了時（３５日後）、ブロイラー鶏の重量は増加しており、摂取された飼料を測定して飼料要求率１５００ｇを算出した（方程式５）。給餌試験の開始時に生存しているブロイラー鶏と給餌試験の終了時に生存しているブロイラー鶏との差異に基づいて、死亡率を算出した（方程式６）。血液サンプルを採取し、血清をＥＬＩＳＡにより天然免疫系の応答（ＩｇＭおよびＩｇＧの濃度）に関して分析した。

【0076】

下記方程式４による平均鶏重量。

【数4】

【0077】

飼料要求率１５００ｇ（ＦＣＲ１５００ｇ）を、１５００ｇを超える鶏重量の２５ｇ毎に定義し（飼料要求率を０．０１で約分する）、下記方程式５により算出する。

【数5】

【0078】

下記方程式６による死亡率。

【数6】

【0079】

［ブロイラー鶏用の標準的なスターター飼料組成物］
ｉｎ−ｖｉｖｏ給餌試験の最初の１０日にわたり投与したブロイラー鶏用の標準的なスターター飼料（コントロール）およびβ−グルカンを含むスターター飼料の化学組成を下記表１に示す。

【0080】

【表1】

【0081】

［ＥＬＩＳＡアッセイ］
全ての血漿サンプルを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に対する抗体に関して同日に分析した。

【0082】

マイクロタイタープレート（９６ウェル）に、大気温度で１，５時間にわたりまたは冷蔵温度で一晩中、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．６中に４μｇ／ｍｌの濃度でＫＬＨを塗布した。マイクロタイタープレートを過剰な水で洗浄して乾燥させた。血漿サンプルの適切な希釈液を、０．５％のウマ血清および０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液で調製した。例：希釈１／４０、１／１６０、１／６４０等。調製した希釈液１００μｌをウェル（ｎ＝１０またはｎ＝２０）中にピペットで移し、各プレートに既知の標準物質も添加した。大気温度で１．５時間にわたりマイクロタイタープレートをインキュベートする。プレートを過剰な水で洗浄し、プレートを乾燥させる。希釈液でコンジュゲート（ニワトリＩｇＧ−Ｆｃ ＨＲＰまたはニワトリＩｇＭ ＨＲＰ）を１／４０，０００または１／２０，０００に希釈し、このコンジュゲート１００μｌを各ウェル中にピペットで移す。大気温度で１．５時間にわたりマイクロタイタープレートをインキュベートする。このプレートを過剰な水で洗浄して未結合のＨＲＰ標識抗体を除去し、乾燥させる。最後に、テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎ）（ＴＭＢ）を含む発色基質１００μｌを各ウェルに添加し、１０分にわたりインキュベートする。各ウェルに１．２５Ｍ硫酸溶液５０μｌを添加して反応を停止させる。プレートを、４５０ｎｍの波長でＥｌｉｓａ Ｒｅａｄｅｒにより測定した。各サンプルの様々な希釈液の測定値に基づいてデータを解釈した。

【0083】

［実施例］
［実施例１］
［デナザイムＧｅｌ−Ｌ１中に存在するラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼのアミノ酸配列。］
［１．１ デナザイムＧｅｌ−Ｌ１中に存在するラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼのトリプシンによる消化。］
デナザイムＧｅＬ−Ｌ１を２０％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）で１：１に希釈して、デナザイムＧｅＬ−Ｌ１中に存在するタンパク質をＴＣＡで沈殿させた。この混合物を４℃で３０分にわたりインキュベートし、遠心分離によりタンパク質を回収した。タンパク質のペレットを氷冷アセトンで洗浄し、遠心分離により再回収し、少量の５０ｍＭ水酸化ナトリウムに溶解させた。タンパク質溶液を１００ｍＭ炭酸水素ナトリウムで１０倍に希釈した。ジチオスレイトールを５ｍＭの最終濃度まで添加し、２５℃で３０分にわたりインキュベートすることにより、ジスルフィド架橋を還元させた。ヨードアセトアミドを５．５ｍＭの最終濃度まで添加し、暗所にて２５℃で３０分にわたりインキュベートすることにより、システインをアルキル化した。この試料を露光させてアルキル化をクエンチした後、トリプシンで消化した。この基質にトリプシンを１：１００のモル比で添加し、一晩３７℃でインキュベートすることにより消化を実施した。

【0084】

［１．２ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析およびタンパク質同定］
タンパク質消化物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析し、得たデータをＮｉｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０１２，１３：３８０に記載されているようなＵｎｉｐｒｏｔデータベースで検索した。得たＭＳおよびＭＳ／ＭＳのデータをＵｎｉｐｒｏｔデータベースとマッチングさせたところ、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３のラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＣ＿１６４３９）が最もヒットした。

【0085】

２０種のペプチドの分子量、ＮＣＢＩ ｇｅｎｂａｎｋから推定される、これらペプチドのアミノ酸配列（１文字表記）、およびストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３のラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼのアミノ酸配列中における、これらペプチドのアミノ酸の位置を表２にまとめる。これら２０種のペプチドは重複を示す。これら２０種のペプチドから、合計で５種の固有のペプチドを構成することができる（表３を参照されたい）。これら５種の固有のペプチドはそれぞれ、配列番号１〜５として配列表に含まれている。

【0086】

表４は、ＮＣＢＩ ｇｅｎｂａｎｋ（受託番号ＣＡＣ＿１６４３９）から入手したストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３のラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼのアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列の下線が引かれた部分は、ストレプトマイセス・マテンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍａｔｅｎｓｉｓ）ＤＩＣ−１０８の対応するラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼに関してＮａｋａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）で開示されたシグナル配列（３３個のアミノ酸）を表す（Ｊ．Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｅｎｇ．８５（５），４５９−４６４“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｌａｍｉｎａｒｉｐｅｎｔａｏｓｅ−Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｂｅｔａ−１，３−ｇｌｕｃａｎａｓｅ（ＬＰＨａｓｅ）ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍａｔｅｎｓｉｓ ＤＩＣ−１０８）。強調されているペプチド（灰色の背景）は、デナザイムＧＥＬ−Ｌ１から単離されたラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼ中に存在する５種の固有のペプチドである。これら５種のペプチドと、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３のベータ１，３−グルカナーゼのアミノ酸配列との完全な一致に基づいて、デナザイムＧＥＬ−Ｌ１から単離されたラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼはストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３のベータ１，３−グルカナーゼと同じアミノ酸配列を有すると推測され得る。

【0087】

表２：デナザイム−Ｌ１のトリプシン消化物から得たペプチド
・左側の列「質量」はペプチドの分子量をダルトンで示す。
・中央の列「ペプチド」は、ＮＣＢＩ ｇｅｎｂａｎｋから推定したマッチングペプチドのアミノ酸配列を示す。
・右側の列は、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３のベータ−１，３−グルカナーゼの配列における、２番目の列のペプチドが存在するアミノ酸の位置を示す。

【0088】

【表2】

【0089】

【表3】

【0090】

【表4】

【0091】

［表４−ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３のラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼのアミノ酸配列］
強調されているペプチドは、上記表３からの５種の固有のペプチド配列を示す。

【0092】

【表5】

【0093】

下線が引かれた部分は、ストレプトマイセス・マテンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍａｔｅｎｓｉｓ）ＤＩＣ−１０８の対応するβ−１，３−グルカナーゼによる研究（Ｎａｋａｎａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８５（５），４５９−４６４）に基づく推定上のシグナル配列である。従って、成熟酵素のアミノ酸配列は３４位でのＡｌａで始まるだろう。強調されているアミノ酸は、表３に示す５種のペプチドを表す。

【0094】

【表6】

【0095】

ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３のラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼと、ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼストレプトマイセス・マテンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍａｔｅｎｓｉｓ）ＤＩＣ−１０とのアラインメントから、これらの配列は４０１個の残基の長さに基づいて７６．３％同一であることが明らかである。ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３のラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼのアミノ酸配列には、３箇所のギャップが導入されていた。

【0096】

［実施例２］
［酸およびアルカリによる酵母細胞壁グルカンの可溶化］
単離されている酵母細胞壁は様々な供給業者から商業的に入手可能である。本実施例の場合、単離されている酵母細胞壁を酵母抽出物の副産物として得た。この酵母細胞壁は、乾燥物基準で３１．７％のグルカンを含んでいた。

【0097】

この酵母細胞壁を、９５℃および下記表に示すｐＨ値で１６時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、試料を１００℃で１５分にわたり加熱し、凍結乾燥後、酵母細胞壁を、材料および方法に記載したようにＤ_２ＯまたはＤＭＳＯに溶解させた。

【0098】

【表7】

【0099】

表６の結果は、５．５のｐＨまたは１０もしくは１２のアルカリ性ｐＨでは酵母細胞壁β−グルカンが水溶化され得ないことを示す。より酸性条件下での可溶化により、グルカンがわずかに可溶化され、酵母細胞壁中の総グルカンの２．８〜５．３％を可溶化することができた。

【0100】

未処理の酵母細胞壁では、総β−グルカンの１３．２％がＤＭＳＯに可溶であった。酸性条件下での可溶化により、ＤＭＳＯに可溶なβ−グルカンの量が大幅に増加した（２１％および３０％）。ｐＨ５．５およびｐＨ１０．０では、ＤＭＳＯに可溶なβ−グルカンの割合は変化しなかった、またはわずかに低下した。ｐＨ１２でのアルカリ条件下における可溶化では、β−グルカンは可溶化しなかった。

【0101】

［実施例３］
［ラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼを使用する酵母細胞壁グルカンの可溶化］
単離されている酵母細胞壁を、５５℃およびｐＨ＝５．５で１６時間にわたり、示した量のデナザイムＧＥＬ−Ｌ１と共にまたはデナザイムＧＥＬ−Ｌ１なしでインキュベートした（ｗｔ％ｄｍは、酵母細胞壁乾燥物基準での酵素溶液の「重量パーセント」を意味しており、例えば０．０１ｗｔ％ｄｍは、酵母細胞壁の１グラム乾燥重量当たりデナザイム溶液０．１ｍｇと等しい）。インキュベーション後、試料を１００℃で１５分にわたり加熱し、凍結乾燥後、酵母細胞壁を、材料および方法に記載したようにＤ_２ＯまたはＤＭＳＯに溶解させた。５０℃での３０分にわたるインキュベーション後、試料を１０分にわたり遠心分離し、上清を、材料および方法に記載したようにＮＭＲで分析した。

【0102】

【表8】

【0103】

表７の結果は、酵母細胞壁とラミナリペンタオース生成β−１，３−グルカナーゼ（デナザイムＧＥＬ−Ｌ１）とのインキュベーションにより、ＤＳＭＯへのβ−グルカンの可溶性の割合が大幅に増加するが水への可溶性は酵素濃度が最高の場合にのみ増加することを示す。

【0104】

［比較例４］
［ラミナリナーゼを使用する酵母細胞壁グルカンの可溶化］
単離されている酵母細胞壁を、５５℃でおよびｐＨ＝５．３で１６時間にわたり、示した量のラミナリナーゼと共にまたはラミナリナーゼなしでインキュベートした（ｗｔ％ｄｍは、酵母細胞壁乾燥物基準での酵素溶液の「重量パーセント」を意味しており、例えば０．０１ｗｔ％ｄｍは、酵母細胞壁の１グラム乾燥重量当たりラミナリナーゼ溶液０．１ｍｇと等しい）。インキュベーション後、試料を１００℃で１５分にわたり加熱し、凍結乾燥後、酵母細胞壁を、材料および方法に記載したようにＤ_２ＯまたはＤＭＳＯに溶解させた。

【0105】

５０℃での３０分にわたるインキュベーション後、試料を１０分にわたり遠心分離し、上清を、材料および方法に記載したようにＮＭＲで分析した。酵母細胞壁は３７％のグルカンを含んでいた。

【0106】

【表9】

【0107】

表８の結果は、ラミナリナーゼは酵母細胞壁中に存在するグルカンを可溶化することができないことを明瞭に示す。

【0108】

［実施例５］
［ＩＬ−６およびＩＬ−１０の分泌に関するｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究］
２匹のブタ由来の単離されている末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）（マクロファージ、単球、Ｂ細胞およびＴ細胞）を、実施例２から得た未処理の酵母細胞壁由来のまたは酸処理した酵母細胞壁由来のβ−グルカンを含む培地中でインキュベートした。ＩＬ−６は、免疫応答の開示時に放出される炎症性サイトカインであり、ＩＬ−１０は抗炎症性サイトカインである。

【0109】

図４および図５は、実施例２（コントロール）の未処理酵母細胞壁由来のβ−グルカンと比較して、実施例２、インキュベーション２のｐＨ３での酸処理した酵母細胞壁由来のβ−グルカンの添加後には、ＩＬ６およびＩＬ１０の分泌への刺激効果が存在していることを示す。

【0110】

［実施例６］
［活性酸素種の産生に関するｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究］
実施例２の酸処理した酵母細胞壁由来のβ−グルカン、実施例３、インキュベーション番号７の酵素処理した酵母細胞壁由来のβ−グルカン、および市販の小麦酵母濃縮物（市販参照物)由来のβ−グルカンの免疫調節効果を、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生が可能な２匹のブタから単離された好中球および単球で試験した。試料の様々な濃度での細胞培地への添加後の活性酸素種（ＲＯＳ）産生は、病原体に対する非特異的な防御の指標である。Ｈａｎｋｓ平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）を陰性コントロールとして使用した。

【0111】

図６および図７のデータは、投与した全てのβ−グルカン含有試料に関して用量応答が確認されたことを明瞭に示す。実施例２の酸処理した酵母細胞壁、実施例３、インキュベーション番号７の酵素処理した酵母細胞壁、および市販の小麦酵母濃縮物（市販参照物）は、５０μｇ／ｍｌおよび２００μｇ／ｍｌのβ−グルカン濃度で、好中球によるＲＯＳ産生を誘発した。

【0112】

実施例２の酸処理した酵母細胞壁、および実施例３、インキュベーション番号７の酵素処理した酵母細胞壁は、市販の小麦酵母濃縮物（市販参照物)と比較してＯ−ラジカルの産生への刺激効果の改善を示した。

【0113】

図８および図９は、市販の小麦酵母濃縮物中に存在するβ−グルカンが、試験した濃度では、単球によるＲＯＳ産生を誘発しなかったことを明瞭に示す。実施例２の酸処理した酵母細胞壁中に存在するβ−グルカン、および実施例３、インキュベーション番号７の酵素処理した酵母細胞壁中に存在するβ−グルカンは、Ｏ−ラジカル産生の誘発を示した。しかしながら、用量応答効果は両方のブタで異なっていた。

【0114】

［実施例７］
［ブロイラー鶏に関するｉｎ ｖｉｖｏでの研究］
３０００羽のブロイラー鶏からなるいくつかの群によるｉｎ−ｖｉｖｏでの研究中に、β−グルカンが添加されていない標準的なスターター飼料（コントロール）または飼料１ｋｇ当たりβ−グルカン５０ｍｇを含む標準的なスターター飼料（試験）のブロイラー鶏への給餌後、下記のパラメーターを測定した。このβ−グルカン５０ｍｇは、標準的な小麦酵母濃縮由来のβ−グルカン（２５ｍｇ）と酸処理した酵母細胞壁由来のβ−グルカン（２５ｍｇ）との組み合わせに由来した。給餌試験の開始時には（即ち最初の１０日にわたり）、β−グルカン５０ｍｇを含むスターター飼料のみを給餌した。両方の群（コントロールおおび試験）に関して、標準的なスターター飼料による給餌試験を３５日にわたり継続した。給餌試験の終了時に、下記のパラメーター：摂取された飼料の合計（ｋｇ）、給餌試験の終了時での肉の合計（ｋｇ）、鶏１羽当たりの平均重量（ｇ）、飼料要求率１５００ｇを測定し、血液サンプルを採取して、血清をＥＬＩＳＡにより天然免疫系応答（ＩｇＭおよびＩｇＧの濃度）に関して分析した。

【0115】

【表10】

【0116】

表９の結果は、酸処理した酵母細胞壁に部分的に由来するβ−グルカンを含む標準的なスターター飼料を給餌したブロイラー鶏は、３５日の給餌試験後に、平均鶏重量の改善、飼料要求率１５００ｇ（ＦＣＲ１５００ｇ）の改善、ならびにＩｇＭおよびＩｇＧの両方に関する免疫応答の増加を示すことを明瞭に示す。

【0117】

［実施例８］
［ブロイラー鶏に関するｉｎ ｖｉｖｏでの研究］
試験の最初の１０日にわたり、添加したβ−グルカンを含む標準的なスターター飼料を給餌した、約３４０００羽のブロイラー鶏からなるいくつかの群によるｉｎ−ｖｉｖｏでの研究。３５０００羽のブロイラー鶏からなるコントロール群に、標準的なスターター飼料のみを給餌した。添加されたβ−グルカンを含む標準的なスターター飼料は、標準的な小麦酵母濃縮物由来のβ−グルカン（２５ｍｇ）と酸処理した酵母細胞壁由来のβ−グルカン（２５ｍｇ）との組み合わせに由来するβ−グルカンを飼料１ｋｇ当たり５０ｍｇ含んでいた。鶏給餌試験の終了時（３５日後）に、下記のパラメーター：摂取された飼料の合計（ｋｇ）、給餌試験の終了時の肉の合計（ｋｇ）、鶏１羽当たりの平均重量（ｇ）、飼料要求率１５００ｇを測定し、ブロイラー鶏の死亡率を記録した。

【0118】

【表11】

【0119】

表１０の結果は、酸処理した酵母細胞壁に部分的に由来するβ−グルカン５０ｍｇを含む標準的なスターター飼料を給餌したブロイラー鶏では、平均重量が改善され、飼料要求率１５００ｇが改善され、最終的には死亡率が明瞭に低下することを明瞭に示した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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