【実施例】
【0074】
IV.実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含まれるものである。以下に記載される実施例中で開示される技術は、発明者らによって発見され、本発明の実践においてうまく機能する技術を示すものであり、従ってその実践に好ましい形態を構成していると考えられると当業者は認識すべきである。しかしながら、本開示を踏まえると、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示した特定に態様に多くの変更を施し、その上でなお、似たようなまたは同様の結果が得られるということを当業者であれば理解できる。
【0075】
実施例1
マエストロ(Mestro)多電極アレイを使った、iPS細胞由来ニューロンの細胞外単一ユニット記録
以下の方法を使用して、マエストロ多電極アレイ(MEA)上において神経細胞を培養してもよい。アイセル(iCell)(登録商標)ニューロンを解凍し、50%ポリエチレンイミン(PEI;シグマ)溶液で予めコーティングしておいた48ウェルMEAプレートにプレーティングする。プレーティングの1日後、消費した培地の100%を、10%ノックアウト血清代替品(KSR;ライフ・テクノロジーズ)を添加したニューロベーサル(Neurobasal)−A培地(NBA;ライフ・テクノロジーズ)で交換する。プレーティングの5日後、消費した培地の50%をNBA+10%KSRで交換する。プレーティングの8日後、ベースライン活性を記録し、細胞を化合物で処理し、その後、活性を記録する。
【0076】
48ウェルMEAプレートの準備
1. 3.10gのホウ酸と4.75gのテトラホウ酸ナトリウムを蒸留水に溶解して1Lのホウ酸緩衝液を準備する。pHを8.4に調整する。必要に応じて計量する。
2. 50%のPEI溶液をホウ酸緩衝液で希釈して0.05〜0.1%のPEI溶液を準備する。0.05〜0.1%のPEI溶液を0.22μmフィルターに通して濾過する。注意:0.05〜0.1%のPEI溶液は4℃で1ヶ月間保存できる。
3. 0.05〜0.1%のPEI溶液を48ウェルMEAプレートの1ウェルにつき125μl入れる。室温で1時間インキュベートする。
4. 48ウェルMEAプレートからPEI溶液を吸引する。ウェルが乾かないように注意する。
5. 1ウェル当たり少なくとも300μlの滅菌水で4回すすぐ。
6. 48ウェルMEAプレートに蓋をしない状態で、無菌の生物学的安全キャビネット内で一晩風乾する。最適な細胞接着性と最大性能を引き出すために48ウェルMEAプレートを一晩風乾させてもよい。
【0077】
アイセル(登録商標)ニューロンの解凍:以下の手順では、バイアル1本分のアイセル(登録商標)ニューロンを解凍し、48ウェルMEAプレートにプレーティングする工程を詳述する。バイアル2本分のアイセル(登録商標)ニューロンについては、これに従って量を増やすこと。一度に2枚を超える48ウェルMEAプレートの準備をしないこと。
1. アイセル(登録商標)ニューロンの使用説明書に従って、完全アイセル(登録商標)ニューロン維持培地(完全維持培地、Complete Maintenance Medium)を調製する。必要に応じて、ペニシリン−ストレプトマイシンを1×最終濃度で完全維持培地に添加してもよい。
2. 250μlのラミニン溶液のストック(1mg/ml)を25ml完全維持培地を添加して希釈して最終濃度を10μg/mlにする。チューブを反転しながら穏やかに混合する。ラミニン溶液のストックは室温でまたは4℃で一晩かけて解凍することができる。
3. 使用説明書に従ってアイセル(登録商標)ニューロンを解凍し、この細胞懸濁液を、10μg/mlのラミニンを含有する完全維持培地で最終容量が10mlになるように希釈する。
4. 必要に応じて、細胞懸濁液試料を除去し、血球計数器でニューロンを計数して、細胞の生存率と総数を決定してもよい。
5. 細胞懸濁液を15mlの遠心管に移す。
6. 380×gで5分間遠心してニューロンを濃縮する。
7. ペレットを壊さないように注意しながら細胞塊の間近まで上清を吸引し、およそ50μlを残す。この近似容量は、真空吸引器の不正確な特性から導き出されたものである。
8. 細胞ペレットに10μg/mlラミニン含有完全維持培地を125μl加え、上下にピペッティングすることで穏やかに再懸濁する。
9. ピペッタ−を使って細胞懸濁液の最終容量を測定する。10μg/mlラミニン含有完全維持培地を最終容量が220μlになるように加える。ピペッティングで穏やかに混合する。
10. 細胞懸濁液を1.5mlの遠心管に移す。
【0078】
アイセル(登録商標)ニューロンの48ウェルMEAプレートへのプレーティング
1. チューブを2〜3回、ゆっくりと上下に反転させ、細胞懸濁液を完全に混合する。ウェルの底面が見えるように、48ウェルMEAプレートを一定の角度に傾ける。直ちに、PEI溶液で予めコーティングしておいた48ウェルMEAのウェルの記録電極部分に直接、1ウェル当たり、細胞懸濁液の液滴4μlを分注する。
2. 液滴が蒸発しないように、48ウェルMEAプレートのウェルの周囲に滅菌水2mlを添加する。水が48ウェルMEAプレートのウェルの中に入らないように注意する。プレートを傾けた時に水がウェル中に漏れるのを回避するために、細胞懸濁液をプレーティングした後に水を加えることもできる。48ウェルMEAプレートの湿潤環境を維持できれば、水の量は重要ではないだろう。
3. 滅菌済みのマイクロクライム・エンバイロメンタル・リッド(MicroClime Environmental lid)で48ウェルMEAプレートを覆い、37℃、5% CO2、湿度95%にした細胞培養用インキュベーター内で約40分インキュベートする。
4. 培地を加える前に、滅菌済みのチップを備えた12チャネルピペッターを装填し、必要があれば、48ウェルMEAプレートへの分注に応じて、チップを外す。
5. 急勾配(およそ75〜80°)になるようにプレートを傾ける。1ウェル当たり150μlの10μg/mlラミニン含有完全維持培地を、48ウェルMEAプレートの1列分のウェルの片側に、12チャネルピペッターを使って一度にゆっくりと加える。培地を勢いよく加えると接着しているニューロンがはがれる恐れがある。この工程ではタイミングが重要になる可能性がある。液滴が乾くと性能が落ちる可能性がある。それぞれのウェルに一度の全容量を入れずに、先に少量の培地を全ウェルに入れておいてもよい。
6. 48ウェルMEAプレートをゆっくりと、生物学的安全キャビネットの表面で水平に戻し、培地が液滴をゆっくりと覆うようにする。
7. 1ウェル当たりの最終容量が300μlになるまで工程5を繰り返す。
8. 滅菌済みマイクロクライム・エンバイロメンタル・リッドで48ウェルMEAプレートを覆い、37℃、5% CO2、湿度95%にした細胞培養用インキュベーター内でインキュベートする。
【0079】
48ウェルMEAプレート上でのアイセル(登録商標)ニューロンの維持
1. 10%のKSRと1×ペニシリン−ストレプトマイシンを加えたNBA培地(NBA+KSR培地)を準備する。0.22μmのフィルターで濾過する。必要に応じて、ペニシリン−ストレプトマイシンを最終濃度が1×となるように培地に加えてもよい。
2. プレーティングした1日後に、NBA+KSR培地を水浴中、37℃で平衡化する。
3. 培地を分注し、消費した培地を48ウェルMEAプレートの一列分のウェルから一度に除去するために、前述したように、滅菌済みのチップを備えた12チャネルピペッターを装填する。
4. 37℃のNBA+KSR培地を1ウェル当たり150μl、48ウェルMEAプレートの1列分のウェルの片側に、12チャネルピペッターを使って一度にゆっくりと加える。培地を勢いよく加えると接着しているニューロンがはがれる恐れがある。
5. 1ウェル当たりの最終容量が300μlになるまで工程4を繰り返す。
6. 滅菌済みマイクロクライム・エンバイロメンタル・リッドで48ウェルMEAプレートを覆い、37℃、5% CO2、湿度95%にした細胞培養用インキュベーター内で4日間インキュベートする。
7. プレーティングした5日後、消費した培地の50%(150μl/ウェル)を1ウェル当たり150μlの、新しい37℃のNBA+KSR培地で交換する。
8. 37℃、5% CO2、湿度95%にした細胞培養用インキュベーター内で3日間インキュベートする。最適性能を発揮するために、プレーティングした8日後にデータを収集することができる。
【0080】
データの解析と収集はAxISソフトウェア(アキシオン・インテグレーテッド・スタジオ、アキシオン・バイオシステムズ(AxionIntegratedStudio、AxionBioSystems))を使って行うことができる。プレーティング後8日目以降のニューロン調整物がデータ収集に好適である場合がある。データ収集には、処理前記録(基準)、化合物処理記録、続く、処理後記録(ドーズ)が含まれる場合がある。AxISソフトウェアを使って電気活性を収集してもよい。CDIニューロンコンフィグ.データストリーム(CDIneuronconfig.datastream)ファイルであれば、データ収集に適した設定がAxISソフトウェアにロードされることを確実とすることができる。
【0081】
実施例2
ヒトiPSC由来細胞型を用いたE/I比の決定による神経回路網バーストおよび同期性の調節
アイセル(登録商標)ニューロン:発明者らは、健常提供者または疾患特異的提供者から得た成人細胞を多能性状態にリプログラミングするためにiPSC技術を利用してきた。この状態では、iPS細胞は実質的に、これまでは扱うことができなかったヒトのニューロンを含む全ての細胞型に分化する能力を有する。重要なことは、アイセル(登録商標)ニューロンが凍結保存された材料として提供され、解凍でき、その週のいつでも使用できるということである。
図1に、凍結保存したアイセル(登録商標)ニューロンを生成するための一般的な模式図を示す。
【0082】
細胞試料の特徴を以下に明らかにする。アイセル(登録商標)ニューロンは、ヒトiPSC由来皮質ニューロンの純度の高い集団(>95%)で、これがニューロンであるということはβIII−チューブリン陽性かつネスチン陰性の染色結果に基づいている。この細胞は古典的なニューロンの形態を有し、二極または多極の神経突起の伸長が培養1日目には始まる。これらの細胞は、抑制性ニューロン(GABA作動性;〜70%)と興奮性ニューロン(グルタミン酸作動性;〜30%)両方の混合物であると考えられており、またこれらは、特徴的な分子マーカーに関する遺伝子発現レベルや表現型解析によって分析されてきた。
【0083】
アイセル(登録商標)ドーパニューロン:ドーパミン作動性(DA)ニューロンは長期間培養することができる。2週間後には、かなりの程度の神経突起が成長し、この時点で形成される精巧な回路網は、古典的なニューロンの表現型を想起させる。アイセル(登録商標)ドーパニューロンの80%超がTH陽性である。アイセル(登録商標)ドーパニューロンもまた、抑制性ニューロン(GABA;〜30%)と興奮性ニューロン(グルタミン酸作動性;〜70%)両方の混合物である。ニューロンが興奮性ニューロンであるか抑制性ニューロンであるかの確認には免疫組織化学を用いた(
図2)。
【0084】
これらの実験では、アイセル(登録商標)ドーパニューロン、アイセル(登録商標)ニューロン、およびアイセル(登録商標)アストロサイトをセルラー・ダイナミクス・インターナショナル社(Cellular Dynamics International Inc.、マジソン、ウィスコンシン)から入手し、混合して、実施例1で記述したようにMEAプレート上で培養した。細胞は、ソーク研究所(ラホーヤ、カリフォルニア)から入手したブレインフィズ(BrainPhys)培地(バーディら、2015)を使って培養した。
【0085】
これらの実験では、個々のニューロン型それぞれを再懸濁した後であって、打点(dot)する直前に、それぞれの細胞型を混合してE/I比を決定した。例えば、50%アイセル(登録商標)ドーパニューロン混合物を50%アイセル(登録商標)ニューロンと混合する場合、再懸濁したアイセル(登録商標)ドーパニューロン40マイクロリットル(uL)と、再懸濁したアイセル(登録商標)ニューロン40μlとを混合した。細胞型の混合が終わった後、この混合溶液をMEAプレートに打点した。
【0086】
ブレインフィズ(Brain Phys)培地はニューロン回路網の構築/安定化を助ける
アイセル(登録商標)ドーパニューロンを解凍後、維持培地(MM)またはブレインフィズ(BP)培地のいずれかを使い、〜12日間培養した。神経回路網の活動/結合性を図示するバースト動態の解析から、MM中で生育させた培養と比較して、BPで処理した培養の方が、より強固で安定した大きな回路網バーストを示すことが分かった。より具体的には、回路網の挙動は、MMで見られたより大きな回路網の活動を伴わない、強く、小さい回路網(単一チャネル)バーストから、大きく、培養全体を包含した(全チャネル)回路網バーストへと変化し、それでもなお、BPで処理した培養では、強く、小さい回路網(単一チャネル)バーストも見られた。解析および結果を
図10に示す。
【0087】
E/I比の決定:EからIは脱同期化
抑制の量を増やしていった8つのウェルに関する例示的なラスタープロットおよびベロシティグラフ。E/I比は、アイセル(登録商標)ドーパニューロン(70:30、E:I%)とアイセル(登録商標)ニューロン(30:70)(各細胞型の%を各グラフの上に示した)を混合することで調整した。ベロシティグラフは、記録を行った4分間の500ミリ秒ごとの瞬間的な平均発火頻度を示している。同期回路網バーストは培養の6〜10日目に始まっている。結果を
図3に示す。
【0088】
アキシオン社の神経測定(Neural Metrics)解析ツールボックスを使い、(各チャネル)平均発火頻度、チャネルバースト頻度(ポアソン・サプライズ)およびバースト強度ならびに(全チャネル)回路網バーストおよび各神経回路バーストに含まれるチャネルの数(増幅)を評価した。このツールボックスを使用して、記載のように混合した培養の全ウェルについて活動を評価した。阻害の量が増えると発火頻度とバースト頻度が低下したが、各バーストの強度には阻害による変化は見られなかったことに注目されたい。阻害が多量になると回路網バーストは完全に消失した。結果を
図4に示す。
【0089】
E/I比の決定:IからEは高同期化
興奮の量を増やしたときの8ウェルに関する例示的な生データのトレースとベロシティグラフを示している。E/I比は、アイセル(登録商標)ニューロン(30:70、E:I%)とグルタミン酸作動性95(95:5、E:I%)細胞を混合することによって調整した。培養は数週間の間、同期回路網バーストを示し続けた。興奮の量が増えると回路網バーストが増大し(
図5、枠内)、強度が高まることに注目されたい。また、興奮が閾値に達すると回路網の発作(seizures)の出現も注目に値する。結果を
図5に示す。
【0090】
平均発火頻度、チャネルバースト頻度およびバースト強度はいずれも、異なるE/I比のピークと分布を示している。チャネルバーストと強度は、興奮レベルが上がると下がった。興奮がより少ない量で一定していた増幅レベルも、興奮が過剰になると低下したことに留意されたい。結果を
図6に示す。
【0091】
アストロサイトを含む神経回路網は安定している
E/I比の決定で使用したものと同じ培養物を使用した。ただし、アイセル(登録商標)アストロサイトを細胞培養に添加した点が異なる。アイセル(登録商標)アストロサイト添加7日後の結果を
図7に示す。アストロサイト添加後には、チャネルバースト頻度のE/I比分布が変化し、強度、回路網バーストおよび増大レベルは全E/I比にわたって標準化された。結果を
図8に示す。
【0092】
発現しているE/I比が相同の(70:30)、例示的な2つのニューロン培養物(12日目)を
図9に示す。アイセル(登録商標)ドーパニューロン(上段)は中脳ニューロンであり、グルタミン酸作動性(グルタミン酸作動性)70(下段)細胞型は皮質ニューロンである。両方の回路網が同程度の回路網バースト強度レベルを示したが、バースト後のノイズ(rumbling)レベルはアイセル(登録商標)ドーパニューロンでより顕著だったことに注目されたい。
【0093】
2つの例示的な興奮性の薬剤であるTHIP(上段)およびL−655,708(下段)がアイセル(登録商標)ドーパニューロン培養物に及ぼす影響を
図11に示している。THIPは持続性抑制を活性化し、L−655,708は持続性抑制を低減する。いずれの薬剤でも回路網バースト強度は変化しなかったが、バースト後の挙動はいずれにおいても変化した。THIPによって、バースト全体の間隔とバースト後のノイズ(rumbling time)が短くなった。逆にL−655,708では「バーストが収まった後」の発火(after-quiet)が見られなくなり、回路網を脱同期化し、それによって、活動を支配する、継続的なノイズ活性が誘導された。
【0094】
培養したニューロンにおける同期バーストを観察した。MEAの同じウェル中になる全16電極の大部分において、同時に発火が見られた。これらの強いバーストの活動電位は、ニューロン回路網が形成されており、細胞が同期的に発火していることを示している。
図12に示すように、ヒトiPS細胞由来ニューロン培養物でバースト表現型が観察された。
図11の各グラフのy軸の目盛りに注意されたい。
図13に示すように、異なる比率の興奮性ニューロンと抑制性ニューロンを多電極アレイ上で、例えばMEA中で共培養してもよい。
【0095】
本明細書で開示し、特許請求した全ての方法は、本開示を踏まえれば、過度の実験を行うことなく立案および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい態様の観点から説明してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法におよび本明細書に記載の方法の各工程に、または各工程の順序に様々な変更を適用可能であることが当業者には明らかである。より具体的には、同じまたは同様の結果が達成される限り、本明細書に記載に薬剤を、化学的および生理学的の両面で関連した特定の薬剤で置き換えてもよいことが明らかである。このような、当業者に明らかな相同の置き換えおよび変更は、添付の請求項で定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内にあると見なされる。
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に示す詳細の補足となる手続上の詳細の例または他の詳細の例を提供する範囲において、具体的に参照することによって本明細書に組み入れられる。
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