特許 6761889 抗ヒトＣｒｉｐｔｏ−１抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】6761889

(24)【登録日】2020年9月9日

(45)【発行日】2020年9月30日

(54)【発明の名称】抗ヒトＣｒｉｐｔｏ−１抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/30 20060101AFI20200917BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20200917BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20200917BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20200917BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20200917BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20200917BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20200917BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20200917BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20200917BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/30ZNA

   C12N15/13

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K39/395 T

   !A61P35/00

   !C12P21/08

【請求項の数】12

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2019-204019(P2019-204019)

(22)【出願日】2019年11月11日

【審査請求日】2019年11月11日

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】511130807

【氏名又は名称】株式会社ＧＳＰエンタープライズ

(73)【特許権者】

【識別番号】519326459

【氏名又は名称】トモイケ バイオ リミテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｔｏｍｏｉｋｅ Ｂｉｏ Ｌｔｄ．

(73)【特許権者】

【識別番号】519402214

【氏名又は名称】エー バイオテック カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】Ａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】妹尾 昌治

(72)【発明者】

【氏名】高柳 淳

(72)【発明者】

【氏名】イ セギョン

【審査官】 鈴木 崇之

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１８／０５７９６７（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２０１８／０４４９７０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１７／１９２５８９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１９−５０６８４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１８−５０６９６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Biochimie，２０１９年 １月２８日，Vol. 158，pp. 246-256

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｐ ２１／０８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外ドメインを特異的に認識する、ヒト由来抗ヒトＣｒｉｐｔｏ−１モノクローナル抗体であって、
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列又は（Ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなる、重鎖ＣＤＲ１、
（Ｅ）配列番号３に示すアミノ酸配列又は（Ｇ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなる、重鎖ＣＤＲ２、
（Ｉ）配列番号７に示すアミノ酸配列からなる、軽鎖ＣＤＲ１、
（Ｋ）配列番号８に示すアミノ酸配列からなる、軽鎖ＣＤＲ２、
（Ｍ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなる、重鎖ＣＤＲ３、及び
（Ｏ）配列番号９に示すアミノ酸配列からなる、軽鎖ＣＤＲ３、
を含有する抗体。

【請求項2】

（Ｑ）配列番号６に示すアミノ酸配列、又は
（Ｒ）（Ｑ）のアミノ酸配列において、ＦＲに存在する１〜５０個のアミノ酸残基が、置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、並びに
（Ｓ）配列番号１０に示すアミノ酸配列、又は
（Ｔ）（Ｓ）のアミノ酸配列において、ＦＲに存在する１〜５０個のアミノ酸残基が、置
換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列
からなる軽鎖可変領域
を含有する、請求項１に記載する抗体。

【請求項3】

Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、又はこれらを組み合わせた構造を有する抗体である、請求項１又は２に記載する抗体。

【請求項4】

定常領域を含む抗体である、請求項１〜３の何れかに記載する抗体。

【請求項5】

イムノグロブリン、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ミニボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、又はこれらを組み合わせた構造を有する抗体である、請求項４に記載する抗体。

【請求項6】

細胞障害活性を有する抗体である、請求項１〜５の何れかに記載する抗体。

【請求項7】

細胞障害活性が、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、及びＡＤＣＰの何れかの活性である、請求項６に記載する抗体。

【請求項8】

サイトトキシンが結合する抗体である、請求項１〜７の何れかに記載する抗体。

【請求項9】

請求項１〜８の何れかに記載する抗体をコードするポリヌクレオチド。

【請求項10】

請求項１〜８の何れかに記載する抗体を産生する細胞。

【請求項11】

請求項９に記載するポリヌクレオチドを保持する細胞。

【請求項12】

請求項１〜８の何れかに記載する抗体を含有する医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、例えば、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外ドメインの構造を特異的に認識する、モノクローナル抗体に関する。また、本発明は、例えば、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外ドメインの構造を特異的に認識する、モノクローナル抗体を含有する飲食品組成物又は医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

ガン近年のガン研究において、ガン組織は、均一な性質等を有する細胞の集合体では無く、不均一な性質等を有する細胞の集合体であることが明らかとなっている。また、ガン組織にガン幹細胞が含有され、このガン幹細胞からガン細胞が分化されると共に、ガン幹細胞そのものも増殖することも知られている。

【0003】

既存のガン治療薬を投与しても、「５年生存率」のように治療効果が表現されることからもわかるように、現実的に、ガンの根治は困難というのが一般的である。分子標的治療薬を含めた既存のガン治療薬が、ガン組織に含有される細胞集団内の特定のガン細胞にのみ効果を示し、不均一性を示す残りのガン細胞やガン幹細胞には薬効を示さないために、ガンが根治される可能性が少ないと推測される。

【0004】

Ｃｒｉｐｔｏ−１（ＣＲ−１）は、がん幹細胞の自己複製に必要なＮｏｄａｌの共受容体として知られている（非特許文献１〜３）。がん幹細胞の増殖を抑制するために、抗Ｎｏｄａｌ抗体又は抗ＴＧＦ−β受容体抗体等が有効であると考えられている。また、ヒトＣｒｉｐｔｏに対する抗体も知られている（特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特表２００５−５２０５５６

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．（２０１１）９（５）：４３３−４４６

【非特許文献2】Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．（２０１４）２０１４：３６４１３４

【非特許文献3】Ｄｏｎｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．（２０１７）１３７（１２）：２５７８−２５８７

【非特許文献4】Ｊｏｓｅｐｈｉｎｅ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１６）７６（８）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ガンを治療するためにはガン幹細胞の増殖を阻害することが有効である。そこで、抗Ｎｏｄａｌ抗体又は抗ＴＧＦ−β受容体抗体が、ガン幹細胞の増殖を阻害するために有効であると考えられる。しかし、Ｎｏｄａｌ又はＴＧＦ−β受容体は、ガン幹細胞以外の生命現象に広く関連する分子であり、これらに結合する抗体が重大な副作用を生じさせる懸念がある。また、Ｎｏｄａｌ又はＴＧＦ−β受容体の調製は困難であるため、抗Ｎｏｄａｌ抗体又は抗ＴＧＦ−β受容体抗体を製造するための抗原の入手も困難である。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上記する課題を検討すべく、本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、ヒトＣｒｉｏｔｏ−１に対して優れた親和性を示す、ヒト由来抗ヒトＣｒｉｐｔｏ−１抗体を製造した。

【0009】

本発明は、斯かる知見に基づいて完成されたものであり、以下に示す態様の発明を広く包含する。

【0010】

Ｉ．抗体
Ｉ―１ ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外ドメインを特異的に認識する、ヒト由来抗ヒトＣｒｉｐｔｏ−１モノクローナル抗体であって、
（Ａ） 配列番号１に示すアミノ酸配列、
（Ｂ） （Ａ）のアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基が、置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列、
（Ｃ） 配列番号２に示すアミノ酸配列、及び
（Ｄ） （Ｃ）のアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基が、置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列、
の何れかに示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
（Ｅ） 配列番号３に示すアミノ酸配列、又は
（Ｆ） （Ｅ）のアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基が、置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列
（Ｇ） 配列番号４に示すアミノ酸配列、及び
（Ｈ） （Ｇ）のアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基が、置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列、
の何れかに示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、
（Ｉ） 配列番号７に示すアミノ酸配列、又は
（Ｊ） （Ｉ）のアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基が、置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、並びに
（Ｋ） 配列番号８に示すアミノ酸配列、又は
（Ｌ） （Ｋ）のアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基が、置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、
からなる群より選択される少なくとも一つのＣＤＲを含有する抗体。

【0011】

Ｉ―２ 前記重鎖ＣＤＲ１及び前記重鎖ＣＤＲ２並びに／又は前記軽鎖ＣＤＲ１及び前記軽鎖ＣＤＲ２を含有する、Ｉ−１に記載する抗体。

【0012】

Ｉ−３ 更に、
（Ｍ） 配列番号５に示すアミノ酸配列、若しくは
（Ｎ） （Ｎ）のアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基が、置換、欠失、或いは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３及び／又は
（Ｏ） 配列番号９に示すアミノ酸配列、若しくは
（Ｐ） （Ｏ）のアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基が、置換、欠失、或いは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含有する抗体である、Ｉ−１又はＩ−２に記載する抗体。

【0013】

Ｉ−４ （Ｑ） 配列番号６に示すアミノ酸配列、若しくは
（Ｒ） （Ｑ）のアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸残基が、置換、欠失、或いは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び／又は
（Ｓ） 配列番号１０に示すアミノ酸配列、若しくは
（Ｔ） （Ｓ）のアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸残基が、置換、欠失、或いは付加されたアミノ酸配列からなる
軽鎖可変領域を含有する、Ｉ−１〜Ｉ−３の何れかに記載する抗体。

【0014】

Ｉ−５ Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、又はこれらを組み合わせた構造を有する抗体である、Ｉ−１〜Ｉ−４の何れかに記載する抗体。

【0015】

Ｉ−６ 定常領域を含む抗体である、Ｉ−１〜Ｉ−５の何れかに記載する抗体。

【0016】

Ｉ−７ イムノグロブリン、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ミニボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、又はこれらを組み合わせた構造を有する抗体である、Ｉ−１〜Ｉ−６に記載する抗体。

【0017】

Ｉ−８ 細胞障害活性を有する抗体である、Ｉ−１〜Ｉ−７の何れかに記載する抗体。

【0018】

Ｉ−９ 細胞障害活性が、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、及びＡＤＣＰの何れかの活性である、Ｉ−８に記載する抗体。

【0019】

Ｉ−１０ 多重特異性抗体である、Ｉ−１〜Ｉ−９の何れかに記載する抗体。

【0020】

Ｉ−１１ サイトトキシンが結合する抗体である、Ｉ−１〜Ｉ−１０の何れかに記載する抗体。

【0021】

ＩＩ．ポリヌクレオチド
ＩＩ−１ 上記Ｉ−１〜Ｉ−１１の何れかに記載する抗体をコードするポリヌクレオチド。

【0022】

ＩＩＩ．細胞
ＩＩＩ−１ 上記Ｉ−１〜Ｉ−１１の何れかに記載する抗体を産生する細胞。

【0023】

ＩＩＩ−２ 上記ＩＩ−１に記載するポリヌクレオチドを保持する細胞。

【0024】

ＩＶ．飲食品組成物
ＩＶ―１ 上記Ｉ―１〜Ｉ―１１の何れかに記載する抗体を含有する飲食品組成物。

【0025】

ＩＶ−２ ガン幹細胞の増殖を阻害するために使用される、上記ＩＶ−１に記載する飲食品組成物。

【0026】

ＩＶ―３ ガンの予防及び／又は治療のための、上記ＩＶ―１又はＩＶ−２に記載する飲食品組成物。

【0027】

Ｖ．医薬組成物
Ｖ―１ 上記Ｉ―１〜Ｉ―１１の何れかに記載する抗体を含有する医薬組成物。

【0028】

Ｖ−２ ガン幹細胞の増殖を阻害するために使用される、上記Ｖ−１に記載する医薬組成物。

【0029】

Ｖ―３ ガンの予防及び／又は治療のための、上記Ｖ―１又はＶ−２に記載する医薬組成物。

【0030】

ＶＩ．予防及び／又は治療方法
ＶＩ―１ ガンの罹患に対して予防を所望する生体に、上記Ｉ−１〜Ｉ〜１１の何れかに記載する抗体を投与する工程を含む、ガンの予防方法。

【0031】

ＶＩ―２ ガンに罹患した生体に、上記Ｉ−１〜Ｉ〜１１の何れかに記載する抗体を投与する工程を含む、ガンの治療方法。

【発明の効果】

【0032】

本発明の抗体は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外ドメインを特異的に認識することができる。このため、ガン幹細胞の自己増殖の阻害のために有用である。

【0033】

ガン細胞は、ガン幹細胞から分化するので、ガン幹細胞の自己増殖を阻害することにより、ガンを治療することができる。このような効果は、ガン細胞を分化させる基となるガン幹細胞への誘導を阻害することで奏される効果であることから、ガンの根治も期待できる効果であると言える。また、このようなメカニズムに鑑みると、本発明の抗体は、ガン細胞を発生させない効果、すなわち、ガンの予防効果を発揮する。これらの効果を期待して、本発明の抗体を、飲食品又は医薬の分野に採用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】図１は、実施例１にて作製した各種クローンの抗体の作成時に構築した発現ベクターの模式図である。図中のＶＨは重鎖可変領域をコードする塩基配列が配置されている事を示し、ＶＬは、軽鎖可変領域をコードする塩基配列が配置されている事を示す。

【図2】図２は、実施例１にて作製した各種クローンの抗体の作成時に構築した発現ベクターの模式図である。図中のＶＨ及びＶＬは、図１と同じである。

【図3】図３は、実施例２の実験結果を示す図である。グラフの縦軸はＨＰＲの発色の程度を示す５７０ｎｍの吸光度を示す。横軸は、ウェルに添加した＃３５クローンの培養上清の２倍希釈の回数を示し、番号が高くなるにつれて、希釈回数ば増加していることを示す。

【図4】図４は、実施例３の実験結果を示す図である。図中の（Ａ）は、膵臓ガン組織、（Ｂ）は、甲状腺ガン組織、（Ｃ）は、前立腺ガン組織、そして（Ｄ）は、胃ガン組織に対する、＃３５クローン抗体の結合である。上記（Ａ）〜（Ｄ）の各図面の上端は、＃３５クローン抗体及び二次抗体による染色像であり、下段は、二次抗体のみによる染色像である。また、上記（Ａ）〜（Ｄ）の各図面の（ａ）は、（ｂ）及び（ｃ）の重ね合わせ、（ｂ）は、＃３５クローン抗体を使用した染色像、（ｃ）は、ＤＡＰＩ染色像である。

【図5】図５は、実施例３の実験結果を示す図である。図中の（Ａ）及び（Ｂ）は、胃ガン組織、（Ｃ）及び（Ｄ）は、子宮頸ガン組織に対する、＃３５クローン抗体の結合である。上記（Ａ）〜（Ｄ）の各図面の上端及び下段、並びに（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）は、図３と同じである。

【図6】図６は、実施例３の実験結果を示す図である。図中の（Ａ）及び（Ｃ）は、子宮頸ガン組織、（Ｂ）は、大腸ガン組織、そして（Ｄ）は、乳ガン組織に対する、＃３５クローン抗体の結合である。上記（Ａ）〜（Ｄ）の各図面の上端及び下段、並びに（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）は、図３と同じである。

【図7】図７は、実施例４の実験結果（定量ＰＣＲ）を示す図である。図中の縦軸は、ガン幹細胞マーカーであるＳＯＸ２、ｃ-Ｍｙｃ、ＯＣＴ３/４、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧの、ＧＡＰＤＨに対する相対発現量を示す。

【図8】図８は、実施例４の実験結果（ＭＴＴアッセイ）を示す図である。図中の縦軸は、５７０ｎｍのＳＯＸ２、ｃ-Ｍｙｃ、ＯＣＴ３/４、ＫＬＦ４、及びＮＡＮＯＧの、ＧＡＰＤＨに対する相対発現量を示す。

【発明を実施するための形態】

【0035】

以下、本発明について、更に詳細に説明する。以下の説明にて使用する用語「含む」又は「含有する」は、「本質的にからなる」及び、「からなる」と意味を包含する。なお、用語「質量」は、「重量」と読み替えることができる。

【0036】

１．抗体
本発明の抗体は、ヒト由来であり、且つ、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外領域を特異的に認識するモノクローナル抗体である。本発明の抗体がヒトＣｒｉｐｔｏ−１を特異的に認識することは、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１のホモログ又はオルソログがヒトＣｒｉｐｔｏ−１と同一の系内に存在する状況下において、本発明の抗体が、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１のホモログ又はオルソログを認識しないこと（ヒトＣｒｉｐｔｏ−１を選択的に認識すること）を意味しているのではなく、これらのホモログ又はオルソログより、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１を、より強く認識すること、または、これらのホモログ又はオルソログに対する親和性より、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１に対する親和性のほうが高いことを意味する。したがって、本発明にて使用する「特異的」との用語は、「選択的」との意味とは全く異なって理解される。

【0037】

本発明の抗体は、以下に詳述するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ１、及び軽鎖ＣＤＲ２からなる群より選択される少なくとも１つのＣＤＲを含有する抗体である。

【0038】

・重鎖ＣＤＲ１
本発明の抗体に含有される重鎖ＣＤＲ１は、以下の（Ａ）〜（Ｄ）の何れかに示すアミノ酸配列からなる。

【0039】

（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列。
（Ｂ） （Ａ）のアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列。
（Ｄ） （Ｃ）のアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列。

【0040】

上記する（Ｂ）又は（Ｄ）の、欠失、置換、又は付加されるアミノ酸残基数は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外ドメインを特異的に認識する効果を発揮する範囲に限り、特に限定されない。上記する置換とは、保存的な置換であることが好ましい。

【0041】

用語「保存的な置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。

【0042】

・重鎖ＣＤＲ２
本発明の抗体に含有される重鎖ＣＤＲ２は、以下の（Ｅ）〜（Ｈ）の何れかに示すアミノ酸配列からなる。

【0043】

（Ｅ） 配列番号３に示すアミノ酸配列。
（Ｆ） （Ｅ）のアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列。
（Ｇ） 配列番号４に示すアミノ酸配列。
（Ｈ） （Ｇ）のアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列。

【0044】

上記する（Ｆ）又は（Ｈ）の、欠失、置換、又は付加されるアミノ酸残基数は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外ドメインを特異的に認識する効果を発揮する範囲に限り、特に限定されない。上記する置換とは、保存的な置換であることが好ましい。

【0045】

・軽鎖ＣＤＲ１
本発明の抗体に含有される軽鎖ＣＤＲ１は、以下の（Ｉ）又は（Ｊ）に示すアミノ酸配列からなる。

【0046】

（Ｉ） 配列番号７に示すアミノ酸配列。
（Ｊ） （Ｉ）のアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列。

【0047】

上記する（Ｊ）の、欠失、置換、若しくは付加されるアミノ酸残基数は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外ドメインを特異的に認識する効果を発揮する範囲に限り、特に限定されない。上記する置換とは、保存的な置換であることが好ましい。

【0048】

・軽鎖ＣＤＲ２
本発明の抗体に含有される軽鎖ＣＤＲ２は、以下の（Ｋ）又は（Ｌ）に示すアミノ酸配列からなる。

【0049】

（Ｋ） 配列番号８に示すアミノ酸配列。
（Ｌ） （Ｌ）のアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列。

【0050】

上記する（Ｌ）の欠失、置換、若しくは付加されるアミノ酸残基数は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外ドメインを特異的に認識する効果を発揮する範囲に限り、特に限定されない。上記する置換とは、保存的な置換であることが好ましい。

【0051】

本発明の抗体のより好ましい態様として、上記する抗体に、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ３、又は重鎖ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ３を含有する態様を挙げることができる。このような重鎖ＣＤＲ３は、以下の（Ｍ）又は（Ｎ）に示すアミノ酸配列からなる。

【0052】

（Ｍ） 配列番号５に示すアミノ酸配列。
（Ｎ） （Ｍ）のアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列。

【0053】

上記する（Ｎ）の欠失、置換、若しくは付加されるアミノ酸残基数は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外ドメインを特異的に認識する効果を発揮する範囲に限り、特に限定されない。上記する置換とは、保存的な置換であることが好ましい。

【0054】

また、上記する軽鎖ＣＤＲ３は、以下の（Ｏ）又は（Ｐ）に示すアミノ酸配列からなる。

【0055】

（Ｏ） 配列番号９に示すアミノ酸配列。
（Ｐ） （Ｏ）のアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列。

【0056】

上記する（Ｐ）の欠失、置換、若しくは付加されるアミノ酸残基数は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外ドメインを特異的に認識する効果を発揮する範囲に限り、特に限定されない。また、置換とは、保存的な置換であることが好ましい。

【0057】

本発明の抗体の更に好ましい態様として、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、又は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含有する態様を挙げることができる。このような重鎖可変領域は、以下の（Ｑ）又は（Ｒ）に示すアミノ酸配列からなる。

【0058】

（Ｑ） 配列番号６からなるアミノ酸配列。
（Ｒ） （Ｑ）に示すアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列。

【0059】

上記する（Ｒ）の欠失、置換、若しくは付加されるアミノ酸残基数は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外ドメインを特異的に認識する効果を発揮する範囲に限り、特に限定されない。例えば、１〜４５個が好ましく、より好ましくは１〜４０個、１〜３５個、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個であり、１〜２個が最も好ましい。

【0060】

なお、このように重鎖可変領域において欠失、置換、若しくは付加されるアミノ酸残基は、ＦＲのアミノ酸残基であることが好ましい。上記する置換とは、保存的な置換であることが好ましい。

【0061】

上記する軽鎖可変領域は、以下の（Ｓ）又は（Ｔ）に示すアミノ酸配列からなる。

【0062】

（Ｓ） 配列番号１０に示すアミノ酸配列。
（Ｔ） （Ｏ）のアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列。

【0063】

上記する（Ｐ）の欠失、置換、若しくは付加されるアミノ酸残基数は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外ドメインを特異的に認識する効果を発揮する範囲に限り、特に限定されない。例えば、１〜４５個が好ましく、より好ましくは１〜４０個、１〜３５個、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個であり、１〜２個が最も好ましい。

【0064】

なお、このように軽鎖可変領域において欠失、置換、若しくは付加されるアミノ酸残基は、ＦＲのアミノ酸残基であることが好ましい。上記する置換とは、保存的な置換であることが好ましい。

【0065】

本発明の抗体の構造は、上記するアミノ酸配列を含有し、且つ、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外領域を特異的に認識する範囲において、特に限定されない。例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ディアボディ、トリアボディ、又はテトラボディ等の構造を挙げることができる。また、これらを適宜組み合わせた構造を有していてもよい。このような構造を有する抗体は、抗体断片と呼ばれることもある。

【0066】

本発明の抗体には、定常領域を含有させることもできる。定常領域の由来は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外領域を特異的に認識する範囲において、特に限定されない。例えば、大量生産が可能な動物種、ヒトに近縁する動物種、ヒトに投与しても、免疫原性を生じさせにくい動物種を挙げることができ、具体的に、ヒト由来、マウス由来、ラット由来、ウサギ由来、ロバ由来、サル由来、チンパンジーを挙げることができる。

【0067】

このような定常領域を含有する抗体の構造は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外領域を特異的に認識する範囲において、特に限定されない。例えば、イムノグロブリン、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ミニボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ等を挙げることができる。また、これらを適宜組み合わせた構造を有していてもよい。このような構造を有する抗体も、抗体断片と呼ばれることもある。

【0068】

上記するイムノグロブリンのサブタイプは、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定されない。例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ等を挙げることができる。中でも、本発明の効果をより発揮することに鑑みて、ＩｇＧであることが好ましい。

【0069】

上記するＩｇＧのサブクラスは、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定されない。例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４等を挙げることができる。本発明の効果をより発揮することに鑑みて、ＩｇＧ_１であることが好ましい。

【0070】

本発明の抗体には、細胞障害活性を有する抗体も包含される。細胞障害活性とは、目的とする細胞（例えば、ガン幹細胞等）に対して毒性を及ぼす活性であればよく、具体的に該細胞を死に至らしめる効果もこれに包含され得る。このような細胞障害活性は、本発明の効果を奏する範囲において、特に限定されない。具体的には、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、及びＡＤＣＰ等を挙げることができる。

【0071】

上記するＡＤＣＣ活性とは、抗体依存性細胞傷害活性とも呼ばれる活性である。この活性は、抗体がマクロファージ、ＮＫ細胞、好中球、又は好酸球等のエフェクター細胞を、その近傍にリクルートし、斯かるエフェクター細胞を介して、その抗体の近傍に存在する細胞に障害を与える活性であると当業者に理解される。このようなＡＤＣＣ活性の程度を測定する方法は、公知の方法を採用することができる。具体的には、Ｋｉｍｕｒａ ＭらのＣａｎｃｅｒ Ｓｃｉ｜Ａｕｇｕｓｔ ２００７ ｖｏｌ．９８ ｎｏ．８ １２７５−１２８０．等の公知の文献に記載の方法を適宜改変して測定することができる。

【0072】

また、ＡＤＣＣ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｂｉｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＡＤＣＣ活性を測定することも可能である。その他の測定方法として、例えば、血液の白血球画分等を標的細胞と混合させることによって生じる細胞障害を、ＬＤＨ漏れ出し量の測定又はＷＳＴ−８等を用いた細胞の生存活性等に数値化することにより測定することもできる。

【0073】

上記するＣＤＣ活性とは、補体依存性細胞傷害活性とも呼ばれる活性である。この活性は、抗体がその近傍に補体をリクルートし、斯かる補体を介して、その抗体の近傍に存在する細胞に障害を与える活性であると当業者に理解される。このようなＣＤＣ活性の程度を測定する方法は、公知の方法を採用することができる。具体的には、ＡＤＣＣ活性の測定にて上記した文献等に記載する公知の方法を適宜改変して測定することができる。具体的には、血清を細胞に添加し、血清中の補体による細胞障害の程度を測定することにより測定可能である。

【0074】

上記するＡＤＣＰ活性とは、抗体依存性細胞貪食活性とも呼ばれる活性である。この活性は、抗体がその近傍にマクロファージをリクルートし、その抗体の近傍に存在する細胞を、リクルートされたマクロファージにより貪食する活性であると当業者に理解される。このようなＡＤＣＰ活性の程度を測定する方法は、公知の方法を採用することができる。

【0075】

本発明の抗体は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１以外の１以上の抗原を特異的に認識する部位を有していてもよい。即ち、本発明の抗体は、多重特異性抗体とすることもできる。このような抗原とは、本発明の効果を奏する範囲において、特に限定されない。

【0076】

本発明の抗体は、サイトトキシンが結合した複合体として使用することもできる。このようなサイトトキシンは、特に限定されない。例えば、本発明の効果を奏する範囲において、抗体に結合する公知のサイトトキシンから適宜選択することができる。具体的には、エムタンシン（ＤＭ１）、オゾガマイシン（カリケアミシン類）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、デュオカルマイシン類、アマニチン（ＡＡＭＴ）、アドゼルシン、ビゼルシン、カルゼルシン（Ｕ−８０２４４）、ＰＮＵ１５９６８２（ネモルビシン類）等を挙げることができる。 本発明の抗体は、後記する本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを慣用の遺伝子工学的な手段を用いて構築し、斯かる発現ベクターを抗体の産生に適した宿主細胞又は無細胞発現系に導入する手段により、当業者であれば容易に製造することができる。製造した抗体は適宜、慣用の精製工程に供することで純度の高い状態として得ることも可能である。

【0077】

本発明のヒトに由来する抗体は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１を特異的に認識することができる。また、本発明の抗体は、ガン幹細胞の増殖を阻害する効果を発揮する。ガン細胞は、ガン幹細胞から分化するので、本発明の抗体は、ガンの予防及び／又は治療効果を発揮する。このような効果を発揮することを期待して、本発明の組成物を、例えば、飲食品又は医薬の分野で用いることができる。

【0078】

２．ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、上記する本発明の抗体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドである。このようなポリヌクレオチドは、特に限定されない。例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、核酸ペプチド、又はこれらの公知の修飾物であってもい。このようなポリヌクレオチドは、一本鎖の形状であっても、二本鎖の形状であってもよい。

【0079】

上記するポリヌクレオチドの塩基配列は、当業者であれば、例えば上記する抗体のアミノ酸配列を基に、インシリコで適宜決定することができる。このような塩基配列を決定するのに使用されるコドンの種類は問わない。ポリヌクレオチドを使用する宿主のコドン頻度を勘案して、塩基配列を決定することが好ましい。

【0080】

なお、本発明のポリヌクレオチドは、種々のベクター内に含有されることもできる。このようなベクターは、特に限定されない。例えば、発現ベクター、クローニングベクター等が挙げられる。

【0081】

３．細胞
本発明の細胞は、上記する本発明の抗体を産生する細胞である。このような抗体の産生は、細胞内での産生であってもよいし、細胞外の産生（分泌産生）であってもよい。

【0082】

本発明の細胞は、上記する本発明のポリヌクレオチドを保持している事が好ましい。用語「保持している」とは、細胞内に本発明のポリヌクレオチドが存在する状態を維持することをいい、該細胞が、積極的か受動的かどうかに関わらず、上記ポリヌクレオチドを細胞外に排出しない状態であることを意味する。

【0083】

本発明の細胞は、抗体産生に適した公知の細胞から適宜選択することができ、特に限定されない。例えば、大腸菌、放線菌等の原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞等の真核細胞等が挙げられる。

【0084】

４．飲食品組成物
本発明の飲食品組成物に含有される有効成分は、上記するヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外領域を特異的に認識する、ヒト由来抗ヒトＣｒｉｐｔｏ−１モノクローナル抗体である。

【0085】

本発明の飲食品組成物に含有される有効成分の量は、本発明の効果を奏する範囲において、特に限定されない。具体的に、１００質量％の飲食品組成物に対する有効成分の含有量を、０．００１〜１００質量％程度とすることができる。

【0086】

本発明の飲食品組成物には、特定保健用食品、機能性表示食品、及び栄養機能食品等の保健機能食品（飲料を含む）；栄養補助食品、健康補助食品、及び栄養調整食品等；並びに一般食品（飲料を含む）の何れもが包含されるものとすることができる。また、本発明の飲食品組成物には、家畜用飼料、養魚用飼料、及びペットフード等の愛玩動物用飼料等の飼料も包含することができる。これらの飲食品組成物は、慣用の飲食物の形状を有していればよく、例えば、一般の食品、飲料の形態（明らか食品）のほか、幹細胞からガン幹細胞への誘導を抑制する効果を奏することを、飲食品の機能として謳うことのできる特定保健用食品、又は機能性表示食品とすることができる。具体的に、本発明の飲食品組成物は、がん細胞の減少に役立つ、がん幹細胞の減少に役立つ、がん細胞の進行抑制に役立つがん幹細胞の進行抑制に役立つ、及びがん幹細胞を減少させてがんの進行抑制に役立つ等と謳うことができる。

【0087】

本発明の飲食品組成物の形状は、本発明の効果を奏する範囲において、特に限定されない。例えば、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料；アイスクリーム、かき氷等の冷菓；ガム、チョコレート、飴、錠菓、スナック菓子、ゼリー、ジャム、クリーム、グミ等の菓子；そば、うどん、即席麺、中華麺等の麺；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産又は畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、マヨネーズ、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂、又は油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、サラダ、惣菜、漬物、パン、又はシリアル等を挙げることができる。

【0088】

本発明の飲食品組成物は、例えば、粉末、顆粒、カプセル、トローチ、又は錠剤（タブレット）等の固形製剤；シロップ又はドリンク等の液体製剤等、一般にサプリメントとして提供される製剤形態とすることもできる。

【0089】

本発明の飲食品組成物の摂取させる対象は、ガン幹細胞に誘導し得る幹細胞を保持する生体であって、幹細胞からガン幹細胞への誘導を抑制することを所望する生体である限り、特に限定されない。

【0090】

例えば、ヒトの他、ウシ、ブタ、イノシシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ロバ、クマ、トナカイ、ウサギ、トナカイ、及びカエル等の家畜；ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、バリケン、ウズラ、ダチョウ、ハト、キジ、カモ、及びウ等の家禽；魚類、甲殻類、軟体動物等の養殖海産物；ハチ及びカイコ等の飼育昆虫；イヌ、ネコ、げっ歯類、ウサギ、サル、ブタ等、オウム、インコ、ヘビ、ワニ、カメ、サンショウウオ、観賞魚（金魚及び熱帯魚等）、カブトムシ、クワガタムシ、クモ、サソリ等の愛玩動物を挙げることができる。

【0091】

本発明の飲食品組成物の摂取量は、適用対象の性別、年齢、当該飲食品組成物の適用形態、所望する効果の程度等に基づいて適宜設定することができ、特に限定されない。例えば、体重５０ｇのマウスであれば、本発明の飲食品組成物の有効成分を、一日当たり、１ｐｍｏｌ〜１μｍｏｌ程度となる量で摂取させることができる。なお、マウス以外の対象に対する摂取量は、上記する数値範囲を基に、その対象の体重等を勘案して、適宜設定することができる。

【0092】

本発明の飲食品組成物を摂取させる間隔も、適用対象の性別、年齢、当該飲食品組成物の適用形態、所望する効果の程度等に基づいて適宜設定することができ、特に限定されない。例えば、上記する本発明の飲食品組成物を、一日一回で摂取させてもよいし、２〜３回の複数回の間隔に分けて摂取させてもよい。また、数日〜数週間に一回の間隔で摂取させることもできる。

【0093】

５．医薬組成物
本発明の医薬組成物に含有される有効成分は、上記するヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外ドメインを特異的に認識する、ヒト由来抗ヒトＣｒｉｐｔｏ−１モノクローナル抗体である。

【0094】

本発明の医薬組成物に含有される有効成分の量は、本発明の効果を奏する範囲において、特に限定されない。具体的に、１００質量％の医薬組成物に対する有効成分の含有量を、０．００１〜１００質量％程度とすることができる。

【0095】

本発明の医薬組成物は、上記有効成分と、薬学分野の組成物を製造する際に使用される、薬学的に許容可能な公知の担体又は添加物とを配合することによって、製造することができる。斯かる担体又は添加物は、本発明の効果を奏する範囲において、特に限定されない。例えば、任意の担体、希釈剤、賦形剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、媒体、送達システム、乳化剤、錠剤分解物質、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、香料、又は甘味料等を挙げることができる。

【0096】

本発明の医薬組成物は、上記する担体又は添加物を適宜組み合わせた、種々の剤形とすることができる。よって、本発明の医薬組成物の剤形は、本発明の効果を奏する範囲において、特に限定されない。具体的には、輸液剤、埋め込み注射剤、マイクロニードル、又は持続性注射剤等の注射剤；腹膜透析用剤又は血液透析用剤等の透析用剤；硬カプセル錠又は軟カプセル錠等のカプセル剤；シロップ剤、経口ゼリー剤、トローチ剤、舌下錠、バッカル錠、付着錠、又はガム剤等の口腔用錠剤；口腔用スプレー剤、口腔用半固形剤、含嗽剤、吸入粉末剤、吸入液剤、又は吸入エアゾール剤等の吸入剤；眼軟膏剤等の点眼剤；点耳剤；点鼻粉末剤又は点鼻液剤等の点鼻剤等を挙げることができる。

【0097】

本発明の医薬組成物の投与方法は、上記する各剤形に最適化される公知の投与方法である限り、特に限定されない。具体的には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、蜘蛛膜下腔内投与、皮内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、肺内投与、眼内投与、腟内投与、頸部内投与、直腸内投与、又は皮下投与等を挙げることができる。

【0098】

なお、本発明の医薬組成物の投与対象は、ガン幹細胞に誘導し得る幹細胞を保持する生体（ガンに罹患する可能性がある生体）であって、幹細胞からガン幹細胞への誘導を抑制することを所望する生体（ガンの予防及び／又は治療されることを所望する生体）である限り、特に限定されない。具体的には、上記する飲食品組成物を摂取させる対象と同様にすることができる。

【0099】

本発明の医薬組成物の投与量は、本発明の効果を奏する範囲において、特に限定されない。具体的には、適用対象の性別や年齢、当該医薬組成物の適用形態、所望する効果の程度などに基づいて、適宜設定することができる。例えば、体重５０ｇのマウスであれば、本発明の医薬組成物の有効成分を、一日当たり、１ｐｍｏｌ〜１μｍｏｌ程度となる量で投与することができる。なお、マウス以外の対象に対する投与量は、上記する数値範囲を基に、その対象の体重等を勘案して、適宜設定することができる。

【0100】

本発明の飲食品組成物の投与間隔も、適用対象の性別、年齢、当該飲食品組成物の適用形態、所望する効果の程度等に基づいて適宜設定することができ、特に限定されない。例えば、上記する本発明の飲食品組成物を、一日一回の投与としてもよいし、２〜３回の複数回の間隔に分けて投与してもよい。また、数日〜数週間に一回の間隔の投与とすることもできる。

【0101】

６．予防及び／又は治療方法
本発明の予防方法は、ガンの罹患に対して予防を所望する生体に、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外領域を特異的に認識する、ヒト由来抗ヒトモノクローナル抗体を投与する工程を含む、ガンの予防方法である。

【0102】

本発明の治療方法は、ガンに罹患した生体に、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外領域を特異的に認識するヒト由来抗ヒトモノクローナル抗体を投与する工程を含む、ガンの治療方法である。

【0103】

ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外領域を特異的に認識するヒト由来抗ヒトモノクローナル抗体は、上記する１．抗体の記載を参考にすることができる。

【0104】

本発明の具体的な予防及び治療方法は、上記する１．抗体、４．飲食品組成物、及び５．医薬組成物の記載を参考にすることができる。

【実施例】

【0105】

以下に、本発明をより詳細に説明するための実施例を示す。なお、本発明が以下の実施例に記載する発明に限定されないのは言うまでもない。

【0106】

実施例１ 抗ヒトＣｒｉｐｔｏ−１抗体のスクリーニング
ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外ドメインを特異的に認識する抗体を、ファージ提示型ヒト抗体ライブラリーから、スクリーニングした。このようなヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外ドメインは、配列番号１１に示すアミノ酸配列からなり、そのN末端側に、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるHisタグ配列が設けられている。Ａｌａｍ．ｅｔ．ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１８，２６；１９（１１）に記載の方法に従って、可溶化型として調製した。スクリーニング対象として使用した抗体ライブラリーは、（Ｓａｋａｉ，Ｋ．，ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４６（１）：２５３-６２）に記載された抗体ライブラリーであり、斯かる抗体のサブクラスはＩｇＧである。

【0107】

その結果、精製ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の細胞外ドメインを特異的に認識する抗体として、＃３５クローンのファージ株を得ることができた。このクローンから抗体をコードする塩基配列を解析し、その結果を基にして、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域等のアミノ配列を、ＩｇＢｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）及びＶｂａｓｅ２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ）によって解析した。これらの結果を以下の表１に示す。なお、ＶＨ−ＣＤＲ１又は２において、二つのアミノ酸配列が記載されている箇所は、そのどちらのアミノ酸配列であってもよいことを示している。

【0108】

【表1】

【0109】

この抗体を得るために、上記する＃３５クローンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする塩基配列を、抗体発現用ベクターに組み込むことにより、ｐＨＩｇＨ５ｚｅｏベクター、ｐＨＩｇＬ５ｈｙｇ、及びｐＴＸ７ｚ−ＨｉｇＧ１Ｌ−＃３５、を作製した（図１及び２）。これらのベクターを一過性にＣＨＯ細胞に導入し、＃３５クローン抗体を分泌産生させた。最後に、定法によりＣＨＯ細胞の培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムを用いて抗体を精製し、ダルベッコ生理的リン酸緩衝液に溶媒を置換した。

【0110】

実施例２ ＥＬＩＳＡによる抗原認識能の評価
上記する＃３５クローン抗体の培養上清を採取し、これをリン酸緩衝液で２５倍に希釈し、さらに２倍毎の連続希釈を行った。これを９６ウェルプレートに添加し、各ウェルに吸着したＩｇＧ分子（ヒト由来抗ヒトＣｒｉｐｔｏ−１抗体）を、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧヤギ抗体（Ａｂｃａｍ社製）によって検出した。その結果を図２に示す。

【0111】

図１に示すように、ＨＲＰに起因する発色が、＃３５クローン抗体を含有する培養上清の希釈の程度に従って低下することが見て取れるので、＃３５クローン抗体が、その抗原であるヒトＣｒｉｐｔｏ−１に特異的に吸着していることが確認できた。

【0112】

実施例３ 組織アレイを用いたガン組織（ヒト）に対する特異性評価
ヒト癌組織アレイ（ＵＳ Ｂｉｏｍａ社製ＢＣＮ８０１）に対して、免疫染色を行った。一次抗体として、上記する＃３５クローンを用いた。２次抗体として、ＡＬＥＸＡ５６８標識抗ヒトＩｇＧヤギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、各ガン組織（膵臓ガン組織、甲状腺ガン組織、前立腺ガン組織、胃ガン組織、子宮頸ガン組織、大腸ガン組織、及び乳ガン組織）におけるヒトＣｒｉｐｔｏ−１の検出を行った。これらのガン組織には、ガン細胞と共にガン幹細胞も含まれ、斯かるガン幹細胞の細胞膜表面上に、Ｃｒｉｐｔｏ−１がＧＰＩアンカーで結合していると考えられる。陰性対照実験として、上記２次抗体のみを用いてシグナルのバックグラウンドの確認を行った。これらの結果を、図３〜５に示す。

【0113】

図３〜５に示すように、上記する全てのガン組織に対して、＃３５クローン抗体による染色像が確認された。

【0114】

実施例４ ガン幹細胞に対する抗体による効果
ガン幹細胞の増殖に対する効果は、３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）を用いて評価した。ここでガン幹細胞として使用したＵ２５１ＭＧ ＳＣ１細胞は、以下に示す方法によって作製した。

【0115】

欧州のＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）から入手した脳腫瘍細胞であるＵ２５１ＭＧ細胞を、ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ，メス）に皮下移植して腫瘍を形成させた。次いで、この腫瘍を採取し、常法に従って培養し、この腫瘍細胞からヒアルロン酸依存的に増殖する細胞を指標にスクリーニングすることで、Ｕ２５１ＭＧ ＳＣ１細胞を得た。

【0116】

このような方法で得たＵ２５１ＭＧ ＳＣ１細胞株のガン幹細胞性を確認するために、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ、ＯＣＴ３/４、ＫＬＦ４、及びＮＡＮＯＧ遺伝子の発現を確認する実験を、各遺伝子を認識するプローブを用いた定量ＰＣＲ法により、常法に従って行った。ここで、定量ＰＣＲ法にて使用した各遺伝子を認識するプローブの塩基配列は、以下の表２に示す通りである。なお、内部標準として、ＧＡＰＤＨを使用した。この結果を図７に示す。

【0117】

【表2】

【0118】

図７に示すように、スクリーニング前のＵ２５１ＭＧ細胞は、ＯＣＴ３/４及びＮＡＮＯＧの発現が検出できなかったのに対して、スクリーニング後のＵ２５１ＭＧ ＳＣ１細胞は、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ、ＯＣＴ３/４、ＫＬＦ４、及びＮＡＮＯＧ遺伝子の全ての発現を確認することができた。従って、Ｕ２５１ＭＧ細胞からスクリーニングにより得られたＵ２５１ＭＧ ＳＣ１細胞は、ガン幹細胞性を有する細胞株であることが明らかとなった。

【0119】

次いで、このようにスクリーニングにより得られたＵ２５１ＭＧ ＳＣ１細胞に対する、＃３５クローン抗体による自己複製能（増殖）阻害効果を確認するＭＴＴアッセイを行った。

【0120】

まず、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ１６４０に懸濁した細胞を９６−ｗｅｌｌプレートに、５×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。５％ＣＯ_２、３７℃の条件下で２４時間培養後、系列希釈を行った上記＃３５クローン抗体の溶液を各ウエルに添加して、さらに７２時間培養を継続した。その後、５ｍｇ／ｍＬでＰＢＳに溶かしたＭＴＴを終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるように添加して４時間培養後に形成されたフォルマザンを０．０２ＮのＨＣｌに溶解した１０％ｗ／ｖＳＤＳを加えて３７℃で一昼夜かけて溶解した。この溶液の５４０ｎｍの吸収を測定して細胞の生存度を評価した。この結果を図８に示す。

【0121】

図８に示すように、ガン幹細胞としてＵ２５１ＭＧからスクリーニングにより得られたＵ２５１ＭＧ ＳＣ１細胞株は、＃３５クローン抗体の存在下で増殖が阻害され、その濃度が高くなるにつれて、より阻害されることが明らかとなった。従って、＃３５クローン抗体は、ガン幹細胞の増殖を阻害する効果を発揮することが明らかとなった。

【0122】

ガン幹細胞は、例えば、低吸着ディッシュのような非接着環境下で培養すると、スフィア形成する特徴を有することが知られている。そこで、＃３５クローン抗体による、ガン幹細胞の増殖を阻害する効果を確認するための実験として、ガン幹細胞のスフィア形成数を測定する実験を、非特許文献４の図４Ａに記載する方法を参考にして行った。具体的に使用したガン幹細胞は、ＮＴＥＲＡ２ ｃｌｏｎｅ Ｄ１（ＥＡＣＣ株番号：０１０７１２２１）であり、この細胞を使用したスフィア形成数を測定する実験によっても、上記する図８に示すように、＃３５クローン抗体が、ガン幹細胞の増殖を阻害する効果を発揮することが明らかとなった（データ示さず）。

【要約】

【課題】ガン幹細胞を抑制する技術の開発
【解決手段】ヒト由来抗ヒトＣｒｉｐｔｏ−１抗体の提供。
【選択図】 なし

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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