特許 6763780 合成脳浸透遺伝子ベクターの操作

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6763780

(24)【登録日】2020年9月14日

(45)【発行日】2020年9月30日

(54)【発明の名称】合成脳浸透遺伝子ベクターの操作

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7088 20060101AFI20200917BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20200917BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20200917BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20200917BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20200917BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20200917BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/7088

   A61K9/14

   A61K47/34

   A61K47/42

   A61K47/10

   A61K47/26

【請求項の数】25

【全頁数】57

(21)【出願番号】特願2016-567385(P2016-567385)

(86)(22)【出願日】2015年5月12日

(65)【公表番号】特表2017-515839(P2017-515839A)

(43)【公表日】2017年6月15日

(86)【国際出願番号】US2015030381

(87)【国際公開番号】WO2015175539

(87)【国際公開日】20151119

【審査請求日】2018年3月12日

(31)【優先権主張番号】62/001,994

(32)【優先日】2014年5月22日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/991,898

(32)【優先日】2014年5月12日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/991,920

(32)【優先日】2014年5月12日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】398076227

【氏名又は名称】ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(72)【発明者】

【氏名】ヘインズ， ジャスティン

(72)【発明者】

【氏名】スク， ジュン ソ

(72)【発明者】

【氏名】マストラコス， パナギオティス

(72)【発明者】

【氏名】ウッドワース， グレアム

(72)【発明者】

【氏名】ザン， クラーク

【審査官】 新熊 忠信

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／１０９３６３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特表２００４−５０２７０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００３−５３１１６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Science Translational Medicine，２０１２年，Vol.4, No.145-149，p.192-199

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−３３／４４

Ａ６１Ｋ ９／００− ９／７２

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／６９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

脳実質への核酸の送達のためのナノ粒子製剤であって、該ナノ粒子が
核酸と、
第１の親水性カチオン性ポリマーと、
ポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコールを含むコポリマーからなる群から選択される第２の親水性中性電荷直鎖状または分岐状ポリマーと
を含み、
（ｉ）該第１の親水性カチオン性ポリマーの９０％〜７５％が、該第２の親水性中性電荷直鎖状ポリマーにコンジュゲートされ、該第１の親水性カチオン性ポリマーの残りの割合が、該第２の親水性中性電荷直鎖状ポリマーに非コンジュゲートのままであり、該第１の親水性カチオン性ポリマーに対する該第２の親水性中性電荷直鎖状ポリマーのモル比が、８を超えるか、または
（ｉｉ）該第１の親水性カチオン性ポリマーの少なくとも５０％が、該第２の親水性中性電荷分岐状ポリマーにコンジュゲートされており、
該核酸が、該ナノ粒子内に被包され、もしくは該ナノ粒子の表面に会合しており、該ナノ粒子が、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍの平均直径を有し、ほぼ中性の電荷を付与し、該脳実質にわたる拡散率を増強する密度の該第２の親水性中性電荷直鎖状または分岐状ポリマーでコーティングされているナノ粒子製剤。

【請求項2】

前記ナノ粒子製剤が、前記脳実質内へ直接的に投与されるか、または全身投与もしくは鼻腔内に投与されることを特徴とする、請求項１に記載のナノ粒子製剤。

【請求項3】

１１４ｎｍ未満の、１００ｎｍ未満のまたは５０ｎｍ未満の、あるいは１１４ｎｍ、１００ｎｍまたは５０ｎｍに等しい直径を有する、請求項１に記載のナノ粒子製剤。

【請求項4】

前記第１の親水性カチオン性ポリマーまたは第２の中性電荷親水性ポリマーが、分岐している、請求項１に記載のナノ粒子製剤。

【請求項5】

前記第２の親水性ポリマーが、１，０００ダルトン〜１０，０００ダルトンの間の分子量を有するポリエチレングリコールである、請求項１に記載のナノ粒子製剤。

【請求項6】

前記ポリエチレングリコールが、５，０００ダルトンの分子量を有する、請求項５に記載のナノ粒子製剤。

【請求項7】

前記第１の親水性カチオン性ポリマーが、１０，０００ダルトン〜５０，０００ダルトンの間の分子量を有する分岐状ポリエチレンイミンである、請求項１に記載のナノ粒子製剤。

【請求項8】

ポリマー中の窒素対核酸中のリン（phosphorous）（Ｎ／Ｐ）比が、少なくとも２である、請求項７に記載のナノ粒子製剤。

【請求項9】

前記第１の親水性カチオン性ポリマーが、ポリ−Ｌリシンである、請求項１に記載のナノ粒子製剤。

【請求項10】

前記第２の中性電荷親水性ポリマーが、５，０００ダルトンの分子量を有する個々の分岐を含む分岐状ポリエチレングリコールである、請求項９に記載のナノ粒子製剤。

【請求項11】

前記ポリ−Ｌリシンの少なくとも５０％が、ポリエチレングリコールにコンジュゲートされている、請求項１０に記載のナノ粒子製剤。

【請求項12】

前記第２の中性電荷親水性ポリマーの質量が、前記粒子の質量の少なくとも１／１０，０００、１／７５００、１／５０００、１／４０００、１／３４００、１／２５００、１／２０００、１／１５００、１／１０００、１／５００、１／２５０、１／２００、１／１５０、１／１００、１／７５、１／５０、１／２５、１／２０、１／５、１／２または９／１０である、請求項１に記載のナノ粒子製剤。

【請求項13】

前記ナノ粒子が、マンニトールのような浸透圧媒体において製剤化されて、前記脳内への取り込みを増強する、請求項１に記載のナノ粒子製剤。

【請求項14】

前記脳への治療剤の送達のための投薬製剤であって、
該脳への投与のための請求項１〜１３のいずれか一項に記載の治療有効量のナノ粒子、および
該脳内への送達のための薬学的に許容される賦形剤
からなる製剤。

【請求項15】

前記ナノ粒子が、対流増強送達を使用した前記脳への直接的投与のために製剤化されている、請求項１４に記載の製剤。

【請求項16】

前記ナノ粒子が、前記脳への全身性または鼻腔内投与のために製剤化されている、請求項１４に記載の製剤。

【請求項17】

前記ナノ粒子が、少なくとも１０分間、２０分間、３０分間、１時間、２時間、４時間、６時間、１０時間、１日間、３日間、７日間、１０日間、２週間、１ヶ月間またはそれより長い期間にわたって、有効量の前記核酸を放出する、請求項１４に記載の製剤。

【請求項18】

前記脳への核酸の送達のための、親水性ポリマーで高密度にコーティングされたナノ粒子を作製する方法であって、
第１の親水性カチオン性ポリマーを、第２の親水性中性電荷ポリマーにコンジュゲートされた第１の親水性カチオン性ポリマーと混合することにより、ブレンドされたポリマーを調製するステップと、
該ブレンドされたポリマーに該核酸を添加するステップと、
該ナノ粒子を精製して、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のナノ粒子を生成するステップと
を含む方法。

【請求項19】

前記脳の疾患または障害の１または複数の症状を処置するための製剤であって、該製剤は、
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の治療有効量のナノ粒子製剤
を含み、該製剤が該脳に送達されることを特徴とする、製剤。

【請求項20】

前記製剤が、前記脳へと直接的に投与される、請求項１９に記載の製剤。

【請求項21】

前記製剤が、全身投与または鼻腔内に投与される、請求項１９に記載の製剤。

【請求項22】

前記製剤が、前記粒子の血液脳関門の通過を容易にするため、該血液脳関門を迂回するため、または前記脳実質に浸透するための１または複数の技法と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項１９に記載の製剤。

【請求項23】

前記技法が、局所注射、直接的植え込み、対流増強送達、マイクロバブルを伴うまたは伴わない超音波処理および浸透圧剤の使用からなる群から選択される、請求項２２に記載の製剤。

【請求項24】

前記疾患または障害が、腫瘍、神経学的障害および脳傷害または外傷からなる群から選択される、請求項１９に記載の製剤。

【請求項25】

前記第１の親水性カチオン性ポリマーの少なくとも９０％が、前記第２の親水性中性電荷分岐状ポリマーにコンジュゲートされており、前記第１の親水性カチオン性ポリマーの残りの割合が、前記第２の親水性中性電荷分岐状ポリマーに非コンジュゲートのままである、請求項１に記載の製剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年５月１２日に出願された米国特許出願第６１／９９１，８９８号、２０１４年５月１２日に出願された米国特許出願第６１／９９１，９２０号および２０１４年５月２２日に出願された米国特許出願第６２／００１，９９４号の優先権および利益を請求し、その開示は、参照によって本明細書により明示的に援用される。

【0002】

連邦政府により支援される研究または開発に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所によりＪｕｓｔｉｎ Ｈａｎｅｓに授与された助成金番号ＥＢ００３５５８および助成金番号ＣＡ１６４７８９のもと政府の支援によりなされた。政府は、本発明における特定の権利を有する。

【0003】

本発明は、全般的には、遺伝子送達の分野、特に、コーティングされた粒子を使用して脳実質に浸透し高レベルの広汎な導入遺伝子発現を達成する、生物学的関門を越えた核酸の送達に存する。

【背景技術】

【0004】

パーキンソン病、アルツハイマー病、脳腫瘍および多くの神経形成障害を含む神経学的疾患の患者は、重篤な衰弱性症状を患い、治癒的処置をもたらす治療選択肢を欠く。中枢神経系（ＣＮＳ）疾患の自然経過を変更または反転し得る特異的な遺伝子標的に関する蓄積された知識は、遺伝子療法を魅力的な治療戦略にした［O’Mahony, A.M.ら、J Pharm Sci、２０１３年、１０２巻（１０号）：３４６９〜３４８４頁；Lentzら、Neurobiol Dis、２０１２年、４８巻（２号）：１７９〜１８８頁］。複数の前臨床および臨床試験は、脳組織の至る所への導入遺伝子発現のレベルおよび分布の増強に特異的な焦点を置いて、有力なウイルスまたは非ウイルス遺伝子ベクターを使用して、ＣＮＳへの核酸の送達を改善することを目標とした［O’Mahonyら、J Pharm Sci、２０１３年、１０２巻（１０号）：３４６９〜３４８４頁；Perez-Martinezら、J Alzheimers Dis、２０１２年、３１巻（４号）：６９７〜７１０頁］。

【0005】

ウイルス遺伝子ベクターは、相対的に効率的ではあるものの、低いパッケージング容量、スケールアップにおける技術的困難、高い生産コスト［Thomasら、Nat Rev Genet、２００３年、４巻（５号）：３４６〜３５８頁］および変異誘発のリスク［OlsenおよびStein、N Engl J Med、２００４年、３５０巻（２１号）：２１６７〜２１７９頁］を含む１または複数の問題点によって限定されてきた。さらに、ＣＮＳの免疫特権のある性質にもかかわらず、免疫応答の中和が、反復投与または以前の曝露に続発して生じ得る［Lentzら、Neurobiol Dis、２０１２年、４８巻（２号）：１７９〜１８８頁；Xiao, X.ら、J Virol、１９９６年、７０巻（１１号）：８０９８〜８１０８頁；Chirmule, N.ら、J Virol、２０００年、７４巻（５号）：２４２０〜２４２５頁；Lowenstein, P.R.ら、Curr Gene Ther、２００７年、７巻（５号）：３４７〜６０頁；Lowenstein, P.R.ら、Neurotherapeutics、２００７年、４巻（４号）：７１５〜７２４頁；Voges, J.ら、Ann Neurol、２００３年、５４巻（４号）：４７９〜４８７頁］。

【0006】

非ウイルス遺伝子ベクターは、これらの限定の多くを伴わない、遺伝子送達のための魅力的な代替戦略を提供することができる［O’Mahony, A.M.ら、J Pharm Sci、２０１３年、１０２巻（１０号）：３４６９〜３４８４頁］。カチオン性ポリマーに基づく遺伝子ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおけるＤＮＡ凝縮および効率的遺伝子移入のための目的に合わせることができる（tailorable）プラットフォームをもたらす。その正電荷密度は、負電荷を持つ核酸の安定的コンパクションを可能にし［Sun, X.およびN. Zhang、Mini Rev Med Chem、２０１０年、１０巻（２号）：１０８〜１２５頁；Dunlap, D.D.ら、Nucleic Acids Res、１９９７年、２５巻（１５号）：３０９５〜３１０１頁］、酵素分解からこれを保護する［Kukowska-Latallo, J.F.ら、Hum Gene Ther、２０００年、１１巻（１０号）：１３８５〜１３９５頁］。また、プロトン化可能な（protonable）アミンの数は、効率的なトランスフェクションを導く「プロトン・スポンジ効果」によるエンドソーム漏出を容易にする緩衝能増加をもたらす［Akinc, A.ら、J Gene Med、２００５年、７巻（５号）：６５７〜６６３頁］。この目的のために多種多様なカチオン性ポリマーが開発され、多様な物理化学的プロファイルおよびｉｎ ｖｉｖｏ挙動を有する遺伝子ベクターを提供する［Mintzer, M.A.およびE.E. Simanek.、Chem Rev、２００９年、１０９巻（２号）：２５９〜３０２頁；Pathakら、Biotechnol J、２００９年、４巻（１１号）：１５５９〜７２頁］。

【0007】

しかし、非ウイルス遺伝子ベクターは依然として、脳内の標的細胞に到達する前に、多数の関門に直面する［O’Mahonyら、J Pharm Sci、２０１３年、１０２巻（１０号）：３４６９〜３４８４頁］。脳への遺伝子ベクターの全身性送達に対する主要な関門である、血液脳関門（ＢＢＢ）を操作または迂回するための様々な戦略が開発された［Jain、Nanomedicine (Lond)、２０１２年、７巻（８号）：１２２５〜３３頁；Wohlfartら、J Control Release、２０１２年、１６１巻（２号）：２６４〜２７３頁］。このようなアプローチとして、ＣＮＳへの直接的局所投与［Patelら、Advanced Drug Delivery Reviews、２０１２年、６４巻（７号）：７０１〜７０５頁］および集束超音波［Vykhodtsevaら、Ultrasonics、２００８年、４８巻（４号）：２７９〜２９６頁］または化学試薬［Krollら、Neurosurgery、１９９８年、４２巻（５号）：１０８３〜１０９９頁；考察１０９９〜１００頁］によるＢＢＢの可逆的破壊が挙げられるがこれらに限定されない。しかし、ＢＢＢを越えると次に、脳細胞間に存在する異方性および静電的に帯電した細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が、別の重大な意味を持つ関門として広く認識されている［Nanceら、Sci Transl Med、２０１２年、４巻（１４９号）：１４９ｒａ１１９頁；Sykovaら、Physiol Rev、２００８年、８８巻（４号）：１２７７〜１３４０頁；Zamecnik, J.、Acta Neuropathol、２００５年、１１０巻（５号）：４３５〜４４２頁］。この「脳組織関門」は、投与方法にかかわらず、脳内の高分子およびナノ粒子の広汎な分布を妨害し、これにより、神経学的疾患の播種性標的区域の至る所におけるその被覆を限定する［Voges, J.ら、Ann Neurol、２００３年、５４巻（４号）：４７９〜４８７頁；Nance, E.A.ら、Sci Transl Med、２０１２年、４巻（１４９号）：１４９ｒａ１１９頁；Sykovaら、Physiol Rev、２００８年、８８巻（４号）：１２７７〜３４０頁；MacKayら、Brain Res、２００５年、１０３５巻（２号）：１３９〜１５３頁］。ＥＣＭは、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、プロテオグリカン、リンクタンパク質およびテネイシンに富み、カチオン性ポリマー遺伝子ベクターの浸透に対し、負電荷を持つ接着性関門をもたらすことができる［Sykovaら、Physiol Rev、２００８年、８８巻（４号）：１２７７〜１３４０頁；Zimmermannら、Histochem Cell Biol、２００８年、１３０巻（４号）：６３５〜６５３頁］。さらに、ＥＣＭの細孔サイズは、ＣＮＳにおけるナノ粒子の移動に対する立体的関門を課し、非接着性１１４ｎｍの粒子は、脳組織に浸透することができるが、２００ｎｍはできない［Nance, E.A.ら、Sci Transl Med、２０１２年、４巻（１４９号）：１４９ｒａ１１９頁；Kenny, G.D.ら、Biomaterials、２０１３年、３４巻（３６号）：９１９０〜９２００頁。親水性および中性電荷ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で例外的に良好にコーティングされる１００ｎｍに満たない（sub-100 nm）ナノ粒子が、脳ＥＣＭにおいて急速に拡散し、治療薬の広汎な分布を可能にすることが示された［Nance, E.A.ら、Sci Transl Med、２０１２年、４巻（１４９号）：１４９ｒａ１１９頁］。

【0008】

対流増強送達（ＣＥＤ）を適用して、頭蓋内投与の間に圧力勾配をもたらすことにより、治療薬の分布をさらに増強することができる［Allardら、Biomaterials、２００９年、３０巻（１２号）：２３０２〜２３１８頁］。しかし、粒子が、接着性相互作用および／または立体障害により脳実質に捕捉されたままである場合、ＣＥＤが、著しい利益をもたらす可能性は低い。よって、脳実質における妨げられない拡散を可能にする粒子の物理化学的特性は依然として、ＣＥＤ後の増強された粒子浸透の達成に重大な意味を持つ［Allardら、Biomaterials、２００９年、３０巻（１２号）：２３０２〜１８頁；Kennyら、Biomaterials、２０１３年、３４巻（３６号）：９１９０〜９２００頁］。しかし、ＣＥＤ後であっても、正電荷を持つ遺伝子ベクターおよび負電荷を持つＥＣＭの間の相互作用は、注射ポイントおよび血管周囲空間にカチオン性ナノ粒子を限局し、脳実質内へのその浸透を制限する［MacKayら、Brain Res、２００５年、１０３５巻（２号）：１３９〜１５３頁；Kennyら、Biomaterials、２０１３年、３４巻（３６号）：９１９０〜９２００頁；Writerら、J Control Release、２０１２年、１６２巻（２号）：３４０〜８頁］。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】O’Mahony, A.M.ら、J Pharm Sci、２０１３年、１０２巻（１０号）：３４６９〜３４８４頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

したがって、本発明の目的は、脳実質に浸透し、これにより脳組織の至る所における分布および導入遺伝子発現を改善することができる、安定的遺伝子ベクターの最適化された物理化学的特性を提供することである。

【0011】

発明のさらなる目的は、好ましい安全性プロファイルを有する遺伝子送達ベクターを提供することである。

【0012】

本発明のまたさらなる目的は、ナノ粒子を、組織、特に脳におけるその分布および導入遺伝子発現をさらに増強することができる送達戦略と組み合わせることである。

【課題を解決するための手段】

【0013】

脳組織への急速な拡散および広汎な分布ならびにその中の標的細胞への高度に有効な遺伝子送達が可能な、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）またはポロキサマー（polaxamer）（ポリエチレングリコールまたはポリアルキレンオキシドコポリマー、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標））等、親水性および中性電荷親水性ポリマーの高密度表面コーティングを有する合成遺伝子送達プラットフォームが開発された。実施例は、２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリ−Ｌリシン（ＰＬＬ）等のカチオン性ポリマーと、ＰＥＧ等のポリマーにコンジュゲートされた親水性ポリマーとの混合物から製剤化された、高密度にペグ化された遺伝子ベクターが、脳実質に急速に浸透することを実証する。これらの脳浸透性遺伝子ベクターの対流増強送達（ＣＥＤ）は、遺伝子ベクターの増強された分布をもたらし、脳組織の至る所における高度に有効な導入遺伝子発現をもたらす。

【0014】

ナノ粒子は、遊離ポリマーおよびポリエチレングリコール等の親水性ポリマーにコンジュゲートされたポリマーのブレンドから形成される。ブレンド技法は、人工脳脊髄液を含む高イオン強度溶液におけるナノ粒子コンパクションを有意に改善し、コロイド安定性を増加させる。この戦略をさらに適用して、同様の特質を有するペプチドおよび生分解性ポリマーに基づく脳浸透性遺伝子ベクターを開発した。実施例に記載されている通り、核酸、生体適合性、生分解性カチオン性ポリマーおよびポリエチレングリコールを含むナノ粒子において、カチオン性ポリマーの９０％〜７５％が、ポリエチレングリコールにコンジュゲートされ、核酸が、ナノ粒子内に被包されているおよび／またはその表面に会合されている。ナノ粒子は、ほぼ中性の電荷を付与し、脳実質にわたる急速拡散を最適化する密度のポリエチレングリコールでコーティングされている。ナノ粒子は、好ましくは、１１４ｎｍ未満、例えば、５０ｎｍの直径を有する。

【0015】

一部の実施形態では、カチオン性ポリマーまたはポリエチレングリコールは、分岐状である。分岐は、ポリマーにコンジュゲートされたポリエチレングリコールの量を、例えば、非分岐状ポリエチレングリコールおよび非分岐状ポリマーのコンジュゲーションと比較して、少なくとも３倍多いポリエチレングリコールにより増強する。一部の実施形態では、ポリエチレングリコールは、５，０００ダルトン等、１，０００ダルトン〜１０，０００ダルトンの間の分子量を有する。

【0016】

ある特定の実施形態では、カチオン性ポリマーは、１０，０００ダルトン〜５０，０００ダルトンの間、例えば２５，０００ダルトンの分子量を有する分岐状ポリエチレンイミンである。さらなる実施形態では、ポリエチレンイミンに対するポリエチレングリコールのモル比は、８超、好ましくは２６である。特定の実施形態では、総アミンの２５％が、非コンジュゲート分岐状ポリエチレンイミンに由来する。他の実施形態では、カチオン性ポリマーは、ポリ−Ｌリシンであり、ポリエチレングリコールは、５，０００ダルトンの分子量を有する分岐状ポリエチレングリコールである。一実施形態では、総ポリ−Ｌリシンの９０％が、ポリエチレングリコールにコンジュゲートされている。

【0017】

脳への治療的または予防的核酸の送達のための投薬製剤も開示されている。製剤は、ポリエチレンで高密度にコーティングされた治療有効量のナノ粒子と、脳内への送達のための薬学的に許容される賦形剤とを含む。ナノ粒子は、脳内への直接的または間接的注射のために製剤化することができる。

【0018】

脳への核酸の送達のための、ポリエチレングリコールで高密度にコーティングされたナノ粒子を作製する方法も提供される。本方法は、ポリエチレングリコール等のポリマーにコンジュゲートされたポリマーと遊離ポリマーとを混合することにより、ブレンドされたポリマーを調製するステップと、このブレンドされたポリマーに核酸を添加するステップと、ナノ粒子を精製するステップとを含む。

【0019】

脳の疾患または障害の１または複数の症状を軽減するための治療有効量のナノ粒子と、脳内への送達のための薬学的に許容される賦形剤とを含む製剤を脳に投与するステップを含む、脳の疾患または障害を処置するための方法も提供される。本製剤は、脳へと直接的または間接的に投与することができる。一部の実施形態では、本製剤は、全身性に投与され、ナノ粒子は、血液脳関門を通過することにより脳に浸透する。粒子は、血液脳関門を迂回するための１または複数の技法と組み合わせて投与することができる。例示的な技法は、対流増強送達（ＣＥＤ）、電子常磁性共鳴、超音波およびマイクロバブルを伴う超音波適用を含む。脳内への取り込みを増加させる他の方法は、マンニトール等、浸透圧剤と共に製剤化するステップを含む。本方法は、腫瘍、神経学的障害および脳傷害または外傷が挙げられるがこれらに限定されない、疾患または障害の１または複数の症状の処置に有用であり得る。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
脳を含む組織への核酸の送達のためのナノ粒子製剤であって、
核酸と、
第１の親水性カチオン性ポリマーと、
ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシドおよびこれらのコポリマーからなる群から選択される第２の親水性中性電荷直鎖状または分岐状ポリマーと
を含み、
該カチオン性ポリマーの９０％〜７５％が、該親水性ポリマーにコンジュゲートされ、または該カチオン性ポリマーの少なくとも５０％が、分岐状親水性ポリマーにコンジュゲートされており、該核酸が、該ナノ粒子内に被包され、もしくは該ナノ粒子の表面に会合しており、該ナノ粒子が、ほぼ中性の電荷を付与し、該組織にわたる拡散率を増強する密度の該親水性ポリマーでコーティングされているナノ粒子製剤。
（項目２）
前記脳実質内への送達のための、項目１に記載のナノ粒子製剤。
（項目３）
１１４ｎｍ、１００ｎｍまたは５０ｎｍ未満のあるいは１１４ｎｍ、１００ｎｍまたは５０ｎｍに等しい直径を有する、項目１に記載のナノ粒子製剤。
（項目４）
前記第１のカチオン性ポリマーまたは第２の中性電荷親水性ポリマーが、分岐している、項目１に記載のナノ粒子製剤。
（項目５）
前記第２の親水性ポリマーが、１，０００ダルトン〜１０，０００ダルトンの間の分子量を有するポリエチレングリコールである、項目１に記載のナノ粒子製剤。
（項目６）
前記ポリエチレングリコールが、５，０００ダルトンの分子量を有する、項目５に記載のナノ粒子製剤。
（項目７）
前記第１のカチオン性ポリマーが、１０，０００ダルトン〜５０，０００ダルトンの間の分子量を有する分岐状ポリエチレンイミンである、項目１に記載のナノ粒子製剤。
（項目８）
第１のカチオン性ポリマーに対する第２の中性電荷親水性ポリマーのモル比が、８を超える、項目７に記載のナノ粒子製剤。
（項目９）
ポリマーに対する核酸のＮ対Ｐ比が、少なくとも２である、項目８に記載のナノ粒子製剤。
（項目１０）
前記第１のカチオン性ポリマーが、ポリ−Ｌリシンである、項目１に記載のナノ粒子製剤。
（項目１１）
前記第２の中性電荷親水性ポリマーが、５，０００ダルトンの個々の分岐の分子量を有する分岐状ポリエチレングリコールである、項目１０に記載のナノ粒子製剤。
（項目１２）
前記ポリ−Ｌリシンの少なくとも５０％が、ポリエチレングリコールにコンジュゲートされている、項目１１に記載のナノ粒子製剤。
（項目１３）
前記第２の中性電荷親水性ポリマーの質量が、前記粒子の質量の少なくとも１／１０，０００、１／７５００、１／５０００、１／４０００、１／３４００、１／２５００、１／２０００、１／１５００、１／１０００、１／５００、１／２５０、１／２００、１／１５０、１／１００、１／７５、１／５０、１／２５、１／２０、１／５、１／２または９／１０である、項目１に記載のナノ粒子製剤。
（項目１４）
総ナノ粒子と比べた前記第２の親水性ポリマーの重量パーセントが、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％またはそれ超である、項目１に記載のナノ粒子製剤。
（項目１５）
前記ナノ粒子が、マンニトールのような浸透圧媒体において製剤化されて、前記脳内への取り込みを増強する、項目１に記載のナノ粒子製剤。
（項目１６）
前記脳への治療剤の送達のための投薬製剤であって、
該脳への投与のための項目１〜１５のいずれか一項に記載の治療有効量のナノ粒子、および
該脳内への送達のための薬学的に許容される賦形剤
からなる製剤。
（項目１７）
前記ナノ粒子が、対流増強送達を使用した前記脳への直接的投与のために製剤化されている、項目１６に記載の製剤。
（項目１８）
前記ナノ粒子が、前記脳への全身性または鼻腔内投与のために製剤化されている、項目１６に記載の製剤。
（項目１９）
前記ナノ粒子が、少なくとも１０分間、２０分間、３０分間、１時間、２時間、４時間（hour hours）、６時間、１０時間、１日間、３日間、７日間、１０日間、２週間、１ヶ月間またはそれより長い期間にわたって、有効量の前記核酸を放出する、項目１６に記載の製剤。
（項目２０）
前記脳への核酸の送達のための、親水性ポリマーで高密度にコーティングされたナノ粒子を作製する方法であって、
第１のカチオン性親水性ポリマーを、第２の中性電荷親水性ポリマーにコンジュゲートされた該第１のポリマーと混合することにより、ブレンドされたポリマーを調製するステップと、
該ブレンドされたポリマーに該核酸を添加するステップと、
該ナノ粒子を精製して、項目１〜１５のいずれか一項に記載のナノ粒子を生成するステップと
を含む方法。
（項目２１）
前記脳の疾患または障害の１または複数の症状を処置するための方法であって、
項目１〜１９のいずれか一項に記載の治療有効量のナノ粒子製剤
を含む製剤を該脳に投与するステップを含む方法。
（項目２２）
前記製剤が、前記脳へと直接的に投与される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記製剤が、全身性または鼻腔内に（intransally）投与される、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記粒子が、該粒子の血液脳関門の通過を容易にするための１または複数の技法と組み合わせて投与される、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記技法が、局所注射、直接的植え込み、対流増強送達、電子常磁性共鳴、マイクロバブルを伴うまたは伴わない超音波処理および浸透圧剤の使用からなる群から選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記疾患または障害が、腫瘍、神経学的障害および脳傷害または外傷からなる群から選択される、項目２１に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】図１は、それぞれＵＰＮ（■）、ＣＰＮ（＋）およびＢＰＮ（◆）の経時的な（時間）ベクターの水力学直径（ｎｍ）を示すグラフである。ｐＨ７．０のａＣＳＦにおける動的光散乱（ＤＬＳ）によりサイズを測定した。測定は、３０分間毎に２４時間、または多分散（ＰＤＩ）＞０．５まで続けた。データは、平均±ＳＥＭを表す。

【0021】

【図2】図２Ａ〜図２Ｄは、棒グラフである。図２Ａ〜図２Ｃは、様々な濃度（１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌ）のそれぞれＰＥＩナノ粒子（ＵＰＮ、ＣＰＮおよびＢＰＮ）またはＰＥＧ−ＰＬＬナノ粒子で処置した、それぞれウサギ初代アストロサイト（図２Ａ）、ラット初代アストロサイト（図２Ｂ）および９Ｌラット膠肉腫細胞（図２Ｃ）の％細胞生存率を示す。処置２４時間後に細胞生存率を測定し、無処置対照と比較した。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊は、１００％からの統計的に有意な（ｐ＜０．０５）差を表示する。図２Ｄは、それぞれ、ＰＥＩナノ粒子（ＵＰＮ、ＣＰＮおよびＢＰＮ）または生理食塩水対照（Ｃｔｒｌ）のそれぞれに対する、カスタムスケール（０：炎症または出血なし；１：軽度；２：中等度；３：重度）を使用してスコア化された病理組織学（炎症および出血）を示す。

【0022】

【図3】図３Ａ〜図３Ｄは、棒グラフである。図３Ａおよび図３Ｂは、それぞれＰＥＩナノ粒子（ＵＰＮ、ＣＰＮおよびＢＰＮ）、ＰＥＧ−ＰＬＬナノ粒子または生理食塩水対照（Ｃｔｒｌ）で処置した９Ｌラット膠肉腫細胞（図３Ａ）およびラット初代アストロサイト（図３Ｂ）の％細胞取り込みを示す。図３Ｃおよび図３Ｄは、それぞれＰＥＩナノ粒子（ＵＰＮ、ＣＰＮおよびＢＰＮ）、ＰＥＧ−ＰＬＬナノ粒子または生理食塩水対照（Ｃｔｒｌ）で処置した９Ｌラット膠肉腫細胞（図３Ｃ）およびラット初代アストロサイト（図３Ｄ）へのルシフェラーゼ遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション後のルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）／ｍｇタンパク質を示す。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊は、統計的有意性Ｐ＜０．０５を表示する。

【0023】

【図4】図４Ａは、１秒間のタイムスケールでの、２０秒間にわたるＵＰＮ、ＣＰＮおよびＢＰＮナノ粒子の軌跡を示す。スケールバーは、０．２５μｍを表す。図４Ｂは、時間（秒）の関数としての、ＰＥＩに基づく遺伝子ベクター（ＵＰＮ、ＣＰＮおよびＢＰＮ）の平均二乗変位（ＭＳＤ）のアンサンブル平均幾何平均（ensemble-averaged geometric mean）を示すグラフである。データは、少なくとも３回の独立した実験のアンサンブル平均を表し、実験毎にＮ≧５００粒子を追跡した。図４Ｃは、τ＝１秒間のタイムスケールにおける、少なくとも３回の独立した実験のそれぞれの遺伝子ベクター（ＵＰＮ、ＣＰＮおよびＢＰＮ）毎のｌｏｇ平均二乗変位（ＭＳＤ）にわたる遺伝子ベクターの％を示すヒストグラムのパネルである。

【0024】

【図5】図５Ａは、ＣＰＮ（〇）およびＢＰＮ（●）（Ｎ＝６）に対する、注射部位からの距離（ｍｍ）の関数としての、ＰＥＩに基づくナノ粒子の分布面積（ｍｍ^２）の、画像に基づくＭａｔｌａｂ定量を示すグラフである。図５Ｂは、ＣＰＮおよびＢＰＮ遺伝子ベクターの分布体積（ｍｍ^３）を示すヒストグラムである。＊は、統計的有意性Ｐ＜０．０５を表示する。

【0025】

【図6】図６Ａおよび図６Ｂはそれぞれ、ＵＰＮ、ＣＰＮおよびＢＰＮ遺伝子ベクターのそれぞれに対する、ｅＧＦＰ発現の分布体積（ｍｍ^３）の、画像に基づくＭａｔｌａｂ定量を示すボックスグラフ（図６Ａ）およびヒストグラム（図６Ｂ）である。（Ｎ＝４〜６）。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊は、統計的有意性Ｐ＜０．０５を表示する。

【0026】

【図7】図７は、ＣＥＤ投与後の齧歯類線条体におけるＵＰＮ、ＣＰＮおよびＢＰＮナノ粒子遺伝子ベクターによる正規化されたＧＦＰ発現を示すヒストグラムである。ＧＦＰの発現レベルは、β−アクチンにより正規化した。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊は、統計的有意性Ｐ＜０．０５を表示する。

【0027】

【図8】図８は、それぞれ０．５ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌの濃度における、ＣＥＤ後のＣＰＮおよびＢＰＮの分布体積（ｍｍ^３）を示すヒストグラムである。＊ｐ＜０．０５。

【0028】

【図9】図９は、分岐状および非分岐状ＰＥＧを含有するペグ化ＰＬＬポリマーの合成のためのクリックケミストリー反応を示す模式図である。

【0029】

【図10】図１０は、それぞれ２または５の窒素（ポリマー）対リン（phosphorous）（核酸）（Ｎ／Ｐ）比で、ポリＬ−リシン（ＰＬＬ）、ＰＥＧまたは異なるパーセンテージのポリＬ−リシンおよび分岐状ＰＥＧ（ＢＲ５０、ＢＲ９０またはＢＲ１００）から形成されたナノ粒子のアスペクト比（長径／短径）を示すグラフである。＊は、ＰＬＬ−ＰＥＧ遺伝子ベクターとの差における統計的有意性ｐ値＜０．０５を表示する。

【0030】

【図11】図１１Ａ〜図１１Ｄは、それぞれポリＬ−リシンおよびＰＥＧ（ＰＬＬ−ＰＥＧ）（図１１Ａ）、ポリＬ−リシンおよび１００％分岐状ＰＥＧ（ＢＲ１００）（図１１Ｂ）、ポリＬ−リシンおよび５０％分岐状ＰＥＧ（ＢＲ５０）（図１１Ｃ）ならびにポリＬ−リシンおよび９０％分岐状ＰＥＧ（ＢＲ９０）（図１１Ｄ）からなる粒子の長径のサイズ（ｎｍ）にわたる粒子のパーセンテージ（％）を示すヒストグラムである。縦棒は、１１４ｎｍのカットオフを表す。

【0031】

【図12】図１２は、それぞれＰＬＬ Ｎ／Ｐ２

【化1】

、ＰＬＬ Ｎ／Ｐ５

【化2】

、ＰＬＬ−ＰＥＧ Ｎ／Ｐ２

【化3】

、ＰＬＬ−ＰＥＧ Ｎ／Ｐ５

【化4】

、ＢＲ９０ Ｎ／Ｐ２

【化5】

およびＢＲ９０ Ｎ／Ｐ

【化6】

の、プラスミドの濃度（μｇ／ｍｌ）にわたる％細胞生存率を示すグラフである。エラーバーは、ＳＥＭを描写する。

【0032】

【図13】図１３Ａおよび図１３Ｂは、それぞれ９Ｌグリオーマ細胞（図１３Ａ）および初代ラットアストロサイト細胞（図１３Ｂ）についての、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌの濃度のＰＬＬ−ＰＥＧ、ＢＲ１００およびＢＲ９０に対する細胞生存率のパーセンテージ（％）を示すヒストグラムである。エラーバーは、ＳＥＭを描写する。

【0033】

【図14-1】図１４Ａ〜図１４Ｄは、９Ｌグリオーマ細胞（図１４Ａ）および初代ラットアストロサイト細胞（図１４Ｂ）についての、ｐＢａｌ ＰＬＬ−ＰＥＧ、ＰＬＬ ＢＲ１００およびＢＲ９０に対する細胞取り込みのパーセンテージ（％）、ならびにそれぞれ９Ｌグリオーマ細胞（図１４Ｃ）および初代ラットアストロサイト細胞（図１４Ｄ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子ベクタートランスフェクション後のルシフェラーゼ遺伝子発現（ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）を示すヒストグラムである。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊は、統計的有意性Ｐ＜０．０５を表示する。

【図14-2】図１４Ａ〜図１４Ｄは、９Ｌグリオーマ細胞（図１４Ａ）および初代ラットアストロサイト細胞（図１４Ｂ）についての、ｐＢａｌ ＰＬＬ−ＰＥＧ、ＰＬＬ ＢＲ１００およびＢＲ９０に対する細胞取り込みのパーセンテージ（％）、ならびにそれぞれ９Ｌグリオーマ細胞（図１４Ｃ）および初代ラットアストロサイト細胞（図１４Ｄ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子ベクタートランスフェクション後のルシフェラーゼ遺伝子発現（ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）を示すヒストグラムである。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊は、統計的有意性Ｐ＜０．０５を表示する。

【0034】

【図15】図１５Ａおよび図１５Ｂは、３７℃におけるａＣＳＦによる処置前、処置後０時間目および１時間目の、ＰＬＬ−ＰＥＧ、ＢＲ１００およびＢＲ９０についてのそれぞれ遺伝子ベクターＺ−平均（ｎｍ）（図１５Ａ）および多分散（ＰＤＩ）（図１５Ｂ）を示すヒストグラムである。

【0035】

【図16】図１６は、それぞれＰＬＬ、ＰＬＬ−ＰＥＧ、ＢＲ１００およびＢＲ９０についての、タイムスケール（秒）にわたるアンサンブル平均幾何平均二乗変位＜ＭＳＤ＞（μｍ^２）を示すグラフである。データは、少なくとも３回の独立した実験のアンサンブル平均を表し、実験毎にＮ≧５００粒子を追跡し、エラーバーは、ＳＥＭを描写する。

【0036】

【図17】図１７は、２０秒間にわたる代表的な粒子軌跡を示す模式図である。図示されている軌跡は、タイムスケール１におけるアンサンブル平均に等しいＭＳＤを有した粒子のものである、スケールバー＝０．２５μｍ。

【0037】

【図18】図１８は、それぞれＰＬＬ、ＰＬＬ−ＰＥＧ、ＢＲ１００およびＢＲ９０の遺伝子ベクターについての、ｌｏｇ＜ＭＳＤ＞にわたるパーセンテージ遺伝子ベクター（％）を示すヒストグラムのパネルである。データは、１秒間のタイムスケールにおける少なくとも３回の独立した実験から得る。

【0038】

【図19】図１９は、脳組織の１００μｍスライスの個々の共焦点画像から定量された、それぞれＢＲ９０（●）およびＰＬＬ−ＰＥＧ（〇）についての、注射部位からの距離（ｍｍ）の関数としての、遺伝子ベクターの分布面積（ｍｍ^２）を示すグラフである。Ｎ＝３、エラーバーは、平均の標準誤差を表す。

【0039】

【図20】図２０は、脳組織の１００μｍスライスの共焦点画像から定量された、それぞれＢＲ９０およびＰＬＬ−ＰＥＧについての、遺伝子ベクターの分布体積（ｍｍ^３）を示すヒストグラムである。＊は、統計的有意性Ｐ値＜０．０５を表示する。

【0040】

【図21】図２１は、０．５ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬのプラスミド濃度におけるＰＥＩ ＣＰＮおよびＢＰＮの分布体積（ｍｍ^３）を実証する棒グラフである。データは、６回の独立した実験から得る。＊は、ｐ＜０．０５の統計的有意性を表示する。

【0041】

【図22】図２２Ａは、ＢＲ９０（ＤＮＡ−ＢＮＰ）またはＰＬＬ−ＰＥＧ（ＤＮＡ−ＣＮＰ）の注射後の、注射平面からの異なる距離（μｍ）における脳スライス当たりの蛍光強度を示す棒グラフである。図２２Ｂは、ＢＲ９０（ＤＮＡ−ＢＮＰ）またはＰＬＬ−ＰＥＧ（ＤＮＡ−ＣＮＰ）の注射後の、注射平面からの異なる距離（μｍ）における脳スライス当たりのトランスフェクトされた細胞の数を示す棒グラフである。＊は、統計的有意性ｐ＜０．０５を表示する。

【発明を実施するための形態】

【0042】

Ｉ．定義
用語「生体適合性」は、本明細書において使用される場合、それ自体が宿主（例えば、動物またはヒト）に対し有毒でもなければ、宿主において毒性濃度のモノマーもしくはオリゴマーサブユニットまたは他の副産物を産生する速度で分解（ポリマーが分解する場合）もしない、１または複数の材料を指す。

【0043】

用語「生分解性」は、本明細書において使用される場合、材料が、その構成成分サブユニットへと分解または崩壊すること、または例えば、ポリマーからより小型な非ポリマーサブユニットへの生化学的過程による消化を意味する。

【0044】

用語「相当する粒子」または「参照粒子」は、本明細書において使用される場合、これが比較される別の粒子と実質的に同一であるが、脳のＥＣＭにおける細孔を通した輸送上の差を促進するための表面修飾を典型的に欠如する粒子を指す。相当する粒子は、典型的には、これが比較される粒子と同様の材料、密度およびサイズのものである。ある特定の実施形態では、相当する粒子は、ポリエチレングリコールの高密度コーティングがない粒子である。ある特定の実施形態では、比較できる粒子は、遊離ポリマーおよびポリエチレングリコールにコンジュゲートされたポリマーを含有するブレンドされた混合物から形成されていない粒子である。

【0045】

用語「高密度にコーティングされた粒子」は、例えば、参照粒子と比べて、粒子の表面におけるコーティング剤の密度を特異的に増強するように修飾された粒子を指す。一部の実施形態では、高密度にコーティングされた粒子は、より低密度にコーティングされたまたはコーティングされていない粒子と比べて、粒子の物理化学的特性の変更に十分な、ポリマーに対するポリエチレングリコールの比から形成される。一部の実施形態では、コーティング剤の密度は、粒子の電荷の完全なマスクに十分であり、生理的溶液におけるほぼ中性の電荷およびほぼ中性のゼータ電位値およびコロイド安定性をもたらす。特定の実施形態では、高密度にコーティングされた粒子は、分岐状ポリエチレングリコールまたは分岐状ポリマーを使用して達成され、分岐化は、分岐状ポリマーまたは分岐状ポリエチレングリコールを含有しない参照粒子と比較して、ポリマーに対するポリエチレングリコールの比を増強する。

【0046】

用語「核酸」は、単離されたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、プラスミド、ベクターおよび発現構築物を指す。

【0047】

用語「直径」は、本技術分野で認識されており、物理的直径または水力学直径のいずれかを指すように本明細書において使用される。基本的に球状の粒子の直径は、物理的または水力学直径を指すことができる。非球状粒子の直径は、水力学直径を優先的に指すことができる。本明細書において使用される場合、非球状粒子の直径は、粒子表面上の２点間の最大直線距離を指すことができる。複数の粒子について言及する場合、粒子の直径は典型的に、粒子の平均直径を指す。

【0048】

「徐放」は、本明細書において使用される場合、物質全量を一度に生物学的に利用可能にするようにするボーラス型の投与とは対照的に、延長された期間にわたる物質の放出を指す。

【0049】

用語「マイクロスフェア」、「マイクロ粒子」および「マイクロカプセル」は、他に断りがなければ、互換的に使用される。これらは、約１〜最大約１０００ミクロンの間のサイズを有する。一般に、「マイクロカプセル」は、シェル材料とは異なる材料のコアを有する。マイクロ粒子は、球状または非球状であり得、いずれか規則的または不規則的な形状を有することができる。構造が、約１ミクロン未満の直径である場合、相当する本技術分野で認識される用語「ナノスフェア」、「ナノカプセル」および「ナノ粒子」を利用することができる。ある特定の実施形態では、ナノスフェア、ナノカプセルおよびナノ粒子は、約１００ｎｍ、または５０ｎｍもしくは１０ｎｍ等、１００ｎｍ未満の平均直径を有する。

【0050】

マイクロ粒子またはナノ粒子を含む組成物は、ある範囲の粒子サイズの粒子を含むことができる。ある特定の実施形態では、粒子サイズ分布は、均一、例えば、体積メジアン径（median volume diameter）の約２０％標準偏差未満以内であり得、他の実施形態では、なおさらに均一、例えば、体積メジアン径の約１０％以内であり得る。

【0051】

語句「非経口的投与」および「非経口的に投与される」は、本技術分野で認識される用語であり、注射等、経腸および局所投与以外の投与機序を含み、静脈内、筋肉内、胸膜内、血管内、心膜内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内（intradennal）、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内（intrastemal）注射および注入を限定することなく含む。

【0052】

用語「界面活性剤」は、液体の表面張力を低減させる剤を指す。

【0053】

用語「治療剤」は、疾患または障害を防止または処置するために投与することができる薬剤を指す。その例として、核酸、核酸アナログ、小分子、ペプチド模倣薬、タンパク質、ペプチド、炭水化物もしくは糖、脂質もしくは界面活性剤またはこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。

【0054】

用語「処置」は、疾患、障害または状態の１または複数の症状の防止または軽減を指す。疾患または状態の処置は、薬剤が疼痛の原因を処置しない場合であるが、鎮痛剤の投与による被験体の疼痛の処置等、根底にある病態生理が影響されない場合であるが、特定の疾患または状態の少なくとも１つの症状の寛解を含む。

【0055】

語句「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内において、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症を伴わない、人間および動物の組織と接触しての使用に適した、妥当なリスク・ベネフィット比と釣り合った、組成物、ポリマーおよび他の材料および／または剤形を指す。語句「薬学的に許容される担体」は、ある臓器または身体部分から別の臓器または身体部分への、いずれかの対象組成物の運搬または輸送に関与する液体または固体フィラー、希釈液、溶媒または被包材料等、薬学的に許容される材料、組成物または媒体を指す。各担体は、対象組成物の他の成分と適合性であり、患者に対し傷害性ではないという意味において「許容され」なければならない。

【0056】

語句「治療有効量」は、いずれかの医学的処置に適用できる妥当なリスク・ベネフィット比で、ある所望の効果を生じる治療剤の量を指す。有効量は、処置されている疾患もしくは状態、投与されている特定の標的化構築物、被験体のサイズまたは疾患もしくは状態の重症度等の因子に応じて変動し得る。当業者であれば、過度な実験法を必要とすることなく、特定の化合物の有効量を経験的に決定することができる。

【0057】

用語「取り込まれた」および「被包された」は、所望の適用において活性薬剤の徐放等の放出を可能にする、組成物の中におよび／または組成物の上に活性薬剤（active agent）を取り込む、製剤化するまたは他の仕方で含むことを指す。この用語は、化学的もしくは物理的カップル、物理的混合物における、またはコーティング層における該薬剤の被包化を含む、治療剤または他の材料がポリマーマトリックスに取り込まれるいずれかの様式を意図する。
ＩＩ．組成物

【0058】

脳組織における急速拡散および広汎な分布が可能な、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）等のポロキサマーとして公知のポリエチレングリコール−ポリオキシエチレンブロックコポリマー等、親水性および中性電荷ポリマーの高密度表面コーティングを有する合成遺伝子送達プラットフォーム（「ペグ化された遺伝子ベクター」とまとめて称される）が開示されている。
Ａ．ナノ粒子

【0059】

一部の実施形態では、高密度にペグ化された遺伝子ベクターは、非コンジュゲートおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲートされたカチオン性ポリマーの混合物から製剤化されたナノ粒子である。ナノ粒子は、脳実質に急速に浸透し、より低密度にペグ化された遺伝子ベクターと比べて、低下した細胞毒性および高イオン強度溶液における増加したコロイド安定性を有する。
１．コーティング剤

【0060】

粒子および脳組織の間の相互作用を低下させることにより、脳におけるＥＣＭにわたる粒子の拡散を促進する１または複数の材料（例えば、表面変更剤）でコーティングされたナノ粒子が開示されている。表面変更剤の例として、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）およびポロキサマー（poloxomer）（ポリエチレンオキシドブロックコポリマー）が挙げられるがこれらに限定されない。
ｉ．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）

【0061】

好ましいコーティング剤は、ＰＥＧとしても公知のポリ（エチレングリコール）である。ＰＥＧを用いて、ある特定の構成の脳ＥＣＭにおける接着を低下させることができ、例えば、表面から延長するＰＥＧ鎖の長さが制御される（ＥＣＭに相互浸透する長い非分岐鎖が低下または排除されるように）。例えば、直鎖の部分のみが、粒子表面から延長するように（例えば、より低ＭＷ ＰＥＧ分子と長さが均等な部分）、粒子の調製において直鎖状高ＭＷ ＰＥＧを用いることができる。あるいは、分岐状高ＭＷ ＰＥＧを用いることができる。かかる実施形態では、ＰＥＧ分子の分子量は高くなることができるが、粒子の表面から延長する分子のいずれか個々の鎖の直鎖の長さは、より低ＭＷ ＰＥＧ分子の直鎖に相当する。

【0062】

代表的なＰＥＧ分子量のダルトン数（Ｄａ）は、３００Ｄａ、６００Ｄａ、１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、８ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、２００ｋＤａ、５００ｋＤａおよび１ＭＤａを含む。好ましい実施形態では、ＰＥＧは、約５，０００ダルトンの分子量を有する。いずれか所定の分子量のＰＥＧは、長さ、密度および分岐等、他の特徴において変動し得る。特定の実施形態では、コーティング剤は、５ｋＤａのＭＷを有するメトキシ−ＰＥＧ−アミンである。別の実施形態では、コーティング剤は、５ｋＤａのＭＷを有するメトキシ−ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ ５ｋＤａ）である。

【0063】

代替的な実施形態では、コーティングは、ＰＬＵＯＲＯＮＩＣ（登録商標）として販売されているポリエチレングリコール−ポリエチレンオキシドブロックコポリマー等、ポロキサマーである。
ｉｉｉ．コーティング剤の密度

【0064】

好ましい実施形態では、ナノ粒子は、脳実質にわたる急速拡散を最適化する密度のＰＥＧまたは他のコーティング剤でコーティングされる。コーティングの密度は、粒子の材料および組成を含む種々の因子に基づき変動され得る。

【0065】

好ましい実施形態では、カチオン性ポリマーに対するＰＥＧまたは他のコーティング剤のコポリマーモル比は、８を超える（すなわち、カチオン性ポリマー１モルごとに８モル超のＰＥＧ）。カチオン性ポリマーに対するＰＥＧまたは他のコーティング剤のモルによる比は、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３７、５０または５０超であり得る。カチオン性ポリマーに対するＰＥＧまたは他のコーティング剤の好ましいモル比は、２６である。

【0066】

一実施形態では、ＰＥＧまたは他のコーティング剤の密度は、１ｎｍ^２当たり少なくとも０．００１、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、５０または１００単位である。

【0067】

別の実施形態では、ＰＥＧまたは他のコーティング剤の量は、粒子の質量のパーセンテージとして表現される。特定の実施形態では、ＰＥＧまたは他のコーティング剤の質量は、粒子の質量の少なくとも１／１０，０００、１／７５００、１／５０００、１／４０００、１／３４００、１／２５００、１／２０００、１／１５００、１／１０００、１／５００、１／２５０、１／２００、１／１５０、１／１００、１／７５、１／５０、１／２５、１／２０、１／５、１／２または９／１０である。さらなる実施形態では、ＰＥＧまたは他のコーティング剤の重量パーセントは、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％またはそれ超である。
２．コアポリマー

【0068】

いずれかの数の生体適合性ポリマーを使用して、ナノ粒子を調製することができる。好ましい実施形態では、生体適合性ポリマー（複数可）は、カチオン性ポリマーである。カチオン性ポリマーは、ＰＥＧ等、コーティング剤にコンジュゲートするポリマーの能力を増強するために分岐状ポリマーであり得る。一部の実施形態では、生体適合性ポリマー（複数可）は、生分解性である。
ｉ．ポリマーの種類

【0069】

例示的なカチオン性ポリマーとして、シクロデキストリン含有ポリマー、特に、米国特許第６，５０９，３２３号に記載されているもの等、カチオン性シクロデキストリン含有ポリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ（Ｌ−リシン）（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリメタクリレート、キトサン、ポリ（グリコアミドアミン（glycoamidoamine））、シゾフィラン、ＤＥＡＥ−デキストラン、デキストラン−スペルミン、ポリ（アミド−アミン）（ＰＡＡ）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、ポリ［Ｒ−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］（ＰＡＧＡ）、ポリ（アミノ−エステル）、ポリ（ホスファゼン）（ＰＰＺ）、ポリ（リン酸エステル）（ＰＰＥ）、ポリ（ホスホロアミデート）（ＰＰＡ）、ＴＡＴベースのペプチド、アンテナペディアホメオドメインペプチド、ＭＰＧペプチド、ポリ（プロピレンイミン（propylenimine））、カルボシランおよびアミン末端のポリアミノホスフィンが挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、ポリマーは、複数の遊離アミンを有するカチオン性ポリマーである。好ましいポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）を含む。ブロックコポリマーおよび／またはランダムコポリマーを含む、上記の２種またはそれを超えるポリマーのコポリマーを用いて、ポリマー粒子を作製することもできる。
ｉｉ．分岐状ポリマー

【0070】

ポリマー化学において、分岐は、置換基、例えば、モノマーサブユニットにおける水素原子の、該ポリマーの別の共有結合した鎖による；またはグラフトコポリマーの場合は、別の種類の鎖による置き換えによって起こる。分岐は、炭素−炭素または様々な他の種類の共有結合の形成に起因し得る。エステル結合およびアミド結合による分岐は、典型的には、縮合反応によって為され、形成された結合毎に１分子の水（またはＨＣｌ）を産生する。

【0071】

分岐指数（branching index）は、溶液における高分子のサイズにおける長鎖分岐の効果を測定する。これは、ｇ＝＜ｓｂ２＞／＜ｓｌ２＞（式中、ｓｂは、所定の溶媒における分岐状高分子の回転運動の平均二乗半径であり、ｓｌは、同じ温度で同じ溶媒におけるそれ以外は同一の直鎖状高分子の回転運動の平均二乗半径である）として定義される。１を超える値は、分岐による回転運動の半径増加を示す。

【0072】

好ましい実施形態では、コアポリマーまたはＰＥＧは、コーティング剤およびコアポリマーのコンジュゲーションを増強することができる分岐状ポリマーである。例示的な分岐状ポリマーは、２５ｋＤａ分岐状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）および５ｋＤａ分岐状メトキシ−ＰＥＧを含む。
ｉｉｉ．コポリマー

【0073】

好ましい実施形態では、上記のポリマーのいずれかとＰＥＧまたはその誘導体とのコポリマーを使用して、ポリマー粒子を作製することができる。ある特定の実施形態では、ＰＥＧまたは誘導体は、コポリマーの内部ポジションに位置することができる。あるいは、ＰＥＧまたは誘導体は、コポリマーの末端ポジションにまたはその付近に位置することができる。ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、ＰＥＧの領域を相分離させてまたは他の仕方で粒子の表面に位置付ける条件下で形成される。表面局在したＰＥＧ領域単独は、表面変更剤の機能を行うことができるまたはそれを含むことができる。
３．核酸

【0074】

ナノ粒子遺伝子担体は、典型的に、１または複数の核酸を運搬する。この核酸は、内在性核酸配列を変更、修正または置き換えることができる。好ましい実施形態では、核酸は、がんの処置、脳疾患および脳機能に影響する代謝疾患における遺伝子、パーキンソンおよびＡＬＳの処置のための遺伝子等の遺伝子における欠損の修正に使用される。

【0075】

遺伝子療法は、疾患発症の原因となる欠損遺伝子を修正するための技法である。研究者らは、欠陥のある遺伝子を修正するためのいくつかのアプローチのうち１種を使用することができる：
・ 正常遺伝子をゲノム内の非特異的位置に挿入して、非機能的遺伝子を置き換えることができる。このアプローチが最も一般的である。
・ 異常遺伝子を、相同組換えにより正常遺伝子に取り替えることができる。
・ 異常遺伝子をその正常機能に戻す選択的復帰変異により、該異常遺伝子を修復することができる。
・ 特定の遺伝子の調節（遺伝子がオンまたはオフされる程度）を変更することができる。

【0076】

ナノ粒子遺伝子担体によって運搬される核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、化学修飾された核酸またはこれらの組合せであり得る。例えば、核酸半減期の安定性および酵素切断に対する抵抗性を増加させるための方法は、本技術分野で公知であり、ポリヌクレオチドの核酸塩基、糖または結合に対する１または複数の修飾または置換を含むことができる。例えば、核酸は、所望の使用に適合するよう目的に合わせられた特性を含有するようにカスタム合成することができる。一般的な修飾として、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエート結合、ホスホノアセテート結合、プロピンアナログ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、５−Ｍｅ−ｄＣ、２’−５’結合したホスホジエステル結合（linage）、キメラ結合（混合されたホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合および修飾）、脂質およびペプチドとのコンジュゲーションならびにこれらの組合せの使用が挙げられるがこれらに限定されない。

【0077】

一部の実施形態では、核酸は、アキラルおよび無電荷サブユニット間結合を有するリン酸アナログ等のヌクレオチド間（internucleotide）結合修飾（例えば、Sterchak, E. P.ら、Organic Chem.、５２巻：４２０２頁（１９８７年））またはアキラルサブユニット間結合を有する無電荷モルホリノに基づくポリマー（例えば、米国特許第５，０３４，５０６号を参照）を含む。一部のヌクレオチド間結合アナログは、モルホリデート（morpholidate）、アセタールおよびポリアミド結合した複素環を含む。他の骨格および結合修飾として、ホスホロチオエート、ペプチド核酸、トリシクロ−ＤＮＡ、デコイオリゴヌクレオチド、リボザイム、スピゲルマー（高い結合親和性を有するアプタマー（apatamer）であるＬ核酸を含有）またはＣｐＧオリゴマーが挙げられるがこれらに限定されない。

【0078】

ホスホロチオエート（またはＳ−オリゴ）は、非架橋酸素のうち１個が硫黄によって置き換えられた、正常ＤＮＡのバリアントである。ヌクレオチド間結合の硫化は、５’から３’および３’から５’のＤＮＡ ＰＯＬ １エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＳ１およびＰ１、ＲＮａｓｅ、血清ヌクレアーゼならびに蛇毒ホスホジエステラーゼを含むエンドおよびエキソヌクレアーゼの作用を劇的に低下させる。加えて、脂質二重層を通過するための電位が増加する。これらの重要な改善によって、ホスホロチオエートは、細胞調節における適用の増加が判明した。ホスホロチオエートは、２種の主要経路によって作製される：ホスホン酸水素（hydrogen phosphonate）における二硫化炭素中の元素硫黄の溶液の作用による、またはテトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）もしくは３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール（bensodithiol）−３−オン１，１−ジオキシド（ＢＤＴＤ）のいずれかにより亜リン酸（phosphite）トリエステルを硫化するより近年の方法による。後者の方法は、大部分の有機溶媒における元素硫黄の不溶性および二硫化炭素の毒性の問題を回避する。ＴＥＴＤおよびＢＤＴＤ方法は、より高純度ホスホロチオエートも生じる（一般に、UhlmannおよびPeymann、１９９０年、Chemical Reviews ９０巻、５４５〜５６１頁およびそこに引用されている参考文献、PadmapriyaおよびAgrawal、１９９３年、Bioorg. & Med. Chem. Lett.３巻、７６１頁を参照）。

【0079】

ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、オリゴヌクレオチドのリン酸骨格の全体が、反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位により置き換えられ、ホスホジエステル結合が、ペプチド結合により置き換えられた分子である。様々な複素環式塩基が、メチレンカルボニル結合により骨格に連結される。ＰＮＡは、オリゴヌクレオチドと同様の複素環式塩基のスペーシングを維持するが、アキラルおよび中性電荷分子である。ペプチド核酸は、典型的には、ペプチド核酸モノマーで構成される。複素環式塩基は、標準塩基（ウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニン）のいずれかまたは下記する修飾複素環式塩基のいずれかであり得る。ＰＮＡは、１または複数のペプチドまたはアミノ酸変種および修飾を有することもできる。よって、ＰＮＡの骨格構成物は、ペプチド結合であり得る、または、あるいは、それらは非ペプチド結合であり得る。例として、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（本明細書において使用される場合、Ｏ−リンカーと称される）等、アセチルキャップおよびアミノスペーサーが挙げられる。ＰＮＡの化学的アセンブリのための方法は周知である。例えば、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号および同第５，７８６，５７１号を参照されたい。

【0080】

一部の実施形態では、核酸は、イノシン、５−（１−プロピニル）ウラシル（ｐＵ）、５−（１−プロピニル）シトシン（ｐＣ）、５−メチルシトシン、８−オキソ−アデニン、シュードシトシン、シュードイソシトシン、５および２−アミノ−５−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピリジン（２−アミノピリジン）ならびに様々なピロロおよびピラゾロピリミジン誘導体、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ−６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシ−アミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン（queosine）、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、２，６−ジアミノプリン、ならびにＯ−メチル、アミノおよびフルオロ修飾アナログ等であるがこれらに限定されない２’−修飾アナログが挙げられるがこれらに限定されない、１または複数の化学修飾された複素環式塩基を含む。２’−フルオロ（flouro）（２’−Ｆ）ピリミジンで修飾された阻害性ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで好ましい特性を有するようである。さらに、ある報告は、２’−Ｆ修飾されたｓｉＲＮＡが、２’−ＯＨ含有ｓｉＲＮＡと比較して、細胞培養において増強された活性を有することを示唆した。２’−Ｆ修飾されたｓｉＲＮＡは、マウスにおいて機能的であるが、２’−ＯＨ ｓｉＲＮＡよりも増強された細胞内活性を必ずしも持たない。

【0081】

一部の実施形態では、核酸は、２’−Ｏ−アミノエトキシ、２’−Ｏ−アミノエチル（amonioethyl）（２’−ＯＡＥ）、２’−Ｏ−メトキシ、２’−Ｏ−メチル、２−グアニドエチル（guanidoethyl）（２’−ＯＧＥ）、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−（メトキシエチル）（２’−ＯＭＥ）および２’−Ｏ−（Ｎ−（メチル）アセトアミド）（２’−ＯＭＡ）が挙げられるがこれらに限定されない、１または複数の糖部分修飾を含む。

【0082】

遺伝子療法の方法において、１または複数の核酸を運搬するナノ粒子遺伝子担体を利用して、核酸カーゴを送達することができる。遺伝子療法の方法は、典型的には、細胞の遺伝子型を変更する核酸分子の、細胞への導入に頼る。例えば、修正遺伝子は、宿主のゲノム内の非特異的位置に導入することができる。このアプローチは、典型的には、遺伝子操作されたウイルスベクター等、細胞に置き換え遺伝子を導入するための送達系を必要とする。

【0083】

他の実施形態では、機能的核酸が導入されて、欠損または疾患の原因となる特定の遺伝子の機能または発現を防止する。

【0084】

機能的核酸は、標的分子との結合または特異的な反応の触媒等、特異的な機能を有する核酸分子である。例えば、機能的核酸として、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、ＲＮＡｉおよび外部ガイド配列が挙げられるがこれらに限定されない。機能的核酸分子は、標的分子によって保有される特異的活性のエフェクター、インヒビター、モジュレーターおよび刺激物質として作用することができる、あるいは機能的核酸分子は、他のいずれかの分子に非依存的なｄｅ ｎｏｖｏ活性を保有することができる。

【0085】

機能的核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたは糖鎖等、いずれかの高分子と相互作用することができる。よって、機能的核酸は、標的ポリペプチドのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと相互作用することができる、あるいはポリペプチドそれ自体と相互作用することができる。多くの場合、機能的核酸は、標的分子および機能的核酸分子の間の配列相同性に基づき、他の核酸と相互作用するように設計される。他の状況では、機能的核酸分子および標的分子の間の特異的認識は、機能的核酸分子および標的分子の間の配列相同性に基づかないがむしろ、特異的認識を行わせる三次構造の形成に基づく。

【0086】

特定の実施形態では、阻害性核酸は、アンチセンス核酸である。アンチセンス分子は、正準または非正準塩基対形成のいずれかにより標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子および標的分子の相互作用は、例えば、ＲＮＡｓｅＨ媒介性ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分解により標的分子の破壊を促進する。あるいは、アンチセンス分子は、転写または複製等、標的分子において正常に行われるプロセシング機能を中断する。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づき設計することができる。標的分子の最も到達できる領域を見出すことによる、アンチセンス効率の最適化のための多数の方法が存在する。例示的な方法は、ＤＭＳおよびＤＥＰＣを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ選択実験およびＤＮＡ修飾試験である。アンチセンス分子が、１０^−６、１０^−８、１０^−１０または１０^−１２未満のまたはこれに等しい解離定数（Ｋ_ｄ）で標的分子に結合することが好ましい。

【0087】

アプタマーは、好ましくは特異的な仕方で、標的分子と相互作用する分子である。典型的には、アプタマーは、ステム−ループまたはＧ−カルテット等、定義された二次および三次構造へと折りたたむ１５〜５０塩基の長さに及ぶ小型の核酸である。アプタマーは、ＡＴＰおよびテオフィリン（theophiline）等の小分子ならびに逆転写酵素およびトロンビン等の大分子に結合することができる。アプタマーは、非常に緊密に、標的分子から１０−１２Ｍ未満のＫ_ｄで結合することができる。アプタマーが、１０^−６、１０^−８、１０^−１０または１０^−１２未満のＫ_ｄで標的分子に結合することが好ましい。アプタマーは、非常に高い程度の特異性で標的分子に結合することができる。例えば、標的分子および分子上の単一のポジションのみが異なる別の分子の間で１０，０００倍を超える結合親和性の差を有するアプタマーが単離された。アプタマーが、バックグラウンド結合分子とのＫ_ｄよりも少なくとも１０、１００、１０００、１０，０００または１００，０００倍低い標的分子とのＫ_ｄを有することが好ましい。ポリペプチドの比較を行う場合、例えば、バックグラウンド分子が、異なるポリペプチドであることが好ましい。

【0088】

リボザイムは、分子内または分子間のいずれかの化学的反応を触媒することができる核酸分子である。リボザイムが、分子間反応を触媒することが好ましい。ハンマーヘッド型リボザイム等、天然の系に見出されるリボザイムに基づくヌクレアーゼまたは核酸ポリメラーゼ型の反応を触媒する多数の異なる種類のリボザイムが存在する。天然の系には見出されないが、ｄｅ ｎｏｖｏで特異的な反応を触媒するように操作された、多数のリボザイムも存在する。好ましいリボザイムは、ＲＮＡ基質またはＤＮＡ基質を切断し、より好ましくは、ＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは、典型的には、標的基質の認識および結合とその後の切断により、核酸基質を切断する。この認識は多くの場合、大部分は、正準または非正準塩基対相互作用に基づく。標的基質の認識は、標的基質配列に基づくため、この特性は、リボザイムを、核酸の標的特異的切断のための特に優れた候補とする。三重鎖形成機能的核酸分子は、二本鎖または一本鎖核酸のいずれかと相互作用することができる分子である。三重鎖分子が、標的領域と相互作用する場合、ワトソン・クリックおよびフーグスティーン塩基対形成の両方に依存する複合体を形成する３本のＤＮＡ鎖が存在する三重鎖と呼ばれる構造が形成される。三重鎖分子は高い親和性および特異性で標的領域に結合することができるため、三重鎖分子が好ましい。三重鎖形成分子が、１０^−６、１０^−８、１０^−１０または１０^−１２未満のＫ_ｄで標的分子に結合することが好ましい。

【0089】

外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、複合体を形成する標的核酸分子に結合する分子であり、この複合体は、標的分子を切断するＲＮａｓｅ Ｐによって認識される。ＥＧＳは、最適なＲＮＡ分子を特異的に標的とするように設計することができる。ＲＮＡｓｅ Ｐは、細胞内の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のプロセシングに役立つ。細菌ＲＮＡｓｅ Ｐは、標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然ｔＲＮＡ基質を模倣させるＥＧＳを使用することにより、実際にいかなるＲＮＡ配列も切断するためにリクルートすることができる。同様に、ＲＮＡの真核生物ＥＧＳ／ＲＮＡｓｅ Ｐ指向性切断を利用して、真核（eukarotic）細胞内の所望の標的を切断することができる。種々の異なる標的分子の切断を容易にするためにＥＧＳ分子を作製および使用する仕方の代表例は、本技術分野で公知である。

【0090】

遺伝子発現は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により高度に特異的な様式で有効にサイレンシングすることもできる。このサイレンシングは本来、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の添加により観察された（Fire,A.ら（１９９８年）Nature、３９１巻：８０６〜１１頁；Napoli, C.ら（１９９０年）Plant Cell ２巻：２７９〜８９頁；Hannon, G.J.（２００２年）Nature、４１８巻：２４４〜５１頁）。ｄｓＲＮＡは、細胞に進入すると、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ様酵素、ダイサーによって、３’末端に２個のヌクレオチドオーバーハングを含有する２１〜２３ヌクレオチドの長さの二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断される（Elbashir, S.M.ら（２００１年）Genes Dev.、１５巻：１８８〜２００頁；Bernstein, E.ら（２００１年）Nature、４０９巻：３６３〜６頁；Hammond, S.M.ら（２０００年）Nature、４０４巻：２９３〜６頁）。ＡＴＰ依存性ステップにおいて、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを標的ＲＮＡ配列へとガイドする、ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として一般的に公知の多サブユニットタンパク質複合体へと統合されるようになる（Nykanen, A.ら（２００１年）Cell、１０７巻：３０９〜２１頁）。いくつかの点において、ｓｉＲＮＡ二重鎖が巻き戻り、アンチセンス鎖は、ＲＩＳＣに結合したままであり、エンドおよびエキソヌクレアーゼの組合せにより、相補的ｍＲＮＡ配列の分解を導くようである（Martinez, J.ら（２００２年）Cell、１１０巻：５６３〜７４頁）。しかし、ｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡの効果またはこれらの使用は、いかなる種類の機構にも限定されない。

【0091】

低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを誘導し、これにより遺伝子発現を減少またはさらには阻害することができる二本鎖ＲＮＡである。一例において、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡおよび標的ＲＮＡの両方の間の配列同一性の領域内のｍＲＮＡ等の相同ＲＮＡ分子の特異的な分解を誘発する。例えば、ＷＯ０２／４４３２１は、３’オーバーハング端と塩基対形成した場合に標的ｍＲＮＡの配列特異的分解が可能なｓｉＲＮＡを開示し、これらのｓｉＲＮＡを作製する方法について、参照により本明細書に組み込まれる。配列特異的遺伝子サイレンシングは、酵素ダイサーによって産生されるｓｉＲＮＡを模倣する合成の短い二本鎖ＲＮＡを使用して、哺乳動物細胞において達成することができる（Elbashir, S.M.ら（２００１年）Nature、４１１巻：４９４ ４９８頁）（Ui-Tei, K.ら（２０００年）FEBS Lett.４７９巻：７９〜８２頁）。ｓｉＲＮＡは、化学合成もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成することができる、または細胞の内側でｓｉＲＮＡへとプロセシングされる短い二本鎖ヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の結果であり得る。合成ｓｉＲＮＡは、一般に、アルゴリズムおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使用して設計される。サプライヤーは、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、ＭＷＢ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｓｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｂｏｕｌｄｅｒ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ）およびＱｉａｇｅｎ（Ｖｅｎｔｏ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を含む。ｓｉＲＮＡは、ＡｍｂｉｏｎのＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ｓｉＲＮＡ構築キット等のキットを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することもできる。

【0092】

ベクターからのｓｉＲＮＡの産生は、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の転写によってさらに一般的に為される。例えば、ＩｍｇｅｎｅｘのＧＥＮＥＳＵＰＰＲＥＳＳＯＲ（商標）構築キットならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＢＬＯＣＫ−ＩＴ（商標）誘導性ＲＮＡｉプラスミドおよびレンチウイルスベクター等、ｓｈＲＮＡを含むベクターの産生のためのキットを利用することができる。

【0093】

ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡは、１８〜１００ヌクレオチドの長さ、より好ましくは１８〜８０ヌクレオチドの長さであり得る。成熟ｍｉＲＮＡは、１９〜３０ヌクレオチド、好ましくは、２１〜２５ヌクレオチド、特に２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドの長さを有することができる。マイクロＲＮＡ前駆体は、典型的には、約７０〜１００ヌクレオチドの長さを有し、ヘアピン立体構造を有する。

【0094】

ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡの配列を考慮すると、このｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡの部分と十分に相補的なｍｉＲＮＡアンタゴニストを、ワトソンおよびクリックの塩基対形成の法則に従って設計することができる。本明細書において使用される場合、用語「十分に相補的」は、２つの配列が、その間に生理条件下で二重鎖を形成できるほどに十分に相補的であることを意味する。ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡ標的配列と十分に相補的なｍｉＲＮＡアンタゴニスト配列は、ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡ配列と７０％、８０％、９０％またはそれを超えて同一であり得る。一実施形態では、ｍｉＲＮＡアンタゴニストは、ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡ標的配列と相補的ではない１、２または３個以下のヌクレオチドを含有する。好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡアンタゴニストは、ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡ標的配列と１００％相補的である。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡアンタゴニストは、ヒトのｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡ配列の部分と相補的である。ｍｉＲＮＡのための配列は、例えば、ｍｉＲＢａｓｅ登録（Griffiths-Jonesら、Nucleic Acids Res.、３６巻（データベース版）：Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁（２００８年）；Griffiths-Jonesら、Nucleic Acids Res.、３６巻（データベース版）：Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁（２００８年）；Griffiths-Jonesら、Nucleic Acids Res.、３６巻（データベース版）：Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁（２００８年））および他の公共利用できるデータベースにより公で利用可能である。

【0095】

一部の実施形態では、相補性の領域においてヌクレオチドミスマッチが存在する。好ましい実施形態では、相補性の領域は、１、２、３、４または５個以下のミスマッチを有する。

【0096】

一実施形態では、ｍｉＲＮＡアンタゴニストは、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはこれらの修飾のオリゴマーまたはポリマーである。ｍｉＲＮＡアンタゴニストは、天然起源の核酸塩基、糖および共有結合性ヌクレオシド間（骨格）結合を含有するオリゴヌクレオチドを含む。

【0097】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡアンタゴニストは、アンタゴミア（antagomir）である。アンタゴミアは、例えば、Stoffelらに対するＵＳ２００７／０２１３２９２に記載されている特異的なクラスのｍｉＲＮＡアンタゴニストである。アンタゴミアは、ＲＮａｓｅ保護ならびに組織および細胞取り込み増強等の薬理的特性のための様々な修飾を含有するＲＮＡ様オリゴヌクレオチドである。アンタゴミアは、糖の完全２’−Ｏ−メチル化、ホスホロチオエート骨格および３’末端におけるコレステロール部分を有することが、通常のＲＮＡとは異なる。

【0098】

アンタゴミアは、ヌクレオチド配列の５’または３’末端に、ホスホロチオエートの少なくとも第１、第２または第３のヌクレオチド間結合を含むことができる。一実施形態では、アンタゴミアは、６個のホスホロチオエート骨格修飾を含有する；２個のホスホロチオエートは、５’末端に位置し、４個は３’末端に位置する。ホスホロチオエート修飾は、ＲＮａｓｅ活性からの保護をもたらし、その親油性は、組織取り込み増強に寄与する。

【0099】

アンタゴミアおよび他のｍｉＲＮＡ阻害剤の例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００９／０２０７７１、ＷＯ２００８／０９１７０３、ＷＯ２００８／０４６９１１、ＷＯ２００８／０７４３２８、ＷＯ２００７／０９００７３、ＷＯ２００７／０２７７７５、ＷＯ２００７／０２７８９４、ＷＯ２００７／０２１８９６、ＷＯ２００６／０９３５２６、ＷＯ２００６／１１２８７２、ＷＯ２００７／１１２７５３、ＷＯ２００７／１１２７５４、ＷＯ２００５／０２３９８６またはＷＯ２００５／０１３９０１に記載されている。

【0100】

カスタム設計されたＡｎｔｉ−ｍｉＲ（商標）分子は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。よって、一部の実施形態では、アンタゴミアは、Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）Ａｎｔｉ−ｍｉＲ（商標）阻害剤である。これらの分子は、細胞における天然起源の成熟ｍｉＲＮＡ分子を特異的に阻害するように設計された、化学修飾および最適化された一本鎖核酸である。

【0101】

カスタム設計されたＤｈａｒｍａｃｏｎ ｍｅｒｉｄｉａｎ（商標）マイクロＲＮＡヘアピン阻害剤も、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている。これらの阻害剤は、化学修飾および二次構造モチーフを含む。例えば、Vermeulenらは、ＵＳ２００６／０２２３７７７において、これらの分子の効力を増強する二次構造エレメントの同定を報告する。特に、逆相補体コア（reverse complement core）周りの高度に構造化された二本鎖の隣接領域の取り込みは、阻害剤機能を有意に増加させ、ナノモル濃度を下回る濃度でのマルチｍｉＲＮＡ阻害を可能にする。アンタゴミア設計における他のかかる改善が、開示されている方法における使用のために企図される。

【0102】

遺伝子配列ならびに適切な転写および翻訳制御エレメントを含有する発現ベクターを構築するための方法が、本技術分野で周知である。このような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えを含む。発現ベクターは、一般に、挿入されたコード配列の翻訳および／または転写に必要なエレメントである調節配列を含有する。例えば、コード配列は、好ましくは、所望の遺伝子産物の発現の制御を助けるプロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結されている。バイオテクノロジーにおいて使用されるプロモーターは、遺伝子発現の制御の意図される種類に応じた異なる種類のものである。これらは一般に、構成的プロモーター、組織特異的または発生ステージ特異的プロモーター、誘導性プロモーターおよび合成プロモーターに分けることができる。

【0103】

相同組換え（ＨＲ）等、標的組換えによる遺伝子標的化は、遺伝子修正のための別の戦略である。標的遺伝子座における遺伝子修正は、標的遺伝子と相同なドナーＤＮＡ断片によって媒介することができる（Huら、Mol. Biotech.、２９巻：１９７〜２１０頁（２００５年）；Olsenら、J. Gene Med.、７巻：１５３４〜１５４４頁（２００５年））。標的化組換えの一方法は、配列特異的様式で二重鎖ＤＮＡにおけるホモプリン／ホモピリミジン部位に第３の鎖として結合する、三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）の使用を含む。三重鎖形成オリゴ（oigo）ヌクレオチドは、二本鎖または一本鎖核酸のいずれかと相互作用することができる。三重鎖分子が、標的領域と相互作用するときに、ワトソン・クリックおよびフーグスティーン塩基対形成の両方に依存して複合体を形成する３本のＤＮＡ鎖が存在する、三重鎖と呼ばれる構造が形成される。三重鎖分子は高い親和性および特異性で標的領域に結合することができるため、三重鎖分子が好ましい。三重鎖形成分子が、１０−６、１０−８、１０−１０または１０−１２未満のＫｄで標的分子に結合することが好ましい。

【0104】

三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）を使用した標的化遺伝子療法のための方法は、米国特許出願公開第２００７０２１９１２２号に記載されており、ＨＩＶ等、感染性疾患を処置するためのその使用は、米国特許出願公開第２００８０５０９２０号に記載されている。三重鎖形成分子はまた、米国特許出願公開第２０１１／０２６２４０６号に記載されているもの等、テールクランプ（tail clamp）ペプチド核酸（ｔｃＰＮＡ）であり得る。高度に安定的なＰＮＡ：ＤＮＡ：ＰＮＡ三重鎖構造物は、２本のＰＮＡ鎖による二重鎖ＤＮＡの鎖侵入から形成することができる。この複合体において、ＰＮＡ／ＤＮＡ／ＰＮＡトリプルヘリックス部分およびＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖部分は両者共に、ピリミジンリッチトリプルヘリックスの変位を生じ、ヌクレオチド切除修復経路を強く誘発し、ドナーオリゴヌクレオチドによる組換えのための部位を活性化することが示されてきた変更された構造をもたらす。２本のＰＮＡ鎖を一体に連結して、ビス−ＰＮＡ分子を形成することもできる。三重鎖形成分子は、修正された配列をもたらす１または複数のドナーオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用される場合、哺乳動物細胞における部位特異的相同組換えの誘導に有用である。ドナーオリゴヌクレオチドは、三重鎖形成分子に繋留することができる、あるいは三重鎖形成分子から分離することができる。ドナーオリゴヌクレオチドは、標的二重鎖ＤＮＡと比べて少なくとも１個のヌクレオチド変異、挿入または欠失を含有することができる。

【0105】

一対の偽相補的（pseudocomplementary）オリゴヌクレオチド等、二重の二重鎖形成分子は、染色体部位におけるドナーオリゴヌクレオチドによる組換えを誘導することもできる。標的化遺伝子療法における偽相補的オリゴヌクレオチドの使用は、米国特許出願公開第２０１１／０２６２４０６号に記載されている。偽相補的オリゴヌクレオチドは、例えば立体障害により互いに認識またはハイブリダイズしないが、それぞれが、標的部位における相補的核酸鎖を認識およびハイブリダイズすることができるように、１または複数の修飾を含有する相補的オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、偽相補的オリゴヌクレオチドは、偽相補的（pseudocomplemenary）ペプチド核酸（ｐｃＰＮＡ）である。偽相補的オリゴヌクレオチドは、標的二本鎖ＤＮＡにおけるポリプリン配列を必要とするトリプルヘリックスオリゴヌクレオチドおよびビス−ペプチド核酸等、誘導された組換えの方法よりもさらに効率的であり得、柔軟性増加をもたらすことができる。

【0106】

ナノ粒子内のコアポリマーに対する核酸のモル比は、少なくとも０．５、１、１０、１００、１０００または１０００超であり得る。
４．追加的な活性薬剤

【0107】

ナノ粒子遺伝子担体は、「遺伝子」材料のみを運搬することができる、あるいは適用に応じて他の治療剤、予防剤および／または診断剤を共送達することができる。しかし、収載されている機能を行うことができるいずれかの「遺伝子」材料をナノ粒子にパッケージすることができる。例えば、ｐ５３およびＲｂ等、腫瘍サプレッサー遺伝子は、抗炎症機能、抗ウイルス機能等を保有するいずれかのプラスミドＤＮＡまたはｓｉＲＮＡのように、ナノ粒子において複合体形成して、がん患者のために使用することができる。

【0108】

これらの追加的な活性薬剤は、ナノ粒子遺伝子担体に分散させることができる、あるいはナノ粒子のポリマー構成成分のうち１または複数に共有結合により結合させることができる。

【0109】

適した追加的な活性薬剤として、他の核酸に基づく医薬、抗炎症薬、抗増殖薬、化学療法薬、血管拡張薬および抗感染剤が挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、ナノ粒子遺伝子担体は、トブラマイシン、コリスチンまたはアズトレオナム等、１または複数の抗生物質を含有する。開示されているナノ粒子遺伝子担体は、エリスロマイシン、アジスロマイシンまたはクラリスロマイシン等、抗炎症活性を保有することが公知の１または複数の抗生物質を任意選択で含有することができる。ナノ粒子は、化学療法剤および抗増殖剤の送達に使用することもできる。
５．ナノ粒子特性

【0110】

実施例に示されている通り、開示されているナノ粒子は、コーティングされていない粒子、例えば、コーティングされていないＰＥＩ粒子等、参照ナノ粒子よりも大きい拡散率の速度（rate of diffusivity）で脳のＥＣＭの細孔を通して拡散する。
ｉ．粒子拡散率

【0111】

開示されているナノ粒子は、参照粒子よりも少なくとも５、１０、２０、３０、５０、６０、８０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、５００、６００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、１００００倍またはそれを超える高い拡散率の速度で、脳のＥＣＭの細孔を通過することができる。

【0112】

粒子の輸送速度は、本技術分野における種々の技法を使用して測定することができる。一実施形態では、拡散の速度（rate of diffusion）は、幾何的アンサンブル平均二乗変位（ＭＳＤ）によって測定される。特定の実施形態では、粒子は、参照粒子よりも少なくとも５、１０、２０、３０、５０、６０、８０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、５００、６００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、１００００倍またはそれを超える高いＭＳＤで、脳のＥＣＭの細孔を通して拡散することができる。

【0113】

他の実施形態では、開示されているナノ粒子は、粒子が水を通って拡散する拡散率の速度に近づく速度で脳のＥＣＭの細孔を通って拡散する。特定の実施形態では、拡散率速度は、同一条件下における水中の粒子の拡散率の速度の少なくとも１／１０００、１／８００、１／７００、１／６００、１／５００、１／４００、１／２５０、１／２００、１／１５０、１／１００、１／７５、１／５０、１／２５、１／１０、１／７、１／５、１／２または１倍である。例えば、１秒間のタイムスケールで、非修飾粒子または参照粒子の拡散の速度は、脳組織において、水中の同じ粒子よりも遅くなり得る。

【0114】

ＰＥＧまたは他の材料のコーティングの密度は、脳実質内におけるナノ粒子の拡散に影響を与えることができる。一部の実施形態では、高密度にペグ化された粒子の１秒間におけるＭＳＤは、より低密度にペグ化された粒子よりも少なくとも５倍大きい、または非ペグ化粒子のＭＳＤよりも少なくとも２９倍高い。さらなる実施形態では、高密度にペグ化された粒子の１秒間における平均二乗変位（ＭＳＤ）は、脳組織において、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）におけるよりも僅か２６０倍遅いかまたはそれ未満遅い一方、より低密度にペグ化された粒子は、最大９３０倍遅くなることができ、非ペグ化粒子は、最大６，９００倍遅くなることができる。特定の実施形態では、高密度にペグ化されたナノ粒子の少なくとも６３％が、それぞれより低密度にペグ化された粒子の３２．９％および非ペグ化粒子の１０．３％と比べ、ラット脳実質を通って移動することができる。

【0115】

粒子輸送速度における不均一性は、特定の期間、例えば、１秒間にわたる個々の粒子拡散率の分布を試験することによって評価することもできる。一実施形態では、所定の平均粒子サイズのコーティングされた粒子の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％またはそれ超が、拡散性として分類される。
ｉｉ．界面動電位

【0116】

ＰＥＧまたはコーティング剤の存在は、粒子のゼータ電位に影響を与えることができる。一実施形態では、粒子のゼータ電位は、−１０ｍＶ〜１００ｍＶの間、−１０〜５０ｍＶの間、−１０ｍＶ〜２５ｍＶの間、−５ｍＶ〜２０ｍＶの間、−１０ｍＶ〜１０ｍＶの間、−１０ｍＶ〜５ｍＶの間、−５ｍＶ〜５ｍＶの間または−２ｍＶ〜２ｍＶの間である。好ましい実施形態では、表面電荷は、ほぼ中性である。
ｉｉｉ．粒子サイズ

【0117】

一部の実施形態では、開示されているナノ粒子は、脳のＥＣＭにおける細孔に等しいまたはそれよりも小さい平均直径を有する。特定の実施形態では、粒子は、約４０ｎｍから最大約１５０ｎｍ、最大約１００ｎｍまたは最大約６０ｎｍ、より好ましくは約５０ｎｍの平均直径を有する。粒子サイズは、本技術分野で公知のいずれかの技法を使用して、例えば、動的光散乱を使用して測定することができる。粒子サイズは、集団に対して参照することもでき、粒子の６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％のパーセンテージが、特定の範囲内の直径を有する。

【0118】

別の実施形態では、粒子は、粒子の大部分が、より大型の粒子と比較して、組織内の細胞またはマイクロドメイン内に局在しなくなるような平均直径を有する。表１に示す通り、５０ｎｍの平均粒子サイズを有する粒子は、齧歯類の脳における蛍光標識された遺伝子ベクターの多重粒子追跡（multiple particle tracking）（ＭＰＴ）を使用して測定される通り、高密度にペグ化した場合、１秒間におけるより大きいＭＳＤを示した。

【0119】

ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも１０分間、２０分間、３０分間、１時間、２時間、４時間（hour hours）、６時間、１０時間、１日間、３日間、７日間、１０日間、２週間、１ヶ月間またはそれより長い期間にわたって有効量の核酸を放出する。
ｉｖ．毒性

【0120】

ＰＥＧまたは他のコーティング剤で高密度にコーティングされた開示されているナノ粒子は、コーティングされていないまたは従来の通りにコーティングされた粒子よりも毒性が低い。ナノ粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ毒性は、細胞生存率アッセイ等、本技術分野で公知のいずれかの技法を使用して評価することができる。一部の実施形態では、粒子の毒性は、ＤＮＡに対するポリマーの比に関連する。例えば、１または２または３または４のＤＮＡに対するポリマーの比は、５またはそれを超える比等、４を超えるＤＮＡに対するポリマーの比よりも毒性が低くなることができる。

【0121】

ナノ粒子の毒性は、細胞型または組織型に依存性であり得、ナノ粒子の濃度に依存することができる。一部の実施形態では、１０μｇ／ｍｌの濃度のナノ粒子への２時間の曝露後に正常初代細胞の７５％が生存可能である場合、毒性は、低いと考えられる。
Ｂ．脳への送達のための医薬賦形剤

【0122】

粒子は、生理的または薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と組み合わせて投与することができる。医薬組成物は、活性化合物から薬学的に使用できる調製物への加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１または複数の生理的に許容される担体を使用して、従来の様式で製剤化することができる。適した製剤は、選択された投与経路に依存する。好ましい実施形態では、粒子は、脳への非経口的送達のために製剤化される。典型的には、粒子は、処置しようとする組織または細胞への注射のための無菌生理食塩水または緩衝溶液において製剤化される。粒子は、使用直前の再水分補給のために、単回使用バイアルにおいて凍結乾燥して貯蔵することができる。再水分補給および投与のための他の手段は、当業者に公知である。

【0123】

任意選択の薬学的に許容される賦形剤として、安定剤および界面活性剤が挙げられるがこれらに限定されない。

【0124】

安定剤は、例として酸化的反応を含む分解反応の阻害または遅延に使用される。

【0125】

ナノ粒子またはナノコンジュゲートは、投与の容易さおよび投薬量の均一性のため、単位剤形で製剤化することができる。表現「単位剤形」は、本明細書において使用される場合、処置しようとする患者に適切なコンジュゲートの物理的に別々の単位を指す。しかし、組成物の毎日の総使用量が、健全な医学的判断の範囲内において主治医によって決断されることが理解される。いずれかのナノ粒子またはナノコンジュゲートのため、治療有効用量は、細胞培養アッセイまたは動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌもしくはブタのいずれかにおいて最初に推定することができる。動物モデルを使用して、望ましい濃度範囲および投与経路も達成する。続いて、かかる情報を使用して、ヒトにおける投与に有用な用量および経路を決定することができる。コンジュゲートの治療有効性および毒性は、細胞培養物または実験動物における標準薬学手順、例えば、ＥＤ５０（用量が、集団の５０％において治療上有効である）およびＬＤ５０（用量が、集団の５０％にとって致死的である）によって決定することができる。治療効果に対する毒性の用量比は、治療指数であり、比、ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現することができる。大きい治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒト使用のためのある範囲の投薬量の製剤化において使用することができる。
ＩＩ．製造方法
Ａ．ポリマー調製

【0126】

ポリマーは、本技術分野で公知のいずれかの手段により合成することができる。ＰＥＧまたは他のコーティング剤は、コーティングが、粒子と共有結合によりまたは非共有結合により会合しているかに応じて、本技術分野で公知の種々の技法を使用して、コアポリマーにコンジュゲートすることができる。

【0127】

一部の実施形態では、ＰＥＧまたは他のコーティング剤は、粒子における官能基をＰＥＧまたは他のコーティング剤における反応性官能基と反応させて、コポリマーを作製することにより、コアポリマーに共有結合により結合させることができる。例えば、アミノ化ＰＥＧは、カルボン酸基等、粒子における反応性官能基と反応させて、アミド結合により薬剤を共有結合により結合させることができる。

【0128】

一実施形態では、メトキシ−ＰＥＧ−ＮＨＳは、２５ｋＤａ分岐状ＰＥＩにコンジュゲートされて、ＰＥＧ−ＰＥＩコポリマーを生じる。その結果得られるＰＥＩコポリマーのペグ化の程度は、ＰＥＩに加えられるＰＥＧのモル比を変動させることにより変動され得る。

【0129】

一部の実施形態では、ナノ粒子は、ペグ化および非ペグ化ポリマーの混合物から形成される。非ペグ化ポリマーは、粒子における総遊離アミンの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％または５０％超等、規定量の総遊離アミンに寄与することができる。
Ｂ．ナノ粒子

【0130】

開示されているナノ粒子遺伝子担体は、本技術分野で公知のポリマーナノ粒子の形成のためのいずれか適した方法を使用して、１または複数のカチオン性ポリマー、１または複数のＰＥＧまたは他のコーティング剤、および１または複数の核酸から形成することができる。ナノ粒子形成のために用いられる方法は、ナノ粒子遺伝子担体に存在するポリマーの特徴ならびに所望の粒子サイズおよびサイズ分布を含む種々の因子に依存する。

【0131】

粒子の単分散集団が望まれる状況において、粒子は、ナノ粒子の単分散集団を産生する方法を使用して形成することができる。あるいは、多分散ナノ粒子分布を産生する方法を使用することができ、粒子は、粒子形成後の篩い分け等、本技術分野で公知の方法を使用して分離して、所望の平均粒子サイズおよび粒子サイズ分布を有する粒子の集団をもたらすことができる。

【0132】

ナノ粒子遺伝子担体を調製するための一般的な技法として、溶媒蒸発、溶媒除去、噴霧乾燥、転相、低温鋳造およびナノ沈殿が挙げられるがこれらに限定されない。粒子製剤化の適した方法について簡潔に下記する。ｐＨ修飾剤、崩壊剤、保存料および抗酸化剤を含む薬学的に許容される賦形剤を、粒子形成の際に粒子に任意選択で取り込むことができる。上記の通り、１または複数の追加的な活性薬剤を粒子形成の際にナノ粒子遺伝子担体に取り込むこともできる。
１．溶媒蒸発

【0133】

本方法において、ポリマーは、塩化メチレン等、揮発性有機溶媒に溶解される。核酸を溶液に添加し、ポリ（ビニルアルコール）等、表面活性剤を含有する水溶液にこの混合物を懸濁する。その結果得られるエマルションは、有機溶媒の大部分が蒸発して固体ナノ粒子を残すまで撹拌する。その結果得られるナノ粒子を水で洗浄し、凍結乾燥器中で一晩乾燥させる。本方法により、異なるサイズおよび形態を有するナノ粒子を得ることができる。本方法は、ポリエステルおよびポリスチレンのような、相対的に安定的なポリマーに有用である。

【0134】

しかし、ポリ酸無水物等、不安定ポリマーは、水の存在のため、製作過程において分解し得る。これらのポリマーのため、完全に無水の有機溶媒において行われる次の２種の方法が、より有用である。
２．溶媒除去

【0135】

本技法は、主にポリ酸無水物のために設計される。本方法において、薬物は、塩化メチレンのような揮発性有機溶媒に溶解した選択されたポリマーの溶液において分散または溶解される。この混合物を有機油（シリコンオイル等）において撹拌することにより懸濁して、エマルションを形成する。溶媒蒸発とは異なり、本方法を使用して、高い融点および異なる分子量を有するポリマーからナノ粒子を作製することができる。本技法により産生される球体の外部形態は、使用されるポリマーの種類に高度に依存する。
３．噴霧乾燥

【0136】

本方法において、ポリマーは、有機溶媒に溶解される。公知の量の活性薬物をポリマー溶液に懸濁し（不溶性薬物）または共溶解（可溶性薬物）する。次に、溶液または分散物を噴霧乾燥する。
４．転相

【0137】

マイクロスフェアは、転相方法を使用して、ポリマーから形成することができ、この方法において、ポリマーは、「優れた」溶媒に溶解され、薬物等、取り込むべき物質の微粒子は、ポリマー溶液において混合または溶解され、この混合物をポリマーのための強い非溶媒に注いで、好ましい条件下で、ポリマーマイクロスフェアを自発的に産生し、ポリマーは粒子でコーティングされる、あるいは粒子はポリマーに分散される。この方法を使用して、例えば、約１００ナノメートル〜約１０ミクロンを含む広範囲のサイズでナノ粒子を生成することができる。使用することができる例示的なポリマーは、ポリビニルフェノールおよびポリ乳酸を含む。取り込むことができる物質は、例えば、蛍光色素等の造影剤またはタンパク質もしくは核酸等の生物学的活性分子を含む。この過程において、ポリマーを有機溶媒に溶解し、次に非溶媒と接触させ、これは、溶解されたポリマーの転相を引き起こして、抗原または他の物質を任意選択で取り込む、狭いサイズ分布を有する小型の球状粒子を形成する。

【0138】

ナノ粒子の調製に使用することができる本技術分野で公知の他の方法として、多価電解質縮合（Sukら、Biomaterials、２７巻、５１４３〜５１５０頁（２００６年）を参照）；シングルおよびダブルエマルション（プローブ超音波処理）；ナノ粒子成形および静電自己集合（例えば、ポリエチレンイミン−ＤＮＡまたはリポソーム）が挙げられるがこれらに限定されない。
ＩＩＩ．使用方法

【0139】

ＰＥＧ等、表面コーティング剤の密度および組成は、脳実質の至る所に拡散する粒子の能力を決定することができることが確立された。実施例に記載されている通り、切除された齧歯類脳スライスにおいて、ナノ粒子（約５０ｎｍ直径粒子）の拡散限界をｅｘ ｖｉｖｏで調査した。多重粒子追跡（ＭＰＴ）および最適化されたペグ化プロトコールを使用して、ＰＥＧコーティング密度および分子量における差が、接着性相互作用からの粒子の遮蔽ならびにｉｎ ｖｉｖｏにおけるより均一なその浸透および分布を可能にする能力に有意な影響を有することが示された。

【0140】

したがって、本明細書に記載されている粒子組成物を使用して、脳に直接的に１または複数の治療剤、予防剤および／または診断剤を投与して、脳の１または複数の疾患または障害を処置することができる。
Ａ．治療上の使用

【0141】

１または複数の核酸を運搬するナノ粒子遺伝子担体を利用して、遺伝子療法の方法における等、治療または予防目的の核酸カーゴを送達することができる。遺伝子療法の方法は典型的に、細胞の遺伝子型を変更する核酸分子の、細胞への導入に依拠する。核酸分子の導入は、遺伝子組換えにより内在性遺伝子を修正、置き換えまたは他の仕方で変更することができる。方法は、欠損遺伝子の置き換えコピー全体、異種遺伝子またはオリゴヌクレオチド等の小型の核酸分子の導入を含むことができる。例えば、修正遺伝子は、宿主ゲノム内の非特異的な位置に導入することができる。このアプローチは典型的には、遺伝子操作されたウイルスベクター等、細胞に置き換え遺伝子を導入するために送達系を必要とする。
１．処置しようとする障害または疾患

【0142】

開示されている組成物および方法によって処置することができる脳の例示的な疾患および障害は、新生物（がん、腫瘍、成長）、感染症（ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、結核）、炎症（多発性硬化症、横断性脊髄炎および他の自己免疫性過程、脳または組織浮腫および他の反応性過程）、後天性または変性状態（アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、筋萎縮性（amylotrophic）側索硬化症、急性および慢性外傷性および疼痛症候群）、先天性または遺伝的異常（神経線維腫症、ムコ多糖症（mucopolysaccaridoses）、結節性硬化症、フォンヒッペル・リンダウ病）、エピジェネティック状態ならびに脳外傷または傷害を含む。
Ｂ．投与および投薬方法

【0143】

開示されているナノ粒子は、種々の投与経路によって投与することができる。ある特定の実施形態では、粒子は、脳に直接的に投与される。他の実施形態では、粒子は、全身的に投与される。

【0144】

脳ＥＣＭの組成は、その構成成分およびそれらの間の空間（「細孔」）の物理化学的特性を含め脳内における物質の浸透を決定する重要な因子である。

【0145】

露出された疎水性領域を有する遮蔽されていない負電荷を持つ粒子は、粒子サイズにかかわらず有意に妨害された拡散を有する。粒子表面およびＥＣＭ構成成分の間の疎水性相互作用は、有意な接着の供給源であり得る。静電力および疎水性力を含む潜在的な相互作用からの適切な表面遮蔽は、脳における急速拡散に決定的である。

【0146】

脳への開示されている遺伝子ベクターの増強された送達のための機構が開示されている。増強された局所送達は、対流、電磁（electricomagnetic）または他の力により達成することができる。増強された全身性送達は、薬理物質（例えば、サイトカイン）、機械的な関門破壊（例えば、超音波）または浸透圧変化（例えば、マンニトール）等が挙げられるがこれらに限定されない、透過処理（permeabliization）剤との共（co-）または逐次投与により達成することができる。他の送達方法は、脳脊髄液空間を介したくも膜下腔内または脳室内送達、嗅球を介した鼻腔内投与または送達および経口、静脈内または動脈内投与を介した全身性送達を含む。
１．対流増強送達

【0147】

一部の実施形態では、開示されているナノ粒子の脳浸透能力は、対流増強送達（ＣＥＤ）後に増強される。

【0148】

ＣＥＤは、脳の実質内に備え付けられ、陽圧および一定流量の注入液をもたらすポンプに取り付けられた針を通して薬物が送達される方法である。例えば、高密度にペグ化されたナノ粒子薬物は、定位で、例えば、脳腫瘍塊内にまたは腫瘍もしくは摘出空洞周りに直接置かれた１から数個のカテーテルを通して送達することができる。

【0149】

一部の実施形態では、ＣＥＤは、変動サイズの分子の分布を有意に増強し、注入される化合物の局所領域的濃度を増加させることができる。ある特定の実施形態では、高密度にペグ化された粒子を送達するためのＣＥＤの使用は、予想を超える程度まで、脳の至る所への粒子の分布を増強する。一部の実施形態では、遺伝子ベクター分布および高レベル導入遺伝子発現は、線条体全体の至る所に達成することができる。参照粒子等の粒子が、接着性相互作用および／または立体障害のために、脳実質に捕捉されたままである場合、ＣＥＤは、著しい利益をもたらす可能性が低い。よって、脳実質における妨げられない拡散を可能にする粒子の物理化学的特性は、ＣＥＤ後の粒子浸透増強の達成にとって依然として重大な意味を持つ。
２．投与レジメ

【0150】

一般に、投与のタイミングおよび頻度は、所定の送達系の副作用と、所定の処置または診断スケジュールの有効性のバランスを取るように調整される。例示的な投薬頻度は、毎時、毎日、毎週、毎月または毎年の投薬等、連続的注入、単一および複数の投与を含む。

【0151】

全身性、くも膜下腔内または脳実質それ自体への局所送達にかかわらず、脳および他の組織における生理活性剤または造影剤の浸透は、有効な治療法および診断に対する重要な障害物であった。ウイルス送達、ナノ粒子送達および対流増強送達を使用した多数の試験は、脳内における物質の限定的な移動のために失敗した。したがって、重大な意味を持つ制限パラメータを定義することおよび脳浸透を増強するための戦略をデザインすることは、これらの処置の有効性を改善する可能性がある。高密度にペグ化されたナノ粒子は、粒子拡散増加、安定性改善および徐放動態の延長を含む多数の追加的な利点を提供する。これらの因子は、多くの治療法の有効性と相関することが公知であり、脳への診断および治療送達に対するナノサイズの担体の有用性に有意な影響を有する可能性がある。

【実施例】

【0152】

本発明は、次の非限定例を参照することによりさらに理解される。
（実施例１）
カチオン性ポリマーに基づく遺伝子ベクターに固有の正の表面電荷を遮蔽するためのベクターの調製
材料と方法
ポリマー調製

【0153】

以前に記載された通りに、メトキシＰＥＧ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ、５ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を２５ｋＤａ分岐状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）にコンジュゲートして、ＰＥＧ５ｋ−ＰＥＩコポリマーを得た［３０］。簡潔に説明すると、ＰＥＩを超高純度蒸留水に溶解し、ｐＨを７．５〜８．０に調整し、ｍＰＥＧ−ＮＨＳをＰＥＩ溶液に様々なモル比で添加して、４℃で一晩反応させた。このポリマー溶液を超高純度蒸留水に対し大規模に透析し（２０，０００ＭＷＣＯ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ）、凍結乾燥した。核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用して、８、２６、３７および５０のＰＥＧ：ＰＥＩ比を確認した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ２．４８−３．２０（ｂｒ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）、３．６２−３．７２（ｂｒ、ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）。以前に発表された通りに、ポリ−Ｌ−リシン ３０−ｍｅｒ（ＰＬＬ）およびＰＥＧ５Ｋ−ＰＬＬブロックコポリマーを合成し、特徴付けた［Suk, J.S.ら、J Control Release、２０１４年；Kim, A.J.ら、J Control Release、２０１２年、１５８巻（１号）：１０２〜７頁］。凍結乾燥したポリマーを超高純度蒸留水に溶解し、ｐＨを約６．５〜７に調整した。
遺伝子ベクター複合体形成

【0154】

ｐｄ１ＧＬ３−ＲＬプラスミドＤＮＡは、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｍ．Ｋｌｉｂａｎｏｖ教授（Ｍ．Ｉ．Ｔ）からのご厚意による寄贈であり、ｐＥＧＦＰプラスミドは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ）から購入した。以前に記載された通りにプラスミドＤＮＡを増やし、精製した［Suk, J.S.ら、J Control Release、２０１４年］。Ｍｉｒｕｓ Ｌａｂｅｌ ＩＴ（登録商標）Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）細胞内核酸局在キット（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、Ｃｙ３またはＣｙ５フルオロフォアによりプラスミドＤＮＡに蛍光タグを付けた。１０容量の標識または非標識プラスミドＤＮＡ（０．２ｍｇ／ｍｌ）を、１容量の回旋しているポリマー溶液に滴下して加えることにより、遺伝子ベクターを形成させた。以前に最適化された窒素対リン酸（Ｎ／Ｐ）比６およびＰＥＧ５ｋ−ＰＥＩ対ＰＥＩモル比３で、ＰＥＩ溶液を調製した。遊離ＰＥＩおよび（ＰＥＧ５ｋ）８−ＰＥＩに基づく遺伝子ベクター対照の製剤のため、それぞれ１００％の遊離ＰＥＩまたは（ＰＥＧ５ｋ）８−ＰＥＩを使用して、Ｎ／Ｐ比６でＰＥＩ溶液を調製した。蛍光イメージングのため、Ｃｙ３またはＣｙ５標識されたＤＮＡを使用して、蛍光標識された遺伝子ベクターをアセンブルした。プラスミド／ポリマー溶液を３０分間室温でインキュベートして、遺伝子ベクターを形成させた。遺伝子ベクターを３容量の超高純度蒸留水で２回洗浄し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）超遠心フィルター（１００，０００ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して、１ｍｇ／ｍｌに再濃縮して、遊離ポリマーを除去した。ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用して、２６０ｎｍの吸光度によりＤＮＡ濃度を決定した。以前に記載された通りに、Ｎ／Ｐ比２で、ＰＥＧ−ＰＬＬナノ粒子を同様に調製した［Suk, J.S．ら、J Control Release、２０１４年；Kim, A.J.ら、J Control Release、２０１２年、１５８巻（１号）：１０２〜７頁；Boylan, N.J.ら、Biomaterials、２０１２年、３３巻（７号）：２３６１〜７１頁］。
ナノ粒子の物理化学的特徴付け

【0155】

Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ ＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）を使用して、それぞれ動的光散乱およびレーザードプラ流速測定（anemometry）により、ｐＨ７．０の１０ｍＭ ＮａＣｌにおいて水力学直径、ζ−電位および多分散を測定した。透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈ７６００、Ｊａｐａｎ）を使用して遺伝子ベクターを画像化して、その形態およびサイズを決定した。
結果

【0156】

カチオン性遺伝子ベクターに固有の正の表面電荷を有効に遮蔽するために、ＰＥＩにコンジュゲートされた複数の５ｋＤａ ＰＥＧ分子のコポリマー（ＰＥＧ５ｋ−ＰＥＩ）を使用した遺伝子ベクターを、ある範囲のＰＥＧ対ＰＥＩモル比で製剤化した。以前に報告された通り、カチオン性ポリマーのペグ化は、ＰＥＧコンジュゲーションに起因する利用できる正電荷の低下およびグラフトされたＰＥＧ鎖によって課される追加的な立体障害により、ＤＮＡ複合体形成にマイナスの影響を有し得る［Petersen, H.ら、Bioconjug Chem、２００２年、１３巻（４号）：８４５〜５４頁］。よって、高度にペグ化されたＰＥＩコポリマーのみを使用した、従来のＤＮＡ複合体形成方法は、生物学的標本においてその安定性を保持する可能性が低い、緩い不安定なＤＮＡナノ粒子を生じる。コンパクトでコロイド的に安定的な遺伝子ベクターを達成するために、Suk, J.S.ら、J Control Release、２０１４年に記載されている通り、ＰＥＧ５ｋ−ＰＥＩと遊離ＰＥＩに由来する２５％のアミンを有する遊離ＰＥＩとのブレンドによりベクターを製剤化した。固定量の遊離ＰＥＩを使用して、広範囲のＰＥＧ対ＰＥＩモル比によるＰＥＧ５ｋ−ＰＥＩコポリマーを使用し、約５０ｎｍ粒子におけるＤＮＡのコンパクションを達成した（表２）。従来使用されたペグ化比よりも相当に高い、ＰＥＧ対ＰＥＩ比２６によるコポリマーの使用［Petersen, H.ら、Bioconjug Chem、２００２年、１３巻（４号）：８４５〜５４頁；Malekら、J Drug Target、２００８年、１６巻（２号）：１２４〜３９頁；Merkelら、Biomaterials、２０１１年、３２巻（２１号）：４９３６〜４２頁］は、ほぼ中性のζ−電位（表１）を有する遺伝子ベクターの形成に十分であり、脳浸透を潜在的に可能にする（脳浸透ナノ粒子；以後ＢＰＮ）。その後の試験において、ペグ化ＰＥＩとより低いＰＥＧ対ＰＥＩ比８からなる同様のサイズの従来通りにペグ化されたナノ粒子（ＣＰＮ）［Petersenら、Bioconjug Chem、２００２年、１３巻（４号）：８４５〜５４頁；Malekら、Toxicol Appl Pharmacol、２００９年、２３６巻（１号）：９７〜１０８頁；Lutzら、Methods Mol Biol、２００８年、４３３巻：１４１〜５８頁］および非ペグ化ＰＥＩナノ粒子（ＵＰＮ）と、ＢＰＮを比較した。ＢＰＮ、ＣＰＮおよびＵＰＮの物理化学的特性は、表１に要約されている。注目すべきことに、ＣＰＮは、ＢＰＮと比較して、より大型の粒子直径およびより正の表面電荷を保有し、より緩いコンパクションおよび／またはより劣る表面コーティングを示唆する。

【0157】

【表1】

【0158】

ｐＨ７．０の１０ｍＭ ＮａＣｌにおいて、動的光散乱（ＤＬＳ）によりサイズ、ζ−電位および多分散（ＰＤＩ）を測定し、少なくとも３回の測定の平均±標準誤差（ＳＥＭ）として示す。齧歯類脳スライスにおける蛍光標識された遺伝子ベクターの多重粒子追跡（ＭＰＴ）を使用して、１秒間の平均二乗変位（ＭＳＤ）を測定した。ストークス・アインシュタイン方程式および平均粒子直径を使用して、ａＣＳＦにおけるＮＰ拡散率を計算した。３７℃１時間のａＣＳＦにおけるインキュベーション後に、ＤＬＳによりａＣＳＦにおける水力学直径を測定した。ＵＰＮ：非ペグ化ナノ粒子、ＣＰＮ：従来通りにペグ化されたナノ粒子、ＢＰＮ：脳浸透ナノ粒子。

【0159】

【表2】

【0160】

ｐＨ７．０の１０ｍＭ ＮａＣｌにおいて、動的光散乱（ＤＬＳ）によりサイズ、ζ−電位および多分散（ＰＤＩ）を測定し、少なくとも３回の測定の平均±標準誤差（ＳＥＭ）として示す。

【0161】

脳におけるナノ粒子拡散は、細胞間の狭い湾曲した空間を介して主に起こる［Sykova, E.およびC. Nicholson、Physiol Rev、２００８年、８８巻（４号）：１２７７〜３４０頁］。細胞外空間の主要構成成分であるＥＣＭは、脳実質を通したナノ粒子の移動に対し接着性の立体的関門を課す。本試験におけるＵＰＮおよびＣＰＮにより示される通り、ＥＣＭの豊富な負の電荷との非特異的静電相互作用は、遮蔽が不十分なカチオン性ポリマーに基づく遺伝子ベクターの拡散を妨害する［Zimmermannら、Histochem Cell Biol、２００８年、１３０巻（４号）：６３５〜５３頁；Ruoslahti、Glycobiology、１９９６年、６巻（５号）：４８９〜９２頁］。したがって、ＢＰＮの急速脳浸透は、カチオン性ポリマーに基づく遺伝子ベクターに固有のこのような正の表面電荷の効率的な遮蔽に起因する可能性が最も高い。さらに、ブレンド技法によって可能になった高密度表面ＰＥＧコーティングは、ＢＰＮに、立体障害によって妨害されることのないＥＣＭメッシュ細孔を通した移動に必要とされる、生理的条件（すなわち、ＣＳＦ）におけるそのコンパクトな１００ｎｍに満たないサイズを保持させる。比較すると、安定性を欠く緩いコンパクションおよびＣＰＮを含む従来通りにペグ化されたカチオン性粒子の凝集する傾向は、２００ｎｍよりも小さい細孔サイズを有するＥＣＭを通した効率的な浸透をもたらさない［Nance, E.A.ら、Sci Transl Med、２０１２年、４巻（１４９号）：１４９ｒａ１１９頁、MacKayら、Brain Res、２００５年、１０３５巻（２号）：１３９〜５３頁］。これらの結果は、脳ＥＣＭによって課される接着性相互作用および立体障害の両方を克服することができる遺伝子ベクターの設計の重要性を実証する。
（実施例２）
遺伝子ベクター粒子は、生理的環境におけるインキュベーション後に安定的である
材料と方法

【0162】

人工脳脊髄液（ａＣＳＦ；Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）において３７℃でナノ粒子をインキュベートし、３０分毎に２４時間動的光散乱を行うことにより、ＰＥＩナノ粒子安定性を評価した。１時間のインキュベーション後に、ナノ粒子溶液の一部を取り出し、ＴＥＭを使用して画像化した。
結果

【0163】

ｉｎ ｖｉｖｏ投与後の遺伝子ベクターの粒子安定性を予測するために、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性を３７℃で経時的に特徴付けた（図１）。ＵＰＮは、ａＣＳＦにおける添加の直後に凝集した。１時間で、水力学直径は８．３倍増加し、７時間で、多分散は０．５よりも大きく、コロイド安定性の喪失を示す。ＣＰＮは、ａＣＳＦにおけるインキュベーション後に直径が３倍増加し、２４時間にわたり安定性を維持した。ブレンドアプローチによって製剤化されたＢＰＮは、ＵＰＮおよびＣＰＮの両方と比較して、ａＣＳＦにおける改善された安定性を示した。ＢＰＮは、最初の１時間にわたって無変化を維持し、続いて直径が２倍増加し、これは２４時間にわたり安定性を維持した（表１；図１）。これらの結果は、超純水におけるおよび３７℃のａＣＳＦにおける１時間インキュベーション後の遺伝子ベクターの透過型電子顕微鏡写真によってさらに確認された。ａＣＳＦにおけるＵＰＮのインキュベーションは、大型の凝集塊の形成をもたらした。ＢＰＮおよびＣＰＮは、サイズが定性的に増加したが、その完全性を保持した。
（実施例３）
遺伝子ベクター粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで無毒性である
材料と方法
細胞培養

【0164】

９Ｌ膠肉腫細胞は、Ｈｅｎｒｙ Ｂｒｅｍ博士によって提供された。１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）および１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において、９Ｌ不死化細胞を培養した。細胞が、７０〜８０％コンフルエントになったら、９６ウェルプレートに再播種して毒性を評価し、２４ウェルプレートに再播種して遺伝子ベクターのトランスフェクションおよび細胞取り込みを評価した。ウサギ初代アストロサイトは、Ｓｕｊａｔｈａ Ｋａｎｎａｎ博士によって提供された。１日目の新生仔ウサギから混合型細胞培養物を調製し、従来のシェイクオフ方法を使用して、アストロサイトを単離した。１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐおよび１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭにおいてアストロサイトを培養し、１回継代した；細胞が、７０〜８０％コンフルエントになったら、細胞生存率アッセイのために９６ウェルプレートに再播種した。ラット脳初代アストロサイトは、Ａｒｕｎ Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ博士によって提供された。新生仔Ｐ３−Ｐ６ラットから（form）ラット脳初代混合型培養物を単離し、以前に発表された通りに従来のシェイクオフ方法によりアストロサイトを単離した［Hosmaneら、Journal of Neuroscience、２０１２年、３２巻（２２号）：７７４５〜７７５７頁］。１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において細胞を培養した。細胞が、継代１回目において７０〜８０％コンフルエントになったら、９６ウェルプレートに直ちに再播種して遺伝子ベクター毒性を評価し、２４ウェルプレートに直ちに再播種して遺伝子ベクターのトランスフェクションおよび細胞取り込みを評価した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性

【0165】

１．０×１０^４細胞／ウェルの初期密度で９６ウェルプレートに細胞を播種し、３７℃でインキュベートした。２４時間後に、培地において２４時間３７℃で、広範囲の用量のＤＮＡナノ粒子と共に細胞をインキュベートした。Ｄｏｊｉｎｄｏ細胞計数キット−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して、細胞生存率を評価した。Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｍｘ Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ，Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）を使用して、分光測定で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
結果

【0166】

非ウイルス遺伝子ベクター系としてのその広範な使用にもかかわらず、ＰＥＩに基づく遺伝子ベクターは、その高い正電荷密度のため、その毒性に関する懸念を生じさせた［Petersenら、Bioconjug Chem、２００２年、１３巻（４号）：８４５〜５４頁；Merkelら、Biomaterials、２０１１年、３２巻（２１号）：４９３６〜４２頁］。ＣＮＳへの投与に対するその安全性を確保するために、遺伝子ベクターによって媒介されるｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性を、１〜１０μｇ／ｍｌのプラスミド濃度を使用して、新生仔ウサギに由来する初代アストロサイト（図２Ａ）、ラットに由来する初代アストロサイト（図２Ｂ）および９Ｌラット膠肉腫細胞（図２Ｃ）において完全に特徴付けた。ＵＰＮおよびＣＰＮは両者共に、検査した全３種の細胞において細胞毒性を示した；ＵＰＮは、それぞれ初代ウサギ細胞、初代ラット細胞および９Ｌ細胞に対して、５、１０および１０μｇ／ｍｌのプラスミド濃度で５０％細胞死をもたらした。同様に、ＣＰＮは、初代ウサギおよび初代ラットアストロサイトに対して、１０μｇ／ｍｌで５０％未満の細胞生存率をもたらした。５および１０μｇ／ｍｌのプラスミドでの９Ｌ膠肉腫細胞のＣＰＮ処置は、およそ７０％細胞生存率をもたらした。

【0167】

これらの知見とは反対に、ＢＰＮは、ウサギ初代アストロサイトおよび９Ｌ膠肉腫細胞において無毒性であり、高濃度の１０μｇ／ｍｌであっても、ラット初代アストロサイトにおける軽度毒性のみを示した（図２Ａ〜図２Ｄ）。動物［Yurekら、Cell Transplant、２００９年、１８巻（１０号）：１１８３〜１１９６頁；Yurekら、Mol Ther、２００９年、１７巻（４号）：６４１〜６５０頁］およびヒト［Konstanら、Hum Gene Ther、２００４年、１５巻（１２号）：１２５５〜１２６９頁］において安全であることが示されたＰＥＧ−ＰＬＬナノ粒子系とＢＰＮの毒性を比較した。ＢＰＮおよびＰＥＧ−ＰＬＬは、可変濃度で全３種の細胞型において同様の安全性プロファイルを示した。要約すると、従来のＰＥＧコーティングは、細胞毒性を十分には低下させない［Daviesら、Mol Ther、２００８年、１６巻（７号）：１２８３〜１２９０頁］。しかし、ＢＰＮは、高いプラスミド用量であっても、好ましい安全性プロファイルを実証する。ＣＥＤ後のこれらの遺伝子ベクターのｉｎ ｖｉｖｏ安全性プロファイルをさらに病理組織学的に特徴付けた。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏデータに従って、ＵＰＮは、ＣＰＮおよびＢＰＮよりも高い毒性徴候を実証した。その効果が、ノーマルセーライン投与と異ならないため、ＢＰＮおよびＣＰＮは、毒性なしを実証した（図２Ｄ）。重要なことに、遺伝子ベクター型にかかわらず、炎症および出血は、注射部位周囲に限局され、脳組織にわたって増えなかった。

【0168】

カチオン性ポリマーに基づく遺伝子ベクターの細胞毒性は、これらの多用途かつ強力な遺伝子送達プラットフォームの使用の限界として長年認められてきた［Petersenら、Bioconjug Chem、２００２年、１３巻（４号）：８４５〜８５４頁；Merkelら、Biomaterials、２０１１年、３２巻（２１号）：４９３６〜４９４２頁］。以前の観察と十分に一致して［Petersenら、Bioconjug Chem、２００２年、１３巻（４号）：８４５〜８５４頁；Daviesら、Mol Ther、２００８年、１６巻（７号）：１２８３１２〜９０頁、Beyerleら、Toxicol Appl Pharmacol、２０１０年、２４２巻（２号）：１４６〜１５４頁］、従来のペグ化（すなわち、ＣＰＮ）は、カチオン性ポリマーに基づく遺伝子ベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏ安全性プロファイルの有意な改善に十分ではない。ブレンドアプローチによって達成される高密度ペグ化は、ＢＰＮの毒性を徹底的に減少させ、動物［Yurekら、Cell Transplant、２００９年、１８巻（１０号）：１１８３〜１１９６頁；Yurekら、Mol Ther、２００９年、１７巻（４号）：６４１〜６５０頁］およびヒト［Konstanら、Hum Gene Ther、２００４年、１５巻（１２号）：１２５５〜１２６９頁］において安全であると示された広く使用されているＰＥＧ−ＰＬＬナノ粒子系と同様の好ましい安全性プロファイルをもたらす。
（実施例４）
ペグ化ナノ粒子遺伝子ベクターは、高い取り込みおよびトランスフェクション効率を有する
材料と方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション

【0169】

５．０×１０^４細胞／ウェルの初期密度で２４ウェルプレートに細胞を播種した。２４時間後に、遺伝子ベクター形態のｐｄ１ＧＬ３−ＲＬプラスミド（１μｇ ＤＮＡ／ウェル）と共に細胞を培地において５時間３７℃でインキュベートした。カチオン性ポリマーに基づく遺伝子ベクタートランスフェクションを、遊離プラスミド対照と比較した。その後、ナノ粒子および培養培地を新鮮培地に置き換えた。さらに４８時間の３７℃インキュベーション後に、培地を除去し、０．５ｍｌの１×レポーター溶解バッファーを添加した。細胞を３回の凍結および融解サイクルに供して、完全な細胞溶解を保証し、遠心分離により上清を得た。次に、標準ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）および２０／２０ｎルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、上清におけるルシフェラーゼ活性を測定した。相対光単位（ＲＬＵ）を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイによって測定される各ウェルの総タンパク質濃度に対し正規化した。
結果

【0170】

遺伝子ベクターの細胞取り込みおよびトランスフェクション効率をｉｎ ｖｉｔｒｏで特徴付けた。ＰＥＧコーティングは、細胞による粒子取り込みを低下させることが示された［Amoozgar, Z.およびY. Yeo、Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol、２０１２年、４巻（２号）：２１９〜２３３頁；Hatakeyamaら、Adv Drug Deliv Rev、２０１１年、６３巻（３号）：１５２〜１６０頁］。しかし、以前の報告と十分に一致して［Mishraら、Eur J Cell Biol、２００４年、８３巻（３号）：９７〜１１１頁］、従来のペグ化は、ＰＥＩに基づく遺伝子ベクター（すなわち、ＣＰＮ）による細胞取り込みに影響を与えなかった。小型の粒子サイズは、ペグ化ナノ粒子の有効な取り込みに寄与し得る［Pamujulaら、J Pharm Pharmacol、２０１２年、６４巻（１号）：６１〜６７頁；Hu, Y.ら、J Control Release、２００７年、１１８巻（１号）：７〜１７頁］。ＢＰＮも、ＣＰＮと比較したそのより高密度のＰＥＧコーティングにもかかわらず、ＵＰＮおよびＣＰＮと比較して、取り込みにおける差を示さなかった。全３種のＰＥＩに基づく遺伝子ベクターは、５０％の９Ｌ不死化細胞（図３Ａ）および３５％の齧歯類初代細胞（図３Ｂ）において検出された。これらの遺伝子ベクターの取り込みは、それぞれ９Ｌ不死化および初代アストロサイトにおける臨床的に検査したＰＥＧ−ＰＬＬ遺伝子ベクターよりも約１７および約３５倍高かった（ｐ＜０．０５）。この差は、同じプラスミド用量のＰＥＧ−ＰＬＬベクターで処置した細胞と比較した、ＰＥＩ−ベクター処置された細胞による有意により高いルシフェラーゼ発現に変換された。以前の観察に合致して［Mishraら、Eur J Cell Biol、２００４年、８３巻（３号）：９７〜１１１頁］、異なるＰＥＩに基づく遺伝子ベクターの間の同様の細胞取り込みにもかかわらず、ＵＰＮと比較して、ＣＰＮおよびＢＰＮの両方による有意により低いｉｎ ｖｉｔｒｏ導入遺伝子発現が見出された（図３Ｃおよび図３Ｄ）。
（実施例５）
ＢＰＮペグ化ナノ粒子遺伝子ベクターは、脳実質に急速に浸透した
材料と方法
動物試験

【0171】

体重各１２０〜１４０ｇの雌フィッシャー３４４ラットをＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）から購入した。遺伝子発現における遺伝的な差の根本的な影響のため、近交系ラットの使用が、他の非近交系系統よりも好ましかった［Liuら、J Biol Chem、２００２年、２７７巻（７号）：４９６６〜４９７２頁］。ラットを標準施設に収容し、食物および水に自由にアクセスできるようにした。全動物は、ジョンズホプキンス大学（Johns Hopkins University）動物実験委員会（Animal Care and Use Committee）のポリシーおよびガイドラインに従って処置した。標準無菌外科的技法を使用して、あらゆる外科手技を行った。

【0172】

以前に記載された通りに、ケタミン・キシラジンの混合物によりラットを麻酔した［Recinosら、Neurosurgery、２０１０年、６６巻（３号）：５３０〜５３７頁；考察５３７頁］。簡潔に説明すると、３５０μＬのケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン（７．５ｍｇ／ｋｇ）、エタノール（１４．２５％）および０．９％ノーマルセーライン溶液を腹腔内投与した。正中線頭皮切開を行って、冠状縫合および矢状縫合を露出させ、矢状（saggital）縫合の３ｍｍ側方およびブレグマの０．５ｍｍ後方に穿頭孔（burr whole）を穿孔した。ナノ粒子溶液の投与後に、生分解性縫合糸（ＰＯＬＹＳＯＲＢ（商標）Ｂｒａｉｄｅｄ Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ Ｓｕｔｕｒｅｓ ５−０）を使用して皮膚を閉じ、バシトラシンを塗布した。

【0173】

ｉｎ ｖｉｖｏにおけるナノ粒子の拡散に基づく伝播を試験するために、Ｎ＝３匹の動物を使用した；注入の間の対流を最小化するために、定位ヘッドフレーム（headframe）に配置した３３ゲージの１０μｌ Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｎｅｕｒｏシリンジを３．５ｍｍの深さまで下げ、１ｍｍ引っ込めて、齧歯類線条体にポケットを作製した。粒子型当たり５００μｇ／ｍｌのプラスミド濃度で、Ｃｙ５標識された従来通りにペグ化されたナノ粒子およびＣｙ３標識された脳浸透ナノ粒子の１０μｌ溶液を、２μｌ／ｍｉｎのボーラス注射として投与した。注射２時間後に動物を屠殺した。

【0174】

齧歯類線条体における対流増強送達後のＰＥＩに基づく遺伝子ベクターの分布を試験するために、Ｎ＝６匹のラットを使用した；定位ヘッドフレームに配置した３３ゲージの５０μｌ Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｎｅｕｒｏシリンジを３．５ｍｍの深さまで下げた。ノーマルセーラインにおける粒子型当たり５００μｇ／ｍｌのプラスミド濃度で、Ｃｙ３標識されたＣＰＮおよびＣｙ５標識されたＢＰＮの２０μｌ溶液を投与した。Ｃｈｅｍｙｘ Ｉｎｃ．Ｎａｎｏｊｅｔ定位シリンジポンプ（Ｃｈｅｍｙｘ、Ｓｔａｆｆｏｒｄ、Ｔｅｘａｓ）を使用して、注入速度を０．３３μｌ／ｍｉｎに設定した。注射５時間後に動物を屠殺した。ナノ粒子濃度における分布の依存を試験するために、ノーマルセーラインにおける半分のプラスミド濃度、粒子型当たり２５０μｇ／ｍｌで、共注射（co-injection）も行った。

【0175】

遺伝子ベクターのＣＥＤ投与後の導入遺伝子発現の分布を評価するために、粒子型当たり少なくともＮ＝４匹のラットを使用した；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターと蛍光ｅＧＦＰレポータータンパク質をコードするプラスミドを様々なＰＥＩに基づくナノ粒子製剤において複合体形成させ、上記の同じパラメータを使用して、１ｍｇ／ｍｌプラスミド溶液の２０μｌ溶液において注入した。ＣＥＤ投与４８時間後に動物を屠殺し、収集した脳を４％ホルムアルデヒドにおいて固定した。

【0176】

遺伝子ベクターのＣＥＤ後のｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションのウエスタンブロット解析のため、粒子型当たりＮ＝３匹のラットを使用し、トランスフェクションの分布のイメージングに基づく解析に従う正確に同じ実験手順を使用した。ＣＥＤ投与４８時間後に動物を屠殺し、氷上に直ちに置き、注射部位から−２ｍｍから２ｍｍにある線条体の４ｍｍ厚冠状スライスを切り離し、ウエスタンブロット解析のために−８０℃に貯蔵した。

【0177】

ＣＥＤ投与後のｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子ベクターの安全性プロファイルを評価するために、群当たりＮ＝３匹のラットを使用した。上記の通り、１ｍｇ／ｍｌプラスミド濃度の２０μｌ溶液における様々なＰＥＩに基づく製剤を注入した。比較のための陰性対照として、ノーマルセーライン溶液を注入した。投与４日後に動物を屠殺し、収集した脳を４％ホルムアルデヒドにおいて固定し、加工し、切片作製し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。委員会認定の神経病理学者により盲検的病理組織学的解析を行い、組織を炎症および出血の指標に関して０〜３にスコア化した（０：炎症／出血なし、１：軽度、２：中等度、３：重度）。
齧歯類脳スライスにおける多重粒子追跡

【0178】

多重粒子追跡（ＭＰＴ）を使用して、以前に発表された通りに、ｅｘ ｖｉｖｏ齧歯類脳スライスにおける蛍光遺伝子ベクターの平均二乗変位（ＭＳＤ）を推定した［Nanceら、Sci Transl Med、２０１２年、４巻（１４９号）：１４９ｒａ１１９頁］。簡潔に説明すると、成体フィッシャー（Fisher）ラットから脳を収集し、氷上で１０分間、ａＣＳＦ中でインキュベートした。Ｚｉｖｉｃ脳マトリックススライサー（Ｚｉｖｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して、脳を１．５ｍｍ冠状スライスに薄く切り、あつらえのスライド上に置いた。定位フレームに配置した５０μｌ Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｎｅｕｒｏシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ）を使用して、０．５マイクロリットルの蛍光標識された遺伝子ベクターを、１ｍｍの深さで大脳皮質に注射した。組織を２２ｍｍ×２２ｍｍカバーガラスで覆って、組織移動およびバルク流を低下させた。１００×／１．４６ＮＡ油浸対物レンズを備える倒立落射蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｄ１、Ｚｅｉｓｓ；Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）に配置したＥｖｏｌｖｅ ５１２ ＥＭＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）により、露光時間６６．７ｍｓで２０秒間にわたって粒子軌跡を記録した。あつらえのＭＡＴＬＡＢコードにより動画を解析して、経時的な遺伝子ベクター中心軌跡のｘ，ｙ座標を抽出し、時間の関数としての各粒子の平均二乗変位を計算した［Nanceら、Sci Transl Med、２０１２年、４巻（１４９号）：１４９ｒａ１１９頁；Schusterら、Biomaterials、２０１３年、３４巻（１３号）：３４３９〜４６頁］。スライドグラス上の固定化された遺伝子ベクターを使用して、ノイズ対シグナル比に対する空間分解能の相関を推定した［Martinら、Biophys J、２００２年、８３巻（４号）：２１０９〜１７頁；Savinら、Biophys J、２００５年、８８巻（１号）：６２３〜３８頁］。この相関に基づき、ＭＰＴ実験の平均分解能を、１秒間に約０．００９μｍ^２と推定した。遺伝子ベクター型当たり少なくともＮ＝３匹のラット脳を使用し、試料当たり少なくとも５００個の遺伝子ベクターを追跡した。試料当たりの全ナノ粒子のためのＭＳＤの幾何平均を計算し、時間の関数として異なる齧歯類脳の平均を計算した。τ＝１秒間のタイムスケールで、全ナノ粒子のＭＳＤからヒストグラムを作成した。ストークス・アインシュタイン方程式を使用して、ＡＣＳＦにおけるナノ粒子の理論的ＭＳＤを計算し、動的光散乱により平均粒子直径を計算した。
イメージングおよび解析

【0179】

新鮮に収集した脳を４％ホルムアルデヒドにおいて一晩固定し、続いて凍結切片作製前に勾配ショ糖溶液処理した。Ｌｅｉｃａ ＣＭ １９０５クリオスタットを使用して、組織を１００マイクロメートル厚スライスへと冠状に切片作製した。スライスをＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で染色し、共焦点ＬＳＭ ７１０顕微鏡を使用して、５×および１０×倍率（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ；Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ）下で、ＤＡＰＩ（細胞核）、Ｃｙ３およびＣｙ５またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ｅＧＦＰ）に関して画像化した。設定を慎重に最適化して、非注射対照ラット脳に基づく、バックグラウンド蛍光を回避した。レーザー出力、ピンホール、ゲイン、オフセットおよびデジタルゲインは、倍率毎に別々に選択し、試験を通して一定に維持した。
統計解析

【0180】

不等分散を仮定する両側スチューデントｔ検定または可能であれば対応のあるスチューデントｔ検定により、２群間の統計的有意差を解析した。ＳＰＳＳ １８．０ソフトウェア（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を使用して、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と続く事後検定を使用して多重比較を行った。
結果

【0181】

脳実質におけるＢＰＮ、ＣＰＮおよびＵＰＮの拡散を調査した。それらの正の表面電荷のため、ＵＰＮは、制約された非ブラウンタイムラプストレースにより強く妨害された。同様に、ＣＰＮは、より制約が少ないが、依然として妨害された非ブラウン運動を示した。対照的に、ＢＰＮ軌跡は、より長い距離に及び、脳組織における妨げられない拡散を示した（図４Ａ）。軌跡に基づき、１秒間にわたるアンサンブル平均ＭＳＤ（＜ＭＳＤ＞）を計算した；ＢＰＮは、それぞれＣＰＮおよびＵＰＮよりも５および２９倍高い＜ＭＳＤ＞を示した（図４Ｂ）。脳組織におけるＵＰＮおよびＣＰＮの拡散速度は、それぞれａＣＳＦ中でのそれらの理論的拡散速度よりも６，９００倍および９３０倍遅かったが、ＢＰＮは、ａＣＳＦ中よりも脳においてほんの２６０倍遅く移動した（表１）。個々の遺伝子ベクターの対数ＭＳＤ（ｌｏｇ１０ＭＳＤ）のヒストグラムにおいて、個々の粒子データを表した。分布は、ＵＰＮおよびＢＰＮに関して大部分は単様式であった；ＵＰＮの大部分は、低いＭＳＤ値を呈し、多くのＢＰＮは、脳組織における急速浸透を可能にするＭＳＤを示した。ＣＰＮは、大部分は捉えられたが、僅かな集団は、脳実質に急速に浸透することができた（図４Ｃ）。急速に運動するナノ粒子をｌｏｇ１０ＭＳＤ≧−１を有するナノ粒子と定義すると、それぞれＵＰＮ、ＣＰＮおよびＢＰＮの、１０．３％、３２．９％および６３％が、脳実質において移動することができた。

【0182】

ＢＰＮによるｅｘ ｖｉｖｏにおける増強された脳浸透が、ｉｎ ｖｉｖｏにおける脳実質中のこのようなベクターの広汎な伝播に変換されるか検査するために、齧歯類線条体において蛍光標識されたＣＰＮおよびＢＰＮのボーラス共注射を行った。投与後に、ＣＰＮは、投与２時間後に注射部位からほんの中程度に漏出した（escaped from）一方、ＢＰＮは、およそ３００μｍの距離を覆って、注射部位からより遠くへと均質に拡散した。

【0183】

投与ポイントから離れた治療タンパク質の高いトランスフェクションおよびその後の発現は、ＣＮＳ疾患の有効な遺伝子送達に基づく処置の基礎をなす。カチオン性ポリマーに基づく遺伝子ベクターの有効なコーティングは、脳線条体のより大きい体積にわたる導入遺伝子発現を可能にする。しかし、ステルスコーティング戦略としてのペグ化は、取り込み、エンドソーム漏出およびその後の導入遺伝子発現を減少させることが示されてきた［Amoozgarら、Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol、２０１２年、４巻（２号）：２１９〜３３頁；Hatakeyamaら、Adv Drug Deliv Rev、２０１１年、６３巻（３号）：１５２〜６０頁］。カチオン性ポリマーに基づく遺伝子ベクターのペグ化は、以前の報告に示唆される通り［Pamujulaら、J Pharm Pharmacol、２０１２年、６４巻（１号）：６１〜７頁；Huら、J Control Release、２００７年、１１８巻（１号）：７〜１７頁］、恐らくは小型の粒子サイズのため、細胞進入を減少させないが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける有意により低いトランスフェクション有効性をもたらす［Mishraら、Eur J Cell Biol、２００４年、８３巻（３号）：９７〜１１１頁；Ogrisら、AAPS PharmSci、２００１年、３巻（３号）：Ｅ２１頁］。これは、遺伝子ベクターの緩衝能およびその後のエンドソーム漏出を低下させる、ＤＮＡアンパッケージングおよび一級アミンへのＰＥＧのコンジュゲーションを妨害し得る、ＢＰＮの細胞内安定性の増加によって説明することができる［Mishraら、Eur J Cell Biol、２００４年、８３巻（３号）：９７〜１１１頁；Sonawaneら、J Biol Chem、２００３年、２７８巻（４５号）：４４８２６〜３１頁］。
（実施例６）
ＣＥＤは、遺伝子ベクター物理化学的特性とともに、高密度に（dencely）ペグ化された遺伝子ベクターの分布および導入遺伝子送達を増強するように働く
材料と方法
イメージングおよび解析

【0184】

バックグラウンド蛍光を減算し、最大強度の１０％における蛍光強度を閾値化するカスタムＭＡＴＬＡＢスクリプトを使用することにより、ＣＥＤ投与後のナノ粒子分布体積を定量した。逆流による脳梁におけるナノ粒子蛍光は、定量から除外した。注射平面の２ｍｍ内の各１００μｍスライスを画像化した。各スライスにおける分布面積を合計して、ナノ粒子分布の総体積を計算した。ｅＧＦＰをコードするＰＥＩに基づく遺伝子ベクターによって媒介される導入遺伝子発現の分布の解析のため、同じ過程を続けた。
抗体およびウエスタンブロッティング

【0185】

ＣＥＤ後のｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションのウエスタンブロット解析のため、使用される抗体は、抗ＧＦＰ（Ｂ−２）：ｓｃ−９９９６および抗β−アクチン：ｓｃ−４７７７８（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を含んだ。氷冷ＰＢＳバッファー（１ｍＭ ＰＭＳＦ、ならびに各１μｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプチンおよびペプスタチンＡ）における短時間の超音波処理を使用して、脳組織を溶解した。サンプリングバッファー（１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２％β−メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）を添加し、１００℃で１０分間試料を煮沸した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって試料を分離（resorved）し、セミドライ型ブロッター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して、ゲル上のタンパク質をニトロセルロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に転写した。この膜をＴＢＳＴ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＴＷＥＥＮ−２０）中３％ＢＳＡでブロッキングし、一次抗体と共に一晩４℃でインキュベートした。高感度ケミルミネッセンス方法により、イムノブロットを可視化した。Ｍｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅプログラム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して、ウエスタンブロット結果の定量を行った［Elliottら、Mol Biol Cell、２００５年、１６巻（２号）：８９１〜９０１頁］。
結果

【0186】

ＢＰＮの高密度ＰＥＧコーティングが、ＣＥＤ後の分布改善に寄与するかどうかを評価した。ＣＥＤ後の異なる脳浸透能力を有する遺伝子ベクターの空間分布を直接的に比較するために、Ｃｙ５標識されたＢＰＮおよびＣｙ３標識されたＣＰＮを共注入した。高密度にペグ化されたＢＰＮは、齧歯類線条体を均質に覆った一方、コーティングが少ないＣＰＮは、注射部位に限局された。注射の冠状平面内に、ＢＰＮは、ＣＰＮよりも３倍大きい面積を覆い（図５Ａ）、分布における差は、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。さらに、ＢＰＮの全体的な分布体積を計算したところ、ＣＰＮよりも３．１倍高かった（図５Ｂ）。ＣＥＤ注入液におけるナノ粒子の濃度は、分布体積に有意な効果を有することが示された［MacKayら、Brain Res、２００５年、１０３５巻（２号）：１３９〜５３頁］。実際に、半分の濃度の遺伝子ベクターの共注入は、それぞれＣＰＮおよびＢＰＮの１３倍および８倍低い分布体積をもたらした。低いプラスミド濃度であっても、ＢＰＮは、ＣＰＮと比較して４．６倍高い分布体積をもたらした（図２１）。

【0187】

ＢＰＮのより大きい分布面積および投与ポイントからさらに離れた距離の細胞に到達するその能力を考慮すると、ｅＧＦＰをコードするプラスミドＤＮＡを運搬する遺伝子ベクターのＣＥＤ投与後の、トランスフェクトされた細胞の分布を評価した。ＵＰＮおよびＣＰＮ処置した動物は、注射部位周囲および血管周囲空間の有意なＧＦＰ発現を実証した。対照的に、ＢＰＮは、齧歯類線条体の至る所に広汎なトランスフェクションをもたらし、これは、遺伝子ベクター分布解析と十分に相関した（図５Ａ〜図５Ｂ）。特に、ＢＰＮは、ＧＦＰ導入遺伝子発現における統計的有意（ｐ＞０．０５）差をもたらし、それぞれＣＰＮおよびＵＰＮと比較して、２．４倍および３．２倍高いトランスフェクション体積であった（図６Ａおよび図６Ｂ）。ウエスタンブロット解析を使用して、ＵＰＮ、ＣＰＮおよびＢＰＮのＣＥＤによって媒介される絶対的導入遺伝子ＧＦＰ発現を定量的に決定した。ＢＰＮは、ＣＰＮおよびＵＰＮと比較して、線条体における統計的に有意な２倍高い全体的な導入遺伝子発現を実証した（図７）。

【0188】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ結果とは対照的に、ＢＰＮのＣＥＤ投与は、ＵＰＮおよびＣＰＮと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏ導入遺伝子発現の総量の倍加をもたらし、線条体の大きい面積にわたり細胞をトランスフェクトするＢＰＮの能力が、その劣る細胞内送達能力を補い、さらにはそれを上回ることができることを示唆する。

【0189】

脳実質におけるＢＰＮの妨げられない拡散は、ＣＥＤを使用して投与される場合、広汎な分布に変換される。高密度表面遮蔽が、遺伝子ベクターのＣＥＤ促進性分布の達成に必要とされることに留意されたい；不十分に遮蔽されたＣＰＮは、注射部位から漏出することができず、ＣＥＤ後の遮蔽されていないＵＰＮと比較して、導入遺伝子発現における増強された分布を媒介することができなかった。
（実施例７）
ポリＬ−リシンおよび分岐状ＰＥＧを含有するナノ粒子の合成
材料と方法
分岐状ＰＥＧ（ＢｒＰＥＧ）の合成

【0190】

ＢｒＰＥＧを二段階反応において合成した。２モル当量のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの存在下で、１：１モル比でジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）無水物を先ずアジド−トリオキサウンデカニンにコンジュゲートした。この反応に起因するアジド−ＤＴＰＡを次に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中それぞれ４０、５および３モル当量の１−エチル−３−（３−メチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下で、４モル当量の５ｋＤａメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ、Ｗｉｎｓｔｏｎ Ｓａｌｅｍ、ＮＣ）とコンジュゲートした。一定に撹拌しつつ、４８時間３７℃で反応を行った。精製のため、反応産物を超純水に対して２４時間透析した（６〜８ｋＤａ ＭＷＣＯ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ）。
ポリ−Ｌ−リシンのペグ化

【0191】

官能基を持つアルキン末端基およびブロミド対イオンを有するポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）３０−ｍｅｒを使用した（Ａｌａｍａｎｄａ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）。直鎖状ペグ化ＰＬＬポリマーの形成のため、ＰＬＬペプチドを、官能基を持つアジド基を有するＰＥＧ（約５ｋＤａ）（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ、Ｗｉｎｓｔｏｎ Ｓａｌｅｍ、ＮＣ）または分岐状ＰＥＧ（約１５ｋＤａ）と１：１のモル比で反応させた。１００ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．５）中０．１モル当量の酢酸銅、５モル当量のアスコルビン酸ナトリウムおよびＴｒｉｓ（ベンジルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＢＴＡ）の存在下で、３７℃で４８時間クリックケミストリー反応を行った。反応産物、ＰＬＬ−ＰＥＧ（ＰＬＬおよび直鎖状ＰＥＧのジブロック）およびＰＬＬ−ＢｒＰＥＧ（ＰＬＬおよび分岐状ＰＥＧのジブロック）を超純水に対して２４時間透析した。
ペグ化ペプチドの精製および対イオンの交換

【0192】

固定相としてのＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ１５（ＭＷＣＯ １５００、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）および移動相としての５０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ７．４）によるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、ペグ化反応からの反応産物を精製した。この過程において、ブロミド対イオンをアセテート対イオンと交換した。２２０ｎｍの吸光度を測定することにより（ＮＡＮＯＤＲＯＰ ＮＤ−１０００分光光度計、ＮＡＮＯＤＲＯＰ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）、異なる画分におけるペプチド濃度をモニターした。ペプチドを含有する高分子量画分をプールし、透析した。５００ＤａのＭＷＣＯを有する透析チューブを使用して、２４時間の経過にわたって断続的に交換した２リットルの超純水に対して透析を行った。精製された産物を凍結乾燥し、さらに使用するまで−８０℃で貯蔵した。
粒子製剤

【0193】

従来通りにペグ化されたコペルニクス（Copernicus）製剤（ＰＬＬ−ＰＥＧ）を模倣した遺伝子ベクターを、２の窒素（ＰＬＬにより寄与）対リン（ＤＮＡにより寄与）比で製剤化した。高密度にペグ化された遺伝子ベクターにおけるＤＮＡの圧縮に最も適した製剤パラメータを決定するために、異なる比のＰＬＬ−ＢｒＰＥＧおよびＰＬＬポリマーを使用して、２および５の窒素対リン（Ｎ／Ｐ）比を検査した。１００％ＰＬＬ−ＢｒＰＥＧ（ＢＲ１００）、９０％ＰＬＬ−ＢｒＰＥＧおよび１０％ＰＬＬ（ＢＲ９０）または５０％ＰＬＬ−ＢｒＰＥＧおよび５０％ＰＬＬ（ＢＲ５０）のいずれかの混合物を使用して、遺伝子ベクターを複合体形成させた。遅いスピードでボルテックスしつつ、１容量のポリマー溶液へと１０容量のプラスミドＤＮＡ（０．２ｍｇ／ｍｌ）を滴下して加えることにより、遺伝子ベクターを形成させた。プラスミド／ポリマー溶液を３０分間室温でインキュベートした。凝集塊の除去のため、シリンジ濾過（０．２μｍ）を使用し、続いてＡＭＩＣＯＮ（登録商標）超遠心フィルター（１００，０００ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）により、遊離ポリマーを除去し、所望の濃度の遺伝子ベクターを採取した。ＮＡＮＯＤＲＯＰ ＮＤ−１０００分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用して、２６０ｎｍの吸光度によりＤＮＡ濃度を決定した。
結果
ポリマー合成

【0194】

分岐状ＰＥＧ（ＢｒＰＥＧ）を合成し、^１Ｈ−ＮＭＲにより解析して、ＤＴＰＡに対するＰＥＧの比を決定した。ＮＭＲの結果は、平均３．６５個のＰＥＧ分子が、各ＤＴＰＡ分子に結合していたことを示した。材料と方法に記載されている通りに、クリックケミストリー反応により、ＰＬＬ−ＰＥＧおよびＰＬＬ−ＢｒＰＥＧポリマーを合成した（図９）。ポリマーの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを使用して、ペグ化の程度を決定した。個々の原子に結合したプロトンによって寄与される予想される化学シフトに基づき、ペプチドに対するＰＥＧの比を計算した。ＰＬＬのリシンモノマーにおいて、各炭素に結合したプロトンによる特定の化学シフトにおける寄与される強度は、次の比、ａ：ｂ：ｃ：ｄ：ｅ＝１：２：２：２：２で存在する。炭素ｂおよびｄに関して、相当するピークは、明確に区別するには近接し過ぎていたため、単一のピークとして考慮した。各リシンモノマーは、３０回反復したため、ａ、ｃ、ｂ＋ｄおよびｅのピークは、それぞれ３０、６０、１２０および６０プロトンを表す。ＰＥＧにおける各反復単位は、４プロトンを有し、５ｋＤａ ＰＥＧは、１１４反復単位を含有するため、これらを参照ピークとして維持する場合、各ＰＥＧ分子は、４５６プロトンに寄与することが予想される。よって、その結果得られる産物は、ＰＬＬ−ＰＥＧポリマーについては１．１２およびＰＬＬ−ＢｒＰＥＧポリマーについては３．１６の計算されるＰＥＧ対ペプチド比を明らかにした。ＮＭＲスペクトルに基づき、両方のペグ化ペプチドは、従来通りにペグ化されたポリマーのおよそ３．１倍である、高密度にペグ化されたポリマーのペグ化の程度を有して、粒子製剤に適しているとみなされた。
粒子特徴付け

【0195】

ＴＥＭ画像の比較は、従来のＰＬＬ−ＰＥＧ遺伝子ベクターが棒状であったのに対し、非ペグ化ＰＬＬ遺伝子ベクターおよび高密度にペグ化された遺伝子ベクターの両方が、球状および楕円体粒子からなったことを明らかにした。非ペグ化ＰＬＬ遺伝子ベクターは、８２ｎｍの平均長径および４６ｎｍの平均短径を有した。ＰＬＬ−ＰＥＧ遺伝子ベクターサイズの解析（表３）は、１７７±８ｎｍの長径および１６±１ｎｍの短径を明らかにした。高密度にペグ化された遺伝子ベクターの長径は、ＰＬＬ−ＰＥＧ遺伝子ベクターよりも約２倍小さかったが、短径は、約２倍大きかった。５のＮ／Ｐ比で形成されたＰＬＬ−ＢｒＰＥＧ遺伝子ベクターは、２のＮ／Ｐ比で形成された遺伝子ベクターと比較して有意により低い長径および短径を有した。長径および短径を使用して計算される遺伝子ベクターアスペクト比は、ＰＬＬ−ＢｒＰＥＧポリマーを取り込んで形成された粒子に関して１〜４倍低いことが判明した（図１０、表３）。高密度にペグ化された粒子の場合、アスペクト比の範囲もより低く、これは、ＰＬＬ−ＢｒＰＥＧポリマーを取り込む遺伝子ベクターに関して観察される、より低い多分散において反映された（図１０、表３）。非ペグ化ＰＬＬの添加は、有意により小さいアスペクト比を有する粒子を生じた（図１０）。

【0196】

【表3】

【0197】

表３：遺伝子ベクターの物理化学的特徴付け。ｐＨ７．０の１／１５×ＰＢＳにおけるレーザードプラ流速測定および動的光散乱により、水力学直径（Ｚ平均）、ζ−電位および多分散（ＰＤＩ）を測定し、３回の測定の算術平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表し、ＩｍａｇｅＪを使用して、それぞれ３種の粒子試料に由来する少なくとも１００粒子のＴＥＭ画像から長径および短径を測定し、算術平均±ＳＥＭとして示す。

【0198】

十分にペグ化されたナノ粒子は、その直径が、ＥＣＭにおける細孔を通った移動が可能なほど十分に小さければ、脳実質において急速に拡散することができる。実際に、１１４ｎｍよりも小さい高密度ＰＥＧコーティングを有する粒子は、ＥＣＭにおける急速拡散を示した［４］。この理由から、いずれの粒子製剤が、このカットオフを下回るサイズを有する集団の大部分を有するかに関して試験した。僅か２９％のＰＬＬ−ＰＥＧ遺伝子ベクターが、１１４ｎｍを下回る長径を有した（図１１）。遺伝子ベクター製剤におけるＢｒＰＥＧ使用の効果を試験するために、２のＮ／Ｐ比で製剤化された粒子集団の長径の分布を比較した。９０：１０の比のＰＬＬ−ＢｒＰＥＧポリマーおよび非ペグ化ＰＬＬポリマーのブレンド（ＢＲ９０）は、粒子の約８０％が、１１４ｎｍを下回る長径を有する集団をもたらした。これは、それぞれ約５９％および約７３％である、ＢＲ１００製剤およびＢＲ５０−５０製剤についてのこのカットオフを下回る粒子のパーセンテージよりも有意に高かった。高密度にペグ化された製剤全てについての短径は、従来のＰＬＬ−ＰＥＧ遺伝子ベクターの短径よりも大きかったが、依然として指定されたカットオフを下回っており、したがって、遺伝子ベクター拡散にマイナスに影響するとは予想されなかった。

【0199】

本明細書における製剤化された粒子が、本来球状でないことを考慮すると、粒子として均等な並進拡散係数を有する球体の直径として定義される水力学直径は、拡散率特徴の説明および比較に有用なパラメータである。Ｚ平均として測定される水力学直径は、高密度にペグ化されたポリマーを使用して形成された全製剤でより低いことが判明した（表３）。高度に荷電された粒子は、ＥＣＭと静電的に相互作用する可能性が高いため、表面電荷も、拡散に影響を与える重要な側面である。ペグ化粒子製剤の間で表面電荷における有意差は認められなかった。非ペグ化ＰＬＬ遺伝子ベクターの表面電荷は、ペグ化製剤よりも約５倍高かった。

【0200】

ＥＣＭの構成成分と従来のナノ粒子との非特異的相互作用は、脳実質におけるナノ粒子分布を妨害するため、標的細胞に到達し、治療効果を達成するその能力に影響を与える。ＰＥＧの高密度層によるナノ粒子表面の有効な遮蔽は、このような接着性相互作用を最小化し、ＥＣＭを通した効率的な粒子浸透を可能にする。本試験において、広く使用され、臨床的に検査される遺伝子ベクターを使用して、脳における広汎かつ十分に高い導入遺伝子発現を達成した。高密度にコーティングされた遺伝子ベクターの製剤のための複合体形成パラメータを解析し、これを完全に特徴付けて、その後のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ評価に対するその適用性を調査した。

【0201】

単一の直鎖状ＰＥＧおよび多腕分岐状ＰＥＧによるＰＬＬのペグ化を達成し、ＮＭＲによって検証した。ＰＬＬ−ＰＥＧポリマーは、ＤＮＡと複合体形成して、臨床的に検査される系を良好に模倣した従来通りにペグ化された遺伝子ベクターを形成することが判明した。ＰＥＧグラフト化によるＰＬＬポリマーの修飾は、直径約１００ｎｍを有する球状遺伝子ベクターを形成することが以前に報告された。ＰＬＬおよび分岐状ＰＥＧジブロックの使用も、従来のＰＬＬ−ＰＥＧ系とは明確に異なる形態を有する粒子の形成をもたらした。しかし、この場合、ある範囲のアスペクト比を有する球状遺伝子ベクターおよび楕円体遺伝子ベクターの両方が形成された。劣るＤＮＡ複合体形成を生じ得る増加量の親水性ＰＥＧ鎖によって課される立体障害にもかかわらず、ＰＬＬ−ＢｒＰＥＧにより製剤化されたが、少量の非ペグ化ポリマーの取り込みを有する遺伝子ベクターは、より小さい範囲のアスペクト比を有するより均一なナノ粒子をもたらした。さらに、非ペグ化ポリマーコアの包含は、１１４ｎｍよりも小さい長径を有するナノ粒子の大集団の製剤をもたらし、これにより、これらのナノ粒子が脳実質において遭遇し得る可能な立体障害を最小化する。しかし、粒子は、流れの存在下で整列または転倒する（tumble）可能性があり、したがって、その挙動は、実験的に特徴付ける必要があるため、非球状粒子の移動は、多数のパラメータによって影響され、容易に予測することができない。
（実施例８）
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるポリＬ−リシンおよび分岐状ＰＥＧを含有するナノ粒子の特徴付け
材料と方法
細胞培養

【0202】

９Ｌラット膠肉腫細胞は、Ｈｅｎｒｙ Ｂｒｅｍ博士によって提供され、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）および１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において培養した。ラット脳初代アストロサイトは、Ａｒｕｎ Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ博士によって提供された。新生仔Ｐ３−Ｐ６ラットからラット脳初代混合培養物を単離し、従来のシェイクオフ方法によりアストロサイトを単離した。

【0203】

１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において細胞を培養した。アッセイ要件の通りに、０．２５％トリプシンＥＤＴＡ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）とともに５分間３７℃でインキュベートすることにより細胞をトリプシン処理し、続いて培地で中和し、９６ウェルプレートまたは２４ウェルプレートにおいて播種し、一晩接着させた。
細胞取り込み

【0204】

細胞取り込み試験のため、２４ウェルプレートにおいてウェル当たり５０，０００細胞の密度で細胞を播種し、異なる粒子製剤のためのその圧縮型ナノ粒子形態の１μｇ ＤＮＡ／ウェルにより３時間３７℃で処理した。ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーターによる蛍光選別を可能にするために、ナノ粒子合成のためにＣｙ３標識されたＤＮＡを使用した。ＴＥＭおよびζ−電位によって確認される通り、標識されたＤＮＡの使用は、ＤＮＡナノ粒子の形成に影響を与えなかった。フローサイトメトリーのため、細胞を０．０４％トリパンブルーで短時間処理して、細胞外蛍光（florescence）をクエンチし、ＰＢＳで３回洗浄し、続いてトリプシン処理した。トリプシンを中和し、１０００ｒｃｆ、１０分間のスピンダウンにより細胞を採取した。得られた細胞ペレットを、ＰＢＳ中１００μｌの１０％ＦＢＳに再懸濁し、試料を加工するまで氷上に維持した。発光検出波長５８５／４０ｎｍによる４８８ｎｍレーザーおよびＦＬ２バンドパスフィルターを備えるＡｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を使用して、ナノ粒子細胞取り込みを測定した。ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ソフトウェアを使用してデータを解析した。未処理試料を使用して閾値を決定し、遺伝子ベクター細胞取り込みを遊離プラスミドと比較した。
ルシフェラーゼアッセイ

【0205】

２４ウェルプレートにおいてウェル当たり５０，０００細胞の密度で細胞を播種し、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭにおける１ｍｇ／ｍｌの圧縮ｐＢａｌ ＤＮＡで３時間３７℃にて処理した。次に、ルシフェラーゼ発現をアッセイする前に、通常通り３日間新鮮培地において細胞を培養した。ルシフェラーゼ抽出のため、培地を除去し、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄した。各ウェルに５００μｌの１×レポーター溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を添加し、１０分間室温でインキュベートした。各ウェルから細胞およびバッファーを別々の微量遠心管に移し、３回の凍結・融解サイクルに付し、続いて１，０００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。新たな微量遠心管に上清を移し、ルシフェラーゼ活性に関して直ちにアッセイした。１００μｌのルシフェラーゼ基質・アッセイバッファー混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、続いて２０μｌの上清をポリスチレンチューブに添加し、２０／２０ｎルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、ルミネセンスを直ちに測定した。Ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって測定された総タンパク質濃度により相対光単位（ＲＬＵ）を正規化した。
毒性アッセイ

【0206】

Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤによって供給された細胞計数キット−８を使用して、遺伝子ベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を測定した。９６ウェルプレートにおいて１０，０００細胞／ウェルを播種し、ＤＭＥＭにおいて１、５、１０、５０および１００μｇ／ｍｌ圧縮ＤＮＡで２４時間処理した。次に、培地を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有する１００μｌのＤＭＥＭに置き換え、２０μｌの細胞計数キット−８試薬を添加し、２時間インキュベートした。Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｍｘ Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ，Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）を使用して、結果を４５０ｎｍにおいて分光測定で測定した。
結果
毒性

【0207】

９Ｌ細胞における細胞生存率アッセイは、その低いＮ／Ｐ比対応物と比較して、ＤＮＡに対するポリマーの高い比（Ｎ／Ｐ ５）で製剤化された粒子の毒性増加を明らかにした（図１２）。最も毒性の高い製剤は、Ｎ／Ｐ比５で形成された高密度にペグ化された遺伝子ベクター、ＢＲ９０であった。しかし、９Ｌ細胞に対するＮ／Ｐ比２の全粒子の細胞生存率アッセイ（図１２）は、遺伝子ベクターが、１００μｇ／ｍｌもの高濃度であっても相対的に無毒性であり、検査した全製剤で約７５％生存率であったことを明らかにした。さらに、細胞生存率試験は、Ｎ／Ｐ ２で製剤化された遺伝子ベクターの毒性が、９Ｌ細胞およびラット初代アストロサイトの両方に対し、最大１０μｇ／ｍｌの濃度で低かったことを明らかにした（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。
細胞取り込み

【0208】

フローサイトメトリー解析は、異なる製剤についてＰＬＬ＞ＢＲ９０＞ＢＲ１００＞ＰＬＬ−ＰＥＧの順に取り込み増加を示し（図１４Ａおよび図１４Ｂ）、粒子間の差は有意であった（ｐ値＜０．０５）。９Ｌ腫瘍細胞および初代ラットアストロサイトについて同じ傾向が観察された。しかし、絶対値は、全体的な遺伝子ベクター取り込みが、９Ｌ細胞に対してより高かったことを示した。ＰＬＬ−ＰＥＧの取り込みは、両方の細胞株における遊離プラスミドに観察されるレベルに近かった。
トランスフェクション

【0209】

９Ｌ細胞および初代アストロサイトの両方における相対ルミネセンス単位（ＲＬＵ）で測定されるルシフェラーゼ活性（図１４Ｃおよび図１４Ｄ）は、ＢＲ９０製剤が最高であり、続いてＢＲ１００製剤、ＰＬＬ製剤、最後にＰＬＬ−ＰＥＧ製剤であった。差は、初代アストロサイトについてのみで有意であることが判明し、ＢＲ９０のトランスフェクションレベルは、検査した他のあらゆる製剤のレベルよりも有意に高かった。ＰＬＬ−ＰＥＧのトランスフェクションは、遊離プラスミドによって達成されるレベルに匹敵した。

【0210】

カチオン性ポリマーの毒性は、その臨床適用性を制限する最も顕著な因子の１つであった。したがって、いずれか提案される遺伝子ベクタープラットフォームにとって、低レベルの毒性を確実にすることが重要である。臨床治験において検査された従来のＰＬＬ−ＰＥＧ製剤は、無毒性であることが判明した。２のＮ／ＰにあるＰＬＬ−ＰＥＧの低いｉｎ−ｖｉｔｒｏ毒性は、安全に投与できる遺伝子ベクターとしてのその適用性を確実にした。ＰＬＬ−ＰＥＧ遺伝子ベクターは、Ｎ／Ｐ比を５に増加させると毒性となることが判明し、この結果は、検査した残りの製剤に対して再現された。文献における以前の報告も、Ｎ／Ｐ比増加に伴うＰＬＬに基づく遺伝子ベクターの毒性増加を示した。Ｎ／Ｐ ５で観察される遺伝子ベクターの高い毒性の結果として、Ｎ／Ｐ ２で製剤化された遺伝子ベクターのみをさらに特徴付けた。９Ｌ細胞および初代細胞において行った追加的な細胞生存率アッセイは、検査した最高処理濃度であっても低い遺伝子ベクター毒性を実証し、遺伝子ベクターが、その後のｉｎ−ｖｉｔｒｏ試験に使用した濃度で、いずれの細胞株に対しても毒性がなかったことを確認した。

【0211】

遺伝子ベクター内部移行のｉｎ−ｖｉｔｒｏ特徴付けは、アスペクト比が減少するにつれて、細胞取り込みが増加したことを明らかにし、ＰＬＬ−ＰＥＧ（平均アスペクト比１２）およびＰＬＬ（平均アスペクト比約２）遺伝子ベクターは、それぞれ最低および最高細胞取り込みを示した。観察は、低いアスペクト比を有する粒子が、より急速な細胞内部移行を示すことを示した以前の実験的試験と合致する。特に、１４ｎｍまたは７４ｎｍの直径を有する金ナノスフェアが、７４ １４ｎｍ棒（アスペクト比約５）の３倍超の頻度でＨｅＬａ細胞によって取り込まれることが示された。同様に、より高いアスペクト比は、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＭＰＡ）−オリゴリシンブラシ（brush）ポリマーを使用して形成されたポリマーに基づく遺伝子ベクターの細胞取り込み低下を実証した。これらの知見を認めるものの、粒子化学および検査した細胞株における変動のため、かかる実験的試験の間の比較を引き出すことは困難である。エネルギー考察に基づく理論的モデルも、低いアスペクト比を有する粒子が、最小ラップ時間に関連付けられる一方、細胞と平行に置かれている粒子が、非常に細長く伸びた場合、部分的にしかラップされないことを提案した（「無駄な（frustrated）エンドサイトーシス」）。高いアスペクト比を有する粒子の取り込み低下が実証されたが、球状および楕円体ナノ粒子の間の比較は、僅かに細長い形状が、細胞取り込みを実際に改善し得ることを示した。ＰＲＩＮＴと呼ばれるトップダウンのアプローチを用いて、Ｇｒａｔｔｏｎらは、３のアスペクト比を有する架橋ＰＥＧに基づくハイドロゲルの円柱状粒子の内部移行が、同じ体積のその球状対応物の約４倍速かったことを実証した。高密度にペグ化された製剤に対し同様のアスペクト比が観察され、試験した細胞株に対する従来のＰＬＬ−ＰＥＧ遺伝子ベクターを上回る細胞取り込みにおける有意な利点を与えた。遺伝子ベクター内部移行に理想的であるようである非球状特徴を維持したまま、より低いアスペクト比が達成された。

【0212】

高い細胞取り込みにもかかわらず、ＰＬＬは、ＢＲ１００およびＢＲ９０と比較してより高いトランスフェクション効率を示さなかった。これは、細胞質におけるリソソーム分解、拡散制約および代謝的分解を含むいくつかの細胞内因子による可能性がある。高密度にペグ化されたＢＲ９０製剤は、恐らくは高い細胞取り込みと、続く核への効率的な細胞内輸送の組み合わされた効果により、９Ｌ細胞およびラット初代アストロサイトの両方において最高トランスフェクション効率を示した。
（実施例９）
ポリＬ−リシンおよび分岐状ＰＥＧを含有するナノ粒子は、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで脳組織における高い拡散率を有する
材料と方法
ａＣＳＦにおける粒子安定性

【0213】

ａＣＳＦ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、ＭＡ）において３７℃でインキュベートし、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）を使用して、処理前ならびに処理０時間および１時間後に、動的光散乱によりＺ−平均および多分散（ＰＤＩ）を記録することにより遺伝子ベクター安定性を評価した。２５℃で、散乱角９０°にて測定を行った。インキュベーション前、インキュベーション直後（０時間）、インキュベーション１時間後およびインキュベーション２４時間後を含む異なる時点で、セクション２．４．２．２に記述されている通りにＴＥＭガード（gird）も調製した。
齧歯類脳スライスの調製

【0214】

全動物実験は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）ガイドラインおよび地域施設内動物実験委員会規則（local Institutional Animal Care and Use Committee regulation）に従ってジョンズホプキンス大学医学部で行われた。簡潔に説明すると、成体フィッシャーラット（１２０〜１４０ｇ）を過量のイソフルランにより安楽死させ、その脳を迅速に取り出し、１０％グルコースを補充した冷ａＣＳＦ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、ＭＡ）に１０分間浸漬した。次に、Ｚｉｖｉｃ脳マトリックススライサー（Ｚｉｖｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して脳を１．５ｍｍ厚スライスに薄く切り、あつらえのスライド上に置いた。定位フレームに配置した５０ｕｌ Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｎｅｕｒｏシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ）を使用して、０．５マイクロリットルの蛍光標識された遺伝子ベクターを大脳皮質に１ｍｍの深さで注射した。組織を２２ｍｍ×２２ｍｍカバーガラスで覆って、組織移動およびバルク流を低下させた。
多重粒子追跡

【0215】

１００×／１．４６ ＮＡ油浸対物レンズを備える倒立落射蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｄ１、Ｚｅｉｓｓ；Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）に配置したＥｖｏｌｖｅ ５１２ ＥＭＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）により、露光時間６６．７ｍｓで２０秒間にわたって粒子軌跡を記録した。経時的な遺伝子ベクター中心軌跡のｘ，ｙ座標を抽出することにより、動画を解析し、各粒子の平均二乗変位を時間の関数として計算した。遺伝子ベクター型当たり少なくともＮ＝３匹のラット脳を使用し、試料当たり少なくとも５００個の遺伝子ベクターを追跡した。試料当たり全ナノ粒子のＭＳＤの幾何平均を計算し、異なる齧歯類脳の平均を時間の関数として計算した。τ＝１秒間のタイムスケールで、ナノ粒子毎のＭＳＤからヒストグラムを作成した。
ｉｎ ｖｉｖｏ共注射

【0216】

ｉｎ ｖｉｖｏでのナノ粒子拡散を試験するために、等しい濃度の差次的に蛍光標識されたＰＬＬ−ＰＥＧナノ粒子およびＢＲ９０ナノ粒子を雌フィッシャー３４４ラット（ｎ＝３）の線条体に共注射した。ケタミン・キシラジンの混合物により齧歯類を麻酔し、正中矢状切開を行って、ブレグマを露出させた。ブレグマの０．５ｍｍ後方および正中線の３ｍｍ側方に線条体を標的化した。ナノ粒子をロードした５０μｌ Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｎｅｕｒｏｓシリンジを硬膜下に３．５ｍｍ下げた。Ｃｈｅｍｙｘ Ｉｎｃ．Ｎａｎｏｊｅｔ定位シリンジポンプ（Ｃｈｅｍｙｘ、Ｓｔａｆｆｏｒｄ、Ｔｅｘａｓ）を使用して、０．３３μｌ／ｍｉｎの速度で個々の濃度０．２５μｇ／μｌの遺伝子ベクターを合計２０μｌ投与し、続いてシリンジを引き抜いた。動物を縫合し、そのケージに戻す前に加温パッド上に置いた。２時間後、齧歯類を屠殺し、脳を取り出し、ホルマリンにおいて一晩固定した。次に、懸濁溶液を１５％ショ糖に、その後２４時間後に３０％ショ糖に交換した。Ｌｅｉｃａ ＣＭ １９０５クリオスタットを使用して脳を薄く切って、１００μｍ厚のスライスを得た。スライスをＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で染色し、５×倍率のＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０ Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ； Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を使用して画像化した。イメージングの間、顕微鏡設定を一定に維持した。最大強度の１０％で画像を閾値化するカスタムＭＡＴＬＡＢスクリプトを介して共焦点レーザー走査顕微鏡画像を処理することにより、ＢＲ９０ナノ粒子またはＰＬＬ−ＰＥＧナノ粒子の蛍光分布に関して脳スライス画像を定量した。脳室または白質路における蛍光分布の定量を回避するよう注意した。各スライスから計算された分布面積に、１００μｍのスライス厚を乗じ、全画像にわたって合計して、総分布体積を得た。
結果
ａＣＳＦにおける粒子安定性

【0217】

ａＣＳＦにおける遺伝子ベクター安定性を調査して、脳への注射後の遺伝子ベクターの物理化学的特徴をモデル化した。Ｚ−平均および多分散指数（ＰＤＩ）の両方が、処置前に測定された粒子特徴と比較した場合、有意に増加したため、ＰＬＬ−ＰＥＧ製剤は、ＣＳＦにおける浸漬直後に不安定であった（図１５）。処置後１時間目に、ＰＤＩはさらに増加したが、Ｚ平均の下落が記載された。高度にペグ化された製剤、ＢＲ１００およびＢＲ９０の両方に関して、ＣＳＦ処置の直後にＺ−平均およびＰＤＩの僅かな増加が観察された。ＢＲ１００の場合、両方の測定値が、１時間の時点で下落した一方、ＢＲ９０に関してＺ−平均およびＰＤＩは、同じレベルで維持された。これらの結果は、同じ時点で各試料で撮影されたＴＥＭ画像により裏付けられた。
粒子拡散

【0218】

遺伝子ベクターの自動追跡を使用して、各組織試料についてτ＝１秒間のタイムスケールまでアンサンブル幾何平均二乗変位を得て、続いて３種の異なる試料にわたって平均した。高密度にペグ化された遺伝子ベクターは、従来のＰＬＬ−ＰＥＧよりも改善された輸送を示した（図１６）。ＢＲ９０およびＢＲ１００についてのτ＝１秒間におけるＭＳＤは、従来のＰＬＬ−ＰＥＧ製剤のＭＳＤよりも５．６倍および４．２倍高かった。ＢＲ９０およびＢＲ１００の間の差は、有意であるとは判明しなかった。高密度にペグ化されたナノ粒子についての増加されたｌｏｇ（ＭＳＤ）は、ヒストグラムプロットに見ることもできる（図１８）。個々の遺伝子ベクターＭＳＤを解析すると、急速運動として定義されるｌｏｇ１０ＭＳＤ≧−１を有する粒子のより大きいパーセンテージが、ＢＲ９０（５８．８％）およびＢＲ１００（４６．３％）対ＰＬＬ−ＰＥＧ（２８．２％）に観察された。代表的な粒子軌跡（図１７）は、ＰＬＬ−ＰＥＧの不十分な拡散率を描写するが、ＢＲ９０およびＢＲ１００は、大きい距離にわたって拡散性であった。ＰＬＬ粒子は、完全に固定化された。
ｉｎ ｖｉｖｏ共注射

【0219】

遺伝子ベクターのｉｎ ｖｉｖｏ共注射は、高密度にペグ化されたＢＲ９０粒子が、従来通りにペグ化されたＰＬＬ粒子よりもさらに遠くに分布することができることを明らかにした。共焦点画像の定量的解析は、分布の面積が、注射部位の平面に最大分布を有するベル型曲線（図１９）に従ったことを示した。高密度にペグ化された遺伝子ベクターの分布体積は、ＰＬＬ−ＰＥＧの分布体積よりもおよそ４倍高かった（図２０）。

【0220】

ＤＮＡ−ＣＰＮと比較してＤＮＡ−ＢＰＮにより達成された脳浸透およびｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション効率における同時発生的改善は、ＣＥＤにより実証される通り、ｉｎ ｖｉｖｏにおける増強されたより広汎な導入遺伝子発現をもたらした。注射平面から最大５００μｍ離れた距離における脳スライス当たりの統合密度（integrated density）（図２２Ａ）およびトランスフェクトされた細胞数の定量的解析は、ＰＬＬ−ＰＥＧ粒子（ＤＮＡ−ＣＰＮ）と比較した、ＢＲ９０（Ｎ／Ｐ２）粒子（ＤＮＡ−ＢＰＮ）の有意なおよそ２〜３倍増加を明らかにした（図２２Ｂ）。

【0221】

ＰＬＬ−ＰＥＧは、脳実質における限定的な拡散を示した。対照的に、高密度にペグ化されたＰＬＬ遺伝子ベクターは、従来のＰＬＬ−ＰＥＧ系と比較して、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ齧歯類脳組織において有意に改善された拡散率を示す。高密度にペグ化された製剤のうち、ＢＲ１００と比較してＢＲ９０の僅かにより高い拡散率は、物理化学的特徴における軽微な差を潜在的に反映し得る。高密度にペグ化されたナノ粒子に関して、ＥＣＭとの接着性相互作用は、徹底的に最小化され、したがって、立体障害が、主要な役割を果たし得る。最大１１４ｎｍの高密度にペグ化された粒子は、脳浸透することができるが、２００ｎｍの粒子はできない。よって、１１４ｎｍは、それを下回ると高密度にペグ化された粒子が急速に拡散すると予想できる、サイズカットオフである。ＢＲ１００遺伝子ベクターへの非ペグ化ポリマーの取り込みは、１１４ｎｍを下回る長径、すなわち、非球状粒子の大きい方の寸法を有する集団のより大きいパーセンテージをもたらした。これは、より低いＰＤＩと共に、ＢＲ９０製剤のより大きな拡散性画分（a larger diffusive fraction）に寄与した可能性がある。高密度にペグ化されたＰＬＬ遺伝子ベクターの増加された脳浸透能力は、現在広く使用されているＰＬＬ−ＰＥＧ遺伝子ベクターを上回る有意な改善である。比較すると、粒子製剤は、より高い安定性、ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション効率および脳ＥＣＭにおける拡散率を実証し、これを、脳への遺伝子送達のための有望なプラットフォームとして確立する。

【0222】

ＰＬＬ−分岐状ＰＥＧコポリマーおよび少量の非ペグ化ＰＬＬポリマーを使用して製剤化されたＰＬＬに基づく遺伝子ベクターは、従来通りに使用されたＰＬＬ−ＰＥＧと比較して、改善された拡散およびトランスフェクションの両方を実証した。高密度ペグ化により、脳実質における遺伝子ベクター分布を制限する電荷に基づく相互作用が最小化された一方、小型のナノ粒子サイズを同時に達成して、立体障害を最小化し、ＣＥＤによる分布体積を増強した。治療的分布の最大化に加えて、高密度にペグ化された遺伝子ベクター系の物理化学的特徴も、改善されたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞取り込みおよびトランスフェクションを支持した。さらに、ＰＬＬ−ＰＥＧ系は、ＣＦの処置のための臨床治験における好ましい安全性プロファイルを実証し、これにより、高密度にペグ化されたＰＬＬに基づく遺伝子ベクター系も説明するための卓越した優位性を定めた。急速拡散および圧力駆動型投与方法による効率的導入遺伝子送達の組合せは、ＧＢの有効な非ウイルス遺伝子療法にチャンスをもたらす。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14-1】

【図14-2】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】