【図1】図１は、インビボでのＬｇｒ５−ＧＦＰの散在した発現を示す。小腸を、Ｌｇｒ５−ＧＦＰマウスから採取し、蛍光顕微鏡下で直接画像化した。小腸の全ての領域が陰窩で覆われているが、これらの陰窩のほぼ半分が、ＧＦＰ＋細胞を含んだ。スケールバー：１００μｍ。

【図2A-B】図２Ａ〜２Ｈは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせがＬｇｒ５＋幹細胞の増殖および自己複製を促進することを示す。図２Ａは、ＥＮＲ（ＥＧＦ、ノギンおよびＲ−スポンジン１）、ＥＮＲ＋ＶＰＡ（ＥＮＲ−Ｖ）、ＥＮＲ＋ＣＨＩＲ（ＥＮＲ−Ｃ）およびＥＮＲ＋ＶＰＡ＋ＣＨＩＲ（ＥＮＲ−ＣＶ）の存在下で６日間培養した小腸陰窩のＧＦＰ画像および明視野画像を示す。アポトーシス性細胞は、自己蛍光により管腔中で可視であり（赤矢印）、白矢印は、陰窩の基底での特定のＬｇｒ５−ＧＦＰを示す。スケールバー：１００μｍ。図２Ｂは、複数の条件で培養した陰窩の細胞増殖およびＧＦＰ発現の定量化を示す。陰窩を、２４ウェルプレートで６日間培養し、アキュターゼ（Accutase）を使用して単一の細胞に分離した。各ウェルの生存細胞数を、細胞増殖の指標として計数した。Ｌｇｒ５−ＧＦＰ発現を、フローサイトメトリー分析によって測定した。エラーバーは、３つの（triplicate）ウェルのＳ．Ｄ．を示す。実験を３回行い、類似の結果を示した。（他に示さない限り、全てのパネルにおいて：^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊Ｐ＜０．０５；ＮＳ Ｐ＞０．０５。）

【図2C-D】図２Ａ〜２Ｈは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせがＬｇｒ５＋幹細胞の増殖および自己複製を促進することを示す。図２Ｃおよび２Ｄは、示されるとおりの複数の条件下での７日の培養の後の単一のＬｇｒ５−ＧＦＰ細胞のＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析を示す。エラーバーは３つのウェルのＳ．Ｄ．を示す。（他に示さない限り、全てのパネルにおいて：^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊Ｐ＜０．０５；ＮＳ Ｐ＞０．０５。）

【図2E】図２Ａ〜２Ｈは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせがＬｇｒ５＋幹細胞の増殖および自己複製を促進することを示す。図２Ｅは、９日の培養後の単一のＬｇｒ５−ＧＦＰ細胞のＧＦＰ画像および明視野画像を示す。スケールバー：１００μｍ。（他に示さない限り、全てのパネルにおいて：^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊Ｐ＜０．０５；ＮＳ Ｐ＞０．０５。）

【図2F-H】図２Ａ〜２Ｈは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせがＬｇｒ５＋幹細胞の増殖および自己複製を促進することを示す。図２Ｆは、複数の条件下で７日間培養したＦＡＣＳ単離された４０００個の単一のＬｇｒ５−ＧＦＰ細胞の代表的な画像を示し、図２Ｇは、コロニー数の定量化を示す。エラーバーは３つのウェルのＳ．Ｄ．を示す。図２Ｈは、正常な核型を有し、ＣＶ条件で８０日間培養した細胞の中期伸展（spread）を示す（２ｎ＝４０）。（他に示さない限り、全てのパネルにおいて：^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊Ｐ＜０．０５；ＮＳ Ｐ＞０．０５。）

【図3A-B】図３Ａ〜３Ｇは、培養条件の関数としての細胞増殖およびＧＦＰ発現を示す。図３Ａおよび３Ｂは、それぞれ、各時点に数えられた３つのウェル由来のコロニー数および単一の生存細胞の数を示す。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。図３Ａにおいて、系列は、左から右に、第０日、第２日、第４日、第６日、第８日、および第１０日である。

【図3C-D】図３Ａ〜３Ｇは、培養条件の関数としての細胞増殖およびＧＦＰ発現を示す。図３Ｃは、新しく単離された単一のＬｇｒ５−ＧＦＰ＋細胞のＦＡＣＳソーティング（sorting）を示す。ＧＦＰ^高単一細胞集団を回収した、ＧＦＰ＋細胞集団を画定するための代表的なＦＡＣＳ分析およびゲーティング戦略を示す。陰窩から新たに単離された単一の細胞は、２つの区別されるＧＦＰ^高およびＧＦＰ^低集団を示し、一方、培養した細胞は、区別されるＧＦＰ^高およびＧＦＰ^低集団を示さないので、全てのＧＦＰ＋細胞を、分析のためにゲーティングした。ＥＮＲ−ＣＶ培養細胞は、ＧＦＰが高度に陽性である単一のＧＦＰ＋集団を示したことに留意のこと。ＧＦＰ−集団は、Ｌｇｒ５−細胞およびＬｇｒ５＋／ＧＦＰ−細胞を示し（即ち、ＧＦＰ鎮静化幹細胞）、これは、全てのソーティングされていない陰窩培養物中に存在するが、ソーティングされた単一のＬｇｒ５−ＧＦＰ細胞培養物には存在しない（図２Ｃ参照）。合計１００００の生存細胞を、各試料について分析した。図３Ｄは、ＣＶ培養条件でのＬｇｒ５＋幹細胞の自己複製には増殖因子が必要であることを示す。陰窩を、示されるとおり、ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１およびこれらの組み合わせと共にＣＨＩＲおよびＶＰＡの存在下で６日間培養した。Ｅ：ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）；Ｎ：ノギン（１００ｎｇ／ｍｌ）；Ｒ：Ｒ−スポンジン１（５００ｎｇ／ｍｌ）；Ｃ：ＣＨＩＲ（３μＭ）；Ｖ：ＶＰＡ（１ｍＭ）。

【図3E-G】図３Ａ〜３Ｇは、培養条件の関数としての細胞増殖およびＧＦＰ発現を示す。図３Ｅは、示されるとおりの複数の条件で６日間培養した陰窩を示す。ＧＦＰ画像および明視野画像を示す。スケールバー：２００μｍ。図３Ｆは、ＥＮＲ、ＥＮＲ−ＣおよびＥＮＲ−ＣＶ条件で培養した結腸陰窩の形態およびＬｇｒ５−ＧＦＰ発現を示す。図３Ｇは、ＥＧＦ、ノギン、および複数の濃度でのＲ−スポンジン１またはＲ−スポンジン２の存在下での第５日に形成された孤立した類臓器体の数を示す。全てのスケールバー：２００μｍ。

【図4】図４Ａ〜４Ｂは、ＥＰＨＢ２＋ヒト結腸幹細胞に対する複数の培養条件の試験を示す。陰窩を、示されるとおりの複数の条件で６日間培養した。ＧＦＰ画像および明視野画像を図４Ａに示す。Ｗ：Ｗｎｔ３ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）；Ｎｉ：ニコチンアミド（１０ｍＭ）；Ｐ：ＰＧＥ２（０．０２μＭ）；Ａ：Ａ−８３−０１（０．５μＭ）；Ｓ：ＳＢ２０２１９０（１０μＭ）；Ｖ：バルプロ酸またはＶＰＡ（１ｍＭ）。ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｗｎｔ３ａおよびＶＰＡ、またはＥＮＲ−Ｗ−Ｖ条件は、ＧＦＰの発現の増加を示すための対照として役に立つ。スケールバー：２００μｍ。図４Ｂは、複数の条件下で培養した陰窩の細胞増殖およびＧＦＰ発現の定量化を示す。陰窩を、２４ウェルプレートで６日間培養し、単一の細胞に分離した。各ウェルの生存細胞数を計数し、ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーにより分析した。エラーバーは３つのウェルのＳ．Ｄ．を示す。

【図5】図５Ａ〜５Ｄは、単一のＬｇｒ５−ＧＦＰ幹細胞の培養を示す。図５Ａは、ＣＶ条件で９日間培養した単一の単離されたＬｇｒ５−ＧＦＰ＋細胞を示す。スケールバー：２００μｍ。図５Ｂは、示されたとおりの条件下でマトリゲル（Matrigel）中で培養したＦＡＣＳソーティングされた１５００個の単一のＬｇｒ５＋細胞を示す。第７日の培養からの代表的な画像を示す。図５Ｃは、コロニー数の定量化を示す。エラーバーは３つのウェルの（or）Ｓ．Ｄ．を示す。図５Ｄは、４８ウェルプレートに播種したソーティングされた単一のＬｇｒ５＋幹細胞を示す。プレーティング（plating）の１２時間後に、生存能力のある細胞数を定量した。コロニー数を第７日に計数し、コロニー形成効率を定量した。１００ｎｇ／ｍｌでＶ：ＶＰＡ；Ｃ：ＣＨＩＲ；Ｗ：Ｗｎｔ３ａ。エラーバーは３つのウェルのＳ．Ｄ．を示す。実験を３×行い、類似の結果を示した。

【図6A】図６Ａ〜６Ｄは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせによるＬｇｒ５＋幹細胞の自己複製の維持を示す。ＥＮＲ条件下で培養した類臓器体（上のパネル）およびＥＮＲ−ＣＶ条件で培養したコロニー（下のパネル）のリゾチーム（図６Ａ）、Ｋｉ６７（図６Ｂ）およびＥｄＵ（図６Ｃ）染色の共焦点画像を示す。ＥｄＵ染色について、細胞を、チミジンアナログＥｄＵ（赤）と共に１時間培養した。スケールバー：５０μｍ。

【図6B】図６Ａ〜６Ｄは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせによるＬｇｒ５＋幹細胞の自己複製の維持を示す。ＥＮＲ条件下で培養した類臓器体（上のパネル）およびＥＮＲ−ＣＶ条件で培養したコロニー（下のパネル）のリゾチーム（図６Ａ）、Ｋｉ６７（図６Ｂ）およびＥｄＵ（図６Ｃ）染色の共焦点画像を示す。ＥｄＵ染色について、細胞を、チミジンアナログＥｄＵ（赤）と共に１時間培養した。図６Ｂおよび６Ｃにおいて、陰窩ドメインのみが、ＥＮＲ条件でＫｉ６７陽性細胞または組み込まれたＥｄＵを含み（上のパネル）、一方、Ｋｉ６７またはＥｄＵは、ＣＶ条件で細胞凝集体のいたるところに存在する（下のパネル）。スケールバー：５０μｍ。

【図6C-D】図６Ａ〜６Ｄは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせによるＬｇｒ５＋幹細胞の自己複製の維持を示す。ＥＮＲ条件下で培養した類臓器体（上のパネル）およびＥＮＲ−ＣＶ条件で培養したコロニー（下のパネル）のリゾチーム（図６Ａ）、Ｋｉ６７（図６Ｂ）およびＥｄＵ（図６Ｃ）染色の共焦点画像を示す。ＥｄＵ染色について、細胞を、チミジンアナログＥｄＵ（赤）と共に１時間培養した。図６Ｂおよび６Ｃにおいて、陰窩ドメインのみが、ＥＮＲ条件でＫｉ６７陽性細胞または組み込まれたＥｄＵを含み（上のパネル）、一方、Ｋｉ６７またはＥｄＵは、ＣＶ条件で細胞凝集体のいたるところに存在する（下のパネル）。図６Ｄは、示されたとおりの条件下で６日間培養した成熟腸上皮細胞についてのマーカーの相対的ｍＲＮＡ発現の定量的リアルタイムＰＣＲ分析を示す（腸細胞について腸アルカリ性フォスファターゼ［Ａｌｐｉ］、杯細胞についてムチン２［Ｍｕｃ２］、腸内分泌細胞についてクロモグラニンＡ［ＣｈｇＡ］、パーネト細胞についてリゾチーム［Ｌｙｚ］、小腸幹細胞についてＬｇｒ５）。ＥＮＲ−ＣＶ（Ｄ４０）は、ＣＶ条件で４０日間培養した細胞を示す。スケールバー：５０μｍ。図６Ｄにおいて、系列は、左から右に、Ａｌｐｉ、Ｍｕｃ２、ＣｈｇＡ、Ｌｙｚ、およびＬｇｒ５である。

【図7A】図７Ａ〜７Ｄは、ＣＶ条件下で培養した腸幹細胞の分化を示す。図７Ａは、ＣＶ条件からＥＮＲ条件に移し、かつ４日間培養した細胞の分化マーカー（腸細胞についてＡｌｐ、杯細胞（白矢印）および杯細胞により分泌されるムチンについてＭｕｃ２、腸内分泌細胞についてＣｈｇＡ、ならびにパーネト細胞についてＬｙｚ）の染色を示す。ＤＡＰＩを、核の染色のために使用し、ＧＦＰは幹細胞の存在を示す。スケールバー：５０μｍ。

【図7B】図７Ａ〜７Ｄは、ＣＶ条件下で培養した腸幹細胞の分化を示す。図７Ｂは、複数の条件下で培養した細胞由来の成熟腸上皮マーカーの相対的ｍＲＮＡ発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。細胞を、最初に、ＣＶ条件で６日間、単一の細胞から培養した。次いで、細胞コロニーを、採取し、洗浄し、２４ウェルプレートのいくつかのウェルに再度プレーティングし、示されたとおりの複数の条件下でマトリゲル中で４日間培養した。ＥＮＲを、全ての条件において添加し、ＥＮＲのみと培養した細胞を、対照として使用した。Ｉ：ＩＷＰ−２（２μＭ）、Ｄ：ＤＡＰＴ（１０μＭ）、Ｃ：ＣＨＩＲ（３μＭ）、Ｖ：ＶＰＡ（１ｍＭ）。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。

【図7C】図７Ａ〜７Ｄは、ＣＶ条件下で培養した腸幹細胞の分化を示す。図７Ｃは、複数の条件下で培養した細胞のＡｌｐ染色を示す。ＩＤおよびＣＤ条件で明らかな細胞の形態の変化があり、これは、杯細胞およびパーネト細胞と類似する。スケールバー：５０μｍ。

【図7D】図７Ａ〜７Ｄは、ＣＶ条件下で培養した腸幹細胞の分化を示す。図７Ｄは、分化マーカーの免疫細胞化学的染色を示す。ＣＤおよびＩＤ条件下で培養した細胞を、ムチン２（Ｍｕｃ２）、クロモグラニンＡ（ＣｈｇＡ）、およびリゾチーム（Ｌｙｚ）染色について使用した。３次元再構築共焦点画像を示す。スケールバー：５０μｍ。

【図8A-B】図８Ａ〜８Ｆは、インビトロでのＬｇｒ５＋幹細胞の制御された分化を示す。図８Ａは、ＥＮＲ条件で培養した類臓器体の染色を示す。左のパネルは、腸細胞のＡｌｐ染色を示す。染色の前に、類臓器体を、解剖顕微鏡下で鋭利な刃を使用することによって切り開き、管腔の内容物を除去した。中央のパネルは、杯細胞（矢印）および杯細胞によって分泌されたムチンのＭｕｃ２染色を示し、右のパネルは、腸内分泌細胞のＣｈｇＡ染色を示す。ＧＦＰ＋細胞は、Ｌｇｒ５＋幹細胞を示す。図８Ｂは、分化プロトコルのスキームを提供する。単一のＬｇｒ５＋幹細胞を、ＣＶ条件で４〜６日間培養し、コロニーを形成させた。次いで、細胞コロニーを、採取し、洗浄し、新しいマトリゲルに植え込み、複数の条件下で培養した。全スケールバー：５０μｍ。

【図8C-D】図８Ａ〜８Ｆは、インビトロでのＬｇｒ５＋幹細胞の制御された分化を示す。図８Ｃは、ＣＶ条件からＥＮＲ条件に移し、かつ４日間培養した細胞コロニーの形態を示す（上のパネル）。ＣＶ条件で継続的に培養したコロニーを、対照として示す（下のパネル）。図８Ｄは、各条件について、低倍率画像および高倍率画像で分化した細胞の形態を示す。ＣＤおよびＩＤ条件でほとんどの細胞の形態が明らかに変化し、これは、それぞれ、パーネト細胞および杯細胞の形成を表すことに留意のこと。全スケールバー：５０μｍ。

【図8E-F】図８Ａ〜８Ｆは、インビトロでのＬｇｒ５＋幹細胞の制御された分化を示す。図８Ｅは、ＩＶ条件で培養したコロニーの Ａｌｐ染色を示す。Ａｌｐの先端（左のパネル）および均質な（右のパネル）染色を示す。図８Ｆは、ＩＤおよびＣＤ条件で培養したコロニーのＭｕｃ２染色を示す。全スケールバー：５０μｍ。

【図9A-B】図９Ａ〜９Ｆは、ＣＨＩＲおよびＶＰＡについての作用の機構を示す。図９Ａは、６日間複数の条件で培養した陰窩の形態およびＬｇｒ５−ＧＦＰ発現を示す。Ｃ：ＣＨＩＲ（３μＭ）；Ｌｉ：ＬｉＣｌ（５ｍＭ）；Ｗ：Ｗｎｔ３ａ（１００ｎＭ）。図９Ｂは、６日の陰窩培養についての細胞数およびＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示す。データは、３つの独立した実験を代表する。（他に示さない限り、全てのパネルにおいて：エラーバーは３つのウェルの（or）Ｓ．Ｄ．を示す。^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊Ｐ＜０．０５；ＮＳ Ｐ＞０．０５。）

【図9C】図９Ａ〜９Ｆは、ＣＨＩＲおよびＶＰＡについての作用の機構を示す。図９Ｃは、ＥＮＲ−Ｃ（対照）条件またはＨＤＡＣインヒビターを伴うＥＮＲ−Ｃ条件での陰窩の６日培養を示す。

【図9D】図９Ａ〜９Ｆは、ＣＨＩＲおよびＶＰＡについての作用の機構を示す。図９Ｄは、図９Ｃの細胞のＧＦＰパーセンテージ、全生存細胞数および相対ＧＦＰ強度の定量化を示す。

【図9E-F】図９Ａ〜９Ｆは、ＣＨＩＲおよびＶＰＡについての作用の機構を示す。図９Ｅは、複数の濃度のＶＰＡおよびＴＳＡの細胞増殖およびＧＦＰ発現に対する効果を示す。図９Ｆは、ニコチンアミド（Ｎｉ）のＷｎｔ３ａ（Ｗ、１００ｎｇ／ｍｌ）またはＣＨＩＲ（Ｃ、３μＭ）と組み合わせた効果を示す。複数の条件で６日間培養した陰窩の細胞数およびＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示す。（他に示さない限り、全てのパネルにおいて：エラーバーは３つのウェルの（or）Ｓ．Ｄ．を示す。^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊Ｐ＜０．０５；ＮＳ Ｐ＞０．０５。）

【図10】図１０は、複数の条件で培養した単一のＬｇｒ５−ＧＦＰ細胞の形態およびＧＦＰ発現を示す。スケールバー：１００μｍ。

【図11A】図１１Ａ〜１１Ｄは、ＶＰＡの機構を示す。図１１Ａは、ノッチ阻害後にＶＰＡがＧＦＰ発現を救出する（rescue）ことを示す。陰窩を、３日間、ＤＡＰＴ（Ｄ、５μＭ）ありまたはなしで、かつＶＰＡの濃度を変動させて（Ｖ、０．２５〜４ｍＭ）、ＥＮＲ−Ｃ条件で培養した。スケールバー：２００μｍ。

【図11B-D】図１１Ａ〜１１Ｄは、ＶＰＡの機構を示す。図１１Ｂおよび１１Ｃは、ＥＮＲ（図１１Ｂ）またはＥＮＲ＋ＣＨＩＲ（図１１Ｃ）条件で４日間培養し、その後、種々の濃度のＶＰＡを添加し、さらに２４時間培養した陰窩を示す。ノッチ１、Ｈｅｓ１およびＡｔｏｈ１の発現を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで分析した。図１１Ｄは、６日の培養後の陰窩中のノッチ１、Ｈｅｓ１およびＡｔｏｈ１の発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲでの分析を示す。図１１Ｂ〜１１Ｃにおいて、系列は、左から右に、０、０．５、１、２、および３である。図１１Ｄにおいて、系列は、左から右に、ＥＮＲ、ＥＮＲ−Ｖ、ＥＮＲ−Ｃ、およびＥＮＲ−ＣＶである。

【図12】図１２Ａ〜１２Ｂは、（図１２Ａ）生理学的条件下および（図１２Ｂ）インビトロ培養での腸幹細胞の自己複製および分化についてのモデルを示す。

【図13】図１３Ａ〜１３Ｂは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせが、マウスの内耳に由来するＬｇｒ５＋幹／前駆細胞の増殖およびＧＦＰ発現を促進することを示す。図１３Ａは、出生後第２日のＬｇｒ５−ＧＦＰマウスに由来する単離された蝸牛感覚上皮の明視野画像およびＧＦＰ画像を示す。図１３Ｂは、単一の細胞に分離し、１１日間複数の条件で培養した単離された蝸牛感覚上皮を示す。Ｅ：ＥＧＦ；Ｎ；ノギン；Ｒ：Ｒ−スポンジン１；Ｃ：ＣＨＩＲ９９０２１、Ｖ：ＶＰＡ。スケールバー：１００μｍ。

【図14A】図１４Ａ〜１４Ｆは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせが、マウスの内耳に由来するＬｇｒ５＋幹／前駆細胞の増殖およびＧＦＰ発現を促進することを示す。図１４Ａは、内耳上皮細胞のＧＦＰ発現を示す。

【図14B】図１４Ａ〜１４Ｆは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせが、マウスの内耳に由来するＬｇｒ５＋幹／前駆細胞の増殖およびＧＦＰ発現を促進することを示す。図１４Ｂは、ＧＦＰ発現の定量化および細胞数を示す。

【図14C】図１４Ａ〜１４Ｆは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせが、マウスの内耳に由来するＬｇｒ５＋幹／前駆細胞の増殖およびＧＦＰ発現を促進することを示す。図１４Ｃは、明視野画像およびＧＦＰ画像を示す。全てのスケールバー：２００μｍ。

【図14D-F】図１４Ａ〜１４Ｆは、ＣＨＩＲとＶＰＡの組み合わせが、マウスの内耳に由来するＬｇｒ５＋幹／前駆細胞の増殖およびＧＦＰ発現を促進することを示す。図１４Ｄは、示されるとおりの複数の条件での内耳幹細胞の８日培養の細胞数を示す。図１４Ｅは、示されるとおりの複数の条件での内耳幹細胞の８日培養のＧＦＰパーセンテージを示す。図１４Ｆは、複数の条件で培養したＬｇｒ５−ＧＦＰ内耳幹細胞の形態およびＧＦＰ発現を示す。全てのスケールバー：２００μｍ。

【図15】図１５は、インビトロでの健康なマウスの結腸組織へのマウス小腸陰窩の播種を示す。左のパネルは、部分的に露出させた（denude）上皮を有する結腸に配置した単離された小腸陰窩を示す。白矢印は、播種した陰窩を示す。右のパネルは、結腸に付着させ、かつ２４時間後にその表面を横切って広げた播種した陰窩を示す。黒矢印は、左のパネルの白矢印と同じ位置を示す。

【図16】図１６は、播種の４８時間後の陰窩の植付けを示す。陰窩を播種したマウス結腸組織の蛍光（上のパネル）および明視野（下のパネル）画像を示す。陰窩を、播種の前にＤｉＤで染色した。白線は、植え付けた細胞を含む領域を示す。

【図17】図１７は、６日のインビトロ培養後の陰窩の植付けを示す。陰窩を播種したマウス結腸組織のＧＦＰ（左のパネル）、ＲＦＰ（中央のパネル）、および明視野（右のパネル）チャネルの画像を示す。ＧＦＰシグナルは、Ｌｇｒ５細胞の存在を示す。

【図18】図１８は、陰窩を植え付けたＴＲＵＣマウスから切除した脱した潰瘍性大腸炎組織の共焦点画像を示す。陰窩を、播種の前にＤｉＤで染色した。脱した組織を、緑の自己蛍光によって示す。

【図19A-F】図１９Ａ〜１９Ｎは、評価した培養系中の播種（左）およびインキュベーション後の類臓器体の成長（右）の概略図を示す。図１９Ａおよび１９Ｂは、典型的な粘膜下組織播種方法（本明細書で「ベアパッチ（bare patch）」という）を示し、これは、単層の成長および類臓器体の分離を支持する。図１９Ｃおよび１９Ｄは、３次元の類臓器体の成長を支持するためのＧＦ注入ＳＩＳ（ＧＦは、ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｙ−２７６３２、バルプロ酸、ＣＨＩＲを含む）を示す。図１９Ｅおよび１９Ｆは、コラーゲンのかぶせもの（overlay）を有するＧＦ注入ＳＩＳで構成されるゲルパッチを示す。図１９Ｅの挿入図は、各々の類臓器体が個々に軟質ゲルおよびＳＩＳ基底層中に覆われることを示す。

【図19G-N】図１９Ａ〜１９Ｎは、評価した培養系中の播種（左）およびインキュベーション後の類臓器体の成長（右）の概略図を示す。図１９Ｇおよび１９Ｈは、培養培地に直接添加されたＧＦ（ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｙ−２７６３２、バルプロ酸、ＣＨＩＲ）を有する典型的なコラーゲン懸濁物を示す。図１９Ｉおよび１９Ｊは、ゲルに植え込まれたＧＦ（ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｙ−２７６３２、バルプロ酸、ＣＨＩＲ）を有する典型的なコラーゲン懸濁物を示す。図１９Ｋおよび１９Ｌは、培養培地に添加されるさらなるＧＦを有さない典型的なコラーゲン懸濁物を示す。図１９Ｍおよび１９Ｎは、培地に添加されるさらなるＧＦを有さない典型的なマトリゲル懸濁物を示す（実験対照）。

【図20】図２０Ａは、Ｌｇｒ５＋類臓器体を播種する手順の概略図を示し；模様の付いた円は、注入された増殖因子（ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、Ｙ−２７６３２、バルプロ酸、およびＣＨＩＲ）を表す。図２０Ｂは、最初の接着相を示し、矢印は、増殖植付け因子拡散支持体（growth embedded factor diffusion suport）を示す。図２０Ｃは、コラーゲンのかぶせものを有する完全培養系を示し、厚さの測定が示される。

【図21】図２１Ａは、７つの培養系中での類臓器体の成長の比較を提供する。系列は、左から右に、マトリゲル、ＧＦを有するゲルパッチ、ＧＦを有するベアパッチ、コラーゲンＩ、培地ＧＦを有するコラーゲンＩ、ＧＦを植え込んだコラーゲンＩ、およびＧＦなしのベアパッチである。図２１Ｂおよび２１Ｃは、ＧＦを有するゲルパッチ系由来の４８時間での代表的な類臓器体を示し、ＧＦＰ＋蛍光は、陰窩基底に存在するＬｇｒ５＋幹細胞を示す（いくつかの中央の自己蛍光が見られる）。２４時間（コラーゲンＩ（ＣＩ） 対 全て）、４８時間（ＧＦを有するベアパッチ（ＢＰＧＦ） 対 全て；ＣＩ 対 マトリゲル（Ｍ）；ＧＦを有するＣＩ（ＣＩＧＦ） 対 Ｍ、ＣＩ、ＧＦを植え込まれたコラーゲンＩ（ＣＩＥＧＦ）、ベアパッチ（ＢＰ）、ＧＦを有するゲルパッチ系（ＰＳＧＦ））、７２時間（ＣＩ 対 全て；ＢＰ、ＣＩＥＧＦ、およびＣＩＧＦ 対 Ｍ、ＰＳ、ＢＰＧＦ、ＣＩ）および９６時間（ＣＩ 対 全て、ＢＰ、ＣＩＥＧＦ、およびＣＩＧＦ 対 全て）で＊＝ｐ＜．０５。スケールバー（図２１Ｂおよび２１Ｃ）＝２００μｍ。

【図22】図２２は、ＧＦを有するゲルパッチ系において播種された類臓器体の成功裡の成長および陰窩の増殖を示す。ＧＦを有するＳＩＳパッチ系上に播種された類臓器体のエキソビボ成長を示す代表的な画像の順序を示す。ピントがずれている陰窩は、単一面顕微鏡で観察した３次元の増殖の効果である。

【図23】図２３Ａは、４ｍｍの胃の欠損の作製を示す概略図を提供する。欠損を覆う６ｍｍのパッチの配置を、図２３Ｂに示す。図２３Ｃに示すように、胃の外壁には目に見える欠損はなく、これは、手術後１週間の代表的な胃の試料で示された。胃の内壁から見た場合、欠損全体（矢印）は、配置したパッチの型に従って示される：図２３Ｄは、ＧＦを有さないＳＩＳパッチを示し、図２３Ｅは、ＧＦを加えたＳＩＳパッチを示し、図２３Ｆは、ＳＩＳなしのＰＧＳＵ裏当て（backing）のみを示す。ＧＦを有するＳＩＳパッチは、完全な閉鎖および胃の壁の上皮形成効果を示し、一方、ＳＩＳのみにおいて、欠損は部分的に開いたままであり、ＳＩＳなしのＰＧＳＵにおいて、欠損は完全に開いたままであった。

【図24】図２４は、複数の条件で培養した単離されたヒト腸陰窩のマーカー遺伝子発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ＥＧＦ、ノギンおよびＲ−スポンジン１を全ての条件に添加した。Ｃ：ＣＨＩＲ、Ｎｉ：ニコチンアミド、Ｗ：Ｗｎｔ３ａ、Ａ：Ａ８３−０１、Ｓ：ＳＢ２０２１９０、Ｐ：ＰＧＥ２、Ｖ：ＶＰＡ、Ｔｕ：ツバスタチンＡ、陰窩は、新たに単離されたヒト小腸陰窩を示す。エラーバーはＳ．Ｄ．を示し、ｎ＝３である。

【図25】図２５Ａ〜２５Ｂは、ヒト腸幹細胞について最適化した培養条件を示す。図２５Ａは、複数の条件で培養したヒト腸上皮細胞の増殖を示す。新たに単離されたヒト小腸陰窩を、示されるとおりの複数の条件で培養した。ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１は、全ての条件において存在した。細胞数を、播種後第９日に定量した。Ｃ：ＣＨＩＲ、Ｖ：０．５〜１．５ｍＭで使用したＶＰＡ、Ｎｉ：ニコチンアミド。図２５Ｂは、図１５Ａのとおりの複数の条件で培養した細胞のＬＧＲ５発現を示す。ＶＰＡを１ｍＭで使用した。

【図26】図２６は、ヒト腸幹細胞の培養を示す。細胞を、ヒト腸幹細胞培養培地（ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンジン１、ＣＨＩＲ９９０２１、ＶＰＡ、およびニコチンアミドを含む）中で培養した。継代後第５日での第２継代の細胞を示す。スケールバー：４００μｍ。

【図27】図２７は、動物モデル系におけるインビボでの７日の経過をとおしたＣＨＩＲおよびＶＰＡの投与後の陰窩サイズの増加を示す。