特許 6768689 高アンモニア血症に関連する病気を処置するために操作された細菌

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6768689

(24)【登録日】2020年9月25日

(45)【発行日】2020年10月14日

(54)【発明の名称】高アンモニア血症に関連する病気を処置するために操作された細菌

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20201005BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20201005BHJP

   A61K 35/741 20150101ALI20201005BHJP

   A61K 35/742 20150101ALI20201005BHJP

   A61K 35/744 20150101ALI20201005BHJP

   A61K 35/745 20150101ALI20201005BHJP

   A61K 35/747 20150101ALI20201005BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20201005BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20201005BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20201005BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20201005BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20201005BHJP

   C12N 15/52 20060101ALI20201005BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20201005BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/21ZNA

   C12N1/20 E

   A61K35/741

   A61K35/742

   A61K35/744

   A61K35/745

   A61K35/747

   A61P1/16

   A61P7/00

   A61P9/00

   A61P25/00

   A61P27/02

   C12N15/52 Z

   C12N15/63 Z

【請求項の数】24

【全頁数】110

(21)【出願番号】特願2017-548375(P2017-548375)

(86)(22)【出願日】2015年12月4日

(65)【公表番号】特表2018-504919(P2018-504919A)

(43)【公表日】2018年2月22日

(86)【国際出願番号】US2015064140

(87)【国際公開番号】WO2016090343

(87)【国際公開日】20160609

【審査請求日】2018年12月3日

(31)【優先権主張番号】62/173,710

(32)【優先日】2015年6月10日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/103,513

(32)【優先日】2015年1月14日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/256,039

(32)【優先日】2015年11月16日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/087,854

(32)【優先日】2014年12月5日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/150,508

(32)【優先日】2015年4月21日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/173,706

(32)【優先日】2015年6月10日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/184,811

(32)【優先日】2015年6月25日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/263,329

(32)【優先日】2015年12月4日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/183,935

(32)【優先日】2015年6月24日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/256,041

(32)【優先日】2015年11月16日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517196203

【氏名又は名称】シンロジック オペレーティング カンパニー インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100181272

【弁理士】

【氏名又は名称】神 紘一郎

(72)【発明者】

【氏名】ディーン ファルブ

(72)【発明者】

【氏名】ビンセント エム イザベラ

(72)【発明者】

【氏名】ジョナサン ダヴリュー コツラ

(72)【発明者】

【氏名】ポール エフ ミラー

【審査官】 田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００４−５２０３６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００６／０３５８３１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Applied and Environmental Microbiology, 1998年，Vo.64, No.5，p.1805-1811

【文献】 Nucleic Acids Research, 1991年，Vol.19, No.11，p.2889-2892

【文献】 Jundishapur J. Microbiol.，２０１４年 ７月 １日，Vol.7, No.7，e15942 (p.1-5)

【文献】 Orphanet Journal of Rare Diseases, 2012年，Vol.7, No.32，p.1-30

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

Ａ６１Ｋ ３５／７４１

Ａ６１Ｋ ３５／７４２

Ａ６１Ｋ ３５／７４４

Ａ６１Ｋ ３５／７４５

Ａ６１Ｋ ３５／７４７

Ａ６１Ｐ １／１６

Ａ６１Ｐ ７／００

Ａ６１Ｐ ９／００

Ａ６１Ｐ ２５／００

Ａ６１Ｐ ２７／０２

Ｃ１２Ｎ １／２０

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作した細菌であって、
前記細菌は、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ（ＡｒｇＡ^ｆｂｒ）をコードする遺伝子を含み、ＡｒｇＡ^ｆｂｒは、同一条件下の同じ細菌サブタイプに由来する野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼと比較し、アルギニンフィードバック阻害が低減しており、ＡｒｇＡ^ｆｂｒをコードする前記遺伝子の発現は、低酸素または嫌気的な条件により誘導されるプロモータにより制御され、
前記細菌は機能性ＡｒｇＲを欠くように遺伝子操作されている、細菌。

【請求項2】

対応する野生型細菌に通常存在する機能性ａｒｇＲ遺伝子の各コピーが削除されている、請求項１に記載の細菌。

【請求項3】

対応する野生型細菌に通常存在する機能性ａｒｇＧ遺伝子の各コピーが個別に削除されているか、または、１つもしくは複数のヌクレオチドの削除、挿入、もしくは置換により不活性になっている、請求項１に記載の細菌。

【請求項4】

対応する野生型細菌に通常存在する機能性ａｒｇＧ遺伝子の各コピーが削除されている、請求項３に記載の細菌。

【請求項5】

低酸素または嫌気的な条件下で、機能性ＡＲＧボックスを含むオペロン中に存在し、アルギニン生合成酵素をコードする各遺伝子の転写が、同一条件下の野生型細菌の対応する遺伝子と比較し増加する、請求項１に記載の細菌。

【請求項6】

低酸素または嫌気的な条件下で誘導される前記プロモータはＦＮＲ応答性プロモータである、請求項１に記載の細菌。

【請求項7】

請求項１に記載の細菌であって、前記アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ遺伝子は、
ａ）配列番号２８、および
ｂ）遺伝子コードの冗長性を別とすれば配列番号２８にコードされているのと同じポリペプチドをコードするＤＮＡ配列から選択されるＤＮＡ配列を有する、細菌。

【請求項8】

非病原性細菌である、請求項１に記載の細菌。

【請求項9】

プロバイオティクス細菌である、請求項１に記載の細菌。

【請求項10】

バクテロイデス、ビフィドバクテリウム、クロストリジウム、エシェリキア、ラクトバチルス、およびラクトコッカスからなる群から選択される、請求項１に記載の細菌。

【請求項11】

大腸菌株Ｎｉｓｓｌｅである、請求項１に記載の細菌。

【請求項12】

前記アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ（ＡｒｇＡ^ｆｂｒ）をコードする遺伝子は、前記細菌のプラスミドに存在し、前記プラスミドにおいて、低酸素または嫌気的な条件下で誘導されるプロモータに操作可能に連結している、請求項１に記載の細菌。

【請求項13】

前記アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ（ＡｒｇＡ^ｆｂｒ）をコードする遺伝子は、細菌染色体に存在し、前記染色体において、低酸素または嫌気的な条件下で誘導されるプロモータに操作可能に連結している、請求項１に記載の細菌。

【請求項14】

哺乳類の消化管に存在する場合に補完される遺伝子において栄養要求株である、請求項１に記載の細菌。

【請求項15】

前記哺乳類の消化管はヒトの消化管である、請求項１４に記載の細菌。

【請求項16】

前記細菌はｔｈｙＡまたはｄａｐＢの栄養要求株である、請求項１４に記載の細菌。

【請求項17】

抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項１に記載の細菌。

【請求項18】

アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作した細菌および薬学的に許容される担体を含む、薬学的に許容される組成物であって、前記細菌は、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ（ＡｒｇＡ^ｆｂｒ）をコードする遺伝子を含み、ＡｒｇＡ^ｆｂｒは、同一条件下の同じ細菌サブタイプに由来する野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼと比較し、アルギニンフィードバック阻害が低減しており、ＡｒｇＡ^ｆｂｒをコードする前記遺伝子の発現は、低酸素または嫌気的な条件により誘導されるプロモータにより制御され、前記細菌は機能性ＡｒｇＲを欠くように遺伝子操作されている、薬学的に許容される組成物。

【請求項19】

請求項１〜１５及び１７の何れか一項に記載の遺伝子操作した細菌または請求項１８に記載の薬学的に許容される組成物を含み、高アンモニア血症関連疾患またはその症状の処置を、それを必要とする対象で行うための医薬組成物。

【請求項20】

前記高アンモニア血症関連疾患は尿素サイクル異常症である、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項21】

前記尿素サイクル異常症は、アルギニノコハク酸尿症、アルギナーゼ欠損症、カルバモイルリン酸シンセターゼ欠損症、シトルリン血症、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ欠損症、またはオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症から選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

前記高アンモニア血症関連疾患は、肝性脳症、急性肝不全、または慢性肝不全から選択される肝疾患である、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項23】

前記高アンモニア血症関連疾患の症状は、脳卒中、運動失調、脳卒中様病変、昏睡、精神病、視力喪失、急性脳症、脳浮腫、ならびに嘔吐、呼吸性アルカローシス、および低体温からなる群から選択される、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項24】

投与は、経口投与または直腸投与である、請求項１９に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【優先権主張】

【0001】

本出願は、２０１４年１２月５日に出願された米国仮特許出願第６２／０８７８５４号、２０１５年６月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／１７３７０６号、２０１５年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／２５６０４１号、２０１５年１月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／１０３５１３号、２０１５年４月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／１５０５０８号、２０１５年６月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／１７３７１０号、２０１５年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／２５６０３９号、２０１５年６月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／１８４８１１号、２０１５年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／１８３９３５号、および２０１５年１２月４日に出願された米国仮特許出願第６２／２６３３２９号の利益を主張するものであり、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれて、開示の継続性を提供する。

【技術分野】

【0002】

本開示は、過剰のアンモニアを減少させ、アンモニアおよび／または窒素を代わりの副生成物に変換するための組成物および治療法に関する。ある態様では、本開示は、特に、哺乳類の消化管などの低酸素条件で過剰なアンモニアを減少させることが可能な、遺伝子操作した細菌に関する。ある態様では、本明細書に開示する組成物および方法を、尿素サイクル異常症および肝性脳症などの高アンモニア血症に関連する疾患を和らげるまたは処置するために用いることができる。

【背景技術】

【0003】

アンモニアは毒性が強く、全器官での代謝時に生成される（Ｗａｌｋｅｒ，２０１２）。高アンモニア血症は、解毒作用の低下および／またはアンモニア生成の増加により引き起こされる。哺乳類では、尿素サイクルでアンモニアを尿素に酵素的に変換することによりアンモニアは解毒され、その後、尿で除去される。アンモニアの解毒作用の低下は、アルギニノコハク酸尿症、アルギナーゼ欠損症、カルバモイルリン酸シンセターゼ欠損症、シトルリン血症、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ欠損症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症などの、尿素サイクル酵素が欠損しているサイクル異常症（ＵＣＤ）により引き起こされ得る（Ｈａｅｂｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎは、ＵＣＤの罹患率は８５００人の出生児数あたり１人と推測する。加えて、肝性脳症、門脈体循環シャント、および有機酸異常症などのいくつかの非ＵＣＤ疾患も、高アンモニア血症を引き起こし得る。高アンモニア血症は、脳卒中、運動失調、脳卒中様病変、昏睡、精神病、視力喪失、急性脳症、脳浮腫、ならびに嘔吐、呼吸性アルカローシス、低体温、または死亡などの神経症状を発生させ得る（Ｈａｅｂｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｈａｅｂｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0004】

アンモニアは、種々の生合成経路により合成されるアミノ酸に対する窒素の供給源でもある。例えば、アルギニン生合成は、窒素原子を１つ含むグルタミン酸を、窒素原子を４つ含むアルギニンに変換する。アルギニン生合成経路で形成されるシトルリンなどの中間代謝産物も窒素を取り込む。したがって、高アンモニア血症に関連する症状を和らげるまたは処置するために、アルギニン生合成の強化を利用して、体内の過剰な窒素を非毒性分子に取り込むことができる。同様に、ヒスチジン生合成、メチオニン生合成、リシン生合成、アスパラギン生合成、グルタミン生合成、およびトリプトファン生合成も過剰な窒素の取り込みが可能であり、これらの経路の強化を利用して、高アンモニア血症に関連する症状を和らげるまたは処置することができる。

【0005】

高アンモニア血症およびＵＣＤの現在の治療は、アンモニア過剰を低減することを目的とするが、準最適だと広く考えられている（Ｎａｇａｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｔｏｒｒｅｓ−Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ほとんどのＵＣＤ患者は、タンパク質制限からなる実質的に修正された食事を必要とする。しかしながら、低タンパク食は注意深くモニターしなければならず、タンパク質の摂取を制限しすぎると身体は筋肉を分解し、その結果アンモニアが生成される。加えて、多くの患者は、フェニル酪酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、およびグリセロールフェニル酪酸塩などのアンモニア除去薬の補給を必要とし、これらの薬物の１つまたは複数を一日に３〜４回投与しなければならない（Ｌｅｏｎａｒｄ，２００６；Ｄｉａｚ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。これらの薬の副作用としては、吐き気、嘔吐、過敏症、食欲不振、および女性の月経障害が挙げられる（Ｌｅｏｎａｒｄ，２００６）。小児では、食物および薬剤の送達に、腹部に外科的に埋め込んだ胃瘻管、または、鼻を通って腹部に手動で挿入される経鼻胃管が必要な場合がある。これらの処置選択肢が失敗した場合、肝臓移植が必要となり得る（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）。したがって、尿素サイクル異常症を含む高アンモニア血症に関連した疾患の、効果的で信頼性が高い、および／または長期の処置に対するニーズは著しく満たされていない。

【0006】

本発明は、過剰なアンモニアを減少させ、アンモニアおよび／または窒素を代わりの副生成物に変換することが可能な、遺伝子操作した細菌を提供する。ある実施形態では、遺伝子操作した細菌は、消化管などの低酸素環境において過剰なアンモニアを減少させ、アンモニアおよび／または窒素を選択的に代わりの副生成物に変換する。ある実施形態では、遺伝子操作した細菌は非病原性であり、有害なアンモニアを減少させるために消化管に導入することができる。高アンモニア血症の患者の過剰なアンモニアの７０％が、胃腸管に蓄積される。本発明の別の態様は、アンモニアおよび／もしくは窒素の消費、または、アルギニンもしくはシトルリンなどの非毒性副生成物の生成のレベルの向上に基づき、遺伝子操作した細菌を選択または標的にする方法を提供する。本発明はまた、遺伝子操作した細菌を含む医薬組成物、および、尿素サイクル異常症および肝性脳症などの高アンモニア血症に関連する疾患を和らげ、処置する方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1A】非誘導条件下での、本発明のＡｒｇＲ欠失細菌の一実施形態におけるアルギニンレギュロンの状態を描いた図である。酸素（Ｏ_２）が、ＦＮＲ（点描されたボックス内のＦＮＲ）の二量体化、およびＦＮＲによるＦＮＲプロモータ（グレーのＦＮＲボックス）とその制御下にあるａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の活性化を防ぐ一方（「Ｘ」により示される）、ＡｒｇＡ（短い不規則な曲線）と相互作用してＡｒｇＡ活性を阻害する（「Ｘ」により示される）アルギニン（楕円中の「Ａｒｇ」）により、好気条件下でアルギニン生成が比較的低いことを示す。

【図1B】誘導条件下での、本発明のＡｒｇＲ欠失細菌の一実施形態におけるアルギニンレギュロンの状態を描いた図である。ＦＮＲ二量体化（２つの点描されたボックス内のＦＮＲ）とアルギニンによる阻害に対し耐性のあるＡｒｇＡ^ｆｂｒ（ａｒｇＡ^ｆｂｒの上の短い不規則な曲線）の誘導ＦＮＲプロモータ（グレーのＦＮＲボックス）介在性発現による、嫌気的条件下でのアルギニン生成の増加を描く。これは、ＡｒｇＡ（ａｒｇＡを描くボックスの上の短い不規則な曲線）と相互作用するアルギニン（楕円中の「Ａｒｇ」）により引き起こされる、野生型ＡｒｇＡの阻害に打ち勝つ（湾曲矢印）。アルギニンレギュロンの各遺伝子は、遺伝子名を含む長方形により描く。１つまたは集合した長方形に隣接する各矢印は、その遺伝子の矢印の方向への転写の駆動を担うプロモータを描く。１つまたは一連の長方形に隣接するより太い線はＡｒｇＲ結合部位を描くが、この細菌ではＡｒｇＲの欠失により利用されることはない。各長方形の上の矢印は各遺伝子の発現産物を描く。

【図2】図２Ａおよび２Ｂは、本発明の代替の例示的実施形態を描く図である。図２Ａは、好気的条件下での実施形態を描き、ここでは酸素の存在下でＦＮＲタンパク質（ＦＮＲボックス）が単量体のまま残り、アルギニンフィードバック耐性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の発現を駆動するＦＮＲプロモータ（「ＦＮＲ」）に結合してそれを活性化することができない。野生型ＡｒｇＡタンパク質は機能的だが、アルギニンへの結合によりネガティブフィードバック阻害の影響を受けやすく、アルギニンレベルを通常以下に抑える。各アルギニン生合成遺伝子（ａｒｇＡ、ａｒｇＥ、ａｒｇＣ、ａｒｇＢ、ａｒｇＨ、ａｒｇＤ、ａｒｇＩ、ａｒｇＧ、ｃａｒＡ、およびｃａｒＢ）のプロモータ領域におけるアルギニンリプレッサ（ＡｒｇＲ）結合部位の全てを突然変異させて（黒い棒；黒「Ｘ」）、ＡｒｇＲへの結合を低減または消失させる。図２Ｂは、嫌気的条件下での同一の実施形態を描き、ここでは酸素がない場合にＦＮＲタンパク質（ＦＮＲボックス）が二量体化し、ＦＮＲプロモータ（「ＦＮＲ」）に結合しそれを活性化させる。これは、アルギニン（楕円中の「Ａｒｇ」）によるフィードバック阻害に対し耐性があるアルギニンフィードバック耐性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の発現を駆動する（黒色の短い不規則な曲線＝ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子発現産物）。各アルギニン生合成遺伝子（ａｒｇＡ、ａｒｇＥ、ａｒｇＣ、ａｒｇＢ、ａｒｇＨ、ａｒｇＤ、ａｒｇＩ、ａｒｇＧ、ｃａｒＡ、およびｃａｒＢ）のプロモータ領域におけるアルギニンリプレッサ（ＡｒｇＲ）結合部位の全てを突然変異させて（黒い棒）、ＡｒｇＲへの結合を低減または消失させ（黒い「Ｘ」）、アルギニン−ＡｒｇＲ複合体による阻害を防いだ。これは高レベルのアルギニン生成を可能にする。図１Ａおよび１Ｂにおけるアルギニン生合成遺伝子の構成は、大腸菌株Ｎｉｓｓｌｅに見られるものの代表である。

【図3】本発明の別の実施形態を描く図である。この実施形態では、ｔｅｔＲ遺伝子に由来するＴｅｔリプレッサ（ＴｅｔＲ）の発現を駆動するプロモータにおいてＡｒｇＲ結合部位（黒い棒）を含む構成物が、遺伝子Ｘの発現を駆動する、ＴｅｔＲ結合部位（ＴｅｔＲとＸの間の黒い棒）を含む第２プロモータに連結している。低アルギニン濃度下では、ＴｅｔＲは発現し、遺伝子Ｘの発現を阻害する。高アルギニン濃度下では、ＡｒｇＲがアルギニンと結合し、ＡｒｇＲ結合部位に結合することにより、ｔｅｔＲ遺伝子に由来するＴｅｔＲの発現を阻害する。これは、次に、ＴｅｔＲによる阻害を解消し、遺伝子Ｘの発現（黒色の短い不規則な曲線）を可能にする。

【図4】本発明の別の実施形態を描く図である。この実施形態では、ｔｅｔＲ遺伝子に由来するＴｅｔリプレッサ（ＴｅｔＲ）の発現を駆動するプロモータにおいてＡｒｇＲ結合部位（黒い棒）を含む構成物が、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）の発現を駆動する、ＴｅｔＲの結合部位（ＴｅｔＲ楕円に結合する黒い棒）を含む第２プロモータに連結している。低アルギニン濃度下でＴｅｔＲは発現し、ＧＦＰの発現を阻害する。高アルギニン濃度でＡｒｇＲはアルギニンと結合し、ＡｒｇＲ結合部位に結合することによりｔｅｔＲ遺伝子に由来するＴｅｔＲの発現を阻害する。これは、次に、ＴｅｔＲによる阻害を解消し、ＧＦＰの発現を可能にする。この構成物を含有する宿主を突然変異させることにより、高アルギニン生成源を、蛍光活性化セルソーター（「ＦＡＣＳ」）を用いて、ＧＦＰ発現に基づき選択することが可能である。

【図5】本発明の別の実施形態を描く図である。この実施形態では、ｔｅｔＲ遺伝子に由来するＴｅｔリプレッサ（図示せず）の発現を駆動するプロモータにおいてＡｒｇＲ結合部位（ＡｒｇＲ−Ａｒｇ複合体が結合する黒い棒）を含む構成物が、宿主の生存のために必要な栄養要求性タンパク質（「ＡＵＸ」）の発現を駆動する、ＴｅｔＲ結合部位（黒い棒）を含む第２プロモータに連結している。高アルギニン濃度下では、ＡｒｇＲ−アルギニン複合体がＡｒｇＲ結合部位に結合することにより、ｔｅｔＲ遺伝子に由来するＴｅｔＲの発現を阻害する。これは、次に、ＡＵＸの発現を可能にし、宿主の生存を可能にする。低アルギニン濃度下では、ＴｅｔＲはｔｅｔＲ遺伝子より発現し、ＡＵＸの発現を阻害して宿主を死滅させる。図５の構成物は、ＡＵＸ発現の制御を通して宿主細胞の生存にそれを必要なものにすることにより、高アルギニン（「Ａｒｇ」）生成を強化する。

【図6-1】大腸菌Ｎｉｓｓｌｅのアルギニン生合成オペロンごとにＡＲＧ結合部位を含む野生型遺伝子配列とその突然変異体を描く図である。各野生型配列では、ＡＲＧボックスをイタリック体で示し、各遺伝子の開始コドンは囲む。ＲＮＡポリメラーゼ結合部位には下線を引く（Ｃｕｎｉｎ，１９８３；Ｍａａｓ，１９９４）。ＡｒｇＲ結合時にＤＮＡメチル化から保護される塩基は強調表示し、ＡｒｇＲ結合時にヒドロキシルラジカルアタックから保護される塩基は太字にする（Ｃｈａｒｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。強調表示した太字の塩基は、ＡｒｇＲ結合を妨げる突然変異の主要標的である。

【図6-2】図６−１と同様である。

【図6-3】図６−１と同様である。

【図7-1】ＦＮＲ応答性プロモータ配列を含む例示的な調節領域配列の核酸配列を描く図である。下線を引いた配列は予想されるリボソーム結合部位であり、太字の配列はクローニングに用いられる制限部位である。ＦＮＲプロモータを含む例示的な配列としては、限定されるわけではないが、配列番号１６、配列番号１７、ｎｉｒＢ１プロモータ（配列番号１８）、ｎｉｒＢ２プロモータ（配列番号１９）、ｎｉｒＢ３プロモータ（配列番号２０）、ｙｄｆＺプロモータ（配列番号２１）、強力なリボソーム結合部位に融合したｎｉｒＢプロモータ（配列番号２２）、強力なリボソーム結合部位に融合したｙｄｆＺプロモータ（配列番号２３）、ｆｎｒＳ１から選択される嫌気的に誘導される小ＲＮＡ遺伝子ｆｎｒＳプロモータ（配列番号２４）、ｆｎｒＳ２から選択される嫌気的に誘導される小ＲＮＡ遺伝子ｆｎｒＳプロモータ（配列番号２５）、ＣＲＰ結合部位に融合したｎｉｒＢプロモータ（配列番号２６）、およびＣＲＰ結合部位に融合したｆｎｒＳプロモータ（配列番号２７）が挙げられる。

【図7-2】図７−１と同様である。

【図8A】例示的なａｒｇＡ^ｆｂｒ配列の核酸配列を描く図である。

【図8B-1】例示的なＦＮＲプロモータ駆動ａｒｇＡ^ｆｂｒプラスミドの核酸配列を描く図である。ＦＮＲプロモータ配列は太字にし、ａｒｇＡ^ｆｂｒ配列は囲む。

【図8B-2】図８Ｂ−１と同様である。

【図9】例示的なＦＮＲプロモータ駆動ａｒｇＡ^ｆｂｒ配列の核酸配列を描く図である。ＦＮＲプロモータ配列は太字にし、リボソーム結合部位は強調表示し、ａｒｇＡ^ｆｂｒ配列は囲む。

【図10】強力なリボソーム結合部位に融合した例示的なＦＮＲプロモータ（ｆｎｒＳ）の制御下のａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の概略図である。

【図11】強力なリボソーム結合部位に融合した例示的なＦＮＲプロモータ（ｎｉｒＢ）の制御下のａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の別の概略図である。他の調節エレメントも存在してよい。

【図12】弱いリボソーム結合部位に融合した例示的なＦＮＲプロモータ（ｎｉｒＢ）の制御下のａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の概略図である。

【図13】図１３Ａおよび１３Ｂは、ＣＲＰ結合部位に融合したＦＮＲ応答性プロモータの例示的な実施形態を描く図である。図１３Ａは、太字で示す制限部位を有する、ＦＮＲ−ＣＲＰプロモータ領域のマップを描く。図１３Ｂは、ＣＲＰ結合部位およびリボソーム結合部位の両方に融合した、例示的なＦＮＲプロモータ（ｎｉｒＢプロモータ）の制御下のａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の概略図を描く。他の調節エレメントも存在してよい。

【図14】図１４Ａおよび１４Ｂは、ＣＲＰ結合部位に融合したＦＮＲ応答性プロモータの代替の例示的実施形態を描く図である。図１４Ａは、太字で示す制限部位を有する、ＦＮＲ−ＣＲＰプロモータ領域のマップを描く。図１４Ｂは、ＣＲＰ結合部位およびリボソーム結合部位の両方に融合した、例示的なＦＮＲプロモータ（ｆｎｒＳプロモータ）の制御下のａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の概略図を描く。

【図15-1】大腸菌ＮｉｓｓｌｅにおけるａｒｇＧ遺伝子の調節領域と５’部分の野生型ゲノム配列と、その構成的突然変異体を描く図である。各配列のプロモータ領域には下線を引き、ａｒｇＧ遺伝子の５’部分は囲む。野生型配列では、ＡｒｇＲ結合部位は大文字で下線を引く。突然変異配列では、５’非翻訳領域が大文字で下線を引く。構成的プロモータの制御下でａｒｇＧを発現する細菌は、アルギニンを生成することが可能である。野生型の制御下でａｒｇＧを発現する細菌、ＡｒｇＲ阻害可能プロモータは、シトルリンを生成することが可能である。

【図15-2】図１５−１と同様である。

【図16】大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの構成的に発現したａｒｇＧ構成物の例示的な実施形態を描く図である。構成的プロモータは、グレーで囲まれたＢＢａ＿Ｊ２３１００である。クローニングで用いる制限部位は太字である。

【図17】野生型ａｒｇＧオペロン大腸菌Ｎｉｓｓｌｅのマップおよび構成的に発現したその突然変異体を描く図である。ＡＲＧボックスは野生型オペロンには存在するが、突然変異体にはない。ＡｒｇＧはＢＢａ＿Ｊ２３１００プロモータの制御下で構成的に発現する。

【図18-1】例示的なＢＡＤプロモータ駆動ａｒｇＡ^ｆｂｒ構成物の核酸配列を描く図である。全ての太字配列がＮｉｓｓｌｅゲノムＤＮＡである。ａｒａＣ遺伝子の一部を太字にし、下線を引き、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は囲み、間の太字配列は、アラビノースの存在により活性化されるプロモータである。リボソーム結合部位はイタリック体で示し、ターミネータ配列は強調し、ＦＲＴ部位は囲む。ａｒａＤ遺伝子の一部は点線で囲む。

【図18-2】図１８−１と同様である。

【図19】例示的なＢＡＤプロモータ駆動ａｒｇＡ^ｆｂｒ構成物の概略図である。この実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子をａｒａＣとａｒａＤの遺伝子の間に挿入する。ＡｒｇＡ^ｆｂｒにはリボソーム結合部位、ＦＲＴ部位、および１つまたは複数の転写ターミネータ配列が隣接する。

【図20】ｐＳＣ１０１プラスミドのマップを描く図である。制限部位は太字で示す。

【図21A-1】ｐＳＣ１０１プラスミドの核酸配列を描く図である。

【図21A-2】図２１Ａ−１と同様である。

【図21B-1】ｆｎｒＳプロモータ駆動ａｒｇＡ^ｆｂｒｐＳＣ１０１プラスミドのヌクレオチド配列を描く図である。ａｒｇＡ^ｆｂｒ配列は囲み、リボソーム結合部位は強調表示し、ｆｎｒＳプロモータは大文字かつ太字である。

【図21B-2】図２１Ｂ−１と同様である。

【図22】大腸菌１９１７Ｎｉｓｓｌｅ染色体内の例示的な組み込み部位のマップを描く図である。これらの部位は、必須遺伝子の発現を妨げることなく回路コンポーネントを染色体に挿入できる領域を示す。挿入が多岐または集中的に発現した遺伝子の間で起きることを示すために逆斜線（／）を用いる。ｔｈｙＡなどの生合成遺伝子内への挿入は、栄養要求性を生じさせるのに有用であり得る。一部の実施形態では、個別の回路コンポーネントを、示した部位のうち２つ以上に挿入する。

【図23】赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を構成的に発現する３つの細菌株を描く図である。株１〜３において、ｒｆｐ遺伝子を細菌染色体内の異なる部位に挿入したが、これは蛍光灯の下で様々な輝度を生じさせる。非改変大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ（株４）は非蛍光性である。

【図24】誘導（＋ＡＴＣ）および非誘導（−ＡＴＣ）の条件下で、ストレプトマイシン耐性対照Ｎｉｓｓｌｅ（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２、およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０３により生成されるｉｎ ｖｉｔｒｏでのアルギニンレベルについての棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０１はΔＡｒｇＲを含み、ａｒｇＡ^ｆｂｒを含まない。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２はΔＡｒｇＲと、高コピープラスミドにおいてテトラサイクリン誘導ａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０３はΔＡｒｇＲと、低コピープラスミドにおいてテトラサイクリン駆動ａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。

【図25】誘導条件下で、ストレプトマイシン耐性対照Ｎｉｓｓｌｅ（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４、およびＳＹＮ−ＵＣＤ１０５により生成されるｉｎ ｖｉｔｒｏでのアルギニンおよびシトルリンレベルについての棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０４は、野生型ＡｒｇＲと、低コピープラスミドにあるテトラサイクリン誘導ａｒｇＡ^ｆｂｒと、テトラサイクリン誘導ａｒｇＧと、ａｒｇＧを除く各アルギニン生合成オペロンの各ＡＲＧボックスにおける突然変異とを含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４は、ΔＡｒｇＲと、低コピープラスミドにおいてテトラサイクリン誘導性プロモータの制御下で発現するａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０５は、野生型ＡｒｇＲ、低コピープラスミドにあるテトラサイクリン誘導ａｒｇＡ^ｆｂｒ、構成的に発現するａｒｇＧ（ＢＢａ＿Ｊ２３１００構成的プロモータ）、およびａｒｇＧを除く各アルギニン生合成オペロンの各ＡＲＧボックスにおいて突然変異を含む。

【図26】酸素の存在下（＋Ｏ_２）または非存在下（−Ｏ_２）で、誘導（＋ＡＴＣ）および非誘導（−ＡＴＣ）の条件下におけるストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅ（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５、およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０４により生成されるｉｎ ｖｉｔｒｏでのアルギニンレベルについての棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３は対照Ｎｉｓｓｌｅ構成物である。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５はΔＡｒｇＲと、低コピープラスミドにおいてＦＮＲ誘導性プロモータ（ｆｎｒＳ２）の制御下で発現するａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４はΔＡｒｇＲと、低コピープラスミドにおいてテトラサイクリン誘導性プロモータの制御下で発現するａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。

【図27】ｉｎ ｖｉｖｏでのＮｉｓｓｌｅ滞留についてのグラフである。ストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅを抗生物質の前処置なしに経口胃管投与を介してマウスに投与した、６匹の全マウスの糞便ペレットを投与後にモニターして、マウスの胃腸管になお滞留する投与Ｎｉｓｓｌｅの量を求めた。棒はマウスに投与された細菌の数を表す。線は、連続１０日間の各日の糞便サンプルから発見されたＮｉｓｓｌｅの数を表す。

【図28】図２８Ａ、２８Ｂ、２８Ｃは、高アンモニア血症ＴＡＡマウスにおけるアンモニアレベルについての棒グラフである。図２８Ａは、非改変対照Ｎｉｓｓｌｅ、または、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２、Ａｒｇリプレッサ遺伝子が削除され、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子が高コピープラスミドにおいてテトラサイクリン誘導性プロモータの制御下にある遺伝子操作した株で処置した、高アンモニア血症マウスにおけるアンモニアレベルについての棒グラフを描く。全部で９６匹のマウスをテストし、エラーバーは標準誤差を表す。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２で処置したマウスのアンモニアレベルは、４日目と５日目は、非改変対照Ｎｉｓｓｌｅで処置したマウスのアンモニアレベルより低い。図２８Ｂは、肝性脳症のＴＡＡマウスモデルにおける、ストレプトマイシン耐性対照Ｎｉｓｓｌｅ（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）および溶媒のみの対照と比較した、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４のｉｎ ｖｉｖｏでの効果（アンモニア消費）を示す棒グラフを描く。図２８Ｃは、ＴＡＡ処置後２４〜２８時間の血中アンモニア濃度の増減率についての棒グラフである。

【図29】高アンモニア血症ｓｐｆ^ａｓｈマウスにおけるアンモニアレベルについての棒グラフである。５６匹のｓｐｆ^ａｓｈマウスを４グループに分けた。グループ１には通常食を与え、グループ２〜４には最初の採血後に７０％タンパク質食を与えた。グループには、１日に２回、水、ストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅ対照（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）、またはＳＹＮ−ＵＣＤ２０４を用いて経管栄養し、第１経管栄養の４時間後に採血した。ΔＡｒｇＲと、低コピープラスミドにおいてテトラサイクリン誘導性プロモータの制御下で発現するａｒｇＡ^ｆｂｒを含むＳＹＮ−ＵＣＤ２０４は、高アンモニア血症の閾値を下回るレベルにまで血中アンモニアを著しく低減させた。

【図30】尿素サイクル酵素の例示的な概略図を描く図である。

【図31】アンモニア消費動態と投薬のチャートである。この情報を用いて、ＵＣＤ患者における、治療に該当する量のアンモニアを吸収するために生成することが必要なアルギニンの量を決定することができる。同様の計算をシトルリン生成についても行うことができる。

【図32】アンモニアをシトルリンまたはアルギニンなどの所望の生成物に変換することを介してＵＣＤおよび高アンモニア血症により特徴付けられる疾患を処置する、合成遺伝子回路の例示的な図である。

【図33】図３３Ａおよび３３Ｂは、ポジティブフィードバック栄養要求株を生成し、高アルギニン生成を選択するのに用いることができる、例示的な構成物の図である。図３３Ａは、ｔｈｙＡの発現を駆動するａｓｔＣプロモータのマップを描く。図３３Ｂは、ａｓｔＣプロモータの制御下のｔｈｙＡ遺伝子の概略図を描く。調節領域には、ＣＲＰ、ＡｒｇＲ、およびＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）の結合部位が含まれ、追加の調節エレメントも含まれ得る。

【図34】栄養要求性株を生成するために、破壊または削除することができる例示的な細菌遺伝子の表である。これらには、限定されるわけではないが、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成、および細胞壁合成に必要な遺伝子が含まれる。

【図35】経管栄養の２４時間または４８時間後に検出した、マウスの消化管における種々のアミノ酸栄養要求株の生存を示す表である。これらの栄養要求株はＢＷ２５１１３、大腸菌の非Ｎｉｓｓｌｅ株を用いて生成した。

【図36】本開示の非限定的実施形態を描く図であり、ここでは外因性環境条件または１つもしくは複数の環境シグナルが、異種遺伝子、および、１つの誘導性プロモータまたは複数の誘導性プロモータに由来する少なくとも１つのリコンビナーゼの発現を活性化する。リコンビナーゼは次に毒素遺伝子を活性化配座にフリッピングし、リコンビナーゼの天然動態が毒素の発現に時間遅延を生じさせ、異種遺伝子が完全に発現できるようにする。いったん毒素が発現したら、それは細胞を死滅させる。

【図37】本開示の別の非限定的例を描く図であり、ここでは外因性環境条件または１つもしくは複数の環境シグナルが、異種遺伝子、抗毒素、および、１つの誘導性プロモータまたは複数の誘導性プロモータに由来する少なくとも１つのリコンビナーゼの発現を活性化する。リコンビナーゼは次に毒素遺伝子を活性化配座にフリッピングするが、蓄積された抗毒素の存在により毒素の活性は抑制される。いったん外因性環境条件または合図（Ｃｕｅ）が存在しなくなると、抗毒素の発現は止まる。毒素は構成的に発現し、蓄積し続け、細菌細胞を死滅させる。

【図38】本開示の別の非限定的例を描く図であり、ここでは外因性環境条件または１つもしくは複数の環境シグナルが、異種遺伝子、および、１つの誘導性プロモータまたは複数の誘導性プロモータに由来する少なくとも１つのリコンビナーゼの発現を活性化する。リコンビナーゼは次に、少なくとも１つの除去酵素を活性化配座にフリッピングする。少なくとも１つの除去酵素は次に１つまたは複数の必須遺伝子を除去し、老化と最終的な細胞死をまねく。リコンビナーゼおよび除去遺伝子の天然動態は時間遅延を生じさせるが、その動態は、除去する必須遺伝子の数および選択に応じて変わり、最適化され、ほんの数時間または数日間のうちに細胞死を起こし得る。（図６０に示すように）入れ子になった多数のリコンビナーゼの存在を利用して、さらに細胞死のタイミングを制御することが可能である。

【図39】本開示の非限定的実施例を描く図であり、ここでは抗毒素が構成的プロモータより発現し、異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルにより活性化される。アラビノースがない場合は、ＡｒａＣ転写因子は転写を阻害する配座をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子の配座は変化し、これは、ＡｒａＣ転写因子がＡｒａＢＡＤプロモータに結合し、ＡｒａＢＡＤプロモータを活性化させることを可能にし、ＴｅｔＲの発現を誘導して毒素の発現を妨げる。しかしながら、アラビノースが存在しない場合、ＴｅｔＲは発現せず、毒素が発現し、最終的には抗毒素に打ち勝ち細胞を死滅させる。抗毒素の発現を調節する構成的プロモータは、毒素の発現を駆動するプロモータより弱いプロモータであるはずである。ＡｒａＣは本回路では構成的プロモータの制御下にある。

【図40】本開示の非限定的実施例を描く図であり、ここでは異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルにより活性化される。アラビノースがない場合は、ＡｒａＣ転写因子は転写を阻害する配座をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子の配座は変化し、これは、ＡｒａＣ転写因子がＡｒａＢＡＤプロモータに結合し、ＡｒａＢＡＤプロモータを活性化させることを可能にし、ＴｅｔＲ（ｔｅｔリプレッサ）および抗毒素の発現を誘導する。抗毒素が組換え細菌細胞において蓄積する一方で、ＴｅｔＲは（ＴｅｔＲ結合部位を有するプロモータの制御下にある）毒素の発現を妨げる。しかしながら、アラビノースが存在しない場合、抗毒素とＴｅｔＲは両方とも発現しない。ＴｅｔＲが存在して毒素の発現を阻害することがないため、毒素が発現し、細胞を死滅させる。ＡｒａＣは本回路では構成的プロモータの制御下にある。

【図41】ａｒｇＲ遺伝子が削除され、フィードバック耐性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を発現する、操作した細菌株の例示的な実施形態を描く図である。この株は、アンモニアの消費およびアルギニンの生成に有用である。

【図42】ａｒｇＲ遺伝子が削除され、フィードバック耐性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を発現する、操作した細菌株の例示的な実施形態を描く図である。この株はさらに、染色体において１つまたは複数の栄養要求性改変を含む。この株は、アンモニアの消費およびアルギニンの生成に有用である。

【図43】ａｒｇＲおよびａｒｇＧ遺伝子が削除され、フィードバック耐性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を発現する、操作した細菌株の例示的な実施形態を描く図である。この株は、アンモニアの消費およびシトルリンの生成に有用である。

【図44】ａｒｇＲおよびａｒｇＧ遺伝子が削除され、フィードバック耐性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を発現する、操作した細菌株の例示的な実施形態を描く図である。この株はさらに、染色体において１つまたは複数の栄養要求性改変を含む。この株は、アンモニアの消費およびシトルリンの生成に有用である。

【図45】ＡｒｇＲ結合部位を欠き、フィードバック耐性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を発現する、操作した細菌株の例示的な実施形態を描く図である。この株は、アンモニアの消費およびアルギニンの生成に有用である。

【図46】ＡｒｇＲ結合部位を欠き、フィードバック耐性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を発現する、操作した細菌株の例示的な実施形態を描く図である。この株はさらに、染色体において１つまたは複数の栄養要求性改変を含む。この株は、アンモニアの消費およびアルギニンの生成に有用である。

【図47】ａｒｇＧを除くアルギニン生合成オペロンの全てにおいてＡｒｇＲ結合部位を欠き、フィードバック耐性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を発現する、操作した細菌株の例示的な実施形態を描く図である。この株は、アンモニアの消費およびシトルリンの生成に有用である。

【図48】ａｒｇＧを除くアルギニン生合成オペロンの全てにおいてＡｒｇＲ結合部位を欠き、フィードバック耐性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を発現する、操作した細菌株の例示的な実施形態を描く図である。この株はさらに、染色体において１つまたは複数の栄養要求性改変を含む。この株は、アンモニアの消費およびシトルリンの生成に有用である。

【図49】図４９Ａは、野生型ｃｌｂＡ構成物の概略図である。図４９Ｂは、ｃｌｂＡノックアウト構成物の概略図である。

【図50】野生型ｃｌｂＡ構成物およびｃｌｂＡノックアウト構成物の例示的配列を描く図である。

【図51】ＳＹＮ−ＵＣＤ１０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０２、およびブランク対照に由来する培養培地における、ベースライン、２時間目、および４時間目のｉｎ ｖｉｔｒｏでのアンモニアレベルについての棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ１０２は両方ともｉｎ ｖｉｔｒｏでアンモニアを消費することが可能である。

【図52】ＳＹＮ−ＵＣＤ２０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０３、およびブランク対照に由来する培養培地における、ベースライン、２時間目、および４時間目のｉｎ ｖｉｔｒｏでのアンモニアレベルについての棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０３は両方ともｉｎ ｖｉｔｒｏでアンモニアを消費することが可能である。

【図53】操作したセーフティーコンポーネントとしてのＧｅｎｅＧｕａｒｄの使用を描く図である。操作したＤＮＡは全て、条件付きで破壊され得るプラスミドに存在する。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，“ＧｅｎｅＧｕａｒｄ：Ａ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ，” ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２０１５） ４：３０７−３１６を参照。

【図54】例示的なＬ−ホモセリンおよびＬ−メチオニンの生合成経路を描く図である。回路は、ＭｅｔＪにより阻害される遺伝子を示し、ｍｅｔＪの欠失はこれらの遺伝子の構成的発現および経路の活性化をまねく。

【図55】例示的なヒスチジン生合成経路を描く図である。

【図56】例示的なリシン生合成経路を描く図である。

【図57】例示的なアスパラギン生合成経路を描く図である。

【図58】例示的なグルタミン生合成経路を描く図である。

【図59】例示的なトリプトファン生合成経路を描く図である。

【図60】本開示の１つの非限定的な実施形態を描く図であり、ここでは外因性環境条件または１つもしくは複数の環境シグナルが、異種遺伝子、および、１つの誘導性プロモータまたは複数の誘導性プロモータに由来する第１リコンビナーゼの発現を活性化する。リコンビナーゼは次に第２リコンビナーゼを逆方向から活性配座にフリッピングする。活性第２リコンビナーゼは毒素遺伝子を活性配座にフリッピングし、リコンビナーゼの天然動態は毒素の発現に時間遅延を生じさせ、異種遺伝子が完全に発現できるようにする。いったん毒素が発現したら、それは細胞を死滅させる。

【図61】図６０に描くキルスイッチの実施形態を有する尿素サイクル異常症（ＵＣＤ）を標的にするように生物操作した合成物質を描く図である。この例では、ＩｎｔリコンビナーゼおよびＫｉｄ−Ｋｉｓ毒素−抗毒素システムをＵＣＤを処置するために組換え細菌細胞において用いる。過剰なアンモニアを消費し有益な副生成物を生成して、患者の予後を改善するように、組換え細菌細胞を操作する。組換え細菌細胞はまた、安全性を確保するため高度に制御可能なキルスイッチを含む。（例えば、消化管に見られるような）低酸素環境に応答して、ＦＮＲプロモータはＩｎｔリコンビナーゼの発現を誘導し、また、Ｋｉｓ抗毒素の発現も誘導する。Ｉｎｔリコンビナーゼは、Ｋｉｄ毒素遺伝子の活性化配座へのフリッピングを引き起こすが、蓄積したＫｉｓ抗毒素の存在が、発現したＫｉｄ毒素の活性を抑制する。酸素の存在下（消化管外など）では、抗毒素の発現は止まる。毒素は構成的に発現するためそれは蓄積し続け、細菌細胞を死滅させる。

【図62】本開示の別の非限定的な実施形態を描く図であり、ここでは異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルにより活性化される。アラビノースがない場合は、ＡｒａＣ転写因子は、転写を阻害する配座をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子の配座は変化し、これは、ＡｒａＣ転写因子がＡｒａＢＡＤプロモータに結合し、ＡｒａＢＡＤプロモータを活性化させることを可能にし、ＴｅｔＲ（ｔｅｔリプレッサ）および抗毒素の発現を誘導する。抗毒素が組換え細菌細胞において蓄積する一方で、ＴｅｔＲは（ＴｅｔＲ結合部位を有するプロモータの制御下にある）毒素の発現を妨げる。しかしながら、アラビノースが存在しない場合、抗毒素とＴｅｔＲは両方とも発現しない。ＴｅｔＲが存在して毒素の発現を阻害することがないため、毒素は発現し、細胞を死滅させる。図６２はまた、本開示の別の非限定的な実施形態を描き、ここでは、組換え細菌に見られない必須遺伝子の発現が、外因性環境シグナルにより活性化される。アラビノースがない場合は、ＡｒａＣ転写因子は、ａｒａＢＡＤプロモータの制御下にある必須遺伝子の転写を阻害する配座をとり、細菌細胞は生存することができない。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子の配座は変化し、これは、ＡｒａＣ転写因子がＡｒａＢＡＤプロモータに結合し、ＡｒａＢＡＤプロモータを活性化させることを可能にし、必須遺伝子の発現を誘導して細菌細胞の生存能力を維持する。

【図63】本開示の非限定的な実施形態を描く図であり、ここでは、抗毒素が構成的プロモータより発現し、異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルにより活性化される。アラビノースがない場合は、ＡｒａＣ転写因子は、転写を阻害する配座をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、ＡｒａＣ転写因子の配座は変化し、これは、ＡｒａＣ転写因子がＡｒａＢＡＤプロモータに結合し、ＡｒａＢＡＤプロモータを活性化させることを可能にし、ＴｅｔＲ発現を誘導することにより毒素の発現を妨げる。しかしながら、アラビノースが存在しない場合、ＴｅｔＲは発現せず、毒素が発現し、最終的には抗毒素に打ち勝ち細胞を死滅させる。抗毒素の発現を調節する構成的プロモータは、毒素の発現を駆動するプロモータより弱いプロモータであるはずである。

【図64】組換え細菌の固有の安全性ならびに改変した安全性−老廃物管理など（キルスイッチおよび／または栄養要求性を含む）、本開示の組換え細菌の安全設計の概要を描く図である。

【0008】

図面の簡単な説明の図１Ａ中，ＡｒｇＡ（短い不規則な曲線）は

とする。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明は、尿素サイクル異常症および肝性脳症などの高アンモニア血症に関連する疾患を和らげるまたは処置する、遺伝子操作した細菌、その医薬組成物、ならびにその方法を含む。遺伝子操作した細菌は、特に、哺乳類の消化管などの低酸素条件で過剰なアンモニアを減少させることが可能である。ある実施形態では、遺伝子操作した細菌は、体内の過剰な窒素を、アルギニン、シトルリン、メチオニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、グルタミン、またはトリプトファンなどの非毒性分子に取り込むことにより、過剰なアンモニアを減少させる。

【0010】

本開示をより容易に理解できるようにするため、ある特定の用語をまず定義する。これらの定義は、本開示の残りの部分に照らし合わせて、当業者によって理解されるように読まれるべきである。別段の定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的な用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。追加の定義は、詳細な説明全体を通して記載する。

【0011】

「高アンモニア血症」、「高アンモニア血症の」、または「過剰なアンモニア」は、体内のアンモニア濃度の上昇を指すために用いる。高アンモニア血症は、解毒作用の低下および／またはアンモニア生成の増加により引き起こされる。解毒作用の低下は、アルギニノコハク酸尿症、アルギナーゼ欠損症、カルバモイルリン酸シンセターゼ欠損症、シトルリン血症、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ欠損症、およびオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症などの尿素サイクル異常症（ＵＣＤ）、または開放肝管などの肝臓のバイパス、ならびに／または、グルタミンシンセターゼの欠損に起因し得る（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｈａｅｂｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。アンモニア生成の増加は、感染症、薬物、神経性膀胱、および腸内細菌の過剰増殖に起因し得る（Ｈａｅｂｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。高アンモニア血症に関連する他の疾患および症状としては、限定されるわけではないが、肝性脳症、急性肝不全、または慢性肝不全などの肝疾患；有機酸異常症；イソ吉草酸血症；３−メチルクロトニルグリシン尿症；メチルマロン酸血症；プロピオン酸尿症；脂肪酸酸化欠損症；カルニチンサイクル異常症；カルニチン欠乏症；β酸化異常症；リシン尿性蛋白不耐症；ピロリン−５−カルボン酸シンセターゼ欠損症；ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症；オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症；炭酸脱水酵素欠乏症；高インスリン血症−高アンモニア血症症候群；ミトコンドリア病；バルプロエート療法；アスパラギナーゼ療法；完全非経口栄養法；グリシン含有溶液を用いた膀胱鏡検査；肺／骨髄移植後；門脈体循環シャント；尿路感染症；尿道拡張；多発性骨髄腫；および化学療法が挙げられる（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｈａｅｂｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｐｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｌａｚｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。健康な対象の血漿アンモニア濃度は、典型的には、約５０μｍｏｌ／Ｌ未満である（Ｌｅｏｎａｒｄ，２００６）。一部の実施形態では、高アンモニア血症の診断シグナルは、少なくとも約５０μｍｏｌ／Ｌ、少なくとも約８０μｍｏｌ／Ｌ、少なくとも約１５０μｍｏｌ／Ｌ、少なくとも約１８０μｍｏｌ／Ｌ、または少なくとも約２００μｍｏｌ／Ｌという血漿アンモニア濃度である（Ｌｅｏｎａｒｄ，２００６；Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｈａｅｂｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0012】

「アンモニア」は、気体アンモニア（ＮＨ_３）、アンモニウムイオン（ＮＨ_４^＋）、またはそれらの混合物を指すために用いる。身体の液体部分では、気体アンモニアおよびアンモニウムイオンは、均衡を保って存在する。

【0013】

【化1】

【0014】

一部の臨床検査では総アンモニア（ＮＨ_３＋ＮＨ_４^＋）を解析する（Ｗａｌｋｅｒ，２０１２）。本発明の任意の実施形態では、別段の指示がない限り、「アンモニア」は、気体アンモニア、アンモニウムイオン、および／または総アンモニアを指し得る。

【0015】

アンモニアの「解毒作用」は、有毒アンモニアを除去する、および／または、限定されるわけではないが、アルギニン、シトルリン、メチオニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、グルタミン、トリプトファン、または尿素を含む、１つまたは複数の非毒性分子に変換する天然または合成のプロセスを指すために用いる。尿素サイクルは、例えば、尿において体内から除去するためにアンモニアを尿素に酵素的に変換する。アンモニアは、非常に多くの生化学経路を介して合成される多くのアミノ酸にとって窒素の供給源であることから、そのアミノ酸生合成経路の１つまたは複数の強化を利用して、過剰な窒素を非毒性分子に取り込むことができる。例えば、アルギニン生合成で、窒素原子を１つ含むグルタミン酸を窒素原子を４つ含むアルギニンに変換することにより、過剰な窒素を非毒性分子に取り込む。ヒトでは、アルギニンは大腸から再吸収されないため、結果として、大腸内の過剰なアルギニンは有害とは考えられない。同様に、シトルリンも大腸から再吸収されないため、結果として、大腸内の過剰なシトルリンは有害とは考えられない。アルギニン生合成はまた、シトルリンを最終生成物として生成するように改変させることができ、シトルリンは３つの窒素原子を含むため、該改変経路も過剰な窒素を非毒性分子に取り込むことが可能である。

【0016】

「アルギニンレギュロン」、「アルギニン生合成レギュロン」、および「ａｒｇレギュロン」は、アルギニン生合成経路において、グルタミン酸からアルギニンおよび／またはシトルリンなどの中間代謝産物への変換を担う酵素をコードした遺伝子を含む所与の細菌種におけるオペロンの集合を指すために、区別なく用いる。アルギニンレギュロンはまた、それらのオペロンに関連するオペレータ、プロモータ、ＡＲＧボックス、および／または、調節領域を含む。アルギニンレギュロンには、限定されるわけではないが、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノスクシネートシンターゼ、アルギニノスクシネートリアーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロン、それらのオペレータ、それらのプロモータ、それらのＡＲＧボックス、および／またはそれらの調節領域が含まれる。一部の実施形態では、アルギニンレギュロンは、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼおよび／もしくはＮ−アセチルオルニチナーゼに追加される、またはそれらの代わりとなるオルニチンアセチルトランスフェラーゼをコードするオペロン、ならびに、関連するオペレータ、プロモータ、ＡＲＧボックス、および／または調節領域を含む。一部の実施形態では、アルギニンレギュロンの１つまたは複数のオペロンまたは遺伝子は、細菌のプラスミドに存在し得る。一部の実施形態では、細菌はアルギニンレギュロン中に任意の遺伝子またはオペロンの多数のコピーを含み得、該１つまたは複数のコピーは、本明細書に記載するように、突然変異させるか、さもなければ変えることができる。

【0017】

１つの遺伝子は１つの酵素、例えば、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ（ａｒｇＡ）をコードし得る。２つ以上の遺伝子は、１つの酵素の別個のサブユニット、例えば、カルバモイルリン酸シンターゼのサブユニットＡおよびサブユニットＢ（ｃａｒＡおよびｃａｒＢ）をコードし得る。一部の細菌では、２つ以上の遺伝子はそれぞれ独立して、同一の酵素、例えばオルニチントランスカルバミラーゼ（ａｒｇＦおよびａｒｇＩ）をコードし得る。一部の細菌では、アルギニンレギュロンは、限定されるわけではないが、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードするａｒｇＡ；Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼをコードするａｒｇＢ；Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼをコードするａｒｇＣ；アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼをコードするａｒｇＤ；Ｎ−アセチルオルニチナーゼをコードするａｒｇＥ；アルギニノスクシネートシンターゼをコードするａｒｇＧ；アルギニノスクシネートリアーゼをコードするａｒｇＨ；それぞれ独立してオルニチントランスカルバミラーゼをコードするａｒｇＦおよびａｒｇＩの一方または両方；カルバモイルリン酸シンターゼの小サブユニットをコードするｃａｒＡ；カルバモイルリン酸シンターゼの大サブユニットをコードするｃａｒＢ；それらのオペロン；それらのオペレータ；それらのプロモータ；それらのＡＲＧボックス；および／またはそれらの調節領域を含む。一部の実施形態では、アルギニンレギュロンは、（Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼおよび／もしくはＮ−アセチルオルニチナーゼに追加される、またはそれらの代わりとなる）オルニチンアセチルトランスフェラーゼをコードするａｒｇＪ、それらのオペロン、それらのオペレータ、それらのプロモータ、それらのＡＲＧボックス、および／またはそれらの調節領域が含まれる。

【0018】

「アルギニンオペロン」、「アルギニン生合成オペロン」、および「ａｒｇオペロン」は、少なくとも１つのプロモータと少なくとも１つのＡＲＧボックスを含む共通の調節領域の制御下でアルギニン生合成酵素をコードする、１つまたは複数の遺伝子のクラスタを指すために区別なく用いる。一部の実施形態では、前記１つまたは複数の遺伝子は、同時転写および／または同時翻訳される。アルギニン生合成を担う酵素をコードする遺伝子の任意の組み合わせは、天然または合成的に、オペロンに組織化され得る。例えば、バチルス・サブチリスでは、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、およびオルニチントランスカルバミラーゼをコードする遺伝子が、プロモータおよびＡＲＧボックスを含む共通の調節領域の制御下で、単一オペロン、ａｒｇＣＡＥＢＤ−ｃａｒＡＢ−ａｒｇＦ（例えばＴａｂｌｅ ２を参照）に組織化される。大腸菌Ｋ１２およびＮｉｓｓｌｅでは、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、およびアルギニノスクシネートリアーゼをコードする遺伝子は、２つの二極性オペロン、ａｒｇＥＣＢＨに組織化される。アルギニン生合成を担う酵素をコードするオペロンは、染色体全体にわたり、異なる遺伝子座に分布し得る。非改変細菌では、各オペロンはＡｒｇＲを介してアルギニンにより阻害され得る。一部の実施形態では、アルギニンおよび／または中間副生成物の生成を、本明細書で提供するように、アルギニン生合成オペロンによりコードされる酵素の発現を改変させることにより、本発明の遺伝子操作した細菌において変えることができる。各アルギニンオペロンは、プラスミドまたは細菌の染色体に存在し得る。加えて、任意のアルギニンオペロンの多数のコピー、またはアルギニンオペロン内の遺伝子もしくは調節領域が細菌内に存在し得、オペロンの１つもしくは複数のコピー、または遺伝子もしくは調節領域は、本明細書に記載するように、突然変異させるか、さもなければ変えることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、コピー数を増やすために同一生成物（例えば、オペロンまたは遺伝子または調節領域）の多数のコピーを含むか、または多数の異なる機能を実行するオペロンの多数の異なるコンポーネントを含むように、遺伝子操作する。

【0019】

「ＡＲＧボックスコンセンサス配列」はＡＲＧボックスの核酸配列を指し、この核酸は、ａｒｇＲ、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡ、および／またはｃａｒＢの調節領域の１つまたは複数において高頻度で生じることが知られている。上記のように、各ａｒｇオペロンは、ＡＲＧボックスと呼ばれる、１８ヌクレオチドの不完全な回帰性配列を少なくとも１つ含む調節領域を含み、これはプロモータと一部重複し、リプレッサタンパク質がそれに結合する（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。ＡＲＧボックスのヌクレオチド配列は各オペロンで異なり得、コンセンサスＡＲＧボックス配列は、^Ａ／_ＴｎＴＧＡＡＴ^Ａ／_Ｔ^Ａ／_Ｔ^Ｔ／_Ａ^Ｔ／_ＡＡＴＴＣＡｎ^Ｔ／_Ａである（Ｍａａｓ，１９９４）。アルギニンリプレッサは、１つまたは複数のＡＲＧボックスに結合して、該１つまたは複数のＡＲＧボックスに操作可能に連結するアルギニン生合成酵素の転写を積極的に阻害する。

【0020】

「突然変異アルギニンレギュロン」または「突然変異させたアルギニンレギュロン」は、アルギニン生合成経路においてグルタミン酸からアルギニンおよび／またはシトルリンなどの中間副生成物への変換を担う酵素をコードしたオペロンそれぞれの、アルギニン介在性阻害を低減または消失させる核酸突然変異を１つまたは複数含み、その結果、突然変異アルギニンレギュロンが、同一条件下の同じ細菌サブタイプに由来する非改変レギュロンよりも多くのアルギニンおよび／または中間副生成物を生成する、アルギニンレギュロンを指すために用いる。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えばａｒｇＡ^ｆｂｒと、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノスクシネートシンターゼ、アルギニノスクシネートリアーゼ、およびカルバモイルリン酸シンターゼをコードする１つまたは複数のオペロンの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の核酸突然変異を含む、突然変異アルギニンレギュロンとを含み、それによりレギュロンの阻害を解除し、アルギニンおよび／または中間副生成物の生合成を強化する。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンリプレッサを含み、その結果、アルギニンリプレッサの機能は低下もしくは不活性となるか、または、遺伝子操作した細菌はアルギニンリプレッサを持たず（例えば、アルギニンリプレッサ遺伝子を削除して）、レギュロンの阻害解除ならびにアルギニンおよび／もしくは中間副生成物の生合成の強化がもたらされる。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−グルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えばａｒｇＡ^ｆｂｒ、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の核酸突然変異を含む、突然変異アルギニンレギュロン、および／または、突然変異アルギニンリプレッサを含むか、もしくは該アルギニンリプレッサは削除されている。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−グルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えばａｒｇＡ^ｆｂｒと、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の核酸突然変異を含む、突然変異アルギニンレギュロンとを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−グルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えばａｒｇＡ^ｆｂｒと、突然変異アルギニンリプレッサとを含むか、もしくはアルギニンリプレッサは削除されている。一部の実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードするオペロンを含み、前記オペロンの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおいて、１つまたは複数の核酸突然変異を含む。一部の実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードするオペロンと、突然変異アルギニンリプレッサとを含むか、またはアルギニンリプレッサは削除されている。一部の実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、（Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼおよび／もしくはＮ−アセチルオルニチナーゼに追加される、またはそれらの代わりとなる）オルニチンアセチルトランスフェラーゼをコードするオペロンを含み、前記オペロンの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおいて、１つまたは複数の核酸突然変異を含む。

【0021】

ＡＲＧボックスは、各アルギニン生合成オペロンの調節領域においてプロモータと一部重複する。突然変異アルギニンレギュロンでは、１つまたは複数のアルギニン生合成オペロンの調節領域を、回帰性ＡＲＧボックス配列を破壊し、ＡｒｇＲ結合を低減させるのに十分なほど突然変異させるが、非突然変異調節領域のプロモータとの相同性は未だ十分に高く、天然のオペロン特異的プロモータとして認識される。オペロンは、少なくとも１つのＡＲＧボックスにおいて少なくとも１つの核酸突然変異を含み、その結果、オペロンのＡＲＧボックスおよび調節領域に対するＡｒｇＲ結合が低減または消失する。一部の実施形態では、ＤＮＡのメチル化から保護される塩基およびＡｒｇＲ結合時のヒドロキシルラジカルアタックから保護される塩基が、ＡｒｇＲ結合を妨げる突然変異の主要標的である（図６等を参照）。突然変異調節領域のプロモータは、非突然変異調節領域のプロモータに対し十分に高い相同性を保持し、その結果、ＲＮＡポリメラーゼは十分な親和性をもってそれに結合して、操作可能に連結したアルギニン生合成酵素の転写を促進する。一部の実施形態では、突然変異体のプロモータのＧ／Ｃ：Ａ／Ｔ比率は、野生型プロモータのＧ／Ｃ：Ａ／Ｔ比率とわずか１０％異なるだけである。

【0022】

一部の実施形態では、２つ以上のＡＲＧボックスが単一オペロンに存在し得る。これらの実施形態の一態様では、オペロンの少なくとも１つのＡＲＧボックスを、オペロンの調節領域に対する、必須の低減ＡｒｇＲ結合を生成するように変更する。これらの実施形態の代替の態様では、オペロンのＡＲＧボックスをそれぞれ、オペロンの調節領域に対する、必須の低減ＡｒｇＲ結合を生成するように変更する

【0023】

「低減」ＡｒｇＲ結合は、同一条件下の同じサブタイプの細菌の非改変のＡＲＧボックスおよび調節領域に対するリプレッサ結合と比較し、オペロンのＡＲＧボックスへのリプレッサ結合が低減すること、または、前記オペロンの調節領域に対する総リプレッサ結合が低減することを指すために用いられる。一部の実施形態では、オペロンの突然変異ＡＲＧボックスおよび突然変異調節領域に対するＡｒｇＲ結合は、同一条件下の同じサブタイプの細菌の非改変のＡＲＧボックスおよび調節領域に対するＡｒｇＲ結合よりも、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％低い。一部の実施形態では、突然変異ＡＲＧボックスおよび突然変異調節領域に対する低減ＡｒｇＲ結合は、オペロンにおいて、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１５００倍の、１つまたは複数の遺伝子のｍＲＮＡ発現の増加をもたらす。

【0024】

「ＡｒｇＲ」または「アルギニンリプレッサ」は、アルギニンレギュロンにおいてアルギニン生合成遺伝子の転写を調節することによりアルギニン生合成を阻害することが可能なタンパク質を指すために用いる。アルギニンリプレッサタンパク質をコードする遺伝子（「ａｒｇＲ」）の発現が野生型細菌で高まると、アルギニン生合成は減少する。ａｒｇＲの発現が野生型細菌で減少するか、または、ａｒｇＲを削除もしくは突然変異させてアルギニンリプレッサ機能を不活化する場合、アルギニン生合成は増加する。

【0025】

「任意の機能的ＡｒｇＲを欠いた」細菌および「ＡｒｇＲ欠失細菌」は、各アルギニンリプレッサの活性が、同一条件下の同じサブタイプの細菌に由来する非改変アルギニンリプレッサと比較し、著しく低減または消失している細菌を指すために用いる。低減または消失したアルギニンリプレッサの活性は、例えば、アルギニン生合成遺伝子の転写の強化、ならびに／または、アルギニンおよび／もしくはシトルリンなどの中間副生成物の濃度の上昇をもたらし得る。アルギニンリプレッサ活性が低減または消失した細菌は、細菌性ａｒｇＲ遺伝子を改変するか、またはａｒｇＲ遺伝子の転写を改変することにより、生成することが可能である。例えば、染色体ａｒｇＲ遺伝子は削除もしくは突然変異させるか、または、ａｒｇＲ遺伝子を、野生型リプレッサ活性を示さないａｒｇＲ遺伝子で置き換えることが可能である。

【0026】

「操作可能に連結した」は、核酸配列の発現を可能にする、例えばシスで作用する形で調節領域配列に結合した核酸配列、例えば、フィードバック耐性ＡｒｇＡをコードする遺伝子を指す。

【0027】

「誘導性プロモータ」は、１つまたは複数の遺伝子に操作可能に連結している調節領域を指し、ここにおいて前記遺伝子の発現は、前記調節領域の誘導因子の存在下で増加する。

【0028】

「外因性環境条件」は、上記のプロモータが誘導される環境または状況を指す。一部の実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の消化管に特異的である。一部の実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の上部胃腸管に特異的である。一部の実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の下部胃腸管に特異的である。一部の実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の小腸に特異的である。一部の実施形態では、外因性環境条件は、哺乳類の消化管の環境などの、低酸素性、微好気的、または嫌気的な条件である。一部の実施形態では、外因性環境条件は、哺乳類の消化管に特異的な分子または代謝産物、例えばプロピオナートである。一部の実施形態において、本発明の遺伝子操作した細菌は、酸素レベル依存性プロモータを含む。細菌は、酸素レベルを感知することができる進化した転写機能を有する。異なるシグナル経路が、異なる酸素レベルにより引き起こされ、異なる動態で起き得る。「酸素レベル依存性プロモータ」または「酸素レベル依存性調節領域」は、１つまたは複数の酸素レベル感知転写因子が結合することのできる核酸配列を指し、ここでは対応する転写因子の結合および／または活性化は、下流の遺伝子発現を活性化させる。

【0029】

酸素レベル依存性転写因子の例としては、限定されるわけではないが、ＦＮＲ、ＡＮＲ、およびＤＮＲが挙げられる。対応するＦＮＲ応答性プロモータ、ＡＮＲ応答性プロモータ、およびＤＮＲ応答性プロモータが当技術分野で知られており（例えば、Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９、Ｇａｌｉｍａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１、Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｈｏｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｓａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３を参照）、非限定的例をＴａｂｌｅ １に示す。

【0030】

【表1】

【0031】

本明細書で用いる場合、「非天然」核酸配列は、細菌に通常存在しない核酸配列、例えば、内因性配列の余分なコピー、異なる細菌種、細菌株、もしくは細菌亜株に有来する配列などの異種配列、または、同じサブタイプの細菌に由来する非改変配列と比較し改変および／もしくは突然変異させた配列を指す。一部の実施形態では、非天然核酸配列は、合成の、非天然発生配列である（例えば、Ｐｕｒｃｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３を参照）。非天然核酸配列は、調節領域、プロモータ、遺伝子、および／または遺伝子カセット中の１つもしくは複数の遺伝子であり得る。一部の実施形態では、「非天然」は、天然で見られる相互関係とは異なる関係の２つ以上の核酸配列を指す。非天然核酸配列は、プラスミドまたは染色体に存在し得る。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌は、直接的または非直接的に誘導できる、天然では無関連のプロモータ、例えば、ブチロジェニック遺伝子カセットに操作可能に連結するＦＮＲ応答性プロモータに、操作可能に連結する遺伝子カセットを含む。

【0032】

「構成的プロモータ」は、その制御下および／またはそれが操作可能に連結するコード配列または遺伝子の連続転写を容易にすることが可能なプロモータを指す。構成的プロモータおよびバリアントは当技術分野で周知であり、該構成的プロモータおよびバリアントとしては、限定されるわけではないが、ＢＢａ＿Ｊ２３１００、構成的大腸菌σ^Ｓ プロモータ（例えば、ｏｓｍＹプロモータ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍａｃｈｉｎｅ（ｉＧＥＭ）Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐａｒｔｓ Ｎａｍｅ ＢＢａ＿Ｊ４５９９２；ＢＢａ＿Ｊ４５９９３））、構成的大腸菌σ^３２プロモータ（例えば、ｈｔｐＧヒートショックプロモータ（ＢＢａ＿Ｊ４５５０４））、構成的大腸菌σ^７０プロモータ（例えば、ｌａｃｑプロモータ（ＢＢａ＿Ｊ５４２００；ＢＢａ＿Ｊ５６０１５）、大腸菌ＣｒｅＡＢＣＤリン酸感知オペロンプロモータ（ＢＢａ＿Ｊ６４９５１）、ＧｌｎＲＳプロモータ（ＢＢａ＿Ｋ０８８００７）ｌａｃＺプロモータ（ＢＢａ＿Ｋ１１９０００；ＢＢａ＿Ｋ１１９００１）；Ｍ１３Ｋ０７遺伝子Ｉプロモータ（ＢＢａ＿Ｍ１３１０１）；Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩプロモータ（ＢＢａ＿Ｍ１３１０２）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩＩプロモータ（ＢＢａ＿Ｍ１３１０３）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＶプロモータ（ＢＢａ＿Ｍ１３１０４）、Ｍ１３Ｋ０７ 遺伝子Ｖプロモータ（ＢＢａ＿Ｍ１３１０５）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩプロモータ（ＢＢａ＿Ｍ１３１０６）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩＩＩプロモータ（ＢＢａ＿Ｍ１３１０８）、Ｍ１３１１０（ＢＢａ＿Ｍ１３１１０））、構成的バチルス・サブチリスσ^Ａプロモータ（例えば、プロモータｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１３））、プロモータ４３（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１３）、Ｐ_ｌｉａＧ（ＢＢａ＿Ｋ８２３０００）、Ｐ_ｌｅｐＡ（ＢＢａ＿Ｋ８２３００２）、Ｐ_ｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ８２３００３））、構成的バチルス・サブチリスσ^Ｂプロモータ（例えば、プロモータｃｔｃ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１０）、プロモータｇｓｉＢ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１１））、サルモネラプロモータ（例えば、サルモネラ由来のＰｓｐｖ２（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０６）、サルモネラ由来のＰｓｐｖ（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０７））、バクテリオファージＴ７プロモータ（例えば、Ｔ７プロモータ（ＢＢａ＿Ｉ７１２０７４；ＢＢａ＿Ｉ７１９００５；ＢＢａ＿Ｊ３４８１４；ＢＢａ＿Ｊ６４９９７；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１０；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１１；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１２；ＢＢａ＿Ｒ００８５；ＢＢａ＿Ｒ０１８０；ＢＢａ＿Ｒ０１８１；ＢＢａ＿Ｒ０１８２；ＢＢａ＿Ｒ０１８３；ＢＢａ＿Ｚ０２５１；ＢＢａ＿Ｚ０２５２；ＢＢａ＿Ｚ０２５３））、およびバクテリオファージＳＰ６プロモータ（例えば、ＳＰ６プロモータ（ＢＢａ＿Ｊ６４９９８））が挙げられる。

【0033】

本明細書で用いる場合、アルギニンまたはシトルリンなどの中間副生成物を「過剰生成」する遺伝子操作した細菌は、突然変異アルギニンレギュロンを含む細菌を指す。例えば、遺伝子操作した細菌はフィードバック耐性型のＡｒｇＡを含み得、アルギニンフィードバック耐性ＡｒｇＡが発現する場合、同一条件下の同じサブタイプの非改変細菌よりも多くのアルギニンおよび／または中間副生成物を生成することが可能である。遺伝子操作した細菌は、代わりにまたはさらに、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の核酸突然変異を含む、突然変異アルギニンレギュロンを含み得る。遺伝子操作した細菌は、代わりにまたはさらに、突然変異アルギニンリプレッサを含むか、もしくはアルギニンリプレッサは削除されている。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、同一条件下の同じサブタイプの非改変細菌よりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１５００倍のアルギニンを生成する。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、同一条件下の同じサブタイプの非改変細菌よりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１５００倍のシトルリンまたは他の中間副生成物を生成する。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌における１つまたは複数のアルギニン生合成遺伝子のｍＲＮＡ転写レベルは、同一条件下の同じサブタイプの非改変細菌におけるｍＲＮＡ転写レベルよりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１５００倍高い。ある実施形態では、非改変細菌は、このようなオペロンにおいて、検出可能レベルのアルギニン、中間副生物、および／または遺伝子の転写を有さないだろう。しかしながら、突然変異アルギニンレギュロンを有する対応する遺伝子操作した細菌では、アルギニンならびに／または中間副生成物のタンパク質および／もしくは転写レベルは検出可能であろう。転写レベルは、遺伝子のｍＲＮＡレベルを直接測定することにより検出することができる。アルギニンおよび／または中間副生成物のレベル、ならびにアルギニン生合成遺伝子から発現した転写物レベルを測定する方法は、当技術分野で既知である。例えば、アルギニンおよびシトルリンは、質量分析により測定することができる。

【0034】

「消化管」は、食物の移送および消化、栄養の吸収、ならびに老廃物の排泄を担う器官、腺、管、および系を指す。ヒトでは、消化管は口で始まり肛門で終わる胃腸管を含み、加えて、食道、胃、小腸、および大腸を含む。消化管はまた、脾臓、肝臓、胆嚢、および膵臓などの副器官および付属腺を含む。上部胃腸管は、食道、胃、小腸の十二指腸を含む。下部胃腸管は、小腸の残り、つまり空腸および回腸、ならびに大腸の全て、つまり盲腸、結腸、直腸、および肛門管を含む。細菌は消化管全体、例えば、胃腸管、特に腸に見られる。

【0035】

「非病原性細菌」は、宿主において病気または有害な反応を引き起こすことのできない細菌を指す。一部の実施形態では、非病原性細菌は共生細菌である。非病原性細菌の例としては、限定されるわけではないが、バチルス、バクテロイデス、ビフィドバクテリウム、ブレビバクテリウム、クロストリジウム、エンテロコッカス、大腸菌、ラクトバチルス、ラクトコッカス、サッカロミケス、およびスタフィロコッカス、例えば、バチルス・コアグランス、バチルス・サブチリス、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・サブチリス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ロングム、クロストリジウム・ブチリカム、エンテロコッカス・フェシウム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブルガリクス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ジョンソニ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトコッカス・ラクティス、およびサッカロマイセス・ブラウディが挙げられる（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４；米国特許第６８３５３７６号明細書；同第６２０３７９７号明細書；同第５５８９１６８号明細書；同第７７３１９７６号明細書）。天然の病原性細菌を遺伝子操作して病原性を低減または消失させることができる。

【0036】

「プロバイオティクス」は、生きた非病原性の微生物、例えば細菌を指すために用い、これは、適切な量の微生物を含む宿主生物に健康上の利益を与えることが可能である。一部の実施形態では、宿主生物は哺乳動物である。一部の実施形態では、宿主生物はヒトである。非病原性細菌の一部の種、株、および／またはサブタイプは、現在、プロバイオティクス細菌として認められている。プロバイオティクス細菌の例としては、限定されるわけではないが、ビフィドバクテリア、大腸菌、ラクトバチルス、およびサッカロミケス、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、エンテロコッカス・フェシウム、大腸菌株Ｎｉｓｓｌｅ、ラクトバチルス アシドフィルス、ラクトバチルス・ブルガリクス、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、およびサッカロマイセス・ブラウディが挙げられる（Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４；米国特許第５５８９１６８号明細書；同第６２０３７９７号明細書；同第６８３５３７６号明細書）。プロバイオティクスは細菌のバリアントまたは突然変異株であり得る（Ａｒｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｃｕｅｖａｓ−Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｏｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｎｏｕｇａｙｒｅｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）。非病原性細菌を遺伝子操作して、所望の生物学的特性、例えば生存性を高めるまたは向上させることができる。非病原性細菌を遺伝子操作して、プロバイオティクス特性を与えることができる。プロバイオティクス細菌を遺伝子操作して、プロバイオティクス特性を高めるまたは向上させることができる。

【0037】

本明細書で用いる場合、「安定的に維持された」または「安定した」細菌は、非天然遺伝物質、例えば、フィードバック耐性ａｒｇＡ遺伝子、突然変異アルギニンリプレッサ、および／または宿主ゲノムに組み込まれたもしくは自己複製染色体外プラスミドで増殖した他の突然変異アルギニンレギュロンを担持し、その結果、該非天然遺伝物質が保持され、発現し、増殖する、細菌宿主細胞を指すために用いる。安定した細菌は、培地などのｉｎ ｖｉｔｒｏで、および／もしくは、消化管などのｉｎ ｖｉｖｏで、生存ならびに／または増殖することが可能である。例えば、安定した細菌は、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を含む遺伝子操作した細菌であり得、ここにおいてａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を担持するプラスミドまたは染色体は細菌において安定的に維持され、その結果、ａｒｇＡ^ｆｂｒは細菌において発現することが可能であり、細菌は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで生存および／または増殖することが可能である。

【0038】

本明細書で用いる場合、用語「処置する」およびその同根語は、病気もしくは疾患、またはその認識できる症状の少なくとも１つを改善することを指す。別の実施形態では、「処置する」は、患者により認識可能であるとは限らない、測定可能な身体的パラメータの少なくとも１つを改善することを指す。別の実施形態では、「処置する」は、身体的（例えば、認識可能な症状の安定化）、生理学的（例えば、身体パラメータの安定化）、またはその両方の何れかで、病気または疾患の進行を抑えることを指す。別の実施形態では、「処置する」は、病気または疾患の進行を遅らせること、または反転させることを指す。本明細書で用いる場合、「予防する」またはその同根語は、発症を遅らせること、または所与の病気もしくは疾患にかかるリスクを低減させることを指す。

【0039】

処置が必要な人には、すでに特定の医学疾患を有する人、および疾患を持つリスクのある人または最終的に疾患にかかり得る人が含まれ得る。処置の必要性は、例えば、疾患の発症に関連する１つまたは複数のリスク因子の存在、疾患の存在もしくは進行、または、疾患のある対象の処置を受けるという推定意志により評価される。初期の高アンモニア血症はＵＣＤにより引き起こされるが、これは常染色体劣性またはＸ連鎖性先天性代謝異常であり、これらの治療法は知られていない。高アンモニア血症はまた、尿素サイクルの他の妨害、例えば有毒代謝産物、感染症、および／または基質欠損症に続発し得る。高アンモニア血症の処置には、過剰なアンモニアおよび／または関連する症状を低減または消失させることを包含し得、基となる高アンモニア血症関連疾患の消失を必ずしも包含するわけではない。

【0040】

本明細書で用いる場合、「医薬組成物」は、生理学的に適切な担体および／または賦形剤といった他の構成要素を有する、本発明の遺伝子操作した細菌の製剤を指す。

【0041】

句「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」は区別なく用いることができるが、これらは、生物にひどい炎症を起こさず、投与される細菌化合物の生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤を指す。アジュバントはこれらの句に含まれる。

【0042】

用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に加えられる不活性物質を指す。例としては、限定されるわけではないが、重炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖および各種澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、ならびに例えばポリソルベート２０を含む界面活性剤が挙げられる。

【0043】

用語「治療的有効用量」および「治療的有効量」は、高アンモニア血症などの病態の予防、症状の発症の先延ばし、または症状の改善をもたらす化合物の量を指すために用いる。治療的有効量は、例えば、アンモニア濃度の上昇に関連する疾患の１つまたは複数の症状を処置し、予防し、重症度を軽減させ、発症を遅らせ、および／または発生のリスクを低減させるために十分であり得る。治療的有効量および治療的に有効な投与頻度は、当技術分野で既知の方法または以下で述べる方法により決定することが可能である。

【0044】

冠詞「一つ（ａ）」および「一つ（ａｎ）」は、本明細書で用いる場合、明確にそれとは反対の指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。

【0045】

句「および／または」は、リストの要素間で用いる場合、（１）単一の列挙された要素のみが存在すること、または（２）リスト中の２つ以上の要素が存在することの何れかを意味することを意図する。例えば、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」は、選択が、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢ、ＡおよびＣ、ＢおよびＣ、またはＡ、Ｂ、およびＣであり得ることを示す。句「および／または」は、リスト中の要素の「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」と、区別なく用いることができる。

【0046】

細菌
本発明の遺伝子操作した細菌は、過剰なアンモニアを減少させ、アンモニアおよび／または窒素を代替の副生成物に変換することが可能である。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、非病原性細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は共生細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はプロビオティック細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、病原性を低減または消失するように改変または突然変異させた天然の病原菌である。例示的な細菌としては、限定されるわけではないが、バチルス、バクテロイデス、ビフィドバクテリウム、ブレビバクテリウム、クロストリジウム、エンテロコッカス、大腸菌、ラクトバチルス、ラクトコッカス、サッカロミケス、およびスタフィロコッカス、例えば、バチルス・コアグランス、バチルス・サブチリス、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・サブチリス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ロングム、クロストリジウム・ブチリカム、エンテロコッカス・フェシウム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブルガリクス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ジョンソニ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトコッカス・ラクティス、およびサッカロマイセス・ブラウディが挙げられる。ある実施形態では、遺伝子操作した細菌は、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、バクテロイデス・サブチリス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、クロストリジウム・ブチリカム、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ロイテリ、およびラクトコッカス・ラクティスからなる群から選択される。

【0047】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、大腸菌株Ｎｉｓｓｌｅ１９１７（大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ）、「最も特徴付けられたプロバイオティクスの１つに進化した」腸内細菌科のグラム陰性細菌である（Ｕｋｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。該株は、その完全なる無害性を特徴とし（Ｓｃｈｕｌｔｚ，２００８）、ＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ ｓａｆｅ）ステータスを有する（Ｒｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４、強調筆者）。ゲノムシーケンシングにより、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅは目立った病原性因子（例えば、大腸菌α溶血素、Ｐ−線毛アドヘシン）を持たないことが確認された（Ｓｃｈｕｌｔｚ，２００８）。加えて大腸菌Ｎｉｓｓｌｅは、病原性付加因子を担持せず、エンテロトキシンも細胞毒も生成せず、浸蝕性でなく、そして尿路病原性ではないことが示されている（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。１９１７年には、大腸菌ＮｉｓｓｌｅはＭｕｔａｆｌｏｒと呼ばれる医薬カプセルに、治療用にパッケージ化された。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅは以来、ヒトの潰瘍性大腸炎をｉｎ ｖｉｖｏで処置するため（Ｒｅｍｂａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、ヒトの炎症性腸疾患、クローン病、および回腸嚢炎をｉｎ ｖｉｖｏで処置するため（Ｓｃｈｕｌｔｚ，２００８）、ならびに腸内浸潤性サルモネラ、レジオネラ、エルシニア、および赤痢菌をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害するため（Ａｌｔｅｎｈｏｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）に用いられてきた。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの治療効果および安全性が説得力をもって証明されていることは一般に認められている（Ｕｋｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

【0048】

当業者は、本明細書で開示する遺伝子の改変は、他の種、株、およびサブタイプの細菌向けに修正され、それらに適合させることができることを理解しよう。例えば、アルギニン介在性調節は、非常に異なる細菌、つまり、大腸菌、サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウム、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、およびモリテラ・プロファンダ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ ｐｒｏｆｕｎｄａ）などのグラム陰性細菌、ならびに、Ｂ．サブチリス、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、およびストレプトマイセス・クラブリガルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）などのグラム陽性細菌、ならびに他の細菌において、著しく良好に保全されることが知られている（Ｎｉｃｏｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，２００４）。さらに、アルギニンリプレッサは、細菌ゲノムに広く保全されており、その認識シグナル（ＡＲＧボックス）、弱いパリンドロームもゲノム間で保全される（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。

【0049】

非改変大腸菌Ｎｉｓｓｌｅおよび本発明の遺伝子操作した細菌は、消化管または血清において、例えば防御因子により破壊され得る（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ｉｎ ｖｉｖｏでの細菌の滞留時間は、実施例１９に記載する方法を用いて決定することが可能である。一部の実施形態では、滞留時間をヒト対象について計算する。野生型ＡｒｇＲおよび野生型アルギニンレギュロンを含むストレプトマイシン耐性大腸菌Ｎｉｓｓｌｅを用いた非限定的例を提供する（図２７を参照）。一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏでの滞留時間を、本発明の遺伝子操作した細菌について計算する。

【0050】

過剰なアンモニアの減少
アルギニン生合成経路
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌において、アルギニン生合成経路は、酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタメートリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノスクシネートシンターゼ、およびアルギニノスクシネートリアーゼを要する８ステップの酵素プロセスにおいて、グルタミン酸をアルギニンに変換することができる（Ｃｕｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。最初の５つのステップは、オルニチン前駆体を生成するためにＮ−アセチル化を伴う。６番目のステップでは、オルニチントランスカルバミラーゼ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼとしても知られる）がシトルリンの形成を触媒する。最後の２ステップは、シトルリンからアルギニンを生成するためにカルバモイルリン酸の利用を伴う。

【0051】

バチルス・ステアロサーモフィルスおよび淋菌などの一部の細菌において、アルギニン生合成の１番目と５番目のステップは、二機能性酵素オルニチンアセチルトランスフェラーゼにより触媒され得る。この二機能性は、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ａｒｇＪ）が、大腸菌において、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ（ａｒｇＡ）とＮ−アセチルオルニチナーゼ（ａｒｇＥ）の両方の栄養要求性遺伝子突然変異を補完することが示された際に、最初に特定された（Ｍｏｕｎｔａｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｃｒａｂｅｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。

【0052】

ａｒｇＡはＮ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードし、ａｒｇＢはＮ−アセチルグルタミン酸キナーゼをコードし、ａｒｇＣはＮ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼをコードし、ａｒｇＤはアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼをコードし、ａｒｇＥはＮ−アセチルオルニチナーゼをコードし、ａｒｇＦはオルニチントランスカルバミラーゼをコードし、ａｒｇＩもオルニチントランスカルバミラーゼをコードし、ａｒｇＧはアルギニノスクシネートシンターゼをコードし、ａｒｇＨはアルギニノスクシネートリアーゼをコードし、ａｒｇＪはオルニチンアセチルトランスフェラーゼをコードする。ｃａｒＡは、グルタミナーゼ活性を有するカルバモイルリン酸シンターゼの小Ａサブユニットをコードし、ｃａｒＢは、アンモニアからのカルバモイルリン酸合成を触媒するカルバモイルリン酸シンターゼの大Ｂサブユニットをコードする。これらのアルギニン生合成遺伝子（つまり、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡ、およびｃａｒＢ）の１つまたは複数の異なる組み合わせは、天然でまたは合成的に１つまたは複数のオペロンに組織化され得、このような組織化は細菌の種、株、およびサブタイプごとに異なり得る（例えばＴａｂｌｅ ２を参照）。各オペロンの調節領域は少なくとも１つのＡＲＧボックスを含有し、調節領域ごとのＡＲＧボックスの数は、オペロンおよび細菌ごとに異なり得る。

【0053】

これらの酵素をコードする遺伝子は全て、各遺伝子の調節領域に結合し転写を阻害する複合体を形成するＡｒｇＲとの相互作用を介し、アルギニンにより阻害を受ける。Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼも、アルギニン単独により、タンパク質レベルでアロステリックフィードバック阻害を受ける（Ｔｕｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｃａｌｄａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｃａｌｄａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｃａｌｄｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0054】

細菌においてアルギニン生合成を調節する遺伝子は、染色体全体に分散し、ＭａａｓおよびＣｌａｒｋ（１９６４）が「レギュロン」と名付けた、単一のリプレッサにより制御される多数のオペロンに組織化される。各オペロンは、プロモータと一部重複し、リプレッサタンパク質が結合する、ＡＲＧボックスと呼ばれる、１８ヌクレオチド不完全回帰性配列を少なくとも１つ含む調節領域により調節される（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。ａｒｇＲ遺伝子は、リプレッサタンパク質をコードし、これは１つまたは複数のＡＲＧボックスに結合する（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。アルギニンは、アルギニンリプレッサを活性化するコリプレッサとして機能する。各オペロンを調節するＡＲＧボックスは非同一の場合があり、コンセンサスＡＲＧボックス配列は、^Ａ／_Ｔ ｎＴＧＡＡＴ ^Ａ／_Ｔ ^Ａ／_Ｔ ^Ｔ／_Ａ ^Ｔ／_Ａ ＡＴＴＣＡｎ ^Ｔ／_Ａである（Ｍａａｓ，１９９４）。加えて、ａｒｇＲの調節領域は、２つのプロモータを含有し、このうち一方が、２つのＡＲＧボックスと一部重複し、自動調節される。

【0055】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は突然変異アルギニンレギュロンを含み、同一条件下の同じサブタイプの非改変細菌より多くのアルギニンおよび／またはシトルリンなどの中間副生成物を生成する。突然変異アルギニンレギュロンは１つまたは複数の核酸突然変異を含み、これは、アルギニン生合成経路におけるグルタミン酸からアルギニンへの変換を担う酵素をコードする１つまたは複数のオペロンの―ＡＲＧボックスへのＡｒｇＲ結合および／またはＮ−アセチルグルタミン酸シンセターゼへのアルギニン結合を介した―アルギニン介在性阻害を低減または防止することにより、アルギニンおよび／または中間副生成物の生合成を強化する。

【0056】

代替の実施形態では、細菌を、別の代謝経路、例えば、ヒスチジン生合成経路、メチオニン生合成経路、リシン生合成経路、アスパラギン生合成経路、グルタミン生合成経路、およびトリプトファン生合成経路を介して過剰なアンモニアを消費するように、遺伝子操作する。

【0057】

ヒスチジン生合成経路
ヒスチジン生合成は、例えば、大腸菌の単一オペロン内に位置する８つの遺伝子により実行される。全部で１０個の酵素反応に対し、オペロンの８つの遺伝子のうち３つ（ｈｉｓＤ、ｈｉｓＢ、およびｈｉｓＩ）は二機能性酵素をコードし、２つ（ｈｉｓＨおよびｈｉｓＦ）は、単一ステップを触媒する１つの酵素を共に形成するポリペプチド鎖をコードする（Ａｌｉｆａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。ｈｉｓＧ遺伝子の生成物、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼは、ヒスチジンによりタンパク質レベルで阻害される。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌は、フィードバック耐性ｈｉｓＧを含む。当技術分野で既知の技法を用いて、細菌を、突然変異させるおよび／またはフィードバック耐性ｈｉｓＧ突然変異体についてスクリーニングすることができる。フィードバック耐性ｈｉｓＧを含むように操作した細菌のヒスチジン生成レベルは上がり、そのためアンモニア消費量は増加し、高アンモニア血症を軽減するだろう。あるいは、ヒスチジン生合成に必要な１つまたは複数の遺伝子を、ＦＮＲ誘導性プロモータなどの誘導性プロモータの制御下に置き、律速酵素の生成の強化を可能にするだろう。ヒスチジン生合成経路に対する任意の他の適切な改変を利用して、アンモニア消費量を増加させることができる。

【0058】

メチオニン生合成経路
細菌性メチオニンレギュロンは、ホモセリンからの３ステップメチオニン合成（つまり、アシル化、スルフリル化、およびメチル化）を制御する。ｍｅｔＪ遺伝子は、メチオニンまたはその誘導体と組み合わさった場合に転写レベルでメチオニンレギュロン内の遺伝子の阻害を引き起こす、調節タンパク質をコードする（Ｓａｉｎｔ−Ｇｉｒｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｓｈｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌は、ｍｅｔＪが削除されているか、または、破壊されたもしくは突然変異したｍｅｔＪを含む。ｍｅｔＪを削除するか、破壊するか、または突然変異させるように操作した細菌のメチオニン生成レベルは上がり、そのためアンモニア消費量は増加し、高アンモニア血症を軽減させるだろう。メチオニン生合成経路に対する任意の他の改変を利用して、アンモニア消費量を増加させることができる。

【0059】

リシン生合成経路
微生物は、２つの経路のうち一方によりリシンを合成する。ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）経路を利用してアスパラギン酸およびピルビン酸からリシンを合成し（Ｄｏｇｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、アミノアジピン酸経路を利用してα−ケトグルタル酸およびアセチル補酵素Ａからリシンを合成する。ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＤＨＤＰＳ）酵素はＤＡＰ経路の第１ステップを触媒し、リシンによるフィードバック阻害を受ける（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｒｅｂｏｕｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌は、フィードバック耐性ＤＨＤＰＳを含む。フィードバック耐性ＤＨＤＰＳを含むように操作した細菌のヒスチジン生成レベルは上がり、そのためアンモニア消費量は増加し、高アンモニア血症を軽減するだろう。あるいは、リシン生成は、リシン生合成に必要な１つまたは複数の遺伝子をＦＮＲ誘導性プロモータなどの誘導性プロモータの制御下に置くことにより最適化することが可能であろう。リシン生合成経路に対する任意の他の適切な改変を利用して、アンモニア消費量を増加させることができる。

【0060】

アスパラギン生合成経路
アスパラギンは、オキサロ酢酸トランスアミナーゼ酵素およびアスパラギンシンセターゼ酵素それぞれを介して、オキサロ酢酸およびアスパラギン酸から直接合成される。この経路の第２ステップでは、Ｌ−グルタミンまたはアンモニアの何れかがアミノ基供与体として機能する。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌は、同一条件下の同じサブタイプの非改変細菌と比較し、アスパラギンを過剰に生成することにより、過剰なアンモニアを消費し、高アンモニア血症を軽減する。あるいは、アスパラギン合成は、これらの遺伝子の一方または両方をＦＮＲ誘導性プロモータなどの誘導性プロモータの制御下に置くことにより最適化することができる。アスパラギン生合成経路に対する任意の他の適切な改変を利用して、アンモニア消費量を増加させることができる。

【0061】

グルタミン生合成経路
アンモニアおよびオキソグルタル酸からのグルタミンおよびグルタミン酸の合成は、３つの酵素により厳重に調節される。グルタミン酸脱水素酵素が、オキソグルタル酸の還元的アミノ化反応を触媒して、単一ステップでグルタミン酸を産する。グルタミンシンセターゼは、グルタミン酸およびアンモニアのＡＴＰ依存性縮合を触媒してグルタミンを形成する（Ｌｏｄｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００８）。グルタミンシンセターゼはまた、サイクル反応においてグルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（グルタミン酸シンターゼとしても知られる）と共に作用して、グルタミンおよびオキソグルタル酸からグルタミン酸を生成する。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌は、同一条件下の同じサブタイプの非改変細菌と比較し、高いレベルでグルタミンシンセターゼを発現する。グルタミンシンセターゼの発現が増大するように操作した細菌のグルタミン生成レベルは上がり、そのためアンモニア消費量は増加し、高アンモニア血症を軽減するだろう。あるいは、グルタミン酸脱水素酵素および／またはグルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼの発現は、アンモニア消費を促進するように改変することができるだろう。グルタミンシンセターゼの生成は窒素により転写レベルで調節されることから（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２；ｖａｎ Ｈｅｅｓｗｉｊｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、グルタミンシンセターゼ遺伝子をＦＮＲ誘導性プロモータなどの異なる誘導性プロモータの制御下に置くことを利用して、グルタミン生成を改善することもできる。グルタミンおよびグルタミン酸の生合成経路に対する任意の他の適切な改変を利用して、アンモニア消費量を増加させることができる。

【0062】

トリプトファン生合成経路
大部分の細菌において、コリスマート前駆体からのトリプトファンの合成に必要な遺伝子は、単一転写ユニット、ｔｒｐオペロンとして組織化される。ｔｒｐオペロンは、高レベルのトリプトファンが存在する場合は、トリプトファンリプレッサ（ＴｒｐＲ）により阻害される単一プロモータの制御下にある。ｔｒｐオペロンの転写はまた、高レベルの荷電トリプトファンｔＲＮＡの存在下で終了し得る。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌は、ｔｒｐＲ遺伝子が削除されているか、または、破壊されたもしくは突然変異したｔｒｐＲ遺伝子を含む。ｔｒｐＲ遺伝子の欠失、破壊、または突然変異、およびその結果として起きるＴｒｐＲ機能の不活化は、高いレベルのトリプトファン生成とアンモニア消費の両方をもたらすだろう。あるいは、トリプトファン生合成に必要な１つまたは複数の酵素を、ＦＮＲ誘導性プロモータなどの誘導性プロモータの制御下に置くことが可能であろう。トリプトファン生合成経路に対する任意の他の適切な改変を利用して、アンモニア消費量を増加させることができる。

【0063】

突然変異アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作した細菌
一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はアルギニン生合成経路を含み、過剰なアンモニアを減少させることが可能である。より具体的な態様では、遺伝子操作した細菌は突然変異アルギニンレギュロンを含み、ここではアルギニン生合成酵素をコードした１つまたは複数のオペロンの阻害が解除されて、同一条件下の同じサブタイプの非改変細菌よりも多くのアルギニンまたはシトルリンなどの中間副生成物を生成する。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はアルギニンを過剰に生成する。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はシトルリンを過剰に生成するが、これは、シトルリンが現在、特定の尿素サイクル異常症の治療に用いられていることから（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、さらに有益であり得る。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はアルギニン生合成経路において、本明細書に記載する任意の中間物などの代替の中間副生成物を過剰生成する。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、同一条件下の同じ細菌サブタイプの非改変細菌よりも、多くのアルギニン、シトルリン、および／または他の中間副生成物を生成することにより、過剰なアンモニアを消費する。アルギニンおよび／または中間副生成物の生合成の強化を利用して、尿素サイクル異常症および肝性脳症を含む高アンモニア血症と関連する症状を処置するために、体内の過剰な窒素を非毒性分子に組み込むことができる。

【0064】

当業者は、オペロン内のアルギニン生合成遺伝子の構成は、大腸菌Ｋ１２の二極性ａｒｇＥＣＢＨ、バチリス・サブチリスのａｒｇＣＡＥＢＤ−ｃａｒＡＢ−ａｒｇＦ、およびラクトバチルス・プランタルムの二極性ｃａｒＡＢ−ａｒｇＣＪＢＤＦなど、細菌の種、株、およびサブタイプにより異なることを理解しよう。異なる細菌に由来するオペロン構成の非限定的例をＴａｂｌｅ ２に示す（ある場合では、遺伝子は、大腸菌の既知の配列に対する配列相同性により推定および／または特定され；ある場合では、アルギニンレギュロンの遺伝子全てが既知である、および／または以下で示されているわけではない）。ある例では、アルギニン生合成酵素は、細菌の種、株、およびサブタイプにより異なる。

【0065】

【表2】

【0066】

各オペロンは、前記オペロンにおいてアルギニン生合成遺伝子の阻害と発現を制御する、少なくとも１つのプロモータおよび少なくとも１つのＡＲＧボックスを含む調節領域により調節される。

【0067】

一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌は、１つまたは複数の核酸突然変異を含むアルギニンレギュロンを含み、該核酸突然変異は、アルギニン生合成経路においてグルタミン酸からアルギニンおよび／または中間副生成物への変換を担う酵素をコードする１つまたは複数のオペロンのアルギニン介在性阻害を、低減または消失させる。アルギニン介在性阻害の低減または消失は、（例えば、アルギニンリプレッサを突然変異させるか、もしくは削除することで、または、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧを突然変異させることで）ＡｒｇＲリプレッサ結合を低減または消失させることにより、および／または、（例えば、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼを突然変異させて、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えばａｒｇＡ^ｆｂｒを生成することで）Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼに対するアルギニン結合を低減または消失させることにより、達成することができる。

【0068】

ＡＲＧボックス
一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノスクシネートシンターゼ、アルギニノスクシネートリアーゼ、およびカルバモイルリン酸シンターゼをコードする１つまたは複数のオペロンの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の核酸突然変異を含む、突然変異アルギニンレギュロンを含むことにより、レギュロンの阻害を解除し、アルギニンおよび／または中間副生成物の生合成を強化する。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンリプレッサを含み、その結果、アルギニンリプレッサの機能は低下もしくは不活性となるか、または、遺伝子操作した細菌はアルギニンリプレッサを持たず（例えば、アルギニンリプレッサ遺伝子が削除されている）、レギュロンの阻害解除ならびにアルギニンおよび／または中間副生成物の生合成の強化がもたらされる。これらの実施形態の何れかにおいて、遺伝子操作した細菌はさらに、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡ^ｆｂｒを含み得る。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、アルギニン生合成酵素をコードする１つまたは複数のオペロンの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の核酸突然変異を含む、突然変異アルギニンレギュロンと、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡ^ｆｂｒとを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、突然変異アルギニンリプレッサを含むか、またはアルギニンリプレッサは削除され、そして、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡ^ｆｂｒ、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の核酸突然変異を含む、突然変異アルギニンレギュロン、および／または、突然変異アルギニンリプレッサを含むか、もしくは、アルギニンリプレッサは削除されている。

【0069】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードし、さらに、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノスクシネートシンターゼ、アルギニノスクシネートリアーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードする１つまたは複数のオペロンの各ＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の核酸突然変異を含む、突然変異アルギニンレギュロンを含み、その結果、ＡｒｇＲ結合は低減または消失し、それによりレギュロンの阻害を解除し、アルギニンおよび／または中間副生成物の生合成を強化する。

【0070】

一部の実施形態では、アルギニノスクシネートシンターゼ（ａｒｇＧ）をコードするオペロンのＡＲＧボックスがＡｒｇＲに結合する機能を維持し、それによりシトルリン生合成を駆動させる。例えば、アルギニノスクシネートシンターゼ（ａｒｇＧ）をコードするオペロンの調節領域が構成的で、それによりアルギニン生合成を駆動させることができる。代替の実施形態において、１つまたは複数の代替オペロンの調節領域は構成的であり得る。しかしながらある細菌では、多数の酵素をコードする遺伝子は二極性オペロンに組織化されるか、または共通の調節領域の制御下にあり得、これらの場合、構成的活性型の調節領域を操作するためには、調節領域をデコンボリューションする必要がある場合がある。例えば、大腸菌Ｋ１２およびＮｉｓｓｌｅでは、ａｒｇＥおよびａｒｇＣＢＨは２つの二極性オペロンａｒｇＥＣＢＨに組織化され、構成型のａｒｇＥおよび／またはａｒｇＣＢＨを生成するためにそれらの調節領域をデコンボリューションする場合がある。

【0071】

一部の実施形態では、アルギニン生合成遺伝子を含む１つまたは複数のオペロンのＡＲＧボックスを全て突然変異させて、ＡｒｇＲ結合を低減または消失させる。一部の実施形態では、アルギニン生合成酵素をコードする１つまたは複数のオペロンのＡＲＧボックスを全て突然変異させて、ＡｒｇＲ結合を低減または消失させる。一部の実施形態では、アルギニン生合成遺伝子を含む各オペロンのＡＲＧボックスを全て突然変異させて、ＡｒｇＲ結合を低減または消失させる。一部の実施形態では、アルギニン生合成酵素をコードする各オペロンのＡＲＧボックスを全て突然変異させて、ＡｒｇＲ結合を低減または消失させる。

【0072】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、フィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼおよびＡｒｇＲ阻害可能調節領域により駆動されるアルギニノスクシネートシンターゼをコードし、さらに、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノスクシネートシンターゼ、アルギニノスクシネートリアーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、およびオプションとして、野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードするオペロンそれぞれの各ＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の核酸突然変異を含む、突然変異アルギニンレギュロンを含み、その結果、ＡｒｇＲ結合は低減または消失し、それによりレギュロンの阻害を解除し、シトルリン生合成を強化する。一部の実施形態では、シトルリンを生成することが可能な遺伝子操作した細菌は、シトルリンがさらに、ある特定の尿素サイクル異常症の処置に対し治療的に有効なサプリメントとして機能することから、特に有利である（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）。

【0073】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼおよび構成的プロモータにより駆動されるアルギニノスクシネートシンターゼをコードし、さらに、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノスクシネートリアーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、およびオプションとして、野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードするオペロンそれぞれの各ＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の核酸突然変異を含む、突然変異アルギニンレギュロンを含み、その結果、ＡｒｇＲ結合は低減または消失し、それによりレギュロンの阻害を解除し、アルギニン生合成を強化する。

【0074】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、突然変異アルギニンレギュロンおよびフィードバック耐性ＡｒｇＡを含み、アルギニンフィードバック耐性ＡｒｇＡが発現する場合、同一条件下の同じサブタイプの非改変細菌よりも多くのアルギニンおよび／または中間副生成物を生成することが可能である。

【0075】

アルギニンリプレッサ結合部位（ＡＲＧボックス）
一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、加えて、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノスクシネートシンターゼ、アルギニノスクシネートリアーゼ、およびカルバモイルリン酸シンターゼをコードする１つまたは複数のオペロンの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の核酸突然変異を含む、突然変異アルギニンレギュロンを含み、その結果、アルギニンレギュロンの阻害を解除し、アルギニンおよび／または中間副生成物、例えばシトルリンの生合成を強化する。

【0076】

一部の実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、オルニチンアセチルトランスフェラーゼをコードするオペロンを含み、前記オペロンの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の核酸突然変異を含む。１つまたは複数の核酸突然変異は回帰性ＡＲＧボックス配列の破壊を引き起こし、その結果、同一条件下の同じサブタイプの細菌の非改変ＡＲＧボックスおよび調節領域に対するＡｒｇＲ結合と比較し、オペロンのＡＲＧボックスおよび調節領域に対するＡｒｇＲ結合は低減または消失する。一部の実施形態では、ＡｒｇＲ結合時のＤＮＡメチル化およびヒドロキシルラジカルアタックから保護される核酸は、ＡｒｇＲ結合を妨げる突然変異の主要標的である。一部の実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、上記のアルギニン生合成酵素をコードするオペロンそれぞれの１つまたは複数のＡＲＧボックスにおいて、少なくとも３つの核酸突然変異を含む。ＡＲＧボックスはプロモータと一部重複し、突然変異アルギニンレギュロンにおいては、突然変異プロモータ領域のＧ／Ｃ：Ａ／Ｔ比率は、野生型プロモータ領域のＧ／Ｃ：Ａ／Ｔ比率とわずか１０％異なるだけである（図６）。プロモータは、非突然変異プロモータに対し十分に高い相同性を保持し、その結果、ＲＮＡポリメラーゼが十分な親和性をもって結合して転写を促進する。

【0077】

大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの各アルギニン生合成オペロンについてＡＲＧボックスを含む野生型遺伝子配列とその突然変異体を、図６に示す。例示的な野生型配列では、ＡＲＧボックスをイタリック体で示し、各遺伝子の開始コドンは囲む。ＲＮＡポリメラーゼ結合部位には下線を引く（Ｃｕｎｉｎ，１９８３；Ｍａａｓ，１９９４）。一部の実施形態では、下線を引いた配列は変更しない。ＡｒｇＲ結合時にＤＮＡメチル化から保護される塩基は強調表示し、ＡｒｇＲ結合時にヒドロキシルラジカルアタックから保護される塩基は太字にする（Ｃｈａｒｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。強調表示した太字の塩基は、ＡｒｇＲ結合を妨げる突然変異の主要標的である。

【0078】

一部の実施形態では、２つ以上のＡＲＧボックスが単一オペロンに存在し得る。これらの実施形態の一態様では、オペロンの少なくとも１つのＡＲＧボックスを突然変異させて、オペロンの調節領域に対する、必須の低減ＡｒｇＲ結合を生成する。これらの実施形態の代替の態様では、オペロンの各ＡＲＧボックスを突然変異させて、オペロンの調節領域に対する、必須の低減ＡｒｇＲ結合を生成する。例えば、大腸菌ＮｉｓｓｌｅのｃａｒＡＢオペロンは２つのＡＧボックスを含み、ＡＲＧボックス配列の一方または両方を突然変異させることができる。大腸菌ＮｉｓｓｌｅのａｒｇＧオペロンは３つのＡＲＧボックスを含み、１つ、２つ、または３つのＡＲＧボックス配列を突然変異させるか、破壊するか、または削除することができる。一部の実施形態では、３つのＡＲＧボックス配列の全てを突然変異させるか、破壊するか、または削除し、構成的プロモータ、例えばＢＢａ＿Ｊ２３１００をａｒｇＧオペロンの調節領域に挿入する。当業者は、調節領域ごとのＡＲＧボックスの数が細菌ごとに異なり得ることと、ＡＲＧボックスのヌクレオチド配列が各オペロンで異なり得ることを理解しよう。

【0079】

一部の実施形態では、オペロンの突然変異ＡＲＧボックスまたは調節領域に対するＡｒｇＲ結合の親和性は、同一条件下の同じサブタイプの細菌の非改変のＡＲＧボックスおよび調節領域に対するＡｒｇＲ結合の親和性よりも、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％低い。一部の実施形態では、突然変異ＡＲＧボックスおよび調節領域に対する低減ＡｒｇＲ結合は、関連オペロンの遺伝子のｍＲＮＡ発現を、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１５００倍に増加させる。

【0080】

一部の実施形態では、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、アルギニン生合成遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを増幅し、検出し、および／または定量化する。アルギニン生合成遺伝子、例えばａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡ、およびｃａｒＢに特異的なプライマーを設計し、それを用いて、当技術分野で既知の方法に従いサンプル中のｍＲＮＡを検出することができる（Ｆｒａｇａ ｅｔ ａｌ．，２００８）。一部の実施形態では、フルオロフォアをａｒｇ ｍＲＮＡを含有し得るサンプル反応混合物に加え、サーマルサイクラ―を用いて、特異的な波長の光をサンプル反応混合物に当て、その結果生じるフルオロフォアによる発光を検出する。反応混合物を加熱し、所定の期間にわたり所定の温度まで冷却する。ある実施形態では、加熱と冷却を所定のサイクル数で繰り返す。一部の実施形態では、反応混合物を所定のサイクル数で加熱し、９０〜１００℃、６０℃〜７０℃、および３０℃〜５０℃まで冷却する。ある実施形態では、反応混合物を所定のサイクル数で加熱し、９３〜９７℃、５５℃〜６５℃、および３５℃〜４５℃まで冷却する。一部の実施形態では、蓄積したアンプリコンを各ｑＰＣＲサイクル後に定量化する。蛍光が閾値を超えるサイクル数がｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ（Ｃ_Ｔ）である。各サンプルで少なくとも１つのＣ_Ｔ結果が生成され、該Ｃ_Ｔ結果を用いて、アルギニン生合成遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを求めることができる。

【0081】

一部の実施形態では、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノスクシネートシンターゼ、アルギニノスクシネートリアーゼ、およびカルバモイルリン酸シンターゼをコードする１つまたは複数のオペロンの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の核酸突然変異を含む、遺伝子操作した細菌は、加えて、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えばａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。

【0082】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、フィードバック耐性形態のＡｒｇＡを含み、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノスクシネートシンターゼ、アルギニノスクシネートリアーゼ、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ、およびカルバモイルリン酸シンターゼをコードする１つまたは複数のオペロンの各ＡＲＧボックスにおいて、１つまたは複数の核酸突然変異を含む。

【0083】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、フィードバック耐性形態のＡｒｇＡと、ＡｒｇＲ阻害可能調節領域により駆動されるアルギニノスクシネートシンターゼとを含み、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノスクシネートリアーゼ、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ、およびカルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロンそれぞれの各ＡＲＧボックスにおいて、１つまたは複数の核酸突然変異を含む。これらの実施形態では、細菌はシトルリンを生成することが可能である。

【0084】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、フィードバック耐性形態のＡｒｇＡと、構成的プロモータから発現したアルギニノスクシネートシンターゼとを含み、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノスクシネートシンターゼ、アルギニノスクシネートリアーゼ、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ、およびカルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロンそれぞれの各ＡＲＧボックスにおいて、１つまたは複数の核酸突然変異を含む。これらの実施形態では、細菌はアルギニンを生成することが可能である。

【0085】

Ｔａｂｌｅ ３は、１つまたは複数の核酸突然変異がアルギニンオペロンそれぞれのアルギニン介在性阻害を低減または消失させる、突然変異構成物の例を示す。突然変異構成物は、酸素レベル依存性プロモータ、例えばＦＮＲプロモータにより駆動される、フィードバック耐性形態のＡｒｇＡを含む。各突然変異アルギニンレギュロンは、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノスクシネートシンターゼ、アルギニノスクシネートリアーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、および野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードする１つまたは複数のオペロンの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおいて、１つまたは複数の核酸突然変異を含み、その結果、ＡｒｇＲ結合は低減または消失し、それによりアルギニンおよび／または中間副生成物の生合成を強化する。突然変異アルギニンレギュロン構成物の非限定的例を、Ｔａｂｌｅ ３に示す。

【0086】

【表3】

【0087】

突然変異は、プラスミドまたは染色体に存在し得る。一部の実施形態では、アルギニンレギュロンは、単一のリプレッサタンパク質により調節される。特定の種、株、および／またはサブタイプの細菌では、アルギニンレギュロンは２つの推定リプレッサにより調節され得るという提案がなされてきた（Ｎｉｃｏｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，２００４）。したがって、ある実施形態では、本発明のアルギニンレギュロンは、２つ以上のリプレッサタンパク質により調節される。

【0088】

ある実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、遺伝子操作した細菌の１つの種、株、またはサブタイプにおいて発現する。代替の実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、遺伝子操作した２つ以上の種、株、および／またはサブタイプの細菌において発現する。

【0089】

アルギニンリプレッサ（ＡｒｇＲ）
本発明の遺伝子操作した細菌は、アルギニン生合成経路においてグルタミン酸からアルギニンおよび／または中間副生成物への変換を担う酵素をコードする１つまたは複数のオペロンのアルギニン介在性阻害を低減または消失させる１つまたは複数の核酸突然変異を含む、アルギニンレギュロンを含む。一部の実施形態では、アルギニン介在性阻害の低減または消失は、例えば、（上記のような）アルギニン生合成酵素をコードする１つもしくは複数のオペロンの少なくとも１つのＡＲＧボックスを突然変異させる、または、（例えば、本明細書で論じる）アルギニンリプレッサを突然変異させるもしくは削除する、および／または、（Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼを突然変異させて、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えばａｒｇＡ^ｆｂｒを生成することにより）Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼに対するアルギニン結合を低減もしくは消失させることにより、ＡｒｇＲリプレッサ結合を低減もしくは消失させることで、達成することができる。

【0090】

したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は機能的ＡｒｇＲリプレッサを欠き、そのためアルギニン生合成オペロンそれぞれのＡｒｇＲリプレッサ介在性転写阻害は、低減または消失する。一部の実施形態では、操作した細菌は、１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンリプレッサを含み、その結果、アルギニンリプレッサ機能は低下するか、または不活性になる。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はアルギニンリプレッサを持たず（例えば、アルギニンリプレッサ遺伝子が削除されている）、レギュロンの阻害解除ならびにアルギニンおよび／または中間副生成物の生合成の強化がもたらされる。一部の実施形態では、対応する野生型細菌に通常存在する機能性ａｒｇＲ遺伝子の各コピーを個別に削除するか、または、１つもしくは複数のヌクレオチドの削除、挿入、もしくは置換により不活性にする。一部の実施形態では、対応する野生型細菌に通常存在する機能性ａｒｇＲ遺伝子の各コピーを削除する。

【0091】

一部の実施形態では、アルギニンレギュロンは単一のリプレッサタンパク質により調節される。特定の種、株、および／またはサブタイプの細菌では、アルギニンレギュロンは２つの別個の推定リプレッサにより調節され得るという提案がなされてきた（Ｎｉｃｏｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，２００４）。したがって、ある実施形態では、遺伝子操作した細菌において、異なるアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの別個のＡｒｇＲタンパク質を突然変異させるか、または削除する。

【0092】

一部の実施形態では、突然変異アルギニンリプレッサを含むか、またはアルギニンリプレッサが削除されている遺伝子改変した細菌は、加えて、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、フィードバック耐性形態のＡｒｇＡを含み、任意の機能性アルギニンリプレッサを欠き、アルギニンを生成することが可能である。ある実施形態では、遺伝子操作した細菌はさらに機能性ＡｒｇＧを欠き、シトルリンを生成することが可能である。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌においてａｒｇＲ遺伝子が削除される。一部の実施形態では、ａｒｇＲ遺伝子を突然変異させてＡｒｇＲ機能を不活化する。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌においてａｒｇＧ遺伝子が削除される。一部の実施形態では、ａｒｇＧ遺伝子を突然変異させてＡｒｇＲ機能を不活化する。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はａｒｇＡ^ｆｂｒを含み、ＡｒｇＲが削除される。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はａｒｇＡ^ｆｂｒを含み、ＡｒｇＲが削除され、ａｒｇＧが削除される。一部の実施形態では、削除されたＡｒｇＲおよび／または削除されたａｒｇＧは細菌ゲノムから削除され、ａｒｇＡ^ｆｂｒはプラスミドに存在する。一部の実施形態では、削除されたＡｒｇＲおよび／または削除されたａｒｇＧは細菌ゲノムから削除され、ａｒｇＡ^ｆｂｒは染色体上に組み込まれる。一つの特定の実施形態では、遺伝子改変した細菌は、染色体上に組み込まれたａｒｇＡ^ｆｂｒを含み、ゲノムＡｒｇＲが削除され、ゲノムａｒｇＧが削除される。別の特定の実施形態では、遺伝子改変した細菌はプラスミド上にあるａｒｇＡ^ｆｂｒを含み、ゲノムＡｒｇＲが削除され、ゲノムａｒｇＧが削除される。ａｒｇＧが削除される任意の実施形態では、アルギニンよりもむしろシトルリンが生成される。

【0093】

一部の実施形態では、フィードバック耐性形態のＡｒｇＡが発現する条件下で、本発明の遺伝子操作した細菌は、同一条件下の同じサブタイプの非改変細菌と比較し、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、もしくは少なくとも約１５００倍のアルギニン、シトルリン、他の中間副生成物、および／またはオペロンにある遺伝子の転写物を生成する。

【0094】

一部の実施形態では、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、アルギニン生合成遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを増幅、検出、および／または定量化する。アルギニン生合成遺伝子、例えば、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡ、およびｃａｒＢに対し特異的なプライマーを設計し、それを用いて当技術分野で既知の方法に従いサンプル中のｍＲＮＡを検出することができる（Ｆｒａｇａ ｅｔ ａｌ．，２００８）。一部の実施形態では、フルオロフォアをａｒｇ ｍＲＮＡを含有し得るサンプル反応混合物に加え、サーマルサイクラ―を用いて、特異的な波長の光をサンプル反応混合物に当て、その結果生じるフルオロフォアによる発光を検出する。反応混合物を加熱し、所定の期間にわたり所定の温度まで冷却する。ある実施形態では、加熱と冷却を所定のサイクル数で繰り返す。一部の実施形態では、反応混合物を所定のサイクル数で、加熱し、９０〜１００℃、６０℃〜７０℃、および３０℃〜５０℃まで冷却する。ある実施形態では、反応混合物を所定のサイクル数で、加熱し、９３〜９７℃、５５℃〜６５℃、および３５℃〜４５℃まで冷却する。一部の実施形態では、蓄積したアンプリコンを各ｑＰＣＲサイクル後に定量化する。蛍光が閾値を超えるサイクル数がｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ（Ｃ_Ｔ）である。各サンプルで少なくとも１つのＣ_Ｔ結果が生成され、該Ｃ_Ｔ結果を用いて、アルギニン生合成遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを求めることができる。

【0095】

フィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ
一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えばａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、アルギニンフィードバック耐性ＡｒｇＡを含む突然変異アルギニンレギュロンを含み、アルギニンフィードバック耐性ＡｒｇＡが発現する際には、同一条件下の同じサブタイプの非改変細菌よりも多くのアルギニンおよび／または中間副生成物を生成することが可能である。アルギニンフィードバック耐性（ｆｅｅｄｂａｃｋ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼタンパク質（ａｒｇＡ^ｆｂｒ）は、フィードバック感受性親株由来の酵素よりもＬ−アルギニンに対する感受性が著しく低い（例えば、Ｅｃｋｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９７５；Ｒａｊａｇｏｐａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８を参照）。フィードバック耐性ａｒｇＡ遺伝子は、プラスミドまたは染色体に存在し得る。一部の実施形態では、プラスミドからの発現は、ａｒｇＡ^ｆｂｒ発現を増加させるのに有効であり得る。一部の実施形態では、染色体からの発現はａｒｇＡ^ｆｂｒ発現の安定性を増大させるのに有効であり得る。

【0096】

一部の実施形態では、本開示の任意の遺伝子操作した細菌は、細菌染色体の１つまたは複数の組み込み部位に組み込まれる。例えば、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードする配列の１つまたは複数のコピーが、細菌染色体に組み込まれ得る。アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼの多数のコピーが染色体に組み込まれていることは、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼをより多く生成することを可能にし、また、発現レベルを微調整することも可能にする。あるいは、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼに加え、任意のキルスイッチ回路といった本明細書に記載の別の回路が、細菌染色体の１つまたは複数の異なる組み込み部位に組み込まれて、多数の異なる機能を実行し得る。

【0097】

多数の別個のフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼタンパク質が当技術分野で既知であり、遺伝子操作した細菌に組み込まれ得る。一部の実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は、構成的プロモータの制御下で発現する。一部の実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は、外因性環境条件により誘導されるプロモータの制御下で発現する。一部の実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の消化管に対し特異的である。一部の実施形態では、外因性環境条件は、哺乳類の消化管に特異的な分子または代謝産物、例えばプロピオナートまたはビリルビンである。一部の実施形態では、外因性環境条件は、哺乳類の消化管の環境といった、低酸素性または嫌気的条件である。

【0098】

細菌は、酸素レベルを感知することが可能な転写機能を進化させてきた。異なるシグナル経路が、異なる酸素レベルにより引き起こされ、異なる動態で起き得る。酸素レベル依存性プロモータは、１つまたは複数の酸素レベル感知転写因子が結合することのできる核酸配列であり、対応する転写因子の結合および／または活性化が、下流の遺伝子発現を活性化させる。一実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は、酸素レベル依存性プロモータの制御下にある。より多くの特定の態様では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は、哺乳類の消化管の環境といった、低酸素性または嫌気的な環境下で活性化される、酸素レベル依存性プロモータの制御下にある。

【0099】

ある実施形態では、遺伝子操作した細菌は、フマル酸・硝酸レダクターゼレギュレータ（ＦＮＲ）プロモータの制御下で発現するａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。大腸菌では、ＦＮＲは、好気代謝から嫌気代謝へのスイッチを制御する、主要な転写アクティベータである（Ｕｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。嫌気状態では、ＦＮＲは二量体化し、嫌気的増殖への適合を担う数百の遺伝子を活性化する活性ＤＮＡ結合タンパク質になる。好気状態では、ＦＮＲは酸素により二量体化を妨げられ、不活性である。代替の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、酸素レベル依存プロモータの制御下で、例えば、アルギニンデイミナーゼ・硝酸還元ＡＮＲプロモータ（Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、異化型硝酸呼吸レギュレータＤＮＲプロモータ（Ｔｒｕｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１０）の嫌気的調節下で発現するａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。これらの実施形態では、アルギニン生合成経路は、消化管などの低酸素または嫌気的な環境で特に活性化する。

【0100】

緑膿菌では、アルギニンデイミナーゼ・硝酸還元（ＡＮＲ）転写レギュレータの嫌気的調節が、「酸素限定または嫌気的な条件下で誘導可能な生理学的機能の発現に必要である」（Ｗｉｎｔｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓａｗｅｒｓ １９９１）。緑膿菌ＡＮＲは、大腸菌ＦＮＲと相同であり、「コンセンサスＦＮＲ部位（ＴＴＧＡＴ――――ＡＴＣＡＡ）はＡＮＲおよびＦＮＲにより効率的に認識された」（Ｗｉｎｔｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。ＦＮＲと同じように、嫌気状態において、ＡＮＲは嫌気的増殖への適合を担う非常に多くの遺伝子を活性化する。好気状態では、ＡＮＲは不活性である。シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・シリンガエ、およびシュードモナス・メンドシナは全て、ＡＮＲの機能的アナログを有する（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。ＡＮＲにより調節されるプロモータ、例えば、ａｒｃＤＡＢＣオペロンのプロモータは当技術分野に既知である（例えば、Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９８を参照）。

【0101】

ＦＮＲファミリーには、異化型硝酸呼吸レギュレータ（ＤＮＲ）（Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、ＡＮＲとともに「緑膿菌の嫌気硝酸呼吸」に必要な転写レギュレータ（Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）も含まれる。ある遺伝子では、ＦＮＲ結合モチーフは「おそらくＤＮＲによってのみ認識される」（Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。外因性環境条件および対応する調節領域により制御される任意の適切な転写レギュレータを用いることができる。非限定的例としては、ＡｒｃＡ／Ｂ、ＲｅｓＤ／ｅ、ＮｒｅＡ／Ｂ／Ｃ、およびＡｉｒＳＲが挙げられ、他のものも当技術分野で既知である。

【0102】

一部の実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒは、哺乳類の消化管などの環境において、特異的な分子または代謝産物に応答する誘導性プロモータの制御下で発現する。例えば、単鎖脂肪酸プロピオナートは、消化管に位置する、主要な微生物発酵代謝産物である（Ｈｏｓｓｅｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。一実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子発現は、プロピオナート誘導性プロモータの制御下にある。より具体的な実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子発現は、哺乳類の消化管におけるプロピオナートの存在により活性化されるプロピオナート誘導性プロモータの制御下にある。健康な状態および／または病気の状態の哺乳類の消化管に見られる任意の分子または代謝産物を用いて、ａｒｇＡ^ｆｂｒ発現を誘導することができる。非限定的例としては、プロピオナート、ビリルビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、血液凝固第ＩＩ因子、血液凝固第第ＶＩＩ因子、血液凝固第第ＩＸ因子、血液凝固第第Ｘ因子、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、肝炎抗原、肝炎抗体、アルファフェトプロテイン抗体、抗ミトコンドリア抗体、抗平滑筋抗体、抗核抗体、鉄、トランスフェリン、フェリチン、銅、セルロプラスミン、アンモニア、およびマンガンが挙げられる。代替の実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子発現は、ｐＢＡＤプロモータの制御下にあり、これは糖アラビノースの存在下で活性化する（例えば、図１８を参照）。

【0103】

肝性脳症（ＨＥ）および他の肝臓の病気または疾患を持つ対象は、慢性肝不全を患い、これは血液および腸における高アンモニアレベルの原因となる。アンモニアに加え、これらの患者は、血液および腸において、ビリルビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、血液凝固第ＩＩ因子、血液凝固第ＶＩＩ因子、血液凝固第ＩＸ因子、および血液凝固第Ｘ因子、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、肝炎抗原、肝炎抗体、アルファフェトプロテイン抗体、抗ミトコンドリア抗体、抗平滑筋抗体、抗核抗体、鉄、トランスフェリン、フェリチン、銅、セルロプラスミン、アンモニア、およびマンガンのレベルが上昇する。これらのＨＥ関連分子またはそれらの代謝産物の１つに応答するプロモータを用いて本開示の細菌を操作することが可能であり、該細菌は、ＨＥ患者の腸のａｒｇＡ^ｆｂｒを発現するようにのみ誘導されるだろう。これらのプロモータがＵＣＤ患者において誘導されることは予想されない。

【0104】

一部の実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は、テトラサイクリンにさらされることにより誘導されるプロモータの制御下で発現する。一部の実施形態では、遺伝子発現はさらに当技術分野で既知の方法により、例えば、リボソーム結合部位を最適化する、転写レギュレータを操作する、および／または、ｍＲＮＡの安定性を高めることにより、最適化される。

【0105】

一部の実施形態では、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼが活性である場合、遺伝子操作した細菌において、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼのアルギニンフィードバック阻害は、同一条件下の同じサブタイプの細菌に由来する野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼと比較し、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％低減する。

【0106】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を担持する、安定的に維持されたプラスミドまたは染色体を含み、その結果、ａｒｇＡ^ｆｂｒは宿主細胞において発現することが可能であり、宿主細胞は培地などのｉｎ ｖｉｔｒｏで、および／または、消化管などのｉｎ ｖｉｖｏで、生存および／または増殖することが可能である。一部の実施形態では、細菌はフィードバック耐性ａｒｇＡ遺伝子の多数のコピーを含み得る。一部の実施形態では、フィードバック耐性ａｒｇＡ遺伝子は、低コピープラスミドにおいて発現する。一部の実施形態では、低コピープラスミドは、発現の安定性を向上させるために有用であり得る。一部の実施形態では、低コピープラスミドは、非誘導条件下において発現の漏れ（ｌｅａｋｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を低減させるのに有用であり得る。一部の実施形態では、フィードバック耐性ａｒｇＡ遺伝子は、高コピープラスミドにおいて発現する。一部の実施形態では、高コピープラスミドは、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を増大させるのに有用であり得る。一部の実施形態では、フィードバック耐性ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は、染色体において発現する。一部の実施形態において、細菌は、多数の作用機序（ＭＯＡ）、例えば、同一の生成物の多数のコピーを生成する回路または多数の異なる機能を実行する回路を含むように、遺伝子操作する。挿入部位の例としては、限定されるわけではないが、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｄａｐＡ、ｃｅａ、および図２２に示す他のものが挙げられる。例えば、遺伝子操作した細菌には、４つの異なる挿入部位、例えばｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺにおいて、ａｒｇＡ^ｆｂｒの４つのコピーが挿入され得る。あるいは、遺伝子操作した細菌には、３つの異なる挿入部位、例えばｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ｌａｃＺにおいて、ａｒｇＡ^ｆｂｒの３つのコピーが挿入され得、３つの異なる挿入部位、例えばｄａｐＡ、ｃｅａ、ａｒａＣ／ＢＡＤにおいて、３つの突然変異アルギニンレギュロン、例えば、２つはシトルリンを生成し、１つはアルギニンを生成する突然変異アルギニンレギュロンが挿入され得る。

【0107】

一部の実施形態では、プラスミドまたは染色体は、野生型ＡｒｇＲ結合部位、例えばＡＲＧボックスも含む。一部の例では、機能性ＡｒｇＲの存在または増加は、ＡＲＧボックス以外の部位におけるオフターゲット結合の原因となり得、これは遺伝子発現においてオフターゲット変異を引き起こし得る。機能性ＡＲＧボックスをさらに含むプラスミドまたは染色体を用いて、つまり、ＡｒｇＲシンク（ｓｉｎｋ）として作用させることにより、オフターゲットＡｒｇＲ結合を低減または消失させることができる。一部の実施形態では、プラスミドまたは染色体は機能性ＡｒｇＲ結合部位を含まず、例えば、プラスミドまたは染色体は改変ＡＲＧボックスを含むか、またはＡＲＧボックスを含まない。

【0108】

一部の実施形態では、フィードバック耐性ａｒｇＡ遺伝子はプラスミドに存在し、低酸素または嫌気的な条件下で誘導されるプロモータに操作可能に連結する。一部の実施形態では、フィードバック耐性ａｒｇＡ遺伝子は染色体に存在し、低酸素または嫌気的な条件下で誘導されるプロモータに操作可能に連結する。一部の実施形態では、フィードバック耐性ａｒｇＡ遺伝子はプラスミドに存在し、哺乳類の消化管に特異的な分子または代謝産物により誘導されるプロモータに操作可能に連結する。一部の実施形態では、フィードバック耐性ａｒｇＡ遺伝子は染色体に存在し、哺乳類の消化管に特異的な分子または代謝産物により誘導されるプロモータに操作可能に連結する。一部の実施形態では、フィードバック耐性ａｒｇＡ遺伝子は染色体に存在し、テトラサイクリンにさらされることにより誘導されるプロモータに操作可能に連結する。一部の実施形態では、フィードバック耐性ａｒｇＡ遺伝子はプラスミドに存在し、テトラサイクリンにさらされることにより誘導されるプロモータに操作可能に連結する。

【0109】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、多数の作用機序（ＭＯＡ）、例えば、（コピー数を増加させるために）同一生成物の多数のコピーを生成する回路、または、多数の異なる機能を実行する回路を含む。挿入部位の例としては、限定されるわけではないが、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｄａｐＡ、ｃｅａ、および図２２に示す他のものが挙げられる。

【0110】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、対応する酸素レベル依存性プロモータに加え、異なるまたは突然変異した酸素レベル依存性転写レギュレータ、例えばＦＮＲ、ＡＮＲ、またはＤＮＲを含む。異なるまたは突然変異した酸素レベル依存性転写レギュレータは、低酸素または嫌気的な環境で操作可能に連結した遺伝子の転写を増加させる。一部の実施形態では、対応する野生型転写レギュレータは野生型活性を保持する。代替の実施形態では、対応する野生型転写レギュレータは削除されるか、または突然変異して野生型活性は低減もしくは消失する。ある実施形態では、突然変異酸素レベル依存性転写レギュレータは、二量体化およびＦＮＲ活性を強化するアミノ酸置換を含む、ＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００６を参照）。

【0111】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、低酸素または嫌気的な環境においてアンモニアを減少させる、および／または、アンモニアを消費する、異なる細菌種に由来する酸素レベル依存性転写レギュレータを含む。ある実施形態では、突然変異酸素レベル依存性転写レギュレータは、淋菌に由来するＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｉｓａｂｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１１を参照）。一部の実施形態では、対応する野生型転写レギュレータは手を加えられておらず、野生型活性を保持する。代替の実施形態では、対応する野生型転写レギュレータを削除するか、または突然変異させて、野生型活性を低減または消失させる。

【0112】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、酸素レベル依存性プロモータ、例えばＦＮＲプロモータの制御下で発現するａｒｇＡ^ｆｂｒと、上記のように１つまたは複数のＡＲＧボックス突然変異を含む突然変異調節領域の制御下で発現する野生型ａｒｇＡとを含む。ある実施形態では、遺伝子操作した細菌は、酸素レベル依存性プロモータ、例えばＦＮＲプロモータの制御下で発現するａｒｇＡ^ｆｂｒを含み、野生型ａｒｇＡは含まない。さらに他の実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、酸素レベル依存性プロモータ、例えばＦＮＲプロモータの制御下で発現するａｒｇＡ^ｆｂｒを含み、さらに、ＡＲＧボックス突然変異を持たない野生型ａｒｇＡを含む。

【0113】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、プラスミドおよび／または染色体からＡｒｇＡ^ｆｂｒを発現させる。一部の実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は構成的プロモータの制御下で発現する。一部の実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は誘導性プロモータの制御下で発現する。一実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒは、低酸素または嫌気的な環境下で活性化する酸素レベル依存性プロモータ、例えばＦＮＲプロモータの制御下で発現する。ＦＮＲプロモータにより駆動されるａｒｇＡ^ｆｂｒプラスミドの核酸配列を図８に示すが、ＦＮＲプロモータ配列は太字にし、ａｒｇＡ^ｆｂｒ配列は囲む。

【0114】

ＦＮＲプロモータ配列は当技術分野で既知であり、任意の適切なＦＮＲプロモータ配列を本発明の遺伝子操作した細菌で用いることができる。任意の適切なＦＮＲプロモータを、任意の適切なフィードバック耐性ＡｒｇＡ（例示的配列、配列番号８Ａ）と組み合わせることができる。非限定的ＦＮＲプロモータ配列を図７で提供する。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌は、配列番号１６、配列番号１７、ｎｉｒＢ１プロモータ（配列番号１８）、ｎｉｒＢ２プロモータ（配列番号１９）、ｎｉｒＢ３プロモータ（配列番号２０）、ｙｄｆＺプロモータ（配列番号２１）、強力なリボソーム結合部位に融合したｎｉｒＢプロモータ（配列番号２２）、強力なリボソーム結合部位に融合したｙｄｆＺプロモータ（配列番号２３）、ｆｎｒＳ、嫌気的に誘導される小ＲＮＡ遺伝子（ｆｎｒＳ１プロモータ配列番号２４またはｆｎｒＳ２プロモータ配列番号２５）、ｃｒｐ結合部位に融合したｎｉｒＢプロモータ（配列番号２６）、およびｃｒｐ結合部位に融合したｆｎｒＳ（配列番号２７）のうち、１つまたは複数を含む。

【0115】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、配列番号２８の核酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、遺伝子コードの冗長性を別とすれば配列番号２８と同じポリペプチドをコードする、核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、配列番号２８のＤＮＡ配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の相同性を有する核酸配列、または、遺伝子コードの冗長性を別とすれば配列番号２８と同じポリペプチドをコードする核酸配列を含む。

【0116】

他の実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒは、転写アクティベータ、例えばＣＲＰの結合部位に融合した酸素レベル依存性プロモータの制御下で発現する。ＣＲＰ（環状ＡＭＰ受容体タンパク質または異化活性化タンパク質またはＣＡＰ）は、グルコースなどの迅速に代謝可能な糖質が存在する場合に、より好ましくない炭素源の吸収、代謝、および同化を担う遺伝子を阻害することにより、細菌において主要な調整的役割を果たす（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。このグルコース選好はグルコース抑制および炭素異化産物抑制と呼ばれている（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，２００８；Ｇｏｅｒｋｅ ａｎｄ Ｓｔｕｅｌｋｅ，２００８）。一部の実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ発現は、ＣＲＰ結合部位に融合した酸素レベル依存性プロモータにより制御される。一部の実施形態では、ａｒｇＡ^ｆｂｒ発現は、ＣＲＰ結合部位に融合したＦＮＲプロモータにより制御される。これらの実施形態では、環状ＡＭＰは、グルコースが環境中に存在しない場合にＣＲＰと結合する。この結合はＣＲＰにおいて配座変化を引き起こし、ＣＲＰがその結合部位に強固に結合できるようにする。ＣＲＰ結合は次に、直接的なタンパク質−タンパク質相互反応を介してＲＮＡポリメラーゼをＦＮＲプロモータに補充することにより、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の転写を活性化させる。グルコースの存在下では、環状ＡＭＰはＣＲＰに結合せず、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子の転写は抑制される。一部の実施形態では、転写アクティベータの結合部位に融合した酸素レベル依存性プロモータ（例えばＦＮＲプロモータ）を用いて、例えばグルコースをｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖培地に加えることにより十分な量のグルコースが存在する際に、ａｒｇＡ^ｆｂｒが嫌気的条件下で発現しないようにする。

【0117】

アルギニン異化
本発明を実施する際に考慮すべき重要な事項は、アンモニアがアルギニンおよび／またはシトルリン異化の副生成物として過剰生成されないようにすることである。尿素サイクルの最終酵素段階で、アルギナーゼはアルギニンのオルニチンおよび尿素への加水分解を触媒する（Ｃｕｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。ウレアーゼは消化管の細菌から生成され得るが、尿素の二酸化炭素およびアンモニアへの分解を触媒する（Ｓｕｍｍｅｒｓｋｉｌｌ，１９６６；Ａｏｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．，１９６６；Ｃｕｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。したがって、ウレアーゼ活性は、「ヒト組織に有毒」であり得るアンモニアを生成し得る（Ｋｏｎｉｅｃｚｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅを含む一部の細菌では、遺伝子ａｒｃＤはアルギニン／オルニチンアンチポータをコードし、これもアンモニアを遊離させ得る（Ｖａｎｄｅｒ Ｗａｕｖｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｇａｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。

【0118】

ＡｓｔＡは、アルギニンからスクシナートへの変換に関与する酵素であり、これはアンモニアを遊離させる。ＳｐｅＡはアルギニンからアグマチンへの変換に関与する酵素であり、これはさらに異化してアンモニアを生成し得る。したがって、一部の例では、アルギニンの分解を防ぐことが有利であり得る。一部の実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作した細菌は、加えて、アルギニン異化を低減または消失させる突然変異を含み、それによりさらなるアンモニア生成を低減または消失させる。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はまた、ＡｒｃＤ活性を低減または消失させる突然変異を含む。ある実施形態では、ＡｒｃＤは削除される。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はまた、ＡｓｔＡ活性を低減または消失させる突然変異を含む。ある実施形態では、ＡｓｔＡは削除される。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はまた、ＳｐｅＡ活性を低減または消失させる突然変異を含む。ある実施形態では、ＳｐｅＡは削除される。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はまた、アルギナーゼ活性を低減または消失させる突然変異を含む。ある実施形態では、アルギナーゼは削除される。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はまた、ウレアーゼ活性を低減または消失させる突然変異を含む。ある実施形態では、ウレアーゼは削除される。一部の実施形態では、アルギニン異化に関与する１つまたは複数の他の遺伝子を突然変異させるか、または削除する。

【0119】

必須遺伝子および栄養要求株
本明細書で用いる場合、用語「必須遺伝子」は、細胞の増殖および／または生存に必要な遺伝子を指す。細菌の必須遺伝子は当業者に周知であり、指示された遺伝子の削除、ならびに／または、ランダムな突然変異誘発およびスクリーニングにより特定することが可能である（例えば、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｌｉｎ，２００９，ＤＥＧ ５．０，ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｂｏｔｈ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３７：Ｄ４５５−Ｄ４５８、およびＧｅｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ ｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｍａｐｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７（５）：４４８−４５６を参照。これらそれぞれの内容は全て、参照により本明細書に明確に組み込まれる）。

【0120】

「必須遺伝子」は、生物が生存する状況および環境に依存し得る。例えば、必須遺伝子の突然変異、改変、または切除は、栄養要求株化する本開示の組換え細菌をもたらし得る。栄養要求性の改変は、外から加えられる生存または増殖に必須の栄養が存在しない場合に、必須栄養を生成するのに必要な遺伝子欠くことで細菌を死滅させることを目的とする。

【0121】

栄養要求性の改変は、外から加えられる生存または増殖に必須の栄養がない場合は、必須栄養を生成するのに必要な遺伝子を欠くことで、細菌を死滅させることを目的とする。一部の実施形態では、本明細書に記載する任意の遺伝子操作した細菌において、細胞の生存および／または増殖に必要な遺伝子を削除するか、または突然変異させる。一実施形態では、必須遺伝子はＤＮＡ合成遺伝子、例えば、ｔｈｙＡである。別の実施形態では、必須遺伝子は細胞壁合成遺伝子、例えば、ｄａｐＡである。さらに別の実施形態では、必須遺伝子はアミノ酸遺伝子、例えばｓｅｒＡまたはＭｅｔＡである。限定されるわけではないが、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉ１を含む、細胞の生存および／または増殖に必要な任意の遺伝子が、対応する野生型遺伝子が細菌で生成されない限り、標的となり得る。例えば、チミンは細菌の細胞増殖に必要な核酸であり、それが欠けると、細菌は細胞死する。ｔｈｙＡ遺伝子は、チミジル酸シンセターゼ、つまりｄＵＭＰをｄＴＭＰに変換することによりチミン合成の第１段階を触媒する酵素をコードする（Ｓａｔ ｅｔ ａｌ．，２００３）。一部の実施形態では、本開示の細菌細胞はｔｈｙＡ栄養要求株であり、ここにおいてｔｈｙＡ遺伝子は削除されている、および／または無関係の遺伝子に置換されている。ｔｈｙＡ栄養要求株は、例えば、チミンをｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖培地に加えることにより十分な量のチミンが存在する場合、または、ｉｎ ｖｉｖｏのヒト消化管において天然に見られる高レベルのチミンが存在する場合にのみ、増殖することが可能である。一部の実施形態では、本開示の細菌細胞は、哺乳類の消化管に該細菌が存在する場合に補完される遺伝子において、栄養要求的である。十分な量のチミンがない場合、ｔｈｙＡ栄養要求株は死滅する。一部の実施形態では、栄養要求性改変を利用して、栄養要求性遺伝子の生成物がない場合は（例えば消化管の外）、細菌細胞が生存できないようにする。

【0122】

ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）は、リシン生合成経路内で合成されるアミノ酸であり、細菌の細胞壁成長に必要である（Ｍｅａｄｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９５９；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９７１）。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作した細菌はいずれもｄａｐＤ栄養要求株であり、ここにおいてｄａｐＤは削除されている、および／または、無関係の遺伝子と置き換えられている。ｄａｐＤ栄養要求株は、例えば、ＤＡＰをｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖培地に加えることにより十分な量のＤＡＰが存在する場合でのみ、増殖することが可能である。十分な量のＤＡＰがなければ、ｄａｐＤ栄養要求株は死滅する。一部の実施形態では、栄養要求性改変を利用して、栄養要求性遺伝子の生成物がない場合は（例えば消化管の外）、細菌細胞が生存できないようにする。

【0123】

他の実施形態では、本開示の遺伝子操作した細菌は、ｕｒａＡ栄養要求株であり、ここにおいてｕｒａＡは削除されている、および／または、無関係の遺伝子と置き換えられている。ｕｒａＡ遺伝子は、ＵｒａＡ、ピリミジンウラシルの吸収およびそれに続く代謝を促進する膜結合性輸送体をコードする（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。ｕｒａＡ栄養要求株は、例えば、ウラシルをｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖培地に加えることにより十分な量のウラシルが存在する場合にのみ、増殖することが可能である。十分な量のウラシルがなければ、ｕｒａＡ栄養要求株は死滅する。一部の実施形態では、栄養要求性改変を利用して、栄養要求性遺伝子の生成物がない場合は（例えば消化管の外）、細菌が生存できないようにする。

【0124】

複雑なコミュニティでは、細菌はＤＮＡを共有することが可能である。非常に稀な状況で、栄養要求性細菌株は、非栄養要求性株からＤＮＡを受け取ることができ、これは遺伝子の欠失を修復し、栄養要求株を永続的にレスキューする。そのため、２つ以上の栄養要求株で細菌株を操作することにより、栄養要求性をレスキューするのに十分な回数でＤＮＡ転移が起きる可能性を著しく減らすことができる。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌では、細胞の生存および／または増殖に必要な２つ以上の遺伝子を削除するか、突然変異させる。

【0125】

必須遺伝子の他の例としては、限定されるわけではないが、ｙｈｂＶ、ｙａｇＧ、ｈｅｍＢ、ｓｅｃＤ、ｓｅｃＦ、ｒｉｂＤ、ｒｉｂＥ、ｔｈｉＬ、ｄｘｓ、ｉｓｐＡ、ｄｎａＸ、ａｄｋ、ｈｅｍＨ、ｌｐｘＨ、ｃｙｓＳ、ｆｏｌｄ、ｒｐｌＴ、ｉｎｆＣ、ｔｈｒＳ、ｎａｄＥ、ｇａｐＡ、ｙｅａＺ、ａｓｐＳ、ａｒｇＳ、ｐｇｓａ、ｙｅｆＭ、ｍｅｔＧ、ｆｏｌＥ、ｙｅｊＭ、ｇｙｒＡ、ｎｒｄＡ、ｎｒｄＢ、ｆｏｌＣ、ａｃｃＤ、ｆａｂＢ、ｇｌｔＸ、ｌｉｇＡ、ｚｉｐＡ、ｄａｐＥ、ｄａｐＡ、ｄｅｒ、ｈｉｓＳ、ｉｓｐＧ、ｓｕｈＢ、ｔａｄＡ、ａｃｐＳ、ｅｒａ、ｒｎｃ、ｆｔｓＢ、ｅｎｏ、ｐｙｒＧ、ｃｈｐＲ、ｌｇｔ、ｆｂａＡ、ｐｇｋ、ｙｑｇＤ、ｍｅｔＫ、ｙｑｇＦ、ｐｌｓＣ、ｙｇｉＴ、ｐａｒｅ、ｒｉｂＢ、ｃｃａ、ｙｇｊＤ、ｔｄｃＦ、ｙｒａＬ、ｙｉｈＡ、ｆｔｓＮ、ｍｕｒＩ、ｍｕｒＢ、ｂｉｒＡ、ｓｅｃＥ、ｎｕｓＧ、ｒｐｌＪ、ｒｐｌＬ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、ｕｂｉＡ、ｐｌｓＢ、ｌｅｘＡ、ｄｎａＢ、ｓｓｂ、ａｌｓＫ、ｇｒｏＳ、ｐｓｄ、ｏｒｎ、ｙｊｅＥ、ｒｐｓＲ、ｃｈｐＳ、ｐｐａ、ｖａｌＳ、ｙｊｇＰ、ｙｊｇＱ、ｄｎａＣ、ｒｉｂＦ、ｌｓｐＡ、ｉｓｐＨ、ｄａｐＢ、ｆｏｌＡ、ｉｍｐ、ｙａｂＱ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＩ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｒａＹ、ｍｕｒＤ、ｆｔｓＷ、ｍｕｒＧ、ｍｕｒＣ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＺ、ｌｐｘＣ、ｓｅｃＭ、ｓｅｃａ、ｃａｎ、ｆｏｌＫ、ｈｅｍＬ、ｙａｄＲ、ｄａｐＤ、ｍａｐ、ｒｐｓＢ、ｉｎｆＢ ，ｎｕｓＡ、ｆｔｓＨ、ｏｂｇＥ、ｒｐｍａ、ｒｐｌＵ、ｉｓｐＢ、ｍｕｒＡ、ｙｒｂＢ、ｙｒｂＫ、ｙｈｂＮ、ｒｐｓＩ、ｒｐｌＭ、ｄｅｇＳ、ｍｒｅＤ、ｍｒｅＣ、ｍｒｅＢ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ｙｒｄＣ、ｄｅｆ、ｆｍｔ、ｒｐｌＱ、ｒｐｏＡ、ｒｐｓＤ、ｒｐｓＫ、ｒｐｓＭ、ｅｎｔＤ、ｍｒｄＢ、ｍｒｄＡ、ｎａｄＤ、ｈｌｅｐＢ、ｒｐｏＥ、ｐｓｓＡ、ｙｆｉＯ、ｒｐｌＳ、ｔｒｍＤ、ｒｐｓＰ、ｆｆｈ、ｇｒｐＥ、ｙｆｊＢ、ｃｓｒＡ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＤ、ｒｐｌＷ、ｒｐｌＤ、ｒｐｌＣ、ｒｐｓＪ、ｆｕｓＡ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＬ、ｔｒｐＳ、ｙｒｆＦ、ａｓｄ、ｒｐｏＨ、ｆｔｓＸ、ｆｔｓＥ、ｆｔｓＹ、ｆｒｒ、ｄｘｒ、ｉｓｐＵ、ｒｆａＫ、ｋｄｔＡ、ｃｏａＤ、ｒｐｍＢ、ｄｆｐ、ｄｕｔ、ｇｍｋ、ｓｐｏｔ、ｇｙｒＢ、ｄｎａＮ、ｄｎａＡ、ｒｐｍＨ、ｒｎｐＡ、ｙｉｄＣ、ｔｎａＢ、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＵ、ｗｚｙＥ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＣ、ｙｉｇＰ、ｕｂｉＢ、ｕｂｉＤ、ｈｅｍＧ、ｓｅｃＹ、ｒｐｌＯ、ｒｐｍＤ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＲ、ｒｐＬＦ、ｒｐｓＨ、ｒｐｓＮ、ｒｐｌＥ、ｒｐｌＸ、ｒｐｌＮ、ｒｐｓＱ、ｒｐｍＣ、ｒｐｌＰ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＶ、ｒｐｓＳ、ｒｐｌＢ、ｃｄｓＡ、ｙａｅＬ、ｙａｅＴ、ｌｐｘＤ、ｆａｂＺ、ｌｐｘＡ、ｌｐｘＢ、ｄｎａＥ、ａｃｃＡ、ｔｉｌＳ、ｐｒｏＳ、ｙａｆＦ、ｔｓｆ、ｐｙｒＨ、ｏｌＡ、ｒｌｐＢ、ｌｅｕＳ、ｌｎｔ、ｇｌｎＳ、ｆｌｄＡ、ｃｙｄＡ、ｉｎｆＡ、ｃｙｄＣ、ｆｔｓＫ、ｌｏｌＡ、ｓｅｒＳ、ｒｐｓＡ、ｍｓｂＡ、ｌｐｘＫ、ｋｄｓＢ、ｍｕｋＦ、ｍｕｋＥ、ｍｕｋＢ、ａｓｎＳ、ｆａｂＡ、ｍｖｉＮ、ｒｎｅ、ｙｃｅＱ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰ、ｔｍｋ、ｈｏｌＢ、ｌｏｌＣ、ｌｏｌＤ、ｌｏｌＥ、ｐｕｒＢ、ｙｍｆＫ、ｍｉｎＥ、ｍｉｎｄ、ｐｔｈ、ｒｓＡ、ｉｓｐＥ、ｌｏｌＢ、ｈｅｍＡ、ｐｒｆＡ、ｐｒｍＣ、ｋｄｓＡ、ｔｏｐＡ、ｒｉｂＡ、ｆａｂＩ、ｒａｃＲ、ｄｉｃＡ、ｙｄｆＢ、ｔｙｒＳ、ｒｉｂＣ、ｙｄｉＬ、ｐｈｅＴ、ｐｈｅＳ、ｙｈｈＱ、ｂｃｓＢ、ｇｌｙＱ、ｙｉｂＪ、およびｇｐｓＡが挙げられる。他の必須遺伝子も当業者には既知である。

【0126】

一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作した細菌は、合成リガンド依存性必須遺伝子（ＳＬｉＤＥ）の細菌細胞である。ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、特定のリガンドの存在下でのみ増殖する１つまたは複数の必須遺伝子において突然変異を有する、合成栄養要求株である（Ｌｏｐｅｚ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ “Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｕｘｏｔｒｏｐｈｓ ｗｉｔｈ Ｌｉｇａｎｄ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ａ ＢＬ２１ （ＤＥ３ Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｓｔｒａｉｎ，”ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２０１５） ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．５ｂ０００８５を参照（この内容は全て参照により本発明に明確に組み込まれる））。

【0127】

一部の実施形態では、ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、必須遺伝子において突然変異を有する。一部の実施形態では、必須遺伝子は、ｐｈｅＳ、ｄｎａＮ、ｔｙｒＳ、ｍｅｔＧ、およびａｄｋからなる群から選択される。一部の実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異：Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、およびＳ３４５Ｃのうち１つまたは複数を含むｄｎａＮである。一部の実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、およびＳ３４５Ｃを含むｄｎａＮである。一部の実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異：Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４ａ、Ｒ１８６ａ、およびＩ１８８Ｌのうち１つまたは複数を含むｐｈｅＳである。一部の実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４ａ、Ｒ１８６ａ、およびＩ１８８Ｌを含むｐｈｅＳである。一部の実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異：Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇのうち１つまたは複数を含むｔｙｒＳである。一部の実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇを含むｔｙｒＳである。一部の実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異：Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃのうち１つまたは複数を含むｍｅｔＧである。一部の実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃを含むｍｅｔＧである。一部の実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異：Ｉ４Ｌ、Ｌ５Ｉ、およびＬ６Ｇのうち１つまたは複数を含むａｄｋである。一部の実施形態では、必須遺伝子は突然変異Ｉ４Ｌ、Ｌ５Ｉ、およびＬ６Ｇを含むａｄｋである。

【0128】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、リガンドにより補完される。一部の実施形態では、リガンドは、ベンゾチアゾール、インドール、２−アミノベンゾチアゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸、およびＬ−ヒスチジンメチルエステルからなる群から選択される。例えば、ｍｅｔＧにおいて突然変異（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドール、２−アミノベンゾチアゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸、またはＬ−ヒスチジンメチルエステルにより補完される。ｄｎａＮにおいて突然変異（Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、およびＳ３４５Ｃ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドール、２−アミノベンゾチアゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸、またはＬ−ヒスチジンメチルエステルにより補完される。ｐｈｅＳにおいて突然変異（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは２−アミノベンゾチアゾールにより補完される。ｔｙｒＳにおいて突然変異（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは２−アミノベンゾチアゾールにより補完される。ａｄｋにおいて突然変異（Ｉ４Ｌ、Ｌ５Ｉ、およびＬ６Ｇ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたはインドールにより補完される。

【0129】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、それをリガンド栄養要求性にする、２つ以上の突然変異必須遺伝子を含む。一部の実施形態では、細菌細胞は２つの必須遺伝子において突然変異を含む。例えば、一部の実施形態では、細菌細胞は、ｔｙｒＳにおける突然変異（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇ）と、ｍｅｔＧにおける突然変異（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃ）を含む。他の実施形態では、細菌細胞は、３つの必須遺伝子において突然変異を含む。例えば、一部の実施形態では、細菌細胞はｔｙｒＳにおける突然変異（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇ）、ｍｅｔＧにおける突然変異（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃ）、ならびにｐｈｅＳにおける突然変異（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌ）を含む。

【0130】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、その必須遺伝子が、図３９、４９、６２、および６３に示すアラビノース系を用いて置き換えられている、条件付きの栄養要求株である。

【0131】

一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作した細菌は栄養要求株であり、また、本明細書に記載するキルスイッチコンポーネントおよび系の何れかなどの、キルスイッチ回路も含む。例えば、組換え細菌は、細胞の生存および／または増殖に必要な必須遺伝子、例えば、ｔｈｙＡなどのＤＮＡ合成遺伝子、ｄａｐＡなどの細胞壁合成遺伝子、および／もしくは、ｓｅｒＡまたはＭｅｔＡなどのアミノ酸遺伝子が削除されるか、または、該必須遺伝子において突然変異を含み、また、環境条件および／もしくはシグナルに応答して発現する１つまたは複数の転写アクティベータ（記載したアラビノース系など）により調節されるか、または、外因性環境条件および／もしくはシグナルを感知して発現する１つまたは複数のリコンビナーゼ（本明細書ならびに図３９、４０、および５０に記載のリコンビナーゼ系など）により調節される、毒素遺伝子も含み得る。他の実施形態は、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，“ＧｅｎｅＧｕａｒｄ：Ａ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ，” ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２０１５） ４：３０７−１６に記載されており、この内容は全て参照により本明細書に明確に組み込まれる。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作した細菌は栄養要求株であり、また、本明細書に記載するキルスイッチコンポーネントおよび系の何れかなどのキルスイッチ回路、ならびに、条件付き複製起点などの別のバイオセキュリティ系も含む（上記Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．を参照）。

【0132】

他の実施形態では、栄養要求性改変を利用して、過剰なアンモニアを消費する突然変異細菌をスクリーニングすることもできる。より具体的な態様では、栄養要求性改変を利用して、アルギニンを過剰生成することにより過剰なアンモニアを消費する突然変異細菌をスクリーニングすることができる。本明細書に記載するように、アルギニン代謝に関与する多くの遺伝子が、ＡｒｇＲとの相互作用を介してアルギニンにより阻害を受ける。ａｓｔＣ遺伝子プロモータは、アルギニン−ＡｒｇＲ複合体が、転写リプレッサとは対照的に転写アクティベータとして機能するという点で独特である。ＡｓｔＣは、大腸菌において、スクシニルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、アンモニア生成アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）経路の第３酵素、および、第１のａｓｔＣＡＤＢＥオペロンをコードする（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ある実施形態では、遺伝子操作した細菌は遺伝子に対し栄養要求性であり、ａｓｔＣプロモータの制御下で栄養要求性遺伝子産物を発現させる。これらの実施形態では、栄養要求性はポジティブフィードバックメカニズムの支配下にあり、該栄養要求性を利用して、アルギニンを過剰生成することにより過剰なアンモニアを消費する突然変異細菌を選択する。ポジティブフィードバック栄養要求株の非限定的例を図３３Ａおよび３３Ｂに示す。

【0133】

遺伝子調節回路
一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、本明細書に記載する構成物を発現させる、多層遺伝子調節回路を含む（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６２／１８４，８１１号を参照）

【0134】

ある実施形態では、本発明は、アルギニンを過剰生成する遺伝子操作した細菌を選択するための方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、代替の代謝経路、例えば、ヒスチジン生合成経路、メチオニン生合成経路、リシン生合成経路、アスパラギン生合成経路、グルタミン生合成経路、およびトリプトファン生合成経路を介して過剰なアンモニアを消費する遺伝子操作した細菌を、選択する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、突然変異アルギニンレギュロンと、ＡｒｇＲを調節した２リプレッサ活性化遺伝子調節回路とを含む、遺伝子操作した細菌を提供する。２リプレッサ活性化遺伝子調節回路は、アンモニアを減少させるか、または栄養要求株をレスキューする突然変異細菌を選択するのに有用である。一部の構成物では、高レベルのアルギニンおよび結果として生じるアルギニンによるＡｒｇＲの活性化は、検出可能標識または細胞の生存に必要な必須遺伝子の発現を引き起こし得る。

【0135】

２リプレッサ活性化調節回路は、第１ＡｒｇＲと、第２リプレッサ、例えばＴｅｔリプレッサとを含む。これらの実施形態の一態様において、ＡｒｇＲは、対象の特定の遺伝子、例えば検出可能な生成物の転写を阻害する第２リプレッサの転写を阻害し、これを用いて、過剰なアンモニアを消費する突然変異体、および／または、細胞の生存に必要な必須遺伝子をスクリーニングすることができる。限定されるわけではないが、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびＧＦＰなどの蛍光タンパク質などの任意の検出可能な生成物を用いることができる。一部の実施形態では、第２リプレッサはＴｅｔリプレッサタンパク質（ＴｅｔＲ）である。この実施形態では、野生型ＡＲＧボックスを含むＡｒｇＲ阻害可能プロモータがＴｅｔＲの発現を引き起こし、ＴｅｔＲ阻害可能プロモータが、対象の少なくとも１つの遺伝子、例えばＧＦＰの発現を引き起こす。（低アルギニン濃度で起きる）ＡｒｇＲ結合を欠く場合、ｔｅｔＲは転写され、ＴｅｔＲはＧＦＰ発現を阻害する。（高アルギニン濃度で起きる）ＡｒｇＲ結合が存在する場合、ｔｅｔＲ発現は阻害され、ＧＦＰが生成される。これらの実施形態で有用な他の第２リプレッサの例としては、限定されるわけではないが、ＡｒｓＲ、ＡｓｃＧ、ＬａｃＩ、ＣｓｃＲ、ＤｅｏＲ、ＤｇｏＲ、ＦｒｕＲ、ＧａｌＲ、ＧａｔＲ、ＣＩ、ＬｅｘＡ、ＲａｆＲ、ＱａｃＲ、およびＰｔｘＳが挙げられる（米国特許出願公開第２００３／０１６６１９１号明細書）。一部の実施形態では、スイッチを含む突然変異アルギニンレギュロンは突然変異誘発にさらされ、アルギニンを過剰生成することによりアンモニアを減少させる突然変異体は、検出可能な生成物が蛍光を発する際に、例えばフローサイメトリー、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）による検出可能生成物のレベルに基づき、選択される。

【0136】

一部の実施形態では、対象の遺伝子は、細菌の生存および／または増殖に必要なものである。ＡｒｇＲの制御下にある場合を除いて遺伝子生成物を生成しないように、対応する野生型遺伝子が取り除かれているか、または突然変異している限り、限定されるわけではないが、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉ１などの任意の遺伝子を用いることができる。一部の実施形態では、野生型ＡＲＧボックスを含むＡｒｇＲ阻害可能プロモータが、ＴｅｔＲタンパク質の発現を引き起こし、ＴｅｔＲ阻害可能プロモータが、細菌の生存および／または増殖に必要な少なくとも１つの遺伝子、例えばｔｈｙＡ、ｕｒａＡの発現を駆動する（Ｓａｔ ｅｔ ａｌ．，２００３）。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、該細菌が哺乳類の消化管に存在する場合は補完されない遺伝子において栄養要求性であり、ここにおいて前記遺伝子は、細菌中に存在する第２誘導遺伝子により補完され；第２遺伝子の転写はＡｒｇＲ阻害可能型であり、十分に高濃度のアルギニンの存在下で誘導される（そうして栄養要求性遺伝子を補完する）。一部の実施形態では、２リプレッサ活性化回路を含む突然変異アルギニンレギュロンは突然変異誘発にさらされ、過剰なアンモニアを減少させる突然変異体は、生存および／または増殖に必要な遺伝子生成物を欠く中での増殖により選択される。一部の実施形態では、２リプレッサ活性化回路を含む突然変異アルギニンレギュロンを用いて、高レベルのアルギニンがない場合は（例えば、消化管の外）細菌が生存できないようにする。

【0137】

宿主プラスミドの相互依存性
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌はまた、プラスミド相互依存性を生成するように改変したプラスミドを含む。ある実施形態では、相互依存性宿主プラスミドのプラットフォームはＧｅｎｅＧｕａｒｄである（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、（ｉ）必須の複製イニシエータータンパク質がトランスに提供されている条件付き複製起点、（ｉｉ）遺伝子の転座を介して宿主によりレスキューされ、また、富栄養培地において使用するのに適合した栄養要求性改変、および／または、（ｉｉｉ）広スペクトル毒素をコードする核酸配列を含む。毒素遺伝子を用いて、抗毒素を発現しない株（例えば、野生型細菌）に対しプラスミドＤＮＡ自体を不利にすることにより、プラスミドの拡散に対し不利な選択を行うことができる。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、抗生物質を選択することなく、少なくとも１００世代にわたり安定的である。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、宿主の増殖を妨害しない。ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドを用いて、本発明の遺伝子操作した細菌において、意図しないプラスミドの伝播を大きく低減させる。

【0138】

相互依存性宿主プラスミドのプラットフォームは、単独で、または本明細書に記載するような他のバイオセーフティ機構（例えば、キルスイッチ、栄養要求性）と組み合わせて用いることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドを含む。他の実施形態では、遺伝子操作した細菌はＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドおよび／または１つもしくは複数のキルスイッチを含む。他の実施形態では、遺伝子操作した細菌はＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドおよび／または１つもしくは複数の栄養要求性を含む。さらに他の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミド、１つもしくは複数のキルスイッチ、および／または１つもしくは複数の栄養要求性を含む。

【0139】

キルスイッチ
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌はまた、キルスイッチを含む（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６２／１８３９３５号および同第６２／２６３３２９号を参照。）キルスイッチは、外部の刺激に応答して遺伝子操作した微生物を積極的に死滅させることを目的としている。細菌が生存のための必須栄養を欠くために死滅する栄養要求性突然変異とは対照的に、キルスイッチは、細胞死を引き起こす微生物内の毒性分子の生成を誘導する、環境内の特定の因子により誘発される。

【0140】

キルスイッチを用いて遺伝子操作した細菌は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究目的のために、例えば、実験室環境の外でバイオ燃料生成微生物の拡散を制限するために、遺伝子操作されている。病気または疾患を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ投与のために遺伝子操作した細菌はまた、治療遺伝子などの異種遺伝子の発現および送達後、または対象が治療効果を経験した後の特定の時点において死滅するようにプログラムすることができる。例えば、一部の実施形態では、キルスイッチを、ａｒｇ^Ａｆｂｒの酸素レベル依存性発現後の一定期間後に、細菌を死滅させるように活性化させる。一部の実施形態では、キルスイッチを、ａｒｇ^Ａｆｂｒの酸素レベル依存性発現後に遅れて、例えば、アルギニンまたはシトルリンの生成後に活性化させる。あるいは、細菌は、該細菌が患部の外まで広がった後に死滅するように操作することができる。具体的には、それは、微生物による対象の長期のコロニー形成、対象内の対象領域の外（例えば、消化管外）への微生物の拡散、または、対象の外側の環境への微生物の拡散（例えば、対象の便を介した環境への拡散）を防ぐのに有用である。キルスイッチで用いることができる毒素の例としては、限定されるわけではないが、バクテリオシン、リシン、および細胞膜の溶解、細胞ＤＮＡの劣化、または他のメカニズムにより細胞死を引き起こす他の分子が挙げられる。このような毒素は個別に、または組み合わせて用いることが可能である。その生成を制御するスイッチは、例えば、転写活性化（トグルスイッチ、例えば、Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００を参照）、翻訳（リボレギュレータ）、またはＤＮＡ組換え（組換え系スイッチ）に基づき得、嫌気状態または活性酸素などの環境刺激を感知することが可能である。これらのスイッチは、単一の環境因子により活性化することが可能であるか、または、細胞死を誘導するためにＡＮＤ、ＯＲ、およびＮＯＲの論理的構成にあるいくつかのアクティベータを必要とし得る。例えば、ＡＮＤリボレギュレータスイッチは、テトラサイクリン、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、およびアラビノースにより活性化されて、細胞膜を透過性にして細胞を死滅させるリシンの発現を誘導する。ＩＰＴＧはエンドリシンおよびホリンのｍＲＮＡの発現を誘導し、これらは次に、アラビノースおよびテトラサイクリンの添加により阻害は解除される。３つの誘導因子は全て細胞死を引き起こすために存在しなければならない。キルスイッチの例は当技術分野で既知である（Ｃａｌｌｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。一部の実施形態では、キルスイッチを、ａｒｇ^Ａｆｂｒの酸素レベル依存性発現後の一定期間後に、細菌を死滅させるように活性化させる。一部の実施形態では、キルスイッチを、ａｒｇ^Ａｆｂｒの酸素レベル依存性発現後に遅れて活性化させる。

【0141】

キルスイッチは、毒素が環境条件または外部シグナルに応答して生成されるように設計する（例えば、細菌が外部刺激に応答して死滅する）、または、代わりに、いったん環境条件が存在しなくなる、もしくは外部シグナルが止まると毒素が生成されるように設計することが可能である。

【0142】

したがって、一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作した細菌を、例えば低酸素環境において外因性環境シグナルを感知した後に死滅するように、さらにプログラミングする。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作した細菌、例えばａｒｇ^ＡｆｂｒおよびリプレッサＡｒｇＲを発現する細菌は、１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子を含み、その発現は環境条件またはシグナルに応答して誘導され、細胞を死滅させる毒素の発現に最終的には至る、１つまたは複数の組換え事象を引き起こす。一部の実施形態では、少なくとも１つの組換え事象とは、細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングであり、該毒素は次に、第１リコンビナーゼによりフリッピングした後に構成的に発現する。一実施形態では、細菌毒素の構成的発現は遺伝子操作した細菌を死滅させる。これらのタイプのキルスイッチ系では、いったん遺伝子操作した細菌細胞が外因性環境条件を感知し、対象の異種遺伝子を発現したら、組換え細菌細胞はもはや生存不可である。

【0143】

本開示の遺伝子操作した細菌、例えば、ａｒｇ^ＡｆｂｒおよびリプレッサＡｒｇＲを発現する細菌が、少なくとも１つの組換え事象を引き起こす環境条件またはシグナルに応答して、１つまたは複数のリコンビナーゼを発現する別の実施形態では、遺伝子操作した細菌はさらに、外因性の環境条件またはシグナルに応答して、抗毒素をコードする異種遺伝子を発現する。一実施形態では、少なくとも１つの組換え事象とは、第１リコンビナーゼによる、細菌毒素をコードした逆方向異種遺伝子のフリッピングである。一実施形態では、細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子は、第１フォワードリコンビナーゼ認識配列と、第１リバースリコンビナーゼ認識配列の間に位置する。一実施形態では、細菌毒素をコードする異種遺伝子は、第１リコンビナーゼによりフリッピングした後に構成的に発現する。一実施形態では、抗毒素は毒素の活性を阻害し、それにより遺伝子操作した細菌の死滅を遅らせる。一実施形態では、遺伝子操作した細菌は、外因性の環境条件がもはや存在せず、抗毒素をコードした異種遺伝子がもはや発現しない場合に、細菌毒素により死滅する。

【0144】

別の実施形態では、少なくとも１つの組換え事象とは、第１リコンビナーゼにより第２リコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子がフリッピングし、その後、第２リコンビナーゼにより細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子がフリッピングすることである。一実施形態では、第２リコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子は、第１フォワードリコンビナーゼ認識配列と、第１リバースリコンビナーゼ認識配列の間に位置する。一実施形態では、細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子は、第２フォワードリコンビナーゼ認識配列と、第２リバースリコンビナーゼ認識配列の間に位置する。一実施形態では、第２リコンビナーゼをコードする異種遺伝子は、第１リコンビナーゼによりフリッピングした後に構成的に発現する。一実施形態では、細菌毒素をコードする異種遺伝子は、第２リコンビナーゼによりフリッピングした後に構成的に発現する。一実施形態では、遺伝子操作した細菌は細菌毒素により死滅する。一実施形態では、遺伝子操作した細菌はさらに、外因性の環境条件に応答して抗毒素をコードする異種遺伝子を発現する。一実施形態では、抗毒素は、外因性の環境条件が存在する場合に毒素の活性を阻害し、それにより遺伝子操作した細菌の死滅を遅らせる。一実施形態では、遺伝子操作した細菌は、外因性の環境条件がもはや存在せず、抗毒素をコードする異種遺伝子がもはや発現しない場合に、細菌毒素によって死滅する。

【0145】

一実施形態では、少なくとも１つの組換え事象とは、第１リコンビナーゼにより、第２リコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子がフリッピングし、その後、第２リコンビナーゼにより、第３リコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子がフリッピングし、その後、第３リコンビナーゼにより、細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子がフリッピングすることである。

【0146】

一実施形態では、少なくとも１つの組換え事象とは、第１リコンビナーゼにより、第１除去酵素をコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングである。一実施形態では、第１除去酵素をコードする逆方向異種遺伝子は、第１フォワードリコンビナーゼ認識配列と、第１リバースリコンビナーゼ認識配列の間に位置する。一実施形態では、第１除去酵素をコードする異種遺伝子は、第１リコンビナーゼによりフリッピングした後、構成的に発現する。一実施形態では、第１除去酵素は、第１必須遺伝子を除去する。一実施形態では、プログラムされた組換え細菌細胞は、第１必須遺伝子が除去された後は生存不可である。

【0147】

一実施形態では、第１リコンビナーゼはさらに、第２除去酵素をコードする逆方向異種遺伝子をフリッピングする。一実施形態では、第２除去酵素をコードする逆方向異種遺伝子は、第２フォワードリコンビナーゼ認識配列と、第２リバースリコンビナーゼ認識配列の間に位置する。一実施形態では、第２除去酵素をコードする異種遺伝子は、第１リコンビナーゼによりフリッピングした後、構成的に発現する。一実施形態では、遺伝子操作した細菌は、第１必須遺伝子および第２必須遺伝子が両方除去された後は、死滅するか、または、もはや生存不可である。一実施形態では、遺伝子操作した細菌は、第１リコンビナーゼにより、第１必須遺伝子が除去されるか、または第２必須遺伝子が除去されるかのいずれかの場合で、死滅するか、または、もはや生存不可である。

【0148】

一実施形態では、遺伝子操作した細菌は、少なくとも１つの組換え事象が起きた後に死滅する。別の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、少なくとも１つの組換え事象が起きた後にもはや生存不可である。

【0149】

これらの実施形態のいずれかにおいて、リコンビナーゼは、ＢｘｂＩ、ＰｈｉＣ３１、ＴＰ９０１、ＢｘｂＩ、ＰｈｉＣ３１、ＴＰ９０１、ＨＫ０２２、ＨＰ１、Ｒ４、Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３、Ｉｎｔ４、Ｉｎｔ５、Ｉｎｔ６、Ｉｎｔ７、Ｉｎｔ８、Ｉｎｔ９、Ｉｎｔ１０、Ｉｎｔ１１、Ｉｎｔ１２、Ｉｎｔ１３、Ｉｎｔ１４、Ｉｎｔ１５、Ｉｎｔ１６、Ｉｎｔ１７、Ｉｎｔ１８、Ｉｎｔ１９、Ｉｎｔ２０、Ｉｎｔ２１、Ｉｎｔ２２、Ｉｎｔ２３、Ｉｎｔ２４、Ｉｎｔ２５、Ｉｎｔ２６、Ｉｎｔ２７、Ｉｎｔ２８、Ｉｎｔ２９、Ｉｎｔ３０、Ｉｎｔ３１、Ｉｎｔ３２、Ｉｎｔ３３、およびＩｎｔ３４から成る群から選択されるリコンビナーゼ、またはその生物学的に活性な断片であり得る。

【0150】

上記のキルスイッチ回路では、毒素は環境因子またはシグナルの存在下で生成される。キルスイッチ回路の別の態様では、毒素は環境因子の存在下で阻害され（生成されない）、その後、いったん環境条件またはシグナルがもはや存在しなくなれば生成される。毒素が外部因子またはシグナルの存在下で阻害される（そして、いったん外部シグナルが除去されれば活性化する）例示的なキルスイッチを、図３９、４０、６２、および６３に示す。本開示は、外因性環境においてアラビノースまたは他の糖を感知した際に１つまたは複数の異種遺伝子を発現させる組換え細菌細胞を提供する。この態様では、組換え細菌細胞はａｒａＣ遺伝子を含有し、これは、ａｒａＢＡＤプロモータの制御下で、１つまたは複数の遺伝子と同様にＡｒａＣ転写因子をコードする。アラビノースがない場合、ＡｒａＣ転写因子は、ａｒａＢＡＤプロモータの制御下で遺伝子の転写を阻害する配座をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子の配座は変化し、これは、それがＡｒａＢＡＤプロモータに結合し、該プロモータを活性化させることを可能にし、これは所望の遺伝子の発現を誘導する。

【0151】

したがって、１つまたは複数の異種遺伝子が外因性環境においてアラビノースを感知すると発現する、一部の実施形態では、１つまたは複数の異種遺伝子は、直接的または間接的に、ａｒａＢＡＤの制御下にある。一部の実施形態では、発現する異種遺伝子は、以下の、異種治療遺伝子、抗毒素をコードする異種遺伝子、リプレッサタンパク質もしくはポリペプチドをコードする異種遺伝子、例えばＴｅｔＲリプレッサ、細菌細胞に見られない必須タンパク質をコードする異種遺伝子、および／または、調節タンパク質もしくはポリペプチドをコードする異種のうちの１つまたは複数から選択される。

【0152】

アラビノース誘導性プロモータは、Ｐ_ａｒａ、Ｐ_ａｒａＢ、Ｐ_ａｒａＣ、およびＰ_{ａｒａＢＡＤ}を含め_、当技術分で既知である。一実施形態では、アラビノース誘導性プロモータは大腸菌由来である。一部の実施形態では、Ｐ_ａｒａＣプロモータおよびＰ_{ａｒａＢＡＤ}プロモータは二方向性のプロモータとして機能し、Ｐ_{ａｒａＢＡＤ}プロモータは一方の方向で異種遺伝子の発現を制御し、（Ｐ_{ａｒａＢＡＤ}プロモータにごく接近し、Ｐ_{ａｒａＢＡＤ}プロモータとは逆鎖にある）Ｐ_ａｒａＣはもう一方の方向で異種遺伝子の発現を制御する。アラビノースの存在下では、両プロモータから両異種遺伝子の転写が誘導される。しかしながら、アラビノースがない場合は、両プロモータから両異種遺伝子の転写は誘導されない。

【0153】

本開示の例示的な一実施形態では、本開示の遺伝子操作した細菌は、少なくとも以下の配列：テトラサイクリンリプレッサタンパク質（ＴｅｔＲ）をコードした異種遺伝子に操作可能に連結したＰ_{ａｒａＢＡＤ}プロモータ、ＡｒａＣ転写因子をコードした異種遺伝子に操作可能に連結したＰ_ａｒａＣプロモータ、および、テトラサイクリンリプレッサタンパク質により阻害されるプロモータ（Ｐ_ＴｅｔＲ）に操作可能に連結した細菌毒素をコードする異種遺伝子を有するキルスイッチを含有する。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子はＰ_{ａｒａＢＡＤ}プロモータを活性化し、これはＴｅｔＲタンパク質の転写を活性化し、これは次に、毒素の転写を阻害する。しかしながら、アラビノースがない場合は、ＡｒａＣはＰ_{ａｒａＢＡＤ}プロモータからの転写を抑制し、ＴｅｔＲタンパク質は発現しない。この場合、異種毒素遺伝子の発現が活性化され、毒素が発現する。毒素は組換え細菌細胞において蓄積され、組換え細菌細胞は死滅する。一実施形態では、ＡｒａＣ転写因子をコードするＡｒａＣ遺伝子は、構成的プロモータの制御下にあり、そのため構成的に発現する。

【0154】

本開示の一実施形態では、組換え細菌細胞はさらに、構成的プロモータの制御下で抗毒素を含む。この状況では、アラビノースの存在下では、毒素はＴｅｔＲタンパク質による阻害により発現せず、抗毒素タンパク質は細胞内に蓄積される。しかしながら、アラビノースがない場合、ＴｅｔＲタンパク質は発現せず、毒素の発現が誘導される。毒素は組換え細菌細胞内で蓄積され始める。組換え細菌細胞は、いったん毒素タンパク質が細胞内の抗毒素タンパク質と等しいか、またはそれより多い量で存在するともはや生存不可であり、組換え細菌細胞は毒素により死滅させられるだろう。

【0155】

本開示の別の実施形態では、組換え細菌細胞はさらに、Ｐ_{ａｒａＢＡＤ}プロモータの制御下で抗毒素を含む。この状況では、アラビノースの存在下で、ＴｅｔＲおよび抗毒素が発現し、抗毒素は細胞内で蓄積され_、毒素はＴｅｔＲタンパク質による阻害により発現しない。しかしながら、アラビノースがない場合は、ＴｅｔＲタンパク質と抗毒素の両方が発現せず、毒素の発現が誘導される。毒素は組換え細菌細胞内で蓄積され始める。組換え細菌細胞は、いったん毒素タンパク質が発現したらもはや生存不可であり、組換え細菌細胞は毒素により死滅させられるだろう。

【0156】

本開示の別の例示的な実施形態では、本開示の遺伝子操作した細菌は、少なくとも以下の配列：組換え細菌細胞に見られない（生存のために必要な）必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に操作可能に連結したＰ_{ａｒａＢＡＤ}プロモータ、および、ＡｒａＣ転写因子をコードする異種遺伝子に操作可能に連結したＰ_ａｒａＣプロモータを有するキルスイッチを含有する。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子はＰ_{ａｒａＢＡＤ}プロモータを活性化し、これは必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子の転写を活性化し、組換え細菌が生存することを可能にする。しかしながら、アラビノースがない場合は、ＡｒａＣはＰ_{ａｒａＢＡＤ}プロモータからの転写を抑制し、生存に必要な必須タンパク質は発現しない。この場合、組換え細菌細胞はアラビノースの非存在下で死滅する。一部の実施形態では、組換え細菌細胞に見られない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に操作可能に連結したＰ_{ａｒａＢＡＤ}プロモータの配列は、上で直接記載したＴｅｔＲ／毒素キルスイッチ系と共に細菌細胞内に存在し得る。一部の実施形態では、組換え細菌細胞に見られない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に操作可能に連結したＰ_{ａｒａＢＡＤ}プロモータの配列は、上で直接記載したＴｅｔＲ／毒素／抗毒素キルスイッチシステム系と共に細菌細胞内に存在し得る。

【0157】

一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作した細菌、例えば、ａｒｇ^ＡｆｂｒとリプレッサＡｒｇＲを発現する細菌はさらに、上記のキルスイッチ回路の何れかのコンポーネントをコードする遺伝子を含む。

【0158】

上記の実施形態の何れかにおいて、細菌毒素は、リシン、Ｈｏｋ、Ｆｓｔ、ＴｉｓＢ、ＬｄｒＤ、Ｋｉｄ、ＳｙｍＥ、ＭａｚＦ、ＦｌｍＡ、Ｉｂｓ、ＸＣＶ２１６２、ｄｉｎＪ、ＣｃｄＢ、ＭａｚＦ、ＰａｒＥ、ＹａｆＯ、Ｚｅｔａ、ｈｉｃＢ、ｒｅｌＢ、ｙｈａＶ、ｙｏｅＢ、ｃｈｐＢＫ、ｈｉｐＡ、ミクロシンＢ、ミクロシンＢ１７、ミクロシンＣ、ミクロシンＣ７−Ｃ５１、ミクロシンＪ２５、ミクロシンＣｏｌＶ、ミクロシン２４、ミクロシンＬ、ミクロシンＤ９３、ミクロシンＬ、ミクロシンＥ４９２、ミクロシンＨ４７、ミクロシンＩ４７、ミクロシンＭ、コリシンＡ、コリシンＥ１、コリシンＫ、コリシンＮ、コリシンＵ、コリシンＢ、コリシンＩａ、コリシンＩｂ、コリシン５、コリシン１０、コリシンＳ４、コリシンＹ、コリシンＥ２、コリシンＥ７、コリシンＥ８、コリシンＥ９、コリシンＥ３、コリシンＥ４、コリシンＥ６；コリシンＥ５、コリシンＤ、コリシンＭ、およびクロアシンＤＦ１３からなる群または生物学的に活性なその断片から選択される。

【0159】

上記の実施形態の何れかでは、抗毒素は、抗リシン、Ｓｏｋ、ＲＮＡＩＩ、ＩｓｔＲ、ＲｄｌＤ、Ｋｉｓ、ＳｙｍＲ、ＭａｚＥ、ＦｌｍＢ、Ｓｉｂ、ｐｔａＲＮＡ１、ｙａｆＱ、ＣｃｄＡ、ＭａｚＥ、ＰａｒＤ、ｙａｆＮ、Ｅｐｓｉｌｏｎ、ＨｉｃＡ、ｒｅｌＥ、ｐｒｌＦ、ｙｅｆＭ、ｃｈｐＢＩ、ｈｉｐＢ、ＭｃｃＥ、ＭｃｃＥ^ＣＴＤ、ＭｃｃＦ、Ｃａｉ、ＩｍｍＥ１、Ｃｋｉ、Ｃｎｉ、Ｃｕｉ、Ｃｂｉ、Ｉｉａ、Ｉｍｍ、Ｃｆｉ、Ｉｍ１０、Ｃｓｉ、Ｃｙｉ、Ｉｍ２、Ｉｍ７、Ｉｍ８、Ｉｍ９、Ｉｍ３、Ｉｍ４、ＩｍｍＥ６、クロアシン免疫タンパク質（Ｃｉｍ）、ＩｍｍＥ５、ＩｍｍＤ、およびＣｍｉからなる群または生物学的に活性なその断片から選択される。

【0160】

一実施形態では、細菌毒素は遺伝子操作した細菌に対し殺菌性である。一実施形態では、細菌毒素は、遺伝子操作した細菌に対し静菌性である。

【0161】

一部の実施形態では、本明細書で提供する操作した細菌は、アルギニン生合成経路においてグルタミンからアルギニンおよびまたは中間副生成物、例えばシトルリンへの変換を担う酵素をコードするオペロンそれぞれの、アルギニン介在性阻害を低減または消失させる１つまたは複数の核酸突然変異を含むアルギニンレギュロンを有し、その結果、突然変異アルギニンレギュロンは、同一条件下の同じ細菌サブタイプに由来する非改変レギュロンよりも多くのアルギニンおよび／または中間副生成物を生成する。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えばａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノスクシネートシンターゼ、アルギニノスクシネートリアーゼ、およびカルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロンそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の拡散突然変異を含む、突然変異アルギニンレギュロンを含み、それによりレギュロンの阻害を解除し、アルギニンおよび／または中間副生成物の生合成を強化する。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はさらに、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体を含む。一部の実施形態では、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体は、酸素レベル依存性プロモータにより制御される。一部の実施形態では、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体は、低酸素または嫌気的な条件下で誘導されるプロモータにより制御される。一部の実施形態では、プロモータは、フマル酸・硝酸レダクターゼレギュレータ（ＦＮＲ）プロモータ、アルギニンデイミナーゼ・硝酸還元（ＡＮＲ）プロモータ、および異化型硝酸呼吸レギュレータ（ＤＮＲ）プロモータから選択される。一部の実施形態では、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体は、ａｒｇＡ^ｆｂｒである。

【0162】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の核酸突然変異を含む、突然変異アルギニンレギュロンと、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は突然変異アルギニンレギュロンを含み、ここにおいて該細菌は、同一条件下の同じ細菌サブタイプに由来する野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼと比較し、アルギニンフィードバック阻害を低減させるように突然変異させた機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードする遺伝子を含み、突然変異Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードする遺伝子の発現は、低酸素または嫌気的な条件下で誘導されるプロモータにより制御され、突然変異アルギニンレギュロンは、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタメートリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノスクシネートシンターゼ、およびアルギニノスクシネートリアーゼをコードする遺伝子を含む１つまたは複数のオペロンを含み、各オペロンは、ＡｒｇＲリプレッサ結合を介したオペロンのアルギニン介在性阻害を低減させる、１つまたは複数の核酸突然変異によって特徴付けられる１つまたは複数の突然変異ＡＲＧボックスを含み、オペロン内の遺伝子の転写を促進するのに十分な親和性を有するＲＮＡポリメラーゼ結合を保持する。

【0163】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の核酸突然変異を含む、突然変異アルギニンレギュロンと、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体とを含む栄養要求株である。一実施形態では、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の核酸突然変異を含む、突然変異アルギニンレギュロンと、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体とを含む遺伝子操作した細菌は、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉ１の栄養要求株から選択される栄養要求株である。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は２つ以上の栄養要求性を有し、例えば、それらはΔｔｈｙＡ栄養要求株およびΔｄａｐＡ栄養要求株である。

【0164】

一部の実施形態では、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の核酸突然変異を含む、突然変異アルギニンレギュロンと、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体とを含む遺伝子操作した細菌は、さらに、本明細書で提供する何れかのキルスイッチ回路などのキルスイッチ回路を含む。例えば、一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はさらに、誘導性プロモータの制御下にある１つまたは複数のリコンビナーゼと、逆方向の毒素配列とをコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はさらに、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はさらに、誘導性プロモータの制御下にある１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子と、１つまたは複数の逆方向除去遺伝子とを含み、ここにおいて該除去遺伝子は、必須遺伝子を削除する酵素をコードする。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はさらに、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はさらに、ＴｅｔＲリプレッサ結合部位を有するプロモータの制御下にある毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子と、ＰａｒａＢＡＤなどのアラビノースにより誘導される誘導性プロモータの制御下にあるＴｅｔＲをコードする遺伝子とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はさらに、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。

【0165】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の核酸突然変異を含む、突然変異アルギニンレギュロンと、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体とを含む栄養要求株であり、さらに、本明細書に記載のキルスイッチ回路の何れかなどの、キルスイッチ回路を含む。

【0166】

上記の遺伝子操作した細菌の一部の実施形態では、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードする遺伝子は、細菌のプラスミドに存在し、プラスミドにおいて、低酸素または嫌気的な条件下で誘導されるプロモータに操作可能に連結する。他の実施形態では、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードする遺伝子は細菌の染色体に存在し、染色体において、低酸素または嫌気的な条件下で誘導されるプロモータに操作可能に連結する。

【0167】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンリプレッサを含み、その結果、アルギニンリプレッサの機能は低減もしくは不活化するか、または、遺伝子操作した細菌はアルギニンリプレッサを有さず（例えば、アルギニンリプレッサ遺伝子が削除されている）、レギュロンの阻害解除ならびに、アルギニンおよび／もしくは中間副生成物の生合成の強化がもたらされる。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はさらに、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体を含む。一部の実施形態では、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体は、酸素レベル依存性プロモータにより制御される。一部の実施形態では、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体は、低酸素または嫌気的な条件下で誘導されるプロモータにより制御される。一部の実施形態では、プロモータは、フマル酸・硝酸レダクターゼレギュレータ（ＦＮＲ）プロモータ、アルギニンデイミナーゼ・硝酸還元（ＡＮＲ）プロモータ、および異化型硝酸呼吸レギュレータ（ＤＮＲ）プロモータから選択される。一部の実施形態では、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体は、ａｒｇＡ^ｆｂｒである。

【0168】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、突然変異したアルギニンリプレッサを含むか、またはアルギニンリプレッサは削除されており、そして、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はアルギニンレギュロンを含み、ここにおいて細菌は、同一条件下の同じ細菌サブタイプに由来する野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼと比較しアルギニンフィードバック阻害が低減した機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードする遺伝子を含み、ここにおいてアルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードする遺伝子の発現は、外因性の環境条件により誘導されるプロモータにより制御され、細菌は機能性ＡｒｇＲリプレッサを欠くように遺伝子操作されている。

【0169】

一部の実施形態では、突然変異アルギニンリプレッサを含むか、またはアルギニンリプレッサが削除されており、そして、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体を含む遺伝子操作した細菌は、栄養要求株である。一実施形態では、突然変異アルギニンリプレッサを含むか、またはアルギニンリプレッサは削除されており、そして、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体を含む遺伝子操作した細菌は、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉ１の栄養要求株から選択される栄養要求株である。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は２つ以上の栄養要求性を有し、例えば、それらはΔｔｈｙＡ栄養要求株およびΔｄａｐＡ栄養要求株である。

【0170】

一部の実施形態では、突然変異アルギニンリプレッサを含むか、またはアルギニンリプレッサは削除されており、そして、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体を含む遺伝子操作した細菌はさらに、本明細書で提供するキルスイッチ回路の何れかなどのキルスイッチ回路を含む。例えば、一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はさらに、誘導性プロモータの制御下にある１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子と、逆方向の毒素配列をコードする１つまたは複数の遺伝子とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はさらに、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はさらに、誘導性プロモータの制御下にある１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子と、１つまたは複数の逆方向除去遺伝子を含み、ここにおいて該除去遺伝子は、必須遺伝子を削除する酵素をコードする。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はさらに、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はさらに、ＴｅｔＲリプレッサ結合部位を有するプロモータの制御下にある毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子と、ＰａｒａＢＡＤなどのアラビノースにより誘導される誘導性プロモータの制御下にあるＴｅｔＲをコードする遺伝子とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌はさらに、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。

【0171】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、突然変異アルギニンリプレッサを含むか、またはアルギニンリプレッサは削除されており、そして、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体を含む栄養要求株であり、さらに、本明細書に記載のキルスイッチ回路の何れかなどの、キルスイッチ回路を含む。

【0172】

上記の遺伝子操作した細菌の一部の実施形態では、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子は細菌のプラスミドに存在し、プラスミドにおいて、低酸素または嫌気的な条件下で誘導されるプロモータに、操作可能に連結する。他の実施形態では、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼは細菌の染色体に存在し、染色体において、低酸素または嫌気的な条件下で誘導されるプロモータに、操作可能に連結する。

【0173】

アンモニア輸送
細胞へのアンモニア輸送を強化するために、アンモニア輸送体を本発明の遺伝子操作した細菌において発現または改変することができる。ａｍｔＢは、アンモニアを細菌細胞に輸送する膜輸送タンパク質である。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌はまた、天然ａｍｔＢ遺伝子の多数のコピーを含む。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌はまた、異なる細菌種に由来するａｍｔＢ遺伝子を含む。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌は、異なる細菌種に由来するａｍｔＢ遺伝子の多数のコピーを含む。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌の天然ａｍｔＢ遺伝子は、改変されていない。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌は、その天然プロモータ、誘導性プロモータ、天然プロモータよりも強力なプロモータ、例えば、ＧｌｎＲＳプロモータ、Ｐ（Ｂｌａ）プロモータ、または構成的プロモータにより制御されるａｍｔＢ遺伝子を含む。

【0174】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌の天然ａｍｔＢ遺伝子は改変されておらず、天然ａｍｔＢ遺伝子の１つまたは複数の追加コピーが、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものと同一の誘導性プロモータ、例えばＦＮＲプロモータ、または、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモータ、または、構成的プロモータの制御下で、ゲノムに挿入される。代替の実施形態では、天然ａｍｔＢ遺伝子は改変されておらず、異なる細菌種に由来する非天然ａｍｔＢ遺伝子のコピーが、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものと同一の誘導性プロモータ、例えばＦＮＲプロモータ、または、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモータ、または構成的プロモータの制御下で、ゲノムに挿入される。

【0175】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌の天然ａｍｔＢ遺伝子は改変されておらず、天然ａｍｔＢ遺伝子の１つまたは複数の追加コピーが、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものと同一の誘導性プロモータ、例えばＦＮＲプロモータ、または、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモータ、または構成的プロモータの制御下で、細菌のプラスミドに存在する。代替の実施形態では、天然ａｍｔＢ遺伝子は改変されておらず、異なる細菌種に由来する非天然ａｍｔＢ遺伝子のコピーが、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものと同一の誘導性プロモータ、例えばＦＮＲプロモータ、または、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモータ、または構成的プロモータの制御下で、細菌のプラスミドに存在する。

【0176】

一部の実施形態では、天然ａｍｔＢ遺伝子を突然変異誘発させ、アンモニア輸送の増大を示す突然変異体を選択し、突然変異誘発ａｍｔＢ遺伝子を単離し、遺伝子操作した細菌に挿入する。一部の実施形態では、天然ａｍｔＢ遺伝子を突然変異誘発させ、アンモニア輸送の増大を示す突然変異体を選択し、その突然変異体を用いて本発明の細菌を生成する。本明細書に記載のアンモニア輸送体改変体はプラスミドまたは染色体に存在し得る。

【0177】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅであり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの天然ａｍｔＢ遺伝子は改変されず、天然大腸菌ＮｉｓｓｌｅのａｍｔＢ遺伝子の１つまたは複数の追加コピーが、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものと同一の誘導性プロモータ、例えばＦＮＲプロモータ、または、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモータ、または構成的プロモータの制御下で、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノムに挿入される。代替の実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの天然ａｍｔＢ遺伝子は改変されず、異なる細菌、例えばラクトバチルス・プランタルムに由来する非天然ａｍｔＢ遺伝子のコピーが、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものと同一の誘導性プロモータ、例えばＦＮＲプロモータ、または、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモータ、または構成的プロモータの制御下で、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノムに挿入される。

【0178】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅであり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの天然ａｍｔＢ遺伝子は改変されず、天然大腸菌ＮｉｓｓｌｅのａｍｔＢ遺伝子の１つまたは複数の追加コピーが、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものと同一の誘導性プロモータ、例えばＦＮＲプロモータ、または、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモータ、または構成的プロモータの制御下で、細菌のプラスミドに存在する。代替の実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの天然ａｍｔＢ遺伝子は改変されず、異なる細菌、例えばラクトバチルス・プランタルムに由来する非天然ａｍｔＢ遺伝子のコピーが、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものと同一の誘導性プロモータ、例えばＦＮＲプロモータ、または、ａｒｇＡ^ｆｂｒの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモータ、または構成的プロモータの制御下で、細菌のプラスミドに存在する。

【0179】

医薬組成物および製剤
本発明の遺伝子操作した細菌を含む医薬組成物を用いて、高アンモニア血症に関連する疾患または高アンモニア血症に関連する症状を処置し、管理し、改善させ、および／または予防することができる。１つまたは複数の遺伝子操作した細菌を含む本発明の医薬組成物は、単独で、または、予防薬、治療薬、および／もしくは薬学的に許容される担体と組み合わせて提供される。

【0180】

ある実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子改変体、例えば、突然変異アルギニンレギュロンを含むように操作した１つの種、株、またはサブタイプの細菌を含む。代替の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子改変体、例えば、突然変異アルギニンレギュロンを含むように操作した２つ以上の種、株、および／またはサブタイプの細菌を含む。

【0181】

本発明の医薬組成物は、有効成分を処理して医薬用途向けの組成物にすることを容易にする賦形剤および助剤を含む、１つまたは複数の生理学的に許容される担体を用いて、従来の方式で製剤化され得る。医薬組成物を製剤化する方法は当技術分野で既知である（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，” Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡを参照）。一部の実施形態では、医薬組成物を、錠剤化、凍結乾燥、直接圧縮、従来型の混合、溶解、造粒、粉末化、乳化、カプセル化、封入、噴霧乾燥して、錠剤、顆粒、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、マイクロタブレット、ペレット、または粉末を形成するが、これらは腸溶コーティングされる場合もされない場合もある。適切な製剤は投与経路によって決まる。

【0182】

本発明の遺伝子操作した細菌は、任意の適切な剤形（例えば、液体、カプセル、サシェ、硬カプセル、軟カプセル、錠剤、腸溶錠、懸濁液用粉末、顆粒、または経口投与用のマトリックス徐放性形態）で、任意の適切な投与形式（例えば、経口性、局所性、即時放出性、拍動放出性、遅延放出性、または徐放性）用に、医薬組成物に製剤化することができる。遺伝子操作した細菌の適切な投与量は、約１０^５〜１０^１２細菌に及び得る。組成物は、日毎、週毎、または月毎に１回または複数回投与することができる。遺伝子操作した細菌は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、界面活性剤、中性又はカチオン性の脂質、脂質複合体、リポソーム、浸透増強剤、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体または薬剤を含む医薬組成物に製剤化し得る。

【0183】

本発明の遺伝子操作した細菌は、局所的に投与することができ、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、水剤、エマルジョンの形態、および当業者に周知の他の形態に製剤化することができる。例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，” Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡを参照。一実施形態では、噴霧不可の局所的剤形として、局所適用に適合した担体または１つもしくは複数の賦形剤を含み、水よりも動粘度の高い粘性形態〜半固形または固形を用いる。適切な製剤としては、限定されるわけではないが、水剤、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、散剤、塗布薬、膏薬などが挙げられ、これは滅菌するか、または、種々の特性、例えば浸透圧に影響を与えるために助剤（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤、もしくは塩）と混ぜることができる。他の適切な局所剤形には噴霧可能なエアゾール製剤が含まれ、ここでは、固体または液体の不活性担体と組み合わさった有効成分が、加圧された揮発性物質（例えば、フレオンなどのガス状噴霧剤）との混合物か、または、スクイズ容器にパッケージ化される。保湿剤または湿潤剤も医薬組成物および剤形に加えることが可能である。このような追加成分の例は当技術分野で周知である。

【0184】

本発明の遺伝子操作した細菌は、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤などとして、経口投与および製剤化し得る。経口用の薬理組成物を、所望により適切な助剤を加えた後に固形賦形剤を用いて作成し、オプションとして、結果として生じる混合物を粉砕し、顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠のコアを得ることが可能である。適切な賦形剤としては、限定されるわけではないが、ラクトース、スクロース、マンニトール、もしくはソルビトールを含む糖などの充填材；トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなどのセルロース組成物；および／または、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの生理学的に許容されるポリマーが挙げられる。架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどのそれらの塩などの崩壊剤も加えることができる。

【0185】

錠剤またはカプセルは、薬学的に許容される、結合剤などの賦形剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、スクロース、グルコース、ソルビトール、デンプン、ガム、カオリン、およびトラガカント）；充填材（例えば、ラクトース、結晶セルロース、もしくはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、カルシウム、アルミニウム、亜鉛、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、安息香酸ナトリウム、Ｌ−ロイシン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、もしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、デンプン、ジャガイモデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、糖、セルロース誘導体、シリカ粉末）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて従来の手段により調製することが可能である。錠剤は、当技術分野で周知の方法によりコーティングすることができる。コーティングの外殻が存在する場合があり、共通の膜としては、限定されるわけではないが、ポリラクチド、ポリグリコール酸、ポリ酸無水物、他の生分解性ポリマー、アルギナート−ポリリジンリシン−アルギナート（ＡＰＡ）、アルギナート−ポリメチレン−ｃｏ−グアニジン−アルギナート（Ａ−ＰＭＣＧ−Ａ）、ヒドロキシメチルアクリレート−メチルメタクリレート（ＨＥＭＡ−ＭＭＡ）、多層ＨＥＭＡ−ＭＭＡ−ＭＡＡ、ポリアクリロニトリルビニルクロライド（ＰＡＮ−ＰＶＣ）、アクリロニトリル／メタリルスルホン酸ナトリウム（ＡＮ−６９）、ポリエチレングリコール／ポリペンタメチルシクロペンタシロキサン／ポリジメチルシロキサン（ＰＥＧ／ＰＤ５／ＰＤＭＳ）、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡＡｍ）、シリカ被包、セルロースサルフェート／アルギン酸ナトリウム／ポリメチレン−ｃｏ−グアニジン（ＣＳ／Ａ／ＰＭＣＧ）、セルロースアセテートフタレート、アルギン酸カルシウム、ｋ−カラギーナン−ローカストビーンガムゲルビーズ、ゲラン−キサンタンビーズ、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、カラギーナン、ポリデンプン無水物、デンプンポリメタクリレート、ポリアミノ酸、および腸溶性コーティングポリマーが挙げられる。

【0186】

一部の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、消化管または消化管の特定領域、例えば大腸への放出向けに腸溶コーティングする。胃から結腸の典型的なｐＨプロファイルは約１〜４（胃）、５．５〜６（十二指腸）、７．３〜８．０（回腸）、および５．５〜６．５（結腸）である。一部の病気では、ｐＨプロファイルは変わり得る。一部の実施形態では、コーティングは、放出部位を特定するために、特定のｐＨ環境で分解される。一部の実施形態では、少なくとも２つのコーティングを用いる。一部の実施形態では、外側のコーティングと内側のコーティングは、異なるｐＨ値で分解される。

【0187】

経口投与向けの液体製剤は、水剤、シロップ、懸濁剤、または、使用前に水もしくは他の適切な溶媒と構成物をなす乾燥品の形態をとることができる。このような液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用油脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画化植物油）；および保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容される薬剤とともに従来の手段により調製することができる。製剤はまた、緩衝塩、着香剤、着色剤、および甘味剤を適宜含んでよい。経口投与向けの製剤は、本発明の遺伝子操作した細菌を徐放、制御放出、または持続放出するために適切に製剤化することができる。

【0188】

ある実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌は、例えば不活性希釈剤または吸収可能な可食担体とともに、経口投与することができる。化合物はまた、硬殻または軟殻のゼラチンカプセルに封入すること、錠剤に圧縮すること、または、対象の食事に直接組み込むことができる。経口治療的投与のために、化合物に賦形剤を組み込むことができ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、およびウエハなどの形態で用いることができる。本発明の化合物を非経口投与以外により投与するため、化合物をその不活性化を防ぐ物質でコーティングするか、または、化合物を該物質と同時投与する必要がある場合がある。

【0189】

一部の実施形態では、組成物を、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、またはマイクロタブレットを介した小腸内投与、空腸内投与、十二指腸内投与、回腸内投与、胃シャント投与、または結腸内投与のために製剤化するが、これは腸溶コーティングされる場合もされない場合もある。本発明の医薬組成物はまた、例えば、ココアバターもしくは他のグリセリドといった従来の坐剤基剤を用いて、座薬または停留浣腸などの直腸組成物に製剤化することができる。組成物は、懸濁剤、水剤、または油性もしくは水性媒体のエマルジョンとすることができ、懸濁剤、安定剤、および／または拡散剤を含んでよい。

【0190】

本発明の遺伝子操作した細菌は、鼻腔内に投与し、エアロゾル形態、スプレー、ミスト、または液滴の形態で製剤化し、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガス）の使用で、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で好都合に送達することができる。加圧式エアロゾルの投薬ユニットは、計量された量を送達するバルブを提供することにより決定され得る。吸入器または注入器で使用する（例えば、ゼラチン製の）カプセルおよびカートリッジは、化合物とラクトースまたはデンプンのような適切な粉末基剤との粉末混合物を含有して製剤化され得る。

【0191】

本発明の遺伝子操作した細菌は、デポ剤として投与および製剤化することができる。このような長く作用する製剤は、注入または注射により投与することができる。例えば、組成物は、適切なポリマー性もしくは疎水性の物質とともに（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）製剤化するか、またはイオン交換樹脂とともに製剤化するか、または、やや難溶の誘導体として（例えばやや難溶の塩として）製剤化することができる。

【0192】

一部の実施形態では、本発明は、単一剤形で薬学的に許容される組成物を提供する。単一剤形は、液状形態または固形であってよい。単一剤形は、改変なしに患者に直接投与するか、または、投与前に希釈もしくは再構成することができる。ある実施形態では、単一剤形は、ボーラス形態、例えば、単回注射、および多数の錠剤、カプセル、ピルなどを含む経口用量を含む単回経口用量で投与することができる。代替の実施形態では、単回剤形を、例えば注入により、ある期間にわたり投与することができる。

【0193】

本発明の医薬組成物の単一剤形は、医薬組成物をより小さいアルコット、単一用量容器、単一用量液状形態、または錠剤、顆粒、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、マイクロタブレット、ペレット、もしくは粉末などの単一用量固形に分割することにより調製することができ、これは腸溶コーティングされる場合もされない場合もある。固形中の単一用量は、患者に投与する前に、液体、典型的には滅菌水または生理食塩液を加えることにより再構成することができる。

【0194】

投与計画は、治療反応が提供されるように調節することができる。例えば、単一ボーラスを一度に投与すること、いくつかに分割された用量を所定の期間にわたり投与すること、または、用量を治療状況が示唆するように増減させることができる。投与量の仕様は、活性化合物のユニークな特性および達成すべき特定の治療効果により定められる。用量の値は、緩和すべき症状の種類および重症度により変更することができる。任意の特定の対象に対しては、特定の投与計画を、個別のニーズおよびに治療する臨床医の専門的な判断力に従い時間とともに調節することができる。

【0195】

別の実施形態では、組成物は制御放出系または徐放系で送達することが可能である。一実施形態では、ポンプを用いて制御放出または徐放を達成することができる。別の実施形態ではポリマー材料を用いて本開示の治療の制御放出または徐放を達成することができる（例えば、米国特許第５９８９４６３号明細書を参照）。徐放製剤で用いるポリマーの例としては、限定されるわけではないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセタート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコライド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコライド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが挙げられる。徐放製剤で用いるポリマーは、不活性で、溶出する不純物がなく、貯蔵時に安定的で、無菌で、生分解性であり得る。一部の実施形態では、制御放出系または徐放系は、予防標的または治療標的の近くに置くことが可能であるため、全身用量の一部のみを必要とする。当業者に既知の任意の適切な技法を用いることができる。

【0196】

本発明の遺伝子操作した細菌は、中性形態または塩形態として投与および製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するようなアニオンとともに形成されたもの、および、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するようなカチオンとともに形成されたものが挙げられる。

【0197】

成分は、別個に、または単位剤形中で混合されて、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封された容器中の凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、供給される。投与方式が注射による場合、成分を投与前に混ぜ合わせることができるように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することが可能である。

【0198】

本発明の医薬組成物は、薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封された容器にパッケージ化することができる。一実施形態では、本発明の１つまたは複数の医薬組成物は、密封された容器において、滅菌凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給され、対象への投与に適した濃度に（例えば水または生理食塩水を用いて）再構成することが可能である。一実施形態では、本発明の１つまたは複数の予防薬、治療薬、または医薬組成物は、２℃〜８℃の間で保存された密封された容器において滅菌凍結乾燥粉末として供給され、再構成後１時間以内、３時間以内、５時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内、７２時間以内、または１週間以内に投与される。抗凍結剤が、凍結乾燥剤形、主に０〜１０％スクロース（最適には０．５〜１．０％）に含まれ得る。他の適切な抗凍結剤には、トレハロースおよびラクトースが含まれる。他の適切な充填材としてはグリシンおよびアルギニン（この何れかは０〜０．０５％の濃度で含まれ得る）、ならびに、ポリソルベート８０（最適には、０．００５〜０．０１％の濃度で含まれる）が挙げられる。追加の界面活性剤としては、限定されるわけではないが、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ（登録商標）界面活性剤が挙げられる。医薬組成物は、注射可能な溶液として調製することができ、さらに、吸収または分散を高めるのに用いられるもの、例えばヒアルロニダーゼなど、アジュバントとして有用な薬剤を含むことが可能である。

【0199】

投薬は、病気の重症度および応答性、投薬経路、処置の時間的経過（数日〜数か月〜数年）、ならびに病気の改善までの時間を含むいくつかの因子に依存し得る。本明細書で提供する化合物の毒性および治療効果は、細胞培養物または動物モデルにおける標準的な薬学的手順により判断することが可能である。例えば、ＬＤ_５０、ＥＤ_５０、ＥＣ_５０、およびＩＣ_５０を決定することができ、毒性と治療効果の用量比（ＬＤ_５０／ＥＤ_５０）を治療インデックスとして計算することができる。毒性副作用を示す組成物は、注意深く改変して、潜在的な損傷を最小化し副作用を減らすことで、用いることができる。投薬は、細胞培養試験および動物モデルから最初に推定することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの試験ならびに動物研究から得られたデータは、ヒトで用いる用量の幅を明確にする際に用いることが可能である。

【0200】

処置法
本発明の別の態様は、高アンモニア血症に関連する病気または疾患の処置法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、これらの病気または疾患に関連する１つまたは複数の症状を低減し、改善させ、または消失させる方法を提供する。一部の実施形態では、疾患は、アルギニノコハク酸尿症、アルギナーゼ欠損症、カルバモイルリン酸シンセターゼ欠損症、シトルリン血症、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ欠損症、およびオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症などの尿素サイクル異常症である。代替の実施形態では、疾患は、肝性脳症、急性肝不全、もしくは慢性肝不全などの肝疾患；有機酸異常症；イソ吉草酸血症；３−メチルクロトニルグリシン尿症；メチルマロン酸血症；プロピオン酸尿症；脂肪酸酸化欠損症；カルニチンサイクル異常症；カルニチン欠乏症；β酸化異常症；リシン尿性蛋白不耐症；ピロリン−５−カルボン酸シンセターゼ欠損症；ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症；オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症；炭酸脱水酵素欠乏症；高インスリン血症−高アンモニア血症症候群；ミトコンドリア病；バルプロエート療法；アスパラギナーゼ療法；完全非経口栄養法；グリシン含有溶液を用いた膀胱鏡検査；肺／骨髄移植後；門脈体循環シャント；尿路感染症；尿道拡張；多発性骨髄腫；化学療法；感染症；神経性膀胱；または腸内細菌の過剰増殖である。一部の実施形態では、それらに関連する症状としては、限定されるわけではないが、発作、運動失調、脳卒中様病変、昏睡、精神病、視力喪失、急性脳症、脳浮腫、ならびに、嘔吐、呼吸性アルカローシス、および低体温が挙げられる。

【0201】

本方法は、本明細書に記載する少なくとも一つの遺伝子操作した細菌種、細菌株、または細菌サブタイプを用いて医薬組成物を調製すること、および、該医薬組成物を治療的に有効な量で対象に投与することを含む。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌を、例えば液体懸濁液において経口投与する。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌をジェルカプセル内で凍結乾燥させ、経口投与する。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌を栄養チューブまたは胃シャントを介して投与する。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌を、例えば浣腸により直腸に投与する。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌を、局所的に、腸内に、空腸内に、十二指腸内に、回腸内に、および／または結腸内に投与する。

【0202】

ある実施形態では、医薬組成物を対象に投与することにより、対象におけるアンモニア濃度を低減させる。一部の実施形態では、本開示の方法は、対象におけるアンモニア濃度を、未処置対象または対照対象のレベルと比較し、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％以上低下させることができる。一部の実施形態では、低下は、対象におけるアンモニア濃度を医薬組成物を投与する前後で比較することにより測定する。一部の実施形態では、高アンモニア血症を処置または改善する方法は、病状または疾患の１つまたは複数の症状を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％以上改善することを可能にする。

【0203】

医薬組成物の投与前、投与中、および投与後に、対象のアンモニア濃度を、血液、血清、血漿、尿、糞便、腹水、腸粘膜擦過物、組織から採取したサンプル、ならびに／または、以下の、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸および肛門管のうち１つもしくは複数の内容物から採取したサンプルなどの生物学的サンプルにおいて、測定することができる。一部の実施形態では、本方法には、本発明の組成物を投与して、対象のアンモニア濃度を検出不能なレベルにまで、または、対象の処置前のアンモニア濃度の１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、または８０％にまで低減させることを含み得る。

【0204】

ある実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作した細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅである。遺伝子操作した細菌は、投与して数時間後または数日後に、例えば消化管もしくは血清の防御因子により（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）、またはキルスイッチの活性化により破壊され得る。したがって、突然変異アルギニンレギュロンを含む医薬組成物は、治療的に有効な用量および頻度で再投与することができる。マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＮｉｓｓｌｅ滞留の長さを図２７に示す。代替の実施形態では、遺伝子操作した細菌は、投与後数時間または数日内では破壊されず、増殖して消化管に定着し得る。

【0205】

医薬組成物は単独で、または、限定されるわけではないが、フェニル酪酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、およびグリセロールフェニルブチラートなどの１つもしくは複数の追加の治療薬と組み合わせて投与することができる。１つまたは複数の追加の治療薬を選択する際の考慮すべき重要な事項は、その薬剤が本発明の遺伝子操作した細菌に適合すべきである、例えば、その薬剤が細菌を死滅させてはならないということである。一部の実施形態では、医薬組成物は食物と共に投与される。代替の実施形態では、医薬組成物は食物を食べる前または後に投与される。医薬組成物は、１つまたは複数の食事改善、例えば低たんぱく食およびアミノ酸捕捉と組み合わせて投与することができる。医薬組成物の用量および投与頻度は、症状の重症度および疾患の進行度に基づき選択することができる。適切な治療的に有効な用量および／または投与頻度は、処置する臨床医により選択され得る。

【0206】

ｉｎ ｖｉｖｏでの処置
本発明の遺伝子操作した細菌は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば動物モデルにおいて評価することができる。高アンモニア血症に関連する病気または症状の任意の適切な動物モデルを用いることができ（例えば、Ｄｅｉｇｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｎｉｃａｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００８を参照）、例えば、急性肝不全および高アンモニア血症のマウスモデルを用いることができる。この急性肝不全および高アンモニア血症は、チオールアセトアミド（ＴＡＡ）を用いた処置により誘導することができる（Ｎｉｃａｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００８）。別の例示的な動物モデルはｓｐｆ^ａｓｈ（ｓｐａｒｓｅ ｆｕｒ ｗｉｔｈ ａｂｎｏｒｍａｌ ｓｋｉｎ ａｎｄ ｈａｉｒ）マウスであり、これはオルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子におけるミスセンス突然変異により、血漿アンモニアレベルの上昇を示す（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９７４；Ｈｏｄｇｅｓ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９８９）。本発明の遺伝子操作した細菌は、動物に、例えば経口胃管投与により投与することができ、処置の効果は、例えば血液サンプルにおけるアンモニア、および／または、糞便サンプルにおけるアルギニン、シトルリン、もしくは他の副生成物を測定することにより決定される。

【0207】

例示的実施形態
１．アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作した細菌であって、
前記細菌は、同一条件下の同じ細菌サブタイプに由来する野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼと比較しアルギニンフィードバック阻害が低減した機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードする遺伝子を含み、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードする前記遺伝子の発現は、外因性の環境条件により誘導されるプロモータにより制御され、
前記細菌は機能性ＡｒｇＲを欠くように遺伝子操作されている、細菌。

【0208】

２．前記アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼの発現を制御するプロモータは、低酸素または嫌気的な条件下で誘導される、実施形態１の細菌。

【0209】

３．対応する野生型細菌に通常存在する機能性ａｒｇＲ遺伝子の各コピーが個別に削除されているか、または、１つもしくは複数のヌクレオチドの削除、挿入、もしくは置換により不活性になっている、実施形態１または２の何れか一つの細菌。

【0210】

４．対応する野生型細菌に通常存在する機能性ａｒｇＲ遺伝子の各コピーが削除されている、実施形態３の細菌。

【0211】

５．対応する野生型細菌に通常存在する機能性ａｒｇＧ遺伝子の各コピーが個別に削除されているか、または、１つもしくは複数のヌクレオチドの削除、挿入、もしくは置換により不活性になっている、実施形態１〜４の何れか一つの細菌。

【0212】

６．対応する野生型細菌に通常存在する機能性ａｒｇＧ遺伝子の各コピーが削除されている、実施形態５の細菌。

【0213】

７．前記アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼの発現を制御するプロモータを誘導する条件下で、機能性ＡＲＧボックスを含むオペロン中に存在し、アルギニン生合成酵素をコードする各遺伝子の転写が、同一条件下の野生型細菌の対応する遺伝子と比較し増加する、実施形態１〜７の何れか一つの細菌。

【0214】

８．低酸素または嫌気的な条件下で誘導される前記プロモータはＦＮＲプロモータである、実施形態２〜７の何れか一つの細菌。

【0215】

９．実施形態２〜７の何れか一つの細菌であって、前記アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ遺伝子は、
ａ）配列番号２８、
ｂ）遺伝子コードの冗長性を別とすれば配列番号２８にコードされているのと同じポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および
ｃ）ａ）またはｂ）のＤＮＡ配列と少なくとも８０％の相同性を有するＤＮＡ配列から選択されるＤＮＡ配列を有する、細菌。

【0216】

１０．非病原性細菌である、実施形態１〜９の何れか一つの細菌。

【0217】

１１．プロバイオティクス細菌である、実施形態１０の細菌。

【0218】

１２．バクテロイデス、ビフィドバクテリウム、クロストリジウム、エシェリキア、ラクトバチルス、およびラクトコッカスからなる群から選択される、実施形態１０の細菌。

【0219】

１３．大腸菌株Ｎｉｓｓｌｅである、実施形態１２の細菌。

【0220】

１４．前記アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードする遺伝子は前記細菌のプラスミドに存在し、前記プラスミドにおいて、低酸素または嫌気的な条件下で誘導される前記プロモータに操作可能に連結している、実施形態２〜１３の何れか一つの細菌。

【0221】

１５．前記アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードする遺伝子は細菌染色体に存在し、前記染色体において、低酸素または嫌気的な条件下で誘導される前記プロモータに操作可能に連結している、実施形態２〜１３の何れか一つの細菌。

【0222】

１６．哺乳類の消化管に存在する場合に補完される遺伝子において栄養要求株である、実施形態１〜１５の何れか一つの細菌。

【0223】

１７．哺乳類の消化管はヒトの消化管である、実施形態１６の細菌。

【0224】

１８．実施形態１〜１７の何れか一つの細菌および薬学的に許容される担体を含む、薬学的に許容される組成物。

【0225】

１９．経口投与または直腸投与向けに製剤化された、実施形態１８の薬学的に許容される組成物。

【0226】

２０．実施形態１９の薬学的に許容される組成物を生成する方法であって、
ａ）前記アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼの発現を制御するプロモータを誘導しない条件下で、実施形態１〜１７の何れか一つの細菌を増殖培地において増殖させるステップと、
ｂ）結果として生じる細菌を前記増殖培地から単離するステップと、
ｃ）前記単離した細菌を薬学的に許容される担体に懸濁するステップとを含む、方法。

【0227】

２１．高アンモニア血症関連疾患またはその症状の処置を、それを必要とする対象で行う方法であって、前記対象に実施形態１８の組成物を、前記高アンモニア血症関連疾患の重症度を軽減するのに十分な期間にわたって投与するステップを含む、方法。

【0228】

２２．前記高アンモニア血症関連疾患は尿素サイクル異常症である、実施形態２１の方法。

【0229】

２３．前記尿素サイクル異常症は、アルギニノコハク酸尿症、アルギナーゼ欠損症、カルバモイルリン酸シンセターゼ欠損症、シトルリン血症、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ欠損症、またはオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症である、実施形態２２の方法。

【0230】

２４．前記高アンモニア血症関連疾患は、肝疾患；有機酸異常症；イソ吉草酸血症；３−メチルクロトニルグリシン尿症；メチルマロン酸血症；プロピオン酸尿症；脂肪酸酸化欠損症；カルニチンサイクル異常症；カルニチン欠乏症；β酸化異常症；リシン尿性蛋白不耐症；ピロリン−５−カルボン酸シンセターゼ欠損症；ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症；オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症；炭酸脱水酵素欠乏症；高インスリン血症−高アンモニア血症症候群；ミトコンドリア病；バルプロエート療法；アスパラギナーゼ療法；完全非経口栄養法；グリシン含有溶液を用いた膀胱鏡検査；肺／骨髄移植後；門脈体循環シャント；尿路感染症；尿道拡張；多発性骨髄腫；化学療法；感染症；神経性膀胱；または腸内細菌の過剰増殖である、実施形態２１の方法。

【0231】

２５．前記肝疾患は、肝性脳症、急性肝不全、または慢性肝不全である、実施形態２４の方法。

【0232】

２６．前記高アンモニア血症関連疾患の症状は、脳卒中、運動失調、脳卒中様病変、昏睡、精神病、視力喪失、急性脳症、脳浮腫、ならびに嘔吐、呼吸性アルカローシス、および低体温からなる群から選択される、実施形態２５の方法。

【0233】

２７．突然変異アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作した細菌であって、
前記細菌は、同一条件下の同じ細菌サブタイプに由来する野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼと比較し、アルギニンフィードバック阻害が低減するように突然変異させた機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼを含み、前記突然変異Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードする遺伝子の発現は、低酸素または嫌気的な条件下で誘導されるプロモータにより制御され、
前記突然変異アルギニンレギュロンは、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタメートリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノスクシネートシンターゼ、およびアルギニノスクシネートリアーゼをコードする遺伝子を含む１つまたは複数のオペロンを含み、
アルギニノスクシネートシンターゼをコードする遺伝子を含むオペロンを除く各オペロンは、ＡｒｇＲ結合を介した前記オペロンのアルギニン介在性阻害を低減させる１つまたは複数の核酸突然変異によって特徴付けられる、１つまたは複数の突然変異ＡＲＧボックスを含み、前記オペロン内の遺伝子の転写を促進するのに十分な親和性を有するＲＮＡポリメラーゼ結合を保持する、細菌。

【0234】

２８．前記アルギニノスクシネートシンターゼをコードする遺伝子を含むオペロンは、ＡｒｇＲ結合を介した前記オペロンのアルギニン介在性阻害を低減させる１つまたは複数の核酸突然変異によって特徴付けられる、１つまたは複数の突然変異ＡＲＧボックスを含み、前記アルギニノスクシネートシンターゼ遺伝子の転写を促進するのに十分な親和性を有するＲＮＡポリメラーゼ結合を保持する、実施形態２７の遺伝子操作した細菌。

【0235】

２９．前記アルギニノスクシネートシンターゼをコードする遺伝子を含むオペロンは、前記アルギニノスクシネートシンターゼ遺伝子の転写を調節する構成的活性型プロモータを含む、実施形態２７の遺伝子操作した細菌。

【0236】

３０．前記機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードする遺伝子を、同一条件下の同じ細菌サブタイプに由来する野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼと比較し、アルギニンフィードバック阻害を低減するように突然変異させた、実施形態２７〜２９の何れか一つの細菌。

【0237】

３１．ＡｒｇＲ結合は、同一条件下の野生型アルギニンレギュロンを含む同じ細菌サブタイプに由来する細菌と比較し低減している、実施形態２７〜３０の何れか一つの細菌。

【0238】

３２．前記低減されたＡｒｇＲ結合を介するアルギニン介在性阻害は、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタメートリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、およびアルギニノスクシネートリアーゼをコードする前記遺伝子それぞれの転写を、同一条件下の対応する野生型細菌と比較し増加させる、実施形態２７の何れか一つの細菌。

【0239】

３３．前記低減されたＡｒｇＲ結合を介するアルギニン介在性阻害は、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタメートリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノスクシネートシンターゼ、およびアルギニノスクシネートリアーゼをコードする前記遺伝子それぞれの転写を、同一条件下の対応する野生型細菌と比較し増加させる、実施形態２８の細菌。

【0240】

３４．前記アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタメートリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、およびアルギニノスクシネートリアーゼをコードするオペロンはそれぞれ、該オペロンの各ＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の核酸突然変異を含む、実施形態２７の細菌。

【0241】

３５．前記アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタメートリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノスクシネートシンターゼ、およびアルギニノスクシネートリアーゼをコードするオペロンはそれぞれ、該オペロンの各ＡＲＧボックスにおいて１つまたは複数の核酸突然変異を含む、実施形態２８の細菌。

【0242】

３６．実施形態２７〜３５の何れか一つの細菌であって、野生型オルニチンアセチルトランスフェラーゼをコードする１つまたは複数のオペロンをさらに含み、野生型オルニチンアセチルトランスフェラーゼをコードする各オペロンは、ＡｒｇＲ結合を介した前記オペロンのアルギニン介在性阻害を低減させる１つまたは複数の核酸突然変異によって特徴付けられる、１つまたは複数の突然変異ＡＲＧボックスを含み、前記オペロンの遺伝子の転写を促進するのに十分な親和性を有するＲＮＡポリメラーゼ結合を保持する、細菌。

【0243】

３７．低酸素または嫌気的な条件下で誘導される前記プロモータはＦＮＲプロモータである、実施形態２７〜３６の何れか一つの細菌。

【0244】

３８．実施形態２７〜３７の何れか一つの細菌であって、野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードする１つまたは複数のオペロンを追加で含み、野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードする各オペロンは、ＡｒｇＲ結合を介した前記オペロンのアルギニン介在性阻害を低減させる１つまたは複数の核酸突然変異によって特徴付けられる、１つまたは複数の突然変異ＡＲＧボックスを含み、前記オペロンの遺伝子の転写を促進するのに十分な親和性を有するＲＮＡポリメラーゼ結合を保持し、前記遺伝子操作した細菌は野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼプロモータを含まない、細菌。

【0245】

３９．Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタメートリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノスクシネートシンターゼ、およびアルギニノスクシネートリアーゼをコードする遺伝子が、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに存在するオペロンにまとめられている、実施形態２７〜３９の何れか一つの細菌。

【0246】

４０．各オペロンがプロモータ領域を含み、前記突然変異アルギニンレギュロンの各プロモータ領域のＧ／Ｃ：Ａ／Ｔ比率は、対応する野生型プロモータ領域で見られるＧ／Ｃ：Ａ／Ｔ比率とわずか１０％異なるだけである、実施形態２７〜３９の何れか一つの細菌。

【0247】

４１．各突然変異ＡＲＧボックスは、前記対応する野生型ＡＲＧボックスと比較し、少なくとも３つのヌクレオチド突然変異によって特徴付けられる、実施形態２７〜４０の何れか一つの細菌。

【0248】

４２．前記突然変異Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ遺伝子は、
ａ）配列番号２８、
ｂ）遺伝子コードの冗長性を別とすれば配列番号２８と同じポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および
ｃ）ａ）またはｂ）のＤＮＡ配列と少なくとも８０％の相同性を有するＤＮＡ配列から選択されるＤＮＡ配列を有する、実施形態２７〜４１の何れか一つの細菌。

【0249】

４３．Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、およびアルギニノスクシネートリアーゼをコードする単一オペロンを含み、前記単一オペロンは突然変異した配列番号５のＤＮＡ配列を含み、前記突然変異は配列番号５のヌクレオチド３７、３８、４５、４６、４７のうち１つまたは複数、および、配列番号５のヌクレオチド５５、５６、５７、６７、６８、６９のうち１つまたは複数にある、実施形態２７〜４２の何れか一つの細菌。

【0250】

４４．前記単一オペロンは配列番号６のＤＮＡ配列を含む、実施形態４３の細菌。

【0251】

４５．アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼをコードする前記オペロンは、突然変異した配列番号１１のＤＮＡ配列を含み、前記突然変異は、配列番号１１のヌクレオチド２０、２１、２９、３０、３１のうち１つまたは複数、および、配列番号１１のヌクレオチド４１、４２、５０、５２のうち１つまたは複数にある、実施形態２７〜４４の何れか一つの細菌。

【0252】

４６．アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼをコードする前記オペロンは、配列番号１２のＤＮＡ配列を含む、実施形態４５の細菌。

【0253】

Ｎ−アセチルオルニチナーゼをコードする前記オペロンは、突然変異した配列番号７のＤＮＡ配列を含み、前記突然変異は、配列番号７のヌクレオチド９２、９３、９４、１０４、１０５、１０６のうち１つまたは複数、および、配列番号７のヌクレオチド１１４、１１５、１１６、１２３、１２４のうち１つまたは複数にある、実施形態２７〜４６の何れか一つの細菌。

【0254】

４８．Ｎ−アセチルオルニチナーゼをコードする前記オペロンは、配列番号８のＤＮＡ配列を含む、実施形態４６の細菌。

【0255】

４９．オルニチントランスカルバミラーゼをコードする前記オペロンは、突然変異した配列番号３のＤＮＡ配列を含み、前記突然変異は、配列番号３のヌクレオチド１２、１３、１４、１８、２０のうち１つまたは複数、および、配列番号３のヌクレオチド３４、３５、３６、４５、４６のうち１つまたは複数にある、実施形態２７〜４８の何れか一つの細菌。

【0256】

５０．オルニチントランスカルバミラーゼをコードする前記オペロンは、配列番号４のＤＮＡ配列を含む、実施形態４９の細菌。

【0257】

５１．カルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロンの前記突然変異プロモータ領域は、突然変異した配列番号９のＤＮＡ配列を含み、前記突然変異は、配列番号９のヌクレオチド３３、３４、３５、４３、４３、４５のうち１つまたは複数、および、配列番号９のヌクレオチド５１、５２、５３、６０、６１、６２のうち１つまたは複数にある、実施形態２７〜５０の何れか一つの細菌。

【0258】

５２．カルバモイルリン酸シンターゼをコードする前記オペロンは、配列番号１０のＤＮＡ配列を含む、実施形態５１の細菌。

【0259】

５３．Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードするオペロンの前記突然変異プロモータ領域は、突然変異した配列番号１のＤＮＡ配列を含み、前記突然変異は、配列番号１のヌクレオチド１２、１３、１４、２１、２２、２３のうち１つまたは複数、および、配列番号１のヌクレオチド３３、３４、３５、４２、４３、４４のうち１つまたは複数にある、実施形態２７〜５２の何れか一つの細菌。

【0260】

５４．Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードする前記オペロンは配列番号２のＤＮＡ配列を含む、実施形態５３の細菌。

【0261】

５５．アルギニノスクシネートシンターゼをコードするオペロンの前記突然変異プロモータ領域は、突然変異した配列番号１３のＤＮＡ配列を含み、前記突然変異は、配列番号１３のヌクレオチド９、１１、１９、２１のうち１つまたは複数、配列番号１３のヌクレオチド１２９、１３０、１３１、１４０、１４１、１４２のうち１つまたは複数、および、配列番号１３のヌクレオチド１５０、１５１、１５２、１６１、１６２、１６３の１つまたは複数にある、実施形態２８の細菌。

【0262】

５６．アルギニノスクシネートシンターゼをコードする前記オペロンは、配列番号３１のＤＮＡ配列を含む、実施形態２７の細菌。

【0263】

５７．アルギニノスクシネートシンターゼをコードする前記オペロンは、配列番号３２のＤＮＡ配列を含む、実施形態２８の細菌。

【0264】

５８．バクテロイデス、ビフィドバクテリウム、クロストリジウム、エシェリキア、ラクトバチルス、およびラクトコッカスからなる群から選択される、実施形態２７〜５７の何れか一つの細菌。

【0265】

５９．大腸菌Ｎｉｓｓｌｅである、実施形態２７〜５８の何れか一つの細菌。

【0266】

６０．前記オペロンの少なくとも１つは前記細菌のプラスミドに存在し、前記プラスミド上のそれらに対応する前記アルギニンレギュロン遺伝子の全ての染色体コピーは活性酵素をコードしない、実施形態２７〜５９の何れか一つの細菌。

【0267】

６１．前記突然変異Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードする遺伝子は、前記細菌のプラスミドに存在し、前記プラスミドにおいて、低酸素または嫌気的な条件下で誘導される前記プロモータに操作可能に連結している、実施形態６０の細菌。

【0268】

６２．前記突然変異Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼをコードする遺伝子は前記細菌染色体に存在し、前記染色体において、低酸素または嫌気的な条件下で誘導される前記プロモータに操作可能に連結している、実施形態２７〜５９の何れか一つの細菌。

【0269】

６３．哺乳類の消化管に存在する際に補完される第１遺伝子において栄養要求株である、実施形態２７〜６２の何れか一つの細菌。

【0270】

６４．哺乳類の消化管はヒトの消化管である、実施形態６３の細菌。

【0271】

６５．実施形態２７〜６４の何れか一つの細菌であって、
ａ）前記細菌は、哺乳類の消化管に存在する場合に補完されない第２遺伝子において栄養要求性であり、
ｂ）前記第２遺伝子は、前記細菌に存在する誘導性第３遺伝子により補完され、
ｃ）前記第３遺伝子の転写は、十分に高濃度のアルギニンの存在下で誘導され、それにより前記第２遺伝子の栄養要求性が補完される、細菌。

【0272】

６６．実施形態６５の細菌であって、
ａ）前記第３の遺伝子の転写は、第２リプレッサにより阻害され、
ｂ）前記第２リプレッサの転写は、アルギニン−アルギニンリプレッサ複合体により阻害される、細菌。

【0273】

６７．前記第３遺伝子および前記第２リプレッサはそれぞれプラスミドに存在する、実施形態６６の細菌。

【0274】

６８．実施形態２７〜６７の何れか一つの細菌と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的に許容される組成物。

【0275】

６９．実施形態６８の薬学的に許容される組成物を生成する方法であって、
ａ）実施形態２７〜６７の何れか一つの細菌を、好気的な条件下で増殖培地において増殖させるステップと、
ｂ）結果として生じる細菌を前記増殖培地から単離するステップと、
ｃ）前記単離した細菌を薬学的に許容される担体に懸濁するステップとを含む、方法。

【0276】

７０．高アンモニア血症関連疾患またはその症状の処置を、それを必要とする対象で行う方法であって、前記対象に実施形態６８の組成物を、前記高アンモニア血症関連疾患の重症度を軽減するのに十分な期間にわたって投与するステップを含む、方法。

【0277】

７１．前記高アンモニア血症関連疾患は尿素サイクル異常症である、実施形態７０の方法。

【0278】

７２．前記尿素サイクル異常症は、アルギニノコハク酸尿症、アルギナーゼ欠損症、カルバモイルリン酸シンセターゼ欠損症、シトルリン血症、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ欠損症、またはオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症である、実施形態７１の方法。

【0279】

７３．前記高アンモニア血症関連疾患は、肝疾患；有機酸異常症；イソ吉草酸血症；３−メチルクロトニルグリシン尿症；メチルマロン酸血症；プロピオン酸尿症；脂肪酸酸化欠損症；カルニチンサイクル異常症；カルニチン欠乏症；β酸化異常症；リシン尿性蛋白不耐症；ピロリン−５−カルボン酸シンセターゼ欠損症；ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症；オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症；炭酸脱水酵素欠乏症；高インスリン血症−高アンモニア血症症候群；ミトコンドリア病；バルプロエート療法；アスパラギナーゼ療法；完全非経口栄養法；グリシン含有溶液を用いた膀胱鏡検査；肺／骨髄移植後；門脈体循環シャント；尿路感染症；尿道拡張；多発性骨髄腫；化学療法；感染症；神経性膀胱；または腸内細菌の過剰増殖である、実施形態７０の方法。

【0280】

７４．前記肝疾患は、肝性脳症、急性肝不全、または慢性肝不全である、実施形態７３の方法。

【0281】

７５．前記高アンモニア血症関連疾患の症状は、脳卒中、運動失調、脳卒中様病変、昏睡、精神病、視力喪失、急性脳症、脳浮腫、ならびに嘔吐、呼吸性アルカローシス、および低体温からなる群から選択される、実施形態７０の方法。

【0282】

７６．検出可能な生成物をコードするＤＮＡ配列を追加で含み、前記検出可能な生成物をコードするＤＮＡ配列の転写は、アルギニンの存在下で誘導される、実施形態２７〜７５の何れか一つの細菌。

【0283】

７７．ａ）前記検出可能な生成物をコードするＤＮＡ配列の転写は、第３リプレッサにより阻害され、
ｂ）前記第３リプレッサの転写はアルギニン−アルギニンリプレッサ複合体により阻害される、実施形態７６の細菌。

【0284】

７８．高レベルのアルギニンを生成する細菌を選択する方法であって、
ａ）実施形態７７の細菌を提供するステップと、
ｂ）前記細菌を第１期間の間培養するステップと、
ｃ）前記培養物を突然変異誘発させるステップと、
ｄ）前記突然変異誘発された培養物を第２期間の間培養するステップと、
ｅ）前記検出可能な生成物を発現する細菌を選択することにより、高レベルのアルギニンを生成する細菌を選択するステップとを含む、方法。

【0285】

７９．前記検出可能な生成物は蛍光タンパク質であり、選択には蛍光活性化セルソーターの使用が含まれる、実施形態７８の方法。

【0286】

本明細書全体を通して言及される参考文献の全列挙には以下を含む。
１．Ａｌｔｅｎｈｏｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００４ Ａｐｒ ９；４０（３）：２２３−９．ＰＭＩＤ：１５０３９０９８；
２．Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｕｒａｃｉｌ ｕｐｔａｋｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒａＡ ｍｕｔａｎｔｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９５ Ａｐｒ；１７７（８）：２００８−１３．ＰＭＩＤ：７７２１６９３；
３．Ａｒｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｔａｒｇｅｔｓ ｃａｎｃｅｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ｏｃｔ ５；３３８（６１０３）：１２０−３．ＰＭＩＤ：２２９０３５２１；
４．Ａｏｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｕｒｅａｓｅ ｉｎ ｍａｎ．Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｕｃｏｓａｌ ｕｒｅａｓｅ．Ｇｕｔ．１９６６ Ｄｅｃ；７（６）：６３１−５．ＰＭＩＤ：５９５７５１４；
５．Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｉｒ ａｎｄ ｎｏｒ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ＣＲＰ／ＦＮＲ−ｒｅｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ，ＤＮＲ，ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｔｏ ＡＮＲ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９５ Ａｕｇ ２８；３７１（１）：７３−６．ＰＭＩＤ：７６６４８８７；
６．Ｃａｌｄａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｇｕｌｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｗｈｏｌｅ−ｓｙｓｔｅｍ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｉｓｃｏｖｅｒｓ ｎｅｗ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｖｉｅｗ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００６ Ｎｏｖ；１５２（Ｐｔ １１）：３３４３−５４．ＰＭＩＤ：１７０７４９０４；
７．Ｃａｌｄａｒａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｇｉｎｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００８ Ｍａｒ ７；２８３（１０）：６３４７−５８．ＰＭＩＤ：１８１６５２３７；
８．Ｃａｌｄｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｆｅｃｔｓ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２０１０；１００ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ１３−９．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２０３０３８１０；
９．Ｃａｌｌｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｃｋｉｎｇ，ｔｕｎｉｎｇ，ａｎｄ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｕｓｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｒｉｂｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１０ Ｓｅｐ ７；１０７（３６）：１５８９８−９０３．ＰＭＩＤ：２０７１３７０８；
１０．Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＤＮＲ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ａｎｄ ｈａｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００９ Ｓｅｐ；１５５（Ｐｔ ９）：２８３８−４４．ＰＭＩＤ：１９４７７９０２；
１１．Ｃｈａｒｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｇｕｌｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２．Ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ−ｏｐｅｒａｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｖｅｒｓｕｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９２ Ｊｕｌ ２０；２２６（２）：３６７−８６．ＰＭＩＤ：１６４０４５６；
１２．Ｃｒａｂｅｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＲＧ７ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ａｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｌｓｏ ｅｎｄｏｗｅｄ ｗｉｔｈ ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７ Ｄｅｃ １；２５０（２）：２３２−４１．ＰＭＩＤ：９４２８６６９；
１３．Ｃｕｅｖａｓ−Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎｄｕｃｅｓ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１０ Ｊｕｎ ２２；１０７（２５）：１１５３７−４２．ＰＭＩＤ：２０５３４５２２；
１４．Ｃｕｎｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｇｕｌｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８３ Ａｕｇ １１；１１（１５）：５００７−１９．ＰＭＩＤ：６３４８７０３；
１５．Ｃｕｎｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．１９８６ Ｓｅｐ；５０（３）：３１４−５２．Ｒｅｖｉｅｗ．Ｅｒｒａｔｕｍ ｉｎ：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．１９８７ Ｍａｒ；５１（１）：１７８．ＰＭＩＤ：３５３４５３８；
１６．Ｄｅｉｇｎａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２００８ Ｊａｎ；９３（１）；７−１４．ＰＭＩＤ：１７９３３５７４；
１７．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ．Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８ Ａｐｒ；１１（２）：８７−９３．ＰＭＩＤ：１８３５９２６９；
１７．Ｄｉａｚ ｅｔ ａｌ．Ａｍｍｏｎｉａ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｏｕｔｃｏｍｅ ａｍｏｎｇ ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１３ Ｊｕｎ；５７（６）：２１７１−９．ＰＭＩＤ：２２９６１７２７；
１９．Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉ ｅｔ ａｌ．Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ ＣＮＣＭ Ｉ−７４５ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１４ Ｎｏｖ；１４（１１）：１５９３−６０９．ＰＭＩＤ：２４９９５６７５；
２０．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ．Ａ ｎｅｗ ａｌｌｅｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐａｒｓｅ ｆｕｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ．Ｊ Ｈｅｒｅｄ．１９７４ Ｍａｙ−Ｊｕｎ；６５（３）：１９４−５．ＰＭＩＤ：４６０３２５９；
２１．Ｅｃｋｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ａ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ １２．Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．１９７５ Ｊｕｎ １９；１３８（３）：２２５−３２．ＰＭＩＤ：１１０２９３１
２２．Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＦＮＲ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８９ Ｊｕｌ；３（７）：８６９−７８．ＰＭＩＤ：２６７７６０２；
２３．Ｆｒａｇａ ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （１０．３．１−１０．３．３３）．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；
２４．Ｇａｌｉｍａｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＦＮＲ−ｌｉｋｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９１ Ｍａｒ；１７３（５）：１５９８−６０６．ＰＭＩＤ：１９００２７７；
２５．Ｇａｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｒｃＤＡＢＣ ｏｐｅｒｏｎ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９１ Ａｕｇ；１７３（１５）：４７４２−５０．ＰＭＩＤ：１９０６８７１；
２６．Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｏｇｇｌｅ ｓｗｉｔｃｈ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｎａｔｕｒｅ．２０００；４０３：３３９−４２．ＰＭＩＤ：１０６５９８５７；
２７．Ｇｏｅｒｋｅ Ｂ ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｂｏｎ ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ：ｍａｎｙ ｗａｙｓ ｔｏ ｍａｋｅ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｏｕｔ ｏｆ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８ Ａｕｇ；６（８）：６１３−２４．ＰＭＩＤ：１８６２８７６９；
２８．Ｈａｅｂｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ．２０１２ Ｍａｙ ２９；７：３２．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２２６４２８８０；
２９．Ｈａｅｂｅｒｌｅ Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２０１３ Ａｕｇ １５；５３６（２）：１０１−８．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２３６２８３４３；
３０．Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ＦＮＲ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｂｙ ＤＮＲ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｎｉｔｒｉｔｅ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９８ Ｓｅｐ １５；１６６（２）：２１３−７．ＰＭＩＤ：９７７０２７６；
３１．Ｈｏｄｇｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｓｐｆａｓｈ ｍｏｕｓｅ：ａ ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ａｌｓｏ ｃａｕｓｅｓ ａｂｅｒｒａｎｔ ｍＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８９ Ｊｕｎ；８６（１１）：４１４２−６．ＰＭＩＤ：２４７１１９７；
３２．Ｈｏｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｎｉｔｒｏｕｓ−ｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３ Ｎｏｖ １５；２１８（１）：４９−５７．ＰＭＩＤ：８２４３４７６；
３３．Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ．Ｈａｎｄｂ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１３；１１３：１７５５−７３．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２３６２２３９９；
３４．Ｈｏｓｓｅｉｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ ａｓ ａ ｈｅａｌｔｈ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｕｔ．Ｎｕｔｒ Ｒｅｖ．２０１１ Ｍａｙ；６９（５）：２４５−５８．ＰＭＩＤ：２１５２１２２７；
３５．Ｉｓａｂｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｔｉｍｕｌｏｎ ｉｎ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１１ Ｊａｎ ２０；１２：５１．ＰＭＩＤ：２１２５１２５５；
３６．Ｋｏｎｉｅｃｚｎａ ｅｔ ａｌ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｕｒｅａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．２０１２ Ｄｅｃ；１３（８）：７８９−８０６．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２３３０５３６５；
３７．Ｌａｚｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ ｉｎ ａｎ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔ ｍａｎａｇｅｄ ｗｉｔｈ ｃａｒｇｌｕｍｉｃ ａｃｉｄ．Ｃｕｒｒ Ｏｎｃｏｌ．２０１４ Ｏｃｔ；２１（５）：ｅ７３６−９．ＰＭＩＤ：２５３０２０４６；
３８．Ｌｅｏｎａｒｄ （２００６）．Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｉｎｂｏｒｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，４^ｔｈ ｅｄ （ｐｐ．２６３−２７２）．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｍｅｄｉｚｉｎ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；
３９．Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｇＲ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｐｒｏｄｕｃｔ，ｔｈｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８７ Ｏｃｔ；８４（１９）：６６９７−７０１．ＰＭＩＤ：３１１６５４２；
４０．Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｉｎ ａｌｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｉｎｅａｇｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２００１；２（４）．ＰＭＩＤ：１１３０５９４１；
４１．Ｍａａｓ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｄｏｍｉｎａｎｃｅ ｏｆ ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｄｉｐｌｏｉｄｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９６４ Ｍａｒ；８：３６５−７０．ＰＭＩＤ：１４１６８６９０；
４２．Ｍａａｓ．Ｔｈｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．１９９４ Ｄｅｃ；５８（４）：６３１−４０．ＰＭＩＤ：７８５４２５０；
４３．Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃａｄ ｏｐｅｒｏｎ：ａ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｗ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐＨ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９２ Ａｐｒ；１７４（８）：２６５９−６９．ＰＭＩＤ：１５５６０８５；
４４．Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＦＮＲ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｕｂｕｎｉｔ ｃｈａｒｇｅ ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００６ Ｎｏｖ ３；２８１（４４）：３３２６８−７５．ＰＭＩＤ：１６９５９７６４；
４５．Ｍｏｕｎｔａｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｅｉｇｈｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．１９８４；１９７（１）：８２−９．ＰＭＩＤ：６０９６６７５；
４６．Ｎａｇａｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄｕｒｉａ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２０１２ Ｓｅｐ；１０７（１−２）：１０−４．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２２８４１５１６；
４７．Ｎｉｃａｉｓｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ａｃｕｔｅ，ｃｈｒｏｎｉｃ，ａｎｄ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉａ ｂｙ ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００８ Ｏｃｔ；４８（４）：１１８４−９２．ＰＭＩＤ：１８６９７２１１；
４８．Ｎｉｃｏｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｔｗｏ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００４ Ｓｅｐ；１８６（１８）：６０５９−６９．ＰＭＩＤ：１５３４２５７５；
４９．Ｎｏｕｇａｙｒｅｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎｄｕｃｅｓ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６ Ａｕｇ １１；３１３（５７８８）：８４８−５１．ＰＭＩＤ：１６９０２１４２；
５０．Ｏｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ ｓｔｒａｉｎ ｃａｎｎｏｔ ｂｅ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｔｓ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ．２０１２ Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；３（６）：５０１−９．ＰＭＩＤ：２２８９５０８５；
５１．Ｐｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：ａｎ ｅｎｔｉｔｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｉｎ−ｐａｔｉｅｎｔ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ．Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔ；３７（１０）：１２２９−３２．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２３９３２５４９；
５２．Ｒａｊａｇｏｐａｌ ｅｔ ａｌ．Ｕｓｅ ｏｆ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆｅｅｄｂａｃｋ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ （ａｒｇＡ） ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｓｔｒａｉｎｓ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９８ Ｍａｙ；６４（５）：１８０５−１１．ＰＭＩＤ：９５７２９５４；
５３．Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｒ ｇｅｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ａｅｒｏｂｉｃ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９７ Ｎｏｖ １５；１５６（２）：２２７−３２．ＰＭＩＤ：９５１３２７０；
５４．Ｒｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｏｃｔ １０；１８７：１０６−７．ＰＭＩＤ：２５０９３９３６；
５５．Ｒｅｍｂａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｏｎ−ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｖｅｒｓｕｓ ｍｅｓａｌａｚｉｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ：ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．１９９９ Ａｕｇ ２１；３５４（９１７９）：６３５−９．ＰＭＩＤ：１０４６６６６５；
５６．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２^ｎｄ ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．；
５７．Ｓａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｘｙｇｅｎ ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ＦＮＲ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３ Ａｕｇ ８；２７８（３２）：２９８３７−５５． ＰＭＩＤ：１２７５４２２０；
５８．Ｓａｔ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｍａｚＥＦ ｓｕｉｃｉｄｅ ｍｏｄｕｌｅ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｙｍｉｎｅｌｅｓｓ ｄｅａｔｈ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ２００３ Ｍａｒ；１８５（６）：１８０３−７． ＰＭＩＤ：１２６１８４４３；
５９．Ｓａｗｅｒｓ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１ ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ＦＮＲ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９９１ Ｊｕｎ；５（６）：１４６９−８１． ＰＭＩＤ：１７８７７９７；
６０．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ． Ａｒｇｉｎｉｎｅ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｔｈｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｓｕｃｃｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９９８ Ａｕｇ；１８０（１６）：４２７８−８６． ＰＭＩＤ：９６９６７７９；
６１．Ｓｃｈｕｌｔｚ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｉｎｆｌａｍｍ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ． ２００８ Ｊｕｌ；１４（７）：１０１２−８． Ｒｅｖｉｅｗ． ＰＭＩＤ：１８２４０２７８；
６２．Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｎｏｎ−ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ − ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ． ２００９；２１：１２２−５８；
６３．Ｓｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｆｉｔｎｅｓｓ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ａ ｓｅａｓｏｎａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００３ Ｏｃｔ ２８；１００（２２）：１２７８２−６． ＰＭＩＤ：１４５５５７６６；
６４．Ｓｕｍｍｅｒｓｋｉｌｌ． Ｏｎ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ａｍｍｏｎｉａ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）． １９６６ Ｎｏｖ；４５（６）：４９１−６． ＰＭＩＤ：５９２５９００；
６５．Ｓｚｗａｊｋａｊｚｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００１ Ｏｃｔ ５；３１２（５）：９４９−６２． ＰＭＩＤ：１１５８０２４１；
６６．Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ｔｏ ｉｔｓ ｏｐｅｒａｔｏｒ ｓｉｔｅｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９２ Ｊｕｌ ２０；２２６（２）：３８７−９７． ＰＭＩＤ：１６４０４５７；
６７．Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂ ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅｉｒ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９４ Ｊａｎ ７；２３５（１）：２２１−３０． ＰＭＩＤ：８２８９２４３；
６８．Ｔｏｒｒｅｓ−Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ． Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｂｙ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ ｐｒｏｏｆ ｏｆ ｃｏｎｃｅｐｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉａ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１４ Ｏｃｔ ２３；２２（１）：５８−６４． ＰＭＩＤ：２５３３８９２１；
６９．Ｔｒｕｎｋ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ：ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｒ ａｎｄ Ｄｎｒ ｒｅｇｕｌｏｎｓ． Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０１０ Ｊｕｎ；１２（６）：１７１９−３３． ＰＭＩＤ：２０５５３５５２；
７０．Ｔｕｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ ａｎｄ ｕｒｅａ ｂｙ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｓｔｒａｉｎｓ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９９７ Ｊａｎ；６３（１）：３３−８． ＰＭＩＤ：８９７９３３６；
７１．Ｕｋｅｎａ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｌｅａｋｙ ｇｕｔ ｂｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２００７ Ｄｅｃ １２；２（１２）：ｅ１３０８． ＰＭＩＤ：１８０７４０３１；
７２．Ｕｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ． Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ａｃｃｅｐｔｏｒｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． １９９７ Ｊｕｌ ４；１３２０（３）：２１７−３４． Ｒｅｖｉｅｗ． ＰＭＩＤ：９２３０９１９；
７３．Ｖａｎｄｅｒ Ｗａｕｖｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｍｕｔａｎｔｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｉｎ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｏｎ ａｒｇｉｎｉｎｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｆｏｕｒ−ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｅｉｍｉｎａｓｅ ｐａｔｈｗａｙ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９８４ Ｄｅｃ；１６０（３）：９２８−３４． ＰＭＩＤ：６４３８０６４；
７４．Ｗａｌｋｅｒ． Ｓｅｖｅｒｅ ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎａｅｍｉａ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ ｎｏｔ ｅｘｐｌａｉｎｅｄ ｂｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０１２ Ｍａｙ；４９（Ｐｔ ３）：２１４−２８． Ｒｅｖｉｅｗ． ＰＭＩＤ：２２３４９５５４；
７５．Ｗｉｎｔｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ＡＮＲ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ａｎｄ ＦＮＲ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈａｖｅ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｂｕｔ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ａｎａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． １９９６ Ｍａｒ；１４２ （ Ｐｔ ３）：６８５−９３． ＰＭＩＤ：８８６８４４４；
７６．Ｗｕ ｅｔ ａｌ． Ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｇｅｎｅ ｔｆｏＸ ｂｙ ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ （ｃＡＭＰ） ａｎｄ ｃＡＭＰ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｖｉｂｒｉｏｓ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１５ Ｏｃｔ ７；５：１４９２１． ＰＭＩＤ：２６４４２５９８；
７７．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｃｙａｎｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｄｅｐｅｎｄ ｏｎ ａｎｒ，ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｗｉｔｈ ｆｎｒ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９９１ Ｊｕｎ；５（６）：１４８３−９０． ＰＭＩＤ：１７８７７９８；
７８．Ｗｒｉｇｈｔ Ｏ，Ｄｅｌｍａｎｓ Ｍ，Ｓｔａｎ ＧＢ，Ｅｌｌｉｓ Ｔ． ＧｅｎｅＧｕａｒｄ：Ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｐｌａｓｍｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ｂｉｏｓａｆｅｔｙ． ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ． ２０１５ Ｍａｒ ２０；４（３）：３０７−１６． ＰＭＩＤ：２４８４７６７３；
７９．Ａｌｉｆａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ｇｅｎｅｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ． １９９６ Ｍａｒ；６０（１）：４４−６９． ＰＭＩＤ：８８５２８９５；
８０．Ｌｉｕ Ｙ，Ｗｈｉｔｅ ＲＨ，Ｗｈｉｔｍａｎ ＷＢ． Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｉ ｕｓｅ ｔｈｅ ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ （ＤａｐＬ） ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｌｙｓｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２０１０ Ｊｕｌ；１９２（１３）：３３０４−１０． ＰＭＩＤ：２０４１８３９２；
８１．Ｄｏｇｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｌｙｓｉｎｅ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｒｏｆ．Ｄｅｎｉｚ Ｅｋｉｎｃｉ （Ｅｄ．），ＩＳＢＮ：９７８−９５３−５１−００７６−８，ＩｎＴｅｃｈ，Ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ．ｃｏｍ／ｂｏｏｋｓ／ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ−ｏｆ−ｂａｃｔｅｒｉａｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；
８２．Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９２ Ｏｃｔ；１７４（１９）：６０６１−７０． ＰＭＩＤ：１３５６９６４；
８３．Ｌｏｄｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ． Ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｄ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ａ ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｏｄｅｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ． ２００８ Ａｐｒ；３４（１−２）：９１−１０６． ＰＭＩＤ：１９６６９４９５；
８４．Ｒｅｂｏｕｌ ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｐｉｃｏｌｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ． ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ． ２０１２；８（６）：ｅ１００２５３７．ＰＭＩＤ：２２６８５３９０；
８５．Ｓａｉｎｔ−Ｇｉｒｏｎｓ ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔＪ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８４ Ｎｏｖ ２５；２５９（２２）：１４２８２−５． ＰＭＩＤ：６０９４５４９；
８６．Ｓｈｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｅｔＪ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔＦ ｇｅｎｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９８５ Ｊｕｎ；８２（１１）：３６０１−５． ＰＭＩＤ：１６５９３５６４；
８７．ｖａｎ Ｈｅｅｓｗｉｊｋ ｅｔ ａｌ． Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｐｕｔｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄａｔａ ｉｎｔｏ ａ ｓｙｓｔｅｍｓ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ． ２０１３ Ｄｅｃ；７７（４）：６２８−９５．ＰＭＩＤ：２４２９６５７５．

【実施例】

【0287】

以下の例は、本開示の例示的な実施形態を提供する。当業者は、本開示の趣旨または範囲を変更することなく多数の修正および変更が実行できることを理解しよう。このような修正および変更は、本開示の範囲内に包含される。実施例は、決して本開示を限定しない。

【0288】

アルギニンリプレッサ結合部位（ＡＲＧボックス）
実施例１．ＡＲＧボックス突然変異
大腸菌Ｎｉｓｓｌｅのアルギニン生合成オペロンごとにＡｒｇＲ結合部位を含む野生型ゲノム配列を図６に示す。それらの配列に対する改変は、以下のパラメータに従い設計される。各野生型配列について、ＡＲＧボックスはイタリック体で示す。アルギニンレギュロンのＡＲＧボックスは、各オペロンのプロモータ領域と一部重複する。下線を引いた配列はＲＮＡポリメラーゼ結合部位を表し、その配列は変更されない。ＡｒｇＲ結合時にＤＮＡメチル化から保護される塩基を強調表示し、ＡｒｇＲ結合時にヒドロキシラジカルアタックから保護される塩基は太字にする。強調表示した太字の塩基は、ＡｒｇＲ結合を破壊する突然変異の主要標的である。

【0289】

実施例２．ラムダレッド組換え
ラムダレッド組換えを用いて、染色体改変、例えばＡＲＧボックス突然変異を作成する。ラムダレッドは、バクテリオファージラムダに由来する組換え酵素を用いて、カスタムＤＮＡの一片を大腸菌の染色体に挿入する手順である。ｐＫＤ４６プラスミドを大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ宿主株に形質転換する。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ細胞をＬＢ培地において一晩増殖させる。一晩たった培養物を５ｍＬのＬＢ培地において１：１００で希釈し、ＯＤ_６００が０．４〜０．６に到達するまで増殖させる。全てのチューブ、溶液、およびキュベットを、予め４℃まで冷却する。大腸菌細胞を４℃で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを取り除き、細胞を４℃の水１ｍＬに再懸濁する。大腸菌を４℃で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを取り除き、細胞を４℃の水０．５ｍＬに再懸濁する。大腸菌を４℃で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを取り除き、細胞を４℃の水０．１ｍＬに再懸濁する。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定する。１ｎｇのｐＫＤ４６プラスミドＤＮＡを大腸菌細胞に加え、ピペットすることにより混ぜ、滅菌した冷却キュベットにピペットする。乾いたキュベットをサンプルチャンバに置き、電気パルスを適用する。１ｍＬの室温ＳＯＣ培地をすぐに加え、混合物を培養チューブに移し、３０℃で１時間インキュベートする。細胞を選択性培地プレートに広げ、３０℃で一晩インキュベートする。

【0290】

図６に示す所望のＡＲＧボックス配列を含むＤＮＡ配列を、遺伝子合成会社に発注した。ａｒｇＡオペロンについては、突然変異調節領域が以下の核酸配列（配列番号２）を含む：
ｇｃａａａａａａａｃａＣＴＴｔａａａａａＣＴＴａａｔａａｔｔｔｃＣＴＴｔａａｔｃａＣＴＴａａａｇａｇｇｔｇｔａｃｃｇｔｇ。

【0291】

ラムダ酵素を用いて、この構成物を、相同組換えを介して大腸菌Ｎｉｓｓｌｅのゲノムに挿入する。構成物は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅのゲノムの特定の部位に、そのＤＮＡ配列に基づいて挿入する。構成物を特定の部位に挿入するため、構成物に隣接する相同性ＤＮＡ配列を特定する。ＤＮＡの相同性配列は、突然変異した配列の何れかの側に約５０塩基を含む。相同性配列は、合成遺伝子の一部として注文する。あるいは、相同性配列をＰＣＲによって加えることができる。構成物を用いて大腸菌ＮｉｓｓｌｅゲノムのａｒｇＡの上流の天然配列を置き換える。構成物は、組換えによって取り除くことのできる抗生物質耐性マーカを含む。結果として生じる突然変異ａｒｇＡ構成物は、ａｒｇＡの上流に約５０の相同塩基を含み、組換えによって取り除くことが可能なカナマイシン耐性マーカ、ｇｃａａａａａａａｃａＣＴＴｔａａａａａＣＴＴａａｔａａｔｔｔｃＣＴＴｔａａｔｃａＣＴＴａａａｇａｇｇｔｇｔａｃｃｇｔｇと、ａｒｇＡに対し相同的な約５０の塩基とを含む。

【0292】

一部の実施形態では、ＡＲＧボックスを上記のようにａｒｇＧ調節領域において突然変異させ、ＢＢａ＿Ｊ２３１００構成プロモータをラムダレッド組換えを用いて調節領域に挿入した（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０５）。これらの細菌はアルギニンを生成することが可能であった。代替の実施形態では、ａｒｇＧ調節領域（配列番号３１）は依然としてＡｒｇＲ阻害性を保ち、細菌はシトルリンを生成することが可能であった。

【0293】

実施例３．大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの形質転換
突然変異ＡＲＧボックス構成物を、ｐＫＤ４６を含む大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに形質転換する。全てのチューブ、溶液、およびキュベットを予め４℃まで冷却する。一晩たった培養物を、アンピシリンを含有する５ｍＬのＬＢ培地において１：１００に希釈し、ＯＤ_６００が０．１に到達するまで増殖させる。０．０５ｍＬの１００Ｘ Ｌ−アラビノース原液を加えて、ｐＫＤ４６ラムダレッド発現を誘導する。培養物のＯＤ_６００が０．４〜０．６に到達するまで増殖させる。大腸菌を４℃で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを取り除き、細胞を４℃の水１ｍＬに再懸濁する。大腸菌細胞を４℃で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを取り除き、細胞を４℃の水０．５ｍＬに再懸濁する。大腸菌を４℃で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを取り除き、細胞を４℃の水０．１ｍＬに再懸濁する。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定する。０．５μｇの突然変異ＡＲＧボックス構成物を細胞に加え、ピペットすることにより混ぜ、滅菌した冷却キュベットにピペットする。乾いたキュベットをサンプルチャンバに置き、電気パルスを適用する。１ｍＬの室温ＳＯＣ培地をすぐに加え、混合物を培養チューブに移し、３７℃で１時間インキュベートする。細胞を、カナマイシンを含有するＬＢプレートに広げ、一晩インキュベートする。

【0294】

実施例４．突然変異体の確認
突然変異の存在をコロニーＰＣＲにより確認する。コロニーをピペットの先で取り、上下にピペットすることにより２０μＬの低温ｄｄＨ_２Ｏに再懸濁する。３μＬの懸濁液を、後で用いる適切な抗生物質を有するインデックスプレートにピペットする。インデックスプレートを３７℃で一晩増殖させる。ＰＣＲマスターミックスを、５μＬの１０ＸＰＣＲ緩衝液、０．６μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．４μＬの５０ｍＭ Ｍｇ_２ＳＯ_４、６．０μＬの１０Ｘエンハンサー、および３．０μＬのｄｄＨ_２Ｏを用いて作成する（ＰＣＲ反応毎に１５μＬのマスターミックス）。１０μＭのプライマーミックスを、ａｒｇＡ突然変異構成物に対し固有の２μＬのプライマー（１００μＭストック）を１６μＬのｄｄＨ_２Ｏに混ぜることにより作成する。各２０μＬの反応に対し、１５μＬのＰＣＲマスターミックス、２．０μＬのコロニー懸濁液（鋳型）、２．０μＬのプライマーミックス、および１．０μＬのＰｆｘ（登録商標）Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＤＮＡ ＰｏｌをＰＣＲチューブにおいて混ぜ合わせる。ＰＣＲサーモサイクラーを以下のようにプログラミングし、ステップ２〜４を３４回繰り返す：１）５：００分で９４℃、２）０：１５分で９４℃、３）０：３０分で５５℃、４）２：００分で６８℃、５）７：００分で６８℃、次に４℃まで冷却する。ＰＣＲ産物を１０μＬの各アンプリコンおよび２．５μＬの５Ｘ色素を用いて、ゲル電気泳動により解析する。ＰＣＲ産物は、突然変異がゲノムに挿入されている場合にのみ生じる。

【0295】

実施例５．選択性マーカの除去
抗生物質耐性遺伝子を、ｐＣＰ２０を用いて除去する。突然変異ＡＲＧボックスを有する各株を、抗生物質を含有するＬＢ培地において、３７℃で、ＯＤ_６００が０．４〜０．６に到達するまで増殖させる。全てのチューブ、溶液、およびキュベットを、予め４℃まで冷却する。細胞を４℃で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを取り除き、細胞を４℃の水１ｍＬに再懸濁する。大腸菌を４℃で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを取り除き、細胞を４℃の水０．５ｍＬに再懸濁する。大腸菌を４℃で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを取り除き、細胞を４℃の水０．１ｍＬに再懸濁する。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定する。１ｎｇのｐＣＰ２０プラスミドＤＮＡを細胞に加え、ピペットすることにより混ぜ、滅菌した冷却キュベットにピペットする。乾いたキュベットをサンプルチャンバに置き、電気パルスを適用する。１ｍＬの室温ＳＯＣ培地をすぐに加え、混合物を培養チューブに移し、３０℃で１〜３時間インキュベートする。細胞を、カナマイシンを含有するＬＢプレートに広げ、一晩インキュベートする。一晩で十分なＯＤ_６００まで増殖しないコロニーは追加で２４時間さらにインキュベートする。２００μＬの細胞をアンピシリンプレートに広げ、２００μＬの細胞をカナマイシンプレートに広げ、両方を一晩３７℃で増殖させる。アンピリシンプレートはｐＣＰ２０を有する細胞を含有する。カナマイシンプレートは、どれぐらいの細胞がエレクトロポレーションに耐えたかについての指標となる。アンピシリンプレートからの形質転換体を非選択的に４３℃で精製し、一晩増殖させる。

【0296】

実施例６．形質転換体の確認
精製した形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンに対する感受性についてテストする。４３℃で増殖させたプレートのコロニーを取り、１０μＬのＬＢ培地に再懸濁する。３μＬの細胞懸濁液を３つのプレートそれぞれにピペットする：１）３７℃でインキュベートしたカナマイシンを有するＬＢプレートであって、宿主株のゲノムにおけるＫａｎＲ遺伝子の有無をテストするプレート；２）３０℃でインキュベートしたアンピシリンを有するＬＢプレートであって、ｐＣＰ２０プラスミドに由来するＡｍｐＲ遺伝子の有無をテストするプレート；３）３７℃でインキュベートした抗生物質なしのＬＢプレート。カナマイシンまたはアンピシリンプレートにおいて特定のコロニーについて増殖が観察されない場合、ＫａｎＲ遺伝子およびｐＣＰ２０プラスミドの両方が失われており、コロニーはさらなる解析のために保存される。保存されたコロニーをＬＢプレートに再度筋状に置いて単一コロニーを得、３７℃で一晩増殖させる。突然変異ゲノムＡＲＧボックスの存在を、ゲノムのａｒｇＡ領域をシーケンシングすることにより確かめる。

【0297】

ラムダレッド組換え、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの形質転換、突然変異の確認、選択性マーカの除去、および形質転換体の確認／シーケンシングのための方法を、図６に示すＡＲＧボックス突然変異およびオペロンのそれぞれについて繰り返す。結果として生じる細菌は、アルギニン生合成酵素をコードする１つまたは複数のオペロンの各ＡＲＧボックスにおいて突然変異を含み、その結果、ＡＲＧボックスへのＡｒｇＲ結合が低減し、前記オペロンの調節領域への全ＡｒｇＲ結合が低減する。

【0298】

実施例７．アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ（ａｒｇＡ^ｆｂｒ）
上記のＡＲＧボックス突然変異に加え、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ細菌はさらに、以下のプロモータ：テトラサイクリン誘導性プロモータ、配列番号１６〜２７から選択されるＦＮＲプロモータの何れかの制御下で発現するアルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ（ａｒｇＡ^ｆｂｒ、配列番号２８）の遺伝子を含む。本明細書に記載するように、他のプロモータも用いることができる。

【0299】

ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は、高コピープラスミド、低コピープラスミド、または染色体において発現する。ＳＹＮ―ＵＣＤ１０１は、野生型ＡｒｇＲ、野生型ＡｒｇＡ、プラスミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒを含み、各アルギニン生合成オペロンの各ＡＲＧボックスにおいて突然変異を含む。プラスミドは機能性ＡｒｇＲ結合部位、つまりＡＲＧボックスを含まない。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０１を用いてＳＹＮ−ＵＣＤ１０２を生成したが、これは野生型ＡｒｇＲ、野生型ＡｒｇＡ、プラスミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒを含み、各アルギニン生合成オペロンの各ＡＲＧボックスにおいて突然変異を含む。プラスミドはさらに、機能性ＡｒｇＲ結合部位、つまりＡＲＧボックスをさらに含む。一部の場合では、機能性ＡｒｇＲの存在および／または蓄積は、ＡＲＧボックス以外の部位でのオフターゲット結合の原因となり得る。このプラスミドにおける機能性ＡＲＧボックスの導入は、つまり、ＡｒｇＲシンクとして作用させることにより、オフターゲットＡｒｇＲ結合を低減または消失させるのに有用であり得る。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０４は、野生型ＡｒｇＲ、野生型ＡｒｇＡ、低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒ、テトラサイクリン誘導性ａｒｇＧを含み、ａｒｇＧを除く各アルギニン生合成オペロンの各ＡＲＧボックスにおいて突然変異を含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０５は、野生型ＡｒｇＲ、野生型ＡｒｇＡ、低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒ、構成的に発現したａｒｇＧ（ＢＢａ＿Ｊ２３１００構成的プロモータを含む配列番号３１）を含み、各アルギニン生合成オペロンの各ＡＲＧボックスにおいて突然変異を含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３は対照Ｎｉｓｓｌｅ構成物である。

【0300】

ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの以下の挿入部位のうち１つまたは複数で細菌ゲノムに挿入する：ｍａｌＥ／Ｋ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｔｈｙＡ、ｍａｌＰ／Ｔ。任意の適切な挿入部位を用いることができる。例えば図２２を参照。挿入部位はゲノムのどこでもよく、例えば、（栄養要求株を生成する）ｔｈｙＡなどの生存および／もしくは増殖に必要な遺伝子；ゲノム複製部位の近くなどのゲノム活性領域；ならびに／または、意図しない転写のリスクを低減させるため、アラビノースオペロンのＡｒａＢとＡｒａＣの間など、分岐プロモータの間でよい。挿入部位において、挿入部位およびａｒｇＡ^ｆｂｒ構成物に対し相同的なＤＮＡプライマーを設計する。標的部位に対し相同性を有する構成物を含有する直鎖状ＤＮＡ断片をＰＣＲにより生成し、ラムダレッド組換えを上記のように実行する。

【0301】

結果として生じる大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ細菌を、アルギニン生合成酵素をコードする１つまたは複数のオペロンの―ＡｒｇＲ結合およびＮ−アセチルグルタミン酸シンセターゼへのアルギニン結合を介した―アルギニン介在性阻害を低減させる核酸突然変異を含むように遺伝子操作し、それによりアルギニンおよび／またはシトルリンの生合成を強化する（図２５）。

【0302】

アルギニンリプレッサ（ＡｒｇＲ）
実施例８．ＡｒｇＲ配列
大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの野生型ａｒｇＲヌクレオチド配列およびａｒｇＲ削除後のヌクレオチド配列を以下に示す。

【0303】

【表4】

【0304】

【表5】

【0305】

実施例９．ＡｒｇＲの削除
ｐＫＤ４６プラスミドを、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ宿主株に形質転換する。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ細胞をＬＢ培地において一晩増殖させる。一晩たった培養物を５ｍＬのＬＢ培地において１：１００で希釈し、ＯＤ_６００が０．４〜０．６に到達するまで増殖させる。全てのチューブ、溶液、およびキュベットを、予め４℃まで冷却する。大腸菌細胞を４℃で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを取り除き、細胞を４℃の水１ｍＬに再懸濁する。大腸菌を４℃で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを取り除き、細胞を４℃の水０．５ｍＬに再懸濁する。大腸菌を４℃で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを取り除き、細胞を４℃の水０．１ｍＬに再懸濁する。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定する。１ｎｇのｐＫＤ４６プラスミドＤＮＡを大腸菌細胞に加え、ピペットすることにより混ぜ、滅菌した冷却キュベットにピペットする。乾いたキュベットをサンプルチャンバに置き、電気パルスを適用する。１ｍＬの室温ＳＯＣ培地をすぐに加え、混合物を培養チューブに移し、３０℃で１時間インキュベートする。細胞を選択性培地プレートに広げ、３０℃で一晩インキュベートする。

【0306】

ＡｒｇＲ遺伝子の上流および下流の約５０の相同塩基を、ＰＣＲによりｐＫＤ４プラスミドのカナマイシン抵抗遺伝子に加え、以下のＫａｎＲ構成物：（ＡｒｇＲ上流の〜５０塩基）（ターミネータ）（ｐＫＤ４由来のＦＲＴ部位に隣接するＫａｎＲ遺伝子）（ＡｒｇＲの下流のＤＮＡ）を生成する。

【0307】

一部の実施形態では、ａｒｇＲ遺伝子およびａｒｇＧ遺伝子の両方を上記のようにラムダレッド組換えを用いて削除し、細菌はシトルリンを生成することが可能である。

【0308】

実施例１０．大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの形質転換
ＡｒｇＲを削除するために、ＫａｎＲ構成物を、ｐＫＤ４６を含む大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに形質転換する。全てのチューブ、溶液、およびキュベットを予め４℃まで冷却する。一晩たった培養物をアンピシリンを含有する５ｍＬのＬＢ培地において１：１００に希釈し、ＯＤ_６００が０．１に到達するまで増殖させる。０．０５ｍＬの１００Ｘ Ｌ−アラビノース原液を加えて、ｐＫＤ４６ラムダレッド発現を誘導する。培養物のＯＤ_６００が０．４〜０．６に到達するまで増殖させる。大腸菌細胞を４℃で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを取り除き、細胞を４℃の水１ｍＬに再懸濁する。大腸菌を４℃で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを取り除き、細胞を４℃の水０．５ｍＬに再懸濁する。大腸菌を４℃で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを取り除き、細胞を４℃の水０．１ｍＬに再懸濁する。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定する。０．５μｇのＫａｎＲ構成物を細胞に加え、ピペットすることにより混ぜ、滅菌した冷却キュベットにピペットする。乾いたキュベットをサンプルチャンバに置き、電気パルスを適用する。１ｍＬの室温ＳＯＣ培地をすぐに加え、混合物を培養チューブに移し、３７℃で１時間インキュベートする。細胞を、カナマイシンを含有するＬＢプレートに広げ、一晩インキュベートする。

【0309】

実施例１１．突然変異体の確認
突然変異の存在をコロニーＰＣＲにより確認する。コロニーをピペットの先で取り、上下にピペットすることにより２０μＬの低温ｄｄＨ_２Ｏに再懸濁する。３μＬの懸濁液を、後で用いる適切な抗生物質を有するインデックスプレートにピペットする。インデックスプレートを３７℃で一晩増殖させる。ＰＣＲマスターミックスを、５μＬの１０ＸＰＣＲ緩衝液、０．６μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．４μＬの５０ｍＭ Ｍｇ_２ＳＯ_４、６．０μＬの１０Ｘエンハンサー、および３．０μＬのｄｄＨ_２Ｏを用いて作成する（ＰＣＲ反応毎に１５μＬのマスターミックス）。１０μＭのプライマーミックスを、ＫａｎＲ遺伝子に対し固有の２μＬのプライマー（１００μＭストック）を１６μＬのｄｄＨ_２Ｏに混ぜることにより作成する。各２０μＬの反応に対し、１５μＬのＰＣＲマスターミックス、２．０μＬのコロニー懸濁液（鋳型）、２．０μＬのプライマーミックス、および１．０μＬのＰｆｘ（登録商標）Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＤＮＡ ＰｏｌをＰＣＲチューブにおいて混ぜ合わせる。ＰＣＲサーモサイクラーを以下のようにプログラミングし、ステップ２〜４を３４回繰り返す：１）５：００分で９４℃、２）０：１５分で９４℃、３）０：３０分で５５℃、４）２：００分で６８℃、５）７：００分で６８℃、次に４℃まで冷却する。ＰＣＲ産物を１０μＬの各アンプリコンおよび２．５μＬの５Ｘ色素を用いて、ゲル電気泳動により解析する。ＰＣＲ産物は、ＫａｎＲ遺伝子がゲノムに挿入されている場合にのみ生じる。

【0310】

実施例１２．選択性マーカの除去
抗生物質耐性遺伝子をｐＣＰ２０を用いて除去する。ＡｒｇＲが削除された株を、抗生物質を含有するＬＢ培地において、３７℃で、ＯＤ_６００が０．４〜０．６に到達するまで増殖させる。全てのチューブ、溶液、およびキュベットを、予め４℃まで冷却する。細胞を４℃で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを取り除き、細胞を４℃の水１ｍＬに再懸濁する。大腸菌を４℃で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを取り除き、細胞を４℃の水０．５ｍＬに再懸濁する。大腸菌を４℃で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを取り除き、細胞を４℃の水０．１ｍＬに再懸濁する。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定する。１ｎｇのｐＫＤ２０プラスミドＤＮＡを細胞に加え、ピペットすることにより混ぜ、滅菌した冷却キュベットにピペットする。乾いたキュベットをサンプルチャンバに置き、電気パルスを適用する。１ｍＬの室温ＳＯＣ培地をすぐに加え、混合物を培養チューブに移し、３０℃で１〜３時間インキュベートする。２００μＬの細胞をアンピシリンプレートに広げ、２００μＬの細胞をカナマイシンプレートに広げ、両方を一晩３７℃で増殖させる。アンピリシンプレートはｐＣＰ２０を有する細胞を含有する。細胞を一晩インキュベートし、一晩で十分なＯＤ_６００まで増殖しないコロニーは追加で２４時間さらにインキュベートする。カナマイシンプレートは、どれぐらいの細胞がエレクトロポレーションに耐えたかについての指標となる。アンピシリンプレートからの形質転換体を非選択的に４３℃で精製し、一晩増殖させる。

【0311】

実施例１３．形質転換体の確認
精製した形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンに対する感受性についてテストする。４３℃で増殖させたプレートのコロニーを取り、１０μＬのＬＢ培地に再懸濁する。３μＬの細胞懸濁液を３つのプレートそれぞれにピペットする：１）３７℃でインキュベートしたカナマイシンを有するＬＢプレートであって、宿主株のゲノムにおけるＫａｎＲ遺伝子の有無をテストする、プレート；２）３０℃でインキュベートしたアンピシリンを有するＬＢプレートであって、ｐＣＰ２０プラスミドに由来するＡｍｐＲ遺伝子の有無をテストする、プレート；３）３７℃でインキュベートした抗生物質なしのＬＢプレート。カナマイシンまたはアンピシリンのプレートにおいて特定のコロニーについて増殖が観察されない場合、ＫａｎＲ遺伝子およびｐＣＰ２０プラスミドの両方が失われており、コロニーはさらなる解析のために保存される。単一コロニーを得るため、保存されたコロニーをＬＢプレートに再度筋状に置いて単一コロニーを得、３７℃で一晩増殖させる。ＡｒｇＲの欠損を、ゲノムのａｒｇＲ領域をシーケンシングすることにより確かめる。

【0312】

実施例１４．アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ（ａｒｇＡ^ｆｂｒ）
上記のＡｒｇＲ欠失に加え、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ細菌はさらに、以下のプロモータ：テトラサイクリン誘導性プロモータ、配列番号１６〜２７から選択されるＦＮＲプロモータのそれぞれの制御下で発現する、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ（ａｒｇＡ^ｆｂｒ、配列番号２８）遺伝子を含む。本明細書で記載するように、他のプロモータも用いることができる。

【0313】

ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子は、高コピープラスミド、低コピープラスミド、または染色体において発現する。ＳＹＮ―ＵＣＤ２０１、ＳＹＮ―ＵＣＤ２０２、およびＳＹＮ―ＵＣＤ２０３のそれぞれにおいて、ＡｒｇＲは削除されている（ΔＡｒｇＲ）。ＳＹＮ―ＵＣＤ２０１はさらに野生型ａｒｇＡ^ｆｂｒを含むが、誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒは欠く。ＳＹＮ―ＵＣＤ２０２は、ΔＡｒｇＲと、高コピープラスミドにおいてテトラサイクリン誘導性プロモータの制御下で発現するａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。ＳＹＮ―ＵＣＤ２０３は、ΔＡｒｇＲと、低コピープラスミドにおいてテトラサイクリン誘導性プロモータの制御下で発現するａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。ＳＹＮ―ＵＣＤ２０４は、ΔＡｒｇＲと、低コピープラスミドにおいてテトラサイクリン誘導性プロモータの制御下で発現するａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。ＳＹＮ―ＵＣＤ２０５は、ΔＡｒｇＲと、低コピープラスミドにおいてＦＮＲ誘導性プロモータ（ｆｎｒＳ２）の制御下で発現するａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。

【0314】

ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子を、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの以下の挿入部位のうち１つまたは複数で細菌ゲノムに挿入する：ｍａｌＥ／Ｋ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｔｈｙＡ、ｍａｌＰ／Ｔ。任意の適切な挿入部位を用いることができる。例えば図２２を参照。挿入部位はゲノムのどこでもよく、例えば、（栄養要求株を生成する）ｔｈｙＡなどの生存および／もしくは増殖に必要な遺伝子；ゲノム複製部位の近くなどのゲノム活性領域；ならびに／または、意図しない転写のリスクを低減させるため、アラビノースオペロンのＡｒａＢとＡｒａＣの間など、分岐プロモータの間でよい。挿入部位において、挿入部位およびａｒｇＡ^ｆｂｒ構成物に対し相同的なＤＮＡプライマーを設計する。標的部位に対し相同性を有する構成物を含有する直鎖状ＤＮＡ断片をＰＣＲにより生成し、ラムダレッド組換えを上記のように実行する。結果として生じる大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ細菌はＡｒｇＲが削除され、フィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンセターゼが挿入され、それによりアルギニンまたはシトルリンの生合成が増大している。

【0315】

実施例１５．アンモニアの定量化
上記の遺伝子操作した細菌を５ｍＬのＬＢにおいて一晩増殖させた。翌日、細胞をペレット化し、Ｍ９＋グルコースにおいて洗浄し、ペレット化し、３ｍＬのＭ９＋グルコースにおいて再懸濁した。細胞培養物を４時間振とう（２５０ｒｐｍ）しながらインキュベートし、３７℃で、好気的に、またはＣｏｙ嫌気的チャンバ（９０％Ｎ_２、５％ＣＯ_２、５％Ｈ_２を供給）において嫌気的にインキュベートした。ベースライン（ｔ＝０）、２時間目、および４時間目で、各細胞培養物のＯＤ_６００を、各細胞の相対豊富度を求めるために測定した。

【0316】

ｔ＝０、２時間目、および４時間目に、培地中のアンモニア濃度を求めるために、各細胞培養物の１ｍＬアリコットをＮｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３００で解析した。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ１０２は両方ともｉｎ ｖｉｔｒｏでアンモニアを消費することが可能だった。図２８Ａ、Ｂ、およびＣには、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３、およびブランク対照を用いたアンモニア濃度についての棒グラフを描く。

【0317】

図１６．アルギニンおよびシトルリンの定量化
一部の実施形態では、上記の遺伝子操作した細菌を、一晩ＬＢにおいて振とうしながら増殖させる。細菌を５ｍＬのＬＢにおいて１：１００に希釈し、１．５時間振とうしながら３７℃で増殖させる。細菌培養物を以下のように誘導する：（１）ＦＮＲ誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒを含む細菌を、３７℃で、Ｃｏｙ嫌気的チャンバ（９０％Ｎ_２、５％ＣＯ_２、５％Ｈ_２、および２０ｍＭ硝酸を供給）において嫌気的条件下で最長４時間、３７℃でＬＢにおいて誘導する；（２）テトラサイクリン誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒを含む細菌を、アンヒドロテトラサイクリン（１００ｎｇ／ｍＬ）を用いて誘導する；（３）アラビノース誘導性ａｒｇＡ^ｆｂｒを含む細菌を、グルコースを欠く培地において１％アラビノースを用いて誘導する。誘導後、細菌細胞をインキュベータから取り出し、５分間最高速度でスピンダウンする。細胞を１ｍＬのＭ９グルコースに再懸濁し、ＯＤ_６００を測定する。ＯＤ_６００が０．６〜０．８になるまで細胞を希釈する。Ｍ９グルコース培地中の再懸濁した細胞を、３７℃で振とうしながら好気的に増殖させる。１００μＬの細胞再懸濁液を取り出し、ＯＤ_６００を時間＝０で測定する。１００μＬのアリコットを、質量分析用の丸底９６ウェルプレートにおいて−２０℃で凍らせる（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）。後続の各時点において、１００μＬの細胞懸濁液を取り出し、ＯＤ_６００を測定し；１００μＬのアリコットを、質量分析用の丸底９６ウェルプレートにおいて−２０℃で凍らせる。サンプルをアルギニンおよび／またはシトルリンの濃度について解析する。各時点で、質量分析により求められる正規化濃度対ＯＤ_６００を用いて、単位時間当たりの細胞ごとのアルギニンおよび／またはシトルリンの生成割合を求める。

【0318】

一部の実施形態では、上記の遺伝子操作した細菌を、アガー上で、単一コロニー用にグリセロールストックから縞状に置く。コロニーを取り、３ｍＬのＬＢにおいて４時間または一晩増殖させ、次に５分間２５００ｒｃｆで遠心分離する。培養物を０．５％グルコースを有するＭ９培地において洗浄する。培養物を０．５％グルコースを有する３ｍＬのＭ９培地に再懸濁し、ＯＤ_６００を測定する。培養物を、ＡＴＣ（１００ｎｇ／ｍＬ）を有するまたは有さない、２０ｍＭグルタミンを有するまたは有さない、０．５％グルコースを有するＭ９培地に希釈し、その結果、全てのＯＤ_６００を０．４〜０．５にする。各サンプルの０．５ｍＬのアリコットを取り出し、５分間１４０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを取り出し、保存する。上澄みを−８０℃で凍らせ、細胞ペレットを−８０℃で凍らせる（ｔ＝０）。残った細胞を４〜６時間振とう（２５０ｒｐｍ）しながら増殖させ、３７℃で、好気的に、またはＣｏｙ嫌気的チャンバ（９０％Ｎ_２、５％ＣＯ_２、５％Ｈ_２を供給）において嫌気的にインキュベートする。０．５ｍＬアリコット１つを各サンプルから２時間ごとに取り出し、ＯＤ_６００を測定する。アリコットを５分間１４０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを取り出す。上澄みを−８０℃で凍らせ、細胞ペレットを−８０℃で凍らせる（ｔ＝２、４、および６時間）サンプルを氷に置き、アルギニンおよびシトルリンのレベルを質量分析を用いて求める。

【0319】

細菌培養物の上澄みに対し、５００、１００、２０、４、および０．８μｇ／ｍＬのアルギニンおよびシトルリン標準液のサンプルを調製する。丸底９６ウェルプレートにおいて、２０μＬのサンプル（細菌上澄みまたは標準液）を、Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ−^１３Ｃ_６、^１５Ｎ_４（Ｓｉｇｍａ）およびＬ−シトルリン−２，３，３，４，４，５，５−ｄ７（ＣＤＮアイソトープ）内部標準物質を２μｇ／ｍＬの最終濃度で有する、８０μＬの水に加える。プレートをＰｉｅｒｃｅＡＳｅａｌ ｆｏｉｌを用いてヒートシールし、よく混ぜる。Ｖ底９６ウェルポリプロピレンプレートにおいて、５μＬの希釈サンプルを、９５μＬの誘導体化混合物（８５μＬの１０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３ ｐＨ９．７および１０μＬの１０ｍｇ／ｍＬダンシルクロリド（アセトニトリルに希釈してある）に加える。プレートをＴｈｅｒｍＡＳｅａｌ ｆｏｉｌを用いてヒートシールし、よく混ぜる。サンプルを誘導体化のために６０℃で４５分間インキュベートし、５分間４０００ｒｐｍで遠心分離する。丸底９６ウェルプレートにおいて、２０μＬの誘導体化サンプルを０．１％ギ酸を有する１８０μＬの水に加える。プレートをＣｌｅａｒＡＳｅａｌ ｓｈｅｅｔを用いてヒートシールし、よく混ぜる。

【0320】

アルギニンおよびシトルリンを、Ｔｈｅｒｍｏ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｍａｘ ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて、タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）に結合させた液体クロマトグラフィにより測定する。以下の表で、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の概要を提供する。

【0321】

【表6】

【0322】

図５１は、ベースライン、２時間目、および４時間目における、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０２、およびブランク対照に由来する培養培地のｉｎ ｖｉｔｒｏでのアンモニアレベルについての棒グラフを描く。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ１０２は両方ともｉｎ ｖｉｔｒｏでアンモニアを消費することが可能である。

【0323】

図５２は、誘導（＋ＡＴＶ）および非誘導（−ＡＴＣ）の条件下での、非改変Ｎｉｓｓｌｅ、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２、およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０３により生成されるｉｎ ｖｉｔｒｏのアルギニンレベルについての棒グラフを描く。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０３は両方とも、非改変ＮｉｓｓｌｅおよびＳＹＮ−ＵＣＤ２０１と比較し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアルギニンを生成することが可能だった。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０３は、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２と比較し、非誘導条件下でより低レベルのアルギニン生成を示した。

【0324】

図２４は、誘導（＋ＡＴＣ）および非誘導（−ＡＴＣ）の条件下で、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２、およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０３により生成されるｉｎ ｖｉｔｒｏでのアルギニンレベルについての棒グラフを描く。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０１はΔＡｒｇＲを含み、ａｒｇＡ^ｆｂｒを含まない。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２は、ΔＡｒｇＲと、高コピープラスミドにおいてテトラサイクリン駆動ａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０３は、ΔＡｒｇＲと、低コピープラスミドにおいてテトラサイクリン駆動ａｒｇＡ^ｆｂｒを含む。

【0325】

図２５は、誘導条件下で、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４、およびＳＹＮ−ＵＣＤ１０５により生成されるｉｎ ｖｉｔｒｏでのアルギニンおよびシトルリンのレベルについての棒グラフを描く。

【0326】

図２６は、酸素の存在下（＋Ｏ_２）または非存在下（−Ｏ_２）での、誘導（＋ＡＴＣ）および非誘導（−ＡＴＣ）の条件下におけるＳＹＮ−ＵＣＤ１０３、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５、およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０４により生成されるｉｎ ｖｉｔｒｏでのアルギニンレベルについての棒グラフを描く。

【0327】

図２７は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＮｉｓｓｌｅ滞留のグラフを描く。ストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅを、抗生物質の前処置なしに経口胃管投与を介してマウスに投与した。６匹の全マウスの糞便ペレットを投与後にモニターして、マウスの胃腸管になお滞留する投与Ｎｉｓｓｌｅの量を求めた。棒はマウスに投与された細菌の数を表す。線は、連続１０日間の各日の糞便サンプルから発見されたＮｉｓｓｌｅの数を表す。

【0328】

図２８Ａは、非改変対照ＮｉｓｓｌｅまたはＳＹＮ−ＵＣＤ２０２、Ａｒｇリプレッサ遺伝子が削除され、ａｒｇＡ^ｆｂｒ遺伝子が高コピープラスミドにおいてテトラサイクリン誘導性プロモータの制御下にある遺伝子操作株で処置した、高アンモニア血症マウスにおけるアンモニアレベルについての棒グラフを描く。図２８Ｂは、肝性脳症のＴＡＡマウスモデルにおける、ストレプトマイシン耐性対照Ｎｉｓｓｌｅ（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）および溶媒のみの対照と比較したＳＹＮ−ＵＣＤ２０４のｉｎ ｖｉｖｏでの効果（アンモニア消費）を示す棒グラフである。図２８Ｃは、ＴＡＡ処置後２４〜２８時間の血中アンモニア濃度の増減率についての棒グラフを描く。

【0329】

図２９は、ストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅ対照（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）またはＳＹＮ−ＵＣＤ１０４で処置した高アンモニア血症ｓｐｆ^ａｓｈマウスにおけるアンモニアレベルについての棒グラフを描く。

【0330】

ＡＴＣまたは嫌気的誘導因子の存在下または非存在下での、遺伝子操作した細菌における細胞内アルギニンおよび分泌（上澄み）アルギニンの生成量を測定し、同一条件下の同じ株の対照細菌と比較する。

【0331】

ＡＴＣまたは嫌気的誘導因子の存在下または非存在下での、遺伝子操作した細菌の遺伝子操作した細菌における、６時間にわたる総アルギニン生成量を測定し、同一条件下の同じ株の対照細菌と比較する。

【0332】

実施例１７．高アンモニア血症および急性肝不全のマウスモデルにおける遺伝子操作した細菌の効果
野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスを、急性肝不全および高アンモニア血症を引き起こすチオールアセトアミド（ＴＡＡ）で処置する（Ｎｉｃａｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００８）。マウスを非改変対照Ｎｉｓｓｌｅ細菌か、または、上記のように高レベルのアルギニンまたはシトルリンを生成するように遺伝子操作したＮｉｓｓｌｅ細菌で処置する。

【0333】

１日目は、５０ｍＬの細菌培養物を一晩増殖させ、ペレット化する。ペレットを最終濃度が約１０^１１ＣＦＵ／ｍＬのＰＢＳ５ｍＬに再懸濁する。マウスの血中アンモニアレベルを下顎出血により測定し、アンモニアレベルをＰｏｃｋｅｔＣｈｅｍ Ａｍｍｏｎｉａ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｒｋｒａｙ）により求める。マウスに１００μＬの細菌（約１０^１０ＣＦＵ）で経管栄養する。マウス用の飲み水を、０．１ｍｇ／ｍＬのアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴＣ）および味をよくするために５％スクロースを含有するように変更した。

【0334】

２日目は、細菌経管栄養溶液を上記のように調製し、マウスに１００μＬの細菌で経管栄養する。マウスは０．１ｍｇ／ｍＬのＡＴＣおよび５％スクロースを含有する飲み水を与えられ続ける。

【0335】

３日目は、細菌経管栄養溶液を上記のように調製し、マウスに１００μＬの細菌で経管栄養する。マウスは０．１ｍｇ／ｍＬのＡＴＣおよび５％スクロースを含有する飲み水を与えられ続ける。マウスは、１００μＬのＴＡＡ（０．５％ＮａＣｌ中に２５０ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内（ＩＰ）注射を受ける。

【0336】

４日目は、細菌経管栄養溶液を上記のように調製し、マウスに１００μＬの細菌で経管栄養する。マウスは０．１ｍｇ／ｍＬのＡＴＣおよび５％スクロースを含有する飲み水を与えられ続ける。マウスは、１００μＬのＴＡＡ（０．５％ＮａＣｌ中に２５０ｍｇ／ｋｇ体重）の別のＩＰ注射を受ける。マウスの血中アンモニアレベルを下顎出血により測定し、アンモニアレベルをＰｏｃｋｅｔＣｈｅｍ Ａｍｍｏｎｉａ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｒｋｒａｙ）により求める。

【0337】

５日目は、マウスの血中アンモニアレベルを下顎出血により測定し、アンモニアレベルをＰｏｃｋｅｔＣｈｅｍ Ａｍｍｏｎｉａ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｒｋｒａｙ）により求める。糞便ペレットをマウスより採取し、液体クロマトグラフィ質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）によりアルギニン含有量を求める。遺伝子操作したＮｉｓｓｌｅおよび非改変対照Ｎｉｓｓｌｅで処置したマウスのアンモニアレベルを比較する。

【0338】

実施例１８．高アンモニア血症およびＵＣＤのマウスモデルにおける遺伝子操作した細菌の効果
オルニチントランスカルバミラーゼは尿素サイクル酵素であり、ｓｐｆ−ａｓｈ突然変異を含むマウスは軽度のオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症を示し、これはヒトＵＣＤのモデルとして機能する。マウスを非改変対照Ｎｉｓｓｌｅ細菌か、または、上記のように高レベルのアルギニンまたはシトルリンを生成するように遺伝子操作したＮｉｓｓｌｅ細菌で処置する。

【0339】

６０匹のｓｐｆ−ａｓｈマウスを、１００μＬ（ＰＯ ＱＤ）の本発明の遺伝子操作した細菌（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４）またはＨ２Ｏ対照：Ｈ２Ｏ対照、通常食（ｎ＝１５）；Ｈ２Ｏ対照、高タンパク質食（ｎ＝１５）；ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３、高タンパク質食（ｎ＝１５）；ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４、高タンパク質食（ｎ＝１５）で処置した。１日目にマウスを計量し、ケージごとのマウスの体重の差異を最小化するようにグループ分けした。マウスに経管栄養し、２０ｍｇ／ＬのＡＴＣを有する水をケージに加えた。２日目は、朝と午後にマウスに経管栄養した。３日目は、朝にマウスに経管栄養し、計量し、ベースラインのアンモニアレベルを得るために投薬４時間後に採血した。マウスに午後に経管栄養し、食事を７０％タンパク質食に変更した。４日目は、マウスに朝と午後に経管栄養した。５日目は、マウスに朝に経管栄養し、計量し、アンモニアレベルを得るために投薬４時間後に採血した。６日目および７日目は、マウスに朝に経管栄養した。８日目は、マウスに朝に経管栄養し、計量し、アンモニアレベルを得るために投薬４時間後に採血した。９日目は、マウスに朝と午後に経管栄養した、１０日目は、マウスに朝に経管栄養し、計量し、アンモニアレベルを得るために投薬４時間後に採血した。１２日目は、朝と午後にマウスに経管栄養した。１３日目は、マウスに朝に経管栄養し、計量し、アンモニアレベルを得るために投薬４時間後に採血した。血中アンモニアレベル、体重、および生存比率を解析する（図２９）。

【0340】

実施例１９．Ｎｉｓｓｌｅ滞留
非改変大腸菌Ｎｉｓｓｌｅおよび本発明の遺伝子操作した細菌は、消化管または血清において、例えば防御因子により破壊され得る。ｉｎ ｖｉｖｏでの細菌の滞留時間は計算できる。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅのストレプトマイシン耐性株を用いた非限定的例を以下に記載する。代替の実施形態では、本発明の遺伝子操作した細菌について、滞留時間を計算する。

【0341】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスを１週間、動物施設で慣らした。１週間の順化後（つまり０日目）、ストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅ（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）を１〜３日目に経口胃管投与を介してマウスに投与した。マウスを抗生物質で前処置した。投与した細菌、つまり接種剤の量をＴａｂｌｅ ４に示す。接種剤のＣＦＵを求めるため、接種剤を階段希釈し、ストレプトマイシン（３００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレートに置いた。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、コロニーを数えた。

【0342】

【表7】

【0343】

２〜１０日目に、糞便ペレットを最大６匹のマウス（ＩＤ Ｎｏ．１〜６；Ｔａｂｌｅ ５）から採取した。ペレットをＰＢＳを含有するチューブにおいて計量し、均質化した。糞便ペレット中のＮｉｓｓｌｅのＣＦＵを求めるため、均質化糞便ペレットを階段希釈し、ストレプトマイシン（３００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレートに置いた。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、コロニーを数えた。

【0344】

１日目の糞便ペレットも採取し、ストレプトマイシン（３００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレートに置いて、ストレプトマイシン耐性型の、マウス胃腸管に特有の任意の株があるか確かめた。マウス胃腸管内に未だ滞留する投与されたＮｉｓｓｌｅの経時変化および量をＴａｂｌｅ ５に示す。

【0345】

図２７は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＮｉｓｓｌｅ滞留についてのグラフを描く。ストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅを抗生物質の前処置なしに経口胃管投与を介してマウスに投与した。６匹の全マウスの糞便ペレットを投与後にモニターして、マウスの胃腸管になお滞留する投与Ｎｉｓｓｌｅの量を求めた。棒はマウスに投与した細菌の数を表す。線は、連続１０日間の各日の糞便サンプルから発見されたＮｉｓｓｌｅの数を表す。

【0346】

【表8】

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7-1】

【図7-2】

【図8A】

【図8B-1】

【図8B-2】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図16】

【図17】

【図18-1】

【図18-2】

【図19】

【図20】

【図21A-1】

【図21A-2】

【図21B-1】

【図21B-2】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49A】

【図49B】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62】

【図63】

【図64】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]