特許 6768800 ＣＴＬＡ４結合性物質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6768800

(24)【登録日】2020年9月25日

(45)【発行日】2020年10月14日

(54)【発明の名称】ＣＴＬＡ４結合性物質

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20201005BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20201005BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20201005BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20201005BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20201005BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20201005BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20201005BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20201005BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20201005BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20201005BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20201005BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20201005BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20201005BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20201005BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20201005BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20201005BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20201005BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20201005BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20201005BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/13ZNA

   C07K16/28

   C12P21/08

   C12N15/62 Z

   C12N15/63 Z

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C07K16/46

   A61P31/04

   A61P31/10

   A61P31/12

   A61P31/00

   A61P37/04

   A61P35/00

   A61K39/395 D

   A61K39/395 E

   A61K39/395 N

   A61K39/395 T

   A61K45/00

   A61K38/16

【請求項の数】23

【全頁数】93

(21)【出願番号】特願2018-525615(P2018-525615)

(86)(22)【出願日】2016年11月17日

(65)【公表番号】特表2019-503655(P2019-503655A)

(43)【公表日】2019年2月14日

(86)【国際出願番号】US2016062393

(87)【国際公開番号】WO2017087588

(87)【国際公開日】20170526

【審査請求日】2018年7月10日

(31)【優先権主張番号】62/257,001

(32)【優先日】2015年11月18日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】596129215

【氏名又は名称】メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100151448

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 孝博

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100203035

【弁理士】

【氏名又は名称】五味渕 琢也

(74)【代理人】

【識別番号】100185959

【弁理士】

【氏名又は名称】今藤 敏和

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100202267

【弁理士】

【氏名又は名称】森山 正浩

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】パンノネン，ユハ

(72)【発明者】

【氏名】ビューモント，マリベル

(72)【発明者】

【氏名】バイセ，マリエ−アンジェ

(72)【発明者】

【氏名】ブートン，カーロ

(72)【発明者】

【氏名】ドンブレヒト，ブルーノ

(72)【発明者】

【氏名】ヴィクター，ビョルン

(72)【発明者】

【氏名】カスターリーン，ロバート・エー

【審査官】 林 康子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／０７１４４７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／００７３７６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１５／１７３３２５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J Biol Chem, 2009, Vol.284, No.5, p.3273-3284

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００〜１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＣＴＬＡ４に結合する１または複数の免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むＣＴＬＡ４結合性物質であって、該ＩＳＶＤが、アミノ酸配列：
XVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEREFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAEPSGISGWDYWGQGTLVTVSS
であって、ここでＸはＤまたはＥであるアミノ酸配列（配列番号６０）を含み；半減期エクステンダーおよび／またはＣ末端エクステンダーを含んでもよい、前記ＣＴＬＡ４結合性物質。

【請求項2】

ヒトＣＴＬＡ４に結合する１または複数の免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むＣＴＬＡ４結合性物質であって、該ＩＳＶＤが、配列番号９３−１０９から選択されるアミノ酸配列を含み；そのシグナル配列（アミノ酸ＡＡＡＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＧＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号９３のアミノ酸１２０−１５３））を欠失していてもよい、前記ＣＴＬＡ４結合性物質。

【請求項3】

半減期エクステンダーを含む、請求項１または２のＣＴＬＡ４結合性物質。

【請求項4】

半減期エクステンダーが、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤである、請求項３のＣＴＬＡ４結合性物質。

【請求項5】

ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤが、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４のＣＴＬＡ４結合性物質。

【請求項6】

・配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含み、ここでＸはＤまたはＥである、ＣＴＬＡ４に結合するＩＳＶＤ；
・ペプチドリンカー；
・配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含み、ここでＸはＤまたはＥである、ＣＴＬＡ４に結合するＩＳＶＤ；
・ペプチドリンカー；
・半減期エクステンダー
を含み、そして
・Ｃ末端伸長アラニン
を含んでもよい、請求項１または２のＣＴＬＡ４結合性物質。

【請求項7】

・配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含み、ここでＸはＤまたはＥである、ＣＴＬＡ４に結合するＩＳＶＤ；
・ペプチドリンカー；
・半減期エクステンダー
を含み、そして
・Ｃ末端伸長アラニン
を含んでもよい、請求項１または２のＣＴＬＡ４結合性物質。

【請求項8】

ペプチドリンカーがアミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６５）を含む、請求項６または７のＣＴＬＡ４結合性物質。

【請求項9】

ヒトＣＴＬＡ４に結合する１または複数の免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むＣＴＬＡ４結合性物質であって、アミノ酸配列：

【表1】

（配列番号６２）
を含む、前記ＣＴＬＡ４結合性物質。

【請求項10】

ヒトＣＴＬＡ４に結合する１または複数の免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むＣＴＬＡ４結合性物質であって、アミノ酸配列：

【表2】

（配列番号６４）
を含む、前記ＣＴＬＡ４結合性物質。

【請求項11】

多価である、請求項１または２のＣＴＬＡ４結合性物質。

【請求項12】

請求項１〜１１のいずれか一項のＣＴＬＡ４結合性物質を含み、さらなる治療剤を伴ってもよい、注入装置または容器。

【請求項13】

請求項１〜１１のいずれか一項のＣＴＬＡ４結合性物質をコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項14】

配列番号６１または６３のヌクレオチド配列を含む、請求項１３のポリヌクレオチド。

【請求項15】

請求項１３または１４のいずれか一項のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項16】

請求項１３〜１５のいずれか一項のポリヌクレオチドまたはベクターを含む、宿主細胞。

【請求項17】

ＣＴＬＡ４結合性物質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入すること、および宿主細胞を培地中で前記ポリヌクレオチドからの前記ＣＴＬＡ４結合性物質の発現に好都合な条件下で培養することを含み、そして、前記宿主細胞および／または前記培地からＣＴＬＡ４結合性物質を精製することを含んでもよい、請求項１〜１１のいずれか一項のＣＴＬＡ４結合性物質を作成する方法。

【請求項18】

さらなる治療剤を伴ってもよい、請求項１〜１１のいずれか一項のＣＴＬＡ４結合性物質を含む、ＣＴＬＡ４がＣＤ８０またはＣＤ８６に結合することを防ぐための医薬組成物。

【請求項19】

さらなる治療剤を伴ってもよい、有効量の請求項１〜１１のいずれか一項のＣＴＬＡ４結合性物質を含む、対象の体内において免疫応答を増強するための医薬組成物。

【請求項20】

さらなる治療剤を伴ってもよい、有効量の請求項１〜１１のいずれか一項のＣＴＬＡ４結合性物質を含む、ヒト対象の体内においてがんまたは感染性疾患を治療または予防するための医薬組成物。

【請求項21】

がんが、転移性がん、固形腫瘍、血液がん、白血病、リンパ腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、腎臓がん、白血病、腎臓移行上皮がん、膀胱がん、ウィルムスがん、卵巣がん、膵臓がん、乳がん、前立腺がん、骨がん、肺がん、非小細胞がん、胃がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、滑膜肉腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、腎臓細胞がん、網膜芽細胞腫、肝芽腫、肝細胞癌、黒色腫、腎臓のラブドイド腫瘍、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脳がん、神経膠芽腫、髄膜腫、脳下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原始神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、退形成性星状細胞腫、乏突起膠細胞腫、上衣腫、脈絡叢乳頭腫、真性多血症、血小板血症、特発性骨髄線維症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｍｙｅｌｆｉｂｒｏｓｉｓ）、軟組織肉腫、甲状腺がん、子宮内膜がん、カルチノイドがんまたは肝臓がん、乳がんまたは胃がんである、請求項２０の医薬組成物。

【請求項22】

感染性疾患が、細菌感染症、ウイルス感染症または真菌感染症である、請求項２０の医薬組成物。

【請求項23】

対象にＣＴＬＡ４結合性物質を伴ったさらなる治療剤または治療手法が投与される、請求項２０〜２２のいずれか一項の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１５年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／２５７，００１号の利益を主張するものであり；この文献は参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。

【0002】

コンピュータ読取可能なフォーマットのヌクレオチド／アミノ酸配列表は、参照によりその全体が組み込まれる。配列表を含有するファイルは、２０１６年１１月１５日に作成され、「２４２３７ＷＯＰＣＴＳＥＱ」と名付けられた１００ｋバイトのＡＳＣＩＩテキストファイルである。

【0003】

本発明は、一部において、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（「ＣＴＬＡ４」）、例えばヒトＣＴＬＡ４に結合するアミノ酸配列およびポリペプチドに関する。とりわけ、本発明は、一部において、ＣＴＬＡ４に結合する改変された重鎖免疫グロブリン単一可変ドメイン（本明細書中で「ＩＳＶ」または「ＩＳＶＤ」とも呼ばれる）に、並びにかかるＩＳＶＤを含むタンパク質、ポリペプチドおよび他の構成物、化合物、分子または化学物質に関する。本発明の他の態様、実施形態、特徴、使用および利点は、本明細書中の開示に基づいて当業者に明らかである。

【背景技術】

【0004】

細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）のような免疫制御性分子を抑止することは、免疫系の操作により腫瘍退縮を誘導し、疾患を安定化し、生存を延長させる新しく有望な戦略を代表するものである。抗ＣＴＬＡ４抗体のイピリムマブは、現在、黒色腫を包含する適応症について販売されている。進行時間延長を伴う腫瘍退縮の証拠は、ＣＴＬＡ４抗体を受けた黒色腫患者において認められており、黒色腫、卵巣がん、前立腺がんおよび腎細胞がんの患者においてイピリムマブでの持続的応答が観察されている。

【0005】

完全なＴ細胞活性化には２つのシグナルが必要である。第一のものは、主要組織適合性複合体ＩおよびＩＩを介して抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示される腫瘍関連抗原へのＴ細胞受容体の結合によって開始される。第二のシグナルは、Ｔ細胞上の主要な共刺激受容体であるＣＤ２８がＡＰＣ上のＢ７リガンドサブタイプＣＤ８０およびＣＤ８６に結合するときに生成される。結果として生じる二重のシグナル伝達はＴ細胞増殖およびサイトカイン放出といった変化を誘導し、免疫応答を誘発し、次いで増幅する。Ｔ細胞活性化に応答して、ＣＴＬＡ−４はアップレギュレートされ、ＡＰＣ上のＣＤ８０およびＣＤ８６結合についてＣＤ２８と顕著に高いアフィニティーを持って競合するが、それゆえＴ細胞をダウンレギュレートまたは不活性化する（図１）。ＣＴＬＡ−４は、それゆえ、Ｔ細胞応答およびＡＰＣ機能をダウンレギュレートし、腫瘍関連抗原に対する免疫応答および免疫寛容の減少をもたらす。

【0006】

ＣＴＬＡ４およびＰＤ１がＴ細胞活性化に対するそれらの阻害効果を発揮するメカニズムは多面的である。ＣＴＬＡ４は主にＴ細胞の活性化およびクローン増殖を制限するように機能するが、ＰＤ１は主に末梢組織におけるエフェクターＴ細胞の機能を制限するように機能する。それらの異なる分子構造、制御、シグナル伝達経路、リガンド分布ならびにＴｒｅｇおよび他の免疫細胞に対する機能は、ＣＴＬＡ４およびＰＤ１の組み合わせた治療的遮断が相乗作用することで抗腫瘍免疫を媒介することができることを示唆する。Ｉｎｔｌｅｋｏｆｅｒ ＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｌｅｕｋｏ．Ｂｉｏｌ． ９４（１）：２５−３９（２０１３）；Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１００６７−１００７１（１９９８）；Ｐａｒｒｙ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２５（２１）：９５４３−９５５３（２００５）；Ｃａｌｌａｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ． Ｖｏｌ ４，Ａｒｔ．３８５（２０１５）。

【0007】

ＣＴＬＡ４を介したダウンレギュレーションを阻害する１つの方法は、それをナノボディと結合させることによって、そのリガンドとのその相互作用を妨げることによるものである。ラマを起源とするナノボディは、例えば患者の血清中の先在抗体によるナノボディの結合によって望まれない抗薬剤免疫応答を引き起こす可能性がある。それゆえに、かかる応答を減少させるまたは除去するためにナノボディをヒト化する新規の方法は、かかる方法により生み出されるナノボディと同じく、とりわけ価値がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｉｎｔｌｅｋｏｆｅｒ ＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｌｅｕｋｏ．Ｂｉｏｌ． ９４（１）：２５−３９（２０１３）

【非特許文献2】Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１００６７−１００７１（１９９８）

【非特許文献3】Ｐａｒｒｙ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２５（２１）：９５４３−９５５３（２００５）

【非特許文献4】Ｃａｌｌａｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ． Ｖｏｌ ４，Ａｒｔ．３８５（２０１５）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、次の残基ＶＲＶＴＶＬ（配列番号１１０のアミノ酸３３−３８）、ＡＤＳＱＶＴＥＶＣ（配列番号１１０のアミノ酸４１−４９）およびＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧ（配列番号１１０のアミノ酸９３−１０６）のうちの１または複数において、例えば３つ全ての（ａｌｌ ａｌｌ）部位においてヒトＣＴＬＡ４と接触することによりヒトＣＴＬＡ４に結合するナノボディのような多重特異性免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を提供する。例えば、結合性物質（ｂｉｎｄｅｒ）は、重水素源、例えばＤ_２Ｏなどの存在下での水素−重水素交換から残基を保護する。本発明のある実施形態において、ＩＳＶＤはヒトＣＴＬＡ４に結合し、図１３に本質的に示されるような結合ヒートマップ（例えば水素−重水素（ｄｕｅｔｅｒｉｕｍ）交換アッセイにおいて生成されるもの）を生成する。

【0010】

本発明はまた、アミノ酸配列ＦＹＧＭＧ（配列番号２のアミノ酸６−１０）またはＧＧＴＦＳＦＹＧＭＧ（配列番号２）を含むＣＤＲ１；アミノ酸配列ＤＩＲＴＳＡＧＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３）またはＤＩＲＴＳＡＧＲＴＹ（配列番号３のアミノ酸１−１０）を含むＣＤＲ２；アミノ酸配列ＥＸＳＧＩＳＧＷＤＹ（配列番号４）を含むＣＤＲ３を含み；ここでＩＳＶＤは、残基１１および８９において変異（例えばＬ１１Ｖおよび／またはＶ８９Ｌ、例えば（Ｅ１Ｄ、Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｑ４５Ｒ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｖ８９Ｌ、Ｍ９６Ｐ、Ｑ１０８Ｌ）、ここで前記残基番号はＫａｂａｔ残基番号である）を含んでもよいヒトＣＴＬＡ４に結合する１または複数の（例えば２つの）免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含む、ＣＴＬＡ４結合性物質を提供する。

【0011】

本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）であって、ここで前記ＣＴＬＡ４結合性物質は配列番号１に示されるアミノ酸配列に関して少なくとも１つの変異を含み、前記少なくとも１つの変異は１１位、８９位、１１０位および１１２位よりなる群から選択される位置におけるものであり、前記位置はＫａｂａｔに従ってナンバリングされ；ならびに本明細書中または他に示される任意の数の付加的な変異、例えば１０個まで（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の）付加的な変異（例えば点変異、置換、欠失、挿入）を包含してもよい、前記ＣＴＬＡ４結合性物質を提供する。例えば、本発明のある実施形態において、ＣＤＲ１はアミノ酸配列：ＦＹＧＭＧ（配列番号２）またはＧＧＴＦＳＦＹＧＭＧ（配列番号５）を含み；ＣＤＲ２はアミノ酸配列：ＤＩＲＴＳＡＧＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３）またはＤＩＲＴＳＡＧＲＴＹ（配列番号６）を含み；およびＣＤＲ３はアミノ酸配列：ＥＭＳＧＩＳＧＷＤＹ（配列番号４）を含む。例えば、本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質は配列番号１に対して変異を持ち、ここで１１位におけるアミノ酸残基はＬもしくはＶから選ばれ；８９位におけるアミノ酸残基はＴ、ＶもしくはＬから好適に選ばれ；１１０位におけるアミノ酸残基はＴ、ＫもしくはＱから好適に選ばれ；および／または１１２位におけるアミノ酸残基はＳ、ＫもしくはＱから好適に選ばれ；例えば、変異は、８９Ｔ；８９Ｌと１１Ｖとの組み合わせ；８９Ｌと１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；８９Ｌと１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；８９Ｌと１１Ｖおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；８９Ｌと１１Ｖおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；１１Ｖと１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；および／または１１Ｖと１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせである。本発明のある実施形態において、１１位、８９位、１１０位および／または１１２位における変異は、表Ｂに示されるとおりである。本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質はさらに、配列番号１に対して１位、１４位、４５位、７４位、８３位および／または１０８位において１または複数の変異を含む。本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質は１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸であるＣ末端伸長を持つ。例えば、本発明の実施形態において、Ｃ末端伸長は、式−Ｘ（ｎ）を持ち、ここでＸおよびｎは：（ａ）ｎ＝１およびＸ＝Ａｌａ；（ｂ）ｎ＝２および各々のＸ＝Ａｌａ；（ｃ）ｎ＝３および各々のＸ＝Ａｌａ；（ｄ）ｎ＝２および少なくとも１つのＸ＝Ａｌａ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれる）；（ｅ）ｎ＝３および少なくとも１つのＸ＝Ａｌａ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれる）；（ｆ）ｎ＝３および少なくとも２つのＸ＝Ａｌａ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれる）；（ｇ）ｎ＝１およびＸ＝Ｇｌｙ；（ｈ）ｎ＝２および各々のＸ＝Ｇｌｙ；（ｉ）ｎ＝３および各々のＸ＝Ｇｌｙ；（ｊ）ｎ＝２および少なくとも１つのＸ＝Ｇｌｙ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれる）；（ｋ）ｎ＝３および少なくとも１つのＸ＝Ｇｌｙ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれる）；（ｌ）ｎ＝３および少なくとも２つのＸ＝Ｇｌｙ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれる）；（ｍ）ｎ＝２および各々のＸ＝ＡｌａもしくはＧｌｙ；（ｎ）ｎ＝３および各々のＸ＝ＡｌａもしくはＧｌｙ；（ｏ）ｎ＝３および少なくとも１つのＸ＝ＡｌａもしくはＧｌｙ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれる）；または（ｐ）ｎ＝３および少なくとも２つのＸ＝ＡｌａもしくはＧｌｙ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれる）。例えば、本発明のある実施形態において、Ｃ末端伸長は、Ａ、ＡＡ、ＡＡＡ、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＡＧ、ＧＡ、ＡＡＧ、ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。本発明は、配列番号８−４３よりなる群から選択されるメンバーに示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％（例えば８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９または１００％）の配列同一性を持つアミノ酸配列を含むＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）を包含し、ここでＣＴＬＡ４結合性物質またはＩＳＶＤは配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、前記ＣＴＬＡ４結合性物質またはＩＳＶＤは配列番号１に示されるアミノ酸配列に関して少なくとも１つの変異を含み、前記少なくとも１つの変異は１１位、８９位、１１０位および１１２位よりなる群から選択される位置におけるものであり、前記位置はＫａｂａｔに従ってナンバリングされる。本発明はまた、配列番号９−４０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＴＬＡ４結合性物質、ＩＳＶＤ、ナノボディまたはポリペプチドを提供する。本発明はまた、ＣＴＬＡ４結合部分が結合するエピトープではないエピトープ（例えばＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡおよび／またはＣＤ２７）に結合する１または複数の分子に連結された、ＣＴＬＡ４に結合するＣＴＬＡ４結合部分（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）を含む多重特異性結合性物質を提供する。

【0012】

本発明はまた、さらなる治療剤を伴った、任意のかかるＣＴＬＡ４結合性物質、ポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）または多重特異性結合性物質を提供する。

【0013】

本発明はまた、ＣＴＬＡ４結合性物質、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、ナノボディ、ポリペプチドまたは多重特異性結合性物質を含み、さらなる治療剤を伴ってもよい注入装置（例えば皮下針およびシリンジ）または容器を提供する。

【0014】

本発明はまた、ＣＴＬＡ４結合性物質、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、ナノボディ、ポリペプチドまたは多重特異性結合性物質をコードする、例えばベクター中にあるポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）細胞）を提供する。

【0015】

本発明はまた、ＣＴＬＡ４結合性物質、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、ナノボディ、ポリペプチドまたは多重特異性結合性物質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞またはピキア細胞）内に導入すること、および宿主細胞を培地中で前記ポリヌクレオチドからの前記免疫グロブリンの発現に好都合な条件下で培養することを含み、前記宿主細胞および／または前記培地から免疫グロブリンを精製することを含んでもよい、ＣＴＬＡ４結合性物質、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、ナノボディ、ポリペプチドまたは多重特異性結合性物質を作成する方法を提供する。任意の免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、ナノボディ、ポリペプチド、多重特異性結合性物質またはＣＴＬＡ４結合性物質が、かかる方法により生産される。

【0016】

本発明はまた、ＣＴＬＡ４をさらなる治療剤を伴ってもよい免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、ナノボディ、ポリペプチド、多重特異性結合性物質またはＣＴＬＡ４結合性物質と接触させることを含む、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ４が抗原提示細胞上のＣＤ８０および／またはＣＤ８６に結合することを防ぐ方法を提供する。本発明はまた、さらなる治療剤を伴ってもよい有効量の免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、ナノボディ、ポリペプチド、多重特異性結合性物質またはＣＴＬＡ４結合性物質を対象（例えばヒトのような哺乳類）に投与することを含む、対象の体内において免疫応答を増強する方法を提供する。本発明はまた、さらなる治療剤を伴ってもよい有効量の免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、ナノボディ、ポリペプチド、多重特異性結合性物質またはＣＴＬＡ４結合性物質を対象に投与することを含む、対象の体内においてがんまたは感染性疾患を治療または予防する方法を提供する。本発明のある実施形態において、がんは、転移性がん、固形腫瘍、血液がん、白血病、リンパ腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、腎臓がん、白血病、腎臓移行上皮がん、膀胱がん、ウィルムスがん、卵巣がん、膵臓がん、乳がん、前立腺がん、骨がん、肺がん、非小細胞がん、胃がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、滑膜肉腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、腎臓細胞がん、網膜芽細胞腫、肝芽腫、肝細胞癌、黒色腫、腎臓のラブドイド腫瘍、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脳がん、神経膠芽腫、髄膜腫、脳下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原始神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、退形成性星状細胞腫、乏突起膠細胞腫、上衣腫、脈絡叢乳頭腫、真性多血症、血小板血症、特発性骨髄線維症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｍｙｅｌｆｉｂｒｏｓｉｓ）、軟組織肉腫、甲状腺がん、子宮内膜がん、カルチノイドがんまたは肝臓がん、乳がんまたは胃がんである。本発明のある実施形態において、感染性疾患は、細菌感染症、ウイルス感染症または真菌感染症である。例えば、本発明のある実施形態において、対象は、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、ナノボディ、ポリペプチド、多重特異性結合性物質またはＣＴＬＡ４結合性物質を伴ってさらなる治療剤または治療手法を投与される。

【0017】

本発明は、次の残基ＶＲＶＴＶＬ（配列番号１１０のアミノ酸３３−３８）、ＡＤＳＱＶＴＥＶＣ（配列番号１１０のアミノ酸４１−４９）およびＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧ（配列番号１１０のアミノ酸９３−１０６）のうちの１または複数においてヒトＣＴＬＡ４と接触することによりヒトＣＴＬＡ４に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含み；ここでＩＳＶＤは、残基１１（例えばＬ１１Ｖ）および８９（例えばＶ８９Ｌ）において変異を含み、前記残基番号はＫａｂａｔ残基番号である、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えば多価結合性物質）を提供する。

【0018】

本発明はまた、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むが、Ｅ１、Ｌ１１、Ａ１４、Ｑ４５、Ａ７４、Ｎ７３、Ｋ８３、Ｖ８９、Ｍ９６またはＱ１０８Ｌよりなる群から選択される位置において１または複数の変異（例えばＥ１Ｄ、Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｑ４５Ｒ、Ａ７４Ｓ、Ｎ７３Ｘ（ここでＸはＳ、Ｖ、Ｇ、Ｒ、Ｑ、Ｍ、Ｈ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｗ、Ｆ、Ｋ、Ａ、ＹまたはＰである）、Ｋ８３Ｒ、Ｖ８９Ｌ、Ｍ９６Ｐ、Ｑ１０８Ｌ）を含み；前記残基番号はＫａｂａｔ残基番号である、ＣＴＬＡ４に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含み；そして半減期エクステンダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）（例えばＡＬＢ１１００２）および／またはＣ末端エクステンダー（例えばアラニン）を含んでもよい、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えば多価結合性物質）を提供する。例えば、本発明のある実施形態において、ＩＳＶＤは、アミノ酸配列：

【表1】

【0019】

であって、ここでＸはＤまたはＥであるアミノ酸配列（配列番号６０）を含み；半減期エクステンダー（例えばＡＬＢ１１００２）および／またはＣ末端エクステンダー（例えばアラニン）を含んでもよい。本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質は、配列番号９３−１０９から選択されるアミノ酸配列であって；任意にアミノ酸ＡＡＡＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＧＡＡＨＨＨＨＨＨを欠失していてもよいアミノ酸配列を包含するＩＳＶＤを含む。本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質は、配列番号６０に示され、ここでＸはＤもしくはＥであるアミノ酸配列を含む、ＣＴＬＡ４に結合するＩＳＶＤ；ペプチドリンカー（例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６５））；配列番号６０に示され、ここでＸはＤもしくはＥであるアミノ酸配列を含む、ＣＴＬＡ４に結合するＩＳＶＤ；ペプチドリンカー；半減期エクステンダーを含み；Ｃ末端伸長アラニンを含んでもよく；ここでＣＴＬＡ４結合性物質は、配列番号６０に示され、ここでＸはＤもしくはＥであるアミノ酸配列を含む、ＣＴＬＡ４に結合するＩＳＶＤ；ペプチドリンカー；半減期エクステンダーを含み；Ｃ末端伸長アラニンを含んでもよい。本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質は、アミノ酸配列：

【表2】

【0020】

（配列番号６２）；または

【表3】

【0021】

（配列番号６４）
を含む。

【0022】

本発明はまた、本明細書に示されるＣＴＬＡ４結合性物質をＣＴＬＡ４への結合から交差遮断する結合性物質（例えば抗体）を提供する。

【0023】

本発明はまた、本明細書に示される任意のＣＴＬＡ４結合性物質（例えば配列番号６２または６４に示されるアミノ酸配列を含むもの）を含み、さらなる治療剤を伴ってもよい、注入装置または容器を提供する。

【0024】

本発明はまた、本明細書に示される任意のＣＴＬＡ４結合性物質（例えば配列番号６２または６４に示されるアミノ酸配列を含むもの）をコードする、例えば配列番号６１もしくは６３のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）；またはかかるポリヌクレオチドを含むベクター；またはかかるポリヌクレオチドもしくはベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0025】

本発明はまた、ＣＴＬＡ４結合性物質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞またはピキア細胞）内に導入すること、および宿主細胞を培地中で前記ポリヌクレオチドからの前記ＣＴＬＡ４結合性物質の発現に好都合な条件下で培養することを含み、前記宿主細胞および／または前記培地からＣＴＬＡ４結合性物質を精製することを含んでもよい、本明細書に示されるＣＴＬＡ４結合性物質（例えば配列番号６２または６４に示されるアミノ酸配列を含むもの）を作成する方法、並びにかかる方法により生産される任意のＣＴＬＡ４結合性物質を提供する。

【0026】

本発明はまた、ＣＴＬＡ４を、さらなる治療剤を伴ってもよいＣＴＬＡ４結合性物質（例えば配列番号６２または６４に示されるアミノ酸配列を含むもの）と接触させることを含む、（例えば対象の体内において）ＣＴＬＡ４がＣＤ８０またはＣＤ８６に結合することを防ぐ方法；並びに、さらなる治療剤（例えばペンブロリズマブ）を伴ってもよい有効量のＣＴＬＡ４結合性物質（例えば配列番号６２または６４に示されるアミノ酸配列を含むもの）を対象に投与することを含む、対象（例えばヒト）の体内において免疫応答を増強する方法を提供する。加えて、本発明は、さらなる治療剤（例えばペンブロリズマブ）を伴ってもよい有効量のＣＴＬＡ４結合性物質（例えば配列番号６２または６４に示されるアミノ酸配列を含むもの）を対象に投与することを含む、対象の体内においてがんまたは感染性疾患を治療または予防する方法を提供する。本発明のある実施形態において、がんは、転移性がん、固形腫瘍、血液がん、白血病、リンパ腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、腎臓がん、白血病、腎臓移行上皮がん、膀胱がん、ウィルムスがん、卵巣がん、膵臓がん、乳がん、前立腺がん、骨がん、肺がん、非小細胞がん、胃がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、滑膜肉腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、腎臓細胞がん、網膜芽細胞腫、肝芽腫、肝細胞癌、黒色腫、腎臓のラブドイド腫瘍、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脳がん、神経膠芽腫、髄膜腫、脳下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原始神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、退形成性星状細胞腫、乏突起膠細胞腫、上衣腫、脈絡叢乳頭腫、真性多血症、血小板血症、特発性骨髄線維症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｍｙｅｌｆｉｂｒｏｓｉｓ）、軟組織肉腫、甲状腺がん、子宮内膜がん、カルチノイドがんもしくは肝臓がん、乳がんもしくは胃がんであり；またはここで感染性疾患は、細菌感染症、ウイルス感染症もしくは真菌感染症である。本発明のある実施形態において、対象は、ＣＴＬＡ４結合性物質を伴ってさらなる治療剤（例えばペンブロリズマブ）または治療手法を投与される。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】本明細書中で具体的に言及されるアミノ酸位置のうちのいくつか、およびいくつかの代替的ナンバリング方式（例えばＡｈｏおよびＩＭＧＴなど）によるそれらのナンバリングを載せた表を示す。

【図2】ＣＴＬＡ４結合性物質の配列を示す。

【図3(A-B)】１１Ｆ１配列と配列番号８−４３の配列とのアラインメントを示す。

【図4】チャイニーズハムスター卵巣細胞中で生産されるモノクローナル抗体について主要なＮ−結合型グリカン（ＣＨＯ Ｎ−結合型グリカン）および遺伝子改変酵母細胞中で生産されるモノクローナル抗体について主要なＮ−結合型グリカン（遺伝子改変酵母 Ｎ−結合型グリカン）を示す：正方形：Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）；丸：マンノース（Ｍａｎ）；菱形：ガラクトース（Ｇａｌ）；三角形：フコース（Ｆｕｃ）。

【図5(A-B)】ナノボディＦ０２３７００９１２、Ｆ０２３７００９２５または対照ナノボディ（ＩＲＲ０００５１；抗ＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２（アルブミン結合性物質につながれた３５ＧＳを有する二価の抗ＨＥＲ２））の、ｈＣＴＬＡ４を発現する（Ａ）Ｊｕｒｋａｔ細胞、および、（Ｂ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞への結合のｂＦＡＣ解析を示す。

【図6(A-B)】ナノボディＦ０２３７００９１２またはイピリムマブと（Ａ）ＣＤ８０または（Ｂ）ＣＤ８６との間の、ＣＨＯ−Ｋ１細胞上に発現したヒトＣＴＬＡ４への結合についての競合を示す。

【図7(A-H)】ナノボディＦ０２３７００９１２、Ｆ０２３７００９２５または対照ナノボディ（ＩＲＲ０００５１）の、ＢＴＬＡ、ＣＤ８、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＣＤ２８または対照細胞への結合についての特異性判定を示す。ナノボディの結合は、（Ａ）陰性対照のＬ細胞、（Ｂ）陰性対照のＣＨＯ−Ｋ１細胞、（Ｃ）ｈｕＣＤ２８＋Ｌ細胞、（Ｄ）ｈｕＣＤ８アルファ＋Ｌ細胞、（Ｅ）ｈｕＬａｇ−３＋ＣＨＯ−Ｋ１細胞、（Ｆ）ｈｕＢＴＬＡ＋ＣＨＯ−Ｋ１細胞、（Ｇ）ｈｕＣＴＬＡ−４＋ＣＨＯ−Ｋ細胞、および、（Ｈ）ｈｕＰＤ−１＋ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対して決定した。

【図8(A-B)】ナノボディＦ０２３７００９０６、Ｆ０２３７０１０５１、Ｆ０２３７１０５４またはＦ０２３７０１０６１と（Ａ）ヒトＣＤ８０または（Ｂ）ヒトＣＤ８６との間の、ＣＨＯ−Ｋ１細胞上に発現したヒトＣＴＬＡ４への結合についての競合を示す。

【図9(A-J)】ヒト化マウスにおけるｐａｎｃ ０８．１３腫瘍に対するナノボディの効果を示す。アイソタイプコントロール、イピリムマブ（Ｎ２９７Ａ）、イピリムマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブ＋ペンブロリズマブ、５ｍｐｋ用量でのＦ０２３７００９１２（ＣＴＬＡ４ Ｎａｂ−５）、１５ｍｐｋ用量でのＦ０２３７００９１２（ＣＴＬＡ４ Ｎａｂ−１５）またはペンブロリズマブ＋ＣＴＬＡ４ Ｎａｂ−１５で治療したマウスにおける（Ａ）平均腫瘍体積±ＳＥＭ、および、（Ｂ）３７日目の個々の腫瘍体積；ならびに（Ｃ）アイソタイプコントロール抗体、（Ｄ）イピリムマブ（Ｎ２９７Ａ）、（Ｅ）イピリムアムブ（ｉｐｉｌｉｍｕａｍｂ）、（Ｆ）ペンブロリズマブ、（Ｇ）イピリムマブ＋ペンブロリズマブ、（Ｈ）ＣＴＬＡ４ Ｎａｂ−５、（Ｉ）ＣＴＬＡ４ Ｎａｂ−１５、または、（Ｊ）ＣＴＬＡ４ Ｎａｂ−１５＋ペンブロリズマブで治療したマウスにおける実験の間にわたる個々のマウスにおける腫瘍体積を示す。

【図10(A-B)】（Ａ）健常ヒト対象血清、および、（Ｂ）がん患者血清によるＦ０２３７００９１２およびＦ０２３７００９２５および三価の対照ナノボディＴ０１３７００１１２（先在抗体の結合を低減させる変異を欠いているもの）への血清プレＡｂの反応性を示す。

【図11】ＣＴＬＡ４結合性物質の構成物を示す。

【図12】ＣＴＬＡ４結合性物質の配列を示す。

【図13】Ｆ０２３７００９１２ ＣＴＬＡ４結合性物質によるヒトＣＴＬＡ４結合の重水素標識差分ヒートマップを示す。

【発明を実施するための形態】

【0028】

本発明は、先在抗体（プレ抗体）のＩＳＶＤ内ネオエピトープへの反応性を遮断する変異を含むＩＳＶＤを提供する。ネオエピトープは、タンパク質が変異（例えばトランケート）したとき、またはそのフォールディングが変わったときに現れるタンパク質内のエピトープである。先在抗体は、ＩＳＶＤを受ける前の患者の体内に存在している抗体である。本発明のＩＳＶＤは、部分的に、Ｃ末端定常ドメインが除去されたラマ抗体に基づき；それゆえに、結果として得られたＶＨＨのＣ末端中のネオエピトープをプレ抗体結合に曝露している。残基１１および８９の変異の組み合わせ（例えばＬ１１ＶおよびＩ８９ＬまたはＶ８９Ｌ）は驚くべきプレ抗体結合欠如を導くことが発見されている。残基１１２における変異もまたプレ抗体結合を著しく低減させることが示されている。Ｂｕｙｓｅ ＆ Ｂｏｕｔｔｏｎ（ＷＯ２０１５／１７３３２５）は、Ｌ１１ＶおよびＶ８９Ｌ変異の組み合わせがＬ１１Ｖ変異単独またはＶ８９Ｌ変異単独と比べてプレ抗体結合の低減に著しい改良を与えることを示すデータを包含していた。例えば、Ｂｕｙｓｅ ＆ Ｂｏｕｔｔｏｎ、９７ページの表Ｈは、Ｖ８９Ｌ変異を単独で有するＩＳＶＤ（Ｃ末端伸長があるものまたはないもの）とＶ８９Ｌ変異をＬ１１Ｖ変異と組み合わせて有する同ＩＳＶＤ（やはり、Ｃ末端伸長があるものまたはないもの）との比較データを示した。また、２つの別々の実験中に生成されたにもかかわらず、Ｌ１１Ｖ／Ｖ８９Ｌの組み合わせについて表Ｈ中に示されたデータは、（同じＩＳＶＤ中の）Ｌ１１Ｖ変異単独について表Ｂ中に与えられたデータと比べて、Ｌ１１Ｖ／Ｖ８９Ｌの組み合わせにより得られるプレ抗体結合低減がＬ１１Ｖ変異単独についてのそれよりも大きいことを示した。ラマ抗体のスキャフォールド構造は非常に高度に保存されていることが知られていることから、１１位および８９位における変異の効果はあらゆるＩＳＶＤについて存在する可能性が高い。実際、その効果は図１０において、本発明の結合性物質Ｆ０２３７００９１２およびＦ０２３７００９２５を使用して実証され、これらは非常に低レベルのプレ抗体結合を呈することが示された。

【0029】

本出願において、免疫グロブリン重鎖可変ドメインにおけるアミノ酸残基／位置は、Ｋａｂａｔによるナンバリングを使用して指し示される。便宜上、図１は、本明細書中で具体的に言及されるアミノ酸位置のうちのいくつか、およびいくつかの代替的ナンバリング方式（例えばＡｈｏおよびＩＭＧＴなど。注：明示的に指示されないかぎり、本説明および特許請求の範囲については、Ｋａｂａｔナンバリングが決定的であり；他のナンバリング方式は参照のためにのみ与えられる）によるそれらのナンバリングを載せた表を与える。

【0030】

ＣＤＲに関しては、当該技術分野で周知であるように、ＶＨまたはＶＨＨ断片のＣＤＲを定義して説明するための複数の慣行があり、例えばＫａｂａｔ定義（配列変化性に基づくものであり、最も通例的に用いられる）およびＣｈｏｔｉａ定義（構造ループ領域の位置に基づくもの）などがある。例えばウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／への参照がなされる。本明細書および特許請求の範囲の目的のため、ＫａｂａｔによるＣＤＲも言及され得るとしても、ＣＤＲは最も好ましくはＡｂｍ定義（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ'ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアに基づくもの）を基礎として定義され、その理由は、これはＫａｂａｔ定義とＣｈｏｔｉａ定義との間の最適な中間物であると考えられるからである。やはり、ウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／への参照がなされる。Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；５ｔｈ ｅｄ．；ＮＩＨ Ｐｕｂｌ． Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ（１９７８） Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ． ３２：１−７５；Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，（１９７７） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５２：６６０９−６６１６；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，（１９８７） Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １９６：９０１−９１７またはＣｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３；Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ（１９８７） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １９６：９０１−９１７；Ｅｌｖｉｎ Ａ．Ｋａｂａｔ，Ｔａｉ Ｔｅ Ｗｕ，Ｃａｒｌ Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｈａｒｏｌｄ Ｍ．Ｐｅｒｒｙ，Ｋａｙ Ｓ．Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ． Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ． ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を参照されたい。本発明のある実施形態において、ＣＤＲ決定はＫａｂａｔに従い、例えばＶＨＨのＦＲ１は１−３０位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ１は３１−３５位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ２は３６−４９位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ２は５０−６５位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ３は６６−９４位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ３は９５−１０２位のアミノ酸残基を含み、およびＶＨＨのＦＲ４は１０３−１１３位のアミノ酸残基を含む。

【0031】

本発明のある実施形態において、ＣＤＲは、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（Ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ ２，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｂｅｒｌｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３，ｐｐ．３３−５１，２０１０）に従って決定される。

【0032】

用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（「ＩＳＶ」または「ＩＳＶＤ」とも呼ばれる）は、一般に、別の可変ドメインとの相互作用がない（例えば慣用的な四本鎖モノクローナル抗体のＶＨドメインとＶＬドメインとの間に必要とされるＶＨ／ＶＬ相互作用がない）機能的抗原結合部位を形成することができる免疫グロブリン可変ドメイン（重鎖ドメインであっても軽鎖ドメインであってもよく、ＶＨドメイン、ＶＨＨドメインまたはＶＬドメインを包含するもの）を指すために用いられる。ＩＳＶＤの例は当業者に明らかであり、例えばナノボディ（ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨおよび／またはラクダ化ＶＨ、例えばラクダ化ヒトＶＨなどを包含するもの）、ＩｇＮＡＲ、ドメイン、ＶＨドメインであるかまたはＶＨドメインに由来する（単一ドメイン）抗体（例えばｄＡｂｓ（商標）など）およびＶＬドメインであるかまたはＶＬドメインに由来する（単一ドメイン）抗体（例えばｄＡｂｓ（商標）など）が挙げられる。重鎖可変ドメイン（例えばＶＨドメインまたはＶＨＨドメインなど）に基づくおよび／またはこれに由来するＩＳＶＤが一般に好ましい。最も好ましくは、ＩＳＶＤはナノボディである。例えば、Ｆ０２３７００９０６はＩＳＶＤである。

【0033】

用語「ナノボディ」は、一般にＷＯ２００８／０２００７９またはＷＯ２００９／１３８５１９中に定義されるとおりであり、それゆえに具体的態様において、一般に、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨもしくはラクダ化ＶＨ（例えばラクダ化ヒトＶＨなど）または一般に配列最適化されたＶＨＨ（例えば化学的安定性および／または溶解性、公知のヒトフレームワーク領域との最大のオーバーラップおよび最大の発現のために最適化されたものなど）を意味する。なお、用語ナノボディまたはナノボディ類はＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の登録商標であり、それゆえにナノボディ（登録商標）および／またはナノボディ類（登録商標）とも呼ばれる）。

【0034】

多重特異性結合性物質は、第一のＣＴＬＡ４結合部分（例えばＩＳＶＤまたはナノボディ）、および第一のＣＴＬＡ４結合部分のエピトープ以外のエピトープ（例えばＣＴＬＡ４の異なるエピトープ、またはＣＤ２７、ＬＡＧ３、ＰＤ１もしくはＢＴＬＡに対するもの）に結合する１または複数の（例えば１、２、３、４、５個の）付加的な結合部分（例えばＩＳＶＤまたはナノボディ）を含む分子である。

【0035】

結合部分または結合ドメインまたは結合ユニットは、例えばＣＴＬＡ４などの抗原に結合する、例えばＩＳＶＤまたはナノボディ（例えば配列番号８−４３または６０のいずれか）などの分子である。結合部分または結合ドメインまたは結合ユニットは、別の機能的要素、例えば半減期エクステンダー（ＨＬＥ）、標的化ユニットおよび／または例えば（ｓｕｃｈ ａ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの低分子を含み得る１つより多くの部分、ドメインまたはユニットを包含する、多価または多重特異性結合性物質のようなより大きな分子の一部分であり得る。

【0036】

一価のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、単一の抗原結合ドメインを含む分子である。二価のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、２つの抗原結合ドメインを含む。多価のＣＴＬＡ４結合性物質は、１つより多くの（例えば１、２、３、４、５、６または７個の）抗原結合ドメインを含む。

【0037】

単一特異性ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、単一の抗原（ＣＴＬＡ４）に結合し；二重特異性ＣＴＬＡ４結合性物質は２つの異なる抗原に結合し、多重特異性ＣＴＬＡ４結合性物質は１より多くの抗原に結合する。

【0038】

二重パラトピック（ｂｉｐａｒａｔｏｐｉｃ）ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、単一特異性であるが、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合する。多重パラトピック（ｍｕｌｔｉｐａｒａｔｏｐｉｃ）ＣＴＬＡ４結合性物質は、同じ抗原に結合するが、抗原中の１つより多くのエピトープに結合する。

【0039】

本明細書中でＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）または他の分子との関係で用いられる用語「半減期」は、一般に、ＷＯ２００８／０２００７９の５７ページ段落ｏ）中に記載されるように定義することができ、その中で言及されているように、アミノ酸配列、ＣＴＬＡ４結合性物質、化合物またはポリペプチドの血清濃度が、例えば天然のメカニズムによるその配列もしくは化合物の分解および／またはその配列もしくは化合物のクリアランスもしくは隔離のためにインビボで５０％低減するのにかかる時間をいう。本発明のアミノ酸配列、ＣＴＬＡ４結合性物質、化合物またはポリペプチドのインビボ半減期は、それ自体公知の任意の方法で、例えば薬物動態学的分析などにより決定することができる。好適な技術は当業者に明らかであり、例えば一般にＷＯ２００８／０２００７９の５７ページ段落ｏ）中に記載されるとおりであり得る。ＷＯ２００８／０２００７９の５７ページ段落ｏ）中にも言及されているように、半減期は、例えばｔ１／２−アルファ、ｔ１／２−ベータおよび曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメーターを用いて表現することができる。なお、この点で、本明細書中で用いられる用語「半減期」は、とりわけ、ｔ１／２−ベータまたは終末相半減期（ここではｔ１／２−アルファおよび／もしくはＡＵＣまたは両方が考慮されないことがある）をいう。例えば下の実験部、並びに標準的なハンドブック、例えばＫｅｎｎｅｔｈ，Ａ ｅｔ ａｌ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ ＰｈａｒｍａｃｉｓｔｓおよびＰｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９６）などを参照されたい。また、“Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ”，Ｍ Ｇｉｂａｌｄｉ ＆ Ｄ Ｐｅｒｒｏｎ，出版元Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，改訂２版（１９８２）も参照されたい。同様に、用語「半減期の増加」または「半減期増加」もまたＷＯ２００８／０２００７９の５７ページ段落ｏ）中に定義されているとおりであり、とりわけ、ｔ１／２−アルファおよび／もしくはＡＵＣまたは両方の増加を伴うまたは伴わない、ｔ１／２−ベータの増加をいう。

【0040】

用語が本明細書中で具体的に定義されていない場合、それは当該技術分野におけるその通常の意味を持ち、これは当業者に明らかである。例えば標準的なハンドブック、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（２ｎｄ．Ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｌｅｗｉｎ，“Ｇｅｎｅｓ ＩＩ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，（１９８５）；Ｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ（１９８１）；Ｒｏｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（６ｔｈ．Ｅｄ．），Ｍｏｓｂｙ／Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ（２００１）；Ｒｏｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｒｏｉｔｔ'ｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１０ｔｈ Ｅｄ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ＵＫ（２００１）；およびＪａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ”（６ｔｈ Ｅｄ．），Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ／Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００５）など、並びに本明細書中で引用される一般的背景技術を参照されたい。

【0041】

１または複数のナノボディを含有する多価の多重特異性ポリペプチドおよびそれらの調製の一般的説明のため、Ｃｏｎｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７６，１０． ７３４６−７３５０，２００１；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４（２００１），２７７−３０２；並びに、例えばＷＯ１９９６／３４１０３、ＷＯ１９９９／２３２２１、ＷＯ２００４／０４１８６２、ＷＯ２００６／１２２７８６、ＷＯ２００８／０２００７９、ＷＯ２００８／１４２１６４またはＷＯ２００９／０６８６２７への参照もなされる。

【0042】

「単離された」ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）、ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｏｔｉｄｅｓ）、ポリヌクレオチドおよびベクターは、それらが生産された細胞または細胞培養物からの他の生物学的分子を少なくとも部分的に含まない。かかる生物学的分子としては、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物または他の材料、例えば細胞デブリおよび増殖培地などが挙げられる。「単離された」ＣＴＬＡ４結合性物質は、さらに、発現系の構成成分、例えば宿主細胞からのまたはその増殖培地の生物学的分子などを少なくとも部分的に含まないものであり得る。一般に、用語「単離された」は、かかる生物学的分子の完全な不存在を、または水、バッファーもしくは塩の不存在を、または抗体もしくは断片を包含する医薬製剤の構成成分を指すことを意図しない。

【0043】

フレーズ「制御配列」は、特定の宿主生物中での作動可能に連結されたコーディング配列の発現のために必要なポリヌクレオチドをいう。原核生物に適した制御配列は、例えばプロモーター、任意選択でオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を包含する。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを用いることが知られている。

【0044】

核酸またはポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドとの機能的関係に置かれたときに「作動可能に連結され」ている。例えばプレ配列もしくは分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関連するタンパク質前駆体として発現するならばポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーターもしくはエンハンサーは、それがコーディング配列の転写に影響するならばコーディング配列に作動可能に連結されており；またはリボソーム結合部位は、それが転写を容易にするように位置するならばコーディング配列に作動可能に連結されている。常にではないが、一般に、「作動可能に連結されている」とは、連結されるＤＮＡ配列が近接すること、分泌リーダーの場合は近接し、かつリーディングフェーズ（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは近接する必要はない。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しないならば、慣行的実務に従って合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーが用いられる。

【0045】

本発明の「ヒト血清アルブミン結合性物質」または「ＨＳＡ結合性物質」は、本明細書中に記載されるＨＳＡに結合する分子（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）、並びにＨＳＡに結合する任意の抗体またはその抗原結合断片のいずれかであり、本明細書中に記載されるＨＳＡ結合部分のいずれかを包含する。個々のＨＳＡ結合性物質は、それがより大きい分子、例えば多価の分子、例えばＦ０２３７００９１２またはＦ０２３７００９１４などの一部であるならば、ＨＳＡ結合部分と呼ばれ得る。

【0046】

一般的に、基本的な抗体構造単位はテトラマーを含む。各々のテトラマーは、２つの同一のポリペプチド鎖の対を包含し、各々の対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を持つ。各々の鎖のアミノ末端部は、主に抗原認識に関与する約１００から１１０個またはそれより多くのアミノ酸でできた可変領域を包含する。重鎖のカルボキシ末端部は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を規定し得る。典型的に、ヒト軽鎖はカッパ軽鎖およびラムダ軽鎖に分類される。さらには、ヒト重鎖は典型的にミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥに規定する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は約１２個またはそれより多くのアミノ酸でできた「Ｊ」領域につながれ、重鎖はまた約１０個より多くのアミノ酸でできた「Ｄ」領域も包含する。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい。

【0047】

抗原結合断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）_２およびＦｖ断片および一本鎖Ｆｖ分子が挙げられる。

【0048】

次の性質は、ＣＴＬＡ４結合性物質１１Ｆ０１中で指し示された変異に関連する：
Ｅ１Ｄ：構成物Ｅ１の最初のアミノ酸におけるピログルタミン酸形成を防ぐ
Ｌ１１Ｖ：プレ抗体結合を減少させる
Ａ１４Ｐ：ヒト化
Ｑ４５Ｒ：安定性を向上させるための変異
Ａ７４Ｓ：ヒト化
Ｋ８３Ｒ：ヒト化
Ｉ８９Ｌ：プレ抗体結合を減少させる
Ｍ９６Ｐ、ＱまたはＲ：Ｍ９６の酸化を防ぐ
Ｑ１０８Ｌ：ヒト化。

【0049】

本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４はヒトＣＴＬＡ４である。本発明のある実施形態において、ヒトＣＴＬＡ４は、アミノ酸配列：

【表4】

【0050】

（配列番号１１１）を含む。

【0051】

ＣＴＬＡ４結合性物質
本発明は、改良されたＣＴＬＡ４結合性物質、とりわけ改良されたＣＴＬＡ４ ＩＳＶＤ、よりとりわけには改良されたＣＴＬＡ４ナノボディを提供することを目的とする。本発明のＣＴＬＡ４結合性物質は、例えば１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位などにおいて変異した配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドのバリアントであるポリペプチドを包含する。

【0052】

ＣＴＬＡ４結合性物質またはＣＴＬＡ４ ＩＳＶＤまたはＣＴＬＡ４ナノボディは、それぞれＣＴＬＡ４に結合する結合性物質、ＩＳＶＤまたはナノボディをいう。

【0053】

本発明により提供される改良されたＣＴＬＡ４結合性物質はまた、本明細書中で「本発明のＣＴＬＡ４結合性物質」または「ＣＴＬＡ４結合性物質」とも呼ばれる。これらの用語は、本明細書に示されるＣＴＬＡ４に結合する分子を含む任意の分子を包含する。例えば、この用語は、配列番号８−４３および６０よりなる群から選択されるメンバーに示されるアミノ酸配列を含むＩＳＶＤ、並びに配列番号８−４３および６０よりなる群から選択されるメンバーに示されるアミノ酸配列を包含する任意のポリペプチド、ナノボディ、ＩＳＶＤ、融合タンパク質、慣用的抗体もしくはその抗原結合断片；または配列番号８−４３および６０よりなる群から選択されるメンバーに示されるアミノ酸配列を含み、ＣＴＬＡ４に結合し、また別の抗原もしくは別のエピトープ、例えばＣＤ２７、ＬＡＧ３、ＰＤ１もしくはＢＴＬＡなどにも結合する任意の二重特異性分子（例えばＩＳＶＤ）を包含する。本発明のＣＴＬＡ４結合性物質は、Ｆ０２３７００９１２またはＦ０２３７００９１４である。

【0054】

本発明の範囲は、図１１に示される結合部分の配列を含み、ＦＬＡＧ３および／またはＨＩＳ６タグを欠いていてもよい任意のＣＴＬＡ４結合性物質；並びに、図１２に示されるアミノ酸配列のうちのいずれかを包含する。

【0055】

ＷＯ２００８／０７１４４７は、ＣＴＬＡ４に結合することができるナノボディおよびその使用を記載している。ＷＯ２００８／０７１４４７の配列番号１３０６は、１１Ｆ０１と呼ばれるＣＴＬＡ４特異的ナノボディを開示し、その配列は本明細書中に配列番号１として与えられる。この配列（本明細書中で「リファレンスＡ」とも呼ばれる）およびそのＣＤＲは、下の表Ａ−１中にも与えられる。

【0056】

本明細書中にさらに記載されるように、本発明のある実施形態において本発明の多価および／または多重特異性ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばＦ０２３７００９１４）の中にある本発明のＣＴＬＡ４結合性物質は、好ましくは、１１Ｆ０１中に存在するものと、または１１Ｆ０１の配列（配列番号１）を含む結合性物質中に存在するものと同じＣＤＲ（すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）の組み合わせを持つ。表Ａ−１を参照されたい。

【0057】

本発明はまた、下の表Ａ−２中に示されるアミノ酸配列を含む１１Ｆ０１のバリアントであるＣＴＬＡ４結合性物質を包含する。本発明の範囲は、下の表Ａ−２中に示される前記バリアント（ｖａｒａｉｎｔｓ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を包含するＣＴＬＡ４結合性物質を包含する。

【0058】

加えて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３または１１Ｆ０１のアミノ酸配列またはそのバリアントのうちの１つを包含するＣＴＬＡ４結合部分を含む本発明の多重特異性および／または多価結合性物質（例えばＦ０２３７００９１４）は、下の表Ａ−２に示される。

【0059】

表Ａ−１．ＣＴＬＡ４ナノボディ１１Ｆ１（１１Ｆ０１）

【表5】

【0060】

表Ａ−２．バリアントＣＴＬＡ４ナノボディ１１Ｆ１

【表6】

【0061】

^＊ＣＤＲは下線および／または太字
配列番号６０の残基１は、ＤまたはＥであることができる。残基１がＤである場合、ＣＴＬＡ４結合性物質は１Ｄとして指定され得て、残基１がＥである場合、ＣＴＬＡ４結合性物質は１Ｅとして指定され得る。

【0062】

本発明のある実施形態において、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質はＮ７３Ｘ変異を含み、ここでＸはＮ以外の任意のアミノ酸、例えばＳ、Ｖ、Ｇ、Ｒ、Ｑ、Ｍ、Ｈ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｗ、Ｆ、Ｋ、Ａ、ＹまたはＰ（またはＮ以外の任意のアミノ酸）である。

【0063】

本発明は、ＣＴＬＡ４結合性物質のＣＤＲのうちの１つ、２つまたは３つを含むＣＴＬＡ４結合性物質を包含し、ここで各々のＣＤＲは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換、例えば保存的置換を含み、および／または表Ａ−１もしくはＡ−２に示されるＣＴＬＡ４結合性物質配列（例えば１１Ｆ０１（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｑ４５Ｒ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ，Ｍ９６Ｐ，Ｑ１０８Ｌ）または１１Ｆ０１）中にあるもしくは配列番号２−７に示されるＣＤＲに対して１００、９９、９８、９７、９６もしくは９５％の配列同一性を含み、かかるＣＤＲを持つＣＴＬＡ４結合性物質はＣＴＬＡ４に結合する能力を保持している。

【0064】

本明細書に示されるリファレンスＡに基づくＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）の特定の残基についてのＫａｂａｔ残基番号は下の配列：

【表7】

【0065】

（配列番号１）中に示される。

【0066】

本明細書に示されるＣＴＬＡ４結合性物質１１Ｆ０１の特定の残基についてのＫａｂａｔ残基番号（Ｅ１Ｄ、Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｑ４５Ｒ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｖ８９Ｌ、Ｍ９６Ｐ、Ｑ１０８Ｌ）は下の配列：

【表8】

【0067】

（配列番号６０）中に示される。

【0068】

本発明は、配列番号６０のアミノ酸配列または８０％もしくはそれより多い（例えば８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の）アミノ酸配列同一性を含むアミノ酸配列を含む任意のＣＴＬＡ４結合性物質を包含し、ここでＣＴＬＡ４結合性物質はＣＴＬＡ４に結合する能力を保持している。

【0069】

本発明は、ＣＴＬＡ４結合性物質のＫａｂａｔ９６位におけるＣＤＲ３のメチオニンが、例えばプロリンなどの任意のアミノ酸（しかしＣｙｓ、ＡｓｐまたはＡｓｎではない）、例えば次のアミノ酸：Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＰｒｏのいずれかで置換されている実施形態を包含する。

【0070】

本発明のいくつかの好ましいが限定されないＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、配列番号６０であるか、または図２中に配列番号８−４３として収載される。図３は、これらの配列とリファレンスＡ（配列番号１）とのアラインメントを示す。これらのＣＴＬＡ４結合性物質のうち、配列番号２６−４３の結合性物質は、通常のＣ末端配列ＶＴＶＳＳ（配列番号５７、リファレンスＡ中に存在する）と比べて、Ｃ末端のアラニン伸長、すなわち、ＩＳＶＤ配列のＣ末端（時に「１１４位」とも呼ばれる）においてアラニン残基を持つ本発明のＣＴＬＡ４結合性物質の例である。ＷＯ２０１２／１７５７４１中に（これだけでなく、例えばＷＯ２０１３／０２４０５９およびＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に）記載されるように、このＣ末端のアラニン伸長は、ＩＳＶのＣ末端領域に位置する推定エピトープへのいわゆる「先在抗体」（ＩｇＧであると推定される）の結合を防ぐことができる。このエピトープは、他の残基のなかでも、Ｃ末端配列ＶＴＶＳＳ（配列番号５７）の表面に露出したアミノ酸残基、並びに１４位におけるアミノ酸残基（およびアミノ酸配列中で同残基の隣の／近いアミノ酸残基、例えば１１位、１３位および１５位など）を包含するものと推定され、また８３位におけるアミノ酸残基（およびアミノ酸配列中で同残基の隣の／近いアミノ酸残基、例えば８２位、８２ａ位、８２ｂ位および８４位など）および／または１０８位におけるアミノ酸残基（およびアミノ酸配列中で同残基の隣の／近いアミノ酸残基、例えば１０７位など）を含み得る。

【0071】

しかしながら、かかるＣ末端アラニン（または一般にＣ末端伸長）の存在はある範囲の対象（健常対象並びに患者の両方）からの血清中に見出すことができる「先在抗体」の結合を大きく低減させる（多くの場合において本質的に完全に防ぎさえする）ことができるが、何人かの対象からの血清（例えばいくつかの免疫疾患、例えばＳＬＥなどを有する患者からの血清など）は、ＩＳＶがかかるＣ末端アラニン（またはより一般にはかかるＣ末端伸長）を含有するときであってもＩＳＶのＣ末端領域に（かかる領域が曝露されたときに）結合することができる先在抗体を含有することがあることが見出されている。やはり、Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．による２０１５年５月１３日に出願された「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ（改良された免疫グロブリン可変ドメイン）」という名称の、共に係属中で未公開のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）への参照がなされる。

【0072】

したがって、本発明の１つの具体的目的は、本明細書中で「リファレンスＡ」と呼ばれるＣＴＬＡ４ナノボディの改良されたバリアントであって、いわゆる「先在抗体」、とりわけＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に記載された種類のもの（すなわち、Ｃ末端伸長の存在下であってもＩＳＶの露出したＣ末端領域に結合することができる先在抗体）による結合が低減された、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）を提供することである。

【0073】

本発明は、配列番号１の配列と比べて次の変異：
− １Ｄもしくは１Ｅ；
− １１Ｖ；
− １４Ｐ；
− ４５Ｒ；
− ７４Ｓ；
− ８３Ｒ；
− ８９Ｌもしくは８９Ｔ；
− ９６Ｐ；または
− １０８Ｌ；
のうちの１または複数を含む、配列番号１の配列のバリアントであるアミノ酸配列を含むＣＴＬＡ４結合性物質を提供し、例えば、ここでＣＴＬＡ４結合性物質は、下の変異セット：
− ８９Ｌと、１１Ｖ；１４Ｐ；４５Ｒ；７４Ｓ；８３Ｒ；８６Ｐ；１０８Ｌおよび１Ｅもしくは１Ｄとの組み合わせ；
− ８９Ｌと１１Ｖとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖ；１４Ｐ；４５Ｒ；７４Ｓ；８３Ｒ；８６Ｐ；１０８Ｌ、１１０Ｋもしくは１１０Ｑおよび１Ｅもしくは１Ｄとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖ；１４Ｐ；４５Ｒ；７４Ｓ；８３Ｒ；８６Ｐ；１０８Ｌ、１１２Ｋもしくは１１２Ｑおよび１Ｅもしくは１Ｄとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；および／または
− １１Ｖと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ
のうちの１または複数を含む。

【0074】

とりわけ、本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は：
− １位におけるアミノ酸は、好ましくはＥまたはＤであること；
− １１位におけるアミノ酸は、好ましくはＬまたはＶであること；
− １４位におけるアミノ酸は、好ましくはＡまたはＰであること；
− ４５位におけるアミノ酸は、好ましくはＱまたはＲであること；
− ７４位におけるアミノ酸は、好ましくはＡまたはＳであること；
− ８３位におけるアミノ酸は、好ましくはＫまたはＲであること；
− ８９位におけるアミノ酸は、好ましくはＴ、ＶまたはＬであること；
− ９６位におけるアミノ酸は、好ましくはＭまたはＰであること；
− １０８位におけるアミノ酸は、好ましくはＱまたはＬであること；
− １１０位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＴ、ＫまたはＱから好適に選ばれること；および
− １１２位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＳ、ＫまたはＱから好適に選ばれること；
を含み、例えば、次のもの：
（ｉ）８９位はＴである；
（ｉｉ）８９位はＬである；
（ｉｉｉ）１位はＤもしくはＥ、１１位はＶ、１４位はＰ、４５位はＲ、７４位はＳ、８３位はＲ、８９位はＬ、９６位はＰおよび１０８位はＬである；
（ｉｖ）８９位はＬおよび１１位はＶである；
（ｖ）８９位はＬおよび１１０位はＫもしくはＱである；
（ｖｉ）８９位はＬおよび１１２位はＫもしくはＱである；
（ｖｉｉ）１位はＤもしくはＥ、１１位はＶ、１４位はＰ、４５位はＲ、７４位はＳ、８３位はＲ、８９位はＬ、９６位はＰ、１０８位はＬ；および１１０位はＫもしくはＱである；
（ｖｉｉｉ）１位はＤもしくはＥ、１１位はＶ、１４位はＰ、４５位はＲ、７４位はＳ、８３位はＲ、８９位はＬ、９６位はＰ、１０８位はＬ；および１１２位はＫもしくはＱである；
（ｉｘ）８９位はＬおよび１１位はＶおよび１１０位はＫもしくはＱである；
（ｘ）８９位はＬおよび１１位はＶおよび１１２位はＫもしくはＱである；
（ｘｉ）１１位はＶおよび１１０位はＫもしくはＱである；または
（ｘｉｉ）１１位はＶおよび１１２位はＫもしくはＱである
のうちの１または複数が当てはまるようになっている。

【0075】

特定の実施形態において、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、配列番号１のバリアントであるアミノ酸配列を含み、ここで８９位はＴであり、または１位はＤ、１１位はＶ、１４位はＰ、４５位はＲ、７４位はＳ、８３位はＲ、８９位はＬ、９６位はＰおよび１０８位はＬであり、または１１位はＶおよび８９位はＬである（１１０Ｋもしくは１１０Ｑ変異および／または１１２Ｋもしくは１１２Ｑ変異との好適な組み合わせであってもよく、とりわけ１１０Ｋまたは１１０Ｑ変異との組み合わせであってもよい）ことがとりわけ好ましい。なおより好ましいのは、１１位はＶおよび８９位はＬであって、１１０Ｋまたは１１０Ｑ変異を有してもよいアミノ酸配列である。

【0076】

言及されているように、本明細書中に記載されるＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、ＣＴＬＡ４に結合することができる（とりわけ特異的に結合することができる）。本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質はＣＴＬＡ４に結合し、それによって抗原提示細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６がＴ細胞上のＣＴＬＡ４に結合することを防ぐことができる。本発明のある実施形態において、得られるＣＴＬＡ４シグナル伝達の遮断は、Ｔ細胞活性化を長引かせ、Ｔ細胞増殖を回復させ、それゆえにＴ細胞介在性免疫を増幅し、これは理論的に患者の抗腫瘍免疫応答を開始する能力を増強する。

【0077】

本発明のある実施形態において、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質は、次の性質：
・例えば約１ｎＭ（例えば約１．２ｎＭ）のＫ_ＤでＣＴＬＡ４に結合する（例えばヒトおよび／またはカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）ＣＴＬＡ４）（ＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質）；
・細胞、例えばＣＴＬＡ４を発現するＣＨＯ細胞の表面上のＣＴＬＡ４に結合する；
・ＣＤ８０またはＣＤ８６のＣＴＬＡ４（例えばＣＨＯ細胞上に発現したＣＴＬＡ４）への結合を遮断する；
・ＢＴＬＡ、ＣＤ８、ＰＤ１、ＬＡＧ３および／またはＣＤ２８に結合しない；
・（１または複数のＡＬＢ１１００２結合性物質と融合されたとき）インビトロおよび／またはインビボで、ヒト、アカゲザルおよびマウスの血清アルブミンに結合する；
・（例えば膵臓腫瘍、例えばヒト免疫細胞を持つマウスにおけるヒト膵臓腫瘍の）腫瘍増殖を阻害する
のうち１または複数を持つ。

【0078】

表Ｂは、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）中で（配列番号１の）１１位、８９位、１１０位および１１２位に存在することができるアミノ酸残基についての、いくつかの限定されない可能な組み合わせを収載する。

【0079】

表Ｂ：配列番号１のＣＴＬＡ４結合性物質バリアント中のアミノ酸１１位、８９位、１１０位および１１２位における変異の可能な組み合わせ

【表9】

【0080】

本発明により提供されるＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、さらに本明細書中の説明、例および図において記載されるとおりであり、すなわち、これらは本明細書中に記載されるとおりであるＣＤＲを持ち、本明細書中に開示されるとおりである配列番号１の配列と全体的な配列同一度（本明細書中に定義されるもの）を持ち、および／またはこれらの参照配列（のうちの１つ）との限定的な数の「アミノ酸の相違」（本明細書中に記載されるもの）を持ち得る。

【0081】

本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、好ましくは、次のＣＤＲ（Ｋａｂａｔ慣行による）：
− アミノ酸配列ＦＹＧＭＧ（配列番号２）であるＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる）；および
− アミノ酸配列ＤＩＲＴＳＡＧＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３）であるＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによる）；および
− アミノ酸配列ＥＰＳＧＩＳＧＷＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Ｋａｂａｔによる）
を含み、ここでＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３は、１、２、３、４、５、５、６、７、８、９または１０個の置換、例えば、保存的置換を含んでもよい。

【0082】

あるいは、ＣＤＲがＡｂｍ慣行に従って与えられるとき、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、好ましくは、次のＣＤＲ：
− アミノ酸配列ＧＧＴＦＳＦＹＧＭＧ（配列番号５）であるＣＤＲ１（Ａｂｍによる）；および
− アミノ酸配列ＤＩＲＴＳＡＧＲＴＹ（配列番号６）であるＣＤＲ２（Ａｂｍによる）；および
− アミノ酸配列ＥＰＳＧＩＳＧＷＤＹ（配列番号７、これは配列番号４と同じである）であるＣＤＲ３（Ａｂｍによる）
を含み、ここでＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３は、１、２、３、４、５、５、６、７、８、９または１０個の置換、例えば、保存的置換を含んでもよい。

【0083】

本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、本発明のある実施形態において、本明細書中で論じられるように、かかるＣＤＲならびに１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異を持ち、および：
− ＢＬＡＳＴアルゴリズムによる比較を実施したときに配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一度（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長、並びに関連する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）を持ってもよく、ここでアルゴリズムのパラメーターはそれぞれの配列の間でそれぞれの参照配列の全長にわたって最大マッチを与えるように選択され（例えばｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０；ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３；ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ：０；ＢＬＯＳＵＭ ６２ ｍａｔｒｉｘ；ｇａｐ ｃｏｓｔｓ：ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １；ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）；および／または
− 配列番号１のアミノ酸配列との７未満、例えば５未満など、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在せず；存在し得る任意のＣ末端伸長は考慮されず、および関連する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異は考慮されない）を持ってもよい。

【0084】

次の参考文献は、配列解析のためにしばしば用いられるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する：ＢＬＡＳＴ ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ：Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（２００５） ＦＥＢＳ Ｊ． ２７２（２０）：５１０１−５１０９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６） Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ７：６４９−６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ． １７：１４９−１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，（１９９４） Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ． １０：６７−７０；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＣＯＲＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．” ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８） ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３． Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３４５−３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．” ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８） ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．”Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１９：５５５−５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：６６−７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ． ３６：２９０−３００；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４） Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ． ２２：２０２２−２０３９；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．“Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．” ｉｎ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ，ｅｄ．），（１９９７） ｐｐ．１−１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。

【0085】

本発明により提供される本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）の様々な態様および好ましい態様に関して、配列番号１に関する配列同一度および／または本発明のかかる結合性物質中に（すなわち配列番号１の配列と比べて）存在し得る「アミノ酸の相違」の数および種類に関していうと、
（ｉ）ＢＬＡＳＴアルゴリズムによる比較を実施したときに、本発明のアミノ酸配列が、配列番号１の配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一度（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長、並びに関連する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）であって、ここでアルゴリズムのパラメーターはそれぞれの配列の間でそれぞれの参照配列の全長にわたって最大マッチを与えるように選択されるもの（例えばｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０；ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３；ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ：０；ＢＬＯＳＵＭ ６２ ｍａｔｒｉｘ；ｇａｐ ｃｏｓｔｓ：ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １；ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）を持つといえるとき、
および／または、
（ｉｉ）本発明のアミノ酸配列が、配列番号１の配列との７未満、好ましくは５未満など、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（やはり、存在し得る任意のＣ末端伸長は考慮されず、および関連する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異は考慮されない）を持つといえるとき、
これはまた、関連する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異ならびに存在し得る任意のＣ末端伸長以外に配列番号１の配列とアミノ酸の相違がない配列を包含する。

【0086】

それゆえに、本発明の１つの具体的態様において、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は配列番号１のアミノ酸配列を含むが、ここで１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／もしくは１１２位における少なくとも１つのアミノ酸変異は置換されており（例えば保存的に置換されており）、配列番号１との１００％の配列同一性（ＣＤＲを包含するが、本明細書中に開示される１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／もしくは１１２位における変異（複数可）もしくは変異の組み合わせ、および／または存在し得る任意のＣ末端伸長は考慮されない）を持ち得て、および／または配列番号１とのアミノ酸の相違（すなわち、本明細書中に開示される１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異（複数可）または変異の組み合わせならびに存在し得る任意のＣ末端伸長以外のもの）を持たないものであり得る。

【0087】

何らかのアミノ酸の相違が（すなわち、任意のＣ末端伸長ならびに関連する本発明の具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異のほかに）存在するとき、これらのアミノ酸の相違はＣＤＲ中および／またはフレームワーク領域中に存在し得るが、それらは好ましくはフレームワーク領域（Ａｂｍ慣行により定義されるもの、すなわちＡｂｍ慣行に従って定義されるＣＤＲ中ではない）中にのみ、すなわち、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が配列番号１または６０中に存在するものと同じＣＤＲ（Ａｂｍ慣行に従って定義される）を持つように、存在する。

【0088】

また、本発明の任意の態様による本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が、配列番号１の配列と１または複数のアミノ酸の相違を（関連する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異のほかに）持つとき、（すなわち、配列番号１の配列と比べて）存在し得るかかる変異／アミノ酸の相違のいくつかの具体的であるが限定されない例は、例えばＥ１Ｄ、Ｐ４１Ａ、Ｐ４１Ｌ、Ｐ４１ＳまたはＰ４１Ｔ（とりわけＰ４１Ａ）および／またはＴ８７Ａ（例えばＥ１Ｄ（任意選択）、Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｑ４５Ｒ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｖ８９Ｌ、Ｍ９６ＰおよびＱ１０８Ｌ）である。変異の他の例は、１または複数の好適な「ヒト化」置換（の好適な組み合わせ）、例えばＱ１０８Ｌなどであり；例えばＷＯ２００９／１３８５１９（またはＷＯ２００９／１３８５１９中で引用される従来技術中に）およびＷＯ２００８／０２００７９（またはＷＯ２００８／０２００７９中で引用される従来技術中に）、並びにＷＯ２００８／０２００７９からの表Ａ−３からＡ−８（これは可能なヒト化置換を示すリストである）への参照がなされる。好ましくは、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質は、少なくともＱ１０８Ｌヒト化置換を含有する。

【0089】

また、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が、それらが存在するＣＴＬＡ４結合性物質のＮ末端部に存在するおよび／またはこれを形成するとき、それらは好ましくは１位にＤ（すなわち、リファレンスＡと比べたＥ１Ｄ変異）を含有する。かかるＮ末端ＣＴＬＡ４結合性物質のいくつかの好ましいが限定されない例は、配列番号２４および２５および６０として与えられる。したがって、さらなる態様において、本発明は、そのＮ末端に本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（これは本明細書中にさらに記載されるとおりである）を持つ本発明のポリペプチド（これは本明細書中にさらに記載されるとおりである）に関し、ここで本発明の前記ＣＴＬＡ４結合性物質は１位にＤを持ち、好ましくは配列番号２４および２５および６０のＣＴＬＡ４結合性物質から選ばれる。

【0090】

同様に、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が一価の型で用いられるとき、これは、好ましくは、本明細書中に記載されるＣ末端伸長Ｘ（ｎ）および１位におけるＤの両方を持つ。かかる一価のＣＴＬＡ４結合性物質についてのいくつかの好ましいが限定されない例は、配列番号４２および４３として与えられる。したがって、さらなる態様において、本発明は、１位におけるＤおよびＣ末端伸長Ｘ（ｎ）（これは好ましくは単一のＡｌａ残基である）を持つ本発明の一価のＣＴＬＡ４結合性物質（これは本明細書中にさらに記載されるとおりである）に関する。１つの具体的態様において、前記一価のＣＴＬＡ４結合性物質は、配列番号４２または４３から選ばれる。

【0091】

好ましいが限定されない例を使用すると、配列番号２２−２５および４０−４２および６０は、配列番号１とのさらなるアミノ酸の相違、すなわちＡ１４Ｐ、Ｑ４５Ｒ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒおよび／またはＱ１０８Ｌを持つ本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）の例である（加えて、前の段落中で指し示すように、配列番号２４、２５、４２および４３５はＥ１Ｄ変異も持つ）。それゆえに、ある具体的態様において、本発明は、少なくとも任意にＥ１Ｄ変異、Ａ１４Ｐ変異、Ｑ４５Ｒ変異、Ａ７４Ｓ変異、Ｋ８３Ｒ変異およびＱ１０８Ｌ変異の好適な組み合わせを、好ましくはＱ１０８Ｌと他のＡ１４Ｐ、Ｑ４５Ｒ、Ａ７４ＳおよびＫ８３Ｒ変異のいずれか１つとの好適な組み合わせを、好ましくはこれらの他の変異のうちのいずれか２つとの組み合わせを、より好ましくはこれらの変異のうちのいずれか３つとの（例えば組み合わせＡ１４Ｐ、Ａ７４ＳおよびＫ８３ＲまたはＥ１Ｄ、Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｑ４５Ｒ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｖ８９Ｌ、Ｍ９６ＰおよびＱ１０８Ｌ）、例えばこれらの変異の全てとの組み合わせなど（およびやはり、ＣＴＬＡ４結合性物質が一価であるとき、または本発明のＣＴＬＡ結合性物質のＮ末端に存在するとき、好ましくはＥ１Ｄ変異もである）を持つ、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（すなわち、本明細書中に記載される１１位、８９位、１１０位および／または１１２位における変異を持つもの、これもまたさらに本明細書中に記載されるとおりである）に関する。

【0092】

本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、それらが一価の型で用いられるとき、および／またはＣＴＬＡ４結合部分がＣＴＬＡ４結合性物質のＣ末端に存在するおよび／もしくはこれを形成するとき（またはそうでなければ、それらがかかるポリペプチド中に、ＩＳＶＤのＣ末端が定常ドメイン（例えばＣＨ１ドメインなど）と会合していないもしくは連結されていないことを一般に意味する「露出した」Ｃ末端を持つとき；やはりＷＯ２０１２／１７５７４１およびＰＣＴ／ＥＰ２０１５／６０６４３（ＷＯ２０１５１７３３２５）への参照がなされる）、これはまた、好ましくは式（Ｘ）_ｎのＣ末端伸長を持ち、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１など）であり；各々のＸは、天然に存在するアミノ酸残基から独立して選ばれ（だが、好ましい１つの態様によると、これはシステイン残基を何ら含まない）、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基である。

【0093】

かかるＣ末端伸長Ｘ_（ｎ）のいくつかの好ましいが限定されない例によると、Ｘおよびｎは、次のもの：
（ａ）ｎ＝１およびＸ＝Ａｌａ；
（ｂ）ｎ＝２および各々のＸ＝Ａｌａ；
（ｃ）ｎ＝３および各々のＸ＝Ａｌａ；
（ｄ）ｎ＝２および少なくとも１つのＸ＝Ａｌａ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれるが、好ましくはＶａｌ、Ｌｅｕおよび／またはＩｌｅから独立して選ばれる）；
（ｅ）ｎ＝３および少なくとも１つのＸ＝Ａｌａ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれるが、好ましくはＶａｌ、Ｌｅｕおよび／またはＩｌｅから独立して選ばれる）；
（ｆ）ｎ＝３および少なくとも２つのＸ＝Ａｌａ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれるが、好ましくはＶａｌ、Ｌｅｕおよび／またはＩｌｅから独立して選ばれる）；
（ｇ）ｎ＝１およびＸ＝Ｇｌｙ；
（ｈ）ｎ＝２および各々のＸ＝Ｇｌｙ；
（ｉ）ｎ＝３および各々のＸ＝Ｇｌｙ；
（ｊ）ｎ＝２および少なくとも１つのＸ＝Ｇｌｙ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれるが、好ましくはＶａｌ、Ｌｅｕおよび／またはＩｌｅから独立して選ばれる）；
（ｋ）ｎ＝３および少なくとも１つのＸ＝Ｇｌｙ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれるが、好ましくはＶａｌ、Ｌｅｕおよび／またはＩｌｅから独立して選ばれる）；
（ｌ）ｎ＝３および少なくとも２つのＸ＝Ｇｌｙ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれるが、好ましくはＶａｌ、Ｌｅｕおよび／またはＩｌｅから独立して選ばれる）；
（ｍ）ｎ＝２および各々のＸ＝ＡｌａもしくはＧｌｙ；
（ｎ）ｎ＝３および各々のＸ＝ＡｌａもしくはＧｌｙ；
（ｏ）ｎ＝３および少なくとも１つのＸ＝ＡｌａもしくはＧｌｙ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれるが、好ましくはＶａｌ、Ｌｅｕおよび／またはＩｌｅから独立して選ばれる）；または
（ｐ）ｎ＝３および少なくとも２つのＸ＝ＡｌａもしくはＧｌｙ（残りのアミノ酸残基（複数可）Ｘは、任意の天然に存在するアミノ酸から独立して選ばれるが、好ましくはＶａｌ、Ｌｅｕおよび／またはＩｌｅから独立して選ばれる）
であることができ、態様（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｍ）および（ｎ）がとりわけ好ましく、ｎ＝１または２である態様が好ましく、ｎ＝１である態様がとりわけ好ましい。

【0094】

なお、好ましくは、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）中に存在するあらゆるＣ末端伸長は、そのシステイン残基がさらなる機能付与、例えばＰＥＧ化のために用いられるまたは意図されるものでないかぎり、（遊離の）システイン残基を含有しない。

【0095】

有用なＣ末端伸長のいくつかの具体的だが限定されない例は、次のアミノ酸配列：Ａ、ＡＡ、ＡＡＡ、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＡＧ、ＧＡ、ＡＡＧ、ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＧＡＡまたはＧＡＧである。

【0096】

本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が（配列番号１のアミノ酸配列に対して）１１０位または１１２位において変異を含有するとき（本明細書中に記載される１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位および／または１０８位における変異と組み合わせてもよい）、フレームワーク４（１０９位から開始する）のＣ末端アミノ酸残基は、本発明のある実施形態において、配列番号１に示されるものであることができるが、ここで５つのＣ末端残基は次のように置換することができる：
（ｉ）Ｃ末端伸長が存在しない場合：ＶＴＶＫＳ（配列番号４５）、ＶＴＶＱＳ（配列番号４６）、ＶＫＶＳＳ（配列番号４７）もしくはＶＱＶＳＳ（配列番号４８）；または
（ｉｉ）Ｃ末端伸長が存在する場合：ＶＴＶＫＳＸ_（ｎ）（配列番号４９）、ＶＴＶＱＳＸ（ｎ）（配列番号５０）、ＶＫＶＳＳＸ（ｎ）（配列番号５１）もしくはＶＱＶＳＳＸ_（ｎ）（配列番号５２）、例えばＶＴＶＫＳＡ（配列番号５３）、ＶＴＶＱＳＡ（配列番号５４）、ＶＫＶＳＳＡ（配列番号５５）もしくはＶＱＶＳＳＡ（配列番号５６）など。

【0097】

本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が１１０位または１１２位において変異を含有しない（が、本明細書中に記載される１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位および／または１０８位における変異のみを含有する）とき、フレームワーク４（１０９位から開始する）のＣ末端アミノ酸残基は、本発明のある実施形態において、配列番号１に示されるものであることができるが、ここで５つのＣ末端残基は次のように置換することができる：
（ｉ）Ｃ末端伸長が存在しないとき：ＶＴＶＳＳ（配列番号５７）（配列番号１の配列におけるもののように）；または
（ｉｉ）Ｃ末端伸長が存在するとき：ＶＴＶＳＳＸ_（ｎ）（配列番号５８）、例えばＶＴＶＳＳＡ（配列番号５９）など。これらのＣ末端配列において、Ｘおよびｎは、Ｃ末端伸長について本明細書中に定義されているとおりである。

【0098】

本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）のいくつかの好ましいが限定されない例は、配列番号９−４３および６０中に与えられ、これらの配列の各々は本発明のさらなる態様を形成する（これらの配列のうちの１つを含むタンパク質、ＣＴＬＡ４結合性物質、ポリペプチドまたは他の化合物もしくは構成物も同様である）。これらのうち、配列番号９−２５および６０のＣＴＬＡ４結合性物質はＣ末端伸長を持たず、配列番号２６−４３のＣＴＬＡ４結合性物質はＣ末端アラニン（これは本明細書中に記載されるＣ末端伸長の好ましいが限定されない例である）を含有する。

【0099】

本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）の例は、配列番号２２、２３、２４、２５、４０、４１、４２、４３および６０のアミノ酸配列を含む。

【0100】

それゆえに、第一の態様において、本発明は、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのような免疫グロブリン単一可変ドメイン）であって、
− アミノ酸配列ＦＹＧＭＧ（配列番号２）であるＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる）；および
− アミノ酸配列ＤＩＲＴＳＡＧＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３）であるＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによる）；および
− アミノ酸配列ＥＰＳＧＩＳＧＷＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Ｋａｂａｔによる）
を持ち、そして
− ＢＬＡＳＴアルゴリズムによる比較を実施したときに配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一度（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長、並びに関連する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）を持ち、ここでアルゴリズムのパラメーターはそれぞれの配列の間でそれぞれの参照配列の全長にわたって最大マッチを与えるように選択され（例えばｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０；ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３；ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ：０；ＢＬＯＳＵＭ ６２ ｍａｔｒｉｘ；ｇａｐ ｃｏｓｔｓ：ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １；ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）、および／または
および／または
− 配列番号１のアミノ酸配列との７未満、例えば５未満など、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（本明細書中に定義されているとおりであり、上で挙げた存在し得る１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異のいずれも考慮されず、存在し得るいずれのＣ末端伸長も考慮されない）（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在しない）を持ち、
そして
− Ｃ末端伸長（Ｘ）_ｎを持ってもよく、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１など）であり；各々のＸは、独立して選ばれる、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基である、
前記ＣＴＬＡ４結合性物質に関し、
ここでＣＴＬＡ４結合性物質のアミノ酸配列中において
− １位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＥもしくはＤから選ばれ；
− １１位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＬもしくはＶから選ばれ；
− １４位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＡもしくはＰから選ばれ；
− ４５位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＱもしくはＲから選ばれ；
− ７４位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＡもしくはＳから選ばれ；
− ８３位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＫもしくはＲから選ばれ；
− ８９位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＴ、ＶもしくはＬから好適に選ばれ；
− ９６位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＭもしくはＰから選ばれ；
− １０８位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＱもしくはＬから選ばれ；
− １１０位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＴ、ＫもしくはＱから好適に選ばれ；および／もしくは
− １１２位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＳ、ＫもしくはＱから好適に選ばれ
例えば、次のもの：
（ｉ）１位は、ＥもしくはＤである；
（ｉｉ）１１位は、Ｖである；
（ｉｉｉ）１４位は、Ｐである；
（ｉｖ）４５位は、Ｒである；
（ｖ）７４位は、Ｓである；
（ｖｉ）８３位は、Ｒである；
（ｖｉｉ）８９位は、ＴもしくはＬである；
（ｖｉｉｉ）９６位は、Ｐである；
（ｉｘ）１０８位は、Ｌである；
のうちの１または複数が当てはまるようになっており、および／または
例えば、ここでＣＴＬＡ４結合性物質は、下の変異セット
ａ．１１位はＶおよび１１０位はＫもしくはＱである；
ｂ．１１位はＶおよび１１２位はＫもしくはＱである．
ｃ．８９位はＬおよび１１位はＶである；
ｄ．８９位はＬおよび１１０位はＫもしくはＱである；
ｅ．８９位はＬおよび１１２位はＫもしくはＱである；
ｆ．８９位はＬおよび１１位はＶおよび１１０位はＫもしくはＱである；
ｇ．８９位はＬおよび１１位はＶおよび１１２位はＫもしくはＱである；
ｈ．１位はＥもしくはＤ；１１位はＶ；１４位はＰ；４５位はＲ；７４位はＳ；８３位はＲ；８９位はＬ；９６位はＰ；および１０８位はＬである；
ｉ．１位はＥもしくはＤ；１１位はＶ；１４位はＰ；４５位はＲ；７４位はＳ；８３位はＲ；８９位はＬ；９６位はＰ；１０８位はＬ；および１１０位はＫもしくはＱである；
ｊ．１位はＥもしくはＤ；１１位はＶ；１４位はＰ；４５位はＲ；７４位はＳ；８３位はＲ；８９位はＬ；９６位はＰ；１０８位はＬ；および１１２位はＫもしくはＱである；
ｋ．１位はＥもしくはＤ；１１位はＶ；１４位はＰ；４５位はＲ；７４位はＳ；８３位はＲ；８９位はＬ；９６位はＰ；および１０８位はＬである
のうちの１または複数を含む。

【0101】

さらなる態様において、本発明は、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのような免疫グロブリン単一可変ドメイン）であって、
− アミノ酸配列ＦＹＧＭＧ（配列番号２）であるＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる）；および
− アミノ酸配列ＤＩＲＴＳＡＧＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３）であるＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによる）；および
− アミノ酸配列ＥＰＳＧＩＳＧＷＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Ｋａｂａｔによる）
を持ち、そして
− ＢＬＡＳＴアルゴリズムによる比較を実施したときに配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一度（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長、並びに関連する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）を持ち、ここでアルゴリズムのパラメーターはそれぞれの配列の間でそれぞれの参照配列の全長にわたって最大マッチを与えるように選択され（例えばｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０；ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３；ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ：０；ＢＬＯＳＵＭ ６２ ｍａｔｒｉｘ；ｇａｐ ｃｏｓｔｓ：ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １；ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）、
および／または
− 配列番号１のアミノ酸配列との７未満、例えば５未満など、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（本明細書中に定義されているとおりであり、上で挙げた存在し得る１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異のいずれも考慮されず、存在し得るいずれのＣ末端伸長も考慮されない）（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在しない）を持ち、
そして
− Ｃ末端伸長（Ｘ）_ｎを持ってもよく、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１など）であり；各々のＸは、独立して選ばれる、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基である、
前記ＣＴＬＡ４結合性物質に関し、
このＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのような免疫グロブリン単一可変ドメイン）は、言及された位置（Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされたもの）において次のアミノ酸残基（すなわち、配列番号１のアミノ酸配列と比べた変異）：
− １Ｄもしくは１Ｅ；
− １１Ｖ；
− １４Ｐ；
− ４５Ｒ；
− ７４Ｓ；
− ８３Ｒ；
− ８９Ｔもしくは８９Ｌ；
− ９６Ｐ；または
− １０８Ｌ
のうちの１または複数を含み、
例えば、ここでＣＴＬＡ４結合性物質は、下の変異セット：
− １Ｄもしくは１Ｅと、１１Ｖ；１４Ｐ；４５Ｒ；７４Ｓ；８３Ｒ；８９Ｌ；９６Ｐ；および１０８Ｌとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと１１Ｖとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− １Ｄもしくは１Ｅと、１１Ｖ；１４Ｐ；４５Ｒ；７４Ｓ；８３Ｒ；８９Ｌ；９６Ｐ；１０８Ｌおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− １Ｄもしくは１Ｅと、１１Ｖ；１４Ｐ；４５Ｒ；７４Ｓ；８３Ｒ；８９Ｌ；９６Ｐ；１０８Ｌおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；または
− ８９Ｌと、１１Ｖおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ
のうちの１または複数を含む。

【0102】

言及されているように、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が一価の型で用いられるとき、および／またはＣＴＬＡ４結合部分が本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（本明細書中に定義されるもの）のＣ末端に存在する場合、ＣＴＬＡ４結合性物質は好ましくはＣ末端伸長Ｘ（ｎ）を持ち、このＣ末端伸長は本発明のＣＴＬＡ４結合性物質について本明細書中で記載されるとおりであり得て、および／またはＷＯ２０１２／１７５７４１もしくはＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に記載されるとおりであり得る。

【0103】

本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）のいくつかの好ましいが限定されない例は、配列番号８−４３または６０中に与えられ、これらのアミノ酸配列の各々は個々で本発明のさらなる態様を形成する。

【0104】

言及されているように、本発明において、８９位がＴであり；または１位がＥもしくはＤ、１１位がＶ、１４位がＰ、４５位がＲ、７４位がＳ、８３位がＲ、８９位がＬ、９６位がＰおよび１０８位がＬであり；または１１位がＶおよび８９位がＬである（１１０Ｋもしくは１１０Ｑ変異および／または１１２Ｋもしくは１１２Ｑ変異との好適な組み合わせであってもよく、とりわけ１１０Ｋまたは１１０Ｑ変異との組み合わせであってもよい）アミノ酸配列がとりわけ好ましい。なおより好ましいのは、１１位がＶおよび８９位がＬであって、１１０Ｋまたは１１０Ｑ変異を有してもよいアミノ酸配列である。

【0105】

それゆえに、１つの好ましい態様において、本発明は、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのような免疫グロブリン単一可変ドメイン）であって、
− アミノ酸配列ＦＹＧＭＧ（配列番号２）であるＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる）；および
− アミノ酸配列ＤＩＲＴＳＡＧＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３）であるＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによる）；および
− アミノ酸配列ＥＰＳＧＩＳＧＷＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Ｋａｂａｔによる）
を持ち、そして
− ＢＬＡＳＴアルゴリズムによる比較を実施したときに配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一度（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長、並びに関連する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）を持ち、ここでアルゴリズムのパラメーターはそれぞれの配列の間でそれぞれの参照配列の全長にわたって最大マッチを与えるように選択され（例えばｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０；ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３；ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ：０；ＢＬＯＳＵＭ ６２ ｍａｔｒｉｘ；ｇａｐ ｃｏｓｔｓ：ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １；ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）、および／または
および／または
− 配列番号１のアミノ酸配列との７未満、例えば５未満など、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（本明細書中に定義されているとおりであり、上で挙げた存在し得る１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異のいずれも考慮されず、存在し得るいずれのＣ末端伸長も考慮されない）（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在しない）を持ち、
そして
− Ｃ末端伸長（Ｘ）_ｎを持ってもよく、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１など）であり；各々のＸは、独立して選ばれる、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基である、
前記ＣＴＬＡ４結合性物質に関し、
ここでＣＴＬＡ４結合性物質のアミノ酸配列中において
− １位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＥもしくはＤから選ばれ；
− １１位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＬもしくはＶから選ばれ；
− １４位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＡもしくはＰから選ばれ；
− ４５位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＱもしくはＲから選ばれ；
− ７４位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＡまたはＳから選ばれ；
− ８３位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＫもしくはＲから選ばれ；
− ８９位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＴ、ＬもしくはＶから選ばれ；
− ９６位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＭもしくはＰから選ばれ；
− １０８位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＬもしくはＱから選ばれ；
− １１０位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＴ、ＫもしくはＱから好適に選ばれ（好ましくはＴであり）；および／または
− １１２位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＳ、ＫもしくはＱから好適に選ばれる（好ましくはＳである）。

【0106】

別の好ましい態様において、本発明は、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのような免疫グロブリン単一可変ドメイン）であって、
− アミノ酸配列ＦＹＧＭＧ（配列番号２）であるＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる）；および
− アミノ酸配列ＤＩＲＴＳＡＧＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３）であるＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによる）；および
− アミノ酸配列ＥＰＳＧＩＳＧＷＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Ｋａｂａｔによる）
を持ち、そして
− ＢＬＡＳＴアルゴリズムによる比較を実施したときに配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一度（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長、並びに関連する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）を持ち、ここでアルゴリズムのパラメーターはそれぞれの配列の間でそれぞれの参照配列の全長にわたって最大マッチを与えるように選択され（例えばｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０；ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３；ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ：０；ＢＬＯＳＵＭ ６２ ｍａｔｒｉｘ；ｇａｐ ｃｏｓｔｓ：ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １；ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）、
および／または
− 配列番号１のアミノ酸配列との７未満、例えば５未満など、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（本明細書中に定義されているとおりであり、上で挙げた存在し得る１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異のいずれも考慮されず、存在し得るいずれのＣ末端伸長も考慮されない）（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在しない）を持ち、
そして
− Ｃ末端伸長（Ｘ）_ｎを持ってもよく、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１など）であり；各々のＸは、独立して選ばれる、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基である、
前記ＣＴＬＡ４結合性物質に関し、
ここで、例えば、ＣＴＬＡ４結合性物質は、次に従う１または複数の変異を含む
− １位におけるアミノ酸残基は、ＥもしくはＤである；
− １１位におけるアミノ酸残基は、Ｖである；
− １４位におけるアミノ酸残基は、Ｐである；
− ４５位におけるアミノ酸残基は、Ｒである；
− ７４位におけるアミノ酸残基は、Ｓである；
− ８３位におけるアミノ酸残基は、Ｒである；
− ８９位におけるアミノ酸残基は、Ｌである；
− ９６位におけるアミノ酸残基は、Ｐである；
− １０８位におけるアミノ酸残基は、Ｌである；
− １１０位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＴ、ＫもしくはＱから選ばれる；または
− １１２位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＳ、ＫもしくはＱから選ばれる。

【0107】

１つの具体的であるが限定されない態様において、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、言及された位置（Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされたもの）において次の変異セット（すなわち、配列番号１の配列と比べた変異）：
− １１Ｖと８９Ｌとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− １１Ｖと、８９Ｌおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− １１Ｖと、８９Ｌおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１Ｄもしくは１Ｅ、１４Ｐ、４５Ｒ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌ、９６Ｐ、１０８Ｌおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１Ｄもしくは１Ｅ、１４Ｐ、４５Ｒ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌ、９６Ｐ、１０８Ｌおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；または
− １１Ｖと、１Ｄもしくは１Ｅ、１４Ｐ、４５Ｒ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌ、９６Ｐおよび１０８Ｌとの組み合わせ
のうちの１または複数を含み、
表ＡのＣＴＬＡ４結合性物質中に、例えば配列番号１または配列番号６０中にあるＣＤＲ（例えばＫａｂａｔによる）を持ち、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を持つ。

【0108】

別の具体的であるが限定されない態様において、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、言及された位置（Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされたもの）において次の変異セット（すなわち、配列番号１の配列と比べた変異）：
− ８９Ｌと１１Ｖとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１Ｄもしくは１Ｅ、１１Ｖ、１４Ｐ、４５Ｒ、７４Ｓ、８３Ｒ、９６Ｐおよび１０８Ｌとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１Ｄもしくは１Ｅ、１１Ｖ、１４Ｐ、４５Ｒ、７４Ｓ、８３Ｒ、９６Ｐ、１０８Ｌおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；または
− ８９Ｌと、１Ｄもしくは１Ｅ、１１Ｖ、１４Ｐ、４５Ｒ、７４Ｓ、８３Ｒ、９６Ｐ、１０８Ｌおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ
のうちの１または複数を含み、
表ＡのＣＴＬＡ４結合性物質中に、例えば配列番号１または配列番号６０中にあるＣＤＲ（例えばＫａｂａｔによる）を持ち、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を持つ。

【0109】

別の具体的であるが限定されない態様において、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、言及された位置（Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされたもの）において次の変異セット（すなわち、配列番号１の配列と比べた変異）：
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１１Ｖとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、８９Ｌとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１１Ｖおよび８９Ｌとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１Ｄもしくは１Ｅ、１１Ｖ、１４Ｐ、４５Ｒ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌ、９６Ｐおよび１０８Ｌとの組み合わせ
のうちの１または複数を含み、
表ＡのＣＴＬＡ４結合性物質中に、例えば配列番号１または配列番号６０中にあるＣＤＲ（例えばＫａｂａｔによる）を持ち、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を持つ。

【0110】

別の具体的であるが限定されない態様において、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、言及された位置（Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされたもの）において次の変異セット（すなわち、配列番号１の配列と比べた変異）：
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、１１Ｖとの組み合わせ；
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、８９Ｌとの組み合わせ；または
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、１１Ｖおよび８９Ｌとの組み合わせ；または
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、１Ｄもしくは１Ｅ、１１Ｖ、１４Ｐ、４５Ｒ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌ、９６Ｐおよび１０８Ｌとの組み合わせ
のうちの１または複数を含み、
表ＡのＣＴＬＡ４結合性物質中に、例えば配列番号１または配列番号６０中にあるＣＤＲ（例えばＫａｂａｔによる）を持ち、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を持つ。

【0111】

別の態様において、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は８９位にＴを含み、ＣＤＲ、例えば配列番号６０に示されるもの（例えばＫａｂａｔによるもの）などを持ち、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を持つ。

【0112】

別の態様において、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は１１位にＶおよび８９位にＬを含み、ＣＤＲ、例えば配列番号１または６０に示されるもの（例えばＫａｂａｔによるもの）などを持ち、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を持つ。

【0113】

言及されているように、上の態様による本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、好ましくはさらにＥ１Ｄ変異、Ｌ１１Ｖ変異、Ａ１４Ｐ変異、Ｑ４５Ｒ変異、Ａ７４Ｓ変異、Ｋ８３Ｒ変異、Ｖ８９Ｌ変異、Ｍ９６Ｐ変異およびＱ１０８Ｌ変異の好適な組み合わせを、本発明のある実施形態においてＱ１０８Ｌと他のＡ１４Ｐ、Ｑ４５Ｒ、Ａ７４ＳおよびＫ８３Ｒ変異のうちのいずれか１つとの好適な組み合わせを、本発明のある実施形態においてこれらの他の変異のうちのいずれか２つとの組み合わせを、より好ましくはこれらの変異のうちのいずれか３つとの組み合わせ（例えば組み合わせＡ１４Ｐ、Ａ７４ＳおよびＫ８３Ｒなど）を、例えばこれらの変異のうちの４つ全てとの組み合わせなどを含有する（およびやはり、ＣＴＬＡ４結合性物質が一価であるとき、または本発明のＣＴＬＡ結合性物質のＮ末端に存在するとき、好ましくはＥ１Ｄ変異もである）。

【0114】

別の態様において、本発明は、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのような免疫グロブリン単一可変ドメイン）であって、
− アミノ酸配列ＧＧＴＦＳＦＹＧＭＧ（配列番号５）であるＣＤＲ１（Ａｂｍによる）；および
− アミノ酸配列ＤＩＲＴＳＡＧＲＴＹ（配列番号６）であるＣＤＲ２（Ａｂｍによる）；および
− アミノ酸配列ＥＰＳＧＩＳＧＷＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Ａｂｍによる）
を持ち、そして
− ＢＬＡＳＴアルゴリズムによる比較を実施したときに配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一度（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長、並びに関連する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）を持ち、ここでアルゴリズムのパラメーターはそれぞれの配列の間でそれぞれの参照配列の全長にわたって最大マッチを与えるように選択され（例えばｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０；ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３；ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ：０；ＢＬＯＳＵＭ ６２ ｍａｔｒｉｘ；ｇａｐ ｃｏｓｔｓ：ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １；ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）、
および／または
− 配列番号１のアミノ酸配列との７未満、例えば５未満など、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（本明細書中に定義されているとおりであり、上で挙げた存在し得る１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異のいずれも考慮されず、存在し得るいずれのＣ末端伸長も考慮されない）（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在しない）を持ち、
そして
− Ｃ末端伸長（Ｘ）_ｎを持ってもよく、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１など）であり；各々のＸは、独立して選ばれる、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基である、
前記ＣＴＬＡ４結合性物質に関し、
前記ＣＴＬＡ４結合性物質は、
− １位におけるアミノ酸残基は、ＥまたはＤであり；
− １１位におけるアミノ酸残基は、ＬまたはＶであり；
− １４位におけるアミノ酸残基は、Ｐであり；
− ４５位におけるアミノ酸残基は、Ｒであり；
− ７４位におけるアミノ酸残基は、Ｓであり；
− ８３位におけるアミノ酸残基は、Ｒであり；
− ８９位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＴ、ＶまたはＬから選ばれ；
− ９６位におけるアミノ酸残基は、Ｐであり；
− １０８位におけるアミノ酸残基は、Ｌであり；
− １１０位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＴ、ＫまたはＱから選ばれ；および
− １１２位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＳ、ＫまたはＱから選ばれる
アミノ酸配列を含み、
例えば、次のもの：
（ｉ）１位は、ＤもしくはＥである；
（ｉｉ）１１位は、Ｖである；
（ｉｉｉ）１４位は、Ｐである；
（ｉｖ）４５位は、Ｒである；
（ｖ）７４位は、Ｓである；
（ｖｉ）８３位は、Ｒである；
（ｖｉｉ）８９位は、ＬもしくはＴである；
（ｖｉｉｉ）９６位は、Ｐである；または
（ｉｘ）１０８位は、Ｌである
のうちの１または複数が当てはまるようになっており、
例えば、ここでＣＴＬＡ４結合性物質は、下の変異セット：
ａ．１１位はＶおよび１１０位はＫもしくはＱである；
ｂ．１１位はＶおよび１１２位はＫもしくはＱである；
ｃ．８９位はＬおよび１１位はＶである；
ｄ．８９位はＬおよび１１０位はＫもしくはＱである；
ｅ．８９位はＬおよび１１２位はＫもしくはＱである；
ｆ．８９位はＬおよび１１位はＶおよび１１０位はＫもしくはＱである；または
ｇ．８９位はＬおよび１１位はＶおよび１１２位はＫもしくはＱである
のうちの１または複数を含む。

【0115】

さらなる態様において、本発明は、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのような免疫グロブリン単一可変ドメイン）であって、
− アミノ酸配列ＧＧＴＦＳＦＹＧＭＧ（配列番号５）であるＣＤＲ１（Ａｂｍによる）；および
− アミノ酸配列ＤＩＲＴＳＡＧＲＴＹ（配列番号６）であるＣＤＲ２（Ａｂｍによる）；および
− アミノ酸配列ＥＰＳＧＩＳＧＷＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Ａｂｍによる）
を持ち、そして
− ＢＬＡＳＴアルゴリズムによる比較を実施したときに配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一度（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長、並びに関連する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）を持ち、ここでアルゴリズムのパラメーターはそれぞれの配列の間でそれぞれの参照配列の全長にわたって最大マッチを与えるように選択され（例えばｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０；ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３；ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ：０；ＢＬＯＳＵＭ ６２ ｍａｔｒｉｘ；ｇａｐ ｃｏｓｔｓ：ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １；ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）、
および／または
− 配列番号１のアミノ酸配列との７未満、例えば５未満など、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（本明細書中に定義されているとおりであり、上で挙げた存在し得る１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異のいずれも考慮されず、存在し得るいずれのＣ末端伸長も考慮されない）（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在しない）を持ち、
そして
− Ｃ末端伸長（Ｘ）_ｎを持ってもよく、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１など）であり；各々のＸは、独立して選ばれる、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基である、
前記ＣＴＬＡ４結合性物質に関し、
ここで、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのような免疫グロブリン単一可変ドメイン）は、言及された位置（Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされたもの）において次のアミノ酸残基（すなわち、配列番号１のアミノ酸配列と比べた変異）：
− １Ｄもしくは１Ｅ；
− １１Ｖ；
− １４Ｐ；
− ４５Ｒ；
− ７４Ｓ；
− ８３Ｒ；
− ８９Ｌもしくは８９Ｔ；
− ９６Ｐ；または
− １０８Ｌ
のうちの１または複数を含み、
例えば、ここでＣＴＬＡ４結合性物質は、下の変異セット：
− １１Ｖと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと１１Ｖとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；または
− ８９Ｌと、１１Ｖおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ
のうちの１または複数を含む。

【0116】

言及されているように、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が一価の型で用いられるとき、および／またはＣＴＬＡ４結合部分が本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（本明細書中に定義されるもの）のＣ末端に存在する場合、ＣＴＬＡ４結合性物質は好ましくはＣ末端伸長Ｘ（ｎ）を持ち、このＣ末端伸長は本発明のＣＴＬＡ４結合性物質について本明細書中で記載されるとおりであり得て、および／またはＷＯ２０１２／１７５７４１もしくはＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に記載されるとおりであり得る。

【0117】

本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）のいくつかの好ましいが限定されない例は、配列番号８−４３または６０中に与えられ、これらのアミノ酸配列の各々は個々で本発明のさらなる態様を形成する。

【0118】

言及されているように、本発明において、８９位がＴであり；または１位がＥもしくはＤ、１１位がＶ、１４位がＰ、４５位がＲ、７４位がＳ、８３位がＲ、８９位がＬ、９６位がＰもしくは１０８位がＬであり；または１１位がＶおよび８９位がＬである（１１０Ｋもしくは１１０Ｑ変異および／または１１２Ｋもしくは１１２Ｑ変異との好適な組み合わせであってもよく、とりわけ１１０Ｋまたは１１０Ｑ変異との組み合わせであってもよい）アミノ酸配列がとりわけ好ましい。なおより好ましいのは、１１位がＶおよび８９位がＬであって、１１０Ｋまたは１１０Ｑ変異を有してもよいアミノ酸配列である。

【0119】

それゆえに、１つの好ましい態様において、本発明は、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのような免疫グロブリン単一可変ドメイン）であって、
− アミノ酸配列ＧＧＴＦＳＦＹＧＭＧ（配列番号５）であるＣＤＲ１（Ａｂｍによる）；および
− アミノ酸配列ＤＩＲＴＳＡＧＲＴＹ（配列番号６）であるＣＤＲ２（Ａｂｍによる）；および
− アミノ酸配列ＥＰＳＧＩＳＧＷＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Ａｂｍによる）
を持ち、そして
− ＢＬＡＳＴアルゴリズムによる比較を実施したときに配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一度（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長、並びに関連する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）を持ち、ここでアルゴリズムのパラメーターはそれぞれの配列の間でそれぞれの参照配列の全長にわたって最大マッチを与えるように選択され（例えばｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０；ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３；ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ：０；ＢＬＯＳＵＭ ６２ ｍａｔｒｉｘ；ｇａｐ ｃｏｓｔｓ：ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １；ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）、
および／または
− 配列番号１のアミノ酸配列との７未満、例えば５未満など、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（本明細書中に定義されているとおりであり、上で挙げた存在し得る１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異のいずれも考慮されず、存在し得るいずれのＣ末端伸長も考慮されない）（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在しない）を持ち、
そして
− Ｃ末端伸長（Ｘ）_ｎを持ってもよく、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１など）であり；各々のＸは、独立して選ばれる、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基である、
前記ＣＴＬＡ４結合性物質に関し、
前記ＣＴＬＡ４結合性物質は、次に従って１または複数の変異（配列番号１のアミノ酸配列に対するもの）を含む
− １位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＥおよびＤから選ばれ；
− １１位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＬおよびＶから選ばれ；
− １４位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＡおよびＰから選ばれ；
− ４５位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＱおよびＲから選ばれ；
− ７４位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＡおよびＳから選ばれ；
− ８３位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＫおよびＲから選ばれ；
− ８９位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＴ、ＬおよびＶから選ばれ；
− ９６位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＭまたはＰから選ばれ；
− １０８位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＬまたはＱから選ばれ；
− １１０位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＴ、ＫまたはＱから選ばれ（好ましくはＴであり）；および
− １１２位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＳ、ＫまたはＱから選ばれる（好ましくはＳである）。

【0120】

別の好ましい態様において、本発明は、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのような免疫グロブリン単一可変ドメイン）であって、
− アミノ酸配列ＧＧＴＦＳＦＹＧＭＧ（配列番号５）であるＣＤＲ１（Ａｂｍによる）；および
− アミノ酸配列ＤＩＲＴＳＡＧＲＴＹ（配列番号６）であるＣＤＲ２（Ａｂｍによる）；および
− アミノ酸配列ＥＰＳＧＩＳＧＷＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Ａｂｍによる）
を持ち、そして
− ＢＬＡＳＴアルゴリズムによる比較を実施したときに配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一度（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長、並びに関連する具体的態様により必要とされる１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）を持ち、ここでアルゴリズムのパラメーターはそれぞれの配列の間でそれぞれの参照配列の全長にわたって最大マッチを与えるように選択され（例えばｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０；ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３；ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ：０；ＢＬＯＳＵＭ ６２ ｍａｔｒｉｘ；ｇａｐ ｃｏｓｔｓ：ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １；ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）、
および／または
− 配列番号１のアミノ酸配列との７未満、例えば５未満など、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（本明細書中に定義されているとおりであり、上で挙げた存在し得る１位、１１位、１４位、４５位、７４位、８３位、８９位、９６位、１０８位、１１０位および／または１１２位における変異のいずれも考慮されず、存在し得るいずれのＣ末端伸長も考慮されない）（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在しない）を持ち、
そして
− Ｃ末端伸長（Ｘ）_ｎを持ってもよく、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１など）であり；各々のＸは、独立して選ばれる、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基である、
前記ＣＴＬＡ４結合性物質に関し、
ここでＣＴＬＡ４結合性物質は、次の変異：
− １位におけるアミノ酸残基は、ＤもしくはＥである；
− １１位におけるアミノ酸残基は、Ｖである；
− １４位におけるアミノ酸残基は、Ｐである；
− ４５位におけるアミノ酸残基は、Ｒである；
− ７４位におけるアミノ酸残基は、Ｓである；
− ８３位におけるアミノ酸残基は、Ｒである；
− ８９位におけるアミノ酸残基は、Ｌである；
− ９６位におけるアミノ酸残基は、Ｐである；
− １０８位におけるアミノ酸残基は、Ｌである；
− １１０位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＴ、ＫもしくはＱから好適に選ばれる；または
− １１２位におけるアミノ酸残基は、好ましくはＳ、ＫもしくはＱから好適に選ばれる
のうちの１または複数を含む。

【0121】

１つの具体的であるが限定されない態様において、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、言及された位置（Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされたもの）において次の変異セット（すなわち、配列番号１の配列と比べた変異）：
− １１Ｖと８９Ｌとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１Ｄ、１４Ｐ、４５Ｒ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌ、９６Ｐ、１０８Ｌとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１Ｅ、１４Ｐ、４５Ｒ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌ、９６Ｐ、１０８Ｌとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑ、および１Ｄもしくは１Ｅおよび１４Ｐ、４５Ｒ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌ、９６Ｐ、および１０８Ｌとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− １１Ｖと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑ、および１Ｄもしくは１Ｅおよび１４Ｐ、４５Ｒ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌ、９６Ｐ、および１０８Ｌとの組み合わせ；
− １１Ｖと、８９Ｌおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；または
− １１Ｖと、８９Ｌおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ
のうちの１または複数を含み、
表ＡのＣＴＬＡ４結合性物質中に、例えば配列番号１または配列番号６０中にあるＣＤＲ（例えばＡｂｍによるもの）を持ち、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を持つ。

【0122】

別の具体的であるが限定されない態様において、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、言及された位置（Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされたもの）において次の変異セット（すなわち、配列番号１の配列と比べた変異）：
− ８９Ｌと１１Ｖとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１Ｄもしくは１Ｅ、１１Ｖ、１４Ｐ、４５Ｒ、７４Ｓ、８３Ｒ、９６Ｐおよび１０８Ｌとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１０Ｋもしくは１１０Ｑおよび１Ｄもしくは１Ｅおよび１１Ｖ、１４Ｐ、４５Ｒ、７４Ｓ、８３Ｒ、９６Ｐおよび１０８Ｌとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１２Ｋもしくは１１２Ｑおよび１Ｄもしくは１Ｅおよび１１Ｖ、１４Ｐ、４５Ｒ、７４Ｓ、８３Ｒ、９６Ｐおよび１０８Ｌとの組み合わせ；
− ８９Ｌと、１１Ｖおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせ；または
− ８９Ｌと、１１Ｖおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせ
を含み、
表ＡのＣＴＬＡ４結合性物質中に、例えば配列番号１または配列番号６０中にあるＣＤＲ（例えばＡｂｍによるもの）を持ち、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を持つ。

【0123】

別の具体的であるが限定されない態様において、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、言及された位置（Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされたもの）において次の変異セット（すなわち、配列番号１の配列と比べた変異）：
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１１Ｖとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、８９Ｌとの組み合わせ；
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１１Ｖおよび８９Ｌとの組み合わせ；または
− １１０Ｋもしくは１１０Ｑと、１Ｄもしくは１Ｅおよび１１Ｖ、１４Ｐ、４５Ｒ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌ、９６Ｐおよび１０８Ｌとの組み合わせ
を含み、
表ＡのＣＴＬＡ４結合性物質中に、例えば配列番号１または配列番号６０中にあるＣＤＲ（例えばＡｂｍによるもの）を持ち、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を持つ。

【0124】

別の具体的であるが限定されない態様において、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、言及された位置（Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされたもの）において次の変異セット（すなわち、配列番号１の配列と比べた変異）：
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、１１Ｖとの組み合わせ；
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、８９Ｌとの組み合わせ；
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、１１Ｖおよび８９Ｌとの組み合わせ；または
− １１２Ｋもしくは１１２Ｑと、１Ｄもしくは１Ｅおよび１１Ｖ、１４Ｐ、４５Ｒ、７４Ｓ、８３Ｒ、８９Ｌ、９６Ｐおよび１０８Ｌとの組み合わせ
を含み、
表ＡのＣＴＬＡ４結合性物質中に、例えば配列番号１または配列番号６０中にあるＣＤＲ（例えばＡｂｍによるもの）を持ち、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を持つ。

【0125】

別の態様において、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は８９位にＴを含み、ＣＤＲ、例えば配列番号１または６０に示されるもの（例えばＡｂｍによるもの）などを持ち、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を持つ。

【0126】

別の態様において、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は１１位にＶおよび８９位にＬを含み、ＣＤＲ、例えば配列番号６０に示されるもの（例えばＡｂｍによるもの）などを持ち、本明細書中に記載されるとおりである配列番号１のアミノ酸配列と全体的な配列同一度を持つ。

【0127】

言及されているように、上の態様による本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、好ましくはさらに、任意にＥ１Ｄ変異、Ｌ１１Ｖ変異、Ａ１４Ｐ変異、Ｑ４５Ｒ変異、Ａ７４Ｓ変異、Ｋ８３Ｒ変異、Ｖ８９Ｌ変異、Ｍ９６Ｐ変異およびＱ１０８Ｌ変異の好適な組み合わせを、好ましくはＱ１０８Ｌと他のＡ１４Ｐ、Ｑ４５Ｒ、Ａ７４ＳおよびＫ８３Ｒ変異のうちのいずれか１つとの好適な組み合わせを、好ましくはこれらの他の変異のうちのいずれか２つとの組み合わせで、より好ましくはこれらの他の変異のうちのいずれか３つとの（例えば組み合わせＡ１４Ｐ、Ａ７４ＳおよびＫ８３Ｒなどとの）組み合わせで、例えばこれらの変異の全てなどとの組み合わせを含有するようなものである（およびやはり、ＣＴＬＡ４結合性物質が一価であるとき、または本発明のＣＴＬＡ結合性物質のＮ末端に存在するとき、好ましくはＥ１Ｄ変異もである）。本発明のある実施形態において、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質は、変異Ｅ１Ｄ（またはかかる変異を欠いており、ここで残基１はＥである）、Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｑ４５Ｒ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｖ８９Ｌ、Ｍ９６Ｐ、Ｑ１０８Ｌを含む。

【0128】

別の具体的であるが限定されない態様において、本発明は、次のアミノ酸配列：配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３もしくは配列番号６０のうちの１つから選ばれるアミノ酸配列であるか、または本質的にこれからなる、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのような免疫グロブリン単一可変ドメイン）に関する。

【0129】

別の具体的であるが限定されない態様において、本発明は、次のアミノ酸配列：配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３もしくは配列番号６０のうちの１つから選ばれるアミノ酸配列であるか、または本質的にこれからなる、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのような免疫グロブリン単一可変ドメイン）に関する。

【0130】

また、本明細書中で既に指示しているように、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）のアミノ酸残基は、ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０００ Ｊｕｎ ２３；２４０（１−２）：１８５−１９５の論文中でラクダ科動物からのＶＨＨドメインに適用されたように、または本明細書中で言及されるように、Ｋａｂａｔら（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１）により与えられるＶＨについての一般的ナンバリングに従ってナンバリングされる。なお、ＶＨドメインについておよびＶＨＨドメインについて当該技術分野で周知であるように、ＣＤＲの各々におけるアミノ酸残基の総数は変わり得て、Ｋａｂａｔナンバリングにより指し示されるアミノ酸の総数に対応しないことがある（すなわち、Ｋａｂａｔナンバリングによる１または複数の位置は実際の配列中では占められていないこともあり、または実際の配列はＫａｂａｔナンバリングにより可能とされる数よりも多くのアミノ酸残基を含有することもある）。これは、一般に、Ｋａｂａｔによるナンバリングは実際の配列中のアミノ酸残基の実際のナンバリングと対応することもしないこともあり得ることを意味する。

【0131】

ＶＨドメインのアミノ酸残基をナンバリングする代替的な方法は、ラクダ科動物からのＶＨＨドメインおよびナノボディと同様に適用することができる方法であり、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｎａｔｕｒｅ ３４２，８７７−８８３（１９８９））により記載される方法、いわゆる「ＡｂＭ定義」およびいわゆる「接触定義（ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）」である。しかしながら、本明細書、態様および図においては、特に指示がないかぎり、ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓによりＶＨＨドメインに適用されたようにＫａｂａｔによるナンバリングに従う。

【0132】

本発明はまた、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）；本発明のＣＴＬＡ４結合性物質を発現／生産する方法；本発明のＣＴＬＡ４結合性物質を含む組成物および生産物（例えば医薬組成物および生産物）；本発明のＣＴＬＡ４結合性物質をコードするポリヌクレオチド；ならびに本発明のＣＴＬＡ４結合性物質の使用（とりわけ治療的、予防的および診断的使用）に関する。

【0133】

本発明のこれらおよび他の態様、実施形態、利点、用途および使用は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。

【0134】

したがって、さらなる態様において、本発明は、本明細書中に記載される少なくとも１つの（例えば１つ、２つまたは３つなどの）ＣＴＬＡ４結合部分を含むまたは本質的にこれからなるポリペプチドまたは他の化学物質に関する。これらの分子それ自体は、「ＣＴＬＡ４結合性物質」または「本発明の化合物」または「本発明のポリペプチド」と呼ばれ得る。

【0135】

本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、１または複数の他のアミノ酸配列、化学物質または部分を含有することができる。これらの他のアミノ酸配列、化学物質または部分は、得られる本発明のＣＴＬＡ４結合性物質に１もしくは複数の所望の性質を付与することで、および／または得られる本発明のＣＴＬＡ４結合性物質の性質を所望のように変えることで、例えば、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質に所望の生物学的および／もしくは治療活性を提供すること（例えば、得られるポリペプチドがＣＴＬＡ４およびその他の治療関連標的、例えばＰＤ１、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡおよび／またはＣＤ２７などに関して「二重特異性」になるように、得られる本発明のＣＴＬＡ４結合性物質にアフィニティーおよび好ましくは別の治療関連標的に対する効力を提供すること）、所望の半減期を与えること、および／または、そうでなければ薬物動態学的、および／または、薬力学的性質を改変もしくは改良すること、ＣＴＬＡ４結合性物質を特異的な細胞、組織もしくは器官（がん細胞がん組織を包含する）に標的化すること、細胞傷害効果を与えること、／または検出可能なタグもしくは標識として働くことができる。かかる他のアミノ酸配列、化学物質または部分のいくつかの限定されない例は：
− １もしくは複数の好適なリンカー（例えば９ＧＳ、１５ＧＳまたは３５ＧＳリンカー（９、１５または３５個のＧおよびＳのアミノ酸の任意の組み合わせ、例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳなど））（配列番号６５）。本発明のある実施形態において、リンカーは（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号１１８）であり、ここでｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；および／または
− ＣＴＬＡ４以外の治療関連標的に対する１もしくは複数の結合部分、結合ドメインもしくは結合ユニット（すなわち、ＣＴＬＡ４および他の治療関連標的、例えばＣＴＬＡ４の異なるエピトープ、ＰＤ１、ＣＤ２７、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＩＬＴ１、ＩＬＴ２ ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＬＴ６、ＩＬＴ７、ＩＬＴ８、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＴＳＬＰなどの両方について二重特異性である本発明のＣＴＬＡ４結合性物質を提供するためのもの）；および／または
− 半減期の増加を与える１もしくは複数の結合ドメインまたは結合ユニット（例えば、血清タンパク質、例えば血清アルブミンなどに対して結合することができる結合ドメインまたは結合ユニット）；および／または
− ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）を所望の細胞、組織もしくは器官（例えばがん細胞など）に標的化する１もしくは複数の結合部分、結合ドメインもしくは結合ユニット；および／または
− ＣＴＬＡ４に対する特異性の向上を提供する１もしくは複数の結合部分、結合ドメインもしくは結合ユニット（通常、これらはＣＴＬＡ４に結合することが可能だが、一般にそれら自体は本質的にＣＴＬＡ４に対して機能的ではない）；および／または
− ＣＴＬＡ４結合性物質が（所望の）細胞内に内部移行することを可能にする結合部分、結合ドメイン、結合ユニットもしくは他の化学物質（例えばＷＯ２００５／０４４８５８中に記載される内部移行性の抗ＥＧＦＲナノボディ）；および／または
− 半減期を改良する部分、例えば好適なポリエチレングリコール基（すなわち、ＰＥＧ化）など、もしくは半減期の増加を与えるアミノ酸配列、例えばヒト血清アルブミンなど、もしくは好適なその断片（すなわち、アルブミン融合物）、もしくは例えばＷＯ２００８／０６８２８０中に記載される血清アルブミン結合ペプチド；および／または
− ペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）、例えば細胞傷害性ペイロードなど；および／または
− 検出可能な標識もしくはタグ、例えば放射性標識もしくは蛍光標識など；および／または
− ＣＴＬＡ４結合性物質の固定化、検出および／または精製に役立つことができるタグ、例えばＨＩＳもしくはＦＬＡＧ３タグなど；および／または
− 機能付与することができるタグ、例えばＣ末端のＧＧＣもしくはＧＧＧＣタグなど；および／または
− Ｃ末端伸長Ｘ（ｎ）、これは本発明のＣＴＬＡ４結合性物質について本明細書中にさらに記載されるとおりであり得て、および／またはＷＯ２０１２／１７５７４１もしくはＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５中に記載されるとおりであり得る。

【0136】

（好ましくはヒトの）慣用的抗体（例えばＦｃ部分またはその機能的断片または１もしくは複数の定常ドメインなど）の、および／またはラクダ科動物の重鎖のみの抗体（例えば１または複数の定常ドメインなど）からの１または複数の部分または断片も含有するＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、本発明の一部である。

【0137】

多重特異性結合性物質
本発明は、ＣＴＬＡ４にも別のポリペプチドにも結合する単一の多価（例えば多重特異性）分子に融合され得るＣＴＬＡ４結合性物質を包含し、本発明のある実施形態において、かかる結合性物質は、対象の体内での結合性物質の半減期を増加させる１または複数の半減期エクステンダーに連結されている（例えば配列番号６２または６４に示されるアミノ酸配列を含む）。本発明のある実施形態において、半減期エクステンダーは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に特異的に結合するＩＳＶＤ（例えばナノボディ）、例えばＡＬＢ１１００２である。本発明のある実施形態において、多重特異性結合性物質は、本明細書中に記載されるＦ０２３７００９１２またはＦ０２３７００９１４である。

【0138】

ポリペプチドは、直接的に、リンカーなしで、またはリンカー、例えばペプチドリンカーなど、例えば３５ＧＳを介して別の分子と「融合」され得る。

【0139】

多重特異性結合性物質は、ＣＴＬＡ４結合性物質、並びに付加的な抗原、例えばＣＤ２７、ＰＤ１、：ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＩＬＴ１、ＩＬＴ２ ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＬＴ６、ＩＬＴ７、ＩＬＴ８、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７またはＴＳＬＰなどに結合する１または複数の結合性物質を包含し得る。

【0140】

かかるＩＳＶＤを基にしたまたはナノボディを基にした生物学的物質についてのいくつかの具体的であるが限定されない例は、Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．による様々な出願、例えば限定されないが、ＷＯ２００４／０６２５５１、ＷＯ２００６／１２２８２５、ＷＯ２００８／０２００７９およびＷＯ２００９／０６８６２７、並びに、例えば限定されないが、例えばＷＯ２００６／０３８０２７、ＷＯ２００６／０５９１０８、ＷＯ２００７／０６３３０８、ＷＯ２００７／０６３３１１、ＷＯ２００７／０６６０１６およびＷＯ２００７／０８５８１４などの出願が参照される。また、本明細書中にさらに記載されるように、上で言及される出願に示される分子の一部であり得るさらなる部分は、（ヒト）血清タンパク質、例えば（ヒト）血清アルブミンなどに対する本明細書中に記載されるＩＳＶＤまたはナノボディであり得て、かかるＩＳＶＤまたはナノボディ（例えばＡＬＢ１１００２）は、治療的使用、とりわけ、その使用および／または本明細書中に記載されるＣＴＬＡ４結合性物質（およびこれを含むポリペプチド）の半減期の延長のための治療的使用も見出し得る。例えばＷＯ２００４／０４１８６５、ＷＯ２００６／１２２７８７およびＷＯ２０１２／１７５４００への参照がなされ、これらは一般に半減期延長のための血清−アルブミン結合ナノボディの使用を記載している。ＷＯ２００９／１３８５１９（またはＷＯ２００９／１３８５１９中で引用される従来技術中のもの）またはＷＯ２００８／０２００７９（またはＷＯ２００８／０２００７９中で引用される従来技術中のもの）は、参照により組み込まれる。また、方法または技術が本明細書中で具体的に記載されていない場合、本発明のある実施形態において、ＷＯ２００９／１３８５１９中に（またはＷＯ２００９／１３８５１９中で引用される従来技術中に）またはＷＯ２００８／０２００７９中に（またはＷＯ２００８／０２００７９中で引用される従来技術中に）記載されるように実施することができる。

【0141】

ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が１または複数のさらなる結合部分、結合ドメインまたは結合ユニット（例えば、ＣＴＬＡ４に対する特異性の向上を与えるＣＴＬＡ４に対するさらなる本質的な非機能的結合ドメインもしくは結合ユニット、ＣＴＬＡ４以外の治療標的に対する結合部分、結合ドメインもしくは結合ユニット、半減期の増加を与える、例えばヒト血清アルブミンなどの標的に対する結合部分、結合ドメインもしくは結合ユニット、および／またはＣＴＬＡ４結合性物質を特異的な細胞、組織もしくは器官に標的化するおよび／またはＣＴＬＡ４結合性物質が細胞内に内部移行することを可能にする結合部分、結合ドメインもしくは結合ユニット）を含有するとき、これらの他の結合部分、結合ドメインまたは結合ユニットは、好ましくは１または複数のＩＳＶＤを含み、より好ましくは全てＩＳＶＤである。例えば、限定されることなく、これらの１または複数のさらなる結合ドメインまたは結合ユニットは、１または複数のナノボディ（ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨおよび／またはラクダ化ＶＨ、例えばラクダ化ヒトＶＨなどを包含するもの）、ＶＨドメインであるもしくはＶＨドメインに由来する（単一ドメイン）抗体、ＶＨドメインであるもしくはＶＨドメインから本質的になるもしくはＶＨドメインに由来するｄＡｂ、またはさらにはＶＬドメインであるか、もしくはＶＬドメインから本質的になる（単一）ドメイン抗体もしくはｄＡｂであることができる。とりわけ、これらの１または複数の結合ドメインまたは結合ユニットは、存在するとき、１または複数のナノボディを含み得て、よりとりわけには全てナノボディである。

【0142】

本発明のＣＴＬＡ４結合性物質がそのＣ末端にＩＳＶＤ（このＣ末端ＩＳＶＤは、本明細書中に記載されるＣＴＬＡ４結合部分であり得て、または例えばＣＴＬＡ４結合性物質中に存在する場合、ＣＴＬＡ４に対する特異性の向上を与えるＣＴＬＡ４に対するさらなる本質的な非機能的ＩＳＶＤ、ＣＴＬＡ４以外の治療標的に対するＩＳＶＤ、半減期の増加を与える、例えばヒト血清アルブミンなどの標的に対するＩＳＶＤ、またはＣＴＬＡ４結合性物質を特異的な細胞、組織もしくは器官に標的化するおよび／またはＣＴＬＡ４結合性物質が細胞内に内部移行することを可能にするＩＳＶＤであり得る）を持つとき、ＣＴＬＡ４結合部分（すなわち、前記Ｃ末端ＩＳＶＤ）は、好ましくはＣ末端伸長Ｘ（ｎ）を持ち、このＣ末端伸長は本発明のＣＴＬＡ４結合性物質について本明細書中に記載されるとおりであり得て、および／またはＷＯ２０１２／１７５７４１もしくはＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に記載されるとおりであり得る。

【0143】

ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が、本明細書中に記載される１または複数のＣＴＬＡ４結合部分に加えて、任意のさらなるＩＳＶＤ（この１または複数のさらなるＩＳＶＤは、言及されているように、ＣＴＬＡ４に対する特異性の向上を与えるＣＴＬＡ４に対するさらなる本質的な非機能的ＩＳＶＤ、ＣＴＬＡ４以外の治療標的に対するＩＳＶＤ、半減期の増加を与える、例えばヒト血清アルブミンなどの標的に対するＩＳＶＤ、および／またはＣＴＬＡ４結合性物質を特異的な細胞、組織もしくは器官に標的化するおよび／またはＣＴＬＡ４結合性物質が細胞内に内部移行することを可能にするＩＳＶＤであり得る）を含有するとき、およびかかるさらなるＩＳＶＤが、ナノボディであるか、または、ＶＨ配列であるかＶＨ配列から本質的になるかおよび／またはＶＨ配列に由来するＩＳＶＤである場合、本発明の好ましい態様によると、ＣＴＬＡ４結合性物質中に存在する前記１または複数の（好ましくは全ての）さらなるＩＳＶＤは、それらの配列内に、先在抗体による結合を低減させる１または複数のフレームワーク変異を含有する。とりわけ、本発明のこの態様によると、かかるさらなるＩＳＶＤは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に記載されるとおりであるか、および／または本質的に本発明のＣＴＬＡ４結合性物質について本明細書中に記載されるとおりである１１位、８９位、１１０位および／または１１２位におけるアミノ酸残基／変異（の好適な組み合わせ）を含有し得る。１つの具体的態様において、ＣＴＬＡ４結合性物質がそのＣ末端においてかかるＩＳＶＤを持つ（すなわち、そのＣ末端において本発明のＣＴＬＡ４結合部分を持たない）とき、少なくともＣ末端に存在するおよび／またはこれを形成する前記ＩＳＶＤは、先在抗体による結合を低減させるかかるフレームワーク変異を持つ（および前記Ｃ末端ＩＳＶＤは、好ましくはまた本明細書中に記載されるＣ末端伸長Ｘ（ｎ）も持つ）。

【0144】

言及されているように、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が（すなわち、本発明の一価のＣＴＬＡ４結合性物質と比べて）半減期が増加したものであるとき、ＣＴＬＡ４結合性物質は、好ましくは、かかる半減期の増加を与える少なくとも１つの（例えば１つなどの）ＩＳＶＤ（とりわけナノボディ）を含有する。かかるＩＳＶＤは、通常、好適な血清タンパク質、例えばトランスフェリンなどに対するものであり、とりわけ（ヒト）血清アルブミンに対するものである。とりわけ、かかるＩＳＶＤまたはナノボディは、例えばＥＰ２１３９９１８、ＷＯ２０１１／００６９１５、ＷＯ２０１２／１７５４００、ＷＯ２０１４／１１１５５０中に記載されるヒト血清アルブミンに対する（単一）ドメイン抗体またはｄＡｂであり得て、とりわけＷＯ２００４／０４１８６５、ＷＯ２００６／１２２７８７、ＷＯ２０１２／１７５４００またはＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に記載される血清アルブミン結合ナノボディであり得る。とりわけ好ましい血清アルブミン結合ＩＳＶＤは、ナノボディＡｌｂ−１（ＷＯ２００６／１２２７８７を参照されたい）またはそのヒト化バリアント、例えばＡｌｂ−８（ＷＯ２００６／１２２７８７、配列番号６２）、Ａｌｂ−２３（ＷＯ２０１２／１７５４００、配列番号１）など、ならびに他のヒト化された（好ましくは配列最適化もされた）Ａｌｂ−１のバリアントおよび／またはＡｌｂ−８もしくはＡｌｂ−２３のバリアント（またはより一般には、Ａｌｂ−１、Ａｌｂ−８およびＡｌｂ−２３と本質的に同じＣＤＲを持つＩＳＶＤ）である。

【0145】

本発明のある実施形態において、ＩＳＶＤ（例えばナノボディ）は、ヒト血清アルブミンに結合するＡＬＢ１１００２である。ＡＬＢ１１００２は下の表Ｃ中にまとめられる。

【0146】

本発明は、本発明のＨＳＡ結合性物質であって、例えば、ＡＬＢ１１００２中にまたは配列番号６６の配列を含む結合性物質中に存在するものと同じＣＤＲの組み合わせ（すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を持つＨＳＡ結合性物質を含むＣＴＬＡ４結合性物質を包含する。表Ｃを参照されたい。

【0147】

表Ｃ．ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合性物質ＡＬＢ１１００２

【表10】

【0148】

ＡＬＢ１１００２はＣ末端アラニンを欠いていてもよい。本発明のある実施形態において、ＨＳＡ結合性物質は配列番号６６のアミノ酸配列を含むが１位、１位、８９位、１１０位または１１２位における変異（ｍｕｔａｔｏｉｎ）を包含し、例えば本明細書中で表Ｃに示される変異セットを含む。

【0149】

配列番号６６の残基１は、ＤまたはＥであることができる。残基１がＤである場合、ＨＳＡ結合性物質は１Ｄとして指定され得て、残基１がＥである場合、ＨＳＡ結合性物質は１Ｅとして指定され得る。

【0150】

本発明は、ＨＳＡ結合性物質のＣＤＲのうちの１つ、２つまたは３つを含むＨＳＡ結合性物質を包含し、ここで各々のＣＤＲは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換、例えば保存的置換を含み、および／または表Ｃに示されるＨＳＡ結合性物質配列中にあるもしくは配列番号６７−６９に示されるＣＤＲに対して１００、９９、９８、９７、９６もしくは９５％の配列同一性を含み、ここでかかるＣＤＲを持つＨＳＡ結合性物質はＨＳＡに結合する能力を保持している。

【0151】

本発明のある実施形態において、半減期エクステンダーは、抗ＨＳＡ ＩＳＶＤ（例えばナノボディ）であって、
− アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＦＧＭＳ（配列番号６７）を含むＣＤＲ１；および
− アミノ酸配列ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬ（配列番号６８）を含むＣＤＲ２；および
− アミノ酸配列ＧＧＳＬＳＲ（配列番号６９）を含むＣＤＲ３；
を含み、そして、
− 配列番号６６のアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一度（ここで存在し得る任意のＣ末端伸長、並びにＣＤＲは、配列同一度を決定するために考慮されない）（ここでＣＤＲ、存在し得る任意のＣ末端伸長、並びに関連する具体的態様により必要とされる１位、１１位、８９位、１１０位および／または１１２位における変異は、配列同一度を決定するために考慮されない）；
および／または
− 配列番号６６のアミノ酸配列との７未満、例えば５未満など、好ましくは３未満、例えば３つ、２つもしくは１つだけの「アミノ酸の相違」（本明細書中に定義されているとおりであり、上で挙げた存在し得る１位、１１位、８９位、１１０位および／または１１２位における変異のいずれも考慮されず、存在し得るいずれのＣ末端伸長も考慮されない）（ここで前記アミノ酸の相違は、存在する場合はフレームワークおよび／またはＣＤＲの中に存在し得るが、好ましくはフレームワーク中にのみ存在し、ＣＤＲ中に存在しない）
を持ってもよく、
そして
− Ｃ末端伸長（Ｘ）_ｎを持ってもよく、ここでｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１など）であり；各々のＸは、独立して選ばれ、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）よりなる群から独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基である。

【0152】

やはり、言及されているように、かかる血清アルブミン結合ＩＳＶＤは、存在するとき、その配列内に先在抗体による結合を低減させる１または複数のフレームワーク変異を含有し得る。とりわけ、かかる血清アルブミン結合ＩＳＶＤがＶＨドメインであるか、本質的にこれからなるおよび／またはこれに由来するナノボディまたは（単一）ドメイン抗体であるとき、血清アルブミン結合ＩＳＶＤは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に記載されるとおりであるかおよび／または本質的に本発明のＣＴＬＡ４結合性物質について本明細書中に記載されるとおりである１１位、８９位、１１０位および／または１１２位におけるアミノ酸残基／変異（の好適な組み合わせ）を含有し得る。例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）は、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質中で用いることができる、先在抗体による結合を低減させる１１位、８９位、１１０位および／または１１２位におけるアミノ酸残基／変異を含有するＡｌｂ−１、Ａｌｂ−８およびＡｌｂ−２３の多数のバリアントを記載している。

【0153】

やはり、かかる血清アルブミン結合ＩＳＶＤが本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）のＣ末端に存在するとき、血清アルブミン結合ＩＳＶＤ（および結果として本発明のＣＴＬＡ４結合性物質）は、好ましくはＣ末端伸長Ｘ（ｎ）を持ち、このＣ末端伸長は本発明のＣＴＬＡ４結合性物質について本明細書中に記載されるとおりであり得、および／またはＷＯ２０１２／１７５７４１もしくはＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に記載されるとおりであり得る。これはまた好ましくは、先在抗体の結合を低減させる変異を、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に記載される１１位、８９位、１１０位および／または１１２位におけるアミノ酸残基／変異（の好適な組み合わせ）などを持つ。

【0154】

しかしながら、言及されているように、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質の半減期を増加させる他の手段（例えばＰＥＧ化、ヒトアルブミンもしくは好適なその断片との融合、または好適な血清アルブミン結合ペプチドの使用など）もまた、本発明の範囲の中に包含される。

【0155】

一般に、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が、増加した半減期（例えば半減期増加性ＩＳＶＤの存在または半減期を増加させる任意の他の好適な方法を介して）を有するとき、得られるＣＴＬＡ４結合性物質は、好ましくは、本発明の一価のＣＴＬＡ４結合性物質の半減期よりも少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍または２０倍よりも長い半減期（本明細書中に定義されるもの）を持つ（ヒトおよび／または好適な動物モデル、例えばマウスまたはカニクイザルなどのいずれかにおいて測定されるように）。とりわけ、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質は、好ましくは、ヒト対象において少なくとも１日、好ましくは少なくとも３日、より好ましくは少なくとも７日、例えば少なくとも１０日などの半減期（本明細書中に定義されるもの）を持つ。

【0156】

本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えば１または複数のＩＳＶＤ、例えばナノボディなどに基づくもの）は異なる「型」を持つことができ、すなわち、本質的に一価、二価または三価であることができ、単一特異性、二重特異性、三重特異性などであることができ、二重パラトピック（本明細書中に定義されるおよび例えばＷＯ２００９／０６８６２５中で定義されるもの）であることができることは本明細書中の開示から明らかである。例えば、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質は：
− （本質的に）一価であること、すなわち、（本質的に）本発明の単一のＣＴＬＡ４結合部分を含むことができる。言及されているように、一価の型で用いられるとき、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質は、好ましくは、本明細書中にさらに記載されるＣ末端伸長Ｘ（ｎ）を持つ。本発明のかかるＣＴＬＡ４結合性物質はまた、半減期が延長されたものであり得る；
− （本質的に）二価または三価であって単一特異性であることができる。本発明のかかるＣＴＬＡ４結合性物質はＣＴＬＡ４に対する２つまたはそれより多い結合部分（例えばＩＳＶＤ）を含み、これらの結合部分は同じであっても異なってもよいが、異なるときはＣＴＬＡ４上の同じエピトープに対するものであってもＣＴＬＡ４上の異なるエピトープに対するものであってもよい（後者の場合、本発明の二重パラトピックまたは多重パラトピックＣＴＬＡ４結合性物質を提供するために）。本発明のかかるＣＴＬＡ４結合性物質はまた、半減期が延長されたものであり得る；
− （本質的に）二価、三価（または多価）であって二重特異性または三重特異性（または多重特異性）であることができる。本発明のかかるＣＴＬＡ４結合性物質は、ＣＴＬＡ４および少なくとも１つの他の標的に対するものである。本明細書中に記載されるように、前記他の標的は例えば、ＣＴＬＡ４および前記他の治療標的に関して二重特異性であるＣＴＬＡ４結合性物質を提供するために、別の治療関連標的（すなわち、ＣＴＬＡ４以外のもの）、例えば、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡおよび／またはＣＤ２７などであり得る。前記他の標的はまた、半減期が増加した本発明のＣＴＬＡ４結合性物質を提供するために、半減期の増加を与える標的（例えばヒト血清アルブミンなど）であり得る。また本明細書中で言及されるように、かかる他の標的はまた、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質を特異的な細胞、組織もしくは器官に標的化することを可能にし得て、または本発明のＣＴＬＡ４結合性物質が細胞内に内部移行することを可能にし得る。これらのアプローチ／ＩＳＶＤを組み合わせること、例えばＣＴＬＡ４についておよび少なくとも１つの他の治療関連標的について二重特異性であり、半減期が延長された本発明のＣＴＬＡ４結合性物質を提供することもまた可能である。

【0157】

やはり、好ましくは、これらの本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が本発明の少なくとも１つのＣＴＬＡ４結合性物質以外の１または複数の結合部分（例えばＩＳＶＤ）を含有するとき、これらの他のＩＳＶＤのうちの少なくとも１つ、好ましくは、全てはその配列内に先在抗体による結合を低減させる１または複数のフレームワーク変異（例えば、とりわけ、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質について本明細書中に記載されるとおりであるか、および／または一般にＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中に記載されるとおりである１１位、８９位、１１０位および／または１１２位におけるアミノ酸残基／変異の組み合わせなど）を含有する。また、本発明のかかるＣＴＬＡ４結合性物質がそれらのＣ末端においてＣＴＬＡ４結合部分を持つとき、前記Ｃ末端ＣＴＬＡ４結合部分（および結果として本発明のＣＴＬＡ４結合性物質）は、好ましくは、本明細書中に記載されるＣ末端伸長Ｘ（ｎ）を持つ。同様に、本発明のかかるＣＴＬＡ４結合性物質がそれらのＣ末端において別のＩＳＶＤ（すなわち、本発明のＣＴＬＡ４結合部分ではなく、例えば半減期延長性ＩＳＶＤ）を持つとき、前記Ｃ末端ＩＳＶＤ（および結果として本発明のＣＴＬＡ４結合性物質）は、好ましくは、本明細書中に記載されるＣ末端伸長Ｘ（ｎ）を持ち、および／またはその配列内に先在抗体による結合を低減させる１もしくは複数のフレームワーク変異（やはり、本明細書中におよびＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３（ＷＯ２０１５／１７３３２５）中にさらに記載されるとおりであるもの）を含有する。

【0158】

当業者に明らかであるように、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が局所使用（すなわち、皮膚上または眼内）を意図されたとき、または例えば消化管中のどこかで（すなわち、経口投与または坐剤による投与の後に）、もしくは肺中のどこかで（すなわち、吸入による投与の後に）（局所化された）治療作用を持つ予定であるとき、またはそうでなければその意図される作用位置に直接的に（例えば直接的な注射により）適用する予定であるとき、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質は、通常、半減期延長を必要としない。また、ある種の急性の症状または適応症の治療のため、半減期が延長されていないことが好ましいこともある。これらの場合、本発明の一価のＣＴＬＡ４結合性物質または半減期が延長されていない本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（本発明のＣＴＬＡ４結合部分を含むもの）（例えば、ＣＴＬＡ４に関して二価または二重パラトピックである本発明のＣＴＬＡ４結合性物質）の使用が好ましい。

【0159】

本発明のかかるＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）のいくつかの好ましいが限定されない例は下の表Ｃ−１中に模式的に表され、これらの各々は本発明のさらなる態様を形成する。半減期が延長されていない本発明の好適なＣＴＬＡ４結合性物質の他の例は、本明細書中の開示に基づいて当業者に明らかである。

【0160】

表Ｃ−１．半減期延長性ＩＳＶＤを有さない本発明のいくつかのＣＴＬＡ４結合性物質の略図

【表11】

【0161】

当業者に明らかであるように、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が全身投与、および／または、慢性疾患もしくは障害の予防および／または治療を意図されたとき、通常、本発明の前記ＣＴＬＡ４結合性物質は増加した半減期（本明細書中に定義されるもの）を有することが好ましい。より好ましくは、本発明のかかるＣＴＬＡ４結合性物質は、半減期延長性ＩＳＶＤ、例えば好ましくはＩＳＶＤ、とりわけヒト血清アルブミンに結合するナノボディ（本明細書中に記載されるもの）を含有する。

【0162】

本発明のかかるＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）のいくつかの好ましいが限定されない例は下の表Ｃ−２中に模式的に表され、これらの各々は本発明のさらなる態様を形成する。半減期が延長された本発明の好適なＣＴＬＡ４結合性物質の他の例は、本明細書中の開示に基づいて当業者に明らかである。一般に、半減期が延長された本発明のＣＴＬＡ４結合性物質については、Ｃ末端伸長の存在が大いに好ましい。

【0163】

表Ｃ−２．半減期延長性ＩＳＶＤを有する本発明のいくつかのＣＴＬＡ４結合性物質の略図

【表12】

【0164】

本発明はまた、アミノ酸配列：

【表13】

【0165】

（配列番号６２；３５ＧＳリンカーは点線の下線；ＣＤＲは下線および／または太字）を含むＣＴＬＡ４ ＩＳＶＤであるＦ０２３７００９１２を提供する。この分子中の任意の結合性物質部分の最初の残基は、適宜、ＤまたはＥで置換されてもよい。

【0166】

ＣＴＬＡ４ ＩＳＶＤは、シグナルペプチド、例えば：

【表14】

【0167】

（配列番号７０）などを含んでもよい。

【0168】

Ｆ０２３７００９１２は、次のヌクレオチド：

【表15】

【0169】

（配列番号６１；ヌクレオチド１−２５５のシグナル配列を欠失してもよい）を含むポリヌクレオチドによりコードすることができる。

【0170】

Ｆ０２３７００９１２は、次の部分：
・ＣＴＬＡ４結合性物質１１Ｆ０１（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｑ４５Ｒ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ，Ｍ９６Ｐ，Ｑ１０８Ｌ）
・３５ＧＳリンカー
・ＣＴＬＡ４結合性物質１１Ｆ０１（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｑ４５Ｒ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ，Ｍ９６Ｐ，Ｑ１０８Ｌ）
・３５ＧＳリンカー
・ヒト血清アルブミン結合性物質ＡＬＢ１１００２；
・Ｃ末端伸長アラニン
例えば：
・ＣＴＬＡ４結合性物質 配列番号６０
・３５ＧＳリンカー 配列番号６５
・ＣＴＬＡ４結合性物質 配列番号６０（Ｄ１Ｅ）
・３５ＧＳリンカー 配列番号６５
・ヒト血清アルブミン結合性物質 配列番号６６
・アラニン
を含む（本発明は、かかる部分配列を包含する任意の結合性物質を包含する）。

【0171】

本発明はまた、アミノ酸配列：

【表16】

【0172】

（配列番号６４；３５ＧＳリンカーは点線の下線；ＣＤＲは下線および／または太字）を含むＣＴＬＡ４ ＩＳＶＤであるＦ０２３７００９１４を提供する。この分子中の任意の結合性物質部分の最初の残基は、適宜、ＤまたはＥで置換されてもよい。

【0173】

ＣＴＬＡ４ ＩＳＶＤは、シグナルペプチド、例えば：

【表17】

【0174】

（配列番号７０）などを含んでもよい。

【0175】

Ｆ０２３７００９１４は、次のヌクレオチド：

【表18】

【0176】

（配列番号６３；ヌクレオチド１−２５５のシグナル配列を欠失してもよい）を含むポリヌクレオチドによりコードされ得る。

【0177】

Ｆ０２３７００９１２は、次の部分：
・ＣＴＬＡ４結合性物質１１Ｆ０１（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｑ４５Ｒ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ，Ｍ９６Ｐ，Ｑ１０８Ｌ）；
・３５ＧＳリンカー；
・ヒト血清アルブミン結合性物質ＡＬＢ１１００２；
・Ｃ末端伸長アラニン、を含む。

【0178】

例えば：
・ＣＴＬＡ４結合性物質 配列番号６０
・３５ＧＳリンカー 配列番号６５
・ヒト血清アルブミン結合性物質 配列番号６６
・アラニン
である（本発明は、かかる部分配列を包含する任意の結合性物質を包含する）。

【0179】

本発明は、配列番号６２もしくは６４のアミノ酸配列、または、８０％もしくはそれより高い（例えば８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の）アミノ酸配列同一性を含むアミノ酸配列を含む任意の多重特異性ＣＴＬＡ４結合性物質を包含し、ここでＣＴＬＡ４結合性物質は、ＣＴＬＡ４に、および任意にＨＳＡに結合する能力を保持している。

【0180】

エピトープ結合および交差遮断
本発明は、本明細書に示されるＣＴＬＡ４結合性物質（例えばＦ０２３７００９１２またはＦ０２３７００９１４）を、並びに、例えばかかる結合性物質の同じＣＴＬＡ４エピトープに結合するＣＴＬＡ４ ＩＳＶＤ（例えばナノボディ）を含む結合性物質を提供する。例えば、本発明は、Ｆ０２３７００９１２またはＦ０２３７００９１４と同じ残基に接触することによりヒトＣＴＬＡ４に結合する結合性物質を包含する。例えば、本発明は、ヒトＣＴＬＡ４の残基ＶＲＶＴＶＬ（配列番号１１０の残基３３−３８）、ＡＤＳＱＶＴＥＶＣ（配列番号１１０の残基４１−４９）、および／またはＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧ（配列番号１１０の残基９３−１０６）、例えば３つ全ての部位においてヒトＣＴＬＡ４に結合する結合性物質を提供する。本発明のある実施形態において、結合性物質はヒトＣＴＬＡ４のこれらの残基における結合を水素−重水素交換アッセイにおいて実証しており、例えば、図１３に本質的に示される結合ヒートマップにより表されるように、重水素、例えばＤ_２Ｏなどの存在下での水素の重水素への交換から残基を保護する。

【0181】

本発明は、ペプチド配列ＶＲＶＴＶＬ（配列番号１１０の残基３３−３８）、ＡＤＳＱＶＴＥＶＣ（配列番号１１０の残基４１−４９）、および／またはＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧ（配列番号１１０の残基９３−１０６）を含むポリペプチド、例えばＣＴＬＡ４に結合するＣＴＬＡ４結合性物質（例えばＦ０２３７００９１２もしくはＦ０２３７００９１４または１１Ｆ０１もしくは本明細書中に示されるそのバリアントのうちのいずれか）を包含する。ポリペプチドは、細胞、例えばＴ細胞の表面上にあってもよく、ポリペプチドはＣＴＬＡ４結合性物質と結合する。

【0182】

本発明はまた、本明細書中に開示される結合性物質のいずれかの結合を交差遮断することが可能な交差遮断結合性物質（例えばＦ０２３７００９１２またはＦ０２３７００９１４）を提供する。かかる交差遮断結合性物質は、かかる交差遮断を呈する任意の分子、例えばＩＳＶＤ、ナノボディ、抗体またはその抗原結合断片であり得る。

【0183】

一般的に、参照結合性物質を「交差遮断」する結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）または抗体もしくはその抗原結合断片は、競合アッセイにおいて参照結合性物質のその抗原への結合を５０％またはそれより多く遮断する結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）または抗体もしくはその抗原結合断片をいい、逆に、参照結合性物質は競合アッセイにおいて結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）または抗体もしくはその抗原結合断片のその抗原への結合を５０％またはそれより多く遮断する。交差遮断は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーといった当該技術分野で知られている任意のアッセイで決定することができる。

【0184】

本発明のある実施形態において、交差遮断はＢｉａｃｏｒｅアッセイの使用により決定される。便宜上、２つの結合性物質への参照がなされるが、本発明の範囲は、本発明の結合性物質を交差遮断する抗体およびその抗原結合断片、例えばＦａｂ断片を包含する。Ｂｉａｃｏｒｅ装置（例えばＢｉａｃｏｒｅ ３０００）は、製造業者の推奨に沿って操作される。

【0185】

それゆえに、１つの交差遮断アッセイにおいて、ＣＴＬＡ４は、標準的なアミンカップリング化学を用いてＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅチップにカップリングされることで、ＣＴＬＡ４がコーティングされた表面を生成する。例えば、ＣＴＬＡ４の２００−８００共鳴単位がチップにカップリングされる（または容易に測定可能な結合レベルを与えるが用いられる試験試薬の濃度により容易に飽和可能である任意の量）。

【0186】

互いに交差遮断するそれらの能力が判定される２つの結合性物質（Ａ^＊およびＢ^＊と名付ける）を好適なバッファー中で１：１の結合部分のモル比で混合することで、試験混合物を作る。

【0187】

試験ミックス中の各々の結合性物質濃度は、Ｂｉａｃｏｒｅチップ上に捕捉されたＣＴＬＡ４分子上のその結合性物質に対する結合部位を容易に飽和するのに十分に高いものであるべきである。混合物中の結合性物質は同じモル濃度である。

【0188】

結合性物質Ａ^＊を単独で、および結合性物質Ｂ^＊を単独で含有する別々の溶液も調製する。これらの溶液中の結合性物質Ａ^＊および結合性物質Ｂ^＊は、試験ミックスと同じバッファー中で、同じ濃度であるべきである。

【0189】

試験混合物を、ＣＴＬＡ４がコーティングされたＢｉａｃｏｒｅチップ上を通過させ、総結合量を記録する。チップを次いで、チップに結合したＣＴＬＡ４を損なわずに結合した結合性物質を除去するように処理する。本発明のある実施形態において、これは、チップを３０ｍＭ ＨＣｌで６０秒間処理することによりなされる。

【0190】

結合性物質Ａ^＊の溶液を単独で、次いでＣＴＬＡ４がコーティングされた表面上を通過させ、結合量を記録する。チップを再度、チップに結合したＣＴＬＡ４を損なわずに結合した結合性物質の全てを除去するように処理する。

【0191】

結合性物質Ｂ^＊の溶液を単独で、次いでＣＴＬＡ４がコーティングされた表面上を通過させ、結合量を記録する。

【0192】

結合性物質Ａ^＊および結合性物質Ｂ^＊の混合物の最大理論的結合を次に算出し、これはＣＴＬＡ４表面上を単独で通過したときの各々の結合性物質の結合の合計である。実際に記録された混合物の結合がこの理論的最大値より小さい場合、２つの結合性物質は互いに交差遮断する。

【0193】

それゆえに、一般的に、本発明による交差遮断結合性物質は、上のＢｉａｃｏｒｅ交差遮断アッセイにおいて、アッセイの際に第二の結合性物質の存在下で記録される結合が、例えば組み合わせた２つの結合性物質の最大理論的結合の８０％から０．１％の間（例えば８０％から４％）、例えば最大理論的結合の７５％から０．１％の間（例えば７５％から４％）、例えば最大理論的結合（ちょうど上で定義されているもの）の７０％から０．１％の間（例えば７０％から４％）になるように、ＣＴＬＡ４に結合するものである。

【0194】

本発明のある実施形態において、本発明によってＣＴＬＡ４結合性物質が交差遮断するか、または交差遮断の能力があるかを決定するため、ＥＬＩＳＡアッセイが用いられる。

【0195】

アッセイの一般原則は、ＣＴＬＡ４結合性物質をＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコーティングすることである。過剰量の第二の潜在的に交差遮断性のＣＴＬＡ４結合性物質を溶液中に加える（すなわち、ＥＬＩＳＡプレートに結合していない）。限定的な量のＣＴＬＡ４を次いでウェルに加える。コーティングされた結合性物質と溶液中の結合性物質は限定的な量のＣＴＬＡ４分子の結合を競合する。プレートを洗浄して、コーティングされた結合性物質によって結合していないＣＴＬＡ４を除去し、また第二の溶液相の結合性物質、並びに第二の溶液相の結合性物質とＣＴＬＡ４との間に形成された何らかの複合体をも除去する。結合したＣＴＬＡ４の量を次いで適切なＣＴＬＡ４検出試薬を用いて測定する。コーティングされた結合性物質を交差遮断することが可能な溶液中の結合性物質は、コーティングされた結合性物質が第二の溶液相の結合性物質の非存在下で結合することができるＣＴＬＡ４分子の数に対する、コーティングされた結合性物質が結合することができるＣＴＬＡ４分子の数の減少を引き起こすことが可能である。

【0196】

発現方法
本発明は、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００９１２またはＦ０２３７００９１４）を作成する組換え方法であって、（ｉ）前記ＣＴＬＡ４結合性物質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを導入すること、例えばここで前記ポリヌクレオチドはベクター中にあり、および／またはプロモーターに作動可能に連結されており；（ｉｉ）宿主細胞（例えばＣＨＯまたはピキアまたはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））を前記ポリヌクレオチドの発現に好都合な条件下で培養することを含み、そして（ｉｉｉ）前記宿主細胞および／または宿主細胞が増殖した培地からＣＴＬＡ４結合性物質を単離することを含んでもよい方法を包含する。例えば、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ２００６／１２２７８６、ＷＯ２００８／０２００７９、ＷＯ２００８／１４２１６４またはＷＯ２００９／０６８６２７を参照されたい。

【0197】

本発明はまた、本明細書中に記載される本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）（例えばＦ０２３７００９１２またはＦ０２３７００９１４）をコードするポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドは、本発明のある実施形態において、１または複数の制御配列に作動可能に連結され得る。ポリヌクレオチドは、プラスミドまたはベクターの形態であり得る。やはり、かかるポリヌクレオチドは、一般に、Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の公開された特許出願中に、例えばＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ２００６／１２２７８６、ＷＯ２００８／０２００７９、ＷＯ２００８／１４２１６４またはＷＯ２００９／０６８６２７などの中に記載されるとおりのものであることができる。

【0198】

本発明はまた、かかるポリヌクレオチド、ベクターおよび／または本明細書中に記載されるＣＴＬＡ４結合性物質（例えばＦ０２３７００９１２またはＦ０２３７００９１４）を含有する宿主または宿主細胞に関する。やはり、かかる宿主細胞は、一般に、Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の公開された特許出願中に、例えばＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ２００６／１２２７８６、ＷＯ２００８／０２００７９、ＷＯ２００８／１４２１６４またはＷＯ２００９／０６８６２７などの中に記載されるとおりのものであることができる。具体的な宿主細胞の例は、下で論じられる。

【0199】

ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）の発現のための哺乳動物細胞を包含する宿主としての真核生物および原核生物の宿主細胞は、当該技術分野で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。これらとしては、なかでも、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、Ｈｅｌａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞および多数の他の細胞株が挙げられる。哺乳動物宿主細胞としては、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスターの細胞が挙げられる。とりわけ好ましい細胞株は、どの細胞株の発現レベルが高いかを決定することを通じて選択される。用いられ得る他の細胞株は昆虫細胞株（例えばスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）またはトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ））、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞および真菌細胞である。真菌細胞としては酵母および糸状真菌細胞が挙げられ、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・ミヌータ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌータ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピキア・オプンティアエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピキア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピキア・ピペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クリベロマイセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）が挙げられる。ピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、任意のサッカロマイセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、任意のクリベロマイセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、任意のアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、任意のフザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）。本発明は、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばＦ０２３７００９１２またはＦ０２３７００９１４）を含有する、またはかかる結合性物質をコードするポリヌクレオチドを含有する若しくはかかるポリヌクレオチドを含有するベクターを含有する、任意の宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞またはピキア細胞、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））を包含する。

【0200】

さらに、産生細胞株からのＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）の発現は、多数の公知の技術を用いて増大させることができる。例えばグルタミン合成酵素遺伝子発現系（ＧＳ系）はある条件下で発現を増大させるための通例のアプローチである。ＧＳ系は、欧州特許第０２１６８４６号、第０２５６０５５号および第０３２３９９７ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号との関連で全体的にまたは一部が論じられている。それゆえに、本発明のある実施形態において、哺乳動物宿主細胞（例えばＣＨＯ）はグルタミン合成酵素遺伝子を欠損しており培地中でグルタミン酸の非存在下で増殖するが、免疫グロブリン鎖をコードするポリヌクレオチドはグルタミン合成酵素遺伝子を含み、これは宿主細胞中の遺伝子欠損を補う。本明細書中で論じられる結合性物質またはポリヌクレオチドまたはベクターを含有するかかる宿主細胞、並びに本明細書中で論じられるかかる宿主細胞を用いて結合性物質を作成する発現方法は、本発明の一部である。

【0201】

本発明は、ＣＴＬＡ４結合性物質を含む試料（例えば培養培地、細胞溶解液または細胞溶解液フラクション、例えば溶解液の可溶性フラクション）を精製媒体（例えばカチオン交換媒体、アニオン交換媒体、疎水性交換媒体、アフィニティー精製媒体（例えばプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ））に導入すること、および、媒体に結合しない前記試料のフロースルーフラクションから精製されたＣＴＬＡ４結合性物質を回収すること；またはフロースルーフラクションを捨て、結合したＣＴＬＡ４結合性物質を媒体から溶出させて溶出物を回収することのいずれかを含む、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）を精製する方法を包含する。本発明のある実施形態において、媒体は試料が付されるカラムの中にある。本発明のある実施形態において、宿主細胞中での抗体または断片の組換え発現の後に精製方法が行われ、例えばここでは宿主細胞が最初に溶解され、そして溶解液は媒体上での精製の前に不溶性材料から精製されてもよく；またはここではＣＴＬＡ４結合性物質が宿主細胞により培養培地中に分泌され、培地もしくはそのフラクションが精製媒体に付される。

【0202】

一般的に、特定の細胞株または遺伝子導入動物中で生産される糖タンパク質は、その細胞株または遺伝子導入動物中で生産される糖タンパク質に特徴的なグリコシル化パターンを持つ。それゆえ、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）の特定のグリコシル化パターンは、ＣＴＬＡ４結合性物質の生産のために用いられるその特定の細胞株または遺伝子導入動物に依存したものとなる。非フコシル化Ｎ−グリカンのみを含むＣＴＬＡ４結合性物質は本発明の一部であり、非フコシル化抗体は典型的にインビトロおよびインビボの両方でそのフコシル化された対応物よりも強力な有効性を呈することが示されていることから、有利であり得る（例えばＳｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７８：３４６６−３４７３（２００３）；米国特許第６，９４６，２９２号および第７，２１４，７７５号を参照されたい）。非フコシル化Ｎ−グリカンを有するこれらのＣＴＬＡ４結合性物質は、それらの炭化水素構造はヒト血清ＩｇＧ中に存在するポピュレーションの正常な構成成分であることから、免疫原性である可能性は低い。

【0203】

本発明は、チャイニーズハムスター卵巣細胞中で生産される免疫グロブリンに典型的に付加されるＮ−結合型グリカン（ＣＨＯ Ｎ−結合型グリカン）または遺伝子改変酵母細胞、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの中で生産される免疫グロブリンに典型的に付加されるＮ−結合型グリカン（遺伝子改変酵母 Ｎ−結合型グリカン）を含むＣＴＬＡ４結合性物質を包含する。例えば、本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、図４に示される「遺伝子改変酵母 Ｎ−結合型グリカン」または「ＣＨＯ Ｎ−結合型グリカン」のうちの１または複数（例えばＧ０および／またはＧ０−Ｆおよび／またはＧ１および／またはＧ１−Ｆおよび／またはおよび／またはＧ２−Ｆおよび／またはＭａｎ５）を含む。本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質は、遺伝子改変酵母 Ｎ−結合型グリカン、すなわちＧ０および／またはＧ１および／またはＧ２を含み、さらにＭａｎ５を包含してもよい。本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質は、ＣＨＯ Ｎ−結合型グリカン、すなわちＧ０−Ｆ、Ｇ１−ＦおよびＧ２−Ｆを含み、さらにＧ０および／またはＧ１および／またはＧ２および／またはＭａｎ５を包含してもよい。本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質上の全てのＮ−結合型グリカンのうちの約８０％から約９５％（例えば約８０−９０％、約８５％、約９０％または約９５％）が遺伝子改変酵母 Ｎ−結合型グリカンまたはＣＨＯ Ｎ−結合型グリカンである。Ｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ． Ｙｅａｓｔ． ２８（３）：２３７−２５２（２０１１）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３１３（５７９２）：１４４１−１４４３（２００６）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８（５）：３８７−３９２（２００７）を参照されたい。例えば、本発明のある実施形態において、遺伝子改変酵母細胞は、ＧＦＩ５．０またはＹＧＬＹ８３１６または米国特許第７，７９５，００２号もしくはＺｈａ ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ９８８：３１−４３（２０１３）に示される株である。国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０６６７６５号も参照されたい。

【0204】

組み合わせ
特定の実施形態において、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、例えば本明細書中で論じられる任意の疾患、例えばがんなどを治療または予防するため、かかる治療または予防の必要がある対象において、単独で、または他のさらなる治療剤および／または治療手法を伴って用いられ得る。さらなる治療剤を伴ったかかるＣＴＬＡ４結合性物質を含む組成物またはキット、例えば薬学的に許容される担体を含む医薬組成物もまた本発明の一部である。

【0205】

用語「伴う」は、構成成分である本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）が、別の剤、例えばペンブロリズマブまたはニボルマブなどと一緒に、例えば同時送達のために１つの組成物に、または別々に２つもしくはそれより多い組成物（例えばキット）に製剤化することができることを指し示す。各々の構成成分は、他の構成成分が投与されるのと異なる時に対象に投与することができ；例えば各々の投与は、間をあけて、所与の時間にわたって、同時でなく（例えば別々にまたは逐次的に）投与され得る。そのうえ、別々の構成成分は、同じ経路により、または異なる経路により対象に投与され得る（例えば、ここで本発明のＣＴＬＡ４結合性物質は非経口的に投与され、パクリタキセルは経口的に投与される）。

【0206】

特定の実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、抗がん治療剤または免疫調節薬剤、例えば免疫調節受容体阻害剤など、例えば受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を伴って用いられ得る。

【0207】

本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、阻害剤（例えば有機低分子または抗体もしくはその抗原結合断片）、例えばＭＴＯＲ（哺乳類ラパマイシン標的）阻害剤、細胞傷害剤、白金剤、ＢＲＡＦ阻害剤、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、微小管安定剤、タキサン、ＣＤ２０阻害剤、ＣＤ５２阻害剤、ＣＤ３０阻害剤、ＲＡＮＫ（核内因子カッパ−Ｂ受容体活性化因子）阻害剤、ＲＡＮＫＬ（核内因子カッパ−Ｂ受容体活性化因子リガンド）阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＨＥＲ１阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ４阻害剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＣＤ２２阻害剤、ＣＤ７９ｂ阻害剤、ＥｒｂＢ２阻害剤またはファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤などのうちの１または複数を伴う。

【0208】

本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片（例えばイピリムマブ）、抗ＰＤ１抗体もしくはその抗原結合断片（例えばペンブロリズマブ、ニボルマブ、ＣＴ−０１１）、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＴＩＭ３、抗ＣＳ１、（例えばエロツズマブ）、抗ＫＩＲ２ＤＬ１／２／３（例えばリリルマブ）、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７（例えばウレルマブ）、抗ＧＩＴＲ（例えばＴＲＸ５１８）、抗ＰＤ−Ｌ１（例えばＢＭＳ−９３６５５９、ＭＳＢ００１０７１８ＣまたはＭＰＤＬ３２８０Ａ）、抗ＰＤ−Ｌ２、抗ＩＬＴ１、抗ＩＬＴ２、抗ＩＬＴ３、抗ＩＬＴ４、抗ＩＬＴ５、抗ＩＬＴ６、抗ＩＬＴ７、抗ＩＬＴ８、抗ＣＤ４０、抗ＯＸ４０、抗ＣＤ１３７、抗ＫＩＲ２ＤＬ１、抗ＫＩＲ２ＤＬ２／３、抗ＫＩＲ２ＤＬ４、抗ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、抗ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、抗ＫＩＲ３ＤＬ１、抗ＫＩＲ３ＤＬ２、抗ＫＩＲ３ＤＬ３、抗ＮＫＧ２Ａ、抗ＮＫＧ２Ｃ、抗ＮＫＧ２Ｅ、または、かかる標的；ＩＬ−１０、抗ＩＬ１０、抗ＴＳＬＰ（胸腺間質性リンパ球新生因子）もしくはＰＥＧ化ＩＬ−１０の任意の有機低分子阻害剤のうちの１または複数を伴う。

【0209】

本発明のある実施形態において、ＰＥＧ化ＩＬ−１０分子上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の分子量は、約１２，０００ダルトンまたは約２０，０００ダルトンである。本発明のある実施形態において、ＰＥＧ化ＩＬ−１０（例えばＰＥＧ化ヒトＩＬ−１０）は、リンカー（例えばＣ_２−１２アルキル、例えば−−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−−など）を介してＩＬ−１０の単一サブユニットの単一のアミノ酸残基に共有結合した１または複数のポリエチレングリコール分子を含み、ここで前記アミノ酸残基はＮ末端アミノ酸残基のアルファアミノ基またはリジン残基のイプシロンアミノ基である。本発明のある実施形態において、ＰＥＧ化ＩＬ−１０は（ＰＥＧ）_ｂ−Ｌ−ＮＨ−ＩＬ−１０であり、ここでｂは１−９、ＬはＩＬ−１０の単一のアミノ酸残基の窒素（Ｎ）に共有結合したＣ_２−１２アルキルリンカー部分である。本発明のある実施形態において、ＰＥＧ化ＩＬ−１０のＩＬ−１０は、式：［Ｘ−−Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ］_ｂ−Ｌ−ＮＨ−ＩＬ−１０であり、ここでＸはＨまたはＣ_１−４アルキル；ｎは２０から２３００；ｂは１から９；およびＬはＣ_１−１１アルキルリンカー部分であって、これは１つのＩＬ−１０サブユニットのアミノ末端におけるアルファアミノ基の窒素（Ｎ）に共有結合しており；ただしｂが１より大きいとき、ｎの総数は２３００を超えない。ＵＳ７，０５２，６８６を参照されたい。

【0210】

本発明のある実施形態において、抗ＩＬ−１０抗体またはその抗原結合断片（例えばヒト化抗体）は、下に示されるＣＤＲ：
ＣＤＲ−Ｌ１：ＫＴＳＱＮＩＦＥＮＬＡ（配列番号７１）；
ＣＤＲ−Ｌ２：ＮＡＳＰＬＱＡ（配列番号７２）；
ＣＤＲ−Ｌ３：ＨＱＹＹＳＧＹＴ（配列番号７３）；
ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＦＴＦＳＤＹＨＭＡ（配列番号７４）；
ＣＤＲ−Ｈ２：ＳＩＴＬＤＡＴＹＴＹＹＲＤＳＶＲＧ（配列番号７５）；
ＣＤＲ−Ｈ３：ＨＲＧＦＳＶＷＬＤＹ（配列番号７６）
を含む（ＵＳ７，６６２，３７９を参照されたい）。

【0211】

本発明のある実施形態において、抗ＴＳＬＰ抗体またはその抗原結合断片（例えばヒト化抗体）は、下に示されるＣＤＲ：
ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＹＩＦＴＤＹＡＭＨ（配列番号７７）；
ＣＤＲ−Ｈ２：ＴＦＩＰＬＬＤＴＳＤＹＮＱＮＦＫ（配列番号７８）；
ＣＤＲ−Ｈ３：ＭＧＶＴＨＳＹＶＭＤＡ（配列番号７９）；
ＣＤＲ−Ｌ１：ＲＡＳＱＰＩＳＩＳＶＨ（配列番号８０）；
ＣＤＲ−Ｌ２：ＦＡＳＱＳＩＳ（配列番号８１）；
ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＱＴＦＳＬＰＹＴ（配列番号８２）
を含む（ＷＯ２００８／７６３２１を参照されたい）。

【0212】

本発明のある実施形態において、抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合断片（例えばヒト化抗体）は、下に示されるＣＤＲ：
ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＦＩＩＫＡＴＹＭＨ（配列番号８３）；
ＣＤＲ−Ｈ２：ＲＩＤＰＡＮＧＥＴＫＹＤＰＫＦＱＶ（配列番号８４）；
ＣＤＲ−Ｈ３：ＹＡＷＹＦＤＶ（配列番号８５）；
ＣＤＲ−Ｌ１：ＲＡＳＥＮＩＹＳＦＬＡ（配列番号８６）；
ＣＤＲ−Ｌ２：ＨＡＫＴＬＡＥ（配列番号８７）；
ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＨＹＹＧＳＰＬＴ（配列番号８８）；
を含む（ＷＯ２０１２／０４３６７を参照されたい）。

【0213】

それゆえに、本発明は、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）を、ペンブロリズマブを伴って含む組成物；並びに、ペンブロリズマブ（例えばペンブロリズマブ２００ｍｇを３週毎に１回投薬）を伴った有効量のＣＴＬＡ４結合性物質を対象に投与することを含む、対象においてがんを治療または予防する方法を包含する。対象は別のさらなる治療剤を伴って投与されてもよい。

【0214】

本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、アミノ酸配列：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＶＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＹＭＹＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＮＰＳＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦＫＮＲＶＴＬＴＴＤＳＳＴＴＴＡＹＭＥＬＫＳＬＱＦＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ；（配列番号８９）を含む免疫グロブリン重鎖（またはそのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３）、およびアミノ酸配列：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＫＧＶＳＴＳＧＹＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＬＡＳＹＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＨＳＲＤＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号９０）を含む免疫グロブリン軽鎖（またはそのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３）を含むペンブロリズマブ抗体を伴う。

【0215】

本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、アミノ酸配列：
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＤＣＫＡＳＧＩＴＦＳＮＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＫＲＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＮＤＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号９１）を含む免疫グロブリン重鎖（またはそのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３）、およびアミノ酸配列：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＳＮＷＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号９２）を含む免疫グロブリン軽鎖（またはそのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３）を含む抗体を伴う。

【0216】

本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質は、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、３−［５−（メチルスルホニルピペラジンメチル）−インドリル］−キノロン、４−ヒドロキシタモキシフェン、５−デオオキシウリジン（ｄｅｏｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、５'−デオキシ−５−フルオロウリジン、５−フルオロウラシル、６−メカプトプリン（ｍｅｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、７−ヒドロキシスタウロスポリン、Ａ−４４３６５４、酢酸アビラテロン、アブラキサン、ＡＢＴ−５７８、アコルビフェン、ＡＤＳ−１００３８０、アフリバーセプト、ＡＬＴ−１１０、アルトレタミン、アミホスチン、アミノグルテチミド、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンジオスタチン、ＡＰ−２３５７３、ＡＲＱ−１９７、アルゾキシフェン、ＡＳ−２５２４２４、ＡＳ−６０５２４０、アスパラギナーゼ、ＡＴＩ３３８７、ＡＴ−９２６３、アトラセンタン、アキシチニブ、ＡＺＤ１１５２、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン、バタブリン、ＢＣ−２１０、ベソドトクス（ｂｅｓｏｄｕｔｏｘ）、ベバシズマブ、ＢＧＪ３９８、ビカルタミド、Ｂｉｏ１１１、ＢＩＯ１４０、ＢＫＭ１２０、ブレオマイシン、ＢＭＳ−２１４６６２、ＢＭＳ−２４７５５０、ＢＭＳ−２７５２９１、ＢＭＳ−３１０７０５、ボルテジミブ（ｂｏｒｔｅｚｉｍｉｂ）、ブセレリン、ブスルファン、カルシトリオール、カンプトテシン、カネルチニブ、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、ＣＣ８４９０、ＣＥＡ（組換えワクシニア−がん胎児抗原ワクチン）、セジラニブ、ＣＧ−１５２１、ＣＧ−７８１、クラミドシン、クロラムブシル、クロロトキシン、シレンジタイド、シミチジン（ｃｉｍｉｔｉｄｉｎｅ）、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コビメトニブ（ｃｏｂｉｍｅｔｎｉｂ）、ＣＯＬ−３、ＣＰ−７２４７１４、シクロホスファミド、シプロテロン、酢酸シプロテロン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ダブラフェニブ、ダカルバジン、ダシノスタット、ダクチノマイシン、ダロツズマブ、ダヌセルチブ、ダサタニブ（ｄａｓａｔａｎｉｂ）、ダウノルビシン、デカタニブ（ｄｅｃａｔａｎｉｂ）、デグエリン、デニロイキン、デオキシコホルマイシン、デプシペプチド、ジアリルプロピオニトリル、ジエチルスチルベストロール、ジフチトクス、ＤＮＥ０３、ドセタキセル、ドビチニブ、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、エドテカリン、イットリウム−９０標識エドトレオチド、エドトレオチド、ＥＫＢ−５６９、ＥＭＤ１２１９７４、エンコラフェニブ、エンドスタチン、エンザルタミド、エンザスタウリン、エピルビシン、エピチロンＢ（ｅｐｉｔｈｉｌｏｎｅ Ｂ）、ＥＲＡ−９２３、アービタックス、エルロチニブ、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、フィクラツズマブ、フィナステリド、フラボピリドール、フロクスウリジン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ＦＯＬＦＯＸレジメン、フルベストラント、ガレテロン、ガネテスピブ、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ジャイマテカン、グルコピラノシルリピドＡ、ゴセレリン、酢酸ゴセレリン、ゴシポール、ＧＳＫ４６１３６４、ＧＳＫ６９０６９３、ＨＭＲ−３３３９、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ヒドロキシウレア、ＩＣ８７１１４、イダルビシン、イドキシフェン（ｉｄｏｘｙｆｅｎｅ）、イホスファミド、ＩＭ８６２、イマチニブ、ＩＭＣ−１Ｃ１１、イミキモド、ＩＮＣ２８０、ＩＮＣＢ２４３６０、ＩＮＯ１００１、インターフェロン、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、イピリムマブ、イリノテカン、ＪＮＪ−１６２４１１９９、ケトコナゾール、ＫＲＸ−０４０２、ラパチニブ、ラソフォキシフェン、ＬＥＥ０１１、レトロゾール、ロイコボリン、リュープロリド、酢酸リュープロリド、レバミソール、リポソーム内包パクリタキセル、ロムスチン、ロナファルニブ、ルカントン、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６４６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９４００２、ＬＹ３１７６１５、ＬＹ３００９１２０、マリマスタット、メクロレタミン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ＭＥＫ１６２、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、加熱死菌マイコバクテリウム・オブエンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｂｕｅｎｓｅ）懸濁物、トザセルチブ、ＭＬＮ８０５４、ナチトクラクス（ｎａｔｉｔｏｃｌａｘ）、ネオバスタット、ネラチニブ、ノイラジアブ（ｎｅｕｒａｄｉａｂ）、ニロチニブ、ニルチミド（ｎｉｌｕｔｉｍｉｄｅ）、ノラトレキセド、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、オブリメルセン、オクトレオチド、オファツムマブ、オレゴボマブ、オルナツズマブ（ｏｒｎａｔｕｚｕｍａｂ）、オルテロネル、オキサリプラチン、パクリタキセル、パルボシクリブ、パミドロネート、パニツムマブ、パゾパニブ、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ１８４３５２、ＰＥＧ−インターフェロン、ペメトレキセド、ペントスタチン、ペリホシン、フェニルアラニンマスタード、ＰＩ−１０３、ピクチリシブ、ＰＩＫ−７５、ピペンドキシフェン、ＰＫＩ−１６６、プリカマイシン、ポリ−ＩＣＬＣ、ポルフィマー、プレドニゾン、プロカルバジン、プロゲスチン類、ＰＳＫタンパク質結合多糖（担子菌コリオルス・ベルシカラー（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）由来）、ＰＬＸ８３９４、ＰＸ−８６６、Ｒ−７６３、ラロキシフェン、ラルチトレキセド、ラゾキシン（ｒａｚｏｘｉｎ）、リダフォロリムス、リツキシマブ、ロミデプシン、ＲＴＡ７４４、ルビテカン、スクリプタイド（ｓｃｒｉｐｔａｉｄ）、Ｓｄｘ１０２、セリシクリブ、セルメチニブ、セマクサニブ、ＳＦ１１２６、シロリムス、ＳＮ３６０９３、ソラフェニブ、スピロノラクトン、スクワラミン、ＳＲ１３６６８、ストレプトゾシン、ＳＵ６６６８、スベロイルアナリドヒドロキサム酸（ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎａｌｉｄｅ ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ ａｃｉｄ）、スニチニブ、合成エストロゲン、タランパネル、タリモジーン・ラハーパレプベック、タモキシフェン、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、テスミリフェン、テストステロン、テトランドリン、ＴＧＸ−２２１、サリドマイド、６−チオグアニン、チオテパ、チシリムマブ、チピファルニブ、チボザニブ、ＴＫＩ−２５８、ＴＬＫ２８６、ＴＮＦ□（腫瘍壊死因子アルファ）、トポテカン、クエン酸トレミフェン、トラベクテジン、トラメチニブ、トラスツズマブ、トレチノイン、トリコスタチンＡ、トリシリビンホスフェート（ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ）一水和物、パモ酸トリプトレリン、ＴＳＥ−４２４、ウラシルマスタード、バルプロ酸、バルルビシン、バンデタニブ、バタラニブ、ＶＥＧＦトラップ、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビタキシン、ビテスパン（ｖｉｔｅｓｐａｎ）、ボリノスタット、ＶＸ−７４５、ワートマニン、Ｘｒ３１１、Ｚ−１００バチルス・ツベルクロシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）熱水抽出物、ザノリムマブ、ＺＫ１８６６１９、ＺＫ−３０４７０９、ＺＭ３３６３７２またはＺＳＴＫ４７４のうちのいずれか１つまたは複数を伴う。

【0217】

本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、１または複数の制吐薬を伴い、これらとしては、限定されるものではないが、カソピタント（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ネツピタント（ＭＧＩ−Ｈｅｌｓｉｎｎ）および他のＮＫ−１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン（ＭＧＩ ＰｈａｒｍａによりＡｌｏｘｉとして販売）、アプレピタント（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．；Ｒａｈｗａｙ，ＮＪによりＥｍｅｎｄとして販売）、ジフェンヒドラミン（Ｐｆｉｚｅｒ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹによりＢｅｎａｄｒｙｌ（登録商標）として販売）、ヒドロキシジン（Ｐｆｉｚｅｒ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹによりＡｔａｒａｘ（登録商標）として販売）、メトクロプラミド（ＡＨ Ｒｏｂｉｎｓ Ｃｏ，；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡによりＲｅｇｌａｎ（登録商標）として販売）、ロラゼパム（Ｗｙｅｔｈ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪによりＡｔｉｖａｎ（登録商標）として販売）、アルプラゾラム（Ｐｆｉｚｅｒ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹによりＸａｎａｘ（登録商標）として販売）、ハロペリドール（Ｏｒｔｈｏ−ＭｃＮｅｉｌ；Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪによりＨａｌｄｏｌ（登録商標）として販売）、ドロペリドール（Ｉｎａｐｓｉｎｅ（登録商標））、ドロナビノール（Ｓｏｌｖａｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．；Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＧＡによりＭａｒｉｎｏｌ（登録商標）として販売）、デキサメタゾン（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．；Ｒａｈｗａｙ，ＮＪによりＤｅｃａｄｒｏｎ（登録商標）として販売）、メチルプレドニゾロン（Ｐｆｉｚｅｒ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹによりＭｅｄｒｏｌ（登録商標）として販売）、プロクロルペラジン（Ｇｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣによりＣｏｍｐａｚｉｎｅ（登録商標）として販売）、グラニセトロン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．；Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪによりＫｙｔｒｉｌ（登録商標）として販売）、オンダンセトロン（Ｇｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣによりＺｏｆｒａｎ（登録商標）として販売）、ドラセトロン（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹによりＡｎｚｅｍｅｔ（登録商標）として販売）、トロピセトロン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ；Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＪによりＮａｖｏｂａｎ（登録商標）として販売）が挙げられる。

【0218】

がん治療の他の副作用としては、赤血球細胞および白血球細胞の欠乏が挙げられる。したがって、本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、かかる欠乏を治療または予防する剤、例えばフィルグラスチム、ＰＥＧ−フィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンアルファまたはダルベポエチンアルファなどを伴う。

【0219】

本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、ワクチンを伴う。本発明のある実施形態において、ワクチンは、抗がんワクチン、ペプチドワクチンまたはＤＮＡワクチンである。例えば、本発明のある実施形態において、ワクチンは、腫瘍細胞（例えば放射線照射腫瘍細胞）または樹状細胞（例えば腫瘍ペプチドをパルスした樹状細胞）である。

【0220】

本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、治療手法を伴う。治療手法は、対象の治療において医師または臨床家により行われる１または複数のステップであって、何かしら臨床的に測定可能な程度、かかる症候の退縮もしくは消失を誘導することによって、またはかかる症候（複数可）、例えばがんの症候、例えば腫瘍増殖もしくは転移などの進行を阻害することによって治療された対象において（例えばがんおよび／または感染性疾患の）１または複数の症候を緩和することが意図されるものである。

【0221】

本発明のある実施形態において、治療手法は抗がん放射線療法である。例えば、本発明のある実施形態において、放射線療法は外部照射療法（ＥＢＴ）であり：これは高エネルギーＸ線ビームを腫瘍の場所に送達させる方法である。ビームは患者の外で（例えば直線加速器により）生成され、腫瘍部位に標的化される。これらのＸ線はがん細胞を破壊することができ、慎重な治療計画により周辺の正常組織を温存することが可能になる。放射線源は患者の体内に設置されない。本発明のある実施形態において、放射線療法は、プロトンビーム療法であり：これはＸ線の代わりにプロトンを罹患組織に照射する、あるタイプの原体療法である。本発明のある実施形態において、放射線療法は原体外部照射放射線療法であり：これは放射線療法を個々の体の構造に適合させるための先進的技術を使用する手法である。

【0222】

本発明のある実施形態において、放射線療法はブラキセラピーであり：これは、体内への一時的な放射性材料の設置であり、通常、ある領域に追加用量またはブーストの放射線照射を与えるために使用される。

【0223】

本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）を伴って投与される外科的手法は、外科的腫瘍摘出術である。

【0224】

治療的使用
本発明は、さらなる治療剤または治療手法を伴ってもよい本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）の使用により予防または治療することができる少なくとも１つの疾患または障害を予防および／または治療する方法を包含し、この方法は、その必要がある対象に薬学的活性量のＣＴＬＡ４結合性物質および／またはこれを含む医薬組成物を投与することを含む。

【0225】

「治療する」または「治療すること」は、例えば薬剤が治療活性を持つがんもしくは感染性疾患を持つまたはがんもしくは感染性疾患を持つことが疑われる対象の治療において、本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）を、ＣＴＬＡ４結合性物質が有効な１または複数の疾患症候を持つ対象（例えばヒトのような哺乳類）に投与することを意味する。典型的に、ＣＴＬＡ４結合性物質は、何かしら臨床的に測定可能な程度、かかる症候の退縮もしくは消失を誘導することによって、またはかかる症候（複数可）、例えばがんの症候、例えば腫瘍増殖もしくは転移などの進行を阻害することによって治療された対象または集団において（例えばがんまたは感染性疾患の）１または複数の症候を緩和する「有効量」または「有効用量」で投与される。ＣＴＬＡ４結合性物質の有効量は、例えば患者の疾患ステージ、年齢および体重、ならびに対象において所望の応答を誘起する薬剤の能力などの因子に応じて変わり得る。

【0226】

治療される対象は任意の温血動物であり得るが、とりわけ哺乳類、よりとりわけにはヒトである。当業者に明らかであるように、治療される対象は、とりわけ、本明細書中に言及される疾患および障害に罹患しているまたはそのリスクがあるヒトである。一般に、治療レジメンは、所望の治療効果が達成されるまで、および／または所望の治療効果が維持されているかぎり続けられる。やはり、これは臨床家が決定することができる。

【0227】

本明細書中に記載されるＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）、ポリペプチド、化合物およびポリヌクレオチド（例えばベクター）は、好ましくは循環に投与される。それらはそれ自体で、ＣＴＬＡ４結合性物質、ポリペプチド、化合物およびポリヌクレオチドが循環に入ることを可能にする任意の好適な方法で、例えば静脈内などに、注射もしくは注入を通じて、または、ＣＴＬＡ４結合性物質、ポリペプチド、化合物およびポリヌクレオチドが循環に入ることを可能にする任意の他の好適な方法（経口投与、皮下投与、筋肉内投与、皮膚を通じた投与、鼻腔内投与、肺を介した投与などを包含するもの）で投与することができる。好適な投与方法および経路は、やはり、例えばまたＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の公開された特許出願、例えばＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ２００６／１２２７８６、ＷＯ２００８／０２００７９、ＷＯ２００８／１４２１６４またはＷＯ２００９／０６８６２７などの教示からも当業者に明らかである。

【0228】

本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）の医薬組成物または滅菌組成物を調製するため、ＣＴＬＡ４結合性物質は薬学的に許容される担体または賦形剤と混合される。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ． Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照されたい。かかる組成物は本発明の一部である。

【0229】

本発明の範囲は、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）、または、薬学的に許容される担体を包含するが実質的に水を含まないその医薬組成物を含む、乾燥された、例えば凍結乾燥された組成物を包含する。

【0230】

治療薬および診断薬の製剤は、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液または懸濁液の形態における許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより調製され得る（例えばＨａｒｄｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ'ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００） Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）。

【0231】

一般に、本明細書中に言及される疾患および障害の予防および／または治療のため、および治療される具体的な疾患または障害、用いられる具体的な融合タンパク質または構成物の効力および／または半減期、用いられる具体的な投与経路および具体的な医薬製剤または組成物に応じて、本発明のナノボディおよびポリペプチドは、一般に、１グラム／ｋｇ体重／日から０．０１マイクログラム／ｋｇ体重／日の間の量で、好ましくは０．１グラム／ｋｇ体重／日から０．１マイクログラム／ｋｇ体重／日の間の量で、例えば約１、１０、１００または１０００マイクログラム／ｋｇ体重／日の量で、連続的に（例えば注入による）、１日１回用量としてまたは１日の間で複数回に分けた用量として投与される。臨床家は、一般に、本明細書中に言及される因子に応じて好適な１日用量を決定することが可能である。また、具体的な場合において、臨床家は、例えば上で引用される因子および自身の専門的判断を基にして、これらの量から逸脱することを選択し得ることも明らかである。一般に、投与量についてのいくつかのガイダンスは、本質的に同じ経路を介して投与される同じ標的に対する同等の慣用的抗体または抗体断片が通常投与される量から、親和性／結合、有効性、体内分布、半減期および当業者に周知の同様の因子の相違を考慮して、得ることができる。

【0232】

ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）の対象への投与様式は変えることができる。投与経路としては、経口、直腸、経粘膜、腸、非経口；筋肉内、皮下、皮内、髄内、髄腔内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼球内、吸入、吹送、局所、皮膚、経皮または動脈内が挙げられる。

【0233】

適切な用量の決定は、臨床家により、例えば当該技術分野において治療に影響することが知られているまたはその可能性があるパラメーターまたは因子を用いてなされる。一般に、用量の決定において、用量は最適用量よりもいくらか少ない量で始めて、その後、何らかのネガティブな副作用に対して所望のまたは最適な効果が達成されるまで、少量ずつ増加させる。重要な診断的測定値としては、症候の、例えば炎症の症候の測定値、または生産される炎症性サイトカインのレベルが挙げられる。一般的に、用いられる生物学的物質は治療の標的となる動物と同じ種に由来することが望ましく、それによって試薬に対する何らかの免疫応答を最小化することができる。ヒト対象の場合、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体が望ましいものであり得る。適切な用量の選択におけるガイダンスが利用可能である（例えばＷａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（ｅｄ．）（１９９１） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｃｈ（ｅｄ．）（１９９３） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ； Ｂａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３４８：６０１−６０８；Ｍｉｌｇｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３４１：１９６６−１９７３；Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３４４：７８３−７９２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３４２：６１３−６１９；Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３４８：２４−３２；Ｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３４３：１５９４−１６０２を参照されたい）。

【0234】

疾患症候が緩和されたかどうかは、その症候の重症度または進行状態を判定するために医師または他の専門の医療提供者により典型的に用いられる任意の臨床的測定により判定することができる。本発明のある実施形態（例えば治療方法または製造物）はあらゆる対象における標的の疾患症候（複数可）の緩和において有効でないこともあるが、当該技術分野で公知である任意の統計的検定、例えばＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定、カイ２乗検定、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙによるＵ検定、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定（Ｈ検定）、Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ−Ｔｅｒｐｓｔｒａ検定およびＷｉｌｃｏｘｏｎ検定などにより決定されるように、統計的に有意な数の対象において標的の疾患症候（複数可）を緩和する。

【0235】

一般に、治療レジメンは、所望の治療効果が達成されるまで、および／または所望の治療効果が維持されているかぎり続けられる。やはり、これは臨床家が決定することができる。

【0236】

本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）はＣＴＬＡ４に結合する能力があることから、これらはとりわけ、がん、転移性がん、固形腫瘍、血液がん、白血病、リンパ腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、腎臓がん、白血病、腎臓移行上皮がん、膀胱がん、ウィルムスがん、卵巣がん、膵臓がん、乳がん、前立腺がん、骨がん、肺がん、非小細胞がん、胃がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、滑膜肉腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、腎臓細胞がん、網膜芽細胞腫、肝芽腫、肝細胞癌、黒色腫、腎臓のラブドイド腫瘍、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脳がん、神経膠芽腫、髄膜腫、脳下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原始神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、退形成性星状細胞腫、乏突起膠細胞腫、上衣腫、脈絡叢乳頭腫、真性多血症、血小板血症、特発性骨髄線維症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｍｙｅｌｆｉｂｒｏｓｉｓ）、軟組織肉腫、甲状腺がん、子宮内膜がん、カルチノイドがんまたは肝臓がん、乳がんおよび胃がんの治療または予防のために用いることができる。

【0237】

本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）は、感染性疾患、例えばウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症または寄生生物感染症などの治療または予防のために用いることができる。本発明のある実施形態において、ウイルス感染症は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エボラウイルス、肝炎ウイルス（Ａ、ＢまたはＣ）、ヘルペスウイルス（例えばＶＺＶ、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩおよびＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス類、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスまたはアルボウイルス脳炎ウイルスよりなる群から選択されるウイルスの感染症である。本発明のある実施形態において、細菌感染症は、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、リケッチア細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｎｏｃｏｃｃｉ）、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、桿菌、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クロストリジウム・テタン（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎ）、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、バチルス・アントリシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒｉｃｉｓ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、マイコバクテリウム・レプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・レプロマトシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ）およびボリエラ（Ｂｏｒｒｉｅｌｌａ）よりなる群から選択される細菌の感染症である。本発明のある実施形態において、真菌感染症は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）（アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）、クルセイ（ｋｒｕｓｅｉ）、グラブラタ（ｇｌａｂｒａｔａ）、トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）など）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（フミガタス（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ニガー（ｎｉｇｅｒ）など）、ケカビ目の属（ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、アブシジア（ａｂｓｉｄｉａ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ））、スポロトリクス・シェンキー（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｋｉｉ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）およびヒストプラズマ・カプスラツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）よりなる群から選択される真菌の感染症である。本発明のある実施形態において、寄生生物感染症は、エントアメーバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、バランチジウム・コリ（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）、ネグレリア・フォーレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ）、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）、ジアルジア・ランビア（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、プラスモジウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、リーシュマニア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、ニッポストロンギルス・ブラジリエンシス（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）よりなる群から選択される寄生生物の感染症である。

【0238】

本発明はまた、ＣＴＬＡ４結合性物質（例えばＦ０２３７００９１２またはＦ０２３７００９１４）を対象に投与することにより；またはインビトロでＣＴＬＡ４をＣＴＬＡ４結合性物質と接触させることにより、対象の体内において
・Ｔ細胞共刺激シグナル伝達；Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖のＣＴＬＡ４を介した阻害を防ぐ方法；
・Ｂ７−１（ＣＤ８０）もしくはＢ７−２（ＣＤ８６）へのＣＴＬＡ４結合を防ぐ方法；および／または
・Ｔ細胞活性化を増強する方法
を包含する。かかる活性は、ＣＴＬＡ４結合性物質を介するものであり得る。それゆえに、かかる方法はまた、ＣＴＬＡ４結合性物質を包含する任意の結合性物質を使用して実施され得る。

【0239】

本発明はまた、一般に、その必要がある対象（すなわち、前述の疾患のうちの１つに罹患している対象）に治療的有効量の本発明のＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）を投与することを含む、前述の疾患および障害を治療する方法に関する。本発明はまた、前述の疾患または障害のうちの１つの予防または治療における使用のための本発明のＣＴＬＡ４結合性物質に関する。

【0240】

本発明はまた、本明細書に示されるＣＴＬＡ４結合性物質（例えばナノボディのようなＩＳＶＤ）、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドのうちのいずれか、またはそれらの医薬組成物を含む注入装置を提供する。注入装置は、非経口の経路、例えば筋肉内、皮下または静脈内を介して患者の体内に物質を導入する装置である。例えば、注入装置は、シリンジ（例えば自動注入器のような医薬組成物を予め充填したもの）であり得て、これは例えば注入される液体（例えばＣＴＬＡ４結合性物質またはその医薬組成物を含むもの）を入れるためのシリンダーもしくは注射外筒、液体の注入のために皮膚および／または血管を貫くための針；ならびに液体をシリンダーから押し出して針穴を通すためのプランジャーを包含する。本発明のある実施形態において、ＣＴＬＡ４結合性物質またはその医薬組成物を含む注入装置は、静脈内（ＩＶ）注入装置である。かかる装置は、ＣＴＬＡ４結合性物質またはその医薬組成物をカニューレまたはトロカール／針の中に包含し、これは、そのカニューレまたはトロカール／針を通じて対象の体内に導入される液体（例えば生理食塩水；またはＮａＣｌ、乳酸ナトリウム、ＫＣｌ、ＣａＣｌ_２を含み、グルコースを包含してもよい乳酸リンゲル溶液）を入れるためのバッグまたはリザーバーに取り付け得るチューブに取り付け得る。本発明のある実施形態において、トロカールおよびカニューレが対象の静脈内に挿入されてトロカールが挿入されたカニューレから取り外されると、ＣＴＬＡ４結合性物質またはその医薬組成物は装置内に導入され得る。ＩＶ装置は、例えば末梢静脈内（例えば手または腕の中）に；上大静脈もしくは下大静脈内に、もしくは右心房内（例えば中心ＩＶ）に；または例えば上大静脈もしくは右心房に達するまで心臓に向かって進む鎖骨下、内頚もしくは大腿静脈内（例えば中心静脈ライン）に挿入され得る。本発明のある実施形態において、注入装置は自動注射器；ジェット式注射器または外部注入ポンプである。ジェット式注射器は、表皮に浸透する液体の高圧で細い噴射を用いることで、ＣＴＬＡ４結合性物質またはその医薬組成物を患者の体に導入する。外部注入ポンプは、ＣＴＬＡ４結合性物質またはその医薬組成物を制御された量で患者の体内に送達させる医療機器である。外部注入ポンプは、電気的に動いても機械的に動いてもよい。異なるポンプは異なる方法で作動し、例えばシリンジポンプは液体をシリンジリザーバー中に入れて可動ピストンが液体の運搬を制御し、エラストマーポンプは液体を伸縮性バルーンリザーバー中に入れて弾力のあるバルーン壁からの圧力が液体の運搬を駆動する。ペリスタルティックポンプにおいては、ローラーのセットが１本のフレキシブルチューブを挟んで下り、液体を前に押す。マルチチャネルポンプにおいては、複数のリザーバーから複数の速度で液体を運搬することができる。

【0241】

なおまた、図、任意の配列表および実験部／実施例は本発明をさらに説明することのみのために与えられたものであって、本明細書中に明示的に指示がないかぎり、本発明の範囲および／または添付の特許請求の範囲を何らか制限するものと理解または解釈すべきではない。

【0242】

本発明の他の態様、実施形態、利点および用途は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。

【実施例】

【0243】

これらの例は本発明を例証することを意図しており、限定するものではない。実施例に示される組成物および方法は本発明の一部を形成する。

【0244】

実施例１：Ｆ０２３７００９０６ナノボディのＣＴＬＡ−４−Ｆｃへの結合
Ｆ０２３７００９２５の構成ブロックである一価のＦ０２３７００９０６ナノボディ１１Ｆ０１（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｑ４５Ｒ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ，Ｍ９６Ｐ，Ｑ１０８Ｌ）−ＦＬＡＧ３−ＨＩＳ６）は、ヒトおよびカニクイザルの両方からのＣＴＬＡ−４−Ｆｃ融合分子への結合を実証する。オン・レート（ｏｎ−ｒａｔｅ）、オフ・レート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）およびアフィニティーは、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（ＢｉｏＲａｄ ６７０ＢＲ０１６６）上で、ヒトＣＴＬＡ−４−ｈＦｃおよびカニクイザルＣＴＬＡ４−ｈＦｃを用いて決定した（下の表Ｄ）。これらの結果は、ヒトおよびカニクイザルのＣＴＬＡ−４へのナノボディの高アフィニティー結合を実証するものであり、ＣＴＬＡ−４の機能を調節するナノボディの潜在力を、およびカニクイザルは毒性種（ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｓｐｅｃｉｅｓ）として用いられ得ることを示唆する。

【0245】

表Ｄ−１．ヒトまたはカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ Ｍｏｎｋｅｙ）のＣＴＬＡ−４−Ｆｃへのナノボディの結合

【表19】

【0246】

表Ｄ−２．試薬

【表20】

【0247】

実施例２：Ｆ０２３７００９１２ナノボディの細胞表面ＣＴＬＡ４への結合
Ｆ０２３７００９１２は、細胞表面上に発現したヒトＰＤ−１への結合を実証する。Ｆ０２３７００９１２（１１Ｆ０１（Ｅ１Ｄ，Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｑ４５Ｒ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ，Ｍ９６Ｐ，Ｑ１０８Ｌ）−３５ＧＳ−１１Ｆ０１（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｑ４５Ｒ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ，Ｍ９６Ｐ，Ｑ１０８Ｌ）−３５ＧＳ−ＡＬＢ１１００２−Ａ］）（黒の丸）、Ｆ０２３７００９２５（ＰＤ１結合性物質−３５ＧＳ−ＰＤ１結合性物質−３５ＧＳ−１１Ｆ０１（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｑ４５Ｒ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ，Ｍ９６Ｐ，Ｑ１０８Ｌ）−３５ＧＳ−１１Ｆ０１（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｑ４５Ｒ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ，Ｍ９６Ｐ，Ｑ１０８Ｌ）−３５ＧＳ−ＡＬＢ１１００２−Ａ］）（黒の正方形）および無関係の（ｉｒｒｅｌａｖａｎｔ）Ｎｂ（黒の三角形）のバッチの、（Ａ）バルクソートされた（ｂｕｌｋｓｏｒｔｅｄ）ｈＣＴＬＡ４過剰発現ｊｕｒｋａｔ ＪＥ６．２．１１細胞、または、（Ｂ）ｈＣＴＬＡ４過剰発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞への結合をフローサイトメトリーにより調べた。ナノボディは、ＡＬＢ１１００２結合ｍＡＢ ＡＢＨ００７４によって検出した。これらの実験において生成されたフローサイトメトリーのデータは、図５（Ａ−Ｂ）に示される。これらの結果は、Ｆ０２３７００９１２およびＦ０２３７００９２５の細胞表面上に発現したＣＴＬＡ−４への結合を実証し、これらのナノボディがＣＴＬＡ−４の機能を調節することを示唆する。

【0248】

図５（Ａ−Ｂ）は、半減期延長された（ＡＬＢ００１１構成ブロック）Ｎｂ Ｆ０２３７００９１２（黒の丸）、Ｆ０２３７００９２５（黒の正方形）および陰性対照Ｎｂ ＩＲＲ０００５１（黒の三角形）のバッチの２００μｌ ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１４１９０−０９４）、１０％熱不活化胎児（ｆｏｅｔａｌ）ウシ血清（Ｓｉｇｍａ、Ｆ７５２４）、０．０５％ ＮａＮ_３（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１９０３８））中での希釈系列（初発濃度１μＭ、１／４段階希釈、１２ｐｔｓ）を、（Ａ）２Ｅ４のバルクソートしたヒトＣＴＬＡ４過剰発現ｊｕｒｋａｔ ＪＥ６．２．１１細胞／ウェル、または、（Ｂ）２Ｅ４のヒトＣＴＬＡ４過剰発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞／ウェルに加え、４℃で３０分間インキュベートしたものである。

【0249】

３回の洗浄ステップ（１回の洗浄ステップ＝Ｎｂ希釈物の除去、１００μｌの冷ＦＡＣＳバッファーの添加、２５０ｇで５分間の遠心分離）の後、半減期が延長されたナノボディの検出のため、細胞を、３μｇ／ｍｌ 抗ＡＬＢ１１００２マウスｍＡｂ ＡＢＨ０００７４と共に、冷ＦＡＣＳバッファー中、４℃で３０分間インキュベートした。

【0250】

３回の洗浄ステップの後、細胞を、ＰＥヤギＦ（ａｂ'）２抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１５−１１６−０７１）の冷ＦＡＣＳバッファー中１／１００希釈物と共に、４℃で３０分間インキュベートした。

【0251】

３回の洗浄ステップの後、細胞を５ｎＭ ＴＯ−ＰＲＯ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｔ３６０５）を加えた５０μｌ 冷ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏで解析した。

【0252】

最初に、Ｐ１ポピュレーションをＦＳＣ−ＳＳＣ分布に基づいて選択する。ゲート停止をＰ１中で１００００細胞に設定した。このポピュレーションから、ＴＯ−ＰＲＯ−３＋細胞（死細胞）を除外する。このＰ１／ＴＯ−ＰＲＯ−３陰性ポピュレーションについて、ＰＥ中央値を算出する。

【0253】

実施例３：Ｆ０２３７００９１２ナノボディはＣＴＬＡ−４のＣＤ８０およびＣＤ８６への結合を遮断する
Ｆ０２３７００９１２は、ヒトＣＴＬＡ−４のそのリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６への結合を遮断する。ｈＣＴＬＡ４過剰発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞上の固定濃度（１０ｘＥＣ３０）の、（Ａ）ｈＣＤ８０−ｈＦｃ、または、（Ｂ）ｈＣＤ８６−ｈＦｃを使用した、Ｆ０２３７００９１２（黒の丸）およびイピリムマブ（黒の正方形）の競合実験のフローサイトメトリー解析である。リガンドは、ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質によって検出した。これらの実験において生成されたデータは、図６（Ａ−Ｂ）に示される。これらの結果は、ＣＴＬＡ−４のそのリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６への結合（ｂｉｎｄｎｉｎｇ）を遮断するＦ０２３７００９１２の能力を実証し、ＣＴＬＡ−４ならびにＣＤ８０およびＣＤ８６とのその相互作用により調節される免疫応答に影響を与えるＦ０２３７００９１２の能力を例証する。

【0254】

図６（Ａ−Ｂ）は、Ｎｂ Ｆ０２３７００９１２（黒の丸）およびイピリムマブ（黒の正方形）の１００μｌ ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１４１９０−０９４）、１０％熱不活化胎児（ｆｏｅｔａｌ）ウシ血清（Ｓｉｇｍａ、Ｆ７５２４）、０．０５％ ＮａＮ_３（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１９０３８））中での希釈系列（初発濃度１μＭ、１／３段階希釈、１２ｐｔｓ）を、固定濃度の（Ａ）ＦＩＴＣ標識ヒトＣＤ８０−ｈＦｃ−ＨＩＳ６または（Ｂ）ＦＩＴＣ標識ヒトＣＤ８６−ｈＦｃ−ＨＩＳ６（ＦＩＴＣ標識はそれぞれ３．６および２の標識度で実施した；濃度＝１０ｘＥＣ３０、それぞれ３．７１Ｅ−０８Ｍまたは４．３５Ｅ−０８Ｍである）の存在下で、１Ｅ５のヒトＣＴＬＡ４過剰発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞／ウェルに加え、４℃で９０分間インキュベートしたものである。

【0255】

３回の洗浄ステップ（１回の洗浄ステップ＝Ｎｂ希釈物の除去、１００μｌの冷ＦＡＣＳバッファーの添加、２５０ｇで５分間の遠心分離）の後、細胞を５ｎＭ ＴＯ−ＰＲＯ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｔ３６０５）を加えた５０μｌ 冷ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏで解析した。

【0256】

最初に、Ｐ１ポピュレーションをＦＳＣ−ＳＳＣ分布に基づいて選択する。ゲート停止をＰ１中で１００００細胞に設定した。このポピュレーションから、ＴＯ−ＰＲＯ−３＋細胞（死細胞）を除外する。このＰ１／ＴＯ−ＰＲＯ−３陰性ポピュレーションについて、ＰＥ中央値を算出する。

【0257】

実施例４：Ｆ０２３７００９１２の特異性判定
Ｆ０２３７００９１２の特異性判定は、ＣＴＬＡ−４への選択的結合を実証した。ＢＴＬＡ、ＣＤ８、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＣＤ２８に対する特異性判定は、フローサイトメトリーを用いて過剰発現細胞上で実施したが、ＩＣＯＳ結合は組換えタンパク質（ｈＩＣＯＳ−ｈＦｃ）としてＥＬＩＳＡ中で評価した。ＢＴＬＡ、ＣＤ８、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＣＤ２８の発現は、直接標識した標的特異的Ａｂによって確認した。抗ｈＩＣＯＳおよび抗ｈＣＴＬＡ４／抗ｈＰＤ１陽性対照は全て陽性であった。ＥＬＩＳＡアッセイにおいてｈＩＣＯＳへの結合は観察されなかった。図７（Ａ−Ｈ）は、それぞれ陰性対照のＬ細胞、陰性対照のＣＨＯ−Ｋ１細胞、ｈｕＣＤ２８＋Ｌ細胞、ｈｕＣＤ８ａｌｐｈａ＋Ｌ細胞、ｈｕＬａｇ−３＋ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ｈｕＢＴＬＡ＋ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ｈｕＣＴＬＡ−４＋ＣＨＯ−Ｋ細胞およびｈｕＰＤ−１＋ＣＨＯ−Ｋ１細胞への結合を判定する。ＢＴＬＡ、ＣＤ８、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＤ２８への結合はＦ０２３７００９１２について観察することができなかったが、Ｆ０２３７００９１２の強力な結合がＣＴＬＡ−４＋ ＣＨＯ−Ｋ１細胞上で観察された。これらの実験において生成されたデータは、図７（Ａ−Ｈ）に示される。これらの結果は、Ｆ０２３７００９１２のＣＴＬＡ−４への選択的結合を例証しており、インビボ投与の際の極めて小さいオフターゲット効果が予測される。

【0258】

図７（Ａ−Ｈ）は、半減期延長された（ＡＬＢ００１１構成ブロック）Ｎｂ Ｆ０２３７００９１２（黒の丸）、Ｆ０２３７００９２５（黒の正方形）および陰性対照Ｎｂ ＩＲＲ０００５１（黒の三角形）のバッチの２００μｌ ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１４１９０−０９４）、１０％熱不活化胎児（ｆｏｅｔａｌ）ウシ血清（Ｓｉｇｍａ、Ｆ７５２４）、０．０５％ ＮａＮ_３（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１９０３８））中での希釈系列（初発濃度１μＭ、１／４段階希釈、１２ｐｔｓ）を、（Ａ）２Ｅ４のＬ細胞／ウェル、（Ｂ）２Ｅ４のＣＨＯ−Ｋ１細胞／ウェル、（Ｃ）ヒトＣＤ２８過剰発現Ｌ細胞、または、（Ｄ）ヒトＣＤ８アルファ過剰発現Ｌ細胞、（Ｅ）２Ｅ４のヒトＬＡＧ３過剰発現ＣＨＯ−Ｋ１／ウェル、（Ｆ）２Ｅ４のヒトＢＴＬＡ過剰発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞／ウェル、（Ｇ）ヒトＣＴＬＡ４過剰発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞／ウェル、または、（Ｈ）ヒトＰＤ１過剰発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞／ウェルに加え、４℃で３０分間インキュベートしたものである。

【0259】

３回の洗浄ステップ（１回の洗浄ステップ＝Ｎｂ希釈物の除去、１００μｌの冷ＦＡＣＳバッファーの添加、２５０ｇで５分間の遠心分離）の後、半減期が延長されたＮｂの検出のため、細胞を、３μｇ／ｍｌ 抗ＡＬＢ００１１マウスｍＡｂ ＡＢＨ０００７４と共に、冷ＦＡＣＳバッファー中、４℃で３０分間インキュベートした。

【0260】

３回の洗浄ステップの後、細胞を、ＰＥヤギＦ（ａｂ'）_２抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１５−１１６−０７１）の冷ＦＡＣＳバッファー中１／１００希釈物と共に、４℃で３０分間インキュベートした。

【0261】

３回の洗浄ステップの後、細胞を５ｎＭ ＴＯ−ＰＲＯ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｔ３６０５）を加えた５０μｌ 冷ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏで解析した。

【0262】

最初に、Ｐ１ポピュレーションをＦＳＣ−ＳＳＣ分布に基づいて選択する。ゲート停止をＰ１中で１００００細胞に設定した。このポピュレーションから、ＴＯ−ＰＲＯ−３＋細胞（死細胞）を除外する。このＰ１／ＴＯ−ＰＲＯ−３陰性ポピュレーションについて、ＰＥ中央値を算出する。

【0263】

実施例５：Ｆ０２３７００９１２ナノボディのヒト、アカゲザルおよびマウスのアルブミンへの結合
Ｆ０２３７００９１２はヒト、アカゲザルおよびマウスのアルブミンに結合し、非アルブミン結合ナノボディと比べたときの半減期の延長を予測する。表面プラスミン共鳴（ＳＰＲ）を用いて分析したとき、ヒト、アカゲザルおよびマウスの血清アルブミンへの結合が観察された。データは、下の表Ｅに示される。Ｆ０２３７００９１２のアルブミン結合は、インビボ投与の際のナノボディのクリアランスを低減させ、その治療的潜在力を改良することが期待される。

【0264】

表Ｅ．ナノボディのアルブミンへの結合

【表21】

【0265】

機器：Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；センサーチップ：ＣＭ５（ＩＤ Ｔ１６０７１３−２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ｌｏｔ １０２４２５９９）。

【0266】

実施例６：ナノボディＦ０２３７００９０６ Ｎ７３バリアント
バリアントＦ０２３７０１０５１（１１Ｆ０１（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｑ４５Ｒ，Ｎ７３Ｑ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ，Ｍ９６Ｐ，Ｑ１０８Ｌ）−ＦＬＡＧ３−ＨＩＳ６）、Ｆ０２３７０１０５４（１１Ｆ０１（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｑ４５Ｒ，Ｎ７３Ｔ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ，Ｍ９６Ｐ，Ｑ１０８Ｌ）−ＦＬＡＧ３−ＨＩＳ６）およびＦ０２３７０１０６１（１１Ｆ０１（Ｌ１１Ｖ，Ａ１４Ｐ，Ｑ４５Ｒ，Ｎ７３Ｙ，Ａ７４Ｓ，Ｋ８３Ｒ，Ｖ８９Ｌ，Ｍ９６Ｐ，Ｑ１０８Ｌ）−ＦＬＡＧ３−ＨＩＳ６）を、Ｆ０２３７００９０６と、（Ａ）ＣＤ８０または（Ｂ）ＣＤ８６のＣＴＬＡ−４発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞への結合を遮断するそれらの能力について比較した。全てのこれらのバリアントは、ＣＤ８０およびＣＤ８４のＣＴＬＡ−４への結合を遮断することが可能であった。ＣＤ８０およびＣＤ８６に対するＣＴＬＡ４の遮断を、バリアントのうちのいくつかについて決定した。これらの遮断データは、図８（Ａ−Ｂ）に示される。これらの結果は、ＣＤ８０またはＣＤ８６のＣＴＬＡ−４への結合を遮断するナノボディの能力に対して大きく影響せずにＮ７３位においてアミノ酸を変えることの可能性を例証する。かかるバリアントは、Ｎ７３における脱アミド化の回避を可能にする。

【0267】

実施例７：Ｆ０２３７００９１２はヒト化マウスにおいて定着固形腫瘍を根絶する
ヒト化マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にＰａｎｃ ０８．１３腫瘍細胞（ヒト膵臓腺癌）を移植した。定着腫瘍を有するマウス（約１００ｍｍ^３、ｎ＝９−１０／群）を次のように治療した：１−アイソタイプコントロール（ｈＩｇＧ１−２ｍｇ／ｋｇおよびｈＩｇＧ４−３ｍｇ／ｋｇ）；２−イピリムマブ−Ｎ２９７Ａ（３ｍｇ／ｋｇ）；３−イピリムマブ（３ｍｇ／ｋｇ）；４−ペンブロリズマブ（２ｍｇ／ｋｇ）；５−イピリムマブ（３ｍｇ／ｋｇ）＋ペンブロリズマブ（２ｍｇ／ｋｇ）；６−Ｆ０２３７００９１２（５ｍｇ／ｋｇ；ＣＴＬＡ４−Ｎａｂ ５として指し示される）、７−Ｆ０２３７００９１２（１５ｍｇ／ｋｇ；ＣＴＬＡ４−Ｎａｂ−１５として指し示される）および８−Ｆ０２３７００９１２（１５ｍｇ／ｋｇ）＋ペンブロリズマブ（２ｍｇ／ｋｇ）。全ての抗体は、７日毎に６回皮下注射した。Ｆ０２３７００９１２は、３．５日毎に１１回皮下投与した。腫瘍体積および体重は４−５日毎に測定した。図９（Ａ−Ｂ）中に、平均腫瘍体積±ＳＥＭ、３７日目の個々の腫瘍体積、および実験期間にわたる個々のマウスにおける腫瘍体積が示される。各処置群についての腫瘍体積もまた図９（Ｃ−Ｊ）中に示される。各処置群における平均（平均±ＳＥＭ）および個々の体重変化もまた測定された（図９（ｋ−ｓ））。死亡が見出されたまたは体重低下のため人道的に安楽死させたマウスの数（ｍｕｍｂｅｒ）は「＃」として指し示した。「↑」は抗体を指し示し、「^＊」はナノボディ投薬スケジュールを指し示した。これらのデータは、ヒト免疫細胞を持つ動物においてインビボでの抗ヒト腫瘍応答（ｒｅｐｏｎｓｅ）を誘導するＦ０２３７００９１２の能力を例証した。これらのデータは、ヒトのがんの治療におけるＦ０２３７００９１２の潜在力を支持する。

【0268】

実施例８：Ｆ０２３７００９１２およびＦ０２３７００９２５の健常対象およびがん患者からの先在抗体への結合
三価の参照ナノボディ０１３７００１１２（先在抗体の結合を低減させるために改変されていない）は、（図１０Ａ）健常対象または（図１０Ｂ）がん患者由来のいくつかの血清試料への結合を実証する。同様のサイズである配列最適化された三価のナノボディＦ０２３７００９１２は、同じ血清試料への結合頻度がより低いことを実証する。Ｆ０２３７００９２５はＦ０２３７００９１２と同じ構成ブロックを含む。サイズがより大きいにもかかわらず、五価のＦ０２３７００９２５ナノボディは、参照ナノボディ０１３７００１１２よりも多くない、先在しているＡｂへの結合を呈する。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上に捕捉されたナノボディへの先在抗体の結合を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて評価した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０）をランニングバッファーとして用いて、２５℃で実験を実施した。ＰｒｏｔｅＯｎ ＧＬＣセンサーチップのリガンドレーンをＥＤＣ／ＮＨＳ（流速３０μｌ／分）で活性化し、ＨＳＡをＰｒｏｔｅＯｎ Ａｃｅｔａｔｅバッファー ｐＨ４．５中に１０μｇ／ｍｌで注入（流速１００μｌ／分）することで固定化レベルを約３６００ＲＵにした。固定化の後、表面をエタノールアミンＨＣｌ（流速３０μｌ／分）で不活性化した。ナノボディをＨＳＡ表面上に４５μｌ／分で２分間注入し、ナノボディ捕捉レベルを三価のＦ０２３７００９１２について約６００ＲＵに、五価のＦ０２３７００９２５について約１０００ＲＵにした。先在抗体を含有する試料をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．００５％）中で１：１０に希釈してから、４５μｌ／分で２分間注入し、その後に続いて４００秒の解離ステップを行った。各サイクルの後（すなわち、新たなナノボディ捕捉および血液試料注入ステップの前）、４５μｌ／分で２分間のＨＣｌ（１００ｍＭ）注入でＨＳＡ表面を再生させた。センサーグラムの加工およびデータ解析は、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ３．１．０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して実施した。１）ナノボディ−ＨＳＡ解離および２）ＨＳＡのみを含有する参照リガンドレーンへの非特異的結合を差し引くことによる二重参照の後に、先在抗体の結合を示すセンサーグラムを得た。先在抗体の結合レベルは、レポート時を１２５秒（会合終了の５秒後）に設定することにより決定した。参照として、先在抗体を含有する試料はまた、これらの先在抗体（Ｔ０１３７００１１２）の結合を低減させるために改変されていない三価のナノボディの結合についても試験した。

【0269】

実施例９：水素重水素交換質量分析による抗ｈＣＴＬＡ４ナノボディのエピトープマッピング
抗ｈＣＴＬＡ４ナノボディ、Ｆ０２３７００９１２との間の接触面を水素重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）の使用により決定した。ＨＤＸ−ＭＳはタンパク質のアミド骨格への重水素の取り込みを測定し、この取り込みの変化は水素の溶媒曝露の影響を受ける。抗原単独の試料とナノボディ結合試料とで重水素交換レベルの比較を行い、ナノボディと接触し得る抗原領域を同定した。

【0270】

ナノボディＦ０２３７００９１２により重水素化から最も強く保護されたヒトＣＴＬＡ４残基は、ＶＲＶＴＶＬ（配列番号１１０の残基３３−３８）、ＡＤＳＱＶＴＥＶＣ（配列番号１１０の残基４１−４９）およびＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧ（配列番号１１０の残基９３−１０６）であった。Ｆ０２３７００９１２のＣＴＬＡ４への結合を実証するヒートマップが図１３に示される。

【0271】

表Ｆ．アミノ酸配列（配列番号１１０）

【表22】

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図2-5】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図7G】

【図7H】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図9F】

【図9G】

【図9H】

【図9I】

【図9J】

【図9K】

【図9L】

【図9M】

【図9N】

【図9O】

【図9P】

【図9Q】

【図9R】

【図9S】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]