特許 6768895 肺に対する特異性を有する新たなペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6768895

(24)【登録日】2020年9月25日

(45)【発行日】2020年10月14日

(54)【発明の名称】肺に対する特異性を有する新たなペプチド

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/015 20060101AFI20201005BHJP

   C12N 15/35 20060101ALI20201005BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20201005BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20201005BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20201005BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/015ZNA

   C12N15/35

   C12N15/63 Z

   C12N15/864 100Z

   A61K35/76

【請求項の数】2

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2019-132864(P2019-132864)

(22)【出願日】2019年7月18日

(62)【分割の表示】特願2016-532677(P2016-532677)の分割

【原出願日】2014年8月6日

(65)【公開番号】特開2019-214579(P2019-214579A)

(43)【公開日】2019年12月19日

【審査請求日】2019年8月19日

(31)【優先権主張番号】102013215817.3

(32)【優先日】2013年8月9日

(33)【優先権主張国】DE

(73)【特許権者】

【識別番号】503385923

【氏名又は名称】ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】100124431

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 順也

(74)【代理人】

【識別番号】100174160

【弁理士】

【氏名又は名称】水谷 馨也

(74)【代理人】

【識別番号】100175651

【弁理士】

【氏名又は名称】迫田 恭子

(72)【発明者】

【氏名】トレペル マーティン

(72)【発明者】

【氏名】ケーベリン ヤーコブ

(72)【発明者】

【氏名】ミシェルフェルダー シュテファン

【審査官】 平林 由利子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００４／０８３４４１（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 DATABASE UniProtKB/Swiss-Prot, Accession No. Q47W67, Definition:Full=Sugar fermentation stimulation

【文献】 PLoS ONE, 2011, Vol. 6, No. 8, e23101

【文献】 Gene Therapy, 2010, Vol. 17, pp. 980-990

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ

Ａ６１Ｋ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

カプシド及びその中にパッケージングされた導入遺伝子を含む組み換えウイルスベクターであって、前記カプシドが配列番号９のアミノ酸配列を含む少なくとも１つのカプシドタンパク質を含む、前記組み換えウイルスベクター。

【請求項2】

請求項１に記載の組み換えウイルスベクターを含む、薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、肺内皮の細胞に特異的に結合するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に関する。このペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、ウイルスカプシドの構成要素であり得、対象への全身投与後に、組み換えウイルスベクターを肺内皮組織に選択的に導き、かつそこでの１つ以上の導入遺伝子の組織特異的発現を確実にするために使用され得る。したがって、本発明は更に、本発明に従うペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含むカプシドを含み、カプシド中にパッケージングされた少なくとも１つの導入遺伝子を含む組み換えウイルスベクター、好ましくはＡＡＶベクターに関する。このウイルスベクターは、肺障害または肺疾患の治療的処置に特に好適である。本発明は更に、本発明に従うウイルスベクターを含む細胞及び薬学的組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

肺高血圧症は、治療されない場合は通常死につながる、深刻な慢性肺疾患である。この用語は、肺脈管構造における構造変化を特徴とし、かつ肺動脈系の血圧が２５ｍｍＨｇ超まで増加する、様々な原因の疾患に適用される［１］。これは、通常、罹患した患者において、ストレス依存性の息切れ及び全般的な能力喪失をもたらす。疾患が悪化すると、形質転換（リモデリング）から生じる血管の狭小化、ならびに血管壁の３つのすべての層、すなわち内膜、中膜、及び外膜の肥厚化が引き起こされる［２］。これは、しばしば、安静時呼吸困難、包括的呼吸不全、及び右心不全を伴ううっ血症候群をもたらし、長期的には心不全をもたらす。肺動脈性肺高血圧症は、診断からの生存期間中央値がわずか約３年である［３］肺高血圧症の特に重度の形態であり、初期には軽度の症状のため、しばしば診断が遅れてしまう。

【0003】

肺高血圧症の機序の調査及び前臨床の治療研究のために、異なる疾患特性を機能させるいくつかの動物モデルが利用可能である。これらは、誘導型モデル（例えば、ハイポキシア、モノクロタリン、または抗原）及び遺伝子導入モデルの両方を含み、好適なモデルの選択は、検査される研究問題に依存する［４］。

【0004】

現在までに、肺動脈性肺高血圧症の様々な形態の可能性のある原因がすべて説明されているわけではない。それにもかかわらず、いくつかの既知の治療的に関連性のある要因が存在する。例えば、特発性肺動脈性肺高血圧症の場合、血管収縮因子の増加した放出が議論される［５〜７］一方で、家族性肺動脈性肺高血圧症の多くの場合、ＢＭＰＲ２［８］またはアクチビン受容体様キナーゼ１（ＡＬＫ１）遺伝子［９］の変異が考えられ得る原因と見なされている。

【0005】

肺高血圧症または肺動脈性肺高血圧症の治療のための新たな治療的選択肢の開発が緊急に必要とされている。そのような開発は、肺組織への、より具体的には、肺内皮への治療的遺伝子の導入であり得る。肺内皮への特異的かつ効率的な遺伝子導入を可能にするベクターは、先行技術において未だに説明されていない。ウイルスベクターを使用する遺伝子治療は、従来の治療に対して全くまたは適切に応答しない疾患にとって有望な治療選択肢である。このアプローチは、ウイルスがそれらのゲノム中に対応する遺伝子の配列を有するような様式で修飾されたウイルスの手段による、治療される生物への治療的遺伝子の導入に基づく。遺伝子治療アプローチの遺伝子治療レジメンにおいて既に使用されているウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスに基づく。

【0006】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、それらが比較的安全であると分類されているため、臨床診療における使用のための有望な候補である。ＡＡＶベクターは、組織に導入遺伝子を導入し、組織内で遺伝子を安定的にかつ効率的に発現することができる。同時に、これらのベクターは、既知の発症機序を有さない［１０］。臨床使用にとって特に重要なのは、特に良く調査されていると考えられる血清型２のＡＡＶベクター（ＡＡＶ２）である。ＡＡＶベクターが導入された後、導入遺伝子は、異なる形態で、例えばエピソーム、一本鎖、または二本鎖ＤＮＡとして、形質移入された細胞に組み込まれ得る。ＤＮＡのコンカテマー形態もまた、形質導入された細胞において実証されている。

【0007】

ＡＡＶ２のゲノムは、約４７００ヌクレオチド長の直鎖、一本鎖ＤＮＡ分子によって形成され、両端に末端逆位配列（ＩＴＲ）を有する。ゲノムはまた、複製領域（ｒｅｐ）及びカプシド領域（ｃａｐ）と呼ばれる２つの大きい読み取り枠を含む。複製領域は、ウイルス複製の一部として必要とされるタンパク質をコードする。しかしながら、カプシド領域は、ウイルスの正二十面体カプシドを構成する、構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。

【0008】

しかしながら、遺伝子治療用途を有し、先行技術において既知であるほとんどのベクターのように、上述のＡＡＶ２ベクターなどの野生型ＡＡＶベクターは、特定の組織に対する十分な特異性を持たず、多種多様な細胞型を感染させる。したがって、野生型ベクターの全身投与は肺組織の不十分な形質導入をもたらし、他の組織の望まれない形質導入のため、治療対象における重度の免疫反応が予想される。特定の器官に対する増加した特異性を有するウイルスベクターの開発における進展は、ベクターを特定の器官に方向付けることができるペプチドリガンドの使用によって過去になされている［１１〜１２］。ある特定のペプチドリガンドが、脳などの様々な器官に対する「ホーミング」をもたらすことが示されている。

【0009】

文献［１３］は、無作為化ペプチドライブラリにおけるＡＡＶ２の向性修飾カプシドの選別を可能にする方法を説明する。これらのライブラリから、インビトロで所望の細胞型を特異的に形質導入するベクターが単離され得る。しかしながら、驚くべきことに、この様式で選択されるカプシドは、それらが動物モデルにおいて必要な特異性を欠くために、しばしばインビボでの使用には好適ではないことが見出されている［１４］。

【0010】

ウイルスベクターの向性を調節することができ、ひいては適切な細胞または組織特異性を確実にして、肺へのウイルスベクターの標的化された送達を可能にする薬剤が依然として大いに必要とされている。そのようなベクターは、肺の疾患及び／または障害の対応する有効な治療のために、肺組織における治療的遺伝子の特異的発現を可能にする。

【0011】

本発明は、肺への標的化された遺伝子導入のために利用可能なウイルスベクターを作製する。本発明に従うウイルスベクターは、それらのカプシド表面上に、肺の内皮組織上の受容体によってインビボで特異的に認識される、以前に未知のアミノ酸配列を発現する。したがって、本発明のウイルスベクターは、患者への全身投与後、患者の肺組織を特異的に形質導入する。

【0012】

本発明に従うウイルスベクターはまた、軽度の免疫反応しか有さない、肺の内皮細胞における導入遺伝子の強力かつ持続性の発現を可能にするため、ある特定の肺障害及び／または肺疾患の遺伝子治療処置に特に好適である。形質移入後、ＡＡＶベクターは、宿生において軽度の免疫反応しか引き起こさず、したがって、遺伝子治療に特に好適である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明において、無作為化ＡＡＶ２七量体ペプチドライブラリにおける選択によって様々な肺特異的配列が特定された。特定されたペプチド配列ＥＳＧＨＧＹＦ（配列番号２）から開始して、ペプチド配列ＥＳＧＨＧＹＦがカプシドタンパク質ＶＰ１の部分配列として発現される、組み換えウイルスベクターｒＡＡＶ２−ＥＳＧＨＧＹＦが調製された。続いて、ベクターｒＡＡＶ２−ＥＳＧＨＧＹＦがマウスに対して静脈内投与され、肺内皮組織に対するベクターの特有の特異性がインビトロ及びインビボの両方で観察された。特異性は、以下の実施例に記載するように、ＣＤ３１で染色することによって実証された。更に、ペプチドのＮ末端でアミノ酸グルタミン酸（Ｅ）とセリン（Ｓ）を置換することによって、アラニンスキャンを使用して、これらの２つのアミノ酸が形質導入の特異性に関連性がないことを示すことが可能であった。したがって、コア構造ＧＨＧＹＦ（配列番号１）のみが、肺特異性に関与する。

【0014】

したがって、本発明は、ウイルスベクターなどの治療的薬剤を治療される対象の肺に方向付けるのに特に適した様々な肺特異的ペプチド配列を提供する。

【0015】

したがって、本発明の第一の態様は、肺内の内皮細胞に特異的に結合するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に関し、このペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。このペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列、または２つのＮ末端アミノ酸のうちの少なくとも１つの修飾によって配列番号２のアミノ酸配列と異なる、配列番号２のアミノ酸配列の変異形を含む。本発明に従うペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、好ましくは、肺、特にヒトの肺の内皮細胞に結合する。

【0016】

別の態様において、本発明は、肺の内皮細胞に特異的に結合するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に関し、このペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のアミノ酸配列を含む。

【0017】

本開示の文脈において、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって互いに連結される、２〜１０個のアミノ酸の連鎖を指す。用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって互いに連結される、１１〜１００個のアミノ酸の連鎖を指す。１００個より多いアミノ酸を有するポリペプチドは、本明細書において「タンパク質」と称される。本発明に従う特に好ましい一実施形態において、本発明に従う配列番号１もしくは配列番号２の肺特異的ペプチド配列、または配列番号２の変異形は、ウイルスのカプシドタンパク質の一部である。これは、ウイルスのカプシドタンパク質の一部として肺特異的配列が存在することを意味する。そのようなカプシドタンパク質を産生するために、肺特異的ペプチドをコードする対応するヌクレオチド配列が、ウイルスのカプシドタンパク質をコードするウイルスゲノムの領域内にクローン化される。肺特異的配列がカプシドタンパク質の一部として発現される場合、それは、ウイルスベクターの表面にわたる多くのコピーにおいて示され得る。

【0018】

カプシドタンパク質は、好ましくは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するものである。ＡＡＶは、先行技術において説明される血清型のうちのいずれかであり得、カプシドタンパク質は、好ましくは血清型２、４、６、８、及び９のうちの１つのＡＡＶに由来する。血清型２のＡＡＶのカプシドタンパク質が特に好ましい。

【0019】

ＡＡＶ野生型のカプシドは、重複ｃａｐ領域によってコードされるカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３から構成される。３つのすべてのタンパク質は、同一のＣ末端領域を有する。ＡＡＶのカプシドは、１：１：８の比率で発現される、タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の６０個のコピーを含む。本明細書に記載される肺特異的ペプチドのうちの１つをコードするヌクレオチド配列が、Ｃ末端でＶＰ１の読み取り枠にクローン化される（すなわち、３つのすべてのタンパク質において同一である領域内で）場合、理論的には特異的ペプチドのうちの６０個がカプシド表面上に見出され得ることが予想さ
れ得る。

【0020】

本発明の文脈におけるＡＡＶベクターが修飾される場合、肺特異的ペプチドコードするヌクレオチド配列は、ゲノムの３′末端でｃａｐ領域にクローン化される。肺特異的ペプチド配列をコードする遺伝子は、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３のうちの１つのゲノム配列にクローン化され得る。ＡＡＶ２のカプシドタンパク質は、配列番号６（ＶＰ１）、配列番号７（ＶＰ２）、及び配列番号８（ＶＰ３）において例として説明される。

【0021】

本発明に従う特に好ましい一実施形態において、肺特異的ペプチド配列をコードする遺伝子は、ＶＰ１遺伝子、好ましくは配列番号６のＡＡＶ２のＶＰ１遺伝子の読み取り枠にクローン化される。この場合、クローン化された配列の挿入は、読み取り枠のいかなる変化にも、翻訳の中途での終了にもつながらないことが留意されるべきである。以上のために必要とされる方法は、当業者に容易に明らかである。

【0022】

ＡＶＶの３つのすべてのカプシドタンパク質において、ホーミング機能のためにペプチド配列に挿入され得る部位が特定されている［１５〜２０］。とりわけ、ＡＡＶ２のＶＰ１において位置５８８（Ｒ５８８）で発生するアルギニンは、ペプチドリガンドの挿入のために具体的に提案されている［２１〜２２］。ウイルスカプシドのこのアミノ酸位置は明らかに、ＡＡＶ２のその天然受容体に対する結合に関与する。Ｒ５８８は、ＡＡＶ２のその天然受容体に対する結合を媒介する４つのアルギニン残渣のうちの１つであることが示されている［２３〜２４］。カプシドのこの領域での修飾は、ＡＡＶ２の天然向性を弱めるか、またはそれを完全に除去する。

【0023】

したがって、本発明に従うと、配列番号１もしくは配列番号２の発明的肺特異的ペプチド配列（またはそれらの変異形）、または配列番号３、配列番号４、もしくは配列番号５の肺特異的ペプチド配列のうちの１つの発明的肺特異的ペプチド配列が、ＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質のアミノ酸５５０〜６００の領域において挿入された形態で、特に配列番号６のタンパク質で存在することが特に好ましい。更により好ましくは、肺特異的ペプチド配列は、ＶＰ１タンパク質のアミノ酸５６０〜６００、５７０〜６００、５６０〜５９０、５７０〜５９０の領域において挿入された形態で存在する。

【0024】

したがって、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列、またはそれらの変異形（または代替的には、配列番号３、配列番号４、もしくは配列番号５のペプチド配列）は、直後の例として、以下、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、または６００のＶＰ１タンパク質のアミノ酸のうちの１つ、特に配列番号６のタンパク質に隣接する。配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列またはその変異形（または代替的には、配列番号３、配列番号４、もしくは配列番号５のペプチド配列）が、実施例において示すように、配列番号６のＶＰ１タンパク質のアミノ酸５８８に続くことが特に好ましい。この場合、クローン化の結果である１個以上、及び特に最大５（例えば、１、２、３、４、または５）個のアミノ酸が、位置５８８のアルギニン残渣と、配列番号１もしくは配列番号２の第１のアミノ酸、または配列番号２の変異形との間に位置することが可能である。同様に、１個以上、及び特に最大５（すなわち、１、２、３、４、または５）個のアミノ酸が、配列番号１もしくは配列番号２の最後のアミノ酸、または配列番号２の変異形の後に位置し得る。

【0025】

ＶＰ１について上に示されるカプシドタンパク質のアミノ酸配列中の部位及び領域は、ＡＡＶ２のカプシドタンパク質ＶＰ２及びＶＰ３に類似して適用される。ＡＡＶ２の３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３は、Ｎ末端配列の長さによってのみ異なり、したがって同一のＣ末端を有するため、当業者は、問題なく配列比較をして、ＶＰ１及びＶＰ２のアミノ酸配列中において上に示されるペプチドリガンドの挿入のための部位を特定するであろう。したがって、ＶＰ１におけるアミノ酸５８８は、ＶＰ２の位置Ｒ４５１（配列番号７）及び／またはＶＰ３の位置Ｒ３８６（配列番号８）に対応する。

【0026】

配列番号９は、配列番号２のペプチド配列の導入後の、ＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質の配列の一例を示す。クローン化のため、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質の天然配列中で発生しない２つの追加のアミノ酸を有する。したがって、配列番号２のペプチド配列は、そのＮ末端で位置５８９でグリシンによって、及びそのＣ末端で位置５９７でアラニンによって隣接される。更に、天然配列の位置５８７のアスパラギンは、グルタミンで置換される。

【0027】

したがって、特定の一実施形態において、本発明はまた、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、または
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に定義されるアミノ酸配列のうちの１つの断片、を含むか、これらからなるカプシドタンパク質に関する。

【0028】

更なる一態様において、本発明は、肺の細胞に特異的に結合し、上述の配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２の変異形（または代替的には、配列番号３、配列番号４、もしくは配列番号５のペプチド配列）を有するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含むウイルスカプシドに向けられる。

【0029】

更に、本発明はまた、上述のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸を提供する。上述の本発明に従うペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含むカプシドタンパク質をコードする核酸が、同様に提供される。好ましくは、カプシドタンパク質をコードする核酸は、少なくとも８０％の配列同一性を有する、配列番号１０のヌクレオチド配列またはそれに由来するヌクレオチド配列を含む。そのような核酸を含むプラスミドがまた、提供される。

【0030】

更に別の態様において、本発明は、カプシド及びその中にパッケージングされた少なくとも１つの導入遺伝子を有する、組み換えウイルスベクター、すなわち、遺伝子操作技術の手段によって産生されたウイルスベクターに関し、カプシドは、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列、または２つのＮ末端アミノ酸のうちの少なくとも１つの修飾によって配列番号２のアミノ酸配列と異なる、配列番号２の変異形のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのカプシドタンパク質を含む。あるいは、カプシドタンパク質はまた、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のアミノ酸配列を含み得る。組み換えウイルスベクターは、例えば、血清型２、４、６、８、及び９の組み換えＡＡＶベクターであり得る。血清型２のＡＡＶベクターが特に好ましい。

【0031】

異なるＡＡＶ血清型は、主にそれらの天然向性によって異なる。したがって、野生型ＡＡＶ２は肺上皮細胞によりも肺胞細胞に容易に結合する一方で、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、及びＡＡＶ９は気道の上皮細胞のより大きい形質導入をすることができる。当業者は、細胞の特異性におけるこれらの天然の差を利用して、ある特定の細胞または組織について、本発明に従うペプチドによって媒介される特異性を更に増幅することができる。核酸レベルでは、様々なＡＡＶ血清型は高度に類似している。例えば、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、及びＡＡＶ６は、核酸レベルでは８２％同一である［２５］。本発明に従うウイルスベクターのカプシドは、１つ以上の導入遺伝子を含む。遺伝子操作によってベクターのゲノムに導入されている遺伝子は、導入遺伝子と呼ばれる。導入遺伝子（複数可）は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。好ましくは、それは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡなどの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）である。好ましくは、本発明に従う組み換えウイルスベクターの補助によって輸送されるべき導入遺伝子は、ヒト遺伝子である。好適な導入遺伝子は、例えば、患者における機能障害性遺伝子を置換するための治療的遺伝子を含む。それらはまた、対応する標的組織において発現されないか、または不十分な程度にしか発現されない遺伝子であり得る。好ましい一実施形態において、本発明に従うウイルスベクターから発現される導入遺伝子は、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）または骨形成タンパク質受容体２（ＢＭＰＲ２）をコードする遺伝子である。ＮＯＳの場合、内皮ＮＯＳ（ｅＮＯＳ）または誘導型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）がコードされ得る。ｅＮＯＳまたはｉＮＯＳをコードする遺伝子は、患者における肺障害または肺疾患、特に肺高血圧症または肺動脈性肺高血圧症の治療のために使用され得る。

【0032】

更なる一実施形態において、導入遺伝子は、放射線防護酵素などの放射線防護タンパク質をコードする。癌の治療における放射線治療の主要な制限は、放射線によって誘導される正常な組織に対する損傷であり、これは、放射線用量における減少、治療レジメンの中断、またはこの形態の治療の完全な断念をしばしば必要にする。肺は、治療的に特に関連性のある腫瘍増殖の部位であるが、同時に特に放射線感受性の器官であり、これが、そこにある原発腫瘍がしばしば制限された程度までしか放射線治療によって治療され得ず、びまん性腫瘍増殖が通常放射線治療によって全く治療され得ない理由である。本発明の肺特異的ベクターの援助によって、悪性組織の周りの健康な組織は、放射線防護タンパク質の標的化された発現によって保護され得る。好ましい一実施形態において、健康な肺組織に導入される導入遺伝子は、放射線誘導毒性における重大な因子のうちの１つであるスーパーオキシドアニオンの過酸化水素への転換を触媒する、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）である。本明細書で提案される更なる実施形態は、放射線によって引き起こされるＤＮＡ損傷の修復に寄与する、血管拡張性失調症変異（ＡＴＭ）遺伝子のキナーゼドメインに関与する。更に好ましい一実施形態において、両方の遺伝子は、現在説明するベクターの手段によって、治療を受ける患者に導入される。

【0033】

更なる一実施形態において、導入遺伝子は、ヒトα１アンチトリプシンをコードする。十分な量のα１アンチトリプシンの欠如は、肺気腫または硬変につながり得る遺伝性代謝疾患である、ローレルエリクソン（Ｌａｕｒｅｌｌ−Ｅｒｉｋｓｓｏｎ）症候群の原因である。α１アンチトリプシンは、血清中のプロテアーゼの活性の調整のために必要とされる。この阻害剤の欠如は、血清中の増加したタンパク質分解、ひいては上に挙げられる重度の続発症につながる。

【0034】

本発明のウイルスベクターは、肺の疾患の治療的処置のための方法における使用に特に好適である。本発明の文脈における肺障害は、特に、肺高血圧症などの肺のすべての種類の血管疾患、肺腫瘍、及びα１アンチトリプシン欠損症（Ａ１ＡＤ）などを含む。例えば、本発明に従うベクターを使用する治療に好適な肺腫瘍は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、扁平上皮細胞癌、腺癌、及び大細胞肺癌腫を含む。好ましい一実施形態において、本発明のウイルスベクターは、肺高血圧症または肺動脈性肺高血圧症の治療的処置のために使用される。

【0035】

更に別の実施形態において、導入遺伝子は、患者の肺組織に選択的に輸送されることが意図される、腫瘍抑制タンパク質などの抗腫瘍薬剤、または（インターロイキン１〜４、γインターフェロン、ｐ５３などの）サイトカインなどの免疫調節剤をコードする。

【0036】

ベクターはまた、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムなどを肺の内皮組織に輸送するために使用され得る。更に、本発明に従うベクターはまた、血流中の全身投与を意図される分泌タンパク質をコードする導入遺伝子を含み得る。そのような分泌タンパク質は、心血管系の一部である肺毛細血管床を介して、血流中に効率的に堆積し得る。

【0037】

本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ＡＡＶベクターによって感染させられ得る、任意のヒトまたは動物生物を示す。好ましくは、治療される対象は、ヒト、霊長動物、マウス、またはラットなどの哺乳動物である。好ましい一実施形態において、治療されるべき対象はヒトである。対象への形質移入後、ベクターは、肺内皮の細胞内で導入遺伝子の部位特異的発現をもたらす。

【0038】

導入遺伝子は、発現されるべき導入遺伝子の配列に加えて、適切な細胞の感染後に導入遺伝子の発現を制御する好適なプロモーターなどの、発現に必要な更なる要素を含むウイルスベクター中に、発現カセットの形態で存在し得る。好適なプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたはニワトリβアクチン／サイトメガロウイルスハイブリッドプロモーター（ＣＡＧ）などのＡＡＶプロモーターに加えて、ＶＥカドヘリンプロモーター、ステロイドプロモーター、及びメタロチオネインプロモーターなどの内皮細胞特異的プロモーターを含む。特に好ましい一実施形態において、本発明に従う導入遺伝子は、発現されるべき導入遺伝子に対する機能的結合によって連結される肺内皮特異的プロモーターを含む。このようにして、本発明に従うベクターの特異性は、肺内皮細胞のために更に増加され得る。本明細書で使用される場合、肺内皮特異的プロモーターは、肺内皮細胞内での活性が、肺内皮細胞ではない細胞内でよりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高いプロモーターである。好ましくは、このプロモーターはヒトプロモーターである。発現カセットはまた、発現されるべき外因性タンパク質の発現レベルを増加させるためのエンハンサー要素を含み得る。更に、発現カセットは、ＳＶ４０ポリアデニル化配列またはウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列などのポリアデニル化配列を含み得る。

【0039】

本発明に従うウイルスベクターは、好ましくは、それらのカプシドタンパク質のうちの１つの一部として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５のアミノ酸配列を含み得る。あるいは、配列番号２のアミノ酸配列の変異形が使用され得、それは、２つのＮ末端アミノ酸のうちの少なくとも１つの修飾によって配列番号２のアミノ酸配列と異なる。変異形が、カプシドの一部として、肺の内皮細胞の受容体構造に対するベクターの特異的結合を通信する能力を保持する限り、修飾は、アミノ酸の置換、欠失、または挿入であり得る。したがって、本発明はまた、配列番号２の２つのＮ末端アミノ酸のうちの１つが変更されている、配列番号２の配列の変異形に及ぶ。したがって、本発明の範囲内にあるこれらの変異形は、配列がＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴを使用して比較されるとき、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して８５％を超える配列同一性を有する。アミノ酸配列同一性を決定するためのこれらのコンピュータプログラムは、当該技術分野において十分に既知である。

【0040】

配列番号２の配列の変異形は、Ｎ末端アミノ酸のうちの１つまたは２つの置換に基づき得、つまり、１つまたは両方のＮ末端アミノ酸が別のアミノ酸と置換され得る。好ましくは、それにより配列番号２におけるアミノ酸配列の変異形が異なる置換は、保存的置換、すなわち、ペプチドに類似した機能的特性を与える類似した極性アミノ酸によるアミノ酸の置換である。好ましくは、置換されたアミノ酸は、置換されるアミノ酸と同一のアミノ酸の群に由来する。例えば、疎水性残渣は別の疎水性残渣と置換され得、極性残渣は別の極性残渣と置換され得る。保存的置換によって互いに交換され得る機能的に類似したアミノ酸は、例えば、グリシン、バリン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、及びトリプトファンなどの非極性アミノ酸を含む。無電荷の極性アミノ酸の例は、セリン、スレオニン、グルタミン、アスパラギン、チロシン、及びシステインである。荷電極性（酸性）アミノ酸の例は、ヒスチジン、アルギニン、及びリジンを含む。荷電極性（塩基性）アミノ酸の例は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。

【0041】

アミノ酸が配列番号２の２つのＮ末端アミノ酸の領域に挿入されているこれらのアミノ酸配列も、配列番号２に示されるアミノ酸配列の変異形と考えられる。そのような挿入は、結果として生じる変異形が肺の内皮細胞に特異的に結合するその能力を保持する限り、原理として実行され得る。更に、本文脈において、配列番号２の２つのＮ末端アミノ酸のうちの１つが欠損しているこれらのタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の変異形であると考えられる。これは、代わりに、対応して欠失している変異形が肺の内皮細胞に特異的に結合することを必要とする。

【0042】

本発明によって網羅されるのはまた、例として、修飾アミノ酸を導入することによって、１つまたは両方のＮ末端アミノ酸で構造的に修飾される、配列番号２に示されるアミノ酸配列の肺内皮特異的変異形である。本発明によると、これらの修飾アミノ酸は、ビオチン化、リン酸化、グリコシル化、アセチル化、分枝、及び／または環化によって修飾されているアミノ酸であり得る。

【0043】

本発明に従うペプチド配列のうちの１つを含むか、または上で定義されるその変異形を含むカプシドを有するウイルスベクターは、肺の内皮細胞に特異的に結合する。本明細書で使用される場合、本発明に従うベクターの「特異的」結合は、全身投与後に主に肺の内皮細胞上または細胞内にベクターが蓄積することを意味する。これは、最初に投与されたベクターゲノムのうちの５０％超が肺の内皮細胞内または内皮細胞の区域内に蓄積する一方で、５０％未満が他の細胞または組織内（脾臓もしくは肝臓内など）またはその区域内に蓄積することを意味する。最初に投与されたベクターゲノムのうちの６０％、７０％、８０％、９０％、９５％超、または９９％超さえもが、肺の内皮細胞内またはその領域内に蓄積することが好ましい。ベクターの特異的結合はまた、導入遺伝子の発現を介して決定され得る。肺の内皮細胞に特異的に結合するウイルスベクターの場合、導入遺伝子の全発現の５０％超が肺の内皮細胞内またはその領域内で発生する一方で、発現の５０％未満が他の組織内またはその領域内で観察され得る。しかしながら、導入遺伝子の測定される全発現のうちの６０％、７０％、８０％、９０％、９５％超、または９９％超さえもが、肺の内皮細胞内またはその領域内で発生することが好ましい。

【0044】

当業者は、本発明に従うベクターの肺の内皮細胞に対する特異的結合、及びそのベクターを使用して導入される導入遺伝子の発現を決定することができるであろう。この目的に好適な形質導入及び発現の特異性を測定する方法を、以下の実施例に示す。

【0045】

本発明によると、そのカプシドが配列番号２に示されるアミノ酸配列の変異形を含むベクターが、対応するウイルスベクターの、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するカプシドとの結合活性の、少なくとも約５０％の結合活性を有することもまた好ましい。変異形が、そのカプシドが配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する対応するウイルスベクターの結合活性の、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の結合活性を有することが更により好ましい。ベクターの結合活性は、含まれる実施例に記載されるインビトロアッセイの補助によって測定され得る。

【0046】

好ましくは、ベクターゲノムの分布または導入遺伝子の発現によって決定され得るような、肺の内皮細胞の本発明に従うベクターの結合活性は、肺内皮細胞ではない対照細胞（脾臓細胞または肝細胞など）の結合活性よりも、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、または１０，０００倍高い。

【0047】

本発明はまた、本発明に従うペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含む細胞、それをコードする核酸、そのような核酸を含むプラスミド、または上述の組み換えＡＡＶベクターに関する。それは、好ましくはヒト細胞または細胞株である。

【0048】

一実施形態において、細胞は、例えば、ヒト対象から生検によって得られ、その後エキソビボ手順においてウイルスベクターを形質移入されている。その後、細胞は対象内に再埋入されても、または他の方法で、例えば、移植もしくは輸注によって対象に供給されてもよい。移植された細胞の拒絶の可能性は、細胞が由来する対象が、細胞が投与される対象に遺伝子的に類似しているときに、より低い。したがって、好ましくは、形質移入された細胞が供給される対象は、細胞が以前に得られた対象と同一の対象である。細胞は、好ましくはヒト肺細胞、特にヒト肺内皮の細胞である。形質移入されるべき細胞はまた、ヒト成体幹細胞などの幹細胞であり得る。本発明によると、形質移入されるべき細胞が、本発明に従うウイルスベクターによってエキソビボで形質移入されている自家細胞、例えば、上述の組み換えＡＡＶ２ベクターであることが特に好ましい。細胞は、好ましくは、対象における肺障害または肺疾患を治療するための方法において使用される。

【0049】

別の態様において、本発明は、カプシドタンパク質をコードするプラスミドが使用され、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列、またはその変異形を含む、ＡＡＶベクターを産生するための方法に関する。あるいは、ベクターはまた、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のアミノ酸配列を含み得る。発現されるべき導入遺伝子を含む組み換えＡＡＶベクターを産生する基本的な方法は、先行技術に十分に説明される［２８］。ＨＥＫ２９３−Ｔ細胞は、３つのプラスミドを形質移入される。第１のプラスミドは、ＡＡＶゲノムのｃａｐ及びｒｅｐ領域を含むが、天然に存在する逆方向反復（ＩＴＲ）は欠損している。このプラスミドのｃａｐ領域は、少なくとも１つの修飾カプシドタンパク質をコードする遺伝子、すなわち、本発明に従うペプチド配列を含む遺伝子を含む。第２のプラスミドは、パッケージング信号を構成する、対応するＩＴＲによって隣接される導入遺伝子発現カセットを含む。したがって、発現カセットは、ウイルス粒子の組み立ての過程でカプシド中にパッケージングされる。第３のプラスミドは、ＨＥＫ２９３−Ｔ細胞内でのＡＡＶ複製のために必要とされる、ヘルパータンパク質Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、及びＶＡがその上にコードされる、アデノウイルスヘルパープラスミドである。

【0050】

本発明に従う組み換えベクターの蓄積及び精製を可能にする条件は、当該技術分野において既知である。本発明に従うベクターは、例えば、ゲル濾過プロセス（例えば、Ｓｅｐｈａｒｐｓｅを使用）によって精製され、脱塩され、続いて濾液によって精製され得る。他の精製方法は、塩化セシウムまたはイオジキサノール勾配超遠心分離プロセスを更に含み得る。精製は、アデノ随伴ウイルスベクターが投与される対象における可能性のある有害な影響を減少させる。投与されるウイルスは、野生型ウイルス及び複製適格性ウイルスを実質的に含まない。ウイルスの純度は、ＰＣＲ増幅などの好適な方法によって確認され得る。
更なる一態様において、本発明は、本発明のウイルスベクター、特にＡＡＶベクターを含む薬学的組成物を提供する。この場合のウイルスベクターは、治療的に有効な量で、すなわち、治療される肺機能障害または肺疾患の少なくとも１つの症状を相当に改善するか、疾患の悪化を防ぐために十分な量で、患者に投与される。肺疾患に通常関連付けられる症状は、咳、発熱、胸痛、嗄声、及び呼吸困難を含む。治療的に有効な量の本発明に従うベクターは、言及した症状のうちの１つにおける正の変化、すなわち、罹患した対象の表現型が、肺疾患を患わない健康な対象の表現型に近づくことをもたらす変化を引き起こす。

【0051】

本発明の好ましい一実施形態において、ウイルスベクターの投与は、肺機能障害または肺疾患の完全な、または実質的に完全な治癒をもたらす量で発生する。したがって、薬学的組成物は、治療的に有効な用量の本発明に従うベクターを含む。治療的に有効な用量は、一般的に、治療を受ける対象にとって非毒性である。

【0052】

治療的効果を達成するために投与されなくてはならないウイルスベクターの正確な量は、いくつかのパラメータに依存する。投与されるべきウイルスベクターの量に関連性のある因子は、例えば、ウイルスベクターの投与の経路、肺疾患の性質及び重症度、治療される患者の疾患歴、ならびに治療される患者の年齢、体重、身長、及び健康である。更に、治療的効果を達成するために必要とされる導入遺伝子の発現レベル、患者の免疫反応、及び遺伝子産物の安定性は、投与される量と関連性がある。ウイルスベクターの治療的に有効な量は、一般的知識及び本開示に基づいて、当業者によって決定され得る。

【0053】

ウイルスベクターは、好ましくは１．０×１０¹⁰〜１．０×１０¹⁴ｖｇ／ｋｇ（１ｋｇの体重当たりのウイルスゲノム）の範囲で、ウイルスの用量に対応する量で投与されるものの、１．０×１０¹¹〜１．０×１０¹³ｖｇ／ｋｇの範囲がより好ましく、５．０×１０¹¹〜５．０×１０¹²ｖｇ／ｋｇの範囲が更により好ましく、及び１．０×１０¹²〜５．０×１０¹²の範囲が更により好ましい。約２．５×１０¹²ｖｇ／ｋｇのウイルス用量が最も好ましい。例えば、本発明に従うＡＡＶ２ベクターなどの投与されるべきウイルスベクターの量は、１つ以上の導入遺伝子の発現の強度に従って調整され得る。

【0054】

本発明に従う好ましいＡＡＶ２ベクターなどの本発明のウイルスベクターは、例えば、様々な投与の経路、例えば、カプセルまたは液体などでの経口投与のために製剤化され得る。しかしながら、ウイルスベクターは、好ましくは静脈内注入または静脈内輸注によって、非経口投与されることが好ましい。例えば、投与は、例えば、６０分以内、３０分以内、または１５分以内の静脈内輸注により得る。ウイルスベクターが、手術中の肺への注入によって局所投与されることが更に好ましい。注入及び／または輸注による投与に好適である組成物は、典型的に、溶液及び分散液、ならびに対応する溶液及び分散液が調製され得る粉末を含む。そのような組成物は、ウイルスベクター及び少なくとも１つの好適な薬学的に許容される担体を含む。静脈内投与に好適な薬学的に許容される担体は、静菌水、リンゲル溶液、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）を含む。注入及び／または輸注のための無菌組成物は、必要とされる量のウイルスベクターを適切な担体内に導入し、その後濾過により無菌化することによって調製され得る。注入または輸注による投与のための組成物は、それらの調製後、長期間にわたって保管条件下で安定したままであるべきである。組成物は、この目的のために保存剤を含有し得る。好適な保存剤は、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールを含む。対応する製剤及び好適なアジュバントの調製は、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，”Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）に説明される。

【0055】

更なる一態様において、本発明は肺障害または肺疾患の治療的処置のための方法に関し、本発明に従うウイルスベクター、好ましくは上述のＡＡＶベクターが対象に投与される。ベクターは、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列、または上述の配列番号２の変異形を有する、少なくとも１つのカプシドタンパク質を有するカプシドを含む。あるいは、ベクターはまた、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のアミノ酸配列を含み得る。ウイルスベクターは、肺障害または肺疾患の治療のために有用である導入遺伝子、例えば、治療的遺伝子を更に含む。好ましくは、例えば、静脈内注入または輸注などの全身投与による、治療される対象への投与後、ベクターは、肺の内皮細胞内で遺伝子の特異的発現をもたらす。

【図面の簡単な説明】

【0056】

【図1】本発明に従って使用されるＡＡＶペプチドライブラリのインビボでの選択方法を示す。

【図2】この選択方法の手段によって特定される肺特異的ペプチドの配列を示す。４回の選択後、４つの異なる配列の合計が特定される。

【図3】マウス器官ライセートにおける組み換えＡＡＶベクターの全身投与の１４日後の、ルシフェラーゼの発現の測定を示す。Ａ：野生型ＡＡＶ２ベクター（上部パネル）及び挿入対照ＡＡＶ２−ＣＶＧＳＰＣＧ（中部パネル）は、主に心臓特異的発現を誘導する。ＡＡＶ２−ＥＳＧＨＹＧＦ（下部パネル）は、同時に肺特異的であるルシフェラーゼの強力な発現を誘導する。Ｂ：心臓（上部パネル）、肝臓（中部パネル）、及び肺（下部パネル）における、野生型ＡＡＶ２、ＡＡＶ２−ＣＶＧＳＰＣＧ、及びＡＡＶ２−ＥＳＧＨＹＧＦベクターの発現レベルの比較。ＡＡＶ２−ＥＳＧＨＹＧＦは、心臓及び肝臓における大きく減弱した発現の誘導を有し、肺におけるルシフェラーゼの発現における有意な増加を有する。平均値を、それらの標準偏差とともに示す。一元配置分散分析。ｎ＝３について、ｐ＜０．０５＝＊、ｐ＜０．０１＝＊＊、ｐ＜０．００１＝＊＊＊。

【図4】組み換えＡＡＶ２−ＥＳＧＨＹＧＦベクターの全身投与後の、マウスにおける長期発現分析を示す。ＩＶＩＳ（登録商標）２００撮像システムを使用した反復測定は、１６８日間の期間にわたって、肺における安定した遺伝子発現を呈する（ｎ＝１）。

【図5】定量的リアルタイムＰＣＲによる、５×１０¹⁰ｇｐ／マウスの全身投与後の、組み換えＡＡＶベクターの分布を示す。Ａ：７つの異なる器官におけるベクター投与の４時間後の、ＡＡＶ２−ＥＳＧＨＹＧＦの分布。Ｂ：野生型ＡＡＶ２ベクター（上部パネル）、対照ベクターＡＡＶ２−ＣＶＧＳＰＣＧ（中部パネル）、及びＡＡＶ２−ＥＳＧＨＹＧＦ（下部パネル）によって提供されるゲノムの分布。対照ベクター及び野生型ベクターは、肝臓及び脾臓の網内皮系内で蓄積する。ＡＡＶ２−ＥＳＧＨＹＧＦは、もっぱら肺内のみに蓄積する。Ｂ：肝臓（上部パネル）、脾臓（下部パネル）、及び肺（下部パネル）における、野生型ＡＡＶ２、対照ベクターＡＡＶ２−ＣＶＧＳＰＣＧ、及びＡＡＶ２−ＥＳＧＨＹＧＦの分布の比較。平均値を、それらの標準偏差とともに示す。一元配置分散分析。ｎ＝３について、ｐ＜０．０５＝＊、ｐ＜０．０１＝＊＊、ｐ＜０．００１＝＊＊＊。

【実施例】

【0057】

すべてのデータを、平均値±標準偏差（ＳＤ）として決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ３．０ ｐｒｏｇｒａｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を使用して、統計分析を実行した。一元配置分散分析によって、その後ボンフェローニによる複数比較試験によってデータを分析した。Ｐ値＞０．０５を有意であると見なした。

【0058】

実施例１：ＡＡＶ２ペプチドライブラリの選択
組織特異的ＡＡＶ２カプシドの選択のために、無作為表示ペプチドライブラリを調製し、４回選択した。以前に説明された２段階プロトコル［２６〜２７］を使用して、個々にクローンを発生する、１×１０⁸個の理論上の多様性を有する無作為Ｘ₇−ＡＡＶペプチドライブラリを調製した。ＶＰ１におけるアミノ酸位置Ｒ５８８に対応する、ＡＡＶゲノムにおけるヌクレオチド位置３９６７で７つの無作為化アミノ酸をコードする縮重オリゴヌクレオチドを、最初に産生した。オリゴヌクレオチドは、配列５′−ＣＡＧＴＣＧＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣ（ＮＮＫ）₇ＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＴＧＡＣＧＡＧ−３′（配列番号
１１）を有した。Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び配列５′−ＣＴＣＧＴＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＧ−３′（配列番号１２）を有するプライマーを使用して、第２の鎖を産生した。二本鎖挿入断片をＢｇｌＩで切断し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製し、ＳｆｉＩ消化ライブラリプラスミドｐＭＴ１８７−０−３でライブラリに結紮した［２６］。寒天を含有する１５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリン上、代表的な一定分量の、形質転換した電気適格性ＤＨ５αバクテリアから増殖したクローンの数によって、プラスミドライブラリの多様性を決定した。ライブラリプラスミドを収集し、ＱｉａｇｅｎからのＰｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製した。１０枚の細胞培養皿（１５ｃｍ）中の２×１０⁸個の２９３Ｔ細胞に
、プラスミドｐＶＰ３ｃｍ（末端逆位配列を有さない修飾コドンの使用を有する野生型ｃａｐ遺伝子を含有）［２７］、ライブラリプラスミド、及びｐＸＸ６ヘルパープラスミド［２８］を形質移入することによって、ＡＡＶライブラリゲノムをキメラ野生型及びライブラリＡＡＶカプシド（ＡＡＶ導入シャトル）内にパッケージングし、プラスミド間の比率は１：１：２であった。結果として生じるＡＡＶライブラリ導入シャトルを使用して、細胞培養皿（１５ｃｍ）中の２×１０⁸個の２９３Ｔ細胞を、１つの細胞当たり０．５複
製単位の感染効率で感染させた。細胞を、５プラーク形成単位（ｐｆｕ／細胞）の感染効率で、Ａｄ５（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ ｄｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅ Ｇeｎｉｑｕｅ，Ｆ
ｒａｎｃｅによる提供）で重感染させた。４８時間後に、上清から最終ＡＡＶ表示ライブラリを収集した。ＶｉｖａＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｖｉｖａ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して上清を濃縮し、以前に説明されたイオジキサノール密度勾配超遠心分離［２９］によって精製し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、ｃａｐ特異的プライマー５′− ＧＣＡＧＴＡＴＧＧＴＴＣＴＧＴＡＴＣＴＡＣＣＡＡＣＣ−３′（配列番号１３）及び５′−ＧＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＧＣＣＴＴＧＴＧＴＧ−３′（配列番号１４）を使用するリアルタイムＰＣＲによって滴定した。

【0059】

インビボでのバイオパニングのために、ゲノムライブラリの１×１０¹¹個の粒子をＦＶＢ／Ｎマウスの尾静脈中に注入した。粒子に８日間を与え、標的細胞を分布及び感染させた。８日後、マウスを死滅させ、肺を取り除いた。ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、組織の全ＤＮＡを抽出した。第１のＰＣＲについてプライマー５′−ＡＴＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＴＧ−３′（配列番号１５）及び５′−ＣＧＴＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＧＴＧＡＴＧＡＡＧ−３′（配列番号１６）を使用し、第２のＰＣＲについてプライマー５′−ＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＡＧＣＡＡＧ−３′（配列番号１７）及び５−ＴＧＡＴＧＡＧＡＡＴＣＴＧＴＧＧＡＧＧＡＧ−３′（配列番号１８）を使用するネステッドＰＣＲによって、ライブラリのＡＡＶ粒子中に含まれ、対象の組織内に蓄積していた無作為オリゴヌクレオチドを増幅した。ＰＣＲ増幅オリゴヌクレオチドを使用して、更に３回の選択のために二次ライブラリを調製した。一次ライブラリ（上記を参照されたい）と同様に、しかし導入シャトルを産生する追加のステップなしで、二次ライブラリを生成した。二次プラスミドライブラリを使用して、形質移入試薬Ｐｏｌｙｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した細胞培養皿（１５ｃｍ）中の２×１０⁸個の２９３Ｔ細胞を、１個の細胞当たり２５個のライブラリプラスミドの比率で形
質移入した。各回の選択後、いくつかのクローンが配列決定された。適用された選択方法を、図１に示す。

【0060】

結果：４回の選択後、合計９個のクローンが配列決定された。配列決定は、５個のクローンがペプチド配列ＥＳＧＨＧＹＦ（配列番号２）を有することを明らかにした。他のクローンは、ペプチド配列ＡＤＧＶＭＷＬ（配列番号３）、ＧＥＶＹＶＳＦ（配列番号４）、及びＮＮＶＲＴＳＥ（配列番号５）を示した。優性クローンＥＳＧＨＧＹＦ、ならびにＡＤＧＶＭＷＬ及びＧＥＶＹＶＳＦを含む４つのペプチド配列のうちの３つが、少なくとも１つの疎水性芳香族基を示した。様々な回の選択で得られたペプチドを、図２に示す。

【0061】

実施例２：組み換えＡＡＶベクターの調製及び定量化
実施例１で濃縮されたクローンを組み換えＡＡＶベクターとして産生し、それらの形質導入プロファイルについて試験した。組み換えＡＡＶベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の三重形質移入によって産生した。１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％のウシ胎仔血清を補った、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）中、３７℃、５％のＣＯ₂で
細胞をインキュベートした。形質移入薬剤Ｐｏｌｙｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、プラスミドＤＮＡを２９３Ｔ細胞内に形質移入した。形質移入の４日後、細胞を収集し、溶解させ、以前に説明されたイオジキサノール密度勾配超遠心分離の手段［２９］によってベクターを精製した。形質移入のために、ルシフェラーゼ遺伝子ｐＵＦ２−ＣＭＶ−ｌｕｃ［２７］またはＧＦＰ遺伝子ｐＴＲ−ＣＭＶ−ＧＦＰ［３０］をコードするアデノウイルスヘルパープラスミドとしてｐＸＸ６を使用し、対象のＡＡＶカプシドをコードするプラスミドもまた使用した［２８］。ＡＡＶライブラリから既に選択されているＡＡＶカプシド変異体をコードするプラスミド、及び野生型対照は、修飾ｐＸＸ２−１８７［３１］またはｐＸＸ２［２８］であった。更に、アラニンスキャニングのために、ペプチドＥＳＧＨＧＹＦの修飾変異形をコードする、更なるオリゴヌクレオチド挿入断片を作製した。記載するように、挿入断片をライブラリ挿入断片に処理した（上記を参照されたい）。組み換えベクターを定量化するために、以前に説明されたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒシステム［３２］によって、ＣＭＶ特異的プライマー５′−ＧＧＣＧＧＡＧＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＡＴ−３′（配列番号１９）及び５′−ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡ−３′（配列番号２０）を使用するリアルタイムＰＣＲによって、ゲノム力価を決定した。

【0062】

実施例３：インビボでの組み換えＡＡＶベクターの向性の検査
インビボでの濃縮ペプチドの向性の検査を可能にするために、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む組み換えベクターのカプシド中にペプチドを導入した。変異カプシドを有するベクターを、対照ベクターとともにマウスに注入した。５×１０¹⁰個のベクターゲノム（ｖｇ）／マウス（１つの注入されたＡＡＶクローン当たり、ｎ＝３匹の動物）の用量で、ＡＡＶベクターを静脈内投与した。１４日目に、イソフルランで動物を麻酔した。１匹のマウス当たり２００μｌのルシフェリン基質（１５０ｍｇ／ｋｇ、Ｘｅｎｏｇｅｎ）の腹腔内注入に続いて、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ４．０（Ｃａｌｉｐｅｒ）ソフトウェアを備えるＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ２００撮像システム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＵＳＡ）を使用して、ルシフェラーゼ発現を分析した。相対光単位（光子／秒／ｃｍ２）における発光が最高の強度に達するとき、異なる位置（腹側、背側、外側）での導入遺伝子の発現の、代表的なインビボ生物発光画像を撮影した。その後、動物を屠殺し、対象の器官を素早く取り除き、各器官内の導入遺伝子の発現の画像を直ちに撮影した。その後、器官を液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保管した。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ４ソフトウェアのＤＬＩＴ選択肢を使用することによって、インビボ発光画像の３次元再構築を得、発光された光を、５６０〜６４０ｎｍの５つの異なる波長においてそれぞれ３分間ずつ測定した。ルシフェラーゼ発現を定量化するために、器官をレポーター溶解緩衝液（ＲＬＢ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）中でホモジナイズした。１００μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬（ＬＡＲ，Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加後、ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の決定を、ルミノメーター（Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９ ４０，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂａｄ Ｗｉｌｄｂａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において、１０秒間隔、各測定間に２秒間の遅延で実行した。Ｒｏｔｉ ＮａｎｏＱｕａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、タンパク質の全量に関して各試料において値を正規化した。

【0063】

結果：ルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する組み換えベクターのベクター力価に関する収率は、野生型ＡＡＶ２カプシドを担持するベクターに匹敵することが見出され、これは、濃縮ペプチドが、カプシド組み立てまたは遺伝子のパッケージングに悪影響を与えないことを示した。１４日後の生物発光のインビボでの測定は、ペプチドＥＳＧＨＧＹＦが、導入遺伝子の強力かつ肺特異的な発現（≦１０⁵ｐ／秒／ｃｍ²／ｒ）をもたらすことを示した。これらの結果は、外植された器官によってエキソビボで実行した対照実験によって確認された。未選択のライブラリ（ＣＶＧＳＰＣＧ）の無作為に選択された対照クローンは、肺においてではなく、主に心臓において、及び腹部のいくつかの部分において発生する、弱い遺伝子発現をもたらした。野生型ＡＡＶ２は、肺においてではなく、心臓、肝臓、及び骨格筋における弱い遺伝子発現を引き起こした。生物発光画像の３次元再構築は、肺特異的発現を確認した。ペプチドＡＤＧＶＭＷＬ（配列番号３）もインビボでの選択中に濃縮されたものであるが、これも同様に導入遺伝子の肺特異的発現をもたらしたが、ペプチドＥＳＧＨＧＹＦよりも弱かった。ＡＤＧＶＭＷＬルシフェラーゼベクターの投与の１４日以内の遺伝子発現は非常に低かったものの、それは、約５×１０⁴ｐ／秒／ｃ
ｍ²／ｒに増加し、ベクター注入の２８日後に肺において特異的に観察することができた
。これらの結果は、外植された器官によってエキソビボで実行した対照実験によって確認された。代表的な器官からの組織可溶化液のルシフェラーゼ活性の調査は、野生型ＡＡＶ２が心臓において低い遺伝子発現（２．９×１０⁴ＲＬＵ／ｍｇのタンパク質、図３Ａ上
部パネルを参照されたい）、及び他の器官においてはより低いレベルの発現を引き起こすことを示した。対照ペプチドＣＶＳＧＰＣＧは、心臓において中程度の遺伝子発現（８．７×１０⁴ＲＬＵ／ｍｇのタンパク質、図３Ａ中部パネルを参照されたい）を産生した。
対照的に、肺特異的ＥＳＧＨＧＹＦカプシドを有するベクターは、肺における強力かつ特異的な遺伝子発現（４．１×１０⁵ＲＬＵ／ｍｇのタンパク質、図３Ａ下部パネルを参照
されたい）をもたらした。心臓及び肝臓において（すなわち、野生型ＡＡＶ２及びペプチドベクターＣＶＧＳＰＣＧが強力な発現をもたらす２つの器官において）、肺特異的ＥＳＧＨＧＹＦベクターは、およそバックグラウンド信号の発現（約１×１０³ＲＬＵ／ｍｇ
のタンパク質）のみを示した。対照的に、ＥＳＧＨＧＹＦベクターの肺における導入遺伝子の発現は、野生型ＡＡＶ２またはＣＶＧＳＰＣＧ対照ベクターによって媒介された発現よりも２００倍超高かった（図３Ｂを参照されたい）。

【0064】

結果は更に、ＥＳＧＨＧＹＦベクターによって媒介された導入遺伝子の肺特異的発現が、長期間にわたって器官特異的なままであることを示した。肺特異的ＡＡＶ２ ＥＳＧＨＧＹＦルシフェラーゼベクターの静脈内投与後、導入遺伝子の発現を１６４日間の期間にわたって測定した。肺領域において発光される放射線を、定量的に決定した。全期間にわたって、導入遺伝子の発現は高レベルで安定し、肺に限定されていた。肺における最も低い発現は７日目に測定され、ピークは４２日目に達せられ、放射線は１６４日目の最終測定までわずかにゆっくりと低下した（図４）。

【0065】

実施例４：ペプチドＥＳＧＨＧＹＦのアラニンスキャニング
肺特異性に関する、ペプチドＥＳＧＨＧＹＦにおける個々のアミノ酸の重要性を調査するために、アラニンスキャニングを実行した。

【0066】

結果：最初の２つのアミノ酸を置換することによって、肺特異的向性は変化しないことが見出された。しかしながら、アミノ酸３〜４または５〜７が交換されると、感染力の完全な喪失（位置３もしくは４）または心臓もしくは骨格筋への特異性の変化（位置５〜７）のいずれかが存在した。

【0067】

実施例５：ベクター分布の分析
静脈内注入されたＥＳＧＨＧＹＦベクターの導入遺伝子の肺特異的発現が、肺特異的ホーミングに基づくかどうかを確認するために、まず、５×１０¹⁰ｇｐ／マウスの静脈内投与の４時間後にベクターの分布を調査した。ベクターゲノムの定量化を、リアルタイムＰＣＲによって実行した。まず、組織ホモジナイザー（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ２４，Ｐｅｑｌａｂ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の説明書に従って使用して、５×１０¹⁰ｖｇ／マウスの静脈内投与後の様々な時点で、関係する器官から全ＤＮＡを抽出した。分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−２０００Ｃ，Ｐｅｑｌａｂ）を使用して、ＤＮＡを定量化した。前述のＣＭＶ特異的プライマーを使用する定量的リアルタイムＰＣＲによって、組織内のＡＡＶベクターＤＮＡの分析を実行し、４０ｎｇのテンプレートを使用し、全ＤＮＡに関して正規化した。

【0068】

結果：リアルタイムＰＣＲによるベクターゲノムの定量化は、ＥＳＧＨＧＹＦの肺特異的ホーミングを示した。肺において検出され得るベクターゲノムの量（３．８×１０⁵±
１．９×１０⁵ｖｇ／１００ｎｇの全ＤＮＡ）は、別の器官において実証されたベクター
ゲノムの量よりも約６〜１００倍高かった（図５Ａ）。ベクターホーミングと導入遺伝子の発現との間の直接の相関性を決定するために、５×１０¹⁰ｇｐ／マウスの静脈内投与の１４日後、すなわち、導入遺伝子の発現が決定されたとき（上記を参照されたい）に、野生型ＡＡＶ２、対照ペプチドＣＶＧＳＰＣＧ、及び肺特異的ペプチドＥＳＧＨＧＹＦのベクター分布を測定した。野生型ＡＡＶ２ベクターによって提供されたゲノムは、主に肝臓及び脾臓から回収され、対照ペプチドを有するベクターのゲノムは、大部分が脾臓から得られた。全体として、脾臓内で検出されたベクターゲノムの量は、検査されたすべてのカプシド変異形において比較的等しく（４×１０³ｖｐ／１００ｎｇの全ＤＮＡ）、これは
、導入遺伝子の提供及び発現から独立した、網内皮系内の粒子の非特異的捕捉機序を示す。対照的に、肺特異的ペプチドＥＳＧＨＧＹＦを有するベクターによって提供されたゲノムの分布データは、高度な特異的蓄積が肺において観察されて、導入遺伝子の発現データに高度に類似した。ペプチドＥＳＧＨＧＹＦを示す、肺において検出されたベクターの量は、他の器官においてよりも約２５０倍高く、野生型ベクターまたは対照カプシドベクターを注入した肺においてよりも最大５００倍高かった（図５Ｂ）。器官間の同一の分布値が、ベクター投与の２８日後に見出された。見出されるゲノムの量についての、３つのベクターカプシド変異形間の直接の比較を、関連性のある量のベクターＤＮＡが検出された３つの組織について、図５Ｃに示す。全体的として、このデータは、ＥＳＧＨＧＹＦベクターによって媒介される導入遺伝子の肺特異的発現が、循環する粒子の組織特異的ホーミングによって達成されることを示す。

【0069】

実施例６：免疫組織化学的検査及び組織学的検査
免疫組織化学的検査を使用して、ペプチドＥＳＧＨＧＹＦ及び／または対照として野生型ＡＡＶカプシドを有するｒＡＡＶ−ＧＦＰベクターの静脈内投与の１４日後の、肺及び対照器官における細胞レベルでの導入遺伝子の発現を可視化した。動物の肺を、２０分間、２０ｃｍの水の静水圧下、気管を通して、４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒドによってエキソサイチュで固定し、同一の固定液中、２４時間の浸漬を続けた。肺組織をパラフィン内に包埋した。２μｍの厚さを有する切片をワックスから取り除き、再水和し、免疫組織化学的検査のために使用した。ＧＦＰ（Ａ−１１１２２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＣＤ３１（ＡＢ２８３６４、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＳＡ）のポリクローナル抗体を使用して、免疫組織化学的手順を実行した。内因性ペルオキシダーゼを、メタノール中、１％のＨ₂Ｏ₂で３０分間不活性化した。ＣＤ３１での染色前に、切片をクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中、１００℃で２０分間加熱した。ＰＢＳ中で洗浄した後、ＰＢＳ、１０％のヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＵＳＡ）及び２％の粉乳（Ｒｏｔｈ）とともに切片を３０分間インキュベートした。原発抗体を３７℃で１時間結合させた。ＰＢＳ中で洗浄した後、二次ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ）とともに切片を３０分間インキュベートした。ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ−Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ）及び３，３′−ジアミノベンジデン（ＤＡＢ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を使用することによって、結合した抗体を可視化した。選択された切片をヘマラムで対比染色した。

【0070】

結果：ｒＡＡＶ−ＥＳＧＨＧＹＦを注入したマウスの肺において、顕微鏡検査は、肺微小血管系全体にわたる内皮細胞の集中的な染色を示し、大肺血管においてわずかに少ない程度に染色を示した（データ図示せず）。対照的に、野生型ＡＡＶ２ベクターを注入したマウスの肺組織は、染色を示さなかった。組織特異性を確認するために、野生型ＡＡＶ２ベクターの注入後に、対照器官（導入遺伝子の高発現を頻繁に実証することが既知である組織）として肝臓を分析した。肝臓において、野生型ｒＡＡＶ２ベクターの投与後に肝細胞染色を観察したが、ｒＡＡＶ２−ＥＳＧＨＧＹＦベクターの投与後に染色は観察されなかった。ＣＤ３１染色によって、ベクターを形質導入した肺細胞の内皮系統を確認し、ｒＡＡＶ２−ＥＳＧＨＧＹＦを注入したマウスの肺の連続切片において、ＧＦＰ染色によって得られたパターンを確認した（データ図示せず）。
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【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]