特許 6769596 膀胱癌診断薬及び生体試料の判定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6769596

(24)【登録日】2020年9月28日

(45)【発行日】2020年10月14日

(54)【発明の名称】膀胱癌診断薬及び生体試料の判定方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20201005BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20201005BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20201005BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20201005BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20201005BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/68

   G01N33/50 P

   G01N33/574 A

   G01N33/53 M

   C12Q1/68

【請求項の数】3

【全頁数】8

(21)【出願番号】特願2016-107206(P2016-107206)

(22)【出願日】2016年5月30日

(65)【公開番号】特開2017-215150(P2017-215150A)

(43)【公開日】2017年12月7日

【審査請求日】2019年5月29日

(73)【特許権者】

【識別番号】598041566

【氏名又は名称】学校法人北里研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100106909

【弁理士】

【氏名又は名称】棚井 澄雄

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(72)【発明者】

【氏名】小寺 義男

(72)【発明者】

【氏名】松本 和将

(72)【発明者】

【氏名】岩村 正嗣

【審査官】 大瀧 真理

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５３２４７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０２７３１４８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２０１５−１５６８６６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ − ３３／９８

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｐｕｔａｔｉｖｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ）タンパク質若しくはＬｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４Ｃ（ＬＲＲＣ４Ｃ）タンパク質に対する特異的結合物質、
ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子若しくはＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子を増幅可能なプライマーセット、又は
ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子若しくはＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、
を備える、膀胱癌診断薬。

【請求項2】

生体試料中のＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質又はＬＲＲＣ４Ｃタンパク質の存在量を測定する工程と、
測定された前記タンパク質の存在量が、対照と比較して多い場合に、前記生体試料は膀胱癌患者由来のものであると判定する工程と、
を備える、生体試料の判定方法。

【請求項3】

生体試料中のＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子又はＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子の発現量を測定する工程と、
測定された前記遺伝子の発現量が、対照と比較して多い場合に、前記生体試料は膀胱癌患者由来のものであると判定する工程と、
を備える、生体試料の判定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、膀胱癌マーカー及びその使用に関する。より具体的には、膀胱癌マーカー、膀胱癌診断薬及び生体試料の判定方法に関する。

【背景技術】

【0002】

膀胱癌の初発症状は無症候性血尿で認められることが多く、膀胱癌の診断は、主に、尿細胞診、超音波検査、膀胱鏡検査、生検試料の病理検査等により行われている。尿細胞診は進行性癌や低分化癌の検出率は良好であるが、表在性癌や高分化癌での有効性は満足のいくものではない。また、膀胱鏡検査は、進行癌のみではなく、表在性癌や高分化癌の検出にも優れ、確定診断に重要である反面、侵襲度が高く、身体負担を伴う検査である。また、表在性癌は高率に再発をきたし、治療後も定期的な膀胱鏡検査を含む経過観察が必要となる（例えば、非特許文献１を参照。）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Kaufman D. S., et al., Bladder cancer., Lancet, 374 (9685), 239-249, 2009.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

現在、日本で保険適用されている膀胱癌マーカーには、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ２２（ＮＭＰ２２）と尿中Ｂｌａｄｄｅｒ Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＢＴＡ）の２種類が存在する。しかしながら、ＮＭＰ２２は炎症や尿路結石を有する患者で偽陽性を示す場合があり、尿中ＢＴＡは血尿による偽陽性を示す場合がある。このため、新たな膀胱癌マーカーの開発が望まれている。そこで、本発明は、新たな膀胱癌マーカーを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は以下の態様を含む。
［１］Ｐｕｔａｔｉｖｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ）タンパク質、Ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４Ｃ（ＬＲＲＣ４Ｃ）タンパク質、Ｖ（Ｄ）Ｊ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＲＡＧ１）タンパク質若しくはＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｈｒｏｏｍ２（ＳＨＲＯＯＭ２）タンパク質、又はＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子、ＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子若しくはＳＨＲＯＯＭ２遺伝子からなる膀胱癌マーカー。
［２］ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質、ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質、ＲＡＧ１タンパク質若しくはＳＨＲＯＯＭ２タンパク質に対する特異的結合物質、ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子、ＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子若しくはＳＨＲＯＯＭ２遺伝子を増幅可能なプライマーセット、又はＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子、ＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子若しくはＳＨＲＯＯＭ２遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、を備える、膀胱癌診断薬。
［３］生体試料中のＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質、ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質、ＲＡＧ１タンパク質又はＳＨＲＯＯＭ２タンパク質の存在量を測定する工程と、測定された前記タンパク質の存在量が、対照と比較して多い場合に、前記生体試料は膀胱癌患者由来のものであると判定する工程と、を備える、生体試料の判定方法。
［４］生体試料中のＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子、ＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子又はＳＨＲＯＯＭ２遺伝子の発現量を測定する工程と、測定された前記遺伝子の発現量が、対照と比較して多い場合に、前記生体試料は膀胱癌患者由来のものであると判定する工程と、を備える、生体試料の判定方法。

【発明の効果】

【0006】

本発明によれば、新たな膀胱癌マーカーを提供することができる。

【発明を実施するための形態】

【0007】

［膀胱癌マーカー］
１実施形態において、本発明は、ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質、ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質、ＲＡＧ１タンパク質若しくはＳＨＲＯＯＭ２タンパク質、又はＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子、ＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子若しくはＳＨＲＯＯＭ２遺伝子からなる膀胱癌マーカーを提供する。

【0008】

本明細書では、遺伝子名ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐにより特定される遺伝子にコードされるタンパク質をＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質という。ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質は、Ｐｕｔａｔｉｖｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ、又はＰｕｔａｔｉｖｅ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ９０ ｋＤａ ｂｅｔａ ｍｅｍｂｅｒ ２とも呼ばれるものである。ヒトＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースのアクセッション番号はＱ５８ＦＦ３である。また、ヒトＨＳＰ９０Ｂ２ＰのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤはＮＲ＿０７３３８３である。

【0009】

本明細書では、遺伝子名ＬＲＲＣ４Ｃにより特定される遺伝子にコードされるタンパク質をＬＲＲＣ４Ｃタンパク質という。ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質は、Ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４Ｃ、又はＮｅｔｒｉｎ−Ｇ１ ｌｉｇａｎｄとも呼ばれるものである。ヒトＬＲＲＣ４Ｃタンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースのアクセッション番号はＱ９ＨＣＪ２、Ａ８Ｋ０Ｔ１、Ｑ７Ｌ０Ｎ３等である。また、ヒトＬＲＲＣ４ＣのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤはＮＭ＿０２０９２９、ＮＭ＿００１２５８４１９等である。また、マウスＬＲＲＣ４Ｃタンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースのアクセッション番号はＱ８Ｃ０３１である。また、マウスＬＲＲＣ４ＣのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤはＮＭ＿００１２８９７４２等である。

【0010】

本明細書では、遺伝子名ＲＡＧ１により特定される遺伝子にコードされるタンパク質をＲＡＧ１タンパク質という。ＲＡＧ１タンパク質は、Ｖ（Ｄ）Ｊ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １、又はＲＩＮＧ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ７４とも呼ばれるものであり、Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＲＡＧ１とＥ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｓｅ ＲＡＧ１の２つのドメインを含んでいる。ヒトＲＡＧ１タンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースのアクセッション番号はＰ１５９１８、Ｅ９ＰＰＣ４、Ｑ８ＩＹ７２、Ｑ８ＮＥＲ２等である。また、ヒトＲＡＧ１のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤはＮＭ＿０００４４８である。また、マウスＲＡＧ１タンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースのアクセッション番号はＰ１５９１９である。また、マウスＲＡＧ１のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤはＮＭ＿００９０１９である。

【0011】

本明細書では、遺伝子名ＳＨＲＯＯＭ２により特定される遺伝子にコードされるタンパク質をＳＨＲＯＯＭ２タンパク質という。ＳＨＲＯＯＭ２タンパク質は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｈｒｏｏｍ２、Ａｐｉｃａｌ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ又はＰｒｏｔｅｉｎ ＡＰＸＬとも呼ばれるものである。ヒトＳＨＲＯＯＭ２タンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースのアクセッション番号はＱ１３７９６、Ｂ９ＥＩＱ７等である。また、ヒトＳＨＲＯＯＭ２のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤはＮＭ＿００１６４９である。また、マウスＳＨＲＯＯＭ２タンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースのアクセッション番号はＡ２ＡＬＵ４である。また、マウスＳＨＲＯＯＭ２のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤはＮＭ＿００１２９０６８４等である。

【0012】

実施例において後述するように、発明者らは、膀胱癌患者の手術前血清及び手術後血清のエクソソーム分画に含まれるタンパク質を液体クロマトグラフィー質量（ＬＣ／ＭＳ）分析法により網羅的に分析、比較し、膀胱癌患者の手術前血清に特異的に存在するタンパク質として、ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質、ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質、ＲＡＧ１タンパク質及びＳＨＲＯＯＭ２タンパク質を同定した。

【0013】

したがって、ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質、ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質、ＲＡＧ１タンパク質若しくはＳＨＲＯＯＭ２タンパク質、又はＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子、ＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子若しくはＳＨＲＯＯＭ２遺伝子を、膀胱癌マーカーとして利用することができる。

【0014】

また、実施例において後述するように、ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質、ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質、ＲＡＧ１タンパク質及びＳＨＲＯＯＭ２タンパク質は、腎細胞癌患者の手術前血清中には検出されなかった。したがって、本実施形態のマーカーは膀胱癌に特異的なマーカーである。

【0015】

［膀胱癌診断薬］
１実施形態において、本発明は、ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質、ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質、ＲＡＧ１タンパク質若しくはＳＨＲＯＯＭ２タンパク質に対する特異的結合物質、ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子、ＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子若しくはＳＨＲＯＯＭ２遺伝子を増幅可能なプライマーセット、又はＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子、ＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子若しくはＳＨＲＯＯＭ２遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、を備える、膀胱癌診断薬を提供する。本実施形態の膀胱癌診断薬は、診断用キットであるということもできる。

【0016】

（特異的結合物質）
特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に、ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質、ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質、ＲＡＧ１タンパク質若しくはＳＨＲＯＯＭ２タンパク質又はそれらの断片を抗原として免疫することによって作製することができる。あるいは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。

【0017】

上記の抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体であってもよい。

【0018】

アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標的ペプチドに特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標的ペプチドに特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。

【0019】

本実施形態の膀胱癌診断薬は、被検者由来の血清、血漿、尿を含む体液、組織等を試料に用い、試料中のＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質、ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質、ＲＡＧ１タンパク質又はＳＨＲＯＯＭ２タンパク質を検出するものであってもよい。特に、血清、血漿又は尿は低侵襲で採取可能な生体試料であるため、患者の負担が少なく、容易に膀胱癌に罹患しているか否かを診断することができる。

【0020】

ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質、ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質、ＲＡＧ１タンパク質又はＳＨＲＯＯＭ２タンパク質の検出方法としては、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、逆相タンパク質アレイを用いた検出、免疫組織化学染色等が挙げられる。なお、逆相タンパク質アレイを用いた検出とは、試料を固相にアレイ状に固定し、検出対象物質に特異的な抗体等を反応させることにより、試料中の検出対象物質を検出する解析方法である。

【0021】

（プライマーセット）
ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子、ＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子又はＳＨＲＯＯＭ２遺伝子を増幅可能なプライマーセットとは、これらの遺伝子のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ等により増幅することができるものであれば特に制限されない。

【0022】

これらの遺伝子のｍＲＮＡは、上述したＩＤで特定されるＲｅｆＳｅｑデータベースのエントリーに記載された塩基配列を有している。なお、ｍＲＮＡにはスプライシングバリアント等が存在する場合があるため、これらの遺伝子のｍＲＮＡは上述したＲｅｆＳｅｑ ＩＤで特定されるものに限られるものではない。

【0023】

例えば、被検者由来の組織等を試料に用い、本プライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ等を行うことにより、試料中の、ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子、ＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子又はＳＨＲＯＯＭ２遺伝子のｍＲＮＡを検出することができる。

【0024】

（プローブ）
プローブとしては、ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子、ＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子又はＳＨＲＯＯＭ２遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば特に限定されない。プローブは、担体上に固定されてＤＮＡマイクロアレイ等を構成していてもよい。例えば、上記のＤＮＡマイクロアレイに、被検者由来の組織から抽出したｍＲＮＡを接触させ、プローブにハイブリダイズしたＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子、ＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子又はＳＨＲＯＯＭ２遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより、被検者が膀胱癌に罹患しているか否かを判定することができる。

【0025】

［生体試料の判定方法］
１実施形態において、本発明は、生体試料中のＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質、ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質、ＲＡＧ１タンパク質又はＳＨＲＯＯＭ２タンパク質の存在量を測定する工程と、測定された前記タンパク質の存在量が、対照と比較して多い場合に、前記生体試料は膀胱癌患者由来のものであると判定する工程と、を備える、生体試料の判定方法を提供する。

【0026】

本実施形態の判定方法により、生体試料が膀胱癌患者由来のものであるか否かを判定することができる。すなわち、本実施形態の判定方法は、膀胱癌の診断方法であるということもできる。本実施形態の判定方法によれば、膀胱癌を特異的に検出することができる。

【0027】

本実施形態の判定方法において、生体試料は、血清、血漿又は血清若しくは血漿から精製されたエクソソームであってもよい。生体試料中のＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質、ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質、ＲＡＧ１タンパク質又はＳＨＲＯＯＭ２タンパク質の存在量を測定する工程は、上述した特異的結合物質を用いた、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、逆相タンパク質アレイを用いた検出、免疫組織化学染色等により行うことができる。ここで、測定したＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質、ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質、ＲＡＧ１タンパク質又はＳＨＲＯＯＭ２タンパク質の存在量は、段階希釈した既知濃度の上記タンパク質を基準に用いて定量値に換算してもよい。

【0028】

本実施形態の判定方法では、生体試料中のＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質、ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質、ＲＡＧ１タンパク質又はＳＨＲＯＯＭ２タンパク質の存在量が、対照試料中のＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質、ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質、ＲＡＧ１タンパク質又はＳＨＲＯＯＭ２タンパク質の存在量と比較して多い場合に、前記生体試料は膀胱癌患者由来のものであると判定する。対照としては、例えば健常人由来の生体試料が挙げられる。あるいは、予め健常人由来の生体試料中に存在する、ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質、ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質、ＲＡＧ１タンパク質又はＳＨＲＯＯＭ２タンパク質の量に基づいて基準値を設定しておき、当該基準値と比較してＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質、ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質、ＲＡＧ１タンパク質又はＳＨＲＯＯＭ２タンパク質の量が多い場合に、生体試料は膀胱癌患者由来のものであると判定してもよい。

【0029】

本実施形態の判定方法は、生体試料中のＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子、ＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子又はＳＨＲＯＯＭ２遺伝子の発現量を測定する工程と、測定された前記遺伝子の発現量が、対照と比較して多い場合に、前記生体試料は膀胱癌患者由来のものであると判定する工程と、を備えるものであってもよい。

【0030】

本実施形態の判定方法において、生体試料は、被検者由来の組織等であってもよい。生体試料中のＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子、ＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子又はＳＨＲＯＯＭ２遺伝子の発現量を測定する工程は、上述したプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等により行うことができる。あるいは、上述したプローブを用いたＤＮＡマイクロアレイ解析、ノーザンブロッティング等により、ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子、ＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子又はＳＨＲＯＯＭ２遺伝子の発現量を測定してもよい。ここで、測定したＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子、ＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子又はＳＨＲＯＯＭ２遺伝子の発現量は、段階希釈した既知濃度の各遺伝子の断片等を基準に用いて定量値に換算してもよい。

【0031】

また、本実施形態の判定方法では、生体試料中のＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子、ＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子又はＳＨＲＯＯＭ２遺伝子の発現量が、対照試料中の上記遺伝子の発現量と比較して多い場合に、前記生体試料は膀胱癌患者由来のものであると判定する。対照としては、例えば健常人由来の生体試料が挙げられる。あるいは、予め健常人由来の生体試料におけるＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ遺伝子、ＬＲＲＣ４Ｃ遺伝子、ＲＡＧ１遺伝子又はＳＨＲＯＯＭ２遺伝子の発現量に基づいて基準値を設定しておき、当該基準値と比較して上記遺伝子の発現量が多い場合に、生体試料は腎細胞癌患者由来のものであると判定してもよい。

【実施例】

【0032】

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0033】

２０症例の膀胱癌患者の手術前血清と手術後血清を採取した。続いて、２０症例の手術前血清の混合血清試料、及び２０症例の手術後血清の混合血清試料を作製し、これらの混合血清を用いたプロテオーム解析を行い、膀胱癌患者の手術前血清に特異的に存在するタンパク質を探索した。

【0034】

具体的には、まず、手術前、手術後の各々の混合血清２００μＬにリン酸緩衝液１１００μＬを添加して、１９，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心し、上清を回収した。続いて、回収した上清を１００，０００×ｇ、４℃で９０分間超遠心し、沈殿を回収した。続いて、回収した沈殿を２回洗浄し、エクソソーム画分とした。

【0035】

続いて、回収したエクソソーム画分に界面活性剤であるデオキシコール酸ナトリウムを含む溶液を加えて加熱処理し、超音波破砕機で溶解後、トリプシン消化した。続いて、手術前血清由来のサンプルと手術後血清由来のサンプルを安定同位体標識試薬（型式「Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｔａｇ ２−ｐｌｅｘ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）でそれぞれ標識して等量混合し、陽イオン交換カラムで８つのフラクションに分画した。続いて得られたフラクションの各々を液体クロマトグラフィー（型式「Ｅａｓｙ−ｎＬＣ １０００」、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）及び四重極・フーリエ変換ハイブリッド質量分析計（型式「Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を組み合わせた液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）により解析し、比較した。

【0036】

その結果、膀胱癌患者の手術前血清に手術後血清よりも有意に多く含まれているタンパク質として、ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質、ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質、ＲＡＧ１タンパク質及びＳＨＲＯＯＭ２タンパク質を見出した。各タンパク質の手術後血清中の存在量に対する手術前血清中の存在量（変動率）を表１に示す。

【0037】

【表1】

【0038】

ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質、ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質、ＲＡＧ１タンパク質及びＳＨＲＯＯＭ２タンパク質は、いずれも、世界ヒトプロテオーム機構がまとめた、血中タンパク質リスト（Ｈｕｍａｎ Ｐｅｏｔｅｏｍｅ Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｊｅｃｔ：ＨＰＰＰ）中の約２０００種類のタンパク質に含まれていなかった。中でも、ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質は、世界ヒトプロテオーム機構がまとめた、血中タンパク質データベース（Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ：ＰＰＤ）中の約１０５００種類のタンパク質にも含まれていなかった。したがって、ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質が血液中に存在することは発明者らが今回初めて明らかにしたことである。

【0039】

また、腎細胞癌患者の手術前及び手術後の血清を用いて上記と同様の解析を行った結果、ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐタンパク質、ＬＲＲＣ４Ｃタンパク質、ＲＡＧ１タンパク質及びＳＨＲＯＯＭ２タンパク質は、腎細胞癌患者の手術前及び手術後の血清中には検出されないことが明らかとなった。この結果はこれらのタンパク質が膀胱癌特異的なマーカーであることを示す。

【産業上の利用可能性】

【0040】

本発明によれば、新たな膀胱癌マーカーを提供することができる。