特許 6770957 試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異状態を決定する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6770957

(24)【登録日】2020年9月30日

(45)【発行日】2020年10月21日

(54)【発明の名称】試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異状態を決定する方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6827 20180101AFI20201012BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20201012BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20201012BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20201012BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6827 ZZNA

   C12Q1/686 Z

   C12N15/54

   C12Q1/6876 Z

【請求項の数】13

【全頁数】35

(21)【出願番号】特願2017-526770(P2017-526770)

(86)(22)【出願日】2015年7月28日

(65)【公表番号】特表2017-523810(P2017-523810A)

(43)【公表日】2017年8月24日

(86)【国際出願番号】GR2015000036

(87)【国際公開番号】WO2016020710

(87)【国際公開日】20160211

【審査請求日】2018年5月10日

(31)【優先権主張番号】62/034,231

(32)【優先日】2014年8月7日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517037870

【氏名又は名称】ファーマシスト リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＰＨＡＲＭＡＳＳＩＳＴ ＬＴＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100169904

【弁理士】

【氏名又は名称】村井 康司

(74)【代理人】

【識別番号】100159916

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 貴之

(72)【発明者】

【氏名】エヴリクレイア リアニドウ

(72)【発明者】

【氏名】アティナ マルコウ

【審査官】 坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／０９５３７８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／０２６０２７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 中国特許出願公開第１０２２３４６８５（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０２５３３９５８（ＣＮ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／１３１０９２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／１５１５６０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１０−５３５４８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５３９９２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Biotechniques，２０１１年，Vol.50, No.5，p.311-318

【文献】 Clinical Cancer Research，２０１４年，Vol.20 No.22，p.5823-5834

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８２７

Ｃ１２Ｎ １５／５４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＤＮＡ試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡの存在を分析する方法であって、前記突然変異アレルＤＮＡの非対称およびアレル特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するステップ、ならびに前記ＰＣＲにおいて産生されたＤＮＡの融解分析を実施するステップを含み、
前記ＰＣＲを、
− 増幅すべき前記突然変異アレルＤＮＡの第１鎖の３’（３プライム）末端に相補的な突然変異アレル特異的プライマーであって、突然変異部位および対応する野生型ＤＮＡに対するミスマッチを含む、突然変異アレル特異的プライマー、および
− 検出すべき突然変異が存在する対応位置における前記突然変異アレルＤＮＡの第１鎖に対応する野生型ＤＮＡの第１鎖の野生型配列に相補的なオリゴヌクレオチドである非標識ブロッキングプローブであって、前記突然変異部位の他に前記突然変異アレルＤＮＡの前記第１鎖に対する付加ミスマッチを含み、前記ＰＣＲ反応におけるＤＮＡ合成のためのプライマーとして作用するのをブロックされる、非標識ブロッキングプローブ、および
− 前記ＰＣＲにより増幅すべき前記突然変異アレルＤＮＡの第２鎖の３’末端に相補的な共通プライマー
の使用により実施し、
前記融解分析を、
− 前記野生型アレルＤＮＡに相補的であり、前記突然変異アレルＤＮＡの配列と重複する配列を含むオリゴヌクレオチドである非標識プローブである融解プローブ、および
− 増幅突然変異アレルＤＮＡ鎖または野生アレルＤＮＡ鎖に結合している前記融解プローブの二本鎖成分を少なくとも含む二本鎖ＤＮＡ成分の融解温度を計測するための検出可能な成分であって、前記融解温度は、前記増幅突然変異アレル鎖に結合している前記融解プローブおよび前記増幅野生アレル鎖に結合している前記融解プローブの前記二本鎖成分間で異なる、検出可能な成分
の使用により実施する方法。

【請求項2】

前記ＰＣＲ反応において増幅すべき前記突然変異アレルＤＮＡが、ＰＩＫ３ＣＡのエクソン９（配列番号１）を含むか、またはそれからなり、前記突然変異アレル特異的プライマー配列が、エクソン９（配列番号４）のＤＮＡ鎖に相補的である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記突然変異がＰＩＫ３ＣＡのエクソン９中に存在し、前記突然変異アレル特異的プライマーが、配列５’−ＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴ−３’（配列番号３）を含むか、もしくはそれからなり、または５’−ＡＣＴＣＣＡＴＡＧＡＡＡＡＴＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴ−３’（配列番号４）（Ｔは、突然変異部位を示し、Ａは、付加ミスマッチを示す）である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記非標識ブロッキングプローブが、配列５’−ＣＴＧＡＴＣＡＧＴＧＡ−３’（配列番号５）およびＰＣＲブロッキング成分を含むか、もしくはそれからなり、または配列５’−ＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＴＧＡＴＴＴＣＡＧＡＧ−Ｐ−３’（配列番号６）（Ｐは、リン酸であり、Ａは、付加ミスマッチである）を含むか、もしくはそれからなる、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記共通プライマーが、配列５’−ＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＧＡＧＡ−３’（配列番号７）に対して７５％から１００％の同一性を有する、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記融解プローブが、前記非標識ブロッキングプローブである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記非標識ブロッキングプローブが、増幅のためのＰＣＲプライマーと比較して付加リン酸基により修飾されている修飾３’末端を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記検出可能な成分が、蛍光成分を含み、前記融解分析が、前記蛍光成分を検出することを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記蛍光成分が、前記試料中の二本鎖ＤＮＡの存在下でのみ蛍光を発光しているＬＣ−Ｇｒｅｅｎ ＰｌｕｓまたはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉからなる群のＤＮＡ結合蛍光色素である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記非標識ブロッキングプローブおよび前記共通プライマーが、前記突然変異アレル特異的プライマーよりも高濃度において存在する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記試料は、悪性新生物疾患を有する、または有すると疑われる哺乳動物のＤＮＡ試料である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記悪性新生物疾患が、乳癌、結腸癌、肺癌、子宮頸癌、卵巣癌、食道癌、脳癌、皮膚癌、肝臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、胃癌および甲状腺癌である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

ｉ）試料中のＰＩＫ３ＣＡ中の突然変異の存在を検出する、および／または
ｉｉ）対象における悪性新生物疾患を検出する；または
ｉｉｉ）対象における悪性新生物疾患を診断する；または
ｉｖ）対象における悪性新生物疾患の治療のアウトカムを予測する；または
ｖ）対象における悪性新生物疾患の治療の効力を評価する；または
ｖｉ）対象における悪性新生物疾患の再発を評価するため
のキットであって、
第１のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチド、および、第５のポリヌクレオチドを含み、
前記第１のポリヌクレオチドは、少なくとも配列５’−ＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴ−３’（配列番号３）を含むか、もしくはそれからなり、または少なくとも配列５’−ＡＣＴＣＣＡＴＡＧＡＡＡＡＴＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴ−３’（配列番号４）（Ｔは、突然変異部位を示し、Ａは、付加ミスマッチを示す）を含むか、もしくはそれからなり、
前記第３のポリヌクレオチドは、少なくとも配列５’−ＣＴＧＡＴＣＡＧＴＧＡ−３’（配列番号５）およびＰＣＲブロッキング成分を含むか、もしくはそれからなり、または少なくとも配列５’−ＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＴＧＡＴＴＴＣＡＧＡＧ−Ｐ−３’（配列番号６）（Ｐは、リン酸であり、Ａは、付加ミスマッチである）を含むか、もしくはそれからなり、
前記第５のポリヌクレオチドは、配列５’−ＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＧＡＧＡ−３’（配列番号７）に対して７５％から１００％の同一性を有する、
キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、血漿／血清中の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）およびホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織のＤＮＡ試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異状態を決定する高感度の方法に関する。

【背景技術】

【0002】

循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）検出および計数は、「リキッドバイオプシー」およびに全身療法に対する応答の初期マーカーとして機能し得る一方、それらの分子特徴付けは、個別化された標的化治療に転換され、癌患者に不要で無効な治療法を控える強力な潜在性を有する。

【0003】

アジュバント化学療法前の７．５ｍＬの血液中の１つ以上のＣＴＣの検出は、全生存率（ＯＳ）を正確に予測し得ることが示されている。フォローアップの最初の５年の間のＣＴＣの持続的検出は、後期疾患再発および死亡のリスクの増加を伴い、化学およびホルモン療法耐性残留疾患の存在を示す。近年のプロスペクティブ臨床試験は、早期再発および全生存率（ＯＳ）の減少について予測される１つ以上のＣＴＣの存在を裏付けた。

【0004】

転移性乳癌（ＭＢＣ）において、ＣＴＣは無進行性生存率（ＰＦＳ）およびＯＳについての独立予後因子を表し、転移性乳癌、前立腺癌、および結腸直腸癌のためのＣＴＣ計数アッセイ（ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（商標）システム、Ｖｅｒｉｄｅｘ）が、ＦＤＡにより認可された。治療法の第２サイクル前のＣＴＣの数の増加は、不良ＰＦＳおよびＯＳの初期予測マーカーであり、それを使用して治療利益をモニタリングすることができた一方、治療下のＣＴＣ減少は、標的療法についてより強力であった。最先端の治療法前のＭＢＣを有する患者におけるＣＴＣの検出は、不良臨床アウトカムを有する患者の下位群を定義し得た。

【0005】

目下、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）が、アポトーシスまたは微小環境ストレスにより誘導される他の生理学的イベントを受ける細胞からの循環に放出され、癌を有する患者の血液試料中で同定することができることが確立されている。しかしながら、産生されるｃｆＤＮＡ断片の長さに関して（ＤＮＡ完全性）、ｃｆＤＮＡの資源を、アポトーシスまたは壊死起源と区別することができる。循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）という用語は、本質的に、腫瘍に由来する全ｃｆＤＮＡのサブタイプを含む。多くの研究が、ｃｔＤＮＡおよびＣＴＣの両方が癌患者の血漿／血清および末梢血中に、進行期だけでなく初期においても存在することを示している。

【0006】

多くの市販のｃｆＤＮＡ抽出キットが存在するが、効率および収率は、抽出の間の出発材料の損失に起因して依然として低く、その定量は標準化の欠落のために変動し得る。これにもかかわらず、ｃｆＤＮＡ抽出の効率は、突然変異検出のアウトカム、すなわち、アッセイ感度に直接影響を与え得る。

【0007】

ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は液体キナーゼのファミリーをなし、１９８０年代に発見され、重要な生物学的機能、例えば、細胞生存、分化および増殖の媒介を担う。ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ＡＫＴシグナリング経路は、ヒト疾患、例として、癌に関与し、この経路の複雑性の理解は、治療介入のための新たな手段を提供し得る。ＰＩ３Ｋのｐ１１０α触媒サブユニット中の体細胞突然変異は、多くのタイプの固形癌、例えば、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頸部癌、食道癌、肺癌、脳癌、皮膚癌、肝臓癌、膵臓癌、胃癌または甲状腺癌において極めて高頻度であり、分子標的療法に対する応答における重要な役割を担い、乳癌におけるＨＥＲ−２増幅と同時に生じることが多い。ＰＩＫ３ＣＡの突然変異は、乳癌患者の１８〜４０％において報告されている一方、症例の約９０％をなす圧倒的多数は、エクソン９およびエクソン２０中の２つのホットスポット領域に集中している。

【0008】

ＣＴＣ、ｃｆＤＮＡまたはＦＦＰＥ組織のＤＮＡ試料中のＰＩＫ３ＣＡホットスポット突然変異の検出の臨床的関連性は極めて重要である。それというのも、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異の存在は標的療法における薬物耐性と関連するためである。問題は、突然変異が臨床腫瘍試料中に極めて少量で存在し、既存の方法の検出限界が極めて低く、したがって、臨床診断および患者管理に影響を与え得る偽陰性をもたらすことである。

【0009】

ｃｔＤＮＡの分析は、腫瘍進行を評価し、予後診断、診断および治療に対する応答を評価するための有用なツールとして示されている。多くの研究は、ｃｔＤＮＡの臨床的有用性を裏付けており、この目的に使用される方法の分析感度を増加させるために多くの技術が開発されてきた。Ｊａｎｋｕらは、ビーミング（ｂｅａｍｉｎｇ）法を使用し、両方のエクソン中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異についての組織および血漿間の一致率が９１％であったことを示している［Ｊａｎｋｕ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｔｉｏｎａｂｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃａｎｃｅｒｓ ｒｅｆｅｒｒｅｄ ｆｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１５；６：１２８０９−２１］。別の研究において、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）アッセイを使用するｃｔＤＮＡ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異の割合は、乳癌を有する患者の２２．７％において見出された［Ｏｓｈｉｒｏ Ｃ，ｅｔ ａｌ．ＰＩＫ３ＣＡ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ＤＮＡ ａｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｏｆ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ．２０１５；１５０：２９９−３０７］。

【0010】

この理由のため、極限感度（０．０５％）および高特異度（１００％）を特徴とするＰＩＫ３ＣＡホットスポット突然変異のための新規方法が開発されてきた［Ｍａｒｋｏｕ Ａ，ｅｔ ａｌ．ＰＩＫ３ＣＡ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｃｈａｎｇｅ ｄｕｒｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１４ Ｎｏｖ １５；２０（２２）：５８２３−３４］。このアッセイは、多くの利点を提供する：それは、過剰の野生型アレルの存在下でＰＩＫ３ＣＡ突然変異を有する極めて少量の突然変異アレルを検出し得る。さらに、開発された方法を使用することにより、ＣＴＣから単離されたＤＮＡ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異を、初期乳癌患者（２０．３％）および臨床的に確認された転移を有する患者（３５．１％）の両方で以前に報告されたものよりもかなり高い割合において検出することができた。

【0011】

この理由のため、アレル特異的プライミング、野生型増幅の競合ブロッキングプローブ、非対称ＰＣＲ、およびプローブ融解分析の組合せに基づく、ＣＴＣ中のＰＩＫ３ＣＡホットスポット突然変異（エクソン９および２０）の検出のための超高感度および高特異度の方法［Ｍａｒｋｏｕ Ａ，ｅｔ ａｌ．ＰＩＫ３ＣＡ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｃｈａｎｇｅ ｄｕｒｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１４ Ｎｏｖ １５；２０（２２）：５８２３−３４］が、開発およびバリデートされた。データは、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異状態が乳癌を有する患者における疾患再発または進行の間に変化し得ること、およびＣＴＣ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異の存在が臨床的に確認された転移を有する患者のより悪い生存率を伴うことも示唆する［Ｍａｒｋｏｕ Ａ，ｅｔ ａｌ．ＰＩＫ３ＣＡ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ＣＴＣｓ ｃａｎ ｃｈａｎｇｅ ｄｕｒｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１４ Ｎｏｖ １５；２０（２２）：５８２３−３４］。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明の課題は、例えば、ＣＴＣの試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異状態を決定する改善された方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0013】

前記課題は、請求項１に記載の方法により完全にまたは部分的に解決される。本発明の実施形態およびさらなる詳細が、添付の従属請求項、図面および配列表に記載される。

【0014】

したがって、本方法は、試料中のＰＩＫ３ＣＡアレル、すなわち、試料中の突然変異、例えば、ホットスポット突然変異を含有するＰＩＫ３ＣＡアレルの存在の決定に関する。試料は、例えば、ＣＴＣのものであり得るが、本方法は、任意の他のタイプの生物学的試料中で、例えば、血漿／血清中の無細胞ＤＮＡまたは固形腫瘍のＦＦＰＥ組織中で使用することもできる。ＰＩＫ３ＣＡ突然変異の検出を使用して多くのタイプの癌、例として、結腸、乳房、脳、甲状腺、膵臓、前立腺、頭頸部、卵巣、子宮頸部、肝臓、胃、食道、皮膚および肺の癌を決定することができる。本方法は、例えば、乳癌の初期診断の間にＰＩＫ３ＣＡ突然変異が存在し得た癌の発症のリスクを決定する場合に特に有利である。

【0015】

本発明の方法は、Ｌ．Ｚｈｏｕら［Ｚｈｏｕ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｒａｒｅ ａｌｌｅｌｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ，ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｐｒｏｂｅ ｂｌｏｃｋｉｎｇ，ａｎｄ ｍｅｌｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２０１１；５０：３１１−８］によりＢＲＡＦ突然変異について最初に記載されたアプローチに基づく。この方法の基本的アプローチを使用して、ＣＴＣの試料中のＰＩＫ３ＣＡホットスポット突然変異を検出するようにデノボプライマーおよびプローブを設計し、全ての実験条件を確認した。融解分析および非標識プローブの態様は、ユタ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ）からＩＤＡＨＯ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにライセンス付与された。

【0016】

本発明による方法は、均一系中の希少アレルの検出を向上させ得る。本方法は、競合ブロッキングプローブを使用する非対称およびアレル特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および融解分析を含む。本方法は、増幅すべき突然変異アレルＤＮＡ標的の第１鎖の３’（３プライム）末端に相補的な突然変異アレル特異的プライマーおよび検出すべき突然変異が存在する正確な位置における野生型ＤＮＡの対応する第１鎖の野生型配列に相補的なオリゴヌクレオチドである非標識ブロッキングプローブ（競合プローブ）を要求する。さらに、本方法は、ＰＣＲにより増幅すべきＤＮＡ標的の第２鎖の３’末端に相補的な共通プライマーを含む。

【0017】

この場合、例えば、ＣＴＣの試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルの存在を決定する本発明による方法は、
・非対称およびアレル特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するステップ、ならびに
・ＰＣＲにおいて産生されたＤＮＡの融解分析を実施するステップ
を含み、
ＰＣＲを、
・増幅すべき突然変異アレルＤＮＡ標的の第１鎖の３’（３プライム）末端に相補的な突然変異アレル特異的プライマー、
・検出すべき突然変異が存在する対応位置における突然変異アレルの第１鎖に対応する野生型ＤＮＡの第１鎖の野生型配列に相補的なオリゴヌクレオチドであり、ＰＣＲ反応におけるＤＮＡ合成のためのプライマーとして作用するのをブロックされる非標識ブロッキングプローブ；および
・ＰＣＲにより増幅すべきＤＮＡ標的の第２鎖の３’末端に相補的な共通プライマー
の使用により実施し、
融解分析を、
・野生型アレル配列に相補的であり、突然変異アレルの配列と重複する配列を含むオリゴヌクレオチドである非標識プローブである融解プローブ；および
・増幅突然変異アレル鎖または野生アレル鎖に結合している融解プローブの二本鎖成分を少なくとも含む二本鎖ＤＮＡ成分の融解温度を計測するための検出可能な成分（融解温度は、増幅突然変異アレル鎖に結合している融解プローブおよび増幅野生アレル鎖に結合している融解プローブの二本鎖成分間で異なる）
の使用により実施する。

【0018】

次いで、アレル特異的ＰＣＲを使用して希少アレルを濃縮する。アレル特異的ＰＣＲは、所望の突然変異アレルに完全に特異的であるように設計される突然変異アレル特異的プライマー（リバースまたはフォワード）である第１のプライマーを要求し、その３’末端は、検出すべき突然変異部位に正確に存在するように設計される。共通プライマー（フォワードまたはリバース）である第２のプライマーも使用し、そのプライマーは第１のプライマーが結合する相補鎖に結合し、突然変異および野生型鎖アレルの両方の増幅に使用することができる。このように、試料中に存在する他のアレル、例えば、野生型はミスマッチし、非特異的増幅は制限される。しかしながら、突然変異アレル特異的プライマーのみを使用することにより、この阻害は、これまで記載された全ての例において１００％完全ではない。それというのも、野生型は、通常、過剰濃度において存在するためである。

【0019】

したがって、本方法は、非標識ブロッキングプローブを使用する競合プローブブロッキングの使用を含む。非標識ブロッキングプローブ（競合プローブ）は、検出すべき突然変異が存在する正確な位置中の野生型配列に相補的なオリゴヌクレオチドである。この非標識ブロッキングプローブは、ＰＣＲにおいてプライマーとして使用されるその３’末端においてブロックされ、例えば、ＰＣＲのための通常プライマーと比較してその３’末端における付加リン酸基を有することによりブロックされる。この非標識ブロッキングプローブは、野生型アレルの競合ブロッキングに使用し、突然変異アレル特異的プライマーよりも高濃度、例えば、アレル特異的プライマーの５から２０倍または１０倍高い濃度において付加する。突然変異アレル特異的プライマーおよび非標識ブロッキングプローブの配列における重複が存在し、突然変異アレル特異的プライマーおよびこの非標識ブロッキングプライマーの両方が存在する場合（野生型および突然変異体）；非標識ブロッキングプローブは野生型にハイブリダイズし、突然変異アレル特異的プライマーは突然変異アレルにハイブリダイズする。したがって、非標識ブロッキングプローブは、感度増加のためのアレル特異的プライマーと競合する。それというのも、それは野生型とマッチさせるように設計され、したがって、野生型アレル上に正確に結合するためである。非標識ブロッキングプローブは、対応するホットスポット突然変異が可能な限り非標識ブロッキングプローブの中央近くに配置されるように設計することができる。このように、野生型の非特異的増幅を最小の程度に低減させることができる。希少アレル濃縮は、アレル特異的プライマーと比較して過剰のブロッキングプローブおよびリバースプライマーについて最適である。

【0020】

非対称ＰＣＲは、突然変異アレル特異的プライマーを、共通プライマーに関してより低濃度（例えば、１０倍低い）において添加するアレル特異的ＰＣＲを含む。このように、この突然変異アレル特異的プライマーは、極めて低い濃度において存在する突然変異アレルによってのみＰＣＲにおいて完全に使用される。突然変異アレルの存在下で、および数回のＰＣＲサイクル後、突然変異アレル特異的プライマーは完全に使用され、次いで突然変異情報を含む鎖が過剰に産生される。それというのも、それは、両方のアレルに共通である他のプライマーのための一定のテンプレートとして使用され、野生型アレルの増幅が突然変異アレル特異的プライマーおよび非標識ブロッキングプローブの使用により制限されるためである。産生される一本鎖ＰＣＲ産物は、突然変異情報を含有する。ＰＣＲ後、それらは過剰であり、過剰で完全に相補的でないプローブにより認識されるため、融解曲線がより低温である。

【0021】

融解分析はＰＣＲ反応に行い、目的の融解温度よりも低い温度から、目的の融解温度を超える温度に温度を増加させ、二本鎖ＤＮＡの融解温度を検出するステップを含む。

【0022】

融解分析は、野生型アレル配列に相補的であり、好ましくは、突然変異位置の周囲の突然変異アレルの配列と重複する配列を含むオリゴヌクレオチドである非標識プローブである融解プローブの使用を含む。この場合、融解プローブ（非標識ブロッキングプローブ）は、突然変異アレル特異的プライマーの配列と重複する配列を含み得る。融解プローブは、野生型アレルへのその結合と比較して突然変異アレルへのその結合について異なる融解温度を提供する。融解プローブは、本明細書においても例示されるとおり、非標識ブロッキングプローブであり得る。突然変異アレルに対する非標識ブロッキングプローブの融解温度は、野生型アレルに対する非標識ブロッキングプローブの融解温度よりも低い。非標識ブロッキングプローブは極めて高い濃度において添加し、これは、主として、野生型配列をブロックする反応において使用し、突然変異アレル特異的プライマーは、野生型に非特異的に結合せず、非特異的ＰＣＲ産物を生じさせ得ない。さらに、この同一の非標識ブロッキングプローブは、上記のとおり突然変異情報を含有する一本鎖および野生型一本鎖を認識している。結果として、得られる融解曲線は、プローブ下のアレルに特異的なシグネチャーに類似する。

【0023】

融解プローブおよび非対称ＰＣＲ産物の相補第１鎖間の融解温度の計測は、蛍光色素を使用する蛍光検出技術の使用により実施することができる。一実施形態において、蛍光色素は、計測試料中の二本鎖ＤＮＡの存在下でのみ蛍光を発光する色素である。色素は、ＬＣ−Ｇｒｅｅｎ Ｐｌｕｓであり得る。二本鎖ＤＮＡおよび蛍光色素ＬＣ−Ｇｒｅｅｎ Ｐｌｕｓの蛍光の発光を計測することにより、突然変異アレルについて特徴的な融解曲線を導出する。それというのも、突然変異ＤＮＡ配列の融解温度は、野生型配列のものよりも低いためである。本方法は、全ての産物が二本鎖であり、１００％において蛍光を発光する場合、ＰＣＲ反応の終了後に温度を増加させることを含み得る。次いで、温度を徐々に増加させ、温度がＤＮＡ配列について特徴的な温度、すなわち、Ｔｍに達する場合、蛍光が減少し始める。Ｔｍは、ＤＮＡの５０％が二本鎖であり、５０％が一本鎖である温度である。

【0024】

色素を使用する融解分析は、例えば、５５から６０摂氏度の１０秒間および９５摂氏度の１分間のアニーリングのステップ（温度を、５５から６０摂氏度の温度から開始して０．２摂氏度／秒の増分（変化速度）だけ徐々に増加させる）、ならびに色素を検出することにより融解温度を計測するステップ（データ収集ステップ）を含み得る。

【0025】

ＰＣＲ反応において増幅すべき突然変異アレルＤＮＡ標的は、ＰＩＫ３ＣＡのエクソン９（配列番号１）および／またはエクソン２０（配列番号２）を含み得、またはそれからなり得、突然変異アレル特異的プライマー配列は、エクソン９（配列番号１）またはエクソン２０（配列番号２）のＤＮＡ鎖に相補的である。

【0026】

融解プローブは、非標識ブロッキングプローブであり得る。非標識ブロッキングプローブは、増幅のためのＰＣＲプライマーと比較して付加リン酸基により修飾されている３’末端を有し得る。これは、ＤＮＡ鎖の合成のためのＰＣＲプライマーとしての非標識ブロッキングプローブの使用をブロックする。場合により、非標識ブロッキングプローブは、１つ以上の非蛍光部分、例えば、限定されるものではないが、非蛍光副溝バインダー、ビオチン、スペーサー、リンカー、リン酸、塩基類似体、非天然塩基などにより修飾することができる。

【0027】

上記のとおり、検出可能な成分は蛍光成分を含み得、この場合、融解分析は蛍光成分を検出することを含み得る。蛍光成分は、蛍光色素、例えば、試料中の二本鎖ＤＮＡの存在下でのみ蛍光を発光するＬＣ−Ｇｒｅｅｎ ＰｌｕｓまたはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉからなる群の蛍光色素であり得る。

【0028】

非標識ブロッキングプローブは、突然変異アレル特異的プライマーよりも高濃度において反応中で添加して野生型アレル配列の増幅をブロックする。非標識プローブは、野生型ＤＮＡに優先的に結合し、プライマー結合と競合する。同時に、より低濃度の突然変異アレル特異的プライマーは、突然変異アレル配列のみの伸長をもたらす。したがって、ブロッキングプローブの濃度は、過剰の野生型アレルへの結合のため突然変異プライマーよりも高いことが望ましい。さらに、突然変異アレル特異的プライマーおよび共通プライマー間の異なる濃度は、突然変異情報を含む鎖の産生を過剰にもたらして本方法の感度を増加させる。

【0029】

突然変異は、ＰＩＫ３ＣＡのエクソン９（配列番号１）中に存在し得、突然変異アレル特異的プライマーは、配列５’ＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴ−３’（配列番号３）（Ｔは、突然変異部位を示し、Ａは、野生型アレル配列の増幅を阻害する付加ミスマッチを示す）を含むか、またはそれからなり、突然変異希少アレルのみの増幅を増加させ、方法の特異度の向上をもたらす。突然変異アレル特異的プライマーの配列は、好ましくは、５’−ＡＣＴＣＣＡＴＡＧＡＡＡＡＴＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴ−３’（配列番号４）を含み得、またはそれであり得る。

【0030】

非標識ブロッキングプローブは、配列５’−ＣＴＧＡＴＣＡＧＴＧＡ−３’（配列番号５）（Ｃは、配列が野生型部位に相補的な正確な位置を示す）、および非標識ブロッキングプローブがＰＣＲ反応においてＤＮＡ合成のためのプライマーとして作用するのをブロックするＰＣＲブロッキング成分を含み得、またはそれからなり得る。非標識ブロッキングプローブの配列は、好ましくは、５’−ＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＴＧＡＴＴＴＣＡＧＡＧ−Ｐ−３’（配列番号６）（Ｐは、ＰＣＲブロッキング成分として作用するリン酸である）を含み得、またはそれであり得る。

【0031】

共通プライマーは、配列５’−ＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＧＡＧＡ−３’（配列番号７）に対して７５％から１００％の同一性を有し得る。これは、共通プライマーが、核酸配列５’−ＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＧＡＧＡ−３’（配列番号７）に対して少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％または少なくとも９０％の同一性、例えば、７５〜１００％、７６〜１００％、７７〜１００％、７８〜１００％、７９〜１００％、８０〜１００％、８１〜１００％、８２〜１００％、８３〜１００％、８４〜１００％、８５〜１００％、８６〜１００％、８７〜１００％、８９〜１００％、９０〜１００％、９１〜１００％、９２〜１００％、９３〜１００％、９４〜１００％、９５〜１００％、９６〜１００％、９７〜１００％、９８〜１００％、９９〜１００％または約１００％の同一性を有し得ることを意味する。

【0032】

突然変異は、ＰＩＫ３ＣＡのエクソン２０（配列番号２）中にも存在し得、突然変異アレル特異的プライマーは、配列５’−ＡＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧ−３’（配列番号８）（Ｇは、突然変異部位を示す）を含むか、またはそれからなる。突然変異アレル特異的プライマーの配列は、好ましくは、５’−ＡＴＧＡＡＡＣＡＡＡＴＧＡＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧ−３’（配列番号９）を含むか、またはそれであり得る。

【0033】

非標識ブロッキングプローブは、配列５’−ＴＧＣＡＣＡＴＣＡＴＧ−３’（配列番号１０）（Ａは、配列が野生型部位に相補的な正確な位置を示す）、および非標識ブロッキングプローブがＰＣＲ反応においてＤＮＡ合成のためのプライマーとして作用するのをブロックするＰＣＲブロッキング成分を含み得、またはそれからなり得る。非標識ブロッキングプローブの配列は、好ましくは、５’−ＧＡＡＴＧＡＴＧＣＡＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧ−Ｐ−３’（配列番号１１）（Ｐは、ＰＣＲブロッキング成分として作用するリン酸である）を含み得、またはそれであり得る。

【0034】

この場合、共通プライマーは、配列５’−ＴＣＴＣＡＧＴＴＡＴＣＴＴＴＴＣＡＧＴＴＣＡＡＴＧＣ−３’（配列番号１２）に対して７５％から１００％の同一性を有し得る。これは、共通プライマーが、核酸配列５’−ＴＣＴＣＡＧＴＴＡＴＣＴＴＴＴＣＡＧＴＴＣＡＡＴＧＣ−３’（配列番号１２）に対して少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％または少なくとも９０％の同一性、例えば、７５〜１００％、７６〜１００％、７７〜１００％、７８〜１００％、７９〜１００％、８０〜１００％、８１〜１００％、８２〜１００％、８３〜１００％、８４〜１００％、８５〜１００％、８６〜１００％、８７〜１００％、８９〜１００％、９０〜１００％、９１〜１００％、９２〜１００％、９３〜１００％、９４〜１００％、９５〜１００％、９６〜１００％、９７〜１００％、９８〜１００％、９９〜１００％または約１００％の同一性を有し得ることを意味する。

【0035】

本文書はまた、
ｉ）対象における悪性新生物疾患を診断し、および／または
ｉｉ）対象における悪性新生物疾患の治療の効力を予測し、および／または
ｉｉｉ）対象における悪性新生物疾患の治療のアウトカムを評価し、および／または
ｉｖ）対象における悪性新生物疾患の再発を評価する
方法であって、
対象は、悪性新生物疾患を有する、または有すると疑われる哺乳動物であり、
本明細書に記載のステップにより試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡの存在を分析することを含む方法
に関する。

【0036】

本明細書に記載の方法は、有利には、試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡの存在を検出するため、ならびに
ｉ）対象における悪性新生物疾患を診断し、および／または
ｉｉ）対象における悪性新生物疾患の治療の効力を予測し、および／または
ｉｉｉ）対象における悪性新生物疾患の治療のアウトカムを評価し、および／または
ｉｖ）対象における悪性新生物疾患の再発を評価するため
に使用することができ、
対象は、悪性新生物疾患を有する、または有すると疑われる哺乳動物である。

【0037】

分析される試料は生物学的試料であり得、前記生物学的試料は、対象から得ることができる。有利には、対象はヒトである。

【0038】

悪性新生物疾患は、乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌、頭頸部癌、肝臓癌、卵巣癌、甲状腺癌、皮膚癌、膵臓癌、前立腺癌および胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌からなる群から選択することができる。

【0039】

有利には、悪性新生物疾患は、乳癌である。

【0040】

対象における悪性新生物疾患を診断および／または予後診断する場合、本方法は、
ａ）所与の対象から生物学的試料を得るステップ
ｂ）本明細書に記載の前記生物学的試料から得られたＤＮＡ試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡの存在を分析する方法を実施するステップ
ｃ）前記ＤＮＡ試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡの存在を検出するステップ；ならびに
ｄ）前記ＤＮＡ試料中で検出されたＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡの量を陽性および／または陰性対照と比較し、それにより対象における悪性新生物疾患を診断および／または予後診断するステップ
を含む。

【0041】

さらなる実施形態は、陽性対照が突然変異を担持する細胞系からの細胞を含む実施形態である。いっそうさらなる実施形態は、陰性対照が悪性新生物疾患を罹患していない健常対象からの細胞を含む実施形態である。

【0042】

悪性新生物疾患を罹患する対象における治療のアウトカムを予測するか、または治療に対する応答を予測する場合、本方法は、
ａ）所与の対象から生物学的試料を得るステップ
ｂ）本明細書に記載の前記生物学的試料から得られたＤＮＡ試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡの存在を分析する方法を実施するステップ；ならびに
ｃ）前記ＤＮＡ試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡの存在を検出するステップ；ならびに
ｄ）前記ＤＮＡ試料中で検出されたＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡの量を陽性および／または陰性対照と比較し、それにより前記ＤＮＡ試料中で検出されたＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡの存在に基づき前記対象における悪性新生物疾患の治療のアウトカムを予測するステップ
を含む。

【0043】

悪性新生物疾患について治療されている対象における悪性新生物疾患の治療の効力を評価する場合、本方法は、
ａ）悪性新生物疾患について治療を受けている対象から生物学的試料を得るステップ
ｂ）本明細書に記載の前記生物学的試料から得られたＤＮＡ試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡの存在を分析する方法を実施するステップ；
ｃ）前記ＤＮＡ試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡの存在を検出するステップ；および
ｄ）悪性新生物疾患についての前記対象の治療間の１つ以上の時点においてステップａ）からｃ）を繰り返すステップ
を含み、経時的な前記ＤＮＡ試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡの相対存在の変化は、治療の効力を示す。

【0044】

したがって、有効な治療の指標は、本方法を繰り返すステップにおける事前の分析試料に対する前記ＤＮＡ試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡの存在の減少の相対変化である。

【0045】

場合により、当技術分野に公知の、または本明細書に記載の標準的なスコアリング系により、前記ＤＮＡ試料中の検出されたＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡのスコアリングを行うことができる。

【0046】

試料は、悪性新生物疾患を含む可能性がある任意の試料、好ましくは、悪性新生物疾患を有する対象からの生物学的試料であり得、その対象は、治療予定、治療の合間または現在治療中の患者である。

【0047】

悪性新生物疾患の再発を評価する場合、本方法は、
ａ）既に悪性新生物疾患を有した対象から生物学的試料を得るステップ、
ｂ）前記生物学的試料から得られたＤＮＡ試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡの存在を検出するステップ、
ｃ）悪性新生物疾患についての前記対象の治療後の１つ以上の時点においてステップａ）およびｂ）を繰り返すステップ
を含み、経時的な前記ＤＮＡ試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡの相対存在の変化は、悪性新生物疾患の再発を示し得る。

【0048】

したがって、再発の指標は、悪性新生物疾患を同定する前記ＤＮＡ試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡの増加量の相対変化、すなわち、本方法を繰り返すステップにおける事前の分析試料に対する前記ＤＮＡ試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡの存在の経時的増加である。

【0049】

本方法はまた、試料中のＰＩＫ３ＣＡのエクソン９中の突然変異の存在を検出するためのポリヌクレオチドであって、少なくとも配列５’−ＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴ−３’（配列番号３）、好ましくは、５’−ＡＣＴＣＣＡＴＡＧＡＡＡＡＴＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴ−３’（配列番号４）（Ｔは、突然変異部位を示し、Ａは、付加ミスマッチを示す）を含むか、またはそれからなる配列を含むか、またはそれからなるポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドは、有利には、上記の方法において、ＰＩＫ３ＣＡのエクソン９中の突然変異の存在を検出するための突然変異アレル特異的プライマーとして使用することができる。ポリヌクレオチドは、乳癌のための予後診断マーカーとして使用することができる。

【0050】

本発明はまた、試料中のＰＩＫ３ＣＡのエクソン２０中の突然変異の存在を検出するためのポリヌクレオチドであって、少なくとも配列５’−ＡＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧ−３’（配列番号８）、好ましくは、５’ＡＴＧＡＡＡＣＡＡＡＴＧＡＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧ−３’（配列番号９）（Ｇは、突然変異部位を示す）を含むか、またはそれからなる配列を含むか、またはそれからなるポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の方法において、ＰＩＫ３ＣＡのエクソン２０中の突然変異の存在を検出するための突然変異アレル特異的プライマーとして使用することができる。ポリヌクレオチドは、乳癌のための予後診断マーカーとして使用することができる。

【0051】

本発明はまた、試料、例えば、ＣＴＣ、ｃｔＤＮＡまたはＦＦＰＥ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡを検出するためのキットに関する。試料中のＰＩＫ３ＣＡ中の突然変異を検出するためのキットは、
ｉ）生物学的試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡを検出し、および／または
ｉｉ）対象における悪性新生物疾患を検出する；または
ｉｉｉ）対象における悪性新生物疾患を診断または予後診断する；または
ｉｖ）対象における悪性新生物疾患の治療のアウトカムを予測する；または
ｖ）対象における悪性新生物疾患の治療の効力を評価する、または
ｖｉ）対象における悪性新生物疾患の再発を評価するため
に使用することもできる。

【0052】

キットは、
− 試料中のＰＩＫ３ＣＡのエクソン９中の突然変異を検出するための第１のポリヌクレオチド（前記第１のポリヌクレオチドは、少なくとも配列５’ＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴ−３’（配列番号３）を含むか、またはそれからなり、好ましくは、前記第１のポリヌクレオチドは、５’−ＡＣＴＣＣＡＴＡＧＡＡＡＡＴＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴ−３’（配列番号４）を含むか、またはそれからなる）、および／または
− 試料中のＰＩＫ３ＣＡのエクソン２０中の突然変異を検出するための第２のポリヌクレオチド（前記第２のポリヌクレオチドは、少なくとも配列５’−ＡＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧ−３’（配列番号８）を含むか、またはそれからなり、好ましくは、前記第２のポリヌクレオチドは５’−ＡＴＧＡＡＡＣＡＡＡＴＧＡＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧ−３’（配列番号９）を含むか、またはそれからなる）を含み得る。第１および／または第２のポリヌクレオチドは、上記の方法において、突然変異アレル特異的プライマーとして使用することができる。

【0053】

キットは、少なくとも配列５’−ＣＴＧＡＴＣＡＧＴＧＡ−３’（配列番号５）およびＰＣＲブロッキング成分を含むか、もしくはそれからなる第３のポリヌクレオチド（好ましくは、前記第３のポリヌクレオチドは、５’−ＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＴＧＡＴＴＴＣＡＧＡＧ−Ｐ−３’（配列番号６）（Ｐは、リン酸であり、Ａは、付加ミスマッチである）を含むか、またはそれである）、ならびに／または少なくとも配列５’−ＴＧＣＡＣＡＴＣＡＴＧ−３’（配列番号１０）およびＰＣＲブロッキング成分を含むか、もしくはそれからなる第４のポリヌクレオチド（好ましくは、前記第４のポリヌクレオチドは、５’−ＧＡＡＴＧＡＴＧＣＡＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧ−Ｐ−３’（配列番号１１）（Ｐは、リン酸である）を含むか、またはそれである）をさらに含み得る。第３および／または第４のポリヌクレオチドは、上記の方法において、非標識ブロッキングプローブとして使用することができる。

【0054】

キットは、配列５’−ＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＧＡＧＡ−３’（配列番号７）に対して７５％から１００％の同一性を有する配列を有する第５のポリヌクレオチド、および／または配列５’−ＴＣＴＣＡＧＴＴＡＴＣＴＴＴＴＣＡＧＴＴＣＡＡＴＧＣ−３’（配列番号１２）に対して７５％から１００％の同一性を有する第６のポリヌクレオチドをさらに含み得る。第５および／または第６のポリヌクレオチドは、上記の方法において、共通プライマーとして使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0055】

【図1】本試験の実験フローチャートを説明する。

【図2A-D】エクソン９ １６３３Ｇ＞Ａ（Ａ）およびエクソン２０ ３１４０Ａ＞Ｇ（Ｂ）について開発されたＰＩＫ３ＣＡ突然変異アッセイの特異度ならびにエクソン９ １６３３Ｇ＞Ａ（Ｃ）およびエクソン２０ ３１４０Ａ＞Ｇ（Ｄ）について開発されたＰＩＫ３ＣＡ突然変異アッセイの感度を示す。

【図3A-D】エクソン９ １６３３Ｇ＞Ａ（Ａ）およびエクソン２０ ３１４０Ａ＞Ｇ（Ｂ）についての手術可能な乳癌を有する患者におけるＣＴＣ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異の検出を示す。エクソン９ １６３３Ｇ＞Ａ（Ｃ）およびエクソン２０ ３１４０Ａ＞Ｇ（Ｄ）についての臨床的に確認された転移を有する患者におけるＣＴＣ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異の検出。

【図4】ＣＴＣ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異状態に関して臨床的に確認された転移を有する乳癌を有する患者についての月数におけるＯＳを推定するカプラン・マイヤー曲線を示す。

【図5】エクソン９ １６３３Ｇ＞Ａ（Ａ、Ｂ）およびエクソン２０ ３１４０Ａ＞Ｇ（Ｃ）についての臨床的に確認された転移性乳癌を有する患者における無細胞ＤＮＡ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異の検出を示す。

【図6】本方法の原理を表す。

【図7】エクソン９および２０についてのヌクレオチド配列を表す。

【0056】

定義
本発明において使用される用語は、一般に、分子生物学の当業者により一般に受け入れられる標準的な定義に従うことが求められる。以下に挙げるいくつかの例外を本発明の範囲内でさらに定義した。

【0057】

本明細書において使用される「少なくとも１つ」は、１つ以上、すなわち、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０などを意味する。

【0058】

本明細書において使用される「検出」、「検出する」、「検出すること」は、対照を参照してまたは参照しない定性および／または定量的検出（レベルの計測）を含み、所与のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡ分子の存在、不存在、または量の同定をさらに指す。

【0059】

本明細書において使用される用語「核酸配列」、「核酸分子」、「核酸」などは、核酸塩基のストリングを含むポリヌクレオチド分子（ＤＮＡ−デオキシリボ核酸、またはＲＮＡ−リボ核酸）を指す。これらの核酸塩基は、「Ａ」（アデニン）、「Ｔ」（チミジン）／「Ｕ」（ウラシル）、「Ｃ」（シチジン）および「Ｇ」（グアニジン）である。ＲＮＡにおいて、「Ｔ」は、「Ｕ」により置き換えられる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖でも二本鎖でもよい。本明細書においてＤＮＡ配列として表現される核酸配列「に対応する」ＲＮＡ配列により、対応するＲＮＡ配列を得るために「Ｔ」が「Ｕ」により置き換えられる同一の核酸配列が意図される。用語「核酸」は、一方または他方が具体的に言及されない限り、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列の両方を含み得る。

【0060】

核酸分子（ＤＮＡおよびＲＮＡ分子）と関連して本明細書において使用される用語「単離」は、分子がその元の環境から除去されていることを意味する。これは、生存生物中に存在する場合、核酸分子が「単離」されていないことを意味する。化学結合の破壊および／または他の手段により配列をその天然環境から分離することは、核酸分子が「単離」されていることを意味する。

【0061】

本明細書において使用される用語「プライマー」は、合成により産生され、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下で、すなわち、ヌクレオチドおよび重合のための薬剤、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などの存在下で、好適な温度およびｐＨにおいて配置される場合に核酸合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、好ましくは、最大の効率のために一本鎖であるが、代替的に二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、最初にその鎖を分離するように処理してから使用して伸長産物を調製する。プライマーは、重合のための薬剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングするために十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、多くの因子、例として、温度およびプライマー源に依存する。例えば、標的配列の複雑性に応じて、プライマーは、典型的には、１５から２５以上のヌクレオチドを含有するが、それは、より少ないヌクレオチドを含有し得る。短鎖プライマー分子は、一般に、十分に安定なテンプレートとのハイブリッド複合体を形成するためにより冷温を要求する。

【0062】

用語「突然変異アレル特異的プライマー」は、突然変異アレル配列にハイブリダイズし、突然変異を有する場合にのみ、プライマーが好適な条件下で核酸ポリメラーゼにより効率的に伸長される点において標的配列のバリアントを区別し得るプライマーを指す。標的配列の他のバリアントについては、伸長はそれほど効率的でなく、または非効率的である。

【0063】

用語「フォワードプライマー」は、変性ＤＮＡ検体の鎖の３’末端への５’から３’方向の結合により伸長産物を形成するプライマーを指す。

【0064】

用語「リバースプライマー」は、変性ＤＮＡ検体の鎖の５’末端への３’から５’方向の結合により伸長産物を形成するプライマーを指す。

【0065】

用語「アンプリコン」は、核酸伸長アッセイ、例えば、ＰＣＲの増幅産物を指す。

【0066】

用語「非標識プローブ」は、色素に共有結合しておらず、標的配列に完全にまたは部分的にハイブリダイズするように構成されるオリゴヌクレオチドを指す。混合物中に存在する色素は、特にプローブが標的配列にハイブリダイズし、それから融解する場合に非標識プローブに自由に結合またはそれから解離する。

【0067】

ブロッキングプローブまたは競合プローブという用語は、野生型アレル配列に相補的であり、突然変異アレル特異的プライマーと競合して非特異的野生型産物の増幅を回避するオリゴヌクレオチドを指す。

【0068】

オリゴヌクレオチドに関連して本明細書において使用される用語「融解温度」（Ｔｍ）は、ＤＮＡの５０％が安定な二重らせんを形成し、他の５０％が一本鎖分子に分離した温度として定義される。当業者に公知のとおり、ＰＣＲアニーリング温度は、典型的には、Ｔｍよりも数度低く、それは反応中のオリゴおよび塩濃度に基づき計算される。

【0069】

用語「相補的」または「相補性」は、ワトソン・クリック塩基対合則により関連するポリヌクレオチドの逆平行鎖を参照して使用される。用語「完全に相補的」または「１００％相補的」は、逆平行鎖間の全ての塩基のワトソン・クリック対合を有する相補的配列を指し、すなわち、ポリヌクレオチド二本鎖中の任意の２つの塩基間のミスマッチが存在しない。しかしながら、二本鎖は、完全な相補性の不存在下でも逆平行鎖間で形成される。用語「部分的に相補的」または「不完全に相補的」は、１００％完全未満の逆平行ポリヌクレオチド鎖間の塩基の任意のアラインメントを指す（例えば、ポリヌクレオチド二本鎖中の少なくとも１つのミスマッチまたは非マッチ塩基が存在する）。部分的に相補的な鎖間の二本鎖は、一般に、完全に相補的な鎖間の二本鎖よりも安定でない。

【0070】

用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用される。「オリゴヌクレオチド」は、より短鎖のポリヌクレオチドを説明するために使用されることもある用語である。

【0071】

用語「ハイブリダイズされた」および「ハイブリダイゼーション」は、二本鎖の形成をもたらす２つの核酸間の塩基対合相互作用を指す。ハイブリダイゼーションを達成するために全長にわたり２つの核酸が１００％の相補性を有することは要求されない。

【0072】

本文書において使用される「そのバリアント（ｖａｒｉａｎｔ ｔｈｅｒｅｏｆ）」または「そのバリアント（ｖａｒｉａｎｔｓ ｔｈｅｒｅｏｆ）」などは、少なくとも８５％または少なくとも９０％、例えば、８５〜１００％、８６〜１００％、８７〜１００％、８９〜１００％、９０〜１００％、９１〜１００％、９２〜１００％、９３〜１００％、９４〜１００％、９５〜１００％、９６〜１００％、９７〜１００％、９８〜１００％、９９〜１００％または約１００％の規定の核酸配列に対する同一性を有する核酸配列が意図される。

【0073】

ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、核酸分子の増幅のための方法である。ＰＣＲ反応は、当業者に周知であり、プライマーおよびプライマーへの相補性を有し、標的配列を増幅するために試料中に存在する可能性がある標的（テンプレート）配列間のハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料をいわゆるオリゴヌクレオチドプライマーのペア（１つのフォワードおよび１つのリバースプライマー）と接触させることを含む。

【0074】

本明細書において使用される「診断」は、疾患の性質の同定を包含する。

【0075】

本明細書において使用される「予後診断」は、疾患の性質および症状により示される疾患の推定アウトカムに関する予想、疾患からの回復に関する見込みを包含する。

【0076】

「真陽性」は、限局性または転移性悪性新生物中のＰＩＫ３ＣＡ特異的突然変異の存在を指す。

【0077】

「偽陰性」は、限局性または転移性悪性新生物のいずれかにおける、診断アッセイによりそれとして分類されないＰＩＫ３ＣＡ特異的突然変異の存在を指す。

【0078】

「真陰性」は、限局性悪性新生物も転移性悪性新生物も有さず、診断アッセイによりそれとして分類されない対象を指す。

【0079】

「偽陽性」は、限局性悪性新生物も転移性悪性新生物も有さないが、慣用の診断アッセイにより限局性または転移性悪性新生物を有すると分類される対象を指す。

【0080】

状況に応じて、用語「偽陽性」は、悪性新生物を有さないが、診断アッセイにより悪性新生物または非悪性疾患を有すると分類される対象も指し得る。

【0081】

診断アッセイへの適用の文脈で本明細書において使用される「感度」は、正確にそれと同定される限局性または転移性悪性新生物を有する全ての対象の比率（すなわち、真陽性の数を真陽性および偽陰性の総数により割ったもの）を指す。

【0082】

診断アッセイへの適用の文脈で本明細書において使用される診断アッセイの「特異度」は、正確にそれと同定される限局性悪性新生物も転移性悪性新生物も有さない全ての対象の比率（すなわち、真陰性の数を、真陰性および偽陽性の総数により割ったもの）を指す。

【0083】

用語「新生物」または「腫瘍」は、互換的に使用することができ、塊状物の成長が正常組織の成長を上回り、正常組織の成長と協調しない異常な組織塊状物を指す。新生物または腫瘍は、以下の特徴：細胞分化の程度、例として、形態および機能性、成長速度、局所侵入および転移に応じて「良性」または「悪性」と定義することができる。「良性」新生物は、一般に、十分分化しており、悪性新生物よりも特徴的に緩慢な成長を有し、出現部位に局在したままである。さらに、良性新生物は、遠位部位に浸潤する能力も、侵入する能力も、転移する能力も有さない。

【0084】

「悪性」新生物は、一般に、分化が不十分であり（未分化）、進行性浸潤、侵入、および周囲組織の破壊を伴う特徴的に急速な成長を有する。さらに、悪性新生物は、遠位部位に転移する能力を有する。用語「転移」は、一次（原発性）腫瘍からの、別の器官または組織への癌性細胞の拡散または移動を指し、典型的には、一次（原発性）腫瘍の組織型のものであり、二次（転移性）腫瘍が局在する器官または組織のものでない「二次腫瘍」または「二次細胞塊」の存在により同定可能である。例えば、骨に移動した肺の癌腫は転移性肺癌と言われ、骨組織中で成長する上皮肺細胞から生じる癌細胞からなる。

【0085】

「健常」は、良好な健康状態を保有する対象を指す。このような対象は、任意の悪性または非悪性疾患の不存在を実証する。この適用の文脈において、「健常個体」は、それらが任意の悪性または非悪性疾患の不存在を有するという点でのみ健常であり；「健常個体」は、通常、「健常」とみなされない他の疾患または病態を有し得る。

【0086】

本明細書において使用される「対象」としては、ヒト、非ヒト霊長類、例えば、チンパンジーおよび他の類人猿およびサル種、家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ、家庭向き哺乳動物、例えば、イヌおよびネコ、実験動物、例として、げっ歯類、例えば、マウス、ラットおよびモルモットなどが挙げられる。この用語は、特定の年齢も性別も示さない。したがって、成体および新生児対象、ならびに胎児が、雄雌にかかわらず含まれるものとする。好ましい実施形態において、対象は哺乳動物、例として、ヒトおよび非ヒト哺乳動物である。最も好ましい実施形態において、対象はヒトである。

【0087】

「血漿（ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ）」または「血漿（ｐｌａｓｍａ）」は、通常、懸濁液中の全血中の血球を保持する血液のわら色／薄黄色の液体成分である。これは、総血液の約５５容量％を構成する。これは、細胞外液（細胞外側の全ての体液）の血管内液部分である。これは、ほぼ水であり（９３容量％）、溶解タンパク質、例として、アルブミン、免疫グロブリン、およびフィブリノゲン、グルコース、凝固因子、電解質（Ｎａ^＋、Ｃａ^２＋、Ｍｅ^２＋、ＨＣＯ^３−、ＣＩ⁻など）、ホルモンおよび二酸化炭素を含有する。

【0088】

本明細書において使用される「生物学的試料」は、悪性新生物を有する、または有さない任意の対象から得られる種々の試料タイプを包含する。典型的な対象は、ヒトである。例えば、生物学的試料としては、悪性新生物を有すると疑われる個体から回収された組織液または血液から得られる試料が挙げられる。

【0089】

本明細書において使用される用語「治療」は、医薬的または外科的手段を介する患者の管理として定義される。治療は、医学的病態または疾患の少なくとも１つの症状を改善または緩和し、治癒を提供することが要求される。本明細書において使用される用語「治療アウトカム」または「治療のアウトカム」は、治療の患者に対する身体的効果である。

【0090】

本明細書において使用される循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）という用語は、一次腫瘍から血管系中に排出され、血流中で循環する細胞である。したがって、ＣＴＣは、生体遠位器官中の後続の付加的腫瘍（転移）の成長のためのシードを構成し、圧倒的多数の癌関連死を担う機序を誘発する。

【0091】

無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）という用語は、アポトーシスまたは微小環境ストレスにより誘導される他の生理学的イベントを受ける細胞から循環に放出されるＤＮＡを指す。ｃｆＤＮＡは、癌を有する患者の血液中で検出することができる。

【0092】

循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）という用語は、一次腫瘍の細胞から循環に放出され、一次腫瘍または転移性腫瘍の状態についての情報を提供するＤＮＡを指す。

【0093】

本明細書において使用されるＰＩＫ３ＣＡという用語は、「ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスリン酸３−キナーゼ触媒サブユニットアルファ」と呼ばれる遺伝子の正式名称を指す。ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ＡＫＴシグナリング経路は、ヒト疾患、例として、癌に関与し、この経路の複雑性の理解は、治療介入のための新たな手段を提供し得る。ＰＩ３Ｋのｐ１１０α触媒サブユニット中の体細胞突然変異は極めて高頻度であり、分子標的療法に対する応答における重要な役割を担い、乳癌におけるＨＥＲ−２増幅と同時に生じることが多い。ＰＩＫ３ＣＡの突然変異は、乳癌患者の１８〜４０％において報告されている一方、症例の約９０％をなす圧倒的多数は、ヘリカルおよびキナーゼドメインをそれぞれコードするエクソン９およびエクソン２０中の２つのホットスポット領域に集中している。ＰＩ３Ｋ経路の異常な活性化は、ＨＥＲ２指向療法に対する応答の縮小と相関する。それというのも、トラスツズマブにより治療されたＨＥＲ２陽性患者のアウトカムは、野生型腫瘍と比較してＰＩＫ３ＣＡ突然変異を有する患者において有意に悪いためである。

【0094】

突然変異アレルＤＮＡという用語は、参照配列によるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子中の２つのエクソン間の少なくとも１つの突然変異を含むＤＮＡ配列を指す。突然変異アレルＤＮＡは、エクソン９中の１６３３Ｇ＞Ａホットスポット突然変異またはエクソン２０中の３１４０Ａ＞Ｇホットスポット突然変異のいずれかを有し得た。

【0095】

突然変異は、配列が参照配列中で見出されるものと異なるように遺伝子を構成するＤＮＡ配列中の恒久的変化である。突然変異は、サイズに幅があり；それらは、単一ＤＮＡビルディングブロック（塩基対）から複数の遺伝子を含む染色体の大きなセグメントまでいずれの場所にも影響し得る。

【0096】

本明細書において使用される用語「参照ゲノム」または「参照配列」は、対象からの同定配列を参照するために使用することができる任意の生物またはウイルスの任意の特定の公知ゲノム配列（部分であるか完全であるかを問わない）を指す。例えば、ヒト対象および多くの他の生物に使用される参照ゲノムは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおけるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにおいて見出される。「ゲノム」は、核酸配列で表現される生物またはウイルスの完全な遺伝子情報を指す。

【0097】

用語「野生アレル鎖」は、特定の天然集団において最も一般的な表現型をコードするＤＮＡ配列を指す。もともと野生型は、非標準的「突然変異」アレルにより産生されるものと対照的に遺伝子座における標準的「正常」アレルの産物として概念化された。

【0098】

用語「ホットスポット突然変異」は、平均配列よりも遺伝子損傷／変化を受けやすい染色体領域において生じる突然変異を指す。

【発明を実施するための形態】

【0099】

本発明は、例えば、循環腫瘍細胞または循環腫瘍ＤＮＡの試料中のＰＩＫ３ＣＡホットスポット突然変異の高スループット突然変異検出のための超高感度および高度に特異的な分子的方法を提供する。ＰＩＫ３ＣＡ突然変異の重要性は、乳癌における分子標的療法に対する応答に関連する。

【0100】

材料および方法
患者
訓練群として、合計７８の試料を分析した：ｉ）６３の末梢血試料；アッセイの特異度を規定するために使用される臨床的に確認された転移を有する患者からの３７および健常女性被験者からの２６、およびｉｉ）１５の一次乳腫瘍組織（ＦＦＰＥ）。独立群として、合計１７５の末梢血試料を、手術可能な乳癌を有する１１８人の患者および臨床的に確認された転移を有する５７人の患者から得；さらに、それらの乳癌患者の７６人（転移を有する３２人および手術可能な乳癌を有する４４人）については、一次腫瘍からのＦＦＰＥも分析した。１５７のこれらの試料については、ＥｐＣＡＭ陽性ＣＴＣ分画中のＣＫ−１９の発現に関する情報も従来の研究を介して利用可能であった。手術可能な乳癌を有する１１８人の患者の独立群において、９人の患者が再発し、疾患進行に起因して死亡した（フォローアップ中央値：４２ヵ月）。さらに、ＨＥＲ２＋腫瘍を有する患者はトラスツズマブを１２ヵ月間受けた一方、ＨＲ＋腫瘍を有する患者は内分泌治療を受けた（ＬＨ／ＲＨ類似体とタモキシフェンまたはアロマターゼ阻害剤のいずれか）。アジュバント放射線療法も、ガイドラインに従って施した。全ての試験参加者は、機関の倫理および科学委員会により承認されたインフォームドコンセントフォームに署名して試験に参加した。

【0101】

ＣＴＣの陽性免疫磁気選択
ＣＴＣを、既に記載のとおり２０ｍＬの末梢血から単離した［Ｓｔｒａｔｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ ＲＴ−ｑＰＣＲ．ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ２０１１；１１：４２２］。より具体的には、２０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ＝７．３）による末梢血の希釈後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ ＡＢ）を６７０ｇにおいて室温において３０分間使用する密度勾配遠心により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。界面の細胞を除去し、４０ｍＬの無菌ＰＢＳ（ｐＨ＝７．３、４℃）により５３０ｇにおいて１０分間、２回洗浄し、１０ｍＬのＰＢＳ中で再懸濁させた。細胞をトリパンブルーにより染色し、血球計数器中で計数した。免疫磁性Ｂｅｒ−ＥＰ４［抗上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）］コート捕捉ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して上皮細胞を濃縮した。

【0102】

ＣＴＣからのＤＮＡ抽出
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、既に記載のとおりＣＴＣから抽出した［Ｃｈｉｍｏｎｉｄｏｕ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２０１１；５７：１１６９−７７］。Ｔｒｉｚｏｌの水相の除去後、１５０μｌの１００％エタノールを添加することによりＤＮＡを（界面から）沈殿させた。試料を反転により混合し、室温において２〜３分間保持し、次いでＤＮＡを遠心分離（２０００ｇ、５分間、４℃）において堆積させ、０．１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウムを１０％エタノール（５００μｌ）中で含有する溶液中で２回洗浄した。それぞれの洗浄後、ＤＮＡペレットを洗浄溶液中で室温において定期的に混合しながら３０分間貯蔵し、遠心分離した（２０００ｇ、５分間、４℃）。これらの２回の洗浄後、ＤＮＡペレットを１ｍＬの７５％エタノール中で懸濁させ、室温において定期的に混合しながら１０〜２０分間保持し、遠心分離した（２０００ｇ、５分間、４℃）。次いで、単離ｇＤＮＡを１５分間空気乾燥させ、５０μｌの８ｍｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ中で溶解させた。ＤＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ−１０００分光光度計中で決定した。患者試料に使用されたものと全く同一の手順を使用することにより、特異度試験のために回収された２６人の女性健常被験者からの末梢血を処理した。

【0103】

血漿からのＤＮＡ抽出
ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄキット（ＱＩＡＧＥＮ）を製造業者の説明書に従って使用して無細胞ＤＮＡを血漿試料から単離した。最初に、ＥＤＴＡ中の末梢血試料を１時間以内に血漿中の単離に使用し、血漿試料をｃｆＤＮＡ単離まで−７０℃において貯蔵した。ｃｆＤＮＡ単離直前、血漿試料を室温において解凍し、１３，４００ｇで４℃において１０分間遠心分離して残留沈殿細胞成分を除去した。全てにおいて、２．００ｍＬの血漿を作業溶液の１．６ｍＬのＢｕｆｆｅｒ ＡＣＬ（１．０μｇのキャリアＲＮＡを含有）および２００μｌのプロテイナーゼＫ（１８ｍｇ ｍｌ^−１）と混合し、６０℃において３０分間インキュベートした。次いで、ＤＮＡ単離を、製造業者のプロトコルに記載のとおり処理した。

【0104】

プライマーおよびプローブ設計
全てのオリゴヌクレオチドは、ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５ソフトウェア（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用することによりＰＩＫ３ＣＡエクソン９（配列番号１）およびエクソン２０（配列番号２）のそれぞれについてデノボインシリコ設計し、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｒｇｒａｄｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した。エクソン９（配列番号１）およびエクソン２０（配列番号２）についての配列は、図７参照。それぞれのエクソンについて、１つのアレル特異的プライマー（エクソン９についての１６３３Ｇ＞Ａ突然変異およびエクソン２０についての３１４０Ａ＞Ｇ突然変異にマッチしている）、１つの非標識競合ブロッキングプローブ、および非対称増幅のための１つのプライマーを、Ｚｈｏｕらの研究［Ｚｈｏｕ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｒａｒｅ ａｌｌｅｌｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ，ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｐｒｏｂｅ ｂｌｏｃｋｉｎｇ，ａｎｄ ｍｅｌｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２０１１；５０：３１１−８］に従って設計した。エクソン９について、エクソン９のホットスポット突然変異を含む領域（７０ｂｐ）を増幅するようにプライマーセットＳ１を設計した。リバースプライマー（アレル特異的プライマー）は、３０末端を由来アレルにマッチさせることにより突然変異アレルを増幅するように設計した。非標識プローブおよびフォワードプライマーは、野生型とマッチさせるように設計した。ブロッキングプローブは、感度増加のためのアレル特異的プライマーと競合する。エクソン２０について、エクソン２０のホットスポット突然変異を含む領域（１０４ｂｐ）を増幅するようにプライマーセットＳ２を設計した。フォワードプライマー（アレル特異的プライマー）は、３０末端を由来アレルにマッチさせることにより突然変異アレルを増幅するように設計した。非標識プローブおよびリバースプライマーは、野生型とマッチさせるように設計した。ホットスポット突然変異は、可能な限り非標識プローブの中央近くに配置した。全てのプライマーおよびプローブは、ＰＩＫ３ＣＡのエクソン９に対して＞９５％の相同性を有する第２２染色体上の偽遺伝子の増幅を回避するように留意して設計した。全てのプライマーおよびプローブ配列を表１に詳細に挙げる。

【0105】

【表1】

【0106】

ＰＣＲおよび融解分析
リアルタイムＰＣＲおよび融解曲線は、ガラスキャピラリーチューブ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ ３２（Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）を使用して得た。しかしながら、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ２．０（ＩＶＤ）装置およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用することにより同一の結果を得ることもできた。ＬＣ−Ｇｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ（Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）を蛍光計測に使用した。ＭＣＦ−７（ｃ．１６３３Ｇ＞Ａ：Ｅ５４５Ｋ；ヘテロ接合）、およびＴ４７Ｄ（ｃ．３１４０Ａ＞Ｇ：Ｈ１０４７Ｒ；ヘテロ接合）乳癌細胞系から単離された２つのｇＤＮＡ試料を、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異対照として使用した。それぞれのエクソンについてのＰＣＲ条件および融解分析プロトコルを表２に詳述する。それぞれのエクソンについてのＰＣＲ反応ミックスを表３に詳述する。

【0107】

【表2】

【0108】

【表3】

【0109】

統計分析
カイ二乗検定を使用することにより、ＣＴＣおよび一次腫瘍中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異状態間の相関を評価した。定性項目についての判定者間一致率または被験者間一致率の統計的尺度であるコーエンカッパ係数を、ＣＴＣおよび一次腫瘍中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異間、ならびにＣＴＣ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異およびＣＫ−１９ ｍＲＮＡ発現間の一致率の評価に使用した。それというのも、それは一般に、ｋが偶然に生じる一致率を考慮するために単純な一致率計算よりもロバストな尺度であると考えられるためである。カプラン・マイヤー法を使用することにより無病期間（ＤＦＩ）および全生存（ＯＳ）曲線を計算し、ログランク検定を使用して比較を実施した。＜０．０５のｐ値を統計的に有意とみなした。ＳＰＳＳ Ｗｉｎｄｏｗｓバージョン１９．０（ＳＰＳＳ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を使用して統計分析を実施した。

【0110】

実施例１
ＰＩＫ３ＣＡホットスポット突然変異のための超高感度および高特異度の方法の開発およびバリデーション
本試験の実験フローチャートを図１に概説する。

【0111】

最初に、ＣＴＣ中のＰＩＫ３ＣＡホットスポット突然変異（エクソン９および２０）のための超高感度および高特異度の方法を開発し、バリデートした。このアッセイは、密閉チューブフォーマットで実施し、アレル特異的プライミング、野生型増幅の競合プローブブロッキング、非対称ＰＣＲ、およびプローブ融解分析の組合せに基づく［Ｍａｒｋｏｕ Ａ，ｅｔ ａｌ．ＰＩＫ３ＣＡ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｃｈａｎｇｅ ｄｕｒｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１４ Ｎｏｖ １５；２０（２２）：５８２３−３４］。このアッセイ設計において、アレル特異的ＰＣＲ感度および特異度は、非対称増幅およびプローブ融解分析により、非標識競合野生型特異的ブロッキングプローブについて向上した。６０℃におけるこの非標識競合プローブの融解分析ピークは、両方のエクソン中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異の存在を示し得た。非標識ブロッキングプローブおよびＷＴアレル特異的プライマーにより増幅されるＷＴ ＰＩＫ３ＣＡエクソン９のＤＮＡテンプレートの導関数融解曲線のピーク、ならびに非標識ブロッキングプローブおよび突然変異アレル特異的プライマーにより増幅される突然変異ＰＩＫ３ＣＡエクソン９のＤＮＡテンプレートの融解曲線のピークは、両方の場合において約４℃異なる（結果は示さず）。突然変異アレルを標的化する全ての実験において、突然変異は、この非標識ブロッキングプローブおよび突然変異アレル特異的プライマーにより増幅される突然変異ＰＩＫ３ＣＡ配列の導関数融解により検出される。したがって、突然変異は、このより低温の６０℃におけるこのピークが存在する場合にのみ検出される。ＰＣＲ産物に起因し、より高温において検出することができる他のピークは、ＷＴの非特異的増幅が存在する場合、突然変異アレル特異的プライマーを使用することにより、突然変異体およびＷＴの両方について確認することができる。全てのプライマーおよびプローブは、ＰＩＫ３ＣＡのエクソン９に対して＞９５％の相同性を有する第２２染色体上の偽遺伝子の増幅を回避するように留意してＰＩＫ３ＣＡエクソン９および２０のそれぞれについてデノボインシリコ設計した。

【0112】

プロトコル最適化。ＰＩＫ３ＣＡ突然変異アッセイは、ＰＣＲアニーリング温度、Ｍｇ^＋２濃度、プライマーおよび非標識プローブ濃度、ＰＣＲサイクルの数、それぞれの非対称ＰＣＲステップの継続時間、非対称ＰＣＲについてのプライマー比および標的ＤＮＡの量、ならびに融解分析条件に関して、陽性および陰性対照として癌細胞系（ＭＣＦ−７およびＴ４７Ｄ）からのｇＤＮＡ試料および健常ドナーから単離された野生型（ＷＴ）ｇＤＮＡを使用する多数の実験において両方のエクソンについて広く最適化した（データ示さず）。

【0113】

ＣＴＣ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異の検出のための低い検出限界を有する高特異度の方法を開発するため、最初にプロトコルおよび条件を最良の結果により最適化した。アレル特異的ＰＣＲ増幅および検出は、非対称ＰＣＲ、野生型ブロッキングプローブ、およびプローブ融解分析を使用することにより向上した。希少アレル濃縮は、アレル特異的プライマーと比較して過剰のブロッキングプローブおよび共通プライマーについて最適であった。突然変異アレル特異的プライマーの濃度が減少するにつれて特異度が増加する一方、ＰＣＲ効率が減少することが観察された。特異度の増加は、野生型およびＰＩＫ３ＣＡ ＤＮＡ間のΔＣｑにより反映された。ＰＣＲ効率の減少は、ＰＩＫ３ＣＡ ＤＮＡのＣｑの増加により証明された。ＰＣＲ効率は、いずれかのプライマーの濃度の減少により影響を受けたが、より低濃度の突然変異アレル特異的プライマーのみが特異度を増加させた。より低いＰＣＲ効率を補うため、典型的には８０サイクルを実施した。

【0114】

ブロッキングプローブによるアレル特異的濃縮は、アニーリング／伸長温度により影響を受ける。アニーリング／伸長温度が、マッチ野生型アレルおよびミスマッチ突然変異アレルについての野生型ブロッキングプローブの融解温度（Ｔｍ）の間である場合、特異度は最適である。アニーリング温度が突然変異アレルのＴｍ以下である場合、プローブは、野生型および突然変異アレルの両方の増幅を抑制し、感度を制限する。アニーリング温度が野生型アレルのＴｍ以上である場合、優先的なブロックおよびＰＣＲ効率が減少し、感度を制限する。

【0115】

実施例２
特異度試験。最初に、乳癌を有する患者について順守された全く同一の手法で２６人の健常女性被験者から単離されたｇＤＮＡを分析することにより、開発された方法のアッセイ特異度を評価した。開発された方法は高度に特異的である。それというのも、それらの試料のいずれにおいても、両方のＰＩＫ３ＣＡエクソン中の任意の突然変異を有する健常女性ドナーの例が存在しなかったためである。図２ＡおよびＢは、開発されたＰＩＫ３ＣＡ突然変異アッセイの特異度を示し、エクソン９ １６３３Ｇ＞Ａホットスポット突然変異（Ａ）およびエクソン２０ ３１４０Ａ＞Ｇホットスポット突然変異（Ｂ）を検出する非標識ブロッキングプローブの存在下でＰＣＲ後に得られた特徴的な導関数融解曲線を示す。ベースラインは、ＰＣＲ陰性対照である。ＰＩＫ３ＣＡ突然変異は、非標識ブロッキングプローブおよび突然変異アレル特異的プライマーにより増幅される突然変異ＰＩＫ３ＣＡ配列の導関数融解により検出される。突然変異は、６０℃におけるこのピークが存在する場合にのみ検出される。より高温における他のピークはＰＣＲ産物に起因し、ＷＴの非特異的増幅が存在する場合、突然変異アレル特異的プライマーを使用することにより、突然変異体およびＷＴの両方について確認することができる。

【0116】

図２ａ、エクソン９において確認することができるとおり、健常ドナーのｇＤＮＡの１つ（Ｎ１８）は、増幅不応性突然変異系（ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（ＡＲＭＳ）ＰＣＲ特異的プライマーにより増幅され、７７．５℃におけるピークを与えたが、６０．０℃においては与えなかった。これは、ＰＩＫ３ＣＡホットスポット突然変異特異的プライマーを使用することによっても、極めて高濃度において存在する極めて少量の野生型配列が非特異的に増幅され得るという事実により説明することができた。これを回避するため、ブロッカーとして重要な役割を担う非標識プローブを使用した。それというのも、それは野生型特異的であり、突然変異特異的プライマーと同一の配列に結合するためである。Ｎ１８の例において、このＷＴ配列が非特異的に増幅され、これが７７．５℃における融解曲線ピークが検出された理由である。しかしながら、これは、本発明者らが求めている特異的突然変異の存在を特異的に示す６０．０℃における非標識プローブについての融解曲線において検出されるいかなるピークでもない。これらの結果は、本方法の１００％の特異度を裏付ける。

【0117】

実施例３
感度試験。細胞系からの突然変異ｇＤＮＡを、５０％、２５％、１２．５％、２．５％、１．２５％、０．５％、０．２５％、０．１２５％、および０．０５％の比においてＷＴ ｇＤＮＡと混合することにより、開発された方法の感度をさらに評価した（エクソン９ １６３３Ｇ＞Ａホットスポット突然変異については図２Ｃ参照、およびエクソン２０ ３１４０Ａ＞Ｇホットスポット突然変異については図２Ｄ参照）。希釈物に使用されるＷＴ ｇＤＮＡ試料は、ＰＣＲバイアスを最小化するように突然変異ｇＤＮＡ量、質、および定量サイクル（Ｃｑ）をマッチさせるように選択した。融解曲線を作成し、細胞系希釈物の融解転移をＷＴ試料のものから区別する能力を評価した。エクソン９については、０．０５％のＭＣＦ−７細胞系（図２Ｃ）に対応する希釈物を明らかに区別することが可能であった一方、エクソン２０については、それは０．０５％の比のＴ４７Ｄ細胞系希釈物（図２Ｄ）も区別し得た。融解曲線は高度に再現可能であった。

【0118】

両方のエクソンについて、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異は、非標識ブロッキングプローブおよび突然変異アレル特異的プライマーにより増幅される突然変異ＰＩＫ３ＣＡ配列の導関数融解により検出される。突然変異は、６０℃におけるこのピークが存在する場合にのみ検出される。より高温における他のピークは、ＰＣＲ産物に起因し、ＷＴの非特異的増幅が存在する場合、突然変異アレル特異的プライマーを使用することにより、突然変異体およびＷＴの両方について確認することができる。

【0119】

特に、ＣＴＣの分子特徴付けについての信頼できる情報を得るため、使用される突然変異検出系の感度、特異度、およびロバストネスは極端に重要である。ＰＩＫ３ＣＡ突然変異のための高感度の方法が、ＨＲＭＡに基づき開発されている［Ｖｏｒｋａｓ ＰＡ，ｅｔ ａｌ．ＰＩＫ３ＣＡ ｈｏｔｓｐｏｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｍａｌｌ ａｍｐｌｉｃｏｎ ｍｅｌｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ．Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ ２０１０；１２：６９７−７０４］。この方法は慣習的なサンガーシーケンシングよりもかなり高感度（１％）であるという事実にもかかわらず、このアッセイがＣＴＣ試料中で適用された場合、ＣＴＣ中の突然変異の検出が不良であった。

【0120】

実施例４
臨床的に確認された転移乳癌を有する患者のＥｐＣＡＭ陽性ＣＴＣおよび一次組織（ＦＦＰＥ）中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異の検出
訓練群として、臨床的に確認された転移を有する患者からの３７の末梢血試料および１５の一次乳腫瘍組織（ＦＦＰＥ）を、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異について分析した。ＰＩＫ３ＣＡ突然変異は、ＥｐＣＡＭ陽性ＣＴＣ分画中でエクソン９について６人／３７人の患者（１６．２％）およびエクソン２０について４人／３７人の患者（１０．８％）において検出された。合計して、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異は、転移性乳癌を有する１０人／３７人（２７．０％）の患者において検出された。一次乳腫瘍組織において、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異は、エクソン９について９／１５（６０．０％）およびエクソン２０について７／１５（４６．７％）において検出された。両方のホットスポット突然変異が同一のＦＦＰＥ試料中で検出された６つの例が存在し；合計して、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異は１０／１５（６６．７％）のＦＦＰＥ試料中で検出された。

【0121】

実施例５
独立群。続いて、手術可能な乳癌を有する１１８人の患者および臨床的に確認された転移を有する５７人の患者の独立群においてアッセイを評価した。乳癌を有するそれらの患者の７６人については、一次腫瘍からのＦＦＰＥも利用可能であった。

【0122】

手術可能な乳癌患者のＣＴＣ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異の検出。
独立群において、一次癌が摘出された後、アジュバント化学療法が開始される前の手術可能な乳癌を有する１１８人の患者からのＥｐＣＡＭ陽性ＣＴＣ分画を分析した。ＰＩＫ３ＣＡ突然変異は、エクソン９ １６３３Ｇ＞Ａ（Ａ）ホットスポット突然変異（図３Ａ）について３人／１１８人（２．５％）、およびエクソン２０ ３１４０Ａ＞Ｇホットスポット突然変異（図３ｂ）について２１人／１１８人（１７．８％）において検出された。両方のホットスポット突然変異がＣＴＣ試料中で検出された１つの例が存在した。合計して、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異は、２４人／１１８人（２０．３％）の手術可能な乳癌患者において検出された。ベースラインはＰＣＲ陰性対照である。

【0123】

臨床的に確認された転移を有する乳癌患者のＣＴＣ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異の検出。
独立群において、転移性乳癌を有する５７人の患者からのＥｐＣＡＭ陽性ＣＴＣ分画を分析した。これらの５７人の患者から、２４人は骨転移を有し、３人は肝臓内転移を有し、２人は脳内転移を有し、９人は肺内転移を有し、３人は骨および肝臓の両方の転移を有し、６人は肺および骨の両方の転移を有し、２人は３つ以上の異なる部位内の転移を有した。ＰＩＫ３ＣＡ突然変異は、ＥｐＣＡＭ陽性ＣＴＣ分画中でエクソン９ １６３３Ｇ＞Ａホットスポット突然変異について８人／５７人（１４．０％）（図３Ｃ）およびエクソン２０ ３１４０Ａ＞Ｇホットスポット突然変異について１２人／５７人（２１．１％）において検出された（図３Ｄ）。合計して、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異は、この患者群において、２０人／５７人（３５．１％）において検出された。図３Ｃおよび３Ｄにおける融解曲線中の６０℃におけるピークは、エクソン９およびエクソン２０突然変異の存在をそれぞれ示す。この状況で、ピークが６０℃において検出されない場合、試料を試験された突然変異について野生型とみなす。ベースラインはＰＣＲ陰性対照である。

【0124】

対応する一次腫瘍中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異の検出。
独立群において、ＣＴＣおよび対応する一次腫瘍中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異状態を、乳癌を有する７６人の患者（３２人は臨床的に確認された転移を有し、４４人は手術可能な乳癌を有する）において比較した。それというのも、それらの患者については、対応するＦＦＰＥも利用可能であったためである（表４）。

【0125】

【表4】

【0126】

エクソン９、１６３３ＱＡ。全ての患者に関して、エクソン１６３３Ｇ＞Ａホットスポット突然変異が、３８／７６（５０％）の一次腫瘍試料および７６のうち６つ（７．９％）の対応するＥｐＣＡＭ陽性ＣＴＣ分画試料中で観察された。このＰＩＫ３ＣＡホットスポット突然変異を一次腫瘍中で担持していた４人の患者について、同一の突然変異がＣＴＣ中でも検出された。３４人の患者において、この突然変異は、一次腫瘍中で同定されたが、ＥｐＣＡＭ陽性ＣＴＣ分画中では同定されなかった一方、３６人の患者は、一次腫瘍およびＣＴＣ中の両方でこの突然変異について陰性であると見出された。しかしながら、２つの例において、このホットスポット突然変異は、ＥｐＣＡＭ陽性ＣＴＣ分画中で同定されたが、対応する一次腫瘍中で同定されなかった。手術可能な乳癌を有する患者において、１６３３Ｇ＞Ａは、２１／４４（４７．７％）のＦＦＰＥおよび１／４４（２．３％）の対応するＣＴＣ試料中で観察され；このＰＩＫ３ＣＡホットスポット突然変異を一次腫瘍中で担持する患者は、ＣＴＣ中の同一の突然変異を有さなかった。２１人の患者において、この突然変異は、一次腫瘍中で同定されたが、ＣＴＣ中で同定されなかった一方、２２人の患者は、一次腫瘍およびＣＴＣ中の両方でこの突然変異について陰性であると見出された。しかしながら、１つの例において、このホットスポット突然変異は、ＣＴＣ分画中で同定されたが、対応する一次腫瘍中で同定されなかった。転移を有する患者において、１６３３Ｇ＞Ａは、１７／３２（５３．１％）のＦＦＰＥおよび５／３２（１５．６％）の対応するＣＴＣ中で観察された。このＰＩＫ３ＣＡホットスポット突然変異を一次腫瘍中で担持していた４人の患者について、同一の突然変異がＣＴＣ中でも検出された。１３人の患者について、この突然変異は一次腫瘍中で同定されたが、ＣＴＣ中で同定されなかった一方、１４人の患者は、一次腫瘍およびＣＴＣ中の両方でこの突然変異について陰性であると見出された。しかしながら、１つの例において、このホットスポット突然変異は、ＣＴＣ分画中で同定されたが、対応する一次腫瘍中で同定されなかった。

【0127】

エクソン２０、３１４０Ａ＞Ｇ。全ての患者に関して、エクソン２０ ３１４０Ａ＞Ｇホットスポット突然変異は、１３／７６（１７．１％）のＦＦＰＥおよび１４／７６（１８．４％）の対応するＣＴＣ試料中で観察された。このＰＩＫ３ＣＡホットスポット突然変異を一次腫瘍中で担持していた４人／１３人の患者については、同一の突然変異がＥｐＣＡＭ陽性ＣＴＣ分画中でも検出された。９人の患者において、この突然変異は一次腫瘍中で同定されたが、ＣＴＣ中では同定されなかった一方、５３人の患者は、一次腫瘍およびＣＴＣ中の両方でこの突然変異について陰性であると見出された。注目すべきことは、１０人の患者において、このホットスポット突然変異がＥｐＣＡＭ陽性ＣＴＣ分画中でのみ検出されたが、対応する一次腫瘍中では検出されなかったことである。手術可能な乳癌を有する患者の群において、３１４０Ａ＞Ｇは、５／４４（１１．４％）のＦＦＰＥおよび１０／４４（２２．７％）の対応するＣＴＣ中で観察された。このＰＩＫ３ＣＡホットスポット突然変異を一次腫瘍中で担持していた２人／５人の患者については、同一の突然変異がＣＴＣ中でも検出された。３人の患者において、この突然変異は一次腫瘍中で同定されたが、ＣＴＣ中では同定されなかった一方、３１人の患者は、一次腫瘍およびＣＴＣ中の両方でこの突然変異について陰性であると見出された。しかしながら、８人の患者において、このホットスポット突然変異はＣＴＣ中でのみ検出されたが、対応するＦＦＰＥ中では検出されなかった。転移を有する患者の群において、３１４０Ａ＞Ｇは、８／３２（２５．０％）の一次腫瘍試料および４／３２（１２．５％）の対応するＣＴＣ中で観察された。このＰＩＫ３ＣＡホットスポット突然変異を一次腫瘍中で担持していた２人／８人の患者については、同一の突然変異がＣＴＣ中でも検出された。６人の患者において、この突然変異は一次腫瘍中で同定されたが、ＣＴＣ中では同定されなかった一方、２２人の患者は、一次腫瘍およびＣＴＣ中の両方でこの突然変異について陰性であると見出された。しかしながら、２人の患者において、このホットスポット突然変異はＣＴＣ中でのみ検出されたが、対応する一次腫瘍中では検出されなかった。

【0128】

一次腫瘍および対応するＣＴＣ中の両方のこれらのＰＩＫ３ＣＡホットスポット突然変異の存在間の一致は存在しなかった。それというのも、これは手術可能および転移が確認された乳癌患者について別個に、または全ての患者について一緒に統計的に評価されたためである（表４参照）。

【0129】

この知見はＣＴＣ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異状態が、乳癌を有する患者における疾患再発または進行の間に変化し得ることを示唆する。７６人の患者の下位群におけるＣＴＣおよび対応する一次腫瘍中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異状態を比較した場合、同一の突然変異が少数の試料中で一次腫瘍およびＣＴＣ中の両方で存在することが観察された。ほとんどの患者において、突然変異は、一次腫瘍中で同定されたが、ＣＴＣ中では同定されなかった一方、多くの患者は、一次腫瘍およびＣＴＣ中の両方でこの突然変異について陰性であった。しかしながら、ホットスポット突然変異がＣＴＣ中で同定されたが、対応する一次腫瘍中では同定されなかった１２の例が存在し；２人の患者において、１６３３Ｇ＞ＡがＣＴＣ中で観察されたが対応するＦＦＰＥ中では観察されなかった一方、１０人の患者において、３１４０Ａ＞ＧはＣＴＣ中で観察されたが、対応する一次腫瘍中では観察されなかった。ＣＴＣの不均一性を反映する同様の知見が報告されている。

【0130】

実施例６
ＣＫ−１９ ｍＲＮＡ発現に関するＣＴＣ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異状態
独立群において、ＣＴＣ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異状態がＣＫ−１９ ｍＲＮＡ発現と相関するか否かを、１５７人のそれらの患者（５７人は臨床的転移を有し、１００人は、初期乳癌を有する；表５）についてさらに評価した。末梢血中のＣＫ−１９ ｍＲＮＡ陽性細胞の検出は、手術可能および転移性乳癌における潜在性腫瘍細胞についての最も高感度なバイオマーカーである。

【0131】

【表5】

【0132】

手術可能な乳癌において、３／１００の試料のみがＰＩＫ３ＣＡ突然変異およびＣＫ−１９ ｍＲＮＡ発現の両方で陽性であり、全てエクソン２０におけるものであった。ＣＫ−１９について陽性で、ＰＩＫ３ＣＡ中の突然変異を担持しない３３／１００の試料が存在した一方、非常に注目すべきことは、ＰＩＫ３ＣＡホットスポット突然変異が、ＣＫ−１９ ｍＲＮＡ発現について陰性である１７人の患者のＣＴＣ中で同定されたことである。臨床的に確認された転移を有する患者において、１１／５７（１９．３％）の試料が、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異およびＣＫ−１９発現の両方について陽性であり、エクソン９において６つ、エクソン２０において５つであった。ＣＫ−１９について陽性であり、それらのＰＩＫ３ＣＡ中のホットスポット突然変異を担持しない１４／５７（２４．６％）の試料が存在した。非常に注目すべきことは、ＰＩＫ３ＣＡホットスポット突然変異が、ＣＫ−１９ｍＲＮＡ発現について陰性である９人の患者のＣＴＣ中で同定されたことである。ＣＴＣ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異について陽性と見出されたが、ＣＫ−１９ ｍＲＮＡ発現について陰性であるこれらの２６の試料（手術可能な乳癌を有する患者からの１７、および臨床的に確認された転移を有する患者からの９つ）は、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異が検出されなかった場合、ＣＴＣ陰性と特徴付けられていた。ＣＴＣ中のこれらのホットスポットＰＩＫ３ＣＡ突然変異およびＣＫ−１９ ｍＲＮＡ発現の両方の存在に関する一致は存在しなかった（表２参照）。

【0133】

この試験の重要な観察は、ＣＫ−１９ ｍＲＮＡ発現について陰性である有意な数の患者（手術可能な乳癌群における１７人／１１８人および確認された転移群における９人／５７人）が、ＣＴＣ中のＰＩＫ３ＣＡホットスポット突然変異を担持していたことであった。これらの患者は、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異が検出されなかった場合、ＣＴＣ陰性と特徴付けられていた。ＣＴＣの分子特徴付けは、ＣＴＣが高度に不均一であることを実証している。これは、少なくとも部分的に、上皮間葉移行および間葉上皮移行に起因し得た。この状況で、全てのＣＫ−１９陽性ＣＴＣがＰＩＫ３ＣＡ突然変異陽性であることも、ＣＫ−１９陰性である全ての本発明者らの試料がＣＴＣ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異を担持しないことも予測されない。ＣＫ−１９リアルタイムＰＣＲアッセイは極めて特異的で高感度であり、従来の研究においてその臨床的有意性が既に実証されている［Ｓｔａｔｈｏｐｏｕｌｏｕ Ａ，Ｖｌａｃｈｏｎｉｋｏｌｉｓ Ｉ，Ｍａｖｒｏｕｄｉｓ Ｄ，Ｐｅｒｒａｋｉ Ｍ，Ｋｏｕｒｏｕｓｓｉｓ Ｃ，Ａｐｏｓｔｏｌａｋｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ−１９−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｏｐｅｒａｂｌｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００２；２０：３４０４−１２．］。しかしながら、ＣＫ−１９陽性であっても再発しない多数の患者またはＣＫ−１９陰性であっても再発する多数の患者が常に存在し、同一のことは、ＦＤＡ認可ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（商標）システムを使用する場合でも示されており、１つのマーカーが万能でなく、本発明者らの試料中の悪性ＣＴＣ集団の存在を確認するために十分でないことを明示する。

【0134】

実施例７
確認された転移を有する患者におけるＣＴＣ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異状態の臨床的有意性。
ＣＴＣ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異状態および臨床的に確認された転移を有するこの比較的小さい患者群の臨床的アウトカム間の相関をさらに評価した。患者の術後生存率を使用することにより実施されたカプラン・マイヤー生存曲線分析は、ＣＴＣ上のＰＩＫ３ＣＡホットスポット突然変異を担持する患者（ｎ＝２０）が、担持しない患者（ｎ＝３７）よりも有意に短いＯＳを有することを実証した（Ｐ＝０．０４７、ログランク検定；図４参照）。

【0135】

際立った知見は、ＣＴＣ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異の存在が、転移患者におけるより悪い生存率を伴うことでもある。任意の癌のタイプにおいて、ＣＴＣ中の遺伝子突然変異の存在が患者生存率と相関するのは、今回が最初である。ＰＩ３Ｋシグナリング経路中の活性化突然変異を有する癌を有する患者を、ＰＩ３Ｋ阻害剤を試験する第１相プロトコルにマッチさせることは、改善された応答率および生存率を有する［Ｔｓｉｍｂｅｒｉｄｏｕ ＡＭ，ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｉｎ ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｐｒｏｇｒａｍ：ｔｈｅ ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１２；１８：６３７３−８３］。これに関して、近年、ｈｅｒｃｅｐｔｉｎの投与がＣＫ−１９ ｍＲＮＡ陽性ＣＴＣの存在に基づくパイロットプロスペクティブ研究において示されたとおり、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異が専らＣＴＣ中に存在し得る一方、一次腫瘍中では不存在であり得るという本発明者らの知見は、患者に有益であり得る［Ｇｅｏｒｇｏｕｌｉａｓ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｌａｐｓｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅａｒｌｙ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＣＫ−１９ ｍＲＮＡ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｙ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１２；２３：１７４４−５０］。腫瘍細胞中で高頻度で脱制御されるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナリング経路中の突然変異が、乳癌の開始、進行、および臨床的応答において中心的な役割を有すると考えられる乳癌幹細胞中で近年同定されている［Ｄｏｎｏｖａｎ ＣＡ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ａｘｉｌｌａｒｙ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ＪＡＭＡ Ｓｕｒｇ ２０１３；１４８：８７３−８］。

【0136】

実施例８
確認された転移を有する乳癌患者のｃｔＤＮＡ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異の検出。
開発された方法を使用して確認された転移を有する乳癌患者の血漿から単離されたｃｔＤＮＡ中のホットスポットＰＩＫ３ＣＡ突然変異を検出した。最初に、血漿から抽出された全てのｃｔＤＮＡ試料をそれらのＤＮＡの質について試験し；ＤＮＡの質を確認するため、ホットスポット突然変異について評価するために使用されるエクソン９についての全く同一のＰＩＫ３ＣＡ遺伝子領域中の野生型に特異的なプライマー。ｃｔＤＮＡ試料中のＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の突然変異状態を、既に記載のものと全く同じように開発された方法により検出した（図５）。ＰＩＫ３ＣＡ突然変異は、ｃｔＤＮＡ試料中でエクソン９について４／２４（１６％）（図５Ａ、５Ｂ）およびエクソン２０について６／２４（２５％）（図５Ｃ）において検出された。図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃの融解曲線における６０℃におけるピークは、エクソン９およびエクソン２０突然変異の存在をそれぞれ示す。この状況で、ピークが６０℃において検出されない場合、試料を試験された突然変異について野生型とみなす。

【0137】

この試験において、このアッセイが癌患者の血漿から単離されたｃｔＤＮＡ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異を検出し得ることが実証された。アッセイ感度は極端に低く（０．０５％）、特異度は極めて高く；このアッセイは、多量の野生型アレルの存在下で極めて希少なＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルを検出し得る。全体として、２４の試料のうち４つがエクソン９中の１６３３Ｇ＞Ａ突然変異について陽性であり、２４のうち６つが血漿試料から単離されたｃｔＤＮＡ中の３１４０Ａ＞Ｇ突然変異について陽性であった。循環腫瘍ＤＮＡは、腫瘍の突然変異状態をリアルタイムで決定するための極端に有効で、有利なバイオマーカー源であると考えられ；しかしながら、この例において、高感度のロバストで特異的な方法が必要とされる。ここで、証拠は、このアッセイが癌患者の血漿から単離されたｃｔＤＮＡ中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異の検出に有用なツールを提供することを提供する。

【0138】

配列表

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]