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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6771385
(24)【登録日】2020年10月1日
(45)【発行日】2020年10月21日
(54)【発明の名称】二重特異性抗体および医薬組成物
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20201012BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20201012BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20201012BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20201012BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20201012BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46ZNA
C07K16/28
A61K39/395 E
A61K39/395 T
A61P35/00
!C12N15/13
【請求項の数】38
【全頁数】63
(21)【出願番号】特願2016-554200(P2016-554200)
(86)(22)【出願日】2015年2月27日
(65)【公表番号】特表2017-512756(P2017-512756A)
(43)【公表日】2017年5月25日
(86)【国際出願番号】NL2015050124
(87)【国際公開番号】WO2015130172
(87)【国際公開日】20150903
【審査請求日】2017年12月7日
(31)【優先権主張番号】14157351.9
(32)【優先日】2014年2月28日
(33)【優先権主張国】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】510340757
【氏名又は名称】メルス ナムローゼ フェンノートシャップ
(74)【代理人】
【識別番号】100084412
【弁理士】
【氏名又は名称】永井 冬紀
(74)【代理人】
【識別番号】100169018
【弁理士】
【氏名又は名称】網屋 美湖
(72)【発明者】
【氏名】ロフテンベルフ， トン
(72)【発明者】
【氏名】トロスビー， マルク
(72)【発明者】
【氏名】ルーフェルス， ロベルトュス コルネリス
【審査官】
池上 文緒
(56)【参考文献】
【文献】
特表２０１２−５２１１９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１３／１４８３１５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特表２０１０−５１８８２０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２０１３−５０６６２２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２００８−５３１５５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Cancer Cell (2011) vol.20, no.4, p. 472-486
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １５／００ − １５／９０
Ｃ０７Ｋ １６／４６
Ｃ０７Ｋ １６／２８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、
ＢｘＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６８７）またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２５０５８）のＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長を阻害することについて、２００ｐＭ未満の半数成長阻害濃度（ＩＣ５０）を有する二重特異性抗体。
ＢｘＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６８７）またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２５０５８）のＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長を阻害することについて、２００ｐＭ未満の半数成長阻害濃度（ＩＣ５０）を有する二重特異性抗体。
【請求項2】
請求項１に記載の二重特異性抗体において、
ＢｘＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６８７）またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２５０５８）のＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長を阻害することについて、１００ｐＭ未満のＩＣ５０を有する、二重特異性抗体。
ＢｘＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６８７）またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２５０５８）のＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長を阻害することについて、１００ｐＭ未満のＩＣ５０を有する、二重特異性抗体。
【請求項3】
請求項１または２に記載の二重特異性抗体において、
ＢｘＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６８７）またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２５０５８）のＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長を阻害することについて、５０ｐＭ未満のＩＣ５０を有する、二重特異性抗体。
ＢｘＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６８７）またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２５０５８）のＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長を阻害することについて、５０ｐＭ未満のＩＣ５０を有する、二重特異性抗体。
【請求項4】
請求項１から３までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ＢｘＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６８７）またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２５０５８）のＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長を阻害することについて、２０ｐＭ未満のＩＣ５０を有する、二重特異性抗体。
ＢｘＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６８７）またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２５０５８）のＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長を阻害することについて、２０ｐＭ未満のＩＣ５０を有する、二重特異性抗体。
【請求項5】
請求項１から４までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
前記第１の抗原結合部位が、ＥＧＦＲのドメインＩまたはドメインＩＩＩに結合する、二重特異性抗体。
前記第１の抗原結合部位が、ＥＧＦＲのドメインＩまたはドメインＩＩＩに結合する、二重特異性抗体。
【請求項6】
請求項１から５までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３陽性細胞上のＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能を低減できる、二重特異性抗体。
ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３陽性細胞上のＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能を低減できる、二重特異性抗体。
【請求項7】
請求項１から６までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
リガンド誘導された前記ＢｘＰＣ３細胞が、ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３リガンド誘導されたＢｘＰＣ３細胞である、二重特異性抗体。
リガンド誘導された前記ＢｘＰＣ３細胞が、ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３リガンド誘導されたＢｘＰＣ３細胞である、二重特異性抗体。
【請求項8】
請求項１から７までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
前記リガンドが、ＥＧＦ、ニューレグリン１またはそれらの組み合わせを含む、二重特異性抗体。
前記リガンドが、ＥＧＦ、ニューレグリン１またはそれらの組み合わせを含む、二重特異性抗体。
【請求項9】
請求項１から８までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含み、
前記第２の抗原結合部位が、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する、二重特異性抗体。
ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含み、
前記第２の抗原結合部位が、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する、二重特異性抗体。
【請求項10】
請求項１から９までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
前記抗体は、ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３陽性細胞のリガンド誘導性成長を低減できる、二重特異性抗体。
前記抗体は、ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３陽性細胞のリガンド誘導性成長を低減できる、二重特異性抗体。
【請求項11】
請求項１から１０までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する前記第２の抗原結合部位の親和性（ＫＤ）が、２．０ｎＭ以下である、二重特異性抗体。
ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する前記第２の抗原結合部位の親和性（ＫＤ）が、２．０ｎＭ以下である、二重特異性抗体。
【請求項12】
請求項１から１１までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する前記第２の抗原結合部位の親和性（ＫＤ）が、１．３９ｎＭ以下である、二重特異性抗体。
ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する前記第２の抗原結合部位の親和性（ＫＤ）が、１．３９ｎＭ以下である、二重特異性抗体。
【請求項13】
請求項１から１２までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する前記第２の抗原結合部位の親和性（ＫＤ）が、０．９９ｎＭ以下である、二重特異性抗体。
ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する前記第２の抗原結合部位の親和性（ＫＤ）が、０．９９ｎＭ以下である、二重特異性抗体。
【請求項14】
請求項１から１３までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
Ｒ４２６およびネイティブＥｒｂＢ−３タンパク質中のＲ４２６から１１．２オングストローム以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩの少なくとも１つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む、二重特異性抗体。
Ｒ４２６およびネイティブＥｒｂＢ−３タンパク質中のＲ４２６から１１．２オングストローム以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩの少なくとも１つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む、二重特異性抗体。
【請求項15】
請求項１から１４までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
配列番号６〜１５２のアミノ酸配列を含む、二重特異性抗体。
配列番号６〜１５２のアミノ酸配列を含む、二重特異性抗体。
【請求項16】
請求項１から１５までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
配列番号８８（ＭＦ３１７８）、配列番号９８（ＭＦ３１６３）、配列番号１０８（ＭＦ３３０７）、配列番号１１３（ＭＦ６０５５）、配列番号１１５（ＭＦ６０５６）、配列番号１１７（ＭＦ６０５７）、配列番号１１９（ＭＦ６０５８）、配列番号１２１（ＭＦ６０５９）、配列番号１２３（ＭＦ６０６０）、配列番号１２５（ＭＦ６０６１）、配列番号１２７（ＭＦ６０６２）、配列番号１２９（ＭＦ６０６３）、配列番号１３１（ＭＦ６０６４）、配列番号１３３（ＭＦ６０６５）、配列番号１３５（ＭＦ６０６６）、配列番号１３７（ＭＦ６０６７）、配列番号１３９（ＭＦ６０６８）、配列番号１４１（ＭＦ６０６９）、配列番号１４３（ＭＦ６０７０）、配列番号１４５（ＭＦ６０７１）、配列番号１４７（ＭＦ６０７２）、配列番号１４９（ＭＦ６０７３）および配列番号１５１（ＭＦ６０７４）からなる群から選択される配列番号に示されるＥｒｂＢ−３特異的重鎖可変領域のＣＤＲ３配列を少なくとも含む、二重特異性抗体。
配列番号８８（ＭＦ３１７８）、配列番号９８（ＭＦ３１６３）、配列番号１０８（ＭＦ３３０７）、配列番号１１３（ＭＦ６０５５）、配列番号１１５（ＭＦ６０５６）、配列番号１１７（ＭＦ６０５７）、配列番号１１９（ＭＦ６０５８）、配列番号１２１（ＭＦ６０５９）、配列番号１２３（ＭＦ６０６０）、配列番号１２５（ＭＦ６０６１）、配列番号１２７（ＭＦ６０６２）、配列番号１２９（ＭＦ６０６３）、配列番号１３１（ＭＦ６０６４）、配列番号１３３（ＭＦ６０６５）、配列番号１３５（ＭＦ６０６６）、配列番号１３７（ＭＦ６０６７）、配列番号１３９（ＭＦ６０６８）、配列番号１４１（ＭＦ６０６９）、配列番号１４３（ＭＦ６０７０）、配列番号１４５（ＭＦ６０７１）、配列番号１４７（ＭＦ６０７２）、配列番号１４９（ＭＦ６０７３）および配列番号１５１（ＭＦ６０７４）からなる群から選択される配列番号に示されるＥｒｂＢ−３特異的重鎖可変領域のＣＤＲ３配列を少なくとも含む、二重特異性抗体。
【請求項17】
請求項１から１６までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す、二重特異性抗体。
抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す、二重特異性抗体。
【請求項18】
請求項１から１７までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ＡＤＣＣを増強するために非フコシル化されている、二重特異性抗体。
ＡＤＣＣを増強するために非フコシル化されている、二重特異性抗体。
【請求項19】
請求項１から１８までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ヒトまたはヒト化抗体である、二重特異性抗体。
ヒトまたはヒト化抗体である、二重特異性抗体。
【請求項20】
請求項１から１９までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
適合的なヘテロ二量体化ドメインを有する２つの異なる免疫グロブリン重鎖を含む、二重特異性抗体。
適合的なヘテロ二量体化ドメインを有する２つの異なる免疫グロブリン重鎖を含む、二重特異性抗体。
【請求項21】
請求項２０に記載の二重特異性抗体において、
前記適合的なヘテロ二量体化ドメインは、適合的な免疫グロブリン重鎖ＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインである、二重特異性抗体。
前記適合的なヘテロ二量体化ドメインは、適合的な免疫グロブリン重鎖ＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインである、二重特異性抗体。
【請求項22】
請求項２０または２１に記載の二重特異性抗体において、
適合的なヘテロ二量体化ドメインを有する２つの異なる免疫グロブリン軽鎖を含む、二重特異性抗体。
適合的なヘテロ二量体化ドメインを有する２つの異なる免疫グロブリン軽鎖を含む、二重特異性抗体。
【請求項23】
請求項１から２２までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
共通の軽鎖を含む、二重特異性抗体。
共通の軽鎖を含む、二重特異性抗体。
【請求項24】
請求項２３に記載の二重特異性抗体において、
前記軽鎖は、軽鎖可変領域ＩＧＫＶ１−３９を含む、二重特異性抗体。
前記軽鎖は、軽鎖可変領域ＩＧＫＶ１−３９を含む、二重特異性抗体。
【請求項25】
請求項２３または２４に記載の二重特異性抗体において、
前記軽鎖は、生殖系列ＩＧＫＶ１−３９軽鎖可変領域を含む、二重特異性抗体。
前記軽鎖は、生殖系列ＩＧＫＶ１−３９軽鎖可変領域を含む、二重特異性抗体。
【請求項26】
請求項１から２５までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物。
【請求項27】
請求項１から２５までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
標識をさらに含む、二重特異性抗体。
標識をさらに含む、二重特異性抗体。
【請求項28】
請求項１から２５まで、および２７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ｉｎ ｖｉｖｏ画像化のための標識をさらに含む、二重特異性抗体。
ｉｎ ｖｉｖｏ画像化のための標識をさらに含む、二重特異性抗体。
【請求項29】
請求項１から２５まで、２７および２８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３もしくはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、または有するリスクがある対象の処置における使用のための、二重特異性抗体。
ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３もしくはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、または有するリスクがある対象の処置における使用のための、二重特異性抗体。
【請求項30】
請求項１から２５まで、および、２７から２９までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
セツキシマブと比較して、より少ない皮膚毒性を誘導する、二重特異性抗体。
セツキシマブと比較して、より少ない皮膚毒性を誘導する、二重特異性抗体。
【請求項31】
請求項１から２５まで、２７および２８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞の転移の形成の処置または予防における使用のための、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位および、前記第１の抗原結合部位とは異なる特異性を有しＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含み、
前記ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞が、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％のヘレグリン発現レベルを有する、二重特異性抗体。
ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞の転移の形成の処置または予防における使用のための、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位および、前記第１の抗原結合部位とは異なる特異性を有しＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含み、
前記ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞が、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％のヘレグリン発現レベルを有する、二重特異性抗体。
【請求項32】
請求項３１に記載の使用のための二重特異性抗体において、
前記ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞が、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも７０％のヘレグリン発現レベルを有する、二重特異性抗体。
前記ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞が、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも７０％のヘレグリン発現レベルを有する、二重特異性抗体。
【請求項33】
請求項３１または３２に記載の使用のための二重特異性抗体において、
前記ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞が、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも８０％のヘレグリン発現レベルを有する、二重特異性抗体。
前記ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞が、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも８０％のヘレグリン発現レベルを有する、二重特異性抗体。
【請求項34】
請求項３１から３３までのいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体において、
前記ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞が、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも８５％のヘレグリン発現レベルを有する、二重特異性抗体。
前記ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞が、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも８５％のヘレグリン発現レベルを有する、二重特異性抗体。
【請求項35】
請求項３１から３４までのいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体において、
前記ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞が、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも９０％のヘレグリン発現レベルを有する、二重特異性抗体。
前記ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞が、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも９０％のヘレグリン発現レベルを有する、二重特異性抗体。
【請求項36】
請求項３１から３５までのいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体において、
前記ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞が、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも９５％のヘレグリン発現レベルを有する、二重特異性抗体。
前記ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞が、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも９５％のヘレグリン発現レベルを有する、二重特異性抗体。
【請求項37】
請求項２９から３６までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体であって、
前記対象が、細胞１つ当たり１．０００．０００未満のＥｒｂＢ−２細胞表面受容体を有するＥＧＦＲまたはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、二重特異性抗体。
前記対象が、細胞１つ当たり１．０００．０００未満のＥｒｂＢ−２細胞表面受容体を有するＥＧＦＲまたはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、二重特異性抗体。
【請求項38】
請求項２９から３７までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体であって、
前記腫瘍細胞が、乳癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、大腸癌細胞、膵臓癌細胞または肺癌細胞である、二重特異性抗体。
前記腫瘍細胞が、乳癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、大腸癌細胞、膵臓癌細胞または肺癌細胞である、二重特異性抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗体の分野に関する。詳細には、本発明は、異常な細胞を伴う疾患の処置のための治療的（ヒト）抗体の分野に関する。より詳細には、本発明は、ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３に結合する抗体、ならびにＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３陽性細胞、特に腫瘍細胞との結合におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体（ＥＧＦＲ）は、上皮増殖因子ファミリー（ＥＧＦファミリー）という細胞外タンパク質リガンドのメンバーに対する、プロトタイプの細胞表面受容体である。ＥＧＦＲは、ＥｒｂＢ−１受容体としても知られている。この受容体には、過去に種々の名称を与えられている（ＥＧＦＲ；ＥＲＢＢ；ＥＲＢＢ１；ＨＥＲ１；ＰＩＧ６１；ｍＥＮＡ）。本発明では、ヒトにおける名称ＥｒｂＢ−１、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ１は、相互交換可能に使用される。ＥＧＦＲは、ＥｒｂＢファミリーの受容体のメンバーであり、４つの密接に関連する受容体チロシン・キナーゼのサブファミリー：ＥｒｂＢ−１（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ−２（ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ；Ｈｅｒ２）、ＥｒｂＢ−３（Ｈｅｒ３）およびＥｒｂＢ−４（Ｈｅｒ４）である。
【0003】
ＥＧＦＲは、細胞表面上に存在し、上皮増殖因子およびトランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）を含むその特異的リガンドの結合によって活性化される。その増殖因子リガンドによる活性化の際に、この受容体は、不活性な主に単量体の形態から活性ホモ二量体へと移行する。リガンド結合後にホモ二量体を形成することに加えて、ＥＧＦＲは、ＥｒｂＢ受容体ファミリーの別のメンバー、例えばＥｒｂＢ２とペアリングして、活性化されたヘテロ二量体を生じ得る。リガンド結合の非存在下で二量体が形成され、活性化されたＥＧＦＲのクラスターがリガンド結合後に形成されることを示唆する証拠もある。
【0004】
ＥＧＦＲの二量体化は、その固有の細胞内タンパク質チロシン・キナーゼ（ＰＴＫ）活性を刺激する。この活性は、細胞の増殖および分化をもたらすいくつかのシグナル伝達カスケードを誘導する。ＥＧＦＲのキナーゼ・ドメインは、共に複合体化する他の受容体のチロシン残基を交差リン酸化し得、自分自身もそのように活性化され得る。
【0005】
ＥＧＦＲにおける変異が、いくつかの型の癌において同定されており、これは、拡大するクラスの抗癌治療の標的である。これらには、肺癌に対するゲフィチニブおよびエルロチニブなどのＥＧＦＲを標的とした小分子、ならびに結腸癌および頭頸部癌に対するセツキシマブおよびパニツムマブなどの抗体が含まれる。
【0006】
セツキシマブおよびパニツムマブは、この受容体を阻害するモノクローナル抗体である。臨床開発中の他のモノクローナルは、ザルツムマブ、ニモツズマブおよびマツズマブである。これらのモノクローナル抗体は、主に受容体へのリガンド結合を遮断することによって、細胞外リガンド誘導性受容体活性化を遮断することを目的としている。結合部位が遮断されると、シグナル誘導分子は、効率的に結合できず、従って、下流のシグナル伝達を活性化することもできない。しかし、リガンド誘導性受容体活性化は、不活性な受容体コンフォメーションの安定化によっても阻害され得る（マツズマブ）。
【0007】
ＥＧＦＲを標的とした抗体治療はいくらか成功しているが、そのほとんどでは、いずれ処置耐性の発生が伴う。ＥＧＦＲ陽性腫瘍が標的化治療を逃れることができる方法の１つは、別の受容体（二量体）を介したシグナル伝達によるものである。例えば、増加したＨＥＲ３発現またはヘレグリン発現に起因する、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３（ＨＥＲ１／ＨＥＲ３）二量体による増加したシグナル伝達は、肺癌および頭頸部癌におけるＥＧＦＲ関連の薬物耐性と関連する。処置耐性の誘導とは別に、ＥＧＦＲ標的化抗体のいくつかの副作用が観察されている。１つの例は、効率的なＥＧＦＲ阻害と関連する皮疹の発症である。極端な場合、かかる発疹は、処置サイクルの低減および／または処置の未完終了をもたらし得る。
【0008】
ＥｒｂＢ−３は、それ自体のキナーゼ不活性は有さない。従って、ＥｒｂＢ−３受容体シグナル伝達の有効な阻害は、小分子チロシン・キナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）では達成できない。最近、ＭＥＨＤ７９４５Ａと称されるモノクローナル抗体が、ＥＧＦＲ陽性腫瘍の前臨床設定において有望であることが見出された。ＭＥＨＤ７９４５Ａは、２つの同一の抗原結合部位を有するモノクローナル抗体である。ＭＥＨＤ７９４５Ａは、各々が個々に、ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ−３のいずれかに結合する能力を有するが他の受容体に結合する能力は有さない２つの同一の抗原結合アームを有するという、独自の特性を有する。一旦抗原が結合すると、この抗原結合部位は、他の抗原に対しては遮断される。従って、ＭＥＨＤ７９４５Ａ（「ツー・イン・ワン」抗体と呼ばれる）は、ＥＧＦＲ標的化抗体およびＨＥＲ３標的化抗体の両方とみなされ得る。
【発明の概要】
【0009】
本発明は、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この抗体は、ＢｘＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６８７）またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２５０５８）のＥＧＦＲおよび／またはＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長を阻害することについて、２００ｐＭ未満の半数成長阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
【0010】
ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位を含む抗体がさらに提供され、この抗体は、ＥＧＦＲに結合し、図１１Ａに示されるＶＨ鎖ＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００２；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；ＭＦ３３７０；ＭＦ３７５１；ＭＦ３７５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する免疫グロブリン重鎖を含み、好ましくは、免疫グロブリン軽鎖可変領域は、図１１Ｃのアミノ酸配列を含む。
【0011】
本発明は、ＥｒｂＢ−３に結合する抗原結合部位を含む抗体をさらに提供し、この抗体は、ＥｒｂＢ−３に結合し、図１１Ｂに示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３３０７、ＭＦ６０５５〜ＭＦ６０７４、好ましくはＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１またはＭＦ６０６５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する免疫グロブリン重鎖を含み、好ましくは、免疫グロブリン軽鎖可変領域は、図１１Ｃのアミノ酸配列を含む。
【0012】
本発明の抗体は、特記しない限り、好ましくは、二重特異性抗体である。
【0013】
本発明はさらに、本発明に従う抗体を含む医薬組成物を提供する。
【0014】
標識、好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏ画像化のための標識をさらに含む、本発明の抗体もまた提供される。
【0015】
本発明は、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３もしくはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、またはこの腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法をさらに提供し、この方法は、本発明に従う二重特異性抗体を対象に投与することを含む。ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３もしくはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、または有するリスクがある対象の処置における使用のための、本発明に従う二重特異性抗体がさらに提供される。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1A】キメラ・カニクイザル−ヒトＥＧＦＲコード構築物の注釈付き配列を示す図である。再クローニングに使用した制限部位（Ｎｈｅ１−Ｎｏｔ１）は、大文字で示される。成熟ペプチドの開始は、下線付きの太字で示される。膜貫通領域は、太字のイタリックである。
【図1B】キメラ・カニクイザル−ヒトＥＧＦＲコード構築物の注釈付き配列を示す図である。再クローニングに使用した制限部位（Ｎｈｅ１−Ｎｏｔ１）は、大文字で示される。成熟ペプチドの開始は、下線付きの太字で示される。膜貫通領域は、太字のイタリックである。
【図1C】キメラ・カニクイザル−ヒトＥＧＦＲコード構築物の注釈付き配列を示す図である。再クローニングに使用した制限部位（Ｎｈｅ１−Ｎｏｔ１）は、大文字で示される。成熟ペプチドの開始は、下線付きの太字で示される。膜貫通領域は、太字のイタリックである。
【図2】ＥＧＦＲ「交換ドメイン（ｓｗａｐ−ｄｏｍａｉｎ）・バリアント」の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のアミノ酸配列を示す図である。ヒトＥＧＦＲ ＥＣＤを骨格として使用し、特定のドメインを、ヒトＨＥＲ３配列に交換した。ＨＥＲ３由来配列が示される。これらの配列を、ｃ−Ｍｙｃ由来エピトープ・タグ、および血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）の膜貫通領域と、イン・フレームでクローニングした。
【図3】結合についての公知の文献由来の抗体との競合による、ファージ上で発現された抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ（ＭＦ番号；「免疫」ファージ・ライブラリーから選択される）のエピトープ・マッピングを示す図である。示された抗体の存在（または非存在）下での固定化されたＥＧＦＲへのファージ結合の、ＥＬＩＳＡにおける試験の後に得られた、代表的ＯＤ値。ＮＤ：決定せず。コントロール抗体のドメイン特異性が示される。
【図4】ＥＧＦＲ交換ドメイン変異体を使用したＦＡＣＳ染色による、選択された抗ＥＧＦＲ共通の軽鎖（ｃＬＣ）ＩｇＧ（ＰＧ番号）のエピトープ・マッピングの例を示す図である。抗体を、示されたＥＧＦＲ交換変異体（ＨＥＲ３の対応するドメインに交換されたｗｔＥＧＦＲ配列中のドメイン）を安定に発現するＣＨＯ細胞への結合について試験した。明るい線：陰性コントロール（無関係（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ）の抗体）染色；暗い線：抗体染色。ｖＩＩＩ：ドメインＩ、およびドメインＩＩのほとんどを欠く、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ。コントロール：陰性コントロール染色（無関係の一次抗体を添加）。決定されたドメイン特異性は、図の右側に示される。
【図5】Ａ４３１細胞のＥＧＦ誘導性死を阻害することにおける抗ＥＧＦＲ ｃＬＣ ＩｇＧ（ＰＧ番号）の機能性の例を示す図である。Ｙ軸（計数）は、使用した抗体の濃度（Ｘ軸）の関数としての、代謝的に活性な細胞の数を連想させるアッセイの蛍光読み出しを示す。機能的ＥＧＦＲ遮断活性を示す抗体は、ＥＧＦ誘導性細胞死を用量依存的に阻害し、従って、漸増する抗体濃度と共に、細胞の増強された成長を示す。臨床的に使用されている抗体セツキシマブを、内部標準として全ての実験において使用した（ひし形）。
【図6】ＭＥＨＤ７９４５Ａ抗体の活性と比較した、抗ＥＧＦＲ×ＨＥＲ３二重特異性のスクリーニングの概観を示す図である。全てのバーは、ＢｘＰＣ−３リガンド非依存的アッセイ（明るいバー）およびリガンド駆動性アッセイ（暗いバー）における二重特異性抗ＥＧＦＲ×ＨＥＲ３抗体の活性を示す。ＭＥＨＤ７９４５Ａ抗体の平均活性は、それぞれ非依存的アッセイおよび依存的アッセイについて、明るい（上）線および暗い（下）線によって示される。成長を、未処置のコントロールに対して標準化した。８００を超える二重特異性抗ＥＧＦＲ×ＨＥＲ３抗体をスクリーニングした。
【図7】ＭＥＨＤ７９４５Ａと比較した、２つの最良の性能の二重特異性体（ＰＢ番号）のＢｘＰＣ−３細胞増殖阻害についてのＩＣ５０の決定を示す図である。Ｙ軸は、コントロール状況（即ち、両方のリガンドの存在下での、阻害されない成長）に対して標準化した成長の百分率を示し、Ｘ軸は使用した抗体濃度を示す。ＩＣ５０値が示される。
【図8】同所性に移植されたＢｘＰＣ−３細胞の成長に対する、二重特異性抗体（ＰＢ番号）処置の治療効果を示す図である。Ｙ軸は、時間（Ｘ軸）の関数としての、マウスにおけるルシフェリンの注射後のバイオルミネセンス（ＢＬＩ）読み出し（生存腫瘍細胞の数を連想させる）を示す。ＭＥＨＤ７９４５Ａ抗体を参照として使用し、無関係の（抗ＲＳＶ）抗体を陰性コントロール抗体として使用した（四角）。明確さのために、エラー・バーは図から省略した。
【図9】０．３ｍｇ／ｋｇ用量のＭＥＨＤ７９４５Ａのものと比較した、リード二重特異性体ＰＢ４５２２の治療効果を示す図である。Ｙ軸は、時間（Ｘ軸）の関数としての、生存腫瘍細胞の数を連想させるｉｎ ｖｉｖｏバイオルミネセンス（ＢＬＩ）を示す。ＮＣ：陰性コントロール抗体（抗ＲＳＶ、３０ｍｇ／ｋｇ用量）。明確さのために、エラー・バーは図から省略した。
【図10】０．３ｍｇ／ｋｇのＭＥＨＤ７９４５Ａ（群Ｇ４）またはＰＢ４５２２（群Ｇ７）のいずれかで処置したマウスから単離された腫瘍の研究の３８日目にｅｘ ｖｉｖｏで測定した腫瘍重量を示す図である。左のパネルは、全ての個々のマウスの腫瘍の重量を示し、右のパネルは、処置した７匹のマウスの平均重量を示す。＊＊ｐ＜０．０５。
【図11AA】図１１は、本発明の抗体のＶＨ鎖、共通の軽鎖および重鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。図１１中にリーダー配列が示される場合、これは、ＶＨ鎖の一部でも抗体の一部でもなく、典型的には、タンパク質を産生する細胞におけるタンパク質のプロセシングの間に切断される。テキストでの大文字ＭＧとその後の数字とによって示された重鎖のＶＨ鎖配列は、文字ＶＨが先行する同じ数字によって本明細書に示される。図１１ｂは、ｅｒｂＢ−３結合抗体ＭＦ６０５５〜ＭＦ６０７４の重鎖可変領域配列のアミノ酸配列をさらに特定する。この可変重鎖配列は、重鎖可変領域ＭＦ３１７８のバリアントである。点は、その位置におけるＭＦ３１７８と同じアミノ酸を示す。ＣＤＲ領域は、スペースによって分離されており、太字で示される。
【図11AB】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11AC】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11AD】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11AE】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11AF】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11AG】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11AH】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11AI】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11BA】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11BB】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11BC】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11BD】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11BE】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11BF】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11BG】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11BH】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11BI】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11BJ】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11BK】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11BL】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11BM】本発明の抗体のＶＨ鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11C】本発明の抗体の共通の軽鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図11D】本発明の抗体の重鎖の核酸およびアミノ酸配列を示す図である。
【図12】異なるＩｇＧで刺激した初代ケラチノサイトにおけるＣＸＣＬ１４およびＲｎａｓｅ７発現を示す図である。発現を、２つの抗体濃度の存在下でＱ−ＰＣＲによって測定した。
【図13A】高いＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１）に対する、ＭＥＨＤ７９４５Ａおよびセツキシマブと比較した、非フコシル化されたＰＢ４５２２のＡＤＣＣ活性を示す図である。「コントロールＡｂ」は、破傷風トキソイドに対するＩｇＧである。
【図13B】中程度のＥＧＦＲ発現細胞（Ａ５４９）に対する、ＭＥＨＤ７９４５Ａおよびセツキシマブと比較した、非フコシル化されたＰＢ４５２２のＡＤＣＣ活性を示す図である。「コントロールＡｂ」は、破傷風トキソイドに対するＩｇＧである。
【図13C】中程度のＥＧＦＲ発現細胞（ＢｘＰＣ３）に対する、ＭＥＨＤ７９４５Ａおよびセツキシマブと比較した、非フコシル化されたＰＢ４５２２のＡＤＣＣ活性を示す図である。「コントロールＡｂ」は、破傷風トキソイドに対するＩｇＧである。
【図14】ＨＲＧ依存的Ｎ８７アッセイにおけるＨＥＲ３モノクローナル抗体の滴定曲線を示す図である。ＰＧ６０５８、ＰＧ６０６１およびＰＧ６０６５は、ＰＧ３１７８のバリアントである。ＰＧ１３３７は、破傷風トキソイドに特異的な陰性コントロールである。データは、各プレート上に存在するリガンドを用いた基底増殖に対して標準化した。
【図15A】ＨＥＲ３モノクローナル抗体のＣＩＥＸ−ＨＰＬＣプロファイルを示す図である。ＰＧ６０５８、ＰＧ６０６１およびＰＧ６０６５は、ＰＧ３１７８のバリアントである。ＶＨ領域の計算された等電点（ｐＩ）および主要ピークの保持時間（ｔＲ）が、各抗体について与えられる。
【図15B】ＨＥＲ３モノクローナル抗体のＣＩＥＸ−ＨＰＬＣプロファイルを示す図である。ＰＧ６０５８、ＰＧ６０６１およびＰＧ６０６５は、ＰＧ３１７８のバリアントである。ＶＨ領域の計算された等電点（ｐＩ）および主要ピークの保持時間（ｔＲ）が、各抗体について与えられる。
【図16A】ａ）灰色球のエピトープ残基Ａｒｇ４２６、および黒色球の、Ａｒｇ４２６から１１．２オングストローム半径以内の全ての、表面に露出した残基を示す、ＨＥＲ３結晶構造（ＰＤＢ＃４Ｐ５９）を示す図である。
【図16B】ｂ）灰色で示されるＡｒｇ４２６および遠位残基、および黒色で示されるＡｒｇ４２６から１１．２オングストローム半径以内の全ての、表面に露出した残基を用いた、エピトープ領域の溶媒に露出した表面を示す図である。
【図16C】ｃ）薄い灰色のエピトープ領域中の残基Ａｒｇ４２６および暗い灰色の周囲の残基（全て標識されている）を示す図である。図１６について、図および分析は、Ｙａｓａｒａ（ｗｗｗ．ｙａｓａｒａ．ｏｒｇ）で行った。
【図17】ＨＥＲ３結晶構造中に示される、ＰＧ３１７８結合のための重要残基を示す図である。ＰＧ３１７８結合について同定された重要残基は、ＨＥＲ３結晶構造上で黒色球として示される（ＰＤＢ ＩＤ＃４Ｐ５９）。
【図18】ＨＥＲ３に対するＰＧ３１７５のための重要結合残基としてのＲ４２６の確認を示す図である。２つの抗ＨＥＲ３抗体を、コントロール抗体として含めた。結合を、ＦＡＣＳ滴定において決定し、結合を、ＷＴ ＨＥＲ３に対する結合と比較したＡＵＣとして表現する。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本明細書で使用する場合、用語「抗原結合部位」とは、抗原に結合することが可能な抗体上の部位を指す。未改変の抗原結合部位は、典型的には、抗体の可変ドメインによって形成され、かかる抗体の可変ドメイン中に存在する。一実施形態では、本発明の抗体可変ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。抗原結合部位は、組み合わされたＶＨ／ＶＬ可変ドメイン中に、またはＶＨ領域中にだけ、もしくはＶＬ領域中にだけ、存在し得る。抗原結合部位が、可変ドメインの２つの領域のうち一方中にだけ存在する場合、対応物の可変領域は、結合性可変領域のフォールディングおよび／または安定性に寄与し得るが、抗原の結合自体には顕著には寄与しない。
【0018】
抗体による抗原結合は、典型的には、抗体のランダムな非特異的付着とは対照的に、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）ならびに抗原および可変ドメインの両方の特異的三次元構造を介して媒介され、これによって、これら２つの構造が正確に一緒に結合することが可能となる（錠および鍵と類似の相互作用）。抗体は、典型的には、抗原の一部のみ（エピトープと呼ばれる）を認識し、かかるエピトープは、他の、好ましくは非ヒトの化合物中にも同様に存在し得るので、ＥＧＦＲおよび／またはＥｒｂＢ−３に結合する本発明に従う抗体は、かかる他の化合物が同じエピトープを含む場合、好ましくは他のヒト・タンパク質ではない、他のタンパク質も同様に認識し得る。従って、用語「結合」は、別のタンパク質または同じエピトープを含むタンパク質（複数可）への抗体の結合を排除しない。かかる他のタンパク質（複数可）は、好ましくは、ヒト・タンパク質ではない。その代わり、交差反応性は許容される。本発明において定義されるＥＧＦＲ抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３抗原結合部位は、典型的には、出生後の、好ましくは成人のヒトでは、細胞の膜上の他のタンパク質に結合しない。本発明に従う抗体は、典型的には、以下により詳細に概説されるように、少なくとも１×１０ｅ−６Ｍの結合親和性（即ち、平衡解離定数ＫＤ）で、ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３に結合することが可能である。
【0019】
本明細書で使用する場合、抗原結合とは、その抗原への抗体の典型的結合能力を指す。ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位を含む抗体は、ＥＧＦＲに結合し、他の点は同一の条件下で、同じ種の相同受容体ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−４に、少なくとも１００分の１低く結合する。ＥｒｂＢ−３に結合する抗原結合部位を含む抗体は、ＥｒｂＢ−３に結合し、他の点は同一の条件下で、同じ種の相同受容体ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−４には結合しない。ＥｒｂＢファミリーが細胞表面受容体のファミリーであることを考慮すると、結合は、典型的には、受容体（複数可）を発現する細胞上で評価される。抗原への抗体の結合は、種々の方法で評価され得る。
【0020】
用語「結合を妨害する」とは、本明細書で使用する場合、抗体が、ＥｒｂＢ−３上のエピトープに対するものであり、抗体が、ＥｒｂＢ−３への結合についてリガンドと競合することを意味する。抗体は、リガンド結合を減退させ得、リガンドがＥｒｂＢ−３に既に結合している場合にはこれを置き換え得、または、例えば立体障害を介して、リガンドがＥｒｂＢ−３に結合する可能性を少なくとも部分的に防止し得る。抗原結合部位の結合を測定するための１つの方法は、抗体を抗原（好ましくは、抗原を発現する細胞）と共にインキュベートし、未結合の抗体を除去し（好ましくは、洗浄工程によって）、結合した抗体の定常ドメインに結合する標識された抗体によって、結合した抗体を検出することである。測定値は、好ましくは、陽性および陰性参照と比較される。細胞の場合、この陰性参照は、抗原を発現しない細胞である。
【0021】
用語「抗体」とは、本明細書で使用する場合、タンパク質性分子、好ましくは、抗原上のエピトープに結合する１または複数の可変ドメインを含む免疫グロブリン・クラスのタンパク質に属するものを意味し、ここで、かかるドメインは、抗体の可変ドメイン由来であるか、またはかかる可変ドメインと配列相同性を共有する。本発明の抗体は、好ましくは、２つの可変ドメインを含む。治療的使用のための抗体は、好ましくは、処置される対象の天然抗体に可能な限り近い（例えば、ヒト対象に対してヒト抗体）。抗体結合は、特異性および親和性に関して表現され得る。特異性は、どの抗原またはそのエピトープが結合ドメインによって特異的に結合されるかを決定する。親和性は、特定の抗原またはエピトープへの結合の強さについての尺度である。特異的結合は、少なくとも１×１０ｅ−６Ｍの、より好ましくは１×１０ｅ−７Ｍの、より好ましくは１×１０ｅ−９Ｍよりも高い親和性（ＫＤ）での結合として定義される。典型的には、治療的適用のための抗体は、最大で１×１０ｅ−１０Ｍまたはそれより高い親和性を有する。本発明の二重特異性抗体などの抗体は、天然抗体の定常ドメイン（Ｆｃ部分）を含む。本発明の抗体は、典型的には、好ましくはヒトＩｇＧサブクラスの、二重特異性全長抗体である。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体である。本発明のかかる抗体は、良好なＡＤＣＣ特性を有し、ヒトへのｉｎ ｖｉｖｏ投与の際に好ましい半減期を有し、クローナル細胞における共発現の際にホモ二量体よりもヘテロ二量体を優先的に形成する改変された重鎖を提供できるＣＨ３操作テクノロジーが存在する。例えば、抗体自体が低いＡＤＣＣ活性を有する場合、抗体の定常領域を僅かに改変することによって、抗体のＡＤＣＣ活性は改善され得る（Ｊｕｎｔｔｉｌａ，Ｔ．Ｔ．、Ｋ．Ｐａｒｓｏｎｓら（２０１０）、「Ｓｕｐｅｒｉｏｒ Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＨＥＲ２−Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７０（１１）：４４８１〜４４８９）。
【0022】
本発明の抗体は、好ましくは、「全長」抗体である。本発明に従う用語「全長」は、本質的に完全な抗体を含むと定義されるが、かかる抗体は、インタクトな抗体の全ての機能を有する必要はない。誤解を避けるために、全長抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。各鎖は、定常（Ｃ）領域および可変（Ｖ）領域を含み、これらは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ、およびＣＬ、ＶＬと称されるドメインへと解体され得る。抗体は、Ｆａｂ部分中に含まれる可変ドメインを介して抗原に結合し、結合後、定常ドメインを介して、主にＦｃ部分を介して、免疫系の分子および細胞と相互作用できる。用語「可変ドメイン」、「ＶＨ／ＶＬ対」、「ＶＨ／ＶＬ」は、本明細書で相互交換可能に使用される。本発明に従う全長抗体は、所望の特徴を提供する変異が存在し得る抗体を包含する。かかる変異は、これらの領域のいずれかの実質的な部分の欠失であるべきではない。しかし、得られた抗体の結合特徴を本質的に変更することなしに１または数個のアミノ酸残基が欠失されている抗体は、用語「全長抗体」内に包含される。例えば、ＩｇＧ抗体は、定常領域中に、１〜２０アミノ酸残基の挿入、欠失またはそれらの組み合わせを有し得る。
【0023】
全長ＩｇＧ抗体は、それらの好ましい半減期、および免疫原性を理由として完全に自己の（ヒト）分子に近くある必要性に起因して、好ましい。本発明の抗体は、好ましくは、二重特異性ＩｇＧ抗体、好ましくは、二重特異性全長ＩｇＧ１抗体である。ＩｇＧ１は、ヒトにおけるその長い循環半減期に基づいて好ましい。本発明に従う二重特異性ＩｇＧ抗体は、ヒトＩｇＧ１であることが好ましい。
【0024】
用語「二重特異性」（ｂｓ）とは、抗体の１つの部分（上に定義される）が抗原上の１つのエピトープに結合する一方で、第２の部分がその抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープに結合することを意味する。この異なるエピトープは、典型的には、異なる抗原上に存在する。本発明によれば、この第１および第２の抗原は、事実上、２つの異なるタンパク質である。好ましい二重特異性抗体は、２つの異なるモノクローナル抗体の部分を含む抗体であり、結果として、２つの異なる型の抗原に結合する。二重特異性抗体の一方のアームは、典型的には、１つの抗体の可変ドメインを含み、他方のアームは、別の抗体の可変ドメインを含む。本発明の二重特異性抗体の重鎖可変領域は、互いに異なるが、軽鎖可変領域は、好ましくは、本発明の二重特異性抗体において同じである。即ち、本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、同じ軽鎖を有する２つの親抗体（即ち、共通の軽鎖の抗体）から構成される。異なる重鎖可変領域が同じまたは共通の軽鎖と結び付けられている二重特異性抗体は、共通の軽鎖を有する二重特異性抗体とも呼ばれる。従って、両方のアームが共通の軽鎖を含む、本発明に従う二重特異性抗体が、さらに提供される。
【0025】
好ましい二重特異性抗体は、単一細胞における２つの異なる重鎖および１つの共通の軽鎖の共発現によって得ることができる。野生型ＣＨ３ドメインが使用される場合、２つの異なる重鎖および１つの共通の軽鎖の共発現は、３つの異なる種、ＡＡ、ＡＢおよびＢＢを生じる。所望の二重特異性産物（ＡＢ）の百分率を増加させるために、ＣＨ３操作が使用でき、または言い換えれば、本明細書の以下に定義されるような、適合的なヘテロ二量体化ドメインを有する重鎖を使用できる。
【0026】
用語「適合的なヘテロ二量体化ドメイン」とは、本明細書で使用する場合、操作されたドメインＡ’が、操作されたドメインＢ’とのヘテロ二量体を優先的に形成し、逆もまた然りであるが、Ａ’−Ａ’間およびＢ’−Ｂ’間のホモ二量体化は好まないように操作されている、タンパク質ドメインを指す。
【0027】
本発明に従う用語「共通の軽鎖」とは、同一であり得るか、または全長抗体の結合特異性は影響されないが、いくらかのアミノ酸配列差異を有し得る軽鎖を指す。例えば、本明細書で使用する場合、共通の軽鎖の定義の範囲内で、例えば、保存的アミノ酸変化、重鎖とペアリングした場合に結合特異性に寄与しないまたは部分的にのみ寄与する領域中のアミノ酸の変化を導入および試験することなどによって、同一ではないがなおも機能的に等価物である軽鎖を調製および見出すことが可能である。用語「共通の軽鎖」、「共通のＶＬ」、「単一軽鎖」、「単一ＶＬ」は、全て、用語「再編成された」の付加ありまたはなしで、本明細書で相互交換可能に使用される。機能的な抗原結合ドメインを有する抗体を形成するために異なる重鎖と組み合わせられるヒト軽鎖を共通の軽鎖として使用することは、本発明の一態様である（ＷＯ２００４／００９６１８、ＷＯ２００９／１５７７７１、Ｍｅｒｃｈａｎｔら、１９９８、Ｎｉｓｓｉｍら、１９９４）。好ましくは、共通の軽鎖は、生殖系列配列を有する。好ましい生殖系列配列は、ヒト・レパートリーにおいて頻繁に使用され、良好な熱力学的安定性、収量および溶解度を有する軽鎖可変領域である。好ましい生殖系列軽鎖は、Ｏ１２に基づいており、好ましくは、再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１またはその断片もしくは機能的等価物（即ち、同じＩｇＶκ１−３９遺伝子セグメントであるが、異なるＩＧＪκ遺伝子セグメント）である（ｉｍｇｔ．ｏｒｇにおけるＩＭＧＴデータベース・ワールドワイド・ウェブに従う命名法）。従って、共通の軽鎖が、生殖系列軽鎖、好ましくは、ＩｇＶＫｌ−３９遺伝子セグメントを含む再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖、最も好ましくは、再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖ＩｇＶＫｌ−３９＊０１／ＩＧＪＫｌ＊０１である、本発明に従う二重特異性抗体が、さらに提供される。用語、再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１、ＩＧＫＶ１−３９／ＩＧＫＪ１、ｈｕＶκ１−３９軽鎖、または短くｈｕＶκ１−３９は、本出願を通じて相互交換可能に使用される。明らかに、当業者は、「共通の」が、そのアミノ酸配列が同一でない、軽鎖の機能的等価物もまた指すことを認識する。機能的結合領域の形成に実質的に影響しない変異（欠失、置換、付加）が存在する、上記軽鎖の多くのバリアントが存在する。本発明の軽鎖はまた、１〜５アミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせを有する、本明細書の上で特定した軽鎖であり得る。
【0028】
ＶＨが、第１の抗原を特異的に認識することが可能であり、免疫グロブリン可変ドメイン中のＶＨとペアリングしたＶＬが、第２の抗原を特異的に認識することが可能である抗体もまた、企図される。得られたＶＨ／ＶＬ対は、抗原１または抗原２のいずれかに結合する。例えばＷＯ２００８／０２７２３６、ＷＯ２０１０／１０８１２７およびＳｃｈａｅｆｅｒら（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２０、４７２〜４８６、２０１１年１０月）に記載される、かかるいわゆる「ツー・イン・ワン抗体」は、本発明の二重特異性抗体とは異なり、さらに「ツー・イン・ワン抗体」と呼ばれる。かかる「ツー・イン・ワン」抗体は、同一のアームを有し、本発明の抗体ではない。
【0029】
ＥＧＦＲは、Ｈｅｒ−またはｃＥｒｂＢ−１、−２、−３および−４と称される、４つの受容体チロシン・キナーゼ（ＲＴＫ）のファミリーのメンバーである。ＥＧＦＲは、４つのサブ・ドメインから構成される細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を有し、そのうち２つはリガンド結合に関与し、そのうちの１つはホモ二量体化およびヘテロ二量体化に関与する１、２（概説については、参考文献３を参照のこと）。このセクションにおいて使用される参考文献番号は、「本明細書で引用した参考文献」の見出しのリスト中の参考文献の番号付けを指す。ＥＧＦＲは、種々のリガンドからの細胞外シグナルを統合して、多様な細胞内応答を生じる４、５。ＥＧＦＲによって活性化される主要なシグナル伝達経路は、Ｒａｓマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）分裂促進性シグナル伝達カスケードから構成される。この経路の活性化は、チロシン・リン酸化されたＥＧＦＲへのＧｒｂ２の動員によって開始される６、７。これは、Ｇｒｂ２が結合したＲａｓグアニン・ヌクレオチド交換因子サン・オブ・セブンレス（Ｓｏｎ ｏｆ Ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ）（ＳＯＳ）を介したＲａｓの活性化をもたらす。さらに、ＰＩ３キナーゼ−Ａｋｔシグナル伝達経路もまた、ＥＧＦＲによって活性化されるが、この活性化は、Ｈｅｒ３の共発現が存在する場合には、はるかに強い８、９。ＥＧＦＲは、いくつかのヒト上皮悪性腫瘍、特に、乳房、膀胱、非小細胞肺癌肺、結腸、卵巣、頭頸部および脳の癌に関与する１０。自己分泌活性化ループを生じる、遺伝子中の活性化変異、ならびに受容体およびそのリガンドの過剰発現が見出されている（概説については、参考文献１１を参照のこと）。従って、このＲＴＫは、癌治療のための標的として広範に使用されている。ＲＴＫを標的化する小分子阻害剤および細胞外リガンド結合ドメインに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の両方が開発されており、主に選択された群の患者についてであるが、いくつかの臨床的成功がこれまでに示されている１２。ヒトＥＧＦＲタンパク質およびそれをコードする遺伝子についてのデータベース登録番号は、（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿００５２２８．３）である。登録番号は、標的としてのＥＧＦＲタンパク質の同定のさらなる方法を提供するために主に与えられ、抗体によって結合されるＥＧＦＲタンパク質の実際の配列は、例えば、一部の癌において生じるものなどの、コード遺伝子中の変異などに起因して、変動し得る。本明細書でＥＧＦＲに対する言及がなされる場合、この言及は、特記しない限り、ヒトＥＧＦＲを指す。ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、ＥＧＦＲおよびその種々のバリアント、例えば、一部のＥＧＦＲ陽性腫瘍上で発現されるものに結合する。
【0030】
用語「ＥｒｂＢ−３」とは、本明細書で使用する場合、ヒトにおける、ＥＲＢＢ３遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。この遺伝子またはタンパク質の代替名は、ＨＥＲ３；ＬＣＣＳ２；ＭＤＡ−ＢＦ−１；ｃ−ＥｒｂＢ−３；ｃ−ＥｒｂＢ３；ＥｒｂＢ３−Ｓ；ｐ１８０−ＥｒｂＢ３；ｐ４５−ｓＥｒｂＢ３；およびｐ８５−ｓＥｒｂＢ３である。本明細書でＥｒｂＢ−３に対する言及がなされる場合、この言及は、ヒトＥｒｂＢ−３を指す。ＥｒｂＢ−３に結合する抗原結合部位を含む抗体は、ヒトＥｒｂＢ−３に結合する。ＥｒｂＢ−３抗原結合部位は、ヒト・オルソログと他の哺乳動物オルソログとの間の配列および三次構造の類似性に起因して、かかるオルソログにも結合し得るが、必ずしも結合しなくともよい。ヒトＥｒｂＢ−３タンパク質およびそれをコードする遺伝子についてのデータベース登録番号は、（ＮＰ＿００１００５９１５．１ ＮＰ＿００１９７３．２、ＮＣ＿００００１２．１１ ＮＣ＿０１８９２３．２ ＮＴ＿０２９４１９．１２）である。これらの登録番号は、標的としてのＥｒｂＢ−３の同定のさらなる方法を提供するために主に与えられ、抗体によって結合されるＥｒｂＢ−３タンパク質の実際の配列は、例えば、一部の癌において生じるものなどの、コード遺伝子中の変異などに起因して、変動し得る。ＥｒｂＢ−３抗原結合部位は、ＥｒｂＢ−３およびそれらの種々のバリアント、例えば、一部のＥｒｂＢ−２陽性腫瘍細胞によって発現されるものに結合する。ＥｒｂＢ−３に結合する抗原結合部位は、好ましくは、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する。好ましい一実施形態では、ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する抗原結合部位の親和性（ＫＤ）は、２．０ｎＭ以下、より好ましくは１．５ｎＭ以下、より好ましくは１．３９ｎＭ以下、より好ましくは０．９９ｎＭ以下である。好ましい一実施形態では、本発明に従う抗体は、好ましくは、Ｒ４２６およびネイティブＥｒｂＢ−３タンパク質中のＲ４２６から１１．２オングストローム以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩの少なくとも１つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。好ましい一実施形態では、ＳＫ−ＢＲ−３細胞上のＥｒｂＢ−３に対する抗原結合部位の親和性（ＫＤ）は、２．０ｎＭ以下、より好ましくは１．５ｎＭ以下、より好ましくは１．３９ｎＭ以下、好ましくは０．９９ｎＭ以下である。一実施形態では、この親和性（ＫＤ）は、１．３９〜０．５９ｎＭの範囲内である。好ましい一実施形態では、ＢＴ−４７４細胞上のＥｒｂＢ−３に対する抗原結合部位の親和性（ＫＤ）は、２．０ｎＭ以下、より好ましくは１．５ｎＭ以下、より好ましくは１．０ｎＭ以下、より好ましくは０．５ｎＭ未満、より好ましくは０．３１ｎＭ以下、より好ましくは０．２３ｎＭ以下である。一実施形態では、この親和性（ＫＤ）は、０．３１〜０．１５ｎＭの範囲内である。上述の親和性は、好ましくは、定常状態細胞親和性測定を使用して測定され、ここで、実施例に記載されるように、細胞は、放射活性標識された抗体を使用して４℃でインキュベートされ、その後、細胞に結合した放射活性が測定される。
【0031】
ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩの少なくとも１つのアミノ酸に結合する抗原結合部位は、好ましくは、Ｒ４２６およびネイティブＥｒｂＢ−３タンパク質中のＲ４２６から１１．２オングストローム以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸に結合する。アミノ酸残基番号付けは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）ＩＤ ＃４Ｐ５９のものである。実施例に示されるように、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩのこの領域に結合する抗体は、特に良好な結合特徴を示し、これらは、ＥｒｂＢ−３陽性細胞上のＥｒｂＢ−３の活性に対抗することが可能である。用語「ネイティブＥｒｂＢ−３タンパク質中のＲ４２６から１１．２オングストローム以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基」とは、Ｒ４２６から１１．２オングストローム以内に空間的に位置するＥｒｂＢ−３タンパク質の三次構造中にあり、タンパク質の外側に少なくとも一部露出しており、その結果、抗体によって結合され得る、アミノ酸残基を指す。好ましくは、ネイティブＥｒｂＢ−３タンパク質中のＲ４２６から１１．２オングストローム以内に位置するアミノ酸残基は、Ｌ４２３、Ｙ４２４、Ｎ４２５、Ｇ４２７、Ｇ４５２、Ｒ４５３、Ｙ４５５、Ｅ４８０、Ｒ４８１、Ｌ４８２、Ｄ４８３およびＫ４８５からなる群から選択される（例えば、図１６および表８を参照のこと）。好ましい一実施形態では、本発明に従う二重特異性抗体が提供され、この抗体は、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩのＲ４２６を少なくとも結合する抗原結合部位を含む。好ましくは、この抗体は、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩのＲ４２６と少なくとも結合する抗原結合部位を含む。
【0032】
本発明は、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩのＲ４２６と少なくとも結合する抗原結合部位を含む二重特異性抗体をさらに提供する。好ましくは、この抗体は、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩのＲ４２６と少なくとも結合する抗原結合部位を含む。好ましくは、この抗体は、図１１Ｂに示される可変領域をさらに含む。好ましい一実施形態では、この抗体は、ＥＧＦＲに対する結合部位をさらに含む。この可変領域は、好ましくは、図１１ａに示される配列を含む。
【0033】
本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、改善されたＡＤＣＣ活性を有する。抗体のＡＤＣＣを増強するための１つの技術は、非フコシル化である（例えば、Ｊｕｎｔｔｉｌａ，Ｔ．Ｔ．、Ｋ．Ｐａｒｓｏｎｓら（２０１０）、「Ｓｕｐｅｒｉｏｒ Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＨＥＲ２−Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７０（１１）：４４８１〜４４８９を参照のこと）。従って、非フコシル化されている、本発明に従う二重特異性抗体が、さらに提供される。代替的に、またはさらに、例えば糖鎖工学（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ／Ｂｉｏｗａ、ＧｌｙｃＡｒｔ（Ｒｏｃｈｅ）およびＥｕｒｅｋａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）および変異誘発（ＸｅｎｃｏｒおよびＭａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）を含む複数の他の戦略が、ＡＤＣＣ増強を達成するために使用され得、これらの戦略は全て、低親和性活性化ＦｃγＲＩＩＩａへのＦｃ結合を改善し、および／または低親和性阻害性ＦｃγＲＩＩｂへの結合を低減させようとするものである。本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、ＡＤＣＣ活性を増強するために非フコシル化されている。本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、正常ＣＨＯ細胞中で産生される同じ抗体と比較した場合、Ｆｃ領域中に、Ｎ結合型炭水化物構造の、低減された量のフコシル化を含む。
【0034】
本発明は、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この抗体は、ＢｘＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６８７）またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２５０５８）のＥＧＦＲおよび／またはＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長を阻害することについて、２００ｐＭ未満の半数成長阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。この抗体は、ＢｘＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６８７）またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２５０５８）のＥＧＦＲおよび／またはＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長を阻害することについて、好ましくは１００ｐＭ未満、好ましくは５０ｐＭ未満、より好ましくは２０ｐＭ未満のＩＣ５０を有する。本発明の抗体は、好ましくは、ＢｘＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６８７）またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２５０５８）のＥＧＦＲおよび／またはＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長を阻害することについて、１ｐＭ超のＩＣ５０を有する。
【0035】
本発明は、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性をさらに提供し、この抗体は、ＢｘＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６８７）またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２５０５８）のＥＧＦＲおよび／またはＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長を阻害することについて、他の点では同じ条件下でこれらの細胞の成長を阻害することについての抗体ＭＥＨＤ７９４５ＡのＩＣ５０よりも低い半数成長阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。抗ＥＧＦＲ／抗ＨＥＲ３抗体ＭＥＨＤ７９４５Ａは、ＷＯ２０１０／１０８１２７に記載されている。好ましくは、ＢｘＰＣ３細胞またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞のＥＧＦＲおよび／またはＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長を阻害することについての、本発明の抗体のＩＣ５０は、他の点では同じ条件下でこれらの細胞の成長を阻害することについてのＭＥＨＤ７９４５ＡのＩＣ５０の９０％未満、好ましくは、抗体ＭＥＨＤ７９４５ＡのＩＣ５０の８０％未満、より好ましくは６０％未満、より好ましくは５０％未満、より好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満、より好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満である。本発明の抗体は、ＢｘＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６８７）またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２５０５８）のＥＧＦＲおよび／またはＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長を阻害することについて、好ましくは、他の点では同じ条件下でこれらの細胞の成長を阻害することについての抗体ＭＥＨＤ７９４５ＡのＩＣ５０の１％超のＩＣ５０を有する。本発明の抗体は、好ましくは、ＢｘＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６８７）またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２５０５８）のＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長を阻害することについて、示されたＩＣ５０を有する。
【0036】
比較的低濃度の抗体において有効な抗体が、本発明において好ましい。かかる抗体は、より低い量でおよび／またはより低い頻度の投与で提供され得、抗体の有用性をより経済的なものにする。比較的低濃度の抗体において有効な抗体は、特により低い濃度において、腫瘍細胞の増殖をｉｎ ｖｉｖｏでより効率的に阻害する。かかる抗体はまた、より良い治療濃度域を有し、より低頻度でまたはより長い投与間隔で投与され得る。
【0037】
ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３は各々、多くのリガンドに結合でき、ＢｘＰＣ３細胞またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞の成長を刺激できる。一方または両方の受容体に対するリガンドの存在下で、ＢｘＰＣ３細胞またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞の成長が刺激される。ＢｘＰＣ３細胞のＥＧＦＲおよび／またはＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長は、リガンドの非存在下および存在下で細胞の成長を比較することによって測定され得る。ＢｘＰＣ３またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞のＥＧＦＲリガンド誘導性成長を測定するための好ましいＥＧＦＲリガンドは、ＥＧＦである。ＢｘＰＣ３またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞のＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長を測定するための好ましいＥｒｂＢ−３リガンドは、ＮＲＧ１である。このリガンド誘導性成長は、好ましくは、飽和量のリガンドを使用して測定される。好ましい一実施形態では、ＥＧＦは、培養培地１ｍｌ当たり１００ｎｇの量で使用される。ＮＲＧ１は、好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌの培養培地で使用される。半数成長阻害濃度（ＩＣ５０）は、ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３リガンド誘導されたＢｘＰＣ３またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞上で測定されることが好ましい。このアッセイでは、ＥＧＦがＥＧＦＲリガンドであり、ＮＲＧ１がＥｒｂＢ−３リガンドであることが好ましい。ＩＣ５０アッセイのための適切な試験は、実施例に記載されている。
【0038】
過剰なＥｒｂＢ−２の存在下では、ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロ二量体は、このヘテロ二量体中のＥｒｂＢ−３鎖に対する検出可能なリガンドの非存在下で、発現細胞に成長シグナルを提供し得る。このＥｒｂＢ−３受容体機能は、本明細書で、ＥｒｂＢ−３のリガンド非依存的受容体機能と呼ばれる。このＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３ヘテロ二量体は、ＥｒｂＢ−３リガンドの存在下でも、発現細胞に成長シグナルを提供する。このＥｒｂＢ−３受容体機能は、本明細書で、ＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能と呼ばれる。
【0039】
ＥＧＦおよびＮＲＧ１は、好ましくは、実施例に記載されるように、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓのカタログ番号３９６−ＨＢおよび２３６−ＥＧのＥＧＦおよびＮＲＧ１である。
【0040】
ＥｒｂＢ−３に結合する抗原結合部位を含む本発明の抗体は、好ましくは、ＥｒｂＢ−３陽性細胞上のＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能を低減できる。この抗体は、ＥＧＦＲとの二量体化を介したＥｒｂＢ−３シグナル伝達を低減することが可能である。この抗体は、ＥｒｂＢ−２を介したＥｒｂＢ−３シグナル伝達を低減することが可能である。このＥｒｂＢ−３陽性細胞は、好ましくは、ＥｒｂＢ−２についても陽性である。このＥｒｂＢ−３陽性細胞は、好ましくは、ＥＧＦＲについても陽性である。ＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能は、好ましくは、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞のＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長である。好ましい一実施形態では、このＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞は、細胞表面上に少なくとも５０．０００のＥｒｂＢ−２受容体を含む。好ましい一実施形態では、少なくとも１００．０００のＥｒｂＢ−２受容体。好ましい一実施形態では、このＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞は、細胞表面上に１．０００．０００以下のＥｒｂＢ−２受容体を含む。好ましい一実施形態では、このＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞は、細胞表面上に１．０００．０００超のＥｒｂＢ−２受容体を含む。好ましい一実施形態では、このＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞は、ＢｘＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６８７）またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２５０５８）；ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−２２（商標））、ＳＫＢＲ３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−３０（商標））ＮＣＩ−８７細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−５８２２（商標））またはＡ４３１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５５５（商標））である。好ましくは、このＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞は、ＥＧＦＲ陽性でもある。このＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞は、好ましくは、本明細書で上に示されるような、ＢｘＰＣ３またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞である。
【0041】
本明細書で使用する場合、リガンド誘導性受容体機能は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０、４０、５０ ６０または少なくとも７０％低減され、特に好ましい一実施形態では、このリガンド誘導性受容体機能は、８０％、より好ましくは９０％低減される。この低減は、好ましくは、本発明の二重特異性抗体の存在下でリガンド誘導性受容体機能を決定し、それを、他の点では同一の条件下で抗体の非存在下での同じ機能と比較することによって、決定される。これらの条件は、ＥｒｂＢ−３リガンドの存在を少なくとも含む。存在するリガンドの量は、好ましくは、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞株の最大成長の半分を誘導する量である。この試験のためのＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３陽性細胞株は、好ましくは、本明細書で上に示されるような、ＢｘＰＣ３またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞である。ＥｒｂＢ−３リガンド誘導性受容体機能を決定するための試験および／またはリガンドは、好ましくは、実施例に特定されるような、ＥｒｂＢ−３リガンド誘導性成長低減についての試験である。
【0042】
ＥｒｂＢ−３に結合する抗原結合部位を含む本発明の抗体は、ＥｒｂＢ−３へのＥｒｂＢ−３リガンドの結合を好ましくは妨害する。かかる抗体は、特に、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位もまた含む抗体の背景で、ＢｘＰＣ３またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞のリガンド誘導性成長を低減する際により有効である。
【0043】
用語「ＥｒｂＢ−３リガンド」とは、本明細書で使用する場合、ＥｒｂＢ−３に結合および活性化するポリペプチドを指す。ＥｒｂＢ−３リガンドの例には、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）およびニューレグリン２（ＮＲＧ２）が含まれるがこれらに限定されない（概説については、Ｏｌａｙｉｏｙｅ ＭＡら；ＥＭＢＯ Ｊ（２０００）第１９巻：３１５９〜３１６７頁）。この用語は、天然に存在するポリペプチドの生物学的に活性な断片および／またはバリアントを含む。
【0044】
用語「ＥＧＦＲリガンド」とは、本明細書で使用する場合、ＥＧＦＲに結合および活性化するポリペプチドを指す。ＥＧＦＲリガンドの例には、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＨＢ−ＥＧＦ、アンフィレグリン、ベータセルリンおよびエピレグリンが含まれるがこれらに限定されない（概説については、Ｏｌａｙｉｏｙｅ ＭＡら；ＥＭＢＯ Ｊ（２０００）第１９巻：３１５９〜３１６７頁）。この用語は、天然に存在するポリペプチドの生物学的に活性な断片および／またはバリアントを含む。
【0045】
本発明の抗体の第１の抗原結合部位は、好ましくは、ＥＧＦＲのドメインＩまたはドメインＩＩＩに結合する。好ましくは、この抗体は、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩに結合する。この抗体は、好ましくは、ＢｘＰＣ３またはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞のＥＧＦ誘導性増殖を阻害する。
【0046】
本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を含む。低い固有のＡＤＣＣ活性を有する抗体には、さらなるＡＤＣＣ活性が提供され得る。この抗体は、ＡＤＣＣ活性を増強するために操作され得る（概説については、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．２００９年９月；１００（９）：１５６６〜７２頁。Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｋｕｂｏｔａ Ｔ、Ｎｉｗａ Ｒ、Ｓａｔｏｈ Ｍ、Ａｋｉｎａｇａ Ｓ、Ｓｈｉｔａｒａ Ｋ、Ｈａｎａｉ Ｎを参照のこと）。ＡＤＣＣを惹起することにおける抗体またはエフェクター細胞の効力を決定するための、いくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法が存在する。これらには、クロム−５１［Ｃｒ５１］放出アッセイ、ユーロピウム［Ｅｕ］放出アッセイおよび硫黄−３５［Ｓ３５］放出アッセイがある。通常、表面に露出した特定の抗原を発現する標識された標的細胞株が、その抗原に特異的な抗体と共にインキュベートされる。洗浄後、Ｆｃ受容体ＣＤ１６を発現するエフェクター細胞は、抗体標識された標的細胞と共に共インキュベートされる。標的細胞溶解は、引き続いて、シンチレーション・カウンターまたは分光光度法によって、細胞内標識の放出によって測定される。好ましい試験は、実施例中に詳述される。本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、非フコシル化されている。本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、正常ＣＨＯ細胞中で産生される同じ抗体と比較した場合、Ｆｃ領域中に、Ｎ結合型炭水化物構造の、低減された量のフコシル化を含む。
【0047】
本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、ヒトにおいて使用される。この目的のために、本発明の抗体は、好ましくは、ヒトまたはヒト化抗体である。
【0048】
ポリペプチドに対するヒトの寛容は、多くの異なる局面によって支配される。Ｔ細胞媒介性、Ｂ細胞媒介性などである免疫は、ポリペプチドに対するヒトの寛容に包含される変数の１つである。本発明の二重特異性抗体の定常領域は、好ましくは、ヒト定常領域である。この定常領域は、天然に存在するヒト抗体の定常領域と、１または複数の、好ましくは１０以下の、好ましくは５アミノ酸以下の差異を含み得る。定常部分が、天然に存在するヒト抗体に完全に由来することが好ましい。本明細書で産生される種々の抗体は、ヒト抗体可変ドメイン・ライブラリーに由来する。かかるこれらの可変ドメインは、ヒトのものである。ユニークＣＤＲ領域は、ヒト由来、合成、または別の生物由来であり得る。可変領域は、ＣＤＲ領域を別にして、天然に存在するヒト抗体の可変領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する場合、ヒト可変領域とみなされる。本発明の抗体中のＥＧＦＲ結合ＶＨ、ＥｒｂＢ−３結合ＶＨまたは軽鎖の可変領域は、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列中の潜在的差異を数に入れずに、天然に存在するヒト抗体の可変領域と、１または複数の、好ましくは１０以下の、好ましくは５アミノ酸以下の差異を含み得る。かかる変異は、体細胞超変異に関しても天然に存在する。
【0049】
抗体は、重鎖可変領域に関しては少なくとも、種々の動物種由来であり得る。例えば、マウス重鎖可変領域などをヒト化することは、一般的実務である。これが達成され得る種々の方法が存在し、マウス重鎖可変領域の３Ｄ構造とマッチする３Ｄ構造を有するヒト重鎖可変領域中へのＣＤＲ移植や、マウス重鎖可変領域から既知のまたは疑わしいＴ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープを除去することによって好ましくは実施される、マウス重鎖可変領域の脱免疫化、がその中にある。除去は、典型的には、エピトープ中のアミノ酸のうちの１または複数を、別の（典型的には保存的）アミノ酸に置換することにより、その結果、エピトープの配列は、もはやＴ細胞エピトープでもＢ細胞エピトープでもないように、改変される。
【0050】
脱免疫化されたマウス重鎖可変領域は、元のマウス重鎖可変領域よりも、ヒトにおいて免疫原性が低い。好ましくは、本発明の可変領域またはドメインは、さらにヒト化、例えば、ベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）などされる。ベニヤ化技術を使用することによって、免疫系が容易に遭遇する外面残基は、弱い免疫原性のベニヤ化表面または実質的に非免疫原性のベニヤ化表面のいずれかを含むハイブリッド分子を提供するために、ヒト残基で選択的に置き換えられる。本発明において使用される動物は、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトである。
【0051】
本発明に従う二重特異性抗体は、好ましくは、ヒト抗体の定常領域を含む。それらの重鎖定常ドメインにおける差異に従って、抗体は、５つのクラスまたはアイソタイプにグループ分けされる：ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ。これらのクラスまたはアイソタイプは、対応するギリシャ文字を用いて名付けられた、上記重鎖のうち少なくとも１つを含む。好ましい一実施形態では、本発明は、本発明に従う抗体を提供し、その定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥの定常領域の群から選択され、より好ましくは、この定常領域は、ＩｇＧ定常領域、より好ましくはＩｇＧ１定常領域、好ましくは変異したＩｇＧ１定常領域を含む。ＩｇＧ１の定常領域におけるいくつかのバリエーションが、天然に存在し、ならびに／または得られた抗体の免疫学的特性を変化させることなしに許容される。典型的には、約１〜１０の間のアミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせが、定常領域において許容される。
【0052】
本発明は、一実施形態では、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインを含む抗体を提供し、この抗体は、図１１Ａに示されるＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００２；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；ＭＦ３３７０；ＭＦ３７５１；ＭＦ３７５２からなる群から選択されるＥＧＦＲ特異的重鎖可変領域のＣＤＲ３配列を少なくとも含み、またはこの抗体は、図１１Ａに示されるＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００２；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；ＭＦ３３７０；ＭＦ３７５１；ＭＦ３７５２からなる群から選択されるＶＨのＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは１つ以下のアミノ酸が異なる重鎖ＣＤＲ３配列を含む。この抗体は、好ましくは、図１１Ａに示されるＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；またはＭＦ３３７０の少なくともＣＤＲ３配列を含む。
【0053】
この抗体は、好ましくは、図１１Ａに示されるＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００２；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；ＭＦ３３７０；ＭＦ３７５１；ＭＦ３７５２からなる群から選択されるＥＧＦＲ特異的重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または図１１Ａに示されるＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００２；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；ＭＦ３３７０；ＭＦ３７５１；ＭＦ３７５２からなる群から選択されるＥＧＦＲ特異的重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは多くて１つのアミノ酸が異なる、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を少なくとも含む。この抗体は、好ましくは、図１１Ａに示されるＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；またはＭＦ３３７０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を少なくとも含む。
【0054】
本発明は、ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインを含む抗体もまた提供し、この抗体は、図１１Ｂに示されるＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ３３０７、ＭＦ６０５５〜ＭＦ６０７４、好ましくはＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１もしくはＭＦ６０６５からなる群から選択されるＥｒｂＢ−３特異的重鎖可変領域のＣＤＲ３配列を少なくとも含み、またはこの抗体は、図１１Ｂに示されるＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ３３０７、ＭＦ６０５５〜ＭＦ６０７４、好ましくはＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１もしくはＭＦ６０６５からなる群から選択されるＶＨのＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは１つ以下のアミノ酸が異なる重鎖ＣＤＲ３配列を含む。この抗体は、好ましくは、ＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６またはＭＦ３１６３の少なくともＣＤＲ３配列、最も好ましくはＭＦ３１７８の少なくともＣＤＲ３配列を含む。この抗体は、好ましくは、図１１Ｂに示されるＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ３３０７、ＭＦ６０５５〜ＭＦ６０７４、好ましくはＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１もしくはＭＦ６０６５からなる群から選択されるＥｒｂＢ３特異的重鎖可変領域の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、またはＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ３３０７、ＭＦ６０５５〜ＭＦ６０７４、好ましくはＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１もしくはＭＦ６０６５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは多くて１つのアミノ酸が異なる、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を、少なくとも含む。この抗体は、好ましくは、ＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６またはＭＦ３１６３の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、最も好ましくは、ＭＦ３１７８の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。
【0055】
本発明は、一実施形態では、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第１の抗原結合部位は、図１１Ａに示されるＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００２；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；ＭＦ３３７０；ＭＦ３７５１；ＭＦ３７５２からなる群から選択されるＥＧＦＲ特異的重鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３配列、または図１１Ａに示されるＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００２；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；ＭＦ３３７０；ＭＦ３７５１；ＭＦ３７５２からなる群から選択されるＶＨのＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは１つ以下のアミノ酸が異なる、重鎖ＣＤＲ３配列を少なくとも含み、第２の抗原結合部位は、図１６Ｂもしくは図１６Ｅに示されるＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ３３０７、ＭＦ６０５５〜ＭＦ６０７４、好ましくはＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１もしくはＭＦ６０６５からなる群から選択されるＥｒｂＢ−３特異的重鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３配列、または、図１１Ｂに示されるＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ３３０７、ＭＦ６０５５〜ＭＦ６０７４、好ましくはＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１もしくはＭＦ６０６５からなる群から選択されるＶＨのＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは１つ以下のアミノ酸が異なる重鎖ＣＤＲ３配列を少なくとも含む。この第１の抗原結合部位は、好ましくは、図１１Ａに示されるＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；またはＭＦ３３７０のＣＤＲ３配列を少なくとも含み、第２の抗原結合部位は、好ましくは、図１１ＢのＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６またはＭＦ３１６３の少なくともＣＤＲ３配列、最も好ましくは、ＭＦ３１７８の少なくともＣＤＲ３配列を含む。この第１の抗原結合部位は、好ましくは、図１１Ａに示されるＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；もしくはＭＦ３３７０からなる群から選択されるＥＧＦＲ特異的重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または図１１Ａに示されるＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；もしくはＭＦ３３７０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは多くて１つのアミノ酸が異なる、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を少なくとも含み、第２の抗原結合部位は、好ましくは、図１１Ｂに示されるＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ３３０７、ＭＦ６０５５〜ＭＦ６０７４、好ましくはＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１もしくはＭＦ６０６５からなる群から選択されるＥｒｂＢ３特異的重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、またはＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ３３０７、ＭＦ６０５５〜ＭＦ６０７４、好ましくはＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１もしくはＭＦ６０６５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは多くて１つのアミノ酸が異なる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を少なくとも含む。この第１の抗原結合部位は、好ましくは、図１１Ａに示されるＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；またはＭＦ３３７０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を少なくとも含み、第２の抗原結合部位は、好ましくは、ＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６またはＭＦ３１６３の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、最も好ましくは、ＭＦ３１７８の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。
【0056】
好ましい一実施形態は、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第１の抗原結合部位は、図１１Ａに示されるＭＦ３９９８のＣＤＲ３配列、または図１１Ａに示されるＭＦ３９９８のＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは１つ以下のアミノ酸が異なるＣＤＲ３配列を少なくとも含み、第２の抗原結合部位は、ＭＦ３１７８のＣＤＲ３配列、またはＭＦ３１７８のＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは１つ以下のアミノ酸が異なるＣＤＲ３配列を少なくとも含む。
【0057】
本発明は、一実施形態では、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第１の抗原結合部位は、ＭＦ３９９８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、またはＭＦ３９５８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは多くて１つのアミノ酸が異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を少なくとも含み、第２の抗原結合部位は、ＭＦ３１７８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、またはＭＦ３１７８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列と、多くて３つ、好ましくは多くて２つ、好ましくは多くて１つのアミノ酸が異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を少なくとも含む。
【0058】
本発明は、一実施形態では、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第１の抗原結合部位は、ＭＦ３９９８のＣＤＲ３配列を少なくとも含み、第２の抗原結合部位は、ＭＦ３１７８のＣＤＲ３配列を少なくとも含む。
【0059】
本発明は、一実施形態では、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第１の抗原結合部位は、ＭＦ３９９８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を少なくとも含み、第２の抗原結合部位は、ＭＦ３１７８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を少なくとも含む。
【0060】
本発明は、一実施形態では、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第１の抗原結合部位は、ＭＦ４２８０のＣＤＲ３配列を少なくとも含み、第２の抗原結合部位は、ＭＦ３１７８のＣＤＲ３配列を少なくとも含む。
【0061】
本発明は、一実施形態では、ＥｒｂＢ−２に結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第１の抗原結合部位は、ＭＦ４２８０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を少なくとも含み、第２の抗原結合部位は、ＭＦ３１７８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を少なくとも含む。
【0062】
ＣＤＲ配列は、好ましくは、抗体の結合効力または安定性を改善するために、例えば、最適化目的のために変化させられる。最適化は、例えば変異誘発手順によって実施され、その後、得られた抗体の安定性および／または結合親和性が好ましくは試験され、改善されたＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ３特異的ＣＤＲ配列が好ましくは選択される。当業者は、本発明に従う少なくとも１つの変更されたＣＤＲ配列を含む抗体バリアントを作製することが十分に可能である。例えば、保存的アミノ酸置換が適用される。保存的アミノ酸置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの１つの疎水性残基の、別の疎水性残基への置換、および１つの極性残基の別の極性残基への置換、例えば、アルギニンのリジンへの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸への置換、またはグルタミンのアスパラギンへの置換が含まれる。
【0063】
本発明は、一実施形態では、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインを含む抗体を提供し、この可変ドメインのＶＨ鎖は、図１１Ａに示されるＶＨ鎖ＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００２；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；ＭＦ３３７０；ＭＦ３７５１；ＭＦ３７５２のアミノ酸配列を含み、または図１１ＡのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０を有する、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１Ａに示されるＶＨ鎖ＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００２；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；ＭＦ３３７０；ＭＦ３７５１；ＭＦ３７５２のアミノ酸配列を含む。この抗体は、好ましくは、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインを含み、この可変ドメインのＶＨ鎖は、図１１Ａに示されるＶＨ鎖ＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；もしくはＭＦ３３７０のアミノ酸配列を含み、または図１１ＡのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１Ａに示されるＶＨ鎖ＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；もしくはＭＦ３３７０のアミノ酸配列を含む。ＥＧＦＲに結合する可変ドメインを含む抗体は、好ましくは、ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインをさらに含む。ＥＧＦＲに結合する可変ドメインを含む抗体は、好ましくは、ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインを好ましくはさらに含む二重特異性抗体である。Ｅｒｂ−Ｂ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、好ましくは、図１１Ｂに示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３３０７、ＭＦ６０５５〜ＭＦ６０７４、好ましくはＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１もしくはＭＦ６０６５のアミノ酸配列を含み、または図１１ＢのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０を有する、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１Ｂに示されるＶＨ ＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３３０７、ＭＦ６０５５〜ＭＦ６０７４、好ましくはＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１もしくはＭＦ６０６５のアミノ酸配列を含む。Ｅｒｂ−Ｂ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、好ましくは、ＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６もしくはＭＦ３１６３のアミノ酸配列を含み、または図１１ＡのそれぞれのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０を有する、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１Ｂに示されるＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６もしくはＭＦ３１６３のアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、ＭＦ３１７８のアミノ酸配列を含み、またはこのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０を有する、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１Ｂに示されるＭＦ３１７８のアミノ酸配列を含む。
【0064】
好ましくは、本明細書で特定されるようなＶＨまたはＶＬ中の上述のアミノ酸の挿入、欠失および置換は、ＣＤＲ３領域中には存在しない。上述のアミノ酸の挿入、欠失および置換は、好ましくは、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域中にも存在しない。上述のアミノ酸の挿入、欠失および置換は、好ましくは、ＦＲ４領域中にも存在しない。
【0065】
本発明は、ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインを含む抗体をさらに提供し、この可変領域のＶＨ鎖は、図１１Ｂに示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３もしくはＭＦ３３０７のアミノ酸配列を含み、または図１１ＢのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０を有する、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１Ｂに示されるＶＨ ＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３；ＭＦ３３０７；ＭＦ６０５５〜ＭＦ６０７４、好ましくはＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１もしくはＭＦ６０６５のアミノ酸配列を含む。ＥｒｂＢ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、好ましくは、ＶＨ鎖ＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６もしくはＭＦ３１６３のアミノ酸配列を含み、または図１１ＢのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０を有する、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１Ｂに示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６もしくはＭＦ３１６３のアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、図１１Ｂに示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列を含み、またはこのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０を有する、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１Ｂに示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列を含む。抗体は、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインを好ましくはさらに含む。ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、好ましくは、図１１ＡのＶＨ鎖のアミノ酸配列を含む。
【0066】
本発明に従う抗体がさらに提供され、この抗体は、図１１Ａに示されるＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００２；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；ＭＦ３３７０；ＭＦ３７５１；ＭＦ３７５２の重鎖可変領域配列からなる群から選択されるＥＧＦＲ特異的重鎖可変領域配列を含み、またはこの抗体は、図１１Ａに示されるＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００２；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；ＭＦ３３７０；ＭＦ３７５１；ＭＦ３７５２の重鎖可変領域配列と、多くて１５アミノ酸が異なる、重鎖可変領域配列を含む。
【0067】
本発明に従う抗体がさらに提供され、この抗体は、図１１Ｂに示されるＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ３３０７、ＭＦ６０５５〜ＭＦ６０７４、好ましくはＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１もしくはＭＦ６０６５の重鎖可変領域配列からなる群から選択されるＥｒｂＢ−３特異的重鎖可変領域配列を含み、またはこの抗体は、ＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ３３０７、ＭＦ６０５５〜ＭＦ６０７４、好ましくはＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１６３、ＭＦ６０５８、ＭＦ６０６１もしくはＭＦ６０６５の重鎖可変領域配列と、多くて１５アミノ酸が異なる、重鎖可変領域配列を含む。
【0068】
本発明は、各々がＥＧＦＲに結合する２つの可変ドメインを含む抗体をさらに提供し、これらの可変ドメインのＶＨは、図１１Ａに示されるＶＨ鎖ＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００２；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；ＭＦ３３７０；ＭＦ３７５１；ＭＦ３７５２のアミノ酸配列を含み、または図１１Ａに示されるＶＨ鎖ＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００２；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；ＭＦ３３７０；ＭＦ３７５１；ＭＦ３７５２のアミノ酸配列を含み、このＶＨ鎖は、図１１ＡのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する。このＶＨは、好ましくは、図１１Ａに示されるＶＨ鎖ＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；もしくはＭＦ３３７０のアミノ酸配列、または図１１ＡのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１Ａに示されるＶＨ鎖ＭＦ３９９８；ＭＦ４２８０；ＭＦ４００３；ＭＦ４０１０；ＭＦ４２８９；もしくはＭＦ３３７０のアミノ酸配列を含む。抗体のこれらの可変ドメインは、好ましくは、図１１Ａに示される配列を好ましくは有する、同一のＶＨ鎖を含む。同一のＶＨ鎖を有する可変ドメインを有する抗体は、二重特異性抗体ではない。これらのＶＨ鎖は、図１１に示されるのと同じＶＨ鎖配列、または図１１ＡのＶＨ鎖配列に関して、１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを別にして同じＶＨ鎖配列を含む場合、本発明にとって同一である。
【0069】
本発明は、各々がＥｒｂＢ３に結合する２つの可変ドメインを含む抗体をさらに提供し、これらの可変ドメインのＶＨは、図１１Ｂに示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３もしくはＭＦ３３０７のアミノ酸配列を含み、または図１１ＢのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０を有する、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１Ｂに示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８；ＭＦ３１７６；ＭＦ３１６３もしくはＭＦ３３０７のアミノ酸配列を含む。このＶＨは、好ましくは、ＶＨ鎖ＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６もしくはＭＦ３１６３のアミノ酸配列を含み、または図１１ＢのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０を有する、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１Ｂに示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６もしくはＭＦ３１６３のアミノ酸配列を含む。このＶＨは、好ましくは、ＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列を含み、または図１１ＢのＶＨ鎖配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０を有する、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１Ｂに示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列を含む。抗体のこれらの可変ドメインは、好ましくは、図１１Ｂに示される配列を好ましくは有する、同一のＶＨ鎖を含む。同一のＶＨ鎖を有する可変ドメインを有する抗体は、二重特異性抗体ではない。これらのＶＨ鎖は、図１１Ｂに示されるのと同じＶＨ鎖配列、または図１１ＢのＶＨ鎖配列に関して、１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを別にして同じＶＨ鎖配列を含む場合、同一である。
【0070】
本発明は、好ましくは、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインおよびＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインを含む抗体を提供し、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、
− 図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ３９９８のアミノ酸配列、または
− このＶＨに関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ３９９８のアミノ酸配列
を含み、
ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、
− 図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列、または
− このＶＨに関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列
を含む。
【0071】
本発明は、好ましくは、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインおよびＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインを含む抗体を提供し、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、
− 図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ４２８０のアミノ酸配列、または
− このＶＨに関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ４２８０のアミノ酸配列
を含み、
ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、
− 図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列、または
− このＶＨに関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列
を含む。
【0072】
本発明は、好ましくは、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインおよびＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインを含む抗体を提供し、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、
− 図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ４００３のアミノ酸配列、または
− このＶＨに関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ４００３のアミノ酸配列
を含み、
ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、
− 図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列、または
− このＶＨに関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列
を含む。
【0073】
本発明は、好ましくは、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインおよびＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインを含む抗体を提供し、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、
− 図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ４０１０のアミノ酸配列、または
− このＶＨに関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ４０１０のアミノ酸配列
を含み、
ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、
− 図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列、または
− このＶＨに関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列
を含む。
【0074】
本発明は、好ましくは、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインおよびＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインを含む抗体を提供し、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、
− 図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ４２８９のアミノ酸配列、または
− このＶＨに関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ４２８９のアミノ酸配列
を含み、
ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、
− 図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列、または
− このＶＨに関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列
を含む。
【0075】
本発明は、好ましくは、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインおよびＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインを含む抗体を提供し、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、
− 図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ３３７０のアミノ酸配列、または
− このＶＨに関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ３３７０のアミノ酸配列
を含み、
ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖は、
− 図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ３１６３のアミノ酸配列、または
− このＶＨに関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１に示されるＶＨ鎖ＭＦ３１６３のアミノ酸配列
を含む。この抗体は、ヒトＥＧＦＲおよびマウスＥＧＦＲに結合し、マウスにおいて標的効果を研究するために使用され得る。
【0076】
図１１中の配列と比較した場合、ＶＨ鎖の挙動は、典型的には、このＶＨ鎖が、図１１に示されるＶＨ鎖のアミノ酸配列に関して、１５アミノ酸超の変化を有する場合、顕著に異なり始める。図１１に示されるＶＨ鎖に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせを有するＶＨ鎖は、図１１に示されるＶＨ鎖に関して、１、２、３、４または５アミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせ、図１１に示されるＶＨ鎖に関して、好ましくは１、２、３または４の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせ、好ましくは１、２または３の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせ、より好ましくは１または２の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせ、好ましくは１の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせを、好ましくは有する。１または複数のアミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせは、好ましくは、ＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域中には存在しない。これらは、好ましくは、ＦＲ４領域中にも存在しない。アミノ酸置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。
【0077】
好ましい一実施形態では、本発明は、図１１Ｄに示されるアミノ酸配列、または図１１Ｄの配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する図１１Ｄのアミノ酸配列を含む重鎖を有する抗体を提供する。好ましい一実施形態では、この抗体は、図１１Ｄに示されるアミノ酸配列、または図１１Ｄの配列に関して、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する図１１Ｄのアミノ酸配列を各々が含む、２つの重鎖を有する。この、多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、好ましくは１、２、３ ４もしくは５アミノ酸の置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせは、好ましくは、ＶＨ鎖のＣＤＲ３領域中には存在せず、好ましくは、ＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域中には存在せず、好ましくは、ＦＲ４領域中には存在しない。
【0078】
ヒト背景において非ヒト残基の含量を最小化することに向け、合理的方法が進化している。種々の方法が、抗体の抗原結合特性を別の抗体に首尾よく移植するために利用可能である。抗体の結合特性は、圧倒的に、ＣＤＲ３領域の配列そのものにあり、これは、全体としての可変ドメインの適切な構造と組み合わせた、可変ドメイン中のＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域の配列によってしばしば支持される。種々の方法が、ＣＤＲ領域を別の抗体の適切な可変ドメインに移植するために、現在利用可能である。これらの方法の一部は、本明細書に参照により含まれる、Ｊ．Ｃ．Ａｌｍａｇｒｏ１およびＪ．Ｆｒａｎｓｓｏｎ（２００８）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １３、１６１９〜１６３３において概説されている。従って、本発明は、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含むヒトまたはヒト化二重特異性抗体をさらに提供し、ＥＧＦＲ結合部位を含む可変ドメインは、図１１Ａに示されるＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、ＥｒｂＢ−３結合部位を含む可変ドメインは、図１１Ｂに示されるＶＨ ＣＤＲ３領域を含む。ＥＧＦＲ結合部位を含むＶＨ可変領域は、好ましくは、図１１Ａ中のＶＨ鎖のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域の配列を含む。ＥｒｂＢ−３結合部位を含むＶＨ可変領域は、好ましくは、図１１Ｂ中のＶＨ鎖のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域の配列を含む。ＣＤＲ移植は、図１１のＶＨのＣＤＲ領域を有するが、異なるフレームワークを有する、ＶＨ鎖を産生するためにも使用され得る。この異なるフレームワークは、別のヒトＶＨまたは異なる哺乳動物のものであり得る。
【0079】
上述の多くて１５、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、好ましくは１、２、３、４もしくは５アミノ酸の置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせは、好ましくは、ＶＨ鎖のＣＤＲ３領域中には存在せず、好ましくは、ＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３領域中には存在せず、好ましくは、ＦＲ４領域中には存在しない。
【0080】
図１１に示される可変重鎖配列を含む可変ドメインの軽鎖は、好ましくは、Ｏ１２の、もしくはＯ１２に基づいた生殖系列軽鎖、好ましくは、再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１またはその断片もしくは機能的誘導体である（ｉｍｇｔ．ｏｒｇにおけるＩＭＧＴデータベース・ワールドワイド・ウェブに従う命名法）。再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１、ＩＧＫＶ１−３９／ＩＧＫＪ１、ｈｕＶκ１−３９軽鎖または短くｈｕＶκ１−３９の用語が使用される。この軽鎖は、１、２、３、４または５アミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせを有し得る。上述の１、２、３、４または５アミノ酸の置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換であり、挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせは、好ましくは、ＶＬ鎖のＣＤＲ３領域中には存在せず、好ましくは、ＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３領域またはＦＲ４領域中には存在しない。
【0081】
種々の方法が、二重特異性抗体を産生するために利用可能である。１つの方法には、細胞における２つの異なる重鎖および２つの異なる軽鎖の発現、ならびに細胞によって産生される抗体を収集することを伴う。この方法で産生された抗体は、典型的には、重鎖および軽鎖の異なる組み合わせを有する一群の抗体を含み、その一部は、所望の二重特異性抗体である。この二重特異性抗体は、引き続いて、この一群の抗体から精製され得る。細胞によって産生される他の抗体に対する二重特異性抗体の比率は、種々の方法で増加され得る。本発明の好ましい一実施形態では、この比率は、細胞において、２つの異なる軽鎖を発現させず、２つの本質的に同一の軽鎖を発現させることによって、増加される。この概念は、当技術分野で、「共通の軽鎖」方法とも呼ばれる。本質的に同一な軽鎖が、２つの異なる重鎖と一緒に機能して、異なる抗原結合部位および付随する異なる結合特性を有する可変ドメインの形成を可能にする場合、細胞によって産生される他の抗体に対する二重特異性抗体の比率は、２つの異なる軽鎖の発現よりも顕著に改善される。細胞によって産生される二重特異性抗体の比率は、２つの同一の重鎖のペアリングよりも、２つの異なる重鎖の互いとのペアリングを刺激することによって、さらに改善され得る。当技術分野は、重鎖のかかるヘテロ二量体化が達成され得る種々の方法を記載している。１つの方法は、「ノブ・イントゥー・ホール」二重特異性抗体を作製することである。米国特許出願公開第２００３００７８３８５号（Ａｒａｔｈｏｏｎら、−Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を参照のこと。別の方法は、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ（ＪＢＣ ２０１０、第２８５巻、１９６３７〜１９６４６頁）に記載されるような荷電操作を使用することによるものである。別のおよび好ましい方法は、参照によって本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６１／６３５，９３５号とそれに続く米国特許出願第１３／８６６，７４７およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＮＬ２０１３／０５０２９４（ＷＯ２０１３／１５７９５４Ａ１）に記載されている。（単一細胞から）二重特異性抗体を産生するための方法および手段は、開示されており、それによって、単一特異性抗体の形成よりも、二重特異性抗体の形成が優先される手段が提供される。これらの方法は、本発明においても好ましく使用され得る。従って、本発明は、（単一細胞から）本発明に従う二重特異性抗体を産生するための方法を提供し、この二重特異性抗体は、接触面を形成することが可能な２つのＣＨ３ドメインを含み、この方法は、この細胞中に、ａ）第１のＣＨ３ドメイン含有重鎖をコードする第１の核酸分子、ｂ）第２のＣＨ３ドメイン含有重鎖をコードする第２の核酸分子を用意することを含み、これらの核酸分子には、第１および第２のＣＨ３ドメイン含有重鎖の優先的ペアリングのための手段が提供され、この方法は、宿主細胞を培養するステップ、およびこれら２つの核酸分子の発現を可能にするステップ、および培養物から二重特異性抗体を回収するステップをさらに含む。この第１および第２の核酸分子は、同じ核酸分子、ベクターまたは遺伝子送達ビヒクルの一部であり得、宿主細胞のゲノムの同じ部位において組み込まれ得る。あるいは、この第１および第２の核酸分子は、上記細胞に別々に提供される。
【0082】
好ましい一実施形態は、単一細胞から本発明に従う二重特異性抗体を産生するための方法を提供し、この二重特異性抗体は、接触面を形成することが可能な２つのＣＨ３ドメインを含み、この方法は、− ａ）ＥＧＦＲに結合し、第１のＣＨ３ドメインを含む抗原結合部位を含む重鎖をコードする第１の核酸分子、およびｂ）ＥｒｂＢ−３に結合し、第２のＣＨ３ドメインを含む抗原結合部位を含む重鎖をコードする第２の核酸分子を有する細胞を用意することを含み、これらの核酸分子には、これら第１および第２のＣＨ３ドメインの優先的ペアリングのための手段が提供され、
この方法は、上記細胞を培養するステップ、およびこれら２つの核酸分子によってコードされるタンパク質の発現を可能にするステップ、および培養物から二重特異性ＩｇＧ抗体を回収するステップをさらに含む。特に好ましい一実施形態では、この細胞は、共通の軽鎖をコードする第３の核酸分子もまた有する。この第１、第２および第３の核酸分子は、同じ核酸分子、ベクターまたは遺伝子送達ビヒクルの一部であり得、宿主細胞のゲノムの同じ部位において組み込まれ得る。あるいは、この第１、第２および第３の核酸分子は、上記細胞に別々に提供される。好ましい共通の軽鎖は、上記のように、Ｏ１２に基づき、好ましくは、再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖ＩｇＶκ１ ３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１である。この第１および第２のＣＨ３ドメインの優先的ペアリングのための手段は、好ましくは、重鎖コード領域のＣＨ３ドメイン中の、対応する変異である。本質的に二重特異性抗体のみを産生するための好ましい変異は、第１のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸置換Ｌ３５１ＫおよびＴ３６６Ｋ（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、ならびに第２のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸置換Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅであり、または逆もまた然りである。従って、二重特異性抗体を産生するための本発明に従う方法がさらに提供され、上記第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｌ３５１ＫおよびＴ３６６Ｋ（Ｋａｂａｔに従う番号付け）を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを含み、この方法は、上記細胞を培養するステップ、およびこれらの核酸分子によってコードされるタンパク質の発現を可能にするステップ、および培養物から二重特異性抗体を回収するステップをさらに含む。二重特異性抗体を産生するための本発明に従う方法もまた提供され、上記第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅ（Ｋａｂａｔに従う番号付け）を含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｌ３５１ＫおよびＴ３６６Ｋを含み、この方法は、上記細胞を培養するステップ、およびこれらの核酸分子の発現を可能にするステップ、および培養物から二重特異性抗体を回収するステップをさらに含む。これらの方法によって産生され得る抗体もまた、本発明の一部である。これらのＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインは、好ましくは、ＩｇＧ１ヘテロ二量体化ドメインである。これらのＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインを含む重鎖定常領域は、好ましくは、ＩｇＧ１定常領域である。
【0083】
一実施形態では、本発明は、本発明に従う抗体重鎖可変領域をコードする核酸分子を提供する。核酸分子（典型的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏの、単離されたまたは組換え核酸分子）は、好ましくは、図１１Ａもしくは図１１Ｂに示される重鎖可変領域、または１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図１１Ａもしくは図１１Ｂに示される重鎖可変領域をコードする。好ましい一実施形態では、この核酸分子は、図１１に示される配列を含む。別の好ましい一実施形態では、この核酸分子は、図１１に示される核酸と同じアミノ酸配列をコードするが、１または複数の異なるコドンをコードするので、異なる配列を有する。本発明は、図１１Ｄの重鎖をコードする核酸配列をさらに提供する。
【0084】
本発明で使用される核酸分子は、排他的ではないが典型的には、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。代替的な核酸は、当業者に入手可能である。本発明に従う核酸は、例えば、細胞中に含まれる。この核酸が細胞において発現される場合、この細胞は、本発明に従う抗体を産生することができる。従って、本発明は、一実施形態では、本発明に従う抗体および／または本発明に従う核酸を含む細胞を提供する。この細胞は、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは霊長類細胞、最も好ましくはヒト細胞である。本発明の目的のために、適切な細胞は、本発明に従う抗体および／または本発明に従う核酸を含むことが可能な、好ましくはそれを産生することが可能な、任意の細胞である。
【0085】
本発明は、本発明に従う抗体を含む細胞をさらに提供する。好ましくは、この細胞（典型的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏの、単離されたまたは組換え細胞）は、この抗体を産生する。好ましい一実施形態では、この細胞は、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞またはＰＥＲ−Ｃ６（商標）細胞である。特に好ましい一実施形態では、この細胞は、ＣＨＯ細胞である。本発明に従う細胞を含む細胞培養物がさらに提供される。種々の機関および会社が、例えば臨床使用のために、抗体の大規模産生のための細胞株を開発している。かかる細胞株の非限定的な例は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞またはＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞である。これらの細胞は、タンパク質の産生などの他の目的のためにも使用される。タンパク質および抗体の産業規模産生のために開発された細胞株は、本明細書で、産業的細胞株とさらに呼ばれる。従って、好ましい一実施形態では、本発明は、本発明の抗体の産生に、抗体の大規模産生のために開発された細胞株の使用を提供する。本発明は、図１１に示されるＶＨ、ＶＬおよび／または重鎖をコードする核酸分子を含む、抗体を産生するための細胞をさらに提供する。好ましくは、この核酸分子は、図１１ａまたは１１ｂに示される配列を含む。
【0086】
本発明は、本発明の細胞を培養すること、およびこの培養物から抗体を回収することを含む、抗体の生産方法をさらに提供する。好ましくは、この細胞は、無血清培地中で培養される。好ましくは、この細胞は、浮遊成長（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｇｒｏｗｔｈ）に適応される。本発明に従う抗体の生産方法によって得ることができる抗体が、さらに提供される。この抗体は、好ましくは、培養の培地から精製される。好ましくは、この抗体は、アフィニティ精製される。
【0087】
本発明の細胞は、例えば、ハイブリドーマ細胞株、ＣＨＯ細胞、２９３Ｆ細胞、ＮＳ０細胞、または臨床目的のための抗体産生についてのその適切性が既知の別の細胞型である。特に好ましい一実施形態では、この細胞は、ヒト細胞である。好ましくは、アデノウイルスＥ１領域またはその機能的等価物によって形質転換された細胞。かかる細胞株の好ましい例は、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞株またはその等価物である。特に好ましい一実施形態では、この細胞は、ＣＨＯ細胞またはそのバリアントである。好ましくは、抗体の発現のためにグルタミン・シンテターゼ（ＧＳ）ベクター系を使用するバリアント。
【0088】
本発明は、本発明に従う抗体を含む、医薬組成物をさらに提供する。この医薬組成物は、好ましくは医薬的に許容される賦形剤または担体を好ましくは含む。好ましい一実施形態では、この医薬組成物は、５〜５０ｍＭのヒスチジン、１００〜３００ｍＭのトレハロース、０．１〜０３ｇ／Ｌのポリソルベート２０またはそれらの組み合わせを含む。ｐＨは、好ましくは、ｐＨ＝５．５〜６．５に設定される。好ましい一実施形態では、この医薬組成物は、２５ｍＭのヒスチジン、２２０ｍＭのトレハロース、０．２ｇ／Ｌのポリソルベート２０またはそれらの組み合わせを含む。ｐＨは、好ましくはｐＨ＝５．５〜６．５、最も好ましくはｐＨ＝６に設定される。
【0089】
本発明の抗体は、好ましくは、標識、好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏ画像化のための標識をさらに含む。かかる標識は、典型的には、治療的適用には必要でない。例えば診断設定では、例えば、身体中の標的細胞を可視化する際に、標識は有用であり得る。種々の標識が適しており、多くが当技術分野で周知である。好ましい一実施形態では、この標識は、検出のための放射活性標識である。別の好ましい一実施形態では、この標識は、赤外標識である。好ましくは、この赤外標識は、ｉｎ ｖｉｖｏ画像化に適している。種々の赤外標識が、当業者に入手可能である。好ましい赤外標識は、例えば、ＩＲＤｙｅ ８００；ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤ；ＩＲＤｙｅ ６８０ＬＴ；ＩＲＤｙｅ ７５０；ＩＲＤｙｅ ７００ＤＸ；ＩＲＤｙｅ ８００ＲＳ ＩＲＤｙｅ ６５０；ＩＲＤｙｅ ７００ホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）；ＩＲＤｙｅ ８００ホスホロアミダイト（ＬＩ−ＣＯＲ ＵＳＡ；４６４７ Ｓｕｐｅｒｉｏｒ Ｓｔｒｅｅｔ；Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｎｅｂｒａｓｋａ）である。
【0090】
本発明は、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３もしくはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、またはこの腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法であって、本発明に従う抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む方法をさらに提供する。この処置の開始前に、この方法は、好ましくは、対象が、かかるＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３もしくはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有するかどうか、またはそのリスクがあるかどうかを決定するステップを含む。本発明は、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３もしくはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する、または有するリスクがある対象の処置における使用のための、本発明の抗体または医薬組成物をさらに提供する。
【0091】
腫瘍がＥＧＦＲについて陽性であるかどうかを確立するために、当業者は、例えば、ＥＧＦＲ増幅および／または免疫組織化学染色を決定できる。生検中の少なくとも１０％の腫瘍細胞が、陽性であるべきである。生検はまた、２０％、３０％ ４０％ ５０％ ６０％ ７０％またはそれ超の陽性細胞を含み得る。腫瘍がＨＥＲ３について陽性であるかどうかを確立するために、当業者は、例えば、ＨＥＲ３増幅および／または免疫組織化学における染色を決定できる。生検中の少なくとも１０％の腫瘍細胞が、陽性であるべきである。生検はまた、２０％、３０％ ４０％ ５０％ ６０％ ７０％またはそれ超の陽性細胞を含み得る。
【0092】
この腫瘍は、好ましくは、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性癌である。好ましくは、この陽性癌は、乳癌、例えば、早期乳癌である。しかし、本発明は、広範なＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性癌、例えば、乳癌、結腸癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、大腸癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、膀胱癌などに適用され得る。この対象は、好ましくはヒト対象である。この対象は、好ましくは、セツキシマブなどのＥＧＦＲ特異的抗体を使用した抗体治療に適格な対象である。好ましい一実施形態では、この対象は、腫瘍、好ましくはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性癌、好ましくはＥＧＦＲモノクローナル抗体耐性表現型を有する腫瘍／癌を含む。
【0093】
患者に投与される本発明に従う抗体の量は、典型的には、治療濃度域中にあり、これは、治療効果を得るために十分な量が使用されるが、その量は、許容できない程度の副作用をもたらす閾値を超えないことを意味する。所望の治療効果を得るために必要とされる抗体の量が低くなるほど、治療濃度域は典型的には大きくなる。従って、低い投薬量で十分な治療効果を発揮する本発明に従う抗体が好ましい。この投薬量は、セツキシマブの投薬レジームの範囲中にあり得る。この投薬量は、より低くてもよい。
【0094】
本発明に従う二重特異性抗体は、好ましくは、他の点では類似の過程の条件下のセツキシマブと比較して、より少ない皮膚毒性を誘導する。本発明に従う二重特異性抗体は、好ましくは、他の点では類似の過程の条件下のセツキシマブと比較して、より少ない炎症促進性ケモカイン、好ましくはＣＸＣＬ１４を産生する。本発明に従う二重特異性抗体は、好ましくは、他の点では類似の過程の条件下のセツキシマブと比較して、抗菌ＲＮＡｓｅｓ、好ましくはＲｎａｓｅ７のより少ない障害を誘導する。
【0095】
本発明は、とりわけ、ＥＧＦＲ受容体およびＥｒｂＢ−３受容体を標的化し、癌細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏでの強力な増殖阻害およびｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長阻害を生じる抗体を記載する。ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ−３のいずれかに特異的なヒトおよびＦａｂ結合アームの多様なパネルが同定された。これらは、重鎖のヘテロ二量体化を駆動するＣＨ３領域中の変異を含む相補的発現ベクター中にそれらをクローニングすることによって、二重特異性抗体として産生された。多くの二重特異性抗体を、小規模で産生し、癌細胞株に対する結合アッセイおよび機能的アッセイにおいて試験した。種々の二重特異性抗体を選択し、ＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞株を使用する同所性異種移植モデルにおいて試験した。この細胞株は、ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３受容体の両方を発現し、成長についてＥＧＦＲリガンドおよびＥｒｂＢ−３リガンドの存在に部分的に依存する。ＢｘＰＣ３モデルは、堅固でストリンジェントなスクリーニング・モデルである。本発明の抗体、特に本発明の二重特異性抗体は、低い毒性プロファイルを高い効力と組み合わせることができる。本発明の抗体は、種々の型および系統のＥＧＦＲ標的化治療において有用であり得る。本発明の抗体は、両方のアームで同じ抗原（複数可）に結合する抗体と比較した場合、増加した治療濃度域を有し得る。本発明の二重特異性抗体は、ＭＥＨＤ７９４５Ａ抗体と比較した場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはそれらの組み合わせで、より良い成長阻害効果を示し得る。
【0096】
本発明の好ましい実施形態は、ヘレグリン・ストレス条件下での、本発明に従う抗体の使用を提供する。ヘレグリンは、ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞の成長に関与する増殖因子である。典型的には、腫瘍細胞が高レベルのヘレグリン（ヘレグリン・ストレスと呼ばれる）を発現する場合、トラスツズマブ、ペルツズマブおよびラパチニブなどの現在公知の治療は、腫瘍成長を阻害することがもはや可能ではない。この現象は、ヘレグリン耐性と呼ばれる。しかし、驚くべきことに、本発明に従う抗体は、高レベルのヘレグリンを発現する腫瘍細胞の成長に対抗することも可能である。本明細書で使用する場合、ヘレグリンの発現レベルは、細胞が、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有する場合、高いとみなされる。ヘレグリン発現レベルは、例えば、腫瘍ＲＮＡを用いたｑＰＣＲを使用して（例えば、Ｓｈａｍｅｓら、ＰＬＯＳ ＯＮＥ、２０１３年２月、第８巻、第２号、１〜１０頁およびＹｏｎｅｓａｋａら、Ｓｃｉ．ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、第３巻、第９９号（２０１１）；１〜１１頁などに記載されている）、または血液、血漿もしくは血清サンプルを好ましくは使用する、例えばＥＬＩＳＡなどのタンパク質検出方法を使用して（例えば、Ｙｏｎｅｓａｋａら、Ｓｃｉ．ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、第３巻、第９９号（２０１１）；１〜１１頁などに記載されている）、測定される。
【0097】
ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する対象における転移の形成に対抗するための方法もまた提供され、このＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有し、この方法は、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を、対象に投与することを含む。ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３もしくはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞の接着斑の処置もしくは予防における使用のため、または転移の形成の処置もしくは予防における使用のための、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体もまた提供され、このＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有する。ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３もしくはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞の接着斑の処置もしくは予防のための、または転移の形成の処置もしくは予防のための医薬の調製のための、本発明に従う二重特異性抗体の使用がさらに提供され、このＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有する。このＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍は、好ましくは、乳癌、結腸癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、大腸癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、膀胱癌などである。最も好ましくは、この腫瘍は、乳癌である。従って、乳癌、結腸癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、膀胱癌など、好ましくは乳癌の細胞の接着斑のまたは転移の形成の処置または予防における使用のための、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む本発明に従う二重特異性抗体がさらに提供され、この細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有する。本発明に従う抗体は、典型的には、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３陽性細胞上のＥｒｂＢ３のリガンド誘導性受容体機能、好ましくはリガンド誘導性成長を低減することが可能である。本発明に従う抗体は、好ましくは、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する抗原結合部位を含む。ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対するＥｒｂＢ−３抗原結合部位の親和性（ＫＤ）は、好ましくは２．０ｎＭ以下、より好ましくは１．３９ｎＭ以下、より好ましくは０．９９ｎＭ以下である。
【0098】
好ましい一実施形態では、本発明に従う抗体は、好ましくは、Ｒ４２６およびネイティブＥｒｂＢ−３タンパク質中のＲ４２６から１１．２オングストローム以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩの少なくとも１つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。
【0099】
好ましい一実施形態は、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍の処置のための医薬の調製のための本発明に従う抗体の使用を提供し、この腫瘍の細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有する。このＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍は、好ましくは、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌または黒色腫である。最も好ましくは、この腫瘍は、乳癌である。従って、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌もしくは黒色腫、好ましくは乳癌を有する、または有するリスクがある対象の処置における使用のための、本発明に従う抗体がさらに提供され、この癌の細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有する。
【0100】
高いヘレグリン・レベルは、典型的には、転移の形成（即ち、腫瘍細胞または腫瘍開始細胞の遊走、浸潤、成長および／または分化）の間に存在する。典型的には、腫瘍開始細胞は、ＣＤ４４などの幹細胞マーカーに基づいて同定される。従って、これらのプロセスが、トラスツズマブおよびペルツズマブなどの現在公知の治療によっては、ほとんど対抗されない。本発明に従う抗体は、高レベルのヘレグリンを発現する腫瘍細胞または腫瘍開始細胞の成長および／または分化に対抗することが可能であるので、本発明に従うかかる抗体は、転移の形成に対抗するのにも特に適切である。従って、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する対象における転移の形成に対抗するための方法が、さらに提供され、このＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有し、この方法は、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を対象に投与することを含む。転移の形成の処置または予防における使用のための、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体もまた提供され、このＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有する。転移の形成の処置または予防のための医薬の調製のための、本発明に従う二重特異性抗体の使用がさらに提供され、このＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有する。このＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３またはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍は、好ましくは、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌または黒色腫である。最も好ましくは、この腫瘍は、乳癌である。従って、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌または黒色腫の細胞、好ましくは乳癌細胞の転移の形成の処置または予防における使用のための、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３に結合する第２の抗原結合部位を含む、本発明に従う二重特異性抗体がさらに提供され、これらの細胞は、ＢＸＰＣ３またはＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％または９５％であるヘレグリン発現レベルを有する。本発明に従う抗体は、典型的には、ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ−３陽性細胞上のＥｒｂＢ−３のリガンド誘導性受容体機能、好ましくはリガンド誘導性成長を低減することが可能である。本発明に従う抗体は、好ましくは、ＥＧＦＲのドメインＩに結合する第１の抗原結合部位およびＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する第２の抗原結合部位を含む。ＥｒｂＢ−３陽性細胞に対する第２の抗原結合部位の親和性は、好ましくは２．０ｎＭ以下、より好ましくは１．３９ｎＭ以下、より好ましくは０．９９ｎＭ以下である。
【0101】
一実施形態では、この二重特異性抗体は、本明細書で上により詳細に説明されるように、ヘレグリン・ストレス条件下での対象の処置における使用のためのものである。
【0102】
本発明の抗体は、懸濁（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）２９３Ｆ細胞における一過的トランスフェクション後に、＞５０ｍｇ／Ｌの水準で産生され得る。これらの二重特異性抗体は、７０％超の収率で、９８％よりも高い純度に精製され得る。分析的特徴付け研究は、二価単一特異性ｌｇＧ１と匹敵する、二重特異性ｌｇＧｌ抗体プロファイルを示している。機能的活性に関して、本発明の二重特異性抗体は、ＭＥＨＤ７９４５Ａと比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで優れた強度（ｐｏｔｅｎｃｙ）を実証できる。
【0103】
明確さおよび簡潔な記述を目的として、特徴は、同じまたは別々の実施形態の一部として本明細書に記載されるが、本発明の範囲は、記載された特徴の全てまたは一部の組み合わせを有する実施形態を含み得ることが理解される。
【0104】
（実施例）細胞株：
ＢｘＰＣ−３−ｌｕｃ２（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２５０５８）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＤＳＭＺ ＡＣＣ１１０）、２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｒ７９０−０７）、Ａ５４９ ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１８５（商標）Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ肺癌腫、ＢｘＰＣ−３ ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１６８７（商標）Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ膵臓腺癌およびＡ４３１細胞ＤＳＭＺ ＡＣＣ ９１を購入し、１０％胎仔熱不活化ウシ血清（ＦＢＳ）を補充した成長培地中で慣用的に維持した。２９３Ｆ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから取得し、２９３ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地中で慣用的に維持した。ＢｘＰｃ−３−ｌｕｃ２（Ｂｉｏｗａｒｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｌｉｇｈｔ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）細胞株は、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ２）で安定にトランスフェクトされたルシフェラーゼ発現細胞株である。この細胞株を、ヒト・ユビキチンＣプロモーターの制御下にルシフェラーゼ２遺伝子を含むレンチウイルス（ｐＧＬ４ ｌｕｃ２）を形質導入することによって確立した。この細胞株は一般にＢｘＰｃ−３−ｌｕｃ２と呼ばれ、これは、ＢｘＰＣ−３ ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１６８７（商標））由来のヒト細胞膵臓腺癌細胞株である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのバイオルミネセンス：およそ３７０光子／秒／細胞。正確な数は、画像化および培養条件に依存して変動する。
【0105】
カニクイザルＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ交換ドメイン構築物をコードするｃＤＮＡのクローニングヒト膜貫通ドメインおよび細胞内尾部に融合させたカニクイザルＥＧＦＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含むキメラ受容体をコードする構築物は、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ（米国特許出願公開第２０１０／０１８３６１５号Ａ１）による公開された特許出願からコピーした。その配列は図１に示される。このｃＤＮＡを、ＧｅｎｅＡｒｔによって合成によって作製し、制限部位ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩを隣接させて、ベクターｐＭＫ−ＲＱ中にクローニングした。このｃＤＮＡを、これら２つの酵素を使用してこのベクターから切り出し、次いで、哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１中にクローニングした。このｃＤＮＡを、完全に配列決定して、これが設計された構築物と一致したことを確認したところ、変異は見出されなかった。
【0106】
エピトープ・マッピングを目的として、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）中の異なるドメイン（Ｌ１、ＣＲ１、Ｌ２およびＣＲ２、ドメインＩ〜ＩＶとも称する：［１］）をＨＥＲ３の対応するドメインに交換した構築物を作製した：図２。次いで、これらを、細胞外ｃＭｙｃ由来エピトープ・タグ、および血小板由来増殖因子受容体の膜貫通領域とイン・フレームで、（抗原陰性）ＣＨＯ細胞における一過的発現のために発現ベクター中にクローニングした。構築物を設計し、ＧｅｎｅＡｒｔにより合成し、引き続いて、Ｓｆｉ１−Ｓａｌ１断片としてｐＤｉｓｐｌａｙ中にクローニングした。全ての構築物を配列決定したところ、正確であることが示され、発現について試験した。ドメインＩ交換バリアント（ＨＥＲ３のドメインＩとＨＥＲ１ドメインＩＩ〜ＩＶ）だけが、トランスフェクトされた細胞の表面上に検出可能な量のタンパク質を生じないことが示された（示さず）。
【0107】
実施例において使用される参考文献番号は、「実施例で引用した参考文献」の見出しのリスト中の参考文献の番号付けを指す。
【0108】
ｒｈＥＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、および抗原を過剰発現するＡ４３１細胞による、ＭｅＭｏの免疫化再編成されたヒトＶＬ、ならびにマウス定常領域遺伝子に作動可能に連結された再編成されていないヒトＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの多様なセットについてトランスジェニックであるマウス（ＭｅＭｏ（登録商標）；ＷＯ２００９／１５７７７１も参照のこと）を、１４日間の間隔で、ＴｉｔｅｒｍａｘＧｏｌｄアジュバント（ＴＭＧ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｔ２６８４）で乳化させたＥＧＦＲ−Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３４４−ＥＲ）で免疫化した。ＭｅＭｏは、抗原への曝露に際して共通の軽鎖（ｃＬＣ）抗体を産生する、即ち：Ｍｅｍｏからの全ての抗体は、本質的に同じ軽鎖を保有するが、それらの重鎖は多様化されている。０日目および１４日目に、マウスに皮下（ｓ．ｃ．）でワクチン接種して、マウスのＴＭＧ誘導性の不快感を最小化した。全ての後の時点では、マウスを、腹腔内（ｉ．ｐ．）経路を介して免疫化して、脾臓において抗原が効率的に取り込まれ提示されることを保証した。３５日目に、抗ＥＧＦＲ血清力価を、ＥＧＦＲ過剰発現性細胞株Ａ４３１を使用してＦＡＣＳによって決定した。３５日目に血清力価＞１／１，０００を生じたマウスは、４２日目に、ＰＢＳ中に溶解させたＥＧＦＲ−Ｆｃタンパク質による最終腹腔内追加免疫を受け、その３日後に脾臓およびリンパ節を収集した。３５日目に低すぎるＥＧＦＲ血清力価を有するマウスは、４９日目にＴＭＧ中のＥＧＦＲ−Ｆｃのさらなる腹腔内追加免疫を受けた。引き続いて、血清力価を、ＥＬＩＳＡによって５６日目に決定した。５６日目に受け入れ基準を上回る血清力価を有していたマウスは、６３日目に、ＰＢＳ中に溶解させたＥＧＦＲ−Ｆｃタンパク質による最終腹腔内追加免疫を受け、その後脾臓およびリンパ節を収集した。マウスに、１２５μｌのＴＭＧまたは２００μｌのＰＢＳ中に溶解させた２０μｇのＥＧＦＲ−Ｆｃタンパク質を注射した。
【0109】
ＥＧＦＲ−Ｆｃで免疫化した２匹のＭｅＭｏマウスは、Ａ４３１細胞による追加免疫も受けた。これは、これらのマウスは、Ｆｃ尾部に主に対して生じたａ−ＥＧＦＲ−Ｆｃ ＩｇＧ血清力価が低かったからである。ＥＧＦＲ応答を特異的に追加免疫するために、これらのマウスを、４９日目に２００μｌのＰＢＳ中の２Ｅ＋６ Ａ４３１細胞の単回腹腔内注射で追加免疫した。
【0110】
ＦＡＣＳにおいて、全長ヒトＥＧＦＲを安定に発現するＣＨＯ細胞およびＥＧＦＲを過剰発現するＡ４３１細胞とのそれらの反応性によって証明されるように、全てのマウスが、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに対する顕著な応答を開始したことが示された。
【0111】
免疫化したマウスからの「免疫」ファージ抗体ライブラリーの作製免疫化後、ＲＮＡを、リンパ組織（リンパ節、脾臓）から抽出し、ＶＨコードｃＤＮＡのポリクローナル・プールを、以前に記載されたように（例えば、欧州２６０４６２５号）、ＶＨファミリー特異的プライマーを使用して増幅した。２匹のマウスの材料を、ライブラリー構築のためにプールした。次いで、得られたＰＣＲ産物を、制限酵素Ｓｆｉ１およびＢｓｔＥＩＩを用いて切断し、本質的に［２］に記載されるように、糸状バクテリオファージ上でのディスプレイのためにバクテリオファージ遺伝子ＩＩＩとイン・フレームでクローニングした。このファージミド・ベクターだけが、Ｖκ１−３９生殖系列ＶＬ遺伝子を既に含んでいた。ファージ・ライブラリーＭＬ１１５５を、最も高いα−ＥＧＦＲ血清力価を有する２匹のマウス（マウスＥ０９４＃１２およびＥ０９４＃１８）から作製した。ライブラリーＭＬ１１５６を、さらなるＡ４３１追加免疫を受けた２匹のマウス（マウスＥ０９４＃１４およびＥ０９４＃１６）から作製した。ライブラリーの特徴を表１に示す。
【0112】
ＥＧＦＲ結合クローンについてのファージ選択ＥＧＦＲのエクト・ドメインの（Ｆｃ−）免疫−融合物（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＰＢＳ中に希釈し（その２倍希釈で５μｇ／ｍｌに）、Ｍａｘｉｓｏｒｐ免疫−プレートのウェルにコートした。次いで、ファージを、記載されたように結合についてパニングした［３］。Ｆｃ反応性クローンの選択を、ファージとコートされた抗原とのインキュベーションの間に（１０μｇの）可溶性ＩｇＧを使用するストリンジェントな対抗選択によって回避した。ＥＧＦＲに対する選択をリガンド結合（Ｌ１）ドメインＩに向けるために、過剰のＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ｖＩＩＩ）免疫−融合物との競合もまた実施した。受容体を阻害することにおいて機能性を有するｃＬＣ抗体を得るために、固定化された抗原に対するファージ選択を、リガンド（ＥＧＦ）または文献からコピーした抗体（マツズマブ、セツキシマブ）のいずれかを使用するエピトープ特異的溶出［４］と組み合わせて実施した。ＥＧＦＲ反応性ファージの溶出もまた、ドメインＩ特異的抗体ＩＣＲ１０（Ａｂｃａｍ、番号ａｂ２３１）およびドメインＩＩ特異的抗体ＥＧＦＲ．１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、番号ＭＳ−３１１）を使用して実施した。Ａ４３１細胞［５］は、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を保有することが示されており［６］、従って高い数のＥＧＦＲを発現するので、これらを、ＥＧＦＲ反応性ファージの選択に使用した。
【0113】
アウトプット・ファージ力価を決定し、アウトプット・ファージ力価が背景を１．５倍上回る全ての選択（抗原コートされていないウェル上での選択）のために、４８の異なるクローンを取り、ファージを、ＥＬＩＳＡにおいてそれぞれの抗原への結合についてスクリーニングした。全てのクローンを、ＥＬＩＳＡにおいてヒトＩｇＧへの結合についても試験して、選択に使用した免疫−融合物のＦｃ部分への結合剤を同定した。高い百分率の陽性クローン（ＥＬＩＳＡにおいてそれぞれの免疫−融合物を認識するが、ＩｇＧ反応性ではないクローンとして規定される）が、コートされた免疫−融合物の全ての選択アウトプット（最大０．６２５μｇ／ｍｌ）において見出された。次いで、ｈＩｇＧに対してではなくＥＧＦＲ−Ｆｃに対して、ファージＥＬＩＳＡにおいて陽性とスコアリングされたクローンを、配列決定し、配列を比較した。配列を、以前に記載されたように（欧州２６０４６２５号）分析し、それらのＶＨ遺伝子セグメント用法および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）配列に基づいてグループ分けした。抗体クラスターを、同じ長さを有し、そのＨＣＤＲ３中に７０％を上回る配列同一性を有するＨＣＤＲ３を有する同じ生殖系列ＶＨセグメントを使用する全ての配列として規定した。合計で１７の抗体クラスターが、免疫化されたＭｅＭｏマウスから同定された。
【0114】
大きい合成ｃＬＣレパートリー（社内で合成した）およびｒｈＥＧＦＲ−Ｆｃに対する選択（上記のとおり）を使用して、多くのＥＧＦＲ特異的クローンが単離され、そのうちの１つだけ（ＭＦ３３７０）が、ＥＧＦ誘導性Ａ４３１細胞死を阻害することができると後に示された。従って、このクローンもまた、より詳細に分析し、引き続くＥＧＦＲ×ＨＥＲ３スクリーニング・アッセイにおいて使用した。
【0115】
コントロール抗体との競合的結合について、選択された抗ＥＧＦＲファージ抗体を試験する代表的抗ＥＧＦＲ Ｆａｂによって認識されるエピトープを描写するために、それらを、過剰のコントロールの文献由来のＩｇＧ［７］の存在下で、ＥＧＦＲへの結合について試験した（ファージ上で発現させたＦａｂとして：「ＭＦ」と称される）。これらの競合実験に使用したコントロールＩｇＧを、表２に列挙する。
【0116】
選択されたＦａｂを発現するファージを、過剰のこれらのコントロール抗体の存在下でＥＬＩＳＡにおいて抗原への結合について試験した場合、いくつかは、コントロール抗体のうちの１または複数による結合について競合を受けることが見出された：図３。これらの結果は、抗ＥＧＦＲパネルが、エピトープ認識において多様であることを示している。
【0117】
選択された抗ＥＧＦＲ ｃＬＣ Ｆａｂの再クローニング、ｃＬＣ ＩｇＧ１の発現および精製ＥＧＦＲ特異的ファージ・クローン（「ＭＦ」と称される）を、２９３Ｆ細胞におけるＩｇＧの一過的発現のために、発現ベクター中にＶＨコード遺伝子断片（Ｓｆｉ１−ＢｓｔＥＩＩ断片として）（「ＭＧ」と称される）を再クローニングすることによって、単一特異性の二価ＩｇＧ（「ＰＧ」と称される）として再クローニングした。２９３Ｆ細胞の一過的トランスフェクションによる産生後に、分泌されたＩｇＧ（「ＰＧ」と称される）を、標準化された手順を使用するプロテインＡアフィニティ・クロマトグラフィーによって培養物上清から精製した。
【0118】
カニクイザルＥＧＦＲおよびマウスＥＧＦＲとの交差反応性についての、抗ＥＧＦＲ抗体の試験抗ＥＧＦＲ ｃＬＣ ＩｇＧがカニクイザルＥＧＦＲと反応性であるかどうかを試験するために、全長ヒトＥＧＦＲをコードする構築物、ならびにキメラ・カニクイザル／ヒトＥＧＦＲをコードする新たに合成された発現構築物（図１）を、共に（抗原陰性）ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトし、次いで、細胞を、５μｇ／ｍｌの抗ＥＧＦＲ ｃＬＣ ＩｇＧ（ＰＧ）で染色し、最後にＦＡＣＳによって分析した。染色についての陽性コントロールとして、臨床的に使用されている抗体セツキシマブを使用したが、それは、この抗体が、カニクイザルＥＧＦＲと交差反応することが公知だからである［８］。キメラ・カニクイザル−ヒト受容体をコードする構築物は、トランスフェクトされた細胞の表面上で発現されている高いレベルのキメラ構築物を生じた（セツキシマブを使用する染色によって判断される）。さらに、全てのｃＬＣ ＩｇＧが、カニクイザルＥＧＦＲと反応性であることが示されたが、それは、ヒトＥＧＦＲを発現する細胞の染色が、キメラ受容体を発現する細胞の染色と、視覚的に識別不能だったからである。
【0119】
マウスＥＧＦＲとの交差反応性について抗ＥＧＦＲ ｃＬＣ ＩｇＧを試験するために、ＥＬＩＳＡを実施した。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃに融合させたマウスＥＧＦＲ ＥＣＤから構成される精製されたタンパク質を、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから購入し（カタログ番号５１０９１−Ｍ０２Ｈ）、連続２倍希釈のこの抗原を使用して、５μｇ／ｍｌで開始してＥＬＩＳＡプレートのウェルをコートした。次いで、この抗原への抗ＥＧＦＲ ｃＬＣ ＩｇＧの結合を、５μｇ／ｍｌの固定された濃度で試験した。これらの抗体の免疫反応性についての陽性コントロールとして、同じＥＬＩＳＡの設定を、抗原としてヒトＥＧＦＲ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。上記１７全ての抗体クラスターから、少なくとも１つの代表的抗体を試験した。さらに、合成ライブラリー由来のクローンＭＦ３３７０もまた、ＩｇＧ（ＰＧ３３７０）として試験した。１つ以外全てのｃＬＣ抗体が、マウスＥＧＦＲを認識しないことが示されたが、それは、これらが、ＥＬＩＳＡにおいて融合タンパク質と反応しなかったからである。しかし、抗体ＰＧ３３７０は、類似の親和性で、マウスＥＧＦＲ、ならびにヒトＥＧＦＲを認識することが示された（データ示さず）：表３はそのデータをまとめる。
【0120】
ＦＡＣＳにおいて、ＥＧＦＲ交換ドメイン構築物を使用して抗ＥＧＦＲ抗体のドメイン特異性を試験する抗ＥＧＦＲ ｃＬＣ ＩｇＧのドメイン特異性を明白に実証するために、これらを、「交換ドメイン」構築物を安定に発現するＣＨＯ細胞への結合について試験した：即ち、特定のドメインがＨｅｒ３の対応するドメインに置き換えられているＥＧＦＲの変異体を発現するＣＨＯ細胞を、ＦＡＣＳにおいて試験した（図２）。図４は、得られたＦＡＣＳデータの一例を示す；データは表３にまとめられる。
【0121】
リガンド誘導性シグナル伝達に対する効果について、抗ＥＧＦＲ抗体を試験するＥＧＦ誘導性シグナル伝達に対する効果について、選択された抗ＥＧＦＲ ｃＬＣ ＩｇＧを試験するために、これらを、Ａ４３１細胞のＥＧＦ誘導性細胞死を防止するそれらの能力について試験した。簡潔に述べると、高い（１０ｎＭ）濃度のＥＧＦは、Ａ４３１細胞において（アポトーシス）細胞死を誘導する［９］。この効果は、リガンド遮断性抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブ（マウス２２５抗体は、セツキシマブのマウス等価物である：［９］）の添加によって、用量依存的に復帰され得る。抗体を、１０μｇ／ｍｌから上への連続片対数希釈において、受容体阻害に対するそれらの影響についてこのアッセイで試験した。全てのアッセイにおいて、ＥＧＦＲ遮断性の、臨床的に使用されている抗体セツキシマブを、陽性コントロールとして含めた。抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦ誘導性細胞死を阻害することにおいて、様々な強度を有することが見出された。一部は、ＥＧＦ誘導性効果をレスキューすることにおいてセツキシマブよりも強力であり（例えば、ＰＧ３９９８：図５）、一部は、そこまで強力ではなく（例えば、ＰＧ４２８９、図５）、一部は、非常に僅かの活性を有していた〜活性を有していなかった（例えば、ＰＧ４０００、図５）。表３は、セツキシマブのものと比較した、受容体を阻害することにおける、ＥＧＦＲに対するｃＬＣ抗体の活性を示す。
【0122】
ＢｘＰＣ−３細胞増殖を阻害する能力についての、二重特異性抗ＥＧＦＲ×ＨＥＲ３抗体のスクリーニングＥＧＦＲおよびＨＥＲ３抗体パネルからのＶＨコードｃＤＮＡ断片を、２９３Ｆ細胞中への一過的トランスフェクション後に二重特異性抗体（二重特異性タンパク質の代わりに、「ＰＢ」と称される）の生成を強いる、荷電操作したＣＨ３ドメインをコードするベクター（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら、ＪＢＣ ２０１０；ＰＣＴ／ＮＬ２０１３／０５０２９４）中に、再クローニングした。３つの異なる戦略を、二重特異性ＩｇＧ形式でＥＧＦＲアームおよびＨＥＲ３アームを組み合わせる際に使用した：Ｉ）両方の親抗体が、それぞれの細胞アッセイ（ＥＧＦＲについてＡ４３１アッセイおよびＨｅｒ３についてＭＣＦ−７アッセイ）において、受容体に対するリガンド遮断活性が証明された、１２０のユニーク二重特異性抗体（表４）を生じる、二重特異性体；ＩＩ）アームの一方のみ（抗Ｈｅｒ３または抗ＥＧＦＲのいずれか）が、上述のアッセイにおいて機能性を有していた、二重特異性体（合計４４０のユニーク二重特異性抗体、非表示）、およびＩＩＩ）両方のＦａｂアームが、これらのアッセイにおいて機能性を有さない（またはほとんど有さない）、二重特異性体（合計３２０のユニーク二重特異性抗体、非表示）。合計で８８０のユニーク二重特異性抗体を、ＢｘＰＣ−３細胞の成長を阻害するそれらの能力について試験した。
【0123】
８８０全ての二重特異性抗体を、２９３Ｆ細胞における共トランスフェクションおよび一過的共発現によって産生した。標準化された手順に従って、ＩｇＧを、培養物上清から精製し、タンパク質が維持される緩衝液を、ＰＢＳに交換した。精製されたタンパク質を、Ｏｃｔｅｔ分析を使用して定量化した。二重特異性体を、リガンド（ＥＧＦおよびＮＲＧ）依存的アッセイ（１０ｎｇ／ｍｌのＮＲＧの次に、１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの添加）、ならびにリガンド非依存的アッセイ（リガンド添加せず）において、２つの濃度（１μｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌ）で試験した。
【0124】
最初に、抗体を、化学組成が既知の飢餓培地（ＣＤＳ：１ｍｌ当たり８０Ｕのペニシリンおよび８０μｇのストレプトマイシン、０．０５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡならびに１０μｇ／ｍｌのホロ・トランスフェリンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）中に希釈し、希釈した抗体の５０μｌを、９６ウェル黒色ウェル透明底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）のウェルに添加した。リガンドを添加した（ＣＤＳ中に希釈した、４０ｎｇ／ｍｌのＮＲＧおよび４００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ：Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３９６−ＨＢおよび２３６−ＥＧを含む、１ウェル当たり５０μｌのストック溶液）。リガンド非依存的アッセイの場合、リガンドは添加せず、その代わりに５０μｌのＣＤＳだけを添加した。ＢｘＰＣ−３細胞を、トリプシン処理し、回収し、計数し、１００μｌのＣＤＳ中８０００の細胞を、プレートの各ウェルに添加した。プレートを、室温で１時間そのままにし、その後、３７℃の細胞培養インキュベーターの内側で３日間、コンテナ中に置いた。４日目に、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃ＤＡＬ１１００）を添加し（１ウェル当たり２０μｌ）、蛍光を、Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ２ Ｍｕｌｔｉ−ｍｏｄｅマイクロプレート・リーダーで、５６０ｎｍの励起および５９０ｎｍの読み出しを使用して、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅとの６時間のインキュベーション（３７℃）後に測定した。蛍光値を、阻害されていない成長（抗体は添加していないが、両方のリガンドを添加した）に対して標準化した。
【0125】
ＩＣ５０決定８８０の二重特異性抗体のスクリーニング・データの概観を、図６に示す。ＭＥＨＤ７９４５Ａは、ベンチマーク抗体として機能した。図５の上の点線は、リガンド非依存的アッセイにおいて観察された平均活性を示し、下の点線は、リガンド依存的アッセイにおいて観察された抗体の平均活性を示す。次いで、両方のアッセイにおいて、ＭＥＨＤ７９４５Ａ抗体のものと少なくとも同等に良好であった強度を有していた２０の二重特異性体を、再産生し、再精製し、リガンド駆動性ＢｘＰＣ−３増殖アッセイにおいて再度試験して、ＩＣ５０値を決定した。抗体を、１０μｇ／ｍｌから下にＣＤＳ中に連続的に希釈し、１ウェル当たり５０μｌの抗体溶液を添加した。リガンドおよび細胞を、上記のように添加し、細胞を、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅの添加および蛍光読み出しの前に３日間インキュベートした。重ねて、値を、阻害されていない成長に対して標準化し、ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（非線形曲線フィッティング）を使用して計算した。６つの最良の性能の二重特異性体を、両方のアッセイにおいてコンパレーター抗体ＭＥＨＤ７９４５Ａのものよりも低いＩＣ５０に基づいて選択した。図７は、これらの最良の性能の抗体のうち２つのＩＣ５０決定を示す。表６は、親モノクローナル抗体の各々の混合物の活性と比較した、これら６つの二重特異性体についてのデータをまとめている（以下を参照のこと）。
【0126】
同所性に移植されたＢｘＰＣ−３腫瘍の成長に対するそれらの効果について、抗ＥＧＦＲ×ＨＥＲ３二重特異性体を試験する。研究の開始時に８〜１０週齢のＣＢ１７ ＳＣＩＤ雌性マウスに、２０μｌ中１×１０６の腫瘍細胞を、膵臓中に同所性に移植した。従って、マウスを麻酔し、右側を下にして寝かせて左側を露出させ、０．５ｃｍの切開を左側腹領域に作製する。膵臓および脾臓を剥き出しにし、２０μｌ中１×１０６の腫瘍細胞を、膵尾部の嚢下（ｓｕｂ−ｃａｐｓｕｌａｒｙ）空間中に注射した。移植の１週間後、バイオルミネセンス（ＢＬＩ）データを生成した。左側の表示をＢＬＩ画像化するために（１週間に１回または２回）、全てのマウスが、画像化の１５分前、１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリン（Ｄ−ルシフェリン−ＥＦカリウム塩、カタログ番号Ｅ６５５２、Ｐｒｏｍｅｇａ）の腹腔内注射を受けた。異常値動物−ＢＬＩ／腫瘍体積に基づく−を除去し、マウスを、各々７匹のマウスの群中にランダムに分配した。実験８日目に、処置を開始した。抗体処置群中の動物に、３連続週にわたって毎週（０日目、７日目、１４日目および２１日目）、３０ｍｇ／ｋｇの抗体を投薬した。処置の０日目に、これらの動物は、初回負荷量の２倍、即ち、６０ｍｇ／ｋｇの抗体を投与された。最終画像化を、３１日目に実施した。
【0127】
６つ全ての二重特異性体が、このモデルにおいてＢｘＰＣ−３腫瘍増生を有意に減少させることが示された（ｐ＜０．００１）（図８）。しかし、コンパレーター抗体ＭＥＨＤ７９４５Ａの治療効果と、これら６つの二重特異性体のうち２つ、ＰＢ４５２２およびＰＢ４５１０の治療効果との間には、有意差は存在しなかった（データ示さず）。従って、用量漸増研究を、二重特異性抗体のうちの１つ、ＰＢ４５２２、およびコンパレーター抗体ＭＥＨＤ７９４５Ａを用いて実施した。正確に同じｉｎ ｖｉｖｏモデルおよび投薬スケジュールを使用して、異なる群のマウスを、３０ｍｇ／ｋｇから３ｍｇ／ｋｇに、最後には０．３ｍｇ／ｋｇに低下させた漸減する抗体用量で処置した。図９は、０．３ｍｇ／ｋｇで処置した群についてのデータを示す。３０ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇのＭＥＨＤ７９４５ＡまたはＰＢ４５２２のいずれかで処置した全ての群間で、治療効果における有意差は存在しなかった（データ示さず）。しかし、０．３ｍｇ／ｋｇ用量では、ＭＥＨＤ７９４５Ａによる処置とＰＢ４５２２による処置との間に治療効果における有意差が存在し、後者は、腫瘍成長の低減においてより強力であった。マウスをこの研究から引き上げた後、それらの全ての腫瘍の重量を、ｅｘ ｖｉｖｏで決定した。図１０は、ＰＢ４５２２（０．３ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスから採取した腫瘍の平均重量が、ＭＥＨＤ７９４５Ａ（０．３ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスのものよりも、有意に低かった（Ｐ＝０．００７、対応の無い（ｕｎｐａｉｒｅｄ）Ｔ検定）ことを示している。
【0128】
ＢｘＰＣ−３細胞増殖阻害における異なる抗体形式の強度の比較細胞増殖阻害における異なる抗体形式の強度を比較するために、精製された二重特異性抗ＥＧＦＲ×ＨＥＲ３抗体を、親抗体の等モル・ミックスと比較して、ＢｘＰＣ−３細胞増殖を阻害する能力について試験した。全てのアッセイ・プレートにおいて、試験されている抗体のＩＣ５０を、「ツー・イン・ワン」ＭＥＨＤ７９４５Ａと直接比較することができるように、ＭＥＨＤ７９４５Ａを、陽性コントロールとして使用した。滴定を、１０μｇ／ｍｌから開始して６回の１０倍希釈で実施した。抗体のこれらの連続希釈を、濃度範囲全体にわたって２連で試験した。得られたシグモイド曲線から、ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した。表６は、そのデータをまとめる。
【0129】
表６で見られるように、全ての場合において、二重特異性形式は、ＢｘＰＣ−３腫瘍細胞の増殖を阻害することにおいて、２つの親抗体のミックスよりも強力であり、従って、この形式が、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３の同時標的化のための好ましい形式であった。同じ二重特異性の増殖阻害についてのＩＣ５０値を数回測定した場合、僅かに異なる値が異なるアッセイにおいて得られた。しかし、これらの差異は、不可避の小さい実験的変動であるとみなした。
【0130】
ケラチノサイト・アッセイＥＧＦＲ遮断は、ケラチノサイトにおけるケモカイン発現に影響を与えることが実証されている（Ｐａｓｔｏｒｅ、Ｍａｓｃｉａら、２００５）。ＥＧＦＲ阻害剤（ＥＧＦＲＩ）の皮膚毒性の最近の分析により、発疹の初期炎症性浸潤が、樹状細胞、マクロファージ、顆粒球、肥満細胞およびＴ細胞によって支配されることが示されている。ＥＧＦＲ阻害は、上皮ケラチノサイトにおけるケモカイン（ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１４）の発現を誘導するが、抗菌ペプチドおよび皮膚障壁タンパク質、例えばＲｎａｓｅ７の産生は、障害される。ｉｎ ｖｉｖｏで観察された皮膚毒性は、Ｑ−ＰＣＲ分析と組み合わせて、初代ケラチノサイト系を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで解釈できた（Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｇｅｒｂｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１３）。ＭＥＨＤ７９４５Ａおよびセツキシマブと比較したＰＢ４５２２の効果を、ヒト初代上皮ケラチノサイトに対して、１０ｎＭおよび１００ｎＭの濃度で試験した。ヒト初代上皮ケラチノサイトを単離し、３７℃、５％ＣＯ２で、ＳＦＭ細胞成長培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、６ウェル・プレート中に１ウェル当たり１００．０００細胞の密度で播種した。細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）の非存在下または存在下で、２４時間処置した。２連の各条件を準備した。２４時間後、細胞を回収し、ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬を使用することによって細胞から抽出した。ｃＤＮＡを、逆転写酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、異なるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）鋳型から合成した。ｑＰＣＲのための遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓによるＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓとして取得した。ＣＸＣＬ１４およびＲｎａｓｅ７ならびに１８ＳおよびＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子の発現を決定した。ＰＢ４５２２は、セツキシマブおよびＭＥＨＤ７９４５Ａと比較して、より少ないＣＸＣＬ１４を誘導する。対照的に、Ｒｎａｓｅ７発現は、セツキシマブおよびＭＥＨＤ７９４５Ａと比較して、ＰＢ４５２２によってはあまり重度に妨害されなかった。
【0131】
ＰＢ４５２２は、ＭＥＨＤ７９４５Ａと比較して優れたＡＤＣＣ活性を示すＡＤＣＣ活性は、癌における、治療的抗体にとって重要な抗腫瘍作用機構である。セツキシマブおよびトラスツズマブなどの、ＨＥＲファミリーの受容体に対するヒト・モノクローナル抗体は、ＡＤＣＣを誘導する。糖鎖工学および変異誘発を含む複数の戦略が、ＡＤＣＣ増強を達成するために使用されてきた。これらは全て、低親和性活性化ＦｃγＲＩＩＩａへのＦｃ結合を改善し、および／または低親和性阻害性ＦｃγＲＩＩｂへの結合を低減させようとするものである。糖鎖工学においてＡＤＣＣ増強を達成するために使用される方法の１つは、フコースの除去である。フコースの除去は、いくつかのｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて、増加した抗腫瘍活性を生じている［Ｊｕｎｔｔｉｌａ、２０１０］。ＰＢ４５２２の活性を最大化するために、非フコシル化テクノロジーを適用して（ＬｉｕおよびＬｅｅ．２００９［１３〜１７］）、Ｆｃ領域中のＮ結合型炭水化物構造からフコースを除去した。
【0132】
ＭＥＤＨ７９４５ａおよびセツキシマブと比較してＰＢ４５２２のＡＤＣＣ活性を決定するために、ＡＤＣＣ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｂｉｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。３つの異なる細胞株を試験した；ＥＧＦＲ増幅された、高ＥＧＦＲ発現性の頭頸部細胞株Ａ４３１、中程度のＥＧＦＲ発現性の肺癌細胞株Ａ５４９、および中程度のＥＧＦＲ発現性の膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ３。
【0133】
このバイオアッセイは、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体のＶ１５８（高親和性）またはＦ１５８（低親和性）バリアントのいずれかを安定に発現する操作されたＪｕｒｋａｔ細胞、およびＦｃγＲ活性化についての尺度であるホタル・ルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントを使用する。このアッセイを、古典的５１Ｃｒ放出アッセイに対して、ＡＤＣＣ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｂｉｏａｓｓａｙを用いて得られたデータを比較することによって検証しており、両方のアッセイが、類似の結果を生じる。これらのＡＤＣＣアッセイを、３８４白色ウェル・プレートを使用して、Ｐｒｏｍｅｇａ ＡＤＣＣ Ｂｉｏａｓｓａｙキットを使用して実施した。この実験設定では、Ａ４３１細胞、ＢｘＰＣ３細胞およびＡ５４９細胞を、バイオアッセイの２０〜２４時間前に、３０μｌのアッセイ培地（４％の低ＩｇＧ血清を含むＲＰＭＩ）中、１０００細胞／ウェルの密度でプレートした。次の日、培養培地を除去した。次に、抗体ＰＢ４５２２およびそのコンパレーター抗体セツキシマブ、ＭＥＨＤ７９４５Ａならびにコントロール抗体の連続希釈を、２連で調製した。１０μｌのこれらの抗体希釈を、ウェルに添加した。抗体の出発濃度は１０μｇ／ｍｌであり、１０点の５倍連続希釈を作製して、完全用量応答曲線を提供した。最後に、５μｌのＡＤＣＣ Ｂｉｏａｓｓａｙエフェクター細胞（１５０００細胞／ウェル、Ｖ１５８）を添加した。これらの細胞を、３７℃で６時間インキュベートした。次に、１５μｌのＢＩＯ−Ｇｌｏルシフェラーゼ基質を添加し、５分後、ルミネセンスを、プレート・リーダーで検出した。得られたデータを図１３に示す。ＰＢ４５２２およびセツキシマブの両方が、中間のＥＧＦＲ発現性細胞ＢｘＰＣ３およびＡ５４９に対してＡＤＣＣ活性を示し、セツキシマブのＥＣ５０は、ＰＢ４５２２と比較してより低かった。しかし、ＰＢ４５２２の総ＡＤＣＣ活性−曲線下面積（ＡＵＣ）−および最大ＡＤＣＣ活性は、セツキシマブと比較してより高かった。３つ全ての抗体が、ＥＧＦＲ増幅された細胞株Ａ４３１に対してＡＤＣＣ活性を示し、セツキシマブは、最も高いＡＤＣＣ活性を示し、ＰＢ４５２２およびセツキシマブがその次であった。中程度のＥＧＦＲ発現性の細胞株が、患者由来の腫瘍細胞サンプル上で発現されたＥＧＦＲの数を代表することに留意されたい。３つ全ての細胞株において、ＰＢ４５２２の最大ＡＤＣＣおよびＡＵＣは、ＭＥＨＤ７９４５Ａと比較してより高かった。３つ全ての細胞株において、ＰＢ４５２２のＥＣ５０は、ＭＥＨＤ７９４５Ａと比較してより低かった。
【0134】
ＨＥＲ３ＦＡＣＳにおける、ＨＥＲ３ ＥＣＤ変異体への、０．２５μｇ／ｍｌのＰＧ３１７８ ＩｇＧの結合分析により、コントロールｍＡｂの結合が保持されつつ、アラニンへの変異がＷＴ ＨＥＲ３と比較して結合の実質的な喪失を引き起こした、２つのいわゆる「重要」残基（Ｆ４０９、Ｒ４２６）が同定された（表７および図１７）。両方の残基は、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩ中に位置し、空間的に遠位である。さらに、Ｆ４０９は、ＨＥＲ３疎水性コア中に埋められ、ＰＧ３１７８エピトープの一部である可能性は低くなっている。
【0135】
確認実験ＨＥＲ３エピトープＣＨＯ−Ｋ１細胞に、ＨＥＲ３ ＥＣＤ変異構築物（表７中に列挙した）、ＷＴ ＨＥＲ３ ＥＣＤおよび２つのコントロール構築物（Ｈ４０７ＡおよびＹ４２４Ａ）をトランスフェクトした。ＨＥＲ３ ＥＣＤバリアントへのＰＧ３１７８結合を、ＦＡＣＳ滴定実験において試験した。ＨＥＲ３のドメインＩ（ＭＭ−１２１）およびドメインＩＩＩ（ＭＥＨＤ７９４５Ａ）に結合する２つのコントロール抗体を、細胞表面上のＨＥＲ３ ＥＣＤ発現を検証するために含めた。平均ＭＦＩ値をプロットし、各曲線について、ＡＵＣを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアを使用して計算した。ＷＴ ＨＥＲ３結合を使用して、データを標準化した。Ｒ４２６Ａ変異は、ＰＧ３１７８結合に重要であることが示されたが、Ｆ４０９Ａへの結合は、細胞表面の発現の喪失に起因して確認できなかった（図１８）。
【0136】
実施例で引用した参考文献1. Schmitz, K.R. and K.M. Ferguson, Interaction of antibodies with ErbB receptor extracellular regions. Exp Cell Res, 2009. 315(4): p. 659-70.
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【0137】
【表1】
【0138】
【表2】
【0139】
【表3】
【0140】
【表4】
【0141】
【表5】
【0142】
【表6】
【0143】
【表7】
【0144】
【表8】
【0145】
明細書中で引用した参考文献1. Garrett TP, McKern NM, Lou M, Elleman TC, Adams TE, Lovrecz GO, Zhu HJ, Walker F, Frenkel MJ, Hoyne PA, Jorissen RN, Nice EC, et al. Crystal structure of a truncated epidermal growth factor receptor extracellular domain bound to transforming growth factor alpha. Cell 2002;110:763-73.
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【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11AA】
【図11AB】
【図11AC】
【図11AD】
【図11AE】
【図11AF】
【図11AG】
【図11AH】
【図11AI】
【図11BA】
【図11BB】
【図11BC】
【図11BD】
【図11BE】
【図11BF】
【図11BG】
【図11BH】
【図11BI】
【図11BJ】
【図11BK】
【図11BL】
【図11BM】
【図11C】
【図11D】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図17】
【図18】