特許 6771568 補体活性化を抑制するポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6771568

(24)【登録日】2020年10月1日

(45)【発行日】2020年10月21日

(54)【発明の名称】補体活性化を抑制するポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20201012BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20201012BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20201012BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20201012BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20201012BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20201012BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20201012BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20201012BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20201012BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20201012BHJP

   A61P 13/02 20060101ALI20201012BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20201012BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20201012BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20201012BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20201012BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20201012BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/62 Z

   C07K19/00ZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N5/10

   C12N1/21

   C12N15/12

   C12N15/63 Z

   C12P21/02 C

   C07K14/47

   A61P13/02

   A61P13/12

   A61P31/00

   A61P17/02

   A61P9/10

   A61K38/16

【請求項の数】18

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2018-533148(P2018-533148)

(86)(22)【出願日】2016年12月23日

(65)【公表番号】特表2019-508022(P2019-508022A)

(43)【公表日】2019年3月28日

(86)【国際出願番号】EP2016082614

(87)【国際公開番号】WO2017109208

(87)【国際公開日】20170629

【審査請求日】2018年7月25日

(31)【優先権主張番号】102015016665.4

(32)【優先日】2015年12月23日

(33)【優先権主張国】DE

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】506047949

【氏名又は名称】グリーンオヴェイション・バイオテック・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング

【氏名又は名称原語表記】ＧＲＥＥＮＯＶＡＴＩＯＮ ＢＩＯＴＥＣＨ ＧＭＢＨ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】シュテファン・ミヒェルフェルダー

(72)【発明者】

【氏名】カルステン・ヘフナー

【審査官】 長谷川 強

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１５／０９２３３５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 BLOOD, 2009, Vol.114, No.12, p.2439-2447

【文献】 ｅ−免疫．ｃｏｍ[online]，ＰＩＤ知識の箱, INTERNET ARCHIVE: WAYBACK MACHINE，公開日：2015年10月1日, [検索日：2019年6月20日]，< https://web.archive.org/web/20151001054747/http://emeneki.com/knowledge/complement_deficiency/detail01.html>

【文献】 The Journal of Clinical Investigation, 2013, Vol.123, No.6, p.2357-2360

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／６２

Ａ６１Ｋ ３８／１６

Ａ６１Ｐ ９／１０

Ａ６１Ｐ １３／０２

Ａ６１Ｐ １３／１２

Ａ６１Ｐ １７／０２

Ａ６１Ｐ ３１／００

Ｃ０７Ｋ １４／４７

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｎ １５／１２

Ｃ１２Ｎ １５／６３

Ｃ１２Ｐ ２１／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｈ因子（ＦＨ）のショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）１−４、Ｈ因子関連タンパク質１（ＦＨＲ１）のＳＣＲ１およびＳＣＲ２、ならびに細胞表面に結合することができるドメインを含むポリペプチド。

【請求項2】

細胞表面に結合することができるドメインが、ＦＨのＳＣＲ１９およびＳＣＲ２０を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

ポリペプチドが多量体である、請求項１または２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

ＦＨＲ１のＳＣＲ１由来の少なくとも１つの二量体化モチーフを含む、請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項5】

ポリペプチドがＴＣＣ（Ｃ５ｂ−９）の形成を抑制することができる、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。

【請求項6】

ポリペプチドのＣ５ｂ−６への結合によりＴＣＣ形成が抑制される、請求項５に記載のポリペプチド。

【請求項7】

構造：
Ａ−Ｂ−Ｃ
［ここで、
Ａは、ＦＨＲ１のＳＣＲ１およびＳＣＲ２を含むか、またはＦＨＲ１のＳＣＲ１およびＳＣＲ２からなり、
Ｂは、ＦＨのＳＣＲ１−４を含むか、またはＦＨのＳＣＲ１−４からなり、
Ｃは、細胞表面に結合することができるドメインである］
を有するポリペプチド。

【請求項8】

細胞表面に結合することができるドメインが、ＦＨのＳＣＲ１９およびＳＣＲ２０を含む、請求項７に記載のポリペプチド。

【請求項9】

ＡとＢが直接に、またはリンカーを介して結合している、請求項７または８に記載のポリペプチド。

【請求項10】

ＢとＣが直接に、またはリンカーを介して結合している、請求項７〜９のいずれかに記載のポリペプチド。

【請求項11】

ＦＨのＳＣＲ１−４が配列番号１のアミノ酸１９〜２６４からなる、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチド。

【請求項12】

ＦＨＲ１のＳＣＲ１およびＳＣＲ２が配列番号２のアミノ酸２２〜１４２からなる、請求項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチド。

【請求項13】

補体系が関連または関与する障害を治療または予防するための、請求項１〜１２のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分として含む医薬組成物。

【請求項14】

補体系が関連または関与する障害が、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、血栓性微小血管症（ＴＭＡ）、Ｃ３腎症（Ｃ３Ｇ）、ＩｇＡ腎症、全身性エリテマトーデスの腎炎、移植片拒絶、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、感染性疾患、敗血症、ＳＩＲＳ、外傷性傷害、虚血／再灌流傷害、および心筋梗塞からなる群から選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

請求項１〜１２のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。

【請求項16】

請求項１５に記載の核酸を含むプラスミドまたはベクター。

【請求項17】

請求項１５に記載の核酸、または請求項１６に記載のプラスミドもしくはベクターを含む細胞。

【請求項18】

請求項１〜１２のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法であって、請求項１７に記載の細胞を、該ポリペプチドの発現を可能にする条件下に培地中で培養し、該細胞または該培地から該ポリペプチドを回収することを含む方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

補体系は、自然免疫の重要な部分であり、病原体の認識および排除、アポトーシス細胞もしくは免疫複合体のクリアランス、ならびに適応免疫応答の調節に寄与する（Ricklin et al. 2010, Carroll et al. 2011）。補体は、通常、酵素前駆体（zymogen）として、または膜タンパク質として循環する、主に肝臓で作られる多数の血漿タンパク質から成り、血漿、組織または細胞内で働く。古典的経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）あるいは第２経路（ＡＰ）の３つの補体経路のいずれが活性化されても、Ｃ３転換酵素が形成され（ＣＰ、ＬＰではＣ４ｂ２ａ、ＡＰではＣ３ｂＢｂ）、これは補体系の中心的成分であるＣ３の、活性化産物Ｃ３ｂおよびアナフィラキシーペプチドＣ３ａへの分解を引き起こす。それに続き、引き起こされるカスケード様反応において、病原体が破壊されるようマークされ、また、感染に対抗しホメオスタシスを維持するために免疫細胞を動員する一連の炎症反応が誘導される（Merle et al. 2015）。補体の活性化または調節のいずれが不全であっても、それは、免疫不全、自己免疫、慢性炎症、血栓性微小血管症、移植片拒絶ならびに腎臓および網膜疾患、例えば非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、Ｃ３腎症（Ｃ３Ｇ）および加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）を包含する多くの感染性もしくは非感染性疾患の原因または誘因となりうる（Holers 2008）。

【0002】

第２経路（ＡＰ）
ＣＰおよびＬＰが、ある種の認識分子が引き金となって開始されるのに対し、ＡＰは常時低レベルで活性である。これは、「チックオーバー」と称されるメカニズムで起こるもので、Ｃ３ｂ様分子であるＣ３（Ｈ２Ｏ）の内部Ｃ３チオエステルが、生体活性形態を形成するよう加水分解されることにより開始される。可溶性のＢ因子（ＦＢ）およびＤ因子（ＦＤ）（これはＣ３（Ｈ２Ｏ）結合ＦＢを分解する）が作用して、液相Ｃ３転換酵素複合体（Ｃ３ｂ（Ｈ２Ｏ）Ｂｂ）が形成され、天然Ｃ３分子が切断され、活性化される。活性化されたＣ３ｂは、チオエステル含有ドメイン（ＴＥＤまたはＣ３ｄドメイン）を介して、隣接表面のヒドロキシル基に共有結合する。病原体上で、Ｃ３ｂが、形成された部位のすぐ近くに蓄積し、さらなるＣ３転換酵素（Ｃ３ｂＢｂ）が形成され、それによって補体活性化が増幅される。Ｃ３転換酵素に第２のＣ３ｂが結合することにより、Ｃ５転換酵素（Ｃ３ｂＢｂＣ３ｂ）が形成され、これはＣ５の、強力な免疫エフェクター分子Ｃ５ａおよびＣ５ｂへの分解を引き起こす。Ｃ５ｂは補体成分Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９を動員してＣ５ｂ−９終末膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を形成し、その結果、病原体が溶解される（Ricklin et al. 2010, Carroll et al. 2011）。

【0003】

ＡＰの制御
オプソニン化細胞および病原体の迅速な排除のため、および宿主組織損傷をもたらしうる無制限のＡＰ活性化を最小限にするために、ＡＰは精密に制御されなければならない。健康な宿主細胞は通常、カスケードの異なる活性化段階で作用する、補体活性化制御因子（regulator of complement activation）（ＲＣＡ）ファミリーのいくつもの膜結合または可溶性タンパク質（それらのいくつかは機能が重複しており、いくつかは独特の補体制御特性を有する）によって、補体が仲介する侵襲から保護されている（Zipfel et al. 2009）。

【0004】

新たなＣ３ｂ生成は、Ｉ因子（ＦＩ）が仲介するＣ３ｂのｉＣ３ｂへの不可逆分解にコファクターとして作用するＲＣＡタンパク質によって、またはＣ３ｂＢｂ転換酵素複合体の脱安定化によって（Decay Acceleration Activity, DAA）、厳重に制御されている。さらに、ＲＣＡはＣ５転換酵素活性を妨げることができ、それによりＣ５の活性化産物Ｃ５ａおよびＣ５ｂへの分解を制御するか、または終末補体複合体（ＴＣＣ）化合物に結合する因子によって、ＭＡＣ複合体の膜挿入を抑制することができる。membrane cofactor protein（ＭＣＰまたはＣＤ４６）、補体受容体１（ＣＲ１またはＣＤ３５）、decay accelerating factor（ＤＡＦまたはＣＤ５５）、membrane inhibitor of reactive lysis（ＭＩＲＬ、ＣＤ５９）、ならびに可溶性因子ビトロネクチンおよびクラステリン（clusterin）等と一緒に、Ｈ因子／ＦＨＲタンパク質ファミリーのメンバー、特にＦＨは、循環中において、およびそれが特異的に結合する表面上において、補体制御をサポートする。

【0005】

Ｈ因子／ＦＨＲタンパク質ファミリー
Ｈ因子／ＦＨＲタンパク質ファミリーは、５つの補体Ｈ因子関連タンパク質（ＦＨＲ）であるＦＨＲ１、ＦＨＲ２、ＦＨＲ３、ＦＨＲ４、ＦＨＲ５、Ｈ因子（ＦＨ）およびスプライスバリアントであるＨ因子様タンパク質１（ＦＨＬ−１）を含む、一群の関連性の高い血漿タンパク質を含む。ファミリーメンバーのそれぞれの単一遺伝子は、ＲＣＡ遺伝子クラスター内において、ヒト染色体１ｑ３２上の個別のセグメント上に位置する（Skerka et al. 2013）。ＦＨは第２経路の主要な制御因子であり、ＦＨＲの機能は完全にはわかっていない。ＦＨＲタンパク質の相互作用は、細胞表面上での補体制御活性を調節すると考えられている（Jozsi et al. 2015）。さらに、それらのホモおよびヘテロオリゴマー化能により、ＦＨＲ１、ＦＨＲ２およびＦＨＲ５のリガンドに対する親和性が高められうる。これは、補体活性化の認識および調節におけるファインチューニング様メカニズムとして提唱されている（Jozsi et al. 2015）。しかしながら、ＦＨＲ１およびＦＨＲ２について、ＦＨ非依存性のユニークな補体制御特性もいくつか報告されている。ＦＨ、ＦＨＲ１およびＦＨＲ２は補体活性化をダウンレギュレートしうるので、病的状態下の補体活性化を調節する手段の有望な候補であると考えられている（Licht et al. 2005, Licht et al. 2006, Skerka et al. 2013, Haffner et al. 2015）。

【0006】

ＦＨ／ＦＨＲタンパク質ファミリーのなかで、ＦＨは、血漿中に約３５０〜６００μｇ／ｍｌの濃度で循環する、最も豊富な補体タンパク質である。分子量１５５ｋＤａの単量体糖タンパク質であるＦＨは、ＡＰおよび補体経路の増幅ループを制御する。ＦＨは２０の反復的なショートコンセンサスリピート（short consensus repeat）（ＳＣＲ）ドメインからなり、液相中および細胞表面上でＣ３転換酵素の活性化を制御する。Ｎ末端ドメインＳＣＲ１−４は、該タンパク質の補体制御領域を含む。ＦＨ ＳＣＲ１−４はＣ３ｂに結合し、それによってＣ３およびＣ５転換酵素の形成を阻止し、また、Ｃ３ｂ結合をＦＢと競合することによって、既に生成した転換酵素の分解を促進する（Weiler et al. 1976）。さらに、前記ドメインは、ＦＨがＦＩ仲介Ｃ３ｂ不活性化のコファクターとして作用するのに関与する（Gordon et al. 1995, Rodriguez de Cordoba et al. 2004, Alexander et al. 2007, de Cordoba et al. 2008）。ＦＨのＣ末端（ＳＣＲ１９−２０）は主に、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｄ、ペントラキシン、細胞外マトリックスおよび細胞表面と相互作用する結合認識ドメインを表す（Jarva et al. 1999, Oppermann et al. 2006, Hebecker et al. 2013）。細胞表面または生体膜上へのＦＨの結合は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（例えばヘパリン）またはシアル酸のようなポリアニオン構造によって仲介され、内生細胞、例えば糸球体内皮細胞または糸球体基底膜（ＧＢＭ）上における局部補体活性化を制御する（Jozsi et al. 2004, Ferreira et al. 2006, Jozsi et al. 2007, Blaum et al. 2015）。

【0007】

ＦＨＲ１は、５個のＳＣＲで構成され（Skerka et al. 1991）、２つのアイソフォームを有する。１つまたは２つの炭水化物側鎖を有する２つのグリコシル化形態（約４１ｋＤａのＦＨＲ１α、および約３７ｋＤａのＦＨＲ１β）が、ヒト血漿中に約１００μｇ／ｍｌの濃度で循環する。ＦＨＲ１はＦＨとのＣ末端配列相同性が高く、Ｃ末端ＳＣＲ１およびＳＣＲ２は、ＦＨＲ２のＳＣＲ１およびＳＣＲ２とのアミノ酸同一性が高く（それぞれ９７％および１００％）、ＦＨＲ５のＳＣＲ１およびＳＣＲ２とのアミノ酸同一性が高い（それぞれ９１％および８３％）。ＦＨＲ１はＣ５転換酵素活性を制御し、補体活性化を抑制するが、Ｃ３転換酵素活性は影響を受けない。Ｎ末端ＳＣＲ１−２はＣ５およびＣ５ｂ６に結合し、Ｃ末端ＳＣＲ３−５はＣ３ｂ、Ｃ３ｄおよびヘパリンに結合する。ＦＨＲは、ＳＣＲ１−２のＣ５への結合によって、Ｃ５の活性化ならびにＣ５ａおよびＣ５ｂへの分解を抑制すると考えられる。さらに、ＦＨＲ１は終末経路制御因子であり、ＭＡＣの形成を阻止するが、これはＳＣＲ１−２のＣ５ｂ６複合体への結合によるものと考えられる（Heinen et al. 2009）。

【0008】

ＦＨＲ２は４個のＳＣＲからなり（Skerka et al. 1992）、ＦＨのＳＣＲ６−７および１９−２０とのアミノ酸同一性を示す。ＦＨＲ２のＮ末端ＳＣＲ１は、ＦＨＲ１およびＦＨＲ５とほぼ同じであり、ホモ二量体、およびＦＨＲ１とのヘテロ二量体の形成を可能にするが、ＦＨＲ５とのヘテロ二量体は形成しない。ＦＨＲ２はヒト血漿中に約５０μｇ／ｍｌの濃度で循環する。ＦＨＲ２は補体活性化を制御するが、これはＦＨＲ２が結合したＣ３転換酵素は基質Ｃ３を分解しないというメカニズムによるものと考えられる。興味深いことに、ＦＨＲ２は、殆ど、Ｃ３ｂからＨ因子を競合的に排除しない。ＦＨＲ２は生理学的濃度でＣ３ｂとの結合をＦＨと競合しない（Goicoechea de Jorge et al. 2013）。

【0009】

ＦＨＲ２と同様にＦＨＲ１も、またＦＨＲ５も、それぞれ、ＳＣＲ１中に位置するＴｙｒ３４、Ｓｅｒ３６およびＴｙｒ３９残基で構成される保存された二量体化インターフェースを含み、これは該集合体形成において重要な役割を果たし、Ｎ末端のタイトな逆平行結合によって伝搬されるホモおよびヘテロ二量体形成を促進する。ＦＨＲは、制御機能を有することに加えて、ある条件下にＣ３ｂまたは宿主／病原体細胞表面へのＦＨの結合を阻害（ＦＨを競合的に排除）して、補体の脱制御（deregulation）（活性化）を引き起こす（Jozsi et al. 2015）。多量体ＦＨＲ複合体の形成は、局部の濃度を高め得、それにより、基質または表面（ＦＨＲによって制御されるもの）への親和力および／または親和性を高め得る。病態生理学的条件下に、例えばＣ３腎症においてＦＨＲの異常な多量体化（それによりリガンド結合およびＦＨ競合が増す）により、脱制御が増強されるのではないかと考えられている（Goicoechea de Jorge et al. 2013）。

【0010】

ＡＰ関連疾患
補体成分およびＦＨのような制御因子の、突然変異、機能不全多型によって引き起こされるＡＰ制御不全、またはＡＰ活性化を促進する抗体は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）（Noris et al. 2009）またはＣ３腎症（Ｃ３Ｇ）（Barbour et al. 2013）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）（Kawa et al. 2014）または発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）（Holers 2008）のような疾患との関連性が高い。これら以外にも、ＩｇＡ腎症（Maillard et al. 2015）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（Wilson et al. 1976）、虚血−再灌流（ＩＲ）傷害または移植片拒絶、関節リウマチ（ＲＡ）および他の多くの疾患（Holers 2008）（Ricklin et al. 2013）について、ＡＰの病原的役割が示されまたは仮定されている。

【0011】

非典型ＨＵＳおよびＣ３Ｇは、ＡＰ関連疾患の代表例である。ａＨＵＳにおいては、ＡＰの成分もしくは制御因子（Ｃ３、ＦＢ、ＦＩ、ＦＨ、ＦＨＲ１またはＭＣＰ）のいずれかの突然変異または抗ＦＨ抗体により、制御されない補体活性化が起こり、最終的にＣ５ｂ−９形成および内皮細胞損傷が起こる。それに伴い糸球体血栓性微小血管症（glomerular thrombotic microangiopathy）および急性腎不全が起こり、過去には、結果的に６０％を超える患者が死亡するかまたは致命的な腎不全を起こしている。Ｃ３Ｇは、５０％を超える患者において１０年以内に致命的な腎不全に発展するもので、糸球体基底膜の中または上に補体の沈着が見られる。Ｃ３ＧにおけるＡＰ活性化も、補体遺伝子、特にＦＨの突然変異によって、またはＣ３転換酵素に影響を及ぼす自己抗体（Ｃ３腎炎因子）よって引き起こされる（Loirat et al. 2011, Sethi et al. 2012）。

【0012】

補体関連疾患の治療オプション
ａＨＵＳまたはＣ３Ｇの治療における確立された治療オプションは限られており、その例には、血漿交換または新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）交換、免疫抑制処置、および腎移植があるが、基礎疾患の再発リスクは高い（Braun et al. 2005, Lu et al. 2012, Cataland et al. 2014, Masani et al. 2014）。補体を標的とする多くの治療法が現在研究段階にあるので、将来、治療オプションに加わるかもしれない（Wagner et al. 2010, Ricklin et al. 2013）。その中で、ヒト化モノクローナル抗Ｃ５抗体エクリズマブは、ＴＣＣ形成を抑制するもので、最近ａＨＵＳ治療用に承認された（Zimmerhackl et al. 2010）。Ｃ３Ｇに対しては、確立された治療法はまだ無い（Masani et al. 2014）。エクリズマブをＣ３Ｇ患者に適用した場合、部分奏功が一部の患者においてのみ得られている（Bomback et al. 2012）。

【0013】

終末補体エフェクター機能の抑制は、Ｃ５転換酵素によるＣ５分解を阻止すれば達成することができる。治療用モノクローナル抗体エクリズマブは、ヒトＣ５に結合し、それがＣ５転換酵素によって、強力なアナフィラトキシンであるＣ５ａ、および終末補体経路のイニシエーターであるＣ５ｂへと活性化されるのを阻止する（Parker et al. 2007）。このようにしてエクリズマブは、炎症シグナル伝達、およびＭＡＣ形成による細胞溶解を抑制するが、Ｃ３転換酵素、および制御されないＣ３ａ形成には影響しない。エクリズマブは、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）（Hillmen et al. 2006）およびａＨＵＳ（Zuber et al. 2012）を含む補体仲介疾患の治療において、臨床アウトカムの顕著な改善を示し、受け入れられている。

【0014】

Ｃ３は補体カスケードの中心的位置にあることから、治療的介入のための標的として注目されており、したがって、Ｃ３の段階に作用する抑制剤も設計されている。コンプスタチンは、前臨床試験中の、１３個のアミノ酸からなる小ペプチドである（Mastellos et al. 2015）。構造研究により、コンプスタチンはＣ３のβ鎖およびＣ３ｂに結合し、Ｃ３転換酵素との相互作用を阻害することがわかっている。コンプスタチンはこのようにしてＣ３活性化およびさらなるカスケード増幅を抑制し、下流の補体エフェクター形成を抑制する。コンプスタチンは、トロンビンのようなプロテアーゼによるＣ３分解も、「チックオーバー」によるＣ３のＣ３（Ｈ２Ｏ）への「活性化」も阻止せず（Ricklin et al. 2015）、インビトロで、および体外循環、敗血症およびＰＮＨを含む動物モデルにおいて、補体抑制における有効性を示している。もう１つのアプローチは、我々の、ＦＨまたは可溶性ＣＲ１のようなＲＣＡのナチュラルパネルを活用すること、あるいはそれらの有効性を、選択されたドメインモジュールを組み合わせることによって改善することである（Ricklin et al. 2013）。ＦＨ ＳＣＲ１−５およびＣＲ２ ＳＣＲ１−４を含むＴＴ３０は、既に補体仲介侵襲下にある部位に優先的に蓄積するように設計されている。ＴＴ３０は宿主細胞表面上で、Ｃ３ｂに結合する液相ＦＨの機能と、Ｃ３ｄに対するＣＲ２の相互作用とを兼ね備え、Ｃ３ｂおよびＣ３ｄと同時に相互作用する。ＴＴ３０は、ＡＭＤ、虚血／再潅流傷害およびＰＮＨのモデルにおいて顕著な改善を示している（Merle et al. 2015,）。ＳＣＲ１−４またはＳＣＲ１−５およびＳＣＲ１９−２０を含むmini-ＦＨ分子は、Ｃ３ｂおよびＣ３ｄと高い親和性で結合し、ａＨＵＳおよびＰＮＨのインビトロモデルにおいて天然ＦＨと比較して、より良好な効果を示す（Hebecker et al. 2013, Schmidt et al. 2013）。しかしながら、Ｃ３Ｇ様表現型を示すＦＨ欠損マウスにおいて、mini-ＦＨ、およびＴＴ３０のネズミアナログの、血漿第２経路制御に関する治療的効果は、半減期が短い関係で、比較的小さかった（Nichols et al. 2015, Ruseva et al. 2015）。

【0015】

エクリズマブは、ａＨＵＳおよびＰＮＨにおける適用のために承認されている。エクリズマブは、Ｃ５転換酵素によるＣ５分解を非特異的に阻止する。エクリズマブ治療を受けている患者は、重篤な感染性疾患、特に髄膜炎のような髄膜炎菌感染症を発症する恐れがある。一方、ＴＣＣ形成阻止は、Ｃ３転換酵素活性化に影響しない。したがって、治療を受けている患者において、アナフィラトキシンＣ３ａが持続的に生成し、また、エクリズマブ治療を受けているＣ３Ｇ患者において見られるように、Ｃ３分解産物が腎臓に持続的に沈着する可能性がある。さらに、エクリズマブ治療を受けた患者の腎生検において、エクリズマブ抗体の蓄積が見られている（Herlitz et al. 2012）。そのような蓄積物による長期的影響はこれまでに研究されていない。

【0016】

Ｃ５転換酵素のみの抑制はまた、すべてのＡＰ関連疾患に十分というわけではないかもしれない。エクリズマブのＣ３Ｇ患者における有効性に関する１つの症例報告によると、一部の患者において有益であったに過ぎず、それも多くは部分寛解であった（Bomback et al. 2012, Legendre et al. 2013）。

【0017】

コンプスタチン、mini-ＦＨまたはＴＴ３０のような新しい補体制御剤は、補体活性化に対しＣ３転換酵素段階で作用することを目指すものである。これらの開発は、前臨床段階での研究中である。エクリズマブおよび現在開発中の他の制御剤は、Ｃ５転換酵素またはＣ３転換酵素のいずれかを標的としている。

【発明の概要】

【0018】

本発明者は、補体カスケードの複数のエフェクター部位に同時に作用することにより（Ｃ３／Ｃ５転換酵素の抑制、Ｃ５分解およびＴＣＣ形成の抑制）、補体活性化を効果的に抑制しうることを見出した。これにより、ＡＰ（ＣＰ）ダウンレギュレーションとアナフィラトキシン放出阻止との間のファインチューニング（それにより望ましくない副作用が低減されうる）を可能とする、ＡＰ（およびＣＰ）活性のより効果的な制御が可能となる。

【0019】

本発明者はさらに、選択されたドメインモジュールで構成される制御剤中の二量体化モチーフが、１）多量体化複合体の形成によって制御活性を高めること、および、２）ＦＨＲ仲介脱制御に対して抵抗性であることを、見出した。

【0020】

したがって本発明は、下記の態様（１）〜（２４）に関する。
（１）抑制性Ｃ３転換酵素エフェクタードメインおよび抑制性Ｃ５転換酵素（Ｃ５結合）エフェクタードメインを含むポリペプチド。
（２）抑制性Ｃ３転換酵素エフェクタードメインが、解離促進（decay-accelerating）およびコファクター活性によって、Ｃ３転換酵素抑制をもたらす、上記項（１）のポリペプチド。
（３）ポリペプチドが解離促進およびコファクター活性を有する、上記項（１）または（２）のポリペプチド。
（４）抑制性Ｃ３転換酵素エフェクタードメインが、Ｈ因子（ＦＨ）の断片である、上記項（１）〜（３）のいずれかのポリペプチド。
（５）抑制性Ｃ３転換酵素エフェクタードメインが、ＦＨのショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）１−４を含むか、またはＦＨのＳＣＲ１−４からなる、上記項（１）〜（４）のいずれかのポリペプチド。
（６）抑制性Ｃ３転換酵素エフェクタードメインが、ＦＨＲ２のＳＣＲ１−４を含むか、またはＦＨＲ２のＳＣＲ１−４からなる、上記項（１）〜（３）のいずれかのポリペプチド。
（７）抑制性Ｃ５転換酵素エフェクタードメインが、Ｈ因子関連タンパク質１（ＦＨＲ１）の断片である、上記項（１）〜（６）のいずれかのポリペプチド。
（８）抑制性Ｃ５転換酵素エフェクタードメインが、ＦＨＲ１のＳＣＲ１およびＳＣＲ２を含むか、またはＦＨＲ１のＳＣＲ１およびＳＣＲ２からなる、上記項（１）〜（７）のいずれかのポリペプチド。
（９）ポリペプチドのＣ５への結合により、Ｃ５の活性化ならびにＣ５ａおよびＣ５ｂへの分解が抑制される、上記項（１）〜（８）のいずれかのポリペプチド。
（１０）細胞表面に結合することができるドメインをさらに含む、上記項（１）〜（９）のいずれかのポリペプチド。
（１１）細胞表面に結合することができるドメインが、ＦＨのＳＣＲ１９およびＳＣＲ２０を含む、上記項（１）〜（１０）のいずれかのポリペプチド。
（１２）ポリペプチドが多量体である、上記項（１）〜（１１）のいずれかのポリペプチド。
（１３）ＦＨＲ１のＳＣＲ１由来の少なくとも１つの二量体化モチーフを含む、上記項（１２）のポリペプチド。
（１４）ポリペプチドがＴＣＣ（Ｃ５ｂ−９）の形成を抑制することができる、上記項（１）〜（１３）のいずれかのポリペプチド。
（１５）ポリペプチドのＣ５ｂ−６への結合によりＴＣＣ形成が抑制される、上記項（１４）のポリペプチド。
（１６）構造：
Ａ−Ｂ−Ｃ
［ここで、
Ａは、上記項（１）〜（１５）のいずれかにおいて規定される抑制性Ｃ５転換酵素エフェクタードメインであり、
Ｂは、上記項（１）〜（１５）のいずれかにおいて規定される抑制性Ｃ３転換酵素エフェクタードメインであり、
Ｃは、存在しないか、または、上記項（１）〜（１５）のいずれかにおいて規定される、細胞表面に結合することができるドメインである］
を有するポリペプチド。
（１７）ＡとＢが直接に、またはリンカーを介して結合している、上記項（１６）のポリペプチド。
（１８）ＢとＣが直接に、またはリンカーを介して結合している、上記項（１６）または（１７）のポリペプチド。
（１９）補体系が関連または関与する障害の治療または予防において使用するための、上記項（１）〜（１８）のいずれかのポリペプチド。
（２０）補体系が関連または関与する障害が、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、血栓性微小血管症（ＴＭＡ）、Ｃ３腎症（Ｃ３Ｇ）、ＩｇＡ腎症、全身性エリテマトーデスの腎炎、移植片拒絶、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、感染性疾患、敗血症、ＳＩＲＳ、外傷性傷害、虚血／再灌流傷害、および心筋梗塞からなる群から選択される、上記項（１９）に記載される使用のためのポリペプチド。
（２１）上記項（１）〜（１８）のいずれかのポリペプチドをコードする核酸。
（２２）上記項（２１）の核酸を含むプラスミドまたはベクター。
（２３）上記項（２１）の核酸、または上記項（２２）のプラスミドもしくはベクターを含む細胞。
（２４）上記項（１）〜（１８）のいずれかのポリペプチドを製造する方法であって、上記項（２３）の細胞を、該ポリペプチドの発現を可能にする条件下に培地中で培養し、該細胞または該培地から該ポリペプチドを回収することを含む方法。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】ＭＦＨＲ１の構造および特徴付け。 Ａ）ＭＦＨＲ１の構造構成。ＭＦＨＲ１は、Ｎ末端においてＦＨＲ１のＳＣＲ１−２（ＦＨＲ１ １−２）がｈＦＨのＳＣＲ１−４およびＳＣＲ１９−２０（それぞれＦＨ１−４およびＦＨ１９−２０と称する）に結合したものからなる融合タンパク質である。精製手段としてペンタヒスチジンタグ（Ｎ末端）を用いた。ＦＨＲ１−２は二量体化モチーフを含み、Ｃ５転換酵素活性およびＭＡＣ形成を抑制する。ＦＨは、解離促進およびコファクター活性を有し（ＦＨ１−４）、Ｃ３ｂおよび細胞表面への結合部位を有する（ＦＨ１９−２０）。 Ｂ）バキュロウイルス感染ＳＦ９細胞の上清からＮｉ親和性およびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製したＭＦＨＲ１の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびCoomassie染色（左）または銀染色（右）。ＭＦＨＲ１は、還元条件下に、計算される分子量５８．６５ｋＤａに見られる。ＭＦＨＲ１の移動が非還元条件下により速いことは（Coomassie染色、右レーン）、ジスルフィド結合が存在することを示す。 Ｃ）ポリクローナル抗ヒトＨＦ、抗ＦＨ１−４またはモノクローナル抗Ｃ１８および抗ＦＨＲ１−２抗体を用いた免疫検出は、組換えＭＦＨＲ１（Ｉ）においてＦＨＲ１−２、ＦＨ１−４およびＦＨ２０が無傷の完全性を有することを示す。組換えＦＨ１−４；１９−２０（ＩＩ）、全長ＦＨＲ１（ＩＩＩ）、ＦＨ１−４（ＩＶ）またはヒト血漿由来ｈＦＨ（Ｖ）は対照である。

【図2】ＭＦＨＲ１はＣ３ｂに結合し、コファクター活性を示し、Ｃ３転換酵素を解離する。 Ａ）ＭＦＨＲ１とＣ３ｂとの相互作用を、ＥＬＩＳＡによって解析した。Ｃ３ｂをマイクロタイタープレート上に固定し、ＭＦＨＲ１またはｈＦＨの段階希釈物を加え、結合を、抗ＦＨ １次抗体およびＨＲＰ標識抗ヤギ２次抗体を用いて検出した。対照としてＢＳＡコーティングしたウェルを用いた。データは、ｎ＝３実験からの平均±ＳＤである。Ｃ３ｂに対するｈＦＨの最大結合を相対結合１００％と規定した。 Ｂ）ＭＦＨＲ１はＣ３ｂＢｂ（Ｃ３転換酵素）複合体を効果的に解離する。マイクロタイタープレートにおいてＣ３ｂ、Ｂ因子（ＦＢ）およびＤ因子（ＦＤ）の存在下に転換酵素を形成し、ｈＦＨまたはＭＦＨＲ１を加えて３７℃でインキュベートした。インタクトＣ３ｂＢｂ、および該複合体の解離を、ＦＢの相対量によって測定した。対照ウェル（Ｃ３ｂ＋ＦＢ＋ＦＤ、制御因子なし）のＯＤ４５０値を１００％と規定した。ＦＤを加えないものを陰性対照とした。データは、ｎ＝３実験からの平均±ＳＤである。 Ｃ）ＭＦＨＲ１はコファクター活性を示す。コファクター試験を行うのに、Ｃ３ｂおよびＩ因子（ＦＩ）を、さまざまな濃度のＭＦＨＲ１またはｈＦＨ（５〜２５０ｎＭ）と共に、３７℃で３０分間インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびCoomassieブルー染色によって、α鎖の切断、ならびにα’６８断片、α’４３断片、α’４６断片を可視化した。 Ｄ）コファクター活性を定量するために、Ｃ３ｂ α鎖のバンド強度をデンシトメトリーにより測定し、インタクトＣ３ｂ α鎖をβ鎖に対して正規化し、１００％と規定した。データは、ｎ＝５実験からの平均値±ＳＤである。

【図3】ＭＦＨＲ１はＣ５に結合し、Ｃ５転換酵素／Ｃ５分解およびＭＡＣ形成の抑制によって終末経路の活性化を制御する。 Ａ）ＥＬＩＳＡによって測定されるとおり、ＭＦＨＲ１はＣ５に結合する。等モル量のＭＦＨＲ１、全長ＦＨＲ１、ｈＦＨまたはＢＳＡ（１３３ｎＭ）をＮｕｎｃプレートに固定し、さまざまな濃度（１０、２０、４０μｇ／ｍｌ）のＣ５と共にインキュベートした。モノクローナルＣ５抗体およびＨＲＰ標識２次抗体を用いて結合を検出した。データは、ｎ＝３実験からの平均±ＳＤである。 Ｂ）ＭＦＨＲ１はＣ５分解を阻止することによりＡＰ活性化を抑制する。Ｂ因子（ＦＢ）およびＤ因子（ＦＤ）を加えて、ヒツジ赤血球（ｓＥ）上にコブラ毒因子（ＣＶＦ）Ｃ５転換酵素を形成させた。Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９成分を加えて溶血を誘導し、４１４ｎｍにおいて検出した。Ｃ５をＦＨＲ１、ＭＦＨＲ１またはエクリズマブと予めインキュベートした場合、溶血は顕著に抑制されたが、ｈＦＨまたはＢＳＡは抑制を示さなかった。ＣＶＦ転換酵素なしの対照（−ＦＢ／ＦＤ）またはＣ５なしの対照は、溶血を誘導しなかった。 Ｃ）ＭＦＨＲ１はｓＥ上の膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成を抑制する。ｓＥ上のＭＡＣ形成を、Ｃ５ｂ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９成分とのインキュベーションにより誘導し、細胞の溶血により検出した。Ｃ５ｂ６をＭＦＨＲ１、ＦＨＲ１またはエクリズマブと予めインキュベートした場合、ｈＦＨまたはＢＳＡの場合と比較して、溶血は顕著に抑制された。Ｃ９なしのサンプルは、溶血を誘導しなかった。 ＢおよびＣにおいて、制御因子なし（ｗ／ｏ）の対照を１００％と規定した。データはいずれも、３実験の平均値±ＳＤである。＊＊＊は、ボンフェローニの多重比較検定による一元ＡＮＯＶＡにより、ｗ／ｏ対照に対しＰ＜０．００１。

【図4】ＭＦＨＲ１は補体第２経路（ＡＰ）および古典的経路（ＣＰ）の活性化を抑制し、ヒト血清中のアナフィラトキシン放出を、臨床的に意義のあるレベルで低減する。 ヒト血清にＭＦＨＲ１、ｈＦＨ、ＦＨＲ１またはエクリズマブを加えて、Ａ）Ｃ３ｂ沈着、またはＢ）Ｃ５ｂ−９複合体形成を、特定の緩衝条件を用いてＬＰＳにより第２経路（ＡＰ）活性化を誘導した後に測定した。 Ａ）抗ヒトＣ３およびＨＲＰ標識２次抗体を用いるＥＬＩＳＡにより測定されたとおり、ＭＦＨＲ１は、表面Ｃ３ｂ沈着を、ｈＦＨよりも効果的に低減する。予想通り、エクリズマブはＣ３ｂ沈着を抑制しなかった。 Ｂ）補体ＡＰ−ＥＬＩＳＡ（WIESLAB（登録商標））により測定されたとおり、ＭＦＨＲ１は、Ｃ５ｂ−９を、ｈＦＨまたはエクリズマブよりも効果的に抑制する。各実験において無処置対照血清を１００％と規定した。データは、４名の健康なドナーの血清を用いるｎ＝４アッセイからの単一の値±ＳＥＭである。さらに、特定のＣ３ａ、Ｃ５ａＥＬＩＳＡ（Quidel）を用いた、ＡＰ活性化血清の上清のアッセイにより示されるとおり、ＭＦＨＲ１は、Ｃ）Ｃ３ａ、およびＤ）Ｃ５ａの生成を効果的に抑制する（ｎ＝３アッセイ±ＳＥＭ）。 Ｅ）ＭＦＨＲ１による古典的経路（ＣＰ）抑制を、補体ＣＰ−ＥＬＩＳＡ（WIESLAB（登録商標）を用いて試験した。各実験において無処置対照血清のＡＰ活性を１００％と規定した。データは、３名の健康なドナーの血清を用いるｎ＝３アッセイからの単一の値±ＳＥＭである。計算されたＩＣ５０値を表１に示す。

【図5】ヒト血清中におけるＭＦＨＲ１のＡＰ制御活性は、多量体複合体によって高められる。 Ａ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、血清血漿由来ＦＨ（ｈＦＨ）およびＭＦＨＲ１のサイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200 10/300 GL）。ＢＳＡ混合物の３つの構成体、すなわちＩ．ＢＳＡ三量体（１９８ｋＤａ、１０．３５ｍｌ）、ＩＩ．ＢＳＡ二量体（１３２ｋＤａ、１１．４５ｍｌ）およびＩＩＩ．ＢＳＡ単量体（６６ｋＤａ、１３．４ｍｌ）は、分子量に応じた異なる保持容量を示した。同じ条件で、ｈＦＨ（９．３ｍｌ）は、ピークのタンパク質種は約３００ｋＤａの二量体タンパク質として移動することを示した。ＭＦＨＲ１は、保持容積１０ｍｌでピーク（Ｉ）を示し、ＭＦＨＲ１は液相中を主に多量体形態で移動することが示された。理論的な三量体（ＩＩ、１０．７）、二量体（ＩＩＩ、１１．４）、中間形態（ＩＶ〜Ｖ）または単量体（ＩＶ、１３．５）ＭＦＨＲ１が、溶出プロファイルに示される。 Ｂ）ＡにおいてＳＥＣカラムから溶出したＭＦＨＲ１の解析。画分からのタンパク質２０μｌを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用し、銀染色した。 Ｃ）その後、単一の、またはプールしたＭＦＨＲ１ ＳＥＣ画分を１０ｎＭでヒト血清に加え、ＬＰＳコーティングしたウェルにおいて、ＡＰ特異的緩衝条件でのインキュベーションにより、ＡＰ活性化を誘導した。ＭＦＨＲ１画分の制御活性を、Ｃ５ｂ−９複合体形成を測定することにより解析した。無処置対照血清のＡＰ活性を１００％と規定した。

【図6】ＭＦＨＲ１はＦＨＲ１およびＦＨＲ５による脱制御に抵抗性である。 Ａ）Ｃ３ｂに対するＭＦＨＲ１の結合は、ＦＨＲ１またはＦＨＲ５により競合的に阻害されない。ＭＦＨＲ１（三角形）またはｈＦＨ（四角形）（試験タンパク質と称する）を、単独で、または等モル量ないし１００倍過剰の範囲のさまざまな濃度のＦＨＲ１（黒色線）またはＦＨＲ５（灰色線）と共に、Ｃ３ｂコーティングしたマイクロタイタープレートに加えた。Ｃ３ｂに対するＭＦＨＲ１またはｈＦＨの結合を、特異的な抗体を用いて検出した。３アッセイの平均とＳＤを示す。 Ｂ）ＭＦＨＲ１が仲介する、血清誘導ＡＰ活性化からのヒツジ赤血球（ｓＥ）保護は、ＦＨＲ５により減弱されないが、ｈＦＨのＡＰ制御作用はＦＨＲ５により用量依存的な脱制御を受けた。ＭＦＨＲ１またはｈＦＨを、ｓＥのＦＨ除去血清誘導溶解を５０％に低下する濃度で使用し、等モル量ないし１００倍過剰の範囲のさまざまな濃度のＦＨＲ５を加えた。溶血を４１４ｎｍで測定し、データを、ＦＨＲ５を加えなかったサンプルに対する相対的な増加として表した。データは、ｎ＝３アッセイからの単一の値±ＳＥＭである。

【図7】ＭＦＨＲ１は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）およびＣ３腎症（Ｃ３Ｇ）の治療モデルにおいて、制御されない補体活性化を低減する。 Ａ）ＦＨの突然変異は家族性ａＨＵＳの原因であり得、患者血清をヒツジ赤血球（ｓＥ）に加えた場合、患者血清における補体制御欠如が溶血を仲介する。ａＨＵＳ患者（pat. #1 FH R1215Q (Gerber et al. 2003)）の血清に加えられたＭＦＨＲ１は、エクリズマブよりも効果的に、補体仲介ＭＡＣ形成および溶血からｓＥを保護する。データは、ｎ＝３実験からの平均値±ＳＤである。 Ｂ）Ｃ３Ｇにおいては通常、過剰な補体活性化により血清Ｃ３が増加するので、制御されない補体活性化の抑制がＣ３Ｇの新たな治療オプションとなる可能性がある。Ｃ３Ｎｅｐｈ陽性患者の血清に加えられたＭＦＨＲ１は、ＬＰＳ刺激によるＡＰ活性化およびＣ５ｂ−９形成を効果的に抑制する。

【図8】ＭＦＨＲ１は、Ｃ３腎症（Ｃ３Ｇ）における制御されない補体活性化に対し、インビボで顕著な治療的有効性を示す。 Ａ〜Ｃ）ＦＨ欠損マウス（ＦＨ−／−）は、ＡＰの過剰活性化により、異常な糸球体Ｃ３沈着、および低い血清Ｃ３レベルを示し、したがって、補体標的薬物の治療的有効性を試験するためのＣ３Ｇモデルとして有用である。 Ａ）ＭＦＨＲ１は、０．５ｍｇ ＭＦＨＲ１の腹腔内注射後の示される時点においてＣ３血清レベルを、ｈＦＨに匹敵するレベルで顕著に高める。個々のデータポイントをプロットし、平均値をバーで示す。 Ｂ）ＭＦＨＲ１は異常な糸球体Ｃ３沈着を顕著に低減する。ＭＦＨＲ１、ｈＦＨまたはＰＢＳで処置したＦＨ−／−マウスの、投与２４時間後の糸球体Ｃ３蛍光強度を測定した。無処置野生型マウスの切片を陰性対照として用いた。任意蛍光単位（ＡＦＵ）で表した個々のデータポイントをプロットし、平均±ＳＤをバーで示す。 Ｃ）糸球体Ｃ３沈着の画像。スケールバー：５０μｍ。＊＊＊は、ボンフェローニ検定による一元ＡＮＯＶＡにより、ＰＢＳ群に対しＰ＜０．００１。

【発明を実施するための形態】

【0022】

詳細な説明
本発明は、抑制性Ｃ３転換酵素エフェクタードメイン、抑制性Ｃ５転換酵素エフェクタードメイン（Ｃ５結合ドメイン）、および場合により抑制性ＴＣＣ形成ドメインおよび／または二量体化モチーフを含むポリペプチドに関する。

【0023】

本発明に関し「抑制性Ｃ３転換酵素エフェクタードメイン」は、Ｃ３転換酵素を抑制すること、すなわちＣ３転換酵素形成を抑制することのできるアミノ酸配列を指す。Ｃ３転換酵素の抑制は典型的には、対照と比較して、補体第２経路活性化後にＣ３ｂ沈着が抑制される場合または低下したＣ３ａ生成がある場合に存在する。Ｃ３ｂおよびＣ３ａの生成は、図４Ａまたは図４Ｃにそれぞれ示すように、アッセイにおいて測定することができる。別の一態様においては、抑制性Ｃ３転換酵素エフェクタードメインは、Ｃ３転換酵素解離促進活性およびコファクター活性を有する。Ｃ３転換酵素解離促進活性は、図２Ｂに示すように、アッセイにおいて測定することができる。コファクター活性は、図２Ｃ〜２Ｄに示すように、アッセイにおいて測定することができる。

【0024】

いくつかの態様においては、抑制性Ｃ３転換酵素エフェクタードメインは、ＦＨの断片である。本発明において、ＦＨは、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するタンパク質を意味する。ＦＨの、配列番号１に示すアミノ酸配列とのアミノ酸配列同一性は、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％である。最も好ましくは、ＦＨは、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むか、または配列番号１に示すアミノ酸配列からなる。

【0025】

２つのアミノ酸配列の間の配列比較およびパーセント同一性（およびパーセント類似性）決定は、任意の適当なプログラムを用いて、例えばプログラム「BLAST 2 SEQUENCES (blastp)」（Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174, 247-250）を、Matrix BLOSUM62; Open gap 11 and extension gap 1 penalties; gap x_dropoff50; expect 10.0 word size 3; Filter: noneのパラメータで用いて行うことができる。

【0026】

Ｃ３転換酵素エフェクタードメインは、好ましくは、ＦＨのＳＣＲ１−４を含むか、またはＦＨのＳＣＲ１−４からなる。一態様においては、Ｃ３転換酵素エフェクタードメインは、配列番号１のアミノ酸１９〜２６４を含むか、または配列番号１のアミノ酸１９〜２６４からなる。

【0027】

他の一態様においては、抑制性Ｃ３転換酵素エフェクタードメインは、ＦＨＲ２の断片である。本発明において、ＦＨＲ２は、配列番号３に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するタンパク質を意味する。ＦＨＲ２の、配列番号３に示すアミノ酸配列とのアミノ酸配列同一性は、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％である。最も好ましくは、ＦＨＲ２は、配列番号３に示すアミノ酸配列を含むか、または配列番号３に示すアミノ酸配列からなる。

【0028】

Ｃ３転換酵素エフェクタードメインは、好ましくは、ＦＨＲ２のＳＣＲ１−４を含むか、またはＦＨのＳＣＲ１−４からなりうる。一態様においては、Ｃ３転換酵素エフェクタードメインは、配列番号３のアミノ酸２２〜２６８を含むか、または配列番号３のアミノ酸２２〜２６８からなる。

【0029】

本発明に関し「抑制性Ｃ５転換酵素エフェクタードメイン」は、Ｃ５転換酵素を抑制することのできるアミノ酸配列を指す。Ｃ５転換酵素の抑制（Ｃ５分解の阻止）は典型的には、低下したＣ５ａ生成がある場合に存在する。Ｃ５ａの生成は、図４Ｄに示すように、アッセイにおいて測定することができる。他の１つの実験アプローチにおいては、抑制性エフェクタードメインのＣ５への結合が示される（図３Ａ）。これにより、実験用Ｃ５転換酵素によるＣ５のＣ５ａおよびＣ５ｂへの分解が抑制され、ＭＡＣ形成および細胞溶解が抑制される（図３Ｂ）。

【0030】

いくつかの態様においては、抑制性Ｃ５転換酵素エフェクタードメインは、ＦＨＲ１の断片である。本発明において、ＦＨＲ１は、配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するタンパク質を意味する。ＦＨＲ１の、配列番号２に示すアミノ酸配列とのアミノ酸配列同一性は、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％である。最も好ましくは、ＦＨＲ１は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むか、または配列番号２に示すアミノ酸配列からなる。ＦＨＲ１のＳＣＲ１−２は、Ｃ５に結合し、Ｃ５転換酵素によるＣ５の分解を阻止するほか、図５に示すようにＭＦＨＲ１の多量体化（該ポリペプチドの機能を増幅する）をもたらす二量体化モチーフを含む。ＦＨＲ１のＳＣＲ１−２は、Ｃ５転換酵素を抑制するほか、Ｃ５ｂ−６を結合することによりＭＡＣ形成を阻止する（図３Ｃ）。

【0031】

抑制性Ｃ５転換酵素エフェクタードメインは、好ましくは、ＦＨＲ１のＳＣＲ１およびＳＣＲ２を含むか、またはＦＨＲ１のＳＣＲ１およびＳＣＲ２からなる。一態様においては、Ｃ５転換酵素エフェクタードメインは、配列番号２のアミノ酸２２〜１４２を含むか、または配列番号２のアミノ酸２２〜１４２からなる。

【0032】

抑制性Ｃ３転換酵素エフェクタードメイン、抑制性Ｃ５転換酵素および抑制性ＭＡＣ形成エフェクタードメインは、直接に、またはリンカーを介して融合しうる。リンカーは、ペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーでありうる。リンカーは、好ましくは１〜１００個のアミノ酸、より好ましくは１〜５０個のアミノ酸、より好ましくは１〜２０個のアミノ酸、より好ましくは１〜１０個のアミノ酸、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸からなる。リンカー配列は通常、Ｃ３転換酵素エフェクタードメインのアミノ酸配列および抑制性Ｃ５転換酵素エフェクタードメインのアミノ酸配列に対して異種である。

【0033】

本発明のポリペプチドは、構造：Ａ−Ｂを有しうる。この構造中、Ａは、本発明において規定されるＣ３転換酵素エフェクタードメインであり、Ｂは、本発明において規定されるＣ５転換酵素エフェクタードメインである。他の一態様においては、本発明のポリペプチドは構造：Ｂ−Ａを有し得、この構造中、Ａは、本発明において規定されるＣ３転換酵素エフェクタードメインであり、Ｂは、本発明において規定されるＣ５転換酵素エフェクタードメインである。

【0034】

ある特定の態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または該アミノ酸配列からなる。

【0035】

いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、細胞表面結合特性を有する第３のドメインを含む。好ましくは、第３のドメインはＦＨの断片を含むか、またはＦＨの断片からなる。より好ましくは、第３のドメインはＦＨのＳＣＲ１９およびＳＣＲ２０を含むか、またはＦＨのＳＣＲ１９およびＳＣＲ２０からなる。一態様において、第３のドメインは、配列番号１のアミノ酸１１０７−１２３０を含むか、または配列番号１のアミノ酸１１０７−１２３０からなる。

【0036】

本発明のポリペプチドは、構造：Ａ−Ｂ−Ｃを有しうる。この構造中、Ａは、本発明において規定されるＣ５転換酵素エフェクタードメインであり、Ｂは、本発明において規定されるＣ３転換酵素エフェクタードメインであり、Ｃは、本発明において規定される第３のドメインである。他の一態様においては、本発明のポリペプチドは、構造：Ａ−Ｃ−Ｂ、Ｂ−Ａ−Ｃ、Ｂ−Ｃ−Ａ、Ｃ−Ａ−ＢまたはＣ−Ｂ−Ａを有し得、ここで、Ａ、ＢおよびＣの意味は本発明において規定されるとおりである。記号Ａ、ＢおよびＣの順序はポリペプチドのＮ末端からＣ末端への配列を示し、例えばＡ−Ｂ−ＣにおいてはドメインＡはＮ末端に、ドメインＣはＣ末端に存在する。

【0037】

第３のドメインは、Ｃ３転換酵素エフェクタードメインおよび／またはＣ５エフェクタードメインおよびＭＡＣエフェクタードメインに、直接に、または先に規定したリンカーを介して融合しうる。

【0038】

ある特定の態様において、本発明のポリペプチドは配列番号８に示すアミノ酸配列を含むか、または配列番号８に示すアミノ酸配列からなる。他の一態様において、本発明のポリペプチドは配列番号９に示すアミノ酸配列を含むか、または配列番号９に示すアミノ酸配列からなる。

【0039】

本発明のポリペプチドは、補体系に関連および／または関与する障害を治療または予防するために使用することができる。そのような障害は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、血栓性微小血管症（ＴＭＡ）、Ｃ３腎症（Ｃ３Ｇ）、ＩｇＡ腎症、全身性エリテマトーデスの腎炎、腎移植患者における液性拒絶、虚血−再灌流後（例えば腎移植後）の組織傷害、過剰な補体活性化、組織傷害（例えば血液透析下のもの）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、感染性疾患、敗血症、ＳＩＲＳ、外傷性傷害、心筋梗塞、さらなる局所的または全身的傷害の原因である、補体活性化を伴う疾患および状態を含むが、それに限定されない。

【0040】

好ましくは、治療または予防する障害は、ａＨＵＳ、ＴＭＡ、Ｃ３Ｇ、ＩｇＡ腎症、全身性エリテマトーデスの腎炎、ＰＮＨおよびＡＭＤからなる群から選択される。

【0041】

本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供し、これは宿主細胞における発現のために、適当なプラスミドおよびベクターに挿入しうる。

【0042】

発現させるポリペプチドをコードする核酸は、当分野で知られた方法に従って調製することができる。ＦＨ（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＭ ００１８６．３）、ＦＨＲ１（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＭ ００２１１３．２）およびＦＨＲ２（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＰ ００５６５７．１）のｃＤＮＡ配列に基づいて、前記ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを設計および生成することができる。

【0043】

タンパク質発現のために、ｃＤＮＡが、発現プラスミドに正しい向きで挿入された完全なオープンリーディングフレームを含むコンストラクトを使用しうる。典型的な発現ベクターは、プラスミド含有細胞において、挿入された核酸に対応するｍＲＮＡの大量合成を指示するプロモーターを含む。典型的な発現ベクターはまた、宿主生物内における自律複製を可能にする複製起点配列、および合成されたｍＲＮＡの翻訳効率を高める配列も含む。例えばウイルスの調節エレメント（例えばEpstein Barr Virusゲノム由来のＯｒｉＰ配列）を用いることにより、安定な長期ベクターを自由複製体として維持しうる。ベクターをゲノムＤＮＡに組み込んだ細胞系を生成することもでき、それによって遺伝子産物を継続的に産生することができる。通常、提供される細胞は、ポリペプチドをコードする核酸を適当な宿主細胞に導入することによって得られる。

【0044】

細胞培養およびポリペプチド発現が可能な任意の宿主細胞を、本発明に従って使用しうる。いくつかの態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。他のいくつかの態様においては、宿主細胞は昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）またはphyscomitrellaの細胞（例えばヒメツリガネゴケ（physcomitrella patens））である。宿主細胞は細菌細胞であってもよい。

【0045】

本発明に従って発現させた糖タンパク質を、単離および／または精製することが通常望ましい。いくつかの態様においては、精製工程の第１ステップとして、発現糖タンパク質を媒体中に放出させ、細胞および他の固形物を例えば遠心分離または濾過により除去しうる。

【0046】

発現ポリペプチドを、クロマトグラフィー（イオン交換、アフィニティ、サイズ排除、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲル濾過、遠心分離、もしくは溶解度差、エタノール沈殿を包含するがそれに限定されない標準的方法によって、および／または他の任意の利用可能なタンパク質精製方法によって、単離および精製しうる（例えば、Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins, S. J. and Hames, B. D. (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; およびDeutscher, M. P., Simon, M. I., Abelson, J. N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol. 182), Academic Press, 1997（いずれも参照により本書の一部とする）を参照されたい）。

【0047】

当業者は、精製方法は、精製するポリペプチドの性質、ポリペプチドを発現させた細胞の性質、および／または細胞を培養した培地の組成に応じて異なり得ることを理解しうる。

【0048】

本発明のもう一つの側面は、本発明のポリペプチド、および薬学的に許容しうる賦形剤または担体を含む医薬組成物である。医薬組成物は、ポリペプチドを、対象において補体関連障害を治療または予防するのに有効な量で含みうる。

【0049】

本明細書に記載される方法に適当な本発明のポリペプチドの医薬製剤は、所望の純度を有する糖タンパク質を、当分野で通常用いられる任意の薬学的に許容しうる担体、賦形剤または安定剤（本明細書において、これらを総称して「担体」という）、すなわち緩衝剤、安定剤、保存剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤および他のさまざまな添加剤と混合することにより、貯蔵のために凍結乾燥製剤または水溶液として、調製しうる（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition（Osol, ed. 1980）を参照されたい）。そのような添加剤は、使用される用量および濃度で被投与体にとって無毒でなければならない。

【0050】

本発明の医薬組成物は、経口、舌下、鼻内、眼内、直腸、経皮、粘膜、局所または非経口投与用に調製しうる。非経口投与は、皮内、皮下、筋肉内（i.m.）、静脈内（i.v.）、腹腔内（i.p.）、動脈内、骨髄内、心臓内、関節内（関節）、滑膜内、頭蓋内、髄腔内およびくも膜下（髄液内）注射または注入、好ましくは、マウスにおいては腹腔内（i.p.）注射、ヒトにおいては静脈内（i.v.）を包含しうる。そのような投与のために、薬物製剤の非経口注射または注入に適する任意の装置を使用しうる。例えば、医薬組成物を滅菌プレフィルドシリンジに充填しうる。

【0051】

本発明の可溶性ポリペプチドの有効な用量、総投与回数および処置期間の決定は、当業者がその能力の範囲内で十分行うことができ、標準的な用量漸増試験を用いて行うことができる。本発明の可溶性ポリペプチドの投与量は、投与する可溶性ポリペプチド、被投与体、および障害の種類および重篤度、被投与体の健康状態、治療レジメン（例えば、他の治療剤を併用するかどうか）、ならびに選択した投与経路によって異なり得、当業者は適当な用量を容易に決定することができる。

【0052】

アミノ酸配列一覧：

【実施例】

【0053】

ＭＦＨＲ１は、Ｎ末端ＦＨ制御活性ドメインＳＣＲ１−４（Ｃ３／Ｃ５転換酵素解離促進およびコファクター活性）とＦＨのＣ末端表面認識ドメイン（ＳＣＲ１９−２０）にＦＨＲ１のＮ末端ドメイン（ＳＣＲ１−２）が組み合わせられたものからなる（図１）。ＦＨＲ１は、唯一知られる内因性の、Ｃ５転換酵素の補体制御因子である。ＦＨＲ１ ＳＣＲ１−２がＣ５に結合し、それによりＣ５ａおよびＣ５ｂへのＣ５の分解を阻止する。ＦＨＲ１ ＳＣＲ１−２はさらに、Ｃ５ｂ６に結合することによって、終末補体経路を抑制する。上記ドメインが組み合わせられることによって、補体活性化がカスケードの複数のエフェクター部位で抑制される（Ｃ３ｂ分解、Ｃ３／Ｃ５転換酵素抑制、Ｃ５分解およびＣ５ｂ−９形成の阻止）。それにより、ＡＰ関連疾患を進行させるように作用すると考えられるアナフィラトキシンＣ３ａおよびＣ５ａの生成の抑制ももたらされる。

【0054】

ＭＦＨＲ１を作成するために、上記ＦＨおよびＦＨＲ１ドメインの求められる配列を含むｃＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、その後、セルフプライミング・オーバーラップＰＣＲによって結合させた。ＤＮＡをpFastbac gp67-10xHisバキュロ発現ベクターにクローニングし、ＳＦ９昆虫細胞においてＭＦＨＲ１を発現させた。ＭＦＨＲ１のアミノ酸配列を配列番号８に示す。このタンパク質を、アフィニティクロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびCommassieまたは銀染色ゲルは、ＭＦＨＲ１の計算される分子量に相当する５８．６５ｋＤａに単一のバンドを示した（図１Ｂ）。ＦＨＲ１ ＳＣＲ１−２およびＦＨ ＳＣＲ１−４およびＳＣＲ１９−２０がうまく融合されたことが、ＦＨＲ１由来ドメインＳＣＲ１−２の検出のための特異的な抗体、ＦＨ由来ドメイン１−４の検出のための抗ＦＨ１−４抗体、ＦＨ由来ドメイン２０の検出のためのモノクローナル抗Ｃ１８抗体、およびポリクローナルＦＨ抗体を用いる免疫検出により確認された（図１Ｃ）。

【0055】

ＭＦＨＲ１は、Ｃ３ｂに結合し（図２Ａ）、Ｃ３転換酵素を解離させ（図２Ｂ）、コファクター活性を示す（図２Ｃ〜２Ｄ）。血漿精製ＦＨ（ＦＨplasma）とは対照的に、ＦＨＲ１およびＭＦＨＲ１は、ＦＨＲ１由来ＳＣＲ１−２に仲介されるＣ５結合能を示す（図３Ａ）。ＦＨＲ１およびＭＦＨＲ１は、Ｃ５転換酵素／Ｃ５分解の抑制（図３Ｂ）およびＭＡＣ形成の抑制（図３Ｃ）により、終末経路活性化を制御する。このことは、本発明の新規融合タンパク質ＭＦＨＲ１は、ＦＨ（図２）およびＦＨＲ１（図３）の補体制御活性を維持するにとどまらず、その両方の性質を融合することを示す。ＭＦＨＲ１は、ヒツジ赤血球のａＨＵＳ血清誘発溶血をエクリズマブよりも効果的に抑制し、このことは、制御活性だけでなく、ＦＨドメイン１９−２０に由来する表面認識もＭＦＨＲ１において維持されていることを示している（図７Ａ）。ＭＦＨＲ１の高い活性は、ＥＬＩＳＡに基づく補体活性アッセイにおいてさらに強調された。ＭＦＨＲ１をスパイクしたヒト血清において、補体カスケードの活性化に続き、ＡＰ制御活性を、Ｃ３ｂ沈着（図４Ａ）またはＣ５ｂ６−９（図４Ｂ）の測定によって測定し、ＣＰ制御活性を、WIESLAB（登録商標）CP-ELISAを用いるＣ５ｂ６−９の測定によって測定した（図４Ｅ）。健常ヒト血清（ＮＨＳ）またはＣ３Ｇ患者（再発患者、Ｃ３Ｎｅｆ自己抗体ポジティブ）の血清にＭＦＨＲ１を添加すると、補体活性化は用量依存的に効果的に抑制される（図４Ａ〜４Ｂ、４Ｅ、７Ｂ）。溶血アッセイにおけるように、ＭＦＨＲ１は、ｈＦＨ（表１）、エクリズマブ、および前臨床段階で試験されている関連する他の抑制剤よりも、モル基準で高い抑制効果を示した（表１にＩＣ５０値を示す）。さらに本発明者は、ＭＦＨＲ１は、ヒト血清においてＣ３ａ（図４Ｃ）およびＣ５ａ（図４Ｄ）の生成を、エクリズマブよりも効果的に抑制することを示す。

【0056】

二量体化モチーフ（ＦＨＲ１のＳＣＲ１により仲介される）の使用は、ＭＦＨＲ１の多量体複合体の形成を促進する。本発明者は、多量体複合体は制御活性がより高いことを示したが、これは、局部的に制御剤濃度を高めることによるものと考えられる（図５）。さらに、ＭＦＨＲ１はＦＨＲ仲介脱制御に対し抵抗性である（図６Ａ〜Ｂ）。

【0057】

ＭＦＨＲ１の治療剤としての有用性は、治療法の２つのインビトロモデル、およびネズミのＣ３Ｇインビボモデルにおいて証明された。ａＨＵＳ（図７Ａ）およびＣ３Ｇ（図７Ｂ）の患者の血清において、ＭＦＨＲ１の添加は、制御されない補体活性化を効果的に低減させる。Ｃ３Ｇ様表現型を示すＦＨ−／−欠損マウスにおいて、ＭＦＨＲ１の投与により、速やかに血漿Ｃ３レベルが正常化され（図８Ａ）、糸球体Ｃ３沈着が解消された（図８Ｂ〜Ｃ）。

【0058】

【表1】

【0059】

本発明者による結果は全体として、補体活性化を、補体カスケードの複数のエフェクター部位において(Ｃ３ｂ分解、Ｃ３／Ｃ５転換酵素阻害、Ｃ５分解およびＴＣＣ形成の阻止)、同時に、また、多量体化能によって（またはその両方で）、抑制する複合的なアプローチは、補体活性化の制御剤を改善するための「従来の」アプローチと比較して、いくつもの利点を有することを示している。ＦＨおよびＦＨＲ１由来の異なる機能性ペプチドを含むＭＦＨＲ１は、Ｃ３およびＣ５転換酵素の段階で、また、終末補体経路を抑制することにより、補体活性化を制御し、ＦＨもしくはエクリズマブまたは他の既知の臨床的に意味のある補体抑制剤よりも有効でありうる。特に注目すべきことに、ＭＦＨＲ１は、ＦＨＲ１およびＦＨＲ５による脱制御に対する抵抗性が高く、その制御効果は多量体複合体形成によって増強されうる。

【0060】

参考文献

【0061】

【0062】

【0063】

【0064】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]