特許 6771644 微生物発酵によるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及び／又はＤ−グルコサミン塩の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6771644

(24)【登録日】2020年10月1日

(45)【発行日】2020年10月21日

(54)【発明の名称】微生物発酵によるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及び／又はＤ−グルコサミン塩の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/31 20060101AFI20201012BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20201012BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20201012BHJP

   C12P 19/26 20060101ALI20201012BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20201012BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20201012BHJP

   C07K 14/805 20060101ALI20201012BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20201012BHJP

   C12N 9/00 20060101ALN20201012BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20201012BHJP

   C12N 15/61 20060101ALN20201012BHJP

   C12N 15/52 20060101ALN20201012BHJP

   C12N 9/90 20060101ALN20201012BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/31ZNA

   C12N1/15

   C12N1/21

   C12P19/26

   C12N15/63 Z

   C12N1/19

   C07K14/805

   !C12N9/10

   !C12N9/00

   !C12N15/54

   !C12N15/61

   !C12N15/52 Z

   !C12N9/90

【請求項の数】20

【全頁数】128

(21)【出願番号】特願2019-503617(P2019-503617)

(86)(22)【出願日】2017年4月14日

(65)【公表番号】特表2019-517275(P2019-517275A)

(43)【公表日】2019年6月24日

(86)【国際出願番号】CN2017080649

(87)【国際公開番号】WO2017174036

(87)【国際公開日】20171012

【審査請求日】2018年12月4日

(31)【優先権主張番号】201710217601.1

(32)【優先日】2017年4月5日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】518353810

【氏名又は名称】孫 ▲ラン▼

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100132883

【弁理士】

【氏名又は名称】森川 泰司

(74)【代理人】

【識別番号】100148633

【弁理士】

【氏名又は名称】桜田 圭

(74)【代理人】

【識別番号】100147924

【弁理士】

【氏名又は名称】美恵 英樹

(72)【発明者】

【氏名】孫 ▲ラン▼

【審査官】 平林 由利子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許第０８７４１６０３（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 中国特許出願公開第１０５３４８３８４（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０１１３４９６７（ＣＮ，Ａ）

【文献】 FEBS Letters，２００８年，582，3494-3500

【文献】 Bioresource Technology，２０１１年，102，8123-8129

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ｃ１２Ｎ ９／００− ９／９９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法であって、次を含む方法；
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変を含む；及び
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを収集する。

【請求項2】

前記微生物は、少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）をコードする核酸配列の組換え核酸分子によって改変され、ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）をコードする核酸配列は少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）の活性を向上させる遺伝子改変を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記遺伝子改変は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に対応する、４５位のメチオニンからロイシンへの置換、８６位のシステインからグリシンへの置換および９５位のチロシンからセリンへの置換の１種または複数種を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）をコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４である、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１のアミノ酸配列の、少なくとも９０％同じアミノ酸配列を有し、そのうち前記ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）は活性を有する、請求項２に記載の方法。

【請求項6】

組換え核酸分子中のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）をコードする遺伝子のコピー数は、１より大きいかまたはそれに等しい；
組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項7】

前記微生物はさらに次の遺伝子改変中の一種または複数種を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法：
（１）少なくとも１種の、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；
（２）少なくとも１種の、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼの働きを向上させることができる遺伝子改変；
（３）少なくとも１種の、微生物の中のＤ−グルコサミン−６−リン酸デアミナーゼの働きを向上させることができる遺伝子改変；
（４）少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン−６−リン酸シンターゼの働きを向上させることができる遺伝子改変、それと同時に少なくとも１種のＤ−グルコサミン−６−リン酸デアミナーゼの働きを低下させることができる遺伝子改変；
（５）少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。

【請求項8】

前記微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼの働きを向上させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼの酵素活性の向上、及び／又は、ｂ）微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼの過剰発現から選ばれる、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記微生物は、少なくとも１種のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変され、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼをコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼの働きを向上させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼの酵素活性の向上、及び／又は、ｂ）微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼの過剰発現から選ばれる、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

微生物は少なくとも１種のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変され、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）をコ−ドする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−２−エピメラーゼの働きを向上させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−２−エピメラーゼの酵素活性の向上；及び／又はｂ）微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−２−エピメラーゼの過剰発現から選ばれる、請求項７に記載の方法。

【請求項13】

前記微生物は、少なくとも１種のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−２−エピメラーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変され、前記ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）をコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記微生物は、さらに次の遺伝子改変の１種または複数種を含む、請求項１−１３のいずれか１項に記載の方法；
（１）少なくとも１種の微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（２）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼ（ＮａｎＡ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（３）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−６−リン酸デアセチラーゼ（ＮａｇＡ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（４）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（５）少なくとも１種の微生物の中のホスホグルコサミンムターゼ（ＧｌｍＭ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；
（６）包含少なくとも１種の微生物の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ＧｌｍＵ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。

【請求項15】

少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変を含む微生物。

【請求項16】

少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変されており、前記ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）をコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４である、請求項１５に記載の微生物。

【請求項17】

蛋白質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５で表されるアミノ酸配列を有する、より高い活性を有するビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）。

【請求項18】

請求項１７に記載のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）をコードする核酸分子であって、前記核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４で表される核酸配列を有する核酸分子。

【請求項19】

請求項１８に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項20】

ゲノムが請求項１８に記載の核酸分子を含む微生物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は微生物発酵分野に属する。具体的には、本発明は微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造しおよびさらにＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ、ＮＡＧまたはＧｌｃＮＡｃ）は、別名Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンともいい、生物細胞の多くの重要な多糖類の基本構成単位であり、生体内において重要な生理的機能を備える。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは臨床において次のように用いられる：ヒト免疫系の機能を向上させる；悪性腫瘍または線維芽細胞の増殖を阻害する；様々な炎症を効果的に治療する；糖尿病患者のための低カロリ−甘味料、乳幼児のための食品添加物とするなど。加水分解されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンはＤ−グルコサミン塩酸塩の製造に用いることができ、後者は抗がん、がん予防、血中脂質低下、血圧低下のための食品サプリメントとすることができ、現在キトサン健康食品シリ−ズの第３世代の健康機能性食品添加物である。それに、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは医薬品業界において抗がん剤クロロゾトシンを合成するための主原料である；生化学用試薬として、さらに抗細菌感染用免疫補助剤とヒト抗インフルエンザウイルス用賦活剤とすることができる。

【0003】

現在、世界の多くの地域では、多くの患者が様々な程度の関節炎に苦しんでおり、米国だけでも３３００万人が変形性関節症および関節痛に苦しんでおり、我が国では１．５億人が苦しんでいる。Ｄ−グルコサミン製品が関節炎と関節痛の治療と健康管理において特殊な効果があるため、広く使用されており、現在国外市場において非常に重要な原薬品種となっている。

【0004】

Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンはＤ−グルコサミンと同様の効果を有すると考えられており、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを摂取することにより、新しい軟骨の発生を誘導し、且つ変形性関節症の発症を予防することができ、場合によって、変形性関節症の治療に用いることができる。Ｄ−グルコサミンは苦味を有し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンはショ糖５０％の甘味を有し、且つ容易く摂取され、そのため、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンはＤ−グルコサミンの代替物質として注目されている。

【0005】

現在、国内外のグルコサミンの由来は生物抽出を主とする。生物抽出は主にエビやカニの殻からキチンまたはキトサンを抽出し、さらに濃塩酸で加水分解して製造され、あるいはクエン酸残基で酸・アルカリ抽出を行って得られ、年間生産量は２万トンぐらいである。しかし、エビやカニの殻で抽出する場合、製品１トン当たり大量の残渣と１００トン以上の廃水が発生する。クエン酸残基で抽出する場合、製品１トン当たり３０−５０トンの廃酸スラグが発生し、汚染度の高い工程であるから、多くの場所では禁止されている。それに、水産物の殻から抽出されるグルコサミンは多くの水産物にアレルギ−のある患者に適せず、水産物にアレルギ−のある人が使用後深刻なアレルギ−を発症させる恐れがあり、ないし生命を脅かすことになる。それに、生物抽出精製工程が複雑であり、製品は魚の臭いがあり、不安定である。このほか、環境汚染のため、エビやカニの殻から抽出して得られるグルコサミンは必然的に重金属によって汚染されている。

【0006】

そのため、生物抽出によってグルコサミンを製造することは、量と質の点で人々のニ−ズを満たすことが困難であり、新しい代替法を開発しなければならない。若し化学合成方法によって製造する場合、製造コストが高く、環境汚染が深刻であり、安全上の危険があるという３つの欠点がある。当該方法は現在国内外で使用されていない。一方では、微生物発酵法によってグルコサミンを製造することは良い方法であり、微生物発酵法はグルコ−スと無機塩を原料とし、優れた菌株を選択して液体発酵を行い、且つ分離、濃縮および精製を経てグルコサミンを直接製造する。製造プロセスにおいて有害ガスを発生しない。発酵法によって製造されるグルコサミンは魚の臭いがなく、製造は資源の制限を受けない。また代謝プロセスによって菌株改良を行い、収率が高く、工業化・大量生産の潜在力が大きい。したがって、微生物発酵法によってグルコサミンを製造することは技術的プロセスにおいて大きな革新があり、従来の生物抽出を代替し、コスト面で有利になるだけでなく、三廃汚染の低減面でも一定の環境保全貢献を有する。

【0007】

微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造する方法に関しては、一般的に次の方法がある：微生物から産生される酵素を使ってエビ殻材料から産生されるキチンを分解してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造する方法（例えば、特許文献１：米国特許第５９９８１７３号明細書、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ」）；微生物（トリコデルマ）から産生される酵素または酸を使って真菌残渣（例えばクエン酸発酵で使用されるクロコウジカビ残渣）から産生されるキチンを分解しまたは部分的に分解・精製してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造する方法（例えば、特許文献２：米国特許出願公開２００３／００７３６６６Ａ１号明細書、「Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ」）；トリコデルマを使い、真菌残渣またはエビの殻から産生されるキチンおよびキチンオリゴ糖を炭素源とせず、グルコ−スを直接炭素源として発酵を行ってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造する方法（例えば、特許文献３：米国特許出願公開２０１１／００５９４８９Ａ１号明細書、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｂｙ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ」）；クロロウイルス（Ｃｈｌｏｒｏｖｉｒｕｓ）で感染される小胞藻細胞を培養し、またはクロロウイルスからの遺伝子組み換えの大腸菌を導入してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造する方法（例えば、特許文献４：特開２００４−２８３１４４号公報、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ａｎｄ Ｎ−ａｃｅｔｙｌＧｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ」）；遺伝子改変微生物、特に遺伝子改変大腸菌を使って発酵させてＤ−グルコサミンまたはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造する方法（例えば、特許文献５：米国特許第６３７２４５７号、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ」；特許文献６：国際公開第２００４／００３１７５号、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ａｎｄ Ｎ−ａｃｅｔｙｌＧｌｕｃｏ

【0008】

微生物または微生物から産生される酵素を使ってカニやエビをはじめとする甲殻類の殻から産生されるキチンを分解してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造する方法は、比較的伝統的であり、収率が低く、コストが高く、動物由来が不足するなどの問題がある。クロロウイルスで感染される小胞藻細胞を培養してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造する方法は、細胞を破砕してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを得る工程を含み、操作が複雑であるなどの問題がある。トリコデルマを使ってグルコ−スを直接炭素源として発酵を行ってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造する方法は、甲殻類の殻または真菌残渣から産生されるキチンまたはキチンオリゴ糖などの炭素源を使用する必要がないという利点があるが、トリコデルマなどの真菌の発酵温度が低く（２７℃）、時間が長く（１０日）、収率がやや低く（１５ｍｇ／ｍｌ）、そのため、生産サイクルが長く、コストが高く、雑菌汚染を受けやすいなどの欠点があり、当該方法の工業的応用が厳しく制限される。

【0009】

従って、グルコサミンの、ますます成長する市場のニ−ズに応じて、遺伝子改変微生物を使ってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造することは、大規模工業化生産を実現するための見込みのある重要な方法である。新しい遺伝子改変微生物は遺伝子組換え、遺伝子導入、遺伝子突然変異、遺伝子欠失、遺伝子過剰発現、代謝経路改変などの様々な方式により得られる。

【0010】

米国特許第６３７２４５７号（特許文献５）において、微生物発酵によってＤ−グルコサミンを製造する方法と材料が開示されている。当該発明は、当該発明のグルコサミン製造方法に用いる遺伝子改変微生物、および組換え核酸分子および前記組換え核酸分子から産生される蛋白質を含む。当該発明に記載の遺伝子改変微生物は、主にグルコサミン６−リン酸シンターゼの活性を向上させるためであり、様々な遺伝子突然変異、アミノ酸の欠失および置換を含む。しかし、当該特許は、内因性グルコサミン６−リン酸シンターゼ遺伝子プロモーターの置換や欠失などの改変による、グルコサミン６−リン酸シンターゼの活性の向上・低下には関していない。それに、当該特許は、主にグルコサミン６−リン酸シンターゼの遺伝子改変によって製造される産物はＤ−グルコサミンだけであり、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造には関していない。また、Ｄ−グルコサミンは発酵液において不安定であり、分解産物が微生物に対する毒性を有し、このような遺伝子改変によってＤ−グルコサミンを製造する方法は、収率が非常に低く、実際の応用において局限性がある。

【0011】

国際公開第２００４／００３１７５号（特許文献６）においては、Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生物学的合成方法が開示されている。当該方法は、発酵遺伝子で微生物を改変させることによって、グルコサミン及び／又はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを産生させる。当該発明は、さらにグルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造に用いる遺伝子改変微生物を開示している。このほか、本発明はさらに発酵法によって製造されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを回収する方法を記載し、高純度のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを産生させる方法を含む。当該発明は、さらにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンからＤ−グルコサミンを製造する方法を開示している。当該発明に記載の遺伝子で改変される微生物は、主にグルコサミン６−リン酸アセチルトランスファラーゼの活性を向上させるための遺伝子改変である。酵母グルコサミン６−リン酸アセチルトランスファラーゼ遺伝子（ＧＮＡ１）の大腸菌における発現はグルコサミン６−リン酸をアセチルグルコサミン６−リン酸にアセチル化することができ、先行技術文献において既に報告・確認されている（非特許文献１）。

【0012】

微生物発酵によってＮ−アセチルグルコサミンを製造する場合、微生物を高密度に発酵させるための酸気需要量が多く、連続して撹拌する必要があるため、エネルギ−消費量が向上し、且つ連続撹拌により大量の泡が発生することによって発酵に影響を与え、さらに収率に影響を与える。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0013】

【特許文献1】米国特許第５９９８１７３号明細書

【特許文献2】米国特許出願公開２００３／００７３６６６Ａ１号明細書

【特許文献3】米国特許出願公開２０１１／００５９４８９Ａ１号明細書

【特許文献4】特開２００４−２８３１４４号公報

【特許文献5】米国特許第６３７２４５７号明細書

【特許文献6】国際公開第２００４／００３１７５号

【非特許文献】

【0014】

【非特許文献1】Ｍｉｏ Ｔ１、 Ｙａｍａｄａ−Ｏｋａｂｅ Ｔ、 Ａｒｉｓａｗａ Ｍ、 Ｙａｍａｄａ−Ｏｋａｂｅ Ｈ： Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＮＡ１、 ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌＧｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ.、 １９９９ Ｊａｎ １; ２７４（１）：４２４−９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

本発明は遺伝子改変法によって微生物を改変させ、その溶存酸素を利用する能力を向上させ、微生物により、高い効率と収率でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造させ、それによって工業規模で生産するための製造コストを削減する。

【0016】

具体的には、本発明は微生物において、ビトレオシラヘモグロビン（ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ、Ｖｈｂ）を発現させることにより、微生物の溶存酸素を利用する能力を向上させ、蛋白質と代謝産物の合成を促し、微生物の成長を促進し、発酵力価とレベルを向上させ、それによって当該微生物に有限酸素条件下でより高い効率と収率をもってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造させる。

【課題を解決するための手段】

【0017】

本発明は、前記内容に基づいてさらに次の内容の１つまたは複数に関する：
１．微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ、ＮａｎＫ）の働きを向上させることにより、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ、ＭａｎＮＡｃ）からＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐ）へのリン酸化を促進し、それによって当該微生物により高い効率と収率でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造させる。

【0018】

２．微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ−６− ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、ＮａｎＥ）の働きを向上させることにより、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐ）からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐ）、への変換を促進し、細胞外に排出されてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）になり、それによって当該微生物により高い効率と収率でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造させる。

【0019】

３．微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ、ＮａｇＢ）の働きを向上させ、好ましくは、それと同時にグルコサミン６−リン酸シンターゼ（Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＧｌｍＳ、Ｌ−グルタミン−６−リン酸アミノトランスファラーゼとも呼ばれ、Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ：Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の働きを低下させることにより、微生物の中のグルコ−ス−６−リン酸（Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｇｌｃ−６−Ｐ）からＤ−グルコサミン６−リン酸（Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＧｌｃＮ−６−Ｐ）へのアミノ化を促進する。Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）による触媒反応が可逆的であり、グルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）による触媒反応が不可逆的であるが、深刻な産物阻害問題があり、ＮａｇＢによる触媒反応がＧｌｃ−６−ＰからＧｌｃＮ−６−Ｐへの生成の方向に進行する場合、その働きはＧｌｍＳと同じであり、ＧｌｍＳを代替することができ、且つ産物阻害問題がない。ＮａｇＢの働きを向上させ、ＮａｇＢによる触媒反応がＧｌｃ−６−ＰからＧｌｃＮ−６−Ｐへの生成の方向に進行することを促し、好ましくはそれと同時にＧｌｍＳの働きを低下させることにより、ＧｌｃＮ−６−Ｐを増加させるという目的を達成し、それによって当該微生物により高い効率と収率でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造させる。

【0020】

４．微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＧｌｍＳ、 Ｌ−グルタミン−６−リン酸アミノトランスファラーゼとも呼ばれ、Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ：Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の働きを向上させ、それと同時にＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ、ＮａｇＢ）の働きを低下させることにより、微生物の中のグルコ−ス−６−リン酸（Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｇｌｃ−６−Ｐ）からＤ−グルコサミン６−リン酸（Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＧｌｃＮ−６−Ｐ）へのアミノ化を促進する。Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）による触媒反応が可逆的であり、ＮａｇＢによる触媒反応がＧｌｃＮ−６−ＰからＧｌｃ−６−Ｐへの生成の方向に進行する場合、その働きはＧｌｍＳと逆であり、ＧｌｍＳの働きを相殺する。ＮａｇＢの働きを低下させ、ＮａｇＢによる触媒反応がＧｌｃＮ−６−ＰからＧｌｃ−６−Ｐへの生成の方向に進行することを阻害し、それと同時にＧｌｍＳを過剰表現させ、ＧｌｍＳの触媒作用によってＧｌｃ−６−ＰからＧｌｃＮ−６−Ｐへのアミノ化を促し、それによって当該微生物により高い効率と収率でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造させる。

【0021】

５．微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ− Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−２−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、ＷｅｃＢ）の働きを向上させることにより、微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）からＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ、ＭａｎＮＡｃ）への変換を促進し、それによって、当該微生物により、高い効率と収率でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造させる。

【0022】

６．微生物の中のタ−ゲット産物が、再度細胞内に取り込まれ、または、有益な中間体が分解されることにかかわる酵素や蛋白質の働きを低下させ、微生物の中の糖変換率とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率を向上させ、それによって当該微生物により高い効率と収率でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造させる。次の内容の一つまたは複数を含むがこれらに限られない：
（１）微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（Ｍａｎｎｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^Man、ＭａｎＸＹＺ）の働きを低下させ、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）などのヘキソ−スが細胞内への輸送分解を阻害する。
（２）微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎａｔｅ ｌｙａｓｅ、ＮａｎＡ）の働きを低下させ、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ、ＭａｎＮＡｃ）の分解を阻害する。
（３）微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌＧｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６− ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ、ＮａｇＡ）の働きを低下させ、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐ）からＤ−グルコサミン６−リン酸（Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＧｌｃＮ−６−Ｐ）への変換を阻害する。
（４）微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（Ｎ−ａｃｅｔｙｌＧｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ＩＩ^Nag、ＮａｇＥ）の働きを低下させ、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が微生物細胞への輸送・分解を阻害する。
（５）微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ｐｈｏｓｐｈｏＧｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｍｕｔａｓｅ、ＧｌｍＭ）の働きを向上させ、微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸（Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＧｌｃＮ−６−Ｐ）からＤ−グルコサミン１−リン酸（Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＧｌｃＮ−１−Ｐ）への変換を促進する。
（６）微生物の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎ−ａｃｅｔｙｌ Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｕｒｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ／Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＧｌｍＵ）の働きを向上させることにより、微生物の中のＤ−グルコサミン１−リン酸（Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＧｌｃＮ−１−Ｐ）からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ）への変換、さらなるＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）への変換を促進する。

【0023】

本発明の一実施形態は、微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、前記方法は以下を含む：
Ａ）発酵培地において微生物を培養し、前記微生物は少なくとも一種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変を含む；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。
好ましくは、さらにＣ）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を脱アセチル化して得られるＤ−グルコサミン塩を含む。

【0024】

本発明によれば、微生物は少なくとも一種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される。
本発明は、ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を対象として、エラ−プロ−ンＰＣＲによるランダム突然変異誘発導入法により、ランダム塩基置換を導入し、ＤＮＡ改変を行い、当該タンパク質の理想的突然変異体をスクリーニングする。エラ−プロ−ンＰＣＲによるランダム突然変異誘発導入法はランダム塩基置換を導入することによって理想的突然変異体をスクリーニングするが、ＤＮＡ組換えはランダム突然変異誘発より良性突然変異の確率を有意に向上させることができ、それによってより有用な突然変異体を得ることができる。ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）の活性を向上させるために、エラ−プロ−ンＰＣＲ とＤＮＡ組換えを組み合わせ、それに対して改変を行い、且つ突然変異遺伝子を酸素調節型プロモーターの下に置いて発現・スクリーニングを行い、それによって酸素制限条件下で活性が野生型より高い突然変異蛋白質を得る。

【0025】

一つの実施形態によれば、ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）をコードする核酸配列は少なくとも一種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）の活性を向上させる遺伝子改変を含む。好ましくは、前記遺伝子改変はアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に対応する以下の位置での置換の１種または複数種を含む：４５位のメチオニンからロイシンへの置換、８６位のシステインからグリシンへの置換および９５位のチロシンからセリンへの置換。さらに好ましくは、前記ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）をコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４である。前記ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５である。

【0026】

もう一つの実施形態によれば、前記ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１のアミノ酸配列の少なくとも３０％同じ、好ましくは少なくとも５０％同じ、より好ましくは少なくとも７０％同じ、より好ましくは少なくとも８０％同じ、さらにより好ましくは９０％同じ、最も好ましくは約９５％同じのアミノ酸配列を有し、そのうち前記ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）は活性を有する。
もう一つの実施形態によれば、前記ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１のアミノ酸配列を有する。

【0027】

もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子の中のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）をコードするコードする遺伝子のコピ−数は、１より大きいかまたはそれに等しい。
もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターを含み、内在性天然プロモーターより高い発現レベルのプロモーター、エンハンサー、融合配列などを有する。好ましくは、組換え核酸分子は天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含み、例えば、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど；より好ましくは、組換え核酸分子はｔｒｃプロモーターを含む。ｔｒｃプロモーターは ｔｒｐプロモーターと ｌａｃプロモーターが連結されるプロモーターであり、ｔｒｐより高い転写効率とｌａｃＩリプレッサーによって調節される強力なプロモーター特性を有する。

【0028】

本発明によれば、組換え核酸分子によって微生物の形質転換を行うことは、遊離型（即ち組換え核酸分子をプラスミドにロ−ドする）と結合型（即ち組換え核酸分子を微生物のゲノムに組み込む）から選択される。好ましくは、組換え核酸分子を微生物のゲノムに組み込む。

【0029】

本発明の好ましい実施形態によれば、前記微生物は、さらに次の遺伝子改変中の一種または複数種を含む：
（１）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；
（２）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；
（３）少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変、好ましくは少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（４）少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることができる遺伝子改変を含み、それと同時に少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（５）少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。

【0030】

前記第（１）において、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させる遺伝子改変はａ）微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の酵素活性の向上；及び／又はｂ）微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の過剰発現から選ばれる。

【0031】

本分野の技術者であれば、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることは、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の酵素活性を向上させるＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）をコードする遺伝子の突然変異体をスクリーニングすることによって実現されること、ＮａｎＫ遺伝子突然変異体をスクリーニングすることは、エラ−プロ−ンＰＣＲ技術によって高頻度突然変異体を得ることによって実現されること、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることは、またその遺伝子のコピ−数を増加させ、発現レベルが天然プロモーターより高いプロモーターに置換するなどによってＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）を過剰発現させることによって実現されること、特定の実施形態において、微生物は少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変されることがわかる。

【0032】

一つの好ましい実施形態によれば、微生物は、少なくとも１種のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される。

【0033】

一つの実施形態によれば、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）をコードする核酸配列は少なくとも１種のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む。好ましくは、前記遺伝子改変はアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の次の位置で置換される１種または複数種を含む：３６位のリシンからアルギニンへの置換、１０３位のイソロイシンからメチオニンへの置換および２２３位のアルギニンからセリンへの置換。さらに好ましくは、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）をコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６である；前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７である。

【0034】

もう一つの実施形態によれば、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列の少なくとも約３０％同じ、好ましくは約５０％同じ、より好ましくは７０％同じ、より好ましくは約８０％同じ、さらに好ましくは約９０％同じ、最も好ましくは約９５％同じであるアミノ酸配列を有し、そのうち、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）は酵素活性を有する。
もう一つの実施形態によれば、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を有する。
もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）をコードする遺伝子のコピ−数を増加させる。

【0035】

もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターを含み、内在性天然プロモーターより高い発現レベルのプロモーター、エンハンサー、融合配列などを有する。好ましくは、組換え核酸分子は天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含み、例えば、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど；より好ましくは、組換え核酸分子はｔｒｃプロモーターを含む。ｔｒｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーターと ｌａｃプロモーターが連結されるプロモーターであり、ｔｒｐより高い転写効率とｌａｃＩリプレッサーによって調節される強力なプロモーター特性を有する。

【0036】

本発明によれば、組換え核酸分子によって微生物の形質転換を行うことは、遊離型（即ち組換え核酸分子をプラスミドにロ−ドする）と結合型（即ち組換え核酸分子を微生物のゲノムに組み込む）から選択される。好ましくは、組換え核酸分子を微生物のゲノムに組み込む。

【0037】

もう一つの好ましい実施形態によれば、微生物は少なくとも１種のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む。好ましくはＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターをより高い発現レベルを有するプロモーターに置換し、例えばＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど；より好ましくは、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターをｔｒｃプロモーターに置換する。

【0038】

前記第（２）の実施形態によれば、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させる遺伝子改変はａ）微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の酵素活性の向上；及び／又はｂ）微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の過剰発現から選ばれる。

【0039】

本分野の技術者であれば、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることは、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の酵素活性を向上させるＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）をコードする遺伝子の突然変異体をスクリーニングすることによって実現されること、ＮａｎＥ遺伝子突然変異体のスクリーニングは、エラ−プロ−ンＰＣＲ技術によって高頻度突然変異遺伝子を得ることによって実現されること、また、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることは、その遺伝子のコピ−数を増加させ、発現レベルが天然プロモーターより高いプロモーターに置換するなどの方式によってＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）を過剰発現させることによって実現されること、特定の実施形態によれば、微生物は少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変されることがわかる。

【0040】

一つの好ましい実施形態によれば、微生物は少なくとも１種のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される。
一つの実施形態によれば、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）をコードする核酸配列は少なくとも１種のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む。好ましくは、前記遺伝子改変はアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に対応する次の位置での置換の１種または２種を含む：１３３位のシステインからアルギニンへの置換および１８７位のチロシンからヒスチジンへの置換。より好ましくは、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）をコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６である；前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）をコードするアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７である。

【0041】

もう一つの実施形態によれば、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のアミノ酸配列の少なくとも約３０％同じ、好ましくは少なくとも約５０％同じ、より好ましくは少なくとも約７０％同じ、より好ましくは少なくとも約８０％同じ、さらに好ましくは少なくとも約９０％同じ、最も好ましくは少なくとも約９５％同じアミノ酸配列を有し、そのうち、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）は酵素活性を有する。
もう一つの実施形態によれば、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のアミノ酸配列を有する。
もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）をコードする遺伝子のコピ−数を増加させる。

【0042】

もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターを含み、内在性天然プロモーターより高い発現レベルのプロモーター、エンハンサー、融合配列などを有する。好ましくは、組換え核酸分子は天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含み、例えば、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど；より好ましくは、組換え核酸分子はｔｒｃプロモーターを含む。ｔｒｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーターとｌａｃプロモーターが連結されてなるプロモーターであり、ｔｒｐより高い転写効率とｌａｃＩリプレッサーによって調節される強力なプロモーター特性を有する。

【0043】

本発明によれば、組換え核酸分子によって微生物の形質転換を行うことは、遊離型（即ち組換え核酸分子をプラスミドにロ−ドする）と結合型（即ち組換え核酸分子を微生物のゲノムに組み込む）から選択される。好ましくは、組換え核酸分子を微生物のゲノムに組み込む。

【0044】

もう一つの好ましい実施形態によれば、微生物は少なくとも１種のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む。好ましくは、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターをより高い発現レベルを有するプロモーターに置換し、例えばＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど；より好ましくは、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターをｔｒｃプロモーターに置換する。

【0045】

前記第（３）の実施形態によれば、微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させる遺伝子改変はａ）微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の酵素活性の向上；及び／又はｂ）微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の過剰発現から選ばれる。

【0046】

本分野の技術者であれば、微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることは、Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の酵素活性を向上させるＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）コードする遺伝子突然変異体をスクリーニングすることによって実現されること、ＮａｇＢの遺伝子突然変異体のスクリーニングは、エラ−プロ−ンＰＣＲ技術によって高頻度突然変異遺伝子を得ることによって実現されること、また、微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることは、その遺伝子のコピ−数を増加させ、天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターなどに置換するなどの方式によってＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）を過剰発現させることによって実現されること、特定の実施形態によれば、微生物は少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変されることがわかる。

【0047】

一つの好ましい実施形態によれば、微生物は少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される。
一つの実施形態によれば、Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）をコードする核酸配列は少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む。
もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）をコードする遺伝子のコピ−数を増加させる。

【0048】

もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子は、内在性天然プロモーターを含み、内在性天然プロモーターより高い発現レベルのプロモーター、エンハンサー、融合配列などを有する。好ましくは、組換え核酸分子は天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含み、例えば、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど；より好ましくは、組換え核酸分子はｔｒｃプロモーターを含む。ｔｒｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーターとｌａｃプロモーターが連結されてなるプロモーターであり、ｔｒｐより高い転写効率とｌａｃＩリプレッサーによって調節される強力なプロモーター特性を有する。

【0049】

本発明によれば、組換え核酸分子によって微生物の形質転換を行うことは、遊離型（即ち組換え核酸分子をプラスミドにロ−ドする）と結合型（即ち組換え核酸分子を微生物のゲノムに組み込む）から選択される。好ましくは、組換え核酸分子を微生物のゲノムに組み込む。

【0050】

もう一つの好ましい実施形態によれば、微生物は、少なくとも１種の、Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む。好ましくは、Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターを、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換し、例えばＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど；より好ましくは、Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターをｔｒｃプロモーターに置換する。

【0051】

本発明によれば、微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の酵素活性の低下；及び／又はｂ）微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の発現低下から選ばれ、次を含むがこれらに限らない：微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、あるいは一部または全部の不活性化、及び／又は微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、あるいは一部または全部の不活性化。好ましくは、微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させる遺伝子改変は微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターを完全に欠失させ、即ち削除する。

【0052】

特定の実施形態によれば、微生物は少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変される。
前記第（４）の実施形態によれば、微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させる遺伝子改変は、a）微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の酵素活性の向上；及び／又はb）微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の過剰発現から選ばれる。

【0053】

本分野の技術者であれば、微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることは、グルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の酵素活性を向上させるグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）をコードする遺伝子の突然変異体をスクリーニングすることによって実現されること、ＧｌｍＳ遺伝子の突然変異体のスクリーニングは、エラ−プロ−ンＰＣＲ技術によって高頻度突然変異遺伝子を得ることによって実現されること、また、微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることは、その遺伝子のコピ−数を増加させ、天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターに置換するなどの方式によってグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）を過剰発現させることによって実現されること、特定の実施形態によれば、微生物は少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変されることがわかる。

【0054】

一つの好ましい実施形態によれば、微生物は、少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される。
一つの実施形態によれば、グルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）をコードする核酸配列は少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む。
もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）をコードする遺伝子のコピ−数を増加させる。
もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターを含み、内在性天然プロモーターより高い発現レベルのプロモーター、エンハンサー、融合配列などを有する。好ましくは、組換え核酸分子は天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含み、例えば、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど；より好ましくは、組換え核酸分子はｔｒｃプロモーターを含む。ｔｒｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーターとｌａｃプロモーターが連結されてなるプロモーターであり、ｔｒｐより高い転写効率とｌａｃＩリプレッサーによって調節される強力なプロモーター特性を有する。

【0055】

本発明によれば、組換え核酸分子によって微生物の形質転換を行うことは、遊離型（即ち組換え核酸分子をプラスミドにロ−ドする）と結合型（即ち組換え核酸分子を微生物のゲノムに組み込む）から選択される。好ましくは、組換え核酸分子を微生物のゲノムに組み込む。

【0056】

もう一つの好ましい実施形態によれば、微生物は、少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む。好ましくは、グルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターをより高い発現レベルを有するプロモーターに置換し、例えばＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど；より好ましくは、グルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターをｔｒｃプロモーターに置換する。
本発明において、微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の酵素活性の低下；及び／又はｂ）微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の発現低下から選ばれ、次を含むがこれらに限らない：微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化、及び／又は微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化。好ましくは、微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターを完全に欠失させ、即ち削除する。
特定の実施形態によれば、微生物は少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変される。

【0057】

前記第（５）の実施形態によれば、微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の酵素活性の向上；及び／又はｂ）微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の過剰発現から選ばれる。

【0058】

本分野の技術者であれば、微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の酵素活性を向上させるＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）をコードする遺伝子の突然変異体をスクリーニングすることによって実現されること、ＷｅｃＢ遺伝子突然変異体のスクリーニングは、エラ−プロ−ンＰＣＲ技術によって高頻度突然変異遺伝子を得ることによって実現されること、また、微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることは、その遺伝子のコピ−数を増加させ、天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターに置換するなどの方式によってＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）を過剰発現させることによって実現されることがわかる。特定の実施形態によれば、微生物は、少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変を含む、少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変される。

【0059】

一つの好ましい実施形態によれば、微生物は少なくとも１種のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される。

【0060】

一つの実施形態によれば、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）をコードする核酸配列は、少なくとも１種のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む。好ましくは、前記遺伝子改変は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に対応する次の位置での置換：３４位のシステインからセリンへの置換、１４５位のヒスチジンからアスパラギン酸への置換、２２６位のシステインからフェニルアラニンへの置換および２４５位のバリンからグリシンへの置換の１種または複数種を含む；より好ましくは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）をコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８である；前記ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。

【0061】

もう一つの実施形態によれば、前記ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０のアミノ酸配列の少なくとも約３０％同じ、好ましくは少なくとも約５０％同じ、より好ましくは少なくとも約７０％同じ、より好ましくは少なくとも約８０％同じ、さらに好ましくは少なくとも約９０％同じ、最も好ましくは少なくとも約９５％同じであるアミノ酸配列を有し、そのうち、前記ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）は酵素活性を有する。
もう一つの実施形態によれば、前記ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０のアミノ酸配列を有する。

【0062】

もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）をコードする遺伝子のコピ−数を増加させる。
もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターを含み、内在性天然プロモーターより高い発現レベルのプロモーター、エンハンサー、融合配列などを有する。好ましくは、組換え核酸分子は天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含み、例えば、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど；より好ましくは、組換え核酸分子はｔｒｃプロモーターを含む。ｔｒｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーターと ｌａｃプロモーターが連結されてなるプロモーターであり、ｔｒｐより高い転写効率とｌａｃＩリプレッサーによって調節される強力なプロモーター特性を有する。

【0063】

本発明によれば、組換え核酸分子によって微生物の形質転換を行うことは、遊離型（即ち組換え核酸分子をプラスミドにロ−ドする）と結合型（即ち組換え核酸分子を微生物のゲノムに組み込む）から選択される。好ましくは、組換え核酸分子を微生物のゲノムに組み込む。

【0064】

もう一つの好ましい実施形態によれば、微生物は少なくとも１種のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む。好ましくは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターをより高い発現レベルを有するプロモーターに置換し、例えばＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど；より好ましくは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターをｔｒｃプロモーターに置換する。

【0065】

本発明の好ましい実施形態によれば、前記微生物はさらに次の遺伝子改変の中の１種または複数種を含む：
（１）少なくとも１種の微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（２）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（３）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（４）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む；
（５）少なくとも１種の微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；
（６）包含少なくとも１種の微生物の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。

【0066】

前記第（１）の実施形態によれば、微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、あるいは一部または全部の不活性化、及び／又は微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化を含むが、これらに限られない。好ましくは、微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）をコードする内因性遺伝子を完全に欠失させ、即ち削除する。特定の実施形態によれば、微生物は、少なくとも１種の微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む、少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変される。

【0067】

前記第（２）の実施形態によれば、微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）の働きを低下させる遺伝子改変：微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化、及び／又は、微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化を含むが、これらに限らない。好ましくは、微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）をコードする内因性遺伝子を完全に欠失させ、即ち削除する。特定の実施形態によれば、微生物は少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変される。

【0068】

前記第（３）の実施形態によれば、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化、及び／又は微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化を含むが、これらに限らない。

【0069】

好ましくは、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）の働きを低下させる遺伝子改変は微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）をコードする内因性遺伝子を完全に欠失させ、即ち削除する。特定の実施形態によれば、微生物は少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変される。

【0070】

前記第（４）の実施形態によれば、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化、及び／又は微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化次を含むが、これらに限られない。

【0071】

好ましくは、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）をコードする内因性遺伝子を完全に欠失させ、即ち削除する。特定の実施形態によれば、微生物は少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変される。

【0072】

前記第（５）の実施形態によれば、微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の働きを向上させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の酵素活性の向上；及び／又は、ｂ）微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の過剰発現から選ばれる。

【0073】

本分野の技術者であれば、微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の働きを向上させることは、ホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の酵素活性を向上させるホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）をコードする遺伝子の突然変異体をスクリーニングすることによって実現されること、ＧｌｍＭ遺伝子突然変異体のスクリーニングは、エラ−プロ−ンＰＣＲ技術によって高頻度突然変異遺伝子を得ることによって実現されること、また、微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の働きを向上させることは、その遺伝子のコピ−数を増加させ、天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターに置換するなどの方式によってホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）を過剰発現させることによって実現されること、特定の実施形態によれば、微生物は少なくとも１種の微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって形質転換されることがわかる。

【0074】

一つの好ましい実施形態によれば、微生物は、少なくとも１種のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される。
一つの実施形態によれば、ホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）をコードする核酸配列は、少なくとも１種のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む。
もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）をコードする遺伝子のコピ−数を増加させる。

【0075】

もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子は、内在性天然プロモーターを含み、内在性天然プロモーターより高い発現レベルのプロモーター、エンハンサー、融合配列などを有する。好ましくは、組換え核酸分子は、天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含み、例えば、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど；より好ましくは、組換え核酸分子はｔｒｃプロモーターを含む。ｔｒｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーターと ｌａｃプロモーターが連結されてなるプロモーターであり、ｔｒｐより高い転写効率とｌａｃＩリプレッサーによって調節される強力なプロモーター特性を有する。

【0076】

本発明によれば、組換え核酸分子によって微生物の形質転換を行うことは、遊離型（即ち組換え核酸分子をプラスミドにロ−ドする）と結合型（即ち組換え核酸分子を微生物のゲノムに組み込む）から選択される。好ましくは、組換え核酸分子を微生物のゲノムに組み込む。

【0077】

もう一つの好ましい実施形態によれば、微生物は少なくとも１種のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む。好ましくは、ホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターをより高い発現レベルを有するプロモーターに置換し、例えばＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど；より好ましくは、ホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターを、ｔｒｃプロモーターに置換する。

【0078】

前記第（６）の実施形態によれば、微生物の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の働きを向上させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の酵素活性の向上；及び／又は、ｂ）微生物の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の過剰発現から選ばれる。

【0079】

本分野の技術者であれば、微生物の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の働きを向上させることは、二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の酵素活性を向上させる二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）をコードする遺伝子の突然変異体をスクリーニングすることによって実現されること、ＧｌｍＵ遺伝子突然変異体のスクリーニングは、エラ−プロ−ンＰＣＲ技術によって高頻度突然変異遺伝子を得ることによって実現されること、また、微生物の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の働きを向上させることは、その遺伝子のコピ−数を増加させ、天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターに置換するなどなどの方式によって二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）を過剰発現させることによって実現されることがわかる。特定の実施形態によれば、微生物は少なくとも１種の微生物の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変されることがわかる。

【0080】

一つの好ましい実施形態によれば、微生物は、二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）をコードする核酸配列を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変される。
一つの実施形態によれば、二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）をコードする核酸配列は、少なくとも１種の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む。

【0081】

もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）をコードする遺伝子のコピ−数を増加させる。
もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターを含み、内在性天然プロモーターより高い発現レベルのプロモーター、エンハンサー、融合配列などを有する。好ましくは、組換え核酸分子は天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含み、例えば、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど；より好ましくは、組換え核酸分子はｔｒｃプロモーターを含む。ｔｒｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーターとｌａｃプロモーターが連結されてなるプロモーターであり、ｔｒｐより高い転写効率とｌａｃＩリプレッサーによって調節される強力なプロモーター特性を有する。

【0082】

本発明によれば、組換え核酸分子によって微生物の形質転換を行うことは、遊離型（即ち組換え核酸分子をプラスミドにロ−ドする）と、結合型（即ち組換え核酸分子を微生物のゲノムに組み込む）から選択される。好ましくは、組換え核酸分子を微生物のゲノムに組み込む。

【0083】

もう一つの好ましい実施形態によれば、微生物は、少なくとも１種の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）をコードする遺伝子に、内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む。好ましくは、二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターをより高い発現レベルを有するプロモーターに置換し、例えばＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど；よりましくは、二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターをｔｒｃプロモーターに置換する。

【0084】

本発明はさらに次の好ましい実施形態に関する：１．本発明の一つの好ましい実施形態によれば、本発明は微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。

【0085】

２．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。

【0086】

３．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。 好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。

【0087】

４．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。

【0088】

５．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。

【0089】

６．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。

【0090】

７．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。

【0091】

８．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。

【0092】

９．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。

【0093】

１０. 本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。

【0094】

１１．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；及び
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。

【0095】

１２．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。

【0096】

１３．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。

【0097】

１４．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。

【0098】

１５．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。
好ましくは、前記微生物さらに少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。

【0099】

１６．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。

【0100】

１７．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）および/またはＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。

【0101】

１８．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。

【0102】

１９．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。

【0103】

２０．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。
好ましくは、前記微生物さらに少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。

【0104】

２１．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；及び
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。

【0105】

２２．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。
好ましくは、前記微生物さらに少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。

【0106】

２３．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法に関し、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；及び
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集する。
前記好ましい実施形態によれば、さらにＣ）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）から脱アセチル化してＤ−グルコサミン塩を得ることを含む。

【0107】

前記好ましい実施形態によれば、前記微生物はさらに次を含む：少なくとも１種の微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）の働きを低下させることができる遺伝子改変。

【0108】

前記いずれかの実施形態によれば、前記任意の組換え核酸分子の発現は誘導されることができ、ラクト−スによって誘導されることを含むがこれに限らず、例えば、培養液にラクト−ス等を加えることによって発現がラクト−スに誘導される。

【0109】

本分野の技術者であれば、本発明によれば、本分野公知の様々な従来の発酵培地を使うことができること、一つの実施形態によれば、発酵培地は炭素源を含むこと、もう一つの実施形態によれば、発酵培地は窒素源を含むこと、もう一つの実施形態によれば、発酵培地は炭素源と窒素源を含むこと、もう一つの実施形態によれば、発酵培地は炭素源、窒素源および無機塩を含むことがわかる。

【0110】

本分野の技術者であれば、本分野の公知の様々な炭素源は、いずれも本発明に用いられることができ、炭素源は有機炭素源及び／又は無機炭素源を含み、好ましくは、炭素源はグルコ−ス、フルクト−ス、ショ糖、ガラクト−ス、デキストリン、グリセリン、デンプン、シロップおよび糖蜜の中の１種または複数種から選ばれること、好ましくは、炭素源の濃度は約０．１％−約５％に維持されることがわかる。本分野の技術者であれば、本分野の公知の様々な窒素源はいずれも本発明に用いられることができ、窒素源は有機窒素源及び／又は無機窒素源を含み、好ましくは、窒素源はアンモニア水、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、魚粉、大豆粉、麦芽、コ−ンシロップおよび綿実粉の中の１種または複数種から選ばれることがわかる。

【0111】

好ましくは、本発明は材料補充発酵法を採用する。本発明の一つの実施形態によれば、糖分補充液はグルコ−スとリボ−スを含み、好ましくは、グルコ−スの濃度は１０％−８５％（ｗ／ｖ）、リボ−スの濃度は０．５％−１５％（ｗ／ｖ）であり、さらに好ましくは、グルコ−スの濃度は５５％−７５％（ｗ／ｖ）、リボ−スの濃度は５％−７％（ｗ／ｖ）である。本発明のもう一つの実施形態によれば、糖分補充液はグルコ−スとグルコン酸塩を含み、好ましくは、グルコ−スの濃度は１０％−８５％（ｗ／ｖ）、グルコン酸塩の濃度は０．５％−１５％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは、グルコ−スの濃度は５５％−７５％（ｗ／ｖ）、グルコン酸塩の濃度は２％−３％（ｗ／ｖ）である。本発明のもう一つの実施形態によれば、糖分補充液はグルコ−ス、リボ−スおよびグルコン酸塩を含み、好ましくは、グルコ−スの濃度は１０％−８５％（ｗ／ｖ）、リボ−スの濃度は０．５％−１５％（ｗ／ｖ）、グルコン酸塩の濃度は０．５％−１５％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは、グルコ−スの濃度は５５％−７５％（ｗ／ｖ）、リボ−スの濃度は５％−７％（ｗ／ｖ）、グルコン酸塩の濃度は２％−３％（ｗ／ｖ）である。好ましくは、グルコン酸塩はグルコン酸ナトリウムである。

【0112】

一つの好ましい実施形態によれば、約２０℃−約４５℃下で前記培養工程を行い、より好ましくは、約３３℃−約３７℃下で前記培養工程を行う。
一つの好ましい実施形態によれば、約ｐＨ４．５−約ｐＨ８．５下で前記培養工程を行う。より好ましくは、約ｐＨ６．７−約ｐＨ７．２下で前記培養工程を行う。

【0113】

本分野の技術者であれば、本発明によれば、本分野の公知の様々な従来の方法を使って、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を収集することができ、好ましくは、発酵培地の中の細胞外産物からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを収集することができ、より好ましくは、当該収集工程は次の工程から選ばれる：（ａ）微生物が除去される発酵液からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを沈殿させる；（ｂ）微生物が除去される発酵液からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを結晶化させることがわかる。

【0114】

本発明によれば、収集工程はさらに発酵液を脱色させる工程を含む。脱色工程は、発酵液を沈殿・結晶化させる前に、発酵液を１回または複数回沈殿・結晶化させる後に行われることを含むがこれらに限らず、脱色は、活性炭処理及び／又はクロマトグラフィ−脱色を含む。前記クロマトグラフィ−脱色は、前記発酵液とイオン交換樹脂に接触させる工程を含み、イオン交換樹脂は陰イオン交換樹脂及び／又は陽イオン交換樹脂を含むが、これらに限らず、例えば、発酵液と陰イオンおよび陽イオン交換樹脂の混合床に接触させるてもよい。

【0115】

本発明によれば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを脱アセチル化させてＤ−グルコサミン塩を得ることができ、前記塩は塩酸塩、硫酸塩、ナトリウム塩、リン酸塩および硫酸水素塩などを含むが、これらに限らない。例えば、酸性および加熱条件下で脱アセチル化してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを分解してＤ−グルコサミン塩を得ることができ、好ましくは、３０％−３７％の塩酸溶液において、６０℃−９０℃下で脱アセチル化してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを分解してＤ−グルコサミン塩酸塩を得る；また、ＵＤＰ−３−Ｏ−Ｎ−アセチルグルコサミンの脱アセチル化酵素の作用下でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを分解してＤ−グルコサミンを得て、さらに塩になる。
本発明のもう一つの実施形態によれば、本発明は微生物に関し、前記微生物は少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変を含む。上文はこの遺伝子改変について詳しく説明する。

【0116】

本発明の好ましい実施形態によれば、前記微生物は、さらに次の遺伝子改変中の一種または複数種を含む：
（１）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；
（２）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；
（３）少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変を含み、好ましくは少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（４）少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることができる遺伝子改変を含み、それと同時に少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（５）少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。上文はこの遺伝子改変について詳しく説明する。

【0117】

本発明の好ましい実施形態によれば、前記微生物は、さらに次の遺伝子改変中の一種または複数種を含む：
（１）少なくとも１種の微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（２）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（３）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（４）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（５）少なくとも１種の微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；
（６）少なくとも１種の微生物の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。上文はこの遺伝子改変について詳しく説明する。

【0118】

本発明さらに次の好ましい実施形態に関する：
１．本発明の一つの好ましい実施形態によれば、本発明は微生物に関し、前記微生物は、少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変、少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変を含む。

【0119】

２．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は微生物に関し、前記微生物は、少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変、少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変を含む。

【0120】

３．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は微生物に関し、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。

【0121】

４．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は微生物に関し、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させることができる遺伝子改変。
５．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は微生物に関し、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。

【0122】

６．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物に関し、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。

【0123】

７．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物に関し、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。

【0124】

８．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物に関し、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させることができる遺伝子改変。

【0125】

９．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物に関し、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。

【0126】

１０．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物に関し、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。

【0127】

１１．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物に関し、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させることができる遺伝子改変。

【0128】

１２．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物に関し、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。

【0129】

１３．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物に関し、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。

【0130】

１４．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物に関し、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。

【0131】

１５．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物に関し、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。

【0132】

１６．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物に関し、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させることができる遺伝子改変。

【0133】

１７．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物に関し、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。

【0134】

１８．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物に関し、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。

【0135】

１９．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物に関し、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。

【0136】

２０．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は微生物に関し、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。

【0137】

２１．本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物に関し、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。

【0138】

２２．本発明の一つの好ましい実施形態によれば、本発明は、微生物に関し、
前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。

【0139】

２３．本発明の一つの好ましい実施形態によれば、本発明は微生物に関し、前記微生物は次を含む：少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。

【0140】

前記好ましい実施形態によれば、前記微生物はさらに以下を含む：少なくとも１種の微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；および少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）の働きを低下させることができる遺伝子改変。

【0141】

本発明のもう一つの実施形態によれば、本発明は、より高い活性を有するビトレオシラヘモグロビンに関し、それはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５で表されるアミノ酸配列を有する。本発明はさらに前記ビトレオシラヘモグロビンをコードする核酸分子に関し、前記核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４で表される核酸配列を有する。本発明はさらに前記核酸分子を含むベクタ−に関する。本発明はさらに前記ベクタ−を含む微生物に関する。本発明はさらにゲノムの中に前記核酸分子が含まれる微生物に関する。

【0142】

本発明によれば、微生物は任意の微生物（例えば細菌、原生生物、藻類、真菌、または他の微生物）であっても良い。好ましい実施形態によれば、微生物は細菌、酵母または真菌を含むがこれらに限らない。好ましくは、前記微生物は細菌または酵母から選ばれる。

【0143】

より好ましくは、細菌はエシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュ−ドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）またはストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の属に属する細菌から選ばれるがこれらに限らない。さらに好ましくは、細菌は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ラクトバチルスブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、シュ−ドモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）またはストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）の種に属する細菌から選ばれるがこれらに限らない。さらに好ましくは、酵母はサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クルベルミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）およびファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）の酵母から選ばれるがこれらに限らない；より好ましくは、酵母はサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、ハンゼヌラポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・カナデンシス（Ｐｉｃｈｉａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）またはファフィア・ロドチ−マ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｏｈｏｄｏｚｙｍａ）から選ばれるが、これらに限らない。

【0144】

好ましくは、前記微生物は真菌である；さらに好ましくは、真菌はアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アブシディア属（Ａｂｓｉｄｉａ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ニュ−ロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に属する真菌から選ばれるがこれらに、限らない；より好ましくは、真菌はアスペルギルス・ニガ−（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アブシディア・コエルレア（Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｅｒｕｌｅａ）、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ロックンオウンズ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、ニュ−ロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ニュ−ロスポラ・インタ−メディア（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）またはトリコデルマ・リ−セイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）から選ばれるがこれらに限らない。特に好ましくはＫ−１２、ＢおよびＷをはじめとする大腸菌株、最も好ましくはＫ−１２である。大腸菌は、好ましい微生物として本発明の様々な実施形態の実施例に用いられるが、本発明の方法を理解するには、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが産生され且つ遺伝子改変によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの収率を向上させることができる任意のその他の微生物を用いることができる。本発明に用いられる微生物は生産生物体とも呼ばれる。

【0145】

本発明における用語Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは、２−アセチルアミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコ−スとも呼ばれる。用語Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸は、それぞれ、ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ−６−ＰおよびＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐとも略記される。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンはＮＡＧと略記される。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびその誘導体と同様、用語Ｄ−グルコサミン、Ｄ−グルコサミン６−リン酸およびＤ−グルコサミン１−リン酸は、それぞれ、ＧｌｃＮ、ＧｌｃＮ−６−Ｐ及びＧｌｃＮ−１−Ｐとも略記される。同様に、用語Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸、グルコ−ス、グルコ−ス−６−リン酸、フルクト−ス−６−リン酸は、それぞれ、ＭａｎＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐ、Ｇｌｃ、Ｇｌｃ−６−Ｐ、Ｆｒｕ−６−Ｐと略記される。

【0146】

微生物の中の酵素の働きを向上させるという用語は、当該酵素の活性を向上させ、及び／又は当該酵素を過剰発現させ、それによって微生物の中の当該酵素によって触媒される基質の生成物の量を増加させることを意味する。
微生物中の酵素の働きを低下させるという用語は、当該酵素の活性を低下させ、及び／又は、当該酵素の発現を低下させ、それによって微生物の中の当該酵素によって触媒される基質の生成物の量を減少させることを意味する。

【0147】

酵素活性を向上させるという用語は、酵素の、一定の化学反応に触媒として作用する能力を向上させることを意味する。それは、酵素が、生成物によって阻害される、および、酵素の基質に対する親和性が不変の条件下で、酵素自身の化学反応に触媒として作用する能力を向上させるということ、及び／又は、酵素活性が生成物の阻害作用によって低下することによって、及び／又は、酵素の基質に対する親和性の向上によって、酵素の一定の化学反応にを触媒として作用する能力を向上させることをカバ−するということである。酵素活性が生成物の阻害作用によって低下するという用語は、反応の触媒となる酵素の活性が、その最終産物の特異的阻害作用によって低下することを意味する。酵素の基質に対する親和性の向上という用語は、触媒される基質に対する親和性が向上することを意味する。

【0148】

図１は大腸菌を例に挙げて本発明により開示されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを大規模生産するためのアミノ糖の代謝経路における遺伝子改変の概要について説明する。

【0149】

図１において、太い矢印は本発明に係る遺伝的改変によって代謝フラックスを産生及び／又は増加させることを示す。図１によって複数のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを合成するための異なる方法を開示し、Ｖｈｂに対する改変を含むほか、ＮａｎＫ、ＮａｎＥ、ＮａｇＢ、ＧｌｍＳ、ＷｅｃＢまたはその組み合わせに対する改変を含み、さらにＭａｎＸＹＺ、ＮａｎＡ、ＮａｇＡ、ＮａｇＥ、ＧｌｍＭ、ＧｌｍＵまたはその組み合わせに対する改変を含む。本分野の技術者であれば、その他の微生物は類似の糖代謝経路を有し、且つこのような経路において遺伝子とタンパク質は類似の構造と機能を有することがわかる。そのため、本発明に関しては、大腸菌に適するほか、同様にその他の微生物に適し且つその他の微生物は明らかに本発明に含まれる。

【0150】

本分野公知の同じ生物活性を有する酵素は、異なる名前を持つことがあり、これは当該酵素の微生物由来に決められる。以下、本文中で言及される多くの酵素のオプションの名前、および、ある生物体由来のこのような酵素をコードする具体的遺伝子の名前について説明する。これらの酵素の名前は、互換使用されること、または適切な場合、所定の配列または生物体に用いることができるが、本発明の意図は、任意の生物体由来の特定の機能を有する酵素をカバ−することである。

【0151】

例えば、本文において一般的に「Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ」と呼ばれる酵素は、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−Ｐにリン酸化することに触媒作用する。大腸菌由来のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼは一般的にＮａｎＫと呼ばれる。様々な生物由来のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼがこの分野で公知化され、且つ本発明の遺伝的改変戦略に用いることができる。例えば、本文において大腸菌由来のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼもＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で表される核酸配列コ−ディング、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で表されるアミノ酸配列を有することが記載される。

【0152】

本文において「Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−Ｐエピメラーゼ」と呼ばれる酵素は、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−ＰからＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−Ｐへの変換に触媒作用する。大腸菌由来のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−Ｐエピメラーゼは一般的にＮａｎＥと呼ばれる。様々な生物体由来のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−Ｐエピメラーゼがこの分野で公知化され、且つ本発明の遺伝的改変戦略に用いることができる。例えば、本文に記載の大腸菌由来のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−ＰエピメラーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で表される核酸配列コ−ディング、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９で表されるアミノ酸配列を有する。

【0153】

本文において一般的に「ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ」と呼ばれる酵素は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンからＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンへの変換に触媒作用する。大腸菌由来のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼは、一般的にＷｅｃＢと呼ばれる。様々な生物体由来のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼがこの分野で公知化され、且つ本発明の遺伝的改変戦略に用いることができる。例えば、本文に記載の大腸菌由来のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９で表される核酸配列コ−ディング、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０で表されるアミノ酸配列を有する。

【0154】

本文において、一般的に「Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ」と呼ばれる酵素は、Ｄ−グルコサミン６−リン酸と水からグルコ−ス−６−リン酸アンモニウムへの可逆的反応に触媒作用する。当該酵素は、Ｄ−グルコサミン６−リン酸イソメラーゼ、ＧｌｃＮ６Ｐデアミナ−ゼ、リン酸Ｄ−グルコサミンエピメラーゼ、リン酸Ｄ−グルコサミンエピメラーゼ、Ｄ−グルコサミンリン酸デアミナ−ゼおよび２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコ−ス−６−リン酸アセトンアルコ−ルイソメラーゼ（脱アミノ化）とも呼ばれる。様々な生物体由来のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼはこの分野では公知化され、且つ本発明の遺伝的改変戦略に用いることができる。大腸菌およびその他の細菌において、当該酵素は一般的にＮａｇＢと呼ばれる。

【0155】

本文において、一般的に「Ｄ−グルコサミン６−リン酸シンターゼ」と呼ばれる酵素は、グルコ−ス−６−リン酸およびグルタミンからＤ−グルコサミン６−リン酸およびグルタミン酸への変換に触媒作用する。当該酵素は、Ｄ−グルコサミンフルクト−ス−６−リン酸アミノトランスファラーゼ（異性化）、リン酸ヘキソ−スアミノトランスファラーゼ、Ｄ−フルクト−ス−６−リン酸アミドトランスファラーゼ、Ｄ−グルコサミン６−リン酸イソメラーゼ（グルタミン形成）、Ｌ−グルタミン−フルクト−ス−６−リン酸アミドトランスファラーゼおよびＧｌｃＮ６Ｐシンターゼとも呼ばれる。様々な生物体由来のＤ−グルコサミン６−リン酸シンターゼがこの分野で公知化され、且つ本発明の遺伝的改変戦略に用いることができる。大腸菌およびその他の細菌由来のＤ−グルコサミン６−リン酸シンターゼは一般的にＧｌｍＳと呼ばれる。

【0156】

本文において、一般的に「Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ」と呼ばれる酵素は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸からＤ−グルコサミン６−リン酸と酢酸エステルへの加水分解に触媒作用する。様々な生物体由来のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼがこの分野で公知化され、且つ本発明の遺伝的改変戦略に用いることができる。例えば、本文に記載の大腸菌由来のものがＮａｇＡと呼ばれる。

【0157】

本文において、一般的に「Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ」と呼ばれる酵素は、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンからＮ−アセチルノイラミン酸への分解に、触媒として作用する。様々な生物体由来のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼがこの分野で公知化され、且つ本発明の遺伝的改変戦略に用いることができる。例えば、本文に記載の大腸菌由来のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼはＮａｎＡと呼ばれる。

【0158】

本文において、一般的に「ホスホグルコサミンムタ−ゼ」と呼ばれる酵素は、Ｄ−グルコサミン６−リン酸からＤ−グルコサミン１−リン酸への変換に、触媒として作用する。様々な生物体由来のリン酸Ｄ−グルコサミンムタ−ゼがこの分野で公知化され、且つ本発明の遺伝的改変戦略に用いることができる。当該酵素が大腸菌およびその他細菌におけるホスホグルコサミンムタ−ゼは一般的にＧｌｍＭと呼ばれる。

【0159】

本文において、一般的に「Ｄ−グルコサミン１−リン酸Ｎ−アセチルトランスファラーゼと呼ばれる酵素は、Ｄ−グルコサミン１−リン酸とアセチル補酵素ＡからＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸への変換に触媒作用し、且つＣｏＡを放出する。それはさらに、二機能性酵素として、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼの機能を備え、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンピロホスホリラ−ゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンジホスファタ−ゼとも呼ばれ、さらにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸を、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに変換する。様々な生物体由来のＤ−グルコサミン１−リン酸Ｎ−アセチルトランスファラーゼとＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼがこの分野で公知化され、且つ本発明の遺伝的改変戦略に用いることができる。当該酵素は大腸菌およびその他細菌においてＧｌｍＵと呼ばれる。

【0160】

「Ｔｒｃプロモーター」は、巧みな設計によって原核生物発現に用いることができ、例えば大腸菌発現系がある。Ｔｒｃプロモーターはこの分野で公知化され、且つ本発明の遺伝的改変戦略に用いることができる。例えば、本文に記載のＴｒｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で表されるヌクレオチド配列を有する。

【0161】

特許文献６（国際公開２００４／００３１７５号）に開示される発明のように、Ｄ−グルコサミンは、一般的に大腸菌の成長に用いるｐＨ範囲において極めて不安定である。Ｄ−グルコサミン及び／又はその分解産物は、菌株に対して毒性作用を示す。細胞摂取前に濃度２０ｇ／ＬのＤ−グルコサミンを、培地（ｐＨ７．０）において３．５時間プレインキュベ−トしても毒性が認められる。毒性は、少なくとも一部が、出発ｐＨが７．０の培地中のＤ−グルコサミンの分解産物によるものである。ＧｌｃＮはより低いｐＨ条件下でより安定し、Ｄ−グルコサミンはｐＨ４．７以下では分解しない。しかし、大腸菌は６−７未満のｐＨ条件下では成長が遅い。そのため、比較的低いｐＨ条件下で、発酵槽でＤ−グルコサミンの生産を行うことは困難である。

【発明の効果】

【0162】

本発明によれば、微生物内でビトレオシラヘモグロビン（ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ、Ｖｈｂ）を発現させることにより、微生物の溶存酸素を使用する能力を向上させ、タンパク質および代謝産物の合成を促進し、微生物の成長を促進し、発酵力価およびレベルを向上させ、さらに、細胞内においてＤ−グルコサミン６−Ｐ（ＧｌｃＮ−６−Ｐ）は、ＧｌｍＭとＧｌｍＵの触媒作用によってＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を生成し、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の触媒下でＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）になり、ＮａｎＫとＮａｎＥを過剰発現させることにより、さらにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐ）に変換し、ホスファタ−ゼの作用下で脱リン酸化され、細胞外に排出されてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）になる。本発明の方法により、Ｄ−グルコサミンの生成を回避し、それによって、Ｄ−グルコサミン及び／又はその分解産物が菌株に対する毒性作用を回避する。

【0163】

従って、本発明の有益な効果は以下のとおりである：本発明により微生物内においてビトレオシラヘモグロビン（ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ、Ｖｈｂ）を発現させることにより、微生物の溶存酸素を使用する能力を向上させ、タンパク質および代謝産物の合成を促進し、微生物の成長を促進し、発酵力価およびレベルを向上させ、それによって、微生物発酵法によって完全に天然なＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを直接生産することができる；当該新しい生産方法は重金属汚染リスクがなく、抗生物質や薬剤残留リスクがなく、生産が原材料供給の影響を受けず、安定して生産でき、且つ収率が高く、コストが低くなる；生産されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルコサミン製品は非動物由来であり、エビ殻のキチンを使用せず、グルコ−スなどの炭素源を使って発酵させ、菜食製品に属し、且つ水産物アレルゲンがない。

【0164】

本文において引用または記載される各公開文献と参考文献のあらゆる内容を本文に引用して参考にする。

【図面の簡単な説明】

【0165】

【図1】大腸菌におけるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン生合成経路および代謝工学戦略マップである。

【発明を実施するための形態】

【0166】

以下、具体的な実施例と合わせて本発明についてさらに詳しく説明する。
以下の実施例は、本発明を単に例示して説明するためのものであり、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
特に断りのない限り、実施例で使用される原料および試薬はいずれも市販品である。

【0167】

以下は、本発明に係る及び／又は記載される様々な遺伝子改変微生物のリスクである。

【表1A-1】

【表1A-2】

【表1A-3】

【表1A-4】

【0168】

（実施例１）
この実施例はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが取り込まれおよび有益な中間産物が分解されることにかかわる代謝経路を遮断する大腸菌の突然変異株を構築することを記載する。

【0169】

前記生産菌株の親株はＡＴ−００１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２７３２５）であり、大腸菌Ｋ−１２の派生株に属し、アメリカンタイプカルチャ−コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）からのものである。

【0170】

菌株がＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに対する取り込みおよび中間代謝産物に対する分解を阻害し、代謝過程における消費を減少させ、タ−ゲット産物（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）の蓄積を増加させる。
このような突然変異型宿主菌株を構築するには、その染色体のゲノムのＭａｎＸＹＺ、ＮａｎＡ、ＮａｇＡおよびＮａｇＥ遺伝子配列を全体的または部分的に削除し、その機能を無効にし、それによってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを蓄積させる。

【0171】

このような染色体における遺伝子配列削除は、Ｒｅｄ組換え技術によって実現される。Ｒｅｄ組換えはλファ−ジＲｅｄオペロンおよびＲａｃファ−ジＲｅｃＥ／ＲｅｃＴＲｅｃＴシステムによって媒介されるＤＮＡ相同組換え技術である。当該技術によって容易く、速く大きさが任意のＤＮＡ分子に対して挿入、削除、突然変異などの様々な改変を行うことができる。Ｒｅｄ組換え技術は簡単に言えば、先ず菌体に組換え酵素遺伝子を発現させるｐＫＤ４６プラスミドを導入し、そして調製された標的線状ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングし、最後に、組換え菌株の中の耐性遺伝子を削除する。
以下、具体的な操作過程について説明する：

【0172】

１，ＭａｎＸＹＺ 遺伝子配列を削除する
マンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ｍａｎｎｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^Man、ＭａｎＸＹＺ）はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの第二トランスポーターとすることができ、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンなどのヘキソ−スを細胞内に輸送することができ、それによって細胞外に排出され且つ蓄積するタ−ゲット産物を細胞内に輸送して分解する。ＭａｎＸＹＺ遺伝子配列を削除することによって、細胞外のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが細胞内に輸送・分解されることを阻害することができる。

【0173】

（１）Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長のＰＣＲ断片を調製する
１）ＰＣＲによってｆＫａｎｒｆ断片を増幅させる
ｆＫａｎｒｆ断片、即ちＦＲＴ−Ｋａｎｒ−ＦＲＴ断片とは、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）の両端にＦＬＰ組換え酵素特異的識別子をロ−ドするＦＲＴ部位の塩基配列である。
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ｍｆＫａｎｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１であり、リバ−スプライマ−（ｍｆＫａｎｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２である。
テンプレ−ト：ｐＰｉｃ９Ｋ。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す；
第３ステップ：７２℃で１０ｍｉｎ伸長を行う。
ｆＫａｎｒｆサイズ：１．２８ｋｂ。そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３である。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0174】

２）ＰＣＲによってＲｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長断片を増幅させる
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する： ＭａｎＸＹＺ配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.４によって、設計してＭａｎＸＹＺ配列のホモロジ−ア−ムフォワ−ドプライマ−（ＭａｎＸＹＺＫＯ−Ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.５、リバ−スプライマ−（ＭａｎＸＹＺＫＯ−Ｒ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６を削除する。
テンプレ−ト：増幅されたｆＫａｎｒｆ ＰＣＲ断片。
ＰＣＲ反応条件：第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す；
第３ステップ：７２℃で１０ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物：ホモロジ−ア−ム+ｆＫａｎｒｆ+ホモロジ−ア−ム。
ＰＣＲ産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して１００ｎｇ／μｌの線状ＤＮＡの完全長ＰＣＲ断片を得てＲｅｄ組換えタ−ゲティングに用いる。

【0175】

（２）Ｒｅｄ組換え操作
先ず、ｐＫＤ４６ベクタ−を大腸菌ＡＴ−００１の菌株に導入する。そして、調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。

【0176】

１）ｐＫＤ４６プラスミドの形質転換を行う
ｐＫＤ４６ベクタ−はＲｅｄ組換え酵素遺伝子を発現させるプラスミドであり、Ｅｘｏ、ＢｅｔおよびＧａｍの３個の遺伝子断片を発現させ、３個の遺伝子をアラビノ−スプロモーター下に置き、Ｌ−アラビノ−スにより誘導されて過剰に発現することができる。Ｒｅｄ組換えによって染色体上のタ−ゲット遺伝子を改変する目的を達成するために、ｐＫＤ４６プラスミドを大腸菌に導入する必要がある。

【0177】

i）コンピテントセルを作製する：先ず、−２０℃で保存されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２７３２５菌液を、１：５０−１００で１０ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍ、２−３時間振盪培養する。さらに培養液を１０ｍｌの遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに５ｍｉｎ懸濁させる。最後に４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。そのうち、０．１ＭＣａＣｌ_２の調製は次のとおりである：無水ＣａＣｌ_２で１ＭのＣａＣｌ_２を調製し、蒸気圧１５ ｌｂｆ／ｉｎ２の高圧で２０ｍｉｎ滅菌し、１．５ｍｌに分注して−２０℃で保存し、使用する前に融解してから１：１０の割合で希釈して、０．１ＭのＣａＣｌ_２に調製される。
ii）プラスミドの形質転換を行う：自然沈降された菌体２５０μｌを取り、５μｌｐＫＤ４６プラスミドを加え、−４℃、３０ｍｉｎ。そして、４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地 ０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。０．２ｍｌの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。３０℃で一晩（１２−１６時間）培養する。モノクロ−ナルを採取し、５ｍｌ ＬＢ液体培地に加えて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。

【0178】

２）調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする
i）電気的形質転換コンピテントセルを作製する：ｐＫＤ４６ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２７３２５を含む菌株ＡＴ−００１をアンピシリン（Ａｍｐ）ＬＢ培地を含む試験管に接種し、２５０ｒｐｍで一晩振盪し、翌日１％の量でＡｍｐを含むＬＢ培地に接種し、３０℃で培養し、ＯＤ₆₀₀が約０．２に達した後、ＯＤ₆₀₀が約０．４に達するまで、０．２％のＬ−アラビノ−スを加え、３０℃で３５分間誘導する。氷浴で冷却する。超純水で１回洗浄し、１０％グリセリンで２回洗浄し、最後に１０％グリセリンで再懸濁させ、グリセリンの用量は、菌体を５００−１０００倍の最終濃度に濃縮させる量であることが好ましい。
ii）電気ショック形質転換：２ｍｍ電気ショック形質転換用カップを７０％エタノ−ルから取り出し、滅菌超純水で２回洗浄し、紫外線ランプで３０分間照射する。４℃で３０分間予備冷却する。９０μｌの最終的に再懸濁された細胞を取り、予備冷却用遠心管に移し、５μｌ（１００ｎｇ以上）のステップ（１）で得られる完全長ＰＣＲ断片（線形ＤＮＡ）を加え、ガンでやさしく吸って均一つに混合させ、３０分間氷浴する。
電気的形質転換パラメ−タ：２５００Ｖ、２００Ω、２５μＦ。
iii）陽性クロ−ンの蘇生およびスクリーニング：１ｍｌのＬＢ液体培地を加え、３７℃、１００ｒｐｍ、１時間。そして２００μｌを１つのカナマイシン（Ｋａｎ）平板に塗布し、全部で５つの平板である。均一に塗布し、乾燥させる。３０℃で２４時間培養する。カナマイシン耐性下で成長するクロ−ンを採取し、ＰＣＲ同定を行い、陽性クロ−ンをスクリーニングする。
得られる菌株の番号：ＡＴ−００２−０１（ＡＴ−００１、△ＭａｎＸＹＺ：：ｆＫａｎｒｆ）。

【0179】

（３）耐性遺伝子を削除する
今後の研究のために、得られる菌株（陽性クロ−ン）の中の耐性遺伝子を削除することができる。耐性遺伝子の削除はｐＣＰ２０プラスミドによって実現される。ｐＣＰ２０ はアンピシリンおよびクロラムフェニコ−ルの耐性遺伝子を持つプラスミドであり、熱誘導後ＦＬＰ組換え酵素を発現させることができ、当該酵素はＦＲＴ部位を特異的に識別することができ、組換えによってＦＲＴ部位間の配列を削除し、ＦＲＴ部位を一つだけ残すことができる。

【0180】

ｐＣＰ２０を前記カナマイシン耐性クロ−ンに導入し、３０℃で８ｈ培養し、そして４２℃で一晩放置し、熱誘導によりＦＬＰ 組換え酵素を発現させ、プラスミドを徐々に失わせる。シクロスポリン接種液を、抗生物質を含まない培地に詰め、成長したモノクロ−ナルを選んでカナマイシン耐性平板に滴下し、成長しないものはカナマイシン耐性遺伝子がＦＬＰ組換え酵素に削除されるクロ−ンである。同定用プライマ−を使ってＰＣＲを行ってカナマイシン耐性が消失したクロ−ンに対して同定を行う。
得られる菌株の番号：ＡＴ−００２−０２（ＡＴ−００１、△ＭａｎＸＹＺ）。

【0181】

２，ＮａｎＡ遺伝子配列を削除する
Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎａｔｅ ｌｙａｓｅ、ＮａｎＡ）は微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）をＮ−アセチル−Ｄ−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）に分解することができる。ＮａｎＫＥＴＡオペロンの中のＮａｎＡ遺伝子配列を削除することにより、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）からＮ−アセチル−Ｄ−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）への分解を阻害することができる。

【0182】

（１）Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長ＰＣＲ断片を調製する
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する： ＮａｎＥ−ＮａｎＫ前半のＮａｎＡ配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.７により、ＮａｎＡ配列が削除されるホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ＮａｎＡＫＯ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.８であり、リバ−スプライマ−（ＮａｎＡＫＯ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.９である。
テンプレ−ト：増幅されたｆＫａｎｒｆ ＰＣＲ断片。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す；第３ステップ：７２℃で１０ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物：ホモロジ−ア−ム+ｆＫａｎｒｆ+ホモロジ−ア−ム。
ＰＣＲ産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して１００ｎｇ／μｌの線状ＤＮＡの完全長ＰＣＲ断片を得てＲｅｄ組換えタ−ゲティングに用いる。

【0183】

（２）Ｒｅｄ組換え操作
先ず、ｐＫＤ４６ベクタ−を大腸菌ＡＴ−００２−０２の菌株に導入する。そして、調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。

【0184】

１）ｐＫＤ４６プラスミドの形質転換を行う
i）コンピテントセルを作製する：先ず、−２０℃で保存されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴ−００２−０２（ＡＴ−００１、△ＭａｎＸＹＺ）菌液を、１：５０−１００で１０ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍ、２−３時間振盪培養する。そして培養液を１０ｍｌ遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに５ｍｉｎ懸濁させる。最後に４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。
ii）プラスミドの形質転換を行う：自然沈降された菌体２５０μｌを取り、５μｌｐＫＤ４６プラスミドを加え、−４℃、３０ｍｉｎ。そして、４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地 ０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。０．２ｍｌの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。３０℃で一晩（１２−１６時間）培養する。モノクロ−ナルを採取し、５ｍｌ ＬＢ液体培地に加えて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。

【0185】

２）調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする
i）電気的形質転換コンピテントセルを作製する： ｐＫＤ４６ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを含む菌株ＡＴ−００２−０２をアンピシリン（Ａｍｐ）ＬＢ培地を含む試験管に接種し、２５０ｒｐｍで一晩振盪し、翌日１％の量でＡｍｐを含むＬＢ培地に接種し、３０℃で培養し、ＯＤ₆₀₀が約０．２に達した後、０．２％のＬ−アラビノ−スを加え、ＯＤ₆₀₀が約０．４に達するまで、３０℃で３５分間誘導する。氷浴で冷却する。超純水で１回洗浄し、１０％グリセリンで２回洗浄し、最後に１０％グリセリンで再懸濁させ、グリセリンの用量は菌体を５００−１０００倍の最終濃度に濃縮させることが好ましい。
ii）電気ショック形質転換： ２ｍｍ電気ショック形質転換用カップを７０％エタノ−ルから取り出し、滅菌超純水で２回洗浄し、紫外線ランプで３０分間照射する。４℃で３０分間予備冷却する。９０μｌの最終的に再懸濁された細胞を取り、予備冷却用遠心管に移し、５μｌ（１００ｎｇ以上）のステップ（１）で得られる完全長ＰＣＲ断片（線形ＤＮＡ）を加え、ガンでやさしく吸って均一つに混合させ、３０分間氷浴する。電気的形質転換パラメ−タ：２５００Ｖ、２００Ω、２５μＦ。
iii）陽性クロ−ンの蘇生およびスクリーニング： １ｍｌのＬＢ液体培地を加え、３７℃、１００ｒｐｍ、１時間。そして２００μｌを１つのカナマイシン（Ｋａｎ）平板に塗布し、全部で５つの平板である。均一に塗布し、乾燥させる。３０℃で２４時間培養する。カナマイシン耐性下で成長するクロ−ンを採取し、ＰＣＲ同定を行い、陽性クロ−ンをスクリーニングする。
得られる菌株の番号： ＡＴ−００３−０１（ＡＴ−００２−０２、△ＮａｎＡ：：ｆＫａｎｒｆ）。

【0186】

（３）耐性遺伝子を削除する
ｐＣＰ２０を前記カナマイシン耐性クロ−ンに導入し、３０℃で８ｈ培養し、そして４２℃で一晩放置し、熱誘導によりＦＬＰ 組換え酵素を発現させ、プラスミドを徐々に失わせる。シクロスポリン接種液を、抗生物質を含まない培地に詰め、成長したモノクロ−ナルを選んでカナマイシン耐性平板に滴下し、成長しないものはカナマイシン耐性遺伝子がＦＬＰ組換え酵素に削除されるクロ−ンである。同定用プライマ−を使ってＰＣＲを行ってカナマイシン耐性が消失したクロ−ンに対して同定を行う。
得られる菌株の番号：ＡＴ−００３−０２（ＡＴ−００２−０２、△ＮａｎＡ）。

【0187】

３，ＮａｇＡ遺伝子配列を削除する
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌＧｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ、ＮａｇＡ）は微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐ）をＤ−グルコサミン６−リン酸（ＧｌｃＮ−６−Ｐ）に変換することができる。ｎａｇオペロン（ＮａｇＥ−ＮａｇＢＡＣＤ）の中のＮａｇＡ遺伝子配列を削除することにより、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐ）からＤ−グルコサミン６−リン酸（ＧｌｃＮ−６−Ｐ）への変換を阻害することができる。

【0188】

（１）Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長ＰＣＲ断片を調製する
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する： ＮＣＢＩ からＮＣ_０００９１３、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ. Ｋ−１２ Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼの遺伝子ＮａｇＡ配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１０を見つけ、ＮａｇＡ配列が削除されるホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ＮａｇＡＫＯ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１１であり、リバ−スプライマ−（ＮａｇＡＫＯ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１２である。
テンプレ−ト：増幅されたｆＫａｎｒｆ ＰＣＲ断片。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す；第３ステップ：７２℃で１０ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物：ホモロジ−ア−ム+ｆＫａｎｆ+ホモロジ−ア−ム。
ＰＣＲ産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して１００ｎｇ／μｌの線状ＤＮＡの完全長ＰＣＲ断片を得てＲｅｄ組換えタ−ゲティングに用いる。

【0189】

（２）Ｒｅｄ組換え操作
先ず、ｐＫＤ４６ベクタ−を大腸菌ＡＴ−００３−０２の菌株に導入する。そして、調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。

【0190】

１）ｐＫＤ４６プラスミドの形質転換を行う
i）コンピテントセルを作製する：先ず、−２０℃で保存されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴ−００３−０２（ＡＴ−００２−０２、△ＮａｎＡ）菌液を、１：５０−１００で１０ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍ、２−３時間振盪培養する。そして培養液を１０ｍｌ遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに５ｍｉｎ懸濁させる。最後に４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。
ii）プラスミドの形質転換を行う：自然沈降された菌体２５０μｌを取り、５μｌ ｐＫＤ４６プラスミドを加え、−４℃、３０ｍｉｎ。そして、４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地 ０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。０．２ｍｌの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。３０℃で一晩（１２−１６時間）培養する。モノクロ−ナルを採取し、５ｍｌ ＬＢ液体培地に加えて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。

【0191】

２）調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする
i）電気的形質転換コンピテントセルを作製する：ｐＫＤ４６ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを含む菌株ＡＴ−００３−０２をアンピシリン（Ａｍｐ）ＬＢ培地を含む試験管に接種し、２５０ｒｐｍで一晩振盪し、翌日１％の量でＡｍｐを含むＬＢ培地に接種し、３０℃で培養し、ＯＤ₆₀₀が約０．２に達した後、０．２％のＬ−アラビノ−スを加え、ＯＤ₆₀₀が約０．４に達するまで３０℃で３５分間誘導する。氷浴で冷却する。超純水で１回洗浄し、１０％グリセリンで２回洗浄し、最後に１０％グリセリンで再懸濁させ、グリセリンの用量は菌体を５００−１０００倍の最終濃度に濃縮させることが好ましい。
ii）電気ショック形質転換： ２ｍｍ電気ショック形質転換用カップを７０％エタノ−ルから取り出し、滅菌超純水で２回洗浄し、紫外線ランプで３０分間照射する。４℃で３０分間予備冷却する。９０μｌの最終的に再懸濁された細胞を取り、予備冷却用遠心管に移し、５μｌ（１００ｎｇ以上）のステップ（１）で得られる完全長ＰＣＲ断片（線形ＤＮＡ）を加え、ガンでやさしく吸って均一つに混合させ、３０分間氷浴する。
電気的形質転換パラメ−タ：２５００Ｖ、２００Ω、２５μＦ。
iii）陽性クロ−ンの蘇生およびスクリーニング： １ｍｌのＬＢ液体培地を加え、３７℃、１００ｒｐｍ、１時間。そして２００μｌを１つのカナマイシン（Ｋａｎ）平板に塗布し、全部で５つの平板である。均一に塗布し、乾燥させる。３０℃で２４時間培養する。カナマイシン耐性下で成長するクロ−ンを採取し、ＰＣＲ同定を行い、陽性クロ−ンをスクリーニングする。
得られる菌株の番号： ＡＴ−００４−０１（ＡＴ−００３−０２、△ＮａｇＡ：：ｆＫａｎｒｆ）。

【0192】

（３）耐性遺伝子を削除する
ｐＣＰ２０を前記カナマイシン耐性クロ−ンに導入し、３０℃で８ｈ培養し、そして４２℃で一晩放置し、熱誘導によりＦＬＰ 組換え酵素を発現させ、プラスミドを徐々に失わせる。シクロスポリン接種液を、抗生物質を含まない培地に詰め、成長したモノクロ−ナルを選んでカナマイシン耐性平板に滴下し、成長しないものはカナマイシン耐性遺伝子がＦＬＰ組換え酵素に削除されるクロ−ンである。同定用プライマ−を使ってＰＣＲを行ってカナマイシン耐性が消失したクロ−ンに対して同定を行う。
得られる菌株の番号： ＡＴ−００４−０２（ＡＴ−００３−０２、△ＮａｇＡ）。

【0193】

４，ＮａｇＥ遺伝子配列を削除する
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ＩＩ^Nag、ＮａｇＥ）の遺伝子配列ＮａｇＥを削除することにより、細胞外のＧｌｃＮＡｃが細胞内に輸送されて分解することを阻害することができる。

【0194】

（１）Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長ＰＣＲ断片を調製する
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する： ＮＣＢＩ からＮＣ_０００９１３、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ. Ｋ−１２ ＮａｇＢプロモーターとＮａｇＥ遺伝子配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１３を見つけ、ＮａｇＥ遺伝子配列が削除されるホモロジ−ア−ムフォワ−ドプライマ−（ＮａｇＥＫＯ−Ｆ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１４、リバ−スプライマ−（ＮａｇＥＫＯ−Ｒ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１５を設計する。
テンプレ−ト：増幅されたｆＫａｎｒｆ ＰＣＲ断片。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物：ホモロジ−ア−ム+ｆＫａｎｒｆ +ホモロジ−ア−ム。
ＰＣＲ産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して１００ｎｇ／μｌの線状ＤＮＡの完全長ＰＣＲ断片を得てＲｅｄ組換えタ−ゲティングに用いる。

【0195】

（２）Ｒｅｄ組換え操作
先ず、ｐＫＤ４６ベクタ−を大腸菌ＡＴ−００４−０２の菌株に導入する。そして、調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。

【0196】

１）ｐＫＤ４６プラスミドの形質転換を行う
i）コンピテントセルを作製する：先ず、−２０℃で保存されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴ−００４−０２（ＡＴ−００３−０２、△ＮａｇＡ）菌液を、１：５０−１００で１０ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍ、２−３時間振盪培養する。そして培養液を１０ｍｌ遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに５ｍｉｎ懸濁させる。最後に４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。
ii）プラスミドの形質転換を行う：自然沈降された菌体２５０μｌを取り、５μｌ ｐＫＤ４６プラスミドを加え、−４℃、３０ｍｉｎ。そして、４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地 ０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。０．２ｍｌの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。３０℃で一晩（１２−１６時間）培養する。モノクロ−ナルを採取し、５ｍｌ ＬＢ液体培地に加えて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。

【0197】

２）調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする
i）電気的形質転換コンピテントセルを作製する： ｐＫＤ４６ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを含む菌株ＡＴ−００４−０２をアンピシリン（Ａｍｐ）ＬＢ培地を含む試験管に接種し、２５０ｒｐｍで一晩振盪し、翌日１％の量でＡｍｐを含むＬＢ培地に接種し、３０℃で培養し、待ＯＤ₆₀₀が約０．２に達した後、０．２％のＬ−アラビノ−スを加え、ＯＤ₆₀₀が約０．４に達するまで３０℃で３５分間誘導する。氷浴で冷却する。超純水で１回洗浄し、１０％グリセリンで２回洗浄し、最後に１０％グリセリンで再懸濁させ、グリセリンの用量は菌体を５００−１０００倍の最終濃度に濃縮させることが好ましい。
ii）電気ショック形質転換： ２ｍｍ電気ショック形質転換用カップを７０％エタノ−ルから取り出し、滅菌超純水で２回洗浄し、紫外線ランプで３０分間照射する。４℃で３０分間予備冷却する。９０μｌの最終的に再懸濁された細胞を取り、予備冷却用遠心管に移し、５μｌ（１００ｎｇ以上）のステップ（１）で得られる完全長ＰＣＲ断片（線形ＤＮＡ）を加え、ガンでやさしく吸って均一つに混合させ、３０分間氷浴する。電気的形質転換パラメ−タ：２５００Ｖ、２００Ω、２５μＦ。
iii）陽性クロ−ンの蘇生およびスクリーニング： １ｍｌのＬＢ液体培地を加え、３７℃、１００ｒｐｍ、１時間。そして２００μｌを１つのカナマイシン（Ｋａｎ）平板に塗布し、全部で５つの平板である。均一に塗布し、乾燥させる。３０℃で２４時間培養する。カナマイシン耐性下で成長するクロ−ンを採取し、ＰＣＲ同定を行い、陽性クロ−ンをスクリーニングする。
得られる菌株の番号： ＡＴ−００５−０１（ＡＴ−００４−０２、△ＮａｇＥ：：ｆＫａｎｒｆ）。

【0198】

（３） 耐性遺伝子を削除する
ｐＣＰ２０を前記カナマイシン耐性クロ−ンに導入し、３０℃で８ｈ培養し、そして４２℃で一晩放置し、熱誘導によりＦＬＰ 組換え酵素を発現させ、プラスミドを徐々に失わせる。シクロスポリン接種液を、抗生物質を含まない培地に詰め、成長したモノクロ−ナルを選んでカナマイシン耐性平板に滴下し、成長しないものはカナマイシン耐性遺伝子がＦＬＰ組換え酵素に削除されるクロ−ンである。同定用プライマ−を使ってＰＣＲを行ってカナマイシン耐性が消失したクロ−ンに対して同定を行う。
得られる菌株の番号：ＡＴ−００５−０２（ＡＴ−００４−０２，△ＮａｇＥ）。

【0199】

（実施例２．ａ）
この実施例はＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の遺伝子ＮａｎＫのクロ−ン化および大腸菌におけるＮａｎＫ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換、並びにｐｔｒｃ− ＮａｎＫ遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込みについて説明する。

【0200】

１，ＮａｎＫ遺伝子のクロ−ン化、大腸菌におけるＮａｎＫ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換およびそれがＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮａｎＫ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ）の遺伝子ＮａｎＫを増幅させ、Ｔｒｃプロモーター制御下で菌株の形質転換を行い、それを過剰に発現させることにより、ＭａｎＮＡｃ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンまたはＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン）からＭａｎＮＡｃ−６−Ｐ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ−６−Ｐ、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸）へのリン酸化を増強させることができる。

【0201】

１）大腸菌ＮａｎＫ遺伝子のクロ−ン化
ＮＣＢＩ からＵ０００９６を見つけ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮａｎＫ遺伝子のヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１６、そのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１７が得られる。
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ＮａｎＫ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１８であり、リバ−スプライマ−（ＮａｎＫ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１９である。
テンプレ−ト：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴ−００１。
ＰＣＲ反応条件：第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す；第３ステップ：７２℃で１０ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物サイズ：０．９ｋｂ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
得られるＰＣＲ増幅断片とｐＵＣ５７−Ｔベクタ−を連結して配列決定・同定を行い、ＮａｎＫ／ｐＵＣ５７が得られる。

【0202】

２）ＮａｎＫ遺伝子のＴｒｃプロモーター制御下でのプラスミドの構築と形質転換
i）プラスミドの構築：プラスミドＮａｎＫ／ｐＵＣ５７を増幅させ、それぞれ酵素Ｎｃｏ ＩとＨｉｎｄＩＩＩを使ってプラスミドＮａｎＫ／ｐＵＣ５７とベクタ−ｐｔｒｃ９９Ａを切断し、アガロ−スゲル電気泳動によって分離させ、精製してＮａｎＫ断片とｐｔｒｃ９９Ａ断片を回収し、Ｔ４ ＤＮＡで酵素を連結し、１６℃で一晩放置し、且つ同定を行い、ＮａｎＫ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドが得られる。
ii）コンピテントセルを作製する：先ず、−２０℃で保存されるＡＴ−００５−０２菌液を、１：５０−１００で１０ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍ、２−３時間振盪培養する。そして培養液を１０ｍｌ遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに５ｍｉｎ懸濁させる。最後に４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。
iii）プラスミドの形質転換を行う：自然沈降後の菌体を２５０μｌ取り、５μｌ ＮａｎＫ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドに加え、−４℃、３０ｍｉｎ。そして、４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地 ０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。０．２ｍｌの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。３０℃で一晩（１２−１６時間）培養し。モノクロ−ナルを採取し、５ｍｌ ＬＢ液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。組換え菌 ＮａｎＫ／ｐｔｒｃ９９Ａ（ＡＴ−００５−０２）が得られる。

【0203】

３）ＮａｎＫ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換が?Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響
組換え菌 ＮａｎＫ／ｐｔｒｃ９９Ａ（ＡＴ−００５−０２）と対照菌株に対して、フラスコ振盪発酵試験を行う。新鮮培養されるＬＢ平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、３ｍｌのＬＢ液体培地付き試験管（１３×１５０ｍｍ）に接種し、３０℃、２２５ｒｐｍ、約８時間培養する。ＬＢ液体培地の成分は以下のとおりである：

【0204】

５ｇ／ｌ 酵母パウダ−、１０ｇ／ｌ ペプトン、１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ。そして種培養液を取り、３％を５０ｍｌの発酵培養液（Ｍ９培養液）を含む２５０ｍｌフラスコに接種する。初期ＯＤ₆₀₀ は約０．５であり、３７℃、２２５ｒｐｍで培養し、発酵サイクルは７２時間である。２４時間目、４８時間目、１０Ｍ ＮａＯＨを使って発酵液のｐＨを７．０に調整する。発酵液の糖分消費状況により、６５％グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を２０ｇ／ｌに維持する。発酵が終了し、１ｍｌの発酵液を取り、遠心分離する。ＨＰＬＣ法によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含量を測定する。

【0205】

i）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含量のＨＰＬＣ法測定
緩衝液：将３．５ｇリン酸水素二カリウムを１Ｌフラスコに入れ、水を加えて十分に溶解させ、０．２５ ｍｌアンモニア水を加え、そして水で希釈し、リン酸でｐＨを７．５に調整し、水で定容する。
移動相：アセトニトリル：緩衝液（７５：２５）。
希釈剤：アセトニトリルと水（５０：５０）。
標準溶液：１．０ｍｇ／ｍｌ ＵＳＰ Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン標準品（ＲＳ）を希釈剤に溶解する。
試料溶液：１．０ｍｇ／ｍｌ Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン試料を希釈剤に溶解する。
液相条件： 型番：ＬＣ 検出器：ＵＶ １９５ ｎｍ
カラム：４．６−ｍｍ×１５−ｃｍ; ３−μｍ ｐａｃｋｉｎｇ Ｌ８
流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：３５℃
注入量：１０μｌ
ii）Ｍ９培養液の調製
先ず５×Ｍ９培地を調製する：約８００ｍｌの二重蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）に６４ｇ Ｎａ₂ＨＰＯ_４７Ｈ_２Ｏ、１５ｇ ＫＨ₂ＰＯ_４、２．５ｇ ＮａＣｌ、５．０ｇ ＮＨ_４Ｃｌを加え、溶解した後、水を加えて１０００ｍｌとする。１２１℃で３０分間滅菌する。そしてそれぞれ１Ｍ ＭｇＳＯ_４、１Ｍ ＣａＣｌ_２、２０％ グルコ−スを調製し、且つ別々に滅菌する。そして表１に従ってＭ９培養液を調製し、そのうち、１０００×微量元素溶液は表２に従って調製される。

【0206】

［Ｍ９培養液の成分］

【表1】

【0207】

［１０００×微量元素溶液の成分］

【表2】

【0208】

iii）ＮａｎＫ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換がフラスコ発酵Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響
フラスコ発酵の収率を表３に示す。結果により、対照菌株ＡＴ−００５−０２の収率が非常に低く、検出されず、ＮａｎＫ遺伝子がＴｒｃプロモーター制御下で過剰発現する組換え菌ＮａｎＫ／ｐｔｒｃ９９Ａ（ＡＴ−００５−０２）の収率が著しく向上することが示唆される。

【0209】

［組換え菌ＮａｎＫ／ｐｔｒｃ９９Ａ（ＡＴ−００５−０２）のフラスコ発酵の収率］

【表3】

【0210】

２，ｐｔｒｃ−ＮａｎＫ 遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込み
ＮａｇＥ遺伝子部位をｐｔｒｃ−ＮａｎＫ 遺伝子カセットの染色体での組込み部位とする。ｐｔｒｃ−ＮａｎＫ 遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込みを実現するために、先ず、Ｔｒｃプロモーター付きのＮａｎＫ断片ｐｔｒｃ−ＮａｎＫ、および両端にＦＬＰ 組換え酵素識別部位（ＦＲＴ 部位）を有するカナマイシン耐性遺伝子断片：ＦＲＴ−Ｋａｎｒ−ＦＲＴ （ｆＫａｎｒｆ）を増幅させ、且つ連結する。そして、もう一度設計してＮａｇＥ遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのプライマ−を削除し、且つｐｔｒｃ−ＮａｎＫとｆＫａｎｒｆで連結される断片をテンプレ−トとし、Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長断片を増幅させる。

【0211】

具体的な操作手順は次のとおりである：
（１）ＰＣＲによりｐｔｒｃ−ＮａｎＫ断片を増幅させる
テンプレ−ト：ＮａｎＫ／ｐｔｒｃ９９Ａ。
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（Ｔｒｃｆｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２０であり、リバ−スプライマ−（Ｔｒｃｆｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２１である。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０ｍｉｎ伸長を行う。
産物サイズ：１．０５ｋｂ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0212】

（２）ＰＣＲ増幅ｆＫａｎｒｆ断片
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ｍｆＫａｎｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１であり、リバ−スプライマ−（ｍｆＫａｎｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２である。
テンプレ−ト：ｐＰｉｃ９Ｋ。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０ｍｉｎ伸長を行う。
ｆＫａｎｒｆサイズ：１．２８ｋｂ。そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３である。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0213】

（３）ｐｔｒｃ−ＮａｎＫに結合するｆＫａｎｒｆを増幅させる
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ｆＫａｎｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２２であり、リバ−スプライマ−（ｆＫａｎｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２３１である。
テンプレ−ト：ｆＫａｎｒｆ。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０ｍｉｎ伸長を行う。
二次増幅されるｆＫａｎｒｆのサイズ：１．３ｋｂ。

【0214】

（４）Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長ＰＣＲ断片を調製する
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する：もう一度設計してＮａｇＥ遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのフォワ−ドプライマ−（ＮａｇＥＫＯ−Ｆ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２４、リバ−スプライマ−（ＮａｇＥＫＯ−Ｒ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２５を削除する。
テンプレ−ト：ｐｔｒｃ−ＮａｎＫ ＰＣＲ断片と二次増幅されるｆＫａｎｒｆ ＰＣＲ断片、１：１で混合する。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物：ホモロジ−ア−ム+ ｐｔｒｃ−ＮａｎＫ−ｆＫａｎｒｆ+ホモロジ−ア−ム。
ＰＣＲ産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して１００ｎｇ／μｌの線状ＤＮＡの完全長ＰＣＲ断片を得てＲｅｄ組換えタ−ゲティングに用いる。

【0215】

（５） Ｒｅｄ組換え操作
先ず、ｐＫＤ４６ベクタ−を大腸菌ＡＴ−００４−０２の菌株に導入する。そして、調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。

【0216】

１）ｐＫＤ４６プラスミドの形質転換を行う
i）コンピテントセルを作製する：先ず、−２０℃で保存されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴ−００４−０２菌液を、１：５０−１００で１０ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍ、２−３時間振盪培養する。そして培養液を１０ｍｌ遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに５ｍｉｎ懸濁させる。最後に４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。
ii）プラスミドの形質転換を行う：自然沈降された菌体２５０μｌを取り、５μｌ ｐＫＤ４６プラスミドを加え、−４℃、３０ｍｉｎ。そして、４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地 ０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。０．２ｍｌの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。３０℃で一晩（１２−１６時間）培養する。モノクロ−ナルを採取し、５ｍｌ ＬＢ液体培地に加えて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。

【0217】

２）調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする
i）電気的形質転換コンピテントセルを作製する：ｐＫＤ４６ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを含む菌株ＡＴ−００４−０２をアンピシリン（Ａｍｐ）ＬＢ培地を含む試験管に接種し、２５０ｒｐｍで一晩振盪し、翌日１％の量でＡｍｐを含むＬＢ培地に接種し、３０℃で培養し、ＯＤ₆₀₀が約０．２に達した後、０．２％のＬ−アラビノ−スを加え、ＯＤ₆₀₀が約０．４に達するまで３０℃で３５分間誘導する。氷浴で冷却する。超純水で１回洗浄し、１０％グリセリンで２回洗浄し、最後に１０％グリセリンで再懸濁させ、グリセリンの用量は菌体を５００−１０００倍の最終濃度に濃縮させることが好ましい。
ii）電気ショック形質転換：２ｍｍ形質転換用カップを７０％エタノ−ルから取り出し、滅菌超純水で２回洗浄し、紫外線ランプで３０分間照射する。４℃で３０分間予備冷却する。９０μｌの最終的に再懸濁された細胞を取り、予備冷却用遠心管に移し、５μｌ（１００ｎｇ以上）のステップ（１）で得られる完全長ＰＣＲ断片（線形ＤＮＡ）を加え、ガンでやさしく吸って均一つに混合させ、３０分間氷浴する。電気的形質転換パラメ−タ：：２５００Ｖ、２００Ω、２５μＦ。
iii）陽性クロ−ンの蘇生およびスクリーニング： １ｍｌのＬＢ液体培地を加え、３７℃、１００ｒｐｍ、１時間。そして２００μｌを１つのカナマイシン（Ｋａｎ）平板に塗布し、全部で５つの平板である。均一に塗布し、乾燥させる。３０℃で２４時間培養する。カナマイシン耐性下で成長するクロ−ンを採取し、ＰＣＲ同定を行い、陽性クロ−ンをスクリーニングする。
得られる菌株の番号： ＡＴ−００６−０１（ＡＴ−００４−０２、△ＮａｇＥ：：ｐｔｒｃ−ＮａｎＫ−ｆＫａｎｒｆ）。

【0218】

（６） 耐性遺伝子を削除する
ｐＣＰ２０を前記カナマイシン耐性クロ−ンに導入し、３０℃で８ｈ培養し、そして４２℃で一晩放置し、熱誘導によりＦＬＰ 組換え酵素を発現させ、プラスミドを徐々に失わせる。シクロスポリン接種液を、抗生物質を含まない培地に詰め、成長したモノクロ−ナルを選んでカナマイシン耐性平板に滴下し、成長しないものはカナマイシン耐性遺伝子がＦＬＰ組換え酵素に削除されるクロ−ンである。同定用プライマ−を使ってＰＣＲを行ってカナマイシン耐性が消失したクロ−ンに対して同定を行う。
得られる菌株の番号： ＡＴ−００６−０２（ＡＴ−００４−０２，△ＮａｇＥ：：ｐｔｒｃ−ＮａｎＫ）。

【0219】

３，ｐｔｒｃ−ＮａｎＫ遺伝子カセットの組込みがＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響
染色体のＮａｇＥ遺伝子部位においてｐｔｒｃ−ＮａｎＫ遺伝子カセットが組込まれる組換え菌ＡＴ−００６−０２と対照菌株に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるＬＢ平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、３ｍｌのＬＢ液体培地付き試験管（１３×１５０ｍｍ）に接種し、３０℃、２２５ｒｐｍ、約８時間培養する。そして種培養液を取り、３％を５０ｍｌの発酵培養液（Ｍ９培養液）を含む２５０ｍｌフラスコに接種する。初期ＯＤ６００ は約０．５であり、３７℃、２２５ｒｐｍで培養し、発酵サイクルは７２時間である。２４時間目、４８時間目、１０Ｍ ＮａＯＨを使って発酵液のｐＨを７．０に調整する。据発酵液の糖分消費状況により、６５％グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を２０ｇ／ｌに維持する。発酵が終了し、１ｍｌの発酵液を取り、遠心分離する。ＨＰＬＣ法によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含量を測定する。

【0220】

フラスコ発酵収率を表４に示す。結果により、対照菌株ＡＴ−００１、ＡＴ−００５−０２の収率は非常に低く、検出されず、一方ではｐｔｒｃ−ＮａｎＫ遺伝子カセットが組込まれる組換え菌の収率が著しく向上し、且つ組み込まれていない組換え菌ＮａｎＫ／ｐｔｒｃ９９Ａ（ＡＴ−００５−０２）の収率よりも著しく向上する。

【0221】

［ｐｔｒｃ−ＮａｎＫ遺伝子カセットが組込まれる組換え菌のフラスコ発酵の収率］

【表4】

【0222】

（実施例２．ｂ）
本実施例は突然変異するＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の遺伝子のスクリーニングについて説明し、前記遺伝子は酵素活性を向上させるＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）をコードする。
さらに生産菌株の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン合成量を向上させるため、酵素活性を向上させるＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）をコードする遺伝子の突然変異体をスクリーニングする。当該目的を達成するため、エラ−プロ−ンＰＣＲ技術によってクロ−ン化した遺伝子を増幅させ、増幅に用いるＤＮＡ ポリメラ−ゼにより、ミスマッチが高頻度に生じる条件下で前記遺伝子を増幅させ、それによってＰＣＲ産物から突然変異が高頻度で得られる。
具体的な操作手順は次のとおりである：

【0223】

１，エラ−プロ−ンＰＣＲによって大腸菌Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼの遺伝子ＮａｎＫを増幅させる
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ−ゼが３’ −５’校正機能を持たない性質を利用し、高マグネシウムイオン濃度(８ｍｍｏｌ／Ｌ)およびｄＮＴＰ濃度の異なる濃度 （そのうち、ｄＡＴＰとｄＧＴＰの濃度は１．５ｍｍｏｌ／Ｌである；ｄＴＴＰとｄＣＴＰの濃度は３．０ｍｍｏｌ／Ｌである）下で、ランダム突然変異の頻度を制御し、タ−ゲット遺伝子にランダム突然変異を導入し、突然変異ライブラリ−を構築する；テンプレ−ト濃度のＡ２６０値は１０００ｎｇ／ｍｌであり、酵素の濃度は５Ｕ／μｌであり、プライマ−の濃度は１００μＭである。
エラ−プロ−ンＰＣＲ反応系（５０μｌ）：１０×ＰＣＲ反応緩衝液５μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）５μｌ、ＭｇＣｌ_２（２５ｍＭ）５μｌ、フォワ−ドプライマ−（ＮａｎＫ−Ｆ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１８）１μｌ、リバ−スプライマ−（ＮａｎＫ−Ｒ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１９）１μｌ、ＤＮＡテンプレ−ト（ＮａｎＫ／ｐＵＣ５７）０．１μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ−ゼ０．５μｌ、ｄｄＨ_２Ｏ ３２．４μｌ。
ＰＣＲ 手順：９６℃で４ｍｉｎ予備変性を行う；９４℃で１ｍｉｎ変性を行い、５６℃で１ｍｉｎアニ−リングを行い、７５℃で２ｍｉｎ伸長を行い、４５サイクル；最後に７５℃で１５ｍｉｎ伸長を行い、ゲル回収法によりＰＣＲ産物（産物サイズ：０．９ｋｂ）を回収する；５μｌ産物を取って１％アガロ−スゲル電気泳動を行い、−２０℃で保存して必要に備える。

【0224】

２，Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼの遺伝子突然変異体ライブラリ−を構築する
前記ＰＣＲ産物は制限エンドヌクレア−ゼＮｃｏ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩの二重消化によって消化された後、Ｎｃｏ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩエンドヌクレア−ゼで消化されたｐｔｒｃ９９Ａプラスミドとライゲ−ション反応を行い、そしてライゲ−ション産物の混合物によって大腸菌 ＡＴ−００５−０２の形質転換を行い、大量のクロ−ン化した形質転換体が得られ、形質転換菌体の突然変異ライブラリ−を構築する。

【0225】

３，高酵素活性の突然変異体をスクリーニングする
形質転換菌体突然変異ライブラリ−から、３００個の突然変異するクロ−ンを無作為に選び、野生型ＮａｎＫ／ｐｔｒｃ９９Ａ（ＡＴ−００５−０２）を対照菌株とし、それぞれ５０μｇ／ｍｌペニシリン（Ａｍｐ）を含む５ｍｌ ＬＢ培地に接種し、３７℃、１５０ｒｐｍで１８ｈ培養した後、１００００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、菌体を収集する。上清を捨てた後、４℃で１ｍｌ ＰＢＳ(ｐＨ値７．５、１０Ｍｍｏｌ／Ｌ)溶液に再懸濁させ、氷浴条件下で３００Ｖの電圧を選び、６ｓ 間隔で超音波を３ｓ出して１０Ｍｉｎ超音波破砕を行い、遠心分離して上清を取って酵素粗抽出液とし、酵素活性測定を行う。

【0226】

Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の活性を測定する：Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）がリン酸化される程度に基づき、即ちＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの減少を測定マ−クとする。酵素活性単位の定義は次のとおりである：酵素促進反応条件下で、１分間当たり１μｍｏｌ Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンに相当する還元糖を減少させるために必要な酵素量を、１酵素活力単位(ＩＵ)とする。具体的な操作は次のとおりである：５ｍｌ反応系を酵素活力測定系とし、そのうち５００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、５ｍｍｏｌ／Ｌ グルコ−ス、１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）および １００μｌ粗酵素液を含む。酵素活性反応は３７℃の水浴下で行われ、４ｈ温度を維持し、そして酵素分解液を７０℃で１０Ｍｉｎ反応終了させる。３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液を取る。ＨＰＬＣによってＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン含量を測定する。

【0227】

結果により、最も高い突然変異株の酵素活性は７７．５ ＩＵ／ｍｌであり、対照菌株の酵素活性は１６．３ ＩＵ／ｍｌであることが示される。エラ−プロ−ンＰＣＲによってＮａｎＫを改変し、酵素活性が５倍向上する突然変異株が得られる。当該酵素の活性が最も高い突然変異株を選び、プラスミドを抽出して配列を決める。結果により、当該Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ突然変異体の遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２６であり、対応するアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２７で表わされることが分かる。野生型Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼの遺伝子配列に比較し、全部で４つの塩基点突然変異が生じる：１０７Ａ／Ｇ、３０９Ｔ／Ｇ、６６９Ｇ／Ｃ、７８３Ａ／Ｇ；アミノ酸の３つのミスセンス突然変異が生じ、その突然変異点はそれぞれ次のとおりである： Ｑ３６Ｒ（３６位のリジンからアルギニンへの変換）、Ｉ１０３Ｍ（１０３位のリジンからメチオニンへの変換）、Ｒ２２３ｓ（２２３位のアルギニンからセリンへの変換）。当該突然変異遺伝子はＮａｎＫＭと命名される。

【0228】

４，ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭ遺伝子カセットの大腸菌染色体のＮａｇＥ遺伝子部位への組込み
ＮａｇＥ遺伝子部位をｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭ 遺伝子カセットの染色体での組込み部位とする。ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭ 遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込みを実現するために、先ず、Ｔｒｃプロモーター付きのＮａｎＫＭ断片ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭ、および両端にＦＬＰ 組換え酵素識別部位（ＦＲＴ 部位）を有するカナマイシン耐性遺伝子断片：ＦＲＴ−Ｋａｎｒ−ＦＲＴ （ｆＫａｎｒｆ）を増幅させ、且つ連結する。そして、もう一度設計してＮａｇＥ遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのプライマ−を削除し、且つｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭとｆＫａｎｒｆで連結される断片をテンプレ−トとし、Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長断片を増幅させる。

【0229】

具体的な操作手順は次のとおりである：（１）ＰＣＲによってｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭ断片を増幅させる
テンプレ−ト：ＮａｎＫＭ／ｐｔｒｃ９９Ａ。
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（Ｔｒｃｆｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２０であり、リバ−スプライマ−（Ｔｒｃｆｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２１である。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
産物サイズ：１．０５ｋｂ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0230】

（２）ＰＣＲによってｆＫａｎｒｆ断片を増幅させる
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ｍｆＫａｎｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１であり、リバ−スプライマ−（ｍｆＫａｎｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２である。
テンプレ−ト：ｐＰｉｃ９Ｋ。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
ｆＫａｎｒｆサイズ：１．２８ｋｂ。そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３である。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0231】

（３） ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭに結合するｆＫａｎｒｆ を増幅させる プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ｆＫａｎｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２２であり、リバ−スプライマ−（ｆＫａｎｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２３１である。
テンプレ−ト：ｆＫａｎｒｆ。
ＰＣＲ反応条件：第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す；第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
二次増幅されるｆＫａｎｒｆのサイズ：１．３ｋｂ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0232】

（４）Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長のＰＣＲ断片を調製する
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する：もう一度設計してＮａｇＥ遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのフォワ−ドプライマ−（ＮａｇＥＫＯ−Ｆ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２４、リバ−スプライマ−（ＮａｇＥＫＯ−Ｒ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２５を削除する。
テンプレ−ト：ｐｔｒｃ−ＮａｎＫ ＰＣＲ断片と二次増幅されるｆＫａｎｒｆ ＰＣＲ断片、１：１で混合する。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物：ホモロジ−ア−ム+ ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭ−ｆＫａｎｒｆ+ホモロジ−ア−ム。
ＰＣＲ産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して１００ｎｇ／μｌの線状ＤＮＡの完全長ＰＣＲ断片を得てＲｅｄ組換えタ−ゲティングに用いる。

【0233】

（５）Ｒｅｄ組換え操作
先ず、ｐＫＤ４６ベクタ−を大腸菌ＡＴ−００４−０２の菌株に導入する。そして、調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。

【0234】

１）ｐＫＤ４６プラスミドの形質転換を行う
i）コンピテントセルを作製する：先ず、−２０℃で保存されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴ−００４−０２菌液を、１：５０−１００で１０Ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍで、２−３時間振盪培養する。さらに培養液を１０Ｍｌ遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに５ｍｉｎ懸濁させる。最後に４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。
ii）プラスミドの形質転換を行う：自然沈降された菌体２５０μｌを取り、５μｌ ｐＫＤ４６プラスミドを加え、−４℃、３０ｍｉｎ。そして、４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地 ０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。０．２ｍｌの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。３０℃で一晩（１２−１６時間）培養する。モノクロ−ナルを採取し、５ｍｌ ＬＢ液体培地に加えて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。

【0235】

２） 調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする
i）電気的形質転換コンピテントセルを作製する：ｐＫＤ４６ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを含む菌株ＡＴ−００４−０２をアンピシリン（Ａｍｐ）ＬＢ培地を含む試験管に接種し、２５０ｒｐｍで一晩振盪し、翌日１％の量でＡｍｐを含むＬＢ培地に接種し、３０℃で培養し、ＯＤ₆₀₀が約０．２に達した後、０．２％のＬ−アラビノ−スを加え、ＯＤ₆₀₀が約０．４に達するまで３０℃で３５分間誘導する。氷浴で冷却する。超純水で１回洗浄し、１０％グリセリンで２回洗浄し、最後に１０％グリセリンで再懸濁させ、グリセリンの用量は菌体を５００−１０００倍の最終濃度に濃縮させることが好ましい。
ii）電気ショック形質転換：２ｍｍ形質転換用カップを７０％エタノ−ルから取り出し、滅菌超純水で２回洗浄し、紫外線ランプで３０分間照射する。４℃で３０分間予備冷却する。９０μｌの最終的に再懸濁された細胞を取り、予備冷却用遠心管に移し、５μｌ（１００ｎｇ以上）のステップ（１）で得られる完全長ＰＣＲ断片（線形ＤＮＡ）を加え、ガンでやさしく吸って均一つに混合させ、３０分間氷浴する。
電気的形質転換パラメ−タ：：２５００Ｖ、２００Ω、２５μＦ。
iii）陽性クロ−ンの蘇生およびスクリーニング： １ｍｌのＬＢ液体培地を加え、３７℃、１００ｒｐｍ、１時間。そして２００μｌを１つのカナマイシン（Ｋａｎ）平板に塗布し、全部で５つの平板である。均一に塗布し、乾燥させる。３０℃で２４時間培養する。カナマイシン耐性下で成長するクロ−ンを採取し、ＰＣＲ同定を行い、陽性クロ−ンをスクリーニングする。
得られる菌株の番号： ＡＴ−００７−０１（ＡＴ−００４−０２，△ＮａｇＥ：：ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭ−ｆＫａｎｒｆ）。

【0236】

（６） 耐性遺伝子を削除する
ｐＣＰ２０を前記カナマイシン耐性クロ−ンに導入し、３０℃で８ｈ培養し、そして４２℃で一晩放置し、熱誘導によりＦＬＰ 組換え酵素を発現させ、プラスミドを徐々に失わせる。シクロスポリン接種液を、抗生物質を含まない培地に詰め、成長したモノクロ−ナルを選んでカナマイシン耐性平板に滴下し、成長しないものはカナマイシン耐性遺伝子がＦＬＰ組換え酵素に削除されるクロ−ンである。同定用プライマ−を使ってＰＣＲを行ってカナマイシン耐性が消失したクロ−ンに対して同定を行う。
得られる菌株の番号： ＡＴ−００７−０２（ＡＴ−００４−０２，△ＮａｇＥ：：ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭ）。

【0237】

５，ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭ遺伝子カセットの組込みがＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響
染色体のＮａｇＥ遺伝子部位においてｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭ遺伝子カセットが組込まれる組換え菌ＡＴ−００７−０２と対照菌株に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるＬＢ平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、３ｍｌのＬＢ液体培地付き試験管（１３×１５０ｍｍ）に接種し、３０℃、２２５ｒｐｍ、約８時間培養する。そして種培養液を取り、３％を５０ｍｌの発酵培養液（Ｍ９培養液）を含む２５０ｍｌフラスコに接種する。初期ＯＤ６００ は約０．５であり、３７℃、２２５ｒｐｍで培養し、発酵サイクルは７２時間である。２４時間目、４８時間目に、１０Ｍ ＮａＯＨを使って発酵液のｐＨを７．０に調整する。据発酵液の糖分消費状況により、６５％グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を２０ｇ／ｌに維持する。発酵が終了し、１ｍｌの発酵液を取り、遠心分離する。ＨＰＬＣ法によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含量を測定する。

【0238】

フラスコ発酵収率を表５に示す。結果により、対照菌株ＡＴ−００５−０２の収率は非常に低く、検出されず、突然変異したｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭ遺伝子カセットが組込まれる組換え菌ＡＴ−００７−０２の収率が著しく向上し、且つ突然変異しない対照菌株ＡＴ−００６−０２の収率よりも著しく向上する。

【0239】

［ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭ遺伝子カセットが組込まれる組換え菌のフラスコ発酵の収率］

【表5】

【0240】

前記結果により： Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼの過剰発現によりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率を著しく向上させることができるだけでなく、エラ−プロ−ンＰＣＲ技術によって突然変異体をスクリーニングすることもＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率を大きく向上させることができ、これは得られる当該酵素の突然変異体が酵素の活性を向上させることによるものであることが分かる。

【0241】

（実施例２．ｃ）
本実施例はｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭカセットが組込まれる大腸菌株、特にビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂおよびその突然変異体が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響について説明する。

【0242】

ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）の遺伝子Ｖｈｂを増幅させ、且つｐｔｒｃ９９Ａを挿入し、それによってＶｈｂをＴｒｃプロモーターの制御下で菌株の形質転換を行い、またはビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）の遺伝子Ｖｈｂの突然変異体をスクリーニングしてｐｔｒｃ９９Ａを挿入し、菌株の形質転換を行い、それによって微生物の溶存酸素を利用する能力を向上させ、Ｎ−アセチルグルコサミン発酵生産収率を向上させる。

【0243】

１，ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭカセットが組込まれる大腸菌株、ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂ
（１）Ｖｈｂ遺伝子を増幅させ、且つｐｔｒｃ９９Ａを挿入する
ビトレオシラヘモグロビン遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６０であり、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６１である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉがコドン塩基を優先することにより、ビトレオシラヘモグロビン遺伝子の最適化・合成を行い、ｐＵＣ５７ ベクタ−をロ−ドする。得られたベクタ−はｐＶＳ／ｐＵＣ５７と命名される。
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（Ｖｈｂ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６２であり、リバ−スプライマ−（Ｖｈｂ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６３である。
テンプレ−ト： ｐＶＳ／ｐＵＣ５７。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物サイズ：４４１ｂｐ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製して断片を回収する。
得られるＰＣＲ増幅断片とベクタ−ｐｔｒｃ９９Ａ をそれぞれＮｃｏ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、アガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製してＶｈｂ断片とｐｔｒｃ９９Ａ断片を回収し、Ｔ４ ＤＮＡで酵素を連結し、１６℃で一晩放置し、且つ同定を行い、Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドが得られる。

【0244】

（２）Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａによってｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭカセットが組込まれる大腸菌株の形質転換を行う。
１）コンピテントセルを作製する
i）−２０℃で保存されるＡＴ−００７−０２菌液を、１：５０−１００で１０Ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍで、２−３時間振盪培養する。
ii）将養液を１０Ｍｌ遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌで５ｍｉｎ懸濁させる。
iii）４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌで懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。
２）プラスミドの形質転換を行う
i）自然沈降後の菌体２５０μｌを取り、５μｌ Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドを加え、−４℃、３０ｍｉｎ。
ii）４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地 ０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。
iii）０．２ｍｌ菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。
iv）３０℃で一晩（１２−１６時間）培養する。
v）モノクロ−ナルを採取し、５ｍｌ ＬＢ液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。
vi）陽性クロ−ンを保存して必要に備える。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０５２（ＡＴ−００７−０２，Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａ）。

【0245】

２，ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭカセットが組込まれる大腸菌株、ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂの突然変異体
さらに生産菌株の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン合成量を向上させるため、活性向上を有するビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）をコードする遺伝子の突然変異体をスクリーニングする。当該目的を達成するため、エラ−プロ−ンＰＣＲ技術でクロ−ン化した遺伝子を増幅させ、増幅に用いるＤＮＡ ポリメラ−ゼにより、ミスマッチが高頻度に生じる条件下で前記遺伝子を増幅させ、それによってＰＣＲ産物から突然変異が高頻度で得られる。

【0246】

具体的な操作手順は次のとおりである：
（１）エラ−プロ−ンＰＣＲによって大腸菌ビトレオシラヘモグロビン遺伝子Ｖｈｂを増幅させる
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ−ゼが３' −５'校正機能を持たない性質を利用し、高マグネシウムイオン濃度(８ｍｍｏｌ／Ｌ)およびｄＮＴＰ濃度の異なる濃度（そのうち、ｄＡＴＰとｄＧＴＰの濃度は１．５ｍｍｏｌ／Ｌである；ｄＴＴＰとｄＣＴＰの濃度は３．０ｍｍｏｌ／Ｌである）下で、ランダム突然変異の頻度を制御し、タ−ゲット遺伝子にランダム突然変異を導入し、突然変異ライブラリ−を構築する；テンプレ−ト濃度のＡ２６０値は１０００ｎｇ／ｍｌであり、酵素の濃度は５Ｕ／μｌであり、プライマ−の濃度は１００μＭである。
エラ−プロ−ンＰＣＲ反応系（５０μｌ）：１０×ＰＣＲ反応緩衝液５μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）５μｌ、ＭｇＣｌ_２ （２５ｍＭ）５μｌ、フォワ−ドプライマ−（Ｖｈｂ−Ｆ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６２）１μｌ、リバ−スプライマ−（Ｖｈｂ−Ｒ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６３）１μｌ、ＤＮＡテンプレ−ト（ＮａｎＫ／ｐＵＣ５７）０．１μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ−ゼ０．５μｌ、ｄｄＨ_２Ｏ ３２．４μｌ。
ＰＣＲ 手順：
９６℃で４ｍｉｎ予備変性を行う。
９４℃で１ｍｉｎ変性を行い、５６℃で１ｍｉｎアニ−リングを行い、７５℃で２ｍｉｎ伸長を行い、４５サイクル；最後に７５℃で１５ｍｉｎ伸長を行い、ゲル回収法によりＰＣＲ産物（産物サイズ：０．９ｋｂ）を回収する。
５μｌ産物を取って１％アガロ−スゲル電気泳動を行い、−２０℃で保存して必要に備える。

【0247】

（２）ビトレオシラヘモグロビンの遺伝子突然変異体ライブラリ−を構築する
前記ＰＣＲ産物は制限エンドヌクレア−ゼＮｃｏ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩの二重消化によって消化された後、Ｎｃｏ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩエンドヌクレア−ゼで消化されたｐｔｒｃ９９Ａプラスミドとライゲ−ション反応を行い、そしてライゲ−ション産物の混合物によって大腸菌 ＡＴ−００５−０２の形質転換を行い、大量のクロ−ン化した形質転換体が得られ、形質転換菌体の突然変異ライブラリ−を構築する。

【0248】

（３）高活性突然変異体をスクリーニングする
形質転換菌体突然変異ライブラリ−から、突然変異するクロ−ンを４２０株無作為に選び、野生型Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａ（ＡＴ−００５−０２）を対照菌株とし、それぞれ５０μｇ／ｍｌペニシリン（Ａｍｐ）を含む５ｍｌ ＬＢ培地に接種し、３７℃、１５０ｒｐｍで１８ｈ培養した後、１００００ｒｐｍで、５ｍｉｎ遠心分離し、菌体を収集する。上清を捨てた後、４℃で１ｍｌ ＰＢＳ(ｐＨ値７．５、１０Ｍｍｏｌ／Ｌ)溶液に再懸濁させ、氷浴条件下で３００Ｖの電圧を選び、６ｓ間隔で超音波を３ｓ出して１０Ｍｉｎ超音波破砕を行い、遠心分離して上清を取って酵素粗抽出液とし、活性測定を行う。
ビトレオシラヘモグロビン活性測定：ＣＯ−差吸収スペクトル法によってビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）の活性測定を行う。ＣＯ とビトレオシラヘモグロビンが結合した後約４２０ｎｍの光波に強い吸収ピ−クが生じ、典型的なＶｈｂタンパク質の特性曲線が形成され、故にこの吸収ピ−クの強さの測定結果によって、発現したＶｈｈｂ タンパク質の活性を知ることができる。

【0249】

測定方法：前記異なるタイプの組換え大腸菌が酸素制限振盪フラスコ培養と低酸素条件下で（溶存酸素≦２０％）数回に分けて材料供給を行って発酵培養試験を行い、それぞれ６ｍｌ培養液を取って遠心分離し、菌体を収集し、沈殿を生理食塩水緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で１回洗浄し、そして３ｍｌ 緩衝液に懸濁させ、超音波による破砕を行い、４℃、１００００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離し、上清を取り、上清を３ｍｌ 緩衝液で１倍に希釈し、且つ亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）を加えて最終濃度を２．５ｍｇ／ｍｌにし、そしてＣＯガスを導入し、３ｍｉｎ 後紫外可視分光光度計により、４００〜５００ ｎｍの波長範囲でスキャンし、紫外線スペクトルの最大吸収ピ−ク（Ａｂｓ）の値によりビトレオシラヘモグロビン活性の高さを決める。
スクリーニングにより、活性が最も高い突然変異菌株が得られる。

【0250】

当該菌株を選び、プラスミドを抽出して配列を決める。結果により、当該ビトレオシラヘモグロビン突然変異体の遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６４であり、対応するアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６５で表わされることが分かる。野生型Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ遺伝子配列に比較し、全部で３つの塩基点突然変異が生じる：１３３Ａ／Ｃ、２５６Ｔ／Ｇ、２８４Ａ／Ｃ；アミノ酸の３つのミスセンス突然変異が生じ、その突然変異点はそれぞれ次のとおりである：Ｍ４５Ｌ（４５位のメチオニンからロイシンへの変換）、Ｃ８６Ｇ（８６位のシステインからグリシンへの変換）、Ｙ９５Ｓ（９５位のチロシンからセリンへの変換）。当該突然変異遺伝子はＶｈｂＭと命名される。

【0251】

（４）ＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９Ａによってｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭカセットが組込まれる大腸菌株の形質転換を行う。
１）コンピテントセルを作製する
i）−２０℃で保存されるＡＴ−００７−０２菌液を、１：５０−１００で１０Ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍで、２−３時間振盪培養する。
ii）将養液を１０Ｍｌ遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌで５ｍｉｎ懸濁させる。
iii）４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌで懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。
２）プラスミドの形質転換を行う
i）自然沈降後の菌体２５０μｌを取り、５μｌ Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドを加え、−４℃、３０ｍｉｎ。
ii）４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地 ０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。
iii）０．２ｍｌ菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。
iv）３０℃で一晩（１２−１６時間）培養する。
v）モノクロ−ナルを採取し、５ｍｌ ＬＢ液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。
vi）陽性クロ−ンを保存して必要に備える。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０５３（ＡＴ−００７−０２，ＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９Ａ）。

【0252】

２，ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭカセットが組込まれる大腸菌株、ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂおよびその突然変異体が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響
ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭカセットが組込まれる菌株、ビトレオシラヘモグロビンを発現させる遺伝子およびその突然変異菌株 ＡＴ−０５２、ＡＴ−０５３に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるＬＢ平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、３ｍｌのＬＢ液体培地付き試験管（１３×１５０ｍｍ）に接種し、３０℃、２２５ｒｐｍで、約８時間培養する。そして種培養液を取り、３％を５０ｍｌのＭ９培養液を含む２５０ｍｌフラスコに接種する。初期ＯＤ₆₀₀ は約０．５であり、３７℃、２２５ｒｐｍで培養し、発酵サイクルは７２時間である。２４時間目、４８時間目に、１０Ｍ ＮａＯＨを使って発酵液のｐＨを７．０に調整する。発酵液の糖分消費状況により、６５％グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を２０ｇ／ｌに維持する。発酵が終了し、１ｍｌ発酵液を取り、遠心分離する。ＨＰＬＣ法によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含量を測定する。
組換え菌のフラスコ発酵収率を表６に示す。結果により、Ｖｈｂの発現は、Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａの形質転換であれ、ＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換であれ、収率を著しく向上させることができ、且つＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換により収率をより著しく向上させることが示唆される。

【0253】

［組換え菌でＶｈｂとＶｈｂＭを発現させるフラスコ発酵の収率］

【表6】

【0254】

（実施例３．ａ）
本実施例はＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−Ｐエピメラーゼ（ＮａｎＥ）の遺伝子ＮａｎＥのクロ−ン化および大腸菌でのＮａｎＥ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換、並びにｐｔｒｃ− ＮａｎＥ遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込みについて説明する。

【0255】

１，ＮａｎＥ遺伝子のクロ−ン化、大腸菌でのＮａｎＥ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換およびそれがＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの収率に対する影響
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮａｎＥ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐＨｏｓｐＨａｔｅ ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−Ｐエピメラーゼ）の遺伝子ＮａｎＥを増幅させ、Ｔｒｃプロモーター制御下で菌株の形質転換を行い、それを過剰発現させることにより、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸（ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐ）からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐ）への変換を促進することができる。

【0256】

１）大腸菌ＮａｎＥの遺伝子のクロ−ン化
ＮＣＢＩ からＵ０００９６を見つけ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮａｎＥの遺伝子のヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２８、そのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２９が得られる。
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ＮａｎＥ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３０であり、リバ−スプライマ−（ＮａｎＥ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３１である。
テンプレ−ト： ＡＴ−００１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２７３２５）ゲノム。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物サイズ：６９０ｂｐ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製して断片を回収する。
得られるＰＣＲ増幅断片とｐＵＣ５７−Ｔベクタ−を連結して配列決定・同定を行い、ＮａｎＥ／ ｐＵＣ５７が得られる。

【0257】

２）ＮａｎＥ遺伝子をＴｒｃプロモーター制御下に置いてプラスミドの構築および形質転換を行う
i）プラスミドの構築：プラスミドＮａｎＥ／ ｐＵＣ５７を増幅させ、それぞれ酵Ｎｃｏ ＩとＨｉｎｄＩＩＩを使ってプラスミドＮａｎＥ／ｐＵＣ５７とベクタ−ｐｔｒｃ９９Ａを切断し、アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製してＮａｎＥ断片とｐｔｒｃ９９Ａ断片を回収し、Ｔ４ ＤＮＡで酵素を連結し、１６℃で一晩放置し、且つ同定を行い、ＮａｎＥ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドが得られる。
ii）コンピテントセルを作製する：先ず、−２０℃で保存されるＡＴ−００５−０２菌液を、１：５０−１００で１０Ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍ、２−３時間振盪培養する。そして培養液を１０Ｍｌ遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに５ｍｉｎ懸濁させる。最後に４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。
iii）プラスミドの形質転換を行う：自然沈降後の菌体２５０μｌを取り、５μｌ ＮａｎＥ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドに加え、−４℃、３０ｍｉｎ。そして、４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地 ０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。０．２ｍｌの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。３０℃で一晩（１２−１６時間）培養する。モノクロ−ナルを採取し、５ｍｌ ＬＢ液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。組換え菌 ＮａｎＥ／ｐｔｒｃ９９Ａ（ＡＴ−００５−０２）が得られる。

【0258】

３）ＮａｎＥ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換がＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響
将組換え菌 ＮａｎＥ／ｐｔｒｃ９９Ａ（ＡＴ−００５−０２）と対照菌株に対して、フラスコ振盪発酵試験を行う。新鮮培養されるＬＢ平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、３ｍｌのＬＢ液体培地付き試験管（１３×１５０ｍｍ）に接種し、３０℃、２２５ｒｐｍで、約８時間培養する。ＬＢ液体培地の成分は以下のとおりである：５ｇ／ｌ 酵母パウダ−、１０ｇ／ｌ ペプトン、１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ。そして取種培養液を取り、３％を５０ｍｌの発酵培養液（Ｍ９培養液）を含む２５０ｍｌフラスコに接種する。初期ＯＤ₆₀₀ は約０．５であり、３７℃下、２２５ｒｐｍで培養し、発酵サイクルは７２時間である。２４時間目、４８時間目に、１０Ｍ ＮａＯＨを使って発酵液のｐＨを７．０に調整する。発酵液の糖分消費状況により、６５％グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を２０ｇ／ｌに維持する。発酵が終了し、１ｍｌの発酵液を取り、遠心分離し。ＨＰＬＣ法によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含量を測定する。

【0259】

フラスコ発酵収率を表７に示す。結果により、対照菌株ＡＴ−００５−０２の収率は非常に低く、検出されず、一方ではＮａｎＥ遺伝子がＴｒｃプロモーター制御下で過剰発現した組換え菌ＮａｎＥ／ｐｔｒｃ９９Ａ（ＡＴ−００５−０２）の収率は著しく向上することが示唆される。

【0260】

［組換え菌ＮａｎＥ／ｐｔｒｃ９９Ａ（ＡＴ−００５−０２）のフラスコ発酵の収率］

【表7】

【0261】

２，ｐｔｒｃ−ＮａｎＥ 遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込み
ＮａｇＥ遺伝子部位をｐｔｒｃ−ＮａｎＥ 遺伝子カセットの染色体での組込み部位とする。ｐｔｒｃ−ＮａｎＥ 遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込みを実現するために、先ず、Ｔｒｃプロモーター付きのＮａｎＥ断片ｐｔｒｃ−ＮａｎＥおよび両端にＦＬＰ 組換え酵素識別部位（ＦＲＴ 部位）を有するカナマイシン耐性遺伝子断片：ＦＲＴ−Ｋａｎｒ−ＦＲＴ （ｆＫａｎｒｆ）を増幅させ、且つ連結する。そして、もう一度設計してＮａｇＥ遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのプライマ−を削除し、且つｐｔｒｃ−ＮａｎＥとｆＫａｎｒｆで連結される断片をテンプレ−トとし、Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長断片を増幅させる。

【0262】

具体的な操作手順は次のとおりである：
（１）ＰＣＲにより ｐｔｒｃ−ＮａｎＥ断片を増幅させる
テンプレ−ト：ＮａｎＥ／ｐｔｒｃ９９Ａ。
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（Ｔｒｃｆｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２０であり、リバ−スプライマ−（Ｔｒｃｆｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２１である。
ＰＣＲ反応条件：第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す；
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
産物サイズ：０．８６ｋｂ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0263】

（２）ＰＣＲによりｆＫａｎｒｆ断片を増幅させる
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ｍｆＫａｎｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１であり、リバ−スプライマ−（ｍｆＫａｎｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２である。
テンプレ−ト：ｐＰｉｃ９Ｋ。
ＰＣＲ反応条件：第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す；第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
ｆＫａｎｒｆサイズ：１．２８ｋｂ。そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.3である。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0264】

（３）ｐｔｒｃ−ＮａｎＥに結合するｆＫａｎｒｆ を増幅させる
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ｆＫａｎｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２２であり、リバ−スプライマ−（ｆＫａｎｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２３１である。
テンプレ−ト：ｆＫａｎｒｆ。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
二次増幅されるｆＫａｎｒｆのサイズ：１．３ｋｂ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0265】

（４）Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長のＰＣＲ断片を調製する
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する：もう一度設計してＮａｇＥ遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのフォワ−ドプライマ−（ＮａｇＥＫＯ−Ｆ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２４、リバ−スプライマ−（ＮａｇＥＫＯ−Ｒ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２５を削除する。
テンプレ−ト：ｐｔｒｃ−ＮａｎＥ ＰＣＲ断片と二次増幅されるｆＫａｎｒｆ ＰＣＲ断片、１：１で混合する。
ＰＣＲ反応条件：第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す；
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物：ホモロジ−ア−ム+ ｐｔｒｃ−ＮａｎＥ−ｆＫａｎｒｆ+ホモロジ−ア−ム。
ＰＣＲ産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して１００ｎｇ／μｌの線状ＤＮＡの完全長ＰＣＲ断片を得てＲｅｄ組換えタ−ゲティングに用いる。

【0266】

（５）Ｒｅｄ組換え操作
先ず、ｐＫＤ４６ベクタ−を大腸菌ＡＴ−００４−０２の菌株に導入する。そして、調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。

【0267】

１）ｐＫＤ４６プラスミドの形質転換を行う
i）コンピテントセルを作製する：先ず、−２０℃で保存されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴ−００４−０２菌液を、１：５０−１００で１０Ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍで、２−３時間振盪培養する。そして培養液を１０Ｍｌ遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに５ｍｉｎ懸濁させる。最後に４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌで懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。
ii）プラスミドの形質転換を行う：自然沈降された菌体２５０μｌを取り、５μｌ ｐＫＤ４６プラスミドを加え、−４℃、３０ｍｉｎ。そして、４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地 ０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。０．２ｍｌの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。３０℃で一晩（１２−１６時間）培養する。モノクロ−ナルを採取し、５ｍｌ ＬＢ液体培地に加えて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。

【0268】

２）調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする
i）電気的形質転換コンピテントセルを作製する： ｐＫＤ４６ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを含む菌株ＡＴ−００４−０２をアンピシリン（Ａｍｐ）ＬＢ培地を含む試験管に接種し、２５０ｒｐｍで一晩振盪し、翌日１％の量でＡｍｐを含むＬＢ培地に接種し、３０℃で培養し、待ＯＤ₆₀₀が約０．２に達した後、０．２％のＬ−アラビノ−スを加え、ＯＤ₆₀₀が約０．４に達するまで３０℃で３５分間誘導する。氷浴で冷却する。超純水で１回洗浄し、１０％グリセリンで２回洗浄し、最後に１０％グリセリンで再懸濁させ、グリセリンの用量は菌体を５００−１０００倍の最終濃度に濃縮させることが好ましい。
ii）電気ショック形質転換：２ｍｍ電気ショック形質転換用カップを７０％エタノ−ルから取り出し、滅菌超純水で２回洗浄し、紫外線ランプで３０分間照射する。４℃で３０分間予備冷却する。９０μｌの最終的に再懸濁された細胞を取り、予備冷却用遠心管に移し、５μｌ（１００ｎｇ以上）のステップ（１）で得られる完全長ＰＣＲ断片（線形ＤＮＡ）を加え、ガンでやさしく吸って均一つに混合させ、３０分間氷浴する。
電気的形質転換パラメ−タ：２５００Ｖ、２００Ω、２５μＦ。
iii）陽性クロ−ンの蘇生およびスクリーニング： １ｍｌのＬＢ液体培地を加え、３７℃、１００ｒｐｍ、１時間。そして２００μｌを１つのカナマイシン（Ｋａｎ）平板に塗布し、全部で５つの平板である。均一に塗布し、乾燥させる。３０℃で２４時間培養する。カナマイシン耐性下で成長するクロ−ンを採取し、ＰＣＲ同定を行い、陽性クロ−ンをスクリーニングする。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０３０−０１（ＡＴ−００４−０２，△ＮａｇＥ：：ｐｔｒｃ−ＮａｎＥ−ｆＫａｎｒｆ）。

【0269】

６）耐性遺伝子を削除する
ｐＣＰ２０を前記カナマイシン耐性クロ−ンに導入し、３０℃で８ｈ培養し、そして４２℃で一晩放置し、熱誘導によりＦＬＰ組換え酵素を発現させ、プラスミドを徐々に失わせる。シクロスポリン接種液を、抗生物質を含まない培地に詰め、成長したモノクロ−ナルを選んでカナマイシン耐性平板に滴下し、成長しないものはカナマイシン耐性遺伝子がＦＬＰ組換え酵素に削除されるクロ−ンである。同定用プライマ−を使ってＰＣＲを行ってカナマイシン耐性が消失したクロ−ンに対して同定を行う。
得られる菌株の番号： ＡＴ−０３０−０２（ＡＴ−００４−０２，△ＮａｇＥ：：ｐｔｒｃ−ＮａｎＥ）。

【0270】

３，ｐｔｒｃ−ＮａｎＥ遺伝子カセットの組込みがＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響
染色体ＮａｇＥ遺伝子部位においてｐｔｒｃ−ＮａｎＥ遺伝子カセットが組込まれる組換え菌ＡＴ−０３０−０２と対照菌株に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるＬＢ平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、３ｍｌのＬＢ液体培地付き試験管（１３×１５０ｍｍ）に接種し、３０℃、２２５ｒｐｍ、約８時間培養する。そして種培養液を取り、３％を５０ｍｌの発酵培養液（Ｍ９培養液）を含む２５０ｍｌフラスコに接種する。初期ＯＤ６００ は約０．５であり、３７℃、２２５ｒｐｍで培養し、発酵サイクルは７２時間である。２４時間目、４８時間目、１０Ｍ ＮａＯＨを使って発酵液のｐＨを７．０に調整する。据発酵液の糖分消費状況により、６５％グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を２０ｇ／ｌに維持する。発酵が終了し、１ｍｌの発酵液を取り、遠心分離する。ＨＰＬＣ法によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含量を測定する。

【0271】

フラスコ発酵の収率を表８に示す。結果により、対照菌株ＡＴ−００１、ＡＴ−００５−０２の収率は非常に低く、検出されず、一方ではｐｔｒｃ−ＮａｎＥ遺伝子カセットが組込まれる組換え菌の収率が著しく向上し、且つ組み込まれていない組換え菌ＮａｎＥ／ｐｔｒｃ９９Ａ（ＡＴ−００５−０２）収率よりも著しく向上することが示唆される。

【0272】

［ｐｔｒｃ−ＮａｎＥ遺伝子カセットが組込まれる組換え菌のフラスコ発酵の収率］

【表8】

【0273】

（実施例３．ｂ）
本実施例は突然変異したＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−Ｐエピメラーゼ（ＮａｎＥ）の遺伝子のスクリーニングについて説明し、前記遺伝子は酵素活性を向上させるＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−Ｐエピメラーゼをコードする。

【0274】

さらに生産菌株の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン合成量を向上させるため、酵素活性を向上させるＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−Ｐエピメラーゼをコードする遺伝子の突然変異体をスクリーニングする。当該目的を達成するため、エラ−プロ−ンＰＣＲ技術によってクロ−ン化した遺伝子を増幅させ、増幅に用いるＤＮＡ ポリメラ−ゼにより、ミスマッチが高頻度に生じる条件下で前記遺伝子を増幅させ、それによってＰＣＲ産物から突然変異が高頻度で得られる。
具体的な操作手順は次のとおりである：

【0275】

１，エラ−プロ−ンＰＣＲにより大腸菌Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−Ｐエピメラーゼ遺伝子ＮａｎＥを増幅させる
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ−ゼが３' −５'校正機能を持たない性質を利用し、高マグネシウムイオン濃度(８ｍｍｏｌ／Ｌ)およびｄＮＴＰ濃度の異なる濃度 (そのうち、ｄＡＴＰとｄＧＴＰの濃度は１．５ｍｍｏｌ／Ｌである；ｄＴＴＰとｄＣＴＰの濃度は３．０ｍｍｏｌ／Ｌである)下で、ランダム突然変異の頻度を制御し、タ−ゲット遺伝子にランダム突然変異を導入し、突然変異ライブラリ−を構築する；テンプレ−ト濃度のＡ２６０値は１０００ｎｇ／ｍｌであり、酵素の濃度は５Ｕ／μｌであり、プライマ−の濃度は１００μＭである。
エラ−プロ−ンＰＣＲ反応系（５０μｌ）：１０×ＰＣＲ反応緩衝液５μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）５μｌ、ＭｇＣｌ_２（２．５ｍＭ） ５μｌ、フォワ−ドプライマ−（ＮａｎＥ−Ｆ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３０）１μｌ、リバ−スプライマ−（ＮａｎＥ−Ｒ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３１）１μｌ、ＤＮＡテンプレ−ト（ＮａｎＥ／ｐＵＣ５７）０．１μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ−ゼ０．５μｌ、ｄｄＨ_２Ｏ ３２．４μｌ。
ＰＣＲ 手順：９６℃で４ｍｉｎ予備変性を行う；９４℃で１ｍｉｎ変性を行い、５６℃で１ｍｉｎアニ−リングを行い、７５℃で２ｍｉｎ伸長を行い、４５サイクル；最後に７５℃で１５ｍｉｎ伸長を行い、ゲル回収法によりＰＣＲ産物（産物サイズ：０．７ｋｂ）；を回収する； ５μｌ産物を取って１％アガロ−スゲル電気泳動を行い、−２０℃で保存して必要に備える。

【0276】

２，Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−Ｐエピメラーゼ遺伝子の突然変異体ライブラリ−を構築する
前記ＰＣＲ産物は制限エンドヌクレア−ゼＮｃｏ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩの二重消化によって消化された後、Ｎｃｏ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩエンドヌクレア−ゼで消化されたｐｔｒｃ９９Ａプラスミドとライゲ−ション反応を行い、そしてライゲ−ション産物の混合物によって大腸菌 ＡＴ−００５−０２の形質転換を行い、大量のクロ−ン化した形質転換体が得られ、形質転換菌体の突然変異ライブラリ−を構築する。

【0277】

３，高酵素活性突然変異体をスクリーニングする
形質転換菌体の突然変異ライブラリ−から、突然変異するクロ−ンを３５０株無作為に選び、野生型ＮａｎＥ／ｐｔｒｃ９９Ａ（ＡＴ−００５−０２）を対照菌株として、それぞれ５０μｇ／ｍｌペニシリン（Ａｍｐ）を含む５ｍｌ ＬＢ培地に接種し、３７℃、１５０ｒｐｍで１８ｈ培養した後、１００００ｒｐｍで、５ｍｉｎ遠心分離して菌体を収集する。上清を捨てた後、在４℃下で１ｍｌ ＰＢＳ(ｐＨ値７．５、１０Ｍｍｏｌ／Ｌ)溶液に再懸濁させ、氷浴条件下で３００Ｖの電圧を選び、６ｓ 間隔で超音波を３ｓ出して１０Ｍｉｎ超音波破砕を行い、遠心分離し上清を取って酵素粗抽出液とし、活性測定を行う。

【0278】

Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−Ｐエピメラーゼの活性測定：Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸（ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐ）からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐ）への変換の程度に基づき、即ちＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸の減少を測定マ−クとする。酵素活単位の定義は次のとおりである：酵素促進反応条件下で、１分間当たり１μｍｏｌ Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸を減少させるために必要な酵素量を、１酵素活力単位(ＩＵ)とする。

【0279】

具体的な操作は次のとおりである：先ず、基質とする同位体標識のＭａｎＮＡｃ−６−Ｐを調製する。合計体積２２５ ｕｌの反応液を配合し、ＭａｎＮＡｃキナーゼ（ＮａｎＫ）の粗酵素液（タンパク質１−５ｍｇを含む）、２０ｍＭＡＴＰ二ナトリウム塩、 ６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、 ｐＨ８．１、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２ 及び５ｍＭ ＭａｎＮＡｃ、５０ｎＣｉ [^14C]ＭａｎＮＡｃを含む。３７℃で３０ ｍｉｎインキュベ−トする。エタノ−ル３５０ｕｌ を加えて反応を終了させる。産物を水で溶出させ、凍結乾燥する。次に、合計体積２６．５ ｕｌの反応液を調製して酵素活力測定系とし、そのうち１ｍＭ同位体標識したＭａｎＮＡｃ−６−Ｐ、３７ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０及び１９ ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む。３７℃で、３０ ｍｉｎインキュベ−トした後、反応液を３ｍｉｎ加熱し、そして０．１体積のアルカリ性のリン酸酵素緩衝液を加えてｐＨと２０単位のアルカリ性リン酸酵素を調整する。３７℃で、１時間インキュベ−トした後、試料を取って乾燥したクロマトグラフィ−紙上に置き、１％四ホウ酸ナトリウムで予備浸漬する。使用される溶媒系は酢酸エチル：イソプロピルアルコ−ル：ピリジン：水 (５０：２２：１４：１４)である。放射能を有する化合物を紙クロマトグラフィ−により分離する。液体シンチレ−ションカウンタ−により放射能を測定し、ＭａｎＮＡｃ−６−ＰからＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐへの変換の程度により、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−Ｐエピメラーゼの活性単位を計算する。

【0280】

結果により、最も高い突然変異菌株の酵素活性は７２ ＩＵ／ｍｌであり、対照菌株の酵素活性は９．５ ＩＵ／ｍｌであることが示唆される。エラ−プロ−ンＰＣＲによってＮａｎＥを改変し、酵素活性が大幅に向上する突然変異株が得られる。当該酵素の活性が最も高い突然変異株を選び、プラスミドを抽出して配列を決める。結果により、当該Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−Ｐエピメラーゼ突然変異体遺伝子の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.５６で、対応するアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.５７で表わされることが分かる。野生型Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−Ｐエピメラーゼ遺伝子の配列に比較し、全部で３つの塩基点突然変異が生じる：：１９８Ｃ／Ｔ、３９７Ｔ／Ｃ、５５９Ｔ／Ｃ；アミノ酸の２つのミスセンス突然変異が生じ、その突然変異点はそれぞれ次のとおりである：Ｃ１３３Ｒ（１３３位のシステインからアルギニンへの変換）、Ｙ１８７Ｈ（１８７位のチロシンからヒスチジンへの変換）。当該突然変異遺伝子はＮａｎＥＭと命名される。

【0281】

４，ｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭ遺伝子カセットの大腸菌染色体ＮａｇＥ遺伝子部位への組込み
ＮａｇＥ遺伝子部位をｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭ 遺伝子カセットの染色体での組込み部位とする。ｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭ 遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込みを実現するために、先ず、Ｔｒｃプロモーター付きのＮａｎＥＭ断片ｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭ、および両端にＦＬＰ 組換え酵素識別部位（ＦＲＴ 部位）を有するカナマイシン耐性遺伝子断片：ＦＲＴ−Ｋａｎｒ−ＦＲＴ （ｆＫａｎｒｆ）を増幅させ、且つ連結する。そして、もう一度設計してＮａｇＥ遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのプライマ−削除し、且つｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭとｆＫａｎｒｆ連結される断片をテンプレ−トとし、Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長断片を増幅させる。
具体的な操作手順は次のとおりである：

【0282】

（１）ＰＣＲによってｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭ断片を増幅させる
テンプレ−ト：ＮａｎＥＭ／ｐｔｒｃ９９Ａ。
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（Ｔｒｃｆｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２０であり、リバ−スプライマ−（Ｔｒｃｆｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２１である。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
産物サイズ：０．８６ｋｂ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0283】

（２）ＰＣＲによってｆＫａｎｒｆ断片を増幅させる
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ｍｆＫａｎｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１であり、リバ−スプライマ−（ｍｆＫａｎｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２である。
テンプレ−ト：ｐＰｉｃ９Ｋ。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
ｆＫａｎｒｆサイズ：１．２８ｋｂ。そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３である。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0284】

（３）ｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭに結合するｆＫａｎｒｆ を増幅させる
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ｆＫａｎｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２２であり、リバ−スプライマ−（ｆＫａｎｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２３１である。
テンプレ−ト：ｆＫａｎｒｆ。
ＰＣＲ反応条件：第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す；
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
二次増幅されるｆＫａｎｒｆのサイズ：１．３ｋｂ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0285】

４）Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長のＰＣＲ断片を調製する
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する：もう一度設計してＮａｇＥ遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのフォワ−ドプライマ−（ＮａｇＥＫＯ−Ｆ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２４、リバ−スプライマ−（ＮａｇＥＫＯ−Ｒ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２５を削除する。
テンプレ−ト：ｐｔｒｃ−ＮａｎＫ ＰＣＲ断片と二次増幅されるｆＫａｎｒｆ ＰＣＲ断片、１：１で混合する。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物：ホモロジ−ア−ム+ ｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭ−ｆＫａｎｒｆ+ホモロジ−ア−ム。
ＰＣＲ産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して１００ｎｇ／μｌの線状ＤＮＡの完全長ＰＣＲ断片を得てＲｅｄ組換えタ−ゲティングに用いる。

【0286】

（５）Ｒｅｄ組換え操作
先ず、ｐＫＤ４６ベクタ−を大腸菌ＡＴ−００４−０２の菌株に導入する。そして、調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。

【0287】

１）ｐＫＤ４６プラスミドの形質転換を行う
i）コンピテントセルを作製する：先ず、−２０℃で保存されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴ−００４−０２菌液を、１：５０−１００で１０Ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍで、２−３時間振盪培養する。そして培養液を１０Ｍｌ遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに５ｍｉｎ懸濁させる。最後に４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌで懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。
ii）プラスミドの形質転換を行う：自然沈降された菌体２５０μｌを取り、５μｌ ｐＫＤ４６プラスミドを加え、−４℃、３０ｍｉｎ。そして、４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地 ０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。０．２ｍｌの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。３０℃で一晩（１２−１６時間）培養する。モノクロ−ナルを採取し、５ｍｌ ＬＢ液体培地に加えて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。

【0288】

２）調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする
i）電気的形質転換コンピテントセルを作製する： ｐＫＤ４６ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを含む菌株ＡＴ−００４−０２をアンピシリン（Ａｍｐ）ＬＢ培地を含む試験管に接種し、２５０ｒｐｍで一晩振盪し、翌日１％の量でＡｍｐを含むＬＢ培地に接種し、３０℃で培養し、待ＯＤ₆₀₀が約０．２に達した後、０．２％のＬ−アラビノ−スを加え、ＯＤ₆₀₀が約０．４に達するまで３０℃で３５分間誘導する。氷浴で冷却する。超純水で１回洗浄し、１０％グリセリンで２回洗浄し、最後に１０％グリセリンで再懸濁させ、グリセリンの用量は菌体を５００−１０００倍の最終濃度に濃縮させることが好ましい。
ii）電気ショック形質転換：２ｍｍ形質転換用カップを７０％エタノ−ルから取り出し、滅菌超純水で２回洗浄し、紫外線ランプで３０分間照射する。４℃で３０分間予備冷却する。９０μｌの最終的に再懸濁された細胞を取り、予備冷却用遠心管に移し、５μｌ（１００ｎｇ以上）のステップ（１）で得られる完全長ＰＣＲ断片（線形ＤＮＡ）を加え、ガンでやさしく吸って均一つに混合させ、３０分間氷浴する。電気的形質転換パラメ−タ：：２５００Ｖ、２００Ω、２５μＦ。
iii）陽性クロ−ンの蘇生およびスクリーニング： １ｍｌのＬＢ液体培地を加え、３７℃、１００ｒｐｍ、１時間。そして２００μｌを１つのカナマイシン（Ｋａｎ）平板に塗布し、全部で５つの平板である。均一に塗布し、乾燥させる。３０℃で２４時間培養する。カナマイシン耐性下で成長するクロ−ンを採取し、ＰＣＲ同定を行い、陽性クロ−ンをスクリーニングする。
得られる菌株の番号： ＡＴ−０３１−０１（ＡＴ−００４−０２，△ＮａｇＥ：：ｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭ−ｆＫａｎｒｆ）。

【0289】

（６）耐性遺伝子を削除する
ｐＣＰ２０を前記カナマイシン耐性クロ−ンに導入し、３０℃で８ｈ培養し、そして４２℃で一晩放置し、熱誘導によりＦＬＰ 組換え酵素を発現させ、プラスミドを徐々に失わせる。シクロスポリン接種液を、抗生物質を含まない培地に詰め、成長したモノクロ−ナルを選んでカナマイシン耐性平板に滴下し、成長しないものはカナマイシン耐性遺伝子がＦＬＰ組換え酵素に削除されるクロ−ンである。同定用プライマ−を使ってＰＣＲを行ってカナマイシン耐性が消失したクロ−ンに対して同定を行う。
得られる菌株の番号： ＡＴ−０３１−０２（ＡＴ−００４−０２，△ＮａｇＥ：：ｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭ）。

【0290】

５，ｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭ遺伝子カセットの組込みがＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響
染色体のＮａｇＥ遺伝子部位においてｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭ遺伝子カセットが組込まれる組換え菌ＡＴ−０３１−０２と対照菌株に対して、フラスコ振盪発酵試験を行う。新鮮培養されるＬＢ平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、３ｍｌのＬＢ液体培地付き試験管（１３×１５０ｍｍ）に接種し、３０℃、２２５ｒｐｍ、約８時間培養する。そして種培養液を取り、３％を５０ｍｌの発酵培養液（Ｍ９培養液）を含む２５０ｍｌフラスコに接種する。初期ＯＤ６００ は約０．５であり、３７℃、２２５ｒｐｍで培養し、発酵サイクルは７２時間である。２４時間目、４８時間目に、１０Ｍ ＮａＯＨを使って発酵液のｐＨを７．０に調整する。据発酵液の糖分消費状況により、６５％グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を２０ｇ／ｌに維持する。発酵が終了し、１ｍｌの発酵液を取り、遠心分離する。ＨＰＬＣ法によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含量を測定する。

【0291】

フラスコ発酵の収率を表９に示す。結果により、対照菌株ＡＴ−００５−０２の収率が非常に低く、検出されず、一方では突然変異のｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭ遺伝子カセットが組込まれる組換え菌ＡＴ−０３１−０２収率が著しく向上し、且つ突然変異しない対照菌株ＡＴ−０３０−０２の収率よりも著しく向上することが示唆される。

【0292】

［ｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭ遺伝子カセットが組込まれる組換え菌のフラスコ発酵の収率］

【表9】

【0293】

前記結果により： Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−Ｐエピメラーゼの過剰発現によりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率を著しく向上させることができるだけでなく、エラ−プロ−ンＰＣＲ技術で突然変異体をスクリーニングすることもＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの収率を大いに向上させることができ、これは得られる当該酵素の突然変異体が酵素の活性を向上させることによるものであることが示唆される。

【0294】

（実施例３．ｃ）
本実施例はｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭカセットが組込まれる大腸菌株、特にビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂ及びその突然変異体が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響について説明する。

【0295】

ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）の遺伝子Ｖｈｂを増幅させ、且つｐｔｒｃ９９Ａを挿入し、それによってＶｈｂをＴｒｃプロモーターの制御下で菌株の形質転換を行い、またはビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）の遺伝子Ｖｈｂの突然変異体をスクリーニングしてｐｔｒｃ９９Ａを挿入し、菌株の形質転換を行い、それによって微生物の溶存酸素を利用する能力を向上させ、Ｎ−アセチルグルコサミン発酵生産収率を向上させる。

【0296】

１，ｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭカセットが組込まれる大腸菌株、ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂ
（１）Ｖｈｂ遺伝子を増幅させ、且つｐｔｒｃ９９Ａを挿入する
ビトレオシラヘモグロビン遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６０であり、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６１である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉがコドン塩基を優先することにより、ビトレオシラヘモグロビン遺伝子の最適化・合成を行い、ｐＵＣ５７ ベクタ−をロ−ドする。得られたベクタ−はＶｈｂ／ｐＵＣ５７と命名される。
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（Ｖｈｂ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６２であり、リバ−スプライマ−（Ｖｈｂ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６３である。
テンプレ−ト： Ｖｈｂ／ｐＵＣ５７。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物サイズ：４４１ｂｐ。
ＰＣＲ産物を１％アガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製して断片を回収する。
得られるＰＣＲ増幅断片とベクタ−ｐｔｒｃ９９Ａ をそれぞれＮｃｏ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、アガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製してＶｈｂ断片とｐｔｒｃ９９Ａ断片を回収し、Ｔ４ ＤＮＡで酵素を連結し、１６℃で一晩放置し、且つ同定を行い、Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドが得られる。

【0297】

（２）Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａを使ってｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭカセット組込まれる大腸菌株の形質転換を行う
１）コンピテントセルを作製する
i）−２０℃で保存されるＡＴ−０３１−０２菌液を、１：５０−１００で１０Ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍで、２−３時間振盪培養する。
ii）培養液を１０Ｍｌ遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに５ｍｉｎ懸濁させる。
iii）４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。
２）プラスミドの形質転換を行う
i）自然沈降後の菌体２５０μｌを取り、５μｌ Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドを加え、−４℃、３０ｍｉｎ。
ii）４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地 ０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。
iii）０．２ｍｌ菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。
iv）３０℃で一晩（１２−１６時間）培養し。
v）モノクロ−ナルを選び、５ｍｌ ＬＢ液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。
vi）陽性クロ−ンを保存して必要に備える。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０５４（ＡＴ−０３１−０２、Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａ）。

【0298】

２，ｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭカセットが組込まれる大腸菌株、ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂの突然変異体
１）コンピテントセルを作製する
i）−２０℃で保存されるＡＴ−０３１−０２菌液を、１：５０−１００で１０Ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍで、２−３時間振盪培養する。
ii）培養液を１０Ｍｌ遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに５ｍｉｎ懸濁させる。
iii）４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。

【0299】

２）プラスミドの形質転換を行う
i）自然沈降後の菌体２５０μｌを取り、５μｌ Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドを加え、−４℃、３０ｍｉｎ。
ii）４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地 ０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。
iii）０．２ｍｌ菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。
iv）３０℃で一晩（１２−１６時間）培養し。
v）モノクロ−ナルを選び、５ｍｌ ＬＢ液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。
vi）陽性クロ−ンを保存して必要に備える。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０５５（ＡＴ−０３１−０２，ＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９Ａ）。

【0300】

３，ｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭカセット組込まれる大腸菌株、ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂ及びその突然変異体が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響
ｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭカセットが組込まれる菌株、ビトレオシラヘモグロビンを発現させる遺伝子およびその突然変異菌株 ＡＴ−０５２、ＡＴ−０５３に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるＬＢ平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、３ｍｌのＬＢ液体培地付き試験管（１３×１５０ｍｍ）に接種し、３０℃、２２５ｒｐｍで、約８時間培養する。そして種培養液を取り、３％を５０ｍｌのＭ９培養液を含む２５０ｍｌフラスコに接種する。初期ＯＤ₆₀₀ は約０．５であり、３７℃、２２５ｒｐｍで培養し、発酵サイクルは７２時間である。２４時間目、４８時間目、１０Ｍ ＮａＯＨを使って発酵液のｐＨを７．０に調整する。発酵液の糖分消費状況により、６５％グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を２０ｇ／ｌに維持する。発酵が終了し、１ｍｌ発酵液を取り、遠心分離する。ＨＰＬＣ法によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含量を測定する。
組換え菌のフラスコ発酵の収率を表１０に示す。結果により、Ｖｈｂの発現により、Ｖｈｂ／ ｐｔｒｃ９９Ａの形質転換であれ、ＶｈｂＭ／ ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換であれ、収率を著しく向上させることができ、且つＶｈｂＭ／ ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換が収率の向上に対する影響がより大きいことが示唆される。

【0301】

［組換え菌によってＶｈｂとＶｈｂＭを発現させるフラスコ発酵の収率］

【表10】

【0302】

（実施例４．ａ）
本実施例はＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の遺伝子ＷｅｃＢのクロ−ン化及び大腸菌におけるＷｅｃＢ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換、並びにｐｔｒｃ−ＷｅｃＢ遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込みについて説明する。

【0303】

１，ＷｅｃＢ遺伝子のクロ−ン化、大腸菌におけるＷｅｃＢ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換及びそれがＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響
大腸菌ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ（ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ −２−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、ＷｅｃＢ）の遺伝子ＷｅｃＢを、Ｔｒｃプロモーター制御下に置いて菌株の形質転換を行い、それを過剰発現させることにより、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）からＭａｎＮＡｃ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンまたはＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン）への変換を促進することができる。

【0304】

１）大腸菌ＷｅｃＢ遺伝子のクロ−ン化
ＮＣＢＩ から大腸菌ＷｅｃＢ 遺伝子のヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.４９、そのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.５０を見つける。
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ＴｒｃＷｅｃＢ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.５１であり、リバ−スプライマ−（ＴｒｃＷｅｃＢ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.５２である。
テンプレ−ト： ＡＴ−００１ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２７３２５）ゲノム。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物サイズ：１．１３ｋｂ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
得られるＰＣＲ増幅断片とｐＵＣ５７−Ｔベクタ−を連結して配列決定・同定を行い、ＷｅｃＢ／ ｐＵＣ５７が得られる。

【0305】

２）ＷｅｃＢ遺伝子をＴｒｃプロモーター制御下に置いてプラスミドの構築および形質転換を行う
i）プラスミドの構築：プラスミドＷｅｃＢ／ ｐＵＣ５７を増幅させ、それぞれＮｃｏ ＩとＨｉｎｄＩＩＩを使ってプラスミドＷｅｃＢ／ ｐＵＣ５７とベクタ−ｐｔｒｃ９９Ａを切断し、アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製してＷｅｃＢ断片とｐｔｒｃ９９Ａ断片を回収し、Ｔ４ ＤＮＡで酵素を連結し、１６℃で一晩放置し、且つ同定を行い、ＷｅｃＢ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドが得られる。
ii）コンピテントセルを作製する：先ず、−２０℃で保存されるＡＴ−００５−０２菌液を、１：５０−１００で１０Ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍ、２−３時間振盪培養する。そして培養液を１０Ｍｌ遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに５ｍｉｎ懸濁させる。最後に４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。
iii）プラスミドの形質転換を行う：自然沈降後の菌体２５０μｌを取り、５μｌ ＷｅｃＢ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドに入れ、−４℃、３０ｍｉｎ。そして、４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地 ０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。０．２ｍｌ菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。３０℃で一晩（１２−１６時間）培養する。モノクロ−ナルを採取し、５ｍｌ ＬＢ液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。組換え菌 ＷｅｃＢ／ｐｔｒｃ９９Ａ（ＡＴ−００５−０２）が得られる。

【0306】

３）ＷｅｃＢ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換がＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響
組換え菌 ＷｅｃＢ／ｐｔｒｃ９９Ａ（ＡＴ−００５−０２）と対照菌株に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるＬＢ平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、３ｍｌのＬＢ液体培地付き試験管（１３×１５０ｍｍ）に接種し、３０℃、２２５ｒｐｍで、約８時間培養する。ＬＢ液体培地の成分は以下のとおりである：
５ｇ／ｌ 酵母パウダ−、１０ｇ／ｌペプトン、１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ。
そして種培養液を取り、３％を５０ｍｌの発酵培養液（Ｍ９培養液）を含む２５０ｍｌフラスコに接種する。初期ＯＤ₆₀₀ は約０．５であり、３７℃下、２２５ｒｐｍで培養し、発酵サイクルは７２時間である。２４時間目、４８時間目に、１０Ｍ ＮａＯＨを使って発酵液のｐＨを７．０に調整する。発酵液の糖分消費状況により、６５％グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を２０ｇ／ｌに維持する。発酵が終了した後、発酵液１ｍｌを取り、遠心分離する。ＨＰＬＣ法によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含量を測定する。

【0307】

フラスコ発酵の収率を表１１に示す。結果により、対照菌株ＡＴ−００５−０２の収率は非常に低く、検出されず、一方ではＷｅｃＢ遺伝子がＴｒｃプロモーター制御下で過剰に発現する組換え菌ＷｅｃＢ／ｐｔｒｃ９９Ａ（ＡＴ−００５−０２）の収率が著しく向上することが示唆される。

【0308】

［組換え菌ＷｅｃＢ／ｐｔｒｃ９９Ａ（ＡＴ−００５−０２）のフラスコ発酵の収率］

【表11】

【0309】

２，ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢ 遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込み
ＮａｇＥ遺伝子部位をｐｔｒｃ−ＷｅｃＢ 遺伝子カセットの染色体での組込み部位とする。ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢ 遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込みを実現するために、先ず、Ｔｒｃプロモーター付きのＷｅｃＢ断片ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢ、および両端にＦＬＰ 組換え酵素識別部位（ＦＲＴ 部位）を有するカナマイシン耐性遺伝子断片：ＦＲＴ−Ｋａｎｒ−ＦＲＴ （ｆＫａｎｒｆ）を増幅させ、且つ連結する。そして、もう一度設計してＮａｇＥ遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのプライマ−を削除し、且つｐｔｒｃ−ＷｅｃＢとｆＫａｎｒｆで連結される断片をテンプレ−トとし、Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長断片を増幅させる。
具体的な操作手順は次のとおりである：

【0310】

（１）ＰＣＲによりｐｔｒｃ−ＷｅｃＢ断片を増幅させる
テンプレ−ト：ＷｅｃＢ／ｐｔｒｃ９９Ａ。
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（Ｔｒｃｆｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２０であり、リバ−スプライマ−（Ｔｒｃｆｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２１である。
ＰＣＲ反応条件：第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す；
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
産物サイズ：１．３ｋｂ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0311】

（２）ＰＣＲによりｆＫａｎｒｆ断片を増幅させる
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ｍｆＫａｎｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１であり、リバ−スプライマ−（ｍｆＫａｎｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２である。
テンプレ−ト：ｐＰｉｃ９Ｋ。
ＰＣＲ反応条件：第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す；
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
ｆＫａｎｒｆサイズ：１．２８ｋｂ。そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.3である。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0312】

（３）ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢに結合するｆＫａｎｒｆ を増幅させる
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ｆＫａｎｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２２であり、リバ−スプライマ−（ｆＫａｎｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２３１である。
テンプレ−ト：ｆＫａｎｒｆ。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
二次増幅されるｆＫａｎｒｆのサイズ：１．３ｋｂ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0313】

（４） Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長のＰＣＲ断片を調製する
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する：もう一度設計してＮａｇＥ遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのフォワ−ドプライマ−（ＮａｇＥＫＯ−Ｆ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２４、リバ−スプライマ−（ＮａｇＥＫＯ−Ｒ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２５を削除する。
テンプレ−ト：ｐｔｒｃ−ＮａｎＫ ＰＣＲ断片と二次増幅されるｆＫａｎｒｆ ＰＣＲ断片、１：１で混合する。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物：ホモロジ−ア−ム+ ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢ−ｆＫａｎｒｆ+ホモロジ−ア−ム。
ＰＣＲ産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して１００ｎｇ／μｌの線状ＤＮＡの完全長ＰＣＲ断片を得てＲｅｄ組換えタ−ゲティングに用いる。

【0314】

（５） Ｒｅｄ組換え操作
先ず、ｐＫＤ４６ベクタ−を大腸菌ＡＴ−００４−０２の菌株に導入する。そして、調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
１）ｐＫＤ４６プラスミドの形質転換を行う
i）コンピテントセルを作製する：先ず、−２０℃で保存されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴ−００４−０２菌液を、１：５０−１００で１０Ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍで、２−３時間振盪培養する。そして培養液を１０Ｍｌ遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに５ｍｉｎ懸濁させる。最後に４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌで懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。
ii）プラスミドの形質転換を行う：自然沈降された菌体２５０μｌを取り、５μｌ ｐＫＤ４６プラスミドを加え、−４℃、３０ｍｉｎ。そして、４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地 ０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。０．２ｍｌの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。３０℃で一晩（１２−１６時間）培養する。モノクロ−ナルを採取し、５ｍｌ ＬＢ液体培地に加えて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。

【0315】

２）調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする
i）電気的形質転換コンピテントセルを作製する： ｐＫＤ４６ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを含む菌株ＡＴ−００４−０２をアンピシリン（Ａｍｐ）ＬＢ培地を含む試験管に接種し、２５０ｒｐｍで一晩振盪し、翌日１％の量でＡｍｐを含むＬＢ培地に接種し、３０℃で培養し、ＯＤ₆₀₀が約０．２に達した後、ＯＤ₆₀₀が約０．４に達するまで、０．２％のＬ−アラビノ−スを加え、３０℃で３５分間誘導する。。氷浴で冷却する。超純水で１回洗浄し、１０％グリセリンで２回洗浄し、最後に１０％グリセリンで再懸濁させ、グリセリンの用量は菌体を５００−１０００倍の最終濃度に濃縮させることが好ましい。
ii）電気ショック形質転換： ２ｍｍ電気ショック形質転換用カップを７０％エタノ−ルから取り出し、滅菌超純水で２回洗浄し、紫外線ランプで３０分間照射する。４℃で３０分間予備冷却する。９０μｌの最終的に再懸濁された細胞を取り、予備冷却用遠心管に移し、５μｌ（１００ｎｇ以上）のステップ（１）で得られる完全長ＰＣＲ断片（線形ＤＮＡ）を加え、ガンでやさしく吸って均一つに混合させ、３０分間氷浴する。電気的形質転換パラメ−タ：２５００Ｖ、２００Ω、２５μＦ。
iii）陽性クロ−ンの蘇生およびスクリーニング： １ｍｌのＬＢ液体培地を加え、３７℃、１００ｒｐｍ、１時間。そして２００μｌを１つのカナマイシン（Ｋａｎ）平板に塗布し、全部で５つの平板である。均一に塗布し、乾燥させる。３０℃で２４時間培養する。カナマイシン耐性下で成長するクロ−ンを採取し、ＰＣＲ同定を行い、陽性クロ−ンをスクリーニングする。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０４２−０１（ＡＴ−００４−０２，△ＮａｇＥ：：ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢ−ｆＫａｎｒｆ）。

【0316】

（６） 耐性遺伝子を削除する
ｐＣＰ２０を前記カナマイシン耐性クロ−ンに導入し、３０℃で８ｈ培養し、そして４２℃で一晩放置し、熱誘導によりＦＬＰ組換え酵素を発現させ、プラスミドを徐々に失わせる。シクロスポリン接種液を、抗生物質を含まない培地に詰め、成長したモノクロ−ナルを選んでカナマイシン耐性平板に滴下し、成長しないものはカナマイシン耐性遺伝子がＦＬＰ組換え酵素に削除されるクロ−ンである。同定用プライマ−を使ってＰＣＲを行ってカナマイシン耐性が消失したクロ−ンに対して同定を行う。
得られる菌株の番号： ＡＴ−０４２−０２（ＡＴ−００４−０２，△ＮａｇＥ：：ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢ）。

【0317】

３，ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢ遺伝子カセットの組込みがＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響
染色体のＮａｇＥ遺伝子部位においてｐｔｒｃ−ＷｅｃＢ遺伝子カセットが組込まれる組換え菌ＡＴ−０４２−０２と対照菌株対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるＬＢ平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、３ｍｌのＬＢ液体培地付き試験管（１３×１５０ｍｍ）に接種し、３０℃、２２５ｒｐｍ、約８時間培養する。そして種培養液を取り、３％を５０ｍｌの発酵培養液（Ｍ９培養液）を含む２５０ｍｌフラスコに接種する。初期ＯＤ６００ は約０．５であり、３７℃、２２５ｒｐｍで培養し、発酵サイクルは７２時間である。２４時間目、４８時間目、１０Ｍ ＮａＯＨを使って発酵液のｐＨを７．０に調整する。据発酵液の糖分消費状況により、６５％グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を２０ｇ／ｌに維持する。発酵が終了し、１ｍｌの発酵液を取り、遠心分離する。ＨＰＬＣ法によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含量を測定する。

【0318】

フラスコ発酵の収率状況を表１２に示す。結果により、対照菌株ＡＴ−００１、ＡＴ−００５−０２の収率は非常に低く、検出されず、一方ではｐｔｒｃ−ＷｅｃＢ遺伝子カセットが組込まれる組換え菌収率が著しく向上し、且つ組み込まれていない組換え菌ＷｅｃＢ／ｐｔｒｃ９９Ａ（ＡＴ−００５−０２）収率よりも著しく向上することが示唆される。

【0319】

［ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢ遺伝子カセットが組込まれる組換え菌のフラスコ発酵の収率］

【表12】

【0320】

（実施例４．ｂ）
本実施例は突然変異するＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の遺伝子をスクリーニングすることについて説明し、前記遺伝子は酵素活性が向上するＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼをコードする。
さらに生産菌株の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン合成量を向上させるため、酵素活性を向上させるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼをコードする遺伝子の突然変異体をスクリーニングする。当該目的を達成するため、エラ−プロ−ンＰＣＲ技術によってクロ−ン化した遺伝子を増幅させ、増幅に用いるＤＮＡ ポリメラ−ゼにより、ミスマッチが高頻度に生じる条件下で前記遺伝子を増幅させ、それによってＰＣＲ産物から突然変異が高頻度で得られる。

【0321】

具体的な操作手順は次のとおりである。
１，エラ−プロ−ンＰＣＲにより大腸菌のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼの遺伝子ＷｅｃＢを増幅させる
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ−ゼが３' −５'校正機能を持たない性質を利用し、高マグネシウムイオン濃度(８ｍｍｏｌ／Ｌ)およびｄＮＴＰ濃度の異なる濃度 （そのうち、ｄＡＴＰとｄＧＴＰの濃度は１．５ｍｍｏｌ／Ｌである；ｄＴＴＰとｄＣＴＰの濃度は３．０ｍｍｏｌ／Ｌである)下で、ランダム突然変異の頻度を制御し、タ−ゲット遺伝子にランダム突然変異を導入し、突然変異ライブラリ−を構築する；テンプレ−ト濃度のＡ２６０値は１０００ｎｇ／ｍｌであり、酵素の濃度は５Ｕ／μｌであり、プライマ−の濃度は１００μＭである。
エラ−プロ−ンＰＣＲ反応系（５０μｌ）：１０×ＰＣＲ反応緩衝液５μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）５μｌ、ＭｇＣｌ_２ （２５ｍＭ）５μｌ、フォワ−ドプライマ−（ＴｒｃＷｅｃＢ−Ｆ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.５１）１μｌ、リバ−スプライマ−（ＴｒｃＷｅｃＢ−Ｒ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.５２）１μｌ、ＤＮＡテンプレ−ト（ＷｅｃＢ／ｐＵＣ５７）０．１μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ−ゼ０．５μｌ、ｄｄＨ_２Ｏ ３２．４μｌ。
ＰＣＲ 手順：９６℃で４ｍｉｎ予備変性を行う；
９４℃で１ｍｉｎ変性、５６℃で１ｍｉｎアニ−リング、７５℃で２ｍｉｎ伸長を、４５サイクル繰り返す；
最後に７５℃で１５ｍｉｎ伸長を行い、ゲル回収法によりＰＣＲ産物（産物サイズ：１．１３ｋｂ）を回収する；
５μｌ産物を取って１％アガロ−スゲル電気泳動を行い、−２０℃で保存して必要に備える。

【0322】

２，ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼの遺伝子の突然変異体ライブラリ−を構築する
前記ＰＣＲ産物は制限エンドヌクレア−ゼＮｃｏ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩの二重消化によって消化された後、Ｎｃｏ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩエンドヌクレア−ゼで消化されたｐｔｒｃ９９Ａプラスミドとライゲ−ション反応を行い、そしてライゲ−ション産物の混合物によって大腸菌 ＡＴ−００５−０２の形質転換を行い、大量のクロ−ン化した形質転換体が得られ、形質転換菌体の突然変異ライブラリ−を構築する。

【0323】

３，高い酵素活性を有する突然変異体をスクリーニングする
形質転換菌体の突然変異ライブラリ−から、突然変異するクロ−ンを６４０株無作為に選び、野生型ＷｅｃＢ／ｐｔｒｃ９９Ａ（ＡＴ−００５−０２）を対照菌株とし、それぞれ５０μｇ／ｍｌペニシリン（Ａｍｐ）を含む５ｍｌ ＬＢ培地に接種し、３７℃、１５０ｒｐｍで１８ｈ培養した後、１００００ｒｐｍで、５ｍｉｎ遠心分離して菌体を収集する。上清を捨てた後、４℃で１ｍｌ ＰＢＳ(ｐＨ値７．５、１０Ｍｍｏｌ／Ｌ)溶液に再懸濁させ、氷浴条件下で３００Ｖの電圧を選び、６ｓ 間隔で超音波を３ｓ出して１０Ｍｉｎ超音波破砕を行い、遠心分離し上清を取って酵素粗抽出液とし、活性測定を行う。

【0324】

ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼの活性測定： ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンかれＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンへの変換の程度に基づき、即ちＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの減少を測定マ−クとする。酵素活単位の定義は次のとおりである：酵素促進反応条件下で、１分間当たり１μｍｏｌ のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを減少させるために必要な酵素量を、１酵素活力単位(ＩＵ)とする。具体的な操作は次のとおりである：２０ｍｌ反応系を酵素活力測定系とし、そのうち４５ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ ｍＭ ＭＧＣＬ２、 １００ ｎＣｉ ＵＤＰＧｌｃＮＡｃ及び５ｍｇ 粗酵素液を含む。酵素活反応は３７℃水浴中で３０ ｍｉｎインキュベ−トを行う。エタノ−ルを加えて反応を終了させる。放射能を有する化合物を紙クロマトグラフィ−により分離する。液体シンチレ−ションカウンタ−により放射能を測定する。使用される溶媒系はノルマルプロパノ−ル：１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ ５．０：水（７：１：２）である。ＵＤＰＧｌｃＮＡｃからＭａｎＮＡｃへの変換の程度により、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼの活性単位を計算する。

【0325】

結果により、最も高い突然変異菌株の酵素活性は６５３ ＩＵ／ｍｌであり、対照菌株の酵素活性は２１．０ ＩＵ／ｍｌであることが示唆される。エラ−プロ−ンＰＣＲによってＷｅｃＢを改変し、酵素活性が大いに向上する突然変異株が得られる。該酵素の活性が最も高い突然変異菌株を選び、プラスミドを抽出して配列を決める。結果により、当該ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ突然変異体の遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.５８で、対応するアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.５９で表わされることが分かる。野生型ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ遺伝子の配列に比較し、全部で５つの塩基点突然変異が生じる：１０１Ｇ／Ｃ、４３３Ｃ／Ｇ、６７７Ｇ／Ｔ、７３４Ｔ／Ｇ、１０３８Ｔ／Ｃ；アミノ酸の４つのミスセンス突然変異が生じ、その突然変異点はそれぞれ次のとおりである：Ｃ３４Ｓ（３４位のシステインからセリンへの変換）、Ｈ１４５Ｄ（１４５位のヒスチジンからアスパラギン酸への変換）、Ｃ２２６Ｆ（２２６位のシステインからフェニルアラニンへの変換）、Ｖ２４５Ｇ（２４５位のバリンからグリシンへの変換）。当該突然変異遺伝子はＷｅｃＢＭと命名される。

【0326】

４，ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭ遺伝子カセットの大腸菌染色体のＮａｇＥ遺伝子部位への組込み
ＮａｇＥ遺伝子部位をｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭ遺伝子カセットの染色体での組込み部位とする。ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭ 遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込みを実現するために、先ず、Ｔｒｃプロモーター付きのＷｅｃＢＭ断片ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭ、および両端にＦＬＰ組換え酵素識別部位（ＦＲＴ 部位）を有するカナマイシン耐性遺伝子断片：ＦＲＴ−Ｋａｎｒ−ＦＲＴ （ｆＫａｎｒｆ）を増幅させ、且つ連結する。そして、もう一度設計してＮａｇＥ遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのプライマ−を削除し、且つｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭとｆＫａｎｒｆで連結される断片をテンプレ−トとし、Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長断片を増幅させる。
具体的な操作手順は次のとおりである：

【0327】

（１）ＰＣＲによりｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭ断片を増幅させる
テンプレ−ト：ＷｅｃＢＭ／ｐｔｒｃ９９Ａ。
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（Ｔｒｃｆｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２０であり、リバ−スプライマ−（Ｔｒｃｆｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２１である。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
産物サイズ：１．３ｋｂ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0328】

（２）ＰＣＲによりｆＫａｎｒｆ断片を増幅させる
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ｍｆＫａｎｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１であり、リバ−スプライマ−（ｍｆＫａｎｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２である。
テンプレ−ト：ｐＰｉｃ９Ｋ。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
ｆＫａｎｒｆサイズ：１．２８ｋｂ。そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３である。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0329】

（３）ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭに結合するｆＫａｎｒｆ を増幅させる
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ｆＫａｎｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２２であり、リバ−スプライマ−（ｆＫａｎｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２３１である。
テンプレ−ト：ｆＫａｎｒｆ。
ＰＣＲ反応条件：第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す；第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
二次増幅されるｆＫａｎｒｆのサイズ：１．３ｋｂ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0330】

（４）Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長のＰＣＲ断片を調製する
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する：もう一度設計してＮａｇＥ遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのフォワ−ドプライマ−（ＮａｇＥＫＯ−Ｆ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２４、リバ−スプライマ−（ＮａｇＥＫＯ−Ｒ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２５を削除する。
テンプレ−ト：ｐｔｒｃ−ＮａｎＫ ＰＣＲ断片と二次増幅されるｆＫａｎｒｆ ＰＣＲ断片、１：１で混合する。
ＰＣＲ反応条件：第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す；
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物：ホモロジ−ア−ム+ ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭ−ｆＫａｎｒｆ+ホモロジ−ア−ム。
ＰＣＲ産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して１００ｎｇ／μｌの線状ＤＮＡの完全長ＰＣＲ断片を得てＲｅｄ組換えタ−ゲティングに用いる。

【0331】

（５）Ｒｅｄ組換え操作
先ず、ｐＫＤ４６ベクタ−を大腸菌ＡＴ−００４−０２の菌株に導入する。そして、調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。

【0332】

１）ｐＫＤ４６プラスミドの形質転換を行う
i）コンピテントセルを作製する：先ず、−２０℃で保存されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴ−００４−０２菌液を、１：５０−１００で１０Ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍで、２−３時間振盪培養する。さらに培養液を１０Ｍｌ遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに５ｍｉｎ懸濁させる。最後に４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。
ii）プラスミドの形質転換を行う：自然沈降された菌体２５０μｌを取り、５μｌ ｐＫＤ４６プラスミドを加え、−４℃、３０ｍｉｎ。そして、４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。０．２ｍｌの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。３０℃で一晩（１２−１６時間）培養する。モノクロ−ナルを採取し、５ｍｌ ＬＢ液体培地に加えて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。

【0333】

２）調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする
i）電気的形質転換コンピテントセルを作製する：ｐＫＤ４６ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを含む菌株ＡＴ−００４−０２をアンピシリン（Ａｍｐ）ＬＢ培地を含む試験管に接種し、２５０ｒｐｍで一晩振盪し、翌日１％の量でＡｍｐを含むＬＢ培地に接種し、３０℃で培養し、ＯＤ₆₀₀が約０．２に達した後、ＯＤ₆₀₀が約０．４に達するまで、０．２％のＬ−アラビノ−スを加え、３０℃で３５分間誘導する。氷浴で冷却する。超純水で１回洗浄し、１０％グリセリンで２回洗浄し、最後に１０％グリセリンで再懸濁させ、グリセリンの用量は菌体を５００−１０００倍の最終濃度に濃縮させることが好ましい。
ii）電気ショック形質転換：２ｍｍ形質転換用カップを７０％エタノ−ルから取り出し、滅菌超純水で２回洗浄し、紫外線ランプで３０分間照射する。４℃で３０分間予備冷却する。９０μｌの最終的に再懸濁された細胞を取り、予備冷却用遠心管に移し、５μｌ（１００ｎｇ以上）のステップ（１）で得られる完全長ＰＣＲ断片（線形ＤＮＡ）を加え、ガンでやさしく吸って均一つに混合させ、３０分間氷浴する。
電気的形質転換パラメ−タ：：２５００Ｖ、２００Ω、２５μＦ。
iii）陽性クロ−ンの蘇生およびスクリーニング：１ｍｌのＬＢ液体培地を加え、３７℃、１００ｒｐｍ、１時間。そして２００μｌを１つのカナマイシン（Ｋａｎ）平板に塗布し、全部で５つの平板である。均一に塗布し、乾燥させる。
３０℃で２４時間培養する。カナマイシン耐性下で成長するクロ−ンを採取し、ＰＣＲ同定を行い、陽性クロ−ンをスクリーニングする。
得られる菌株の番号： ＡＴ−０４３−０１（ＡＴ−００４−０２，△ＮａｇＥ：：ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭ−ｆＫａｎｒｆ）。

【0334】

（６）耐性遺伝子を削除する
ｐＣＰ２０を前記カナマイシン耐性クロ−ンに導入し、３０℃で８ｈ培養し、そして４２℃で一晩放置し、熱誘導によりＦＬＰ 組換え酵素を発現させ、プラスミドを徐々に失わせる。シクロスポリン接種液を、抗生物質を含まない培地に詰め、成長したモノクロ−ナルを選んでカナマイシン耐性平板に滴下し、成長しないものはカナマイシン耐性遺伝子がＦＬＰ組換え酵素に削除されるクロ−ンである。同定用プライマ−を使ってＰＣＲを行ってカナマイシン耐性が消失したクロ−ンに対して同定を行う。
得られる菌株の番号： ＡＴ−０４３−０２（ＡＴ−００４−０２，△ＮａｇＥ：：ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭ）。

【0335】

５，ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭ遺伝子カセットの組込みがＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの収率に対する影響
染色体のＮａｇＥ遺伝子部位においてｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭ遺伝子カセットが組込まれる組換え菌ＡＴ−０４３−０２と対照菌株に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるＬＢ平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、３ｍｌのＬＢ液体培地付き試験管（１３×１５０ｍｍ）に接種し、３０℃、２２５ｒｐｍ、約８時間培養する。そして種培養液を取り、３％を５０ｍｌの発酵培養液（Ｍ９培養液）を含む２５０ｍｌフラスコに接種する。初期ＯＤ６００ は約０．５であり、３７℃、２２５ｒｐｍで培養し、発酵サイクルは７２時間である。２４時間目、４８時間目、１０Ｍ ＮａＯＨを使って発酵液のｐＨを７．０に調整する。据発酵液の糖分消費状況により、６５％グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を２０ｇ／ｌに維持する。発酵が終了し、１ｍｌの発酵液を取り、遠心分離する。ＨＰＬＣ法によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含量を測定する。

【0336】

フラスコ発酵の収率状況を表１３に示す。結果により、対照菌株ＡＴ−００５−０２の収率は非常に低く、検出されず、突然変異したｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭ遺伝子カセットが組込まれる組換え菌ＡＴ−０４３−０２の収率が著しく向上し、且つ突然変異しない対照菌株ＡＴ−０４２−０２の収率よりも著しく向上することが示唆される。

【0337】

[ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭ遺伝子カセットが組込まれる組換え菌のフラスコ発酵の収率]

【表13】

【0338】

前記結果により、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼの過剰発現によりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率を著しく向上させることができるだけでなく、エラ−プロ−ンＰＣＲ技術によって突然変異体をスクリーニングすることもＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの収率を大いに向上させることができ、これは得られる当該エピメラーゼの突然変異体が酵素の活性を向上させることによるものであることが分かる。

【0339】

（実施例４．ｃ）
本実施例はｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭカセットが組込まれる大腸菌株、特にビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂ及びその突然変異体が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響について説明する。

【0340】

ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）の遺伝子Ｖｈｂを増幅させ、且つｐｔｒｃ９９Ａを挿入し、それによってＶｈｂをＴｒｃプロモーターの制御下で菌株の形質転換を行い、またはビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）の遺伝子Ｖｈｂの突然変異体をスクリーニングしてｐｔｒｃ９９Ａを挿入し、菌株の形質転換を行い、それによって微生物の溶存酸素を利用する能力を向上させ、Ｎ−アセチルグルコサミン発酵生産収率を向上させる。

【0341】

１，ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭカセットが組込まれる大腸菌株、ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂ
（１）Ｖｈｂ遺伝子を増幅させ、且つｐｔｒｃ９９Ａを挿入する
ビトレオシラヘモグロビン遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６０であり、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６１である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉがコドン塩基を優先することにより、ビトレオシラヘモグロビン遺伝子の最適化・合成を行い、ｐＵＣ５７ ベクタ−をロ−ドする。得られたベクタ−はＶｈｂ／ｐＵＣ５７と命名される。
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（Ｖｈｂ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６２であり、リバ−スプライマ−（Ｖｈｂ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６３である。
テンプレ−ト： Ｖｈｂ／ｐＵＣ５７。
ＰＣＲ反応条件：第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す；第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物サイズ：４４１ｂｐ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
得られたＰＣＲ増幅断片とベクタ−ｐｔｒｃ９９Ａ を、それぞれＮｃｏ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、アガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製してＶｈｂ断片とｐｔｒｃ９９Ａ断片を回収し、Ｔ４ ＤＮＡで酵素を連結し、１６℃で一晩放置し、且つ同定を行い、Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドが得られる。

【0342】

（２）Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａを使ってｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭカセット組込まれる大腸菌株の形質転換を行う
１）コンピテントセルを作製する
i）−２０℃で保存されるＡＴ−０４３−０２菌液を、１：５０−１００で１０Ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍで、２−３時間振盪培養する。
ii）培養液を１０Ｍｌ遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに５ｍｉｎ懸濁させる。
iii）４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。
２）プラスミドの形質転換を行う
i）自然沈降後の菌体２５０μｌを取り、５μｌ Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドを加え、−４℃、３０ｍｉｎ。
ii）４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地 ０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。
iii）０．２ｍｌ菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。
iv）３０℃で一晩（１２−１６時間）培養する。
v）モノクロ−ナルを選び、５ｍｌ ＬＢ液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。
vi）陽性クロ−ンを保存して必要に備える。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０５６（ＡＴ−０４３−０２，Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａ）。

【0343】

２，ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭカセットが組込まれる大腸菌株、ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂの突然変異体
１）コンピテントセルを作製する
i）−２０℃で保存されるＡＴ−０４３−０２菌液を、１：５０−１００で１０Ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍで、２−３時間振盪培養する。
ii）培養液を１０Ｍｌ遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに５ｍｉｎ懸濁させる。
iii）４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。
２）プラスミドの形質転換を行う
i）自然沈降後の菌体２５０μｌを取り、５μｌ Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドを加え、−４℃、３０ｍｉｎ。
ii）４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地 ０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。
iii）０．２ｍｌ菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。
iv）３０℃で一晩（１２−１６時間）培養する。
v）モノクロ−ナルを選び、５ｍｌ ＬＢ液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。
vi）陽性クロ−ンを保存して必要に備える。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０５７（ＡＴ−０４３−０２，ＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９Ａ）。

【0344】

３，ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭカセット組込まれる大腸菌株、ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂ及びその突然変異体が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響
ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭカセットが組込まれる菌株、ビトレオシラヘモグロビンを発現させる遺伝子およびその突然変異菌株 ＡＴ−０５６、ＡＴ−０５７に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるＬＢ平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、３ｍｌのＬＢ液体培地付き試験管（１３×１５０ｍｍ）に接種し、３０℃、２２５ｒｐｍで、約８時間培養する。そして種培養液を取り、３％を５０ｍｌのＭ９培養液を含む２５０ｍｌフラスコに接種する。初期ＯＤ₆₀₀ は約０．５であり、３７℃、２２５ｒｐｍで培養し、発酵サイクルは７２時間である。２４時間目、４８時間目に、１０Ｍ ＮａＯＨを使って発酵液のｐＨを７．０に調整する。発酵液の糖分消費状況により、６５％グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を２０ｇ／ｌに維持する。発酵が終了し、１ｍｌ発酵液を取り、遠心分離する。ＨＰＬＣ法によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含量を測定する。

【0345】

組換え菌のフラスコ発酵の収率状況を表１４に示す。結果により、Ｖｈｂの発現により、Ｖｈｂ／ ｐｔｒｃ９９Ａの形質転換であれ、ＶｈｂＭ／ ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換であれ、収率を著しく向上させることができ、且つＶｈｂＭ／ ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換が収率の向上に対する影響がより大きいことが示唆される。

【0346】

[ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭ遺伝子カセットが組込まれる組換え菌がＶｈｂとＶｈｂＭを発現させるフラスコ発酵の収率]

【表14】

【0347】

（実施例５．ａ）
本実施例はＮａｇＢ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換し、さらにＧｌｍＳ遺伝子の内在性天然プロモーターを削除することが、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響について説明する

【0348】

１，ＮａｇＢ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換する
ｎａｇレギュレ−タ（ＮａｇＥ−ＮａｇＢＡＣＤ）の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐＨｏｓｐＨａｔｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ、ＮａｇＢ）の遺伝子のプロモーターを削除し、Ｔｒｃプロモーターに置換する。Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐＨｏｓｐＨａｔｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ、ＮａｇＢ）による触媒反応は可逆的であり、ＮａｇＢを過剰発現させ、ＮａｇＢの順方向触媒反応を加速し、Ｄ−グルコサミン６−リン酸（ＧｌｃＮ−６−Ｐ）を増加させるという目的を達成する。
先ず、Ｔｒｃプロモーター断片とｆＫａｎｒｆ断片を増幅させ、且つ連結する。そして、ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する、Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長断片を増幅させる。

【0349】

（１）Ｔｒｃ プロモーター配列を増幅させる
開示情報から、Ｔｒｃプロモーター配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３２を見つける。
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ＫａｎＴｒｃＲｅｄ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３３であり、リバ−スプライマ−（ＫａｎＴｒｃＲｅｄ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３４である。
テンプレ−ト：ｐｔｒｃ９９Ａ
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
産物サイズ：１６６ｂｐ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0350】

（２）両端にＦＬＰ 組換え酵素識別部位（ＦＲＴ 部位）を有するカナマイシン耐性遺伝子：ｆＫａｎｒｆを増幅させる
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ｍｆＫａｎｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１であり、リバ−スプライマ−（ｍｆＫａｎｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２である。
テンプレ−ト：ｐＰｉｃ９Ｋ。
ＰＣＲ反応条件：第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す；
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
ｆＫａｎｒｆサイズ：１．２８ｋｂ。そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３である。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0351】

（３）Ｔｒｃプロモーターに結合するｆＫａｎｒｆを増幅させる
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ｆＫａｎｆＲｅｄ−Ｆ１）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３５であり、リバ−スプライマ−（ｆＫａｎｆＲｅｄ−Ｒ１）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３６である。
テンプレ−ト：ｆＫａｎｒｆ。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
二次増幅されるｆＫａｎｒｆのサイズ：１．３ｋｂ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0352】

（４）Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長ＰＣＲ断片を調製する
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する： ＮＣＢＩ からＮＣ_０００９１３、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ. Ｋ−１２ ＮａｇＢプロモーターの配列とＮａｇＥ遺伝子の配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１３を見つけ、設計してＮａｇＢプロモーターホモロジ−ア−ムのフォワ−ドプライマ−（ＮａｇＢＫＯ−Ｆ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.４０、リバ−スプライマ−（ＮａｇＢＫＯ−Ｒ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.４１を削除する。
テンプレ−ト：Ｔｒｃ プロモーターＰＣＲ断片と二次増幅されるｆＫａｎｒｆ ＰＣＲ断片を１：１で混合する。
ＰＣＲ反応条件：第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す；第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物：ホモロジ−ア−ム+ ｆＫａｎｒｆ+ Ｔｒｃプロモーター+ホモロジ−ア−ム。
ＰＣＲ産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して１００ｎｇ／μｌの線状ＤＮＡの完全長ＰＣＲ断片を得てＲｅｄ組換えタ−ゲティングに用いる。

【0353】

（５）Ｒｅｄ組換え操作
先ず、ｐＫＤ４６ベクタ−を大腸菌ＡＴ−００５−０２の菌株に導入する。そして、調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０４８（ＡＴ−００５−０２、△ＮａｇＢ ｐｒｏｍｏｔｏｒ：：Ｔｒｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）。

【0354】

２，ＧｌｍＳ遺伝子の内在性天然プロモーターを削除する
グルコサミン６−リン酸シンターゼ（Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐＨｏｓｐＨａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＧｌｍＳ）の遺伝子のプロモーター配列を削除する。グルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）はＬ−グルタミン−６−リン酸アミノトランスファラーゼ（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ：Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐＨｏｓｐＨａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とも呼ばれ、グルコ−ス−６−リン酸（Ｇｌｃ−６−Ｐ）からＤ−グルコサミン６−リン酸（ＧｌｃＮ−６−Ｐ）へのアミノ化に触媒として作用することができるが、深刻な産物抑制問題があり、そのプロモーターの配列を削除し、当該酵素に発現を失わせることにより、ＧｌｃＮ−６−Ｐの産物抑制を解除することができる。

【0355】

先ず、ｆＫａｎｒｆ断片を増幅させ、そして、ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計し、Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長断片を増幅させる
（１）両端にＦＬＰ 組換え酵素識別部位（ＦＲＴ 部位）を有するカナマイシン耐性遺伝子：ｆＫａｎｒｆを増幅させる
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ｍｆＫａｎｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１であり、リバ−スプライマ−（ｍｆＫａｎｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２である。
テンプレ−ト：ｐＰｉｃ９Ｋ。
ＰＣＲ反応条件：第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す；第３ステップ：
７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
ｆＫａｎｒｆサイズ：１．２８ｋｂ。そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３である。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0356】

（２）Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長ＰＣＲ断片を調製する
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する： ＮＣＢＩ からＮＣ_０００９１３、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ. Ｋ−１２ Ｌ−グルタミン−６−リン酸アミノトランスファラーゼ（ＧｌｍＳ）遺伝子のプロモーター配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.４２を見つけ、ＧｌｍＳ遺伝子プロモーター配列が削除されるホモロジ−ア−ムフォワ−ドプライマ−（ＰｒｏＧｌｍＳＫＯ−Ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.４３、リバ−スプライマ−（ＰｒｏＧｌｍＳＫＯ−Ｒ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.４４を設計する。
テンプレ−ト：ｆＫａｎｒｆ ＰＣＲ断片。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物：ホモロジ−ア−ム+ ｆＫａｎｆ+ホモロジ−ア−ム。
ＰＣＲ産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して１００ｎｇ／μｌの線状ＤＮＡの完全長ＰＣＲ断片を得てＲｅｄ組換えタ−ゲティングに用いる。

【0357】

（３）Ｒｅｄ組換え操作
先ず、ｐＫＤ４６ベクタ−を大腸菌ＡＴ−０４８の菌株に導入する。そして、調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０４９（ＡＴ−０４８，△ＧｌｍＳ ｐｒｏｍｏｔｏｒ）。

【0358】

３，ＮａｇＢプロモーターを発現レベルがより高いプロモーターに置換し且つさらにＧｌｍＳプロモーターがＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響を削除する
ＮａｇＢプロモーターを発現レベルがより高いプロモーターに置換する菌株、及びさらにＧｌｍＳプロモーターを削除する組換え菌株に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるＬＢ平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、３ｍｌのＬＢ液体培地付き試験管（１３×１５０ｍｍ）に接種し、３０℃、２２５ｒｐｍ、約８時間培養する。そして種培養液を取り、３％を５０ｍｌの発酵培養液（Ｍ９培養液）を含む２５０ｍｌフラスコに接種する。初期ＯＤ６００ は約０．５であり、３７℃、２２５ｒｐｍで培養し、発酵サイクルは７２時間である。２４時間目、４８時間目、１０Ｍ ＮａＯＨを使って発酵液のｐＨを７．０に調整する。据発酵液の糖分消費状況により、６５％グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を２０ｇ／ｌに維持する。発酵が終了し、１ｍｌの発酵液を取り、遠心分離する。ＨＰＬＣ法によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含量を測定する。

【0359】

フラスコ発酵の収率状況を表１５に示す。結果により、ＮａｇＢプロモーターをＴｒｃプロモーターに置換する組換え菌によりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率を著しく向上させ、さらにＧｌｍＳプロモーター削除した場合、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率をさらに大いに向上させることが示唆される。

【0360】

[ＮａｇＢプロモーターを置換しおよびさらにＧｌｍＳプロモーターを削除する組換え菌のフラスコ発酵の収率]

【表15】

【0361】

（実施例５．ｂ）
本実施例はＧｌｍＳ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換し、さらにＮａｇＢ遺伝子の内在性天然プロモーター削除することが、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響について説明する

【0362】

１，ＧｌｍＳ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換する
Ｌ−グルタミン−６−リン酸アミノトランスファラーゼ（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ：Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐＨｏｓｐＨａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の遺伝子のプロモーター配列をＴｒｃプロモーター配列に置換する。Ｌ−グルタミン−６−リン酸アミノトランスファラーゼはグルコサミン６−リン酸シンターゼ（Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐＨｏｓｐＨａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＧｌｍＳ）とも呼ばれ、そのプロモーター配列をＴｒｃプロモーター配列に置換することにより、ＧｌｍＳを過剰発現させ、ＧｌｍＳの触媒機能を向上させることができ、ぞれによってＤ−グルコサミン６−リン酸（ＧｌｃＮ−６−Ｐ）を増加させるという目的を達成する。
先ず、Ｔｒｃプロモーター配列断片とｆＫａｎｒｆ断片を増幅させ、且つ連結する。そして、ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する、Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長断片を増幅させる。

【0363】

（１）Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長ＰＣＲ断片を増幅させる
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する： ＧｌｍＳ遺伝子のプロモーター配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.４２により、設計してＴｒｃプロモーターのホモロジ−ア−ムフォワ−ドプライマ−（ＰｒｏＧｌｍＳｐｔｒｃ−Ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.４５、リバ−スプライマ−（ＰｒｏＧｌｍＳｐｔｒｃ−Ｒ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.４６に置換する。
テンプレ−ト：Ｔｒｃ プロモーター ＰＣＲ断片と二次増幅されたｆＫａｎｒｆ ＰＣＲ断片を１：１で混合する。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物：ホモロジ−ア−ム+ ｆＫａｎｒｆ+ Ｔｒｃプロモーター+ホモロジ−ア−ム。
ＰＣＲ産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して１００ｎｇ／μｌの線状ＤＮＡの完全長ＰＣＲ断片を得てＲｅｄ組換えタ−ゲティングに用いる。

【0364】

（２）Ｒｅｄ組換え操作
先ず、ｐＫＤ４６ベクタ−を大腸菌ＡＴ−００５−０２の菌株に導入する。そして、調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０５０（ＡＴ−００５−０２，△ＧｌｍＳ ｐｒｏｍｏｔｏｒ：：Ｔｒｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）。

【0365】

２，ＮａｇＢ遺伝子の内在性天然プロモーターを削除する
ｎａｇレギュレ−タ（ＮａｇＥ−ＮａｇＢＡＣＤ）の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐＨｏｓｐＨａｔｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ、ＮａｇＢ）の遺伝子のプロモーター配列を削除し、ＮａｇＢに機能を失わせることにより、ＮａｇＢの逆方向触媒機能を削除し、ＧｌｃＮ−６−ＰからＧｌｃ−６−Ｐへの生成を低下させることができる。
先ず、ｆＫａｎｒｆ断片を増幅させ、そして、ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計し、Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長断片を調製する。

【0366】

（１）Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長ＰＣＲ断片を調製する
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する： ＮａｇＢプロモーターとＮａｇＥ遺伝子配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１３により、設計してＮａｇＢプロモーター配列のホモロジ−ア−ムフォワ−ドプライマ−（ＮａｇＢＫＯ−Ｆ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.４７、リバ−スプライマ−（ＮａｇＢＫＯ−Ｒ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.４８を削除する。
テンプレ−ト：ｆＫａｎｒｆ ＰＣＲ断片
ＰＣＲ反応条件：第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す；
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物：ホモロジ−ア−ム+ｆＫａｎｒｆ+ホモロジ−ア−ム。
ＰＣＲ産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して１００ｎｇ／μｌの線状ＤＮＡの完全長ＰＣＲ断片を得てＲｅｄ組換えタ−ゲティングに用いる。

【0367】

（２）Ｒｅｄ組換え操作
先ず、ｐＫＤ４６ベクタ−を大腸菌ＡＴ−０５０の菌株に導入する。そして、調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０５１（ＡＴ−０５０，△ＮａｇＢ ｐｒｏｍｏｔｏｒ）。

【0368】

３，ＧｌｍＳプロモーターを発現レベルがより高いプロモーターに置換し且つさらにＮａｇＢプロモーターがＮ−アセチルグルコサミン収率に対する影響を削除する
ＧｌｍＳプロモーターを発現レベルがより高いプロモーターに置換する菌株、およびＮａｇＢプロモーターを削除する組換え菌株に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるＬＢ平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、３ｍｌのＬＢ液体培地付き試験管（１３×１５０ｍｍ）に接種し、３０℃、２２５ｒｐｍ、約８時間培養する。そして種培養液を取り、３％を５０ｍｌの発酵培養液（Ｍ９培養液）を含む２５０ｍｌフラスコに接種する。初期ＯＤ６００ は約０．５であり、３７℃、２２５ｒｐｍで培養し、発酵サイクルは７２時間である。２４時間目、４８時間目、１０Ｍ ＮａＯＨを使って発酵液のｐＨを７．０に調整する。据発酵液の糖分消費状況により、６５％グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を２０ｇ／ｌに維持する。発酵が終了し、１ｍｌの発酵液を取り、遠心分離する。ＨＰＬＣ法によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含量を測定する。

【0369】

フラスコ発酵の収率状況を表１６に示す。結果により、ＧｌｍＳプロモーターをＴｒｃプロモーターに置換する組換え菌のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの収率向上の効果が顕著でなく、収率が検出されない。しかし、ＮａｇＢプロモーターを同時に削除することによりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの収率が対照菌株に比べ著しく向上することが示唆される。

【0370】

[ＧｌｍＳプロモーターを置換しおよびさらにＮａｇＢプロモーターを削除する組換え菌のフラスコ発酵の収率]

【表16】

【0371】

（実施例５．ｃ）
本実施例はＧｌｍＳ遺伝子とＮａｇＢ遺伝子の内在性天然プロモーターを置換及び／又は削除する大腸菌株、ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂ及びその突然変異体が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響について説明する。
ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）の遺伝子Ｖｈｂを増幅させ、且つｐｔｒｃ９９Ａを挿入し、それによってＶｈｂをＴｒｃプロモーターの制御下で菌株の形質転換を行い、またはビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）の遺伝子Ｖｈｂの突然変異体をスクリーニングしてｐｔｒｃ９９Ａを挿入し、菌株の形質転換を行い、それによって微生物の溶存酸素を利用する能力を向上させ、Ｎ−アセチルグルコサミン発酵生産収率を向上させる。

【0372】

１，ＮａｇＢプロモーターを発現レベルがより高いプロモーターに置換し且つさらにＧｌｍＳプロモーターを削除する大腸菌株、ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂ及びその突然変異体
（１）Ｖｈｂ遺伝子を増幅させ、且つｐｔｒｃ９９Ａを挿入する
ビトレオシラヘモグロビン遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６０であり、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６１である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉがコドン塩基を優先することにより、ビトレオシラヘモグロビン遺伝子の最適化・合成を行い、ｐＵＣ５７ ベクタ−をロ−ドする。得られたベクタ−はＶｈｂ／ｐＵＣ５７と命名される。
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（Ｖｈｂ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６２であり、リバ−スプライマ−（Ｖｈｂ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６３である。
テンプレ−ト： Ｖｈｂ／ｐＵＣ５７。
ＰＣＲ反応条件：第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す；
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物サイズ：４４１ｂｐ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
得られるＰＣＲ増幅断片とベクタ−ｐｔｒｃ９９ＡをそれぞれＮｃｏ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、アガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製してＶｈｂ断片とｐｔｒｃ９９Ａ断片を回収し、Ｔ４ ＤＮＡで酵素を連結し、１６℃で一晩放置し、且つ同定を行い、Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドが得られる。

【0373】

（２）Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａ、ＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９ＡでＮａｇＢプロモーターを改変して発現レベルがより高いプロモーターに置換し且つさらにＧｌｍＳプロモーターを削除する大腸菌株
１）コンピテントセルを作製する
i）−２０℃で保存されるＡＴ−０４９菌液を、１：５０−１００で１０Ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍで、２−３時間振盪培養する。
ii）培養液を１０Ｍｌ遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに５ｍｉｎ懸濁させる。
iii）４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。
２）プラスミドの形質転換を行う
i）自然沈降後の菌体２５０μｌを取り、５μｌ Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドを加え、−４℃、３０ｍｉｎ。
ii）４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地 ０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。
iii）０．２ｍｌ菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。
iv）３０℃で一晩（１２−１６時間）培養し。
v）モノクロ−ナルを選び、５ｍｌ ＬＢ液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。
vi）陽性クロ−ンを保存して必要に備える。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０５８（ＡＴ−０４９，Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａ）、ＡＴ−０５９（ＡＴ−０４９，ＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９Ａ）。

【0374】

２，ＧｌｍＳ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換し、さらにＮａｇＢ遺伝子の内在性天然プロモーターを削除する大腸菌株、ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂの突然変異体
１）コンピテントセルを作製する
i）−２０℃で保存されるＡＴ−０５１菌液を、１：５０−１００で１０Ｍｌ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍで、２−３時間振盪培養する。
ii）培養液を１０Ｍｌ遠心管に入れ、４０００ｇ×５ｍｉｎ、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに５ｍｉｎ懸濁させる。
iii）４０００ｇ×５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、氷浴用０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ５ｍｌに懸濁させる。−４℃で１２時間放置し、自然沈降させる。
２）プラスミドの形質転換を行う
i）自然沈降後の菌体２５０μｌを取り、５μｌ Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドを加え、−４℃、３０ｍｉｎ。
ii）４２℃で１．５ｍｉｎ水浴し、ＳＯＣ培地０．７ｍｌを加え、３０℃で２時間振盪する。
iii）０．２ｍｌ菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。
iv）３０℃で一晩（１２−１６時間）培養する。
v）モノクロ−ナルを選び、５ｍｌ ＬＢ液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。
vi）陽性クロ−ンを保存して必要に備える。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０６０（ＡＴ−０５１，Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａ）、ＡＴ−０６１（ＡＴ−０５１，ＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９Ａ）。

【0375】

３，ＧｌｍＳ遺伝子とＮａｇＢ遺伝子の内在性天然プロモーターを置換及び／又は削除する大腸菌株、ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂ及びその突然変異体が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響
ＧｌｍＳ遺伝子とＮａｇＢ遺伝子の内在性天然プロモーターを置換及び／又は削除する菌株、ビトレオシラヘモグロビンを発現させる遺伝子及びその突然変異菌株ＡＴ−０５８、ＡＴ−０５９、ＡＴ−０６０、ＡＴ−０６１に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるＬＢ平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、３ｍｌのＬＢ液体培地付き試験管（１３×１５０ｍｍ）に接種し、３０℃、２２５ｒｐｍで、約８時間培養する。そして種培養液を取り、３％を５０ｍｌのＭ９培養液を含む２５０ｍｌフラスコに接種する。初期ＯＤ₆₀₀ は約０．５であり、３７℃、２２５ｒｐｍで培養し、発酵サイクルは７２時間である。２４時間目、４８時間目、１０Ｍ ＮａＯＨを使って発酵液のｐＨを７．０に調整する。発酵液の糖分消費状況により、６５％グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を２０ｇ／ｌに維持する。発酵が終了し、１ｍｌ発酵液を取り、遠心分離し。ＨＰＬＣ法によりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含量を測定する。

【0376】

組換え菌のフラスコ発酵の収率状況を表１７に示す。結果により、Ｖｈｂを発現させることにより、Ｖｈｂ／ ｐｔｒｃ９９Ａの形質転換であれ、ＶｈｂＭ／ ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換であれ、収率を著しく向上させることができ、且つＶｈｂＭ／ ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換により収率をより著しく向上させることが示唆される。

【0377】

[ＶｈｂとＶｈｂＭを発現させる組換え菌のフラスコ発酵の収率]

【表17】

【0378】

（実施例６）
本実施例はｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭカセットが組込まれる大腸菌株、且つＮａｎＥ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換し、さらにビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂ及びその突然変異体が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響について説明する。

【0379】

１，ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭカセットが組込まれる大腸菌株のＮａｎＥ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換する
先ず、Ｔｒｃプロモーター配列断片とｆＫａｎｒｆ断片を増幅させ、且つ連結する。そして、ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する、Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長断片を増幅させる。

【0380】

（１）Ｔｒｃ プロモーター配列を増幅させる
開示情報から、Ｔｒｃプロモーター配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３２を見つける。
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ＫａｎＴｒｃＲｅｄ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３３であり、リバ−スプライマ−（ＫａｎＴｒｃＲｅｄ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３４である。
テンプレ−ト：ｐｔｒｃ９９Ａ
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
産物サイズ：１６６ｂｐ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0381】

（２）両端にＦＬＰ 組換え酵素識別部位（ＦＲＴ 部位）を有するカナマイシン耐性遺伝子：ｆＫａｎｒｆを増幅させる
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ｍｆＫａｎｆ−Ｆ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１であり、リバ−スプライマ−（ｍｆＫａｎｆ−Ｒ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２である。
テンプレ−ト：ｐＰｉｃ９Ｋ。
ＰＣＲ反応条件：第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う；第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓ、３０回繰り返す；第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
ｆＫａｎｒｆサイズ：１．２８ｋｂ。そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３である。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0382】

（３）Ｔｒｃプロモーターに結合するｆＫａｎｒｆを増幅させる
プライマ−を設計する：フォワ−ドプライマ−（ｆＫａｎｆＲｅｄ−Ｆ１）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３５であり、リバ−スプライマ−（ｆＫａｎｆＲｅｄ−Ｒ１）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３６である。
テンプレ−ト：ｆＫａｎｒｆ。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
二次増幅されるｆＫａｎｒｆのサイズ：１．３ｋｂ。
ＰＣＲ 産物を１％アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。

【0383】

（４）Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長ＰＣＲ断片を調製する
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する： ＮａｎＥ遺伝子のプロモーター配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３７により、設計してＴｒｃプロモーターのホモロジ−ア−ムフォワ−ドプライマ−（ＰｒｏＮａｎＥｐｔｒｃ−Ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３８、リバ−スプライマ−（ＰｒｏＮａｎＥｐｔｒｃ−Ｒ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３９に置換する。
テンプレ−ト：Ｔｒｃ プロモーター ＰＣＲ断片と二次増幅されるｆＫａｎｒｆ ＰＣＲ断片を、１：１で混合する。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物：ホモロジ−ア−ム+ ｆＫａｎｒｆ+ Ｔｒｃプロモーター+ホモロジ−ア−ム。
ＰＣＲ産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して１００ｎｇ／μｌの線状ＤＮＡの完全長ＰＣＲ断片を得てＲｅｄ組換えタ−ゲティングに用いる。

【0384】

（５）Ｒｅｄ組換え操作
先ず、ｐＫＤ４６ベクタ−を大腸菌ＡＴ−００７−０２の菌株に導入する。そして、調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
得られる菌株の番号： ＡＴ−００９（ＡＴ−００７−０２、△ＮａｎＥ ｐｒｏｍｏｔｏｒ：：Ｔｒｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）。

【0385】

２，ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭカセットが組込まれる大腸菌株、且つＮａｎＥ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換し、そしてビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂ及びその突然変異体
先ず、組換え大腸菌株ＡＴ−００９のコンピテントセルを作製し、そして、Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９ＡとＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９ＡプラスミドをＣａＣｌ_２形質転換法によってＡＴ−００９に導入し、モノクロ−ナルを採取して培養し、プラスミドを抽出して陽性クロ−ンの同定を行う。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０６２（ＡＴ−００９、Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａ）、ＡＴ−０６３（ＡＴ−００９、ＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９Ａ）。

【0386】

ビトレオシラヘモグロビンを発現させる遺伝子及びその突然変異菌株 ＡＴ−０６２、ＡＴ−０６３に対して、フラスコ発酵試験を行う。組換え菌のフラスコ発酵の収率状況を表１８に示す。結果により、Ｖｈｂを発現させることにより、Ｖｈｂ／ ｐｔｒｃ９９Ａの形質転換であれ、ＶｈｂＭ／ ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換であれ、収率を著しく向上させることができ、且つＶｈｂＭ／ ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換により収率をより著しく向上させることが示唆される。

【0387】

[組換え菌のフラスコ発酵の収率]

【表18】

【0388】

（実施例７）
本実施例はｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭカセットが組込まれる大腸菌株、且つグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の遺伝子ＧｌｍＳ及び／又はＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の遺伝子ＮａｇＢの内在性天然プロモーターを置換及び／又は削除し、そしてビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂ及びその突然変異体が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響について説明する。

【0389】

ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭカセットが組込まれる大腸菌株のＮａｇＢ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換し、ＡＴ−０１０（ＡＴ−００７−０２、△ＮａｇＢ ｐｒｏｍｏｔｏｒ：：Ｔｒｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が得られ、さらにＧｌｍＳ遺伝子の内在性天然プロモーターを削除してＡＴ−０１１（ＡＴ−０１０、△ＧｌｍＳ ｐｒｏｍｏｔｏｒ）が得られる；ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭカセットが組込まれる大腸菌株のＧｌｍＳ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換してＡＴ−０１２（ＡＴ−００７−０２、△ＧｌｍＳ ｐｒｏｍｏｔｏｒ：：Ｔｒｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が得られ、さらにＮａｇＢ遺伝子の内在性天然プロモーターを削除してＡＴ−０１３（ＡＴ−０１２、△ＮａｇＢ ｐｒｏｍｏｔｏｒ）が得られる。
組換え大腸菌株ＡＴ−０１１、ＡＴ−０１３のコンピテントセルを作製し、そして、Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９ＡとＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９ＡプラスミドをＣａＣｌ_２形質転換法によってＡＴ−０１１、ＡＴ−０１３に導入し、モノクロ−ナルを採取して培養して、プラスミドを抽出して陽性クロ−ンの同定を行う。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０６４（ＡＴ−０１１，Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａ）、ＡＴ−０６５（ＡＴ−０１１，ＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９Ａ）、ＡＴ−０６６（ＡＴ−０１３，Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａ）、ＡＴ−０６７（ＡＴ−０１３，ＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９Ａ）。

【0390】

ビトレオシラヘモグロビンを発現させる遺伝子及びその突然変異菌株 ＡＴ−０６４、ＡＴ−０６５、ＡＴ−０６６、ＡＴ−０６７に対して、フラスコ発酵試験を行う。組換え菌のフラスコ発酵の収率状況を表１９に示す。結果により、Ｖｈｂを発現させることにより、Ｖｈｂ／ ｐｔｒｃ９９Ａの形質転換であれ、ＶｈｂＭ／ ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換であれ、収率を著しく向上させることができ、且つＶｈｂＭ／ ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換により収率をより著しく向上させることが示唆される。

【0391】

[組換え菌のフラスコ発酵の収率]

【表19】

【0392】

（実施例８）
本実施例はｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭカセットが組込まれる大腸菌株、且つＷｅｃＢ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換し、そしてビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂ及びその突然変異体が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響について説明する。

【0393】

１，ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭカセットが組込まれる大腸菌株のＷｅｃＢ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換する
先ず、Ｔｒｃプロモーター配列断片とｆＫａｎｒｆ断片を増幅させ、且つ連結する。そして、ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計し、Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長断片を増幅させる。

【0394】

（１）Ｒｅｄ組換え標的線形ＤＮＡ完全長ＰＣＲ断片を調製する
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する：ＮＣＢＩ からＮＣ_０００９１３を見つけ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）遺伝子のプロモーターのヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.５３が得られ、設計してＴｒｃプロモーターのホモロジ−ア−ムフォワ−ドプライマ−（ＰｒｏＷｅｃＢｐｔｒｃ−Ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.５４、リバ−スプライマ−（Ｐｒｏ ＷｅｃＢｐｔｒｃ−Ｒ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.５５に置換する。
テンプレ−ト：Ｔｒｃ プロモーター ＰＣＲ断片と二次増幅されるｆＫａｎｒｆ ＰＣＲ断片を、１：１で混合する。
ＰＣＲ反応条件：
第１ステップ：９４℃で１ｍｉｎ変性を行う。
第２ステップ：９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃４０ｓを３０回繰り返す。
第３ステップ：７２℃で１０Ｍｉｎ伸長を行う。
増幅産物：ホモロジ−ア−ム+ ｆＫａｎｒｆ+ Ｔｒｃプロモーター+ホモロジ−ア−ム。
ＰＣＲ産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して１００ｎｇ／μｌの線状ＤＮＡの完全長ＰＣＲ断片を得てＲｅｄ組換えタ−ゲティングに用いる。

【0395】

（２） Ｒｅｄ組換え操作
先ず、ｐＫＤ４６ベクタ−を大腸菌ＡＴ−００７−０２の菌株に導入する。そして、調製された標的線形ＤＮＡ断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０１９（ＡＴ−００７−０２，△ＷｅｃＢ ｐｒｏｍｏｔｏｒ：：Ｔｒｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）。

【0396】

２，ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭカセットが組込まれる大腸菌株、且つＷｅｃＢ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換し、そしてビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂ及びその突然変異体
先ず、組換え大腸菌株ＡＴ−０１９のコンピテントセルを作製し、そして、Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９ＡとＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９ＡプラスミドをＣａＣｌ_２形質転換法によってＡＴ−０１９に導入し、モノクロ−ナルを採取して培養し、プラスミドを抽出して陽性クロ−ンの同定を行う。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０６８（ＡＴ−０１９，Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａ）、ＡＴ−０６９（ＡＴ−０１９，ＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９Ａ）。

【0397】

ビトレオシラヘモグロビンを発現させる遺伝子及びその突然変異菌株 ＡＴ−０６８、ＡＴ−０６９に対して、フラスコ発酵試験を行う。組換え菌のフラスコ発酵の収率状況を表２０に示す。結果により、Ｖｈｂを発現させることにより、Ｖｈｂ／ ｐｔｒｃ９９Ａの形質転換であれ、ＶｈｂＭ／ ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換であれ、 収率を著しく向上させることができ、且つＶｈｂＭ／ ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換により収率をより著しく向上させることが示唆される。

【0398】

［組換え菌のフラスコ発酵の収率］

【表20】

【0399】

（実施例９）
本実施例はｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭカセットが組込まれる大腸菌株、且つグルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の遺伝子ＧｌｍＳ及び／又はＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の遺伝子ＮａｇＢの内在性天然プロモーターを置換及び／又は削除し、そしてビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂ及びその突然変異体が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響について説明する。

【0400】

ｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭカセットが組込まれる大腸菌株のＮａｇＢ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換し、ＡＴ−０３２（ＡＴ−０３１−０２、△ＮａｇＢ ｐｒｏｍｏｔｏｒ：：Ｔｒｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が得られ、さらにＧｌｍＳ遺伝子の内在性天然プロモーターを削除してＡＴ−０３３（ＡＴ−０３２、△ＧｌｍＳ ｐｒｏｍｏｔｏｒ）が得られる；
ｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭカセットが組込まれる大腸菌株ＧｌｍＳの遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換してＡＴ−０３４（ＡＴ−０３１−０２、△ＧｌｍＳ ｐｒｏｍｏｔｏｒ：：Ｔｒｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が得られ、さらにＮａｇＢ遺伝子の内在性天然プロモーターを削除してＡＴ−０３５（ＡＴ−０３４、△ＮａｇＢ ｐｒｏｍｏｔｏｒ）が得られる。

【0401】

組換え大腸菌株ＡＴ−０３３、ＡＴ−０３５のコンピテントセルを作製し、そして、Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９ＡとＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９ＡプラスミドをＣａＣｌ_２形質転換法によってＡＴ−０３３、ＡＴ−０３５に導入し、モノクロ−ナルを採取して培養し、プラスミドを抽出して陽性クロ−ンの同定を行う。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０７０（ＡＴ−０３３，Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａ）、ＡＴ−０７１（ＡＴ−０３３，ＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９Ａ）、ＡＴ−０７２（ＡＴ−０３５，Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａ）、ＡＴ−０７３（ＡＴ−０３５，ＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９Ａ）。

【0402】

ビトレオシラヘモグロビンを発現させる遺伝子及びその突然変異菌株 ＡＴ−０７０、ＡＴ−０７１、ＡＴ−０７２、ＡＴ−０７３に対して、フラスコ発酵試験を行う。組換え菌のフラスコ発酵の収率状況を表２１に示す。結果により、Ｖｈｂを発現させることにより、Ｖｈｂ／ ｐｔｒｃ９９Ａの形質転換であれ、ＶｈｂＭ／ ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換であれ、収率を著しく向上させることができ、且つＶｈｂＭ／ ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換により、収率をより著しく向上させることが示唆される。

【0403】

［組換え菌のフラスコ発酵の収率］

【表21】

【0404】

（実施例１０）
本実施例はｐｔｒｃ−ＮａｎＥＭカセットが組込まれる大腸菌株、且つＷｅｃＢ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換し、そしてビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂ及びその突然変異体が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響について説明する。

【0405】

ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭカセットが組込まれる大腸菌株のＷｅｃＢ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換し、ＡＴ−０３７（ＡＴ−０３１−０２、△ＷｅｃＢ ｐｒｏｍｏｔｏｒ：：Ｔｒｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が得られる。
組換え大腸菌株ＡＴ−０３７のコンピテントセルを作製し、そして、Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９ＡとＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９ＡプラスミドをＣａＣｌ_２形質転換法によってＡＴ−０３７に導入し、モノクロ−ナルを採取して培養し、プラスミドを抽出して陽性クロ−ンの同定を行う。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０７４（ＡＴ−０３７，Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａ）、ＡＴ−０７５（ＡＴ−０３７，ＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９Ａ）。

【0406】

ビトレオシラヘモグロビンを発現させる遺伝子及びその突然変異菌株 ＡＴ−０７４、ＡＴ−０７５に対して、フラスコ発酵試験を行う。組換え菌のフラスコ発酵の収率状況を表２２に示す。結果により、Ｖｈｂを発現させることにより、Ｖｈｂ／ ｐｔｒｃ９９Ａの形質転換であれ、ＶｈｂＭ／ ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換であれ、収率を著しく向上させることができ、且つＶｈｂＭ／ ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換により、収率をより著しく向上させることが示唆される。

【0407】

［組換え菌のフラスコ発酵の収率］

【表22】

【0408】

（実施例１１）
本実施例はｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭカセットが組込まれる大腸菌株、グルコサミン６−リン酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）の遺伝子ＧｌｍＳ及び／又はＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼ（ＮａｇＢ）の遺伝子ＮａｇＢの内在性天然プロモーターを置換及び／又は削除し、そしてビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂ及びその突然変異体が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響について説明する。

【0409】

ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭカセットが組込まれる大腸菌株のＮａｇＢ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換し、ＡＴ−０４４（ＡＴ−０４３−０２、△ＮａｇＢ ｐｒｏｍｏｔｏｒ：：Ｔｒｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が得られ、さらにＧｌｍＳ遺伝子の内在性天然プロモーターを削除してＡＴ−０４５（ＡＴ−０４４、△ＧｌｍＳ ｐｒｏｍｏｔｏｒ）が得られる； ｐｔｒｃ−ＷｅｃＢＭカセットが組込まれる大腸菌株のＧｌｍＳ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換してＡＴ−０４６（ＡＴ−０４３−０２、△ＧｌｍＳ ｐｒｏｍｏｔｏｒ：：Ｔｒｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が得られ、さらにＮａｇＢ遺伝子の内在性天然プロモーターを削除してＡＴ−０４７（ＡＴ−０４６、△ＮａｇＢ ｐｒｏｍｏｔｏｒ）が得られる。

【0410】

組換え大腸菌株ＡＴ−０４５、ＡＴ−０４７のコンピテントセルを作製し、そして、Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９ＡとＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９ＡプラスミドをＣａＣｌ_２形質転換法によってＡＴ−０４５、ＡＴ−０４７に導入し、モノクロ−ナルを採取して培養し、プラスミドを抽出して陽性クロ−ンの同定を行う。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０７６（ＡＴ−０４５，Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａ）、ＡＴ−０７７（ＡＴ−０４５，ＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９Ａ）、ＡＴ−０７８（ＡＴ−０４７，Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａ）、ＡＴ−０７９（ＡＴ−０４７，ＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９Ａ）。

【0411】

ビトレオシラヘモグロビンを発現させる遺伝子及びその突然変異菌株 ＡＴ−０７６、ＡＴ−０７７、ＡＴ−０７８、ＡＴ−０７９に対して、フラスコ発酵試験を行う。組換え菌のフラスコ発酵の収率状況を表２３に示す。結果により、Ｖｈｂを発現させることにより、Ｖｈｂ／ ｐｔｒｃ９９Ａの形質転換であれ、ＶｈｂＭ／ ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換であれ、収率を著しく向上させることができ、且つＶｈｂＭ／ ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換により、収率をより著しく向上させることが示唆される。

【0412】

［組換え菌のフラスコ発酵の収率］

【表23】

【0413】

（実施例１２）
本実施例はｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭカセットが組込まれ、ＮａｎＥ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換する大腸菌株、ＧｌｍＳ遺伝子とＮａｇＢ遺伝子の内在性天然プロモーターを置換及び／又は削除し、ＷｅｃＢ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換し、そしてビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させる遺伝子Ｖｈｂ及びその突然変異体が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン収率に対する影響について説明する。

【0414】

ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭカセットが組込まれ、且つＮａｇＢ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換し及びＧｌｍＳ遺伝子の内在性天然プロモーター同時に削除する大腸菌株において、ＮａｎＥ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換し、ＡＴ−０１５（ＡＴ−０１１、△ＮａｎＥ ｐｒｏｍｏｔｏｒ：：Ｔｒｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が得られ、さらにＷｅｃＢ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換し、ＡＴ−０２７（ＡＴ−０１５、△ＷｅｃＢ ｐｒｏｍｏｔｏｒ：：Ｔｒｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が得られる；ｐｔｒｃ−ＮａｎＫＭカセットが組込まれ、且つＧｌｍＳ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換し及びＮａｇＢ遺伝子の内在性天然プロモーターを同時に削除する大腸菌株において、ＮａｎＥ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換し、ＡＴ−０１７（ＡＴ−０１３、△ＮａｎＥ ｐｒｏｍｏｔｏｒ：：Ｔｒｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が得られ、さらにＷｅｃＢ遺伝子の内在性天然プロモーターをＴｒｃプロモーターに置換し、ＡＴ−０２９（ＡＴ−０１７、△ＷｅｃＢ ｐｒｏｍｏｔｏｒ：：Ｔｒｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が得られる。

【0415】

組換え大腸菌株ＡＴ−０２７、ＡＴ−０２９のコンピテントセルを作製し、そして、Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９ＡとＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９ＡプラスミドをＣａＣｌ_２形質転換法によってＡＴ−０２７、ＡＴ−０２９に導入し、モノクロ−ナルを採取して培養し、プラスミドを抽出して陽性クロ−ンの同定を行う。
得られる菌株の番号：ＡＴ−０８０（ＡＴ−０２７、Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａ）、ＡＴ−０８１（ＡＴ−０２７、ＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９Ａ）、ＡＴ−０８２（ＡＴ−０２９、Ｖｈｂ／ｐｔｒｃ９９Ａ）、ＡＴ−０８３（ＡＴ−０２９、ＶｈｂＭ／ｐｔｒｃ９９Ａ）。

【0416】

ビトレオシラヘモグロビンを発現させる遺伝子及びその突然変異菌株 ＡＴ−０８０、ＡＴ−０８１、ＡＴ−０８２、ＡＴ−０８３に対して、フラスコ発酵試験を行う。組換え菌のフラスコ発酵の収率状況を表２４に示す。結果により、Ｖｈｂを発現させることにより、Ｖｈｂ／ ｐｔｒｃ９９Ａの形質転換であれ、ＶｈｂＭ／ ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換であれ、収率を著しく向上させることができ、且つＶｈｂＭ／ ｐｔｒｃ９９Ａプラスミドの形質転換により、収率をより著しく向上させることが示唆される。

【0417】

［組換え菌のフラスコ発酵の収率］

【表24】

【0418】

（実施例１３）
本実施例は１０Ｌ発酵槽でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造するための発酵試験について説明する
組換えエンジニアリング菌株ＡＴ−０８３を生産菌株とし、１０Ｌ発酵槽でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造するための発酵試験を行う。

【0419】

１，種培養
（１）一次種培養：新鮮培養されるＬＢ平板培地上のモノクロ−ナル菌株を選び、８ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍで８時間培養する。
（２）二次種培養：６ｍｌの一次種培養液を取り、２００ｍｌのＭ９培養液を含む１０００ｍｌフラスコに接種し、３７℃、２２５ｒｐｍで１６時間培養する。ＯＤ₆₀₀値が６．０−１０になるまで、大抵対数増殖期にある。
（３）発酵培地を表２５に従って調製し、そのうち、微量元素溶液を表２６に従って調製し、マルチビタミン溶液を表２７に従って調製する。

【0420】

［発酵培地］

【表25】

注：
i）微量元素溶液を滅菌後別々に加え、ビタミン溶液を濾過後加える；
ii）グルコ−ス：濃度６５％（ｗ／ｖ）、別々に滅菌し、接種前に加える。グルコ−ス添加量： ６．０ｇ／ｌ；
iii）前記ものを混合した後、１０Ｍ ＮＨ_４ＯＨを使ってｐＨを７．０に調整する；
iv）発酵培地はグルコ−スを加える前に基礎培地であり、基礎培地の初期液量（培地の初期体積が発酵槽の総容量に占める割合）：５０％。

【0421】

［微量元素溶液］

【表26】

【0422】

［マルチビタミン溶液］

【表27】

【0423】

２，接種
二次種液を４０ｍｌ／Ｌで発酵槽に接種する。
接種量：２．５５％（体積として），初期ＯＤ₆₀₀は０．３−０．５。

【0424】

３，工程パラメ−タ
１０Ｌ自己制御型発酵槽を使って高密度発酵を行い、付属ソフトウェアを使ってデ−タ収集を行い、コンピュ−タオンライン制御を実現する。制御パラメ−タは次のとおりである：エア流量０．５−１ ｖｖｍ.；溶存酸素≧２０％、それによって回転速度を向上させ換気を調整する；温度３７℃；ｐＨ値７．０、自動流動プラス飽和アンモニア水によって一定に保つ。基礎培地におけるグルコ−スが消費され、即ち溶存酸素が回復するとき糖分を補充する。糖分補充速度は残糖濃度０．４５ｇ／ｌ以下を基準とする。糖分補充液はグルコ−ス濃度６５％（ｗ／ｖ）であり、且つ２．５％グルコン酸ナトリウムまたは６％リボ−スを加える。６０−７２ ｈ後発酵終了する。総液体量は７５−８０％である。

【0425】

４，実例（１０Ｌ発酵槽）
（１）菌株の番号：ＡＴ−０８３。ロット番号：１０１９。
（２）種液濃度：ＯＤ₆₀₀は２．８である。
（３）基材：４Ｌ。
（４）接種量２００ｍｌ。
（５）糖分補充速度：残糖濃度０．４５ｇ／ｌ以下となるように制御する。
（６）糖分補充液：グルコ−ス濃度６５％（ｗ／ｖ）であり、且つ２．５％グルコン酸ナトリウムを加える。
（７）追跡指数： ＯＤ₆₀₀、残糖含量（発酵液中の残存グルコ−ス）を測定する。
（８）産物： Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン。力価：７２時間１５６ｇ／ｌ。

【0426】

（実施例１４）
本実施例はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルコサミン塩酸塩を分離・精製する後処理工程について説明する。

【0427】

１，Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの精製
（１）不活性化：発酵液８０℃、３０ｍｉｎ。
（２）固液分離：４０００−８０００ｒｐｍで遠心分離し、残渣と蛋白質を捨て、発酵液を取る。また、セラミック膜でろ過しても良い。
（３）脱色：製品：水：活性炭=１：（１．５−３）：（０．０１−０．１）、０．５−５ｈ撹拌する。
（４）脱塩：電気透析によって脱塩する。高濃度槽に発酵液を加える時の初期塩濃度：０．０１−０．０５ｍｏｌ／Ｌ。低濃度槽中の発酵液の流速：４０−８０Ｌ／ｈ、高濃度槽中の発酵液の流速：４０−８０Ｌ／ｈ、シングルフィルム接地電圧０．５−１．４Ｖ。また陰・陽イオン交換樹脂により脱塩しても良い。
（５）濃縮：脱塩後の発酵液を真空条件（０．０９５ＭＰａ）下で５０−８０℃まで加熱し、８−１５ｈ濃縮し、過飽和となり、約４−６倍である。
（６）結晶化：濃縮後の発酵液を先ず２５℃の水で２５−３５℃まで温度低下させ、そして０℃の水で１−３ｈ温度低下させ、０−１０℃になる。無水エタノ−ル（用量が製品重量の５−２０倍）を加え、７００−１５００ｒｐｍで１５ｍｉｎ−１ｈ撹拌する。
（７）洗浄：無水エタノ−ル（製品と等量）を加え、１０−１００ｒｐｍで、０．５−２ｈ撹拌する。
（８）乾燥：５０−１００℃、３−１０ｈ。純度：９９．９６％。総収率：９１．５％。

【0428】

２，Ｄ−グルコサミン塩酸塩の精製
（１）不活性化：発酵液８０℃、３０ｍｉｎ。
（２）固液分離：４０００−８０００ｒｐｍで遠心分離し、残渣と蛋白質を捨て、発酵液を取る。また、セラミック膜でろ過しても良い。
（３）脱色：製品：水：活性炭=１：（１．５−３）：（０．０１−０．１）、０．５−５ｈ撹拌する。
（４）脱塩：電気透析によって脱塩する。高濃度槽に発酵液を加える時の初期塩濃度：０．０１−０．０５ｍｏｌ／Ｌ。低濃度槽中の発酵液の流速：４０−８０Ｌ／ｈ、高濃度槽中の発酵液の流速：４０−８０Ｌ／ｈ、シングルフィルム接地電圧０．５−１．４Ｖ。また陰・陽イオン交換樹脂により脱塩しても良い。
（５）濃縮：脱塩後の発酵液を真空条件（０．０９５ＭＰａ）下で５０−８０℃まで加熱し、８−１５ｈ濃縮し、過飽和となり、約４−６倍である。
（６）加水分解：濃縮後の発酵液をエナメルまたはガラス容器に入れ、濃塩酸（３７％）を加えて最終濃度を１２−１６％にし、均一に撹拌し、７０℃で９０ｍｉｎ温度を維持する。塩酸をリサイクルすることができる。
（７）結晶化：まず２５℃の水で温度を２５−３５℃まで下げ、そして０℃の水で１−３ｈ温度低下させ、４℃になる。
（８）洗浄：無水エタノ−ル（製品と等量）を加え、１０−１００ｒｐｍで０．５−２ｈ撹拌する。７００−１５００ｒｐｍで、１５−６０ｍｉｎ遠心分離し、グルコサミン塩酸塩が得られ、転換率は８９．５％である。
（９）溶解：洗浄後の製品を水に溶解し、水の用量は最初の発酵液の体積である。
（１０）脱色：活性炭（用量は１％）を加える。３０分間混合する。７００−１５００ｒｐｍで、１５−６０ｍｉｎ遠心分離する。あるいは濾過し、無色の濾液が得られる。
（１１）再結晶化：５０℃と５５ｃｍＨｇ真空下で濾液を真空蒸発させて過飽和となる。無水エタノ−ル（用量が製品重量の５−２０倍）を加え、７００−１５００ｒｐｍで１５ｍｉｎ−１ｈ撹拌する。
（１２）洗浄：無水エタノ−ル（製品と等量）を加え、１０−１００ｒｐｍで、０．５−２ｈ撹拌する。７００−１５００ｒｐｍで、１５−６０ｍｉｎ遠心分離する。
（１３）乾燥：５０−１００℃、３−１０ｈ。純度：９９．９２％。総収率：８４．６％。

【0429】

上文において一般的な説明および実施の形態と合わせて本発明について詳しく説明するが、本発明についてある本発明に基づいて改変または改良を行うことができ、これらは当業界の技術者にとって明らかである。従って、本発明の精神から逸脱することなくなされたそのような改変又は改良は、本発明の特許請求の範囲内に含まれる。

【0430】

（付記）
（付記１）
微生物発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及び／又はＤ−グルコサミン塩を製造する方法であって、当該方法は次を含む：
Ａ）発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変を含む；及び
Ｂ）培養工程Ａ）から産生されるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを収集する；
好ましくは、さらにＣ）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから脱アセチル化して得られるＤ−グルコサミン塩を含む；
より好ましくは、前記塩は塩酸塩、硫酸塩、ナトリウム塩、リン酸塩及び硫酸水素塩から選ばれる。

【0431】

（付記２）
前記微生物は、少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）をコードする核酸配列の組換え核酸分子によって改変される；
好ましくは、ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）をコードする核酸配列は少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）の活性を向上させる遺伝子改変を含む；より好ましくは、前記遺伝子改変はアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に対応する以下の位置での置換の１種または複数種を含む：４５位のメチオニンからロイシンへの置換、８６位のシステインからグリシンへの置換および９５位のチロシンからセリンへの置換；さらに好ましくは、前記ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）をコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４である；
好ましくは、前記ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１のアミノ酸配列の少なくとも約３０％同じ、好ましくは少なくとも約５０％同じ、より好ましくは少なくとも約７０％同じ、より好ましくは少なくとも約８０％同じ、さらに好ましくは少なくとも約９０％同じ、最も好ましくは少なくとも約９５％同じのアミノ酸配列を有し、そのうち前記ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）は活性を有する；より好ましくは、前記ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１のアミノ酸配列を有する；
より好ましくは、組換え核酸分子中のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）をコードする遺伝子のコピ−数は、１より大きいかまたはそれに等しい；
より好ましくは、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む；好ましくは、内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；より好ましくは、内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記１に記載の方法。

【0432】

（付記３）
前記微生物はさらに次の遺伝子改変中の一種または複数種を含む、付記１または２に記載の方法：
（１）少なくとも１種の、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；
（２）少なくとも１種の、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼの働きを向上させることができる遺伝子改変；
（３）少なくとも１種の、微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの働きを向上させることができる遺伝子改変、好ましくは同時に少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼの働きを低下させることができる遺伝子改変；
（４）少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの働きを向上させることができる遺伝子改変、それと同時に少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの働きを低下させることができる遺伝子改変；
（５）少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。

【0433】

（付記４）
前記微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼの働きを向上させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼの酵素活性の向上、及び／又は、ｂ）微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼの過剰発現から選ばれる；
好ましくは、微生物は少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼの働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変される、付記３に記載の方法。

【0434】

（付記５）
前記微生物は、少なくとも１種のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される、付記４に記載の方法；
好ましくは、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼをコードする核酸配列は少なくとも１種のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼの酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む；より好ましくは、前記遺伝子改変はアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に対応する次の位置での置換：３６位のリジンからアルギニンへの置換、１０３位のリジンからメチオニンへの置換および２２３位のアルギニンからセリンへの置換の１種または複数種を含む；
さらに好ましくは、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼをコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６である；
好ましくは、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７のアミノ酸配列の少なくとも約３０％同じ、好ましくは少なくとも約５０％同じ、より好ましくは少なくとも約７０％同じ、より好ましくは少なくとも約８０％同じ、さらに好ましくは少なくとも約９０％同じ、最も好ましくは少なくとも約９５％同じのアミノ酸配列を有し、そのうち前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼは酵素活性を有する；より好ましくは、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７のアミノ酸配列を有する；
より好ましくは、組換え核酸分子中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼをコードする遺伝子のコピ−数が増加されている；
より好ましくは、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを有する；
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；
より好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである。

【0435】

（付記６）
前記微生物は、少なくとも１種のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む；
好ましくは、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換される；より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；最も好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記４に記載の方法。

【0436】

（付記７）
前記微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼの働きを向上させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼの酵素活性の向上、及び／又は、ｂ）微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼの過剰発現から選ばれる；
好ましくは、前記微生物は、少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼの働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変される、付記３に記載の方法。

【0437】

（付記８）
微生物は少なくとも１種のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される；好ましくは、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼをコードする核酸配列は、少なくとも１種のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼの酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む；
好ましくは、前記遺伝子改変は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に対応する次の位置での置換の１種または２種を含む：１３３のシステインからアルギニンへの置換および１８７位のチロシンからヒスチジンへの置換。より好ましくは、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＮａｎＥ）をコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６である；
好ましくは、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のアミノ酸配列の少なくとも約３０％同じ、好ましくは少なくとも約５０％同じ、より好ましくは少なくとも約７０％同じ、より好ましくは少なくとも約８０％同じ、さらに好ましくは少なくとも約９０％同じ、最も好ましくは少なくとも約９５％同じのアミノ酸配列を有し、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼは酵素活性を有する；より好ましくは、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のアミノ酸配列を有する；
より好ましくは、組換え核酸分子中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子のコピ−数が増加されている；
より好ましくは、前記組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む；
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；
より好ましくは、内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記７に記載の方法。

【0438】

（付記９）
微生物は少なくとも１種のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む；好ましくは、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターはより高い発現レベルを有するプロモーターに置換される；より好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；最も好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記７に記載の方法。

【0439】

（付記１０）
微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの働きを向上させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの酵素活性の向上；及び／又はｂ）微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの過剰発現から選ばれる；
好ましくは、微生物は少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変される、付記３に記載の方法。

【0440】

（付記１１）
微生物は、少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される；
好ましくは、エンコードＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼをコードする核酸配列は少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む；
より好ましくは、組換え核酸分子中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼをコードする遺伝子のコピ−数が増加されている；
より好ましくは、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む；好ましくは、内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；より好ましくは、内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記１０に記載の方法。

【0441】

（付記１２）
前記微生物は、少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む；好ましくは、Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターはより高い発現レベルを有するプロモーターに置換される；
より好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；最も好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記１０に記載の方法。

【0442】

（付記１３）
前記微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの働きを低下させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの酵素活性の低下、及び／又はｂ）微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの発現低下から選ばれる；
好ましくは、前記微生物は、少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種組換え核酸分子によって改変される；
より好ましくは、前記微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの働きを低下させる遺伝子改変は微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化、及び／又は微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化から選ばれる；
さらに好ましくは、微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの働きを低下させる遺伝子改変は微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターを完全に欠失させ、即ち削除する、付記３に記載の方法。

【0443】

（付記１４）
前記微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの働きを向上させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの酵素活性の向上、及び／又はｂ）微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの過剰発現から選ばれる；
好ましくは、微生物は少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変される、付記３に記載の方法。

【0444】

（付記１５）
前記微生物は、少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される；
好ましくは、グルコサミン６−リン酸シンターゼをコードする核酸配列は少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼの酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む；
より好ましくは、組換え核酸分子中のグルコサミン６−リン酸シンターゼをコードする遺伝子のコピ−数が増加されている；
より好ましくは、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む；
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；より好ましくは、内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記１４に記載の方法。

【0445】

（付記１６）
前記微生物は、少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む。好ましくは、グルコサミン６−リン酸シンターゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターはより高い発現レベルを有するプロモーターに置換される；より好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；最も好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記１４に記載の方法。

【0446】

（付記１７）
.微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの働きを低下させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの酵素活性の低下、及び／又はｂ）微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの発現低下から選ばれる；
好ましくは、前記微生物は、少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変される；
より好ましくは、前記微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの働きを低下させる遺伝子改変は，前記微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼをコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化、及び／又は、前記微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化から選ばれる；さらに好ましくは、微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターを完全に欠失させ、即ち削除する、付記３に記載の方法。

【0447】

（付記１８）
前記微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼの働きを向上させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼの酵素活性の向上；及び／又はｂ）微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼの過剰発現から選ばれる；
好ましくは、前記微生物は、少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼの働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変される、付記３に記載の方法。

【0448】

（付記１９）
前記微生物は、少なくとも１種のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される；
好ましくは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼをコードする核酸配列は少なくとも１種のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼの酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む；
好ましくは、前記遺伝子改変は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に対応する次の位置での置換：３４位のシステインからセリンへの置換、１４５位のヒスチジンからアスパラギン酸への置換、２２６位のシステインからフェニルアラニンへの置換および２４５位のバリンからグリシンへの置換の１種または複数種を含む；
さらに好ましくは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）をコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８である；
好ましくは、前記ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０のアミノ酸配列の少なくとも約３０％同じ、好ましくは少なくとも約５０％同じ、より好ましくは少なくとも約７０％同じ、より好ましくは少なくとも約８０％同じ、さらに好ましくは少なくとも約９０％同じ、最も好ましくは少なくとも約９５％同じのアミノ酸配列を有し、そのうち前記ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）は酵素活性を有する；より好ましくは、前記ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０のアミノ酸配列を有する；
より好ましくは、組換え核酸分子中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼをコードする遺伝子のコピ−数が増加されている；
より好ましくは、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む；
好ましくは、内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；より好ましくは、内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記１８に記載の方法。

【0449】

（付記２０）
前記微生物は、少なくとも１種のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む；
好ましくは、前記ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換される；
より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；
最も好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記１８に記載の方法。

【0450】

（付記２１）
前記微生物は、さらに次の遺伝子改変の１種または複数種を含む、付記１−２０のいずれか１つに記載の方法；
（１）少なくとも１種の微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（２）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（３）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を；
（４）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（５）少なくとも１種の微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；
（６）包含少なくとも１種の微生物の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。

【0451】

（付記２２）
前記微生物は、少なくとも１種の微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変される；
好ましくは、前記微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）の働きを低下させる遺伝子改変は、前記微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化、及び／又は微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化から選ばれる；
さらに好ましくは、前記微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）の働きを低下させる遺伝子改変が微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）をコードする内因性遺伝子を完全に欠失させ、即ち削除する、付記２１に記載の方法。

【0452】

（付記２３）
前記微生物は少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変される；
好ましくは、微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化、及び／又は微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化から選ばれる；
さらに好ましくは、微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）をコードする内因性遺伝子を完全に欠失させ、即ち削除する、付記２１に記載の方法。

【0453】

（付記２４）
前記微生物は、少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変される；
好ましくは、前記微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化、及び／又は、エンコード微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化から選ばれる；
さらに好ましくは、前記微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）の働きを低下させる遺伝子改変は微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）をコードする内因性遺伝子を完全に欠失させ、即ち削除する、付記２１に記載の方法。

【0454】

（付記２５）
前記微生物は、少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）の働きを低下させる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変される；
好ましくは、前記微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）の働きを低下させる遺伝子改変は、前記微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化、及び／又は、エンコード微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化から選ばれる；
さらに好ましくは、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）の働きを低下させる遺伝子改変は、前記微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）をコードする内因性遺伝子を完全に欠失させ、即ち削除する、付記２１に記載の方法。

【0455】

（付記２６）
前記微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の働きを向上させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の酵素活性の向上；及び／又はｂ）微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の過剰発現から選ばれる；
好ましくは、前記微生物は、少なくとも１種の微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の働きを向上させる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変される、付記２１に記載の方法。

【0456】

（付記２７）
前記微生物は、少なくとも１種のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される；
好ましくは、前記ホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）をコードする核酸配列は、少なくとも１種のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む；
より好ましくは、前記組換え核酸分子中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）をコードする遺伝子のコピ−数が増加されている；
より好ましくは、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む；
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；
より好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記２６に記載の方法。

【0457】

（付記２８）
前記微生物は、少なくとも１種のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む；
好ましくは、ホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換される；
より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；
最も好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記２６に記載の方法。

【0458】

（付記２９）
前記微生物の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の働きを向上させる遺伝子改変は、ａ）前記微生物の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の酵素活性の向上、及び／又は、ｂ）前記微生物の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の過剰発現から選ばれる；
好ましくは、前記微生物は、少なくとも１種の微生物の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の働きを向上させることができる遺伝子改変を含む、少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変される、付記２１に記載の方法。

【0459】

（付記３０）
前記微生物は、少なくとも１種の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される；
好ましくは、二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）をコードする核酸配列は、少なくとも１種の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む；
より好ましくは、前記組換え核酸分子中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）をコードする遺伝子のコピ−数が増加されている；
より好ましくは、前記組換え核酸分子は、内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む；
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；
より好ましくは、内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記２９に記載の方法。

【0460】

（付記３１）
前記微生物は、少なくとも１種の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む；
好ましくは、前記二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換される；
より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；
最も好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記２９に記載の方法。

【0461】

（付記３２）
組換え核酸分子がプラスミドにロ−ドされまたは組換え核酸分子が微生物のゲノムに組込まれる、付記１−３１のいずれか１つに記載の方法。

【0462】

（付記３３）
前記組換え核酸分子の発現は誘導されることができる；好ましくは、前記組換え核酸分子の発現は乳糖によって誘導される、付記１−３２のいずれか１つに記載の方法。

【0463】

（付記３４）
前記培養工程Ａ）は、約２０℃−約４５℃で行われる；好ましくは、約３３℃−約３７℃で行われる；
好ましくは、前記培養工程Ａ）は、約ｐＨ４．５−約ｐＨ８．５で行われる；好ましくは約ｐＨ６．７−約ｐＨ７．２で行われる；
好ましくは、前記培養工程Ａ）は、材料補充発酵法を採用する；
より好ましくは、糖分補充液は、グルコ−スとリボ−スを含み、好ましくは、グルコ−スの濃度は１０％−８５％（ｗ／ｖ）、リボ−スの濃度は０．５％−１５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは、グルコ−スの濃度は５５％−７５％（ｗ／ｖ）、リボ−スの濃度は５％−７％（ｗ／ｖ）である；
より好ましくは、糖分補充液はグルコ−スとグルコン酸塩を含み、好ましくは、グルコ−スの濃度は１０％−８５％（ｗ／ｖ）、グルコン酸塩の濃度は０．５％−１５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは、グルコ−スの濃度は５５％−７５％（ｗ／ｖ）、グルコン酸塩の濃度は２％−３％（ｗ／ｖ）である；
より好ましくは、糖分補充液はグルコ−ス、リボ−スおよびグルコン酸塩を含み、好ましくは、グルコ−スの濃度は１０％−８５％（ｗ／ｖ）、リボ−スの濃度は０．５％−１５％（ｗ／ｖ）、グルコン酸塩の濃度は０．５％−１５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは、グルコ−スの濃度は５５％−７５％（ｗ／ｖ）、リボ−スの濃度は５％−７％（ｗ／ｖ）、グルコン酸塩の濃度は２％−３％（ｗ／ｖ）である；
さらに好ましくは、グルコン酸塩はグルコン酸ナトリウムである、付記１−３３のいずれか１つに記載の方法。

【0464】

（付記３５）
前記收集ステップＢ）は、（ａ）微生物が除去される発酵液からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを沈殿させる、及び／又は、（ｂ）微生物が除去される発酵液からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを結晶化させることを含む；
好ましくは、前記收集ステップＢ）は、さらに発酵液を脱色するステップを含む；
より好ましくは、前記脱色ステップは、発酵液を沈殿・結晶化させる前に、発酵液を１回または複数回沈殿・結晶化させる後に行われる；
さらに好ましくは、前記脱色ステップは活性炭処理及び／又はクロマトグラフィ−脱色を含む、付記１−３４のいずれか１つに記載の方法。

【0465】

（付記３６）
前記ステップＣ）は、酸性と加熱条件下または酵素触媒下で行われる；
好ましくは、３０％−３７％の塩酸溶液から、６０℃−９０℃で脱アセチル化してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを加水分解してＤ−グルコサミン塩酸塩が得られる；
好ましくは、ＵＤＰ−３−Ｏ−Ｎ−アセチルグルコサミンの脱アセチル化酵素作用下でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを加水分解してＤ−グルコサミンが得られ、さらに塩になる、付記１−３５のいずれか１つに記載の方法。

【0466】

（付記３７）
少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）を発現させることができる遺伝子改変を含む微生物。

【0467】

（付記３８）
少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変されている、付記３７に記載の微生物；
好ましくは、前記ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）をコードする核酸配列は、少なくとも１種のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）の活性を向上させる遺伝子改変を含む；
より好ましくは、前記遺伝子改変は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に対応する以下の位置での置換：４５位のメチオニンからロイシンへの置換、８６位のシステインからグリシンへの置換および９５位のチロシンからセリンへの置換の１種または複数種を含む；
さらに好ましくは、前記ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）をコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４である；
好ましくは、前記ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１のアミノ酸配列の少なくとも約３０％同じ、好ましくは少なくとも約５０％同じ、より好ましくは少なくとも約７０％同じ、より好ましくは少なくとも約８０％同じ、さらに好ましくは少なくとも約９０％同じ、最も好ましくは少なくとも約９５％同じのアミノ酸配列を有し、そのうち前記ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）は活性を有する；
より好ましくは、前記ビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１のアミノ酸配列を有する；
より好ましくは、組換え核酸分子中のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）コードする遺伝子のコピ−数は１より大きいかまたはそれに等しい；
より好ましくは、前記組換え核酸分子は、内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む；
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；
より好ましくは、内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである微生物。

【0468】

（付記３９）
さらに、次の遺伝子改変の１種または複数種を含む、付記３７または３８に記載の微生物；
（１）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ（ＮａｎＫ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；
（２）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼの働きを向上させることができる遺伝子改変；
（３）少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの働きを向上させることができる遺伝子改変をみ、好ましくは同時に少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼの働きを低下させることができる遺伝子改変；
（４）少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの働きを向上させることができる遺伝子改変を含み、それと同時に少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの働きを低下させることができる遺伝子改変；
（５）少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。

【0469】

（付記４０）
前記微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼの働きを向上させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼの酵素活性の向上、及び／又は、ｂ）微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼの過剰発現から選ばれる、；
好ましくは、少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼの働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変されている、付記３９に記載の微生物。

【0470】

（付記４１）
少なくとも１種のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変されている；
好ましくは、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼをコードする核酸配列は、少なくとも１種のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼの酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む；
より好ましくは、前記遺伝子改変は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に対応する次の位置での置換：３６位のリジンからアルギニンへの置換、１０３位のリジンからメチオニンへの置換および２２３位のアルギニンからセリンへの置換の１種または複数種を含む；
さらに好ましくは、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼをコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６である；
好ましくは、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７のアミノ酸配列の少なくとも約３０％同じ、好ましくは少なくとも約５０％同じ、より好ましくは少なくとも約７０％同じ、より好ましくは少なくとも約８０％同じ、さらに好ましくは少なくとも約９０％同じ、最も好ましくは少なくとも約９５％同じのアミノ酸配列を有し、そのうち前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼは酵素活性を有する；
より好ましくは、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７のアミノ酸配列を有する；
より好ましくは、前記組換え核酸分子中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼをコードする遺伝子のコピ−数が増加されている；
より好ましくは、前記組換え核酸分子は、内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを有する；
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；
より好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記４０に記載の微生物。

【0471】

（付記４２）
少なくとも１種のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む；
好ましくは、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンキナーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換されている；
より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；
最も好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記４０に記載の微生物。

【0472】

（付記４３）
前記微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼの働きを向上させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼの酵素活性の向上、及び／又は、ｂ）微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼの過剰発現から選ばれる；
好ましくは、少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼの働きを向上させる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変されている、付記３９に記載の微生物。

【0473】

（付記４４）
少なくとも１種のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変されている；
好ましくは、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼをコードする核酸配列は、少なくとも１種のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼの酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む；
好ましくは、前記遺伝子改変は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に対応する次の位置での置換：１３３位のシステインからアルギニンへの置換および１８７位のチロシンからヒスチジンへの置換の１種または２種を含む；
より好ましくは、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６である；
好ましくは、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のアミノ酸配列の少なくとも約３０％同じ、好ましくは少なくとも約５０％同じ、より好ましくは少なくとも約７０％同じ、より好ましくは少なくとも約８０％同じ、さらに好ましくは少なくとも約９０％同じ、最も好ましくは少なくとも約９５％同じのアミノ酸配列を有し、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼは酵素活性を有する；
より好ましくは、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のアミノ酸配列を有する；
より好ましくは、組換え核酸分子中のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子のコピ−数が増加されている；
より好ましくは、前記組換え核酸分子は、内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む；
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；
より好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記４３に記載の微生物。

【0474】

（付記４５）
少なくとも１種のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む；
好ましくは、前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−６−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換されている；
より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；
最も好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記４３に記載の微生物。

【0475】

（付記４６）
前記微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの働きを向上させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの酵素活性の向上、及び／又は、ｂ）微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの過剰発現から選ばれる；
好ましくは、微生物は少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変されている、付記３９に記載の微生物。

【0476】

（付記４７）
少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変されている；
好ましくは、前記エンコードＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼをコードする核酸配列は、少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む；
より好ましくは、前記組換え核酸分子中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼをコードする遺伝子のコピ−数が増加されている；
より好ましくは、前記組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む；好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；
より好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記４６に記載の微生物。

【0477】

（付記４８）
微生物は少なくとも１種のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む；好ましくは、前記Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換されている；
より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；最も好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記４６に記載の微生物。

【0478】

（付記４９）
前記微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの働きを低下させることが遺伝子改変は、ａ）微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの酵素活性の低下、及び／又は、ｂ）微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの発現低下から選ばれる；
好ましくは、少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種組換え核酸分子によって改変されている；
より好ましくは、前記微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの働きを低下させる遺伝子改変は、前記微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化、及び／又は、微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化から選ばれる；
さらに好ましくは、前記微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターを完全に欠失させ、即ち削除する、付記３９に記載の微生物。

【0479】

（付記５０）
前記微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの働きを向上させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの酵素活性の向上、及び／又は、ｂ）微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの過剰発現から選ばれる；
好ましくは、少なくとも１種の微生物の中のグルコサミン６−リン酸シンターゼの働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変されている、付記３９に記載の微生物。

【0480】

（付記５１）
少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変されている；
好ましくは、グルコサミン６−リン酸シンターゼをコードする核酸配列は少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼの酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む；
より好ましくは、組換え核酸分子中のグルコサミン６−リン酸シンターゼをコードする遺伝子のコピ−数が増加されている；
より好ましくは、前記組換え核酸分子は、内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む；
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；
より好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記５０に記載の微生物。

【0481】

（付記５２）
少なくとも１種のグルコサミン６−リン酸シンターゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む；好ましくは、グルコサミン６−リン酸シンターゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換されている；より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；
最も好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記５０に記載の微生物。

【0482】

（付記５３）
前記微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの働きを低下させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの酵素活性の低下、及び／又は、ｂ）微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの発現低下から選ばれる；
好ましくは、微生物は少なくとも１種の微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの働きを低下させることができる遺伝子改変を含む、少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変されている；
より好ましくは、前記微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの働きを低下させる遺伝子改変は、前記微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼをコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化、及び／又は、微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化から選ばれる；
さらに好ましくは、前記微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼの働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のＤ−グルコサミン６−リン酸デアミナ−ゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターを完全に欠失させ、即ち削除する、付記３９に記載の微生物。

【0483】

（付記５４）
前記微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼの働きを向上させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼの酵素活性の向上、及び／又は、ｂ）微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼの過剰発現から選ばれる；
好ましくは、少なくとも１種の微生物の中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼの働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変されている、付記３９に記載の微生物。

【0484】

（付記５５）
少なくとも１種のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変されている；
好ましくは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼをコードする核酸配列は少なくとも１種のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼの酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む；
好ましくは、前記遺伝子改変はアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に対応する次の位置での置換：３４位のシステインからセリンへの置換、１４５位のヒスチジンからアスパラギン酸への置換、２２６位のシステインからフェニルアラニンへの置換および２４５位のバリンからグリシンへの置換の１種または複数種を含む；
さらに好ましくは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）をコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８である；
好ましくは、前記ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０のアミノ酸配列の少なくとも約３０％同じ、好ましくは少なくとも約５０％同じ、より好ましくは少なくとも約７０％同じ、より好ましくは少なくとも約８０％同じ、さらに好ましくは少なくとも約９０％同じ、最も好ましくは少なくとも約９５％同じのアミノ酸配列を有し、そのうち前記ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）は酵素活性を有する；
より好ましくは、前記ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０のアミノ酸配列を有する；
より好ましくは、組換え核酸分子中のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼをコードする遺伝子のコピ−数が増加されている；
より好ましくは、前記組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む；
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；
より好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記５４に記載の微生物。

【0485】

（付記５６）
少なくとも１種のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む；
好ましくは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換されている；
より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；
最も好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記５４に記載の微生物。

【0486】

（付記５７）
さらに次の遺伝子改変の１種または複数種を含む、付記３７−５６のいずれか１つに記載の微生物：
（１）少なくとも１種の微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（２）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（３）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（４）少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）の働きを低下させることができる遺伝子改変；
（５）少なくとも１種の微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の働きを向上させることができる遺伝子改変；
（６）包含少なくとも１種の微生物の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の働きを向上させることができる遺伝子改変。

【0487】

（付記５８）
少なくとも１種の微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変されている；
好ましくは、微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化、及び／又は、微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化から選ばれる；
さらに好ましくは、前記微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）の働きを低下させる遺伝子改変が微生物の中のマンノーストランスポーターＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^man（ＭａｎＸＹＺ）をコードする内因性遺伝子を完全に欠失させ、即ち削除する、付記５７に記載の微生物。

【0488】

（付記５９）
少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変されている；
好ましくは、前記微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化、及び／又は、前記微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化から選ばれる；
さらに好ましくは、前記微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）の働きを低下させる遺伝子改変は微生物の中のＮ−アセチルノイラミン酸リア−ゼ（ＮａｎＡ）をコードする内因性遺伝子を完全に欠失させ、即ち削除する、付記５７に記載の微生物。

【0489】

（付記６０）
少なくとも１種の微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変されている；
好ましくは、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化、及び／又はエンコード微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化から選ばれる；
さらに好ましくは、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）の働きを低下させる遺伝子改変は微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸デアセチラ−ゼ（ＮａｇＡ）をコードする内因性遺伝子を完全に欠失させ、即ち削除する、付記５７に記載の微生物。

【0490】

（付記６１）
少なくとも１種の前記微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変されている：
好ましくは、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化、及び／又は、エンコード微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化から選ばれる；
さらに好ましくは、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン特異的酵素ＩＩ^Nag（ＮａｇＥ）をコードする内因性遺伝子を完全に欠失させ、即ち削除する、付記５７に記載の微生物。

【0491】

（付記６２）
前記微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の働きを向上させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の酵素活性の向上及び／又は、ｂ）微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の過剰発現から選ばれる；
好ましくは、少なくとも１種の微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変されている、付記５７に記載の微生物。

【0492】

（付記６３）
少なくとも１種ホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変されている；
好ましくは、前記ホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）をコードする核酸配列は、少なくとも１種のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）の酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む；
より好ましくは、前記組換え核酸分子中のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）をコードする遺伝子のコピ−数が増加されている；
より好ましくは、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む；
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；
より好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記６２に記載の微生物。

【0493】

（付記６４）
少なくとも１種のホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む；
好ましくは、前記ホスホグルコサミンムタ−ゼ（ＧｌｍＭ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換されている；
より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；最も好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記６２に記載の微生物。

【0494】

（付記６５）
前記微生物の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の働きを向上させる遺伝子改変は、ａ）微生物の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の酵素活性の向上、及び／又は、ｂ）微生物の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の過剰発現から選ばれる；
好ましくは、少なくとも１種の、前記微生物の中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の働きを向上させることができる遺伝子改変を含む、少なくとも１種の組換え核酸分子によって改変されている、付記５７に記載の微生物。

【0495】

（付記６６）
少なくとも１種の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変されている。
好ましくは、前記二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）をコードする核酸配列は、少なくとも１種の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）の酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む；
より好ましくは、前記組換え核酸分子中の二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）をコードする遺伝子のコピ−数が増加されている。
より好ましくは、前記組換え核酸分子は、内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む；
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；
より好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記６５に記載の微生物。

【0496】

（付記６７）
少なくとも１種の、二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む；
好ましくは、前記二機能性酵素Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸ウリジルトランスファラーゼ（ＧｌｍＵ）をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換されている；
より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、ＨＣＥプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターから選ばれる；
最も好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターはｔｒｃプロモーターである、付記６５に記載の微生物。

【0497】

（付記６８）
組換え核酸分子はプラスミドにロ−ドされている、または、組換え核酸分子は微生物のゲノムに組込まれている、付記３７−６７のいずれか１つに記載の微生物。

【0498】

（付記６９）
前記組換え核酸分子の発現は誘導されることができる；好ましくは、前記組換え核酸分子の発現は乳糖によって誘導される、付記３７−６８のいずれか１つに記載の微生物。

【0499】

（付記７０）
前記微生物は細菌、酵母または真菌である、付記１−３６のいずれか１つに記載の方法、または、付記３７−６９のいずれか１つに記載の微生物；
好ましくは、前記微生物は細菌または酵母から選ばれる；
より好ましくは、前記細菌は、エシェリヒア属(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ)、バシラス属 (Ｂａｃｉｌｌｕｓ)、ラクトバチルス属(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ)、シュ−ドモナス属(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)またはストレプトミセス属(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)の属に属する細菌から選ばれる；
より好ましくは、前記細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ラクトバチルスブレビス(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ)、シュ−ドモナス・アエルギノサ(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ)またはストレプトマイセス・リビダンス(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ)の種に属する細菌から選ばれる；
さらに好ましくは、細菌は大腸菌である；
さらに好ましくは、前記大腸菌は、Ｋ−１２、ＢおよびＷの菌株から選ばれる；
最も好ましくは大腸菌はＫ−１２菌株である；
より好ましくは、酵母はサッカロマイセス属(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属(Ｃａｎｄｉｄａ)、ハンゼヌラ属(Ｈａｎｓｅｎｕｌａ)、ピキア属(Ｐｉｃｈｉａ)、クルベルミセス属(Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ)およびファフィア属（ＰＨａｆｆｉａ）の酵母から選ばれる；
さらに好ましくは、前記酵母は、サッカロマイセスセレビシエ(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)、シゾサッカロミセスポンベ(Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ)、カンジダ・アルビカンス(Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ)、ハンゼヌラポリモルファ(ＨａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐＨａ)、ピキア・パストリス(Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ)、ピキア・カナデンシス（(Ｐｉｃｈｉａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ)、クルイベロマイセス・マルシアヌス(Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ)またはファフィア・ロドチ−マ(ＰＨａｆｆｉａ ｒｏｈｏｄｏｚｙｍａ)から選ばれる；
好ましくは、前記微生物は真菌であり；
より好ましくは、真菌はアスペルギルス属(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)、アブシディア属(Ａｂｓｉｄｉａ)、リゾプス属(Ｒｈｉｚｏｐｕｓ)、クリソスポリウム属(Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ)、ニュ−ロスポラ属(Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ)またはトリコデルマ属(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)の属に属する真菌から選ばれる；
さらに好ましくは、真菌はアスペルギルス・ニガ−(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ)、アスペルギルス・ニドランス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ)、アブシディア・コエルレア(Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｅｒｕｌｅａ)、リゾプス・オリザエ(Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ)、クリソスポリウム・ロックンオウンズ(Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ)、ニュ−ロスポラ・クラッサ(Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ)、ニュ−ロスポラ・インタ−メディア(Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ)またはトリコデルマ・リ−セイ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ) から選ばれる。

【0500】

（付記７１）
前記蛋白質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５で表されるアミノ酸配列を有する、より高い活性を有するビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）。

【0501】

（付記７２）
付記７１に記載のビトレオシラヘモグロビン（Ｖｈｂ）をコードする核酸分子であって、前記核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４で表される核酸配列を有する核酸分子。

【0502】

（付記７３）
付記７２に記載の核酸分子を含むベクタ−。

【0503】

（付記７４）
付記７３に記載のベクタ−を含む微生物。

【0504】

（付記７５）
ゲノムが付記７２に記載の核酸分子を含む微生物。

【図1】

【配列表】

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