特許 6772063 誘導可能なキメラポリペプチドを使用して細胞を活性化するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6772063

(24)【登録日】2020年10月2日

(45)【発行日】2020年10月21日

(54)【発明の名称】誘導可能なキメラポリペプチドを使用して細胞を活性化するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20201012BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20201012BHJP

   C07K 14/715 20060101ALI20201012BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20201012BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20201012BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20201012BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20201012BHJP

   A61K 35/14 20150101ALI20201012BHJP

   A61K 35/16 20150101ALI20201012BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20201012BHJP

   A61K 31/4545 20060101ALI20201012BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20201012BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20201012BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20201012BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20201012BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20201012BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20201012BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20201012BHJP

   A61P 17/14 20060101ALI20201012BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20201012BHJP

   A61P 1/06 20060101ALI20201012BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20201012BHJP

   A61P 33/06 20060101ALI20201012BHJP

   A61P 33/02 20060101ALI20201012BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20201012BHJP

   A61P 31/06 20060101ALI20201012BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/62 ZZNA

   C07K19/00

   C07K14/715

   C07K14/705

   C12N5/10

   A61K35/17 Z

   A61K35/15 Z

   A61K35/14 Z

   A61K35/16 Z

   A61P37/04

   A61K31/4545

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61P25/00

   A61P37/02

   A61P7/00

   A61P19/00

   A61P7/06

   A61P17/14

   A61P31/18

   A61P1/06

   A61P31/12

   A61P33/06

   A61P33/02

   A61P31/04

   A61P31/06

【請求項の数】53

【全頁数】282

(21)【出願番号】特願2016-550700(P2016-550700)

(86)(22)【出願日】2015年2月13日

(65)【公表番号】特表2017-506507(P2017-506507A)

(43)【公表日】2017年3月9日

(86)【国際出願番号】US2015015829

(87)【国際公開番号】WO2015123527

(87)【国際公開日】20150820

【審査請求日】2018年1月15日

(31)【優先権主張番号】61/952,839

(32)【優先日】2014年3月13日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/940,347

(32)【優先日】2014年2月14日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/047,875

(32)【優先日】2014年9月9日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】510274452

【氏名又は名称】ベリカム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】フォスター， アーロン エドワード

(72)【発明者】

【氏名】スペンサー， デイビッド

(72)【発明者】

【氏名】コリンソン−パウツ， マシュー ロバート

(72)【発明者】

【氏名】スローウィン， ケビン

【審査官】 山本 匡子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１２−５０３０１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５２５３０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／０７９０００（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）誘導可能なキメラ刺激分子をコードする第１の核酸配列であって、該誘導可能なキメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、および（ｉｉｉ）多量体化領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）キメラ抗原レセプターをコードする第２の核酸配列
を含む、核酸であって、該誘導可能なキメラ刺激分子が、領域（ｉ）〜（ｉｉｉ）を、ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端に向かって（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）という順序で含むポリペプチドである、核酸。

【請求項2】

前記誘導可能なキメラ刺激分子が、さらに（ｉｖ）膜標的化領域を含む、請求項１に記載の核酸。

【請求項3】

前記キメラ刺激分子がポリペプチドであって、領域（ｉ）〜（ｉｖ）を、該ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって（ｉｖ）、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）という順序で含むポリペプチドである、請求項２に記載の核酸。

【請求項4】

前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項5】

前記ＦＫＢＰ１２領域が、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、請求項４に記載の核酸。

【請求項6】

前記ＦＫＢＰ１２領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、請求項４に記載の核酸。

【請求項7】

前記多量体化領域が、配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメント、あるいは配列番号１０のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントを含む、請求項４に記載の核酸。

【請求項8】

前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメント、あるいは配列番号１２のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、請求項７に記載の核酸。

【請求項9】

残基３６がバリンであるＦｖポリペプチドバリアントをさらに含む、請求項７に記載の核酸。

【請求項10】

前記多量体化領域が、多量体リガンドに結合し、前記多量体リガンドが、ＦＫ５０６二量体または二量体のＦＫ５０６アナログリガンドである、請求項４〜９のいずれか１項に記載の核酸。

【請求項11】

前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３である、請求項１０に記載の核酸。

【請求項12】

前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列の両方に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸。

【請求項13】

前記第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモーターおよび前記第２の核酸配列に作動可能に連結された第２のプロモーターをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸。

【請求項14】

前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列との間にリンカーポリペプチドをコードする第３の核酸配列をさらに含み、ここで、該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後の該第１および第２の核酸配列の翻訳産物を分断している、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸。

【請求項15】

前記リンカーポリペプチドが、２Ａポリペプチドである、請求項１４に記載の核酸。

【請求項16】

前記誘導可能なキメラ刺激分子が、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくは配列番号１３４のアミノ酸配列を有する切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはそれらの機能的フラグメントを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸。

【請求項17】

前記誘導可能なキメラ刺激分子が、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含む、請求項１６に記載の核酸。

【請求項18】

前記ＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域が、配列番号９のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸。

【請求項19】

前記核酸が、ウイルスベクター内に含まれている、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸。

【請求項20】

請求項１〜１９のいずれか１項に記載の核酸でトランスフェクトされたまたは形質導入された、改変された細胞。

【請求項21】

前記改変された細胞が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞、ＴＣＲを発現している細胞またはＮＫ細胞である、請求項２０に記載の改変された細胞。

【請求項22】

前記改変された細胞が、Ｔ細胞である、請求項２１に記載の改変された細胞。

【請求項23】

前記改変された細胞が、ヒト細胞である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の改変された細胞。

【請求項24】

被験体におけるＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激するための組み合わせ物であって、
（ａ）請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の改変された細胞；および
（ｂ）前記多量体化領域に結合する有効量の多量体リガンド
を含む、組み合わせ物。

【請求項25】

前記被験体が、腫瘍を有すると診断されているか、がんを有するか、あるいは血液疾患または骨髄疾患を有する、請求項２４に記載の組み合わせ物。

【請求項26】

細胞において誘導可能なキメラ刺激分子を発現させるためのエキソビボ方法であって、該方法は、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の核酸を、該核酸が細胞に組み込まれる条件下において該細胞と接触させる工程を含み、それにより、該細胞は、該組み込まれた核酸からキメラ抗原レセプターを発現する、方法。

【請求項27】

誘導可能なキメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸でトランスフェクトされたまたは形質導入された、改変されたＴ細胞であって、ここで、該誘導可能なキメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、および（ｉｉｉ）多量体化領域を含み、該誘導可能なキメラ刺激分子が、領域（ｉ）〜（ｉｉｉ）を、ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端に向かって（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）という順序で含むポリペプチドである、改変されたＴ細胞。

【請求項28】

前記誘導可能なキメラ刺激分子が、（ｉｖ）膜標的化領域をさらに含む、請求項２７に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項29】

前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、請求項２７に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項30】

前記ＦＫＢＰ１２領域が、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、請求項２９に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項31】

前記ＦＫＢＰ１２領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、請求項２９に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項32】

前記多量体化領域が、配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメント、あるいは配列番号１０のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチまたはその機能的フラグメントを含む、請求項２９に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項33】

前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメント、あるいは配列番号１２のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、請求項３２に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項34】

残基３６がバリンであるＦｖポリペプチドバリアントをさらに含む、請求項３０に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項35】

前記多量体化領域が、多量体化リガンドに結合し、前記多量体リガンドが、ＦＫ５０６二量体または二量体のＦＫ５０６アナログリガンドである、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項36】

前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３である、請求項３５に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項37】

前記誘導可能なキメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項２７〜３６のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項38】

前記改変された細胞が、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項39】

前記誘導可能なキメラ刺激分子が、配列番号５のアミノ酸配列を有する切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはその機能的フラグメントを含む、請求項２７〜３８のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項40】

前記誘導可能なキメラ刺激分子が、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含む、請求項２７〜３８のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項41】

前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、請求項２７〜４０のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項42】

前記膜標的化領域が、レセプターのミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域および膜貫通配列からなる群より選択される、請求項２８に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項43】

前記膜標的化領域が、ミリストイル化領域である、請求項４２に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項44】

前記ミリストイル化領域が、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、請求項４３に記載の改変されたＴ細胞。

【請求項45】

被験体におけるＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激するための組み合わせ物であって、
（ａ）請求項２７〜４４のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞；および
（ｂ）前記多量体化領域に結合する有効量の多量体リガンド
を含む、組み合わせ物。

【請求項46】

被験体におけるＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激するための組み合わせ物であって、
（ａ）請求項３８に記載の改変されたＴ細胞；および
（ｂ）前記多量体化領域に結合する有効量の多量体リガンド
を含み、前記キメラ抗原受容体が標的細胞に結合する、組み合わせ物。

【請求項47】

前記標的細胞が腫瘍細胞である、請求項４６に記載の組み合わせ物。

【請求項48】

前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の組み合わせ物。

【請求項49】

ａ）誘導可能なキメラ刺激分子をコードする第１の核酸配列であって、ここで、該誘導可能なキメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、および（ｉｉｉ）位置３６におけるアミノ酸置換を含む改変されたＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む多量体化領域を含み、前記改変されたＦＫＢＰ１２ポリペプチドが、ＡＰ１９０３に結合し、前記誘導可能なキメラ刺激分子が、膜標的化領域を含まない、第１のポリヌクレオチドと、
ｂ）キメラ抗原受容体をコードする第２の核酸配列と
を含む、核酸であって、該誘導可能なキメラ刺激分子が、領域（ｉ）〜（ｉｉｉ）を、ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端に向かって（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）という順序で含むポリペプチドである、核酸。

【請求項50】

請求項４９に記載の核酸でトランスフェクトされたまたは形質導入された改変された細胞。

【請求項51】

前記改変された細胞が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞、ＴＣＲ発現細胞、またはＮＫ細胞である、請求項５０に記載の改変された細胞。

【請求項52】

前記改変された細胞がＴ細胞である、請求項５１に記載の改変された細胞。

【請求項53】

前記改変された細胞がヒト細胞である、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の改変された細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

分野
本技術は、概して免疫学の分野に関し、部分的には、ＣＤ４０、ＭｙＤ８８またはＣＤ４０およびＭｙＤ８８ポリペプチドを含む誘導可能なキメラポリペプチドを使用して、例えば、Ｔ細胞およびキメラ抗原レセプターを発現しているＴ細胞を含む細胞を活性化するための方法に関する。本技術は、さらに部分的には、患者において免疫応答を誘導するためおよび腫瘍を処置するための治療方法に関する。

【0002】

関連出願
２０１４年２月１４日に出願され、「Methods for Activating T Cells Using an Inducible Chimeric Polypeptide」という名称の米国仮特許出願第６１／９４０，３４７号；２０１４年３月１３日に出願され、「Methods for Activating T Cells Using an Inducible Chimeric Polypeptide」という名称の米国仮特許出願第６１／９５２，８３９号；および２０１４年９月９日に出願され、「Methods for Activating T Cells Using an Inducible Chimeric Polypeptide」という名称の米国仮特許出願第６２／０４７，８７５号に基づく優先権を主張する。これらはすべて参照され、その全体が本明細書中に参照によって組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

背景
Ｔ細胞の活性化は、病原微生物（例えば、ウイルス、細菌および寄生生物）、外来タンパク質および環境内の有害な化学物質に対する防御免疫において、ならびにがんおよび他の過剰増殖性疾患に対する免疫としても、重要な工程である。Ｔ細胞は、その表面上に、細胞表面上に提示された抗原を認識するレセプター（すなわち、Ｔ細胞レセプター）を発現している。正常な免疫応答では、これらの抗原がＴ細胞レセプターに結合することにより、細胞内の変化が惹起され、Ｔ細胞の活性化に至る。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

要旨
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）によって操作されたＴ細胞の抗腫瘍有効性は、養子移入後のそれらの細胞の生存およびインビボにおける拡大に依存する。共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８および４−１ＢＢ）を含めることによって、白血病を処置するための、ＣＤ１９によって標的化されるＣＡＲのＴ細胞拡大が向上したが^１−４、そのＣＡＲを介してこれらのシグナル伝達ドメインと抗原認識とが密接に結び付くと、抑制されないＴ細胞活性化による強い毒性がもたらされた^５，６。本明細書中には、ＣＡＲ Ｔ細胞治療をコントロールするための方法が提供され、その方法は、１つの実施形態において、Ｔ細胞共刺激スイッチ、すなわち、共刺激分子によって誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ｉＭＣ）に依存し、そのｉＭＣは、小分子である二量体化化学誘導物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）（ＣＩＤ）リミズシド（ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ）（ＡＰ１９０３）によってインビボにおいて活性化可能であり、それにより、ＣＡＲによって改変されたＴ細胞に共刺激が提供され、Ｔ細胞の増殖、生存および抗腫瘍有効性が誘導される。ｉＭＣに基づく誘導可能な共刺激は、インビボにおけるＴ細胞の拡大を制御するために使用されることがあり、ＣＡＲ−Ｔ細胞治療の安全性および有効性をコントロールする新しい治療法の選択肢となる。

【0005】

キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞に抗原特異性を伝えるためにデザインされた人工レセプターである。それらは、一般的に、Ｔ細胞を活性化し、特異免疫をもたらすように選択された、抗原特異的な構成要素、膜貫通の構成要素および細胞内の構成要素を含む。キメラ抗原レセプターを発現しているＴ細胞は、癌治療をはじめとした様々な治療において使用され得る。これらの治療は、腫瘍に対して有効であるが、場合によっては、健康な組織に対する非特異的な攻撃に部分的に起因して、副作用をもたらした。強力な免疫療法反応をもたらし、かつ有毒な副作用を回避する、コントロール可能なＴ細胞治療のための方法が必要とされている。

【0006】

例えば、免疫応答を誘導するためまたは増大させるために使用され得る、誘導可能なキメラシグナル伝達分子（ＣＳＭ）が、部分的に提供される。ＣＳＭは、単独でまたはキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）と組み合わせて使用され得、特定の腫瘍細胞に対して免疫応答を特異的に向けさせる。コントロールされたＴ細胞活性化の方法は、以前のＣＡＲに基づく処置の有毒な副作用の多くを回避する。

【0007】

誘導可能なＭｙＤ８８、誘導可能なＣＤ４０または誘導可能なキメラＭｙＤ８８／ＣＤ４０ポリペプチドを発現する活性化Ｔ細胞も本明細書中に提供される。それらの活性化された細胞は、疾患に対する免疫応答を高めるため、または例えば腫瘍サイズを減少させることによってがんを処置するために、使用され得る。活性化Ｔ細胞および活性化されたＣＡＲ Ｔ細胞を用いた処置の治療経過は、様々なイメージング様式（例えば、ＣＴ、骨スキャン、ＭＲＩ、ＰＥＴスキャン、Ｔｒｏｆｅｘスキャン）、様々な標準的な血液バイオマーカー（例えば、ＰＳＡ、循環腫瘍細胞）、または様々な炎症性低酸素性（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ，ｈｙｐｏｘｉｃ）サイトカインもしくは処置されている患者における他の因子の血清レベルによって、腫瘍のサイズおよび血管分布を決定することによって、モニターされ得る。

【0008】

本明細書中で論じられる誘導可能なキメラシグナル伝達分子は、細胞内で共発現されるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の持続的で調節されたコントロールを可能にする。その誘導可能なキメラシグナル伝達分子は、本明細書中で論じられる誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０ポリペプチドを含む。ある疾患または状態に関係している細胞性抗原を標的化するようにデザインされた抗原特異的Ｔ細胞の活性化は、リガンド誘導物質の投与に依存する。そのリガンド誘導物質は、誘導可能なキメラシグナル伝達分子を多量体化することによってＣＡＲ発現細胞を活性化し、次に、細胞、例えば、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞またはナチュラルキラーＴ細胞を活性化する、ＮＦ−κＢシグナル伝達および他の細胞内シグナル伝達経路を活性化する（例えば、図５７を参照のこと）。リガンド誘導物質の非存在下では、Ｔ細胞は、静止状態であるか、または基底レベルの活性を有する。そのリガンドの投薬は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の増殖および活性化の速度および規模を決定する。

【0009】

完全な活性化および腫瘍細胞殺傷は、依然として、抗原認識、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達を介したＮＦＡＴのさらなる活性化に依存している。完全奏効（ＣＲ）が達成されると、リガンドの投薬を終了する。疾患または状態が再発した場合、リガンドの投薬を再開し、腫瘍を標的にしている静止状態のＴ細胞の再拡大および再活性化がもたらされる。

【0010】

細胞治療の１つの例において、キメラ抗原レセプターをコードする核酸を形質導入されたＴ細胞が、癌を処置するために患者に投与された（Ｚｈｏｎｇ，Ｘ．−Ｓ．，（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １８：４１３−４２０）。例えば、ヒト化モノクローナル抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）に基づくキメラ抗原レセプターを発現しているＴ細胞が、癌患者を処置するために使用された。しかしながら、有害事象が生じる可能性があり、少なくとも１つの報告された症例では、その治療は、患者に対して致命的結果をもたらした（Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ら（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １８：８４３−８５１）。本明細書中に提示されるように、コントロール可能で誘導可能な安全スイッチを細胞に形質導入することにより、リガンド誘導物質の投与を停止することによって有害事象が進行するのを阻止できる安全スイッチが提供され得る。低レベルの基底活性が残るかもしれないが、その誘導物質の存在を除去することにより、有害事象の症状は、無くなるとまではいかなくとも、大幅に減少するはずである。

【0011】

キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、ＭＨＣ抗原提示の必要なくＴ細胞に抗原特異性を伝えるためにデザインされた人工レセプターである。それらは、Ｔ細胞を活性化し、特異免疫をもたらすように選択された、抗原特異的な構成要素、膜貫通の構成要素および細胞内の構成要素を含む。キメラ抗原レセプターを発現しているＴ細胞は、がん治療をはじめとした様々な治療において使用され得る。共刺激ポリペプチドは、標的抗原に対するＣＡＲ発現Ｔ細胞の活性化を高め、ゆえに養子免疫療法の効力を高めるために使用され得る。

【0012】

例えば、ヒト化モノクローナル抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）に基づくキメラ抗原レセプターを発現しているＴ細胞が、がん患者を処置するために使用された。しかしながら、有害事象が生じる可能性があり、少なくとも１つの報告された症例では、その治療は、患者に対して致命的結果をもたらした（Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ら（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １８：８４３−８５１）。本明細書中に提示されるように、誘導可能なキメラ刺激分子を細胞に形質導入することにより、リガンド誘導物質の存在下においてＣＡＲ Ｔ細胞のさらなる活性化が可能となり得；リガンド治療を中止すると、ＣＡＲ Ｔ細胞は、それほど活性でなくなり得る。

【0013】

キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）分子の効力を高めるためにＣＡＲ分子にさらなるシグナル伝達ドメインを組み込んだとき、ＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞による免疫療法の抗腫瘍有効性は、着実に改善した。腫瘍細胞は、完全なＴ細胞活性化にとって必要な必須の共刺激分子を欠くことが多いので、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達分子だけを含む第１世代ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞は、養子移入後にインビボにおいて不良な存続および拡大を示した（Ｔｉｌｌ ＢＧ，Ｊｅｎｓｅｎ ＭＣ，Ｗａｎｇ Ｊら：ＣＤ２０−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ ｂｏｔｈ ＣＤ２８ ａｎｄ ４−１ＢＢ ｄｏｍａｉｎｓ：ｐｉｌｏｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｂｌｏｏｄ １１９：３９４０−５０，２０１２；Ｐｕｌｅ ＭＡ，Ｓａｖｏｌｄｏ Ｂ，Ｍｙｅｒｓ ＧＤら：Ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ ｃｏｅｘｐｒｅｓｓ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｗｉｔｈ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １４：１２６４−７０，２００８；Ｋｅｒｓｈａｗ ＭＨ，Ｗｅｓｔｗｏｏｄ ＪＡ，Ｐａｒｋｅｒ ＬＬら：Ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２：６１０６−１５，２００６）。第２世代ＣＡＲ Ｔ細胞は、それらの細胞の増殖および生存を改善するようにデザインされた。ＣＤ２８または４−１ＢＢ由来の細胞内の共刺激ドメインを組み込んでいる第２世代ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ Ｃ，Ｍｉｌｏｎｅ ＭＣ，Ｈａｓｓａｎ Ｒら：Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｌａｒｇｅ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣＤ２８ ａｎｄ ＣＤ１３７ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６：３３６０−５，２００９；Ｓｏｎｇ ＤＧ，Ｙｅ Ｑ，Ｐｏｕｓｓｉｎ Ｍら：ＣＤ２７ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｂｌｏｏｄ １１９：６９６−７０６，２０１２）は、養子移入後に、改善された生存およびインビボでの拡大を示し、これらの共刺激分子を含む、抗ＣＤ１９ ＣＡＲによって改変されたＴ細胞を用いたより最近の臨床試験では、ＣＤ１９^＋白血病の処置に対して顕著な有効性が示された（Ｋａｌｏｓ Ｍ，Ｌｅｖｉｎｅ ＢＬ，Ｐｏｒｔｅｒ ＤＬら：Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｈａｖｅ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｃａｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ３：９５ｒａ７３，２０１１；Ｐｏｒｔｅｒ ＤＬ，Ｌｅｖｉｎｅ ＢＬ，Ｋａｌｏｓ Ｍら：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６５：７２５−３３，２０１１；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ＲＪ，Ｄａｖｉｌａ ＭＬ，Ｒｉｖｉｅｒｅ Ｉら：ＣＤ１９−ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｒａｐｉｄｌｙ ｉｎｄｕｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５：１７７ｒａ３８，２０１３）。

【0014】

他の研究者らは、「第３世代」ＣＡＲ Ｔ細胞と呼ばれる、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリータンパク質（例えば、ＯＸ４０および４−１ＢＢ）由来のさらなるシグナル伝達分子を探索した（Ｆｉｎｎｅｙ ＨＭ，Ａｋｂａｒ ＡＮ，Ｌａｗｓｏｎ ＡＤ：Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＣＤ２８，ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ，ＣＤ１３４，ａｎｄ ＣＤ１３７ ｉｎ ｓｅｒｉｅｓ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎａｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＴＣＲ ｚｅｔａ ｃｈａｉｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：１０４−１３，２００４；Ｇｕｅｄａｎ Ｓ，Ｃｈｅｎ Ｘ，Ｍａｄａｒ Ａら：ＩＣＯＳ−ｂａｓｅｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｐｒｏｇｒａｍ ｂｉｐｏｌａｒ ＴＨ１７／ＴＨ１ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ，２０１４）が、活性化Ｔ細胞のＣＤ３ζ核因子（ＮＦＡＴ）経路と異なるＴ細胞シグナル伝達を誘導する他の分子が、Ｔ細胞の生存および増殖に必要な共刺激を提供する可能性があり、おそらく、従来の共刺激分子によって供給されない、価値のあるさらなる機能をＣＡＲ Ｔ細胞に与える。いくつかの第２および第３世代ＣＡＲ Ｔ細胞は、高度に活性化されたＴ細胞によって引き起こされるサイトカインストームおよび腫瘍崩壊症候群に起因する患者の死に関係していた。

【0015】

「キメラ抗原レセプター」または「ＣＡＲ」は、例えば、Ｔ細胞を活性化し、特異免疫をもたらすように選択された、膜貫通ポリペプチドおよび細胞内ドメインポリペプチドに連結された、標的抗原を認識するポリペプチド配列（抗原認識ドメイン）を含むキメラポリペプチドのことを意味する。その抗原認識ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）であり得るか、または例えば、他の分子（例えば、Ｔ細胞レセプターまたはパターン認識レセプター）に由来し得る。細胞内ドメインは、Ｔ細胞の活性化を引き起こす少なくとも１つのポリペプチド（例えば、ＣＤ３ゼータであるがこれに限定されず、例えば、共刺激分子、例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４−１ＢＢであるがこれらに限定されない）を含む。用語「キメラ抗原レセプター」とは、抗体に由来するのではなくキメラＴ細胞レセプターに由来するキメラレセプターのことも指すことがある。これらのキメラＴ細胞レセプターは、標的抗原を認識するポリペプチド配列を含み得、ここで、その認識配列は、例えば、Ｔ細胞レセプターまたはｓｃＦｖに由来する認識配列であり得るがこれらに限定されない。細胞内ドメインポリペプチドは、Ｔ細胞を活性化するように作用するポリペプチドである。キメラＴ細胞レセプターは、例えば、Ｇｒｏｓｓ，Ｇ．，ａｎｄ Ｅｓｈａｒ，Ｚ．，ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：３３７０−３３７８（１９９２）およびＺｈａｎｇ，Ｙ．ら、ＰＬＯＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ６：１−１３（２０１０）において論じられている。

【0016】

１つのタイプのキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）では、腫瘍特異的モノクローナル抗体に対する可変重（ＶＨ）鎖および可変軽（ＶＬ）鎖が、Ｔ細胞レセプター複合体由来のＣＤ３ゼータ鎖（ζ）とインフレームで融合される。そのＶＨおよびＶＬは、通常、グリシン−セリン可動性リンカーを使用して互いに接続され、次いで、スペーサー（ＣＨ２ＣＨ３）によって膜貫通ドメインに付着されることにより、腫瘍抗原と相互作用できるようにｓｃＦｖが細胞表面から離れて伸長する。形質導入の後、Ｔ細胞は、この時点で、その表面上にＣＡＲを発現し、腫瘍抗原と接触し、ライゲーションすると、ＣＤ３ゼータ鎖を介してシグナル伝達し、細胞傷害および細胞活性化を誘導する。

【0017】

研究者らは、ＣＤ３ゼータを介したＴ細胞の活性化が、腫瘍特異的殺滅を誘導するのに十分であるが、Ｔ細胞の増殖および生存を誘導するには不十分であることを述べている。ゼータ鎖のみを発現している第１世代ＣＡＲによって改変されたＴ細胞を使用した初期の臨床試験は、遺伝子が改変されたＴ細胞が、インビボにおいて不良な生存および増殖を示すことを示した。

【0018】

Ｂ７軸を介した共刺激が、完全なＴ細胞活性化にとって必要であるので、研究者らは、共刺激ポリペプチドＣＤ２８シグナル伝達ドメインをＣＡＲ構築物に加えた。この領域は、通常、膜貫通領域（ＣＤ３ゼータバージョンの代わりに）、ならびにＰＩ３ＫおよびＬｃｋに結合するためのＹＭＮＭモチーフを含む。ゼータだけを有するＣＡＲまたはゼータとＣＤ２８の両方を有するＣＡＲを発現しているＴ細胞の間のインビボでの比較から、活性化後のＩＬ−２産生の増加に部分的に起因して、ＣＤ２８がインビボにおいて拡大を促進することが実証された。ＣＤ２８を含んでいるものは、第２世代ＣＡＲと呼ばれる。最もよく使用される共刺激分子としては、ＣＤ２８および４−１ＢＢが挙げられ、これらは、腫瘍認識後に、ＮＦ−κＢの活性化をもたらすシグナル伝達カスケードを惹起し得、Ｔ細胞の増殖と細胞生存の両方を促進する。

【0019】

ＣＡＲのデザインにおいて共刺激ポリペプチド４−１ＢＢまたはＯＸ４０を使用することにより、Ｔ細胞の生存および有効性がさらに改善された。４−１ＢＢは、特に、Ｔ細胞の増殖および生存を大幅に増強するとみられる。この第３世代のデザイン（３つのシグナル伝達ドメインを有する）は、ＰＳＭＡ ＣＡＲ（Ｚｈｏｎｇ ＸＳら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｆｅｂ；１８（２）：４１３−２０）およびＣＤ１９ ＣＡＲにおいて、最も著しくはＣＬＬの処置のために、使用されている（Ｍｉｌｏｎｅ，Ｍ．Ｃ．ら（２００９）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１４５３−１４６４；Ｋａｌｏｓ，Ｍ．ら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．（２０１１）３：９５ｒａ７３；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．ら（２０１１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：７２５−５３３）。これらの細胞は、インビボにおいて１０００倍超拡大して、３人の患者において目覚ましい機能を示し、３人の患者すべてにおいて持続的な緩解をもたらした。

【0020】

「由来する」とは、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、その分子の配列から得られることがあることを意味すると理解される。上記細胞内ドメインは、Ｔ細胞の活性化を引き起こす少なくとも１つのポリペプチド（例えば、ＣＤ３ゼータであるがこれに限定されず、例えば、共刺激分子、例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４−１ＢＢであるがこれらに限定されない）を含む。

【0021】

したがって、本技術は、いくつかの実施形態において、ａ）誘導可能なキメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドであって、その誘導可能なキメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、および（ｉｉｉ）多量体化領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびにｂ）キメラ抗原レセプターをコードする第２のポリヌクレオチドを含む核酸を提供する。いくつかの実施形態において、その誘導可能なキメラ刺激分子は、（ｉｖ）膜標的化領域をさらに含む。ある特定の実施形態において、その膜標的化領域は、ミリストイル化領域である。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、リガンド結合領域である。いくつかの実施形態において、リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ領域である。いくつかの実施形態において、上記核酸は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含み、ここで、そのリンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後の第１および第２のポリヌクレオチドの翻訳産物を分断している。いくつかの実施形態において、キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域；（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子；および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞活性化分子は、ＣＤ３ζポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原認識部分は、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する。ある特定の実施形態において、抗原認識部分は、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６およびＨｅｒ２／Ｎｅｕからなる群より選択される抗原に結合する。

【0022】

本願の核酸でトランスフェクトされたまたは形質転換された、改変された細胞も提供される。いくつかの実施形態において、改変された細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞、ＴＣＲを発現している細胞、またはＮＫ細胞である。被験体におけるＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激するための方法も提供され、その方法は、本願の改変された細胞、および有効量の、多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与することにより、その被験体においてＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激する工程を含む。いくつかの実施形態において、キメラ抗原レセプターは、標的細胞に結合する。いくつかの実施形態において、被験体における標的細胞の数または濃度は、改変された細胞の投与後に減少する。

【0023】

標的抗原の高発現に関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法も提供され、その方法は、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与する工程を含み、ここで、ａ）その多量体リガンドは、多量体リガンド領域、ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む誘導可能なキメラ刺激分子に結合し；ｂ）被験体内を循環しているＴ細胞は、（ｉ）誘導可能なキメラ刺激分子；および（ｉｉ）標的抗原に結合するキメラ抗原レセプターを発現し；ｃ）標的抗原は、被験体内を循環している標的細胞上に存在し；ｄ）被験体における標的細胞の数または濃度は、多量体リガンドを投与した後に減少する。いくつかの実施形態において、誘導可能なキメラ刺激分子は、膜標的化領域をさらに含む。

【0024】

いくつかの実施形態において、誘導可能なキメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸でトランスフェクトされたまたは形質導入された、改変されたＴ細胞も提供され、ここで、その誘導可能なキメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、および（ｉｉｉ）多量体化領域を含む。いくつかの実施形態において、誘導可能なキメラ刺激分子は、（ｉｖ）膜標的化領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、膜標的化領域は、レセプターのミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域および膜貫通配列からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、改変されたＴ細胞は、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。

【0025】

いくつかの実施形態において、被験体におけるＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激するための方法も提供され、その方法は、ａ）本願の改変されたＴ細胞をその被験体に投与する工程；およびｂ）有効量の、多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与することにより、その被験体においてＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激する工程を含む。いくつかの実施形態において、キメラ抗原レセプターは、標的細胞に結合する。いくつかの実施形態において、被験体における標的細胞の数または濃度は、リガンドの投与後に減少する。

【0026】

誘導可能なキメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸も提供され、ここで、その誘導可能なキメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、および（ｉｉｉ）多量体化領域を含む。いくつかの実施形態において、本願の核酸でトランスフェクトされたまたは形質転換された、改変された細胞が提供される。他の実施形態において、改変された細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞、ＴＣＲを発現している細胞、またはＮＫ細胞である。

【0027】

いくつかの実施形態において、改変された細胞は、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、被験体におけるＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激するための方法が提供され、その方法は、本願の改変された細胞をその被験体に投与する工程；および有効量の、多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与することにより、その被験体においてＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激する工程を含む。

【0028】

本技術は、Ｔ細胞を活性化するための方法も提供し、その方法は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸でＴ細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入する工程を含み、ここで、そのキメラタンパク質は、膜標的化領域、多量体化領域およびＭｙＤ８８ポリペプチドを含み、それによって、そのＴ細胞は活性化される。本技術は、Ｔ細胞を活性化するための方法も提供し、その方法は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸でＴ細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入する工程を含み、ここで、そのキメラタンパク質は、膜標的化領域、多量体化領域、ＭｙＤ８８ポリペプチドおよびＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域を含み、そのＣＤ４０ポリペプチドは、機能的な細胞外ドメインを有さず；それによって、そのＴ細胞は活性化される。Ｔ細胞を活性化するための方法が本技術において注目され、その方法は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸でＴ細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入する工程を含み、ここで、そのキメラタンパク質は、膜標的化領域、多量体化領域およびＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域を含み、そのＣＤ４０ポリペプチドは、機能的な細胞外ドメインを有さず；それによって、そのＴ細胞は活性化される。

【0029】

いくつかの実施形態において、被験体において腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導するための方法、被験体における表面腫瘍抗原を有する腫瘍サイズを減少させるための方法、または被験体における前立腺がんを処置するための方法が提供され、それらの方法は、本技術の方法に従ってＴ細胞を活性化する工程およびその活性化されたＴ細胞を被験体に投与する工程を含む。

【0030】

いくつかの実施形態において、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むＴ細胞を含む組成物が提供され、ここで、そのキメラタンパク質は、膜標的化領域、多量体化領域およびＭｙＤ８８ポリペプチドを含む。キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むＴ細胞もまたいくつかの実施形態において注目され、ここで、そのキメラタンパク質は、膜標的化領域、多量体化領域、ＭｙＤ８８ポリペプチドおよびＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域を含み、そのＣＤ４０ポリペプチドは、機能的な細胞外ドメインを有しない。キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むＴ細胞を含む組成物もまたいくつかの実施形態において提供され、ここで、そのキメラタンパク質は、膜標的化領域、多量体化領域およびＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域を含み、そのＣＤ４０ポリペプチドは、機能的な細胞外ドメインを有しない。

【0031】

いくつかの実施形態において、本技術の細胞組成物を用いて、免疫応答を誘導するための方法または腫瘍サイズを減少させるための方法が提供される。

【0032】

実施形態において、被験体におけるＴ細胞を活性化するための方法が提供され、その方法は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸をその被験体に投与する工程を含み、ここで、そのキメラタンパク質は、膜標的化領域、多量体化領域およびＭｙＤ８８ポリペプチドを含み、それによって、そのＴ細胞は活性化される。被験体におけるＴ細胞を活性化するための方法が、いくつかの実施形態において注目され、その方法は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸をその被験体に投与する工程を含み、ここで、そのキメラタンパク質は、膜標的化領域、多量体化領域、ＭｙＤ８８ポリペプチドおよびＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域を含み、そのＣＤ４０ポリペプチドは、機能的な細胞外ドメインを有さず；それによって、そのＴ細胞は活性化される。被験体におけるＴ細胞を活性化するための方法もまた提供され、その方法は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸をその被験体に投与する工程を含み、ここで、そのキメラタンパク質は、膜標的化領域、多量体化領域およびＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域を含み、そのＣＤ４０ポリペプチドは、機能的な細胞外ドメインを有さず；それによって、そのＴ細胞は活性化される。

【0033】

なおも他の実施形態において、樹状細胞またはＢ細胞ではない細胞、例えば、非リンパ球性造血細胞または非造血細胞、例えば、マクロファージ、メラノーマ細胞、線維芽細胞およびケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｄ）を用いる、Ｔ細胞に関して本明細書中で論じられるような方法および組成物が提供される。

【0034】

いくつかの実施形態において、膜標的化領域は、レセプターのミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域および膜貫通配列からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、膜標的化領域は、ミリストイル化領域である。いくつかの実施形態において、多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、可動性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをタンデムで含む一本鎖抗体およびそれらの変異された配列からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域である。いくつかの実施形態において、多量体リガンドは、ＦＫ５０６二量体または二量体のＦＫ５０６アナログリガンドである。いくつかの実施形態において、そのリガンドは、ＡＰ１９０３である。いくつかの実施形態において、上記細胞は、静脈内、皮内、皮下、腫瘍内、前立腺内（ｉｎｔｒａｐｒｏｔａｔｉｃ）または腹腔内投与によって被験体に投与される。いくつかの実施形態において、前立腺がんは、転移性、転移性去勢抵抗性、転移性去勢感受性、局所進行性および限局性前立腺がんからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記細胞およびリガンドが、少なくとも２回、被験体に投与される。いくつかの実施形態において、その細胞は、樹状細胞である。いくつかの実施形態において、ＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域は、配列番号８におけるポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクターでトランスフェクトされる。いくつかの実施形態において、上記細胞は、Ａｄ５ｆ３５ベクターでトランスフェクトされる。いくつかの実施形態において、ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である。

【0035】

いくつかの実施形態において、前立腺がんの進行が、少なくとも６ヶ月間、予防されるかまたは遅延される。いくつかの実施形態において、前立腺がんの進行が、少なくとも１２ヶ月間、予防されるかまたは遅延される。いくつかの実施形態において、上記前立腺がんは、７、８、９、１０またはそれを超えるグリーソンスコアを有する。いくつかの実施形態において、被験体は、多量体リガンドの投与の３ヶ月後までには部分奏功または完全奏効を有する。いくつかの実施形態において、被験体は、多量体リガンドの投与の６ヶ月後までには部分奏功または完全奏効を有する。いくつかの実施形態において、被験体は、多量体リガンドの投与の９ヶ月後までには部分奏功または完全奏効を有する。いくつかの実施形態において、被験体内の血清ＰＳＡのレベルは、多量体リガンドの投与の６週間後までには２０％、３０％、４０％．５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％低下する。いくつかの実施形態において、被験体内の血清ＰＳＡのレベルは、多量体リガンドの投与の３ヶ月後までには３０％、４０％．５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％低下する。いくつかの実施形態において、被験体内の血清ＰＳＡのレベルは、多量体リガンドの投与の６ヶ月後までには３０％、４０％．５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％低下する。いくつかの実施形態において、被験体内の血清ＰＳＡのレベルは、多量体リガンドの投与の９ヶ月後までには３０％、４０％．５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％低下する。いくつかの実施形態において、前立腺がんの腫瘍サイズは、多量体リガンドの投与の３ヶ月後までには３０％、４０％．５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％減少する。いくつかの実施形態において、前立腺がんの腫瘍サイズは、多量体リガンドの投与の６ヶ月後までには３０％、４０％．５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％減少する。いくつかの実施形態において、前立腺がんの腫瘍サイズは、多量体リガンドの投与の９ヶ月後までには３０％、４０％．５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％減少する。いくつかの実施形態において、前立腺がんの腫瘍の血管新生は、多量体リガンドの投与の３ヶ月後までには２０％、３０％、４０％．５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％減少する。いくつかの実施形態において、前立腺がんの腫瘍の血管新生は、多量体リガンドの投与の６ヶ月後までには２０％、３０％、４０％．５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％減少する。いくつかの実施形態において、前立腺がんの腫瘍の血管新生は、多量体リガンドの投与の９ヶ月後までには２０％、３０％、４０％．５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％減少する。いくつかの実施形態において、Ｔ_Ｈ１またはＴ_Ｈ２抗原特異的免疫応答が、多量体リガンドの投与後の被験体において検出される。

【0036】

いくつかの実施形態において、上記方法は、化学療法剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記組成物、リガンドおよび化学療法剤は、被験体における前立腺がんを処置するのに有効な量で投与される。いくつかの実施形態において、上記組成物またはヌクレオチド配列、リガンドおよび化学療法剤は、被験体における前立腺がんを処置するのに有効な量で投与される。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、カルボプラチン、リン酸エストラムスチン（Ｅｍｃｙｔ）およびサリドマイドからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、タキサンである。そのタキサンは、例えば、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、パクリタキセルおよびカバジタキセル（ｃａｂａｚｉｔａｘｅｌ）からなる群より選択され得る。いくつかの実施形態において、タキサンは、ドセタキセルである。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、上記細胞、核酸もしくはリガンドの投与と同時にまたはその投与後１週間以内に投与される。他の実施形態において、化学療法剤は、リガンドの投与後に投与される。他の実施形態において、化学療法剤は、リガンドの投与の１〜４週間後または１週間〜１ヶ月後、１週間〜２ヶ月後または１週間〜３ヶ月後に投与される。他の実施形態において、上記方法は、上記細胞または核酸の投与の１〜４週間前または１週間〜１ヶ月前、１週間〜２ヶ月前または１週間〜３ヶ月前に化学療法剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、上記細胞または核酸の投与の少なくとも２週間前に投与される。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、上記細胞または核酸の投与の少なくとも１ヶ月前に投与される。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、多量体リガンドの投与後に投与される。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、多量体リガンドの投与の少なくとも２週間後に投与される。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、多量体リガンドの投与の少なくとも１ヶ月後に投与される。

【0037】

いくつかの実施形態において、上記方法は、２つまたはそれを超える化学療法剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、それらの化学療法剤は、カルボプラチン、リン酸エストラムスチンおよびサリドマイドからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの化学療法剤は、タキサンである。タキサンは、例えば、ドセタキセル、パクリタキセルおよびカバジタキセルからなる群より選択され得る。いくつかの実施形態において、タキサンは、ドセタキセルである。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、上記細胞、核酸もしくはリガンドの投与と同時またはその投与後１週間以内に投与される。他の実施形態において、化学療法剤は、リガンドの投与後に投与される。他の実施形態において、化学療法剤は、リガンドの投与の１〜４週間後または１週間〜１ヶ月後、１週間〜２ヶ月後または１週間〜３ヶ月後に投与される。他の実施形態において、上記方法は、上記細胞または核酸の投与の１〜４週間前または１週間〜１ヶ月前、１週間〜２ヶ月前または１週間〜３ヶ月前に化学療法剤を投与する工程をさらに含む。

【0038】

いくつかの実施形態において、被験体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、被験体は、ヒトである。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ａ）誘導可能なキメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドであって、該誘導可能なキメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、および（ｉｉｉ）多量体化領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）キメラ抗原レセプターをコードする第２のポリヌクレオチド
を含む、核酸。
（項目２）
前記誘導可能なキメラ刺激分子が、さらに（ｉｖ）膜標的化領域を含む、項目１に記載の核酸。
（項目３）
前記キメラ刺激分子がポリペプチドであって、領域（ｉ）〜（ｉｉｉ）を、該ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）という順序で含むポリペプチドである、項目１に記載の核酸。
（項目４）
前記キメラ刺激分子がポリペプチドであって、領域（ｉ）〜（ｉｖ）を、該ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって（ｉｖ）、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）という順序で含むポリペプチドである、項目２に記載の核酸。
（項目５）
前記多量体化領域が、リガンド結合領域である、項目１〜４のいずれか１項に記載の核酸。
（項目６）
前記リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、項目５に記載の核酸。
（項目７）
前記ＦＫＢＰ１２領域が、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、項目６に記載の核酸。
（項目８）
前記ＦＫＢＰ１２領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、項目６に記載の核酸。
（項目９）
前記多量体化領域が、配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントおよび配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントを含むか、または配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、項目５に記載の核酸。
（項目１０）
前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含むか、または配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、項目９に記載の核酸。
（項目１１）
残基３６がバリンであるＦｖポリペプチドバリアントをさらに含む、項目９に記載の核酸。
（項目１２）
前記リガンドが、ＦＫ５０６二量体または二量体のＦＫ５０６アナログリガンドである、項目５〜１１のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１３）
前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、項目１２に記載の核酸。
（項目１４）
領域（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくとも１つが、コドン最適化されたヌクレオチド配列によってコードされる、項目１〜１３のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１５）
前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドの両方に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、項目１〜１４のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１６）
前記第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターおよび前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターをさらに含む、項目１〜１４のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１７）
前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含み、ここで、該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後の該第１および第２のポリヌクレオチドの翻訳産物を分断している、項目１〜１６のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１８）
前記リンカーポリペプチドが、２Ａポリペプチドである、項目１７に記載の核酸。
（項目１９）
前記キメラ抗原レセプターが、
（ｉ）膜貫通領域；（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子；および（ｉｉｉ）抗原認識部分
を含む、項目１〜１８のいずれか１項に記載の核酸。
（項目２０）
前記キメラ抗原レセプターが、共刺激分子をさらに含む、項目１９に記載の核酸。
（項目２１）
前記共刺激分子が、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４−１ＢＢからなる群より選択される、項目２０に記載の核酸。
（項目２２）
前記Ｔ細胞活性化分子が、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子である、項目１９〜２１のいずれか１項に記載の核酸。
（項目２３）
前記Ｔ細胞活性化分子が、ＣＤ３ζポリペプチドである、項目１９〜２２のいずれか１項に記載の核酸。
（項目２４）
前記Ｔ細胞活性化分子が、Ｆｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドである、項目１９〜２２のいずれか１項に記載の核酸。
（項目２５）
前記抗原認識部分が、腫瘍細胞上の抗原に結合する、項目１９〜２４のいずれか１項に記載の核酸。
（項目２６）
前記抗原認識部分が、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、項目１９〜２４のいずれか１項に記載の核酸。
（項目２７）
前記抗原認識部分が、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６およびＨｅｒ２／Ｎｅｕからなる群より選択される抗原に結合する、項目１９〜２４のいずれか１項に記載の核酸。
（項目２８）
前記抗原認識部分が、ＰＳＣＡに結合する、項目１９〜２４のいずれか１項に記載の核酸。
（項目２９）
前記抗原認識部分が、ＣＤ１９に結合する、項目１９〜２４のいずれか１項に記載の核酸。
（項目３０）
前記抗原認識部分が、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結合する、項目１９〜２４のいずれか１項に記載の核酸。
（項目３１）
前記抗原認識部分が、ウイルス抗原または細菌抗原に結合する、項目１９〜２４のいずれか１項に記載の核酸。
（項目３２）
前記抗原認識部分が、一本鎖可変フラグメントである、項目１９〜３１のいずれか１項に記載の核酸。
（項目３３）
前記膜貫通領域が、ＣＤ２８膜貫通領域である、項目１９〜３２のいずれか１項に記載の核酸。
（項目３４）
前記膜貫通領域が、ＣＤ８膜貫通領域である、項目１９〜３２のいずれか１項に記載の核酸。
（項目３５）
ＣＤ８ストーク領域をさらに含む、項目３４に記載の核酸。
（項目３６）
前記キメラ刺激分子が、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＭｙＤ８８ポリペプチドもしくは配列番号１３７のアミノ酸配列を有する切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはそれらの機能的フラグメントを含む、項目１〜３５のいずれか１項に記載の核酸。
（項目３７）
前記ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号４９のアミノ酸配列を有する、項目１〜３６のいずれか１項に記載の核酸。
（項目３８）
前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目１〜３７のいずれか１項に記載の核酸。
（項目４０）
前記ＣＤ３ζポリペプチドが、配列番号３９のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを含む、項目２３〜３８のいずれか１項に記載の核酸。
（項目４１）
前記膜標的化領域が、レセプターのミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域および膜貫通配列からなる群より選択される、項目２〜４０のいずれか１項に記載の核酸。
（項目４２）
前記膜標的化領域が、ミリストイル化領域である、項目２〜４０のいずれか１項に記載の核酸。
（項目４３）
前記ミリストイル化領域が、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目４２に記載の核酸。
（項目４４）
前記核酸が、ウイルスベクター内に含まれている、項目１〜４３のいずれか１項に記載の核酸。
（項目４５）
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、項目４４に記載の核酸。
（項目４６）
前記レトロウイルスベクターが、マウス白血病ウイルスベクターである、項目４４に記載の核酸。
（項目４７）
前記レトロウイルスベクターが、ＳＦＧベクターである、項目４４に記載の核酸。
（項目４８）
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、項目４４に記載の核酸。
（項目４９）
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、項目４４に記載の核酸。
（項目５０）
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスからなる群より選択される、項目４４に記載の核酸。
（項目５１）
前記核酸が、プラスミド内に含まれている、項目１〜４３のいずれか１項に記載の核酸。
（項目５２）
項目２〜１９のいずれか１項に記載の核酸によってコードされるキメラ刺激分子ポリペプチド。
（項目５３）
項目１〜５１のいずれか１項に記載の核酸でトランスフェクトされたまたは形質導入された、改変された細胞。
（項目５４）
前記改変された細胞が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞、ＴＣＲを発現している細胞またはＮＫ細胞である、項目５３に記載の改変された細胞。
（項目５５）
前記細胞が、Ｔ細胞である、項目５３に記載の改変された細胞。
（項目５６）
前記細胞が、骨髄から得られるかまたは調製される、項目５３〜５５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目５７）
前記細胞が、臍帯血から得られるかまたは調製される、項目５３〜５５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目５８）
前記細胞が、末梢血から得られるかまたは調製される、項目５３〜５５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目５９）
前記細胞が、末梢血単核球から得られるかまたは調製される、項目５３〜５５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目６０）
前記細胞が、ヒト細胞である、項目５３〜５５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目６１）
前記細胞が、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子を用いた遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子またはポリプレックスからなる群より選択される方法を用いて、前記核酸ベクターによってトランスフェクトされるかまたは形質導入される、項目５３〜６０のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目６２）
被験体におけるＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激するための方法であって、
ａ）項目５３〜６１のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に投与する工程；および
ｂ）有効量の、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与することにより、該被験体においてＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激する工程
を含む、方法。
（項目６３）
前記キメラ抗原レセプターが、標的細胞に結合する、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記標的細胞が、腫瘍細胞である、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記被験体における標的細胞の数または濃度が、前記改変された細胞の投与後に減少する、項目６３〜６４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６６）
前記改変された細胞またはリガンドを投与する前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、該改変された細胞およびリガンドを投与した後に該被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および該第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比べて該第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増加または減少を判定する工程をさらに含む、項目６２〜６５のいずれか１項に記載の方法。
（項目６７）
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度が、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比べて減少する、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度が、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比べて増加する、項目６６に記載の方法。
（項目６９）
さらなる用量のリガンドが、前記被験体に投与される、項目６６〜６８のいずれか１項に記載の方法。
（項目７０）
多量体リガンドの有効量が、標的細胞の数または濃度を減少させ、細胞傷害性の症候を減少させるのに有効な量である、項目６２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
（項目７１）
前記多量体リガンドを投与した後に、細胞傷害性の症候のレベルが前記被験体において決定され、（ｉ）該多量体リガンドの投与が中止されるか、または（ｉｉ）投与された多量体リガンドの以前の用量よりも低いさらなる用量の多量体リガンドが投与される、項目６２〜６９．１に記載の方法。
（項目７２）
前記多量体リガンドを投与した後に、細胞傷害性の症候のレベルが、前記被験体において決定され、投与された多量体リガンドの以前の用量よりも高いさらなる用量の多量体リガンドが投与される、項目６２〜６９．１に記載の方法。
（項目７３）
前記多量体リガンドを投与した後に、前記被験体における標的細胞の数または濃度が決定され、（ｉ）該多量体リガンドの投与が中止されるか、または（ｉｉ）投与された多量体リガンドの以前の用量よりも低いさらなる用量の多量体リガンドが投与される、項目６２〜６９．１に記載の方法。
（項目７４）
前記多量体リガンドを投与した後に、前記被験体における標的細胞の数または濃度が決定され、投与された多量体リガンドの以前の用量よりも高いさらなる用量の多量体リガンドが投与される、項目６２〜６９．１に記載の方法。
（項目７５）
前記多量体リガンドのさらなる用量が、前記以前の用量よりも１２０％〜２００％高い、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記多量体リガンドのさらなる用量が、前記以前の用量よりも約１５０％高い、項目７４に記載の方法。
（項目７７）
被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、有効量の項目５３〜６１のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に投与する工程および前記多量体化領域に結合するリガンドを投与することにより該被験体に抗腫瘍免疫を提供する工程を含む、方法。
（項目７８）
標的抗原の高発現に関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、有効量の項目５３〜６１のいずれか１項に記載の改変された細胞、および有効量の、前記多量体化領域に結合するリガンドを該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目７９）
前記標的抗原が、腫瘍抗原である、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記改変された細胞が、自己のＴ細胞である、項目５３〜７９のいずれか１項に記載の方法。
（項目８１）
前記改変された細胞が、同種異系のＴ細胞である、項目５３〜７９のいずれか１項に記載の方法。
（項目８２）
被験体における腫瘍サイズを減少させるための方法であって、該方法は、項目５３〜６１のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に投与する工程を含み、前記抗原認識部分は、該腫瘍上の抗原に結合する、方法。
（項目８３）
前記被験体が、腫瘍を有すると診断されている、項目６２〜８２のいずれか１項に記載の方法。
（項目８４）
前記被験体が、がんを有する、項目６２〜８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目８５）
前記被験体が、固形腫瘍を有する、項目６２〜８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目８６）
前記改変された細胞が、腫瘍浸潤リンパ球またはＴ細胞である、項目６２〜８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目８７）
前記改変された細胞が、腫瘍床に送達される、項目６２〜８６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８８）
前記がんが、前記被験体の血液中または骨髄中に存在する、項目８４に記載の方法。
（項目８９）
前記被験体が、血液疾患または骨髄疾患を有する、項目６２〜８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９０）
前記被験体が、任意の状態または幹細胞移植によって緩和され得る状態と診断されている、項目６２〜８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９１）
前記被験体が、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、項目６２〜８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９２）
前記被験体が、原発性免疫不全状態、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＡＨ）または他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、異常ヘモグロビン症、代謝状態および破骨細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、項目６２〜８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９３）
前記疾患または状態が、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＡＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンドブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスおよび大理石骨病からなる群より選択される、項目６２〜８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９４）
さらなる用量の前記リガンドを前記被験体に投与するべきであるかを判定する工程をさらに含む、項目６２〜９３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９５）
さらなる用量の前記リガンドを前記被験体に投与する工程をさらに含み、ここで、前記疾患または状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検出される、項目６２〜９３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９６）
多量体リガンドの有効量が、標的抗原を発現している細胞の数もしくは濃度または該標的抗原を発現している細胞の組織浸潤の程度を減少させ、前記細胞傷害性の症候を減少させるのに有効な量である、項目７８〜９３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９７）
前記多量体リガンドを投与した後に、細胞傷害性の症候のレベルが前記被験体において決定され、（ｉ）該多量体リガンドの投与が中止されるか、または（ｉｉ）投与された多量体リガンドの以前の用量よりも低いさらなる用量の多量体リガンドが投与される、項目７８〜９６に記載の方法。
（項目９８）
前記多量体リガンドを投与した後に、細胞傷害性の症候のレベルが、前記被験体において決定され、投与された多量体リガンドの以前の用量よりも高いさらなる用量の多量体リガンドが投与される、項目７８〜９７に記載の方法。
（項目９９）
前記多量体リガンドを投与した後に、前記被験体における標的抗原を発現している細胞の数もしくは濃度または該標的抗原を発現している細胞の組織浸潤の程度が決定され、（ｉ）該多量体リガンドの投与が中止されるか、または（ｉｉ）投与された多量体リガンドの以前の用量よりも低いさらなる用量の多量体リガンドが投与される、項目７８〜９７に記載の方法。
（項目１００）
前記多量体リガンドを投与した後に、前記被験体における標的抗原を発現している細胞の数もしくは濃度または該標的抗原を発現している細胞の組織浸潤の程度が決定され、投与された多量体リガンドの以前の用量よりも高いさらなる用量の多量体リガンドが投与される、項目７８〜９９に記載の方法。
（項目１０１）
被験体における状態または疾患の有無またはステージを特定する工程；および
該被験体において特定された状態または疾患の有無またはステージに基づいて、項目５３〜６１のいずれか１項に記載のリガンドを投与する指示、該リガンドのその後の投与量を維持する指示または該被験体に投与される該リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに含む、項目６２〜１００のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０２）
前記状態が、白血病である、項目６２〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０３）
前記被験体が、ＨＩＶ、インフルエンザ、疱疹、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６，Ｉ）およびパピローマウイルスからなる群より選択されるウイルス病因の感染症と診断されているか、または肺炎、結核および梅毒からなる群より選択される細菌病因の感染症と診断されているか、またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症およびアメーバ症からなる群より選択される寄生生物病因の感染症と診断されている、項目６２〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０４）
前記改変された細胞が、エキソビボにおいてトランスフェクトされるかまたは形質導入される、項目６２〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０５）
前記改変された細胞が、インビボにおいてトランスフェクトされるかまたは形質導入される、項目５３〜６１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１０６）
前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、項目６２〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０７）
細胞においてキメラ刺激分子を発現させるための方法であって、該方法は、項目１〜５１のいずれか１項に記載の核酸を、該核酸が細胞に組み込まれる条件下において該細胞と接触させる工程を含み、それにより、該細胞は、該組み込まれた核酸からキメラ抗原レセプターを発現する、方法。
（項目１０８）
前記核酸が、エキソビボにおいて前記細胞と接触される、項目１０７に記載の方法。
（項目１０９）
前記核酸が、インビボにおいて前記細胞と接触される、項目１０７に記載の方法。
（項目１１０）
標的抗原の高発現に関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与する工程を含み、ここで、
ａ）該多量体リガンドは、該多量体リガンド領域、ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む誘導可能なキメラ刺激分子に結合し；
ｂ）該被験体内を循環しているＴ細胞は、（ｉ）該誘導可能なキメラ刺激分子；および（ｉｉ）該標的抗原に結合するキメラ抗原レセプターを発現し；
ｃ）該標的抗原は、該被験体内を循環している標的細胞上に存在し；
ｄ）該被験体における標的細胞の数または濃度は、該多量体リガンドを投与した後に減少する、
方法。
（項目１１１）
前記誘導可能なキメラ刺激分子が、膜標的化領域をさらに含む、項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）
前記キメラ刺激分子を発現しているＴ細胞が、項目１〜５１のいずれか１項に記載の核酸を含む、項目１１０または１１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１３）
前記標的抗原が、腫瘍細胞によって発現され、前記キメラ抗原レセプターが、前記腫瘍細胞に結合する、項目１１０〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１４）
前記改変された細胞またはリガンドを投与する前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、該改変された細胞およびリガンドを投与した後に該被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および該第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比べて該第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増加または減少を判定する工程をさらに含む、項目１１０〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１５）
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度が、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比べて減少する、項目１１３に記載の方法。
（項目１１６）
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度が、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比べて増加する、項目１１３に記載の方法。
（項目１１７）
さらなる用量の前記リガンドが、前記被験体に投与される、項目１１０〜１１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１８）
前記標的抗原が、腫瘍抗原である、項目１１０〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１９）
前記被験体が、がんを有するまたは腫瘍を有すると診断されている、項目１１０〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２０）
前記被験体が、固形腫瘍を有する、項目１１０〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２１）
前記がんが、前記被験体の血液中または骨髄中に存在する、項目１１９に記載の方法。
（項目１２２）
前記被験体が、血液疾患または骨髄疾患を有する、項目１１０〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２３）
前記被験体が、任意の状態または幹細胞移植によって緩和され得る状態と診断されている、項目１１０〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２４）
前記被験体が、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、項目１１０〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２５）
前記被験体が、原発性免疫不全状態、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＡＨ）または他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、異常ヘモグロビン症、代謝状態および破骨細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、項目１１０〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２６）
前記疾患または状態が、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＡＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンドブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスおよび大理石骨病からなる群より選択される、項目１１０〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２７）
さらなる用量の前記多量体リガンドを前記被験体に投与するべきであるかを判定する工程をさらに含む、項目１１０〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２８）
さらなる用量の前記多量体リガンドを前記被験体に投与する工程をさらに含み、ここで、前記疾患または状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検出される、項目１１０〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２９）
被験体における状態または疾患の有無またはステージを特定する工程；および
該被験体において特定された状態または疾患の有無またはステージに基づいて、前記多量体リガンドを該被験体に投与する指示、該多量体リガンドのその後の投与量を維持する指示または該被験体に投与される該多量体リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに含む、項目１１０〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３０）
前記状態が、白血病である、項目１１０〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３１）
前記被験体が、ＨＩＶ、インフルエンザ、疱疹、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６，Ｉ）およびパピローマウイルスからなる群より選択されるウイルス病因の感染症と診断されているか、または肺炎、結核および梅毒からなる群より選択される細菌病因の感染症と診断されているか、またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症およびアメーバ症からなる群より選択される寄生生物病因の感染症と診断されている、項目１１０〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３３）
前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、項目１１０〜１３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３４）
誘導可能なキメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸でトランスフェクトされたまたは形質導入された、改変されたＴ細胞であって、ここで、該誘導可能なキメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、および（ｉｉｉ）多量体化領域を含む、改変されたＴ細胞。
（項目１３５）
前記誘導可能なキメラ刺激分子が、（ｉｖ）膜標的化領域をさらに含む、項目１３４に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１３６）
前記キメラ刺激分子がポリペプチドであって、領域（ｉ）〜（ｉｉｉ）を、該ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）という順序で含むポリペプチドである、項目１３４に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１３７）
前記キメラ刺激分子がポリペプチドであって、領域（ｉ）〜（ｉｖ）を、該ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって（ｉｖ）、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）という順序で含むポリペプチドである、項目１３５に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１３８）
前記多量体化領域が、リガンド結合領域である、項目１３４〜１３７のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１３９）
前記リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、項目１３８に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１４０）
前記ＦＫＢＰ１２領域が、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、項目１３８に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１４１）
前記ＦＫＢＰ１２領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、項目１４０に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１４２）
前記多量体化領域が、配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントおよび配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントを含むか、または配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチまたはその機能的フラグメントをさらに含む、項目１３８に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１４３）
前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含むか、または配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、項目１４２に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１４４）
残基３６がバリンであるＦｖポリペプチドバリアントをさらに含む、項目１４２に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１４５）
前記リガンドが、ＦＫ５０６二量体または二量体のＦＫ５０６アナログリガンドである、項目１３４〜１４４のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１４６）
前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、項目１４５に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１４７）
領域（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくとも１つが、コドン最適化されたヌクレオチド配列によってコードされる、項目１３４〜１４６のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１４８）
前記誘導可能なキメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、項目１３４〜１４７のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１４９）
前記改変された細胞が、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目１３４〜１４８のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１５０）
前記キメラ抗原レセプターが、
（ｉ）膜貫通領域；（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子；および（ｉｉｉ）抗原認識部分
を含む、項目１４９に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１５１）
前記改変された細胞が、Ｔ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目１３４〜１５０のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１５２）
前記改変された細胞が、Ｔ細胞レセプターまたはＴ細胞レセプターに基づくキメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む核酸でトランスフェクトされるかまたは形質導入される、項目１４５〜１５１のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１５３）
前記キメラ抗原レセプターが、共刺激分子をさらに含む、項目１５０に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１５４）
前記共刺激分子が、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４−１ＢＢからなる群より選択される、項目１５３に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１５５）
前記Ｔ細胞活性化分子が、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子である、項目１５０に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１５６）
前記Ｔ細胞活性化分子が、ＣＤ３ζポリペプチドである、項目１５０に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１５７）
前記Ｔ細胞活性化分子が、Ｆｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドである、項目１５０に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１５８）
前記抗原認識部分が、腫瘍細胞上の抗原に結合する、項目１５０〜１５７のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１５９）
前記抗原認識部分が、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、項目１５０〜１５７のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１６０）
前記抗原認識部分が、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６およびＨｅｒ２／Ｎｅｕからなる群より選択される抗原に結合する、項目１５０〜１５７のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１６１）
前記抗原認識部分が、ＰＳＣＡに結合する、項目１５０〜１５７のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１６２）
前記抗原認識部分が、ＣＤ１９に結合する、項目１５０〜１５７のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１６３）
前記抗原認識部分が、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結合する、項目１５０〜１５７のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１６４）
前記抗原認識部分が、ウイルス抗原または細菌抗原に結合する、項目１５０〜１５７のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１６５）
前記抗原認識部分が、一本鎖可変フラグメントである、項目１５０〜１５７のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１６６）
前記膜貫通領域が、ＣＤ２８膜貫通領域である、項目１５０〜１５７のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１６７）
前記膜貫通領域が、ＣＤ８膜貫通領域である、項目１５０〜１５７のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１６８）
前記キメラ抗原レセプターが、ＣＤ８ストーク領域をさらに含む、項目１６７に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１６９）
前記キメラ刺激分子が、配列番号５のアミノ酸配列を有する切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはその機能的フラグメントを含む、項目１３４〜１６９のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１７０）
前記ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号４９のアミノ酸配列を有する、項目１３４〜１６９のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１７１）
前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目１３４〜７０のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１７２）
前記ＣＤ３ζポリペプチドが、配列番号３９のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを含む、項目１５６〜１７１のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１７３）
前記膜標的化領域が、レセプターのミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域および膜貫通配列からなる群より選択される、項目１３５〜１７２のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１７４）
前記膜標的化領域が、ミリストイル化領域である、項目１３５〜１７３のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１７５）
前記ミリストイル化領域が、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目１７４に記載の改変されたＴ細胞。
（項目１７６）
被験体におけるＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激するための方法であって、
ａ）項目１３４〜１７５のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞を該被験体に投与する工程；および
ｂ）有効量の、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与することにより、該被験体においてＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激する工程
を含む、方法。
（項目１７７）
前記キメラ抗原レセプターが、標的細胞に結合する、項目１７６に記載の方法。
（項目１７８）
前記標的細胞が、腫瘍細胞である、項目１７６に記載の方法。
（項目１７９）
前記被験体における標的細胞の数または濃度が、前記リガンドの投与後に減少する、項目１７６〜１７８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８０）
前記改変された細胞またはリガンドを投与する前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、該改変された細胞およびリガンドを投与した後に該被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および該第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比べて該第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増加または減少を判定する工程をさらに含む、項目１７６〜１７９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８１）
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度が、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比べて減少する、項目１８０に記載の方法。
（項目１８２）
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度が、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比べて増加する、項目１８１に記載の方法。
（項目１８３）
さらなる用量の前記リガンドが、前記被験体に投与される、項目１７６〜１８２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８４）
被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、有効量の項目１３４〜１７５のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞を該被験体に投与する工程および前記多量体化領域に結合するリガンドを投与することにより該被験体に抗腫瘍免疫を提供する工程を含む、方法。
（項目１８５）
標的抗原の高発現に関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、有効量の項目１３４〜１７５のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞、および有効量の、前記多量体化領域に結合するリガンドを該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目１８６）
前記標的抗原が、腫瘍抗原である、項目１８５に記載の方法。
（項目１８７）
前記改変されたＴ細胞が、自己のＴ細胞である、項目１７６〜１８６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８８）
前記改変されたＴ細胞が、同種異系のＴ細胞である、項目１７６〜１８６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８９）
被験体における腫瘍サイズを減少させるための方法であって、該方法は、項目１３４〜１７５のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞を該被験体に投与する工程を含み、前記抗原認識部分は、該腫瘍上の抗原に結合する、方法。
（項目１９０）
前記被験体が、腫瘍を有すると診断されている、項目１７６〜１８９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９１）
前記被験体が、がんを有する、項目１７６〜１９０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９２）
前記被験体が、固形腫瘍を有する、項目１７６〜１９１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９３）
前記改変されたＴ細胞が、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ細胞またはＮＫ−Ｔ細胞である、項目１７６〜１９２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９４）
前記改変されたＴ細胞が、腫瘍床に送達される、項目１７６〜１９３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９５）
前記がんが、前記被験体の血液中または骨髄中に存在する、項目１９１に記載の方法。
（項目１９６）
前記被験体が、血液疾患または骨髄疾患を有する、項目１７６〜１９５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９７）
前記被験体が、任意の状態または幹細胞移植によって緩和され得る状態と診断されている、項目１７６〜１９６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９８）
前記被験体が、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、項目１７６〜１９０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９９）
前記被験体が、原発性免疫不全状態、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＡＨ）または他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、異常ヘモグロビン症、代謝状態および破骨細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、項目１７６〜１９０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２００）
前記疾患または状態が、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＡＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンドブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスおよび大理石骨病からなる群より選択される、項目１７６〜１９０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０１）
さらなる用量の前記リガンドを前記被験体に投与するべきであるかを判定する工程をさらに含む、項目１７６〜２００のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０２）
さらなる用量の前記リガンドを前記被験体に投与する工程をさらに含み、ここで、前記疾患または状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検出される、項目１７６〜２０１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０３）
被験体における状態または疾患の有無またはステージを特定する工程；および
該被験体において特定された状態または疾患の有無またはステージに基づいて、項目Ｃ５３〜Ｃ６１のいずれか１項に記載のリガンドを投与する指示、該リガンドのその後の投与量を維持する指示または該被験体に投与される該リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに含む、項目１７６〜２０２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０４）
前記状態が、白血病である、項目１７６〜２０３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０５）
前記被験体が、ＨＩＶ、インフルエンザ、疱疹、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６，Ｉ）およびパピローマウイルスからなる群より選択されるウイルス病因の感染症と診断されているか、または肺炎、結核および梅毒からなる群より選択される細菌病因の感染症と診断されているか、またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症およびアメーバ症からなる群より選択される寄生生物病因の感染症と診断されている、項目１７６〜２０３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０６）
前記改変されたＴ細胞が、エキソビボにおいてトランスフェクトされるかまたは形質導入される、項目１７６〜２０５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０７）
前記改変されたＴ細胞が、インビボにおいてトランスフェクトされるかまたは形質導入される、項目１３４〜１７５のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。
（項目２０８）
前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、項目１７６〜２０６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０９）
誘導可能なキメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸であって、ここで、該誘導可能なキメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、および（ｉｉｉ）多量体化領域を含む、核酸。
（項目２１０）
前記キメラ刺激分子がポリペプチドであって、領域（ｉ）〜（ｉｉｉ）を、該ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）という順序で含むポリペプチドである、項目２０９に記載の核酸。
（項目２１１）
前記多量体化領域が、リガンド結合領域である、項目２０９〜２１０のいずれか１項に記載の核酸。
（項目２１２）
前記リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、項目２１１に記載の核酸。
（項目２１３）
前記ＦＫＢＰ１２領域が、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、項目２１１に記載の核酸。
（項目２１４）
前記ＦＫＢＰ１２領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、項目２１１に記載の核酸。
（項目２１５）
前記多量体化領域が、配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントおよび配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、項目２１１に記載の核酸。
（項目２１６）
前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、項目２１５に記載の核酸。
（項目２１７）
残基３６がバリンであるＦｖポリペプチドバリアントをさらに含む、項目２１５に記載の核酸。
（項目２１８）
前記リガンドが、ＦＫ５０６二量体または二量体のＦＫ５０６アナログリガンドである、項目２０９〜２１７のいずれか１項に記載の核酸。
（項目２１９）
前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、項目２１８に記載の核酸。
（項目２２０）
領域（ｉ）〜（ｉｉｉ）の少なくとも１つが、コドン最適化されたヌクレオチド配列によってコードされる、項目２０９〜２１９のいずれか１項に記載の核酸。
（項目２２１）
前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、項目２０９〜２２０のいずれか１項に記載の核酸。
（項目２２２）
前記核酸が、ウイルスベクター内に含まれている、項目２０９〜２２１のいずれか１項に記載の核酸。
（項目２２３）
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、項目２２２に記載の核酸。
（項目２２４）
前記レトロウイルスベクターが、マウス白血病ウイルスベクターである、項目２２３に記載の核酸。
（項目２２５）
前記レトロウイルスベクターが、ＳＦＧベクターである、項目２２３に記載の核酸。
（項目２２６）
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、項目２２２に記載の核酸。
（項目２２７）
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、項目２２２に記載の核酸。
（項目２２８）
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスからなる群より選択される、項目２２２に記載の核酸。
（項目２２９）
前記核酸が、プラスミド内に含まれている、項目２０９〜２２２のいずれか１項に記載の核酸。
（項目２３０）
項目２０９〜２３０のいずれか１項に記載の核酸でトランスフェクトされたまたは形質導入された、改変された細胞。
（項目２３１）
前記改変された細胞が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞、ＴＣＲを発現している細胞またはＮＫ細胞である、項目２３０に記載の改変された細胞。
（項目２３２）
前記細胞が、Ｔ細胞である、項目２３０に記載の改変された細胞。
（項目２３４）
前記細胞が、骨髄から得られるかまたは調製される、項目２３０〜２３２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２３５）
前記細胞が、臍帯血から得られるかまたは調製される、項目２３０〜２３２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２３６）
前記細胞が、末梢血から得られるかまたは調製される、項目２３０〜２３２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２３７）
前記細胞が、末梢血単核球から得られるかまたは調製される、項目２３０〜２３２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２３８）
前記細胞が、ヒト細胞である、項目２３０〜２３７のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２３９）
前記細胞が、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子を用いた遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子またはポリプレックスからなる群より選択される方法を用いて、前記核酸ベクターによってトランスフェクトされるかまたは形質導入される、項目２３０〜２３８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２４０）
前記改変された細胞が、Ｔ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目２３０〜２３９のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２４１）
前記改変された細胞が、Ｔ細胞レセプターまたはＴ細胞レセプターに基づくキメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む核酸でトランスフェクトされるかまたは形質導入される、項目２３０〜２４０のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２４２）
前記改変された細胞が、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目２３０〜２４１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２４３）
前記キメラ抗原レセプターが、
（ｉ）膜貫通領域；（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子；および（ｉｉｉ）抗原認識部分
を含む、項目２４２に記載の改変された細胞
（項目２４４）
前記キメラ抗原レセプターが、共刺激分子をさらに含む、項目２４３に記載の改変された細胞。
（項目２４５）
前記共刺激分子が、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４−１ＢＢからなる群より選択される、項目２４４に記載の改変された細胞。
（項目２４６）
前記Ｔ細胞活性化分子が、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子である、項目２４３に記載の改変された細胞。
（項目２４７）
前記Ｔ細胞活性化分子が、ＣＤ３ζポリペプチドである、項目２４３に記載の改変された細胞。
（項目２４８）
前記Ｔ細胞活性化分子が、Ｆｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドである、項目２４３に記載の改変された細胞。
（項目２４９）
前記抗原認識部分が、腫瘍細胞上の抗原に結合する、項目２４３〜２４８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２５０）
前記抗原認識部分が、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、項目２４３〜２４９のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２５１）
前記抗原認識部分が、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６およびＨｅｒ２／Ｎｅｕからなる群より選択される抗原に結合する、項目２４３〜２５０のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２５２）
前記抗原認識部分が、ＰＳＣＡに結合する、項目２４３〜２５０のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２５３）
前記抗原認識部分が、ＣＤ１９に結合する、項目２４３〜２４８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２５４）
前記抗原認識部分が、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結合する、項目２４３〜２４８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２５５）
前記抗原認識部分が、ウイルス抗原または細菌抗原に結合する、項目２４３〜２４８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２５６）
前記抗原認識部分が、一本鎖可変フラグメントである、項目２４３〜２５５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２５７）
前記膜貫通領域が、ＣＤ２８膜貫通領域である、項目２４３〜２５６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２５８）
前記膜貫通領域が、ＣＤ８膜貫通領域である、項目２４３〜２５６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２５９）
前記キメラ抗原レセプターが、ＣＤ８ストーク領域をさらに含む、項目２５８に記載の改変された細胞。
（項目２６０）
前記キメラ刺激分子が、配列番号５のアミノ酸配列を有する切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはその機能的フラグメントを含む、項目２３０〜２５０のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２６１）
前記ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号４９のアミノ酸配列を有する、項目２３０〜２６０のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２６２）
前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目２３０〜２６１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２６３）
前記ＣＤ３ζポリペプチドが、配列番号３９のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを含む、項目２４７〜２６１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２６４）
被験体におけるＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激するための方法であって、
ａ）項目２３０〜２６３のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に投与する工程；および
ｂ）有効量の、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与することにより、該被験体においてＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激する工程
を含む、方法。
（項目２６５）
前記キメラ抗原レセプターが、標的細胞に結合する、項目２６４に記載の方法。
（項目２６６）
前記標的細胞が、腫瘍細胞である、項目２６４に記載の方法。
（項目２６７）
前記被験体における標的細胞の数または濃度が、前記リガンドの投与後に減少する、項目２６５〜２６６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６８）
前記改変された細胞またはリガンドを投与する前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、該改変された細胞および該リガンドを投与した後に該被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および該第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比べて該第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増加または減少を判定する工程をさらに含む、項目２６５〜２６７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６９）
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度が、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比べて減少する、項目２６８に記載の方法。
（項目２７０）
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度が、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比べて増加する、項目２６８に記載の方法。
（項目２７１）
さらなる用量のリガンドが、前記被験体に投与される、項目２６４〜２７０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７２）
被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、有効量の項目２３０〜２６３のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に投与する工程および前記多量体化領域に結合するリガンドを投与することにより該被験体に抗腫瘍免疫を提供する工程を含む、方法。
（項目２７３）
標的抗原の高発現に関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、有効量の項目２３０〜２６３のいずれか１項に記載の改変された細胞、および有効量の、前記多量体化領域に結合するリガンドを該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目２７４）
前記標的抗原が、腫瘍抗原である、項目２７３に記載の方法。
（項目２７５）
前記改変された細胞が、Ｔ細胞である、項目２７３または２７４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７６）
前記改変された細胞が、同種異系のＴ細胞である、項目２７３または２７４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７７）
被験体における腫瘍サイズを減少させるための方法であって、該方法は、項目２３０〜２６３のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に投与する工程を含み、前記抗原認識部分は、該腫瘍上の抗原に結合する、方法。
（項目２７８）
前記被験体が、腫瘍を有すると診断されている、項目２６４〜２７７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７９）
前記被験体が、がんを有する、項目２６４〜２７８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８０）
前記被験体が、固形腫瘍を有する、項目２６４〜２７９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８１）
前記改変された細胞が、腫瘍浸潤リンパ球である、項目２６４〜２８０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８２）
前記改変された細胞が、腫瘍床に送達される、項目２６４〜２８１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８３）
前記がんが、前記被験体の血液中または骨髄中に存在する、項目２７９に記載の方法。
（項目２８４）
前記被験体が、血液疾患または骨髄疾患を有する、項目２６４〜２８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８５）
前記被験体が、任意の状態または幹細胞移植によって緩和され得る状態と診断されている、項目２６４〜２８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８６）
前記被験体が、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、項目２６４〜２７７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８７）
前記被験体が、原発性免疫不全状態、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＡＨ）または他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、異常ヘモグロビン症、代謝状態および破骨細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、項目２６４〜２７７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８８）
前記疾患または状態が、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＡＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンドブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスおよび大理石骨病からなる群より選択される、項目２６４〜２７７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８９）
さらなる用量の前記リガンドを前記被験体に投与するべきであるかを判定する工程をさらに含む、項目２６４〜２８８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９０）
さらなる用量の前記リガンドを前記被験体に投与する工程をさらに含み、ここで、前記疾患または状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検出される、項目２６４〜２８９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９１）
被験体における状態または疾患の有無またはステージを特定する工程；および
該被験体において特定された状態または疾患の有無またはステージに基づいて、前記リガンドを投与する指示、該リガンドのその後の投与量を維持する指示または該被験体に投与される該リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに含む、項目２６４〜２９０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９２）
前記状態が、白血病である、項目２６４〜２９１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９３）
前記被験体が、ＨＩＶ、インフルエンザ、疱疹、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６，Ｉ）およびパピローマウイルスからなる群より選択されるウイルス病因の感染症と診断されているか、または肺炎、結核および梅毒からなる群より選択される細菌病因の感染症と診断されているか、またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症およびアメーバ症からなる群より選択される寄生生物病因の感染症と診断されている、項目２６４〜２９１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９４）
前記改変された細胞が、エキソビボにおいてトランスフェクトされるかまたは形質導入される、項目２６４〜２９３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９５）
前記改変された細胞が、インビボにおいてトランスフェクトされるかまたは形質導入される、項目２３０〜２６３のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目２９６）
前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、項目２６４〜２９４のいずれか１項に記載の方法。

【0039】

ある特定の実施形態は、以下の説明、実施例、請求項および図面においてさらに説明される。

【図面の簡単な説明】

【0040】

図面は、本技術の実施形態を図示するものであって、限定するものではない。図示を明確にするためおよび容易にするために、図面は、一定の比率で拡大縮小して作成されておらず、場合によっては、特定の実施形態の理解を容易にするために、様々な態様が、誇張または拡大されて示されていることがある。

【図1】図１ａ〜１ｈは、ｉＭＣの機能が、誘導可能な共刺激をＴ細胞に提供することを示している、アッセイの結果を提供している。１ａ）リミズシド曝露の後のＴ細胞におけるＭｙＤ８８およびＣＤ４０細胞質シグナル伝達ドメインの二量体化の模式図。１ｂ）ｉＭＣによって形質導入されたＴ細胞は、ＮＴおよびコントロールベクター（ＦＫＢＰ）によって形質導入されたＴ細胞と比べて、ＡＰ１９０３用量依存的活性化を示す。１ｃ）ＦＫＢＰのみ、または誘導可能なＭｙＤ８８、誘導可能なＣＤ４０もしくはｉＭＣを含むベクターで形質導入されたＴ細胞における１０ｎＭのリミズシドによる処置の後のＩＬ−６産生の解析。１ｄ）形質導入されたＴ細胞を１０ｎＭリミズシドに曝露した後の時間依存的なリン酸化ＪＮＫ、ＲｅｌＡおよびｐ３８（ＭＡＰＫ）シグナル伝達分子を測定するマルチプレックスアレイ。１ｅ）０、１５および６０分間のリミズシド処置の後の、ＦＫＰＢまたはｉＭＣを形質導入されたＴ細胞におけるリン酸化されたシグナル伝達タンパク質のウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｐｌｏｔ）解析。ポジティブコントロールは、ＰＨＡおよびイオノマイシンによるＴ細胞の処置を示している。１ｆ）ＦＫＢＰのみ、または誘導可能なＭｙＤ８８、誘導可能なＣＤ４０もしくはｉＭＣを含むベクターで形質導入されたＴ細胞を、１０ｎＭリミズシドおよび／または５０ｎｇ／ｍｌ可溶性抗ＣＤ３を用いておよび用いずに活性化し、上清を、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２について測定し、フローサイトメトリーによってＣＤ２５の発現について評価した（１ｇおよび１ｈ）。^＊は、ｐ値＜０．０５を示す。

【図2】図２ａ〜２ｆは、ｉＭＣとＰＳＣＡ．ζＣＡＲとを同時形質導入されたＴ細胞が、腫瘍殺滅の改善および拡大をリミズシド依存的様式で示すことを示しているアッセイの結果を提供している。２ａ）ＣＡＲおよびｉＭＣで遺伝的に改変されたＴ細胞の模式図。２ｂ）Ｔ細胞を、ＰＳＣＡ．ζＣＡＲおよびＦＫＢＰまたはｉＭＣレトロウイルスで形質導入し、ＣＤ１９−ＰＥおよび抗ＣＡＲ−ＡＰＣを用いるフローサイトメトリーによって共発現について測定した。２ｃ）形質導入されていないＴ細胞およびＦＫＢＰまたはｉＭＣで改変されたＰＳＣＡ．ζＣＡＲ Ｔ細胞をＣａｐａｎ−１−ＧＦＰ腫瘍細胞とともにＴ細胞と腫瘍細胞との比が１：１で、１０ｎＭリミズシドを用いておよび用いずに共培養した。７日後にフローサイトメトリーによって腫瘍細胞およびＴ細胞の出現頻度を評価した。腫瘍細胞の出現頻度を、フローサイトメトリーによってＳＳＣ／ＧＦＰゲーティングによってＣＤ３⁻ＧＦＰ^＋腫瘍細胞を測定することによって評価した。ｉＭＣとＣＡＲとを共発現しているＴ細胞の濃縮を、共培養アッセイにおいてフローサイトメトリーによってそれぞれＣＤ１９−ＰＥおよび抗ＣＡＲ−ＡＰＣの出現頻度を測定することによって評価した。２ｄ）続いて、Ｔ細胞を、ＣＤ２５の発現について評価し、フローサイトメトリーおよび細胞数測定を用いてＴ細胞の増殖（２ｅ）について測定した。２ｆ）ｉＭＣまたはＣｔｒｌベクターとＰＳＣＡ．ζＣＡＲとを同時形質導入されたＴ細胞を、Ｃａｐａｎ−１腫瘍細胞を伴っておよび伴わずに１０ｎＭリミズシドを用いておよび用いずに共培養し、４８時間後に上清をＩＬ−２レベルについて測定した。^＊は、ｐ値＜０．０５を示す。^＊＊は、ｐ値＜０．０１を示す。

【図3】図３ａ〜３ｈは、ｉＭＣを同時形質導入されたＣＡＲ Ｔ細胞が、インビボにおいてリミズシド依存的様式で抗腫瘍有効性の増大を示すことを示しているアッセイの結果を提供している。３ａ）ＳｈｏｒｎマウスにＣａｐａｎ−１腫瘍細胞を移植し、そのマウスを、コントロールベクターもしくはｉＭＣを同時形質導入されたＰＳＣＡ．ζＣＡＲ Ｔ細胞または形質導入されていないＴ細胞で処置し、７および１４日目にｉ．ｖ．注射した。２１日目まで外来性ＩＬ−２をｉ．ｐ．投与し、その後、中止した。すべてのマウスに５ｍｇ／ｋｇのリミズシドを１週間に２回（ｂｉｗ）ｉ．ｐ．投与した。腫瘍サイズをノギスによって測定し（３ｂ）、１００日間にわたって生存を評価した（３ｃ）。３ｄ）インビボにおけるＣＡＲ Ｔ細胞の残留および拡大を測定するために、ＮＳＧマウスを用いた。マウスにＣａｐａｎ−１腫瘍細胞をｓ．ｃ．注射し、次いで、そのマウスを、形質導入されていない（ＮＴ）Ｔ細胞またはＦＫＢＰおよびＰＳＣＡ．ζで改変されたＴ細胞またはｉＭＣおよびＰＳＣＡ．ζで改変されたＴ細胞で処置した。ｉＭＣを使用できるＴ細胞で処置されたマウスに、２．５ｍｇ／ｋｇリミズシドを１週間に１回（ｑｗ）、１週間に２回（ｂｉｗ）または食塩水のみをｉ．ｐ．注射によって投与した。３ｅ）皮下の腫瘍サイズを３０日間にわたってノギスによって測定した。３ｆ）食塩水のみを投与しつつ、ｉＭＣを形質導入されたＴ細胞で処置されたマウスまたはリミズシドの全身投与とともに、ｉＭＣを形質導入されたＴ細胞で処置されたマウスにおいて、インビボでの生物発光イメージングを行った。関心領域（ＲＯＩ）の測定を、動物全体（３ｇ）またはそれらの群の中の個々の腫瘍（３ｈ）において行った。^＊は、ｐ値＜０．０５を示す。

【図4】図４ａおよび４ｂは、レトロウイルス構築物のデザインの模式図である。４ａ）切断型ＣＤ１９（ΔＣＤ１９）とインフレームで、ミリストイル化ドメイン（Ｍｙｒ）および２つのタンデムのＦＫＢＰ１２ｖ３６二量体結合ドメインをコードするＳＦＧレトロウイルス骨格を用いて、４つの構築物を作製した。これらのベクターは、シグナル伝達分子を欠くか、またはＭｙＤ８８および／もしくはＣＤ４０由来の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。４ｂ）ＩｇＧ１ ＣＨ２ＣＨ３スペーサーおよびＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインとインフレームである抗ＰＳＣＡ一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ｂｍ２Ｂ３^４，５を用いて、２つのＰＳＣＡ標的化ＣＡＲを作製した。さらに、細胞内ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含む第２世代ＣＡＲを構築した。

【図5】図５ａ〜ｄは、ｉＭＣによって改変されたＴ細胞の形質導入効率、機能および表現型のアッセイの結果を提供している。５ａおよび５ｂ）形質導入されていないＴ細胞またはＦＫＢＰコントロールベクター（ＳＦＧ−ＦＫＢＰ−２Ａ−ΔＣＤ１９）もしくはｉＭＣ（ＳＦＧ−ｉＭＣ−２Ａ−ΔＣＤ１９）を形質導入されたＴ細胞のフローサイトメトリー解析（ｎ＝７）。５ｃ）形質導入されていないＴ細胞またはＦＫＢＰもしくはｉＭＣベクターで形質導入されたＴ細胞からの、２４時間後の１０ｎＭリミズシド（ＣＩＤ）曝露の後のＩＦＮ−γの誘導。５ｄ）１４日間の培養の後の、形質導入されたＣＤ３^＋ＣＤ１９^＋Ｔ細胞におけるゲーティングの後の、ＦＫＢＰまたはｉＭＣを形質導入されたＴ細胞の表現型分析。^＊は、ｐ値＜０．０５を示す。

【図6】図６ａおよび６ｂは、ｉＭＣおよびコントロール構築物の形質導入効率のアッセイの結果を提供している。６ａ）コントロールおよびｉＭＣレトロウイルスベクターのデザインの模式図。６ｂ）ＦＫＢＰ、ｉＭｙＤ８８、ｉＣＤ４０およびｉＭＣを形質導入されたＴ細胞の形質導入効率。

【図7】図７ａ〜７ｃは、ｉＭＣによって改変されたＴ細胞の遺伝子発現解析の結果を提供している。健常ドナー（ｎ＝３）から作製されたＴ細胞に、ＦＫＢＰまたはｉＭＣレトロウイルスを形質導入し、次いで、１０ｎＭリミズシド（ＣＩＤ）を用いておよび用いずに処理した。４８時間後、ｍＲＮＡを抽出し、ヒト遺伝子発現チップにハイブリダイズさせた。ＡｒｒａｙＳｔａｒ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてデータを抽出した。７ａ）ＣＩＤの活性化の後、ｉＭＣにおいてアップレギュレートされた遺伝子を用いて、ｉＭＣによって改変されたＴ細胞のみと比べて、階層クラスタリングを行った。７ｂ）ＣＩＤを用いたおよび用いていないコントロールＴ細胞（ＦＫＢＰ）と、ＣＩＤを用いたおよび用いていないｉＭＣによって改変されたＴ細胞との間のデータセットの比較。７ｃ）ＣＩＤで処置されたｉＭＣ^＋Ｔ細胞に対して、ＣＩＤで処置されたＦＫＢＰ^＋Ｔ細胞から抽出された遺伝子セット（４３３個のアップレギュレート遺伝子）を、誘導されたネットワークモジュールについてＣｏｎｓｅｎｓｕｓＰａｔｈＤＢによって解析したところ、ＮＫ−κＢおよびＴＲＡＦ経路の中心になるシグナル伝達ネットワークの関連が実証された。

【図8】図８ａ〜８ｃは、初代Ｔ細胞（ｐｒｉｍａｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ）におけるｉＭＣシグナル伝達がＩＬ−２の非存在下において細胞生存を誘導するというアッセイの結果を提供している。８ａおよび８ｂ）ＦＫＢＰおよびｉＭＣを形質導入されたＴ細胞を、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充されたまたは補充されてない培地中で培養し、１０ｎＭリミズシド（ＣＩＤ）で毎週刺激し、細胞の計数によって成長について測定した。８ｃ）ＣＩＤ刺激有りおよび無しで、ＩＬ−２を含まない培地中で培養された、ｉＭＣによって改変されたＴ細胞を、４２日間培養した後、フローサイトメトリーによって（ＳＳＣ、ＦＳＣ）生存率について測定した。^＊は、ｐ値＜０．０５を示す。

【図9】図９ａおよび９ｂは、ｉＭＣを形質導入されたＴ細胞におけるリミズシドによるサイトカインの誘導のアッセイの結果を提供している。ＦＫＢＰコントロールベクター（９ａ）またはｉＭＣレトロウイルス（９ｂ）を形質導入されたＴ細胞を、１０ｎＭリミズシド（ＣＩＤ）で４８時間処置した。次いで、上清を回収し、マルチプレックスサイトカイン／ケモカインアレイを用いて解析した。

【図10】図１０ａ〜１０ｄは、ｉＭＣおよびＰＳＣＡ．ζＣＡＲで改変されたＴ細胞の表現型および機能のアッセイの結果を提供している。１０ａ）ＦＫＢＰコントロールまたはｉＭＣレトロウイルスで形質導入されたＰＳＣＡ．ζＣＡＲ Ｔ細胞の模式図。１０ｂ）形質導入されていない（ＮＴ）Ｔ細胞と比べたときの、ＰＳＣＡ．ζＣＡＲとＦＫＢＰおよびｉＭＣレトロウイルスとの両方で同時形質導入されたＴ細胞の表現型。１０ｃ）ＰＳＣＡ．ζおよびＦＫＢＰまたはｉＭＣを形質導入されたＴ細胞を、ＤＥＬＰＨＩＡ細胞傷害アッセイを用いて、ＰＳＣＡ^＋腫瘍細胞株Ｃａｐａｎ−１およびＨＰＡＣに対して異なるエフェクター：標的比で細胞傷害性についてアッセイした。１０ｄ）腫瘍およびリミズシド刺激の状況におけるＩＬ−２産生に向けて、Ｔ細胞に、ＦＫＢＰもしくはｉＭＣのみ、ＰＳＣＡ．ζのみ、またはそれらの組み合わせを形質導入し、次いで、ＣＡＲまたはシグナル伝達ベクターの共発現を検出するフローサイトメトリーを用いて表現型分析した。

【図11】図１１は、ｉＭＣ活性化が、ＩＬ−２の非存在下におけるＣＡＲの生存を高めることを示しているアッセイの結果を提供している。ｉＭＣおよびＰＳＣＡ．ζＣＡＲを形質導入されたＴ細胞を、ＩＬ−２を含まない培地中で４２日間培養した。Ｔ細胞に、処置を行わない（培地交換のみ）か、αＣＤ３刺激（５０ｎｇ／ｍｌ ＯＫＴ３）、１０ｎＭリミズシド（ＣＩＤ）またはＣＤ３とＣＩＤ刺激の両方を毎週投与した。培養物を、フローサイトメトリーによってＴ細胞生存（ＦＳＣ／ＳＳＣ）について、およびフローサイトメトリーによってｉＭＣ^＋ＣＡＲ^＋発現について表現型分析した。

【図12】図１２ａ〜１２ｄは、ＰＳＣＡ．ζＣＡＲ Ｔ細胞におけるＣＤ２８およびｉＭＣ共刺激を比較するアッセイの結果を提供している。１２ａ）ＦＫＢＰおよびｉＭＣ分子、ならびに第１（ＰＳＣＡ．ζ）および第２（ＰＳＣＡ．２８．ζ）のＣＡＲ構築物で操作されたＴ細胞の模式図。１２ｂ）形質導入されていないＴ細胞、およびＦＫＢＰ^＋ＰＳＣＡ．ζ、ＦＫＢＰ^＋ＰＳＣＡ．２８．ζまたはｉＭＣ^＋ＰＳＣＡ．ζを形質導入されたＴ細胞をＣａｐａｎ−１−ＧＦＰ腫瘍細胞と、１：１というエフェクター：標的比で７日間共培養し、フローサイトメトリーによって残留腫瘍細胞（ＣＤ３⁻ＧＦＰ^＋）について解析した。１２ｃ）リミズシド（ＣＩＤ）で処置されたおよび処置されなかった共培養上清において、ＩＬ−２のＥＬＩＳＡを行った。１２ｄ）細胞の総数に、共培養アッセイにおいて得られたフローサイトメトリーによって測定されたＣＤ３^＋ＧＦＰ⁻細胞の出現頻度を乗算することによって、Ｔ細胞数を評価した。

【図13】図１３ａ〜１３ｃ ＰＳＣＡ．ζＣＡＲ Ｔ細胞におけるｉＭＣの共刺激は、ＣＤ２８共刺激と比べて抗腫瘍有効性を高める。１３ａ）ＣＤ２８共刺激と、ｉＭＣのリミズシド（ＣＩＤ）依存性共刺激との比較を、ｓ．ｃ．Ｃａｐａｎ−１腫瘍を有するＳｈｏｒｎマウスにおいて比較した。腫瘍注射の７日後に、マウスに、１×１０^７個の形質導入されていないＴ細胞、またはＦＫＢＰ^＋ＰＳＣＡ．ζ、ＦＫＢＰ^＋ＰＳＣＡ．２８．ζもしくはｉＭＣ^＋ＰＳＣＡ．ζで改変されたＴ細胞を１回、ｉ．ｖ．投与した。続いて、形質導入されたＴ細胞を投与されたマウスを、１週間に２回、５ｍｇ／ｋｇリミズシド（ＣＩＤ）でｉ．ｐ．処置した。１３ｂ）腫瘍サイズをノギスによって各群について測定し、生存を評価した（１３ｃ）。

【図14】図１４は、複数のレトロウイルスベクターを同時形質導入されたＴ細胞の形質導入効率を評価している散布図を提供している。形質導入されていないＴ細胞を、ＥＧＦＰルシフェラーゼ（ＥＧＦＰｌｕｃ）のみを形質導入されたＴ細胞、およびＦＫＢＰ^＋ＰＳＣＡ．ζ、ＦＫＢＰ^＋ＰＳＣＡ．２８．ζを形質導入され、ＥＧＦＰｌｕｃをさらに形質導入されたＴ細胞と比較した。ＦＫＢＰおよびｉＭＣならびにＣＡＲの発現をフローサイトメトリーによって解析した。

【図15】図１５は、アミノ末端のミリストイル化領域を含まないベクターｐＳＦＧ−ｉΔＭＣ−２Ａ−ａＣＤ１９−Ｑ−８ｓｔｍ−ＣＤ３ζのプラスミドマップである。

【図16】図１６は、アミノ末端のミリストイル化領域を含まないベクターｐＳＦＧ−ｉΔＭＣ−２Ａ−ΔＣＤ１９のプラスミドマップである。

【図17】図１７ａ〜１７ｂは、ミリストイル化されていない（６０６、６０８）誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０を発現するＴ細胞と比べたときの、ミリストイル化された（１７２、６０７、１８０、６０９）誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０によるリミズシド依存性のＩＬ−６の産生を示している棒グラフを提供している。

【図18】図１８ａ〜１８ｂは、ＣＤ１９^＋Ｒａｊｉ細胞と共培養されたミリストイル化されていない（６０８）誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０を発現しているＴ細胞と比べたときの、ミリストイル化された（ｍｙｉｓｔｏｙｌａｔｅｄ）（１８０）誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０によるリミズシド依存性のＩＬ−２およびＩＬ−６の産生を示している棒グラフを提供している。

【図19】図１９は、ミリストイル化領域、誘導可能なＣＤ４０／完全長ＭｙＤ８８ポリペプチド、およびＰＳＣＡに結合するＣＡＲをコードする配列を含むベクターＳＦＧ−ｉＭＣｆｌ−２Ａ−ＰＳＣＡ（Ａ１１）ｓｃＦｖ−ＣＤ３４ｅ−ＣＤ８ｓｔｍ−ゼータのプラスミドマップである。

【図20】図２０は、ミリストイル化領域、誘導可能なＣＤ４０／完全長ＭｙＤ８８ポリペプチドおよびＣＤ１９ポリペプチドマーカーをコードする配列を含むベクターｐＢＰＯ１７２−ＳＦｇ−ｉＭＣｆｌ．２Ａ．ＣＤ１９のプラスミドマップである。

【図21】図２１は、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｅｉｏｎ）領域、誘導可能なＣＤ４０／完全長ＭｙＤ８８ポリペプチド、およびＣＤ１９に結合するＣＡＲをコードする配列を含む、ベクターｐＢＰＯ１８０ｋ−ＳＦＧ−ｉＭＣｆｌ−２Ａ−ＣＤ１９ＣＤ３４ｅＣＤ８ｓｔｍゼータのプラスミドマップである。

【図22】図２２は、誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラポリペプチドを発現している非樹状細胞の活性化を示している模式図である。

【図23】図２３は、実験計画の模式図である。

【図24】図２４Ａおよび２４Ｂは、形質導入されたマクロファージのアッセイの折れ線グラフを提供している。

【図25】図２５Ａおよび２５Ｂは、形質導入されたマクロファージのアッセイの折れ線グラフを提供している。

【図26-1】図２６Ａ〜Ｄは、マクロファージを用いたときの結果の棒グラフを提供している。

【図26-2】図２６Ａ〜Ｄは、マクロファージを用いたときの結果の棒グラフを提供している。

【図27】図２７Ａおよび２７Ｂは、形質導入されたメラノーマ細胞のアッセイの折れ線グラフを提供している。

【図28】図２８Ａおよび２８Ｂは、形質導入されたメラノーマ細胞のアッセイの折れ線グラフを提供している。

【図29】図２９Ａおよび２９Ｂは、メラノーマ細胞を用いたときの結果の棒グラフを提供している。

【図30】図３０Ａおよび３０Ｂは、形質導入された線維芽細胞のアッセイの折れ線グラフを提供している。

【図31】図３１Ａおよび３１Ｂは、線維芽細胞を用いたときの結果の棒グラフを提供している。

【図32】図３２は、アッセイのデザインの模式図である。

【図33】図３３は、マクロファージにおけるｉＭＣ活性化の棒グラフを提供している。

【図34】図３４は、マクロファージにおけるｉＭＣ活性化の棒グラフを提供している。

【図35】図３５は、マクロファージにおけるｉＭＣ活性化の棒グラフを提供している。

【図36】図３６は、実施例のレトロウイルスベクターを作製するために使用され得るプラスミドに対するプラスミドベクターマップである。

【図37】図３７は、実施例のアデノウイルスベクターを作製するために使用され得るプラスミドに対するプラスミドベクターマップである。

【図38】図３８は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の遺伝子移入の図示を提供している。

【図39】図３９は、ＣＡＲの改善および関連する毒性の図示を提供している。

【図40】図４０は、自殺（アポトーシス）遺伝子も発現しているＣＡＲ発現細胞と比べて、ＣＩＤによってコントロールされるキメラシグナル伝達分子の理論的解析のグラフ描写を提供している。

【図41】図４１は、ＣＩＤによってコントロールされるＣＳＭのいくつかの例の図示を提供している。

【図42】図４２は、ＣＳＭのＣＩＤ誘導、およびＣＡＲを含むＴ細胞の誘導可能なＣＳＭ活性化の図示を提供している。

【図43】図４３は、ＣＩＤによってコントロールされるＴ細胞による腫瘍細胞の殺傷の図示を提供している。

【図44】図４４は、改変されたＴ細胞のＦＡＣｓ選別解析の結果を提供している。

【図45】図４５は、改変されたＴ細胞およびコントロールＴ細胞におけるＧＭ−ＣＳＦおよびインターフェロンガンマのレベルの棒グラフを提供している。

【図46】図４６は、改変されたＴ細胞およびコントロールＴ細胞におけるＩＬ−１０およびＩＬ−１３のレベルの棒グラフを提供している。

【図47】図４７は、改変されたＴ細胞およびコントロールＴ細胞におけるＩＬ−４およびＩＬ−５のレベルの棒グラフを提供している。

【図48】図４８は、改変されたＴ細胞およびコントロールＴ細胞におけるＩＬ−６およびＩＬ−８のレベルの棒グラフを提供している。

【図49】図４９は、改変されたＴ細胞およびコントロールＴ細胞におけるＩＬ−１βおよびＩＬ−１２−ｐ７０のレベルの棒グラフを提供している。

【図50】図５０は、改変されたＴ細胞およびコントロールＴ細胞におけるＩＰ−１０およびＭＩＰ１αのレベルの棒グラフを提供している。

【図51】図５１は、改変されたＴ細胞およびコントロールＴ細胞におけるＭＩＰ１βおよびＲＡＮＴＥＳのレベルの棒グラフを提供している。

【図52】図５２は、改変されたＴ細胞およびコントロールＴ細胞におけるＴＮＦ−αレベルの棒グラフを提供している。

【図53】ｉＭＣを形質導入されたＴ細胞のＡＰ１９０３による活性化は、腫瘍細胞のＴ細胞殺傷を誘導する。コントロールベクター（ＭｙＤ８８／ＣＤ４０シグナル伝達ドメインを欠く）、またはマクロファージにおけるｉＭＣ活性化により形質導入されたＴ細胞を、ＣＡＰＡＮ−１−ＧＦＰ腫瘍細胞とともに、５：１というＴ細胞と腫瘍細胞との比で培養した。共培養物を、１０ｎＭ ＡＰ１９０３ありまたはなしで培養した。７２時間後、共培養物をフローサイトメトリーによってＧＦＰ^＋腫瘍細胞（Ｘ軸）について解析した。

【図54】図５４は、図５３について論じた実験と類似の、異なるドナーに対する実験の結果を示している。

【図55】ｉＭＣを形質導入されたＴ細胞のＡＰ１９０３による活性化は、腫瘍細胞のＴ細胞殺傷を誘導する。コントロールベクター（ＭｙＤ８８／ＣＤ４０シグナル伝達ドメインを欠く）またはｉＭＣを形質導入されたＴ細胞を、ＣＡＰＡＮ−１−ＧＦＰ腫瘍細胞とともに、５：１というＴ細胞と腫瘍細胞との比で培養した。共培養物を、１０ｎＭ ＡＰ１９０３ありまたはなしで培養した。７２時間後、共培養物をフローサイトメトリーによってＧＦＰ^＋腫瘍細胞について解析した（ｎ＝２）。

【図56】ｉＭＣを形質導入されたＴ細胞のＡＰ１９０３による活性化は、腫瘍細胞のＴ細胞殺傷を誘導する。コントロールベクター（ＭｙＤ８８／ＣＤ４０シグナル伝達ドメインを欠く）またはｉＭＣを形質導入されたＴ細胞を、ＣＡＰＡＮ−１−ＧＦＰ腫瘍細胞とともに、５：１というＴ細胞と腫瘍細胞との比で培養した。共培養物を、１０ｎＭ ＡＰ１９０３ありまたはなしで培養した。７２時間後、共培養物を蛍光顕微鏡法によって解析したところ、１０ｎＭ ＡＰ１９０３で活性化されたとき、Ｔ細胞芽球の活性化（右の２つのパネル）およびＧＦＰ^＋腫瘍細胞の排除が示された。

【図57】図５７は、キメラ抗原レセプターを形質導入されたまたはトランスフェクトされた細胞（左）および本明細書中に提供されるようなキメラシグナル伝達分子の例の模式図である。

【図58】図５８は、キメラ抗原レセプターで形質導入されたまたはトランスフェクトされた細胞（左）および本明細書中に提供されるようなキメラシグナル伝達分子の例の模式図である。

【図59】図５９は、２つのキメラポリペプチドとの間に２Ａポリペプチドを有するキメラ抗原レセプターと共発現される誘導可能なキメラ刺激分子のプラスミドマップである。

【図60】図６０Ａ〜６０Ｄは、誘導可能なキメラ刺激分子の例を提供している。図６０Ａは、誘導可能なキメラ刺激分子の一般的なポリペプチドエレメントのグラフによる図示を提供している。図６０Ｂは、キメラ刺激分子を発現しているＴ細胞におけるＣＤ１９マーカー検出のフローサイトメトリーの結果を提供している。図６０Ｃは、キメラ刺激分子を発現しているＴ細胞におけるＩＦＮγ産生のグラフである。図６０Ｄは、キメラ刺激分子を発現しているＴ細胞におけるＩＬ−６産生のグラフである。

【図61】図６１は、誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドおよびキメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドをコードするプラスミドのプラスミドマップであり、ここで、両方のポリヌクレオチドが、同じプロモーターに作動可能に連結されている。

【図62】図６２は、誘導可能なキメラ共刺激分子のプラスミドマップである。このプラスミドは、ポリペプチドマーカーとしてＣＤ１９もコードする。

【図63】図６３は、第１世代抗ＣＤ１９−ＣＡＲとともに、ミリストイル化領域を含む誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０ポリペプチドをコードするｐＢＰ０１７２のプラスミドマップである。例えば本明細書中の実施例８に論じられるように、次世代のベクターにおいて外来の上流開始部位および付随の短いペプチドを除去するために、５’「ＡＴＧ」を「ＡＧ」に変更した（下線の「ＡＴＧ」配列および横線で消された「Ｔ」によって示されている）。この同一の５’非翻訳領域は、プラスミド６０６、６０７、６０８および６０９の間で共有された。

【発明を実施するための形態】

【0041】

詳細な説明
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現しているＴ細胞は、いくつかのタイプのがんの処置に対して長期間の有効性を示したが、しかしながら、過剰なＴ細胞の活性化に関連する毒性、例えば、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）が、なおも懸念として残っている。ステロイドを用いるか、またはベクター内への自殺遺伝子（例えば、誘導可能なカスパーゼ−９、ＨＳＶ−ＴＫ、ＣＤ２０、切断型ＥＧＦＲ）^７−１２の組み込みを用いることにより、安全性プロファイルを改善することができるが、これらの現行のアプローチは、治療のレベルを低下させることがあるか、または治療を終わらせることがあり、ゆえに、有効性を損なう可能性がある。より最近では、ＩＬ−６レセプターの遮断がＣＲＳを管理するために使用されている^６；しかしながら、このストラテジーは、直接的なＴ細胞の細胞傷害性が組織損傷に関与しているときには、あまり有効でない可能性がある^１３。さらに、ＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の不良な生存、活性化および増殖に起因して、おそらく、腫瘍内微小環境のより深刻な阻害作用に起因して、固形腫瘍においてより限定的である^{１４，１５}。したがって、腫瘍を標的とするＴ細胞のコントロールされた拡大および生存を可能にするストラテジーは、毒性を最小限に抑えつつ、治療効力を最大にし得る。

【0042】

腫瘍細胞は、完全なＴ細胞活性化にとって必要な必須の共刺激分子を欠くことが多いので^１９、腫瘍抗原特異的な一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ドメインおよびＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）と会合したＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達分子を含む第１世代ＣＡＲを有するＴ細胞は、インビボにおいて存続しないかまたは拡大しない^{１６−１８}。ＣＤ２８または４−１ＢＢのような強力な細胞内共刺激ドメインを組み込んでいる第２世代ＣＡＲ−Ｔ細胞^{２０，２１}は、養子移入後に、改善された生存およびインビボ拡大を示す^１−４。いくつかの研究は、健康な組織によって活性化される阻害性ドメインを用いてＣＡＲ−Ｔ細胞を操作した^２２か、または「オンターゲットオフ腫瘍（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ，ｏｆｆ−ｔｕｍｏｒ）」毒性を限定するために種々の抗原標的でＣＡＲ上の共刺激ドメインおよびＣＤ３ζを分断することによる腫瘍センシングアプローチを用いた^{２３，２４}。これらのアプローチは、腫瘍特異性を改善し得るが、予測不可能な細胞の自律性因子に依存することが多い。対照的に、インビボにおいてＴ細胞の増幅および排除をコントロールするために医師が実施可能なアプローチは、臨床経過に合わせた患者ごとの治療を促進し得、急性のまたは長期間にわたる治療関連毒性を潜在的に回避し得る。

【0043】

一般に、Ｔ細胞治療は、注入された細胞のインビボでの拡大が不良であるという困難を伴っていた。この問題に対処する１つの方法は、高用量のＩＬ−２を患者に投与することによるものである。この治療は、Ｔ細胞の成長および抗腫瘍機能を助けるが、患者にとって非常に有毒でもある。高用量のＩＬ−２は、メラノーマに対する標準治療法（ｓｔａｎｄａｒｄ−ｏｆ−ｃａｒｅ ｔｈｅｒａｐｙ）であると考えられているので、これは、その疾患において広く使用されてきた。他のほとんどのＴ細胞治療の適用は、有毒作用に起因して、Ｔ細胞治療とともにＩＬ−２を使用してこなかった。Ｔ細胞治療において生じている別の問題は、注入されたＴ細胞の生着および存続が不良であること（インビボでの増殖の機能）であり、これは、Ｔ細胞を注入する前にリンパ球枯渇前処置（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）を行うことによって対処されてきた。研究者らは、これを達成するために化学療法（特にシクロホスファミド）を広く使用するが、一部の研究者は、Ｃａｍｐａｔｈを含む抗体を使用する。前処置は、リンパ系の「空間」を作り出すことならびに増殖因子および生存因子について競合する調節性の免疫細胞を枯渇させることによって、Ｔ細胞治療を大いに促進するとみられる。しかしながら、それは、患者にとって非常に有毒であり、正常な免疫細胞（例えば、病原体特異的）を完全に除去するので、いくつかのタイプの癌または高齢患者に対して容易に使用できない。さらに、リンパ球枯渇レジメンの使用は、Ｔ細胞治療を独立型の治療ではなく「一連の手順」に押し進め得る。

【0044】

各患者は、その患者に対して製造されたユニークな細胞生成物を有する必要があるので、Ｔ細胞治療は、ブティック療法（ｂｏｕｔｉｑｕｅ ｔｈｅｒａｐｙ）であると広く考えられてきた。従来のＴ細胞治療（反復性の抗原刺激または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の単離によってもたらされる）は、それらの特異性または機能に関して再現できず、極端に変動する結果をもたらし、場合によっては、処置用の生成物を生成できないことがある。天然のＴ細胞レセプターまたはキメラＴ細胞レセプターの遺伝子移入は、この問題を解決し始めている（ここで、高度に腫瘍特異的なＴ細胞は、２週間未満で産生され得る）が、遺伝子が改変されたＴ細胞が、天然に存在するＴ細胞と異なって機能し得ることは明らかである。さらに、高度に特異的なＣＡＲ Ｔ細胞または最適化されたＴＣＲアルファ鎖およびベータ鎖を発現しているＴ細胞は、オフターゲット毒性を引き起こし得ることから、自殺遺伝子を含めることが必要である。

【0045】

図３８は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の最も基本的な構成要素を図示している。腫瘍特異的モノクローナル抗体に対する可変重（Ｖ_Ｈ）鎖および可変軽（Ｖ_Ｌ）鎖が、Ｔ細胞レセプター複合体由来のＣＤ３ゼータ鎖（ζ）とインフレームで融合される。そのＶ_ＨおよびＶ_Ｌは、通常、グリシン−セリン可動性リンカーを使用して互いに接続され、次いで、スペーサー（ＣＨ２ＣＨ３）によって膜貫通ドメインに付着されることにより、腫瘍抗原と相互作用できるようにｓｃＦｖが細胞表面から離れて伸長する。

【0046】

形質導入の後、Ｔ細胞は、この時点で、その表面上にＣＡＲを発現し、腫瘍抗原と接触し、ライゲーションすると、細胞傷害および細胞活性化を誘導するＣＤ３ゼータ鎖を介してシグナル伝達する。

【0047】

図３９は、様々なキメラ抗原レセプターの開発を図示している。研究者らは、ＣＤ３ゼータを介したＴ細胞の活性化が、腫瘍特異的殺傷を誘導するのに十分であるが、Ｔ細胞の増殖および生存を誘導するには不十分であることを述べている。ゼータ鎖のみを発現しているＣＡＲによって改変されたＴ細胞を使用した初期の臨床試験は、遺伝子が改変されたＴ細胞が、インビボにおいて不良な生存および増殖を示すことを示した。これらの構築物は、第１世代ＣＡＲと呼ばれる。

【0048】

Ｂ７軸を介した共刺激は、完全なＴ細胞活性化にとって必要であるので、研究者らは、共刺激ポリペプチドＣＤ２８シグナル伝達ドメインをＣＡＲ構築物に加えた。この領域は、通常、膜貫通領域（ＣＤ３ゼータバージョンの代わりに）、ならびにＰＩ３ＫおよびＬｃｋに結合するためのＹＭＮＭモチーフを含む。ゼータだけを有するＣＡＲまたはゼータとＣＤ２８の両方を有するＣＡＲを発現しているＴ細胞の間のインビボでの比較から、ＣＤ２８が、活性化後のＩＬ−２産生の増加に部分的に起因して、インビボにおいて拡大を促進することが実証された。ＣＤ２８を含んでいるものは、第２世代ＣＡＲと呼ばれる。

【0049】

ＣＡＲのデザインにおいて共刺激ポリペプチド４−１ＢＢまたはＯＸ４０を使用することにより、Ｔ細胞の生存および有効性がさらに改善された。４−１ＢＢは、特に、Ｔ細胞の増殖および生存を大幅に増強するとみられる。この第３世代のデザイン（３つのシグナル伝達ドメインを有する）は、ＰＳＭＡ ＣＡＲ（Ｚｈｏｎｇ ＸＳら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｆｅｂ；１８（２）：４１３−２０）およびＣＤ１９ ＣＡＲにおいて、最も著しくはＣＬＬの処置のために、使用されている（Ｍｉｌｏｎｅ，Ｍ．Ｃ．ら（２００９）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１４５３−１４６４；Ｋａｌｏｓ，Ｍ．ら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．（２０１１）３：９５ｒａ７３；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．ら（２０１１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：７２５−５３３）。これらの細胞は、インビボにおいて１０００倍超拡大して、３人の患者において目覚ましい機能を示し、３人の患者すべてにおいて持続的な緩解をもたらした。

【0050】

しかしながら、ＣＡＲは、抗腫瘍効果を改善しながらも、それらは、より危険にもなった。第２および第３世代のＣＡＲを使用した２つの目立った死亡例があり、ほんの少数の患者しか処置されていないことを考慮すれば、これは、甚だしい。これらの死亡は、高度に活性化されたＴ細胞によって引き起こされるサイトカインストームおよび腫瘍崩壊症候群に起因する敗血症が原因で生じた（Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ら（２０１０）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：８４３−８５１）。

【0051】

Ｔ細胞レセプターシグナル伝達は、二量体化化学誘導物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）（ＣＩＤ）に結合する多量体化領域を含むキメラレセプターと組み合わせてＣＩＤを使用して誘導され得る。Ｔ細胞を、１、２または３つのＦＫＢＰフラグメントと連結されたＣＤ３ゼータ鎖を発現するように操作した。それらの細胞は、キメラレセプターを発現し、ＣＩＤ依存性のＴ細胞活性化を示した（Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３．２６２：ｐ．１０１９−１０２４）。本願は、ＣＩＤによってコントロールされる誘導可能なキメラシグナル伝達分子（ＣＳＭ）を部分的に提供する。誘導可能なＣＳＭを発現するＴ細胞をＣＩＤと接触させることにより、細胞の活性化および免疫応答の誘導がもたらされる。

【0052】

樹状細胞（ＤＣ）は、「ユニバーサルな」Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）アダプターであるＭｙＤ８８およびＴＮＦファミリーメンバーであるＣＤ４０を含む、小分子（すなわち、リミズシド／ＡＰ１９０３）応答性（ｒｅｓｐｏｎｓｅ）キメラシグナル伝達分子を用いる二量体化化学誘導（ＣＩＤ）によって活性化され得る^２５。

【0053】

図４０では、本願の治療法を、自殺遺伝子を使用するＣＡＲ処置の方法と比較している。本願は、抗腫瘍効果が徐々に増大するようにインビボにおけるＴ細胞の増殖および機能を増幅する遺伝子操作アプローチを部分的に提供する。二量体化化学誘導物質は、Ｔ細胞の機能および頻度を高めるために、インビボにおいてＴ細胞を活性化するためのコントロール可能な系において使用される。

【0054】

図６３および６４に示されているように、いくつかの実施形態において、ＣＳＭは、ＣＤ３ゼータ鎖を伴っておよび伴わずに、１つ以上の共刺激ポリペプチド（例えば、ＣＤ２８および４−１ＢＢなど）とタンデムで、Ｆｖドメインなどの多量体化領域を使用することにより、ＣＩＤ依存性の増殖および共刺激が可能になる。共刺激を提供するためおよびＴ細胞免疫応答を増加させるために、ＣＳＭは、単独で使用され得る。この方法を使用して、Ｔ細胞の集団、例えば、非特異的な標的を含む集団が、ＣＳＭをコードするＤＮＡでトランスフェクトされ得るかまたは形質転換され得、次いで、被験体に投与されることにより、全身的免疫応答が高められ得る。

【0055】

このＣＳＭは、例えばｓｃＦｖポリペプチドおよびＣＤ３ゼータ鎖を含み得るＣＡＲとともに、細胞において発現され得る。この方法では、誘導可能なＣＳＭ分子は、ＣＡＲと組み合わせて使用され、それにより、ＣＡＲシグナル伝達が２つの別個の機能に分離される。ＣＡＲによって提供されるこの第２の機能は、操作されたＴ細胞に対して抗原特異的細胞傷害をもたらす。図４１において、この例は、ＰＳＭＡに対して特異性を有するＣＡＲを示しており；これらの操作されたＴ細胞は、例えば、被験体に投与されることにより、特異的な免疫応答、例えば、前立腺癌腫瘍に対する免疫応答をもたらし得る（図４３）。

【0056】

図５９に示されるように、いくつかの実施形態において、誘導可能な共刺激ポリペプチド、例えば、ＣＤ４０細胞質領域ポリペプチドまたは切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドなどが、キメラ抗原レセプター自体の活性化をコントロールするために使用される。この改変された誘導可能なキメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドは、細胞、例えば、Ｔ細胞などを形質導入するために使用され得る。これらの細胞は、本明細書中で論じられるようなキメラシグナル伝達分子をさらに発現し得、ある特定の実施形態において、キメラシグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、誘導可能なキメラ抗原レセプターは、ＣＤ４０細胞質領域ポリペプチドとＭｙＤ８８ポリペプチドの両方を含む。

【0057】

誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラタンパク質は、ＴＣＲまたはＣＡＲシグナル伝達の状況において、Ｔ細胞の生存を強め、Ｔ細胞の増殖を高める、強力な共刺激シグナルとして機能し得る。さらに、この共刺激経路は、小分子を二量体化する高度に特異的な合成リガンドであるリミズシドを使用して、インビボにおいて活性化され得る。細胞溶解シグナル１（ＣＤ３ζ）ドメインを共刺激シグナル２（ｉＭＣ）と分離することにより、Ｔ細胞が、投与されたリガンドおよび腫瘍抗原に応答して拡大され得るか、または刺激性の薬物を休薬して、不十分なＴ細胞の活性化を可能にすることによりアネルギーおよび細胞排除を誘導することによって、数を潜在的に減少させ得る、独特の機構がもたらされる。さらに、腫瘍特異的Ｔ細胞の拡大の制御に関連する、ｉＭＣによって駆動されるＣＡＲ−Ｔ細胞の効力増大の可能性は、以前にＣＡＲ−Ｔ抵抗性だった腫瘍標的、例えば、固形腫瘍に適応し得る。

【0058】

本明細書中で使用されるとき、請求項および／または明細書において用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに使用されるときの単語「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つの」を意味し得るが、「１つ以上の」、「少なくとも１つの」および「１つもしくは２つ以上の」の意味とも一致する。なおもさらに、用語「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、相互交換可能であり、当業者は、これらの用語がオープンエンドな（ｏｐｅｎ ｅｎｄｅｄ）用語であると認識している。

【0059】

本明細書中で使用される用語「同種異系」は、宿主細胞とドナー細胞との間で抗原的に異なるＨＬＡ遺伝子座またはＭＨＣ遺伝子座のことを指す。

【0060】

したがって、同じ種から移植される細胞または組織は、抗原的に異なり得る。同系マウスは、１つ以上の遺伝子座が異なり得（コンジェニック）、同種異系マウスは、同じバックグラウンドを有し得る。

【0061】

本明細書中で使用される用語「抗原」は、免疫応答を引き起こす分子として定義される。この免疫応答は、抗体の産生もしくは特定の免疫適格細胞の活性化またはその両方を含み得る。抗原は、生物、タンパク質／抗原のサブユニット、殺傷されたまたは不活性化されたホールセルまたは溶解産物に由来し得る。例示的な生物としては、ヘリコバクター、カンピロバクター、クロストリジウム、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｉ、プラスモディウム、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、パピローマウイルス、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ、大腸菌、麻疹ウイルス、ロタウイルス、赤痢菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａが挙げられるが、これらに限定されない。ゆえに、実質的にすべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が、抗原として働き得る。さらに、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。病原性ゲノム、または免疫応答を誘発するタンパク質に対する遺伝子もしくは遺伝子のフラグメントのヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡは、抗原の合成をもたらす。さらに、本方法は、遺伝子またはゲノムの核酸配列全体の使用に限定されない。本発明が、２つ以上の遺伝子またはゲノムの部分的な核酸配列の使用を含むがこれに限定されないこと、およびこれらの核酸配列が、所望の免疫応答を誘発するように様々な組み合わせで配置されることは、容易に固有のことである。

【0062】

「抗原認識部分」は、抗原に結合する任意のポリペプチドまたはそのフラグメント、例えば、天然に由来するかまたは合成の抗体フラグメント可変ドメインであり得る。抗原認識部分の例としては、抗体に由来するポリペプチド、例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；Ｔ細胞レセプターに由来するポリペプチド、例えば、ＴＣＲ可変ドメイン；ならびに細胞外の相同の（ｃｏｇｎａｔｅ）タンパク質に結合する任意のリガンドまたはレセプターフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。

【0063】

用語「抗原提示細胞」は、少なくとも１つの抗原または抗原性フラグメントをその細胞表面上に（または細胞表面に）ディスプレイするか、獲得するかまたは提示することができる種々の細胞のいずれかである。一般に、用語「細胞」は、抗原または抗原性組成物に対する免疫応答（すなわち、免疫系のＴ細胞またはＢ細胞のアームからの免疫応答）の強化を助けるという目標を達成する任意の細胞であり得る。例えば、Ｋｕｂｙ，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ ｃｏｍｐａｎｙ（参照により本明細書中に援用される）において論じられ、ある特定の実施形態において本明細書中で使用されるように、正常にまたはクラスＩＩ主要組織適合分子もしくは主要組織適合複合体とともに免疫細胞に抗原をディスプレイするかまたは提示する細胞が、「細胞」である。ある特定の態様において、細胞（例えば、ＡＰＣ細胞）は、別の細胞、例えば、組換え細胞または所望の抗原を発現している腫瘍細胞と融合され得る。２つまたはそれを超える細胞の融合物を調製するための方法は、例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．６５−６６，７１−７４（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３，Ｂｕｒｄｅｎ ＆ Ｖｏｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｅｌｓｅｖｉｅｗ，ｐｐ．７５−８３，１９８４； Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５；Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−５１９，１９７６，Ｇｅｆｔｅｒら、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．，３：２３１−２３６，１９７７（これらの各々は参照により本明細書中に援用される）において論じられている。場合によっては、細胞が抗原をディスプレイするかまたは提示する免疫細胞は、ＣＤ４^＋ＴＨ細胞である。ＡＰＣ上または他の免疫細胞上に発現されるさらなる分子は、免疫応答の強化を助け得るか、または改善し得る。分泌分子または可溶性分子、例えば、サイトカインおよびアジュバントもまた、抗原に対する免疫応答を助け得るかまたは高め得る。様々な例が、本明細書中で論じられる。

【0064】

本明細書中で使用される用語「癌」は、そのユニークな特質である正常なコントロールの喪失が、制御されない成長、分化の欠如、局所的な組織浸潤および転移をもたらす、細胞の過剰増殖として定義される。例としては、メラノーマ、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺癌、肝細胞癌、白血病、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、歯肉癌、舌癌、神経芽細胞腫、頭部癌、頚部癌、乳癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、骨癌、精巣癌、卵巣癌、中皮腫、子宮頸癌、胃腸癌、リンパ腫、脳癌、結腸癌、肉腫または膀胱癌が挙げられるが、これらに限定されない。

【0065】

本明細書中で使用される用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、交換可能に使用され得る。これらの用語のすべてには、任意およびすべてのその後の世代のそれらの子孫も含まれる。故意または偶然の変異に起因して、すべての子孫が同一でない可能性があることが理解される。

【0066】

本明細書中で使用されるとき、用語「ｉＣＤ４０分子」は、誘導可能なＣＤ４０と定義される。このｉＣＤ４０は、内因性のＣＤ４０シグナル伝達を無効にする機構を迂回し得る。用語「ｉＣＤ４０」は、「ｉＣＤ４０核酸」、「ｉＣＤ４０ポリペプチド」および／またはｉＣＤ４０発現ベクターを包含する。

【0067】

本明細書中で使用されるとき、用語「ｃＤＮＡ」は、鋳型としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を使用して調製されたＤＮＡのことを指すと意図されている。ゲノムＤＮＡ、またはゲノムＲＮＡ鋳型、プロセシングされていないＲＮＡ鋳型もしくは部分的にプロセシングされたＲＮＡ鋳型から重合されたＤＮＡに対立するものとしてｃＤＮＡを使用することの利点は、ｃＤＮＡが、主に、対応するタンパク質のコード配列を含む点である。完全または部分的なゲノム配列が使用されるときがあり、例えば、最適な発現のために非コード領域を必要とする場合、またはイントロンなどの非コード領域がアンチセンスストラテジーにおいて標的化される場合が存在する。

【0068】

用語「樹状細胞」（ＤＣ）は、インビボ、インビトロ、エキソビボ、または宿主もしくは被験体に存在するか、あるいは造血幹細胞または単球に由来し得る細胞である。樹状細胞およびそれらの前駆体は、種々のリンパ系器官、例えば、脾臓、リンパ節ならびに骨髄および末梢血から単離され得る。ＤＣは、樹状細胞本体から薄いシート状物（ラメリポディウム）が複数の方向に広がる特徴的な形態を有する。通常、樹状細胞は、高レベルのＭＨＣおよび共刺激（例えば、Ｂ７−１およびＢ７−２）分子を発現する。樹状細胞は、インビトロにおいてＴ細胞の抗原特異的な分化を誘導し得、インビトロおよびインビボにおいて、初代Ｔ細胞の応答を惹起することができる。

【0069】

本明細書中で使用されるとき、用語「発現構築物」または「導入遺伝子」は、遺伝子産物をコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝的構築物として定義され、ここで、核酸コード配列の一部または全部が転写されることが可能であり、該構築物は、ベクターに挿入され得る。転写産物は、タンパク質に翻訳されるが、必ずしも翻訳されるわけではない。ある特定の実施形態において、発現は、遺伝子の転写とｍＲＮＡから遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の実施形態において、発現は、目的の遺伝子をコードする核酸の転写だけを含む。用語「治療的な構築物」は、発現構築物または導入遺伝子のことを指すためにも使用され得る。発現構築物または導入遺伝子は、例えば、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害（例えば、癌）を処置する治療として、使用され得、ゆえに、発現構築物または導入遺伝子は、治療的な構築物または予防的な構築物である。

【0070】

本明細書中で使用されるとき、用語「発現ベクター」は、転写されることが可能な遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターのことを指す。場合によっては、ＲＮＡ分子は、その後、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。他の場合、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの生成では、これらの配列は、翻訳されない。発現ベクターは、種々の調節配列を含み得、それらの調節配列は、特定の宿主生物において、作動可能に連結されたコード配列を転写するためおよびおそらく翻訳するために必要な核酸配列のことを指す。ベクターおよび発現ベクターは、転写および翻訳を支配する調節配列に加えて、同様に他の機能を果たす核酸配列を含み得、それらは、下で論じられる。

【0071】

本明細書中で使用されるとき、用語「エキソビボ」は、身体の「外側」のことを指す。用語「エキソビボ」および「インビトロ」は、本明細書中で交換可能に使用され得る。

【0072】

本明細書中で使用されるとき、用語「機能的に等価な」は、それがＣＤ４０に関するとき、例えば、ＣＤ４０核酸フラグメント、バリアントまたはアナログについて言及しているとき、腫瘍もしくは過剰増殖性疾患を破壊するように免疫応答を刺激するＣＤ４０ポリペプチドをコードする核酸またはＣＤ４０ポリペプチドのことを指す。ＣＤ４０ポリペプチドの「機能的に等価な」または「機能的フラグメント」とは、例えば、細胞外ドメインを欠いているが、抗原提示分子の樹状細胞の発現をアップレギュレートすることによってＴ細胞媒介性の腫瘍殺滅応答を増幅することができるＣＤ４０ポリペプチドのことを指す。用語「機能的に等価な」が、他の核酸またはポリペプチド、例えば、ＰＳＡペプチド、ＰＳＭＡペプチド、ＭｙＤ８８または切断型ＭｙＤ８８に適用されるとき、その用語は、本明細書中の方法の参照ポリペプチドと同じまたは類似の活性を有するフラグメント、バリアントなどのことを指す。例えば、腫瘍抗原ポリペプチド、例えば、ＰＳＭＡの機能的フラグメントは、抗原性であり得、特定の腫瘍抗原を認識する抗体を産生させ得る。リガンド結合領域の機能的フラグメント、例えば、Ｆｖｌｓは、適切なリガンドに結合するのに十分なリガンド結合領域ポリペプチドの部分を含み得る。「機能的に等価な」とは、例えば、細胞外ドメインを欠いているが、Ｔ細胞において発現されたとき、Ｔ細胞媒介性の腫瘍殺滅応答を増幅することができる、共刺激ポリペプチドのことを指す。

【0073】

用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖に起因する疾患として定義される。例示的な過剰増殖性疾患としては、癌または自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。他の過剰増殖性疾患としては、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症または炎症性腸疾患が挙げられ得る。

【0074】

本明細書中で使用されるとき、用語「遺伝子」は、機能的なタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする単位として定義される。理解されるように、この機能的な用語には、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質および変異体を発現するかまたは発現するように適合された、より小さい操作された遺伝子セグメントが含まれる。

【0075】

用語「免疫原性組成物」または「免疫原」は、免疫応答を引き起こすことができる物質のことを指す。免疫原の例としては、例えば、抗原、自己免疫疾患の誘導において役割を果たす自己抗原、および癌細胞上に発現された腫瘍関連抗原が挙げられる。

【0076】

本明細書中で使用される用語「免疫無防備状態」は、免疫系が衰えているかまたは弱くなっている被験体として定義される。免疫無防備状態の状態は、免疫系の欠損もしくは機能不全または感染および／もしくは疾患への感受性を高める他の要因に起因し得る。そのような分類は、評価に対して概念的基礎を与えるが、免疫無防備状態の個体は、一方の群または他方の群に完全に当てはまらないことが多い。身体の防御機構における２つ以上の欠損が、影響され得る。例えば、ＨＩＶによって引き起こされる特定のＴリンパ球欠損を有する個体は、抗ウイルス治療のために使用される薬物によって引き起こされる好中球減少症も有し得るか、または皮膚および粘膜の完全性が破られたために免疫無防備状態であり得る。免疫無防備状態の状況は、留置中心ライン（ｉｎｄｗｅｌｌｉｎｇ ｃｅｎｔｒａｌ ｌｉｎｅｓ）もしくは静脈内薬物乱用に起因する他のタイプの機能障害に起因し得るか；または続発性悪性疾患、栄養失調によって引き起こされ得るか、または他の感染病原体（例えば、結核）もしくは性行為感染症、例えば、梅毒もしくは肝炎に感染していることに起因し得る。

【0077】

本明細書中で使用されるとき、用語「薬学的または薬理学的に許容され得る」は、動物またはヒトに投与されたとき、有害（ａｄｖｅｒｓｅ）反応、アレルギー反応または他の有害（ｕｎｔｏｗａｒｄ）反応をもたらさない分子実体および組成物のことを指す。いくつかの実施形態において、被験体は、哺乳動物である。

【0078】

本明細書中で使用されるとき、「薬学的に許容され得るキャリア」は、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質および作用物質の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒質または作用物質が、本明細書中に提示されるベクターまたは細胞と不適合性である場合を除いては、治療的な組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分もまた、その組成物に組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、被験体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、被験体は、ヒトである。

【0079】

本明細書中で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書中で使用される核酸およびポリヌクレオチドは、相互交換可能である。核酸は、モノマーの「ヌクレオチド」に加水分解され得るポリヌクレオチドである。モノマーのヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書中で使用されるとき、ポリヌクレオチドには、当該分野において利用可能な任意の手段によって得られるすべての核酸配列が含まれるが、これらに限定されず、そのような手段としては、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術およびＰＣＲ^ＴＭなどを使用する組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング、ならびに合成手段が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの変異を含み、当該分野で周知の方法によるヌクレオチドまたはヌクレオシドの変異を含むが、これらに限定されない。核酸は、１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。

【0080】

本明細書中で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、通常、規定の配列を有する、アミノ酸残基の鎖として定義される。本明細書中で使用されるとき、ポリペプチドという用語は、タンパク質という用語と相互交換可能であり得る。

【0081】

本明細書中で使用されるとき、用語「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列として定義される。

【0082】

本明細書中で使用されるとき、用語「免疫応答を制御する」、「免疫応答を調節する」または「免疫応答をコントロールする」とは、免疫応答を改変できることを指す。例えば、組成物は、免疫応答を増強することおよび／または活性化することができる。なおもさらに、組成物は、免疫応答を阻害することもできる。制御の形態は、組成物とともに使用されるリガンドによって決定される。例えば、化学物質の二量体アナログが、共刺激ポリペプチドの二量体化をもたらし、Ｔ細胞活性化をもたらすが、しかしながら、その化学物質のモノマーアナログは、共刺激ポリペプチドの二量体化をもたらさず、Ｔ細胞を活性化しない。

【0083】

用語「トランスフェクション」および「形質導入」は、相互交換可能であり、外来性ＤＮＡ配列が真核生物宿主細胞に導入されるプロセスのことを指す。トランスフェクション（または形質導入）は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃送達、レトロウイルス感染、リポフェクション、スーパーフェクション（ｓｕｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ）などを含むいくつかの手段のうちのいずれか１つによって達成され得る。

【0084】

本明細書中で使用されるとき、用語「同系」とは、同一の遺伝子型、または組織移植が可能であるのに十分密接な関係がある遺伝子型、または免疫学的に適合性の遺伝子型を有する細胞、組織または動物のことを指す。例えば、同じ近交系の一卵性双生児または動物。同系および同遺伝子系は、交換可能に使用され得る。

【0085】

用語用語「患者」または「被験体」は、相互交換可能であり、本明細書中で使用されるとき、生物または動物；哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジまたは他の非ヒト哺乳動物を含む）；非哺乳動物（例えば、非哺乳動物の脊椎動物、例えば、鳥類（例えば、ニワトリまたはアヒル）または魚類、および非哺乳動物の無脊椎動物を含む）を含むが、これらに限定されない。

【0086】

「Ｔ細胞活性化分子」とは、キメラ抗原レセプターを発現するＴ細胞に組み込まれたとき、Ｔ細胞の活性化を増強するポリペプチドのことを意味する。例としては、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子（ＩＴＡＭ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ，Ｓｉｇｎａｌ １ ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、例えば、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃレセプターガンマ、例えば、Ｆｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニット（Ｈａｙｎｅｓ，Ｎ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：１８２−７（２００１）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0087】

本明細書中で使用されるとき、用語「ワクチン」とは、動物に投与することができる形態で存在する、本明細書中に提示される組成物を含む製剤のことを指す。代表的には、ワクチンは、組成物が懸濁されるかまたは溶解される従来の食塩水または緩衝水溶液媒質を含む。この形態において、組成物は、ある状態を予防するか、回復させるか、または別途処置するために都合よく使用され得る。ワクチンは、被験体に導入されたとき、抗体、サイトカインおよび／または他の細胞応答の産生を含むがこれらに限定されない免疫応答を引き起こすことができる。

【0088】

本明細書中で使用されるとき、用語「転写支配下」または「作動可能に連結された」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現をコントロールする核酸に対して正しい位置および方向で存在することとして定義される。

【0089】

本明細書中で使用されるとき、用語「処置」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置される」または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、予防法および／または治療のことを指す。その用語は、例えば、癌性の固形腫瘍などの固形腫瘍に関して使用されるとき、固形腫瘍または癌に対する被験体の抵抗性を高める予防的処置による予防のことを指す。いくつかの例において、被験体は、癌を予防するために処置され得、ここで、その癌は、家族性であるか、または遺伝的に関連する。その用語は、例えば、感染症に関して使用されるとき、病原体による感染に対する被験体の抵抗性を高める予防的処置、すなわち換言すれば、その被験体が病原体に感染する可能性もしくはその感染症に起因し得る疾病の徴候を示す可能性を低下させる予防的処置、ならびに感染症と闘うための、例えば、感染症を弱めるためもしくは排除するための、または悪化するのを防ぐための、その被験体が感染した後の処置のことを指す。

【0090】

本明細書中で使用されるとき、用語「ワクチン」とは、動物に投与することができる形態で存在する、本明細書中に提示される組成物を含む製剤のことを指す。代表的には、ワクチンは、組成物が懸濁されるかまたは溶解される従来の食塩水または緩衝水溶液媒質を含む。この形態において、組成物は、ある状態を予防するか、回復させるか、または別途処置するために都合よく使用され得る。ワクチンは、被験体に導入されたとき、抗体の産生、サイトカインの産生および／または他の細胞応答を含むがこれらに限定されない免疫応答を引き起こすことができる。

【0091】

血液疾患：本明細書中で使用される用語「血液疾患」、「血液疾患」および／または「血液の疾患」は、血液およびその構成要素（血液細胞、ヘモグロビン、血液タンパク質を含むが、これらに限定されない）の産生、凝固のメカニズム、血液の産生、血液タンパク質の産生などおよびそれらの組み合わせに影響する状態のことを指す。血液疾患の非限定的な例としては、貧血、白血病、リンパ腫、血液学的新生物、アルブミン血症（ａｌｂｕｍｉｎｅｍｉａｓ）、血友病などが挙げられる。

【0092】

骨髄疾患：本明細書中で使用される用語「骨髄疾患」は、血液細胞および血小板の産生の減少をもたらす状態のことを指す。いくつかの骨髄疾患では、正常な骨髄の構造が、感染症（例えば、結核）または悪性疾患によって取って代わられ得、その後、血液細胞および血小板の産生の減少に至り得る。骨髄疾患の非限定的な例としては、白血病、細菌感染症（例えば、結核）、放射線宿酔または放射線中毒、汎血球減少症（ａｐｎｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）、貧血、多発性骨髄腫などが挙げられる。

【0093】

Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞（これはＣＤ３＋細胞を意味することを含む）：Ｔ細胞（Ｔリンパ球とも称される）は、リンパ球と称される白血球の一群に属する。リンパ球は、一般に、細胞性免疫に関わる。「Ｔ細胞」における「Ｔ」とは、胸腺に由来する細胞またはその成熟が胸腺に影響される細胞のことを指す。Ｔ細胞は、Ｔ細胞レセプターとして知られる細胞表面タンパク質の存在によって、他のリンパ球のタイプ（例えば、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）と区別され得る。本明細書中で使用される用語「活性化Ｔ細胞」は、クラスＩＩ主要組織適合性（ＭＨＣ）マーカーにおいて提示された抗原決定基の認識によって免疫応答（例えば、活性化Ｔ細胞のクローン性拡大）をもたらすように刺激されたＴ細胞のことを指す。Ｔ細胞は、抗原決定基、サイトカインおよび／またはリンフォカインならびに分化クラスター細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８などおよびそれらの組み合わせ）の存在によって活性化される。差次的なタンパク質のクラスターを発現する細胞は、しばしば、Ｔ細胞表面上のそのタンパク質の発現について「陽性」であると言われる（例えば、ＣＤ３またはＣＤ４の発現について陽性の細胞は、ＣＤ３＋またはＣＤ４＋と称される）。ＣＤ３およびＣＤ４タンパク質は、Ｔ細胞におけるシグナル伝達に直接的および／または間接的に関わり得る細胞表面レセプターまたはコレセプターである。

【0094】

末梢血：本明細書中で使用される用語「末梢血」は、血液の循環プールから得られるかまたは調製され、リンパ系、脾臓、肝臓もしくは骨髄内に隔絶されない、血液の細胞成分（例えば、赤血球、白血球および血小板）のことを指す。

【0095】

臍帯血：臍帯血は、末梢血、およびリンパ系、脾臓、肝臓または骨髄内に隔絶された血液とは異なる。交換可能に使用され得る用語「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｂｌｏｏｄ）」、「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｂｌｏｏｄ）」または「臍帯血（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）」は、胎盤および出産後のつながったままの臍帯に残存する血液のことを指す。臍帯血は、造血細胞をはじめとした幹細胞を含むことが多い。

【0096】

例えば、細胞の場合におけるような「得られるかまたは調製される」は、細胞または細胞培養物が、その供給源から単離されること、精製されることまたは部分的に精製されることを意味し、ここで、その供給源は、例えば、臍帯血、骨髄または末梢血であり得る。これらの用語は、元の供給源または細胞培養物が培養され、細胞が複製される場合、および子孫細胞がその元の供給源に由来する場合にも適用され得る。

【0097】

あるパーセントの細胞が殺傷される場合におけるような「殺傷する（ｋｉｌｌ）」または「殺傷する（ｋｉｌｌｉｎｇ）」は、アポトーシスを計測するための公知の任意の方法を用いて計測されるときの、アポトーシスによる細胞の死を意味する。その用語は、細胞剥離のことも指し得る。

【0098】

ドナーＴ細胞：ここで使用される用語「ドナーＴ細胞」は、同種異系の幹細胞移植の後に抗ウイルス免疫および／または抗腫瘍免疫をもたらすためにレシピエントにしばしば投与されるＴ細胞のことを指す。ドナーＴ細胞は、骨髄移植片拒絶反応を阻害するためおよび同種異系生着（ａｌｌｏｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）の成功を増加させるために利用されることが多いが、しかしながら、同じドナーＴ細胞は、宿主抗原に対する同種異系攻撃反応（ａｌｌｏａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を引き起こし得、それはその後、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）をもたらし得る。ある特定の活性化ドナーＴ細胞は、他の活性化Ｔ細胞よりも高いまたは低いＧｖＨＤ反応を引き起こし得る。ドナーＴ細胞は、レシピエントの腫瘍細胞に対しても反応性であり得、有益な移植片対腫瘍効果を引き起こす。

【0099】

機能保存的バリアント」は、タンパク質または酵素の全体的な立体構造および機能を変化させずに所与のアミノ酸残基が変更されたタンパク質または酵素であり、それには、あるアミノ酸を、極性または非極性の性質、サイズ、形状および電荷を含む類似の特性を有するアミノ酸で置き換えることが含まれるが、これらに限定されない。一般に公知の遺伝的にコードされないアミノ酸の多くに対する保存的アミノ酸置換は、当該分野で周知である。他のコードされないアミノ酸に対する保存的置換は、遺伝的にコードされるアミノ酸の特性と比べたときの物理的特性に基づいて決定され得る。

【0100】

保存アミノ酸と示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素において異なり得、機能が類似した任意の２つのタンパク質の間のタンパク質配列またはアミノ酸配列の類似性のパーセントは、変動し得、アラインメントスキームに従って決定されるとき、例えば、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％であり得る。本明細書中で言及されるとき、「配列類似性」は、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列が関係する程度を意味する。２つの配列間の類似性の程度は、配列同一性および／または保存のパーセントに基づき得る。本明細書中の「配列同一性」は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が不変である程度を意味する。「配列アラインメント」は、類似性の程度を評価する目的のために最大の同一性（およびアミノ酸配列の場合、保存）レベルを達成するように２つ以上の配列を並べるプロセスを意味する。配列をアラインメントするためおよび類似性／同一性を評価するための数多くの方法（例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくＣｌｕｓｔｅｒ法ならびにＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡなど）が、当該分野で公知である。これらのプログラムのうちのいずれかを使用するとき、好ましい設定は、最も高い配列類似性をもたらす設定である。

【0101】

間葉系ストローマ細胞：本明細書中で使用される用語「間葉系ストローマ細胞」または「骨髄由来間葉系ストローマ細胞」は、エキソビボ、インビトロおよびインビボにおいて脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨芽細胞に分化し得、標準的な培養条件においてプラスチック培養皿に接着する単核骨髄細胞の一部としてさらに定義され得る、多分化能幹細胞のことを指し、造血系マーカーが陰性であり、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５が陽性である。

【0102】

胚性幹細胞：本明細書中で使用される用語「胚性幹細胞」は、５０〜１５０個の細胞の初期胚である、胚盤胞の内部細胞塊に由来する、多能性幹細胞のことを指す。胚性幹細胞は、それ自体を無限に再生する能力、ならびに３つの一次胚葉である外胚葉、内胚葉および中胚葉のすべての誘導体に分化する能力を特徴とする。多能性細胞は、すべての細胞型を生み出せるが、多分化能細胞（例えば、成体幹細胞）は、限られた数の細胞型しか生み出せないという点で、多能性は、多分化能（ｍｕｔｉｐｏｔｅｎｔ）と区別される。

【0103】

誘導可能な多能性幹細胞：本明細書中で使用される用語「誘導可能な多能性幹細胞」または「人工多能性幹細胞」は、胚性幹細胞のような、すべての細胞型ではないが多くの細胞型に分化できる細胞を作製するように、遺伝的操作（例えば、後に多能性を活性化する遺伝子の発現）、生物学的操作（例えば、ウイルスまたはレトロウイルスによる処理）および／または化学的操作（例えば、小分子、ペプチドなど）によって「再プログラムされた」または誘導された、成体の細胞または分化細胞のことを指す。誘導可能な多能性幹細胞は、それらが、中間に分化したまたは最終分化した状況（例えば、皮膚細胞、骨細胞、線維芽細胞など）を達成し、次いで、脱分化するように誘導され、それにより、多分化能細胞または多能性細胞を作製する能力の一部または全部を回復するという点で胚性幹細胞と区別される。

【0104】

ＣＤ３４＋細胞：本明細書中で使用される用語「ＣＤ３４＋細胞」は、その細胞表面上にＣＤ３４タンパク質を発現している細胞のことを指す。本明細書中で使用される「ＣＤ３４」は、細胞間接着因子としてしばしば働き、リンパ節にＴ細胞が入ることに関与し、「分化クラスター」遺伝子ファミリーのメンバーである、細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）のことを指す。ＣＤ３４は、骨髄、細胞外マトリックスに、またはストローマ細胞に直接、幹細胞が付着することも媒介し得る。ＣＤ３４＋細胞は、臍帯および骨髄において造血細胞として、間葉系幹細胞のサブセット、内皮前駆細胞、リンパ管（胸膜のリンパ管を除く）ではなく血管の内皮細胞、マスト細胞、皮膚の真皮の間質におよび付属器周辺における樹状細胞の部分集団（ＸＩＩＩａ因子が陰性である）、ならびにある特定の軟部組織の腫瘍（例えば、胞状軟部肉腫、プレＢ急性リンパ芽球性白血病（Ｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ＡＭＬ−Ｍ７、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、巨細胞線維芽腫、顆粒球性肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、髄膜（ｍｅｎｇｉｎｇｅａｌ）血管周囲細胞腫、髄膜腫、神経線維腫、神経鞘腫および甲状腺乳頭癌）における細胞に見られることが多い。

【0105】

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、標的化された様式（ｍａｎｏｒ）で、腫瘍に浸潤し、腫瘍細胞を殺傷する、様々なレセプターを有するＴ細胞のことを指す。本願の方法を使用してＴＩＬの活性を制御することは、腫瘍細胞の排除のより直接的なコントロールを可能にし得る。

【0106】

遺伝子発現ベクター：本文書全体を通じて交換可能に使用され得る、本明細書中で使用される用語「遺伝子発現ベクター」、「核酸発現ベクター」または「発現ベクター」は、宿主細胞内で複製され得、単数または複数の遺伝子を宿主細胞に導入するために利用され得る、核酸分子（例えば、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、人工染色体、酵母人工染色体（例えば、ＹＡＣ））のことを広く指す。発現ベクター上に導入された遺伝子は、内在性遺伝子（例えば、宿主細胞または宿主生物に通常見られる遺伝子）または異種遺伝子（例えば、ゲノムに通常見られない遺伝子または宿主細胞もしくは宿主生物の染色体外核酸上の遺伝子）であり得る。発現ベクターによって細胞に導入される遺伝子は、天然の遺伝子、または改変されたもしくは操作された遺伝子であり得る。遺伝子発現ベクターは、発現ベクター上に保有された単数または複数の遺伝子の効率的な転写を促進し得るかまたは増強し得る、エンハンサー配列、プロモーター領域および／またはターミネーター配列として時折、機能し得る、５’および３’非翻訳制御配列を含むようにも操作され得る。遺伝子発現ベクターは時折、特定の細胞型、細胞位置または組織タイプにおける複製および／または発現の機能性（例えば、転写および翻訳）について操作される。発現ベクターは時折、宿主細胞またはレシピエント細胞においてベクターを維持するための選択マーカーを含む。

【0107】

発生的に制御されるプロモーター：本明細書中で使用される用語「発生的に制御されるプロモーター」は、発生のプログラムまたは経路によってコントロールされるか、開始されるか、または影響されるある特定の条件下で発現される遺伝子を転写するＲＮＡポリメラーゼに対する最初の結合部位として作用するプロモーターのことを指す。発生的に制御されるプロモーターは、発生のプログラムまたは経路の一部である遺伝子の転写に影響し得る転写のアクチベーターまたはリプレッサーに結合するためのさらなる調節領域をプロモーター領域にまたはプロモーター領域付近に有することが多い。発生的に制御されるプロモーターは、時折、遺伝子産物が細胞の発生分化に影響する遺伝子の転写に関与する。

【0108】

発生的に分化した細胞：本明細書中で使用される用語「発生的に分化した細胞」は、発生的に制御される特定の遺伝子の発現を伴うことが多く、特定の機能を果たすために、その細胞がそれほど特殊化されていない形態からより特殊化された形態に発展するプロセスを経た細胞のことを指す。発生的に分化した細胞の非限定的な例は、肝臓細胞、肺細胞、皮膚細胞、神経細胞、血液細胞などである。発生分化の変化は、通常、遺伝子発現の変化（例えば、遺伝子発現のパターンの変化）、遺伝子の再編成（例えば、サイレンシングされるかまたは発現される遺伝子をそれぞれ隠すかまたは曝すリモデリングまたはクロマチン）を含み、時々、ＤＮＡ配列の変化（例えば、免疫多様性の分化）を含む。発生中の細胞分化は、遺伝子制御ネットワークの結果として理解され得る。制御遺伝子およびそのシス制御のモジュールは、インプット（例えば、発生の経路またはプログラムの上流で発現されるタンパク質）を受け取り、そのネットワークの別の箇所でアウトプットをもたらす、遺伝子制御ネットワークにおける分岐点（ｎｏｄｅ）である（例えば、発現された遺伝子産物は、その発生の経路またはプログラムの下流の他の遺伝子に対して作用する）。

【0109】

用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖に起因する疾患として定義される。例示的な過剰増殖性疾患としては、癌または自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。他の過剰増殖性疾患としては、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症または炎症性腸疾患が挙げられ得る。

【0110】

いくつかの実施形態において、核酸は、ウイルスベクター内に含まれている。ある特定の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、細胞は、エキソビボにおいてウイルスベクターと接触され、いくつかの実施形態において、細胞は、インビボにおいてウイルスベクターと接触されることが理解される。

【0111】

いくつかの実施形態において、細胞は、樹状細胞、例えば、哺乳動物の樹状細胞である。しばしば、その細胞は、ヒト樹状細胞である。

【0112】

ある特定の実施形態において、細胞は、抗原とも接触される。しばしば、細胞は、エキソビボにおいて抗原と接触される。時折、細胞は、インビボにおいて抗原と接触される。いくつかの実施形態において、細胞は、被験体内に存在し、免疫応答が、抗原に対してもたらされる。時折、免疫応答は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答である。時折、免疫応答は、腫瘍抗原に対してもたらされる。ある特定の実施形態において、細胞は、アジュバントの添加なしに活性化される。

【0113】

いくつかの実施形態において、細胞は、エキソビボにおいて核酸を形質導入され、皮内投与によって被験体に投与される。いくつかの実施形態において、細胞は、エキソビボにおいて核酸を形質導入され、皮下投与によって被験体に投与される。時折、その細胞は、エキソビボにおいて核酸を形質導入される。時折、その細胞は、インビボにおいて核酸を形質導入される。

【0114】

ＭｙＤ８８とは、ミエロイド分化一次応答遺伝子８８、例えば、ｎｃｂｉ遺伝子ＩＤ４６１５として引用されるヒトバージョンであるがこれに限定されないもののことを意味する。「切断型」とは、そのタンパク質が、完全長ではなく、例えば、あるドメインを欠くことがあることを意味する。例えば、切断型ＭｙＤ８８は、完全長ではなく、例えば、Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１レセプタードメイン（ＴＩＲドメイン）を欠損していることがある。切断型ＭｙＤ８８の１つの例は、本明細書中でＭｙＤ８８Ｌとして示され、配列番号４および５としても提示される。配列番号７１および７２は、サブクローニング中に付加されたリンカーを含む。「切断型ＭｙＤ８８」をコードする核酸配列とは、切断型ＭｙＤ８８ペプチドをコードする核酸配列のことを意味し、この用語は、リンカーによってコードされる任意のアミノ酸をはじめとした、クローニングのアーチファクトとして付加された任意のアミノ酸をコードする一部を含む核酸配列のことも指し得る。誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０ポリペプチドは、例えば、配列番号４８または４９において提供されるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有する、完全長のＭｙＤ８８ポリペプチドも含み得る。ＭｙＤ８８または本願の他のポリペプチドをコードする核酸配列は、例えば、コドン最適化され得、改変された細胞において好ましいコドンまたは本明細書中に提供されるようなゆらいだコドンを含む。

【0115】

本明細書中の方法では、上記ペプチドの誘導可能なＣＤ４０の一部は、誘導可能なＭｙＤ８８または切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドの一部の上流または下流に配置され得る。また、誘導可能なＣＤ４０の一部および誘導可能なＭｙＤ８８または切断型ＭｙＤ８８アダプタータンパク質の一部は、同じベクターにおけるシスでまたは別個のベクターにおけるトランスで細胞にトランスフェクトされ得るかまたは形質導入され得る。

【0116】

いくつかの実施形態における細胞は、時折、エキソビボにおいて抗原と接触される。ある特定の実施形態において、細胞は、被験体内に存在し、免疫応答、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答が、その抗原に対してもたらされる。ある特定の実施形態において、免疫応答が、腫瘍抗原（例えば、ＰＳＭＡ）に対してもたらされる。いくつかの実施形態において、核酸は、エキソビボにおいて調製され、例えば、皮内投与または皮下投与によって、被験体に投与される。時折、細胞は、エキソビボまたはインビボにおいて核酸を形質導入されるかまたはトランスフェクトされる。

【0117】

いくつかの実施形態において、核酸は、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。あるいは、核酸は、キメラタンパク質のタンパク質コード領域を含む、エキソビボにおいて転写されるＲＮＡを含む。

【0118】

固形腫瘍の「腫瘍サイズを減少させる」または「腫瘍の成長を阻害する」とは、標準的なガイドライン、例えば、固形がんの治療効果判定のための新ガイドライン（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ）（ＲＥＣＩＳＴ）基準に従う、処置に対する応答または疾患の安定化のことを意味する。例えば、これは、固形腫瘍の直径の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の減少、または腫瘍、循環腫瘍細胞もしくは腫瘍マーカーの数の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の減少を含み得る。腫瘍のサイズは、例えば、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、例えば、ＣＴ−ＭＲＩ、胸部Ｘ線（肺の腫瘍の場合）または分子イメージング、例えば、ＰＥＴスキャン、例えば、阻害剤がＴＲＯＦＥＸ^ＴＭ／ＭＩＰ−１０７２／１０９５である場合、例えば、ヨウ素１２３で標識されたＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡリガンドを投与した後のＰＥＴスキャン、または分子イメージング、例えば、ＳＰＥＣＴ、またはＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡ抗体、例えば、１１１−イリジウムで標識されたＰＳＭＡ抗体であるカプロマブ（ｃａｐｒｏｍａｄ）ペンデチド（ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）（Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ）を用いるＰＥＴスキャンをはじめとした任意の方法によって解析され得る。

【0119】

「腫瘍の血管新生を減少させるか、遅延させるかまたは阻害する」とは、処置前の腫瘍の血管新生の量と比べたときの、腫瘍の血管新生の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の減少または新しい血管構造の出現の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の減少のことを意味する。その減少は、１つの腫瘍について言及していることもあるし、１つより多い腫瘍における血管新生の合計または平均でもあり得る。腫瘍の血管新生を測定する方法としては、例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲＩ、例えば、ＣＴ−ＭＲＩ、または分子イメージング、例えば、ＳＰＥＣＴもしくはＰＥＴスキャン、例えば、阻害剤がＴＲＯＦＥＸ^ＴＭ／ＭＩＰ−１０７２／１０９５である場合、例えば、ヨウ素１２３で標識されたＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡリガンドの投与後のＰＥＴスキャン、またはＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡ抗体、例えば、１１１−イリジウムで標識されたＰＳＭＡ抗体であるカプロマブペンデチド（Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ）を用いるＰＥＴスキャンが挙げられる。

【0120】

例えば、腫瘍が、前立腺に存在するものであるか、または前立腺における腫瘍に由来するかもしくは前立腺における腫瘍から転移したものであるか、またはＰＳＡを産生するものであるとき、その腫瘍は、前立腺がんの腫瘍と分類される。例えば、腫瘍が、被験体の前立腺における腫瘍と同じまたは同様の染色体切断点を有すると判定されるとき、その腫瘍は、前立腺における腫瘍から転移したものである。

【0121】

Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．らに対して２００８年６月２９日に発行された米国特許第７，４０４，９５０号および２０１４年４月８日に発行されたＳｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．らによる米国特許第８，６９１，２１０号は、それらの全体が参照により援用される。２０１０年１０月２６日に出願されたＳｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．らによる米国特許出願１２／４４５，９３９；２００９年９月２１日に出願されたＳｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．らによる１２／５６３，９９１；２０１１年４月１４日に出願されたＳｌａｗｉｎ，Ｋ．らによる１３／０８７，３２９；２０１３年２月８日に出願されたＳｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．らによる１３／７６３，５９１；２００９年９月２１日に出願され、ＷＯ２０１０／０３３９４９として２０１０年３月２８日に公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５７７３８；２０１１年４月１４日に出願され、ＷＯ２０１１／１３０５６６として２０１１年１０月２０日に公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３２５７２もまた、それらの全体が参照により援用される。

【0122】

前立腺がん
米国では、前立腺がんは、男性において最も一般的な固形悪性腫瘍である。２００８年の前立腺がんの新しい症例は推定１８６，３２０例であり、２８，６６０人が死亡すると予想された。Ｊｅｍａｌ Ａら、Ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２００８．ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ．５８：７１−９６，２００８．一次療法の後にＰＳＡ−進行を経験する患者のおよそ７０％が、その疾患の経過中の任意の時点において転移する。Ｇｉｔｔｅｓ ＲＦ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３２４：２３６−４５，１９９１．アンドロゲン枯渇療法（ＡＤＴ）は、転移性前立腺がんに対する標準的な治療法であり、８０〜８５％の患者において、一時的な腫瘍のコントロールまたは後退を達成する。Ｃｒａｗｆｏｒｄ ＥＤら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３２１：４１９−２４，１９８９；Ｓｃｈｅｌｌｈａｍｍｅｒ ＰＦら、Ｊ Ｕｒｏｌ．１５７：１７３１−５，１９９７；Ｓｃｈｅｒ ＨＩ ａｎｄ Ｋｅｌｌｙ ＷＫ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１１：１５６６−７２，１９９３；Ｓｍａｌｌ ＥＪ ａｎｄ Ｓｒｉｎｉｖａｓ Ｓ，Ｃａｎｃｅｒ．７６：１４２８−３４，１９９５．
ホルモン療法に対する奏功期間ならびにホルモン療法開始後の生存時間は、いくつかの因子に依存することが示されており、その因子としては、原発性腫瘍のグリーソン和（Ｇｌｅａｓｏｎ Ｓｕｍ）、ＡＤＴ開始後に検出不可能な最下点ＰＳＡを達成する能力、およびＡＤＴ開始前のＰＳＡ倍加時間が挙げられる。ホルモン療法にもかかわらず、転移性前立腺がんを有する実質的にすべての患者が、最終的には進行性疾患を発症する。Ｋｅｌｌｙ ＷＫ ａｎｄ Ｓｌｏｖｉｎ ＳＦ，Ｃｕｒｒ Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ．２：３９４−４０１，２０００；Ｓｃｈｅｒ ＨＩら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８８：１６２３−３４，１９９６；Ｓｍａｌｌ ＥＪ ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｚａｎｇ ＮＪ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１５：３８２−８，１９９７．原発性腫瘍のグリーソン和、すなわちグリーソンスコアを用いることにより、その腫瘍の微視的評価に基づいて男性の前立腺がんのレベルがグレーディングされる。より高いグリーソンスコアは、そのがんが、より高悪性度であり、広がる可能性がより高いので、より不良な予後を有するがんであることを意味する。このグレーディングシステムの例は、Ｇｌｅａｓｏｎ ＤＦ．，Ｔｈｅ Ｖｅｔｅｒａｎ’ｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ：ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｇｒａｄｉｎｇ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔａｇｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｉｎ Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ Ｍ（ｅｄ．）Ｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ．Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９７７；１７１−１９８において論じられている。

【0123】

ＡＤＴを開始した前立腺がんを有するほとんどの患者は、一次療法（例えば、前立腺全摘除術、近接照射療法、外照射療法、凍結融解壊死治療など）が失敗した後の上昇性のＰＳＡに対して処置される。臨床転移が無い場合、これらの患者は、７〜１１年間の範囲の比較的長い無病期間を経験するが；しかしながら、これらの患者の大部分は、最終的には、去勢レベルの血清テストステロンにもかかわらず上昇性のＰＳＡレベルの再発によって証明されるようなホルモン抵抗性疾患を発症する。これらの患者もまた、予後不良であり、大部分は、９ヶ月以内に臨床転移を発症し、２４ヶ月という生存期間中央値を有する。Ｂｉａｎｃｏ ＦＪら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ：Ａｂｓｔｒａｃｔ ２７８，２００５．用語「前立腺がん」は、種々の形態またはステージを含み、それらには、例えば、転移性、転移性去勢抵抗性、転移性去勢感受性、局所進行性および限局性の前立腺がんが含まれる。

【0124】

抗原提示細胞
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、その表面上に外来抗原を主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子とともにディスプレイすることによって、その外来抗原に対してＴ細胞をプライムし得る細胞である。ＡＰＣには、２つのタイプ、プロフェッショナルおよび非プロフェッショナルがある。プロフェッショナルＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩ分子とＭＨＣクラスＩＩ分子の両方を発現し、非プロフェッショナルＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩＩ分子を恒常的に発現しない。特定の実施形態では、プロフェッショナルＡＰＣが、本明細書中の方法において使用される。プロフェッショナルＡＰＣとしては、例えば、Ｂ細胞、マクロファージおよび樹状細胞が挙げられる。

【0125】

活性化された細胞に関連する１つまたはそれを超える活性が、観察され得るおよび／または測定され得るとき、その細胞は、「活性化されている」。例えば、本明細書中に提示される発現ベクターと接触した後、発現ベクターと接触していないかまたはネガティブコントロールベクターと接触した細胞と比べて、発現ベクターと接触した細胞において、活性化に関連する活性が測定され得るとき、その細胞は、活性化されている。１つの例において、活性の上昇は、接触していない細胞またはネガティブコントロールと接触した細胞の活性と比べて２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０倍高いレベルまたはそれを超えるレベルであり得る。例えば、以下の活性のうちの１つが、発現ベクターと接触した細胞において高まり得る：その細胞上の共刺激分子の発現、細胞におけるＮＦ−カッパーＢの核移行、ＤＣ成熟マーカーの発現、例えば、ｔｏｌｌ様レセプターの発現またはＣＣＲ７の発現、特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球応答、例えば、腫瘍細胞に対する特異的な溶解活性、またはサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）もしくはケモカインの発現。

【0126】

細胞を活性化するかまたは免疫応答を「高める」組成物の量は、その組成物を添加せずに測定された同じ免疫応答と比べたとき、その組成物の添加に伴って、多少なりとも、より大きいかまたは増強するかまたは逸脱する免疫応答が観察される量のことを指す。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞の溶解活性は、例えば、５１Ｃｒ放出アッセイを用いて、組成物有りおよび無しで測定され得る。ＣＴＬの溶解活性が組成物無しでのＣＴＬの溶解活性と比べて上昇する物質の量は、その抗原に対して動物の免疫応答を高めるのに十分な量であると言われる。例えば、免疫応答は、少なくとも約２倍、または例えば約３倍もしくはそれを超えて、高められ得る。分泌されるサイトカインの量もまた変化し得る。

【0127】

高められた免疫応答は、能動免疫応答または受動免疫応答であり得る。あるいは、その応答は、細胞を被験体（例えば、患者）から得て、次いで、その細胞に、本明細書中に提示される発現ベクターまたは構築物を含む組成物を形質導入するかまたはトランスフェクトする、適応免疫療法アプローチの一部であり得る。それらの細胞は、例えば、被験体の血液または被験体の骨髄から得られることがある。次いで、それらの細胞は、同じもしくは異なる動物、または同じもしくは異なる被験体（例えば、同じまたは異なるドナー）に投与され得る。ある特定の実施形態において、被験体（例えば、患者）は、がん（例えば、前立腺がん）を有するかもしくは有していると疑われるか、または感染症を有するかもしくは有していると疑われる。他の実施形態において、免疫応答を高める方法は、公知のがん治療または感染症を処置する任意の公知の治療とともに実施される。

【0128】

樹状細胞
自然免疫系は、微生物に存在する保存された分子パターンを認識するために、一連の生殖細胞系列によってコードされるレセプターを用いる。これらの分子パターンは、微生物のある特定の構成物に存在し、その構成物としては、リポ多糖類、ペプチドグリカン、リポテイコ酸、ホスファチジルコリン、リポタンパク質を含む細菌特異的タンパク質、細菌のＤＮＡ、ウイルスの一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、非メチル化ＣｐＧ−ＤＮＡ、マンナンならびに種々の他の細菌および真菌細胞壁の構成要素が挙げられる。そのような分子パターンは、植物アルカロイドなどの他の分子にも存在し得る。自然免疫の認識のこれらの標的は、微生物が産生するのであって、感染した宿主生物が産生するのではないので、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる（Ｊａｎｅｗａｙら（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５４：１−１３；Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖら、Ｎａｔｕｒｅ，３８８：３９４−３９７，１９９７）。

【0129】

ＰＡＭＰを認識する自然免疫系のレセプターは、パターン認識レセプター（ＰＲＲ）と呼ばれる（Ｊａｎｅｗａｙら、１９８９；Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖら、１９９７）。これらのレセプターは、構造が異なり、いくつかの異なるタンパク質ファミリーに属する。これらのレセプターのいくつかは、直接ＰＡＭＰを認識する（例えば、ＣＤ１４、ＤＥＣ２０５、コレクチン）が、その他のもの（例えば、補体レセプター）は、ＰＡＭＰ認識によって産生された生成物を認識する。これらのレセプターファミリーのメンバーは、一般に、３つのタイプ：１）血漿中に循環している体液性レセプター（ｈｕｍｏｒａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）；２）免疫細胞表面上に発現されるエンドサイトーシスレセプター、および３）細胞表面上または細胞内に発現され得るシグナル伝達レセプターに分けることができる（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖら、１９９７；Ｆｅａｒｏｎら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：５０−３）。

【0130】

細胞性ＰＲＲは、適応免疫においてプロフェッショナル細胞（ＡＰＣ）として機能する細胞を含む、自然免疫系のエフェクター細胞上に発現される。そのようなエフェクター細胞としては、マクロファージ、樹状細胞、Ｂリンパ球および表面上皮が挙げられるが、これらに限定されない。この発現プロファイルのおかげで、ＰＲＲは、生得的なエフェクター機構を直接誘導することが可能になり、また、下記で論じられるように、一連の内因性シグナル（例えば、炎症性サイトカインおよびケモカイン）の発現を誘導することによって、宿主生物に感染病原体の存在を知らせることが可能になる。この後者の機能は、侵入者と戦うエフェクターの力の効率的な動員を可能にする。

【0131】

樹状細胞（ＤＣ）の主要な機能は、末梢組織において抗原を獲得すること、二次リンパ組織に移動すること、および免疫系のエフェクターＴ細胞に抗原を提示することである（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．ら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０００，．１８：ｐ．７６７−８１１；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．，＆ Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９２，２４５−２５２（１９９８））。ＤＣは、免疫応答において決定的な役割を果たすとき、成熟変化を起こして、各環境に対して適切な機能を果たすことが可能になる（Ｔｅｒｍｅｅｒ，Ｃ．Ｃ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０００，Ａｕｇ．１５．１６５：ｐ．１８６３−７０）。ＤＣの成熟中、抗原取り込みの潜在能力は失われ、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびクラスＩＩ分子の表面密度が、１０〜１００倍高まり、ＣＤ４０分子、共刺激分子および接着分子の発現もまた大幅に増加する（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，Ａ．ａｎｄ Ｆ．Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００．２９０：ｐ．９２−９６）。さらに、他の遺伝子変化によって、ＤＣが、流入領域リンパ節のＴ細胞が豊富な副皮質にホーミングすること、およびナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞を引きつけ、抗原特異的ナイーブＴＨ０細胞をプライムするＴ細胞ケモカインを発現することが可能になる（Ａｄｅｍａ，Ｇ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９７，Ｊｕｎ．１２．３８７：ｐ．７１３−７）。このステージにおいて、成熟ＤＣは、ＭＨＣ ＩＩ分子を介してＣＤ４^＋Ｔヘルパー細胞に抗原を提示して、Ｔ細胞ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）のアップレギュレーションを誘導し、その後、そのリガンドは、ＤＣ ＣＤ４０レセプターに会合する。このＤＣ：Ｔ細胞の相互作用は、ＭＨＣ ＩおよびＩＩ分子、接着分子、共刺激分子（例えば、Ｂ７．１、Ｂ７．２）、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２）ならびに抗アポトーシスタンパク質（例えば、Ｂｃｌ−２）のさらなるアップレギュレーションを含む、強力なＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の惹起にとって重大なさらなるＤＣ分子の迅速な発現を誘導する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９７，Ｎｏｖ．１３．３９０：ｐ．１７５−９；Ｏｈｓｈｉｍａ，Ｙ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９７，Ｏｃｔ．１５．１５９：ｐ．３８３８−４８；Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｆ．ら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９８，Ｓｅｐ．２８：ｐ．２７６０−９；Ｃａｕｘ，Ｃ．Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．１９９７，４１７：２１−５；）。ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、リンパ節を出て、循環に再び入り、元の炎症部位にホーミングして、病原体または悪性細胞を破壊する。

【0132】

ＤＣの機能に影響する鍵となるパラメータの１つは、ＤＣに対して「オンスイッチ」として働くＣＤ４０レセプターである（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，Ｊｕｎ．４．３９３：ｐ．４７８−８０；Ｃｌａｒｋｅ，Ｓ．Ｒ．，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ，２０００，Ｍａｙ．６７：ｐ．６０７−１４；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｎ．Ｃ．ら、Ｎａｔ Ｍｅｄ，１９９９，Ａｐｒ．５：ｐ．４０５−１１；Ｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｐ．，Ｄ．Ｒ．Ｆ，ａｎｄ Ｐ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，Ｊｕｎ．４．３９３：ｐ．４７４−８；Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，Ｊｕｎ．４．３９３：ｐ．４８０−３）。ＣＤ４０は、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーの４８ｋＤａ膜貫通メンバーである（ＭｃＷｈｉｒｔｅｒ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９９，Ｊｕｌ．２０．９６：ｐ．８４０８−１３）。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用は、ＴＮＦレセプター関連因子（ＴＲＡＦ）が関与するシグナル伝達カスケードを惹起するために必要なＣＤ４０の三量体化を誘導する（Ｎｉ，Ｃ．ら、ＰＮＡＳ，２０００，９７（１９）：１０３９５−１０３９９；Ｐｕｌｌｅｎ，Ｓ．Ｓ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９９，Ｍａｙ １４．２７４：ｐ．１４２４６−５４）。ＣＤ４０は、これらのシグナル伝達分子を用いて、ＮＦ−カッパーＢ、ＡＰ−１、ＳＴＡＴ３およびｐ３８ＭＡＰＫをはじめとした、ＤＣにおけるいくつかの転写因子を活性化する（ＭｃＷｈｉｒｔｅｒ，Ｓ．Ｍ．ら、１９９９）。

【0133】

抗原をプロセシングして提示するユニークな方法ならびに共刺激分子およびサイトカイン分子の高レベル発現の可能性に起因して、樹状細胞（ＤＣ）は、ナイーブＴ細胞をプライミングして活性化するのに有効な細胞（ＡＰＣ）である（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ Ｊら、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．２００３；９８７：１８０−１８７）。この特性のおかげで、いくつかの臨床試験においてワクチン接種に対する細胞プラットフォームとして幅広く使用されており、有望な結果がもたらされている（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ＤＷら、Ｂｌｏｏｄ．２００４；１０４：２２３５−２２４６；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１９９９；１０：２８１−２８７）。しかしながら、がん患者におけるＤＣワクチンの臨床的有効性は、最適以下の活性化、流入領域リンパ節への限定的な遊走およびリンパ節の環境における最適なＴ細胞の活性化の不十分な寿命をはじめとしたいくつかの鍵となる欠点におそらく起因して、不十分である。

【0134】

ＤＣベースのがんワクチンの最適化におけるパラメータは、免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＴ調節性（Ｔｒｅｇ）細胞）とＤＣの相互作用である。これらの相互作用において、ＤＣの成熟状態が、得られるエフェクター機能を決定する際の鍵となる因子である（Ｓｔｅｉｎｍａｎ ＲＭ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；２１：６８５−７１１）。Ｔｒｅｇの拡大を最小限に抑えつつ、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞のプライミングを最大にするためには、ＤＣは、完全に成熟していて、高レベルの共刺激分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６のような）ならびにＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−６のような炎症促進性サイトカインを発現している必要がある。等しく重要なことには、ＤＣは、ワクチン接種部位から流入領域リンパ節に効率的に遊走して、Ｔ細胞の相互作用を惹起できなければならない（Ｖｉｅｗｅｇ Ｊら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２００５；２６：３２９−３４１）。

【0135】

単球由来の未熟なＤＣをエキソビボにおいて成熟させる場合、ＤＣベースの試験の大部分は、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６およびＰＧＥ２を含む標準的な成熟サイトカインカクテル（ＭＣ）を使用してきた。その標準的な成熟カクテル中のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の主な機能は、ＣＣケモカインレセプター７（ＣＣＲ７）をそのリガンドであるＣＣケモカインリガンド１９（ＣＣＬ１９）およびＣＣＬ２１に対して感作することであり、それにより、流入領域リンパ節へのＤＣの遊走能が高まる（Ｓｃａｎｄｅｌｌａ Ｅら、Ｂｌｏｏｄ．２００２；１００：１３５４−１３６１；Ｌｕｆｔ Ｔら、Ｂｌｏｏｄ．２００２；１００：１３６２−１３７２）。しかしながら、ＰＧＥ２は、Ｔ細胞の増殖の抑制（Ｇｏｏｄｗｉｎ ＪＳら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９７７；１４６：１７１９−１７３４；Ｇｏｏｄｗｉｎ ＪＳ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９；２：２６４−２６８）、炎症促進性サイトカイン産生の阻害（例えば、ＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦ−アルファ（Ｋａｌｉｎｓｋｉ Ｐ，Ｂｌｏｏｄ．２００１；９７：３４６６−３４６９；ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｕｗ Ｋｒａａｎ ＴＣら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９５；１８１：７７５−７７９））および主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）ＩＩ表面発現のダウンレギュレーション（Ｓｎｙｄｅｒ ＤＳ，Ｎａｔｕｒｅ．１９８２；２９９：１６３−１６５）をはじめとした、免疫応答の刺激にとって潜在的に有害な数多くの特性を有するとも報告されている。ゆえに、遊走を促進しつつＰＧＥ２を回避し得る成熟プロトコルは、ＤＣベースのワクチンの治療効果を改善する可能性がある。

【0136】

リンパ系組織内のＤＣの刺激促進性の（ｐｒｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）状態を拡大するために、ＣＤ４０シグナル伝達経路の標的化された時間的なコントロールに基づくＤＣの活性化システムが開発された。ＣＤ４０シグナル伝達の大きさと持続時間の両方を増加させることによって、ＤＣの機能が改善された（Ｈａｎｋｓ ＢＡら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００５；１１：１３０−１３７）。これを達成するために、ＣＤ４０の細胞質ドメインを、膜標的化配列とともに合成リガンド結合ドメインに融合するように、ＣＤ４０レセプターが再度操作された。二量体化化学誘導物質（ＣＩＤ）（Ｓｐｅｎｃｅｒ ＤＭら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９３；２６２：１０１９−１０２４）と呼ばれる脂質透過性の二量体化薬物ＡＰ２０１８７（ＡＰ）の投与によって、マウスＤＣにおけるＣＤ４０依存性のシグナル伝達カスケードがインビボにおいて誘導された。この誘導ストラテジーは、インビボにおいて規定の抗原と腫瘍の両方に対する免疫原性を、他の活性化様式で達成されたものを超えて有意に高めた（Ｈａｎｋｓ ＢＡら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００５；１１：１３０−１３７）。

【0137】

パターン認識レセプター（ＰＲＲ）シグナル伝達（その一例は、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）シグナル伝達である）は、ＤＣの成熟および活性化の誘導においても重大な役割を果たし；ヒトＤＣは、複数の異なるＴＬＲを発現する（Ｋａｄｏｗａｋｉ Ｎら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２００１；１９４：８６３−８６９）。１１個の哺乳動物ＴＬＲが、様々な病原体由来の高分子に応答して、適応免疫の惹起ととともに自然免疫反応の活性化に寄与する。リポ多糖（ＬＰＳ）および臨床的に妥当な誘導体であるモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）は、細胞表面ＴＬＲ−４複合体に結合し（Ｋａｄｏｗａｋｉ Ｎら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２００１；１９４：８６３−８６９）、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ｐ３８およびｃ−Ｊｕｎキナーゼ（ＪＮＫ）とともに、結果的に転写因子（例えば、ＮＦ−カッパーＢおよびＩＲＦ３）を誘導する様々なシグナル伝達経路をもたらす（Ａｒｄｅｓｈｎａ ＫＭら、Ｂｌｏｏｄ．２０００；９６：１０３９−１０４６；Ｉｓｍａｉｌｉ Ｊら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２；１６８：９２６−９３２）。このプロセスの間に、ＤＣは、成熟し、ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびタイプＩインターフェロンのような炎症促進性サイトカインを部分的にアップレギュレートする（Ｒｅｓｃｉｇｎｏ Ｍら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９８；１８８：２１７５−２１８０）。ＬＰＳによって誘導される成熟は、インビトロおよびインビボにおいて、ＤＣが抗原特異的Ｔ細胞の応答を刺激する能力を高めると示されている（Ｌａｐｏｉｎｔｅ Ｒら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；３０：３２９１−３２９８）。ＣＤ４０ペプチドをコードする核酸を細胞に形質導入する工程を含む細胞を活性化するための方法は、米国特許第７，４０４，９５０号において論じられており、誘導可能なＣＤ４０ペプチドおよびパターン認識レセプターまたはその経路内の他の下流のタンパク質を含むキメラタンパク質をコードする核酸を細胞にトランスフェクトする工程を含む細胞を活性化するための方法は、２００７年１０月１９日に出願され、ＷＯ２００８／０４９１１３として公開された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８１９６３において論じられている（これらは、参照により本明細書に援用される）。

【0138】

誘導可能なＣＤ４０（ｉＣＤ４０）システムは、ヒト樹状細胞（ＤＣ）に適用されており、ｉＣＤ４０シグナル伝達をパターン認識レセプター（ＰＲＲ）アダプターライゲーションと組み合わせることにより、ヒトＤＣの持続的かつ頑強な活性化を引き起こすことが実証されている（Ｓｐｅｎｃｅｒらの、２００９年９月２１日に出願され、２０１０年３月２５日にＷＯ２０１０／０３３９４９として公開された関連国際出願であり、参照により本明細書に援用されるＵＳＳＮ１２／５６３，９９１）。

【0139】

発現構築物の操作
発現構築物は、共刺激ポリペプチドおよびリガンド結合ドメインをコードし、これらはすべて、作動可能に連結されている。一般に、用語「作動可能に連結された」は、プロモーター配列が第２の配列に機能的に連結されていることを示すと意味され、ここで、そのプロモーター配列は、第２の配列に対応するＤＮＡの転写を開始および媒介する。より詳細には、１つより多いリガンド結合ドメインが、発現構築物において使用される。なおもさらに、その発現構築物は、膜標的化配列を含む。適切な発現構築物は、上記のＦＫＢＰリガンド結合エレメントのいずれかの側に共刺激ポリペプチドエレメントを含み得る。発現構築物は、ベクター、例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドに挿入され得る。提供される方法の工程は、任意の好適な方法を使用して行われ得、これらの方法としては、本明細書中に提示される細胞に核酸を形質導入する方法、形質転換する方法または別途提供する方法が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、切断型ＭｙＤ８８ペプチドは、配列番号４のヌクレオチド配列（ＤＮＡリンカー有りもしくは無しで、または配列番号５のアミノ酸配列を有する）によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域は、配列番号８におけるポリヌクレオチド配列によってコードされる。

【0140】

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、誘導可能なキメラ刺激ポリペプチドおよび異種ポリペプチドをコードし得、それらは、例えば、マーカーポリペプチドであり得、例えば、キメラ抗原レセプターであり得る。その異種ポリペプチド、例えば、キメラ抗原レセプターは、ポリペプチド配列、例えば、２Ａ様リンカーポリペプチドを介して、誘導可能なキメラ刺激分子に連結され得る。

【0141】

ある特定の例では、誘導可能なキメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸は、第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、同じベクター、例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターの中に含められる。この第２のポリペプチドは、例えば、本明細書中で論じられるようなキメラ抗原レセプターポリペプチド、またはマーカーポリペプチドであり得る。これらの例では、その構築物は、２Ａポリペプチドによって連結された２つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸に作動可能に連結された１つのプロモーターを有するようにデザインされ得る。この例では、第１および第２のポリペプチドは、翻訳中に分断されており、キメラ刺激分子ポリペプチドおよび第２のポリペプチドが生じる。他の例では、これらの２つのポリペプチドは、同じベクターから別々に発現され得、ここで、それらのポリペプチドのうちの１つをコードするポリヌクレオチドを含む各核酸が、別個のプロモーターに作動可能に連結されている。なおも他の例では、１つのプロモーターが、２つの核酸に作動可能に連結され得、２つの別個のＲＮＡ転写物、ゆえに２つのポリペプチドの産生が指示される。ゆえに、本明細書中で論じられる発現構築物は、少なくとも１つまたは少なくとも２つのプロモーターを含み得る。

【0142】

発現構築物は、マーカーポリペプチドをさらに含み得る。ある特定の実施形態において、マーカーポリペプチドは、誘導可能なキメラシグナル伝達分子に連結される。例えば、マーカーポリペプチドは、ポリペプチド配列、例えば、切断可能な２Ａ様配列を介して誘導可能なキメラシグナル伝達分子に連結され得る。マーカーポリペプチドは、例えば、ＣＤ１９、ΔＣＤ１９であり得るか、または例えば誘導可能なキメラシグナル伝達分子の活性に影響しないように選択される異種タンパク質であり得る。

【0143】

２Ａ様配列または「切断可能な」２Ａ配列は、例えば、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａを含む、例えば、多くの異なるウイルスに由来する。これらの配列は、時折、「ペプチドスキッピング配列」としても知られる。このタイプの配列が、分断されるように意図された２つのペプチドの間のシストロン内に配置されるとき、リボソームは、ペプチド結合をスキップするとみられ、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａの配列の場合、Ｇｌｙアミノ酸とＰｒｏアミノ酸との間の結合が省略される。これにより、２つのポリペプチド、この場合、カスパーゼ−９ポリペプチドおよびマーカーポリペプチドが残される。この配列が使用されるとき、２Ａ配列の５’側でコードされるペプチドは、カルボキシ末端において、Ｇｌｙ残基および２Ａ配列内の任意の上流を含むさらなるアミノ酸で終わることがある。２Ａ配列の３’側でコードされるペプチドは、アミノ末端において、Ｐｒｏ残基および２Ａ配列内の任意の下流を含むさらなるアミノ酸で終わることがある。「２Ａ」または「２Ａ様」配列は、ペプチド結合のスキッピングを引き起こし得る大きなファミリーのペプチドの一部である（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ＭＬ ２００１，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０１３−２５）。様々な２Ａ配列が、特徴付けられており（例えば、Ｆ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ）、それらは、本願のポリペプチドにおいて使用され得る２Ａ様配列の例である。

【0144】

共刺激ポリペプチド
共刺激ポリペプチド分子は、細胞の生存および増殖に関与するシグナル伝達経路の活性化によって細胞媒介性の免疫応答を増幅することができる。企図される共刺激タンパク質としては、例えば、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバー（すなわち、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ）およびＣＤ２８ファミリーのメンバー（ＣＤ２８、ＩＣＯＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。共刺激タンパク質には、例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０およびＣＤ３ゼータ鎖、または例えばそれらの細胞質領域が含まれ得る。２つ以上の共刺激ポリペプチドまたは共刺激ポリペプチドの細胞質領域が、本明細書中で論じられる誘導可能なキメラシグナル伝達分子において使用され得る。例えば、誘導可能なＣＳＭは、ＣＤ２８細胞質ポリペプチドおよび４−１ＢＢ細胞質ポリペプチドを含み得る。または、例えば、誘導可能なＣＳＭは、ＣＤ２８細胞質ポリペプチドおよびＯＸ４０細胞質ポリペプチドを含み得る。または、例えば、誘導可能なＣＳＭは、ＣＤ３ゼータドメインポリペプチドをさらに含み得る。

【0145】

共刺激ポリペプチドには、ＮＦ−カッパーＢ経路、Ａｋｔ経路および／またはｐ３８経路を活性化する任意の分子またはポリペプチドが含まれる。細胞活性化システムは、１つ以上のリガンド結合ドメイン（すなわち、小分子結合ドメイン）に融合された組換えシグナル伝達分子の利用に基づき、ここで、共刺激ポリペプチドは、オリゴマー化をもたらすリガンド（すなわち、脂質透過性の有機二量体化薬物）によって活性化されるおよび／または制御される。共刺激ポリペプチドの架橋またはオリゴマー化のために使用され得る他のシステムは、抗体、天然のリガンドおよび／または人工の交差反応リガンドもしくは合成リガンドを含む。なおもさらに、企図される別の二量体化のシステムは、クーママイシン／ＤＮＡジャイレースＢシステムを含む。

【0146】

使用され得る共刺激ポリペプチドは、ＮＦ−カッパーＢおよび他の可変性のシグナル伝達カスケード、例えば、ｐ３８経路および／またはＡｋｔ経路を活性化するポリペプチドを含む。そのような共刺激ポリペプチドとしては、ＣＤ２８ファミリーメンバー（例えば、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ）、ＴＮＦレセプター（すなわち、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0147】

パターン認識レセプターとしては、エンドサイトーシスパターン認識レセプター（すなわち、マンノースレセプター、スカベンジャーレセプター（すなわち、Ｍａｃ−１、ＬＲＰ、ペプチドグリカン、テイコ酸（ｔｅｃｈｏｉｃ ａｃｉｄｓ）、トキシン、ＣＤ１１ｃ／ＣＲ４））；外部シグナルパターン認識レセプター（Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０）、ペプチドグリカン認識タンパク質（ＰＧＲＰは、細菌のペプチドグリカンおよびＣＤ１４に結合する）；内部シグナルパターン認識レセプター（すなわち、ＮＯＤレセプター１および２）、ＲＩＧ１およびＰＲＲが挙げられるが、これらに限定されない。本方法および組成物に適したパターン認識レセプターには、例えば、Ｗｅｒｔｓ Ｃ．ら、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２００６）１３：７９８−８１５；Ｍｅｙｌａｎ，Ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（２００６）４４２：３９−４４；およびＳｔｒｏｂｅｒ，Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００６）６：９−２０において論じられているものも含まれる。企図される共刺激タンパク質には、例えば、ＣＤ４０およびＭｙＤ８８ポリペプチド、ならびに本明細書中で論じられるキメラＣＤ４０およびＭｙＤ８８ポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態において、キメラシグナル伝達分子は、ＣＤ４０細胞質領域ポリペプチドおよび切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドを含む。ＣＤ４０細胞質領域ポリペプチドおよび切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドを含むポリペプチドは、２００９年９月２１日に出願され、ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ ＡＮ ＩＭＭＵＮＥ ＲＥＳＰＯＮＳＥ ＢＹ ＩＮＤＵＣＩＮＧ ＣＤ４０ ＡＮＤ ＰＡＴＴＥＲＮ ＲＥＣＯＧＮＩＴＩＯＮ ＲＥＣＥＰＴＯＲ ＡＤＡＰＴＥＲＳという標題の米国特許出願番号１２／５６３，９９１（その全体が参照により本明細書に援用される）において論じられている。

【0148】

特定の実施形態において、共刺激ポリペプチド分子は、ＣＤ４０である。ＣＤ４０分子は、（１）ストリンジェントな条件下において、公知のＣＤ４０遺伝子の配列を有する核酸にハイブリダイズし、（２）ＣＤ４０ポリペプチドをコードする、核酸分子を含む。ＣＤ４０ポリペプチドは、ある特定の例では、細胞外ドメインを欠くことがある。ＣＤ４０ポリペプチドをコードする例示的なポリヌクレオチド配列としては、配列番号１および他の種に由来するＣＤ４０アイソフォームが挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ４０の他の正常なバリアントまたは変異体バリアントが、本方法および組成物において使用され得ることが企図される。したがって、ＣＤ４０領域は、１つまたはそれを超えるアミノ酸の置換、欠失および／または挿入によって天然の配列とは異なるアミノ酸配列を有し得る。例えば、１つまたはそれを超えるＴＮＦレセプター関連因子（ＴＲＡＦ）結合領域が、排除され得るかまたは効果的に排除され得る（例えば、ＣＤ４０アミノ酸配列は、ＴＲＡＦタンパク質が、天然のＣＤ４０配列に結合しないかまたは天然のＣＤ４０配列に結合するときよりも低親和性で結合するように、欠失されるかまたは変更される）。特定の実施形態において、ＴＲＡＦ３結合領域は、それが排除されるかまたは効果的に排除されるように、欠失されるかまたは変更される（例えば、アミノ酸２５０〜２５４が、変更され得るかまたは欠失され得る；Ｈａｕｅｒら、ＰＮＡＳ １０２（８）：２８７４−２８７９（２００５））。

【0149】

ある特定の実施形態において、本方法は、誘導可能な形態のＣＤ４０（ｉＣＤ４０）をコードする発現構築物が生成されるような遺伝物質の操作を含む。そのような方法は、例えば、ＣＤ４０細胞質ドメインをコードする異種核酸配列およびそれを発現させるための手段を含む発現構築物の作製を含む。そのベクターは、適切なヘルパー細胞において複製され得、それらからウイルス粒子が産生され得、その組換えウイルス粒子に細胞が感染し得る。

【0150】

したがって、本明細書中に提示されるＣＤ４０分子は、例えば、細胞外ドメインを欠くことがある。特定の実施形態において、その細胞外ドメインは、切断されているか、または除去されている。細胞外ドメインは、標準的な変異誘発、挿入、欠失または置換を用いて、機能的な細胞外ドメインを有しないＣＤ４０分子が生成されるように変異され得ることも企図される。ＣＤ４０核酸は、配列番号１の核酸配列を有し得る。ＣＤ４０核酸には、配列番号１の配列を有する核酸のホモログおよび対立遺伝子、ならびに前述の核酸の機能的に等価なフラグメント、バリアントおよびアナログも含まれる。誘導可能なＣＤ４０ベクターを構築する方法は、例えば、２００８年７月２９日に発行された米国特許第７，４０４，９５０号において論じられている。

【0151】

遺伝子治療の文脈において、遺伝子は、ベクターの骨格を提供するウイルスゲノム以外の起源に由来する異種ポリヌクレオチド配列であり得る。遺伝子は、原核生物または真核生物の起源（例えば、細菌、ウイルス、酵母、寄生生物、植物またはさらには動物）に由来する。また、異種ＤＮＡは、２つ以上の起源に由来し、すなわち、多重遺伝子構築物または融合タンパク質である。また、異種ＤＮＡは、１つの起源に由来する制御配列および異なる起源に由来する遺伝子を含み得る。

【0152】

共刺激ポリペプチドは、本明細書中に提供されるアミノ酸配列を含み得るが、これらに限定されず、欠失または切断をはじめとした機能的な保存的変異を含み得、本明細書中に提供されるアミノ酸配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。

【0153】

Ｔ細胞などの細胞における共刺激ポリペプチドの発現は、例えば、２０１４年３月１３日に出願されたＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＣＯＮＴＲＯＬＬＩＮＧ Ｔ ＣＥＬＬ ＰＲＯＬＩＦＥＲＡＴＩＯＮという標題の米国特許出願番号１４／２１０，０３４、および２０１４年９月２５日にＷＯ２０１４／１５１９６０として公開された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２６７３４（これらの全体が参照により本明細書に援用される）において論じられている。

【0154】

リガンド結合領域
発現構築物のリガンド結合（「二量体化」）ドメインは、天然または非天然のリガンド、例えば、非天然の合成リガンドを使用して誘導を可能にし得る任意の好都合なドメインであり得る。多量体化領域またはリガンド結合ドメインは、構築物の性質およびリガンドの選択に応じて、細胞膜に対して内側または外側であり得る。上に示された細胞質領域と会合されるリガンド結合タンパク質を含むレセプターをはじめとした多種多様のリガンド結合タンパク質が公知である。本明細書中で使用されるとき、用語「リガンド結合ドメインは、用語「レセプター」と相互交換可能であり得る。リガンド（例えば、小さい有機リガンド）が公知であるかまたは容易に生成され得るリガンド結合タンパク質が、特に興味深い。これらのリガンド結合ドメインまたはレセプターには、ＦＫＢＰおよびシクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、上に示された他のレセプターなど、ならびに抗体から得ることができる「非天然の」レセプター、特に、重鎖または軽鎖サブユニット、その変異された配列、確率論的手順、コンビナトリアル合成などによって得られるランダムアミノ酸配列が含まれる。ある特定の実施形態において、リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域、ステロイドレセプターリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域およびテトラサイクリンレセプターリガンド結合領域からなる群より選択される。しばしば、リガンド結合領域は、Ｆ_ｖＦ_ｖｌｓ配列を含む。時折、Ｆ_ｖ’Ｆ_ｖｌｓ配列は、さらなるＦｖ’配列をさらに含む。例としては、例えば、Ｋｏｐｙｔｅｋ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：３１３−３２１（２０００）およびＧｅｓｔｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍ．＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ １０：６６７−６７５（２００７）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ Ｔ（２００６）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ ６７：４４０−２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，ｓ．ら、ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ，２００７））において論じられているものが挙げられる。

【0155】

おおむね、リガンド結合ドメインまたはレセプタードメインは、天然のドメインまたはその切断された活性な一部として、少なくとも約５０アミノ酸、および約３５０アミノ酸未満、通常、２００アミノ酸未満であり得る。結合ドメインは、例えば、低分子（ウイルスベクターでの効率的なトランスフェクションを可能にする＜２５ｋＤａ）であり得、モノマーであり得、非免疫原性であり得、二量体化のために形成され得る、合成的に入手可能な細胞透過性の無毒性リガンドを有し得る。

【0156】

レセプタードメインは、発現構築物のデザインおよび適切なリガンドの利用可能性に応じて、細胞内または細胞外であり得る。疎水性リガンドの場合、結合ドメインは、膜のいずれの側であってもよいが、親水性リガンド、特に、タンパク質リガンドの場合、リガンドを結合にとって利用可能な形態で内部移行させるための輸送系が存在しない場合、結合ドメインは、通常、細胞膜に対して外側であり得る。細胞内レセプターの場合、構築物は、レセプタードメイン配列の５’または３’においてシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインをコードし得るか、またはレセプタードメイン配列の５’に脂質付着シグナル配列を有し得る。レセプタードメインが、シグナルペプチドと膜貫通ドメインとの間に存在する場合、レセプタードメインは、細胞外であり得る。

【0157】

レセプターをコードする発現構築物の一部は、種々の理由のために変異誘発に供され得る。変異誘発されたタンパク質は、より高い結合親和性を提供し得、天然に存在するレセプターと変異誘発されたレセプターとのリガンドによる区別を可能にし得、レセプター−リガンド対などをデザインする機会を提供し得る。レセプターの変更は、結合部位におけるコンビナトリアル法を使用したランダム変異誘発と知られているアミノ酸の変更を含み得、ここで、結合部位に関連するアミノ酸または立体構造変化に関連する他のアミノ酸に対するコドンが、特定のアミノ酸に対するコドン（複数可）を公知の変化によってまたはランダムに変更し、得られるタンパク質を適切な原核生物宿主において発現し、次いで、得られたタンパク質を結合についてスクリーニングすることによって、変異誘発に供され得る。

【0158】

抗体および抗体サブユニット、例えば、重鎖もしくは軽鎖、特にフラグメント、より詳細には、可変領域の全部もしくは一部、または高親和性結合をもたらす重鎖と軽鎖との融合物が、結合ドメインとして使用され得る。企図される抗体には、免疫応答を引き起こさず、一般に末梢（すなわち、ＣＮＳ／脳領域の外側）では発現されない細胞外ドメインなどの異所的に発現されたヒト生成物であるものが含まれる。そのような例としては、低親和性神経成長因子レセプター（ＬＮＧＦＲ）および胚表面タンパク質（すなわち、癌胎児抗原）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0159】

なおもさらに、抗体は、生理的に許容され得るハプテン分子、および結合親和性についてスクリーニングされる個別の抗体サブユニットに対して調製され得る。そのサブユニットをコードするｃＤＮＡは、単離され、定常領域、可変領域の一部の欠失、可変領域の変異誘発などによって改変されることにより、リガンドに対して適切な親和性を有する結合タンパク質ドメインを得ることができる。このように、ほとんどの生理的に許容され得る任意のハプテン化合物が、リガンドとして使用され得るか、またはリガンドに対するエピトープを提供するために使用され得る。抗体単位の代わりに、結合ドメインが公知であって、結合のための有用なリガンドが存在する、天然のレセプターが使用され得る。

【0160】

オリゴマー化
形質導入されるシグナルは、通常、キメラタンパク質分子のリガンド媒介性のオリゴマー化によって、すなわち、リガンドが結合した後のオリゴマー化の結果として、生じ得るが、他の結合事象、例えば、アロステリックな活性化が、シグナルを惹起するために使用され得る。キメラタンパク質の構築物は、様々なドメインの順序および個々のドメインの反復の数に関して、変動し得る。

【0161】

レセプターを多量体化する場合、キメラ表面膜タンパク質のリガンド結合ドメイン／レセプタードメインに対するリガンドは、通常、少なくとも２つの結合部位を有し、それらの結合部位の各々がリガンドレセプタードメインに結合することができるという意味において、多量体であり得る。「多量体リガンド結合領域」とは、多量体リガンドに結合するリガンド結合領域のことを意味する。用語「多量体リガンド」には、二量体のリガンドが含まれる。二量体のリガンドは、リガンドレセプタードメインに結合することができる２つの結合部位を有し得る。望ましくは、対象のリガンドは、二量体またはそれより高次のオリゴマー、通常、約四量体以下の、小さい合成有機分子であり得、個々の分子は、代表的には、少なくとも約１５０Ｄａおよび約５ｋＤａ未満、通常、約３ｋＤａ未満であり得る。合成リガンドとレセプターとの種々の対が、使用され得る。例えば、天然のレセプターを含む実施形態において、二量体のＦＫ５０６は、ＦＫＢＰ１２レセプターとともに使用され得、二量体化されたシクロスポリンＡは、シクロフィリンレセプターとともに使用され得、二量体化されたエストロゲンは、エストロゲンレセプターとともに使用され得、二量体化された糖質コルチコイドは、糖質コルチコイドレセプターとともに使用され得、二量体化されたテトラサイクリンは、テトラサイクリンレセプターとともに使用され得、二量体化されたビタミンＤは、ビタミンＤレセプターとともに使用され得るなど。あるいは、それより高次のリガンド、例えば、三量体が、使用され得る。非天然のレセプター、例えば、抗体サブユニット、改変された抗体サブユニット、可動性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタンデムで含む一本鎖抗体、または改変されたレセプターならびにその変異された配列などを含む実施形態の場合、多種多様な化合物のうちのいずれかが使用され得る。これらのリガンド単位の有意な特色は、各結合部位が、高親和性でレセプターに結合することができる点、およびそれらのリガンド単位が、化学的に二量体化されることができる点である。また、リガンドが、機能的なレベルで血清に溶解することができ、なおもほとんどの用途のために原形質膜を横断して拡散することができるように、それらのリガンドの疎水性／親水性のバランスをとる方法も利用可能である。

【0162】

ある特定の実施形態において、本方法は、条件的にコントロールされるタンパク質またはポリペプチドを生成するために、化学的に誘導される二量体化（ＣＩＤ）の手法を利用する。この手法は、誘導可能であることに加えて、不安定な二量体化剤の分解またはモノマーの競合的阻害剤の投与に起因して、可逆的である。

【0163】

ＣＩＤシステムは、合成二価リガンドを使用して、リガンド結合ドメインに融合されたシグナル伝達分子を迅速に架橋する。このシステムは、細胞表面タンパク質（Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３．２６２：ｐ．１０１９−１０２４；Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｄ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １９９６，６：８３９−８４７；Ｂｌａｕ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９７，９４：３０７６−３０８１）またはサイトゾルタンパク質（Ｌｕｏ，Ｚ．ら、Ｎａｔｕｒｅ １９９６，３８３：１８１−１８５；ＭａｃＣｏｒｋｌｅ，Ｒ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８，９５：３６５５−３６６０）のオリゴマー化および活性化、転写を調節するＤＮＡエレメントへの転写因子のリクルートメント（Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ １９９６，３８２：８２２−８２６；Ｒｉｖｅｒａ，Ｖ．Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９６，２：１０２８−１０３２）またはシグナル伝達を刺激する原形質膜へのシグナル伝達分子のリクルートメント（Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｄ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９５，９２：９８０５−９８０９；Ｈｏｌｓｉｎｇｅｒ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９５，９５：９８１０−９８１４）を引き起こすために使用されている。

【0164】

ＣＩＤシステムは、表面レセプターの凝集が、下流のシグナル伝達カスケードを効率的に活性化するという概念に基づく。最も単純な実施形態において、ＣＩＤシステムは、脂質透過性免疫抑制薬ＦＫ５０６の二量体アナログを使用し、その二量体アナログは、その正常な生物活性を失っているが、ＦＫ５０６結合タンパク質であるＦＫＢＰ１２に遺伝的に融合された分子を架橋する能力を獲得している。１つ以上のＦＫＢＰおよびミリストイル化配列を、標的レセプターの細胞質シグナル伝達ドメインに融合することによって、二量体化薬物に依存的であるがリガンドおよび外部ドメインに非依存的な様式でシグナル伝達を刺激することができる。これにより、時間的なコントロール、モノマー薬物アナログを使用して可逆性、および高い特異性を備えたシステムが提供される。第３世代のＡＰ２０１８７／ＡＰ１９０３ ＣＩＤの、それらの結合ドメインであるＦＫＢＰ１２に対する高親和性は、インビボにおいて、内在性のＦＫＢＰ１２による非特異的な副作用を誘導することなく、組換えレセプターの特異的な活性化を可能にする。二量体化薬に結合する、アミノ酸の置換および欠失を有するＦＫＢＰ１２バリアント（例えば、ＦＫＢＰ１２_ｖ３６）もまた使用され得る。さらに、合成リガンドは、プロテアーゼ分解に対して抵抗性であり、それにより、インビボにおけるレセプターの活性化において、送達されるほとんどのタンパク質剤よりも効率的になる。

【0165】

使用されるリガンドは、リガンド結合ドメインの２つ以上に結合することができる。キメラタンパク質は、２つ以上のリガンド結合ドメインを含むとき、２つ以上のリガンドに結合することができる場合がある。そのリガンドは、代表的には、非タンパク質または化学物質である。例示的なリガンドとしては、二量体のＦＫ５０６（例えば、ＦＫ１０１２）が挙げられるが、これに限定されない。

【0166】

他のリガンド結合領域は、例えば、二量体の領域、またはゆらぎ置換によって改変されたリガンド結合領域、例えば、ＦＫＢＰ１２（Ｖ３６）などであり得る：Ｆ３６がＶに置換されたヒト１２ｋＤａ ＦＫ５０６結合タンパク質、完全に成熟したコード配列（アミノ酸１〜１０７）は、合成二量体化薬ＡＰ１９０３に対する結合部位を提供する（Ｊｅｍａｌ，Ａ．ら、ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃ．５８，７１−９６（２００８）；Ｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｉ．ａｎｄ Ｋｅｌｌｙ，Ｗ．Ｋ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １１，１５６６−７２（１９９３））。上記タンパク質の２つのタンデムなコピーは、より高次のオリゴマーが、ＡＰ１９０３による架橋の際に誘導されるようにその構築物においても使用され得る。

【0167】

Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰ：Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、Ｆ３６Ｖ−ＦＫＢＰのコドンゆらぎバージョンである。それは、
Ｆ３６Ｖ−ＦＫＰＢと同一のポリペプチド配列をコードするが、ヌクレオチドレベルでは６２％の相同性しか有しない。Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、レトロウイルスベクターにおける組換えを減少させるようにデザインされた（Ｓｃｈｅｌｌｈａｍｍｅｒ，Ｐ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５７，１７３１−５（１９９７））。Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、ＰＣＲアセンブリ手順によって構築された。その導入遺伝子は、１コピーのＦ３６Ｖ−ＦＫＢＰに直接連結された１コピーのＦ３６Ｖ’−ＦＫＢＰを含む。

【0168】

いくつかの実施形態において、リガンドは、小分子である。選択されたリガンド結合領域に対する適切なリガンドが、選択され得る。しばしば、リガンドは、二量体であり、時折、リガンドは、二量体のＦＫ５０６または二量体のＦＫ５０６アナログである。ある特定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ１９０３（ＣＡＳ索引名：２−ピペリジンカルボン酸、１−［（２Ｓ）−１−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ブチル］−、１，２−エタンジイルビス［イミノ（２−オキソ−２，１−エタンジイル）オキシ−３，１−フェニレン［（１Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピリデン］］エステル、［２Ｓ−［１（Ｒ^＊），２Ｒ^＊［Ｓ^＊［Ｓ^＊［１（Ｒ^＊），２Ｒ^＊］］］］］−（９Ｃｌ）ＣＡＳ登録番号：１９５５１４−６３−７；分子式：Ｃ７８Ｈ９８Ｎ４Ｏ２０
分子量：１４１１．６５）である。ある特定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ２０１８７である。ある特定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ２０１８７アナログ、例えば、ＡＰ１５１０などである。いくつかの実施形態において、ある特定のアナログは、ＦＫＢＰ１２に対して適切であり得、ある特定のアナログは、ＦＫＢＰ１２のゆらぎバージョンに対して適切であり得る。ある特定の実施形態において、１つのリガンド結合領域が、キメラタンパク質に含められる。他の実施形態において、２つ以上のリガンド結合領域が、含められる。例えば、リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２である場合、これらの領域の２つが含められる場合、一方は、例えば、ゆらぎバージョンであり得る。

【0169】

そのような方法において、多量体分子は、ＣＤ４０細胞外ドメインにおけるエピトープに結合する抗体（例えば、ヒト化抗ＣＤ４０抗体；Ｔａｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６４，２８４６−２８５２（２００４））であり得るか、ＣＤ４０リガンド（例えば、米国特許第６，４９７，８７６号（Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙら））であり得るか、または別の共刺激分子（例えば、Ｂ７／ＣＤ２８）であり得る。本明細書中でアッセイされるとき、機能に影響しない配列の保存的バリエーションは、本請求項の範囲内であると理解される。

【0170】

ＣＤ４０活性化の機構は、基本的に三量体化に基づくので、このレセプターは、特にＣＩＤシステムに適用できる。ＣＩＤの制御により、１）時間的なコントロール、２）自己免疫反応の徴候の際に不活性モノマーを付加することによって可逆性、および３）非特異的な副作用が限られた可能性を備えたシステムが提供される。さらに、誘導可能なインビボでのＤＣ ＣＤ４０活性化は、ＣＤ４０シグナル伝達の完全な誘導に通常必要とされる第２の「危険」シグナルの要求を回避し得、Ｔ細胞のプライミングの増大を可能にする、インサイチュにおいてＤＣ生存を潜在的に促進し得る。したがって、ｉＣＤ４０を発現するようにＤＣワクチンを操作することにより、抗原提示分子、接着分子、ＴＨ１促進サイトカインおよび生存促進因子のＤＣ発現をアップレギュレートすることによって、Ｔ細胞媒介性の殺滅応答が増幅される。

【0171】

企図される他の二量体化システムとしては、クーママイシン／ＤＮＡジャイレースＢシステムが挙げられる。クーママイシンによって誘導される二量体化は、改変されたＲａｆタンパク質を活性化し、ＭＡＰキナーゼカスケードを刺激する。Ｆａｒｒａｒら、１９９６を参照のこと。

【0172】

膜標的化
膜標的化配列は、細胞表面膜へのキメラタンパク質の輸送を提供し、ここで、同じ配列または他の配列が、細胞表面膜へのキメラタンパク質の結合をコードし得る。細胞膜と会合した分子は、膜会合を容易にするある特定の領域を含み、そのような領域は、キメラタンパク質分子に組み込まれることにより、膜標的化分子をもたらし得る。例えば、いくつかのタンパク質は、アシル化される配列をＮ末端またはＣ末端に含み、これらのアシル部分は、膜会合を容易にする。そのような配列は、アシルトランスフェラーゼによって認識され、特定の配列モチーフに一致することが多い。ある特定のアシル化モチーフは、単一のアシル部分（その後に、陰イオン性脂質頭部基との会合を改善するいくつかの正に帯電した残基（例えば、ヒトｃ−Ｓｒｃ：Ｍ−Ｇ−Ｓ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ）が続くことが多い）によって修飾されることができ、他のものは、複数のアシル部分によって修飾されることができる。例えば、タンパク質チロシンキナーゼＳｒｃのＮ末端配列は、単一のミリストイル部分を含み得る。二重アシル化領域は、ある特定のタンパク質キナーゼ（例えば、Ｓｒｃファミリーメンバーのサブセット（例えば、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ）およびＧタンパク質アルファサブユニット）のＮ末端領域内に配置されている。そのような二重アシル化領域は、そのようなタンパク質の最初の１８アミノ酸の中に配置されることが多く、それは、配列モチーフＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｃｙｓに一致し、ここで、Ｍｅｔは、切断され、Ｇｌｙは、Ｎ−アシル化され、Ｃｙｓ残基のうちの１つは、Ｓ−アシル化される。Ｇｌｙは、ミリストイル化されることが多く、Ｃｙｓは、パルミトイル化され得る。配列モチーフＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ（いわゆる「ＣＡＡＸボックス」）に一致するアシル化領域は、Ｇタンパク質ガンマサブユニットのＣ末端由来のＣ１５またはＣ１０イソプレニル部分によって修飾され得、他のタンパク質（例えば、ワールドワイドウェブアドレスｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ＤｉｓｐｌａｙＩｐｒｏＥｎｔｒｙ？ａｃ＝ＩＰＲ００１２３０）もまた使用され得る。これらのおよび他のアシル化モチーフとしては、例えば、Ｇａｕｔｈｉｅｒ−Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ １５：２２０５−２２１７（２００４）；Ｇｌａｂａｔｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０３：６９７−７００（１９９４）およびＺｌａｋｉｎｅら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１０：６７３−６７９（１９９７）において論じられているものが挙げられ、そのモチーフは、膜局在化を誘導するためにキメラ分子に組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、アシル化モチーフを含むタンパク質由来の天然の配列が、キメラタンパク質に組み込まれる。例えば、いくつかの実施形態において、Ｌｃｋ、ＦｙｎもしくはＹｅｓまたはＧタンパク質アルファサブユニットのＮ末端部分（例えば、そのようなタンパク質由来の最初の２５個のＮ末端アミノ酸またはそれより少ないアミノ酸（例えば、随意の変異を有する、その天然の配列の約５〜約２０アミノ酸、約１０〜約１９アミノ酸または約１５〜約１９アミノ酸））が、キメラタンパク質のＮ末端の中に組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、ＣＡＡＸボックスモチーフ配列を含むＧタンパク質ガンマサブユニット由来の約２５アミノ酸以下のＣ末端配列（例えば、随意の変異を有する、天然の配列の約５〜約２０アミノ酸、約１０〜約１８アミノ酸または約１５〜約１８アミノ酸）が、キメラタンパク質のＣ末端に連結され得る。

【0173】

いくつかの実施形態において、アシル部分は、＋１から＋６というｌｏｇ ｐ値を有し、時折、＋３から＋４．５というｌｏｇ ｐ値を有する。Ｌｏｇ ｐ値は、疎水性の尺度であり、オクタノール／水の分配研究に由来することが多く、ここで、より高い疎水性を有する分子は、より高い頻度でオクタノールに分配し、より高いｌｏｇ ｐ値を有すると特徴付けられる。Ｌｏｇ ｐ値は、いくつかの親油性分子に対して公表されており、ｌｏｇ ｐ値は、公知の分配プロセスを使用して計算され得る（例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．７１，Ｉｓｓｕｅ ６，ｐａｇｅ ５９９、エントリー４４９３は、４．２というｌｏｇ ｐ値を有するラウリン酸を示している）。任意のアシル部分が、上で論じられたペプチド組成物に連結され得、公知の方法および本明細書中以後に論じられる方法を用いて抗菌活性について試験され得る。アシル部分は、時折、例えば、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ４−Ｃ１２シクロアルキルアルキル（ｃｙｃｌａｌｋｙｌａｌｋｙｌ）、アリール、置換アリールまたはアリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキルである。任意のアシル含有部分は、時折、脂肪酸であり、脂肪酸部分の例は、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）、オクチル（Ｃ８）、ノニル（Ｃ９）、デシル（Ｃ１０）、ウンデシル（Ｃ１１）、ラウリル（Ｃ１２）、ミリスチル（Ｃ１４）、パルミチル（Ｃ１６）、ステアリル（Ｃ１８）、アラキジル（Ｃ２０）、ベヘニル（Ｃ２２）およびリグノセリル部分（Ｃ２４）であり、各部分は、０、１、２、３、４、５、６、７または８つの不飽和（すなわち、二重結合）を含み得る。アシル部分は、時折、脂質分子（例えば、ホスファチジル脂質（例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴミエリン（ｓｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）、スフィンゴシン、セラミド、ガングリオシド、セレブロシド））またはそれらの改変バージョンである。ある特定の実施形態において、１、２、３、４もしくは５個またはそれより多くのアシル部分が、膜会合領域に連結される。

【0174】

本明細書中のキメラタンパク質は、一回貫通型（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｓｓ）または複数回貫通型（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐａｓｓ）の膜貫通配列も含み得る（例えば、キメラタンパク質のＮ末端またはＣ末端に）。一回貫通型膜貫通領域は、ある特定のＣＤ分子、チロシンキナーゼレセプター、セリン／トレオニンキナーゼレセプター、ＴＧＦベータ、ＢＭＰ、アクチビンおよびホスファターゼに見られる。一回貫通型膜貫通領域は、シグナルペプチド領域および約２０〜約２５アミノ酸（それらの多くは、疎水性アミノ酸であり、アルファヘリックスを形成し得る）の膜貫通領域を含むことが多い。短いトラックの正に帯電したアミノ酸が、タンパク質を膜に繋ぎ止める膜貫通の範囲の後に続くことが多い。複数回貫通型タンパク質には、イオンポンプ、イオンチャネルおよびトランスポーターが含まれ、膜を複数回またぐ２つ以上のらせんを含む。複数回貫通型タンパク質のすべてまたは実質的にすべてが、時折、キメラタンパク質に組み込まれる。一回貫通型および複数回貫通型膜貫通領域に対する配列は、公知であり、キメラタンパク質分子に組み込むために選択され得る。

【0175】

宿主において機能性であり、キメラタンパク質の他のドメインのうちの１つと会合されていることもあるし会合されていないこともある、任意の膜標的化配列が、使用され得る。いくつかの実施形態において、そのような配列としては、ミリストイル化標的化配列、パルミトイル化標的化配列、プレニル化配列（すなわち、ファルネシル化、ゲラニル−ゲラニル化、ＣＡＡＸボックス）、タンパク質間相互作用モチーフ、またはレセプター由来の膜貫通配列（シグナルペプチドを利用する）が挙げられるが、これらに限定されない。例としては、例えば、ｔｅｎ Ｋｌｏｏｓｔｅｒ ＪＰら、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（２００７）９９，１−１２，Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：９３６−４０，１０９８（２００３）において論じられているものが挙げられる。

【0176】

様々な膜におけるタンパク質の保持を高め得るさらなるタンパク質ドメインが存在する。例えば、約１２０アミノ酸のプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインが、代表的には細胞内のシグナル伝達に関与する２００個を超えるヒトタンパク質において見られる。ＰＨドメインは、膜内の様々なホスファチジルイノシトール（ＰＩ）脂質（例えば、ＰＩ（３，４，５）−Ｐ３、ＰＩ（３，４）−Ｐ２、ＰＩ（４，５）−Ｐ２）に結合し得るので、種々の膜コンパートメントまたは細胞内コンパートメントにタンパク質をリクルートする際に鍵となる役割を果たし得る。しばしば、ＰＩ脂質のリン酸化状態は、例えば、ＰＩ−３キナーゼまたはＰＴＥＮによって制御されるので、膜とＰＨドメインとの相互作用は、アシル脂質による相互作用ほど安定でない。

【0177】

ＡＰ１９０３ ＡＰＩは、Ａｌｐｈｏｒａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．によって製造されており、ＡＰ１９０３ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは、ＡＡＩ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐによって作製されている。それは、非イオン性可溶化剤Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５（２５０ｍｇ／ｍＬ，ＢＡＳＦ）の２５％溶液中のＡＰ１９０３の５ｍｇ／ｍＬ溶液として製剤化されている。室温において、この製剤は、透明の溶液である。冷蔵されると、この製剤は、長期の貯蔵において可逆的な相転移を起こし、乳白色の溶液になる。室温に再度温めると、この相転移は、元に戻る。１本分は、１０ｍＬのガラスバイアルにおける８ｍＬである（バイアル１本あたり合計約４０ｍｇのＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。

【0178】

使用するために、ＡＰ１９０３は、投与前に、室温に温め、希釈される。５０ｋｇを超える被験体の場合、ＡＰ１９０３は、１００ｍＬの生理食塩水に希釈された４０ｍｇの用量で、１時間あたり５０ｍＬの速度で２時間にわたって、ＤＥＨＰフリー食塩水バッグおよび溶液セットを使用して、ｉ．ｖ．注入によって投与される。５０ｋｇ未満の被験体は、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を投与される。

【0179】

すべての試験薬が、２℃〜８℃の温度で維持され、過剰な光および熱から保護され、アクセスが制限された鍵が掛かった区域で保管される。

【0180】

ＡＰ１９０３を投与する必要性、ならびに治療用Ｔ細胞、例えば、キメラ抗原レセプターおよび誘導可能なキメラ共刺激ポリペプチドを発現しているＴ細胞を活性化する必要性を判定する際、患者には、例えば、非ＤＥＨＰで非エチレンオキシドの滅菌された注入セットを使用して、２時間にわたるＩＶ注入によって、単一の固定された用量のＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（０．４ｍｇ／ｋｇ）が投与され得る。ＡＰ１９０３の用量は、すべての患者に対して個別に計算され、体重が≧１０％上下しない限り、再計算されない。計算された用量は、注入前に０．９％生理食塩水において１００ｍＬに希釈される。

【0181】

ＡＰ１９０３の以前の第Ｉ相研究では、２４人の健常志願者を、２時間にわたって、ＩＶ注入される０．０１、０．０５、０．１、０．５および１．０ｍｇ／ｋｇという用量レベルにおいて、単一用量のＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎで処置した。ＡＰ１９０３血漿レベルは、用量に正比例し、平均Ｃｍａｘ値は、０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量の範囲にわたって、およそ１０〜１２７５ｎｇ／ｍＬの範囲だった。最初の注入期間の後、血中濃度は、急速な分布相を示し、血漿レベルは、投与の０．５、２および１０時間後にそれぞれ最高濃度のおよそ１８、７および１％に減少した。ＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは、すべての用量レベルにおいて安全であり、耐容性がよいことが示され、好ましい薬物動態プロファイルを示した。Ｉｕｌｉｕｃｃｉ ＪＤら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：８７０−９，２００１。

【0182】

使用されるＡＰ１９０３ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎの固定された用量は、例えば、２時間にわたって静脈内に注入される０．４ｍｇ／ｋｇであり得る。細胞の効率的なシグナル伝達のためにインビトロにおいて必要とされるＡＰ１９０３の量は、約１０〜１００ｎＭ（ＭＷ：１４１２Ｄａ）である。これは、１４〜１４０μｇ／Ｌまたは約０．０１４〜０．１４ｍｇ／ｋｇ（１．４〜１４０μｇ／ｋｇ）に等しい。投与量は、用途に応じて変動することがあり、ある特定の例では、０．１〜１０ｎＭの範囲内、または５０〜１５０ｎＭ、１０〜２００ｎＭ、７５〜１２５ｎＭ、１００〜５００ｎＭ、１００〜６００ｎＭ、１００〜７００ｎＭ、１００〜８００ｎＭもしくは１００〜９００ｎＭの範囲内であり得る。１ｍｇ／ｋｇまでの用量が、上に記載されたＡＰ１９０３の第Ｉ相研究において耐容性がよかった。

【0183】

選択マーカー
ある特定の実施形態において、発現構築物は、その発現構築物にマーカーを含めることによってその発現がインビトロまたはインビボにおいて識別される核酸構築物を含む。そのようなマーカーは、その発現構築物を含む細胞の容易な識別を可能にする識別可能な変化を細胞にもたらし得る。通常、薬物選択マーカーを含めることが、クローニングおよび形質転換体の選択に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する抵抗性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）などの酵素が使用される。免疫学的表面マーカーを含む細胞外の非シグナル伝達ドメインまたは様々なタンパク質（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＬＮＧＦＲ）もまた使用され得、それにより、磁性抗体または蛍光抗体によって媒介される選別のための直接的方法が可能になる。使用される選択マーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、重要であると考えられない。選択マーカーのさらなる例としては、例えば、レポーター（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ベータ−ｇａｌまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））が挙げられる。ある特定の実施形態において、マーカータンパク質、例えば、ＣＤ１９などは、例えば、免疫磁気選択などにおいて、移入するための細胞の選択のために使用される。

【0184】

本明細書中で論じられるように、ＣＤ１９マーカーは、抗ＣＤ１９抗体、すなわち、例えば、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ、ＴＣＲまたは他の抗原認識部分と区別される。

【0185】

いくつかの実施形態において、細胞の選別を助けるために、あるポリペプチドが発現ベクターに含められ得る。例えば、ＣＤ３４最小エピトープが、ベクターに組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるキメラ抗原レセプターまたはキメラ刺激分子を発現させるために使用される発現ベクターは、１６アミノ酸のＣＤ３４最小エピトープをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態、例えば、本明細書中の実施例に提供されるある特定の実施形態において、ＣＤ３４最小エピトープは、ＣＤ８ストーク（ｓｔａｌｋ）のアミノ末端の位置に組み込まれる。

【0186】

膜貫通領域
本明細書中のキメラ抗原レセプターは、一回貫通型（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｓｓ）または複数回貫通型（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐａｓｓ）の膜貫通配列を含み得る（例えば、キメラタンパク質のＮ末端またはＣ末端に）。一回貫通型膜貫通領域は、ある特定のＣＤ分子、チロシンキナーゼレセプター、セリン／トレオニンキナーゼレセプター、ＴＧＦβ、ＢＭＰ、アクチビンおよびホスファターゼに見られる。一回貫通型膜貫通領域は、シグナルペプチド領域および約２０〜約２５アミノ酸（それらの多くは、疎水性アミノ酸であり、アルファヘリックスを形成し得る）の膜貫通領域を含むことが多い。短いトラックの正に帯電したアミノ酸が、タンパク質を膜に繋ぎ止めるために膜貫通の範囲の後に続くことが多い。複数回貫通型タンパク質には、イオンポンプ、イオンチャネルおよびトランスポーターが含まれ、膜を複数回またぐ２つまたはそれを超えるらせんを含む。複数回貫通型タンパク質のすべてまたは実質的にすべてが、時折、キメラタンパク質に組み込まれる。一回貫通型および複数回貫通型膜貫通領域に対する配列は、公知であり、キメラタンパク質分子に組み込むために選択され得る。

【0187】

いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合される。１つの実施形態において、ＣＡＲにおけるドメインのうちの１つと天然に会合する膜貫通ドメインが使用される。他の実施形態において、ＣＡＲにおけるドメインのうちの１つと天然に会合しない膜貫通ドメインが使用される。場合によっては、そのレセプター複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインにそのようなドメインが結合するのを回避するために膜貫通ドメインは、選択され得るか、またはアミノ酸置換によって改変され得る（例えば、代表的には、疎水性残基に変更される（ｃｈａｒｇｅｄ））。

【0188】

膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞レセプターのアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ３−ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７またはＣＤ１５４に由来し得る。または、いくつかの例では、主に疎水性残基、例えば、ロイシンおよびバリンを含む膜貫通ドメインが、新規に合成され得る。ある特定の実施形態において、短いポリペプチドリンカーは、キメラ抗原レセプターの膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間に結合を形成し得る。それらのキメラ抗原レセプターは、ストーク、すなわち、細胞外領域のアミノ酸を細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間にさらに含み得る。例えば、そのストークは、選択された膜貫通ドメインに天然に会合するアミノ酸の配列であり得る。いくつかの実施形態において、キメラ抗原レセプターは、ＣＤ８膜貫通ドメインを含み、ある特定の実施形態において、キメラ抗原レセプターは、ＣＤ８膜貫通ドメインおよびその膜貫通ドメインの細胞外部分におけるさらなるアミノ酸を含み、ある特定の実施形態において、キメラ抗原レセプターは、ＣＤ８膜貫通ドメインおよびＣＤ８ストークを含む。キメラ抗原レセプターは、膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの間にアミノ酸の領域をさらに含み得、それらのアミノ酸は、その膜貫通ドメインが由来するポリペプチドと天然に会合するものである。

【0189】

調節領域
１．プロモーター
目的のポリヌクレオチド配列の発現をコントロールするために使用される特定のプロモーターは、標的化された細胞においてそのポリヌクレオチドの発現を指示することができる限り、重要であると考えられない。したがって、ヒト細胞が標的化される場合、ポリヌクレオチド配列コード領域は、例えば、ヒト細胞において発現されることができるプロモーターに隣接しておよびそのプロモーターの支配下に配置され得る。一般的に言えば、そのようなプロモーターは、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターを含み得る。

【0190】

様々な実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列、β−アクチン、ラットインスリンプロモーターおよびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素が、目的のコード配列の高レベル発現を得るために使用され得る。発現レベルが所与の目的にとって十分であるならば、目的のコード配列の発現を達成すると当該分野で周知である他のウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターの使用も同様に企図される。周知の特性を有するプロモーターを使用することによって、トランスフェクション後または形質転換後の目的のタンパク質の発現のレベルおよびパターンが、最適化され得る。

【0191】

特異的な生理学的シグナルまたは合成シグナルに応答して制御されるプロモーターの選択は、遺伝子産物の誘導可能な発現を可能にし得る。例えば、１つの導入遺伝子の発現、またはマルチシストロニックなベクターが使用されるときは複数の導入遺伝子の発現が、ベクターが生成される細胞にとって有毒である場合、それらの導入遺伝子のうちの１つ以上の発現を妨げるかまたは減少させることが望ましい。産生細胞株にとって有毒である導入遺伝子の例は、アポトーシス促進遺伝子およびサイトカイン遺伝子である。いくつかの誘導性プロモーターシステムが、導入遺伝子産物が有毒である場合のウイルスベクターの作製に利用可能である（より誘導性のプロモーターを付加する）。

【0192】

エクジソンシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）は、１つのそのようなシステムである。このシステムは、哺乳動物細胞において目的の遺伝子の制御された発現を可能にするようにデザインされる。そのシステムは、導入遺伝子の基底レベルの発現ではなく２００倍超の誘導能を実質的に可能にする厳しく制御された発現機構からなる。そのシステムは、ショウジョウバエのヘテロ二量体エクジソンレセプターに基づき、エクジソンまたはムリステロンＡなどのアナログが、そのレセプターに結合すると、そのレセプターは、プロモーターを活性化して、下流の導入遺伝子の発現をオンにし、高レベルのｍＲＮＡ転写産物がもたらされる。このシステムでは、ヘテロ二量体レセプターの両方のモノマーが、１つのベクターから構成的に発現されるのに対し、目的の遺伝子の発現を駆動するエクジソン応答性プロモーターは、別のプラスミド上に存在する。ゆえに、このタイプのシステムを目的の遺伝子トランスファーベクターに遺伝子操作して導入することが、有用であり得る。次いで、産生細胞株において目的の遺伝子を含むプラスミドとレセプターモノマーを含むプラスミドとをコトランスフェクションすることにより、潜在的に有毒な導入遺伝子を発現させずに、遺伝子トランスファーベクターの作製が可能になり得る。適切な時点において、導入遺伝子の発現が、エクジソンまたはムリステロンＡによって活性化され得る。

【0193】

有用であり得る別の誘導可能なシステムは、もともとはＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄによって開発された（Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１，１９９２；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９，１９９５）、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ^ＴＭまたはＴｅｔ−Ｏｎ^ＴＭシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）である。このシステムもまた、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体（例えば、ドキシサイクリン）に応答して高レベルの遺伝子発現を制御することが可能である。Ｔｅｔ−Ｏｎ^ＴＭシステムでは、ドキシサイクリンの存在下において遺伝子発現がオンになるのに対し、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ^ＴＭシステムでは、ドキシサイクリンの非存在下において遺伝子発現がオンになる。これらのシステムは、大腸菌のテトラサイクリン抵抗性オペロンに由来する２つの制御エレメントに基づく。テトラサイクリンリプレッサーが結合するテトラサイクリンオペレーター配列、およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質。目的の遺伝子は、プラスミドの中に存在するテトラサイクリン応答性エレメントを有するプロモーターの後ろでプラスミド中にクローニングされる。第２のプラスミドは、テトラサイクリンによってコントロールされるトランス活性化因子と呼ばれる制御エレメントを含み、その制御エレメントは、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ^ＴＭシステムでは、単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６ドメインおよび野生型テトラサイクリン（ｔｅｒｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）リプレッサーから構成される。したがって、ドキシサイクリンの非存在下において、転写は、恒常的にオンである。Ｔｅｔ−Ｏｎ^ＴＭシステムでは、テトラサイクリンリプレッサーは、野生型でなく、ドキシサイクリンの存在下において転写を活性化する。遺伝子治療ベクターを作製する場合、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在下において産生細胞が生育され得、潜在的に有毒な導入遺伝子の発現を妨げ得るように、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ^ＴＭシステムが使用され得るが、そのベクターが患者に導入されると、遺伝子発現は恒常的にオンになり得る。

【0194】

いくつかの状況において、遺伝子治療ベクターにおける導入遺伝子の発現を制御することが望ましい。例えば、様々な活性強度を有する種々のウイルスプロモーターが、所望の発現レベルに応じて使用される。哺乳動物細胞では、ＣＭＶ前初期プロモーターが、強力な転写活性化をもたらすために使用されることが多い。ＣＭＶプロモーターは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ら、１９９７．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−４８において概説されている。導入遺伝子の低い発現レベルが望まれるとき、それほど強力でないＣＭＶプロモーターの改変バージョンもまた、使用されている。造血細胞における導入遺伝子の発現が望まれるとき、ＭＬＶまたはＭＭＴＶ由来のＬＴＲなどのレトロウイルスプロモーターが使用されることが多い。所望の効果に応じて使用される他のウイルスプロモーターとしては、ＳＶ４０、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ ＬＴＲ、アデノウイルスプロモーター（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ２ＡまたはＭＬＰ領域由来のもの）、ＡＡＶ ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫおよびトリ肉腫ウイルスが挙げられる。

【0195】

同様に、組織特異的プロモーターは、標的化されていない組織に対する潜在的な毒性または望ましくない効果を減少させるように、特定の組織または細胞において転写をもたらすために使用される。これらのプロモーターは、ＣＭＶプロモーターなどのより強力なプロモーターと比べて低い発現をもたらし得るが、より限定された発現および免疫原性ももたらし得る（Ｂｏｊａｋ，Ａ．ら、２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：１９７５−７９；Ｃａｚｅａｕｘ．，Ｎ．ら、２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：３３２２−３１）。例えば、組織特異的プロモーター（例えば、ＰＳＡ関連プロモーター）または前立腺特異的腺性カリクレインまたは筋肉クレアチンキナーゼ遺伝子が、必要に応じて使用され得る。

【0196】

組織特異的プロモーターまたは分化特異的プロモーターの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｂ２９（Ｂ細胞）；ＣＤ１４（単球性細胞）；ＣＤ４３（白血球および血小板）；ＣＤ４５（造血細胞）；ＣＤ６８（マクロファージ）；デスミン（筋肉）；エラスターゼ−１（膵腺房細胞）；エンドグリン（内皮細胞）；フィブロネクチン（分化中の細胞、治癒中の組織）；およびＦｌｔ−１（内皮細胞）；ＧＦＡＰ（アストロサイト）。

【0197】

ある特定の適応症では、遺伝子治療ベクターを投与した後の特定の時点において転写を活性化することが望ましい。これは、ホルモンまたはサイトカインによって制御可能であるようなプロモーターを用いて行われる。使用され得るサイトカイン応答性プロモーターおよび炎症性タンパク質応答性プロモーターとしては、ＫキニノーゲンおよびＴキニノーゲン（Ｋａｇｅｙａｍａら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，２３４５−２３５１）、ｃ−ｆｏｓ、ＴＮＦ−アルファ、Ｃ反応性タンパク質（Ａｒｃｏｎｅら（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６（８），３１９５−３２０７）、ハプトグロビン（Ｏｌｉｖｉｅｒｏら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．，６，１９０５−１９１２）、血清アミロイドＡ２、Ｃ／ＥＢＰアルファ、ＩＬ−１、ＩＬ−６（Ｐｏｌｉ ａｎｄ Ｃｏｒｔｅｓｅ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２０２−８２０６）、補体Ｃ３（Ｗｉｌｓｏｎら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６１８１−６１９１）、ＩＬ−８、アルファ−１酸性糖タンパク質（Ｐｒｏｗｓｅ ａｎｄ Ｂａｕｍａｎｎ，（１９８８）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，８，４２−５１）、アルファ−１抗トリプシン、リポタンパク質リパーゼ（Ｚｅｃｈｎｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２３９４−２４０１，１９８８）、アンジオテンシノーゲン（Ｒｏｎら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２８８７−２８９５）、フィブリノゲン、ｃ−ｊｕｎ（ホルボールエステル、ＴＮＦ−アルファ、ＵＶ照射、レチノイン酸および過酸化水素によって誘導可能）、コラゲナーゼ（ホルボールエステルおよびレチノイン酸によって誘導される）、メタロチオネイン（重金属および糖質コルチコイド誘導性）、ストロメライシン（ホルボールエステル、インターロイキン−１およびＥＧＦによって誘導可能）、アルファ−２マクログロブリンおよびアルファ−１抗キモトリプシンが挙げられる。他のプロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、ヒト免疫不全ウイルス（ＭＶ）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、エプスタイン・バーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビンおよびクレアチンが挙げられる。

【0198】

上記プロモーターのいずれか単独または別のプロモーターとの併用が、所望の作用に応じて有用であり得ることが想定される。プロモーターおよび他の制御エレメントは、それらが所望の細胞または組織において機能的であるように選択される。さらに、このプロモーターのリストは、網羅的または限定的であると解釈されるべきでなく；他のプロモーターが、本明細書中に開示されるプロモーターおよび方法とともに使用される。

【0199】

２．エンハンサー
エンハンサーは、同じＤＮＡ分子上の離れた位置に配置されたプロモーターからの転写を増加させる遺伝的エレメントである。初期の例としては、コード配列に隣接し、かついくつかのイントロンの中に存在する、免疫グロブリンおよびＴ細胞レセプターに関連するエンハンサーが挙げられる。多くのウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０およびレトロウイルスＬＴＲ）は、エンハンサーの活性と密接に関連し、単一エレメントのように扱われることが多い。エンハンサーは、ほぼプロモーターのように組織化される。すなわち、エンハンサーは、多くの個々のエレメントから構成され、その各々が、１つ以上の転写性タンパク質に結合する。エンハンサーとプロモーターとの基本的な区別は、操作上のものである。エンハンサー領域は概して、少し離れて、しばしば向きに関係なく、転写を刺激する；これは、プロモーター領域またはその構成要素エレメントには必ずしも当てはまらない。他方で、プロモーターは、特定の部位において特定の向きでＲＮＡ合成の開始を指示する１つ以上のエレメントを有するのに対し、エンハンサーは、これらの特異性を欠く。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば重複し、近接することから、しばしば非常によく似たモジュール構成を有するようである。エンハンサーのサブセットには、転写活性を増加させ得るだけでなく、ゲノムにインテグレートされたとき、隣接する配列から転写性エレメントを（インスレーターエレメントとともに）隔離するのを助け得る、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）が含まれる。

【0200】

任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ ＥＰＤＢのように）が、遺伝子の発現を駆動するために使用され得るが、多くは、特定の組織タイプまたは組織のサブセットに発現を限定し得る（例えば、Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９：７７６−８８に概説されている）。例としては、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビン、筋肉クレアチンキナーゼ由来のエンハンサー、ならびにウイルスＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶ由来の配列が挙げられるが、これらに限定されない。適切なエンハンサーが、特定の用途に対して選択され得る。適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部としてまたは追加の遺伝的発現構築物として提供される場合、真核細胞は、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質内転写を支持し得る。

【0201】

３．ポリアデニル化シグナル
ｃＤＮＡインサートが使用される場合、遺伝子転写産物の適切なポリアデニル化をもたらすためにポリアデニル化シグナルを含めることが通常望ましい。ポリアデニル化シグナルの性質は、本方法の実施の成功にとって重大であるとは考えられておらず、任意のそのような配列（例えば、ヒトまたはウシの成長ホルモンおよびＳＶ４０のポリアデニル化シグナルならびにＬＴＲポリアデニル化シグナル）が、使用される。１つの非限定的な例は、ｐＣＥＰ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に存在するＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。ターミネーターもまた、発現カセットのエレメントとして企図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを高めるため、およびそのカセットから他の配列への読み過ごしを最小限にするために役立ち得る。終止シグナル配列またはポリ（Ａ）シグナル配列は、例えば、ｍＲＮＡの３’末端における保存配列（ＡＡＵＡＡＡ）から約１１〜３０ヌクレオチド下流に位置し得る（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．ら、１９９３．ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：７７７−８３；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８）。

【0202】

４．開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位
特定の開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳に必要とされることがある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接する配列を含む。ＡＴＧ開始コドンをはじめとした外来性翻訳調節シグナルが、提供される必要があり得る。開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列の読み枠とインフレームで配置される。外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然または合成であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって上昇し得る。

【0203】

ある特定の実施形態において、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用は、多重遺伝子すなわちポリシストロニックなメッセージを作製するために使用される。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回することができ、内部部位において翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：３２０−３２５，１９８８）。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメントが、論じられており（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）、ならびに哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳも論じられている（Ｍａｃｅｊａｋ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９０−９４，１９９１）。ＩＲＥＳエレメントは、異種のオープンリーディングフレームに連結され得る。各々がＩＲＥＳによって分断されている複数のオープンリーディングフレームが、共に転写され得、ポリシストロニックなメッセージを作製する。ＩＲＥＳエレメントのおかげで、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。複数の遺伝子が、単一のメッセージを転写するために単一のプロモーター／エンハンサーを使用して効率的に発現され得る（米国特許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８１９号（各々が参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）。

【0204】

配列の最適化
タンパク質産生は、導入遺伝子におけるコドンを最適化することによっても増加され得る。タンパク質産生を増加させるために、種特異的コドンの変更が用いられ得る。また、コドンが最適化されることにより、最適化されたＲＮＡが生成され得、それにより、より効率的な翻訳がもたらされ得る。ＲＮＡに組み込まれるコドンを最適化することによって、不安定性を引き起こす二次構造をもたらすエレメント、例えばリボソーム結合を阻害し得るｍＲＮＡ二次構造、またはｍＲＮＡの核外輸送を阻害し得るクリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）配列などのエレメントが、除去され得る（Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８；Ｙａｎ．，Ｊ．ら、２００７．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：４１１−２１；Ｃｈｅｕｎｇ，Ｙ．Ｋ．ら、２００４．Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：６２９−３８；Ｎａｒｕｍ．，Ｄ．Ｌ．ら、２００１．６９：７２５０−５５；Ｙａｄａｖａ，Ａ．，ａｎｄ Ｏｃｋｅｎｈｏｕｓｅ，Ｃ．Ｆ．，２００３．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：４９６２−６９；Ｓｍｉｔｈ．，Ｊ．Ｍ．ら、２００４．ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ２０：１３３５−４７；Ｚｈｏｕ，Ｗ．ら、２００２．Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８８：１２７−５１；Ｗｕ，Ｘ．ら、２００４．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１３：８９−９６；Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ら、２００６．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４９：６９−７８；Ｄｅｍｌ，Ｌ．Ａ．ら、２００１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１０９９−１１００１；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｒ．Ｍ．ら、１９９７．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４８９２−４９０３；Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｄ．ら、２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：４５３１−４０；ｚｕｒ Ｍｅｇｅｄｅ，Ｊ．ら、２０００．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２６２８−２６３５）。例えば、ＦＢＰ１２または他の多量体化領域ポリペプチド、共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域およびＣＤ１９配列が、コドンの変更によって最適化され得る。

【0205】

リーダー配列
リーダー配列は、ｍＲＮＡの安定性を高めるためおよびより効率的な翻訳をもたらすために付加され得る。リーダー配列は、通常、ｍＲＮＡを小胞体に標的化することに関与する。例としては、自身の切断を遅延させる、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）に対するシグナル配列、およびＩｇＥ遺伝子リーダー配列が挙げられる（Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８；Ｌｉ，Ｖ．ら、２０００．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７２：４１７−２８；Ｘｕ，Ｚ．Ｌ．ら、２００１．Ｇｅｎｅ ２７２：１４９−５６；Ｍａｌｉｎ，Ａ．Ｓ．ら、２０００．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．２：１６７７−８５；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．ら、２００５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：１１２−１２５；Ｙａｎｇ．，Ｊ．Ｓ．ら、２００２．Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：１３７９−８４；Ｋｕｍａｒ．，Ｓ．ら、２００６．ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２５：３８３−９２；Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：４５３１−４０）。ＩｇＥリーダーは、小胞体への挿入を高めるために使用され得る（Ｔｅｐｌｅｒ，Ｉら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５９１２）。

【0206】

導入遺伝子の発現は、発現を最適化するための適切な方法を選択することによって、最適化され得るおよび／またはコントロールされ得る。これらの方法は、例えば、プロモーター、送達方法および遺伝子配列を最適化する工程を含む（例えば、Ｌａｄｄｙ，Ｄ．Ｊ．ら、２００８．ＰＬｏＳ．ＯＮＥ ３ ｅ２５１７；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８に提示されているような）。

【0207】

核酸
本明細書中で使用される「核酸」は、一般に、核酸塩基を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその誘導体もしくはアナログの分子（１本、２本またはそれより多くの鎖）のことを指す。核酸塩基には、例えば、ＤＮＡ（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」またはシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」またはＣ）に見られる天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基が含まれる。用語「核酸」は、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を包含し、その各々は、用語「核酸」の亜属として包含される。核酸は、少なくとも、多くとも、または約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０もしくは１０００ヌクレオチド長、またはこの中の導き出せる任意の範囲の長さであり得る。

【0208】

本明細書中に提供される核酸は、別の核酸に対して同一または相補的である領域を有し得る。その相補的または同一である領域は、少なくとも５つ連続した残基であり得ることが企図されるが、その領域は、少なくとも、多くとも、または約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０または１０００個連続したヌクレオチドであることが特に企図される。

【0209】

本明細書中で使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズすることができる」は、二本鎖分子もしくは三本鎖分子、または部分的な二本鎖もしくは三本鎖の性質を有する分子を形成することを意味すると理解される。本明細書中で使用される用語「アニールする」は、「ハイブリダイズする」と同義である。用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズすることができる」は、用語「ストリンジェントな条件（複数可）」または「高ストリンジェンシー」および用語「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件（複数可）」を包含する。

【0210】

本明細書中で使用されるとき、「ストリンジェントな条件（複数可）」または「高ストリンジェンシー」は、相補的な配列（複数可）を含む１つ以上の核酸鎖の間のまたはその１つ以上の核酸鎖内のハイブリダイゼーションを可能にするが、ランダム配列のハイブリダイゼーションを妨げる条件である。ストリンジェントな条件は、核酸と標的鎖との間のミスマッチを、たとえあったにしてもほとんど許容しない。そのような条件は、公知であり、高選択性が要求される用途のために使用されることが多い。非限定的な用途としては、核酸（例えば、遺伝子またはその核酸セグメント）の単離、または少なくとも１つの特異的なｍＲＮＡ転写産物もしくはその核酸セグメントの検出などが挙げられる。

【0211】

ストリンジェントな条件は、約４２℃〜約７０℃の温度における約０．０２Ｍ〜約０．５Ｍ ＮａＣｌによって提供されるような、低塩および／または高温の条件を含み得る。所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、特定の核酸（複数可）の長さ、標的配列（複数可）の長さおよび核酸塩基含有量、核酸（複数可）の電荷組成、ならびにハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたは他の溶媒（複数可）の存在または濃度によって部分的に決定されることが理解される。

【0212】

ハイブリダイゼーションのためのこれらの範囲、組成および条件は、単なる非限定的な例という目的で言及されていること、特定のハイブリダイゼーション反応に対する所望のストリンジェンシーは、１つ以上のポジティブコントロールまたはネガティブコントロールとの比較によって経験的に決定されることが多いことが理解される。想定される用途に応じて、標的配列に対する様々な程度の核酸選択性を達成するために、様々なハイブリダイゼーション条件が使用され得る。非限定的な例では、ストリンジェントな条件下において核酸にハイブリダイズしない関係する標的核酸の同定または単離は、低温および／または高イオン強度におけるハイブリダイゼーションによって達成され得る。そのような条件は、「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」と呼ばれ、低ストリンジェンシーの非限定的な例としては、約２０℃〜約５０℃の温度範囲における約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍ ＮａＣｌで行われるハイブリダイゼーションが挙げられる。低または高ストリンジェンシー条件は、特定の用途に適合させるためにさらに改変され得る。

【0213】

「機能保存的バリアント」は、タンパク質または酵素の全体的な立体構造および機能を変化させずに所与のアミノ酸残基が変更されたタンパク質または酵素であり、それには、あるアミノ酸を、極性または非極性の性質、サイズ、形状および電荷を含む類似の特性を有するアミノ酸で置き換えたものが含まれるが、これらに限定されない。一般に公知の遺伝的にコードされないアミノ酸の多くに対する保存的アミノ酸置換は、当該分野で周知である。他のコードされないアミノ酸に対する保存的置換は、遺伝的にコードされるアミノ酸の特性と比べたときの物理的特性に基づいて決定され得る。

【0214】

保存アミノ酸と示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素において異なり得、機能が類似した任意の２つのタンパク質の間のタンパク質配列またはアミノ酸配列の類似性のパーセントは、変動し得、アラインメントスキームに従って決定されるとき、例えば、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％であり得る。本明細書中で言及されるとき、「配列類似性」は、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列が関係する程度を意味する。２つの配列間の類似性の程度は、配列同一性および／または保存のパーセントに基づき得る。本明細書中の「配列同一性」は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が不変である程度を意味する。「配列アラインメント」は、類似性の程度を評価する目的のために最大の同一性（およびアミノ酸配列の場合、保存）レベルを達成するように２つ以上の配列を並べるプロセスを意味する。配列をアラインメントするためおよび類似性／同一性を評価するための数多くの方法（例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくＣｌｕｓｔｅｒ法ならびにＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡなど）が、当該分野で公知である。これらのプログラムのうちのいずれかを使用するとき、好ましい設定は、最も高い配列類似性をもたらす設定である。

【0215】

核酸修飾
下記で論じられる修飾のいずれかが、核酸に適用され得る。修飾の例としては、ＲＮＡもしくはＤＮＡの骨格、糖または塩基、およびそれらの様々な組み合わせに対する変更が挙げられる。核酸における任意の好適な数の骨格結合、糖および／または塩基が、修飾され得る（例えば、独立して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、最大１００％）。修飾されていないヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素に結合された塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシルのうちのいずれか１つである。

【0216】

修飾塩基は、１’位におけるアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基である。修飾塩基の非限定的な例としては、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピンなどが挙げられる。修飾塩基の他の非限定的な例としては、ニトロピロリル（例えば、３−ニトロピロリル）、ニトロインドリル（例えば、４−、５−、６−ニトロインドリル）、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｙｌ）、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニルなどが挙げられる。

【0217】

いくつかの実施形態において、例えば、核酸（ｎｕｃｌｅｉｄ ａｃｉｄ）は、リン酸骨格修飾を有する修飾された核酸分子を含み得る。骨格修飾の非限定的な例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタールおよび／またはアルキルシリル修飾が挙げられる。ある特定の場合において、ヌクレオシドに天然に存在するリボース糖部分は、ヘキソース糖、多環式ヘテロアルキル環またはシクロヘキセニル基で置き換えられる。ある特定の場合において、ヘキソース糖は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースまたはそれらの誘導体である。ヘキソースは、Ｄ−ヘキソース、グルコースまたはマンノースであり得る。ある特定の場合において、多環式ヘテロアルキル基は、環内に１つの酸素原子を含む二環式環であり得る。ある特定の場合において、多環式ヘテロアルキル基は、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［３．２．１］オクタンまたはビシクロ［３．３．１］ノナンである。

【0218】

ニトロピロリル核酸塩基およびニトロインドリル核酸塩基は、ユニバーサル塩基として公知の化合物のクラスのメンバーである。ユニバーサル塩基は、オリゴヌクレオチド二重鎖の融解挙動または活性に実質的に影響せずに４つの天然に存在する塩基のいずれかを置き換え得る化合物である。天然に存在する核酸塩基に関連する安定化する水素結合相互作用とは対照的に、３−ニトロピロリル核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド二重鎖は、スタッキング相互作用によって単独で安定化され得る。ニトロピロリル核酸塩基との有意な水素結合相互作用が無いことにより、特定の相補性塩基に対する特異性は不必要になる。さらに、４−、５−および６−ニトロインドリルは、４つの天然塩基に対して非常に低い特異性しか示さない。１−（２’−Ｏ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ニトロインドールを調製するための手順は、Ｇａｕｂｅｒｔ，Ｇ．；Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００４，４５，５６２９に論じられている。他のユニバーサル塩基としては、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニルおよびそれらの構造的誘導体が挙げられる。

【0219】

ジフルオロトリルは、ユニバーサル塩基として機能する非天然の核酸塩基である。ジフルオロトリルは、天然の核酸塩基チミンの同配体である。しかしながら、チミンとは異なり、ジフルオロトリルは、天然塩基のいずれに対しても、顕著な選択性を示さない。ユニバーサル塩基として機能する他の芳香族化合物は、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾールおよび４−メチルベンゾイミダゾールである。さらに、比較的疎水性のイソカルボスチリリル誘導体である３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリルおよび３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリルは、天然塩基だけを含むオリゴヌクレオチド配列と比べてオリゴヌクレオチド二重鎖の不安定化をわずかにしか引き起こさないユニバーサル塩基である。他の非天然の核酸塩基としては、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニルおよびそれらの構造的誘導体が挙げられる。ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾールおよび上で言及された他の非天然塩基の合成手順を含むより詳細な考察については、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９：７２３８−７２４２（１９９４）を参照のこと。

【0220】

さらに、化学的置換基、例えば、架橋剤が、反応物に対して安定性または不可逆性をさらに付加するために使用され得る。架橋剤の非限定的な例としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル（ジスクシンイミジルエステル、例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）を含む）、二官能性マレイミド（例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの作用物質が挙げられる。

【0221】

ヌクレオチドアナログは、「ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）」核酸も含み得る。ある特定の組成物は、内因性の核酸を特定の構造に本質的に「繋ぎ止める」または「ロックする」ために使用され得る。配列を繋ぎ止めることは、核酸複合体の解離を防ぐために役立ち、ゆえに、複製を防ぎ得るだけでなく、内在性配列の標識、修飾および／またはクローニングも可能にし得る。ロックされた構造は、遺伝子発現を制御し得る（すなわち、転写または複製を阻害し得るかまたは増強し得る）か、または内在性の核酸配列を標識するためもしくはその他の方法で修飾するために使用され得る安定した構造として使用され得るか、またはその内在性配列を単離するために、すなわちクローニングのために使用され得る。

【0222】

核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡだけを含む分子に必ずしも限定されず、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含する。非ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのパーセントは、１％〜１００％（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５％）であり得る。

【0223】

核酸調製物
いくつかの実施形態において、例えば、アッセイにおけるコントロールまたは標準物質として、または治療薬として使用するための核酸が、提供される。核酸は、当該分野で公知の任意の手法（例えば、化学合成、酵素的生成または生物学的生成など）によって作製され得る。核酸は、生物学的サンプルから回収され得るかまたは単離され得る。核酸は、組換えであり得るか、または天然であり得るかもしくは細胞にとって内因性であり得る（細胞のゲノムから産生され得る）。生物学的サンプルは、小さい核酸分子の回収率を高めるような方法で処理され得ることが企図される。一般に、方法は、グアニジニウムおよび界面活性剤を有する溶液で細胞を溶解する工程を含み得る。

【0224】

核酸合成はまた、標準的な方法に従って行われ得る。合成核酸（例えば、合成オリゴヌクレオチド）の非限定的な例としては、ホスホトリエステル、ホスファイトもしくはホスホルアミダイト化学を使用するインビトロ化学合成および固相法によってまたはデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体を介して作製された核酸が挙げられる。様々な異なるオリゴヌクレオチド合成機構が、他の箇所に開示されている。

【0225】

核酸は、公知の手法を用いて単離され得る。特定の実施形態において、小さい核酸分子を単離するためおよび／またはＲＮＡ分子を単離するための方法が、使用され得る。クロマトグラフィーは、タンパク質または他の核酸から核酸を分離するためまたは単離するために使用されるプロセスである。そのような方法は、ゲルマトリックスを用いる電気泳動、フィルターカラム、アルコール沈殿および／または他のクロマトグラフィーを含み得る。細胞からの核酸が、使用されるかまたは評価される場合、方法は、一般に、特定のＲＮＡ集団を単離するためのプロセスを実行する前に、細胞をカオトロピック（例えば、グアニジニウムイソチオシアネート）および／または界面活性剤（例えば、Ｎ−ラウロイルサルコシン）で溶解する工程を含む。

【0226】

方法は、核酸を単離するための有機溶媒および／またはアルコールの使用を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞溶解産物に加えられるアルコールの量は、約５５％〜６０％というアルコール濃度に達する。種々のアルコールを使用できるが、エタノールがうまく機能する。固体支持体は、任意の構造であってよく、それには、電気陰性基を有する無機物またはポリマー支持体を含み得る、ビーズ、フィルターおよびカラムが含まれる。ガラス繊維のフィルターまたはカラムは、そのような単離手順にとって有効である。

【0227】

核酸単離プロセスは、時折、ａ）サンプル中の細胞を、グアニジニウムを含む溶解液で溶解する工程（ここで、少なくとも約１Ｍグアニジニウムの濃度を有する溶解産物が生成される）；ｂ）その溶解産物から核酸分子を、フェノールを含む抽出液を用いて抽出する工程；ｃ）その溶解産物にアルコール溶液を加えることにより、溶解産物／アルコール混合物を形成する工程（ここで、その混合物中のアルコールの濃度は、約３５％〜約７０％である）；ｄ）その溶解産物／アルコール混合物を固体支持体に適用する工程；ｅ）イオン性溶液を用いてその固体支持体から核酸分子を溶出する工程；およびｆ）その核酸分子を捕捉する工程を含み得る。サンプルは、乾燥され得、その後の操作にとって適切な液体および体積で再懸濁され得る。

【0228】

遺伝子移入の方法
細胞内での導入遺伝子発現の効果を媒介するために、発現構築物を細胞に移行させる必要があり得る。そのような移行は、ウイルスによる遺伝子移入方法またはウイルスによらない遺伝子移入方法を使用し得る。この項では、遺伝子移入の方法および組成物の考察が提供される。

【0229】

発現ベクターを含む形質転換された細胞は、その細胞に発現ベクターを導入することによって作製される。本方法とともに使用するための細胞小器官、細胞、組織または生物の形質転換のためのポリヌクレオチド送達に適した方法は、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を細胞小器官、細胞、組織または生物に導入し得る実質的に任意の方法を含む。

【0230】

宿主細胞は、ベクターに対するレシピエントとして使用され得るし、使用されてきた。宿主細胞は、所望の結果が、ベクターの複製であるかまたはベクターによってコードされるポリヌクレオチド配列の一部もしくは全部の発現であるかに応じて、原核生物または真核生物に由来し得る。数多くの細胞株および細胞培養物が、宿主細胞として使用するために利用可能であり、それらは、生存している培養物および遺伝物質に対する保管所としての機能を果たす組織であるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）を通じて入手することができる。具体的な実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、またはナチュラルキラーＴ細胞である。

【0231】

適切な宿主は、決定され得る。一般に、これは、ベクターの骨格および所望の結果に基づく。例えば、プラスミドまたはコスミドは、多くのベクターの複製のために、原核生物宿主細胞に導入され得る。ベクターの複製および／または発現のための宿主細胞として使用される細菌細胞としては、ＤＨ５アルファ、ＪＭ１０９およびＫＣ８、ならびにいくつかの商業的に入手可能な細菌宿主（例えば、ＳＵＲＥ（登録商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ＣｅｌｌｓおよびＳＯＬＯＰＡＣＫ Ｇｏｌｄ Ｃｅｌｌｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標），Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））が挙げられる。あるいは、大腸菌ＬＥ３９２などの細菌細胞が、ファージウイルスに対する宿主細胞として使用され得る。宿主細胞として使用され得る真核細胞としては、酵母、昆虫および哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの複製および／または発現のための哺乳動物真核生物宿主細胞の例としては、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＳａｏｓおよびＰＣ１２が挙げられるが、これらに限定されない。酵母株の例としては、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１が挙げられるが、これらに限定されない。

【0232】

核酸ワクチンは、例えば、非ウイルスＤＮＡベクター、「裸の」ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにウイルスベクターを含み得る。細胞をこれらのワクチンで形質転換する方法およびこれらのワクチンに含まれる遺伝子の発現を最適化するための方法は公知であり、それらの方法も本明細書中で論じられる。

【0233】

核酸またはウイルスベクターを移入する方法の例
細胞、例えば、Ｔ細胞をトランスフェクトするためもしくは形質導入するため、または本方法のヌクレオチド配列もしくは組成物を投与するために、任意の適切な方法が使用され得る。ある特定の例が、本明細書中に提示され、それらの例としてはさらに、カチオン性ポリマー、脂質様分子およびある特定の市販品、例えば、ＩＮ−ＶＩＶＯ−ＪＥＴ ＰＥＩなどを使用した送達などの方法が挙げられる。

【0234】

１．エキソビボ形質転換
生物から取り出された血管細胞および血管組織をエキソビボの環境においてトランスフェクトするために、様々な方法が利用可能である。例えば、イヌ内皮細胞は、インビトロにおけるレトロウイルス遺伝子移入によって遺伝的に変更され、イヌに移植された（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４４−１３４６，１９８９）。別の例では、ユカタンミニブタ内皮細胞を、インビトロにおいてレトロウイルスでトランスフェクトし、ダブルバルーンカテーテルを使用して動脈に移植した（Ｎａｂｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４（４９１０）：１３４２−１３４４，１９８９）。したがって、細胞または組織が、取り出され、本明細書中に提示されるポリヌクレオチドを使用してエキソビボにおいてトランスフェクトされ得ることが企図される。特定の態様において、移植された細胞または組織は、生物の中に配置され得る。例えば、動物由来の樹状細胞が、発現ベクターでその細胞をトランスフェクトし、次いで、トランスフェクトされたまたは形質導入された細胞をその動物に投与して戻す。

【0235】

２．注射
ある特定の実施形態において、細胞または核酸ベクターもしくはウイルスベクターは、１つ以上の注射（すなわち、針による注射）、例えば、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、前立腺内（ｉｎｔｒａｐｒｏｔａｔｉｃ）、腫瘍内、腹腔内（ｉｎｔｒｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）などを介して、細胞小器官、細胞、組織または生物に送達され得る。注射の方法としては、例えば（ｆｏｅ ｅｘａｍｐｌｅ）、食塩水溶液を含む組成物の注射が挙げられる。さらなる実施形態は、直接マイクロインジェクションによるポリヌクレオチドの導入を含む。使用される発現ベクターの量は、抗原の性質、ならびに使用される細胞小器官、細胞、組織または生物に応じて変動し得る。

【0236】

皮内注射、結節内注射またはリンパ管内注射は、ＤＣ投与のより一般的に使用される方法の一部である。皮内注射は、血流への吸収が低速度であるがリンパ系への取り込みが迅速であることを特徴とする。真皮に多数のランゲルハンス樹状細胞が存在することにより、インタクトな抗原ならびにプロセシングされた抗原が流入領域リンパ節に輸送され得る。これを正しく行うためには、適切な部位の準備が必要である（すなわち、適切な針の留置を観察するために、毛を刈り込む）。結節内注射は、リンパ系組織への抗原の直接的な送達を可能にする。リンパ管内注射は、ＤＣの直接投与を可能にする。

【0237】

３．エレクトロポレーション
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションを介して細胞小器官、細胞、組織または生物に導入される。エレクトロポレーションは、細胞およびＤＮＡの懸濁液を高圧放電に曝露することを含む。この方法のいくつかの変法では、ある特定の細胞壁分解酵素（例えば、ペクチン分解酵素）を使用して、標的レシピエント細胞を、未処理の細胞よりもエレクトロポレーションによる形質転換に対してより感受性にする（参照により本明細書中に援用される米国特許第５，３８４，２５３号）。

【0238】

エレクトロポレーションを使用した真核細胞のトランスフェクションは、かなり成功している。この様式で、マウスプレＢリンパ球がヒトカッパー免疫グロブリン遺伝子でトランスフェクトされ（Ｐｏｔｔｅｒら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，７１６１−７１６５）、ラット肝細胞がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされた（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６，７１６−７１８）。

【0239】

インビボにおけるワクチン用エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ）、すなわちｅＶａｃは、単純な注射法を介して臨床で実行されている。腫瘍抗原をコードするＤＮＡベクターが、患者の皮内に注射される。次いで、電極によって皮内の空間に電気的パルスが適用されることにより、そこに局在化している細胞、特に、常在の皮膚樹状細胞が、ＤＮＡベクターを取り込み、コードされる腫瘍抗原を発現するようになる。次いで、局所炎症によって活性化された、腫瘍抗原を発現しているこれらの樹状細胞が、リンパ節に遊走し、腫瘍抗原を提示し、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞をプライムし得る。核酸が、エレクトロポレーションによって細胞に送達され得る場合、その核酸は、例えば、限定されないが、核酸の注射または他の任意の投与手段の後で、エレクトロポレーションを使用して投与されるとき、電気穿孔的に（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒｅｔｉｃａｌｌｙ）投与される。

【0240】

エレクトロポレーションの方法は、例えば、Ｓａｒｄｅｓａｉ，Ｎ．Ｙ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ２３：４２１−９（２０１１）およびＦｅｒｒａｒｏ，Ｂ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ７：１２０−１２７（２０１１）（これらの全体が本明細書中で参照により援用される）に論じられている。

【0241】

４．リン酸カルシウム
他の実施形態では、リン酸カルシウム沈殿を用いて、ポリヌクレオチドが細胞に導入される。この手法を用いて、ヒトＫＢ細胞が、アデノウイルス５ＤＮＡでトランスフェクトされた（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４６７）。また、この様式において、マウスＬ（Ａ９）、マウスＣ１２７、ＣＨＯ、ＣＶ−１、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａ細胞が、ネオマイシンマーカー遺伝子でトランスフェクトされ（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７（８）：２７４５−２７５２，１９８７）、ラット肝細胞が、種々のマーカー遺伝子でトランスフェクトされた（Ｒｉｐｐｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０：６８９−６９５，１９９０）。

【0242】

５．ＤＥＡＥ−デキストラン
別の実施形態では、ＤＥＡＥ−デキストランの後にポリエチレングリコールを使用して、ポリヌクレオチドが細胞に送達される。この様式において、レポータープラスミドが、マウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞に導入された（Ｇｏｐａｌ，Ｔ．Ｖ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８５ Ｍａｙ；５（５）：１１８８−９０）。

【0243】

６．音波処理負荷（Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ Ｌｏａｄｉｎｇ）
さらなる実施形態は、直接音波負荷（ｄｉｒｅｃｔ ｓｏｎｉｃ ｌｏａｄｉｎｇ）によるポリヌクレオチドの導入を含む。ＬＴＫ線維芽細胞が、音波処理負荷によってチミジンキナーゼ遺伝子でトランスフェクトされた（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，８４６３−８４６７）。

【0244】

７．リポソーム媒介性トランスフェクション
さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、脂質複合体、例えば、リポソームなどの中に閉じ込められ得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内側の水性媒質を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒質によって隔てられた複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると、自発的に形成する。それらの脂質成分は、自己再配列を起こした後、閉鎖構造を形成し、水および溶解した溶質を脂質二重層の間に閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ ａｎｄ Ｂａｃｈｈａｗａｔ，（１９９１）Ｉｎ：Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｕｓｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｌｉｇａｎｄｓ．ｐｐ．８７−１０４）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体化されたポリヌクレオチドも企図される。

【0245】

８．レセプター媒介性トランスフェクション
なおもさらに、ポリヌクレオチドは、レセプター媒介性送達ビヒクルを介して標的細胞に送達され得る。これらは、標的細胞において生じているレセプター媒介性エンドサイトーシスによる高分子の選択的取り込みを利用する。様々なレセプターの細胞型特異的分布に照らして、この送達方法は、別の特異性の程度を付加する。

【0246】

ある特定のレセプター媒介性遺伝子標的化ビヒクルは、細胞レセプター特異的リガンドおよびポリヌクレオチド結合剤を含む。他のものは、送達されるべきポリヌクレオチドに作動可能に付着された細胞レセプター特異的リガンドを含む。いくつかのリガンドは、レセプター媒介性遺伝子移入のために使用され（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，４４２９−４４３２；Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７（９）：３４１０−３４１４，１９９０；Ｐｅｒａｌｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４０８６−４０９０，１９９４；Ｍｙｅｒｓ，ＥＰＯ ０２７３０８５）、これにより、この手法の実施可能性が確立される。別の哺乳動物細胞型における特異的送達も論じられている（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，１２：１５９−１６７，１９９３；参照により本明細書中に援用される）。ある特定の態様では、標的細胞集団上に特異的に発現されるレセプターに対応するリガンドが、選択される。

【0247】

他の実施形態において、細胞特異的ポリヌクレオチド標的化ビヒクルのポリヌクレオチド送達ビヒクル成分は、リポソームとともに特異的結合リガンドを含み得る。送達されるべきポリヌクレオチド（複数可）は、そのリポソーム内に収容され、特異的結合リガンドは、リポソーム膜に機能的に組み込まれる。このようにして、そのリポソームは、標的細胞のレセプター（複数可）に特異的に結合し、細胞にその内容物を送達し得る。そのようなシステムは、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）が、ＥＧＦレセプターのアップレギュレーションを示す細胞へのポリヌクレオチドのレセプター媒介性送達において使用されるシステムを使用して機能的であると示された。

【0248】

なおもさらなる実施形態において、標的化された送達ビヒクルのポリヌクレオチド送達ビヒクル成分は、リポソーム自体であり得、そのリポソームは、例えば、細胞特異的結合を指示する１つ以上の脂質または糖タンパク質を含み得る。例えば、ガラクトース末端のアシアロガングリオシドであるラクトシル−セラミドが、リポソームに組み込まれ、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増加が観察された（Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９，１５７−１７６）。組織特異的な形質転換構築物が、類似の様式で標的細胞に特異的に送達され得ることが企図される。

【0249】

９．微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）
微粒子銃法は、ポリヌクレオチドを少なくとも１つの細胞小器官、細胞、組織または生物に導入するために使用され得る（米国特許第５，５５０，３１８号；米国特許第５，５３８，８８０号；米国特許第５，６１０，０４２号；およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９６９９；これらの各々は、参照により本明細書中に援用される）。この方法は、ＤＮＡでコーティングされた微小発射体が高速度に加速して、それらが細胞膜を貫通し、細胞を殺傷せずにそれらの細胞に入ることを可能にする能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３）。当該分野で公知の多種多様の微粒子銃法が存在し、それらの多くは、本方法に適用可能である。

【0250】

この微粒子銃では、１つ以上の粒子が、少なくとも１つのポリヌクレオチドでコーティングされ、推進力によって細胞に送達され得る。小粒子を加速するためのいくつかのデバイスが、開発された。１つのそのようなデバイスは、電流を発生させ、その後その電流が輸送力を提供する高圧放電に依存する（Ｙａｎｇら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，９５６８−９５７２）。使用される微小発射体は、生物学的に不活性な物質（例えば、タングステンまたは金の粒子またはビーズ）からなった。例示的な粒子としては、タングステン、白金、およびある特定の例では、金から構成された粒子（例えば、ナノ粒子を含む）が挙げられる。場合によっては、金属粒子上へのＤＮＡ沈殿が、微粒子銃を使用したレシピエント細胞へのＤＮＡ送達に必要としないことが企図される。しかしながら、粒子は、ＤＮＡでコーティングされるのではなく、ＤＮＡを含み得ることが企図される。ＤＮＡでコーティングされた粒子は、粒子銃を介したＤＮＡ送達のレベルを上昇させ得るが、本質的に必要ない。

【0251】

ウイルスベクター媒介性移入方法の例
被験体内の単数または複数の細胞がヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子を発現し得るようにそのヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列を含む組成物をその細胞またはその被験体に投与するのに適した任意のウイルスベクターが、本方法において使用され得る。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、細胞への遺伝子移入を媒介するウイルス粒子に組み込まれる。代表的には、そのウイルスは、単純に、適切な宿主細胞に生理学的条件下で曝露されることにより、ウイルスの取り込みが可能になり得る。本方法は、下記で論じられるように、種々のウイルスベクターを使用して都合よく使用される。

【0252】

１．アデノウイルス
アデノウイルスは、その中程度のサイズのＤＮＡゲノム、操作の容易性、高力価、広範囲な標的細胞および高感染力を理由に、遺伝子トランスファーベクターとして使用するのに特に適している。およそ３６ｋｂのウイルスゲノムは、ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに必要なシス作用性エレメントを含む１００〜２００塩基対（ｂｐ）の末端逆位配列（ＩＴＲ）が境を接している。異なる転写単位を含む、ゲノムの初期（Ｅ）領域および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分割される。

【0253】

Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転写の制御に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現により、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質が合成される。これらのタンパク質は、ＤＮＡの複製、後期遺伝子の発現および宿主細胞の切り離しに関与する（Ｒｅｎａｎ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌ．，１９，１９７−２１８）。ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５）の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によってもたらされる単一の一次転写産物の有意なプロセシングの後にだけ、発現される。ＭＬＰ（１６．８マップ単位に位置する）は、感染の後期において特に有効であり、このプロモーターからもたらされたすべてのｍＲＮＡは、それらを翻訳にとって有用にする５’トリパータイトリーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ）（ＴＬ）配列を有する。

【0254】

アデノウイルスが遺伝子治療に対して最適化されるために、大きなＤＮＡセグメントを含むことができるように運搬能を最大にする必要がある。ある特定のアデノウイルス産物に関連する毒性および免疫学的反応を減少させることも非常に望ましい。これらの２つの目標は、アデノウイルス遺伝子の除去が両方の目的にかなうという点で、ある程度重なり合っている。本方法の実施によって、治療的な構築物を比較的容易にマニピュレートする能力を保持しつつ、これらの両方の目標を達成することができる。

【0255】

ウイルスＤＮＡの複製に必要とされるシスエレメントがすべて、直鎖状のウイルスゲノムのいずれかの末端の末端逆位反復配列（ＩＴＲ）（１００〜２００ｂｐ）に局在化するので、ＤＮＡの大きな置き換えが可能である。ＩＴＲを含むプラスミドは、非欠陥アデノウイルスの存在下において複製し得る（Ｈａｙ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９８４ Ｊｕｎ ５；１７５（４）：４９３−５１０）。ゆえに、これらのエレメントをアデノウイルスベクターに含めることにより、複製が可能になり得る。

【0256】

さらに、ウイルス封入のためのパッケージングシグナルは、ウイルスゲノムの左端の１９４〜３８５ｂｐ（０．５〜１．１マップ単位）に局在する（Ｈｅａｒｉｎｇら、Ｊ．（１９８７）Ｖｉｒｏｌ．，６７，２５５５−２５５８）。このシグナルは、左端に近いが付着末端配列の外側の特異的配列が、頭部構造へのＤＮＡの挿入に必要とされるタンパク質への結合を媒介する、バクテリオファージラムダＤＮＡにおけるタンパク質認識部位を模倣している。ＡｄのＥ１置換ベクターは、ウイルスゲノムの左端の４５０ｂｐ（０〜１．２５マップ単位）フラグメントが２９３細胞においてパッケージングを指示し得ることを実証した（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ，１０１：１９５−２０２，１９９１）。

【0257】

以前に、アデノウイルスゲノムのある特定の領域が、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、コードされている遺伝子が発現され得ることが示された。これらの細胞株は、その細胞株によってコードされる、アデノウイルス機能を欠いたアデノウイルスベクターの複製を支持することができる。「補助」ベクター、例えば、野生型ウイルスまたは条件欠陥性変異体による複製欠損性アデノウイルスベクターの補完の報告も存在する。

【0258】

複製欠損性アデノウイルスベクターは、ヘルパーウイルスによってトランスで補完され得る。しかしながら、複製機能を提供するのに必要なヘルパーウイルスが存在するせいで、いずれの調製物も汚染され得るので、この知見だけでは、複製欠損性ベクターの単離が可能にならない。したがって、複製欠損性ベクターの複製および／またはパッケージングに特異性を付加し得るさらなるエレメントが必要だった。そのエレメントは、アデノウイルスのパッケージング機能に由来する。

【0259】

アデノウイルスに対するパッケージングシグナルは、従来のアデノウイルスマップの左端に存在することが示されている（Ｔｉｂｂｅｔｔｓら（１９７７）Ｃｅｌｌ，１２，２４３−２４９）。後の研究から、ゲノムのＥ１Ａ（１９４〜３５８ｂｐ）領域に欠失を有する変異体が、初期（Ｅ１Ａ）機能を補完した細胞株においてさえ不十分にしか成長しないことが示された（Ｈｅａｒｉｎｇ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ，（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６７，８０９−８２２）。代償的な（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｎｇ）アデノウイルスＤＮＡ（０〜３５３ｂｐ）が、その変異体の右端に組み換えられたとき、そのウイルスは、正常にパッケージングされた。さらなる変異解析から、Ａｄ５ゲノムの左端に、短い反復性の位置依存性エレメントが同定された。その反復は、ゲノムのいずれかの末端に存在する場合、効率的なパッケージングには１コピーで十分であるが、Ａｄ５ ＤＮＡ分子の内側に向かって移動した場合は、そうではないことが見出された（Ｈｅａｒｉｎｇら、Ｊ．（１９８７）Ｖｉｒｏｌ．，６７，２５５５−２５５８）。

【0260】

パッケージングシグナルの変異バージョンを使用することによって、様々な効率でパッケージングされるヘルパーウイルスを作製することが可能である。代表的には、変異は、点変異または欠失である。パッケージングが低効率であるヘルパーウイルスをヘルパー細胞内で生育させるとき、そのウイルスは、野生型ウイルスと比べて低い速度であったとしてもパッケージングされ、それにより、ヘルパーの繁殖が可能となる。しかしながら、これらのヘルパーウイルスを、野生型パッケージングシグナルを含むウイルスとともに細胞内で生育させるとき、その野生型パッケージングシグナルは、変異バージョンよりも優先的に認識される。パッケージング因子の量が限られていることを考慮すると、野生型シグナルを含むウイルスは、ヘルパーと比べて選択的にパッケージングされる。優先性が十分大きい場合、均質に近い系統（stock）が達成され得る。

【0261】

特定の組織または種に対するＡＤＶ構築物の向性を改善するために、レセプター結合ファイバー配列は、しばしばアデノウイルス分離株の間で置換され得る。例えば、アデノウイルス５において見出されたコクサッキー−アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）リガンドは、アデノウイルス３５由来のＣＤ４６結合ファイバー配列の代わりに用いられ、ヒト造血細胞に対する結合親和性が大幅に改善されたウイルスが作製され得る。得られた「シュードタイプ化された」ウイルスであるＡｄ５ｆ３５は、いくつかの臨床的に開発されたウイルス分離株の基礎となった。さらに、例えばＴ細胞などの標的細胞に対してウイルスを再標的化することを可能にするファイバーを改変する様々な生化学的方法が存在する。方法は、二機能性抗体（一方の末端はＣＡＲリガンドに結合し、もう一方の末端は標的配列に結合する）の使用、およびカスタマイズされたアビジンベースのキメラリガンドとの会合を可能にするファイバーの代謝性のビオチン化を含む。あるいは、リガンド（例えば、抗ＣＤ２０５）をヘテロ二機能性リンカー（例えば、ＰＥＧ含有）によってアデノウイルス粒子に付着することができる。

【0262】

２．レトロウイルス
レトロウイルスは、そのＲＮＡを逆転写のプロセスによって感染細胞において二本鎖ＤＮＡに変換する能力を特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ，（１９９０）Ｉｎ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｅｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４３７−１５００）。次いで、得られたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞染色体内に安定に組み込み、ウイルスタンパク質の合成を指示する。その組み込みにより、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、３つの遺伝子、それぞれキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含む。ｐｓｉと呼ばれる、ｇａｇ遺伝子から上流に見られる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルとして機能する。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列が、ウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムへの組み込みにも必要である（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。したがって、例えば、本技術は、例えば、細胞を形質導入するために使用されるポリヌクレオチドがその細胞のゲノムに組み込まれた細胞を含む。

【0263】

レトロウイルスベクターを構築するために、プロモーターをコードする核酸を、ウイルスゲノム内のある特定のウイルス配列の位置に挿入することにより、複製欠損であるウイルスが作製される。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含むがＬＴＲおよびｐｓｉ成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎら（１９８３）Ｃｅｌｌ，３３，１５３−１５９）。レトロウイルスのＬＴＲ配列およびｐｓｉ配列とともにヒトｃＤＮＡを含む組換えプラスミドをこの細胞株に導入するとき（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、そのｐｓｉ配列は、その組換えプラスミドのＲＮＡ転写産物をウイルス粒子内にパッケージングさせ、次いでそれを培養培地中に分泌させる（Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｊ．Ｆ．，ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．Ｒ．，（１９８８）Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．）．Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ；Ｔｅｍｉｎら（１９８６）Ｉｎ：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４９−１８８；Ｍａｎｎら、１９８３）。組換えレトロウイルスを含む培地を捕集し、必要に応じて濃縮し、遺伝子移入のために使用する。レトロウイルスベクターは、幅広い種類の細胞型に感染することができる。しかしながら、多くのタイプのレトロウイルスの組み込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら（１９７５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７，２４２−２４８）。

【0264】

レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするようにデザインされたアプローチは、ウイルスエンベロープへのガラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づいて最近開発された。アシアロ糖タンパク質レセプターを介した肝細胞などの細胞の特異的感染を可能にし得るこの修飾が望まれる場合がある。

【0265】

組換えレトロウイルスの標的化に対する異なるアプローチがデザインされており、そのアプローチは、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体および特異的な細胞レセプターに対するビオチン化抗体を使用した。それらの抗体は、ストレプトアビジンを使用することによってビオチン成分を介して結合された（Ｒｏｕｘら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９０７９−９０８３）。主要組織適合遺伝子複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を使用して、それらの表面抗原を有する種々のヒト細胞がインビトロにおいてエコトロピックウイルスに感染することが実証された（Ｒｏｕｘら、１９８９）。

【0266】

３．アデノ随伴ウイルス
ＡＡＶは、約４７００塩基対の直鎖状の一本鎖ＤＮＡを使用する。末端逆位反復配列は、ゲノムに隣接している。２つの遺伝子が、ゲノム内に存在し、いくつかの異なる遺伝子産物を生じる。第１に、ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ−１、ＶＰ−２およびＶＰ−３と命名された３つの異なるビリオンタンパク質（ＶＰ）を生成する。第２に、ｒｅｐ遺伝子は、４つの非構造タンパク質（ＮＳ）をコードする。これらのｒｅｐ遺伝子産物の１つ以上は、ＡＡＶ転写のトランス活性化に関与する。

【0267】

ＡＡＶにおける３つのプロモーターは、ゲノム内のそれらの位置によって、マップ単位で命名されている。これらは、左から右へ、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０である。転写によって、６つの転写産物が生じ、２つは、３つの各プロモーターにおいて開始され、各対の一方がスプライシングされる。マップ単位４２〜４６に由来するスプライス部位は、各転写産物にとって同じである。４つの非構造タンパク質は、より長い転写産物に由来するとみられ、３つのビリオンタンパク質のすべてが、最も小さい転写産物から生じる。

【0268】

ＡＡＶは、ヒトにおけるいかなる病的状態にも関連しない。興味深いことに、効率的な複製のために、ＡＡＶは、単純ヘルペスウイルスＩおよびＩＩ、サイトメガロウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ならびに当然のことながらアデノウイルスなどのウイルスからの「補助」機能を必要とする。それらのヘルパーのうち最も特徴付けられたものは、アデノウイルスであり、このウイルスに対する多くの「初期」機能は、ＡＡＶの複製を支援すると示された。ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質の低レベルの発現は、ＡＡＶ構造発現を抑制すると考えられており、ヘルパーウイルス感染は、この阻止を取り消すと考えられている。

【0269】

ＡＡＶベクターの末端反復配列は、ＡＡＶまたは改変されたＡＡＶゲノムを含むｐ２０１などのプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化によって（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１：３０９６−３１０１（１９８７））またはＡＡＶの公開配列に基づく末端反復配列の化学的合成もしくは酵素的合成を含むがこれらに限定されない他の方法によって得ることができる。それは、例えば、機能、すなわち安定した部位特異的な組み込みを可能にするために必要とされるＡＡＶ ＩＴＲの最小の配列または一部を、欠失分析によって決定することができる。また、安定した部位特異的な組み込みを指示する末端反復配列の能力を維持しつつ、配列のどの軽微な改変が許容され得るかを判定することもできる。

【0270】

ＡＡＶベースのベクターは、インビトロにおいて遺伝子送達するための安全で有効なビヒクルであることが証明されており、これらのベクターは、開発されており、エキソビボとインビボの両方における潜在的な遺伝子治療において広範囲に適用するために前臨床段階および臨床段階において試験されている（Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｆｌｏｔｔｅ，（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７０；７９−９０；Ｃｈａｔｔｅｉｊｅｅら（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７０，７９−９０；Ｆｅｒｒａｒｉら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，３２２７−３２３４；Ｆｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，５２０−５３２；Ｆｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０６１３−１０６１７，（１９９３）；Ｇｏｏｄｍａｎら（１９９４），Ｂｌｏｏｄ，８４，１４９２−１５００；Ｋａｐｌｉｔｔら（１９９４）Ｎａｔ’ｌ Ｇｅｎｅｔ．，８，１４８−１５３；Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ．１９９６ Ｄｅｃ；６２（６）：１６６９−７６；Ｋｅｓｓｌｅｒら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１４０８２−１４０８７；Ｋｏｅｂｅｒｌら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１４２６−１４３１；Ｍｉｚｕｋａｍｉら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１７，１２４−１３０）。

【0271】

肺におけるＡＡＶ媒介性の効率的な遺伝子移入および遺伝子発現は、嚢胞性線維症の処置のための臨床試験に至っている（Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｆｌｏｔｔｅ，１９９５；Ｆｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０６１３−１０６１７，（１９９３））。同様に、骨格筋へのジストロフィン遺伝子のＡＡＶ媒介性の遺伝子送達による筋ジストロフィーの処置、脳へのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子送達によるパーキンソン病の処置、肝臓への第ＩＸ因子遺伝子送達による血友病Ｂの処置、および潜在的に、心臓への血管内皮成長因子遺伝子による心筋梗塞の処置の見込みは、これらの器官におけるＡＡＶ媒介性の導入遺伝子発現が高度に効率的であると最近示されたので、有望であるとみられる（Ｆｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，５２０−５３２；Ｆｌｏｔｔｅら、１９９３；Ｋａｐｌｉｔｔら、１９９４；１９９６；Ｋｏｅｂｅｒｌら、１９９７；ＭｃＣｏｗｎら（１９９６）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，７１３，９９−１０７；Ｐｉｎｇら（１９９６）Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，３，２２５−２２８；Ｘｉａｏら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，８０９８−８１０８）。

【0272】

４．他のウイルスベクター
他のウイルスベクターも、本発明の方法および組成物において発現構築物として用いられる。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，（１９８８）Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，ｐｐ．４６７−４９２；Ｂａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ，（１９８６）Ｉｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｐｐ．１１７−１４８；Ｃｏｕｐａｒら、Ｇｅｎｅ，６８：１−１０，１９８８）カナリアポックスウイルスおよびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターが使用される。これらのウイルスは、様々な哺乳動物細胞への遺伝子移入において使用するためのいくつかの特徴を提供する。

【0273】

いったん、構築物が細胞内に送達されたら、導入遺伝子をコードする核酸は、種々の部位に位置づけられ、発現される。ある実施形態おいて、導入遺伝子をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定に組み込まれる。この組み込みは、相同組換えを介して同種の（ｃｏｇｎａｔｅ）位置および向きである（遺伝子置換）かまたはランダムで非特異的な位置に組み込まれる（遺伝子増強）。なおもさらなる実施形態において、核酸は、ＤＮＡの別個のエピソームセグメントとして細胞において安定に維持される。そのような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期と無関係のまたはそれと同期した維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物がどのように細胞に送達され、その核酸が細胞のどこにとどまるかは、使用される発現構築物のタイプに依存する。

【0274】

疾患を処置するための方法
本方法は、疾患を処置するかまたは予防する方法も包含し、ここで、例えば注入による細胞の投与が、有益であり得る。

【0275】

細胞、例えば、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ＴＣＲを発現している細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、または前駆細胞など、例えば、造血幹細胞、間葉系ストローマ細胞、幹細胞、多能性幹細胞および胚性幹細胞などが、細胞治療のために使用され得る。それらの細胞は、ドナーに由来し得るか、または患者から得られた細胞であり得る。それらの細胞は、例えば、病的な細胞の機能を置き換えるための、例えば、再生において使用され得る。それらの細胞は、生物学的作用物質が、特定の微小環境、例えば、病的な骨髄または転移性の沈着物（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｄｅｐｏｓｉｔ）などに送達され得るように、異種遺伝子を発現するようにも改変され得る。間葉系ストローマ細胞は、例えば、免疫抑制活性を提供するためにも使用されており、移植片対宿主病および自己免疫障害の処置において使用され得る。本願において提供される細胞は、細胞治療後に治療用細胞の活性が取り除かれるか、増加されるか、または減少される必要がある状況において価値のあるものであり得る安全スイッチを含む。例えば、キメラ抗原レセプターを発現する前駆Ｔ細胞が患者に提供される場合、場合によっては、該細胞のより成熟した細胞型への不適切な分化または別組織のオフターゲット毒性への望ましくない誘因などの有害事象が存在し得る。リガンドの投与を終了すると、治療用Ｔ細胞は非活性化状態に戻り、無毒性の低い発現レベルで残存し得る。または、例えば、治療用細胞が取り除かれる必要がある場合である。その治療用細胞は、腫瘍細胞または腫瘍サイズを減少させるように働き得、もはや必要とされなくなることがある。この状況では、リガンドの投与は、終了してもよく、治療用細胞は、もはや活性化されない。最初の治療後に腫瘍細胞が再発する（ｒｅｔｕｒｎ）かまたは腫瘍サイズが増加する場合、キメラ抗原レセプターを発現しているＴ細胞を活性化させ、患者を再処置するために、リガンドが再度投与され得る。

【0276】

「治療用細胞」とは、細胞治療のために使用される細胞、すなわち、状態または疾患を処置するためまたは予防するために被験体に投与される細胞のことを意味する。

【0277】

用語「単位用量」は、それが接種材料に関するとき、哺乳動物に対する単位投与量（ｕｎｉｔａｒｙ ｄｏｓａｇｅｓ）として好適な物理的に分離した単位のことを指し、各単位は、必要とされる希釈剤とともに、所望の免疫刺激効果をもたらすと計算された所定の量の薬学的組成物を含む。接種材料の単位用量に対する詳述は、薬学的組成物のユニークな特色および達成されるべき特定の免疫学的効果によって規定され、それらに依存する。

【0278】

本明細書中に提示される多量体リガンドなどの薬学的組成物の有効量は、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９７％超または８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％もしくは１０％未満の治療用細胞が活性化されるような、誘導可能なキメラシグナル伝達分子を発現するＴ細胞を活性化するこの選択された結果を達成する量であり得る。この用語は、「十分な量」とも同義である。有効量は、所望の治療的応答（例えば、リガンド誘導物質が投与される前の時点と比べて、腫瘍サイズの減少、腫瘍細胞のレベルの低下、またはＣＤ１９発現白血病細胞のレベルの低下）を達成する量でもあり得る。

【0279】

任意の特定の用途に対する有効量は、処置される疾患もしくは状態、投与される特定の組成物、被験体のサイズおよび／または疾患もしくは状態の重症度などのような因子に応じて変動し得る。本明細書中に提示される特定の組成物の有効量は、過度の実験を必要とせずに、経験的に決定され得る。

【0280】

用語「接触される」および「曝露される」は、細胞、組織または生物に適用されるとき、薬学的組成物および／もしくは別の作用物質、例えば、化学療法剤または放射線治療薬などが、標的細胞、組織もしくは生物に送達されるプロセス、または標的細胞、組織もしくは生物のすぐ近位に配置されるプロセスを記述するために本明細書中で使用される。細胞の殺傷または静止を達成するために、薬学的組成物および／またはさらなる作用物質（複数可）が、細胞（複数可）を殺傷するのに有効または細胞の分裂を防ぐのに有効な合計量で１つ以上の細胞に送達される。

【0281】

薬学的組成物の投与は、数分から数週間の範囲の間隔だけ、他の作用物質（複数可）より先に行われ得る、他の作用物質（複数可）と同時であり得る、および／または他の作用物質（複数可）の後に行われ得る。薬学的組成物および他の作用物質（複数可）が別々に細胞、組織または生物に適用される実施形態では、その薬学的組成物および作用物質（複数可）がなおも、都合よく組み合わされた効果をその細胞、組織または生物に対して発揮することができ得るように、各送達の時点の間に有効時間が満了しないことが通常、保証され得る。例えば、そういった場合には、２、３、４つまたはそれより多くの様式を用いて、細胞、組織または生物を実質的に同時に（すなわち、約１分未満以内に）薬学的組成物と接触させ得ることが企図される。他の態様では、１つ以上の作用物質が、発現ベクターを投与する前および／または投与した後に、実質的に同時、約１分以内から、約２４時間、約７日間、約１〜約８週間またはそれより長くまで、およびそれらの中の任意の導き出せる範囲で投与され得る。なおもさらに、本明細書中に提示される薬学的組成物と１つ以上の作用物質との様々な併用レジメンが、使用され得る。

【0282】

最適化されたおよび個別化された治療的処置
リガンド誘導物質の投与量および投与スケジュールは、処置される疾患または状態のレベルを決定することによって最適化され得る。例えば、任意の残存している固形腫瘍のサイズ、または標的化される細胞、例えば、患者の中に残存している可能性がある腫瘍細胞またはＣＤ１９発現Ｂ細胞などのレベルが、決定され得る。

【0283】

例えば、患者が臨床的に関連するレベルの腫瘍細胞を有するか、または最初の治療の後に固形腫瘍を有するという判定は、多量体リガンドを投与することによる、キメラ抗原レセプターを発現しているＴ細胞活性化することによってそれらの細胞を活性化する必要があり得るという指示を臨床医に提供する。別の例では、多量体リガンドで処置した後に、患者が、低下したレベルの腫瘍細胞または減少した腫瘍サイズを有するという判定は、追加の用量の多量体リガンドが必要ないと臨床医に指示し得る。同様に、多量体リガンドで処置した後、患者が、疾患もしくは状態の症状を示し続けているかまたは症状の再発に苦しんでいるという判定は、少なくとも１つのさらなる用量の多量体リガンドを投与する必要があり得ると臨床医に指示し得る。用語「投与量」は、投与の用量と投与の頻度（例えば、次の投与のタイミングなど）の両方を含むと意味される。用語「投与量レベル」とは、被験体の体重との関係から投与される多量体リガンドの量のことを指す。したがって、投与量レベルの上昇は、被験体の体重に対して投与されるリガンドの量の増加を意味し得る。さらに、投与される用量（例えば、多量体リガンドが持続注入ポンプを使用して投与されるときなど）の濃度の上昇は、１分あたりまたは１秒あたりに投与される濃度（ひいては、投与される量）が上昇することを意味し得る。

【0284】

したがって、例えば、ある特定の実施形態において、上記方法は、多量体リガンドの投与後の腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞数と比べて、被験体における腫瘍サイズの増加および／または腫瘍細胞数の増加の存在または不在を決定する工程、ならびに腫瘍サイズの増加および／または腫瘍細胞数の増加の存在が決定された場合、さらなる用量の多量体リガンドを被験体に投与する工程を含む。上記方法は、例えば、多量体リガンドの投与後のＣＤ１９発現Ｂ細胞のレベルと比べて、被験体におけるＣＤ１９発現Ｂ細胞の増加の存在または不在を決定する工程、および被験体におけるＣＤ１９発現Ｂ細胞の増加の存在が決定された場合、さらなる用量の多量体リガンドを被験体に投与する工程も含む。これらの実施形態では、例えば、患者は最初に、本明細書中に提供される方法に従って治療用細胞およびリガンドで処置される。最初の処置の後、例えば、腫瘍サイズ、腫瘍細胞数またはＣＤ１９発現Ｂ細胞数は、最初の処置の前の時点と比べて減少し得る。この最初の処置の後のある特定の時点において、患者は、再度試験されるか、または患者は、疾患症状について継続的にモニターされ得る。例えば、腫瘍サイズ、腫瘍細胞数またはＣＤ１９発現Ｂ細胞数が、最初の処置の直後の時点と比べて増加していると判定される場合、リガンドは、さらなる用量のために投与され得る。誘導可能なキメラシグナル伝達分子を発現する治療用細胞が、さらなるリガンドの非存在下においては比較的不活性な状態であるが患者の中に残っているので、このモニタリングおよび処置スケジュールは、継続され得る。

【0285】

その後の薬物の用量、例えば、その後の多量体リガンドの用量、および／またはその後の薬物投与量などを調整するまたは維持する指示は、任意の好都合な様式で提供され得る。指示は、いくつかの実施形態において、表形式で（例えば、物理的媒体または電子媒体において）提供され得る。例えば、腫瘍細胞のサイズ、またはサンプル中の腫瘍細胞の数もしくはレベルが、表に提供され得、臨床医は、疾患のステージのリストまたは表とその症状を比較し得る。次いで、その臨床医は、その表から、その後の薬物用量に対する指示を特定し得る。ある特定の実施形態において、指示は、それらの症状がコンピュータに提供された後（例えば、コンピュータ上のメモリに入れられた後）、コンピュータによって提示され得る（例えば、表示され得る）。例えば、この情報は、コンピュータに提供され得（例えば、ユーザーによってコンピュータメモリに入れられ得るか、またはコンピュータネットワーク内のリモートデバイスを介してコンピュータに送信され得）、コンピュータ内のソフトウェアが、その後の薬物用量を調整するかもしくは維持するための指示を生成し得、および／またはその後の薬物用量の量を提供し得る。

【0286】

その後の用量が、指示に基づいて決定されたら、臨床医は、決定されたその後の用量を投与し得るか、または別の人もしくは実体に対してその用量を調整する指示書を提供し得る。本明細書中で使用される用語「臨床医」は、意思決定者のことを指し、ある特定の実施形態において、臨床医は、医療専門家である。意思決定者は、いくつかの実施形態において、コンピュータまたは表示されたコンピュータプログラムのアウトプットであり得、そのコンピュータによって表示される指示またはその後の薬物用量に基づいて、保健サービス提供者が行動し得る。意思決定者は、その後の用量を直接投与し得る（例えば、その後の用量を被験体に注入し得る）か、または遠隔的に投与し得る（例えば、ポンプパラメータが、意思決定者によって遠隔的に変更され得る）。

【0287】

本明細書中に提示されるような方法は、有効量の活性化された細胞、核酸またはそれをコードする発現構築物の送達を含むが、これらに限定されない。薬学的組成物の「有効量」は、一般に、述べられた所望の結果を検出可能におよび繰り返し達成するのに十分な量、例えば、疾患またはその症状を回復させるか、減少させるか、最小にするか、またはその程度を限定するのに十分な量として定義される。疾患の排除、根絶または治癒を含む他のより厳密な定義が、適用され得る。いくつかの実施形態において、処置の有効性を評価するためおよび毒性をコントロールするためにバイオマーカーをモニターする工程が存在し得る。

【0288】

免疫応答の増強
ある特定の実施形態において、生物学的経路、例えば、免疫学的経路、例えば、ＮＦ−カッパーＢ経路、Ａｋｔ経路および／またはｐ３８経路を活性化するシグナル伝達共刺激ポリペプチドの操作を組み込んだＤＣ活性化ストラテジーが企図される。このＤＣ活性化システムは、ＡＰＣ活性化においてＣＤ４^＋Ｔ細胞を助けるための要件に取って代わるので、免疫応答を増強する標準的なワクチンとともにまたは標準的なワクチンなしで使用され得る（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，Ｊｕｎ．４．３９３：ｐ．４７８−８０；Ｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｐ．，Ｄ．Ｒ．Ｆ，ａｎｄ Ｐ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，Ｊｕｎ．４．３９３：ｐ．４７４−８；Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，Ｊｕｎ．４．３９３：ｐ．４８０−３）。したがって、本明細書中に提示されるＤＣ活性化システムは、ＭＨＣクラスＩＩ特異的ペプチドを作製する必要性を回避することによって、免疫応答を増強する。

【0289】

特定の実施形態において、ＤＣ活性化は、ＣＤ４０活性化を介する。したがって、内因性のＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用を介したＤＣ活性化は、負のフィードバックに起因してダウンレギュレーションすることがあり、急速に「ＩＬ−１２バーンアウト作用（ｂｕｒｎ−ｏｕｔ ｅｆｆｅｃｔ）」がもたらされる。ＣＤ４０活性化後７〜１０時間以内に、ＣＤ４０の選択的スプライシングされたアイソフォーム（タイプＩＩ）が、分泌可能な因子として産生される（Ｔｏｎｅ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００１．９８（４）：ｐ．１７５１−１７５６）。タイプＩＩ ＣＤ４０は、ドミナントネガティブレセプターとして作用し得、ＣＤ４０Ｌを介してシグナル伝達をダウンレギュレートし、潜在的には、発生する免疫応答の効力を限定する。ゆえに、本方法は、誘導可能な形態のＣＤ４０（ｉＣＤ４０）を作製し、細胞外ドメインを欠損させ、代わりに化学誘導二量体化（ＣＩＤ）と呼ばれる技術によって合成二量体化リガンド（Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３．２６２：ｐ．１０１９−１０２４）によって活性化することによって、ＣＤ４０の天然の制御を取り込む。

【0290】

被験体における免疫応答を増強する方法が含まれ、その方法は、発現ベクター、発現構築物または形質導入された細胞をその被験体に投与する工程を含む。発現ベクターは、ｉＣＤ４０などの共刺激ポリペプチドをコードする。

【0291】

ある特定の実施形態において、上記細胞は、動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類における細胞である。上記被験体は、例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類であり得る。上記被験体は、例えば、ヒト、例えば、感染症に罹患している患者、および／または免疫無防備状態であるかもしくは過剰増殖性疾患に罹患している被験体であり得る。

【0292】

さらなる実施形態において、発現構築物および／または発現ベクターは、細胞を活性化する組成物または物質として利用され得る。「細胞を活性化する」または「細胞の活性（ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｅｌｌｓ）を増強する」そのような組成物とは、細胞に関連する１つまたはそれを超える活性を刺激する能力のことを指す。例えば、本方法の発現構築物またはベクターなどの組成物は、細胞上の共刺激分子のアップレギュレーションを刺激し得るか、細胞におけるＮＦ−カッパーＢの核移行を誘導し得るか、細胞におけるｔｏｌｌ様レセプター、またはサイトカインもしくはケモカインを含む他の活性を活性化し得る。

【0293】

発現構築物、発現ベクターおよび／または形質導入された細胞は、例えば、より弱い抗原（例えば、高度に精製された抗原または組換え抗原）の免疫原性を高めること、免疫応答に必要な抗原の量を減少させること、防御免疫をもたらすのに必要な免疫化の頻度を減少させること、免疫応答が低下しているかまたは弱まっている被験体（例えば、新生児、高齢および免疫無防備状態の個体）におけるワクチンの有効性を改善すること、および粘膜免疫などの標的組織における免疫を増強することによって、ワクチンの有効性を高め得るかもしくはワクチンの有効性に寄与し得るか、または特定のサイトカインプロファイルを誘発することによって細胞媒介性免疫もしくは体液性免疫を促進し得る。

【0294】

ある特定の実施形態において、細胞は、抗原とも接触される。しばしば、細胞は、エキソビボにおいて抗原と接触される。時折、細胞は、インビボにおいて抗原と接触される。いくつかの実施形態において、細胞は、被験体内に存在し、免疫応答が、抗原に対してもたらされる。時折、その免疫応答は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答である。時折、その免疫応答は、腫瘍抗原に対してもたらされる。ある特定の実施形態において、その細胞は、アジュバントの添加なしに活性化される。

【0295】

いくつかの実施形態において、細胞は、エキソビボにおいて核酸を形質導入され、皮内投与によって被験体に投与される。いくつかの実施形態において、細胞は、エキソビボにおいて核酸を形質導入され、皮下投与によって被験体に投与される。時折、細胞は、エキソビボにおいて核酸を形質導入される。時折、細胞は、インビボにおいて核酸を形質導入される。

【0296】

ある特定の実施形態において、エキソビボまたはインビボにおいて、キメラタンパク質をコードする核酸が細胞に形質導入され得る。細胞は、その細胞が多量体リガンドと接触されるのと同時に抗原に対して感作され得るか、または細胞は、その細胞が多量体化リガンドと接触される前に、予めその抗原に感作され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、エキソビボにおいて抗原と接触される。ある特定の実施形態では、エキソビボにおいて核酸が細胞に形質導入され、その細胞が、皮内投与によって被験体に投与され、時折、エキソビボにおいて細胞に核酸が形質導入され、皮下投与によって被験体に投与される。抗原は、腫瘍抗原であり得、流入領域リンパ節への細胞の遊走によってＣＴＬ免疫応答が誘導され得る。腫瘍抗原は、宿主において免疫応答を引き起こす任意の抗原、例えば、ペプチドまたはポリペプチドである。腫瘍抗原は、新生物腫瘍細胞に関連する腫瘍関連抗原であり得る。

【0297】

いくつかの実施形態において、免疫無防備状態の個体または被験体は、免疫応答が低下したまたは弱まった被験体である。そのような個体には、化学療法または免疫系を弱める他の任意の治療を受けた被験体、移植レシピエント、現在、免疫抑制剤を摂取している被験体、高齢化している個体、またはＣＤ４ Ｔヘルパー細胞が減少しているおよび／もしくは損なわれている任意の個体も含まれ得る。本方法は、免疫無防備状態の被験体におけるＣＤ４ Ｔヘルパー細胞の量および／または活性を高めるために利用され得ることが企図される。

【0298】

標的抗原によるチャレンジ
特定の実施形態において、形質導入された細胞を投与する前に、それらの細胞を抗原（本明細書中では「標的抗原」とも称される）でチャレンジする。チャレンジの後、負荷された形質導入された細胞は、被験体に非経口的に、皮内に、結節内に、またはリンパ内に（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃａｌｌｙ）、投与される。さらなる非経口的経路としては、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、動脈内、心筋内、経心内膜、経心外膜（ｔｒａｎｓｅｐｉｃａｒｄｉａｌ）、鞘内、前立腺内、腫瘍内および注入の手法が挙げられるが、これらに限定されない。

【0299】

標的抗原は、本明細書中で使用されるとき、抗原または抗原上の免疫学的エピトープであり、それは、哺乳動物における、免疫認識および疾患を引き起こす物質または疾患状態の最終的な排除またはコントロールにおいて重大である。その免疫認識は、細胞性および／または体液性であり得る。細胞内の病原体およびがんの場合、免疫認識は、例えば、Ｔリンパ球応答であり得る。

【0300】

標的抗原は、例えば、病原性の微生物、例えば、ＨＩＶ（Ｋｏｒｂｅｒら編 ＨＩＶ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，Ｎ．Ｍｅｘ．１９７７）、インフルエンザ、ヘルペス、ヒトパピローマウイルス（米国特許第５，７１９，０５４号）、Ｂ型肝炎（米国特許第５，７８０，０３６号）、Ｃ型肝炎（米国特許第５，７０９，９９５号）、ＥＢＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などを含むウイルスに由来し得るかまたはそれらから単離され得る。標的抗原は、病原菌、例えば、クラミジア（米国特許第５，８６９，６０８号）、マイコバクテリア、レジオネラ、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓ）、Ａ群連鎖球菌、サルモネラ、リステリア、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（米国特許第５，９５５，５９６号）などに由来し得るかまたはそれらから単離され得る。

【0301】

標的抗原は、例えば、アスペルギルス、侵襲性カンジダ（米国特許第５，６４５，９９２）、ノカルジア、ヒストプラスマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）、クリプトスポリジウムなどを含む病原性の酵母に由来し得るかまたはそれらから単離され得る。

【0302】

標的抗原は、例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、トリパノソーマ、リーシュマニア（米国特許第５，９６５，２４２号）、マラリア原虫（米国特許第５，５８９，３４３号）およびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉを含むがこれらに限定されない、病原性の原生動物および病原性の寄生生物に由来し得るかまたはそれらから単離され得る。

【0303】

標的抗原には、新生物発生前または過形成の状態に関連する抗原が含まれる。標的抗原はまた、がんに関連し得るか、またはがんの原因となり得る。そのような標的抗原は、例えば、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または組織特異的抗原、それらのエピトープおよびそれらのエピトープアゴニストであり得る。そのような標的抗原としては、がん胎児抗原（ＣＥＡ）およびそのエピトープ、例えば、ＣＡＰ−１、ＣＡＰ−１−６Ｄなど（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ２９５４０）、ＭＡＲＴ−１（Ｋａｗａｋａｒｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３４７−３５２，１９９４）、ＭＡＧＥ−１（米国特許第５，７５０，３９５号）、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ（米国特許第５，６４８，２２６号）、ＧＰ−１００（Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：６４５８−６４６２，１９９２）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、点変異したｒａｓがん遺伝子、正常なおよび点変異したｐ５３がん遺伝子（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：３５５１−３５５５，１９９４）、ＰＳＭＡ（Ｉｓｒａｅｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２２７−２３０，１９９３）、チロシナーゼ（Ｋｗｏｎら、ＰＮＡＳ ８４：７４７３−７４７７，１９８７）ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）（Ｃｏｈｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１８：２８０７−２８０８，１９９０；米国特許第５，８４０，８３９号）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（Ｃｈｅｎら、ＰＮＡＳ ９４：１９１４−１９１８，１９９７）、ＴＲＰ−２（Ｊａｃｋｓｏｎら、ＥＭＢＯＪ，１１：５２７−５３５，１９９２）、ＴＡＧ７２、ＫＳＡ、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ／ｃ−ｅｒｂ／Ｂ２（米国特許第５，５５０，２１４号）、ＢＲＣ−Ｉ、ＢＲＣ−ＩＩ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｐａｘ３−ｆｋｈｒ、ｅｗｓ−ｆｌｉ−１、ＴＡＡおよび組織特異的抗原の改変物、ＴＡＡのスプライスバリアント、エピトープアゴニストなどが挙げられるがこれらに限定されない。他のＴＡＡは、当該分野で公知の方法、例えば、米国特許第４，５１４，５０６号に開示されている方法によって同定され、単離され、クローニングされ得る。標的抗原は、１つまたはそれを超える成長因子および各々のスプライスバリアントも含み得る。

【0304】

ある抗原は、非がん細胞よりもがん細胞において、頻繁に発現され得る。その抗原は、改変された樹状細胞を、前立腺特異的膜抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）またはそのフラグメントと接触させた結果、生じ得る。

【0305】

前立腺抗原（ＰＡ００１）は、ＰＳＭＡ抗原の細胞外の一部からなる組換えタンパク質である。ＰＳＭＡは、ニューロペプチダーゼ活性および葉酸加水分解酵素活性を有する約１００ｋＤａ（グリコシル化前は８４ｋＤａであり、二量体としては約１８０ｋＤａ）のタイプＩＩ膜タンパク質であるが、ＰＳＭＡの真の機能は、現在のところ不明である。Ｃａｒｔｅｒ ＲＥら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９３：７４９−５３，１９９６；Ｉｓｒａｅｌｉ ＲＳら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２２７−３０，１９９３；Ｐｉｎｔｏ ＪＴら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２：１４４５−５１，１９９６．
発現は、広く前立腺特異的ではあるが前立腺特異的に限らず、進行型のホルモン不応性疾患において維持される。Ｉｓｒａｅｌｉ ＲＳら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：１８０７−１１，１９９４．前立腺以外の正常な組織における弱い検出が、唾液腺、脳、小腸、十二指腸粘膜、近位尿細管および結腸陰窩の神経内分泌細胞においても見られた。Ｓｉｌｖｅｒ ＤＡら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３：８１−５，１９９７；Ｔｒｏｙｅｒ ＪＫら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．６２：５５２−８，１９９５．さらに、ＰＳＭＡは、アンドロゲン枯渇療法（ＡＤＴ）の後にアップレギュレートされる。Ｗｒｉｇｈｔ ＧＬ，Ｊｒ．ら、Ｕｒｏｌｏｇｙ．４８：３２６−３４，１９９６．ほとんどのＰＳＭＡは、細胞質タンパク質として発現されるが、選択的スプライシングされた膜貫通型は、新生物前立腺細胞の頂端表面上の優勢型（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｔｅ ｆｏｒｍ）である。Ｓｕ ＳＬら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：１４４１−３，１９９５；Ｉｓｒａｅｌｉ ＲＳら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：６３０６−１０，１９９４．
さらに、ＰＳＭＡは、架橋後に内部移行され、結合した抗体または放射性ヌクレオチドもしくはウイルスおよび他の高分子複合体と複合体化したリガンドを内部移行するために使用されている。Ｌｉｕ Ｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：４０５５−６０，１９９８；Ｆｒｅｅｍａｎ ＬＭら、Ｑ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ．４６：１３１−７，２００２；Ｋｒａａｉｊ Ｒら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ．６２：２５３−９，２００５．Ｂａｎｄｅｒらは、腫瘍を微小管阻害剤で前処置すると、ＰＳＭＡの異常な基底面標的化および抗体媒介性の内部移行が増加することを実証した。Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ ＪＪら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．４：７０４−１４，２００５．腫瘍の標的化は、前立腺だけでなく腎臓および他の腫瘍の腫瘍血管内皮においてもＰＳＭＡの異所性発現が観察されることによって容易になり得る。Ｌｉｕ Ｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：３６２９−３４，１９９７；Ｃｈａｎｇ ＳＳら、Ｕｒｏｌｏｇｙ．５７：８０１−５，２００１；Ｃｈａｎｇ ＳＳら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：２６７４−８１，１９９９．
ＰＳＭＡは、対応する良性の組織の血管内皮細胞には見られない。ｄｅ ｌａ Ｔａｉｌｌｅ Ａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔ Ｐｒｅｖ．２４：５７９−８８，２０００．転移性前立腺疾患の初期の組織学的研究の１つは、約５０％（１８個中８個）の骨転移（８個中７個のリンパ節転移）だけしかＰＳＭＡを発現しなかったことを示唆したが、ＰＳＭＡの外部ドメインに標的化された、より感度の高い試薬である１７７Ｌｕで放射標識されたＭｏＡｂ Ｊ５９１は、３０人中３０人の患者において骨および軟部組織の転移の既知のすべての部位を標的化することができたことから、進行した前立腺疾患におけるほぼ普遍的な発現が示唆される。Ｂａｎｄｅｒ ＮＨら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２３：４５９１−６０１，２００５．
前立腺特異的抗原、すなわちＰＳＡは、ＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡに対して免疫応答、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得、かつ任意の抗ＰＳＡ抗体によって特異的に認識され得る、任意の抗原を含むと意味される。本方法において使用されるＰＳＡは、従来の方法を用いてアッセイされるとき、細胞を負荷するために使用されることができる。したがって、「前立腺特異的抗原」または「ＰＳＡ」は、例えば、ＰＳＡの野生型アミノ酸配列を有するタンパク質、またはＰＳＡタンパク質の一部を含むポリペプチドのことを指すことがある。

【0306】

前立腺特異的膜抗原、すなわちＰＳＭＡは、ＰＳＭＡに対する免疫応答、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得、かつ抗ＰＳＭＡ抗体によって特異的に認識され得る、任意の抗原を含むと意味される。本方法において使用されるＰＳＭＡは、従来の方法を用いてアッセイされるとき、細胞を負荷するために使用されることができる。したがって、「前立腺特異的膜抗原」または「ＰＳＭＡ」は、例えば、ＰＳＭＡの野生型アミノ酸配列を有するタンパク質、またはそのＰＳＭＡタンパク質の一部を含むポリペプチドのことを指すことがある。前述のもののいずれかのバリアントも含まれ、そのバリアントとしては、例えば、置換および欠失を有するバリアントが挙げられる。野生型ＰＳＭＡと差次的な翻訳後プロセシング（例えば、グリコシル化の差異）を有するタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドもまた、本方法において使用され得る。さらに、ＰＳＭＡに対する免疫応答を誘導することができる様々な糖分子もまた企図される。

【0307】

ＰＳＡポリペプチド、例えば、ＰＳＭＡポリペプチドは、改変された細胞を負荷するために使用され得る。ある特定の実施形態において、改変された細胞は、ＰＳＭＡポリペプチドフラグメントと接触される。いくつかの実施形態において、ＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡポリペプチドフラグメントは、シグナルペプチド配列を含まない。他の実施形態において、改変された細胞は、そのポリペプチドにおけるアミノ酸の置換または欠失を含むＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡポリペプチドフラグメントと接触され、そのフラグメントは、細胞を負荷するのに十分である。

【0308】

前立腺特異的タンパク質抗原、すなわちｓＰＳＰＡは、本明細書では前立腺特異的抗原またはＰＳＡとも称され、前立腺特異的タンパク質抗原に対する免疫応答、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得る任意の抗原を含むと意味される。これには、例えば、前立腺特異的タンパク質抗原または前立腺特異的抗原が含まれる。本方法において使用されるＰＳＰＡは、従来の方法を用いてアッセイされるとき、細胞を負荷するために使用されることができる。前立腺特異的抗原、すなわちＰＳＡは、例えば、ＰＳＡの野生型アミノ酸配列を有するタンパク質またはそのＰＳＡタンパク質の一部を含むポリペプチドのことを指すことがある。

【0309】

前立腺特異的膜抗原、すなわちＰＳＭＡは、ＰＳＭＡに対する免疫応答、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得、かつ抗ＰＳＭＡ抗体によって特異的に認識され得る、任意の抗原を含むと意味される。本方法において使用されるＰＳＭＡは、従来の方法を用いてアッセイされるとき、細胞を負荷するために使用されることができる。したがって、「前立腺特異的膜抗原」または「ＰＳＭＡ」は、例えば、ＰＳＭＡの野生型アミノ酸配列を有するタンパク質、またはそのＰＳＭＡタンパク質の一部を含むポリペプチドのことを指すことがある。前述のもののいずれかのバリアントも含まれ、そのバリアントとしては、例えば、置換および欠失を有するバリアントが挙げられる。野生型ＰＳＭＡと差次的な翻訳後プロセシング（例えば、グリコシル化の差異）を有するタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドもまた、本方法において使用され得る。さらに、ＰＳＭＡに対する免疫応答を誘導することができる様々な糖分子もまた企図される。

【0310】

ＰＳＰＡポリペプチド、例えば、ＰＳＭＡポリペプチドは、改変された細胞を負荷するために使用され得る。ある特定の実施形態において、改変された細胞は、ＰＳＭＡポリペプチドフラグメントと接触される。いくつかの実施形態において、ＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡポリペプチドフラグメントは、シグナルペプチド配列を含まない。他の実施形態において、改変された細胞は、そのポリペプチドにおけるアミノ酸の置換または欠失を含むＰＳＰＡ、例えば、ＰＳＭＡポリペプチドフラグメントと接触され、そのフラグメントは、細胞を負荷するのに十分である。

【0311】

腫瘍抗原は、宿主において腫瘍に対する免疫応答を引き起こす任意の抗原、例えば、ペプチドまたはポリペプチドであり得る。腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原、すなわち新生物腫瘍細胞に関連するものであり得る。

【0312】

前立腺がん抗原、すなわちＰＣＡは、宿主において前立腺がん腫瘍に対する免疫応答を引き起こす任意の抗原、例えば、ペプチドまたはポリペプチドである。前立腺がん抗原は、前立腺がん腫瘍に特異的である場合もあるし、または前立腺がん腫瘍に特異的でない場合もある。前立腺がん抗原は、他のタイプの腫瘍または新生物細胞に対しても免疫応答を引き起こし得る。前立腺がん抗原としては、例えば、前立腺特異的タンパク質抗原、前立腺特異的抗原および前立腺特異的膜抗原が挙げられる。

【0313】

上記細胞は、例えば、未分画の腫瘍溶解産物、ＭＨＣによって溶出されたペプチド、腫瘍由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ（ペプチドまたはタンパク質））を未熟なＤＣにパルスすること、またはバルク腫瘍ｍＲＮＡ、すなわちＴＡＡをコードするｍＲＮＡでＤＣをトランスフェクトすること（Ｇｉｌｂｏａ，Ｅ．＆ Ｖｉｅｗｅｇ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １９９，２５１−６３（２００４）；Ｇｉｌｂｏａ，Ｅ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ４，４０１−１１（２００４）に概説）をはじめとした様々な方法によって、腫瘍抗原、例えば、ＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡポリペプチドと接触され得る。

【0314】

ＤＮＡゲノムを含む生物の場合、標的抗原またはその目的の免疫学的エピトープをコードする遺伝子は、そのゲノムＤＮＡから単離される。ＲＮＡゲノムを有する生物の場合、所望の遺伝子は、そのゲノムのｃＤＮＡコピーから単離され得る。そのゲノムの制限酵素地図が入手可能である場合、目的の遺伝子を含むＤＮＡフラグメントは、日常的な方法による制限エンドヌクレアーゼ消化によって切断される。所望の遺伝子が以前にクローニングされていた場合、それらの遺伝子は、入手可能なクローンから容易に得られることがある。あるいは、その遺伝子のＤＮＡ配列が既知である場合、その遺伝子は、デオキシリボ核酸を合成するための任意の従来の手法によって合成することができる。

【0315】

目的の抗原をコードする遺伝子は、例えば、その遺伝子を細菌宿主にクローニングすることによって、増幅され得る。この目的のために、様々な原核生物のクローニングベクターが使用され得る。例は、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣおよびｐＥＭＢＬである。

【0316】

少なくとも１つの標的抗原またはその免疫学的エピトープをコードする遺伝子は、標準的な手法によるウイルスを用いた組換えのためにデザインされたプラスミドベクターに挿入するために調製され得る。一般に、クローニングされた遺伝子は、制限酵素消化によって原核生物クローニングベクターから切り取られ得る。ほとんどの場合、切り取られたフラグメントは、その遺伝子のコード領域全体を含み得る。クローニングされた遺伝子を有するＤＮＡフラグメントは、例えば、ウイルスを用いた組換えのために使用されるＤＮＡベクターの挿入部位と適合するフラグメントの末端を作製するために、必要に応じて改変され得、次いで、精製された後、そのベクターの制限エンドヌクレアーゼ切断部位（クローニング部位）に挿入される。

【0317】

細胞、例えば、樹状細胞の抗原負荷は、例えば、細胞、例えば、樹状細胞または前駆細胞を抗原と接触させることによって、例えば、細胞を抗原とともにインキュベートすることによって、達成され得る。負荷は、例えば、抗原をコードするＤＮＡ（裸のものまたはプラスミドベクター内のもの）またはＲＮＡを；または抗原を発現している組換え細菌またはウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、アデノウイルスまたはレンチウイルスベクター）とともにインキュベートすることによっても達成され得る。負荷の前に、抗原は、Ｔ細胞を助ける免疫学的パートナー（例えば、キャリア分子）に共有結合的に結合体化されてもよい。あるいは、樹状細胞は、別々にまたはポリペプチドの存在下において、結合体化されていない免疫学的パートナーでパルスされ得る。細胞由来の抗原またはＭＨＣ分子は、酸溶出または他の方法によって得られることがある（Ｚｉｔｖｏｇｅｌ Ｌら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９６．１８３：８７−９７を参照のこと）。それらの細胞は、それらの細胞が抗原で負荷される前、負荷された後、または負荷されるのと同時に、本方法に従って、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を形質導入され得るかまたはトランスフェクトされ得る。特定の実施形態において、抗原負荷は、形質導入またはトランスフェクションの後に行われる。

【0318】

さらなる実施形態において、形質導入された細胞は、腫瘍細胞ｍＲＮＡでトランスフェクトされる。形質導入され、トランスフェクトされた細胞は、動物に投与されて、細胞傷害性Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞の抗腫瘍抗原免疫応答をもたらし、その細胞は、二量体のＦＫ５０６および二量体のＦＫ５０６アナログによって制御される。腫瘍細胞ｍＲＮＡは、例えば、前立腺腫瘍細胞由来のｍＲＮＡであり得る。

【0319】

いくつかの実施形態において、形質導入された細胞は、腫瘍細胞溶解産物でパルスすることによって負荷され得る。パルスされ、形質導入された細胞は、動物に投与されて、細胞傷害性Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞の抗腫瘍抗原免疫応答をもたらし、その細胞は、二量体のＦＫ５０６および二量体のＦＫ５０６アナログを用いて制御される。その腫瘍細胞溶解産物は、例えば、前立腺腫瘍細胞溶解産物であり得る。

【0320】

免疫細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球応答
Ｔリンパ球は、本明細書中で論じられる発現ベクターを含む細胞との接触によって活性化され得、ここで、その細胞は、抗原でチャレンジされているか、トランスフェクトされているか、パルスされているか、または電気融合されている。

【0321】

Ｔ細胞は、その膜上にユニークな抗原結合レセプター（Ｔ細胞レセプター）を発現し、そのレセプターは、他の細胞の表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と共同して抗原を認識することだけができる。Ｔ細胞にはいくつかの集団、例えば、Ｔヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔ細胞がある。Ｔヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔ細胞は、第一に、それぞれ、膜結合糖タンパク質ＣＤ４およびＣＤ８のディスプレイによって区別される。Ｔヘルパー細胞は、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージおよび他の免疫系細胞の活性化にとって重大な様々なリンフォカインを分泌する。対照的に、抗原−ＭＨＣ複合体を認識するナイーブＣＤ８Ｔ細胞は、増殖し、細胞傷害性ＣＤ８Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と呼ばれるエフェクター細胞に分化する。ＣＴＬは、細胞溶解をもたらす物質を産生することによって、抗原をディスプレイしている体内の細胞（例えば、ウイルスに感染した細胞および腫瘍細胞）を排除する。

【0322】

ＣＴＬの活性は、例えば、本明細書中で論じられる方法によって評価され得る。例えば、ＣＴＬは、単離されたばかりの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）において評価され得るか、ＰＢＭＣから確立された、フィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）によって刺激され、ＩＬ−２によって拡大された細胞株において評価され得るか（Ｂｅｒｎａｒｄら、ＡＩＤＳ，１２（１６）：２１２５−２１３９，１９９８）、または予め免疫された被験体から単離され、抗原を含むアデノウイルスベクターに感染したＤＣで６日間にわたって再刺激されたＴ細胞によって、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出マイクロ毒性アッセイを用いて評価され得る。１つのタイプのアッセイは、クローン化Ｔ細胞を用いる。クローン化Ｔ細胞は、再指向化（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）細胞傷害性アッセイにおいてパーフォリン依存性の殺滅とＦａｓリガンド依存性の殺滅の両方を媒介する能力について試験された（Ｓｉｍｐｓｏｎら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１１５（４）：８４９−８５５，１９９８）。クローン化細胞傷害性Ｔリンパ球は、Ｆａｓ依存性殺滅とパーフォリン依存性殺滅の両方を示した。最近になって、新しい蛍光増幅システムを利用するインビトロデヒドロゲナーゼ放出アッセイが開発された（Ｐａｇｅ，Ｂ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９８ Ｊｕｌ−Ａｕｇ；１８（４Ａ）：２３１３−６）。このアプローチは、高感度であり、迅速であり、再現性があり、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）に対して有益に使用され得る。このアプローチは、細胞膜の完全性を用いる、大規模な細胞傷害性試験のためにさらに容易に自動化され得るので、考慮に入れられる。細胞媒介性の細胞傷害性を検出するために開発された別の蛍光定量的アッセイでは、使用されるフルオロフォアは、無毒性分子のＡｌａｍａｒＢｌｕｅである（Ｎｏｃｉａｒｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１３（２）：１５７−１６７，１９９８）。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅは、ミトコンドリアの還元が生じ、それによってＡｌａｍａｒＢｌｕｅの蛍光強度の劇的な増加（すなわち、量子収量の増加）がもたらされるまで、蛍光消光される（すなわち、低量子収量）。このアッセイは、極めて高感度であり、特異的であると報告されており、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイよりも有意に少ない数のエフェクター細胞しか必要ない。

【0323】

本方法によって誘導され得る他の免疫細胞としては、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）が挙げられる。ＮＫは、抗原特異的レセプターを欠き、自然免疫系の一部である、リンパ系細胞である。代表的には、感染した細胞は、通常、細胞表面ＭＨＣに結合した外来粒子によって警告されたＴ細胞によって破壊される。しかしながら、ウイルスに感染した細胞は、抗体によって認識されるウイルスタンパク質を発現することによって感染をシグナル伝達する。これらの細胞は、ＮＫによって殺滅され得る。腫瘍細胞では、その腫瘍細胞が、ＭＨＣ Ｉ分子の発現を失っている場合、それは、ＮＫに感受性であり得る。

【0324】

患者に投与するための製剤および経路
臨床適用が企図される場合、薬学的組成物（発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、形質導入された細胞、活性化Ｔ細胞、形質導入されたＴ細胞、および負荷されたＴ細胞）を、意図される用途にとって適切な形態で調製する必要があり得る。一般に、これは、発熱物質ならびにヒトまたは動物にとって有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴い得る。

【0325】

多量体リガンド、例えば、ＡＰ１９０３などは、例えば、約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ被験体体重、０．１〜２ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．０５〜１．０ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．２〜４ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．３〜３ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．３〜２ｍｇ／ｋｇ被験体体重または約０．３〜１ｍｇ／ｋｇ被験体体重、例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９もしくは１０ｍｇ／ｋｇ被験体体重の用量で送達され得る。いくつかの実施形態において、リガンドは、１用量あたり０．４ｍｇ／ｋｇ、例えば、５ｍｇ／ｍＬの濃度で提供される。リガンドを、例えば、バイアル１本あたり約０．２５ｍｌ〜約１０ｍｌ、例えば、約０．２５、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０ｍｌ、例えば、約２ｍｌの体積で含むバイアルまたは他の容器が提供され得る。

【0326】

ＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ
ＡＰ１９０３ ＡＰＩは、Ａｌｐｈｏｒａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．によって製造されており、ＡＰ１９０３ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは、Ｆｏｒｍａｔｅｃｈ Ｉｎｃによって作製されている。それは、非イオン性可溶化剤Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５（２５０ｍｇ／ｍＬ，ＢＡＳＦ）の２５％溶液中のＡＰ１９０３の５ｍｇ／ｍＬ溶液として製剤化されている。室温において、この製剤は、わずかに黄色の透明の溶液である。冷蔵されると、この製剤は、可逆的な相転移を起こし、乳白色の溶液になる。この相転移は、室温に再度温めると、元に戻る。１本分は、３ｍＬのガラスバイアルにおける２．３３ｍＬである（バイアル１本あたり合計約１０ｍｇのＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。

【0327】

ＡＰ１９０３は、患者に投与する前の夜に冷蔵庫から取り出され、およそ２１℃の温度で一晩保管され、その結果、その溶液は、希釈前に透明になる。その溶液は、注入開始の３０分以内にガラスボトルもしくはポリエチレンボトルまたは非ＤＥＨＰバッグにおいて調製され、投与するまでおよそ２１℃で保管される。

【0328】

すべての試験薬が、２℃〜８℃の温度で維持され、過剰な光および熱から保護され、アクセスが制限された鍵が掛かった区域で保管される。

【0329】

投与
１つの例において、患者には、非ＤＥＨＰで非エチレンオキシドの滅菌された注入セットを使用して、２時間にわたるＩＶ注入によって、単一の固定された用量のＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（０．４ｍｇ／ｋｇ）が投与される。ＡＰ１９０３の用量は、すべての患者に対して個別に計算され、体重が≧１０％上下しない限り、再計算されない。計算された用量は、注入前に０．９％生理食塩水で１００ｍＬに希釈される。

【0330】

患者は、注入終了後１５分間、都合の悪い有害作用について観察される。

【0331】

送達ベクターを安定にするためおよび標的細胞による取り込みを可能にするために適切な塩および緩衝剤を使用することが一般に望ましい場合がある。緩衝剤は、組換え細胞が患者に導入されるときにも使用され得る。水性組成物は、薬学的に許容され得るキャリアまたは水性媒質に溶解されたまたは分散された、細胞に対して有効量のベクターを含む。そのような組成物は、接種材料とも称される。句「薬学的にまたは薬理学的に許容され得る」とは、動物またはヒトに投与されたとき、有害（ａｄｖｅｒｓｅ）反応、アレルギー反応または他の有害（ｕｎｔｏｗａｒｄ）反応をもたらさない分子実体および組成物のことを指す。薬学的に許容され得るキャリアは、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質および作用物質の使用は、公知である。任意の従来の媒質または作用物質が、ベクターまたは細胞と不適合性である場合を除いては、治療的な組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分もまた、その組成物に組み込まれ得る。

【0332】

活性な組成物は、従来の医薬品を含み得る。これらの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の通常の経路を介し得る。これには、例えば、経口、経鼻、頬側、直腸、膣または局所的が含まれる。あるいは、投与は、同所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射による投与であり得る。そのような組成物は、通常、本明細書中で論じられる薬学的に許容され得る組成物として投与され得る。

【0333】

注射可能な使用に適した薬学的な形態としては、滅菌された水溶液または分散液、および滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時調製用の滅菌された粉末が挙げられる。すべての場合において、その形態は、滅菌されており、容易に注射できる程度に流動性である。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護される。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用すること、分散液の場合、必要とされる粒径を維持すること、および界面活性物質を使用することによって、維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。ある特定の例では、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムが、含められ得る。注射可能な組成物の持続性の吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物において使用することによってもたらされ得る。

【0334】

経口投与の場合、組成物は、賦形剤とともに組み込まれ得、摂取不可能なうがい薬および歯磨剤の形態で使用され得る。必要とされる量で活性成分をホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）などの適切な溶媒に組み込んでいるうがい薬が、調製され得る。あるいは、活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含む殺菌洗浄液に組み込まれ得る。活性成分は、例えば、ゲル、ペースト、粉末およびスラリーを含む、歯磨剤にも分散され得る。活性成分は、例えば、水、結合剤、研磨剤、香味料、起泡剤および湿潤剤を含み得るペースト歯磨剤に治療有効量で加えられ得る。

【0335】

組成物は、中性または塩の形態で製剤化され得る。薬学的に許容され得る塩としては、例えば、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸など、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸とともに形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基とともに形成される塩は、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄など、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基からも得ることができる。

【0336】

製剤化されると、溶液は、投与製剤（ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）に適合した様式で、および治療的に有効であるような量で、投与され得る。それらの製剤は、種々の剤形（例えば、注射可能な液剤、薬物放出カプセル剤など）で容易に投与される。例えば、水性液剤での非経口投与の場合、その液剤は、必要であれば適切に緩衝され得、最初に、液体希釈剤が、十分な食塩水またはグルコースで等張性にされ得る。これらの特定の水性液剤は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。この文脈では、滅菌された水性媒質が使用され得る。例えば、１投与量が、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、１０００ｍｌの皮下注入液に加えられ得るか、または提案される注入部位に注射され得る（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１０３５−１０３８および１５７０−１５８０頁を参照のこと）。処置されている被験体の状態に応じて、投与量のいくつかのバリエーションが必然的に生じる。いずれにしても、投与に関与する者が、個々の被験体に対する適切な用量を決定し得る。さらに、ヒトに投与する場合、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓの基準が要求するような、無菌性、発熱性ならびに一般的な安全性および純度の基準を満たし得る。

【0337】

投与スケジュールは、患者にふさわしいように決定され得、例えば、核酸が０週目に投与された後、二量体化化学誘導物質の投与による誘導が行われ、それに続いて、さらなる誘導物質が、有効な治療結果を得るのに必要なとき、または例えば、その後、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０間隔で、例えば、合計２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８または３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００週間わたって、投与される投薬スケジュールを含み得る。

【0338】

投与スケジュールは、患者にふさわしいように決定され得、例えば、核酸を形質導入されたＴ細胞または他の細胞が０週目に投与された後、二量体化化学誘導物質の投与による誘導が行われ、それに続いて、さらなる誘導物質が、有効な治療結果を得るのに必要なとき、または例えば、その後、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０間隔で、例えば、合計２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８または３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００週間わたって、投与される投薬スケジュールを含み得る。

【0339】

形質導入されたＴ細胞の投与の場合、おそらく、そのＴ細胞の１回の投与の後の複数回のリガンドの投与で十分であるが、Ｔ細胞は、１回よりも多く提供されてもよいし、他の細胞（例えば、本明細書中で論じられる非樹状細胞および非Ｂ細胞）が、複数回投与されてもよい。さらに、本技術の非Ｔ細胞の態様に標的化された核酸が、最適な治療効果のために、１回よりも多く投与されてもよい。ゆえに、例えば、投与スケジュールは、患者にふさわしいように決定され得、例えば、核酸または核酸を形質導入された細胞が０週目に投与された後、二量体化化学誘導物質の投与による誘導が行われ、それに続いて、その後、さらなる核酸または核酸を形質導入された細胞および誘導物質が２週間間隔で、例えば、合計２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８または３０週間にわたって投与される投薬スケジュールを含み得る。

【0340】

他の投薬スケジュールには、例えば、細胞が１回および誘導物質が１回投与されるスケジュールが含まれる。別の例では、スケジュールは、細胞を投与する工程を含み得、誘導物質が、０週目に投与された後、さらなる細胞および誘導物質の投与が、４週間間隔で、例えば、合計４、８、１２、１６、２０、２４、２８または３２週間にわたって行われる。

【0341】

ある用量の細胞の投与は、１セッションでまたは１セッションより多いセッションで行われ得るが、用量という用語は、リガンドを投与する前に投与される細胞の総量のことを指し得る。

【0342】

必要であれば、上記方法は、処置において使用されるより多くの細胞を得るためにさらなる白血球アフェレーシスをさらに含み得る。

【0343】

疾患を処置するための方法
本方法は、病原微生物によって引き起こされる疾患および／または過剰増殖性疾患の処置または予防の方法も包含する。

【0344】

処置され得るかまたは予防され得る疾患としては、ウイルス、細菌、酵母、寄生生物、原生動物、がん細胞などによって引き起こされる疾患が挙げられる。薬学的組成物（形質導入されたＴ細胞、発現ベクター、発現構築物など）は、一般化された免疫賦活物（Ｔ細胞を活性化する組成物またはシステム）として使用され得、それ自体、疾患を処置する際の有用性を有する。処置され得るおよび／または予防され得る例示的な疾患としては、ウイルス病因の感染症（例えば、ＨＩＶ、インフルエンザ、疱疹、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、パピローマウイルスなど）；または細菌病因の感染症（例えば、肺炎、結核、梅毒など）；または寄生生物病因の感染症（例えば、マラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症など）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0345】

薬学的組成物（形質導入されたＴ細胞、発現ベクター、発現構築物など）を使用して処置され得るかまたは予防され得る新生物発生前または過形成の状態としては、結腸ポリープ、クローン病、潰瘍性大腸炎、乳房病変などのような新生物発生前または過形成の状態が挙げられるが、これらに限定されない。

【0346】

薬学的組成物を使用して処置され得る、固形腫瘍を含むがんとしては、原発性または転移性メラノーマ、腺がん、扁平上皮がん腫、腺扁平上皮がん腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、肝臓がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵がん、結腸がん、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、ＮＰＣ、膀胱がん、子宮頸がんなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0347】

本明細書中に提示されるＴ細胞活性化システムおよび他の治療的細胞活性化システムを使用して処置され得る、固形腫瘍を含む他の過剰増殖性疾患としては、関節リウマチ、炎症性腸疾患、変形性関節症、平滑筋腫、アデノーマ、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、新生物発生前の病変（例えば、腺腫様過形成および前立腺上皮内新形成）、上皮内がん、口腔毛状白斑症または乾癬が挙げられるが、これらに限定されない。

【0348】

処置方法において、薬学的組成物（発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、形質導入された細胞、活性化Ｔ細胞、形質導入されたＴ細胞および負荷されたＴ細胞）の投与は、「予防的」または「治療的」な目的であり得る。薬学的組成物は、予防的に提供されるとき、任意の症候よりも先に提供される。薬学的組成物の予防的投与は、その後の任意の感染または疾患を予防するためまたは回復させるために役立つ。薬学的組成物は、治療的に提供されるとき、感染または疾患の症候の発生時または発生後に提供される。したがって、本明細書中に提示される組成物は、疾患を引き起こす物質もしくは疾患状態への予想される曝露の前または感染もしくは疾患の開始後に提供され得る。したがって、本明細書中で論じられる核酸およびリガンドを用いる、固形腫瘍（例えば、がんに見られる固形腫瘍、または例えば前立腺がんであるがこれに限定されない）の予防的処置のための方法が、本明細書中に提供される。例えば、被験体における腫瘍サイズを予防的に妨げるかまたは減少させる方法が提供され、その方法は、それを必要とする被験体に、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸および腫瘍抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドを含む核酸を投与する工程（ここで、そのキメラタンパク質は、膜標的化領域、多量体リガンド結合領域、ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド、ＭｙＤ８８ポリペプチドを含む）および多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与する工程を含み、ここで、その核酸およびリガンドは、被験体における腫瘍サイズを妨げるかまたは減少させるのに有効な量で投与される。被験体における腫瘍サイズを予防的に妨げるかまたは減少させる方法も提供され、その方法は、それを必要とする被験体に、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸および腫瘍抗原をコードするポリヌクレオチドを投与する工程（ここで、そのキメラタンパク質は、膜標的化領域、多量体リガンド結合領域、ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド、ＭｙＤ８８ポリペプチドを含む）および多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与する工程を含み、ここで、その核酸およびリガンドは、被験体における腫瘍サイズを妨げるかまたは減少させるのに有効な量で投与される。多量体化領域という用語は、本願では、リガンド結合領域という用語の代わりに使用されることがある。

【0349】

任意の組織または器官由来の固形腫瘍が、本方法を用いて処置され得るが、その固形腫瘍としては、血管構造において、ＰＳＡ、例えばＰＳＭＡを発現している任意の腫瘍、例えば、肺、骨、肝臓、前立腺または脳、ならびにまた、例えば、乳房、卵巣、腸、精巣、結腸、膵臓、腎臓、膀胱、神経内分泌系、軟部組織、骨塊（ｂｏｎｅｙ ｍａｓｓ）およびリンパ系に存在する固形腫瘍が挙げられる。処置され得る他の固形腫瘍としては、例えば、神経膠芽腫および悪性骨髄腫が挙げられる。

【0350】

用語「単位用量」は、それが接種材料に関するとき、哺乳動物に対する単位投与量として好適な物理的に分離した単位のことを指し、各単位は、必要とされる希釈剤とともに、所望の免疫原性効果をもたらすと計算された所定の量の薬学的組成物を含む。接種材料の単位用量に対する詳述は、薬学的組成物のユニークな特色および達成されるべき特定の免疫学的効果によって規定され、その特色に依存する。

【0351】

薬学的組成物の有効量は、免疫応答を増強するこの選択された結果を達成する量であり得、そのような量は、決定され得る。例えば、免疫系不全を処置するための有効量は、免疫系の活性化を引き起こし、抗原に曝露されたときに抗原特異的な免疫応答を発生させるために必要な量であり得る。この用語は、「十分な量」とも同義である。

【0352】

任意の特定の用途に対する有効量は、処置されている疾患もしくは状態、投与される特定の組成物、被験体のサイズおよび／または疾患もしくは状態の重症度のような因子に応じて変動し得る。本明細書中に提示される特定の組成物の有効量は、過度の実験を必要とせずに、経験的に決定され得る。したがって、例えば、１つの実施形態において、形質導入されたＴ細胞または他の細胞は、例えば、免疫応答を誘導するのに有効な量で、または例えば、腫瘍サイズを減少させるかもしくは腫瘍血管構造の量を減少させるのに有効な量で、被験体に投与される。

【0353】

いくつかの実施形態において、多量体リガンドが、被験体に複数回投与され、その複数回投与の間で投与量レベルを漸増させながら投与される。いくつかの実施形態において、投与量レベルの漸増は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性のレベルを上げ、ゆえに、治療効果（例えば、標的細胞、例えば、腫瘍細胞の量または濃度の減少）を高める。いくつかの実施形態において、用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇに漸増させる。いくつかの実施形態において、それらの用量は、約１５〜３０分きざみで投与される。いくつかの実施形態において、多量体リガンドは、持続注入ポンプを用いて投与され、多量体リガンドの濃度は、注入中に上げられる。いくつかの実施形態において、多量体リガンドは、別個の用量で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０日空けて、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１ヶ月空けて、または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０年空けて投与される。

【0354】

いくつかの実施形態において、個別化された処置が提供され、ここで、その疾患または状態のステージまたはレベルは、多量体リガンドを投与する前、さらなる用量の多量体リガンドを投与する前、または多量体リガンドの投与に関与する方法および投与量を決定する際に、決定される。これらの方法は、本願の方法のいずれかにおいて使用され得る。リガンドを投与する前に患者を評価するこれらの方法は、例えば固形腫瘍を有する被験体の処置の文脈において論じられるが、これらの方法は、他の状態および疾患の処置にも同様に適用され得ると理解される。したがって、例えば、本願のいくつかの実施形態において、本方法は、本願の改変された細胞を被験体に投与する工程を含み、さらに、腫瘍サイズの有効な減少レベルを達成するための多量体リガンドの適切な用量を決定する工程を含む。いくつかの例では、必要とされる治療結果を達成するために十分なレベルの共刺激分子の活性を誘導することによって、ＣＡＲ−Ｔ細胞を活性化するために、より少ない用量で十分であり得る。いくつかの例では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性のより高いレベルの共刺激を達成するためには、より高い用量が必要である場合もある。リガンドの量は、例えば、被験体の臨床上の状態、体重および／もしくは性別または他の関連する身体的特色に基づいて決定され得る。被験体に投与される多量体リガンドの量をコントロールすることによって、有害事象、例えば、サイトカインストームの可能性が、低下し得る。ＣＡＲとともに誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激分子を発現する改変された細胞の抗腫瘍活性は、適切な投与量の多量体リガンドを用いて調節され得る。したがって、ある特定の実施形態において、改変された細胞が被験体に投与され、ある投与量の多量体リガンドが投与される方法が提供され；この最初の投与の後に、その方法は、その患者における、ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性のレベルの増加または減少を必要とする状態の有無を特定する工程を含み得、その工程は、第１の用量よりも高いまたは低い濃度のさらなる用量の多量体リガンドによって達成され得る。したがって、その方法は、その患者において特定された状態の有無に基づいて、誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激分子の多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与する工程、その多量体リガンドのその後の投与量を維持する工程、またはその患者への多量体リガンドのその後の投与量を調整する工程を含む。

【0355】

用語「投与量」は、投与の用量と投与の頻度（例えば、次の投与のタイミング）の両方を含むと意味される。用語「投与量レベル」とは、被験体の体重との関係から投与される多量体リガンドの量のことを指す。したがって、投与量レベルの上昇は、被験体の体重に対して投与されるリガンドの量の増加を意味し得る。さらに、投与される用量（例えば、多量体リガンドが持続注入ポンプを使用して投与されるとき）の濃度の上昇は、１分あたりまたは１秒あたりに投与される濃度（ひいては、投与される量）が上昇することを意味し得る。

【0356】

その後の薬物の用量、例えば、その後の多量体リガンドの用量、および／またはその後の薬物投与量を調整するまたは維持する指示は、任意の好都合な様式で提供され得る。指示は、いくつかの実施形態において、表形式で（例えば、物理的媒体または電子媒体において）提供され得る。例えば、疾患または状態の症候が、表として提供され得、臨床医は、疾患のステージのリストまたは表とその症候を比較し得る。次いで、その臨床医は、その表から、その後の薬物用量に対する指示を特定し得る。ある特定の実施形態において、指示は、それらの症候またはステージがコンピュータに提供された後（例えば、コンピュータ上のメモリに入れられた後）、コンピュータによって提示され得る（例えば、表示され得る）。例えば、この情報は、コンピュータに提供され得（例えば、ユーザーによってコンピュータメモリに入れられ得るか、またはコンピュータネットワーク内のリモートデバイスを介してコンピュータに送信され得）、コンピュータ内のソフトウェアが、その後の薬物用量を調整するかもしくは維持することについての指示を生成し得、および／またはその後の薬物用量の量を提供し得る。

【0357】

その後の用量が、指示に基づいて決定されたら、臨床医は、決定されたその後の用量を投与し得るか、または別の人もしくは実体に対してその用量を調整する指示書を提供し得る。本明細書中で使用される用語「臨床医」は、意思決定者のことを指し、ある特定の実施形態において、臨床医は、医療専門家である。意思決定者は、いくつかの実施形態において、コンピュータまたは表示されたコンピュータプログラムのアウトプットであり得、そのコンピュータによって表示される指示またはその後の薬物用量に基づいて、保健サービス提供者が行動し得る。意思決定者は、その後の用量を直接投与し得る（例えば、その後の用量を被験体に注入し得る）か、または遠隔的に投与し得る（例えば、ポンプパラメータが、意思決定者によって遠隔的に変更され得る）。

【0358】

本明細書中に提示されるような方法は、有効量の活性化された細胞、核酸またはそれをコードする発現構築物の送達を含むが、これらに限定されない。薬学的組成物の「有効量」は、一般に、述べられた所望の結果を検出可能におよび繰り返し達成するのに十分な量、例えば、疾患またはその症候を回復させるか、減少させるか、最小にするか、またはその程度を限定するのに十分な量として定義される。疾患の排除、根絶または治癒を含む他のより厳密な定義が、適用され得る。いくつかの実施形態において、処置の有効性を評価するためおよび毒性をコントロールするために生物学的マーカーをモニターする工程が存在し得る。

【0359】

Ａ．遺伝子に基づく治療
ある特定の実施形態において、共刺激ポリペプチド（例えば、本明細書中で論じられるもの）を提供することができる発現構築物が、細胞に、および例えばＴ細胞において提供される。発現ベクターおよびその中に使用される遺伝的エレメントに関する長い考察が、参照によりこの項に援用される。ある特定の例では、発現ベクターは、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびレトロウイルス）であり得る。別の例では、ベクターは、リソソームによって被包された発現ベクターであり得る。

【0360】

遺伝子送達は、インビボとエキソビボの両方の状況において行われ得る。ウイルスベクターの場合、一般に、ウイルスベクターストックが調製され得る。エキソビボおよびインビボにおけるウイルスベクター媒介性の遺伝子送達の例は、本願において提示される。インビボで送達する場合、ウイルスの種類および達成可能な力価に応じて、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０^４、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０^５、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０^６、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０^７、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０^８、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０^９、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０^１０、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０^１１または１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０^１２個の感染性粒子が患者に送達され得る。類似の数字は、相対的な取り込み効率を比較することによって、リポソーム製剤または他の非ウイルス製剤に対して外挿され得る。薬学的に許容され得る組成物としての製剤は、下記で論じられる。多量体リガンド、例えば、ＡＰ１９０３などは、例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９または１０ｍｇ／ｋｇ被験体体重の用量で送達され得る。

【0361】

Ｂ．細胞に基づく治療
企図される別の治療は、形質導入されたＴ細胞の投与である。それらのＴ細胞は、インビトロにおいて形質導入され得る。薬学的に許容され得る組成物としての製剤は、本明細書中で論じられる。

【0362】

細胞に基づく治療では、形質導入される細胞は、例えば、標的抗原核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）もしくはタンパク質でトランスフェクトされ得るか；細胞溶解産物、タンパク質もしくは核酸でパルスされ得るか；または細胞と電気的に融合され得る。それらの細胞、タンパク質、細胞溶解産物または核酸は、腫瘍細胞などの細胞、または他の病原微生物、例えば、ウイルス、細菌、原生動物などに由来し得る。

【0363】

Ｃ．併用療法
本明細書中に提示される発現ベクターの有効性を高めるために、これらの組成物および方法をその疾患の処置において有効な作用物質と組み合わせることが、望ましい場合がある。

【0364】

ある特定の実施形態において、抗癌剤が、本方法と組み合わせて使用され得る。「抗癌」剤は、例えば、１つ以上の癌細胞を殺傷すること、１つ以上の癌細胞においてアポトーシスを誘導すること、１つ以上の癌細胞の成長速度を低下させること、転移の発生率もしくは数を減少させること、腫瘍のサイズを減少させること、腫瘍の成長を阻害すること、腫瘍もしくは１つ以上の癌細胞への血液の供給を減少させること、１つ以上の癌細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進すること、癌の進行を予防するかもしくは阻害すること、または癌を有する被験体の寿命を延長することによって、被験体における癌に悪影響を与えることができる。抗癌剤としては、例えば、化学療法剤（化学療法）、放射線治療剤（放射線治療）、外科手技（手術）、免疫治療剤（免疫療法）、遺伝的治療剤（遺伝子治療）、ホルモン治療、他の生物学的薬剤（生物療法）および／または代替療法が挙げられる。

【0365】

さらなる実施形態では、感染症を処置するためおよび／または予防するために、抗生物質が薬学的組成物と組み合わせて使用され得る。そのような抗生物質としては、アミカシン、アミノグリコシド類（例えば、ゲンタマイシン）、アモキシシリン、アンホテリシンＢ、アンピシリン、アンチモン類（ａｎｔｉｍｏｎｉａｌｓ）、アトバコン、スチボグルコン酸ナトリウム、アジスロマイシン、カプレオマイシン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフトリアキソン、クロラムフェニコール、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、クロファジミン、サイクロセリン、ダプソン、ドキシサイクリン、エタンブトール、エチオナミド、フルコナゾール、フルオロキノロン類、イソニアジド、イトラコナゾール、カナマイシン、ケトコナゾール、ミノサイクリン、オフロキサシン）、パラ−アミノサリチル酸、ペンタミジン、ポリミキシン、ディフェンシン類（ｄｅｆｉｎｓｉｎｓ）、プロチオナミド、ピラジナミド、ピリメタミン、スルファジアジン、キノロン類（例えば、シプロフロキサシン）、リファブチン、リファンピン、スパルフロキサシン、ストレプトマイシン、スルホンアミド類、テトラサイクリン類、チアセタゾン、トリメトプリム（ｔｒｉｍｅｔｈａｐｒｉｍ）−スルファメトキサゾール、バイオマイシンまたはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0366】

より一般的には、そのような薬剤は、癌細胞および／もしくは微生物を殺傷するためまたは癌細胞および／もしくは微生物の増殖を阻害するために有効な発現ベクターとともに、合計量で提供され得る。このプロセスは、細胞（複数可）を薬剤（複数可）および薬学的組成物と同時にまたはある時間内に接触させる工程を含み得、ここで、細胞、組織または生物への薬学的組成物と薬剤との別個の投与によって、所望の治療的な利益がもたらされる。これは、薬学的組成物と１つ以上の薬剤の両方を含む単一の組成物または薬理学的製剤と細胞、組織もしくは生物を接触させることによって、または２つ以上の別々の組成物もしくは製剤（ここで、一方の組成物は薬学的組成物を含み、他方は１つ以上の薬剤を含む）と細胞を接触させることによって達成され得る。

【0367】

用語「接触される」および「曝露される」は、細胞、組織または生物に適用されるとき、薬学的組成物および／もしくは別の作用物質、例えば、化学療法剤または放射線治療薬などが標的細胞、組織もしくは生物に送達されるプロセスを記述するために本明細書中で使用されるか、または標的細胞、組織もしくは生物のすぐ近位に配置されるプロセスを記述するために本明細書中で使用される。細胞の殺傷または静止を達成するために、薬学的組成物および／またはさらなる作用物質（複数可）が、細胞（複数可）を殺傷するのに有効または細胞の分裂を防ぐのに有効な合計量で１つ以上の細胞に送達される。

【0368】

薬学的組成物の投与は、数分から数週間の範囲の間隔だけ、他の作用物質（複数可）より先に行われ得る、他の作用物質（複数可）と同時であり得る、および／または他の作用物質（複数可）の後に行われ得る。薬学的組成物および他の作用物質（複数可）が別々に細胞、組織または生物に適用される実施形態では、その薬学的組成物および作用物質（複数可）がなおも、都合よく組み合わされた効果をその細胞、組織または生物に対して発揮することができ得るように、各送達の時点の間に有効時間が満了しないことが通常、保証され得る。例えば、そういった場合には、２、３、４つまたはそれより多くの様式を用いて、細胞、組織または生物を実質的に同時に（すなわち、約１分未満以内に）薬学的組成物と接触させ得ることが企図される。他の態様において、１つ以上の作用物質が、発現ベクターを投与する前および／または投与した後に、実質的に同時、約１分以内から、約２４時間、約７日間、約１〜約８週間またはそれより長くまで、およびそれらの中の任意の導き出せる範囲で投与され得る。なおもさらに、本明細書中に提示される薬学的組成物と１つ以上の作用物質との様々な併用レジメンが、使用され得る。

【0369】

いくつかの実施形態において、化学療法剤は、タキソテール（ドセタキセル）または別のタキサン、例えば、カバジタキセル（ｃａｂａｚｉｔａｘｅｌ）などであり得る。化学療法剤は、細胞および誘導物質による処置の前、処置中または処置の後に投与され得る。例えば、化学療法剤は、第１の用量の活性化された核酸を投与する約１年前、１１、１０、９、８、７、６、５もしくは４ヶ月前、または１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２，１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２週間前もしくは１週間前に、投与され得る。または、例えば、化学療法剤は、第１の用量の細胞または誘導物質を投与した約１週間後、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７もしくは１８週間後、または４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１ヶ月後、または１年後に投与され得る。

【0370】

化学療法剤の投与は、２つ以上の化学療法剤の投与を含み得る。例えば、シスプラチンは、タキソテールまたは他のタキサン、例えば、カバジタキセルなどに加えて投与され得る。

【0371】

特定の腫瘍または疾患に標的化された免疫応答の発生
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞に抗原特異性を伝えるためにデザインされた人工レセプターである。それらは、Ｔ細胞を活性化し、特異免疫をもたらすように選択された、抗原特異的な構成要素、膜貫通の構成要素および細胞内の構成要素を含む。キメラ抗原レセプターを発現しているＴ細胞は、がん治療をはじめとした様々な治療において使用され得る。

【0372】

誘導可能なＣＤ４０、誘導可能なＭｙＤ８８または誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０を形質導入されたＴ細胞および他の細胞には、キメラ抗原レセプター、すなわちＣＡＲをコードする核酸も形質導入され得る。そのキメラ抗原レセプターは、処置されるべき腫瘍の表面上に存在する腫瘍抗原または疾患に関連する他の抗原を標的化するために選択され得る。そしてそのキメラ抗原レセプターを発現している活性化Ｔ細胞は、腫瘍または他の疾患を標的化し得る。形質導入されたＴ細胞には、特定の腫瘍または疾患に対する免疫防御を維持し得るメモリーＴ細胞も含まれることがある。

【0373】

最適化されたおよび個別化された治療的処置
例えば前立腺がんを含む固形腫瘍がんに対する処置は、処置の経過中にＩＬ−６、ＩＬ６−ｓＲまたはＶＣＡＭ−１の濃度を決定することによって、最適化され得る。ＩＬ−６とは、インターロイキン６のことを指す。ＩＬ−６ｓＲとは、ＩＬ−６可溶性レセプターのことを指し、そのレベルは、ＩＬ−６のレベルと密接に相関することが多い。ＶＣＡＭ−１とは、血管細胞接着分子のことを指す。種々のステージまたはタイプのがんを有する種々の患者は、様々な治療に対して異なって反応し得る。処置に対する応答は、様々な体液中または組織内のＩＬ−６、ＩＬ−６ｓＲまたはＶＣＡＭ−１の濃度またはレベルを追跡することによってモニターされ得る。ＩＬ−６、ＩＬ−６ｓＲまたはＶＣＡＭ−１などのポリペプチドの濃度、レベルまたは量の決定には、完全長ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはバリアントの検出が含まれ得る。そのフラグメントまたはバリアントは、例えば、免疫学的方法、質量分析、核酸ハイブリダイゼーションなどによって検出されるのに十分であり得る。個々の患者に対する処置の最適化は、過量投与の結果としての副作用を回避するのに役立つこともあるし、その処置がいつ無効であるかを判定し、処置の経過を変更するのに役立つこともあるし、いつ用量を増加させ得るかを判定するのに役立つこともある。本明細書中で論じられる技術は、臨床医が生物学的マーカー、例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−６ｓＲまたはＶＣＡＭ−１を追跡すること、および被験体に投与するための薬物またはワクチンのその後の用量を維持し得るか、減少させ得るかまたは増加させ得るかを判定すること、およびその後の投与のタイミングを決定することを可能にすることによって、固形腫瘍がんを処置するための治療方法を最適化する。

【0374】

例えば前立腺がんを含む固形腫瘍がんに対する処置は、処置の経過中にウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーターレセプター（ｕＰＡＲ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）または血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の濃度を決定することによっても最適化され得る。種々のステージまたはタイプのがんを有する種々の患者は、様々な治療に対して異なって反応し得る。処置の経過の間、被験体１００３に対するｕＰＡＲ、ＨＧＦ、ＥＧＦおよびＶＥＧＦのレベルが測定された。被験体１００３は、血清中の低酸素因子の全身の乱れを示し、これは、処置に対する正の応答を示唆し得る。この知見の解釈を限定するものではないが、これは、処置に応答した腫瘍による低酸素因子の分泌を示唆し得る。したがって、処置に対する応答は、例えば、様々な体液中または組織内のｕＰＡＲ、ＨＧＦ、ＥＧＦまたはＶＥＧＦの濃度またはレベルを追跡することによってモニターされ得る。ｕＰＡＲ、ＨＧＦ、ＥＧＦまたはＶＥＧＦなどのポリペプチドの濃度、レベルまたは量の決定には、完全長ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはバリアントの検出が含まれ得る。そのフラグメントまたはバリアントは、例えば、免疫学的方法、質量分析、核酸ハイブリダイゼーションなどによって検出されるのに十分であり得る。個々の患者に対する処置の最適化は、過量投与の結果としての副作用を回避するのに役立つこともあるし、その処置がいつ無効であるかを判定し、処置の経過を変更するのに役立つこともあるし、いつ用量を増加させ得るかを判定するのに役立つこともある。本明細書中で論じられる技術は、臨床医が生物学的マーカー、例えば、ｕＰＡＲ、ＨＧＦ、ＥＧＦまたはＶＥＧＦを追跡すること、および被験体に投与するための薬物またはワクチンのその後の用量を維持し得るか、減少させ得るかまたは増加させ得るかを判定すること、およびその後の投与のタイミングを決定することを可能にすることによって、固形腫瘍がんを処置するための治療方法を最適化する。

【0375】

例えば、ある特定の生物学的マーカーの量または濃度が、固形腫瘍の処置の経過中に変化することが決定されてきた。薬物を必要とする被験体（例えば、固形腫瘍、例えば、前立腺腫瘍を有する被験体）に投与される薬物のその後の用量を増加させ得るか、減少させ得るかまたは維持し得るかを臨床医が判定することを可能にする、そのような生物学的マーカーの所定の標的レベル、すなわち生物学的マーカーの閾値は、正常な被験体において特定され得、提供される。臨床医は、生物学的マーカーの有無または量が、ある特定の実施形態において、それぞれの生物学的マーカーの閾値より低いか、高いか、またはほぼ同じであるかに基づいて、そのような判定を行い得る。

【0376】

例えば、薬物処置またはワクチン接種の後に、過大に示された生物学的マーカーのレベルが有意に減少しているおよび／または過少に示された生物学的マーカーのレベルが有意に増加しているとの判定は、投与された薬物が治療効果を発揮しているという兆しを臨床医に提供する。「レベル」とは、流体中もしくは組織内の生物学的マーカーの濃度または組織内の絶対量のことを意味する。そのような生物学的マーカーの測定に基づいて、臨床医は、その薬物のその後の用量を維持するかまたはその後の用量を上げるかもしくは下げること（投与のタイミングの変更することを含む）を決定し得る。用語「薬物」は、従来の医薬（例えば、小分子）、ならびに生物製剤（例えば、核酸、抗体、タンパク質、ポリペプチド、改変された細胞など）を含む。別の例では、過大に示された生物学的マーカーのレベルが有意に減少していないおよび／または過少に示された生物学的マーカーのレベルが有意に増加していないとの判定は、投与された薬物が治療効果を有意に発揮していないという兆しを臨床医に提供する。そのような生物学的マーカーの測定に基づいて、臨床医は、その薬物のその後の用量を増加させることを決定し得る。薬物は、被験体にとって有毒である場合があり、副作用を発揮することがあることを考えると、本明細書中に提供される方法は、薬物の有効な投与量に「ダイヤルイン（ｄｉａｌ ｉｎ）」する能力および副作用を最小限に抑える能力を臨床医に提供するので、治療的アプローチを最適化する。特定の例では、本明細書中に提供される方法は、臨床医が、薬物用量を治療的に効果的なレベルに「ダイヤルアップ（ｄｉａｌ ｕｐ）」することを可能にし、ここで、ダイヤルアップされた投与量は、毒性閾値レベル未満である。したがって、本明細書中で論じられる処置方法は、有効性を高め、有毒な副作用の可能性を低下させる。

【0377】

サイトカインは、多種多様な起源の細胞によって全身で広く産生されるポリペプチド制御因子の多種多様な大きなファミリーである。サイトカインは、小さな分泌タンパク質であり、それには、ペプチドおよび糖タンパク質が含まれ、免疫、炎症および造血を媒介し、制御する。サイトカインは、免疫刺激に応答して新規に産生される。サイトカインは、通常、短い距離および短い時間枠にわたって低濃度で作用する（が必ずしもそうではない）。サイトカインは、通常、特定の膜レセプターに結合することによって作用し、次いでその結合によって、セカンドメッセンジャー（チロシンキナーゼであることが多い）を介して細胞にシグナルを伝達し、それにより、細胞の挙動（例えば、遺伝子発現）を変化させる。サイトカインに対する応答としては、例えば、膜タンパク質（サイトカインレセプターを含む）の発現の増加または減少、エフェクター分子の増殖および分泌が挙げられる。

【0378】

用語「サイトカイン」は、タンパク質および糖タンパク質の大きなファミリーの総称である。他の名称としては、リンフォカイン（リンパ球によって産生されるサイトカイン）、モノカイン（単球によって産生されるサイトカイン）、ケモカイン（化学走性活性を有するサイトカイン）およびインターロイキン（１種類の白血球によって産生され、他の白血球に対して作用するサイトカイン）が挙げられる。サイトカインは、サイトカインを分泌する細胞に対して作用することもあるし（オートクライン作用）、近くの細胞に対して作用することもあるし（パラクリン作用）、場合によっては、遠く離れた細胞に対して作用することもある（内分泌作用）。

【0379】

サイトカインの例としては、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８など）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマなど）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータなど）、リンフォカイン、モノカインおよびケモカイン；成長因子（例えば、トランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータなど））；コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）など）；などが挙げられるがこれらに限定されない。

【0380】

サイトカインは、細胞表面レセプター対応物を介して作用することが多い。次いで、その後の細胞内のシグナル伝達のカスケードは、細胞の機能を変化させる。このシグナル伝達には、他のサイトカインの産生をもたらす、いくつかの遺伝子およびそれらの転写因子のアップレギュレーションおよび／もしくはダウンレギュレーション、他の分子に対する表面レセプターの数の増加、またはフィードバック阻害によるそれら自体の作用の抑制が含まれ得る。

【0381】

ＶＣＡＭ−１（ＣＤ１０６とも呼ばれる血管細胞接着分子−１）は、６つまたは７つの免疫グロブリンドメインを含み、内皮細胞がサイトカインによって刺激された後だけ、大血管と小血管の両方において発現される。したがって、ＶＣＡＭ−１の発現は、サイトカイン発現に対するマーカーである。

【0382】

サイトカインは、完全長（例えば、全）タンパク質、ポリペプチド、代謝産物、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ならびに前述のものの様々な中間生成物およびフラグメント（例えば、切断産物（例えば、ペプチド、ｍＲＮＡフラグメント））として検出され得る。例えば、ＩＬ−６タンパク質は、完全な完全長分子として、または様々なレベルの陽性の特定を提供するのに十分大きな任意のフラグメントとして、検出され得る。そのようなフラグメントは、総数が１０未満、１０〜２０、２０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００およびそれを超える数に達するアミノ酸を含み得る。同様に、ＶＣＡＭ−１タンパク質は、完全な完全長アミノ酸分子として、または様々なレベルの陽性の特定を提供するのに十分大きな任意のフラグメントとして、検出され得る。そのようなフラグメントは、総数が１０未満、１０〜２０、２０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０およびそれを超える数に達するアミノ酸を含み得る。

【0383】

ある特定の実施形態において、サイトカインのｍＲＮＡは、完全な配列または特異的な検出にとって十分な任意のフラグメントを標的化することによって検出され得る。ｍＲＮＡフラグメントは、１０個より少ないヌクレオチドまたはそれより多い任意の数のヌクレオチドを含み得る。フラグメントは、ｍＲＮＡ鎖の任意の部分を含むその鎖の３’末端、その鎖の任意の部分を含む５’末端、およびその鎖の任意の中心部分を含み得る。

【0384】

検出は、任意の好適な方法を用いて行われ得、これらの方法としては、質量分析（例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、エレクトロスプレー質量分析（ＥＳ−ＭＳ））、電気泳動（例えば、キャピラリー電気泳動）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、核酸の親和性（例えば、ハイブリダイゼーション）、増幅および検出（例えば、リアルタイムまたは逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ））、ならびに抗体アッセイ（例えば、抗体アレイ、酵素結合免疫吸着測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ））が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＬ−６および他のサイトカインのアッセイの例としては、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．が提供するアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｐａｎｅｌ）が挙げられる。ＩＬ６−ｓＲアッセイの例としては、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃが提供するアッセイ（Ｓｏｌｕｂｌｅ ＩＬ−６Ｒ：（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）Ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ））が挙げられる。ＶＣＡＭ−１アッセイの例としては、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓが提供するアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製の（ＣＤ１０６）ＥＬＩＳＡ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｋｉｔ，ＤｕｏＳｅｔ（＃ＤＹ８０９））が挙げられる。

【0385】

生物学的マーカーの起源
生物学的マーカーの有無または量は、被験体内（例えば、インサイチュ）または被験体外（例えば、エキソビボ）において決定され得る。いくつかの実施形態において、生物学的マーカーの有無または量は、細胞（例えば、分化細胞、幹細胞）において決定され得、ある特定の実施形態では、生物学的マーカーの有無または量は、実質的に無細胞の媒質（例えば、インビトロ）において決定され得る。用語「被験体において生物学的マーカーの有無または量を特定する」は、本明細書中で使用されるとき、生物学的マーカーを評価するため、およびその被験体における有無または量を推測するための当該分野で公知の任意の方法（例えば、インサイチュ、エキソビボにおいてまたはインビトロにおける方法）のことを指す。

【0386】

体液または組織サンプルは、エキソビボにおいて生物学的マーカーの有無または量を決定するために被験体から得られることが多い。組織サンプルを得ることがある身体の非限定的な部分としては、いくつかの実施形態において、脚、腕、腹部、上背部、下背部、胸部、手、指、爪、足、足指、足指爪、頸部、直腸、鼻部、咽頭、口、頭皮、顔、脊椎、咽頭、心臓、肺、乳房、腎臓、肝臓、腸、結腸、膵臓、膀胱、子宮頸部、精巣、筋肉、皮膚、毛髪、腫瘍または腫瘍の周囲の領域などが挙げられる。組織サンプルは、当該分野で公知の任意の好適な方法によって得ることができ、ある特定の実施形態において、その方法としては、生検（例えば、薄片生検、パンチ生検、切開生検、切除生検、掻爬生検、穿刺吸引生検、へら（ｓｃｏｏｐ）生検、スキャロップ（ｓｃａｌｌｏｐ）生検、コア針生検、真空補助下生検、開放外科的（ｏｐｅｎ ｓｕｒｇｉｃａｌ）生検）などが挙げられるがこれらに限定されない。被験体から得ることができる体液の例としては、いくつかの実施形態において、血液、脳脊髄液、髄液、洗浄液（例えば、気管支肺胞洗浄液、胃洗浄液、腹膜洗浄液、管洗浄液、耳洗浄液、関節鏡下洗浄液）、尿、間質液、便、痰、唾液、鼻粘膜、前立腺液、洗浄液、精液、リンパ液、胆汁、涙、汗、母乳、乳汁、炎症領域からの流体、筋消耗領域からの流体などが挙げられるがこれらに限定されない。

【0387】

被験体由来のサンプルは、生物学的マーカーの有無または量を決定する前に処理され得る。例えば、被験体由来の血液サンプルは、ある特定の画分を得るために処理され得、その画分としては、血漿、血清、バフィーコート、赤血球層などが挙げられるがこれらに限定されず、生物学的マーカーの有無または量は、その画分において決定され得る。ある特定の実施形態において、組織サンプル（例えば、腫瘍生検サンプル）は、組織サンプルをスライスし、生物学的マーカーを可視化する作用物質（例えば、抗体）とスライスされたサンプルを接触させる前および／または接触させた後にそのサンプルを顕微鏡下で観察することによって、処理され得る。いくつかの実施形態において、組織サンプルは、以下の非限定的な条件のうちの１つまたはそれを超える条件に曝露され得る：洗浄、高塩溶液または低塩溶液（例えば、高張液、低張液、等張液）への曝露、剪断条件への曝露（例えば、超音波処理、プレス（例えば、フレンチプレス））、ミンシング、遠心分離、細胞の分離、組織の分離など。ある特定の実施形態において、生物学的マーカーは、組織から分離され得、有無または量が、インビトロにおいて決定され得る。サンプルは、生物学的マーカーの有無または量を決定する前に、ある期間にわたって保管されることもある（例えば、サンプルは、凍結され、凍結保存され、保存媒質（例えば、ホルムアルデヒド）中で維持され得る）。

【0388】

サンプルは、薬物を被験体に送達した後、任意の好適な回収時点において被験体から得ることができる。例えば、サンプルは、薬物を被験体に送達した後、約１時間以内（例えば、薬物送達の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５５または６０分以内）、薬物を被験体に送達した後、約１日以内（例えば、薬物送達の約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４時間以内）または薬物を被験体に送達した後、約２週間以内（例えば、薬物送達の約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日以内）に回収され得る。回収は、例えば、毎時間、毎日、週２回、週１回、隔週、毎月、隔月、年４回および年１回などを含む指定のスケジュールにおいて行われ得る。薬物が、ある期間にわたって持続的に投与される場合（例えば、注入）、薬物が被験体に導入された最初の時点、薬物投与が終わる時点またはその中間の時点（例えば、投与時間枠の中間点または他の時点）からの遅延時間が決定され得る。

【0389】

生物学的マーカーの検出
１つまたはそれを超える生物学的マーカーの有無または量は、当該分野で公知の任意の好適な方法によって決定され得、非限定的な決定方法は、本明細書中で論じられる。生物学的マーカーの有無または量の決定は、時折、生物学的アッセイの使用を含む。生物学的アッセイにおいて、そのアッセイにおいて検出される１つまたはそれを超えるシグナルは、生物学的マーカーの有無または量に変換され得る。そのアッセイにおいて検出されたシグナルの変換は、例えば、検量線、１つまたはそれを超える標準物質（例えば、内部標準、外部標準）、チャート、シグナルを生物学的マーカーの有無または量に変換するコンピュータプログラムなど、および前述のものの組み合わせの使用を含み得る。

【0390】

アッセイにおいて検出される生物学的マーカーは、例えば、完全長の生物学的マーカー、生物学的マーカーのフラグメント、変更されたもしくは改変された生物学的マーカー（例えば、生物学的マーカー誘導体、生物学的マーカー代謝産物）または２つもしくはそれを超える前述のものを足し合わせたものであり得る。改変された生物学的マーカーは、本明細書中で論じられる生物学的マーカーに対して実質的な配列同一性を有することが多い。例えば、改変された生物学的マーカーと本明細書中で論じられる生物学的マーカーとの間の同一性パーセントは、１５〜２０％、２０〜３０％、３１〜４０％、４１〜５０％、５１〜６０％、６１〜７０％、７１〜８０％、８１〜９０％および９１〜１００％の範囲内（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９および１００パーセントの同一性）であり得る。改変された生物学的マーカーは、本明細書中で論じられる生物学的マーカーの配列と９０％またはそれを超えて同一である配列（例えば、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列）を有することが多い。パーセント配列同一性は、当該分野で公知のアラインメント方法を用いて決定され得る。

【0391】

生物学的マーカーの検出は、当該分野で公知の任意の好適な方法を用いて行われ得、その方法としては、質量分析、抗体アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、核酸親和性、マイクロアレイハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、逆ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、ＲＮＡの純度および濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ １０００において、分光光度的に決定され得る（２６０／２８０＞１．９）。ＲＮＡの質は、当該分野で公知の方法（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ；ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）など）を用いて評価され得る。

【0392】

その後の薬物用量を調整することまたは維持することについての指示
その後の薬物用量を調整することまたは維持することについての指示は、生物学的マーカーの有無に基づき得る。例えば、（ｉ）生物学的マーカーのレベルの低感度の測定が利用可能であるとき、（ｉｉ）生物学的マーカーのレベルが、薬物に応答して急激に変化するとき、（ｉｉｉ）低レベルもしくは高レベルの生物学的マーカーが存在するとき、および／または（ｉｖ）薬物が、投与のレベルにおいて明らかに有毒でないとき、生物学的マーカーの有無は、その後の薬物用量を調整するかまたは維持する指示を作製するのに十分であり得る。

【0393】

その後の薬物用量を調整することまたは維持することについての指示は、生物学的マーカーの量またはレベルに基づくことが多い。生物学的マーカーの量は、いくつかの実施形態において、平均値、中央値、名目上の量、範囲、間隔、最大値、最小値または相対量であり得る。生物学的マーカーの量は、ある特定の実施形態において、測定誤差範囲を伴ってまたは測定誤差範囲なしで表現され得る。いくつかの実施形態において、生物学的マーカーの量は、生物学的マーカーの濃度、単位重量あたりの生物学的マーカーの重量、単位体積あたりの生物学的マーカーの重量、生物学的マーカーのモル、単位体積あたりの生物学的マーカーのモル、単位重量あたりの生物学的マーカーのモル、単位細胞あたりの生物学的マーカーの重量、単位細胞数あたりの生物学的マーカーの体積、単位細胞数あたりの生物学的マーカーのモルなどとして表現され得る。重量は、例えば、フェムトグラム、ピコグラム、ナノグラム、マイクログラム、ミリグラムおよびグラムとして表現され得る。体積は、例えば、フェムトリットル、ピコリットル、ナノリットル、マイクロリットル、ミリリットルおよびリットルとして表現され得る。モルは、例えば、ピコモル、ナノモル、マイクロモル、ミリモルおよびモルで表現され得る。いくつかの実施形態において、単位重量は、被験体の重量または被験体由来のサンプルの重量であり得、単位体積は、被験体由来のサンプルの体積（例えば、血液サンプルの体積）であり得、単位細胞数は、１つの細胞あたりまたはある特定の数の細胞あたりであり得る（例えば、１０００個の細胞あたりの生物学的マーカーのマイクログラム）。いくつかの実施形態において、１つの組織または体液から決定された生物学的マーカーの量は、当該分野で公知であるように、別の体液中または組織内の生物学的マーカーの量に相関し得る。

【0394】

その後の薬物用量を調整することまたは維持することについての指示は、被験体における生物学的マーカーの決定されたレベルを生物学的マーカーの所定のレベルと比較することによって作製されることが多い。ある特定の実施形態において、生物学的マーカーの所定のレベルは、時折、被験体における薬物の治療的な量または効果的な量に関連し、時折、薬物の毒性レベルに関連し、時折、ある状態の存在に関連し、時折、処置の中間点に関連し、時折、処置の終点に関連する。生物学的マーカーの所定のレベルは、時折、エレメントとして時間を含み、いくつかの実施形態において、閾値は、時間依存的シグネチャである。

【0395】

例えば、正常レベルより約８倍またはそれを超えて高い（例えば、正常レベルよりも約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４または７５倍高い）ＩＬ−６またはＩＬ６−ｓＲレベルは、薬物の投与量または投与の頻度がその後の投与において高められ得ることを示唆し得る。

【0396】

用語「投与量」は、投与の用量と投与の頻度（例えば、次の投与のタイミング）の両方を含むと意味される。正常レベルよりも約８倍高いレベルより低いＩＬ−６またはＩＬ−６ｓＲのレベル（例えば、正常レベルよりも約７、６、５、４、３、２もしくは１倍高いか、または正常レベル未満もしくは正常レベルと等しいレベル）は、その後の投与において投与量が維持され得るかまたは減少され得ることを示唆し得る。正常レベルよりも約８倍またはそれを超えて高い（例えば、例えば、正常レベルよりも約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４または７５倍高い）ＶＣＡＭ−１レベルは、その後の投与においてその薬物の投与量が増加され得ることを示唆し得る。正常レベルよりも約８倍高いレベルよりも低いＶＣＡＭ−１レベル（例えば、正常レベルよりも約７、６、５、４、３、２もしくは１倍高いか、または正常レベル未満もしくは正常レベルと等しいレベル）は、その後の投与において投与量が維持され得るかまたは減少され得ることを示唆し得る。ＩＬ−６、ＩＬ−６ｓＲまたはＶＣＡＭ−１の正常レベルは、患者において処置されている固形腫瘍または固形腫瘍のタイプと診断されていない被験体において評価され得る。

【0397】

薬物の用量を調整することまたは維持することについての他の指示としては、例えば、個々の分泌因子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＣＰ−１、ＩＦＮ−ガンマ、ＲＡＮＴＥＳ、ＥＧＦもしくはＨＧＦの濃度の乱れ、または分泌因子のパネル（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＣＰ−１、ＩＦＮ−ガンマ、ＲＡＮＴＥＳ、ＥＧＦおよびＨＧＦからなる群より選択される２つまたはそれを超えるマーカー）の平均濃度の乱れが挙げられる。この乱れは、例えば、個々の分泌因子の濃度の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の増加または減少、あるいは分泌因子のパネルの血清濃度の相対変化の平均値の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の増加または減少からなり得る。この増加の後、次の投与の前に、ベースライン血清濃度に戻ることもあるし、戻らないこともある。血清濃度の相対的変化の平均値の増加または減少は、例えば、パネルの中の各因子の相対値の重みづけを含み得る。また、その増加または減少は、例えば、収集されたデータの各時点の相対値の重みづけを含み得る。各時点に対する重みづけされた値または各因子は、がん、転移または腫瘍量の状態または程度に応じて変動し得る。薬物の用量を調整することまたは維持することについての指示は、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０回またはそれを超える投与の後の個々の分泌因子の濃度または分泌因子のパネルの平均濃度の乱れを含み得る。例えば、処置の経過にわたって、例えば、薬物または本明細書中で論じられるワクチンもしくは組成物の６回の投与にわたって、個々の分泌因子の濃度または分泌因子のパネルの平均濃度が、少なくとも１回の投与の後に乱されることが観察される場合、これは、投与の頻度もしくはその後の投与量を維持するか、減少させるか、もしくは増加させる指示であり得るか、または例えば、さらなる薬物、アデノウイルスワクチン、またはアデノウイルスでトランスフェクトされたもしくは形質導入された細胞を調製することによって処置を継続する指示であり得る。

【0398】

いくつかの処置方法は、（ｉ）１回またはそれを超える投与（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回）で被験体に薬物を投与する工程、（ｉｉ）（ｉ）の後、被験体における生物学的マーカーまたは被験体由来の生物学的マーカーの有無または量を決定する工程、（ｉｉｉ）被験体への投与についてその薬物のその後の用量を増加させるか減少させるかまたは維持する指示を提供する工程、および（ｉｖ）必要に応じて、被験体にその後の用量を投与する工程（ここで、上記その後の用量は、（ｉ）におけるより早いときの用量と比べて増加しているか、減少しているか、または維持されている）を含む。いくつかの実施形態において、生物学的マーカーの有無または量は、薬物の各用量が被験体に投与された後に決定され、時折、生物学的マーカーの有無または量は、薬物の各用量が投与された後に決定されない（例えば、生物学的マーカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回目の投与のうちの１回またはそれを超える投与の後に評価されるが、各投与後に毎回評価されるわけではない）。

【0399】

その後の薬物用量を調整することについての指示は、その後の薬物用量を増加させる必要性または減少させる必要性を考慮され得る。その後の薬物用量を調整することまたは維持することについての指示は、臨床医によって考慮され得、臨床医は、ある特定の実施形態において、その指示に従って行動し得る。いくつかの実施形態において、臨床医は、指示に従って行動しないことがある。したがって、臨床医は、提供された指示に基づいてその後の薬物用量を調整することまたは調整しないことを選ぶことができる。

【0400】

その後の薬物用量および／またはその後の薬物投与量を調整するまたは維持する指示は、任意の好都合な様式で提供され得る。指示は、いくつかの実施形態において、表形式で（例えば、物理的媒体または電子媒体において）提供され得る。例えば、生物学的マーカーの閾値が、表として提供され得、臨床医は、被験体に対して決定された生物学的マーカーの有無または量をその閾値と比較し得る。次いで、その臨床医は、その表から、その後の薬物用量に対する指示を特定し得る。ある特定の実施形態において、指示は、生物学的マーカーの有無または量がコンピュータに提供された後（例えば、コンピュータ上のメモリに入れられた後）、コンピュータによって提示され得る（例えば、表示され得る）。例えば、被験体に対して決定された生物学的マーカーの有無または量は、コンピュータに提供され得（例えば、ユーザーによってコンピュータメモリに入れられ得るか、またはコンピュータネットワーク内のリモートデバイスを介してコンピュータに送信され得）、コンピュータ内のソフトウェアが、その後の薬物用量を調整するかもしくは維持することについての指示を生成し得、および／またはその後の薬物用量の量を提供し得る。その後の用量は、例えば、生物学的マーカーの有無または量以外のある特定の因子（例えば、被験体の重量、その被験体に対する１つまたはそれを超える代謝産物のレベル（例えば、肝機能に関する代謝産物のレベル）など）に基づいて決定され得る。

【0401】

その後の用量が、指示に基づいて決定されたら、臨床医は、決定されたその後の用量を投与し得るか、または別の人もしくは実体に対してその用量を調整する指示書を提供し得る。本明細書中で使用される用語「臨床医」は、意思決定者のことを指し、ある特定の実施形態において、臨床医は、医療専門家である。意思決定者は、いくつかの実施形態において、コンピュータまたは表示されたコンピュータプログラムのアウトプットであり得、そのコンピュータによって表示される指示またはその後の薬物用量に基づいて、保健サービス提供者が行動し得る。意思決定者は、その後の用量を直接投与し得る（例えば、その後の用量を被験体に注入し得る）か、または遠隔的に投与し得る（例えば、ポンプパラメータが、意思決定者によって遠隔的に変更され得る）。

【0402】

被験体は、特定の生物学的マーカーの有無または量が決定され得るか否かを判定するために、事前にスクリーニングされ得る。事前のスクリーニングの非限定的な例としては、遺伝的マーカー（例えば、多型、特定のヌクレオチド配列）の有無の特定；特定の代謝産物の有無または量の特定が挙げられる。事前のスクリーニングの結果は、その後の薬物用量が調整され得るかまたは維持され得るかを判定するために、生物学的マーカーの有無または量と組み合わせて、臨床医によって使用され得る。

【0403】

抗体および小分子
いくつかの実施形態において、例えば、アッセイにおいてコントロールまたは標準物質として使用するため、または治療薬として使用するために、抗体または小分子が提供される。いくつかの実施形態において、抗体または他の小分子は、サイトカインもしくはサイトカインレセプター（ＩＬ−６、ＩＬ−６ｓＲを含むがこれらに限定されない）に結合し、そのサイトカインの作用を変化させるように形成されているか、またはＶＣＡＭ−１に結合するように形成されていることがある。ある特定の実施形態において、抗体または他の小分子は、サイトカインまたはレセプターをコードするｍＲＮＡの構造に結合し得る。

【0404】

本明細書中で使用される小分子という用語は、およそ８００ダルトンまたはそれより小さいダルトンの有機分子のことを意味する。ある特定の実施形態において、小分子は、細胞膜を横断して拡散することにより、細胞間の作用部位に到達し得る。いくつかの実施形態において、小分子は、生体高分子（例えば、タンパク質、核酸または多糖）に高親和性で結合し、時折、その生体高分子の活性または機能を変化させ得る。様々な実施形態において、小分子は、天然のもの（例えば、二次代謝産物）または人工のもの（例えば、抗ウイルス薬）であり得；それらは、疾患に対して有益な効果を有し得る（例えば、薬物）か、または有害であり得る（例えば、催奇形物質および発がん性物質）。

【0405】

非限定的な例として、小分子には、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、アミノ酸、単糖類および小さいオリゴマー（例えば、ジヌクレオチド）、ペプチド（例えば、抗酸化物質であるグルタチオン）および二糖類（例えば、スクロース）が含まれ得る。

【0406】

本明細書中で使用される抗体という用語は、脊椎動物の血液または他の体液中に見られ、細菌およびウイルスなどの外来の物体を識別し、中和するために免疫系によって用いられる、ガンマグロブリンタンパク質を意味していると理解されるべきである。抗体は、代表的には、２本の大きな重鎖および２本の小さな軽鎖という基本的な構造単位を含む。

【0407】

抗体への特異的結合には、特定のタンパク質に対する親和性について選択された抗体が必要である。例えば、特定のタンパク質、多型バリアント、対立遺伝子、オルソログおよび保存的に改変されたバリアントもしくはスプライスバリアントまたはそれらの一部に対して産生されたポリクローナル抗体が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−アルファまたはＮＦ−カッパー−Ｂを調節するタンパク質には特異的に免疫反応性であるが他のタンパク質には免疫反応性でないポリクローナル抗体だけを得るために選択され得る。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を取り去ることによって達成され得る。

【0408】

本明細書中に提示されるような方法としては、有効量の活性化された細胞、核酸またはそれをコードする発現構築物の送達が挙げられるがこれに限定されない。薬学的組成物の「有効量」は、一般に、述べられた所望の結果を検出可能かつ繰り返し達成するのに十分な量、例えば、疾患またはその症候を回復させるか、減少させるか、最小にするか、またはその程度を限定するのに十分な量として定義される。疾患の排除、根絶または治癒を含む他のより厳密な定義が、適用されることもある。いくつかの実施形態において、処置の有効性を評価するためおよび毒性をコントロールするために生物学的マーカーをモニターする工程が存在してもよい。

【実施例】

【0409】

下記に示される実施例は、ある特定の実施形態を例証するものであって、本技術を限定しない。インビトロまたはエキソビボにおいて細胞を形質転換するためまたはトランスフェクトするための方法を論じている本明細書中の実施例は、キメラポリペプチドを発現する核酸の使用例を提供するがこれに限定されない。実験動物またはヒト被験体への、形質導入されたまたはトランスフェクトされた細胞の送達およびリガンド誘導物質の送達の例は、それを必要とする被験体において、キメラポリペプチドを発現する核酸、腫瘍抗原およびリガンド誘導物質の直接的な投与の例を提供するがこれに限定されない。

【0410】

また、以下の項では、特に実施例２１（以下参照）は、治療用細胞、例えば、Ｔ細胞において、誘導可能なキメラシグナル伝達分子を発現する方法、および形質転換された細胞を使用する方法の例が、提供される。誘導可能なポリペプチドを発現する方法、形質導入されたまたはトランスフェクトされた細胞の使用、およびアッセイは、例えば、Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１０１９−１０２４（１９９３）；２００８年７月２９日に発行された“Ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ”という表題の米国特許第７，４０４，９５０号；２０１１年４月１４日に出願された“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ”という表題の米国特許出願番号１３／０８７，３２９；および２０１１年５月２０日に出願された“Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓという表題の米国特許出願番号１３／１１２，７３９（これらの全体が参照により本明細書中に援用される）に論じられている。

【0411】

実施例１：材料および方法
以下の実施例において論じられる研究において用いられた材料および方法が、本明細書中以後、論じられる。

【0412】

マウス。ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＨｒ^ｈｒ／ＮＣｒＨｓｄマウスは、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入し、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＴＨＳＣ）の動物施設における病原体フリーのマウス施設において、施設のガイドラインに従って維持した。この研究は、ＵＴＨＳＣのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓによって承認されたものだった。

【0413】

細胞株、培地および試薬。２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ／１７）、Ｃａｐａｎ−１、ＨＰＡＣ、Ｒａｊｉ細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。２９３Ｔ、Ｃａｐａｎ−１およびＨＰＡＣ細胞株は、３７℃および５％ＣＯ_２において、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充されたＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で維持した。Ｒａｊｉ腫瘍細胞は、１０％ＦＳＣおよび２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘを含むＲＰＭＩ中で培養した。Ｇｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から入手した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から作製したＴ細胞は、別段述べられない限り、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔ細胞培地；ＴＣＭ）および１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が補充された４５％ＲＰＭＩ１６４０、４５％Ｃｌｉｃｋ’ｓ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。臨床グレードのリミズシドは、インビトロアッセイのためにエタノールで、または動物試験のために０．９％食塩水で、１００ｍＭの使用溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に希釈した。

【0414】

レトロウイルスおよびプラスミドの構築物。ミリストイル化標的化配列（Ｍ）^１、ＴＬＲアダプター分子、ＭｙＤ８８、ＣＤ４０細胞質領域および２つのタンデムのリガンド結合ＦＫＢＰ１２ｖ３６ドメイン（Ｆｖ’Ｆｖ）を含む誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ｉＭＣ）を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）^３を用いて、ＳＦＧレトロウイルス骨格^２において２Ａ−ΔＣＤ１９とインフレームでクローニングすることにより、ＳＦＧ−Ｍ．ＭｙＤ８８／ＣＤ４０．Ｆｖ’Ｆｖ−２Ａ−ΔＣＤ１９を作製した。同様に、ミリストイル化配列およびタンデムのＦＫＢＰ１２ｖ３６ドメインだけを含むコントロールベクター（ＦＫＢＰまたはＳＦＧ−ＦＫＢＰ−２Ａ−ΔＣＤ１９と呼ばれる）を作製した。合成ＤＮＡアプローチ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、ＳＦＧ−Ｍ．ＭｙＤ８８−２Ａ−ΔＣＤ１９またはＳＦＧ−Ｍ．ＣＤ４０−２Ａ−ΔＣＤ１９と呼ばれる、それぞれＭｙＤ８８またはＣＤ４０だけの構築物を作製することにより、さらなるレトロウイルスベクターを構築した。以前に記載されたように^６、マウスｂｍ２Ｂ３一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）^４，５、ＩｇＧ１ ＣＨ２ＣＨ３スペーサー領域、ＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＣＤ３ζ細胞質ドメイン（ＰＳＣＡ．ζ）を含む第１世代ＰＳＣＡ ＣＡＲを合成した。ＣＤ２８膜貫通および細胞質ドメインを含む第２世代ＣＡＲ（ＰＳＣＡ．２８．ζ）をＰＣＲ増幅によって構築した。ＰＳＣＡ−ＣＡＲによって改変された細胞との共培養アッセイに向けて、Ｃａｐａｎ−１およびＨＰＡＣ腫瘍細胞を、ＧＦＰ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ＧＦＰ．２Ａ．ピューロマイシン）によるトランスフェクションによって改変し、１μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）を用いて安定に選択した。インビボ腫瘍生物発光研究に向けて、Ｔ細胞にＳＦＧ−ＥＧＦＰルシフェラーゼを同時形質導入した。

【0415】

レトロウイルス上清。以前に記載されたように^７、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）トランスフェクション試薬を用いて、ＭｏＭＬＶ ｇａｇ−ｐｏｌに対する配列を含むＳＦＧベクタープラスミドであるＰｅｇ−Ｐａｍ−ｅプラスミドとＲＤ１１４エンベロープをコードするプラスミドとによって２９３Ｔ細胞を一過性にコトランスフェクトすることによってレトロウイルス上清を生成した。レトロウイルスを含む上清をトランスフェクションの４８および７２時間後に回収した。

【0416】

活性化Ｔ細胞の作製。Ｇｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から入手した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いて、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８によって活性化されるＴ細胞を、本質的には論じられたように^７作製した。簡潔には、５×１０^５個のＰＢＭＣを、ＴＣＭに再懸濁し、各々０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）でコーティングされた組織培養用処理がなされていない２４ウェルプレート上において、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２の存在下において刺激した。３日目に、活性化Ｔ細胞を回収し、下記に記載されるように、その細胞にレトロウイルスベクターを形質導入するかまたはその細胞をＩＬ−２が補充された培地中で拡大した。

【0417】

Ｔ細胞の形質導入。組織培養用処理がなされていない２４ウェルプレートを、４℃において一晩、７μｇ／ｍｌ Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）でコーティングした。そのウェルをリン酸緩衝食塩水で洗浄し、次いで、レトロウイルス上清でコーティングした。その後、活性化Ｔ細胞を、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２が補充されたウイルス上清中において、１ウェルあたり３×１０^５個の細胞でプレーティングした。３日間の培養の後、細胞を回収し、ＴＣＭ＋１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む組織培養用処理がなされたプレートにおいて拡大した。２遺伝子または３遺伝子の形質導入の場合、プロトコルは、ウェルを等量の各レトロウイルス上清でコーティングしたこと、および次いで活性化Ｔ細胞を１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２が補充された等量のウイルス上清を含む各ウェルにプレーティングしたことを除いては上記と同一であった。

【0418】

免疫表現型分析。遺伝子改変されたＴ細胞を、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５およびＣＤ１９−ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用することによって、形質導入の１０〜１４日後に、ｉＭＣ導入遺伝子の発現について解析した。ＣＡＲを形質導入された細胞を検出するために、Ｔ細胞を、レセプターのＩｇＧ１ ＣＨ２ＣＨ３構成要素を認識するＦｃ特異的ＡＰＣ結合体化モノクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）でも染色した。Ｔ細胞を、１０ｎＭリミズシドおよびＣａｐａｎ−１腫瘍細胞で活性化した後、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ２５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）についても解析した。すべてのフローサイトメトリーを、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）を用いて行い、データは、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）またはＫａｌｕｚａソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）を用いて解析した。

【0419】

サイトカインおよびケモカインの産生。ｉＭＣベクターまたはコントロールベクターで改変されたＴ細胞によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−６の産生を、製造者のプロトコル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従ってＥＬＩＳＡによって解析した。さらに、サイトカインおよびケモカインのパネルを、マルチプレックスアレイシステム（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ ＭＡＧＰＩＸ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて解析した。このアッセイでは、形質導入されていないＴ細胞およびｉＭＣベクターまたはコントロールベクター（ＦＫＢＰ）で改変されたＴ細胞を、１０ｎＭリミズシドを用いておよび用いずに活性化し、２４および４８時間後に上清を回収した。いくつかの実験では、Ｔ細胞を５０ｎｇ／ｍｌ可溶性抗ＣＤ３でも刺激した。ＰＳＣＡ．ζＣＡＲとｉＭＣシグナル伝達の両方によるサイトカインおよびケモカインの産生の効果を測定するために、ｉＭＣ（またはコントロールベクター）で改変されたＴ細胞、ならびにリミズシドおよびＣａｐａｎ−１標的細胞とともにおよびそれら無しでＰＳＣＡ．ζＣＡＲを同時形質導入されたＴ細胞を用いて、さらなる実験を行った。４８時間後に上清を回収し、解析した。

【0420】

免疫ブロット法。ＳＦＧ−ＦＫＢＰ−２Ａ−ΔＣＤ１９またはＳＦＧ−ｉＭＣ−２Ａ−ΔＣＤ１９を形質導入された初代ヒトＴ細胞（１時点あたり４×１０^６）を、１０ｎＭリミズシド、各２５０ｎＭのＰＭＡおよびイオノマイシン、または培地のみを用いて、３７℃のウォーターバス内で、示された時点まで培養した。４℃での２分間の６０００ｒｐｍにおける遠心分離の後に、培地を吸引によって除去した。１×ＭＳ−ＳＡＦＥ（Ｒｏｃｈｅ）を含む１００μｌのラジオイムノ沈殿アッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム）中での溶解によって、細胞質抽出物を調製した。溶解産物を氷上で１０分間インキュベートし、４℃での２０分間の１１，０００ｒｐｍにおける遠心分離によって細胞質画分を取り除いた。１．５×１０^６個の細胞と等価な細胞質抽出物を、９８℃で５分間煮沸することによって１×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中で変性させた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気的に転写した。続いて、膜を、ｐ−ＲｅｌＡ（Ｓ５３６）、ｐ−Ａｋｔ（Ｓ４７３）、ｐ−ｐ３８（Ｔ１８０／Ｙ１８２）、ｐ−ＪＮＫ（Ｔ１８３／Ｙ１８５）、ｐ−ＥＲＫ１／２（Ｔ２０２／Ｙ２０４）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）または総β−チューブリン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）に特異的なＡｂでプロービングした。結合したＡｂを、ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ａｂ（Ｐｉｅｒｃｅ）に続いてＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって検出し、Ｇｅｌ Ｌｏｇｉｃイメージングシステム（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ）において検出した。

【0421】

Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ ＭＡＰアッセイ。３人の健常ドナーから回収された初代ヒトＴ細胞を、ＳＦＧ−ＦＫＢＰ−２Ａ−ΔＣＤ１９またはＳＦＧ−ｉＭＣ−２Ａ−ΔＣＤ１９を形質導入した。細胞（１時点あたり２×１０^６）を、Ｔ細胞培地中で維持する（刺激しない）か、または示された時間にわたって３７℃のウォーターバス内で、１０ｎＭリミズシドもしくは各２５０ｎＭのＰＭＡおよびイオノマイシンで処理した。４℃での５分間の５０００ｒｐｍにおける遠心分離によって、細胞を回収した。ペレットを、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が補充された２００μｌのＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ ＭＡＰキット；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で溶解し、氷上で１０分間インキュベートした。溶解産物を卓上型振盪機によって１５分間撹拌し、１０分間の１０，０００ｒｐｍにおいてペレットにし、これらすべてを４℃において行った。液相を新しいエッペンドルフチューブに移し、個々のアリコートを製造者の提唱するプロトコルに従って処理し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ ＭＡＧＰＩＸ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において解析した。ｐ−ＲｅｌＡ（Ｓ５３６）、ｐ−Ａｋｔ（Ｓ４７３）、ｐ−ｐ３８（Ｔ１８０／Ｙ１８２）、ｐ−ＪＮＫ（Ｔ１８３／Ｙ１８５）、ｐ−ＥＲＫ１／２（Ｔ２０２／Ｙ２０４）（カスタムＭＩＬＬＩＰＬＥＸ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄ ＭＡＰｍａｔｅキット；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、または総タンパク質含有量に対するコントロールとしてのＧＡＰＤＨに特異的な抗体によって、リン酸化されたエピトープをＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ ２（ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ ＭＡＰキット）中で検出した。リン酸化の増加倍率を、所与の時点におけるリミズシド処理の正味のＭＦＩを、刺激されていない対応する時点の正味のＭＦＩで除算することによって算出した。

【0422】

遺伝子発現解析。形質導入されていないＴ細胞またはＦＫＢＰレトロウイルスベクターもしくはｉＭＣレトロウイルスベクターで改変されたＴ細胞を、３人の健常ドナー由来のＰＢＭＣから作製した。Ｔ細胞を、１０ｎＭリミズシド有りおよび無しで２４時間刺激し、次いで、回収し、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ ＲＮＡ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｃｏｒｅ（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を用いるＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）におけるハイブリダイゼーションに向けてｍＲＮＡを抽出した（ＲＮｅａｓｙ；Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）。ＡｒｒａｙＳｔａｒ Ｖｅｒ １２．０．０ソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてイメージファイルからシグナルデータを抽出した。遺伝子は、データセット間で、＞９５％のＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ信頼区間および＞２倍の増加を示した。遺伝子オントロジーを、Ｃ２ ＣＰ：ＫＥＧＧ遺伝子セット、Ｃ３転写因子標的およびＣ７免疫学的標的遺伝子セットを使用して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ）（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）^８を用いて行った。誘導されたネットワークのモジュール解析を、ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＰａｔｈＤＢ−ｈｕｍａｎ（Ｍａｘ Ｐｌａｎｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）^９を用いて行った。

【0423】

細胞傷害アッセイ。Ｃａｐａｎ−１腫瘍細胞に対するＣＡＲ Ｔ細胞の特異的な細胞傷害性を、１０：１〜０．５：１の範囲のエフェクターと標的との比（Ｅ：Ｔ）、ならびに標的細胞としてＣａｐａｎ−１およびＨＰＡＣを用いて、製造者の推奨（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）に従って、４時間のＤＥＬＦＩＡ細胞傷害アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）において測定した。

【0424】

共培養実験。リミズシド依存的なＰＳＣＡ．ζＣＡＲの活性化の後の細胞傷害性、活性化、増殖およびサイトカイン産生を試験するために、１０ｎＭリミズシド有りまたは無しかつ外来性ＩＬ−２の非存在下のＴＣＭ中でＣａｐａｎ−１−ＧＦＰ腫瘍細胞を様々なエフェクター：標的比において用いて、共培養アッセイを行った。７日後、すべての残留細胞をトリプシン処理によって回収し、カウントし、ＣＤ３、ＣＤ１９およびＦｃ特異的抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。

【0425】

インビボ研究。ｉＭＣで改変されたＣＡＲ−Ｔ細胞の固形腫瘍に対するインビボでの有効性を評価するために、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁された１×１０^６個のＣａｐａｎ−１腫瘍細胞を免疫不全Ｓｈｏｒｎマウスの右側腹部の皮下に注射して移植した。マウスに、１×１０^７個のＴ細胞を、１回（７日目）または２回（７および１４日目）ｉ．ｖ．注射した。いくつかの実験では、外来性ＩＬ−２を、１週間に２回（ｂｉｗ）腹腔内に与えた（４，０００Ｕ／動物）。Ｓｈｏｒｎ実験の場合、リミズシドを、０．９％食塩水中の５ｍｇ／ｋｇでｂｉｗにおいて投与した。腫瘍をノギスによって測定し、腫瘍サイズを算出した。Ｔ細胞のインビボ拡大および有効性に対するｉＭＣおよびＣＡＲの寄与を評価するために、ＮＳＧマウスを用いた。ここで、ＮＳＧマウスには、１×１０^６個のＣａｐａｎ−１腫瘍細胞をｓ．ｃ．で移植した。７日後、マウスを、ｉＭＣおよびＰＳＣＡ．ζＣＡＲによって改変され、ＥＧＦＰルシフェラーゼを同時形質導入された５×１０^６個のＴ細胞の単回のｉ．ｖ．で処置した。続いて、マウスを、１週間に１回または１週間に２回、リミズシドｉ．ｐ．で処置し、次いで、１５０ｍｇ／ｋｇ Ｄ−ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）のｉ．ｐ．注射の後、ＩＶＩＳイメージングカメラ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて撮像した。光子放出を、腫瘍領域の中から抜き取られた一定の関心領域（ＲＯＩ）によって解析し、シグナルを、以前に検証されたように^１０総カウントとして測定した。上記のように、ノギスを用いて腫瘍を測定することによって有効性を評価した。

【0426】

統計。データは、平均値±ＳＥＭとして表される。すべてのアッセイにおいて２つの処置群を比較するとき、差の統計的有意性を判定するために両側Ｐ値または片側Ｐ値を算出するために、対応のないスチューデントのｔ検定を用いてデータを解析した。１元配置分散分析に続くボンフェローニ多重比較検定を用いることにより、複数の処置群を比較した。２元配置分散分析に続くボンフェローニ検定を用いることにより、異なる時点における複数の処置群間の腫瘍の成長の差の統計的有意性を評価した。生存時間は、カプラン・マイヤーグラフによって記録し、ログランク検定によって有意性を判定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いてデータを解析した。

【0427】

方法の参考文献

【表A-1】

【表A-2】

【0428】

実施例２：誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０によるＴ細胞の活性化
Ｔ細胞を、ｉＭＣおよび表面マーカー、ΔＣＤ１９、ＣＤ１９の細胞外の部分をコードするバイシストロニックベクター、またはＭｙＤ８８／ＣＤ４０シグナル伝達の構成要素を欠くがタンデムのＦＫＢＰ１２ｖ３６リガンド結合ドメインを保持しているコントロールベクターで形質導入した（図１ａおよび４ａ）。フローサイトメトリーによって類似の形質導入効率を確認した後（それぞれ７７±１０％および６２±１６％のＣＤ３^＋ＣＤ１９^＋）（図５ａ，ｂ）、形質導入されたＴ細胞および形質導入されていないＴ細胞を１０ｎＭリミズシドと接触させた；ｉＭＣによって改変されたＴ細胞においてのみ、二量体化によってＩＦＮ−γの産生が誘発された（図５ｃ）。重要なことには、ｉＭＣの発現は、形質導入されたＴ細胞の表現型または分化状態を変化させなかった（図５Ｄ）。樹状細胞において観察されたように^２５、リミズシドの滴定は、ｉＭＣスイッチの高感度を実証し、ナノモル濃度未満の範囲（ＥＣ_５０＝約０．１２ｎＭ）でＴ細胞を活性化した（図１ｂ）。ＭｙＤ８８だけまたはＣＤ４０だけを発現するさらなるベクター（図４ａ、６ａおよび６ｂ）は、両方の分子が、リミズシド曝露の後に、相乗的に作用することによりＴ細胞を活性化することを示した（図１ｃ）。

【0429】

ＪＮＫ、Ａｋｔ、ＲｅｌＡ、ＥＲＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫを含む鍵となる下流のシグナル伝達分子のリン酸化を、誘導されたｉＭＣ Ｔ細胞において測定した。経時的解析から、リミズシドが、曝露の１５分後という早さでＴ細胞においてシグナル伝達を誘導すること（図１ｄ）、およびＴ細胞におけるこれらの各シグナル伝達経路がリン酸化の増加を示し、ＭＡＰＫおよびＪＮＫは、最も大きなリミズシド依存的活性化を示すこと（図１ｅ）が示唆された。マイクロアレイ比較研究は、ｉＭＣによって改変されたＴ細胞が、主に、ＩＦＮ−γサイトカインの産生に関連するサイトカイン関連遺伝子（例えば、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ３、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１）、ＭｙＤ８８依存的Ｔｏｌｌ様レセプターシグナル伝達の下流の遺伝子（例えば、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１３）、およびリミズシドによる活性化の際にアポトーシスを制御するＣＤ４０関連遺伝子（例えば、ＢＣＬ２Ｌ１）をアップレギュレートしたことを示唆した（図７ａおよび７ｂ）。遺伝子オントロジー経路解析は、タンパク質の解析によって特定されたリン酸化事象の増加に対応する、アポトーシスに関連するＭＡＰＫ経路の増加を示した（図１ｄおよび１ｅ）。さらに、遺伝子セット濃縮解析（ＭＳｉｇＤＢおよびＣｏｎｓｅｎｓｕｓＰａｔｈＤＢ）は、ＮＦ−κＢ活性化との有意な関連（ｐ＝４．４×１０^−１５）、ならびにＴＬＲ４、７および８アゴニストによって活性化されたＤＣにおける遺伝子発現プロファイリングとの有意な重複（ｐ＝６．１×１０^−４０）を示した（表１〜３）。これらのデータは、ｉＭＣが、生存促進遺伝子のネットワークを誘導するいくつかの経路を活性化することを示唆する（図７ｃ）。実際に、ｉＭＣを発現しているＴ細胞のリミズシド活性化によって、外来性ＩＬ−２の存在下においてＴ細胞生存の増加および細胞の拡大が可能になったが、ＩＬ−２を取り除いたとき、増殖は観察されなかった（図８ａ〜８ｃ）。

【0430】

実施例３：改変された活性化Ｔ細胞のさらなる特徴づけ
Ｔ細胞の活性化をさらに特徴づけるために、マルチプレックスアレイ解析を行うことにより、種々のサイトカインおよびケモカインを測定した（図９ａおよび９ｂ）。ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−１３の分泌は、リミズシドによって誘導されたが、ＩＬ−２および他のサイトカインの産生は、アップレギュレートされず、これは、完全なＴ細胞活性化にはＮＦＡＴとＮＦ−κＢの両方のシグナル伝達が必要であるという仮説^１９と一致した。このことを調べるために、共刺激されたＴ細胞を、ＣＤ３架橋有りおよび無しで、リミズシドで処理した後、ＩＬ−２の産生およびＣＤ２５（高親和性ＩＬ−２レセプター）の発現を測定した。両方のシグナル（例えば、ＴＣＲおよびｉＭＣ）によって活性化された、ｉＭＣ（およびそれほどではないがｉＭ）によって改変されたＴ細胞だけが、測定可能なＩＬ−２を産生し（図１ｆ）、ＣＤ２５の発現を増加させた（図１ｇおよび１ｈ）。これらのデータは、ｉＭＣが、Ｔ細胞において共刺激シグナルとして機能し得ることを示唆しており、ここで、天然のＴＣＲとｉＭＣとの同時のシグナル伝達が、ＩＬ−２の産生およびＴ細胞増殖の持続に必要とされる。

【0431】

実施例４：誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０によるＣＡＲ発現Ｔ細胞の刺激
ＴＣＲ複合体の主要なシグナル伝達構成要素としては、２本の非共有結合的に連結されたＣＤ３ζ鎖が挙げられ、その各々は、３つの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＡＭ）を含み、その２本のＣＤ３ζ鎖は、シグナル伝達カスケードを惹起してＮＦＡＴの活性化をもたらすチロシンキナーゼであるζ活性化タンパク質７０ｋＤａ（ＺＡＰ７０）に結合する。第１世代ＣＡＲは、代表的には、タンパク質特異的ｓｃＦｖ領域がＣＤ３ζ細胞質領域に結合した状態で構築され、そのｓｃＦｖによる標的抗原の認識は、天然のＴＣＲシグナル伝達を模倣し、Ｔ細胞の活性化および標的細胞の細胞溶解を誘導する。誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０が、ＣＤ３ζポリペプチド分子を含むキメラ抗原レセプターに共刺激活性を提供し得るかを調べるために、腫瘍関連表面タンパク質である前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）を認識する第１世代ＣＡＲ^２８を構築し、それを用いることにより、Ｔ細胞をｉＭＣまたはＦＫＢＰのみのコントロールベクターと同時形質導入した（図４ｂおよび５ａ）。ＣＤ３、ＣＤ１９および抗ＣＡＲ抗体を用いたフローサイトメトリー解析は、それらのＴ細胞のおよそ７０±２１％および５８±２３％が、それぞれ、ＣＡＲとコントロールの両方、またはＣＡＲとｉＭＣベクターの両方で形質導入されたことを示し（図２ｂ、１０ａおよび１０ｂ）、ＣＡＲによって改変されたＴ細胞が、ＰＳＣＡ^＋腫瘍細胞株（すなわち、Ｃａｐａｎ−１およびＨＰＡＣ）に対する細胞傷害性機能を保持したことを示した（図１０ｃ）。ＣＡＲ（腫瘍抗原による）とｉＭＣ（リミズシドによる）との同時活性化によって、Ｔ細胞の拡大および腫瘍管理の増加がもたらされ得るかを調べるために、ＧＦＰによって改変されたＰＳＣＡ^＋腫瘍細胞株（Ｃａｐａｎ−１）に対して共培養アッセイを行った。リミズシドの非存在下において、ＰＳＣＡ．ζおよびコントロールベクターまたはＰＳＣＡ．ζＣＡＲおよびｉＭＣで操作されたＴ細胞は、形質導入されていないＴ細胞と比べて有意な腫瘍殺滅を示した；しかしながら、リミズシド添加によるｉＭＣの活性化は、Ｃａｐａｎ−１−ＧＦＰの排除をさらに高めた（図２ｃ）。フローサイトメトリー解析は、リミズシドによって活性化されたＣＡＲ＋ｉＭＣ^＋Ｔ細胞の出現頻度の劇的な増加を示した（図２ｃ）。さらに、ＣＡＲとｉＭＣの両方で改変されたＴ細胞は、ＩＬ−２を産生しただけでなく、ＣＤ２５の発現をアップレギュレートし、腫瘍抗原とリミズシドの両方の存在下において増殖した（図２ｄおよび２ｅ）。ＩＬ−２の産生に対する必要条件をさらに定義するために、Ｔ細胞に、ＰＳＣＡ．ζ有りまたは無しでｉＭＣまたはコントロールベクター（ＦＫＢＰ）を形質導入し（図１０ｄ）、網羅的解析を行ったところ、腫瘍抗原の刺激およびリミズシドの活性化が変化した（図２ｆ）。ｉＭＣおよびＣＡＲだけを形質導入され、腫瘍抗原とリミズシドの両方で刺激されたＴ細胞だけが、ＩＬ−２を産生した。重要なことには、リミズシドによって誘導されるｉＭＣの活性化は、同様に、外来性ＩＬ−２またはＴＣＲ活性化の非存在下においてＣＡＲ Ｔ細胞の生存を改善した（図１１）ことから、ＣＡＲおよびｉＭＣを介した同時活性化は、Ｔ細胞の応答を増幅し得るが、ｉＭＣの活性化のみでは、生存および存続を改善し得ることが示唆される。

【0432】

実施例５：誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０によるＣＡＲ発現Ｔ細胞の活性化は抗腫瘍活性を高める
腫瘍細胞およびリミズシドによるＣＡＲとｉＭＣとの同時活性化が、抗腫瘍有効性の改善に変換されるかを評価するために、免疫不全マウスにおける腫瘍異種移植研究を行った。Ｃａｐａｎ−１腫瘍細胞を皮下移植されたＳｈｏｒｎ（「ＳＨｒＮ」無毛ＮＯＤ．ＳＣＩＤ）マウスを、形質導入されていないＴ細胞またはｉＭＣもしくはコントロールベクターとともにＰＳＣＡ．ζＣＡＲを同時形質導入されたＴ細胞で２回、静脈内処置した（図３ａ）。リミズシド（５ｍｇ／ｋｇ）を、１日目から１００日目まで１週間に２回、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって投与し、外来性ＩＬ−２を２１日目まで投与した。インビトロ研究によると、ｉＭＣおよびＰＳＣＡ．ζＣＡＲを形質導入されたＴ細胞で処置されたマウスは、形質導入されていないＴ細胞またはＰＳＣＡ．ζＣＡＲおよびコントロールベクターで形質導入されたＴ細胞と比べて、有意に改善された腫瘍管理および生存を示した（図３ｂおよび３ｃ）。ｉＭＣの架橋は、Ｔ細胞の共刺激をもたらすとみられるので、ｉＭＣが第２世代ＰＳＣＡ−ＣＡＲ（ＰＳＣＡ．２８．ζ）におけるＣＤ２８の機能（例えば、増殖および生存の増加）に取って代わり得るかを判定するために、ｉＭＣを試験した（図４ｂ）。ここで、形質導入されていないＴ細胞、あるいはＦＫＢＰおよびＰＳＣＡ．ζもしくはＰＳＣＡ．２８．ζまたはｉＭＣおよびＰＳＣＡ．ζで改変されたＴ細胞（図１２ａ）を、共培養アッセイにおいて、腫瘍殺滅およびＩＬ−２分泌について調べた。ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含めることによって、腫瘍殺滅、Ｔ細胞増殖およびＩＬ−２産生が改善されたが、これらの特徴は、ｉＭＣ活性化によってなおもさらに高度に増強された（図１２ｂ〜１２ｄ）ことから、ｉＭＣは、ＣＡＲ分子内に組み込まれたアクセサリーシグナル伝達ドメインの代わりに、リミズシド依存的共刺激スイッチとして作用し得ることが示唆される。このことをインビボにおいて評価するために、Ｃａｐａｎ−１腫瘍を有する免疫不全マウスを単回のＰＳＣＡ．ζ、ＰＳＣＡ．２８．ζまたはＰＳＣＡ．ζおよびｉＭＣによって改変されたＴ細胞で処置し、次いで、ＩＬ−２補充なしで５ｍｇ／ｋｇのリミズシドを隔週で投与した（図１３ａ）。ＰＳＣＡ．ζおよびコントロールベクターを発現しているＴ細胞またはＰＳＣＡ．２８．ζを発現しているＴ細胞と比べて、ＰＳＣＡ．ζおよびｉＭＣによって改変されたＴ細胞は、腫瘍量の有意な減少および全体的な生存の改善をもたらした（図１３ｂおよび１３ｃ）。これらのデータから、ＩＬ−２産生およびおそらく他の因子の増加が、ＣＤ２８内部ドメインを含むＣＡＲ分子によって達成される上記のＴ細胞の存続および抗腫瘍機能を改善することが示唆される。

【0433】

実施例６：誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０によって刺激された細胞における、ＣＡＲによって改変されたＴ細胞の拡大
リミズシドによって媒介されるｉＭＣの活性化は、ＣＡＲによって改変されたＴ細胞に対して成長の利点を提供したので、インビボにおけるＴ細胞の拡大を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ ＩＬ−２Ｒγ欠損（ＮＳＧ）マウスにおいて生物発光（ＢＬＩ）を用いて調べた。形質導入されていないものおよびｉＭＣまたはＦＫＢＰを同時形質導入されたＰＳＣＡ．ζＣＡＲに、続いて、ＥＧＦＰ−ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質（ＥＧＦＰｌｕｃ）をコードするレトロウイルスを形質導入し（図１４）、それを、Ｃａｐａｎ−１腫瘍を有するＮＳＧマウスに注入し、２．５ｍｇ／ｋｇリミズシドで１週間に１回（ｑｗ）または１週間に２回（ｂｉｗ）処置し、生物発光をイメージングした（図３ｄ）。リミズシドの全身投与によるｉＭＣの活性化によって、ｉＭＣ活性化を欠くＴ細胞と比べて、高い腫瘍管理が可能になった（図３ｅ）。インビボイメージングは、リミズシドで処置されたマウスの全身（図３ｆおよび３ｇ）と皮下腫瘍部位（図３ｈ）の両方において、Ｔ細胞のＢＬＩの劇的な増加を示した。これらのデータは、リミズシドを用いたＴ細胞共刺激の外部管理によって、Ｔ細胞の拡大および有効性がインビボにおいて調節できることを示している。

【0434】

実施例７：実施例２〜６および本明細書における引用

【表B-1】

【表B-2】

【表B-3】

【0435】

【表1】

【0436】

【表2】

【0437】

【表3】

【0438】

【表4】

【0439】

実施例８：より低い基底活性を有する誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉ）刺激分子
中程度の二量体化剤（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）非依存的な（「基底」の）ＮＦ−κＢ誘導およびＩＬ−６分泌が、時折、誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ刺激分子を用いたとき観察される。この活性は低いにもかかわらず、アミノ末端のミリストイル化領域を含まない改変されたＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ刺激分子がデザインされた。この改変されたＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ刺激分子は、アミノ末端のミリストイル化領域を含むキメラ刺激分子よりも低いレベルの自発的な二量体化、すなわち、より低い基底活性を有するかを判定するために試験された。

【0440】

「ｉＭＣ」のミリストイル化標的化ドメインの役割を厳密に実証するために、ｐＢＰ１８０−ＳＦＧ−ｉＭＣ−２Ａ−ａＣＤ１９−ＣＤ３４ｅ−ゼータ（図６３を参照のこと）を用いて、約２ｋｂのＢｓｒＧＩ−ＳａｃＩＩフラグメントを、ｖ−Ｓｒｃに由来する１４アミノ酸のミリストイル化標的化アミノ末端を欠く類似のフラグメントで置き換えることによって、バイシストロニックなγ−レトロウイルスベクターを構築した。その親ベクターをさらに「クリーンアップ（ｃｌｅａｎ−ｕｐ）」するために、最適以下のリボソーム負荷「Ｋｏｚａｋ」配列の後にあるベクター１８０内の上流の余分なインフレームのＡＴＧを除去して、わずかに改変されたｐＢＰ１８０（「ｐＢＰ６０７」と呼ばれる）、およびミリストイル化されていない（ｎｏｎ−ｍｙｒｉｓｔｏｒｙｌａｔｅｄ）ｉΔを含む新しい試験ベクター「ｐＢＰ６０６−ｐＳＦＧ−ｉΔＭＣ．２Ａ−ａＣＤ１９．Ｑ．８ｓｔｍ．ＣＤ３ζ」を得た（図１５）。さらに、そのミリストイル化されていないｉＭＣベクターの「一般的な」バージョンを作製するために、上記のような２つ目の上流のＡＴＧを、ΔＣＤ１９を共発現するｉＭＣベクターであるｐＢＰ０１７２−ＳＦＧ−ｉＭＣｎｏＥ−２Ａ−ΔＣＤ１９から除去することにより、ｐＢＰ６０９を得て、ｐＢＰ６０９由来の除去されたミリストイル化標的化配列を除去することにより、「ｐＢＰ６０８−ｐＳＦＧ−ｉΔＭＣ−２Ａ−ΔＣＤ１９」を得た（図１６）。

【0441】

ミリストイル化されていないｉＭＣの機能をミリストイル化されたｉＭＣと比較して試験するために、対応するレトロウイルスベクターを、ＳＦＧをコードするプラスミドから作製し、ミリストイル化されたまたはミリストイル化されていないｉＭＣを、同一の５’非翻訳領域または対応する元のベクターｐＢＰ０１７２およびｐＢＰ０１８０、わずかに改変された５’末端とともに含み、さらにそれぞれΔＣＤ１９または抗ＣＤ１９ ＣＡＲ−ＣＤ３ζを含む３セットのウイルスベクターを１^０ヒトＴ細胞に形質導入した。ウイルスへの曝露の２日後に、抗ＣＤ１９（１７２、６０６および６０７）または抗ＣＤ３４（１８０、６０８および６０９）を用いて、形質導入されたＴ細胞のフローサイトメトリーを行ったところ、感染が成功したこと、および各群内でベクター間の発現レベルが匹敵していたこと（それぞれ約８０％または約４０％；示さず）が確かめられた。その後、等しい数の細胞を、１０ｎＭリミズシドの存在下または非存在下において再プレーティングし、２４時間後に、培養した培地を、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−６についてアッセイした（図１７）。

【0442】

等しい数（５^５個）のＴ細胞芽球を、ウイルスでコーティングされた２４ウェルプレートに加えた。４８時間後、細胞を回収し、ＣＤ１９の発現（ベクター１７２、６０６および６０７）またはＣＤ３４ Ｑエピトープの発現（１８０、６０８および６０９）についてアッセイした。細胞を回収し、１０ｎＭリミズシド有りまたは無しで再プレーティングした。２４時間後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−６のレベルについてアッセイした。上清を１０倍（１７ａ）または５０倍（１７ｂ）希釈した。１Ｏ．Ｄ．約３００ｎｇ／ｍｌ（検量線から）。

【0443】

１７２と１８０の両方のファミリーのベクターに対する結果は、ミリストイル化されていないｉΔＭＣ構築物が、予測されたように、リミズシドの非存在下において、より少ないＩＬ−６を産生したことを示唆する；が、ＩＬ−６の誘導されたレベルは、低下しなかった。ゆえに、ミリストイル化されていないｉΔＭＣは、ＣＤ３ζシグナル伝達の非存在下において（ＴＣＲシグナル伝達に相当する）、よりコントロール可能なリミズシド（ｒｉｍｕｄｉｃｉｄ）依存的活性化シグナルを提供し得る。

【0444】

ミリストイル化されていない誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ｉΔＭＣ）とミリストイル化された誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ｉＭＣ）とをさらに比較するために、抗ＣＤ１９第１世代ＣＡＲ＋ｉＭＣ（１８０）またはｉΔＭＣ（６０８）を含む細胞を、ＣＤ１９^＋Ｒａｊｉ腫瘍細胞有りまたは無しおよびリミズシド有りまたは無しで培養し、ＩＬ−２とＩＬ−６の両方をアッセイした。

【0445】

形質導入されていない（ＮＴ）Ｔ細胞、ならびにｉＭＣおよびミリストイル化されていないｉΔＭＣを使用できるＣＡＲ構築物を形質導入されたＴ細胞をＣＤ１９^＋Ｒａｊｉ腫瘍細胞とともに、Ｔ細胞と腫瘍細胞との比が１：１で２４ウェルプレートにおいて共培養した。続いて、Ｔ細胞を１０ｎＭリミズシドで刺激した。２４時間後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡを用いてＩＬ−６（１８ａ）およびＩＬ−２（１８ｂ）の産生について測定した。

【0446】

上記のＩＬ−６アッセイと同様に、外来性の刺激の非存在下において、ｉΔＭＣ（６０８）によって改変された細胞は、最初のｉＭＣ−１９構築物（１８０）を発現する細胞よりも少ないＩＬ６を分泌した（図１８、左のパネル）。ＩＬ−２について同様の結果が観察された（図１８、右のパネル）。さらに、Ｒａｊｉ細胞の存在は、ＩＬ−６に関して、１８０および６０８によって改変された細胞の基底のシグナル伝達を有意に変化させなかった。興味深いことに、Ｒａｊｉ細胞の存在は、リミズシドの非存在下でさえも、ｉＭＣまたはｉΔＭＣによるＩＬ−２の高レベル産生をもたらしたことから、ｉΔＭＣの基底のシグナル伝達は、ｉＭＣのそれよりも低いが、完全なＣＤ１９依存性ＩＬ−２産生にとってなおも十分であることが示された。それにもかかわらず、ＣＤ１９ｈｉのリンパ腫細胞は、例外である可能性があり、ＩＬ−２産生のリミズシド依存性は、Ｂ細胞由来の腫瘍によって与えられる残残存ＡＰＣ様特性がなければ、上皮由来の腫瘍細胞において、より厳重にコントロールされる可能性がある。これは、Ｂ細胞が、ＤＣのような他のＡＰＣと同様に、ＣＤ８０およびＣＤ８６のような共刺激分子に加えて、より高いレベルのＭＨＣクラスＩＩを発現するからである。

【0447】

ｉΔＭＣにおけるような、ｉＭＣからのミリストイル化標的化ドメインの除去は、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ共刺激分子のより低いリミズシド非依存的基底活性をもたらし、より少ないＮＦ−κＢシグナル伝達およびより少ない自発的なＩＬ−６産生をもたらす。Ｔ細胞の生存および拡大は、５−アミノ末端にミリストイル化領域を含まないＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ刺激分子を用いて、インビボにおいて、より厳重にコントロールされ得る。これらの構築物を形質導入されたＴ細胞は、ＣＩＤの非存在下では、より低い二量体非依存的毒性およびより低い存続を有し得る。それらは、滴定によって決定された最適なレベルのリミズシドを用いて、Ｔ細胞の拡大および腫瘍サイズのコントロールを高めることも可能にし得る。

【0448】

したがって、本明細書中に提供される誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ共刺激分子による共刺激のレベルをコントロールするために、様々な投与量のＡＰ１９０３が提供されるという点において、Ｔ細胞を活性化するための方法が調整できる実施形態も提供される。

【0449】

実施例９：プラスミドを構築するために使用されたポリヌクレオチド配列
ｐＳＦＧ−ｉΔＭＣ−２Ａ−ａＣＤ１９−Ｑ−８ｓｔｍ−ＣＤ３ζ（随意のミリストイル化標的化ドメインを伴う）。

【0450】

【表5-1】

【0451】

【表5-2】

【0452】

【表5-3】

【0453】

【表5-4】

【0454】

【表5-5】

【0455】

ｐＳＦＧ−ｉｄＭＣ−２Ａ−ｄＣＤ１９（随意のミリストイル化標的化ドメインを伴う）。

【0456】

【表6-1】

【0457】

【表6-2】

【0458】

【表6-3】

【0459】

実施例１０：特定の核酸配列およびアミノ酸配列の例

【0460】

【化1】

【0461】

【化2】

【0462】

【化3】

【0463】

【化4】

【0464】

実施例１１：種々の細胞型における誘導可能なキメラポリペプチドの発現
本願の誘導可能なキメラポリペプチドを、様々な細胞型において、腫瘍抗原とともに発現させた。形質導入された細胞は、キメラポリペプチドを発現し、免疫応答を誘導したことがケモカインおよびサイトカインの分泌によって実証された。例えばＩＬ−６の発現によって実証されるような免疫応答は、ＡＰ１９０３リガンドの存在下と非存在下の両方において活性化された。細胞株には、ケラチノサイト、メラノサイト（例えば、Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ）、マクロファージ（例えば、ＩＣ−２１）および線維芽細胞（例えば、ＢＬＫ−ＣＬ４）が含まれた。図２２は、ＡＰ１９０３と接触した後のキメラポリペプチドの発現が、形質導入された細胞において炎症性サイトカインおよびケモカインの発現を誘導し得るプロセスの模式的な概要を提供している。図２３は、形質導入された細胞におけるＰＳＭＡの発現およびサイトカインの分泌を測定するために使用されたアッセイの模式図を提供している。それらの細胞は、４つのアデノウイルスＡｄ５ベクター：Ａｄ５−ｉＭＣ−ＲＰ−ＦＬ；Ａｄ５−ｉＭＣ−Ｐ２Ａ−Ｐ−ＦＬ；Ａｄ５ｆ３５ｉＭＣ−ＲＰ−ＦＬ；またはＡｄ５ｆ３５ｉＭＣ−Ｐ２Ａ−ＦＬのうちの１つで形質導入された。図２４は、ＩＣ−２１マクロファージの形質導入の後の結果のグラフを提供しており、ＩＬ−６を産生することによるＡＰ１９０３に対する応答を示している。ＩＣ−２１マクロファージは、２４ウェルプレートにおいて１００，０００細胞／ｍｌ／ウェルで培養された。アデノウイルスを、１０００、２０００、４０００、８０００および１６０００ｖ．ｐ．／細胞比で加え、細胞を２４時間インキュベートした。その後、１００ｎＭのＡＰ１９０３をすべてのウェルに加え、翌日、細胞および培養上清を回収した。Ａ．細胞を抗ヒトＰＳＭＡ抗体ＬＮＩ−１７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で標識し、ＰＳＭＡの発現をフローサイトメトリーによって解析した。形質導入されていない細胞と比較したときのＰＳＭＡ^＋細胞のパーセンテージが表されている。Ｂ．ＩＬ−６を、ＥＬＩＳＡ（ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって培養上清から評価した。図２５は、種々のレベルの細胞プレーティングおよび感染効率においてキメラポリペプチドを形質導入されたマクロファージにＡＰ１９０３を加えた後のＩＬ−６の発現も評価している。ＩＣ−２１マクロファージは、２４ウェルプレートにおいて５０，０００細胞／ｍｌ／ウェルで培養された。アデノウイルスを、６０００、１２０００、１８０００、２４０００および３００００ｖ．ｐ．／細胞比で加え、細胞を２４時間インキュベートした。次いで、１００ｎＭのＡＰ１９０３をすべてのウェルに加え、翌日、細胞および培養上清を回収した。Ａ．細胞を抗ヒトＰＳＭＡ抗体ＬＮＩ−１７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で標識し、ＰＳＭＡの発現をフローサイトメトリーによって解析した。形質導入されていない細胞と比較したときのＰＳＭＡ^＋細胞のパーセンテージが表されている。Ｂ．ＩＬ−６を、ＥＬＩＳＡ（ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって培養上清から評価した。図２６は、形質導入された細胞の活性化がＡＰ１９０３の添加有りおよび無しで生じたことを実証しているアッセイの結果を提示している。ＩＣ−２１マクロファージは、６ウェルプレートにおいて３００，０００細胞／ウェルで培養された。アデノウイルスを、Ａｄ５ｆ３５−ｉＭＣ−ＲＰ−ＦＬに対しては２４，０００ｖ．ｐ．／細胞比で、およびＡｄ５−ｉＭＣ−Ｐ２Ａ−Ｐ−ＦＬに対しては１８０００ｖ．ｐ．／細胞で加え、細胞を２４時間インキュベートした。次いで、１００ｎＭのＡＰ１９０３を加え、６時間後および２０時間後に培養上清を回収した。ＩＬ−６を、ＥＬＩＳＡ（ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって培養上清から評価した。

【0465】

図２７は、Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞の形質導入の後の結果のグラフを提供しており、ＩＬ−６を産生することによるＡＰ１９０３に対する応答を示している。Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマは、２４ウェルプレートにおいて１００，０００細胞／ｍｌ／ウェルで培養された。アデノウイルスを、１０００、２０００、４０００、８０００および１６０００ウイルス／細胞比で加え、細胞を２４時間インキュベートした。次いで、１００ｎＭのＡＰ１９０３をすべてのウェルに加え、翌日、細胞および培養上清を回収した。Ａ．細胞を抗ヒトＰＳＭＡ抗体ＬＮＩ−１７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で標識し、ＰＳＭＡの発現をフローサイトメトリーによって解析した。形質導入されていない細胞と比較したときのＰＳＭＡ^＋細胞のパーセンテージが表されている。Ｂ．ＩＬ−６を、ＥＬＩＳＡ（ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって培養上清から評価した。図２８は、種々の感染効率およびプレーティング濃度におけるアッセイの結果を提供している。Ｂ１６メラノーマは、２４ウェルプレートにおいて５０，０００細胞／ｍｌ／ウェルで培養された。アデノウイルスを、６０００、１２０００、１８０００、２４０００および３００００ウイルス／細胞比で加え、細胞を２４時間インキュベートした。次いで、１００ｎＭのＡＰ１９０３をすべてのウェルに加え、翌日、細胞および培養上清を回収した。Ａ．細胞を抗ヒトＰＳＭＡ抗体ＬＮＩ−１７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で標識し、ＰＳＭＡの発現をフローサイトメトリーによって解析した。形質導入されていない細胞と比較したときのＰＳＭＡ^＋細胞のパーセンテージが表されている。Ｂ．ＩＬ−６を、ＥＬＩＳＡ（ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって培養上清から評価した。図２９は、ＡＰ１９０３の存在下および非存在下におけるＩＬ−６アッセイの棒グラフを提供しており、形質導入された細胞が、ＡＰ１９０３の添加無しでＩＬ−６を産生することを示している。Ｂ１６メラノーマ細胞は、６ウェルプレートにおいて３００，０００細胞／ウェルで培養された。アデノウイルスを、Ａｄ５ｆ３５−ｉＭＣ−ＲＰ−ＦＬに対しては２４，０００ｖ．ｐ．／細胞比で、およびＡｄ５−ｉＭＣ−Ｐ２Ａ−Ｐ−ＦＬに対しては１８０００ｖ．ｐ．／細胞で加え、細胞を２４時間インキュベートした。次いで、１００ｎＭのＡＰ１９０３を加え、６時間後および２０時間後に培養上清を回収した。ＩＬ−６を、ＥＬＩＳＡ（ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって培養上清から評価した。

【0466】

図３０は、ＢＬＫ ＣＬ４線維芽細胞の形質導入の後の結果のグラフを提供しており、ＩＬ−６を産生することによるＡＰ１９０３に対する応答を示している。ＢＬＫ．ＣＬ４線維芽細胞は、２４ウェルプレートにおいて１７５，０００細胞／ｍｌ／ウェルで培養された。アデノウイルスを、６０００、１２０００、１８０００、２４０００および３００００ウイルス／細胞比で加え、細胞を２４時間インキュベートした。次いで、１００ｎＭのＡＰ１９０３をすべてのウェルに加え、翌日、細胞および培養上清を回収した。Ａ．細胞を抗ヒトＰＳＭＡ抗体ＬＮＩ−１７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で標識し、ＰＳＭＡの発現をフローサイトメトリーによって解析した。形質導入されていない細胞と比較したときのＰＳＭＡ^＋細胞のパーセンテージが表されている。Ｂ．ＩＬ−６を、ＥＬＩＳＡ（ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって培養上清から評価した。図３１では、ＢＬＫ．ＣＬ４線維芽細胞は、６ウェルプレートにおいて３５０，０００細胞／ウェルで培養された。アデノウイルスを、２０，０００ｖ．ｐ．／細胞比で加え、細胞を２４時間インキュベートした。次いで、１００ｎＭのＡＰ１９０３を加え、翌日、培養上清を回収した。ＩＬ−６を、ＥＬＩＳＡ（ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって培養上清から評価した。

【0467】

図３２は、形質導入された細胞の活性化を決定するために使用された遺伝子発現アッセイの模式図を提供している。マクロファージを用いるこのアッセイにおいて、図３３は、ＡＰ１９０３応答性を調べるマクロファージベースのアッセイである。ＩＣ−２１マクロファージは、６ウェルプレートにおいて３００，０００細胞／ウェルで培養された。アデノウイルスを、Ａｄ５ｆ３５−ｉＭＣ−ＲＰ−ＦＬに対しては２４，０００ｖ．ｐ．／細胞比で、Ａｄ５−ｉＭＣ−Ｐ２Ａ−Ｐ−ＦＬに対しては１８，０００ｖ．ｐ．／細胞で加え、細胞を２４時間インキュベートした。次いで、１００ｎＭのＡＰ１９０３を加え、２０時間後に細胞を回収した。それらの細胞からのＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦ−アルファのｍＲＮＡ遺伝子発現を、Ｓｙｂｅｒ ｇｒｅｅｎ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いるＲＴ−ＰＣＲによって評価した。図３４は、ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ１０の遺伝子発現のアッセイの結果を示している。ＩＣ−２１マクロファージは、６ウェルプレートにおいて３００，０００細胞／ウェルで培養された。アデノウイルスを、Ａｄ５ｆ３５−ｉＭＣ−ＲＰ−ＦＬに対しては２４，０００ｖ．ｐ．／細胞比で、Ａｄ５−ｉＭＣ−Ｐ２Ａ−Ｐ−ＦＬに対しては１８，０００ｖ．ｐ．／細胞で加え、細胞を２４時間インキュベートした。次いで、１００ｎＭのＡＰ１９０３を加え、２０時間後に細胞を回収した。それらの細胞からのＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ１０のｍＲＮＡ遺伝子発現を、Ｓｙｂｅｒ ｇｒｅｅｎ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いるＲＴ−ＰＣＲによって評価した。図３５は、ＣＣＬ２およびＣＣＬ３の遺伝子発現のアッセイの結果を示している。ＩＣ−２１マクロファージは、６ウェルプレートにおいて３００，０００細胞／ウェルで培養された。アデノウイルスを、Ａｄ５ｆ３５−ｉＭＣ−ＲＰ−ＦＬに対しては２４，０００ｖ．ｐ．／細胞比で、Ａｄ５−ｉＭＣ−Ｐ２Ａ−Ｐ−ＦＬに対しては１８０００ｖ．ｐ．／細胞で加え、細胞を２４時間インキュベートした。次いで、１００ｎＭのＡＰ１９０３を加え、２０時間後に細胞を回収した。それらの細胞からのＣＣＬ２およびＣＣＬ３のｍＲＮＡ遺伝子発現を、Ｓｙｂｅｒ ｇｒｅｅｎ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いるＲＴ−ＰＣＲによって評価した。

【0468】

メラノーマ、線維芽細胞、マクロファージおよびケラチノサイト細胞株をはじめとした様々な細胞の形質導入の例が、本実施例に含まれる。マクロファージにおけるＩＬ−６の活性化が、ＡＰ１９０３の存在下または非存在下において生じた。形質導入された細胞株におけるＩＬ−６の遺伝子発現ならびに他のサイトカインおよびケモカインの遺伝子発現が、ＡＰ１９０３によって誘導された。

【0469】

実施例１２：プラスミド構築配列
以下のヌクレオチド配列を使用して、Ａｄ５−ｉＭＣ−Ｐ２Ａ−Ｐ−ＦＬおよびＡｄ５ｆ３５−ｉＭＣ−Ｐ２Ａ−Ｐ−ＦＬベクターを構築した。それらのヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列も提供される。

【0470】

【化5】

【0471】

【化6】

【0472】

【化7】

【0473】

プラスミドベクターの図は、図３７に提供されている。

【0474】

ｐＡｄ１１２７−０２．ｉＭＣ−Ｐ２Ａ−Ｐ−ＦＬは、Ａｄ５−ｉＭＣ−Ｐ２Ａ−Ｐ−ＦＬと血清型３５シュードタイプ化Ａｄ５ｆ３５−ｉＭＣ−Ｐ２Ａ−Ｐ−ＦＬの両方を作製するために使用されたシャトルベクターである。それは、誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０および完全長ＰＳＭＡを、ＣＭＶｐおよびウシ成長ホルモンポリＡ部位によって駆動される同じ転写物上に含む。ＣＭＶ−ｉＭＣ−Ｐ２Ａ−Ｐ−ＦＬに対する配列は、以下のようなハイライトが付けられた様々な領域を伴う：緑色：ＣＭＶプロモーター、青色：ミリストイル化ドメイン、赤色：ＭｙＤ８８Ｌ、橙色：ＣＤ４０、緑がかった青色：ＦＫＢＰｖ３６（コドンゆらぎ）、琥珀色：ＦＫＢＰｖ３６（ＷＴ配列）、黄緑色：Ｐ２Ａペプチド、赤色下線：ＰＳＭＡ−ＦＬ、茶色：ＢＧＨｐＡ

【0475】

実施例１３：Ｔリンパ球における誘導可能なキメラポリペプチドの発現
初代Ｔ細胞におけるｉＭＣの活性化を試験する実験：
１．２９３Ｔ細胞の一過性のトランスフェクションによってレトロウイルスを生成する：
２．ＣＤ３／ＣＤ２８によって活性化されたＴ細胞にＳＦＧ−ＭＣ．Ｆｖ１．Ｆｖ２．２Ａ．ΔＣＤ１９プラスミドベクター（配列はこの実施例および図３６に提供されている）を形質導入し、フローサイトメトリーによってＣＤ３^＋ＣＤ１９^＋の発現を調べることによって形質導入効率を測定する。
３．１０ｎＭ ＡＰ１９０３有りまたは無しでＴ細胞を活性化し、２４、４８および７２時間後に以下の解析を行う：
ａ．マルチプレックス解析を用いて、サイトカインおよびケモカインの産生を測定する。
ｂ．ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６ならびにＭＨＣクラスＩおよびＩＩ抗体を用いて、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化の表現型を測定する。
ｃ．ＣＦＳＥ希釈および細胞数測定を用いて、増殖を測定する。
ｄ．Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイおよび細胞数測定アッセイを用いて、外来性ＩＬ−２の非存在下における細胞生存を測定する。
４．さらなるマーカー（例えば、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯ）を用いて、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞のメモリーの表現型を調べる。
５．ＴＧＦβおよび／またはＩＬ−１０を産生するＴｒｅｇ細胞の存在下における、休止Ｔ細胞およびｉＭＣによって活性化されたＴ細胞の耐性を試験する。

【0476】

予想される結果：
１．ｉＭＣの架橋は、この実施例において列挙されるＴ細胞活性化マーカーを用いてアッセイしたとき、Ｔ細胞の活性化を駆動し、Ｔ細胞増殖を増加させるＴｈ１サイトカイン（例えば、ＩＬ−２およびＩＦＮγ）および細胞傷害性を増加させるＩＦＮγの同化を増大する。２．Ｔ細胞は、ｉＭＣの架橋によって活性化され、アポトーシスの変化は、ほとんどまたは全く無い。
３．メモリーの表現型（ｐｈｏｎｏｔｙｐｅ）の増加ならびにＴｒｅｇ細胞の阻害作用に対するＣＤ４^＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の耐性の増大が観察される。

【0477】

本実施例は、誘導可能なキメラポリペプチドをＴリンパ球において発現させるために使用される方法の例を提供する。誘導可能なキメラＭｙＤ８８／ＣＤ４０ポリペプチドを用いる特定の例が提供される。同様の方法が、誘導可能なキメラＭｙＤ８８またはＣＤ４０ポリペプチドに適用され得る。

【0478】

誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０ポリペプチドであるｉＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ｉＭＣ）をＴ細胞において試験するために、同じ転写物上でｉＭＣおよび切断型ＣＤ１９マーカーをコードするレトロウイルスプラスミドベクターｐＳＦＧ．Ｍｙｒ−ＭＣ−Ｆｖ１−Ｆｖ２−２Ａ−ΔＣＤ１９（「ｐＳＦＧ．ｉＭＣ−２Ａ−ΔＣＤ１９」）を、ｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターおよびＲＤ１１４エンベロープベクターとともに２９３細胞に一過性にコトランスフェクトすることにより、高力価のレトロウイルスを作製する。

【0479】

誘導可能なポリペプチドは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＳｅｒリンカーとともにＭｙＤ８８またはＣＤ４０配列に連結された２つのＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ、例えば、Ｆ３６Ｖ変異を含むＦＫＢＰ１２ｖ３６バリアント、すなわちＦＫＢＰ１２；ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨ００２８１８））を含む。レトロウイルスにおいて発現されたときの相同組換えを防ぐために、ＦＫＢＰ（Ｆ_ｖ２）のうちの１つのアミノ酸配列をコドンゆらぎにする（例えば、各アミノ酸コドンの３番目のヌクレオチドを、元々コードされていたアミノ酸を維持したサイレント変異によって変更する）。それらの構築物を、ＳＦＧにクローニングする；それらは、ｐＬｅｎｔｉ７．３にもクローニングされ得る。

【0480】

２９３Ｔ細胞を、これらの各構築物でトランスフェクトし、形質導入の４８時間後に、マーカー遺伝子ＧＦＰまたはΔＣＤ１９の発現をフローサイトメトリーによって解析する。ＧＦＰまたはΔＣＤ１９の発現レベルに加えて、発現された遺伝子産物をウエスタンブロットによって解析することにより、キメラポリペプチドの発現も確かめる。

【0481】

トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、アプロチニン、ロイペプチンおよびフッ化フェニルメチルスルホニル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む溶解緩衝液（５０％Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙ、１０％ドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］、４％ベータ−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、１２％水、４％ブロモフェノールブルー０．５％）に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートする。３０分間の遠心分離の後、上清を収集し、１：２でＬａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）と混合し、煮沸し、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにローディングする。膜を、ウサギ抗共刺激ポリペプチド免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ；Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ，Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ；１：５００希釈）およびマウス抗ＧＦＰ ＩｇＧ（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ；１：２５，０００希釈）でプロービングする。次いで、ブロットを、適切なペルオキシダーゼ結合二次抗体に曝露し、タンパク質の発現を、高感度化学発光（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）で検出する。次いで、その膜をストリッピングし、ヤギポリクローナル抗アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：５００希釈）でリプロービングすることにより、ローディングの質を調べる。

【0482】

誘導可能な発現構築物の評価
細胞株
がん細胞株ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、ＤＵ１４５およびＡ５４９、ならびにヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ−２９３Ｔを、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手する。細胞を、３７℃における５％二酸化炭素（ＣＯ２）を含む加湿雰囲気において、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含む完全ＩＭＤＭ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で維持する。形質導入されたＴ細胞およびＰＨＡ芽球を、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）が補充されたＣｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）培地中で維持する。

【0483】

Ｔ細胞の活性化
拡大および形質導入のためのＴ細胞の活性化は、可溶性αＣＤ３およびαＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して行われる。ＰＢＭＣを、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）が補充されたＣｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に、１×１０^６細胞／ｍｌで再懸濁し、０．２μｇ／ｍｌ αＣＤ３および０．５μｇ／ｍｌ αＣＤ２８可溶性抗体で刺激する。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ２において４日間培養する。４日目に、ＩＬ−２を含む１ｍｌの新鮮培地を加える。７日目に、形質導入に向けて、細胞を収集し、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に再懸濁する。

【0484】

レトロウイルス構築物およびレンチウイルス構築物
誘導可能なキメラポリペプチドの構築物は、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）によって合成され、模式図が図３６に示されている。そのキメラポリペプチドの発現、ならびに炎症性サイトカインおよびケモカインの発現および分泌の評価を、これらの導入遺伝子をコードするレトロウイルスまたはレンチウイルスをＴ細胞に個別にまたは同時に形質導入することによって行う。

【0485】

レトロウイルス形質導入
レトロウイルスの一過性の生成のために、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅトランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、ｇａｇ−ｐｏｌおよびＲＤ１１４エンベロープをコードするプラスミドとともに、キメラポリペプチド構築物で２９３Ｔ細胞をトランスフェクトする。トランスフェクションの４８〜７２時間後にウイルスを収集し、急速凍結し、使用するまで約８０℃で保存する。レンチウイルスの一過性の生成のために、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅを使用して、プラスミドｐＬＰ１（ｇａｇ／ｐｏｌ）、ｐＬＰ２（ｒｅｖ）およびｐＬＰ／ＶＳＶＧ（ＶＳＶＧ ｅｎｖ）とともに、上記構築物で２９３Ｔ細胞をトランスフェクトする。トランスフェクションの４８〜７２時間後にウイルスを収集し、急速凍結し、使用するまで約８０℃で保存する。大規模なレトロウイルスの生成のために、一過性ＶＳＶ−Ｇシュードタイプ化レトロウイルス上清を用いた複数回の形質導入によって、安定なＦＬＹＲＤ１８由来レトロウイルス産生株を作製する。導入遺伝子発現が最も高いＦＬＹＲＤ１８細胞を、単一細胞ソーティングし、最も高いウイルス力価をもたらすクローンを拡大し、リンパ球形質導入のためのウイルスを作製するために使用する。このクローンの導入遺伝子発現、機能およびレトロウイルス力価は、８週間超にわたる連続培養中、維持される。組織培養用の処理が行われていない２４ウェルプレートを、３７℃において１時間または４℃において一晩、７μｇ／ｍｌ Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＴａｋａｒａＢｉｏ，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）でコーティングする。それらのウェルを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次いで、３７℃において３０分間、プレートを１．５ｍｌの上清とともにインキュベートすることによって、レトロウイルス上清でコーティングする。続いて、Ｔ細胞芽球を、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充されたウイルス上清において１ウェルあたり５×１０^５細胞でプレーティングする。６０時間にわたって形質導入を行う。形質導入後、細胞を収集し、フローサイトメトリーによってＣＤ１９またはＧＦＰの発現について表現型分析を行う。

【0486】

形質導入されたＴ細胞の細胞傷害性
形質導入された各Ｔ細胞株の細胞傷害活性は、例えば、以前に提示されたような標準的な４時間の^５１Ｃｒ放出アッセイにおいて評価され得る。Ｔ細胞に上記レトロウイルスまたはレンチウイルスを形質導入し、それを、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）によって刺激された自家リンパ球（ＰＨＡ芽球）、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３またはＤＵ１４５およびＡ５４９がん細胞株、ならびにヒトＰＳＭＡを発現するトランスジェニックＡ５４９（Ａ５４９−ＰＳＭＡ）を含む、Ｃｒ^５１で標識された標的細胞と比較する。完全培地または１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中でインキュベートされた標的細胞をそれぞれ自発的なおよび最大の^５１Ｃｒ放出を決定するために使用する。３つ組ウェルの特異的溶解の平均パーセンテージを、１００×（実験による放出−自発的な放出）／（最大放出−自発的な放出）として計算した。クロム放出アッセイに加えて、共培養実験を行う。ここでは、細胞株ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、ＤＵ１４５、Ａ５４９およびＡ５４９−ＰＳＭＡを、蛍光性ｍＯｒａｎｇｅを発現するように形質導入し、標的細胞として使用する。ｍＯｒａｎｇｅを発現している腫瘍細胞を、完全培地中、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）の存在下において、形質導入されていないＴ細胞または改変されたＴ細胞とともに、腫瘍細胞とＴ細胞とが１：１０という比で共培養する。２４時間後、Ｔ細胞を１００ｎＭ ＡＰ１９０３で刺激する。７２時間後、細胞を捕集し、カウントし、Ｔ細胞を検出するためにＣＤ３で標識し、ｍＯｒａｎｇｅ腫瘍細胞のパーセンテージをフローサイトメトリー（ＬＳＲＩＩ；ＢＤ）によって解析する。

【0487】

形質導入されたＴ細胞の表現型分析および活性化状態
形質導入されたＴ細胞の細胞表面の表現型を、以下のモノクローナル抗体を使用して調べる：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２７、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＨＬＡ−ＡＢＣおよびＨＬＡ−ＤＲ。１００ｎＭ ＡＰ９０３を用いておよび用いずに、表現型分析を行う。適切なアイソタイプマッチコントロールを各実験において使用し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）を用いて細胞を解析する。抗Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を使用して、キメラポリペプチドの発現を評価する。

【0488】

形質導入されたＴ細胞のサイトカイン産生の解析
１００ｎＭ ＡＰ１９０３による刺激の前および後（２４時間）のＴ細胞培養上清中のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）の濃度を、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインサイトメトリビーズアレイ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して測定する。培養上清中の誘導されたサイトカイン産生を、製造者の指示書に従って酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって検証する。

【0489】

形質導入されたＴ細胞の増殖
ＡＰ１９０３によって誘導される活性化の増殖効果を、ＡＰ１９０３に曝露した後の、形質導入されたＴ細胞および形質導入されていないＴ細胞の細胞成長を測定することによって評価する。Ｔ細胞を、３７℃において１０分間、１０μＭカルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識する。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に再懸濁する。その後、１×１０^６個のＣＦＳＥで標識された改変Ｔ細胞または形質導入されていないＴ細胞を、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地のみにおいて培養するか、または１００ｎＭ ＡＰ１９０３で刺激する。５日後、細胞を収集し、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５．５およびＣＤ１９−ＰＥで標識し、ＣＦＳＥ希釈についてフローサイトメトリーによって解析する。

【0490】

可溶性免疫グロブリンが、形質導入されたＴリンパ球の増殖および拡大に影響するかを評価するために、いかなる外来性サイトカインも加えずに、健常ドナーから得られたヒト血漿の段階希釈物または精製されたヒト免疫グロブリン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の段階希釈物とともに細胞を１×１０^５細胞／ウェルで培養する。７２時間後、それらの細胞を、１μＣｉ（０．０３７ＭＢｑ）メチル−３［Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）でパルスし、さらに１５時間培養する。次いで、それらの細胞を、フィルター上に収集し、乾燥させ、毎分のカウント数を、β−シンチレーションカウンター（ＴｒｉＣａｒｂ ２５００ ＴＲ；Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｍｅｒｉｄｉｅｎ，ＣＴ）において測定する。これらの実験は、３つ組で行う。他の実験では、コントロールおよび改変されたＴリンパ球を、培地のみ、または血漿もしくは精製された免疫グロブリンの段階希釈物を１日おきに加えた培地を用いて培養する。次いで、トリパンブルー排除を用いて細胞を２日おきにカウントする。

【0491】

インビボ実験
インビボにおける腫瘍サイズに対する活性化Ｔ細胞の効果は、例えば以下のとおりアッセイされ得る。６〜８週齢の非肥満糖尿病重症複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスに照射し（２５０ｒａｄ）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に再懸濁された１０×１０^６〜１５×１０^６個のＬＮＣａＰ腫瘍細胞を、そのマウスの右側腹部の皮下に注射する。２週間後、直径がおよそ０．５ｃｍの腫瘍を有するマウスの尾静脈に、形質導入されていないＴ細胞または形質導入されたＴ細胞（合計１５×１０^６個）を注射する。それらのマウスを、ランダムに２群に分ける：Ｔ細胞を拡大するために、１群には、ＣＩＤ（５０μｇ ＡＰ１９０３、腹腔内、１週間に２回）を投与し、もう１群には、キャリアのみ（１６．７％プロパンジオール、２２．５％ＰＥＧ４００および１．２５％Ｔｗｅｅｎ８０、腹腔内、１週間に２回）を投与する。２１日間にわたるノギス測定によって、腫瘍の成長についてマウスを評価する。末梢血サンプルを、７、１４および２１日目に後眼窩出血によって採取することにより、ヒトＣＤ３／ヒトＣＤ１９発現Ｔ細胞に対するフローサイトメトリー解析を用いて、形質導入されたＴ細胞またはコントロールＴ細胞の残留および拡大を測定する。

【0492】

注釈付きベクター配列：
８９３１ｂｐ ｄｓ−ＤＮＡ
／ｎｏｔｅ＝“ＭＭＬＶ Ｐｓｉ”
／ｎｏｔｅ＝“モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）のパッケージングシグナル”
ＣＤＳ １２２６．．３８０２
／ｃｏｄｏｎ＿ｓｔａｒｔ＝１
／ｎｏｔｅ＝“ｉＭＣ−２Ａ−デルタ−ＣＤ１９”
／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ＝”

【0493】

【化8】

【0494】

【化9】

【0495】

ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ １２２６．．１２６７
／ｎｏｔｅ＝“Ｍｙｒ”
ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ １２６８．．１２７３
／ｎｏｔｅ＝“ＸｈｏＩ”
ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ １２７４．．１７８９
／ｎｏｔｅ＝“ＭｙＤ８８”
ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ １７９０．．１９７５
／ｎｏｔｅ＝“デルタ−ＣＤ４０”
ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ １９７６
／ｎｏｔｅ＝“ＳａｌＩ”
ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ １９７７．．１９８１
／ｎｏｔｅ＝“ＸｈｏＩ”
ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ １９８２．．１９９９
／ｎｏｔｅ＝“Ｌ１”
ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ ２０００．．２３２０
／ｎｏｔｅ＝“ＬＦｖ１”
ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ ２３２７．．２６４７
／ｎｏｔｅ＝“Ｆｖ２Ｌ”
ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ ２６４８．．２６６５
／ｎｏｔｅ＝“Ｌ１”
ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ ２６６６
／ｎｏｔｅ＝“ＳａｌＩ”
ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ ２６６７．．２６７１
／ｎｏｔｅ＝“ＳａｌＩ”
ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ ２６７２．．２６８３
／ｎｏｔｅ＝“フューリン”
ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ ２６８４．．２７２５
／ｐｒｏｄｕｃｔ＝“サルウイルス５由来のエピトープタグ”
／ｎｏｔｅ＝“Ｖ５タグ”
ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ ２７２６．．２７９４
／ｎｏｔｅ＝“Ｌ−２Ａ”
ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ ２７９５．．２８００
／ｎｏｔｅ＝“ＭｌｕＩ”
ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ ２８０１．．３８０２
／ｎｏｔｅ＝“ｄＣＤ１９”
ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ ３９６２．．４５５１
／ｎｏｔｅ＝“ＬＴＲ”
ｐｒｉｍｅｒ＿ｂｉｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（５２５０．．５２６６）
／ｎｏｔｅ＝“Ｍ１３ ｆｗｄ”
／ｎｏｔｅ＝“共通のシークエンシングプライマー、複数の類似のバリアントのうちの１つ”
ｐｒｏｍｏｔｅｒ ５７４１．．５８４５
／ｇｅｎｅ＝“ｂｌａ”
／ｎｏｔｅ＝“ＡｍｐＲプロモーター”
ＣＤＳ ５８４６．．６７０６
／ｃｏｄｏｎ＿ｓｔａｒｔ＝１
／ｇｅｎｅ＝“ｂｌａ”
／ｐｒｏｄｕｃｔ＝“ベータ−ラクタマーゼ”
／ｎｏｔｅ＝“ＡｍｐＲ”
／ｎｏｔｅ＝“アンピシリン、カルベニシリンおよび関連する抗生物質に対する耐性を付与する”
／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ＝”

【0496】

【化11】

【0497】

ｒｅｐ＿ｏｒｉｇｉｎ ６８７７．．７４６５
／ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ＝ＲＩＧＨＴ
／ｎｏｔｅ＝“ｏｒｉ”
／ｎｏｔｅ＝“高コピー数ｃｏｌＥ１／ｐＭＢ１／ｐＢＲ３２２／ｐＵＣ複製起点”
ｐｒｏｍｏｔｅｒ ７７８９．．７８１９
／ｎｏｔｅ＝“ｌａｃプロモーター”
／ｎｏｔｅ＝“大腸菌のｌａｃオペロンに対するプロモーター”
ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｂｉｎｄ ７８２７．．７８４３
／ｂｏｕｎｄ＿ ｍｏｉｅｔｙ＝“ｌａｃＩによってコードされるｌａｃリプレッサー”
／ｎｏｔｅ＝“ｌａｃオペレーター”
／ｎｏｔｅ＝“このｌａｃリプレッサーは、ｌａｃオペレーターに結合して、大腸菌における転写を阻害する。この阻害は、ラクトースまたはイソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えることによって軽減され得る”
ｐｒｉｍｅｒ ＿ｂｉｎｄ７８５１．．７８６７
／ｎｏｔｅ＝“Ｍ１３ ｒｅｖ”
／ｎｏｔｅ＝“共通のシークエンシングプライマー、複数の類似のバリアントのうちの１つ”
ＬＴＲ ８２７６．．８８６９
／ｎｏｔｅ＝“モロニーマウス白血病ウイルス由来の長い末端反復配列”
ＯＲＩＧＩＮ

【0498】

【化12】

【0499】

【化13】

【0500】

【化14】

【0501】

【化15】

【0502】

【化16】

【0503】

実施例１４：さらなる配列

【0504】

【化17】

【0505】

【化18】

【0506】

【化19】

【0507】

【化20】

【0508】

【化21】

【0509】

実施例１５：エキソビボにおけるＴ細胞の活性化およびヒト被験体への投与
ヒトを治療するために、改変されたＴ細胞を使用する方法が、この実施例に提示される。これらの方法は、他の非Ｔ細胞にも適用され得る。

【0510】

材料および方法
遺伝子改変されたＴ細胞の大規模産生
Ｔ細胞は、標準的な方法を用いて健常志願者から作製される。簡潔には、健常ドナーまたはがん患者由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、可溶性αＣＤ３およびαＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して、拡大および形質導入のために活性化する。ＰＢＭＣを、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）が補充されたＣｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に、１×１０^６細胞／ｍｌで再懸濁し、０．２μｇ／ｍｌ αＣＤ３および０．５μｇ／ｍｌ αＣＤ２８可溶性抗体で刺激する。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２において４日間培養する。４日目に、ＩＬ−２を含む１ｍｌの新鮮培地を加える。７日目に、形質導入に向けて、細胞を収集し、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に再懸濁する。

【0511】

プラスミドおよびレトロウイルス
ＳＦＧベースのプラスミドは、自己切断可能な２Ａ様配列を介して、細胞質シグナル伝達ドメインを欠く切断型ヒトＣＤ１９に連結された誘導可能なキメラポリペプチドからなる。１つの反復（ｉｎｔｅｒａｔｉｏｎ）において、その誘導可能なキメラポリペプチドは、Ｆ３６Ｖ変異を有し、短いＶａｌ−Ｇｌｕリンカーを介してヒトキメラポリペプチドに接続された、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２；ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨ００２８１８）からなる。そのＦ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３に対するＦＫＢＰ１２の結合親和性を高める。その２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の２０アミノ酸ペプチドをコードし、それは、グリシンと末端プロリン残基との間での＞９９％の切断を媒介して、誘導可能なキメラポリペプチドのＣ末端に１９個の追加のアミノ酸およびＣＤ１９のＮ末端に１つの追加のプロリン残基をもたらす。ＣＤ１９は、細胞質内ドメインを２４２アミノ酸から１９アミノ酸に短縮し、リン酸化に対する潜在的な部位である保存されたすべてのチロシン残基を除去する、アミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）で切断される、完全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ００１７７０）からなる。

【0512】

テナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ−Ｖ）シュードタイプ化レトロウイルスを産生する安定したＰＧ１３クローンを、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ ｐｒｏｄｕｃｔ ＃ＳＤ３４４４；ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をＳＦＧプラスミドで一過性にトランスフェクトすることによって、作製する。これは、Ｅｃｏシュードタイプ化レトロウイルスを産生する。そのＰＧ１３パッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）を、Ｅｃｏシュードタイプ化レトロウイルスで３回形質導入することにより、細胞１つあたり複数のＳＦＧプラスミド（ｐｌａｍｉｄ）プロウイルス組み込み体を含む産生株を作製する。単一細胞クローニングを行い、最も高い力価をもたらしたＰＧ１３クローンを、拡大し、ベクター作製のために使用する。

【0513】

レトロウイルス形質導入
Ｔ細胞の活性化および拡大のための培養液は、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）が補充された無血清Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）である。レトロウイルスベクターで形質導入する前の７日間にわたって、Ｔ細胞を可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって活性化する。必要であれば、ΔＣＤ１９の免疫磁気選択を形質導入後の４日目に行い；陽性画分をさらに２日間にわたって拡大し、凍結保存する。

【0514】

遺伝子改変され、同種異系枯渇された（ａｌｌｏｄｅｐｌｅｔｅｄ）細胞のスケールアップ産生
臨床適用のための形質導入プロセスのスケールアップでは、１０ｍｌの抗ＣＤ３ ０．５μｇ／ｍｌおよび抗ＣＤ２８ ０．２μｇ／ｍｌまたは１０ｍｌのフィブロネクチン７μｇ／ｍｌで４℃において一晩コーティングされた、組織培養用に処理されていないＴ７５フラスコ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を使用する。高細胞粘着性のためにコロナ処理されたフッ化エチレンプロピレンバッグ（２ＰＦ−００７２ＡＣ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）も使用する。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８によってコーティングされたフラスコに、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充された培地中、１×１０^６細胞／ｍｌで播種する。レトロウイルス形質導入に向けて、レトロネクチンでコーティングされたフラスコまたはバッグを、１０ｍｌのレトロウイルス含有上清で２〜３時間、一度負荷する。活性化Ｔ細胞を、レトロウイルスベクター含有新鮮培地と１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充されたＴ細胞培養液とが３：１の中に１×１０^６細胞／ｍｌで播種する。細胞を、翌朝収集し、組織培養用に処理されたＴ７５またはＴ１７５フラスコ内、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充された培養液中で、約５×１０^５細胞／ｍｌ〜８×１０^５細胞／ｍｌの播種密度で拡大する。

【0515】

ＣＤ１９免疫磁気選択
ＣＤ１９に対する免疫磁気選択は、１つの例において、形質導入の４日後に行われ得る。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に結合体化された常磁性マイクロビーズで標識し、小規模実験ではＭＳまたはＬＳカラムにおいて、および大規模実験ではＣｌｉｎｉＭａｃｓ Ｐｌｕｓ自動選択デバイスにおいて、選択する。ＣＤ１９によって選択された細胞を、さらに４日間拡大し、形質導入後の８日目に凍結保存する。これらの細胞は、「遺伝子改変細胞」と称される。

【0516】

免疫表現型分析および五量体解析
フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、以下の抗体を使用して行う：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６およびＣＤ６２Ｌ。ＣＤ１９−ＰＥ（クローン４Ｇ７；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）は、最適な染色をもたらすと見出されており、その後のすべての解析において使用された。形質導入されていないコントロールを、ＣＤ１９に対するネガティブゲートを設定するために使用する。

【0517】

統計解析
対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して、サンプル間の差の統計的有意性を判定する。すべてのデータを平均値±１標準偏差として表す。

【0518】

実施例１６：誘導可能なキメラシグナル伝達分子発現ベクターの構築および評価
ベクターの構築および発現の確認
ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６（Ｆｖ）に融合されたシグナル伝達分子をコードする、治療薬としての使用に適した発現ベクターを構築する。これらの方法は、１つまたはそれを超える誘導可能なシグナル伝達分子を発現させるためにも使用され得る。誘導可能なＣＳＭは、小分子医薬を使用して二量体化（または多量体化）され得る。誘導可能なＣＳＭをコードする核酸を、リガンド結合ドメインをコードする核酸に融合し、蛍光マーカーであるＧＦＰの発現も可能にする、ＳＦＧレトロウイルスベクターまたはｐＬｅｎｔｉ７．３レンチウイルスベクターに挿入する。

【0519】

誘導可能なＣＳＭポリペプチドは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＳｅｒリンカーとともにＣＳＭ配列に連結された、２つ、３つまたはそれを超える、ある特定の実施形態では、２つまたは３つのＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ、例えば、Ｆ３６Ｖ変異を含むＦＫＢＰ１２ｖ３６バリアントまたはＦＫＢＰ１２；ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨ００２８１８））を含む。レトロウイルスにおいて発現されたときの相同組換えを防ぐために、１つまたはそれを超えるＦＫＢＰ（Ｆ_ｖ２）のアミノ酸配列をコドンゆらぎにする（例えば、各アミノ酸コドンの３番目のヌクレオチドを、元々コードされていたアミノ酸を維持したサイレント変異によって変更する）。すべての構築物を、ＳＦＧまたはｐＬｅｎｔｉ７．３にクローニングする。

【0520】

２９３Ｔ細胞を、これらの各構築物でトランスフェクトし、形質導入の４８時間後に、マーカー遺伝子ＧＦＰまたはΔＣＤ１９の発現をフローサイトメトリーによって解析する。ＧＦＰまたはΔＣＤ１９の発現レベルに加えて、発現された遺伝子産物をウエスタンブロットによって解析することにより、キメラシグナル伝達分子ポリペプチドの発現も確かめる。例えば、共刺激ポリペプチドに結合する抗体が、そのウエスタンブロットのために使用され得る。

【0521】

トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、アプロチニン、ロイペプチンおよびフッ化フェニルメチルスルホニル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む溶解緩衝液（５０％Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙ、１０％ドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］、４％ベータ−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、１２％水、４％ブロモフェノールブルー０．５％）に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートする。３０分間の遠心分離の後、上清を収集し、１：２でＬａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）と混合し、煮沸し、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにローディングする。膜を、ウサギ抗共刺激ポリペプチド免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ；Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ，Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ；１：５００希釈）およびマウス抗ＧＦＰ ＩｇＧ（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ；１：２５，０００希釈）でプロービングする。次いで、ブロットを、適切なペルオキシダーゼ結合二次抗体に曝露し、タンパク質の発現を、高感度化学発光（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）で検出する。次いで、その膜をストリッピングし、ヤギポリクローナル抗アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：５００希釈）でリプロービングすることにより、ローディングの質を調べる。

【0522】

誘導可能なＣＳＭ発現構築物の評価
細胞株
がん細胞株ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、ＤＵ１４５およびＡ５４９、ならびにヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ−２９３Ｔを、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手する。細胞を、３７℃における５％二酸化炭素（ＣＯ_２）を含む加湿雰囲気において、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含む完全ＩＭＤＭ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で維持する。形質導入されたＴ細胞およびＰＨＡ芽球を、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）が補充されたＣｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）培地中で維持する。

【0523】

Ｔ細胞の活性化
拡大および形質導入のためのＴ細胞の活性化は、可溶性αＣＤ３およびαＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して行われる。ＰＢＭＣを、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）が補充されたＣｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に、１×１０^６細胞／ｍｌで再懸濁し、０．２μｇ／ｍｌ αＣＤ３および０．５μｇ／ｍｌ αＣＤ２８可溶性抗体で刺激する。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ２において４日間培養する。４日目に、ＩＬ−２を含む１ｍｌの新鮮培地を加える。７日目に、形質導入に向けて、細胞を収集し、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に再懸濁する。

【0524】

レトロウイルス構築物およびレンチウイルス構築物
ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１およびＨｅｒ２／Ｎｅｕを標的化するコドン最適化された一本鎖可変フラグメントで構成される誘導可能なＣＳＭ（ｉＣＳＭ）およびＣＡＲ−ＣＤ３ゼータ構築物は、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）によって合成される。ｉＣＳＭ構築物は、Ｔ細胞レセプターのＣＤ２８、４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータ鎖を含む共刺激内部ドメインにインフレームで連結されたＦＫＢＰ１２ｖ３６ドメインからなる。ＣＡＲ構築物は、ヒトＩｇＧ１−Ｃｈ２Ｃｈ３ドメインおよびＣＤ３−ゼータ鎖をインフレームで含むｓｃＦｖフラグメントをクローニングすることによって作製される。ｉＣＳＭ構築物とＣＡＲ−ＣＤ３ゼータ構築物の両方を、エメラルドＧＦＰを共発現する、ＳＦＧレトロウイルス骨格またはｐＬｅｎｔｉ７．３レンチウイルス骨格（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングする。ｉＣＳＭの刺激作用および共刺激作用、ならびにＣＡＲ−ＣＤ３ゼータの細胞傷害性の評価を、これらの導入遺伝子をコードするレトロウイルスまたはレンチウイルスでＴ細胞を個別にまたは同時に形質導入することによって行う。

【0525】

レトロウイルス形質導入
レトロウイルスの一過性の生成のために、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅトランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、ｇａｇ−ｐｏｌおよびＲＤ１１４エンベロープをコードするプラスミドとともに、ｉＣＳＭ構築物で２９３Ｔ細胞をトランスフェクトする。トランスフェクションの４８〜７２時間後にウイルスを収集し、急速凍結し、使用するまで−８０℃で保存する。レンチウイルスの一過性の生成のために、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅを使用して、プラスミドｐＬＰ１（ｇａｇ／ｐｏｌ）、ｐＬＰ２（ｒｅｖ）およびｐＬＰ／ＶＳＶＧ（ＶＳＶＧ ｅｎｖ）とともに、ｉＣＡＲ構築物で２９３Ｔ細胞をトランスフェクトする。トランスフェクションの４８〜７２時間後にウイルスを収集し、急速凍結し、使用するまで−８０℃で保存する。大規模なレトロウイルスの生成のために、一過性ＶＳＶ−Ｇシュードタイプ化レトロウイルス上清を用いた複数回の形質導入によって、安定なＦＬＹＲＤ１８由来レトロウイルス産生株を作製する。導入遺伝子発現が最も高いＦＬＹＲＤ１８細胞を、単一細胞ソーティングし、最も高いウイルス力価をもたらすクローンを拡大し、リンパ球形質導入のためのウイルスを作製するために使用する。このクローンの導入遺伝子発現、機能およびレトロウイルス力価を、８週間超にわたる連続培養中、維持する。組織培養用の処理が行われていない２４ウェルプレートを、３７℃において１時間または４℃において一晩、７μｇ／ｍｌ Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＴａｋａｒａＢｉｏ，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）でコーティングする。それらのウェルを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次いで、３７℃において３０分間、プレートを１．５ｍｌの上清とともにインキュベートすることによって、レトロウイルス上清でコーティングする。続いて、Ｔ細胞芽球を、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充されたウイルス上清において１ウェルあたり５×１０^５細胞でプレーティングする。６０時間にわたって形質導入を行う。形質導入後、細胞を収集し、フローサイトメトリーによってＣＤ１９またはＧＦＰの発現について表現型分析を行う。

【0526】

ｉＣＳＭ／ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞の細胞傷害性
形質導入された各Ｔ細胞株の細胞傷害活性を、先に提示されたような、標準的な４時間の^５１Ｃｒ放出アッセイにおいて評価する。ｉＣＳＭ、ＰＳＭＡ ＣＡＲ−ＣＤ３ゼータ、またはｉＣＳＭウイルスとＣＡＲウイルスの両方で形質導入されたＴ細胞を、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）によって刺激された自家リンパ球（ＰＨＡ芽球）、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３またはＤＵ１４５およびＡ５４９癌細胞株、ならびにヒトＰＳＭＡを発現するトランスジェニックＡ５４９（Ａ５４９−ＰＳＭＡ）を含む、Ｃｒ^５１で標識された標的細胞に対して比較する。完全培地または１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中でインキュベートされた標的細胞をそれぞれ自発的なおよび最大の^５１Ｃｒ放出を決定するために使用する。３つ組ウェルの特異的溶解の平均パーセンテージを、１００×（実験による放出−自発的な放出）／（最大放出−自発的な放出）として計算した。クロム放出アッセイに加えて、共培養実験を行う。ここでは、細胞株ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、ＤＵ１４５、Ａ５４９およびＡ５４９−ＰＳＭＡを、蛍光性ｍＯｒａｎｇｅを発現するように形質導入し、標的細胞として使用する。ｍＯｒａｎｇｅを発現している腫瘍細胞を、完全培地中、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）の存在下において、形質導入されていないＴ細胞またはＣＡＲによって改変されたＴ細胞とともに、腫瘍細胞とＴ細胞とが１：１０という比で共培養する。２４時間後、ｉＣＡＲを有するＴ細胞を１００ｎＭ ＡＰ１９０３で刺激する。７２時間後、細胞を捕集し、カウントし、Ｔ細胞を検出するためにＣＤ３で標識し、ｍＯｒａｎｇｅ腫瘍細胞のパーセンテージをフローサイトメトリー（ＬＳＲＩＩ；ＢＤ）によって解析する。

【0527】

ｉＣＳＭを形質導入されたＴ細胞の表現型分析および活性化状態
ｉＣＡＲを形質導入されたＴ細胞の細胞表面の表現型を、以下のモノクローナル抗体を使用して調べる：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２７、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＨＬＡ−ＡＢＣおよびＨＬＡ−ＤＲ。ｉＣＳＭ刺激剤として１０〜１００ｎＭ ＡＰ１９０３を用いておよび用いずに、表現型分析を行う。適切なアイソタイプマッチコントロールを各実験において使用し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）を用いて細胞を解析する。抗Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を使用して、ＣＡＲの発現を評価した。

【0528】

ｉＣＳＭを形質導入されたＴ細胞のサイトカイン産生の解析
１００ｎＭ ＡＰ１９０３による刺激の前および後（２４時間）のＴ細胞培養上清中のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）の濃度を、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインサイトメトリビーズアレイ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して計測する。培養上清中の誘導されたサイトカイン産生を、製造者の指示書に従って酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって検証する。

【0529】

ｉＣＳＭを形質導入されたＴ細胞の増殖
ｉＣＳＭを介したＡＰ１９０３誘導性シグナル伝達の増殖効果を、ＡＰ１９０３に曝露した後の、形質導入されたＴ細胞および形質導入されていないＴ細胞の細胞成長を計測することによって評価する。Ｔ細胞を、３７℃において１０分間、１０μＭカルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識する。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に再懸濁する。その後、１×１０^６個のＣＦＳＥで標識されたｉＣＳＭ改変Ｔ細胞または形質導入されていないＴ細胞を、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地のみにおいて培養するか、または１００ｎＭ ＡＰ１９０３で刺激する。５日後、細胞を収集し、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５．５およびＣＤ１９−ＰＥで標識し、ＣＦＳＥ希釈についてフローサイトメトリーによって解析する。

【0530】

可溶性免疫グロブリンがＣＡＲ^＋Ｔリンパ球の増殖および拡大に影響するかを評価するために、いかなる外来性サイトカインも加えずに、健常ドナーから得られたヒト血漿の段階希釈物または精製されたヒト免疫グロブリン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の段階希釈物とともに細胞を１×１０^５細胞／ウェルで培養する。７２時間後、それらの細胞を、１μＣｉ（０．０３７ＭＢｑ）メチル−^３［Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）でパルスし、さらに１５時間培養する。次いで、それらの細胞を、フィルター上に収集し、乾燥させ、毎分のカウント数を、β−シンチレーションカウンター（ＴｒｉＣａｒｂ ２５００ ＴＲ；Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｍｅｒｉｄｉｅｎ，ＣＴ）において計測する。これらの実験は、３つ組で行う。他の実験では、コントロールおよびＣＡＲ^＋Ｔリンパ球を、培地のみ、または血漿もしくは精製された免疫グロブリンの段階希釈物を１日おきに加える培地を用いて培養する。次いで、トリパンブルー排除を用いて細胞を２日おきにカウントする。

【0531】

インビボ実験
６〜８週齢の非肥満糖尿病重症複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスを照射し（２５０ｒａｄ）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に再懸濁された１０×１０^６〜１５×１０^６個のＬＮＣａＰ腫瘍細胞を、そのマウスの右側腹部の皮下に注射する。２週間後、直径がおよそ０．５ｃｍの腫瘍を有するマウスの尾静脈に、形質導入されていないＴ細胞またはｉＣＳＭ／ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞（合計１５×１０^６個）を注射した。それらのマウスを、ランダムに２群に分ける：Ｔ細胞を拡大するために、１群には、ＣＩＤ（５０〜１２５μｇ ＡＰ１９０３、腹腔内、１週間に２回）を投与し、もう１群には、キャリアのみ（１６．７％プロパンジオール、２２．５％ＰＥＧ４００および１．２５％Ｔｗｅｅｎ８０、腹腔内、１週間に２回）を投与する。２１日間にわたるノギス計測によって、腫瘍の成長についてマウスを評価する。末梢血サンプルを、７、１４および２１日目に後眼窩出血によって採取することにより、ヒトＣＤ３／ヒトＣＤ１９発現Ｔ細胞に対するフローサイトメトリー解析を用いて、ｉＣＳＭまたはコントロールＴ細胞の残留および拡大を計測する。

【0532】

ｉＣＳＭを形質導入されたＴ細胞の特色のインビボにおける評価
誘導可能なＣＳＭの発現が、Ｔ細胞の特色を変化させないことを確実にするために、形質導入されていないまたは非機能性の誘導可能なＣＡＲ（ＰＳＭＡ ＣＡＲ−ＣＤ３ゼータのみ）の表現型、抗原特異性、増殖能および機能を、ｉＣＳＭ／ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞と比較する。形質導入された細胞および形質導入されていない細胞におけるＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋、ＣＤ５６^＋およびＴＣＲα／β^＋細胞の数を比較し、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−２を含むサイトカインの産生産生も同様に比較する。指数関数的に増えるＣＴＬの成長の特色、ならびに増殖に対する抗原およびＩＬ−２への依存性を評価し、抗原刺激の際のタイプＴ_Ｈ１およびＴ_Ｈ２サイトカインの表現型データおよび分泌データも同様に評価する。

【0533】

実施例１７：治療のためのヒト細胞における誘導可能なＣＳＭの使用
発現構築物、およびヒト細胞においてその発現構築物を使用する方法が、この実施例に提示される。

【0534】

材料および方法
遺伝子改変されたＴ細胞の大規模産生
Ｔ細胞は、標準的な方法を用いて健常志願者から作製される。簡潔には、健常ドナーまたはがん患者由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、可溶性αＣＤ３およびαＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して、拡大および形質導入のために活性化する。ＰＢＭＣを、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）が補充されたＣｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に、１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、０．２μｇ／ｍｌ αＣＤ３および０．５μｇ／ｍｌ αＣＤ２８可溶性抗体で刺激する。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ２において４日間培養する。４日目に、ＩＬ−２を含む１ｍｌの新鮮培地を加える。７日目に、形質導入に向けて、細胞を収集し、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に再懸濁する。

【0535】

プラスミドおよびレトロウイルス
ＳＦＧプラスミドは、切断可能な２Ａ様配列を介して切断型ヒトＣＤ１９に連結された誘導可能なＣＳＭからなる。その誘導可能なＣＳＭは、Ｆ３６Ｖ変異を有し、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介してヒトＣＳＭに接続された、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２；ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨ００２８１８）からなる。そのＦ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３に対するＦＫＢＰ１２の結合親和性を高める。その２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の２０アミノ酸ペプチドをコードし、それは、グリシンと末端プロリン残基との間での＞９５％の切断を媒介して、ｉＣＳＭのＣ末端に１９個の追加のアミノ酸およびＣＤ１９のＮ末端に１つの追加のプロリン残基をもたらす。ＣＤ１９は、細胞質内ドメインを２４２アミノ酸から１９アミノ酸に短縮し、リン酸化に対する潜在的な部位である保存されたすべてのチロシン残基を除去する、アミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）で切断される、完全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ００１７７０）からなる。

【0536】

テナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ−Ｖ）シュードタイプ化レトロウイルスを産生するＰＧ１３ベースの安定したクローンを、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ ｐｒｏｄｕｃｔ ＃ＳＤ３４４４；ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をＳＦＧプラスミドで一過性にトランスフェクトすることによって、作製する。これは、Ｅｃｏシュードタイプ化レトロウイルスを産生する。そのＰＧ１３パッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）を、Ｅｃｏシュードタイプ化レトロウイルスで３回形質導入することにより、細胞１つあたり複数のＳＦＧプラスミドプロウイルス組み込み体を含む産生株を作製する。単一細胞クローニングを行い、最も高い力価をもたらしたＰＧ１３クローンを、拡大し、ベクター作製のために使用する。

【0537】

レトロウイルス形質導入
Ｔ細胞の活性化および拡大のための培養液は、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）が補充された無血清Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）である。レトロウイルスベクターで形質導入する前の７日間にわたって、Ｔ細胞を可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって活性化する。必要であれば、ΔＣＤ１９の免疫磁気選択を形質導入後の４日目に行い；陽性画分をさらに２日間にわたって拡大し、凍結保存した。

【0538】

遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞のスケールアップ産生
臨床適用のための形質導入プロセスのスケールアップでは、１０ｍｌの抗ＣＤ３ ０．５μｇ／ｍｌおよび抗ＣＤ２８ ０．２μｇ／ｍｌまたは１０ｍｌのフィブロネクチン７μｇ／ｍｌで４℃において一晩コーティングされた、組織培養用に処理されていないＴ７５フラスコ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を使用する。高細胞粘着性のためにコロナ処理されたフッ化エチレンプロピレンバッグ（２ＰＦ−００７２ＡＣ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）も使用する。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８によってコーティングされたフラスコに、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充された培地中、１×１０^６細胞／ｍｌで播種する。レトロウイルス形質導入に向けて、レトロネクチンでコーティングされたフラスコまたはバッグを、１０ｍｌのレトロウイルス含有上清で２〜３時間、一度負荷する。活性化Ｔ細胞を、レトロウイルスベクター含有新鮮培地と１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充されたＴ細胞培養液とが３：１の比の中に１×１０^６細胞／ｍｌで播種する。細胞を、翌朝収集し、組織培養用に処理されたＴ７５またはＴ１７５フラスコ内、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充された培養液中で、約５×１０^５細胞／ｍｌ〜８×１０^５細胞／ｍｌの播種密度で拡大する。

【0539】

ＣＤ１９免疫磁気選択
ＣＤ１９に対する免疫磁気選択は、例えば、形質導入の４日後に行われ得る。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に結合体化された常磁性マイクロビーズで標識し、小規模実験ではＭＳまたはＬＳカラムにおいて、および大規模実験ではＣｌｉｎｉＭａｃｓ Ｐｌｕｓ自動選択デバイスにおいて、選択する。ＣＤ１９によって選択された細胞を、さらに４日間拡大し、形質導入後の８日目に凍結保存する。これらの細胞は、「遺伝子改変細胞」と称される。

【0540】

免疫表現型分析および五量体解析
フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、以下の抗体を使用して行う：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６およびＣＤ６２Ｌ。ＣＤ１９−ＰＥ（クローン４Ｇ７；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）は、最適な染色をもたらすと見出されており、その後のすべての解析において使用された。形質導入されていないコントロールを、ＣＤ１９に対するネガティブゲートを設定するために使用する。ＣＡＲ発現を、抗Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を使用して評価する。

【0541】

統計解析
対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して、サンプル間の差の統計的有意性を判定する。すべてのデータを平均値±１標準偏差として表す。

【0542】

実施例１８：ＡＰ１９０３依存性Ｔ細胞活性化の測定
目的：２つのＦＫＢＰｖ３６分子に連結されたシグナル伝達分子をコードするレトロウイルスベクターで初代Ｔ細胞を形質導入することにより、そのＴ細胞のＡＰ１９０３活性化を可能にすること。この実験では、二量体化に応答したサイトカインの産生を、マルチプレックスサイトカインビーズアレイを使用して計測した。

【0543】

方法：
誘導可能なＴ細胞分子のデザインおよびクローニング：
１．２つのＳＦＧベースのレトロウイルスベクターを、Ｇｉｂｓｏｎクローニングによって構築した（ここで、ＰＣＲ産物を、ｐＡｄ１１２７−０２−ｉＭＣから増幅し、ＬＦｖ１．Ｆｖ２Ｌ ＤＮＡフラグメントの代わりにｐＢＰ０３２０−ＳＦＧ−Ｍｙｒ．ＬＦｖ１．Ｆｖ２Ｌ．２Ａ．ΔＣＤ１９構築物に挿入した）。

【0544】

ａ．第１のベクターにおいて、増幅されるＰＣＲ産物は、Ｆｖ’Ｆｖであるか、またはＦＫＢＰｖ３６フラグメントだけをレトロウイルス骨格に挿入した場合、ＸｈｏＩおよびＳａｌＩ部位においてＬＦｖ１．Ｆｖ２Ｌを置き換えた。このベクターは、ｐＢＰ０１７１−ＳＦＧ−Ｍｙｒ．Ｆｖ’．Ｆｖ．２Ａ．ΔＣＤ１９と呼ばれ、いかなるＴ細胞シグナル伝達分子も有しないコントロールベクターである。

【0545】

ｂ．第２のベクターにおいて、増幅されるＰＣＲ産物は、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０．Ｆｖ’．Ｆｖ（またはｉＭＣｎｏＥ）だった。これを、ＬＦｖ１．Ｆｖ２Ｌ ＤＮＡ配列の代わりに、ＸｈｏＩおよびＳａｌＩ制限酵素認識部位においてｐＢＰ０３２０プラスミドに挿入した。このベクターは、ｐＢＰ０１７２−ＳＦＧ−Ｍｙｒ．ｉＭＣｎｏＥ．２Ａ．ΔＣＤ１９と呼ばれる。「ｎｏＥ」という接尾辞は、このｉＭＣ ＤＮＡが、エピトープタグをコードしないことを示す。

【0546】

レトロウイルスの産生：
２．一過性のトランスフェクション法によってレトロウイルスを作製し、ここで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を以下のプラスミドでトランスフェクトした：ａ．ＳＦＧレトロウイルスプラスミド（ｐＢＰ０１７１またはｐＢＰ０１７２；それぞれＲＶ−１７１またはＲＶ−１７２）ｂ．レトロウイルスエンベローププラスミド（ＲＤ１１４）ｃ．Ｇａｇ／ｐｏｌプラスミド（ｐＥＱ−ＰＡＭ−Ｅ）。

【0547】

３．４８および７２時間で、複製欠損レトロウイルスを含むトランスフェクトされた細胞からの上清を捕集し、ドライアイス／エタノールにおいて急速凍結し、Ｔ細胞の形質導入まで−８０℃で保存した。

【0548】

４．初代Ｔ細胞を形質導入するために、健常ドナー由来のＰＢＭＣを、１００Ｕ／ｍｌ
ＩＬ−２が補充されたＴ細胞増殖培地中において、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で活性化した。３日後、Ｔ細胞を活性化し、収集し、レトロウイルス形質導入の準備を整えた。それらのＴ細胞を形質導入するために、まず、組織培養用に処理されていないプレートを４℃において一晩、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎでコーティングした。次いで、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎを除去し、プレートをＰＢＳで洗浄した。次いで、レトロウイルス上清を、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎプレートをコーティングするために使用した。次いで、活性化Ｔ細胞をウェルに加え、プレートを遠心分離することにより、ウイルス粒子の結合および形質導入を促進した。４８時間後、それらのＴ細胞を収集し、ＣＤ３とＣＤ１９との共発現についてフローサイトメトリーによって解析することにより、ウイルスの形質導入効率を決定した。

【0549】

ＡＰ１９０３によって誘導されたＴ細胞活性化の、サイトカイン産生による解析：
５．Ｔ細胞のＡＰ１９０３依存性Ｔ細胞活性化を評価するために、１×１０^５個の形質導入されていない（ＮＴ）Ｔ細胞またはコントロールレトロウイルス（ＲＶ−１７１）もしくはｉＭＣを含むレトロウイルス（ＲＶ−１７２）で形質導入されたＴ細胞を、９６ウェルプレートに３つ組でプレーティングし、培地のみまたは１０ｎＭ ＡＰ１９０３を含む培地を用いて３７℃、５％ＣＯ_２において培養した。

【0550】

６．２４時間後、それらの細胞を静かに混合し、プレートを遠心分離した。次いで、上清を捕集し、以下のサイトカインおよびケモカインを計測するＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ２７−ｐｌｅｘプレートにプレーティングした：
ａ．塩基性ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７ＲＡ、エオタキシン、ＩＰ１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−アルファおよびＶＥＧＦ。

【0551】

ｂ．続いて、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ ＭＡＧＰＩＸ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｒｅａｄｅｒを使用して、上清中のサイトカインおよびケモカインを計測し、そのプレートにおける標準物質と比較した。

【0552】

結果：
形質導入効率：
１．２人の健常ドナー由来のＴ細胞を、レトロウイルスで形質導入し、４８時間後、ＣＤ３^＋ＣＤ１９^＋共発現についてフローサイトメトリーによって決定された効率は、以下のとおりだった：
ａ．ドナー０６３
ｉ．ＮＴ＝６．５４％
ｉｉ．ＲＶ−１７１＝７３．９％
ｉｉｉ．ＲＶ−１７２＝５４．６％
ｂ．ドナー７０７
ｉ．ＮＴ＝２．１６％
ｉｉ．ＲＶ−１７１＝８５．２％
ｉｉｉ．ＲＶ−１７２＝７３．６％ 。

【0553】

２．形質導入は、ベクターとドナーの両方についてかなり高かったことから、それらがＨＥＫ２９３Ｔ細胞にとって有毒でないことおよびウイルス力価が良好であることが示唆された。

【0554】

サイトカイン／ケモカインの産生
３．サイトカインおよびケモカインの分泌の解析から、ＡＰ１９０３二量体化に対する顕著な依存性が示された。Ｔ細胞によって産生された以下のサイトカインおよびケモカインは、２４時間にわたって誘導を示したが、コントロールベクターで形質導入されたＴ細胞または形質導入されていないＴ細胞からは誘導されなかった：
ａ．ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＰ１０、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳおよびＴＮＦ−アルファ。

【0555】

４．さらに、他のサイトカインおよびケモカインは、ｉＭＣのＡＰ１９０３活性化によって誘導されないとみられた。これらには、以下が含まれる：
ａ．塩基性ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７ＲＡ、エオタキシン、ＭＣＰ−１、ＰＤＧＦ−ｂｂおよびＶＥＧＦ。

【0556】

ある特定の結果は、図６６〜７４にも示される。ＮＴ＝形質導入されていない活性化Ｔ細胞
ＲＶ０１７１＝ＳＦＧ−Ｍｙｒ．Ｆｖ’．Ｆｖ．２Ａ．ΔＣＤ１９；ＲＶ０１７２＝ＳＦＧ＝Ｍｙｒ．ＭｙＤ８８／ＣＤ４０．Ｆｖ’．Ｆｖ．２Ａ．ΔＣＤ１９。

【0557】

Ｔ細胞を、１０ｎＭ ＡＰ１９０３で２４時間刺激し、次いで、上清をサイトカインレベルについてアッセイした。

【0558】

実施例１９：ＡＰ１９０３依存性のＴ細胞の細胞傷害性の計測：
目的：２つのＦＫＢＰｖ３６分子に連結されたシグナル伝達分子をコードするレトロウイルスベクターで初代Ｔ細胞を形質導入することにより、そのＴ細胞のＡＰ１９０３活性化を可能にすること。この実験では、ＡＰ１９０３活性化の２つの態様を調べた。第１に、Ｔ細胞が、腫瘍細胞の近位に存在する場合、それらの活性化によって腫瘍細胞の殺傷が誘導されるのか？第２に、Ｔ細胞が、ＡＰ１９０３を介して活性化される場合、それらは増殖するのか？
方法：
誘導可能なＴ細胞分子のデザインおよびクローニングならびにレトロウイルスの産生
１．方法は、上記の実施例４において論じられた方法と本質的に同じである。同じ細胞をこのアッセイのために使用した。

【0559】

ＧＦＰによってマークされたＣＡＰＡＮ−１（膵臓腺癌）細胞株の作製：
２．ＣＡＰＡＮ−１をＡＴＣＣから購入した。続いて、ＥＧＦＰ／ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質に対する遺伝子、ならびに安定にトランスフェクトされた細胞が、Ｇ４１８抗生物質とともに培養することによって長い時間にわたって選択されるのを可能にするネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＢＰ０１６８−ｐｃＤＮＡ３．１−ＥＧＦＰｌｕｃプラスミドによるトランスフェクションによって、その細胞株を遺伝子改変した。培養後、高いＧＦＰ発現を有するクローンを選択し、＞９５％ＧＦＰを有する細胞株が得られるまで継代培養した。

【0560】

ｉＭＣ対応（ｅｎａｂｌｅｄ）Ｔ細胞とＣＡＰＡＮ−１腫瘍細胞との共培養：
３．形質導入されていないＴ細胞またはＲＶ−１７１（コントロールベクター）もしくはＲＶ−１７２（ｉＭＣベクター）で形質導入された細胞を、１０ｎＭ ＡＰ１９０３ありまたはなしで５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充された培地中においてＴ細胞と腫瘍細胞とが５：１の比で培養した。次いで、共培養物を３７℃および５％ＣＯ_２において７２時間インキュベートした。続いて、蛍光顕微鏡法によって、および０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて培養物を収集し、培養物中のＧＦＰ^＋ＣＤ３⁻腫瘍細胞の頻度をフローサイトメトリーによって計測することによって、ＧＦＰ^＋腫瘍細胞の存在について培養物を解析した。

【0561】

結果：
４．共培養物のウェルを調べたところ、両方のドナーにおいて、ＡＰ１９０３で刺激されたＲＶ−１７２（ｉＭＣ含有ベクター）で形質導入されたＴ細胞は、大きなＴ細胞芽球コロニーによって明らかであるように、増殖していることが明らかだった。さらに、蛍光顕微鏡法によって、ＡＰ１９０３を投与されたＲＶ−１７２を形質導入されたＴ細胞を含む共培養物は、非常に少ない生存可能なＧＦＰ^＋腫瘍細胞しか示さなかった。これらの最初の観察の後、Ｔ細胞および腫瘍細胞を収集し、フローサイトメトリーによって解析することにより、残存しているＣＡＰＡＮ−１ ＧＦＰ^＋腫瘍細胞の頻度を決定した。

【0562】

５．顕微鏡法によって観察されたように、フローサイトメトリーは、ＡＰ１９０３によって処理された、ｉＭＣを形質導入された（ＲＶ−１７２）Ｔ細胞を含む共培養物におけるＡＰ１９０３の明白な効果を示した。ＧＦＰ^＋腫瘍細胞の減少は、この条件だけで生じ、コントロールベクターで形質導入されたＴ細胞では生じず、二量体化剤を投与されなかったＲＶ−１７２で形質導入されたＴ細胞ではより低い程度でしか生じなかった。

【0563】

６．まとめると、これらのデータから、Ｔ細胞におけるｉＭＣの活性化が、Ｔ細胞の殺傷を誘導することができ、ＡＰ１９０３によって処理されたＴ細胞の増殖を誘導することが示唆される。集合的には、サイトカイン／ケモカイン産生に関する本発明者らの知見とともに、これらのデータは、ｉＭＣが、Ｔ細胞において活性化され得ること、およびｉＭＣ二量体化の際にＴ細胞がそのエフェクター機能を保持し、高めることを示す。

【0564】

ある特定の結果は、図７５〜７８にも示される。

【0565】

実施例２０：エキソビボにおけるＴ細胞の活性化およびヒト被験体への投与
ヒトを治療するために、改変されたＴ細胞を使用する方法が、この実施例に提示される。この実施例では、共刺激ポリペプチドの細胞質領域は、ＣＤ４０およびＭｙＤ８８に由来する。これらの方法は、他の細胞、例えば、ＮＫおよびＮＫＴ細胞など、ならびに腫瘍浸潤リンパ球に対して適合され得、本明細書中で論じられるような他の共刺激ポリペプチド細胞質領域を含むキメラ共刺激ポリペプチドに対しても適合され得る。

【0566】

材料および方法
遺伝子改変されたＴ細胞の大規模産生
Ｔ細胞は、標準的な方法を用いて健常志願者から作製される。簡潔には、健常ドナーまたはがん患者由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、可溶性αＣＤ３およびαＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して、拡大および形質導入のために活性化する。ＰＢＭＣを、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）が補充されたＣｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に、１×１０^６細胞／ｍｌで再懸濁し、０．２μｇ／ｍｌ αＣＤ３および０．５μｇ／ｍｌ αＣＤ２８可溶性抗体で刺激する。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ２において４日間培養する。４日目に、ＩＬ−２を含む１ｍｌの新鮮培地を加える。７日目に、形質導入に向けて、細胞を収集し、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に再懸濁する。

【0567】

プラスミドおよびレトロウイルス
ＳＦＧプラスミドは、切断可能な２Ａ様配列を介して切断型ヒトＣＤ１９に連結された誘導可能なキメラポリペプチドからなる。その誘導可能なキメラポリペプチドは、Ｆ３６Ｖ変異を有し、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介してヒトキメラポリペプチドに接続された、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２；ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨ００２８１８）からなる。そのＦ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３に対するＦＫＢＰ１２の結合親和性を高める。その２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の２０アミノ酸ペプチドをコードし、それは、グリシンと末端プロリン残基との間での＞９９％の切断を媒介して、誘導可能なキメラポリペプチドのＣ末端に１９個の追加のアミノ酸およびＣＤ１９のＮ末端に１つの追加のプロリン残基をもたらす。ＣＤ１９は、細胞質内ドメインを２４２アミノ酸から１９アミノ酸に短縮し、リン酸化に対する潜在的な部位である保存されたすべてのチロシン残基を除去する、アミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）で切断される、完全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ００１７７０）からなる。

【0568】

テナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ−Ｖ）シュードタイプ化レトロウイルスを産生する安定したＰＧ１３クローンを、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ ｐｒｏｄｕｃｔ ＃ＳＤ３４４４；ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をＳＦＧプラスミドで一過性にトランスフェクトすることによって、作製する。これは、Ｅｃｏシュードタイプ化レトロウイルスを産生する。そのＰＧ１３パッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）を、Ｅｃｏシュードタイプ化レトロウイルスで３回形質導入することにより、細胞１つあたり複数のＳＦＧプラスミド（ｐｌａｍｉｄ）プロウイルス組み込み体を含む産生株を作製する。単一細胞クローニングを行い、最も高い力価をもたらしたＰＧ１３クローンを、拡大し、ベクター作製のために使用する。

【0569】

レトロウイルス形質導入
Ｔ細胞の活性化および拡大のための培養液は、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）が補充された無血清Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）である。レトロウイルスベクターで形質導入する前の７日間にわたって、Ｔ細胞を可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって活性化する。必要であれば、ΔＣＤ１９の免疫磁気選択を形質導入後の４日目に行い；陽性画分をさらに２日間にわたって拡大し、凍結保存する。

【0570】

遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞のスケールアップ産生
臨床適用のための形質導入プロセスのスケールアップでは、１０ｍｌの抗ＣＤ３ ０．５μｇ／ｍｌおよび抗ＣＤ２８ ０．２μｇ／ｍｌまたは１０ｍｌのフィブロネクチン７μｇ／ｍｌで４℃において一晩コーティングされた、組織培養用に処理されていないＴ７５フラスコ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を使用する。高細胞粘着性のためにコロナ処理されたフッ化エチレンプロピレンバッグ（２ＰＦ−００７２ＡＣ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）も使用する。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８によってコーティングされたフラスコに、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充された培地中、１×１０^６細胞／ｍｌで播種する。レトロウイルス形質導入に向けて、レトロネクチンでコーティングされたフラスコまたはバッグを、１０ｍｌのレトロウイルス含有上清で２〜３時間、一度負荷する。活性化Ｔ細胞を、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充された、３：１の比のレトロウイルスベクター含有新鮮培地およびＴ細胞培養培地中に１×１０^６細胞／ｍｌで播種する。細胞を、翌朝収集し、組織培養用に処理されたＴ７５またはＴ１７５フラスコ内、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充された培養培地中で、約５×１０^５細胞／ｍｌ〜８×１０^５細胞／ｍｌの播種密度で拡大する。

【0571】

ＣＤ１９免疫磁気選択
ＣＤ１９に対する免疫磁気選択は、例えば、形質導入の４日後に行われ得る。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に結合体化された常磁性マイクロビーズで標識し、小規模実験ではＭＳまたはＬＳカラムにおいて、および大規模実験ではＣｌｉｎｉＭａｃｓ Ｐｌｕｓ自動選択デバイスにおいて、選択する。ＣＤ１９によって選択された細胞を、さらに４日間拡大し、形質導入後の８日目に凍結保存する。これらの細胞は、「遺伝子改変細胞」と称される。

【0572】

実施例２１：白血病患者の処置
本願の方法を使用して、進行した治療抵抗性白血病を有する白血病患者を処置する本実施例は、他の状態または疾患、例えば、他の過剰増殖性疾患または固形腫瘍などにも適用され得る。これらの方法は、標的抗原に応じて一本鎖可変フラグメントが変化し得るという理解の下で、本質的には論じられるように使用され得る。

【0573】

Ｔ細胞を、キメラシグナル伝達分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸で形質導入する。それらのＴ細胞を、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む核酸でも形質導入する。誘導可能なキメラシグナル伝達分子の例としては、ＣＤ２８ポリペプチド細胞質刺激領域および４−１ＢＢポリペプチド細胞質シグナル伝達領域を含む、図４１に示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。誘導可能なキメラシグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータポリペプチドも含み得る。キメラ抗原レセプターは、ＣＤ１９を認識する一本鎖可変フラグメントを含む。

【0574】

患者は、リンパ球枯渇の前処置を受けた後、形質導入されたＣＤ１９標的化Ｔ細胞を投与される。それらのＴ細胞は、自家、同種異系または非同種異系であり得る。それらのＴ細胞を投与した後、キメラシグナル伝達分子を誘導することによってＣＤ１９標的化Ｔ細胞を拡大するために、リガンド誘導物質をその患者に投与する。その用量は、例えば、毎日、１週間に２回、または毎週、提供され得る。腫瘍細胞のレベルをモニターし、リガンド誘導物質、例えば、ＡＰ１９０３の投薬スケジュールを腫瘍細胞の負荷に基づいて調整する。制御されない速すぎる速度のＴ細胞の拡大、活性化および腫瘍細胞殺傷は、不必要に患者を害するより重度のサイトカインストーム（ｃｙｔｏｋｉｎｇ ｓｔｏｒｍ）をもたらし得るという懸念を理由に、投薬スケジュールは、毒性を限定し、患者に対して多大な害を引き起こさず、例えば、患者を病院の集中治療室の外で維持する速度で完全な回復を達成するようにデザインされる。いったん患者が完全な回復を達成し、決定されるある特定の長さの時間、例えば、１ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間にわたって疾患の無いままになると、ＡＰ１９０３の投与は、停止される。処置の後、リガンド誘導物質の非存在下において、ＣＤ１９標的化Ｔ細胞の数は、減少する。少数の静止状態のＣＤ１９標的化Ｔ細胞の生存を可能にする低レベルの基底のシグナル伝達が、存在し得る。リガンド誘導物質なしでは、これらの細胞は、不活性のままであり、正常なＢ細胞の回復が可能となる。将来の任意の時点において、患者が、白血病の再発を起こした場合、リガンド誘導物質であるＡＰ１９０３の投与を再開することにより、ＣＤ１９標的化Ｔ細胞が再活性化し、その患者において完全奏効が再誘導される。複数の再発の場合には、この追加の投与は、２回以上繰り返されてもよい。

【0575】

実施例２２：ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞におけるｉＭＣ活性の計測：
目的：２つのＦＫＢＰｖ３６分子に連結されたシグナル伝達分子をコードするレトロウイルスベクターで初代Ｔ細胞を形質導入することにより、そのＴ細胞のＡＰ１９０３活性化を可能にすること。この実験は、切断型ＭｙＤ８８およびＣＤ４０ポリペプチドを含む誘導可能な共刺激分子が、ＣＡＰＡＮ−１腫瘍細胞上に高度に発現される前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）を認識するＣＡＲで形質導入されたＴ細胞によるＧＦＰ改変ＣＡＰＡＮ−１（膵臓腺癌）細胞の殺傷を改善するかを調べるためにデザインされる。

【0576】

方法：
誘導可能なＴ細胞分子のデザインおよびクローニング：
１．Ｔ細胞の形質導入は、ＲＶ−１７２（ＳＦＧ−Ｍｙｒ．ＭｙＤ８８／ＣＤ４０．Ｆｖ．Ｆｖ’．２Ａ．ΔＣＤ１９）およびＲＶ−８９（ＳＦＧ．ＰＳＣＡｓｃＦｖ．ＣＨ２ＣＨ３．ＣＤ２８．ゼータ）を用いて行う。そのｓｃＦｖは、ヒト化モノクローナル抗体１Ｇ８（ＵＳ２０１２０７７９６２Ａ１におけるヒト化抗ＰＳＣＡから得られる）由来のｓｃＦｖを使用してＰＳＣＡを標的化する。これは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ＣＨ３領域に連結され、それは続いて、その分子の膜貫通部分と細胞質部分の両方を含むＣＤ２８に連結される。ＣＤ２８は、ＣＤ３ゼータの細胞質部分に連結される。

【0577】

レトロウイルスの産生：
２．本質的には、前の実施例と同じである。

【0578】

ＧＦＰによってマークされたＣＡＰＡＮ−１（膵臓腺癌）細胞株の作製：
３．ＣＡＰＡＮ−１をＡＴＣＣから購入する。続いて、ＥＧＦＰ／ホタルルルシフェリン融合タンパク質に対する遺伝子、ならびに安定にトランスフェクトされた細胞が、Ｇ４１８抗生物質とともに培養することによって長い時間にわたって選択されるのを可能にするネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＢＰ０１６８−ｐｃＤＮＡ３．１−ＥＧＦＰｌｕｃによるトランスフェクションによって、その細胞株を遺伝子改変する。培養後、高いＧＦＰ発現を有するクローンを選択し、＞９５％ＧＦＰを有する細胞株が得られるまで継代培養する。

【0579】

ｉＭＣ対応Ｔ細胞とＣＡＰＡＮ−１腫瘍細胞との共培養：
４．形質導入されていないＴ細胞またはＲＶ−８９（ＰＳＣＡ ＣＡＲ）およびＲＶ−１７２（ｉＭＣベクター）で共形質導入されたＴ細胞を、１０ｎＭ ＡＰ１９０３ありまたはなしで５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充された培地中においてＴ細胞と腫瘍細胞とが５：１の比で培養する。次いで、共培養物を３７℃および５％ＣＯ_２において７２時間インキュベートする。続いて、蛍光顕微鏡法によって、および０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて培養物を回収し、培養物中のＧＦＰ^＋ＣＤ３⁻腫瘍細胞の頻度をフローサイトメトリーによって計測することによって、ＧＦＰ^＋腫瘍細胞の存在について培養物を解析する。

【0580】

結果：
１．培養物を蛍光顕微鏡法によって調べることにより、誘導可能な共刺激分子およびキメラ抗原レセプターを形質導入されたＴ細胞を含むウェルおよびＡＰ１９０３を投与されたウェルにおける腫瘍細胞殺傷の改善を評価する。

【0581】

２．フローサイトメトリーを使用して、トリプシン処理後の培養物中のＧＦＰ^＋細胞を解析することにより、ＡＰ１９０３がこの短い培養期間（７２時間）において腫瘍細胞数の減少に寄与するかを判定する。培養の時間は、およそ５日間まで延長され得る。フローサイトメトリーのプロットは、５：１の比において、両方のウイルスで形質導入され、ＡＰ１９０３を投与されたウェル内のＧＦＰ^＋細胞の減少を示し得る。

【0582】

３．残存している生存可能なＣＡＰＡＮ−１−ＧＦＰ細胞を、ＡＰ１９０３なしのＮＴ
Ｔ細胞の条件に正規化することにより、腫瘍細胞殺傷に対するｉＭＣ活性化の効果が示される。

【0583】

実施例２３：特定の核酸配列およびアミノ酸配列の例

【0584】

【化22】

【0585】

【化23-1】

【0586】

以下は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）配列に対するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の例である（順番に、ｓｃＦｖフラグメントなしで）。

【0587】

【化23-2】

【0588】

【化24】

【0589】

【化25】

【0590】

【化26】

【0591】

【化27】

【0592】

実施例２４：誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラポリペプチドに対するさらなる配列

【0593】

【化28】

【0594】

【化29】

【0595】

【化30】

【0596】

【化31】

【0597】

【化32】

【0598】

Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結合するキメラ抗原レセプターをコードするプラスミドインサートの例を下記に提供する。そのキメラ抗原レセプターは、共刺激ポリペプチド（例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４−１ＢＢであるがこれらに限定されない）を含めることによってさらに改変され得る。

【0599】

【化33】

【0600】

【化34】

【0601】

【化35】

【0602】

【化36】

【0603】

実施例２５：誘導可能なＭｙＤ８８、ＣＤ４０またはＭｙＤ８８／ＣＤ４０を用いた初代Ｔ細胞の活性化
図４１は、誘導可能なＭｙＤ８８、ＣＤ４０およびＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラポリペプチドの模式図を提供している。ＭｙＤ８８、ＣＤ４０または両方の分子が、潜在的なキメラ抗原レセプター構築物に内部ドメインとして含められるべきであるかを調べるために、ＡＰ１９０３結合ドメインのみを含む（Ｆｖ’Ｆｖ）か、またはＭｙＤ８８（ｉＭｙＤ８８）、ＣＤ４０（ｉＣＤ４０）もしくはＭｙＤ８８とＣＤ４０の両方（ｉＭＣ）と遺伝的に融合されている、４つの異なるベクターをデザインした（図４１ａ）。ＣＤ３／ＣＤ２８によって活性化されたＴ細胞に形質導入し、各ベクターの形質導入効率を、ＣＤ３Ｔ細胞の表面上のＣＤ１９のフローサイトメトリー検出（ＣＤ３^＋ＣＤ１９^＋）によって測定したところ、各レトロウイルスは、初代Ｔ細胞において、形質導入されていないＴ細胞と比べて十分に発現されたことが示された（５７％〜９５％）（図４１ｂ）。次いで、ＡＰ１９０３への曝露の後にｉＭｙＤ８８、ｉＣＤ４０またはｉＭＣがＴ細胞を活性化する能力を、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−γおよびＩＬ−６の産生を測定することによってアッセイした。ｉＭＣを形質導入されたＴ細胞だけが、ＡＰ１９０３活性化の後にかなりの量のＩＦＮ−γとＩＬ−６の両方を産生したことが観察されたのに対し、ＮＴ、ｉＭｙＤ８８およびｉＣＤ４０のいずれもがサイトカイン産生を示さなかった（図４１ｃおよびｄ）。これらのデータから、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０が、ヒトＴ細胞において活性化シグナル伝達分子として相乗作用を示すこと、およびＣＡＲ分子が、複合のＭＣシグナル伝達ドメインを含めることの恩恵を受けるはずであることが示唆される。

【0604】

ＭｙＤ８８、ＣＤ４０または両方の構成要素が、ｉＭＣ分子を用いた最適なＴ細胞刺激のために必要とされるかを調べるために、一連の実験を行った。ＭｙＤ８８とＣＤ４０のいずれもが、サイトカインの産生（ＩＬ−２およびＩＬ−６）によって測定されたとき、Ｔ細胞の活性化を十分に誘導できなかったが、単一の融合タンパク質として組み合わされたときは、強力なＴ細胞の活性化を誘導することができたことが観察された（図４１）。

【0605】

生存および成長の利点は別として、ＭＣによって誘導される共刺激は、ＣＡＲによって改変されたＴ細胞にさらなる機能も提供し得る。Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖらは、最近になって、ＭｙＤ８８のシグナル伝達がＴｈ１とＴｈ１７の両方の応答に欠かせないこと、およびそれが、ＩＬ−１を介して作用することにより、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）によって駆動される阻害に対して耐性にすることを実証した。ｉＭＣを用いた実験は、ＩＬ−１αおよびβがＡＰ１９０３活性化の後に分泌されることを示す。さらに、Ｍａｒｔｉｎらは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＲａｓ、ＰＩ３Ｋおよびタンパク質キナーゼＣを介したＣＤ４０シグナル伝達が、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞を溶解する細胞傷害性メディエーターであるグランザイムおよびパーフォリンのＮＦ−κＢ依存性誘導をもたらすことを実証した。したがって、ＭｙＤ８８とＣＤ４０との同時活性化は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を、固形腫瘍および他のタイプのがんの処置において非常に重要であり得る機能であるＴｒｅｇ細胞の免疫抑制効果に対して耐性にし得る。

【0606】

誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ刺激分子は、例えばｓｃＦｖポリペプチドおよびＣＤ３−ζ鎖を含み得るＣＡＲとともに、細胞において発現され得る。この方法では、ｉＣＳＭ分子は、ＣＡＲと組み合わせて使用され、それにより、ＣＡＲシグナル伝達が２つの別個の機能に分離される。ＣＡＲによって提供されるこの第２の機能は、操作されたＴ細胞に対して抗原特異的細胞傷害をもたらす。例えば、ＰＳＭＡに対して特異性を有するＣＡＲは、誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ刺激分子とともにＴ細胞において発現され得る。また、誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０ ＣＳＭおよびＣＡＲの一部は、同じベクターにおけるｃｉｓでまたは別個のベクターにおけるｔｒａｎｓで細胞にトランスフェクトされ得るかまたは形質導入され得る。したがって、それらの２つのポリペプチドは、２つの核酸、例えば、２つのプラスミドまたは２つのウイルスを用いて発現され得、それらのＴ細胞は、例えば、２回トランスフェクトされ得るか、または特定の実施形態では、それらの２つの核酸が、コトランスフェクトされ得る。他の実施形態において、それらの２つのポリペプチドは、１つの核酸として、例えば、同じプラスミドまたはウイルスにおいて、発現され得る。その核酸は、それらの２つのポリペプチドを、２つの別個のプロモーター（１つはＣＡＲ用であり、もう１つはｉＣＳＭ用である）を用いて発現し得る。または、他の実施形態において、それらの２つのポリペプチドは、同じプロモーターを用いて発現され得る。この実施形態において、それらの２つのポリペプチドは、切断可能なポリペプチド、例えば、２Ａ配列によって分断され得る。操作されたＴは、例えば、特異的な免疫応答、例えば、前立腺がん腫瘍に対する免疫応答をもたらすために被験体に投与され得る。

【0607】

いくつかの実施形態において、誘導可能なキメラ刺激分子は、ＣＤ４０を含まない。ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ刺激分子に対して提供される方法、構築物、ポリペプチドおよび細胞は、必要に応じて、ＭｙＤ８８キメラ刺激分子の発現および使用のために改変され得ることが理解される。

【0608】

参考文献
以下の参考文献は、本明細書中の実施例において引用されているか、または例えば本明細書中の実施例を含む関連し得るさらなる情報を提供する。

【表C-1】

【表C-2】

【表C-3】

【表C-4】

【0609】

実施例２６：Ｔ細胞レセプターを発現している細胞および腫瘍浸潤リンパ球におけるＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激分子の発現
本明細書中に提供される誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激分子を発現する改変された細胞は、Ｔ細胞レセプターも発現し得る。これらの例では、そのＴ細胞レセプターは、その細胞にとって内在性であってもよいし、Ｔ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む核酸によるトランスフェクションまたは形質転換を介してその細胞に提供されてもよい。ある特定の例では、そのＴ細胞レセプターは、誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激分子と同じ核酸ベクターにおいて発現され得る。いくつかの例では、改変された細胞は、腫瘍浸潤リンパ球である。

【0610】

実施例２７：様々な投与量の多量体リガンドの投与による、コントロールされたレベルのＣＡＲ−Ｔ細胞活性の共刺激の誘導
標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の迅速かつ完全な排除が、いくつかの臨床上のシナリオにおいて望まれ得るが、これらの細胞の部分的な排除および減少がより望ましい場合がある他の多くのシナリオも存在する。そのようなシナリオの可能性は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）−Ｔ細胞の標的に固有の様々な特性および関連する有害事象（ＡＥ）のタイプによって左右される。これらの特性には、標的化される分子および器官、毒性の重症度、ならびに発生の迅速性が含まれる。これらの特性に関して異なるプロファイルを有する異なるタイプのＣＡＲ−Ｔ細胞標的が少なくとも５つ存在し、それらの特性は、各患者に対して適切なレベルのＣＡＲ−Ｔ細胞活性を達成するために、よりコントロールされた量の多量体リガンドの送達の恩恵を受け得る臨床上のシナリオに関連し得る有効性および安全性を左右し、十分な治療効果をもたらしながらも、有害事象、例えば、サイトカインストームまたはオフターゲット毒性を回避する必要性とのバランスがとられる。これらの例では、十分な投与量の多量体リガンドを治療のために使用し、かつ有害な副作用をもたらし得る過剰な活性を回避しつつ、よりコントロールされたレベルの共刺激が望まれる場合がある。

【0611】

カテゴリー１：分化抗原（例えば、ＭＡＲＴ、ｇｐ１００、ＣＥＡ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）は、成体において低レベルで発現される。これらの抗原を標的化するＣＡＲ Ｔ細胞は、臨床上の生存率を限定する重大なＡＥおよび生命を危うくするＡＥの高い割合に関連し、大多数が初期段階の治験に進んでも突破していない。これらの抗原が正常な器官（例えば、肺）において低レベルで発現することに起因して、予想外の患者の合併症および死亡が生じた。

【0612】

カテゴリー２：非必須組織の標的（例えば、Ｂ細胞上のＣＤ１９、甲状腺上のチログロブリン、前立腺細胞上のＰＳＭＡ）。これらのＣＡＲ Ｔ細胞は、患者において著しい抗がん活性を示したが、患者の死亡を含むＳＡＥも伴い、処置に別途応答している患者における腫瘍崩壊症候群およびサイトカインストームに関係することが多かった。

【0613】

カテゴリー３：がん精巣抗原（ＣＴＡ）（例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、−Ａ３；がんの５０％が、これらの２つのファミリーのいずれかを発現する）。ＣＴＡは、生殖細胞およびいくつかの腫瘍において発現される。ファミリーメンバーとの交差反応性に起因して、カテゴリー１と同様の懸念。

【0614】

カテゴリー４：ユニークな抗原（例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）は、利用可能であるとき、おそらく最善であるが、少数の腫瘍でしか利用可能でない。

【0615】

カテゴリー５：腫瘍間質（例えば、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＦＡＰ）は、腫瘍において高レベルであるが、正常な組織において低レベルである。いくつかの完全奏効（ＣＲ）が存在したが、ＳＡＥに対する潜在的なリスクは高い。

【0616】

より高い用量の化学誘導物質、例えば、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７を用いるＣＡＲ−Ｔ細胞治療のレベルの上昇および有害事象の回避が必要とされるときはそのレベルの減少に「ダイヤルイン」し得る共刺激分子の加減抵抗器は、細胞治療毒性の種々の臨床上のシナリオに対して、測定された応答を考慮に入れることによって、未だ対処されていない臨床上の必要性をより良く満たし得る。誘導可能なＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激分子技術を加減抵抗器として用いることは、０．５〜１ｍｇ／ｋｇの総量において＞９０％の迅速な殺滅を達成する能力を維持し得るのと同時に、抗腫瘍治療などの臨床的に用量設定可能な治療を可能にし得る。

【0617】

１つの実施形態において、０．０１から１ｍｇ／ｋｇまでの用量漸増が、１５〜３０分きざみで、またはより長い時間間隔（例えば、１時間、半日、２４時間）きざみで、または１日、１週間もしくは１ヶ月きざみで行われる間、患者の有害事象が、応答についてモニターされる。

【0618】

別の実施形態において、持続注入ポンプを用いることにより、ＡＰ１９０３注入が非常に低用量で開始され、１５〜３０分きざみでゆっくり用量を増加させ、患者の有害事象がモニターされる。

【0619】

別の実施形態において、ＡＰ１９０３の緩効性製剤（経口、ＩＭ、ＳＱ、ＳＬ）が、数日間または数週間にわたって投与されることにより、生命を危うくしない亜急性の細胞治療のコントロールがゆっくり達成される。

【0620】

実施例２８：代表的な実施形態
本技術のある特定の実施形態の例を、この後に提供する。

【0621】

Ａ１．ａ）誘導可能なキメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドであって、その誘導可能なキメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、および（ｉｉｉ）多量体化領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）キメラ抗原レセプターをコードする第２のポリヌクレオチド
を含む、核酸。

【0622】

Ａ２．前記誘導可能なキメラ刺激分子が、（ｉｖ）膜標的化領域をさらに含む、実施形態Ａ１に記載の核酸。

【0623】

Ａ３．前記キメラ刺激分子がポリペプチドであって、領域（ｉ）〜（ｉｉｉ）を、該ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）という順序で含むポリペプチドである、実施形態Ａ１に記載の核酸。

【0624】

Ａ４．前記キメラ刺激分子がポリペプチドであって、領域（ｉ）〜（ｉｖ）を、該ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって（ｉｖ）、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）という順序で含むポリペプチドである、実施形態Ａ２に記載の核酸。

【0625】

Ａ５．前記多量体化領域が、リガンド結合領域である、実施形態Ａ１〜Ａ４のいずれか１つに記載の核酸。

【0626】

Ａ６．前記リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ａ５に記載の核酸。

【0627】

Ａ７．前記ＦＫＢＰ１２領域が、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態Ａ６に記載の核酸。

【0628】

Ａ８．前記ＦＫＢＰ１２領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、実施形態Ａ６に記載の核酸。

【0629】

Ａ９．前記多量体化領域が、配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントおよび配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントを含むか、または配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ａ９に記載の核酸。

【0630】

Ａ１０．前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含むか、または配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ａ１０に記載の核酸。

【0631】

Ａ１１．残基３６がバリンであるＦｖポリペプチドバリアントをさらに含む、実施形態Ａ９に記載の核酸。

【0632】

Ａ１２．前記リガンドが、ＦＫ５０６二量体または二量体のＦＫ５０６アナログリガンドである、実施形態Ａ５〜Ａ１１のいずれか１つに記載の核酸。

【0633】

Ａ１３．前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ａ１２に記載の核酸。

【0634】

Ａ１４．領域（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくとも１つが、コドン最適化されたヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態Ａ１〜Ａ１３のいずれか１つに記載の核酸。

【0635】

Ａ１５．前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドの両方に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ１４のいずれか１つに記載の核酸。

【0636】

Ａ１６．前記第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターおよび前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ１４のいずれか１つに記載の核酸。

【0637】

Ａ１７．前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含み、ここで、そのリンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後の第１および第２のポリヌクレオチドの翻訳産物を分断している、実施形態Ａ１〜Ａ１５のいずれか１つに記載の核酸。

【0638】

Ａ１８．前記リンカーポリペプチドが、２Ａポリペプチドである、実施形態Ａ１７に記載の核酸。

【0639】

Ａ１９．前記キメラ抗原レセプターが、
（ｉ）膜貫通領域；（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子；および（ｉｉｉ）抗原認識部分
を含む、実施形態Ａ１〜Ａ１８のいずれか１つに記載の核酸。

【0640】

Ａ２０．前記キメラ抗原レセプターが、共刺激分子をさらに含む、実施形態Ａ１９に記載の核酸。

【0641】

Ａ２１．前記共刺激分子が、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４−１ＢＢからなる群より選択される、実施形態Ａ２０に記載の核酸。

【0642】

Ａ２２．前記Ｔ細胞活性化分子が、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子である、実施形態Ａ１９〜Ａ２１のいずれか１つに記載の核酸。

【0643】

Ａ２３．前記Ｔ細胞活性化分子が、ＣＤ３ζポリペプチドである、実施形態Ａ１９〜Ａ２２のいずれか１つに記載の核酸。

【0644】

Ａ２４．前記Ｔ細胞活性化分子が、Ｆｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドである、実施形態Ａ１９〜Ａ２２のいずれか１つに記載の核酸。

【0645】

Ａ２５．前記抗原認識部分が、腫瘍細胞上の抗原に結合する、実施形態Ａ１９〜Ａ２４のいずれか１つに記載の核酸。

【0646】

Ａ２６．前記抗原認識部分が、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、実施形態Ａ１９〜Ａ２４のいずれか１つに記載の核酸。

【0647】

Ａ２７．前記抗原認識部分が、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６およびＨｅｒ２／Ｎｅｕからなる群より選択される抗原に結合する、実施形態Ａ１９〜Ａ２４のいずれか１つに記載の核酸。

【0648】

Ａ２８．前記抗原認識部分が、ＰＳＣＡに結合する、実施形態Ａ１９〜Ａ２４のいずれか１つに記載の核酸。

【0649】

Ａ２９．前記抗原認識部分が、ＣＤ１９に結合する、実施形態Ａ１９〜Ａ２４のいずれか１つに記載の核酸。

【0650】

Ａ３０．前記抗原認識部分が、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結合する、実施形態Ａ１９〜Ａ２４のいずれか１つに記載の核酸。

【0651】

Ａ３１．前記抗原認識部分が、ウイルス抗原または細菌抗原に結合する、実施形態Ａ１９〜Ａ２４のいずれか１つに記載の核酸。

【0652】

Ａ３２．前記抗原認識部分が、一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ａ１９〜Ａ３１のいずれか１つに記載の核酸。

【0653】

Ａ３３．前記膜貫通領域が、ＣＤ２８膜貫通領域である、実施形態Ａ１９〜Ａ３２のいずれか１つに記載の核酸。

【0654】

Ａ３４．前記膜貫通領域が、ＣＤ８膜貫通領域である、実施形態Ａ１９〜Ａ３２のいずれか１つに記載の核酸。

【0655】

Ａ３５．ＣＤ８ストーク領域をさらに含む、実施形態Ａ３４に記載の核酸。

【0656】

Ａ３６．前記キメラ刺激分子が、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＭｙＤ８８ポリペプチドもしくは配列番号１３７のアミノ酸配列を有する切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはそれらの機能的フラグメントを含む、実施形態Ａ１〜Ａ３５のいずれか１つに記載の核酸。

【0657】

Ａ３７．前記ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号４９のアミノ酸配列を有する、実施形態Ａ１〜Ａ３６のいずれか１つに記載の核酸。

【0658】

Ａ３８．前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ａ１〜Ａ３７のいずれか１つに記載の核酸。

【0659】

Ａ４０．前記ＣＤ３ζポリペプチドが、配列番号３９のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ａ２３〜Ａ３８のいずれか１つに記載の核酸。

【0660】

Ａ４１．前記膜標的化領域が、レセプターのミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域および膜貫通配列からなる群より選択される、実施形態Ａ２〜Ａ４０のいずれか１つに記載の核酸。

【0661】

Ａ４２．前記膜標的化領域が、ミリストイル化領域である、実施形態Ａ２〜Ａ４０のいずれか１つに記載の核酸。

【0662】

Ａ４３．前記ミリストイル化領域が、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ａ４２に記載の核酸。

【0663】

Ａ４４．前記核酸が、ウイルスベクター内に含まれている、実施形態Ａ１〜Ａ４３のいずれか１つに記載の核酸。

【0664】

Ａ４５．前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、実施形態Ａ４４に記載の核酸。

【0665】

Ａ４６．前記レトロウイルスベクターが、マウス白血病ウイルスベクターである、実施形態Ａ４４に記載の核酸。

【0666】

Ａ４７．前記レトロウイルスベクターが、ＳＦＧベクターである、実施形態Ａ４４に記載の核酸。

【0667】

Ａ４８．前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、実施形態Ａ４４に記載の核酸。

【0668】

Ａ４９．前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、実施形態Ａ４４に記載の核酸。

【0669】

Ａ５０．前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスからなる群より選択される、実施形態Ａ４４に記載の核酸。

【0670】

Ａ５１．前記核酸が、プラスミド内に含まれている、実施形態Ａ１〜Ａ４３のいずれか１つに記載の核酸。

【0671】

Ａ５２．実施形態Ａ２〜Ａ１９のいずれか１つに記載の核酸によってコードされるキメラ刺激分子ポリペプチド。

【0672】

Ａ５３．実施形態Ａ１〜Ａ５１のいずれか１つに記載の核酸でトランスフェクトされたまたは形質導入された、改変された細胞。

【0673】

Ａ５４．前記改変された細胞が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞、ＴＣＲを発現している細胞またはＮＫ細胞である、実施形態Ａ５３に記載の改変された細胞。

【0674】

Ａ５５．前記細胞が、Ｔ細胞である、実施形態Ａ５３に記載の改変された細胞。

【0675】

Ａ５６．前記細胞が、骨髄から得られるかまたは調製される、実施形態Ａ５３〜Ａ５５のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0676】

Ａ５７．前記細胞が、臍帯血から得られるかまたは調製される、実施形態Ａ５３〜Ａ５５のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0677】

Ａ５８．前記細胞が、末梢血から得られるかまたは調製される、実施形態Ａ５３〜Ａ５５のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0678】

Ａ５９．前記細胞が、末梢血単核球から得られるかまたは調製される、実施形態Ａ５３〜Ａ５５のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0679】

Ａ６０．前記細胞が、ヒト細胞である、実施形態Ａ５３〜Ａ５５のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0680】

Ａ６１．前記細胞が、エレクトロポレーション、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）（例えば、Ａｕ粒子を用いた遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子またはポリプレックス（ｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ）からなる群より選択される方法を用いて、前記核酸ベクターによってトランスフェクトされるかまたは形質導入される、実施形態Ａ５３〜Ａ６０のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0681】

Ａ６２．被験体におけるＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激するための方法であって、
ａ）実施形態Ａ５３〜Ａ６１のいずれか１つに記載の改変された細胞をその被験体に投与する工程；および
ｂ）有効量の、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与することにより、その被験体においてＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激する工程
を含む、方法。

【0682】

Ａ６３．前記キメラ抗原レセプターが、標的細胞に結合する、実施形態Ａ６２に記載の方法。

【0683】

Ａ６４．前記標的細胞が、腫瘍細胞である、実施形態Ａ６３に記載の方法。

【0684】

Ａ６５．被験体における標的細胞の数または濃度が、前記改変された細胞の投与後に減少する、実施形態Ａ６３〜Ａ６４のいずれか１つに記載の方法。

【0685】

Ａ６６．前記改変された細胞またはリガンドを投与する前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、改変された細胞およびリガンドを投与した後に被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比べて第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増加または減少を判定する工程をさらに含む、実施形態Ａ６２〜Ａ６５のいずれか１つに記載の方法。

【0686】

Ａ６７．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度が、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比べて減少する、実施形態Ａ６６に記載の方法。

【0687】

Ａ６８．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度が、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比べて増加する、実施形態Ａ６６に記載の方法。

【0688】

Ａ６９．さらなる用量のリガンドが、前記被験体に投与される、実施形態Ａ６６〜Ａ６８のいずれか１つに記載の方法。

【0689】

Ａ６９．１．多量体リガンドの有効量が、標的細胞の数または濃度を減少させ、細胞傷害性の症候を減少させるのに有効な量である、実施形態Ａ６２〜Ａ６９のいずれか１つに記載の方法。

【0690】

Ａ６９．２．前記多量体リガンドを投与した後に、細胞傷害性の（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）症候のレベルが前記被験体において決定され、（ｉ）多量体リガンドの投与が中止されるか、または（ｉｉ）投与された多量体リガンドの以前の用量よりも低いさらなる用量の多量体リガンドが投与される、実施形態Ａ６２〜Ａ６９．１に記載の方法。

【0691】

Ａ６９．３．前記多量体リガンドを投与した後に、細胞傷害性の症候のレベルが、前記被験体において決定され、投与された多量体リガンドの以前の用量よりも高いさらなる用量の多量体リガンドが投与される、実施形態Ａ６２〜Ａ６９．１に記載の方法。

【0692】

Ａ６９．４．前記多量体リガンドを投与した後に、前記被験体における標的細胞の数または濃度が決定され、（ｉ）その多量体リガンドの投与が中止されるか、または（ｉｉ）投与された多量体リガンドの以前の用量よりも低いさらなる用量の多量体リガンドが投与される、実施形態Ａ６２〜Ａ６９．１に記載の方法。

【0693】

Ａ６９．５．前記多量体リガンドを投与した後に、前記被験体における標的細胞の数または濃度が決定され、投与された多量体リガンドの以前の用量よりも高いさらなる用量の多量体リガンドが投与される、実施形態Ａ６２〜Ａ６９．１に記載の方法。

【0694】

Ａ６９．６．前記多量体リガンドのさらなる用量が、前記以前の用量よりも１２０％〜２００％高い、実施形態６９．５に記載の方法。

【0695】

Ａ６９．７．前記多量体リガンドのさらなる用量が、前記以前の用量よりも約１５０％高い、実施形態Ａ６９．５に記載の方法。

【0696】

Ａ７０．被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、有効量の実施形態Ａ５３〜Ａ６１のいずれか１つに記載の改変された細胞をその被験体に投与する工程および前記多量体化領域に結合するリガンドを投与することによりその被験体に抗腫瘍免疫を提供する工程を含む、方法。

【0697】

Ａ７１．標的抗原の高発現に関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、有効量の実施形態Ａ５３〜Ａ６１のいずれか１つに記載の改変された細胞、および有効量の、前記多量体化領域に結合するリガンドをその被験体に投与する工程を含む、方法。

【0698】

Ａ７２．前記標的抗原が、腫瘍抗原である、実施形態Ａ７１に記載の方法。

【0699】

Ａ７３．前記改変された細胞が、自己のＴ細胞である、実施形態Ａ５３〜Ａ７２のいずれか１つに記載の方法。

【0700】

Ａ７４．前記改変された細胞が、同種異系のＴ細胞である、実施形態Ａ５３〜Ａ７２のいずれか１つに記載の方法。

【0701】

Ａ７５．被験体における腫瘍サイズを減少させるための方法であって、その方法は、実施形態Ａ５３〜Ａ６１のいずれか１つに記載の改変された細胞をその被験体に投与する工程を含み、前記抗原認識部分は、その腫瘍上の抗原に結合する、方法。

【0702】

Ａ７６．前記被験体が、腫瘍を有すると診断されている、実施形態Ａ６２〜Ａ７５のいずれか１つに記載の方法。

【0703】

Ａ７６．前記被験体が、がんを有する、実施形態Ａ６２〜Ａ７６のいずれか１つに記載の方法。

【0704】

Ａ７７．前記被験体が、固形腫瘍を有する、実施形態Ａ６２〜Ａ７６のいずれか１つに記載の方法。

【0705】

Ａ７８．前記改変された細胞が、腫瘍浸潤リンパ球またはＴ細胞である、実施形態Ａ６２〜Ａ７６のいずれか１つに記載の方法。

【0706】

Ａ７９．前記改変された細胞が、腫瘍床に送達される、実施形態Ａ６２〜Ａ７８のいずれか１つに記載の方法。

【0707】

Ａ８０．前記がんが、前記被験体の血液中または骨髄中に存在する、実施形態Ａ７６に記載の方法。

【0708】

Ａ８１．前記被験体が、血液疾患または骨髄疾患を有する、実施形態Ａ６２〜Ａ７６のいずれか１つに記載の方法。

【0709】

Ａ８２．前記被験体が、任意の状態または幹細胞移植によって緩和され得る状態と診断されている、実施形態Ａ６２〜Ａ７６のいずれか１つに記載の方法。

【0710】

Ａ８３．前記被験体が、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、実施形態Ａ６２〜Ａ７６のいずれか１つに記載の方法。

【0711】

Ａ８４．前記被験体が、原発性免疫不全状態、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＡＨ）または他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、異常ヘモグロビン症、代謝状態および破骨細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、実施形態Ａ６２〜Ａ７６のいずれか１つに記載の方法。

【0712】

Ａ８４．前記疾患または状態が、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＡＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンドブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスおよび大理石骨病からなる群より選択される、実施形態Ａ６２〜Ａ７６のいずれか１つに記載の方法。

【0713】

Ａ８５．さらなる用量の前記リガンドを前記被験体に投与するべきであるかを判定する工程をさらに含む、実施形態Ａ６２〜Ａ８４のいずれか１つに記載の方法。

【0714】

Ａ８６．さらなる用量の前記リガンドを前記被験体に投与する工程をさらに含み、ここで、前記疾患または状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検出される、実施形態Ａ６２〜Ａ８５のいずれか１つに記載の方法。

【0715】

Ａ８６．１．多量体リガンドの有効量が、標的抗原を発現している細胞の数もしくは濃度または標的抗原を発現している細胞の組織浸潤の程度を減少させ、前記細胞傷害性の症候を減少させるのに有効な量である、実施形態Ａ７１〜Ａ８６のいずれか１つに記載の方法。

【0716】

Ａ８６．２．前記多量体リガンドを投与した後に、細胞傷害性の症候のレベルが前記被験体において決定され、（ｉ）該多量体リガンドの投与が中止されるか、または（ｉｉ）投与された多量体リガンドの以前の用量よりも低いさらなる用量の多量体リガンドが投与される、実施形態Ａ７１〜Ａ８６．１に記載の方法。

【0717】

Ａ８６．３．前記多量体リガンドを投与した後に、細胞傷害性の症候のレベルが、前記被験体において決定され、投与された多量体リガンドの以前の用量よりも高いさらなる用量の多量体リガンドが投与される、実施形態Ａ７１〜Ａ８６に記載の方法。

【0718】

Ａ８６．４．前記多量体リガンドを投与した後に、前記被験体における標的抗原を発現している細胞の数もしくは濃度または標的抗原を発現している細胞の組織浸潤の程度が決定され、（ｉ）多量体リガンドの投与が中止されるか、または（ｉｉ）投与された多量体リガンドの以前の用量よりも低いさらなる用量の多量体リガンドが投与される、実施形態Ａ７１〜Ａ８６．３に記載の方法。

【0719】

Ａ８６．５．前記多量体リガンドを投与した後に、前記被験体における標的抗原を発現している細胞の数もしくは濃度または標的抗原を発現している細胞の組織浸潤の程度が決定され、投与された多量体リガンドの以前の用量よりも高いさらなる用量の多量体リガンドが投与される、実施形態Ａ７１〜Ａ８６．３に記載の方法。

【0720】

Ａ８７．被験体における状態または疾患の有無またはステージを特定する工程；および
その被験体において特定された状態または疾患の有無またはステージに基づいて、実施形態Ａ５３〜Ａ６１のいずれか１つに記載のリガンドを投与する指示、そのリガンドのその後の投与量を維持する指示またはその被験体に投与されるそのリガンドのその後の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに含む、実施形態Ａ６２〜Ａ８６．５のいずれか１つに記載の方法。

【0721】

Ａ８８．前記状態が、白血病である、実施形態Ａ６２〜Ａ８７のいずれか１つに記載の方法。

【0722】

Ａ８９．前記被験体が、ＨＩＶ、インフルエンザ、疱疹、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６，Ｉ）およびパピローマウイルスからなる群より選択されるウイルス病因の感染症と診断されているか、または肺炎、結核および梅毒からなる群より選択される細菌病因の感染症と診断されているか、またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症およびアメーバ症からなる群より選択される寄生生物病因の感染症と診断されている、実施形態Ａ６２〜Ａ８７のいずれか１つに記載の方法。

【0723】

Ａ９０．前記改変された細胞が、エキソビボにおいてトランスフェクトされるかまたは形質導入される、実施形態Ａ６２〜Ａ８９のいずれか１つに記載の方法。

【0724】

Ａ９１．前記改変された細胞が、インビボにおいてトランスフェクトされるかまたは形質導入される、実施形態Ａ６２〜Ａ８９のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0725】

Ａ９２．前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ａ６２〜Ａ９０のいずれか１つに記載の方法。

【0726】

Ａ９３．細胞においてキメラ刺激分子を発現させるための方法であって、その方法は、実施形態Ａ１〜Ａ５１のいずれか１つに記載の核酸を、その核酸が細胞に組み込まれる条件下において細胞と接触させる工程を含み、それにより、その細胞は、組み込まれた核酸からキメラ抗原レセプターを発現する、方法。

【0727】

Ａ９４．前記核酸が、エキソビボにおいて前記細胞と接触される、実施形態Ａ９３に記載の方法。

【0728】

Ａ９５．前記核酸が、インビボにおいて前記細胞と接触される、実施形態Ａ９３に記載の方法。

【0729】

Ｂ１．標的抗原の高発現に関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、その方法は、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与する工程を含み、ここで、
ａ）その多量体リガンドは、前記多量体リガンド領域、ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む誘導可能なキメラ刺激分子に結合し；
ｂ）被験体内を循環しているＴ細胞は、（ｉ）誘導可能なキメラ刺激分子；および（ｉｉ）標的抗原に結合するキメラ抗原レセプターを発現し；
ｃ）標的抗原は、被験体内を循環している標的細胞上に存在し；
ｄ）被験体における標的細胞の数または濃度は、多量体リガンドを投与した後に減少する、
方法。

【0730】

Ｂ２．前記誘導可能なキメラ刺激分子が、膜標的化領域をさらに含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。

【0731】

Ｂ３．前記キメラ刺激分子を発現しているＴ細胞が、実施形態Ａ１〜Ａ５１のいずれか１つに記載の核酸を含む、実施形態Ｂ１またはＢ２のいずれか１つに記載の方法。

【0732】

Ｂ４．前記標的抗原が、腫瘍細胞によって発現され、前記キメラ抗原レセプターが、その腫瘍細胞に結合する、実施形態Ｂ１〜Ｂ３のいずれか１つに記載の方法。

【0733】

Ｂ５．前記改変された細胞またはリガンドを投与する前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、改変された細胞およびリガンドを投与した後に被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比べて第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増加または減少を判定する工程をさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ４のいずれか１つに記載の方法。

【0734】

Ｂ６．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度が、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比べて減少する、実施形態Ｂ５に記載の方法。

【0735】

Ｂ７．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度が、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比べて増加する、実施形態Ｂ５に記載の方法。

【0736】

Ｂ８．さらなる用量の前記リガンドが、前記被験体に投与される、実施形態Ｂ１〜Ｂ７のいずれか１つに記載の方法。

【0737】

Ｂ９．前記標的抗原が、腫瘍抗原である、実施形態Ｂ１〜Ｂ８のいずれか１つに記載の方法。

【0738】

Ｂ１０．前記被験体が、腫瘍を有すると診断されている、実施形態Ｂ１〜Ｂ９のいずれか１つに記載の方法。

【0739】

Ｂ１１．前記被験体が、がんを有する、実施形態Ｂ１〜Ｂ９のいずれか１つに記載の方法。

【0740】

Ｂ１２．前記被験体が、固形腫瘍を有する、実施形態Ｂ１〜Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。

【0741】

Ｂ１３．前記がんが、前記被験体の血液中または骨髄中に存在する、実施形態Ｂ１１に記載の方法。

【0742】

Ｂ１４．前記被験体が、血液疾患または骨髄疾患を有する、実施形態Ｂ１〜Ｂ１３のいずれか１つに記載の方法。

【0743】

Ｂ１５．前記被験体が、任意の状態または幹細胞移植によって緩和され得る状態と診断されている、実施形態Ｂ１〜Ｂ９のいずれか１つに記載の方法。

【0744】

Ｂ１６．前記被験体が、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、実施形態Ｂ１〜Ｂ９のいずれか１つに記載の方法。

【0745】

Ｂ１７．前記被験体が、原発性免疫不全状態、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＡＨ）または他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、異常ヘモグロビン症、代謝状態および破骨細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、実施形態Ｂ１〜Ｂ９のいずれか１つに記載の方法。

【0746】

Ｂ１８．前記疾患または状態が、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＡＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンドブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスおよび大理石骨病からなる群より選択される、実施形態Ｂ１〜Ｂ９のいずれか１つに記載の方法。

【0747】

Ｂ１９．さらなる用量の前記多量体リガンドを前記被験体に投与するべきであるかを判定する工程をさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１８のいずれか１つに記載の方法。

【0748】

Ｂ２０．さらなる用量の前記多量体リガンドを前記被験体に投与する工程をさらに含み、ここで、前記疾患または状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検出される、実施形態Ｂ１〜Ｂ１８のいずれか１つに記載の方法。

【0749】

Ｂ２１．被験体における状態または疾患の有無またはステージを特定する工程；および
その被験体において特定された状態または疾患の有無またはステージに基づいて、前記多量体リガンドをその被験体に投与する指示、その多量体リガンドのその後の投与量を維持する指示またはその被験体に投与されるその多量体リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１８のいずれか１つに記載の方法。

【0750】

Ｂ２２．前記状態が、白血病である、実施形態Ｂ１〜Ｂ２１のいずれか１つに記載の方法。

【0751】

Ｂ２３．前記被験体が、ＨＩＶ、インフルエンザ、疱疹、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６，Ｉ）およびパピローマウイルスからなる群より選択されるウイルス病因の感染症と診断されているか、または肺炎、結核および梅毒からなる群より選択される細菌病因の感染症と診断されているか、またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症およびアメーバ症からなる群より選択される寄生生物病因の感染症と診断されている、実施形態Ｂ１〜Ｂ９のいずれか１つに記載の方法。

【0752】

Ｂ２４．前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ｂ１〜Ｂ２３のいずれか１つに記載の方法。

【0753】

Ｃ１．誘導可能なキメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸でトランスフェクトされたまたは形質導入された、改変されたＴ細胞であって、ここで、その誘導可能なキメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、および（ｉｉｉ）多量体化領域を含む、改変されたＴ細胞。

【0754】

Ｃ２．前記誘導可能なキメラ刺激分子が、（ｉｖ）膜標的化領域をさらに含む、実施形態Ｃ１に記載の改変されたＴ細胞。

【0755】

Ｃ３．前記キメラ刺激分子がポリペプチドであって、領域（ｉ）〜（ｉｉｉ）を、該ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）という順序で含むポリペプチドである、実施形態Ｃ１に記載の改変されたＴ細胞。

【0756】

Ｃ４．前記キメラ刺激分子がポリペプチドであって、領域（ｉ）〜（ｉｖ）を、該ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって（ｉｖ）、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）という順序で含むポリペプチドである、実施形態Ｃ２に記載の改変されたＴ細胞。

【0757】

Ｃ５．前記多量体化領域が、リガンド結合領域である、実施形態Ｃ１〜Ｃ４のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0758】

Ｃ６．前記リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ｃ５に記載の改変されたＴ細胞。

【0759】

Ｃ７．前記ＦＫＢＰ１２領域が、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｃ６に記載の改変されたＴ細胞。

【0760】

Ｃ８．前記ＦＫＢＰ１２領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、実施形態Ｃ６に記載の改変されたＴ細胞。

【0761】

Ｃ９．前記多量体化領域が、配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントおよび配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントを含むか、または配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｃ５に記載の改変されたＴ細胞。

【0762】

Ｃ１０．前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含むか、または配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｃ９に記載の改変されたＴ細胞。

【0763】

Ｃ１１．残基３６がバリンであるＦｖポリペプチドバリアントをさらに含む、実施形態Ｃ９に記載の改変されたＴ細胞（Ｔ ｃｅｌ）。

【0764】

Ｃ１２．前記リガンドが、ＦＫ５０６二量体または二量体のＦＫ５０６アナログリガンドである、実施形態Ｃ５〜Ｃ１１のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0765】

Ｃ１３．前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ｃ１２に記載の改変されたＴ細胞。

【0766】

Ｃ１４．領域（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくとも１つが、コドン最適化されたヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態Ｃ１〜Ｃ１３のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0767】

Ｃ１５．前記誘導可能なキメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ１４のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0768】

Ｃ１６．前記改変された細胞が、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ１５のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0769】

Ｃ１７．前記キメラ抗原レセプターが、
（ｉ）膜貫通領域；（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子；および（ｉｉｉ）抗原認識部分
を含む、実施形態Ｃ１６に記載の改変されたＴ細胞。

【0770】

Ｃ１８．前記改変された細胞が、Ｔ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ１５のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0771】

Ｃ１９．前記改変された細胞が、Ｔ細胞レセプターまたはＴ細胞レセプターに基づくキメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む核酸でトランスフェクトされるかまたは形質導入される、実施形態Ｃ１〜Ｃ１５のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0772】

Ｃ２０．前記キメラ抗原レセプターが、共刺激分子をさらに含む、実施形態Ｃ１６に記載の改変されたＴ細胞。

【0773】

Ｃ２１．前記共刺激分子が、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４−１ＢＢからなる群より選択される、実施形態Ｃ２０に記載の改変されたＴ細胞。

【0774】

Ｃ２２．前記Ｔ細胞活性化分子が、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子である、実施形態Ｃ１７に記載の改変されたＴ細胞。

【0775】

Ｃ２３．前記Ｔ細胞活性化分子が、ＣＤ３ζポリペプチドである、実施形態Ｃ１７に記載の改変されたＴ細胞。

【0776】

Ｃ２４．前記Ｔ細胞活性化分子が、Ｆｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドである、実施形態Ｃ１７に記載の改変されたＴ細胞。

【0777】

Ｃ２５．前記抗原認識部分が、腫瘍細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｃ１７またはＣ２２〜Ｃ２４のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0778】

Ｃ２６．前記抗原認識部分が、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｃ１７またはＣ２２〜Ｃ２４のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0779】

Ｃ２７．前記抗原認識部分が、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６およびＨｅｒ２／Ｎｅｕからなる群より選択される抗原に結合する、実施形態Ｃ１７またはＣ２２〜Ｃ２６のいずれか１項に記載の改変されたＴ細胞。

【0780】

Ｃ２８．前記抗原認識部分が、ＰＳＣＡに結合する、実施形態Ｃ１７またはＣ２２〜Ｃ２４のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0781】

Ｃ２９．前記抗原認識部分が、ＣＤ１９に結合する、実施形態Ｃ１７またはＣ２２〜Ｃ２４のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0782】

Ｃ３０．前記抗原認識部分が、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結合する、実施形態Ｃ１７またはＣ２２〜Ｃ２４のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0783】

Ｃ３１．前記抗原認識部分が、ウイルス抗原または細菌抗原に結合する、実施形態Ｃ１７またはＣ２２〜Ｃ２４のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0784】

Ｃ３２．前記抗原認識部分が、一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ｃ１７またはＣ２２〜Ｃ３１のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0785】

Ｃ３３．前記膜貫通領域が、ＣＤ２８膜貫通領域である、実施形態Ｃ１７またはＣ２２〜Ｃ３２のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0786】

Ｃ３４．前記膜貫通領域が、ＣＤ８膜貫通領域である、実施形態Ｃ１７またはＣ２２〜Ｃ３２のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0787】

Ｃ３５．前記キメラ抗原レセプターが、ＣＤ８ストーク領域をさらに含む、実施形態Ｃ３４に記載の改変されたＴ細胞。

【0788】

Ｃ３６．前記キメラ刺激分子が、配列番号５のアミノ酸配列を有する切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ３５のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0789】

Ｃ３７．前記ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号４９のアミノ酸配列を有する、実施形態Ｃ１〜Ｃ３６のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0790】

Ｃ３８．前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｃ１〜Ｃ３７のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0791】

Ｃ４０．前記ＣＤ３ζポリペプチドが、配列番号３９のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｃ２３〜Ｃ３８のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0792】

Ｃ４１．前記膜標的化領域が、レセプターのミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域および膜貫通配列からなる群より選択される、実施形態Ｃ２〜Ｃ４０のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0793】

Ｃ４２．前記膜標的化領域が、ミリストイル化領域である、実施形態Ｃ２〜Ｃ４０のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0794】

Ｃ４３．前記ミリストイル化領域が、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｃ４２に記載の改変されたＴ細胞。

【0795】

Ｃ４４〜Ｃ６１ 保留。

【0796】

Ｃ６２．被験体におけるＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激するための方法であって、
ａ）実施形態Ｃ１〜Ｃ４３のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞をその被験体に投与する工程；および
ｂ）有効量の、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与することにより、その被験体においてＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激する工程
を含む、方法。

【0797】

Ｃ６３．前記キメラ抗原レセプターが、標的細胞に結合する、実施形態Ｃ６２に記載の方法。

【0798】

Ｃ６４．前記標的細胞が、腫瘍細胞である、実施形態Ｃ６３に記載の方法。

【0799】

Ｃ６５．被験体における標的細胞の数または濃度が、前記リガンドの投与後に減少する、実施形態Ｃ６２〜Ｃ６４のいずれか１つに記載の方法。

【0800】

Ｃ６６．前記改変された細胞またはリガンドを投与する前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、改変された細胞およびリガンドを投与した後に被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比べて第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増加または減少を判定する工程をさらに含む、実施形態Ｃ６２〜Ｃ６５のいずれか１つに記載の方法。

【0801】

Ｃ６７．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度が、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比べて減少する、実施形態Ｃ６６に記載の方法。

【0802】

Ｃ６８．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度が、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比べて増加する、実施形態Ｃ６６に記載の方法。

【0803】

Ｃ６９．さらなる用量の前記リガンドが、前記被験体に投与される、実施形態Ｃ６２〜Ｃ６８のいずれか１つに記載の方法。

【0804】

Ｃ７０．被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、有効量の実施形態Ｃ１〜Ｃ４３のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞をその被験体に投与する工程および多量体化領域に結合するリガンドを投与することによりその被験体に抗腫瘍免疫をもたらす工程を含む、方法。

【0805】

Ｃ７１．標的抗原の高発現に関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、有効量の実施形態Ｃ１〜Ｃ４３のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞、および有効量の、前記多量体化領域に結合するリガンドをその被験体に投与する工程を含む、方法。

【0806】

Ｃ７２．前記標的抗原が、腫瘍抗原である、実施形態Ｃ７１に記載の方法。

【0807】

Ｃ７３．前記改変されたＴ細胞が、自己のＴ細胞である、実施形態Ｃ６２〜Ｃ７２のいずれか１つに記載の方法。

【0808】

Ｃ７４．前記改変されたＴ細胞が、同種異系のＴ細胞である、実施形態Ｃ６２〜Ｃ７２のいずれか１つに記載の方法。

【0809】

Ｃ７５．被験体における腫瘍サイズを減少させるための方法であって、その方法は、実施形態Ｃ１〜Ｃ４３のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞をその被験体に投与する工程を含み、前記抗原認識部分は、その腫瘍上の抗原に結合する、方法。

【0810】

Ｃ７６．前記被験体が、腫瘍を有すると診断されている、実施形態Ｃ６２〜Ｃ７５のいずれか１つに記載の方法。

【0811】

Ｃ７６．前記被験体が、がんを有する、実施形態Ｃ６２〜Ｃ７５のいずれか１つに記載の方法。

【0812】

Ｃ７７．前記被験体が、固形腫瘍を有する、実施形態Ｃ６２〜Ｃ７５のいずれか１つに記載の方法。

【0813】

Ｃ７８．前記改変されたＴ細胞が、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ細胞またはＮＫ−Ｔ細胞である、実施形態Ｃ６２〜Ｃ７５のいずれか１つに記載の方法。

【0814】

Ｃ７９．前記改変されたＴ細胞が、腫瘍床に送達される、実施形態Ｃ６２〜Ｃ７５のいずれか１つに記載の方法。

【0815】

Ｃ８０．前記がんが、前記被験体の血液中または骨髄中に存在する、実施形態Ｃ７６に記載の方法。

【0816】

Ｃ８１．前記被験体が、血液疾患または骨髄疾患を有する、実施形態Ｃ６２〜Ｃ７５のいずれか１つに記載の方法。

【0817】

Ｃ８２．前記被験体が、任意の状態または幹細胞移植によって緩和され得る状態と診断されている、実施形態Ｃ６２〜Ｃ７５のいずれか１つに記載の方法。

【0818】

Ｃ８３．前記被験体が、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、実施形態Ｃ６２〜Ｃ７５のいずれか１つに記載の方法。

【0819】

Ｃ８４．前記被験体が、原発性免疫不全状態、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＡＨ）または他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、異常ヘモグロビン症、代謝状態および破骨細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、実施形態Ｃ６２〜Ｃ７５のいずれか１つに記載の方法。

【0820】

Ｃ８４．前記疾患または状態が、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＡＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンドブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスおよび大理石骨病からなる群より選択される、実施形態Ｃ６２〜Ｃ７６のいずれか１つに記載の方法。

【0821】

Ｃ８５．さらなる用量の前記リガンドを前記被験体に投与するべきであるかを判定する工程をさらに含む、実施形態Ｃ６２〜Ｃ８４のいずれか１つに記載の方法。

【0822】

Ｃ８６．さらなる用量の前記リガンドを前記被験体に投与する工程をさらに含み、ここで、前記疾患または状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検出される、実施形態Ｃ６２〜Ｃ８５のいずれか１つに記載の方法。

【0823】

Ｃ８７．被験体における状態または疾患の有無またはステージを特定する工程；および
その被験体において特定された状態または疾患の有無またはステージに基づいて、実施形態Ｃ５３〜Ｃ６１のいずれか１つに記載のリガンドを投与する指示、そのリガンドのその後の投与量を維持する指示またはその被験体に投与されるそのリガンドのその後の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに含む、実施形態Ｃ６２〜Ｃ８６のいずれか１つに記載の方法。

【0824】

Ｃ８８．前記状態が、白血病である、実施形態Ｃ６２〜Ｃ８７のいずれか１つに記載の方法。

【0825】

Ｃ８９．前記被験体が、ＨＩＶ、インフルエンザ、疱疹、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６，Ｉ）およびパピローマウイルスからなる群より選択されるウイルス病因の感染症と診断されているか、または肺炎、結核および梅毒からなる群より選択される細菌病因の感染症と診断されているか、またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症およびアメーバ症からなる群より選択される寄生生物病因の感染症と診断されている、実施形態Ｃ６２〜Ｃ８７のいずれか１つに記載の方法。

【0826】

Ｃ９０．前記改変されたＴ細胞が、エキソビボにおいてトランスフェクトされるかまたは形質導入される、実施形態Ｃ６２〜Ｃ８９のいずれか１つに記載の方法。

【0827】

Ｃ９１．前記改変されたＴ細胞が、インビボにおいてトランスフェクトされるかまたは形質導入される、実施形態Ｃ６２〜Ｃ８９のいずれか１つに記載の改変されたＴ細胞。

【0828】

Ｃ９２．前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ｃ６２〜Ｃ９０のいずれか１つに記載の方法。

【0829】

Ｄ１．誘導可能なキメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸であって、ここで、その誘導可能なキメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、および（ｉｉｉ）多量体化領域を含む、核酸。

【0830】

Ｄ２．前記キメラ刺激分子がポリペプチドであって、領域（ｉ）〜（ｉｉｉ）を、該ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）という順序で含むポリペプチドである、実施形態Ｄ１に記載の核酸。

【0831】

Ｄ３．前記多量体化領域が、リガンド結合領域である、実施形態Ｄ１〜Ｄ２のいずれか１つに記載の核酸。

【0832】

Ｄ３．前記リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ｄ３に記載の核酸。

【0833】

Ｄ４．前記ＦＫＢＰ１２領域が、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｄ３に記載の核酸。

【0834】

Ｄ５．前記ＦＫＢＰ１２領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、実施形態Ｄ３に記載の核酸。

【0835】

Ｄ６．前記多量体化領域が、配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントおよび配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、実施形態Ｄ３に記載の核酸。

【0836】

Ｄ７．前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｄ６に記載の核酸。

【0837】

Ｄ８．残基３６がバリンであるＦｖポリペプチドバリアントをさらに含む、実施形態Ｄ６に記載の核酸。

【0838】

Ｄ９．前記リガンドが、ＦＫ５０６二量体または二量体のＦＫ５０６アナログリガンドである、実施形態Ｄ１〜Ｄ８のいずれか１つに記載の核酸。

【0839】

Ｄ１０．前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ｄ９に記載の核酸。

【0840】

Ｄ１１．領域（ｉ）〜（ｉｉｉ）の少なくとも１つが、コドン最適化されたヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態Ｄ１〜Ｄ１０のいずれか１つに記載の核酸。

【0841】

Ｄ１２．前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ１１のいずれか１つに記載の核酸。

【0842】

Ｄ１３．前記核酸が、ウイルスベクター内に含まれている、実施形態Ｄ１〜Ｄ１２のいずれか１つに記載の核酸。

【0843】

Ｄ１４．前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、実施形態Ｄ１３に記載の核酸。

【0844】

Ｄ１５．前記レトロウイルスベクターが、マウス白血病ウイルスベクターである、実施形態Ｄ１４に記載の核酸。

【0845】

Ｄ１６．前記レトロウイルスベクターが、ＳＦＧベクターである、実施形態Ｄ１４に記載の核酸。

【0846】

Ｄ１７．前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、実施形態Ｄ１３に記載の核酸。

【0847】

Ｄ１８．前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、実施形態Ｄ１３に記載の核酸。

【0848】

Ｄ１９．前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスからなる群より選択される、実施形態Ｄ１３に記載の核酸。

【0849】

Ｄ２０．前記核酸が、プラスミド内に含まれている、実施形態Ｄ１〜Ｄ１２のいずれか１つに記載の核酸。

【0850】

Ｄ２１．実施形態Ｄ１〜Ｄ２０のいずれか１つに記載の核酸でトランスフェクトされたまたは形質導入された、改変された細胞。

【0851】

Ｄ２２．前記改変された細胞が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞、ＴＣＲを発現している細胞またはＮＫ細胞である、実施形態Ｄ２１に記載の改変された細胞。

【0852】

Ｄ２３．前記細胞が、Ｔ細胞である、実施形態Ｄ２１に記載の改変された細胞。

【0853】

Ｄ２４．前記細胞が、骨髄から得られるかまたは調製される、実施形態Ｄ２１〜Ｄ２３のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0854】

Ｄ２５．前記細胞が、臍帯血から得られるかまたは調製される、実施形態Ｄ２１〜Ｄ２３のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0855】

Ｄ２６．前記細胞が、末梢血から得られるかまたは調製される、実施形態Ｄ２１〜Ｄ２３のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0856】

Ｄ２７．前記細胞が、末梢血単核球から得られるかまたは調製される、実施形態Ｄ２１〜Ｄ２３のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0857】

Ｄ２８．前記細胞が、ヒト細胞である、実施形態Ｄ２１〜Ｄ２７のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0858】

Ｄ２９．前記細胞が、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子を用いた遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子またはポリプレックスからなる群より選択される方法を用いて、前記核酸ベクターによってトランスフェクトされるかまたは形質導入される、実施形態Ｄ２１〜Ｄ２８のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0859】

Ｄ３０．前記改変された細胞が、Ｔ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ２９のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0860】

Ｄ３１．前記改変された細胞が、Ｔ細胞レセプターまたはＴ細胞レセプターに基づくキメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む核酸でトランスフェクトされるかまたは形質導入される、実施形態Ｄ１〜Ｄ２９のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0861】

Ｄ３２．前記改変された細胞が、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ｄ２１〜Ｄ２９のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0862】

Ｄ３３．前記キメラ抗原レセプターが、（ｉ）膜貫通領域；（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子；および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、実施形態Ｄ３２に記載の改変された細胞。

【0863】

Ｄ３４．前記キメラ抗原レセプターが、共刺激分子をさらに含む、実施形態Ｄ３３に記載の改変された細胞。

【0864】

Ｄ３５．前記共刺激分子が、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４−１ＢＢからなる群より選択される、実施形態Ｄ３４に記載の改変された細胞。

【0865】

Ｄ３６．前記Ｔ細胞活性化分子が、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子である、実施形態Ｄ３３に記載の改変された細胞。

【0866】

Ｄ３７．前記Ｔ細胞活性化分子が、ＣＤ３ζポリペプチドである、実施形態Ｄ３３に記載の改変された細胞。

【0867】

Ｄ３８．前記Ｔ細胞活性化分子が、Ｆｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドである、実施形態Ｄ３３に記載の改変された細胞。

【0868】

Ｄ３９．前記抗原認識部分が、腫瘍細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｄ３２〜Ｄ３８のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0869】

Ｄ４０．前記抗原認識部分が、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｄ３２〜Ｄ３８のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0870】

Ｄ４１．前記抗原認識部分が、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６およびＨｅｒ２／Ｎｅｕからなる群より選択される抗原に結合する、実施形態Ｄ３２〜Ｄ４０のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0871】

Ｄ４２．前記抗原認識部分が、ＰＳＣＡに結合する、実施形態Ｄ３２〜Ｄ４０のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0872】

Ｄ４３．前記抗原認識部分が、ＣＤ１９に結合する、実施形態Ｄ３２〜Ｄ４０のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0873】

Ｄ４４．前記抗原認識部分が、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結合する、実施形態Ｄ３２〜Ｄ４０のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0874】

Ｄ４５．前記抗原認識部分が、ウイルス抗原または細菌抗原に結合する、実施形態Ｄ３２〜Ｄ３８のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0875】

Ｄ４６．前記抗原認識部分が、一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ｄ３２〜Ｄ４５のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0876】

Ｄ４７．前記膜貫通領域が、ＣＤ２８膜貫通領域である、実施形態Ｄ３２〜Ｄ４６のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0877】

Ｄ４８．前記膜貫通領域が、ＣＤ８膜貫通領域である、実施形態Ｄ３２〜Ｄ４６のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0878】

Ｄ４９．前記キメラ抗原レセプターが、ＣＤ８ストーク領域をさらに含む、実施形態Ｄ４８に記載の改変された細胞。

【0879】

Ｄ５０．前記キメラ刺激分子が、配列番号５のアミノ酸配列を有する切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ２１〜Ｄ４９のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0880】

Ｄ５１．前記ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号４９のアミノ酸配列を有する、実施形態Ｄ２１〜Ｄ５０のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0881】

Ｄ５２．前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｄ２１〜Ｄ５１のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0882】

Ｄ５３．前記ＣＤ３ζポリペプチドが、配列番号３９のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ３２〜Ｄ５２のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0883】

Ｄ５４．被験体におけるＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激するための方法であって、
ａ）実施形態Ｄ２１〜Ｄ５３のいずれか１つに記載の改変された細胞をその被験体に投与する工程；および
ｂ）有効量の、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与することにより、その被験体においてＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激する工程
を含む、方法。

【0884】

Ｄ５５．保留。

【0885】

Ｄ５６．前記キメラ抗原レセプターが、標的細胞に結合する、実施形態Ｄ５４に記載の方法。

【0886】

Ｄ５７．前記標的細胞が、腫瘍細胞である、実施形態Ｄ５６に記載の方法。

【0887】

Ｄ５８．被験体における標的細胞の数または濃度が、前記リガンドの投与後に減少する、実施形態Ｄ５６またはＤ５７のいずれか１つに記載の方法。

【0888】

Ｄ５９．前記改変された細胞またはリガンドを投与する前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、改変された細胞およびリガンドを投与した後に被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比べて第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増加または減少を判定する工程をさらに含む、実施形態Ｄ５６〜Ｄ５８のいずれか１つに記載の方法。

【0889】

Ｄ６０．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度が、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比べて減少する、実施形態Ｄ５９に記載の方法。

【0890】

Ｄ６１．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度が、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比べて増加する、実施形態Ｄ５９に記載の方法。

【0891】

Ｄ６２．さらなる用量のリガンドが、前記被験体に投与される、実施形態Ｄ５４〜Ｄ６１のいずれか１つに記載の方法。

【0892】

Ｄ６３．被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、有効量の実施形態Ｄ２１〜Ｄ５３のいずれか１つに記載の改変された細胞をその被験体に投与する工程および前記多量体化領域に結合するリガンドを投与することによりその被験体に抗腫瘍免疫を提供する工程を含む、方法。

【0893】

Ｄ６４．標的抗原の高発現に関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、有効量の実施形態Ｄ３２〜Ｄ５３のいずれか１つに記載の改変された細胞、および有効量の、前記多量体化領域に結合するリガンドをその被験体に投与する工程を含む、方法。

【0894】

Ｄ６５．前記標的抗原が、腫瘍抗原である、実施形態Ｄ６４に記載の方法。

【0895】

Ｄ６６．前記改変された細胞が、Ｔ細胞である、実施形態Ｄ６４またはＤ６５のいずれか１つに記載の方法。

【0896】

Ｄ６７．前記改変された細胞が、同種異系のＴ細胞である、実施形態Ｄ６４またはＤ６５のいずれか１つに記載の方法。

【0897】

Ｄ６８．被験体における腫瘍サイズを減少させるための方法であって、その方法は、実施形態Ｄ３２〜Ｄ５３のいずれか１項に記載の改変された細胞を前記被験体に投与する工程を含み、前記抗原認識部分は、その腫瘍上の抗原に結合する、方法。

【0898】

Ｄ６９．前記被験体が、腫瘍を有すると診断されている、実施形態Ｄ５４〜Ｄ６９のいずれか１つに記載の方法。

【0899】

Ｄ７０．前記被験体が、がんを有する、実施形態Ｄ５４〜Ｄ７０のいずれか１つに記載の方法。

【0900】

Ｄ７１．前記被験体が、固形腫瘍を有する、実施形態Ｄ５４〜Ｄ７０のいずれか１つに記載の方法。

【0901】

Ｄ７２．前記改変された細胞が、腫瘍浸潤リンパ球である、実施形態Ｄ５４〜Ｄ７１のいずれか１つに記載の方法。

【0902】

Ｄ７３．前記改変された細胞が、腫瘍床に送達される、実施形態Ｄ５４〜Ｄ７２のいずれか１つに記載の方法。

【0903】

Ｄ７４．前記がんが、前記被験体の血液中または骨髄中に存在する、実施形態Ｄ７０に記載の方法。

【0904】

Ｄ７５．前記被験体が、血液疾患または骨髄疾患を有する、実施形態Ｄ５４〜Ｄ７４のいずれか１つに記載の方法。

【0905】

Ｄ７６．前記被験体が、任意の状態または幹細胞移植によって緩和され得る状態と診断されている、実施形態Ｄ５４〜Ｄ７５のいずれか１つに記載の方法。

【0906】

Ｄ７７．前記被験体が、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、実施形態Ｄ５４〜Ｄ７５のいずれか１つに記載の方法。

【0907】

Ｄ７８．前記被験体が、原発性免疫不全状態、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＡＨ）または他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、異常ヘモグロビン症、代謝状態および破骨細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、実施形態Ｄ５４〜Ｄ７５のいずれか１つに記載の方法。

【0908】

Ｄ７９．前記疾患または状態が、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＡＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンドブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスおよび大理石骨病からなる群より選択される、実施形態Ｄ５４〜Ｄ７５のいずれか１つに記載の方法。

【0909】

Ｄ８０．さらなる用量の前記リガンドを前記被験体に投与するべきであるかを判定する工程をさらに含む、実施形態Ｄ５４〜Ｄ７９のいずれか１つに記載の方法。

【0910】

Ｄ８１．さらなる用量の前記リガンドを前記被験体に投与する工程をさらに含み、ここで、前記疾患または状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検出される、実施形態Ｄ５４〜Ｄ８０のいずれか１つに記載の方法。

【0911】

Ｄ８２．被験体における状態または疾患の有無またはステージを特定する工程；および
その被験体において特定された状態または疾患の有無またはステージに基づいて、前記リガンドを投与する指示、そのリガンドのその後の投与量を維持する指示またはその被験体に投与されるそのリガンドのその後の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに含む、実施形態Ｄ５４〜Ｄ８０のいずれか１つに記載の方法。

【0912】

Ｄ８３．前記状態が、白血病である、実施形態Ｄ５４〜Ｄ８２のいずれか１つに記載の方法。

【0913】

Ｄ８４．前記被験体が、ＨＩＶ、インフルエンザ、疱疹、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６，Ｉ）およびパピローマウイルスからなる群より選択されるウイルス病因の感染症と診断されているか、または肺炎、結核および梅毒からなる群より選択される細菌病因の感染症と診断されているか、またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症およびアメーバ症からなる群より選択される寄生生物病因の感染症と診断されている、実施形態Ｄ５４〜Ｄ８２のいずれか１つに記載の方法。

【0914】

Ｄ８５．前記改変された細胞が、エキソビボにおいてトランスフェクトされるかまたは形質導入される、実施形態Ｄ５４〜Ｄ８２のいずれか１つに記載の方法。

【0915】

Ｄ８６．前記改変された細胞が、インビボにおいてトランスフェクトされるかまたは形質導入される、実施形態Ｄ２１〜Ｄ５３のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【0916】

Ｄ８７．前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ｄ５４〜Ｄ８６のいずれか１つに記載の方法。

【0917】

実施例２９：さらなる代表的な実施形態
本技術のある特定の実施形態の例を、この後に提供する。

【0918】

Ａ１．Ｔ細胞を活性化するための方法であって、その方法は、
キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸でＴ細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入する工程
を含み、ここで、そのキメラタンパク質は、
ａ）膜標的化領域、
ｂ）多量体化領域、および
ｃ）ＭｙＤ８８ポリペプチド
を含み、それによって、そのＴ細胞は活性化される、方法。

【0919】

Ａ２．Ｔ細胞を活性化するための方法であって、その方法は、
キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸でＴ細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入する工程
を含み、ここで、そのキメラタンパク質は、
ａ）膜標的化領域、
ｂ）多量体化領域、および
ｃ）ＣＤ４０細胞質領域であって、ここで、そのＣＤ４０ポリペプチドは、機能的な細胞外ドメインを有しない、ＣＤ４０細胞質領域
を含み、それによって、そのＴ細胞は活性化される、方法。

【0920】

Ｂ１．Ｔ細胞を活性化するための方法であって、その方法は、
キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸でＴ細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入する工程
を含み、ここで、そのキメラタンパク質は、
ａ）膜標的化領域、
ｂ）多量体化領域、
ｃ）ＭｙＤ８８ポリペプチド、および
ｄ）ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域であって、ここで、そのＣＤ４０ポリペプチドは、機能的な細胞外ドメインを有しない、ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域
を含み、それによって、そのＴ細胞は活性化される、方法。

【0921】

Ｃ１．Ｔ細胞を活性化するための方法であって、その方法は、
キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸でＴ細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入する工程
を含み、ここで、そのキメラタンパク質は、
ａ）膜標的化領域、
ｂ）多量体化領域、および
ｃ）ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域であって、ここで、そのＣＤ４０ポリペプチドは、機能的な細胞外ドメインを有しない、ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域
を含み、それによって、そのＴ細胞は活性化される、方法。

【0922】

Ｄ１．前記Ｔ細胞が、初代Ｔ細胞である、実施形態Ａ１〜Ｃ１のいずれか１つに記載の方法。

【0923】

Ｄ２．前記Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞である、実施形態Ａ１〜Ｃ１のいずれか１つに記載の方法。

【0924】

Ｄ３．前記Ｔ細胞が、ナチュラルキラー細胞である、実施形態Ａ１〜Ｃ１のいずれか１つに記載の方法。

【0925】

Ｄ４．前記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞である、実施形態Ａ１〜Ｃ１のいずれか１つに記載の方法。

【0926】

Ｄ４．１．前記Ｔ細胞が、単離されたＴ細胞である、実施形態Ａ１〜Ｄ４のいずれか１つに記載の方法。

【0927】

Ｄ５．多量体化領域に結合するリガンドと前記Ｔ細胞を接触させることにより多量体化をもたらし、それによって、そのＴ細胞が活性化される工程を含む、実施形態Ａ１〜Ｄ４．１のいずれか１つに記載の方法。

【0928】

Ｄ６．前記核酸が、ウイルスベクター内に含まれている、実施形態Ａ１〜Ｄ５のいずれか１つに記載の方法。

【0929】

Ｄ７．前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、実施形態Ｄ６に記載の方法。

【0930】

Ｄ８．前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、実施形態Ｄ６に記載の方法。

【0931】

Ｄ９．前記レトロウイルスベクターが、図３６のプラスミドベクターを用いて作製される、実施形態Ｄ８に記載の方法。

【0932】

Ｄ１０．前記核酸が、プラスミド内に含まれている、実施形態Ａ１〜Ｄ５のいずれか１つに記載の方法。

【0933】

Ｄ１１．前記核酸が、プラスミド内またはウイルス内に含まれていない、実施形態Ｄ１０に記載の方法。

【0934】

Ｄ１２．前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態Ａ１〜Ｄ１０のいずれか１つに記載の方法。

【0935】

Ｄ１３．前記ＭｙＤ８８ポリペプチドが、ＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドである、実施形態Ａ１、Ｂ１またはＤ１〜Ｄ１２のいずれか１つに記載の方法。

【0936】

Ｄ１４．前記ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｄ１３に記載の方法。

【0937】

Ｄ１５．前記ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号４の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ｄ１３またはＤ１４に記載の方法。

【0938】

Ｄ１６．腫瘍抗原を標的化するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含む核酸で前記Ｔ細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入する工程をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ｄ１５のいずれか１つに記載の方法。

【0939】

Ｄ１７．前記標的化された腫瘍抗原が、前立腺がん抗原である、実施形態Ｄ１６のいずれか１つに記載の方法。

【0940】

Ｄ１８．前記標的化された腫瘍抗原が、前立腺特異的膜抗原である、実施形態Ｄ１６のいずれか１つに記載の方法。

【0941】

Ｄ１９．前記膜標的化領域が、レセプターのミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域および膜貫通配列からなる群より選択される、実施形態Ａ１〜Ｄ１８のいずれか１つに記載の方法。

【0942】

Ｄ２０．前記膜標的化領域が、ミリストイル化領域である、実施形態Ｄ１９に記載の方法。

【0943】

Ｄ２１．前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、可動性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをタンデムで含む一本鎖抗体およびそれらの変異された配列からなる群より選択されるリガンド結合領域である、実施形態Ａ１〜Ｄ２０のいずれか１つに記載の方法。

【0944】

Ｄ２２．前記リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ｄ２１に記載の方法。

【0945】

Ｄ２３．前記ＦＫＢＰ１２領域が、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｄ２２に記載の方法。

【0946】

Ｄ２４．前記ＦＫＢＰ領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、実施形態Ｄ２１に記載の方法。

【0947】

Ｄ２５．前記リガンドが、ＦＫ５０６二量体または二量体のＦＫ５０６アナログリガンドである、実施形態Ｄ５〜Ｄ２４のいずれか１つに記載の方法。

【0948】

Ｄ２６．前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ｄ２５に記載の方法。

【0949】

Ｄ２７．前記ＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域が、配列番号９の細胞質領域のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ａ１〜Ｄ２６のいずれか１つに記載の方法。

【0950】

Ｄ２８．前記ＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域が、配列番号８におけるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ｂ１〜Ｄ２７のいずれか１つに記載の方法。

【0951】

Ｄ２９．保留。

【0952】

Ｄ３０．保留。

【0953】

Ｄ３１．前記多量体化領域が、配列番号１１のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ａ１〜Ｄ２９のいずれか１つに記載の方法。

【0954】

Ｄ３２．前記多量体化領域が、配列番号１０におけるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ａ１〜Ｄ３０のいずれか１つに記載の方法。

【0955】

Ｄ３３．前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｄ３１に記載の方法。

【0956】

Ｄ３３．１．前記多量体化領域が、配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｄ３１に記載の方法。

【0957】

Ｄ３３．１．前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｄ３１に記載の方法。

【0958】

Ｄ３３．２．前記多量体化領域が、配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｄ３１に記載の方法。

【0959】

Ｄ３３．３．前記多量体化領域が、配列番号２７もしくは配列番号３２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｄ３３．１またはＤ３３．２に記載の方法。

【0960】

Ｄ３３．４．前記多量体化領域が、配列番号１２もしくは配列番号１０におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｄ３３．１またはＤ３３．２に記載の方法。

【0961】

Ｄ３４．前記膜標的化領域が、ミリストイル化領域である、実施形態Ａ１〜Ｄ３３．２４のいずれか１つに記載の方法。

【0962】

Ｄ３５．前記ミリストイル化領域が、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｄ３４に記載の方法。

【0963】

Ｄ３６．前記ミリストイル化領域が、配列番号２におけるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ｄ３４に記載の方法。

【0964】

Ｄ３７．前記Ｔ細胞が、ヒトＴ細胞である、実施形態Ａ１〜Ｄ３６のいずれか１つに記載の方法。

【0965】

Ｄ３８．前記Ｔ細胞が、インビボにおいて前記多量体リガンドと接触される、実施形態Ｄ１〜Ｄ３７のいずれか１つに記載の方法。

【0966】

Ｅ１．被験体における腫瘍抗原に対して免疫応答を誘導する方法であって、実施形態Ａ１〜Ｄ３７のいずれか１つに記載の方法に従ってＴ細胞を活性化する工程およびその活性化されたＴ細胞を被験体に投与する工程を含む、方法。

【0967】

Ｅ２．被験体における表面腫瘍抗原を有する腫瘍のサイズを減少させる方法であって、実施形態Ａ１〜Ｄ３７のいずれか１つに記載の方法に従ってＴ細胞を活性化する工程を含む、方法。

【0968】

Ｅ３．前記腫瘍が、前立腺がん腫瘍である、実施形態Ｅ２に記載の方法。

【0969】

Ｅ３．被験体における前立腺がんを処置する方法であって、その方法は、実施形態Ａ１〜Ｄ３７のいずれか１つに記載の方法に従ってＴ細胞を活性化する工程であって、ここで、その腫瘍抗原は、前立腺がん抗原である、工程、およびその活性化されたＴ細胞を被験体に投与する工程を含む、方法。

【0970】

Ｅ４．前記腫瘍抗原が、ＰＳＭＡである、実施形態Ｅ３に記載の方法。

【0971】

Ｅ５．前記被験体が、ヒトである、実施形態Ｅ１〜Ｅ４のいずれか１つに記載の方法。

【0972】

Ｅ６．前記被験体が、前立腺がんを有する、実施形態Ｅ１〜Ｅ５のいずれか１つに記載の方法。

【0973】

Ｅ７．前記Ｔ細胞が、インビボにおいて前記多量体リガンドと接触される、実施形態Ｅ１〜Ｅ６のいずれか１つに記載の方法。

【0974】

Ｅ８．前記多量体リガンドを前記被験体に投与する工程を含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ７のいずれか１つに記載の方法。

【0975】

Ｅ９．前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ｅ８に記載の方法。

【0976】

Ｅ１０．前記Ｔ細胞を投与する前および／または投与した後に腫瘍のサイズを測定する工程を含む、実施形態Ｅ２〜Ｅ９のいずれかに記載の方法。

【0977】

Ｅ１１．前記Ｔ細胞を投与する前および／または投与した後に前記被験体の血清ＰＳＡレベルを決定する工程を含む、実施形態Ｅ２〜Ｅ９のいずれか１つに記載の方法。

【0978】

Ｅ１２．前記被験体が、７またはそれを超えるグリーソンスコアを有する前立腺がんを有する、実施形態Ｅ２〜Ｅ１１のいずれか１つに記載の方法。

【0979】

Ｅ１３．前記被験体が、８またはそれを超えるグリーソンスコアを有する前立腺がんを有する、実施形態Ｅ２〜Ｅ１１のいずれか１つに記載の方法。

【0980】

Ｆ１．キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むＴ細胞であって、ここで、そのキメラタンパク質は、
ａ）膜標的化領域、
ｂ）多量体化領域、および
ｃ）ＭｙＤ８８ポリペプチド
を含む、Ｔ細胞。

【0981】

Ｆ２．キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むＴ細胞であって、ここで、そのキメラタンパク質は、
ａ）膜標的化領域、
ｂ）多量体化領域、
ｃ）ＭｙＤ８８ポリペプチド、および
ｄ）ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域であって、ここで、そのＣＤ４０ポリペプチドは、機能的な細胞外ドメインを有しない、ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域
を含む、Ｔ細胞。

【0982】

Ｆ３．キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むＴ細胞であって、ここで、そのキメラタンパク質は、
ａ）膜標的化領域、
ｂ）多量体化領域、および
ｃ）ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域であって、ここで、そのＣＤ４０ポリペプチドは、機能的な細胞外ドメインを有しない、ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域
を含む、Ｔ細胞。

【0983】

Ｆ４．腫瘍抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸をさらに含む、実施形態Ｆ１〜Ｆ３のいずれか１つに記載のＴ細胞。

【0984】

Ｆ５．保留。

【0985】

Ｆ６．保留。

【0986】

Ｆ７．前記Ｔ細胞が、初代Ｔ細胞である、実施形態Ｆ１〜Ｆ７のいずれか１つに記載のＴ細胞。

【0987】

Ｆ８．前記Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞である、実施形態Ｆ１〜Ｆ７のいずれか１つに記載のＴ細胞。

【0988】

Ｆ９．保留。

【0989】

Ｆ１０．前記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞である、実施形態Ｆ１〜Ｆ７のいずれか１つに記載のＴ細胞。

【0990】

Ｆ１０．１．前記Ｔ細胞が、単離されたＴ細胞である、実施形態Ｆ１〜Ｆ１０のいずれか１つに記載のＴ細胞。

【0991】

Ｆ１１．前記核酸が、ウイルスベクター内に含まれている、実施形態Ｆ１〜Ｆ３またはＦ７〜Ｆ１０．１のいずれか１つに記載のＴ細胞。

【0992】

Ｆ１２．前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、実施形態Ｆ１１に記載のＴ細胞。

【0993】

Ｆ１３．前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、実施形態Ｆ１１に記載のＴ細胞。

【0994】

Ｆ１４．前記レトロウイルスベクターが、図３６のプラスミドベクターを用いて作製される、実施形態Ｆ１３に記載のＴ細胞。

【0995】

Ｆ１５．前記核酸が、プラスミド内に含まれている、実施形態Ｆ１〜Ｆ３またはＦ７〜Ｆ１０．１のいずれか１つに記載のＴ細胞。

【0996】

Ｆ１６．保留。

【0997】

Ｆ１７．前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態Ｆ１〜Ｆ１６のいずれか１つに記載のＴ細胞。

【0998】

Ｆ１８．前記ＭｙＤ８８ポリペプチドが、ＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドである、実施形態Ｆ１〜Ｆ２またはＦ４〜Ｆ１８のいずれか１つに記載のＴ細胞。

【0999】

Ｆ１９．前記ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態１８に記載のＴ細胞。

【1000】

Ｆ２０．前記ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号４の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ｆ１８またはＦ１９に記載のＴ細胞。

【1001】

Ｆ２１．保留。

【1002】

Ｆ２２．前記腫瘍抗原が、前立腺がん抗原である、実施形態Ｆ４に記載のＴ細胞。

【1003】

Ｆ２３．前記腫瘍抗原が、前立腺特異的膜抗原である、実施形態Ｆ２２に記載のＴ細胞。

【1004】

Ｆ２４．前記膜標的化領域が、レセプターのミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域および膜貫通配列からなる群より選択される、実施形態Ｆ１〜Ｆ２３のいずれか１つに記載のＴ細胞。

【1005】

Ｆ２５．前記膜標的化領域が、ミリストイル化領域である、実施形態Ｆ２４に記載のＴ細胞。

【1006】

Ｆ２６．前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、可動性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをタンデムで含む一本鎖抗体およびそれらの変異された配列からなる群より選択される、実施形態Ｆ１〜Ｆ２５のいずれか１つに記載のＴ細胞。

【1007】

Ｆ２７．前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ｆ２６に記載のＴ細胞。

【1008】

Ｆ２８．前記ＦＫＢＰ１２領域が、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｆ２７に記載のＴ細胞。

【1009】

Ｆ２９．前記ＦＫＢＰ領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、実施形態Ｆ２６に記載のＴ細胞。

【1010】

Ｆ３０．前記多量体化領域に結合することができる多量体リガンドを含む組成物中の、実施形態Ｆ１〜Ｆ２９のいずれか１つに記載のＴ細胞。

【1011】

Ｆ３０．１．前記多量体リガンドが、ＦＫ５０６二量体または二量体のＦＫ５０６アナログリガンドである、実施形態Ｆ３０に記載のＴ細胞。

【1012】

Ｆ３１．前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ｆ３０．１に記載のＴ細胞。

【1013】

Ｆ３２．前記ＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域が、配列番号９の細胞質領域のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｆ２〜Ｆ３またはＦ５〜Ｆ３１のいずれか１つに記載のＴ細胞。

【1014】

Ｆ３３．前記ＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域が、配列番号８におけるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ｆ２〜Ｆ３またはＦ５〜Ｆ３１のいずれか１つに記載のＴ細胞。

【1015】

Ｆ３４．〜Ｆ３５．保留。

【1016】

Ｆ３６．前記多量体化領域が、配列番号１１のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｆ１〜Ｆ３５のいずれか１つに記載のＴ細胞。

【1017】

Ｆ３７．前記多量体化領域が、配列番号１０におけるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ｆ１〜Ｆ３６のいずれか１つに記載のＴ細胞。

【1018】

Ｆ３７．１．前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｆ３６に記載の方法。

【1019】

Ｆ３７．２．前記多量体化領域が、配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｆ３７に記載の方法。

【1020】

Ｆ３７．３．前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｆ３７．１に記載の方法。

【1021】

Ｆ３７．４．前記多量体化領域が、配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｆ３７．２に記載の方法。

【1022】

Ｆ３８．前記膜標的化領域が、ミリストイル化領域である、実施形態Ｆ１〜Ｆ３７のいずれか１つに記載のＴ細胞。

【1023】

Ｆ３９．前記ミリストイル化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｆ３８に記載のＴ細胞。

【1024】

Ｆ４０．前記ミリストイル化領域が、配列番号２におけるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ｆ３８に記載のＴ細胞。

【1025】

Ｆ４１．前記Ｔ細胞が、ヒトＴ細胞である、実施形態Ｆ１〜Ｆ３９のいずれか１つに記載のＴ細胞。

【1026】

Ｇ１．被験体における腫瘍抗原に対して免疫応答を誘導する方法であって、実施形態Ｆ１〜Ｆ１４のいずれか１つに記載のＴ細胞を被験体に投与する工程を含む、方法。

【1027】

Ｇ２．被験体における腫瘍サイズを減少させる方法であって、実施形態Ｆ１〜Ｆ４１のいずれか１つに記載のＴ細胞を被験体に投与する工程を含む、方法。

【1028】

Ｇ３．前記腫瘍が、前立腺がん腫瘍である、実施形態Ｇ２に記載の方法。

【1029】

Ｇ４．被験体における前立腺がんを処置する方法であって、その方法は、実施形態Ｆ１〜Ｆ４１のいずれか１つに記載のＴ細胞を被験体に投与する工程を含み、前記腫瘍抗原は、前立腺がん抗原である、方法。

【1030】

Ｇ５．前記腫瘍抗原が、ＰＳＭＡである、実施形態Ｇ４に記載の方法。

【1031】

Ｇ６．前記被験体が、ヒトである、実施形態Ｇ１〜Ｇ５のいずれか１つに記載の方法。

【1032】

Ｇ７．前記被験体が、前立腺がんを有する、実施形態Ｇ１〜Ｇ６のいずれか１つに記載の方法。

【1033】

Ｇ８．前記Ｔ細胞が、前記被験体に前記Ｔ細胞を投与する前に、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドとエキソビボにおいて接触される、実施形態Ｇ１〜Ｇ７のいずれか１つに記載の方法。

【1034】

Ｇ９．前記多量体リガンドを前記被験体に投与する工程をさらに含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ８のいずれか１つに記載の方法。

【1035】

Ｇ１０．前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ｇ９に記載の方法。

【1036】

Ｇ１１．前記Ｔ細胞を投与する前および／または投与した後に前記腫瘍のサイズを測定する工程を含む、実施形態Ｇ２〜Ｇ１０に記載の方法。

【1037】

Ｇ１２．前記Ｔ細胞を投与する前および／または投与した後に前記被験体の血清ＰＳＡレベルを決定する工程を含む、実施形態Ｇ２〜Ｇ１０に記載の方法。

【1038】

Ｇ１３．前記被験体が、７またはそれを超えるグリーソンスコアを有する前立腺がんを有する、実施形態Ｇ２〜Ｇ１２に記載の方法。

【1039】

Ｇ１４．前記被験体が、８またはそれを超えるグリーソンスコアを有する前立腺がんを有する、実施形態Ｇ２〜Ｇ１２に記載の方法。

【1040】

Ｇ１５．前記Ｔ細胞を投与する前および／または投与した後に腫瘍血管構造のレベルを測定する工程を含む、実施形態Ｇ２〜Ｇ１０に記載の方法。

【1041】

Ｈ１．被験体におけるＴ細胞を活性化するための方法であって、その方法は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸をその被験体に投与する工程を含み、ここで、そのキメラタンパク質は、
ａ）膜標的化領域、
ｂ）多量体化領域、および
ｃ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域
を含み、それによって、そのＴ細胞は活性化される、方法。

【1042】

Ｈ２．被験体におけるＴ細胞を活性化するための方法であって、その方法は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸をその被験体に投与する工程を含み、ここで、そのキメラタンパク質は、
ａ）膜標的化領域、
ｂ）多量体化領域、
ｃ）ＭｙＤ８８ポリペプチド、および
ｄ）ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域であって、ここで、そのＣＤ４０ポリペプチドは、機能的な細胞外ドメインを有しない、ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域
を含み、それによって、そのＴ細胞は活性化される、方法。

【1043】

Ｈ３．被験体におけるＴ細胞を活性化するための方法であって、その方法は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸をその被験体に投与する工程を含み、ここで、そのキメラタンパク質は、
ａ）膜標的化領域、
ｂ）多量体化領域、および
ｃ）ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域であって、ここで、そのＣＤ４０ポリペプチドは、機能的な細胞外ドメインを有しない、ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域
を含み、それによって、そのＴ細胞は活性化される、方法。

【1044】

Ｈ４．被験体における腫瘍抗原に対して免疫応答を誘導する方法であって、実施形態Ｈ１〜Ｈ３のいずれか１つに記載の方法に従って核酸を被験体に投与する工程を含む、方法。

【1045】

Ｈ５．被験体における腫瘍サイズを減少させる方法であって、実施形態Ｈ１〜Ｈ３のいずれか１つに記載の方法に従って核酸を被験体に投与する工程を含む、方法。

【1046】

Ｈ６．前記腫瘍が、前立腺がん腫瘍である、実施形態Ｈ５に記載の方法。

【1047】

Ｈ７．被験体における前立腺がんを処置する方法であって、実施形態Ｈ１〜Ｈ３のいずれか１つに記載の方法に従って核酸を被験体に投与する工程を含み、前立腺がん抗原をコードする核酸を投与する工程をさらに含む、方法。

【1048】

Ｈ８．前記腫瘍抗原が、ＰＳＭＡである、実施形態Ｈ４に記載の方法。

【1049】

Ｈ６．前記被験体が、ヒトである、実施形態Ｈ１〜Ｈ５のいずれか１つに記載の方法。

【1050】

Ｈ７．前記被験体が、前立腺がんを有する、実施形態Ｈ１〜Ｈ６のいずれか１つに記載の方法。

【1051】

Ｈ８．前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与する工程をさらに含む、実施形態Ｈ１〜Ｈ７のいずれか１つに記載の方法。

【1052】

Ｈ９．前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ｈ８に記載の方法。

【1053】

Ｈ１０．前記Ｔ細胞を投与する前および／または投与した後に腫瘍のサイズを測定する工程を含む、実施形態Ｈ４〜Ｈ９に記載の方法。

【1054】

Ｈ１１．前記核酸を投与する前および／または投与した後に前記被験体の血清ＰＳＡレベルを決定する工程を含む、実施形態Ｈ４〜Ｈ１０に記載の方法。

【1055】

Ｈ１２．前記被験体が、７またはそれを超えるグリーソンスコアを有する前立腺がんを有する、実施形態Ｈ４〜Ｈ１１に記載の方法。

【1056】

Ｈ１３．前記被験体が、８またはそれを超えるグリーソンスコアを有する前立腺がんを有する、実施形態Ｈ４〜Ｈ１１に記載の方法。

【1057】

Ｈ１４．前記核酸を投与する前および／または投与した後に腫瘍血管構造のレベルを測定する工程を含む、実施形態Ｈ４〜Ｈ１３に記載の方法。

【1058】

実施例３０：さらなる代表的な実施形態
本技術のある特定の実施形態の例を、この後に提供する。

【1059】

Ａ１．細胞を活性化するための方法であって、ここで、その細胞は、樹状細胞またはＢ細胞ではなく、その方法は、
キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸でその細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入する工程を含み、ここで、そのキメラタンパク質は、
ａ）膜標的化領域、
ｂ）多量体化領域、および
ｃ）ＭｙＤ８８ポリペプチド
を含み、それによって、その細胞は活性化される、方法。

【1060】

Ｂ１．細胞を活性化するための方法であって、ここで、その細胞は、樹状細胞またはＢ細胞ではなく、その方法は、
キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸でその細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入する工程を含み、ここで、そのキメラタンパク質は、
ａ）膜標的化領域、
ｂ）多量体化領域、
ｃ）ＭｙＤ８８ポリペプチド、および
ｄ）ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域であって、ここで、そのＣＤ４０ポリペプチドは、機能的な細胞外ドメインを有しない、ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域
を含み、それによって、その細胞は活性化される、方法。

【1061】

Ｃ１．細胞を活性化するための方法であって、ここで、その細胞は、樹状細胞またはＢ細胞ではなく、その方法は、
キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸でその細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入する工程を含み、ここで、そのキメラタンパク質は、
ａ）膜標的化領域、
ｂ）多量体化領域、および
ｃ）ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域であって、ここで、そのＣＤ４０ポリペプチドは、機能的な細胞外ドメインを有しない、ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域
を含み、それによって、その細胞は活性化される、方法。

【1062】

Ｄ１．前記細胞が、ナチュラルキラー細胞である、実施形態Ａ１〜Ｃ１のいずれか１つに記載の方法。

【1063】

Ｄ２．前記細胞が、非リンパ球性造血細胞である、実施形態Ａ１〜Ｃ１のいずれか１つに記載の方法。

【1064】

Ｄ２．１．前記細胞が、非造血細胞である、実施形態Ａ１〜Ｃ１のいずれか１つに記載の方法。

【1065】

Ｄ３．前記細胞が、マクロファージである、実施形態Ａ１〜Ｃ１のいずれか１つに記載の方法。

【1066】

Ｄ４．前記細胞が、ミエローマ細胞である、実施形態Ａ１〜Ｃ１のいずれか１つに記載の方法。

【1067】

Ｄ４．１．前記細胞が、ケラチノサイトまたは線維芽細胞である、実施形態Ａ１〜Ｃ１のいずれか１つに記載の方法。

【1068】

Ｄ５．多量体化領域に結合するリガンドと前記細胞を接触させることにより多量体化をもたらし、それによって、その細胞が活性化される工程を含む、実施形態Ａ１〜Ｄ４．１のいずれか１つに記載の方法。

【1069】

Ｄ６．前記核酸が、ウイルスベクター内に含まれている、実施形態Ａ１〜Ｄ５のいずれか１つに記載の方法。

【1070】

Ｄ７．前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、実施形態Ｄ６に記載の方法。

【1071】

Ｄ８．前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、実施形態Ｄ６に記載の方法。

【1072】

Ｄ８．１．前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、実施形態Ｄ６に記載の方法。

【1073】

Ｄ９．前記レトロウイルスベクターが、図３６のプラスミドベクターを用いて作製される、実施形態Ｄ８に記載の方法。

【1074】

Ｄ１０．前記核酸が、プラスミド内に含まれている、実施形態Ａ１〜Ｄ５のいずれか１つに記載の方法。

【1075】

Ｄ１１．前記核酸が、プラスミド内またはウイルス内に含まれていない、実施形態Ｄ１０に記載の方法。

【1076】

Ｄ１２．前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態Ａ１〜Ｄ１０のいずれか１つに記載の方法。

【1077】

Ｄ１３．前記ＭｙＤ８８ポリペプチドが、ＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドである、実施形態Ａ１、Ｂ１またはＤ１〜Ｄ１２のいずれか１つに記載の方法。

【1078】

Ｄ１４．前記ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｄ１３に記載の方法。

【1079】

Ｄ１５．前記ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号４の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ｄ１３またはＤ１４に記載の方法。

【1080】

Ｄ１６．腫瘍抗原を標的化するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含む核酸で前記細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入する工程をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ｄ１５のいずれか１つに記載の方法。

【1081】

Ｄ１７．前記標的化された腫瘍抗原が、前立腺がん抗原である、実施形態Ｄ１６のいずれか１つに記載の方法。

【1082】

Ｄ１８．前記標的化された腫瘍抗原が、前立腺特異的膜抗原である、実施形態Ｄ１６のいずれか１つに記載の方法。

【1083】

Ｄ１９．前記膜標的化領域が、レセプターのミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域および膜貫通配列からなる群より選択される、実施形態Ａ１〜Ｄ１８のいずれか１つに記載の方法。

【1084】

Ｄ２０．前記膜標的化領域が、ミリストイル化領域である、実施形態Ｄ１９に記載の方法。

【1085】

Ｄ２１．前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、可動性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをタンデムで含む一本鎖抗体およびそれらの変異された配列からなる群より選択されるリガンド結合領域である、実施形態Ａ１〜Ｄ２０のいずれか１つに記載の方法。

【1086】

Ｄ２２．前記リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ｄ２１に記載の方法。

【1087】

Ｄ２３．前記ＦＫＢＰ１２領域が、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｄ２２に記載の方法。

【1088】

Ｄ２４．前記ＦＫＢＰ領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、実施形態Ｄ２１に記載の方法。

【1089】

Ｄ２５．前記リガンドが、ＦＫ５０６二量体または二量体のＦＫ５０６アナログリガンドである、実施形態Ｄ５〜Ｄ２４のいずれか１つに記載の方法。

【1090】

Ｄ２６．前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ｄ２５に記載の方法。

【1091】

Ｄ２７．前記ＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域が、配列番号９の細胞質領域のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ａ１〜Ｄ２６のいずれか１つに記載の方法。

【1092】

Ｄ２８．前記ＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域が、配列番号８におけるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ｂ１〜Ｄ２７のいずれか１つに記載の方法。

【1093】

Ｄ２９〜Ｄ３０．保留。

【1094】

Ｄ３１．前記多量体化領域が、配列番号１１のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ａ１〜Ｄ２９のいずれか１つに記載の方法。

【1095】

Ｄ３２．前記多量体化領域が、配列番号１０におけるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ａ１〜Ｄ３０のいずれか１つに記載の方法。

【1096】

Ｄ３３．前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｄ３１に記載の方法。

【1097】

Ｄ３３．１．前記多量体化領域が、配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｄ３１に記載の方法。

【1098】

Ｄ３３．１．前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｄ３１に記載の方法。

【1099】

Ｄ３３．２．前記多量体化領域が、配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｄ３１に記載の方法。

【1100】

Ｄ３３．３．前記多量体化領域が、配列番号１１もしくは配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｄ３３．１またはＤ３３．２に記載の方法。

【1101】

Ｄ３３．４．前記多量体化領域が、配列番号１０もしくは配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｄ３３．１またはＤ３３．２に記載の方法。

【1102】

Ｄ３４．前記膜標的化領域が、ミリストイル化領域である、実施形態Ａ１〜Ｄ３３．２４のいずれか１つに記載の方法。

【1103】

Ｄ３５．前記ミリストイル化領域が、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｄ３４に記載の方法。

【1104】

Ｄ３６．前記ミリストイル化領域が、配列番号２におけるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ｄ３４に記載の方法。

【1105】

Ｄ３７．前記細胞が、ヒト細胞である、実施形態Ａ１〜Ｄ３６のいずれか１つに記載の方法。

【1106】

Ｄ３８．前記細胞が、インビボにおいて前記多量体リガンドと接触される、実施形態Ｄ１〜Ｄ３７のいずれか１つに記載の方法。

【1107】

Ｅ１．被験体における腫瘍抗原に対して免疫応答を誘導する方法であって、実施形態Ａ１〜Ｄ３７のいずれか１つに記載の方法に従って細胞を活性化する工程およびその活性化された細胞を被験体に投与する工程を含む、方法。

【1108】

Ｅ２．被験体における表面腫瘍抗原を有する腫瘍のサイズを減少させる方法であって、実施形態Ａ１〜Ｄ３７のいずれか１つに記載の方法に従って細胞を活性化する工程を含む、方法。

【1109】

Ｅ３．前記腫瘍が、前立腺がん腫瘍である、実施形態Ｅ２に記載の方法。

【1110】

Ｅ３．被験体における前立腺がんを処置する方法であって、その方法は、実施形態Ａ１〜Ｄ３７のいずれか１つに記載の方法に従って細胞を活性化する工程であって、ここで、前記腫瘍抗原は、前立腺がん抗原である、工程、およびその活性化された細胞を被験体に投与する工程を含む、方法。

【1111】

Ｅ４．前記腫瘍抗原が、ＰＳＭＡである、実施形態Ｅ３に記載の方法。

【1112】

Ｅ５．前記被験体が、ヒトである、実施形態Ｅ１〜Ｅ４のいずれか１つに記載の方法。

【1113】

Ｅ６．前記被験体が、前立腺がんを有する、実施形態Ｅ１〜Ｅ５のいずれか１つに記載の方法。

【1114】

Ｅ７．前記細胞が、インビボにおいて前記多量体リガンドと接触される、実施形態Ｅ１〜Ｅ６のいずれか１つに記載の方法。

【1115】

Ｅ８．前記多量体リガンドを前記被験体に投与する工程を含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ７のいずれか１つに記載の方法。

【1116】

Ｅ９．前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ｅ８に記載の方法。

【1117】

Ｅ１０．前記細胞を投与する前および／または投与した後に前記腫瘍のサイズを測定する工程を含む、実施形態Ｅ２〜Ｅ９のいずれかに記載の方法。

【1118】

Ｅ１１．前記細胞を投与する前および／または投与した後に前記被験体の血清ＰＳＡレベルを決定する工程を含む、実施形態Ｅ２〜Ｅ９のいずれか１つに記載の方法。

【1119】

Ｅ１２．前記被験体が、７またはそれを超えるグリーソンスコアを有する前立腺がんを有する、実施形態Ｅ２〜Ｅ１１のいずれか１つに記載の方法。

【1120】

Ｅ１３．前記被験体が、８またはそれを超えるグリーソンスコアを有する前立腺がんを有する、実施形態Ｅ２〜Ｅ１１のいずれか１つに記載の方法。

【1121】

Ｆ１．キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細胞であって、ここで、そのキメラタンパク質は、
ａ）膜標的化領域、
ｂ）多量体化領域、および
ｃ）ＭｙＤ８８ポリペプチド
を含む、細胞。

【1122】

Ｆ２．キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細胞であって、ここで、そのキメラタンパク質は、
ａ）膜標的化領域、
ｂ）多量体化領域、
ｃ）ＭｙＤ８８ポリペプチド、および
ｄ）ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域であって、ここで、そのＣＤ４０ポリペプチドは、機能的な細胞外ドメインを有しない、ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域
を含み、ここで、その細胞は、樹状細胞またはＢ細胞ではない、細胞。

【1123】

Ｆ３．キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細胞であって、ここで、そのキメラタンパク質は、
ａ）膜標的化領域、
ｂ）多量体化領域、および
ｃ）ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域であって、ここで、そのＣＤ４０ポリペプチドは、機能的な細胞外ドメインを有しない、ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域
を含む、細胞。

【1124】

Ｆ４．腫瘍抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸をさらに含む、実施形態Ｆ１〜Ｆ３のいずれか１つに記載の細胞。

【1125】

Ｆ５．前記細胞が、ナチュラルキラー細胞である、実施形態Ｆ１〜Ｆ４のいずれか１つに記載の細胞。

【1126】

Ｆ６．前記細胞が、非リンパ球性造血細胞である、実施形態Ｆ１〜Ｆ４のいずれか１つに記載の細胞。

【1127】

Ｆ７．前記細胞が、非造血細胞である、実施形態Ｆ１〜Ｆ４のいずれか１つに記載の細胞。

【1128】

Ｆ８．前記細胞が、マクロファージである、実施形態Ｆ１〜Ｆ４のいずれか１つに記載の細胞。

【1129】

Ｆ９．前記細胞が、ケラチノサイトである、実施形態Ｆ１〜Ｆ４のいずれか１つに記載の細胞。

【1130】

Ｆ１０．前記細胞が、線維芽細胞である、実施形態Ｆ１〜Ｆ４のいずれか１つに記載の細胞。

【1131】

Ｆ１０．１．前記細胞が、メラノーマ細胞である、実施形態Ｆ１〜Ｆ４のいずれか１つに記載の細胞。

【1132】

Ｆ１１．前記核酸が、ウイルスベクター内に含まれている、実施形態Ｆ１〜Ｆ３またはＦ７〜Ｆ１０．１のいずれか１つに記載の細胞。

【1133】

Ｆ１２．前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、実施形態Ｆ１１に記載の細胞。

【1134】

Ｆ１３．前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、実施形態Ｆ１１に記載の細胞。

【1135】

Ｆ１４．前記レトロウイルスベクターが、図３６のプラスミドベクターを用いて作製される、実施形態Ｆ１３に記載の細胞。

【1136】

Ｆ１５．前記核酸が、プラスミド内に含まれている、実施形態Ｆ１〜Ｆ３またはＦ７〜Ｆ１０．１のいずれか１つに記載の細胞。

【1137】

Ｆ１６．保留。

【1138】

Ｆ１７．前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態Ｆ１〜Ｆ１６のいずれか１つに記載の細胞。

【1139】

Ｆ１８．前記ＭｙＤ８８ポリペプチドが、ＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドである、実施形態Ｆ１〜Ｆ２またはＦ４〜Ｆ１８のいずれか１つに記載の細胞。

【1140】

Ｆ１９．前記ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態１８に記載の細胞。

【1141】

Ｆ２０．前記ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号４の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ｆ１８またはＦ１９に記載の細胞。

【1142】

Ｆ２１．保留。

【1143】

Ｆ２２．前記腫瘍抗原が、前立腺がん抗原である、実施形態Ｆ４に記載の細胞。

【1144】

Ｆ２３．前記腫瘍抗原が、前立腺特異的膜抗原である、実施形態Ｆ２２に記載の細胞。

【1145】

Ｆ２４．前記膜標的化領域が、レセプターのミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域および膜貫通配列からなる群より選択される、実施形態Ｆ１〜Ｆ２３のいずれか１つに記載の細胞。

【1146】

Ｆ２５．前記膜標的化領域が、ミリストイル化領域である、実施形態Ｆ２４に記載の細胞。

【1147】

Ｆ２６．前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、可動性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをタンデムで含む一本鎖抗体およびそれらの変異された配列からなる群より選択される、実施形態Ｆ１〜Ｆ２５のいずれか１つに記載の細胞。

【1148】

Ｆ２７．前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ｆ２６に記載の細胞。

【1149】

Ｆ２８．前記ＦＫＢＰ１２領域が、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｆ２７に記載の細胞。

【1150】

Ｆ２９．前記ＦＫＢＰ領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、実施形態Ｆ２６に記載の細胞。

【1151】

Ｆ３０．前記多量体化領域に結合することができる多量体リガンドを含む組成物中の、実施形態Ｆ１〜Ｆ２９のいずれか１つに記載の細胞。

【1152】

Ｆ３０．１．前記多量体リガンドが、ＦＫ５０６二量体または二量体のＦＫ５０６アナログリガンドである、実施形態Ｆ３０に記載の細胞。

【1153】

Ｆ３１．前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ｆ３０．１に記載の細胞。

【1154】

Ｆ３２．前記ＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域が、配列番号９の細胞質領域のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｆ２〜Ｆ３またはＦ５〜Ｆ３１のいずれか１つに記載の細胞。

【1155】

Ｆ３３．前記ＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域が、配列番号８におけるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ｆ２〜Ｆ３またはＦ５〜Ｆ３１のいずれか１つに記載の細胞。

【1156】

Ｆ３４〜Ｆ３５．保留。

【1157】

Ｆ３６．前記多量体化領域が、配列番号１１のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｆ１〜Ｆ３５のいずれか１つに記載の細胞。

【1158】

Ｆ３７．前記多量体化領域が、配列番号１０におけるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ｆ１〜Ｆ３６のいずれか１つに記載の細胞。

【1159】

Ｆ３７．１．前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｆ３６に記載の方法。

【1160】

Ｆ３７．２．前記多量体化領域が、配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｆ３７に記載の方法。

【1161】

Ｆ３７．３．前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｆ３７．１に記載の方法。

【1162】

Ｆ３７．４．前記多量体化領域が、配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｆ３７．２に記載の方法。

【1163】

Ｆ３８．前記膜標的化領域が、ミリストイル化領域である、実施形態Ｆ１〜Ｆ３７のいずれか１つに記載の細胞。

【1164】

Ｆ３９．前記ミリストイル化領域が、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｆ３８に記載の細胞。

【1165】

Ｆ４０．前記ミリストイル化領域が、配列番号２におけるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ｆ３８に記載の細胞。

【1166】

Ｆ４１．前記細胞が、ヒト細胞である、実施形態Ｆ１〜Ｆ３９のいずれか１つに記載の細胞。

【1167】

Ｇ１．被験体における腫瘍抗原に対して免疫応答を誘導する方法であって、実施形態Ｆ１〜Ｆ１４のいずれか１つに記載の細胞を被験体に投与する工程を含む、方法。

【1168】

Ｇ２．被験体における腫瘍サイズを減少させる方法であって、実施形態Ｆ１〜Ｆ４１のいずれか１つに記載の細胞を被験体に投与する工程を含む、方法。

【1169】

Ｇ３．前記腫瘍が、前立腺がん腫瘍である、実施形態Ｇ２に記載の方法。

【1170】

Ｇ４．被験体における前立腺がんを処置する方法であって、その方法は、実施形態Ｆ１〜Ｆ４１のいずれか１つに記載の細胞を被験体に投与する工程を含み、前記腫瘍抗原は、前立腺がん抗原である、方法。

【1171】

Ｇ５．前記腫瘍抗原が、ＰＳＭＡである、実施形態Ｇ４に記載の方法。

【1172】

Ｇ６．前記被験体が、ヒトである、実施形態Ｇ１〜Ｇ５のいずれか１つに記載の方法。

【1173】

Ｇ７．前記被験体が、前立腺がんを有する、実施形態Ｇ１〜Ｇ６のいずれか１つに記載の方法。

【1174】

Ｇ８．前記細胞が、前記被験体にその細胞を投与する前に、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドとエキソビボにおいて接触される、実施形態Ｇ１〜Ｇ７のいずれか１つに記載の方法。

【1175】

Ｇ９．前記多量体リガンドを前記被験体に投与する工程をさらに含む、実施形態Ｇ１〜Ｇ８のいずれか１つに記載の方法。

【1176】

Ｇ１０．前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ｇ９に記載の方法。

【1177】

Ｇ１１．前記細胞を投与する前および／または投与した後に前記腫瘍のサイズを測定する工程を含む、実施形態Ｇ２〜Ｇ１０に記載の方法。

【1178】

Ｇ１２．前記細胞を投与する前および／または投与した後に前記被験体の血清ＰＳＡレベルを決定する工程を含む、実施形態Ｇ２〜Ｇ１０に記載の方法。

【1179】

Ｇ１３．前記被験体が、７またはそれを超えるグリーソンスコアを有する前立腺がんを有する、実施形態Ｇ２〜Ｇ１２に記載の方法。

【1180】

Ｇ１４．前記被験体が、８またはそれを超えるグリーソンスコアを有する前立腺がんを有する、実施形態Ｇ２〜Ｇ１２に記載の方法。

【1181】

Ｇ１５．前記細胞を投与する前および／または投与した後に腫瘍血管構造のレベルを測定する工程を含む、実施形態Ｇ２〜Ｇ１０に記載の方法。

【1182】

Ｈ１．被験体における細胞を活性化するための方法であって、その方法は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸をその被験体に投与する工程を含み、ここで、そのキメラタンパク質は、
ａ）膜標的化領域、
ｂ）多量体化領域、および
ｃ）ＭｙＤ８８ポリペプチド
を含み、それによって、その細胞は活性化され、ここで、その細胞は、樹状細胞またはＢ細胞ではない、方法。

【1183】

Ｈ２．被験体における細胞を活性化するための方法であって、その方法は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸をその被験体に投与する工程を含み、ここで、そのキメラタンパク質は、
ａ）膜標的化領域、
ｂ）多量体化領域、
ｃ）ＭｙＤ８８ポリペプチド、および
ｄ）ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域であって、ここで、そのＣＤ４０ポリペプチドは、機能的な細胞外ドメインを有しない、ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域
を含み、それによって、その細胞は活性化される、方法。

【1184】

Ｈ３．被験体における細胞を活性化するための方法であって、その方法は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸をその被験体に投与する工程を含み、ここで、そのキメラタンパク質は、
ａ）膜標的化領域、
ｂ）多量体化領域、および
ｃ）ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域であって、ここで、そのＣＤ４０ポリペプチドは、機能的な細胞外ドメインを有しない、ＣＤ４０ポリペプチド細胞質領域
を含み、それによって、その細胞は活性化される、方法。

【1185】

Ｈ４．実施形態Ｈ１〜Ｈ３のいずれか１つに記載の方法に従って核酸を被験体に投与する工程を含む、被験体における腫瘍抗原に対して免疫応答を誘導する方法。

【1186】

Ｈ５．実施形態Ｈ１〜Ｈ３のいずれか１つに記載の方法に従って核酸を被験体に投与する工程を含む、被験体における腫瘍サイズを減少させる方法。

【1187】

Ｈ６．前記腫瘍が、前立腺がん腫瘍である、実施形態Ｈ５に記載の方法。

【1188】

Ｈ７．被験体における前立腺がんを処置する方法であって、実施形態Ｈ１〜Ｈ３のいずれか１つに記載の方法に従って核酸を被験体に投与する工程を含み、前立腺がん抗原をコードする核酸を投与する工程をさらに含む、方法。

【1189】

Ｈ８．前記腫瘍抗原が、ＰＳＭＡである、実施形態Ｈ４に記載の方法。

【1190】

Ｈ６．前記被験体が、ヒトである、実施形態Ｈ１〜Ｈ５のいずれか１つに記載の方法。

【1191】

Ｈ７．前記被験体が、前立腺がんを有する、実施形態Ｈ１〜Ｈ６のいずれか１つに記載の方法。

【1192】

Ｈ８．前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与する工程をさらに含む、実施形態Ｈ１〜Ｈ７のいずれか１つに記載の方法。

【1193】

Ｈ９．前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ｈ８に記載の方法。

【1194】

Ｈ１０．前記細胞を投与する前および／または投与した後に前記腫瘍のサイズを測定する工程を含む、実施形態Ｈ４〜Ｈ９に記載の方法。

【1195】

Ｈ１１．前記核酸を投与する前および／または投与した後に前記被験体の血清ＰＳＡレベルを決定する工程を含む、実施形態Ｈ４〜Ｈ１０に記載の方法。

【1196】

Ｈ１２．前記被験体が、７またはそれを超えるグリーソンスコアを有する前立腺がんを有する、実施形態Ｈ４〜Ｈ１１に記載の方法。

【1197】

Ｈ１３．前記被験体が、８またはそれを超えるグリーソンスコアを有する前立腺がんを有する、実施形態Ｈ４〜Ｈ１１に記載の方法。

【1198】

Ｈ１４．前記核酸を投与する前および／または投与した後に腫瘍血管構造のレベルを測定する工程を含む、実施形態Ｈ４〜Ｈ１３に記載の方法。

【1199】

Ｈ１５．前記細胞が、ナチュラルキラー細胞である、実施形態Ｈ１〜Ｈ１４のいずれか１つに記載の方法。

【1200】

Ｈ１６．前記細胞が、非リンパ球性造血細胞である、実施形態Ｈ１〜Ｈ１４のいずれか１つに記載の方法。

【1201】

Ｈ１７．前記細胞が、非造血細胞である、実施形態Ｈ１〜Ｈ１４のいずれか１つに記載の方法。

【1202】

Ｈ１８．前記細胞が、マクロファージである、実施形態Ｈ１〜Ｈ１４のいずれか１つに記載の方法。

【1203】

Ｈ１９．前記細胞が、ケラチノサイトである、実施形態Ｈ１〜Ｈ１４のいずれか１つに記載の方法。

【1204】

Ｈ２０．前記細胞が、線維芽細胞である、実施形態Ｈ１〜Ｈ１４のいずれか１つに記載の方法。

【1205】

Ｈ２１．前記細胞が、メラノーマ細胞である、実施形態Ｈ１〜Ｈ１４のいずれか１つに記載の方法。

【1206】

Ｊ１．誘導可能なキメラシグナル伝達分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む組成物を形質導入されたまたはトランスフェクトされた細胞であって、ここで、その誘導可能なキメラシグナル伝達分子は、膜標的化領域、多量体化領域、およびＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドを含む、細胞。

【1207】

Ｊ１．１．前記誘導可能なキメラシグナル伝達分子が、細胞外ドメインを欠く細胞質ＣＤ４０ポリペプチドをさらに含む、実施形態Ｊ１に記載の細胞。

【1208】

Ｊ１．２．誘導可能なキメラシグナル伝達分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む組成物を形質導入されたまたはトランスフェクトされた細胞であって、ここで、その誘導可能なキメラシグナル伝達分子が、膜標的化領域、多量体化領域、および細胞外ドメインを欠く細胞質ＣＤ４０ポリペプチドを含む、細胞。

【1209】

Ｊ２．前記切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｊ１またはＪ１．２のいずれかに記載の細胞。

【1210】

Ｊ２．１．前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｊ１．１またはＪ１．２のいずれかに記載の細胞。

【1211】

Ｊ３．前記膜標的化領域が、ミリストイル化標的化配列である、実施形態Ｊ１〜Ｊ２．１のいずれかに記載の細胞。

【1212】

Ｊ４〜Ｊ６．保留。

【1213】

Ｊ７．前記誘導可能なキメラシグナル伝達分子が、ＣＤ３ζポリペプチドをさらに含む、実施形態Ｊ１〜Ｊ３のいずれか１つに記載の細胞。

【1214】

Ｊ８．前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニットおよびそれらの変異された配列からなる群より選択される、実施形態Ｊ１〜Ｊ７のいずれか１つに記載の細胞。

【1215】

Ｊ９．前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ｊ１〜Ｊ８のいずれか１つに記載の細胞。

【1216】

Ｊ１０．前記ＦＫＢＰ１２領域が、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｊ１〜Ｊ９のいずれか１つに記載の細胞。

【1217】

Ｊ１１．前記多量体化領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、実施形態Ｊ１〜Ｊ８のいずれか１つに記載の細胞。

【1218】

Ｊ１２．前記多量体化領域が、ＦＫ５０６二量体および二量体のＦＫ５０６アナログリガンドからなる群より選択されるリガンドに結合する、実施形態Ｊ１〜Ｊ８のいずれか１つに記載の細胞。

【1219】

Ｊ１３．前記リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｊ１〜Ｊ１２のいずれか１つに記載の細胞。

【1220】

Ｊ１４．前記多量体化領域が、配列番号１１のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｊ１〜Ｊ１３のいずれか１つに記載の細胞。

【1221】

Ｊ１５．前記多量体化領域が、配列番号１０におけるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ｊ１〜Ｊ１４のいずれか１つに記載の細胞。

【1222】

Ｊ１６．前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｊ１４に記載の細胞。

【1223】

Ｊ１７．前記多量体化領域が、配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｊ１５に記載の細胞。

【1224】

Ｊ１８．前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｊ１４またはＪ１６に記載の細胞。

【1225】

Ｊ１９．前記多量体化領域が、配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｊ１５またはＪ１７に記載の細胞。

【1226】

Ｊ２０．前記多量体化領域が、配列番号１１もしくは配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｊ１４、Ｊ１６またはＪ１８のいずれか１つに記載の細胞。

【1227】

Ｊ２１．前記多量体化領域が、配列番号１０もしくは配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｊ１５、Ｊ１７またはＪ１９のいずれか１つに記載の細胞。

【1228】

Ｊ２２．前記核酸が、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター配列を含む、実施形態Ｊ１〜Ｊ２１のいずれか１つに記載の細胞。

【1229】

Ｊ２３．前記核酸が、ウイルスベクター内に含まれている、実施形態Ｊ１〜Ｊ２２のいずれか１つに記載の細胞。

【1230】

Ｊ２４．前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、実施形態Ｊ２３に記載の細胞。

【1231】

Ｊ２５．前記レトロウイルスベクターが、マウス白血病ウイルスベクターである、実施形態Ｊ２４に記載の細胞。

【1232】

Ｊ２６．前記レトロウイルスベクターが、ＳＦＧベクターである、実施形態Ｊ２４に記載の細胞。

【1233】

Ｊ２７．前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、実施形態Ｊ２３に記載の細胞。

【1234】

Ｊ２８．前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、実施形態Ｊ２３に記載の細胞。

【1235】

Ｊ２９．前記核酸が、プラスミド内に含まれている、実施形態Ｊ１〜Ｊ２２のいずれか１つに記載の細胞。

【1236】

Ｊ３０．保留。

【1237】

Ｊ３１．前記細胞が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、実施形態Ｊ１〜Ｊ３０のいずれか１つに記載の細胞。

【1238】

Ｊ３２．前記細胞が、Ｔ細胞である、実施形態Ｊ３１に記載の細胞。

【1239】

Ｊ３３．前記細胞が、骨髄から得られるかまたは調製される、実施形態Ｊ１〜Ｊ３２のいずれか１つに記載の細胞。

【1240】

Ｊ３４．前記細胞が、臍帯血から得られるかまたは調製される、実施形態Ｊ１〜Ｊ３２のいずれか１つに記載の細胞。

【1241】

Ｊ３５．前記細胞が、末梢血から得られるかまたは調製される、実施形態Ｊ１〜Ｊ３２のいずれか１つに記載の細胞。

【1242】

Ｊ３６．前記細胞が、末梢血単核球から得られるかまたは調製される、実施形態Ｊ１〜Ｊ３２のいずれか１つに記載の細胞。

【1243】

Ｊ３７．前記細胞が、ヒト細胞である、実施形態Ｊ３１〜Ｊ３６のいずれか１つに記載の細胞。

【1244】

Ｊ３８．前記細胞が、シグナルペプチド、一本鎖可変フラグメント、ＣＨ２−ＣＨ３ヒンジ領域およびＣＤ３ζポリペプチドを含む誘導可能なキメラシグナル伝達分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸でさらに形質転換されるかまたは形質導入される、実施形態Ｊ１〜Ｊ３７のいずれか１つに記載の細胞。

【1245】

Ｊ３８．１．前記誘導可能なキメラシグナル伝達分子が、ＣＤ３ζポリペプチドを含まない、実施形態Ｊ３８に記載の細胞。

【1246】

Ｊ３８．２．前記誘導可能なキメラシグナル伝達分子が、ＣＤ３ζポリペプチドを含む、実施形態Ｊ３８またはＪ３８．１に記載の細胞。

【1247】

Ｊ３９．前記一本鎖可変フラグメントが、腫瘍細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｊ３８〜Ｊ３８．２のいずれか１つに記載の細胞。

【1248】

Ｊ４０．前記一本鎖可変フラグメントが、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｊ３８〜Ｊ３８．２のいずれか１つに記載の細胞。

【1249】

Ｊ４１．前記一本鎖可変フラグメントが、αＰＳＭＡ、αＰＳＣＡ、αＭＵＣ１、αＣＤ１９、αＲＯＲ１、αＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、αＧＤ２、αＣＤ１２３、αＭＵＣ１６およびαＨｅｒ２／Ｎｅｕ一本鎖可変フラグメントからなる群より選択される、実施形態Ｊ３８〜Ｊ４０のいずれか１つに記載の細胞。

【1250】

Ｊ４２．前記一本鎖可変フラグメントが、αＣＤ１９一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ｊ３８〜Ｊ４０のいずれかに記載の細胞。

【1251】

Ｊ４２．１．前記一本鎖可変フラグメントが、αＰＳＣＡ一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ｊ３８〜Ｊ４０のいずれかに記載の細胞。

【1252】

Ｊ４３．免疫応答を誘導するための方法であって、実施形態Ｊ１〜Ｊ４２．１に記載の細胞を、前記多量体化領域に結合するリガンドと接触させることによりその誘導可能なキメラシグナル伝達分子の多量体化をもたらす工程を含む、方法。

【1253】

Ｊ４４．前記細胞が、インビボにおいて前記リガンドと接触される、実施形態Ｊ４３に記載の方法。

【1254】

Ｊ４５．前記リガンドが、二量体である、実施形態Ｊ４３またはＪ４４に記載の方法。

【1255】

Ｊ４６．前記リガンドが、二量体のＦＫ５０６または二量体のＦＫ５０６様アナログである、実施形態Ｊ４５に記載の方法。

【1256】

Ｊ４７．前記リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｊ４５に記載の方法。

【1257】

Ｊ４８．前記トランスフェクトされたまたは形質導入された細胞を被験体に投与する工程をさらに含む、実施形態Ｊ４３〜Ｊ４７のいずれか１つに記載の方法。

【1258】

Ｊ４９．前記細胞が、静脈内投与によって前記被験体に投与される、実施形態Ｊ４８に記載の方法。

【1259】

Ｊ５０〜Ｊ５６．保留。

【1260】

Ｊ５６．前記被験体が、腫瘍と診断されている、実施形態Ｊ４３〜Ｊ４９のいずれか１つに記載の方法。

【1261】

Ｊ５７．前記被験体が、がんを有する、実施形態Ｊ４３〜Ｊ４９のいずれか１つに記載の方法。

【1262】

Ｊ５８．前記被験体が、固形腫瘍を有する、実施形態Ｊ４３〜Ｊ４９のいずれか１つに記載の方法。

【1263】

Ｊ５９．前記細胞が、腫瘍浸潤リンパ球またはＴ細胞である、実施形態Ｊ５８に記載の方法。

【1264】

Ｊ６０．前記細胞が、前記腫瘍床に送達される、実施形態Ｊ５８またはＪ５９に記載の方法。

【1265】

Ｊ６１．前記がんが、前記被験体の血液中または骨髄中に存在する、実施形態Ｊ５７に記載の方法。

【1266】

Ｊ６２．前記被験体が、血液疾患または骨髄疾患を有する、実施形態Ｊ４３〜Ｊ４９のいずれか１つに記載の方法。

【1267】

Ｊ６３．前記被験体が、任意の状態または幹細胞移植によって緩和され得る障害と診断されている、実施形態Ｊ４３〜Ｊ４９のいずれか１つに記載の方法。

【1268】

Ｊ６４．前記被験体が、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、実施形態Ｊ４３〜Ｊ４９のいずれか１つに記載の方法。

【1269】

Ｊ６５．前記患者が、原発性免疫不全障害、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＬＨ）または他の血球貪食障害、遺伝性骨髄不全障害、異常ヘモグロビン症、代謝障害および破骨細胞障害からなる群より選択される状態と診断されている、実施形態Ｊ４３〜Ｊ４９のいずれか１つに記載の方法。

【1270】

Ｊ６６．前記状態が、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＫ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンドブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスおよび大理石骨病からなる群より選択される、実施形態Ｊ４３〜Ｊ４９のいずれか１つに記載の方法。

【1271】

Ｊ６７．被験体における白血病を処置するための方法であって、実施形態Ｊ１〜Ｊ４２．１のいずれか１つに記載の細胞を投与する工程および多量体リガンドをその被験体に投与する工程を含む、方法。

【1272】

Ｊ６８．前記一本鎖可変フラグメントが、ＣＤ１９に結合する、実施形態Ｊ６７に記載の方法。

【1273】

Ｊ６９．前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｊ６７またはＪ６８に記載の方法。

【1274】

Ｊ７０．前記細胞が、Ｔ細胞である、実施形態Ｊ６７〜Ｊ６９のいずれかに記載の方法。

【1275】

Ｊ７１．前記被験体が、ヒトである、実施形態Ｊ４３〜Ｊ７０のいずれか１つに記載の方法。

【1276】

Ｊ７２．さらなる用量の前記多量体リガンドを前記被験体に投与するべきであるかを判定する工程をさらに含む、実施形態Ｊ４３〜Ｊ７１のいずれか１つに記載の方法。

【1277】

Ｊ７３．さらなる用量の前記多量体リガンドを前記被験体に投与する工程をさらに含み、ここで、前記疾患または状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検出される、実施形態Ｊ４３〜Ｊ７２のいずれか１つに記載の方法。

【1278】

Ｊ７４．実施形態１〜４２．１のいずれか１つに記載の細胞を投与する前に、前記被験体が、ある疾患または状態と診断されており、前記多量体リガンドを投与した後にその疾患または状態が検出され、さらなる用量の該多量体リガンドが、その被験体に投与される、実施形態Ｊ７３に記載の方法。

【1279】

Ｊ７５．被験体における状態または疾患の有無またはステージを特定する工程、および
その被験体において特定された状態または疾患の有無またはステージに基づいて、多量体結合領域に結合する多量体リガンドを投与する指示、その多量体リガンドのその後の投与量を維持する指示またはその患者に投与されるその多量体リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに含む、実施形態Ｊ４３〜Ｊ７４のいずれか１つに記載の方法。

【1280】

Ｊ７６．前記状態が、がんである、実施形態Ｊ７２〜Ｊ７５のいずれか１つに記載の方法。

【1281】

Ｊ７７．前記状態が、白血病である、実施形態Ｊ７２〜Ｊ７５のいずれか１つに記載の方法。

【1282】

Ｊ７８．前記状態が、固形腫瘍である、実施形態Ｊ７２〜Ｊ７５のいずれか１つに記載の方法。

【1283】

Ｊ７９．前記多量体リガンドを投与した後の腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞数と比べたときの、被験体における腫瘍サイズの増加および／または腫瘍細胞数の増加の有無を判定する工程、および
腫瘍サイズの増加および／または腫瘍細胞数の増加の存在が判定された場合、さらなる用量の該多量体リガンドをその被験体に投与する工程
を含む、実施形態Ｊ７８に記載の方法。

【1284】

Ｊ８０．前記多量体リガンドを投与した後の、ＣＤ１９を発現しているＢ細胞のレベルと比べたときの、被験体におけるＣＤ１９を発現しているＢ細胞の増加の有無を判定する工程、および
その被験体においてＣＤ１９を発現しているＢ細胞の増加の存在が判定された場合、さらなる用量の該多量体リガンドをその被験体に投与する工程
を含む、実施形態Ｊ７７に記載の方法。

【1285】

Ｊ８１．前記多量体リガンドを投与した後の腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞数が、その多量体リガンドを投与する前の腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞数と比べて減少する、実施形態Ｊ７９に記載の方法。

【1286】

Ｊ８２．前記多量体リガンドを投与した後のＣＤ１９を発現しているＢ細胞のレベルが、その多量体リガンドを投与する前のＣＤ１９を発現しているＢ細胞のレベルと比べて減少する、実施形態Ｊ８０に記載の方法。

【1287】

Ｊ８３．前記被験体が、ＨＩＶ、インフルエンザ、疱疹、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６，Ｉ）およびパピローマウイルスからなる群より選択されるウイルス病因の感染症と診断されているか、または肺炎、結核および梅毒からなる群より選択される細菌病因の感染症と診断されているか、またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症およびアメーバ症からなる群より選択される寄生生物病因の感染症と診断されている、実施形態Ｊ４３〜Ｊ７４のいずれか１つに記載の方法。

【1288】

Ｋ１．誘導可能なキメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む組成物であって、ここで、前記誘導可能なキメラ抗原レセプターは、多量体化領域、ＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドおよび一本鎖可変フラグメントを含む、組成物。

【1289】

Ｋ１．１．前記誘導可能なキメラ抗原レセプターが、細胞外ドメインを欠く細胞質ＣＤ４０ポリペプチドをさらに含む、実施形態Ｋ１に記載の組成物。

【1290】

Ｋ１．２．誘導可能なキメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む組成物であって、ここで、前記誘導可能なキメラ抗原レセプターは、多量体化領域、細胞外ドメインを欠く細胞質ＣＤ４０ポリペプチドおよび一本鎖可変フラグメントを含む、組成物。

【1291】

Ｋ２．前記切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、任意の実施形態Ｋ１またはＫ１．２に記載の組成物。

【1292】

Ｋ２．１．前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｋ１．１またはＫ１．２のいずれかに記載の組成物。

【1293】

Ｋ３〜Ｋ６．保留。

【1294】

Ｋ７．前記誘導可能なキメラ抗原レセプターが、ＣＤ３ζポリペプチドをさらに含む、実施形態Ｋ１〜Ｋ２．１のいずれか１つに記載の組成物。

【1295】

Ｋ８．前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニットおよびそれらの変異された配列からなる群より選択される、実施形態Ｋ１〜Ｋ７のいずれか１つに記載の組成物。

【1296】

Ｋ９．前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ｋ１〜Ｋ８のいずれか１つに記載の組成物。

【1297】

Ｋ１０．前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｋ１〜Ｋ９のいずれか１つに記載の組成物。

【1298】

Ｋ１１．前記多量体化領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、実施形態Ｋ１〜Ｋ８のいずれか１つに記載の組成物。

【1299】

Ｋ１２．前記多量体化領域が、ＦＫ５０６二量体および二量体のＦＫ５０６アナログリガンドからなる群より選択されるリガンドに結合する、実施形態Ｋ１〜Ｋ８のいずれか１つに記載の組成物。

【1300】

Ｋ１３．前記リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｋ１〜Ｋ１２のいずれか１つに記載の組成物。

【1301】

Ｋ１４．前記多量体化領域が、配列番号１１のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｋ１〜Ｋ１３のいずれか１つに記載の組成物。

【1302】

Ｋ１５．前記多量体化領域が、配列番号１０におけるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ｋ１〜Ｋ１４のいずれか１つに記載の組成物。

【1303】

Ｋ１６．前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｋ１４に記載の組成物。

【1304】

Ｋ１７．前記多量体化領域が、配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｋ１５に記載の組成物。

【1305】

Ｋ１８．前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｋ１４またはＫ１６に記載の組成物。

【1306】

Ｋ１９．前記多量体化領域が、配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｋ１５またはＫ１７に記載の組成物。

【1307】

Ｋ２０．前記多量体化領域が、配列番号１１もしくは配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｋ１４、Ｋ１６またはＫ１８のいずれか１つに記載の組成物。

【1308】

Ｋ２１．前記多量体化領域が、配列番号１０もしくは配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｋ１５、Ｋ１７またはＫ１９のいずれか１つに記載の組成物。

【1309】

Ｋ２２．前記核酸が、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター配列を含む、実施形態Ｋ１〜Ｋ２１のいずれか１つに記載の組成物。

【1310】

Ｋ２３．前記核酸が、ウイルスベクター内に含まれている、実施形態Ｋ１〜Ｋ２２のいずれか１つに記載の組成物。

【1311】

Ｋ２４．前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、実施形態Ｋ２３に記載の組成物。

【1312】

Ｋ２５．前記レトロウイルスベクターが、マウス白血病ウイルスベクターである、実施形態Ｋ２４に記載の組成物。

【1313】

Ｋ２６．前記レトロウイルスベクターが、ＳＦＧベクターである、実施形態Ｋ２４に記載の組成物。

【1314】

Ｋ２７．前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、実施形態Ｋ２３に記載の組成物。

【1315】

Ｋ２８．前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、実施形態Ｋ２３に記載の組成物。

【1316】

Ｋ２９．前記核酸が、プラスミド内に含まれている、実施形態Ｋ１〜Ｋ２２のいずれか１つに記載の組成物。

【1317】

Ｋ３０．実施形態Ｋ１〜Ｋ２９のいずれか１つに記載の組成物を形質導入されたまたは形質転換された細胞。

【1318】

Ｋ３１．前記細胞が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、実施形態Ｋ３０に記載の細胞。

【1319】

Ｋ３２．前記細胞が、Ｔ細胞である、実施形態Ｋ３１に記載の細胞。

【1320】

Ｋ３３．前記細胞が、骨髄から得られるかまたは調製される、実施形態Ｋ１〜Ｋ３のいずれか１つに記載の細胞。

【1321】

Ｋ３４．前記細胞が、臍帯血から得られるかまたは調製される、実施形態Ｋ１〜Ｋ３のいずれか１つに記載の細胞。

【1322】

Ｋ３５．前記細胞が、末梢血から得られるかまたは調製される、実施形態Ｋ１〜Ｋ３のいずれか１つに記載の細胞。

【1323】

Ｋ３６．前記細胞が、末梢血単核球から得られるかまたは調製される、実施形態Ｋ１〜Ｋ３のいずれか１つに記載の細胞。

【1324】

Ｋ３７．前記細胞が、ヒト細胞である、実施形態Ｋ３１〜Ｋ３のいずれか１つに記載の細胞。

【1325】

Ｋ３８．保留。

【1326】

Ｋ３９．前記一本鎖可変フラグメントが、腫瘍細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｋ１〜Ｋ３７のいずれか１つに記載の細胞。

【1327】

Ｋ４０．前記一本鎖可変フラグメントが、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｋ１〜Ｋ３７のいずれか１つに記載の細胞。

【1328】

Ｋ４１．前記一本鎖可変フラグメントが、αＰＳＭＡ、αＰＳＣＡ、αＭＵＣ１、αＣＤ１９、αＲＯＲ１、αＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、αＧＤ２、αＣＤ１２３、αＭＵＣ１６およびαＨｅｒ２／Ｎｅｕ一本鎖可変フラグメントからなる群より選択される、実施形態Ｋ１〜Ｋ４０のいずれか１つに記載の細胞。

【1329】

Ｋ４２．前記一本鎖可変フラグメントが、αＣＤ１９一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ｋ１〜Ｋ４０のいずれかに記載の細胞。

【1330】

Ｋ４２．１．前記一本鎖可変フラグメントが、αＰＳＣＡ一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ｋ１〜Ｋ４０のいずれかに記載の細胞。

【1331】

Ｋ４３．免疫応答を誘導するための方法であって、実施形態Ｋ１〜Ｋ４２．１に記載の細胞を、多量体化領域に結合するリガンドと接触させることにより、誘導可能なキメラ抗原レセプターの多量体化をもたらす工程を含む、方法。

【1332】

Ｋ４４．前記細胞が、インビボにおいて前記リガンドと接触される、実施形態Ｋ４３に記載の方法。

【1333】

Ｋ４５．前記リガンドが、二量体である、実施形態Ｋ４３またはＫ４４に記載の方法。

【1334】

Ｋ４６．前記リガンドが、二量体のＦＫ５０６または二量体のＦＫ５０６様アナログである、実施形態Ｋ４５に記載の方法。

【1335】

Ｋ４７．前記リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｋ４５に記載の方法。

【1336】

Ｋ４８．前記トランスフェクトされたまたは形質導入された細胞を被験体に投与する工程をさらに含む、実施形態Ｋ４３〜Ｋ４７のいずれか１つに記載の方法。

【1337】

Ｋ４９．前記細胞が、静脈内投与によって前記被験体に投与される、実施形態Ｋ４８に記載の方法。

【1338】

Ｋ５０〜Ｋ５６．保留。

【1339】

Ｋ５６．前記被験体が、腫瘍と診断されている、実施形態Ｋ４３〜Ｋ４９のいずれか１つに記載の方法。

【1340】

Ｋ５７．前記被験体が、がんを有する、実施形態Ｋ４３〜Ｋ４９のいずれか１つに記載の方法。

【1341】

Ｋ５８．前記被験体が、固形腫瘍を有する、実施形態Ｋ４３〜Ｋ４９のいずれか１つに記載の方法。

【1342】

Ｋ５９．前記細胞が、腫瘍浸潤リンパ球またはＴ細胞である、実施形態Ｋ５８に記載の方法。

【1343】

Ｋ６０．前記細胞が、前記腫瘍床に送達される、実施形態Ｋ５８またはＫ５９に記載の方法。

【1344】

Ｋ６１．前記がんが、前記被験体の血液中または骨髄中に存在する、実施形態Ｋ５７に記載の方法。

【1345】

Ｋ６２．前記被験体が、血液疾患または骨髄疾患を有する、実施形態Ｋ４３〜Ｋ４９のいずれか１つに記載の方法。

【1346】

Ｋ６３．前記被験体が、任意の状態または幹細胞移植によって緩和され得る障害と診断されている、実施形態Ｋ４３〜Ｋ４９のいずれか１つに記載の方法。

【1347】

Ｋ６４．前記被験体が、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、実施形態Ｋ４３〜Ｋ４９のいずれか１つに記載の方法。

【1348】

Ｋ６５．前記患者が、原発性免疫不全障害、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＬＨ）または他の血球貪食障害、遺伝性骨髄不全障害、異常ヘモグロビン症、代謝障害および破骨細胞障害からなる群より選択される状態と診断されている、実施形態Ｋ４３〜Ｋ４９のいずれか１つに記載の方法。

【1349】

Ｋ６６．前記状態が、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＫ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンドブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスおよび大理石骨病からなる群より選択される、実施形態Ｋ４３〜Ｋ４９のいずれか１つに記載の方法。

【1350】

Ｋ６７．被験体における白血病を処置するための方法であって、実施形態Ｋ１〜Ｋ４２．１のいずれか１つに記載の細胞を投与する工程および多量体リガンドをその被験体に投与する工程を含む、方法。

【1351】

Ｋ６８．前記一本鎖可変フラグメントが、ＣＤ１９に結合する、実施形態Ｋ６７に記載の方法。

【1352】

Ｋ６９．前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｋ６７またはＫ６８に記載の方法。

【1353】

Ｋ７０．前記細胞が、Ｔ細胞である、実施形態Ｋ６７〜Ｋ６９のいずれかに記載の方法。

【1354】

Ｋ７１．前記被験体が、ヒトである、実施形態Ｋ４３〜Ｋ７０のいずれか１つに記載の方法。

【1355】

Ｋ７２．さらなる用量の前記多量体リガンドを前記被験体に投与するべきであるかを判定する工程をさらに含む、実施形態Ｋ４３〜Ｋ７１のいずれか１つに記載の方法。

【1356】

Ｋ７３．さらなる用量の前記多量体リガンドを前記被験体に投与する工程をさらに含み、ここで、前記疾患または状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検出される、実施形態Ｋ４３〜Ｋ７２のいずれか１つに記載の方法。

【1357】

Ｋ７４．実施形態１〜４２．１のいずれか１つに記載の細胞を投与する前に、前記被験体が、ある疾患または状態と診断されており、多量体リガンドを投与した後に、その疾患または状態が検出され、さらなる用量の該多量体リガンドが、その被験体に投与される、実施形態Ｋ７３に記載の方法。

【1358】

Ｋ７５．被験体における状態または疾患の有無またはステージを特定する工程、および
その被験体において特定された状態または疾患の有無またはステージに基づいて、多量体結合領域に結合する多量体リガンドを投与する指示、その多量体リガンドのその後の投与量を維持する指示またはその患者に投与されるその多量体リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに含む、実施形態Ｋ４３〜Ｋ７４のいずれか１つに記載の方法。

【1359】

Ｋ７６．前記状態が、がんである、実施形態Ｋ７２〜Ｋ７５のいずれか１つに記載の方法。

【1360】

Ｋ７７．前記状態が、白血病である、実施形態Ｋ７２〜Ｋ７５のいずれか１つに記載の方法。

【1361】

Ｋ７８．前記状態が、固形腫瘍である、実施形態Ｋ７２〜Ｋ７５のいずれか１つに記載の方法。

【1362】

Ｋ７９．前記多量体リガンドを投与した後の腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞数と比べたときの、被験体における腫瘍サイズの増加および／または腫瘍細胞数の増加の有無を判定する工程、および
腫瘍サイズの増加および／または腫瘍細胞数の増加の存在が判定された場合、さらなる用量の該多量体リガンドをその被験体に投与する工程
を含む、実施形態Ｋ７８に記載の方法。

【1363】

Ｋ８０．前記多量体リガンドを投与した後の、ＣＤ１９を発現しているＢ細胞のレベルと比べたときの、被験体におけるＣＤ１９を発現しているＢ細胞の増加の有無を判定する工程、および
その被験体においてＣＤ１９を発現しているＢ細胞の増加の存在が判定された場合、さらなる用量の該多量体リガンドをその被験体に投与する工程
を含む、実施形態Ｋ７７に記載の方法。

【1364】

Ｋ８１．前記多量体リガンドを投与した後の腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞数が、その多量体リガンドを投与する前の腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞数と比べて減少する、実施形態Ｃ７９に記載の方法。

【1365】

Ｋ８２．前記多量体リガンドを投与した後のＣＤ１９を発現しているＢ細胞のレベルが、その多量体リガンドを投与する前のＣＤ１９を発現しているＢ細胞のレベルと比べて減少する、実施形態Ｋ８０に記載の方法。

【1366】

Ｋ８３．前記被験体が、ＨＩＶ、インフルエンザ、疱疹、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６，Ｉ）およびパピローマウイルスからなる群より選択されるウイルス病因の感染症と診断されているか、または肺炎、結核および梅毒からなる群より選択される細菌病因の感染症と診断されているか、またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症およびアメーバ症からなる群より選択される寄生生物病因の感染症と診断されている、実施形態Ｋ４３〜Ｋ７４のいずれか１つに記載の方法。

【1367】

Ｌ１．前記キメラ刺激分子が、（ｉ）膜標的化領域；（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド、またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、および（ｉｖ）多量体化領域を含む、誘導可能なキメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸。

【1368】

Ｌ２．キメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸であって、ここで、前記キメラ刺激分子は、（ｉ）膜標的化領域；（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド、またはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド、および多量体化領域を含む、核酸。

【1369】

Ｌ３．誘導可能なキメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸であって、ここで、前記キメラ刺激分子は、（ｉ）膜標的化領域；（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、および（ｉｉｉ）多量体化領域を含む、核酸。

【1370】

Ｌ４．前記キメラ刺激分子が、Ｔ細胞活性化分子をさらに含む、実施形態Ｌ１〜Ｌ３のいずれか１つに記載の核酸。

【1371】

Ｌ４．１．前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、可動性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをタンデムで含む一本鎖抗体およびそれらの変異された配列からなる群より選択されるリガンド結合領域である、実施形態Ｌ１〜Ｌ４のいずれか１つに記載の核酸。

【1372】

Ｌ４．２．前記リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ｌ４．１に記載の核酸。

【1373】

Ｌ４．３．前記ＦＫＢＰ１２領域が、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｌ４．２に記載の核酸。

【1374】

Ｌ４．４．前記ＦＫＢＰ領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、実施形態４．２に記載の核酸。

【1375】

Ｌ４．５．前記リガンドが、ＦＫ５０６二量体または二量体のＦＫ５０６アナログリガンドである、実施形態Ｌ４．１〜Ｌ４．４のいずれか１つに記載の核酸。

【1376】

Ｌ４．６．前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ｌ４．５に記載の核酸。

【1377】

Ｌ４．７．前記ＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域が、配列番号９の細胞質領域のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｌ１〜Ｌ４．６のいずれか１つに記載の核酸。

【1378】

Ｌ４．８．前記ＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域が、配列番号８におけるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ｌ１〜Ｌ４．７のいずれか１つに記載の核酸。

【1379】

Ｌ４．９．前記多量体化領域が、配列番号１１のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｌ１〜Ｌ４．８のいずれか１つに記載の核酸。

【1380】

Ｌ４．１０．前記多量体化領域が、配列番号１０におけるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ｌ１〜Ｌ４．９のいずれか１つに記載の核酸。

【1381】

Ｌ４．１１．前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｌ４．９に記載の核酸。

【1382】

Ｌ４．１２．前記多量体化領域が、配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｌ４．１０に記載の核酸。

【1383】

Ｌ４．１３．前記多量体化領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｌ４．１１に記載の核酸。

【1384】

Ｌ４．１４．前記多量体化領域が、配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｌ４．１２に記載の核酸。

【1385】

Ｌ４．１５．前記多量体化領域が、配列番号１１もしくは配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｌ４．１１またはＬ４．１３のいずれか１つに記載の核酸。

【1386】

Ｌ４．１６．前記多量体化領域が、配列番号１０もしくは配列番号１２におけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、実施形態Ｌ４．１２またはＬ４．１４のいずれか１つに記載の核酸。

【1387】

Ｌ４．１７．前記膜標的化領域が、ミリストイル化領域である、実施形態Ｌ１〜Ｌ４．１６のいずれか１つに記載の核酸。

【1388】

Ｌ４．１８．前記ミリストイル化領域が、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｌ４．１７に記載の核酸。

【1389】

Ｌ４．１９．前記ミリストイル化領域が、配列番号２におけるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはその機能的フラグメントである、実施形態Ｌ４．１７に記載の核酸。

【1390】

Ｌ４．２０．キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ｌ１〜Ｌ４．１９のいずれか１つに記載の核酸。

【1391】

Ｌ４．２１．誘導可能なキメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで、その誘導可能なキメラ刺激分子は、（ｉ）膜標的化領域；（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、および多量体化領域を含む、第１のポリヌクレオチド；および
キメラ抗原レセプターをコードする第２のポリヌクレオチド
を含む、核酸。

【1392】

Ｌ４．２２．前記多量体化が、リガンド結合領域である、実施形態Ｌ４．２１に記載の核酸。

【1393】

Ｌ４．２３．前記リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態４．２２に記載の核酸。

【1394】

Ｌ４．２４．前記ＦＫＢＰ１２領域が、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｌ４．２３に記載の核酸。

【1395】

Ｌ４．２５．前記ＦＫＢＰ１２領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、実施形態Ｌ４．２３に記載の核酸。

【1396】

Ｌ４．２６．前記リガンドが、ＦＫ５０６二量体または二量体のＦＫ５０６アナログリガンドである、実施形態Ｌ４．２１〜Ｌ４．２５のいずれか１つに記載の核酸。

【1397】

Ｌ４．２７．前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ｌ４．２６に記載の核酸。

【1398】

Ｌ４．２８．少なくとも１つのプロモーターをさらに含む、実施形態４．２１〜４．２７のいずれか１つに記載の核酸。

【1399】

Ｌ４．２９．少なくとも２つのプロモーターをさらに含む、実施形態４．２１〜４．２７のいずれか１つに記載の核酸。

【1400】

Ｌ４．３０．１つのプロモーターが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドの両方に作動可能に連結されている、実施形態Ｌ４．２８に記載の核酸。

【1401】

Ｌ４．３１．第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含み、ここで、そのリンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後の第１および第２のポリヌクレオチドの翻訳産物を分断している、実施形態Ｌ４．２１〜Ｌ４．３０のいずれか１つに記載の核酸。

【1402】

Ｌ４．３２．前記リンカーポリペプチドが、２Ａポリペプチドである、実施形態Ｌ４．３１に記載の核酸。

【1403】

Ｌ４．３３．前記核酸が、キメラ刺激分子、２Ａポリペプチドおよびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする、実施形態Ｌ４．２１〜Ｌ４．３２のいずれか１つに記載の核酸。

【1404】

Ｌ４．３４．前記第１のポリヌクレオチドが、第１のプロモーターに作動可能に連結され、前記第２のポリヌクレオチドが、第２のプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態Ｌ４．２１〜Ｌ４．３３のいずれか１つに記載の核酸。

【1405】

Ｌ４．３５．前記２つのポリヌクレオチドに相補的な２つのＲＮＡ転写物が生成される、実施形態Ｌ４．２１〜Ｌ４．３４のいずれか１つに記載の核酸。

【1406】

Ｌ５．前記Ｔ細胞活性化分子が、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子である、実施形態Ｌ４〜Ｌ４．３５のいずれか１つに記載の核酸。

【1407】

Ｌ６．前記Ｔ細胞活性化分子が、ＣＤ３ζポリペプチドである、実施形態Ｌ４〜Ｌ４．１９のいずれか１つに記載の核酸。

【1408】

Ｌ６．１．前記Ｔ細胞活性化分子が、Ｆｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドである、実施形態Ｌ４〜Ｌ４．１９のいずれか１つに記載の核酸。

【1409】

Ｌ７．前記切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｌ１〜Ｌ６．１のいずれか１つに記載の核酸。

【1410】

Ｌ８．前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｌ１またはＬ２〜Ｌ７のいずれか１つに記載の核酸。

【1411】

Ｌ９．前記ＣＤ３ζポリペプチドが、配列番号３９のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｌ６〜Ｌ８のいずれか１つに記載の核酸。

【1412】

Ｌ１０．前記膜標的化領域が、レセプターのミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域および膜貫通配列からなる群より選択される、実施形態Ｌ１〜Ｌ９のいずれか１つに記載の核酸。

【1413】

Ｌ１１．前記膜標的化領域が、ミリストイル化領域である、実施形態Ｌ１〜Ｌ１０のいずれか１つに記載の核酸。

【1414】

Ｌ１１．１．前記キメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドが、二量体化分子結合領域または多量体化分子結合領域を含まない、実施形態Ｌ１〜Ｌ１０のいずれか１つに記載の核酸。

【1415】

Ｌ１２．前記核酸が、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター配列を含む、実施形態Ｌ１〜Ｌ１１．１のいずれか１つに記載の核酸。

【1416】

Ｌ１３．前記核酸が、ウイルスベクター内に含まれている、実施形態Ｌ１〜Ｌ１２のいずれか１つに記載の核酸。

【1417】

Ｌ１４．前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、実施形態Ｌ１３に記載の核酸。

【1418】

Ｌ１５．前記レトロウイルスベクターが、マウス白血病ウイルスベクターである、実施形態Ｌ１４に記載の核酸。

【1419】

Ｌ１６．前記レトロウイルスベクターが、ＳＦＧベクターである、実施形態Ｌ１４に記載の核酸。

【1420】

Ｌ１７．前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、実施形態Ｌ１３に記載の核酸。

【1421】

Ｌ１８．前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、実施形態Ｌ１３に記載の核酸。

【1422】

Ｌ１８．１．前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスからなる群より選択される、実施形態Ｌ１３に記載の核酸。

【1423】

Ｌ１９．前記核酸が、プラスミド内に含まれている、実施形態Ｌ１〜Ｌ１２のいずれか１つに記載の核酸。

【1424】

Ｌ２０．実施形態Ｌ１〜Ｌ１９のいずれか１つに記載の核酸によってコードされるキメラ刺激分子ポリペプチド。

【1425】

Ｌ２１．実施形態Ｌ１〜Ｌ１９のいずれか１つに記載の核酸でトランスフェクトされたまたは形質導入された、改変された細胞。

【1426】

Ｌ２２．前記改変された細胞が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞、ＴＣＲを発現している細胞またはＮＫ細胞である、実施形態Ｌ２１に記載の改変された細胞。

【1427】

Ｌ２３．前記細胞が、Ｔ細胞である、実施形態Ｌ２１に記載の改変された細胞。

【1428】

Ｌ２４．前記細胞が、骨髄から得られるかまたは調製される、実施形態Ｌ２１〜Ｌ２３のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【1429】

Ｌ２５．前記細胞が、臍帯血から得られるかまたは調製される、実施形態Ｌ２１〜Ｌ２３のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【1430】

Ｌ２６．前記細胞が、末梢血から得られるかまたは調製される、実施形態Ｌ２１〜Ｌ２５のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【1431】

Ｌ２７．前記細胞が、末梢血単核球から得られるかまたは調製される、実施形態Ｌ２１〜Ｌ２５のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【1432】

Ｌ２８．前記細胞が、ヒト細胞である、実施形態Ｌ２１〜Ｌ２７のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【1433】

Ｌ２９．前記改変された細胞が、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ｌ２１〜Ｌ２８のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【1434】

Ｌ３０．前記キメラ抗原レセプターが、抗原認識部分を含む、実施形態Ｌ２９に記載の改変された細胞。

【1435】

Ｌ３０．１．前記細胞が、Ｔ細胞である、実施形態Ｌ２１〜Ｌ３０のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【1436】

Ｌ３０．２．前記改変された細胞が、Ｔ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ｌ２１〜Ｌ２８のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【1437】

Ｌ３０．３．前記改変された細胞が、Ｔ細胞レセプターに基づくＣＡＲをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ｌ２１〜２８のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【1438】

Ｌ３０．４．改変された細胞が、前記Ｔ細胞レセプターまたはＴ細胞レセプターに基づくＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む核酸でトランスフェクトされるかまたは形質導入される、実施形態Ｌ３０．２またはＬ３０．３のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【1439】

Ｌ３１．前記抗原認識部分が、一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ｌ２７．１またはＬ３０のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【1440】

Ｌ３１．１．前記キメラ抗原レセプターまたはＴ細胞レセプターが、腫瘍細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｌ２９〜Ｌ３１のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【1441】

Ｌ３２．前記キメラ抗原レセプターまたはＴ細胞レセプターが、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｌ２９〜Ｌ３１．１のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【1442】

Ｌ３３．前記キメラ抗原レセプターまたはＴ細胞レセプターが、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６およびＨｅｒ２／Ｎｅｕからなる群より選択される抗原に結合する、実施形態Ｌ２９〜Ｌ３１．１のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【1443】

Ｌ３４．前記キメラ抗原レセプターまたはＴ細胞レセプターが、ＣＤ１９に結合する、実施形態Ｌ２９〜Ｌ３３のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【1444】

Ｌ３５．前記キメラ抗原レセプターまたはＴ細胞レセプターが、Ｈｅｒ２^＋に結合する、実施形態Ｌ２９〜Ｌ３３のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【1445】

Ｌ３６．前記抗原認識部分が、ウイルス抗原または細菌抗原に結合する、実施形態Ｌ２９〜Ｌ３３のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【1446】

Ｌ３６．１．前記細胞が、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子を用いた遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子またはポリプレックスからなる群より選択される方法を用いて、前記核酸ベクターによってトランスフェクトされるかまたは形質導入される、実施形態Ｌ２９〜Ｌ３６のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【1447】

Ｌ３７．被験体におけるＴ細胞媒介性の免疫応答を刺激するための方法であって、実施形態Ｌ２１〜Ｌ３６．１のいずれか１つに記載の改変された細胞をその被験体に投与する工程を含む、方法。

【1448】

Ｌ３７．１．前記改変された細胞が、標的細胞上の抗原に結合するキメラ抗原レセプターまたはＴ細胞レセプターを含む、実施形態Ｌ３７に記載の方法。

【1449】

Ｌ３８．前記標的細胞が、腫瘍細胞である、実施形態Ｌ３７．１に記載の方法。

【1450】

Ｌ３９．前記被験体における標的細胞の数または濃度が、前記改変された細胞の投与後に減少する、実施形態Ｌ３７〜Ｌ３８のいずれか１つに記載の方法。

【1451】

Ｌ４０．前記改変された細胞を投与する前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、改変された細胞を投与した後に被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数濃度を測定する工程、および第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比べて第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増加または減少を判定する工程を含む、実施形態Ｌ３７〜Ｌ３９のいずれか１つに記載の方法。

【1452】

Ｌ４１．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度が、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比べて減少する、実施形態Ｌ４０に記載の方法。

【1453】

Ｌ４２．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度が、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比べて増加する、実施形態Ｌ４０に記載の方法。

【1454】

Ｌ４３．さらなる用量の改変された細胞が、前記被験体に投与される、実施形態Ｌ４０〜Ｌ４２のいずれか１つに記載の方法。

【1455】

Ｌ４４．被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、有効量の実施形態Ｌ２１〜Ｌ３６．１のいずれか１つに記載の改変された細胞をその被験体に投与する工程を含む、方法。

【1456】

Ｌ４５．標的抗原の高発現に関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、有効量の実施形態Ｌ２１〜Ｌ３６．１のいずれか１つに記載の改変された細胞をその被験体に投与する工程を含む、方法。

【1457】

Ｌ４６．前記標的抗原が、腫瘍抗原である、実施形態Ｌ４５に記載の方法。

【1458】

Ｌ４７．前記改変された細胞が、自己のＴ細胞である、実施形態Ｌ３７〜Ｌ４６のいずれか１つに記載の方法。

【1459】

Ｌ４８．前記改変された細胞が、同種異系のＴ細胞である、実施形態Ｌ３７〜Ｌ４６のいずれか１つに記載の方法。

【1460】

Ｌ５０．被験体における腫瘍サイズを減少させるための方法であって、その方法は、実施形態Ｌ２９〜Ｌ３６．１のいずれか１つに記載の改変された細胞をその被験体に投与する工程を含み、前記抗原認識部分は、前記腫瘍上の抗原に結合する、方法。

【1461】

Ｌ５１．前記被験体が、腫瘍を有すると診断されている、実施形態Ｌ３７〜Ｌ５０のいずれか１つに記載の方法。

【1462】

Ｌ５２．前記被験体が、がんを有する、実施形態Ｌ３７〜Ｌ５１のいずれか１つに記載の方法。

【1463】

Ｌ５３．前記被験体が、固形腫瘍を有する、実施形態Ｌ３７〜Ｌ５１のいずれか１つに記載の方法。

【1464】

Ｌ５４．前記改変された細胞が、腫瘍浸潤リンパ球またはＴ細胞である、実施形態Ｌ３７〜Ｌ５３のいずれか１つに記載の方法。

【1465】

Ｌ５５．前記改変された細胞が、腫瘍床に送達される、実施形態Ｌ３７〜Ｌ５４のいずれか１つに記載の方法。

【1466】

Ｌ５６．前記がんが、前記被験体の血液中または骨髄中に存在する、実施形態Ｌ５２に記載の方法。

【1467】

Ｌ５７．前記被験体が、血液疾患または骨髄疾患を有する、実施形態Ｌ３７〜Ｌ５１のいずれか１つに記載の方法。

【1468】

Ｌ５８．前記被験体が、任意の状態または幹細胞移植によって緩和され得る状態と診断されている、実施形態Ｌ３７〜Ｌ５１のいずれか１つに記載の方法。

【1469】

Ｌ５９．前記被験体が、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、実施形態Ｌ３７〜Ｌ５１のいずれか１つに記載の方法。

【1470】

Ｌ６０．前記患者が、原発性免疫不全状態、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＬＨ）または他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、異常ヘモグロビン症、代謝状態および破骨細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、実施形態Ｌ３７〜Ｌ５１のいずれか１つに記載の方法。

【1471】

Ｌ６１．前記疾患または状態が、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンドブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスおよび大理石骨病からなる群より選択される、実施形態Ｌ３７〜Ｌ５１のいずれか１つに記載の方法。

【1472】

Ｌ６２．さらなる用量の前記改変された細胞が、前記被験体に投与されるべきであるかを判定する工程をさらに含む、実施形態Ｌ３７〜Ｌ６１のいずれか１つに記載の方法。

【1473】

Ｌ６３．さらなる用量の前記改変された細胞を前記被験体に投与する工程をさらに含み、ここで、前記疾患または状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検出される、実施形態Ｌ３７〜Ｌ６２のいずれか１つに記載の方法。

【1474】

Ｌ６４．被験体における状態または疾患の有無またはステージを特定する工程；および
その被験体において特定された状態または疾患の有無またはステージに基づいて、実施形態Ｌ３１〜Ｌ３６のいずれか１つに記載の改変された細胞を投与する指示、その改変された細胞のその後の投与量を維持する指示またはその患者に投与される改変された細胞のその後の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに含む、実施形態Ｌ３７〜Ｌ６３のいずれか１つに記載の方法。

【1475】

Ｌ６５．前記状態が、白血病である、実施形態Ｌ３７〜Ｌ６４のいずれか１つに記載の方法。

【1476】

Ｌ６６．保留。

【1477】

Ｌ６７．前記被験体が、ＨＩＶ、インフルエンザ、疱疹、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６，Ｉ）およびパピローマウイルスからなる群より選択されるウイルス病因の感染症と診断されているか、または肺炎、結核および梅毒からなる群より選択される細菌病因の感染症と診断されているか、またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症およびアメーバ症からなる群より選択される寄生生物病因の感染症と診断されている、実施形態Ｌ３７〜Ｌ６４のいずれか１つに記載の方法。

【1478】

Ｌ６８．前記改変された細胞が、インビボにおいてトランスフェクトされるかまたは形質導入される、実施形態Ｌ３７〜Ｌ６７のいずれか１つに記載の方法。

【1479】

Ｌ６９．前記改変された細胞が、インビボにおいてトランスフェクトされるかまたは形質導入される、実施形態Ｌ２１〜Ｌ６７のいずれか１つに記載の改変された細胞。

【1480】

Ｌ７０．細胞においてキメラ刺激分子を発現させるための方法であって、その方法は、実施形態Ｌ１〜Ｌ２０のいずれか１つに記載の核酸を、その核酸が細胞に組み込まれる条件下においてその細胞と接触させる工程を含み、それにより、その細胞は、組み込まれた核酸からキメラ抗原レセプターを発現する、方法。

【1481】

Ｌ７１．前記核酸が、エキソビボにおいて前記細胞と接触される、実施形態Ｌ７０に記載の方法。

【1482】

Ｌ７２．前記核酸が、インビボにおいて前記細胞と接触される、実施形態Ｌ７０に記載の方法。

【1483】

Ｍ１．前記核酸が、キメラ抗原レセプターをコードするか、または前記改変された細胞が、キメラ抗原レセプターを含む、実施形態Ｌ４．２０〜Ｌ７２のいずれか１つに記載の核酸、改変された細胞または方法。

【1484】

Ｍ２．前記キメラ抗原レセプターが、
（ｉ）膜貫通領域；（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子；および（ｉｉｉ）抗原認識部分
を含む、実施形態Ｍ１に記載の核酸、改変された細胞または方法。

【1485】

Ｍ３．前記キメラ抗原レセプターが、（ｉ）膜貫通領域；（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子；および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、実施形態Ｍ１〜Ｍ２のいずれか１つに記載の核酸、改変された細胞または方法。

【1486】

Ｍ４．前記キメラ抗原レセプターが、共刺激分子をさらに含む、実施形態Ｍ３に記載の核酸、改変された細胞または方法。

【1487】

Ｍ５．前記共刺激分子が、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４−１ＢＢからなる群より選択される、実施形態Ｍ４に記載の核酸、改変された細胞または方法。

【1488】

Ｍ６．前記Ｔ細胞活性化分子が、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子である、実施形態Ｍ２〜Ｍ５のいずれか１つに記載の核酸、改変された細胞または方法。

【1489】

Ｍ７．前記Ｔ細胞活性化分子が、ＣＤ３ゼータポリペプチドである、実施形態Ｍ２〜Ｍ５のいずれか１つに記載の核酸、改変された細胞または方法。

【1490】

Ｍ８．前記Ｔ細胞活性化分子が、Ｆｃレセプターガンマポリペプチドである、実施形態Ｍ２〜Ｍ５のいずれか１つに記載の核酸、改変された細胞または方法。

【1491】

Ｍ９．前記抗原認識部分が、腫瘍細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｍ２〜Ｍ８のいずれか１つに記載の核酸、改変された細胞または方法。

【1492】

Ｍ９．前記抗原認識部分が、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｍ２〜Ｍ８のいずれか１つに記載の核酸、改変された細胞または方法。

【1493】

Ｍ１０．前記抗原認識部分が、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６およびＨｅｒ２／Ｎｅｕからなる群より選択される抗原に結合する、実施形態Ｍ２〜Ｍ８のいずれか１つに記載の核酸、改変された細胞または方法。

【1494】

Ｍ１１．前記抗原認識部分が、ＰＳＣＡに結合する、実施形態Ｍ２〜Ｍ８のいずれか１つに記載の核酸、改変された細胞または方法。

【1495】

Ｍ１２．前記抗原認識部分が、ＣＤ１９に結合する、実施形態Ｍ２〜Ｍ８のいずれか１つに記載の核酸、改変された細胞または方法。

【1496】

Ｍ１３．前記抗原認識部分が、ウイルス抗原または細菌抗原に結合する、実施形態Ｍ２〜Ｍ８のいずれか１つに記載の核酸、改変された細胞または方法。

【1497】

Ｍ１４．前記抗原認識部分が、一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ｍ２〜Ｍ１３のいずれか１つに記載の核酸、改変された細胞または方法。

【1498】

Ｍ１５．前記膜貫通領域が、ＣＤ２８膜貫通領域である、実施形態Ｍ２〜Ｍ１４のいずれか１つに記載の核酸、改変された細胞または方法。

【1499】

Ｍ１６．前記膜貫通領域が、ＣＤ８膜貫通領域である、実施形態Ｍ２〜Ｍ１４のいずれか１つに記載の核酸、改変された細胞または方法。

【1500】

Ｍ１７．ＣＤ８ストーク領域をさらに含む、実施形態Ｍ１６に記載の核酸、改変された細胞または方法。

【1501】

Ｍ１８．前記抗原認識部分が、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結合する、実施形態Ｍ２〜Ｍ１７のいずれか１つに記載の核酸、改変された細胞または方法。

【1502】

本明細書中で参照された特許、特許出願、刊行物および文書の各々の全体が、参照により本明細書によって援用される。上記特許、特許出願、刊行物および文書の引用は、前述のいずれかが、関連する従来技術であることを自認するものでもないし、これらの刊行物または文書の内容または日付に関して何ら自認するものでもない。

【1503】

本技術の基本的な態様から逸脱することなく、前述のものに対して改変が行われ得る。本技術は、１つ以上の特定の実施形態に照らして実質的に詳細に説明されてきたが、当業者は、本願において具体的に開示された実施形態に対して変更が行われ得るが、これらの改変および改善が本技術の範囲内および精神内であることを認識する。

【1504】

本明細書中に例証的に記載された技術は、本明細書中に具体的に開示されていない任意のエレメント（複数可）の非存在下において、適切に実施され得る。したがって、例えば、本明細書中の各場合において、用語「〜を含む」、「〜から本質的になる」および「〜からなる」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと置き換えられてもよい。使用されてきた用語および表現は、限定の用語ではなく説明の用語として使用され、そのような用語および表現の使用は、示されたおよび記載された特徴またはそれらの一部のいかなる等価物も排除せず、特許請求される本技術の範囲内で様々な改変が可能である。エレメントのうちの１つまたはエレメントのうちの２つ以上が記載されていることが文脈から明らかでない限り、用語「ａ」または「ａｎ」は、それが修飾するエレメントのうちの１つまたは複数のことを指し得る（例えば、「試薬（ａ ｒｅａｇｅｎｔ）」は、１つ以上の試薬を意味し得る）。本明細書中で使用される用語「約」は、基となるパラメータの１０％以内の値（すなわち、プラスまたはマイナス１０％）のことを指し、一続きの値の始めに用語「約」を使用することにより、それらの値の各々が修飾される（すなわち、「約１、２および３」は、約１、約２および約３のことを指す）。例えば、「約１００グラム」という重量は、９０グラム〜１１０グラムの重量を含み得る。さらに、値のリストが、本明細書中に記載されるとき（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６％）、そのリストには、それらのすべての中間値および分数値（例えば、５４％、８５．４％）が含まれる。したがって、本技術は、代表的な実施形態および随意の特徴によって具体的に開示されてきたが、本明細書中に開示された概念の改変およびバリエーションが、当業者によって用いられることがあり、そのような改変およびバリエーションは、本技術の範囲内であるとみなされると理解されるべきである。

【1505】

本技術のある特定の実施形態が、以下の請求項に示される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26-1】

【図26-2】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62】

【図63】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]