特許 6774047 複合体、試料中の対象核酸の検出方法及びキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6774047

(24)【登録日】2020年10月6日

(45)【発行日】2020年10月21日

(54)【発明の名称】複合体、試料中の対象核酸の検出方法及びキット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6834 20180101AFI20201012BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20201012BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6834 Z

   C12M1/00 AZNA

【請求項の数】17

【全頁数】35

(21)【出願番号】特願2016-123934(P2016-123934)

(22)【出願日】2016年6月22日

(65)【公開番号】特開2017-225396(P2017-225396A)

(43)【公開日】2017年12月28日

【審査請求日】2019年6月20日

(73)【特許権者】

【識別番号】504171134

【氏名又は名称】国立大学法人 筑波大学

(74)【代理人】

【識別番号】100106909

【弁理士】

【氏名又は名称】棚井 澄雄

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100169764

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 雄一郎

(72)【発明者】

【氏名】大石 基

(72)【発明者】

【氏名】杉山 聡深

【審査官】 松浦 安紀子

(56)【参考文献】

【文献】 ACS Applied Materials and Interfaces，２０１５年，7(41)，pp.22821-22830

【文献】 Biosensors and Bioelectronics，２０１２年，32(1)，pp.127-132

【文献】 Biosensors and Bioelectronics，２０１５年，67，pp.419-423

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８３４

Ｃ１２Ｍ １／００

ＷＰＩ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（１）〜（４）のいずれかで表される、第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した複合体であって、前記第１の核酸構造体の足場依存型鎖交換反応によって、前記第１の粒子と前記第２の粒子との結合が解離する、複合体。

【化1】

［式（１）中、Ｘ^１又はＸ^２は一方が前記第１の粒子を表し、他方が前記第２の粒子を表し、γ及びδ’はそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、γ’は前記γと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］

【化2】

［式（２）中、Ｘ^１、Ｘ^２、γ、γ’及びδ’は前記式（１）における定義に同じであり、α及びβはそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、α’及びβ’はそれぞれ前記α又は前記βと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］

【化3】

［式（３）中、Ｘ^１、Ｘ^２、α、α’、β、β’、γ、γ’及びδ’は前記式（２）における定義に同じであり、εはそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、ε’は前記εと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］

【化4】

［式（４）中、Ｘ^１、Ｘ^２、α、α’、β、β’、γ、γ’、δ’、ε及びε’は前記式（３）における定義に同じである。］

【請求項2】

前記第１の粒子が光学的に識別可能である、請求項１に記載の複合体。

【請求項3】

前記第１の粒子に水溶性高分子化合物が結合している、請求項１又は２に記載の複合体。

【請求項4】

遠心分離又は磁石を近接させることにより前記第２の粒子が凝集する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項5】

下記式（５）で表される、第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した複合体であって、前記第１の核酸構造体の足場依存型鎖交換反応によって、対象核酸が生成される、複合体。

【化5】

［式（５）中、Ｘ^１、Ｘ^２、α、α’、β’、γ、γ’及びδ’は請求項１の式（３）における定義に同じであり、δは前記δ’又と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］

【請求項6】

前記第１の粒子が光学的に識別可能である、請求項５に記載の複合体。

【請求項7】

前記第１の粒子に水溶性高分子化合物が結合している、請求項５又は６に記載の複合体。

【請求項8】

遠心分離又は磁石を近接させることにより前記第２の粒子が凝集する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項9】

下記工程（ａ）〜（ｃ）を備える、試料中の対象核酸の検出方法。
工程（ａ）：前記試料と、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合体とを含む混合液をインキュベートする工程であって、前記混合液中で、前記試料中の対象核酸が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の粒子と前記第２の粒子との結合が解離する工程。
工程（ｂ）：工程（ａ）の後に、解離した前記第２の粒子及び未反応の前記複合体を凝集させる工程であって、その結果、解離した前記第１の粒子が前記混合液中に分散する工程。
工程（ｃ）：工程（ｂ）の後に、前記混合液中の前記第１の粒子の存在量を測定する工程であって、測定された前記存在量が前記対象核酸の存在量に対応する工程。

【請求項10】

工程（ａ）における前記複合体が請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合体であり、前記対象核酸がγ−δ［但し、γは前記式（３）における定義に同じであり、δは前記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片である、請求項９に記載の検出方法。

【請求項11】

前記工程（ａ）が、前記試料と、前記式（２）〜（４）のいずれかで表される複合体と、α−β−γ［但し、α、β、γは、前記式（３）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを含む混合液をインキュベートする工程であって、
前記混合液中で、前記試料中の対象核酸が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の核酸構造体からβ−γの塩基配列を有する一本鎖核酸が解離する工程（ａ１）と、
α−β−γの塩基配列を有する前記一本鎖核酸断片が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の核酸構造体からαの塩基配列を有する一本鎖核酸及び対象核酸が解離することにより、前記第１の粒子と前記第２の粒子の結合が解離し、更に対象核酸が再生される工程（ａ２）とを含む、請求項１０に記載の検出方法。

【請求項12】

下記工程（ａａ）、（ｂｂ）及び（ｃｃ）を備える、試料中の対象核酸の検出方法。
工程（ａａ）：前記試料と、請求項５〜８のいずれか一項に記載の複合体とを含む混合液をインキュベートする工程であって、前記混合液中で、足場依存型鎖交換反応により前記第１の粒子と前記第２の粒子との結合が解離するとともに対象核酸が増幅される工程。
工程（ｂｂ）：工程（ａａ）の後に、解離した前記第２の粒子及び未反応の前記複合体を凝集させる工程であって、その結果、解離した前記第１の粒子が前記混合液中に分散する工程。
工程（ｃｃ）：工程（ｂｂ）の後に、前記混合液中の前記第１の粒子の存在量を測定する工程であって、測定された前記存在量が前記対象核酸の存在量に対応する工程。

【請求項13】

前記工程（ａａ）が、前記試料と、下記式（６）で表され、第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した第１の複合体と、下記式（７）で表され、第２の核酸構造体を介して前記第１の粒子と前記第２の粒子とが結合した第２の複合体と、下記式（８）で表される第３の核酸構造体と、λ−γ−β−γ［但し、λ、β、γは、下記式（８）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを含む混合液をインキュベートする工程であって、
前記対象核酸がγ−δ［但し、γは前記式（３）における定義に同じであり、δは前記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片であり、
前記混合液中で、前記試料中の対象核酸が前記第３の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第３の核酸構造体からα−β−γの塩基配列を有する一本鎖核酸が解離する工程（ａａ１）と、
α−β−γの塩基配列を有する前記一本鎖核酸断片が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の核酸構造体からαの塩基配列を有する一本鎖核酸及びγ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が解離することにより、前記第１の粒子と前記第２の粒子の結合が解離し、更に対象核酸が生成される工程（ａａ２）と、
λ−γ−β−γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が前記第３の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第３の核酸構造体からθ−λ−γの塩基配列を有する一本鎖核酸及び対象核酸が解離することにより、対象核酸が再生される工程（ａａ３）と、
θ−λ−γの塩基配列を有する前記一本鎖核酸断片が前記第２の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第２の核酸構造体からθの塩基配列を有する一本鎖核酸及びγ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が解離することにより、前記第１の粒子と前記第２の粒子の結合が解離し、更に対象核酸が生成される工程（ａａ４）とを含む、請求項１２に記載の検出方法。

【化6】

［式（６）中、Ｘ^１、Ｘ^２、α、α’、β’、γ、γ’及びδ’は前記式（３）における定義に同じであり、δは前記δ’又と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］

【化7】

［式（７）中、Ｘ^１、Ｘ^２、γ、γ’、δ及びδ’は前記式（６）における定義に同じであり、θ’及びλ’はそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、θは前記θ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］

【化8】

［式（８）中、α、β、β’、γ、γ’、δ’は前記式（３）における定義に同じであり、θ及びλはそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、λ’は前記λと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］

【請求項14】

請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合体を備える、試料中の対象核酸の検出キット。

【請求項15】

前記式（２）〜（４）のいずれかで表される複合体と、α−β−γ［但し、α、β、γは、前記式（３）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを備え、前記対象核酸がγ−δ［但し、γは前記式（３）における定義に同じであり、δは前記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片である、請求項１４に記載のキット。

【請求項16】

前記式（６）で表され、第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した第１の複合体と、前記式（７）で表され、第２の核酸構造体を介して前記第１の粒子と前記第２の粒子とが結合した第２の複合体と、前記式（８）で表される第３の核酸構造体と、λ−γ−β−γ［但し、λ、β、γは、前記式（８）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを備え、前記対象核酸がγ−δ［但し、γは前記式（３）における定義に同じであり、δは前記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片である、請求項１４に記載のキット。

【請求項17】

増感剤を更に備える、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、複合体、試料中の対象核酸の検出方法及びキットに関する。

【背景技術】

【0002】

近年の分子生物学の急速な発展に伴い、疾病に関与する様々な核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）の存在が明らかになりつつある。特に、タンパク質をコードしていない約２０塩基の１本鎖の非翻訳ＲＮＡであるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が、自身の配列と相補的な配列を持つｍＲＮＡの翻訳を制御していることが明らかとなっている。ｍｉＲＮＡは、癌、循環器疾患、神経系疾患を含むヒトの様々な疾患に関与していることからもその重要性が広く認識されつつある。

【0003】

近年、疾患に関与するｍｉＲＮＡがエクソソーム（脂質膜で構成された大きさ３０〜１００ｎｍのベシクル）に封入された状態で血中に安定に存在することが報告されている。したがって、臓器と比ベてアクセスしやすい血中からｍｉＲＮＡを高感度にその場で検出することができれば様々な疾病に対する早期診断が可能になると考えられる。

【0004】

現在、血中ｍｉＲＮＡ等の対象核酸を検出する手法としては、ＲＴ−ＰＣＲ（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応）法等が用いられている（例えば非特許文献１を参照。）。

【0005】

また、より簡便な対象核酸の比色検出システムとして、ＤＮＡ化金ナノ粒子を用いた手法が数多く報告されている（例えば、非特許文献２を参照。）。これらは、金ナノ粒子表面に存在するＤＮＡと対象核酸がハイブリダイゼーションすることでＤＮＡ化金ナノ粒子が凝集（架橋）し、溶液の色が赤色から紫色に変化する現象を利用したものである。また、ＤＮＡ化金ナノ粒子を用いた手法にシグナル増幅機能を付与した検出システムも報告されている（例えば、非特許文献３を参照。）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Chen C., et al., Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR., Nucleic Acids Res., 33 (20), e179. 2005.

【非特許文献2】Mirkin C. A., et al., A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials., Nature, 382 (6592), 607-609, 1996.

【非特許文献3】Song T. and Liang H., Synchronized assembly of gold nanoparticles driven by a dynamic DNA-fueled molecular machine., J. Am. Chem. Soc., 134 (26), 10803-10806, 2012.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、非特許文献１に記載の方法は、手間、時間、コストのかかる前処理（対象核酸の精製等）及び高価な装置（リアルタイムＰＣＲ装置等）が必要不可欠であり、対象核酸のその場検出には利用しにくい場合がある。また、非特許文献２に記載の方法は、検出感度が低く、対象核酸の検出限界濃度は１０ｎＭ程度である。また、非特許文献３に記載の方法は、非特許文献２に記載の方法よりも検出感度が向上し、対象核酸の検出限界濃度は０．２６ｎＭ程度であるが、検出に要する時間が極めて長く、約１２時間を要する。そこで、本発明は、対象核酸を簡便に検出する技術を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は以下の態様を含む。
［１］第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した複合体であって、前記第１の核酸構造体の足場依存型鎖交換反応によって、前記第１の粒子と前記第２の粒子との結合が解離する、複合体。
［２］前記第１の粒子が光学的に識別可能である、［１］に記載の複合体。
［３］前記第１の粒子に水溶性高分子化合物が結合している、［１］又は［２］に記載の複合体。
［４］遠心分離又は磁石を近接させることにより前記第２の粒子が凝集する、［１］〜［３］のいずれかに記載の複合体。
［５］下記式（１）で表される、［１］〜［４］のいずれかに記載の複合体。

【化1】

［式（１）中、Ｘ^１又はＸ^２は一方が前記第１の粒子を表し、他方が前記第２の粒子を表し、γ及びδ’はそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、γ’は前記γと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］
［６］下記式（２）で表される、［１］〜［４］のいずれかに記載の複合体。

【化2】

［式（２）中、Ｘ^１、Ｘ^２、γ、γ’及びδ’は前記式（１）における定義に同じであり、α及びβはそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、α’及びβ’はそれぞれ前記α又は前記βと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］
［７］下記式（３）又は下記式（４）で表される、［１］〜［４］のいずれかに記載の複合体。

【化3】

［式（３）中、Ｘ^１、Ｘ^２、α、α’、β、β’、γ、γ’及びδ’は前記式（２）における定義に同じであり、εはそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、ε’は前記εと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］

【化4】

［式（４）中、Ｘ^１、Ｘ^２、α、α’、β、β’、γ、γ’、δ’、ε及びε’は前記式（３）における定義に同じである。］
［８］第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した複合体であって、前記第１の核酸構造体の足場依存型鎖交換反応によって、対象核酸が生成される、複合体。
［９］前記第１の粒子が光学的に識別可能である、［８］に記載の複合体。
［１０］前記第１の粒子に水溶性高分子化合物が結合している、［８］又は［９］に記載の複合体。
［１１］遠心分離又は磁石を近接させることにより前記第２の粒子が凝集する、［８］〜［１０］のいずれかに記載の複合体。
［１２］下記式（５）で表される、［８］〜［１１］のいずれかに記載の複合体。

【化5】

［式（５）中、Ｘ^１、Ｘ^２、α、α’、β’、γ、γ’及びδ’は前記式（３）における定義に同じであり、δは前記δ’又と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］
［１３］下記工程（ａ）〜（ｃ）を備える、試料中の対象核酸の検出方法。
工程（ａ）：前記試料と、［１］〜［７］のいずれかに記載の複合体とを含む混合液をインキュベートする工程であって、前記混合液中で、前記試料中の対象核酸が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の粒子と前記第２の粒子との結合が解離する工程。
工程（ｂ）：工程（ａ）の後に、解離した前記第２の粒子及び未反応の前記複合体を凝集させる工程であって、その結果、解離した前記第１の粒子が前記混合液中に分散する工程。
工程（ｃ）：工程（ｂ）の後に、前記混合液中の前記第１の粒子の存在量を測定する工程であって、測定された前記存在量が前記対象核酸の存在量に対応する工程。
［１４］工程（ａ）における前記複合体が［５］〜［７］のいずれかに記載の複合体であり、前記対象核酸がγ−δ［但し、γは前記式（３）における定義に同じであり、δは前記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片である、［１３］に記載の検出方法。
［１５］前記工程（ａ）が、前記試料と、［６］又は［７］に記載の複合体と、α−β−γ［但し、α、β、γは、前記式（３）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを含む混合液をインキュベートする工程であって、
前記混合液中で、前記試料中の対象核酸が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の核酸構造体からβ−γの塩基配列を有する一本鎖核酸が解離する工程（ａ１）と、
α−β−γの塩基配列を有する前記一本鎖核酸断片が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の核酸構造体からαの塩基配列を有する一本鎖核酸及び対象核酸が解離することにより、前記第１の粒子と前記第２の粒子の結合が解離し、更に対象核酸が再生される工程（ａ２）とを含む、［１４］に記載の検出方法。
［１６］下記工程（ａａ）、（ｂｂ）及び（ｃｃ）を備える、試料中の対象核酸の検出方法。
工程（ａａ）：前記試料と、［１２］に記載の複合体とを含む混合液をインキュベートする工程であって、前記混合液中で、足場依存型鎖交換反応により前記第１の粒子と前記第２の粒子との結合が解離するとともに対象核酸が増幅される工程。
工程（ｂｂ）：工程（ａａ）の後に、解離した前記第２の粒子及び未反応の前記複合体を凝集させる工程であって、その結果、解離した前記第１の粒子が前記混合液中に分散する工程。
工程（ｃｃ）：工程（ｂｂ）の後に、前記混合液中の前記第１の粒子の存在量を測定する工程であって、測定された前記存在量が前記対象核酸の存在量に対応する工程。
［１７］前記工程（ａａ）が、前記試料と、下記式（６）で表され、第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した第１の複合体と、下記式（７）で表され、第２の核酸構造体を介して前記第１の粒子と前記第２の粒子とが結合した第２の複合体と、下記式（８）で表される第３の核酸構造体と、λ−γ−β−γ［但し、λ、β、γは、下記式（８）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを含む混合液をインキュベートする工程であって、
前記対象核酸がγ−δ［但し、γは前記式（３）における定義に同じであり、δは前記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片であり、
前記混合液中で、前記試料中の対象核酸が前記第３の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第３の核酸構造体からα−β−γの塩基配列を有する一本鎖核酸が解離する工程（ａａ１）と、
α−β−γの塩基配列を有する前記一本鎖核酸断片が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の核酸構造体からαの塩基配列を有する一本鎖核酸及びγ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が解離することにより、前記第１の粒子と前記第２の粒子の結合が解離し、更に対象核酸が生成される工程（ａａ２）と、
λ−γ−β−γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が前記第３の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第３の核酸構造体からθ−λ−γの塩基配列を有する一本鎖核酸及び対象核酸が解離することにより、対象核酸が再生される工程（ａａ３）と、
θ−λ−γの塩基配列を有する前記一本鎖核酸断片が前記第２の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第２の核酸構造体からθの塩基配列を有する一本鎖核酸及びγ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が解離することにより、前記第１の粒子と前記第２の粒子の結合が解離し、更に対象核酸が生成される工程（ａａ４）とを含む、［１６］に記載の検出方法。

【化6】

［式（６）中、Ｘ^１、Ｘ^２、α、α’、β’、γ、γ’及びδ’は前記式（３）における定義に同じであり、δは前記δ’又と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］

【化7】

［式（７）中、Ｘ^１、Ｘ^２、γ、γ’、δ及びδ’は前記式（６）における定義に同じであり、θ’及びλ’はそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、θは前記θ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］

【化8】

［式（８）中、α、β、β’、γ、γ’、δ’は前記式（３）における定義に同じであり、θ及びλはそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、λ’は前記λと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］
［１８］［１］〜［１２］のいずれかに記載の複合体を備える、試料中の対象核酸の検出キット。
［１９］［６］又は［７］に記載の複合体と、α−β−γ［但し、α、β、γは、前記式（３）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを備え、前記対象核酸がγ−δ［但し、γは前記式（３）における定義に同じであり、δは前記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片である、［１８］に記載のキット。
［２０］前記式（６）で表され、第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した第１の複合体と、前記式（７）で表され、第２の核酸構造体を介して前記第１の粒子と前記第２の粒子とが結合した第２の複合体と、前記式（８）で表される第３の核酸構造体と、λ−γ−β−γ［但し、λ、β、γは、前記式（８）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを備え、前記対象核酸がγ−δ［但し、γは前記式（３）における定義に同じであり、δは前記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片である、［１８］に記載のキット。
［２１］増感剤を更に備える、［１８］〜［２０］のいずれかに記載のキット。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、対象核酸を簡便に検出する技術を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】複合体の一例を示す模式図である。

【図2】ＤＮＡの鎖交換反応の一例を示す模式図である。

【図3】ＤＮＡの足場依存型鎖交換反応の一例を示す模式図である。

【図4】実験例２において、波長５２２ｎｍにおける吸光度を測定した結果を示すグラフである。

【図5】実験例３において、波長５２２ｎｍにおける吸光度を測定した結果を示すグラフである。

【図6】実験例４において、波長５２２ｎｍにおける吸光度を測定した結果を示すグラフである。また、挿入図は、ｍｉＲ３４ｃの濃度０〜１．０ｎＭの範囲の拡大図である。

【図7】実験例５において、波長５７５ｎｍにおける吸光度を測定した結果を示すグラフである。また、挿入図は、ｍｉＲ３４ｃの濃度０〜０．１ｎＭの範囲の拡大図である。

【図8】実験例５の増幅反応の前後における反応液の写真である。

【図9】実験例６の増幅反応の前後における反応液の写真である。

【図10】実験例６の増幅反応前の波長５２２ｎｍにおける吸光度の測定結果を示すグラフである。また、挿入図は、増幅反応後の波長５７５ｎｍにおける吸光度の測定結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

［複合体］
１実施形態において、本発明は、第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した複合体であって、前記第１の核酸構造体の足場依存型鎖交換反応によって、前記第１の粒子と前記第２の粒子との結合が解離する、複合体を提供する。

【0012】

図１は、本実施形態の複合体の一例を示す模式図である。図１に示すように、複合体１００は、第１の粒子１１０と、第２の粒子１２０と、第１の核酸構造体１３０とを備える。第１の核酸構造体１３０の一部は第１の粒子１１０と結合している。また、第１の核酸構造体１３０の他の一部は第２の粒子１２０と結合している。すなわち、第１の粒子１１０と第２の粒子１２０とは、第１の核酸構造体１３０を介して結合している。後述するように、第１の核酸構造体が、足場依存型鎖交換反応を行うことにより、第１の粒子１１０と第２の粒子１２０との結合が解離する。

【0013】

（鎖交換反応）
ここで、図２を参照しながら、鎖交換反応について説明する。図２は、ＤＮＡの鎖交換反応の一例を示す模式図である。図２では、一本鎖ＤＮＡ断片２１０と、これに相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片２２０とがハイブリダイズして、二本鎖ＤＮＡ断片２３０を形成している。二本鎖ＤＮＡ断片２３０に、一本鎖ＤＮＡ断片２２０と同じ塩基配列を有する別の一本鎖ＤＮＡ断片２２０’を混合してインキュベートすると、やがて、一本鎖ＤＮＡ断片２２０と一本鎖ＤＮＡ断片２２０’とが置換される。この、一本鎖ＤＮＡ断片２２０と一本鎖ＤＮＡ断片２２０’との置換反応を鎖交換反応という。

【0014】

鎖交換反応の結果、一本鎖ＤＮＡ断片２２０と一本鎖ＤＮＡ断片２２０’とが置換され、一本鎖ＤＮＡ断片２１０と一本鎖ＤＮＡ断片２２０’とがハイブリダイズした二本鎖ＤＮＡ断片２３０’と、遊離した一本鎖ＤＮＡ断片２２０とが生成される。しかしながら、図２に示す鎖交換反応は反応に長時間を必要とすることが知られている。

【0015】

（足場依存型鎖交換反応）
続いて、図３を参照しながら、足場依存型鎖交換反応について説明する。図３は、ＤＮＡの足場依存型鎖交換反応の一例を示す模式図である。図３では、一本鎖ＤＮＡ断片３１０と、これに相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片３２０とがハイブリダイズして、二本鎖ＤＮＡ断片３３０を形成している。

【0016】

ここで、一本鎖ＤＮＡ断片３１０のうち、一本鎖ＤＮＡ断片３２０とハイブリダイズしていない領域３１１を足場（ｔｏｅ−ｈｏｌｄ）という。二本鎖ＤＮＡ断片３３０に、一本鎖ＤＮＡ断片３１０に相補的な塩基配列を有する別の一本鎖ＤＮＡ断片３４０を混合してインキュベートすると、やがて、一本鎖ＤＮＡ断片３１０の足場領域３１１に一本鎖ＤＮＡ断片３４０の一部がハイブリダイズする。続いて、足場領域３１１におけるハイブリダイゼーションを起点として、一本鎖ＤＮＡ断片３４０と一本鎖ＤＮＡ断片３２０とが置換される。この、足場領域３１１を介した、一本鎖ＤＮＡ断片３４０と一本鎖ＤＮＡ断片３２０との置換反応を足場依存型鎖交換反応という。

【0017】

足場依存型鎖交換反応の結果、一本鎖ＤＮＡ断片３２０と一本鎖ＤＮＡ断片３４０とが置換され、一本鎖ＤＮＡ断片３１０と一本鎖ＤＮＡ断片３４０とがハイブリダイズした二本鎖ＤＮＡ断片３３０’と、遊離した一本鎖ＤＮＡ断片３２０とが生成される。

【0018】

二本鎖ＤＮＡ断片３３０’において、一本鎖ＤＮＡ断片３１０のうち、一本鎖ＤＮＡ断片３４０とハイブリダイズしていない領域３１２は、再び足場として機能する。その結果、今度は一本鎖ＤＮＡ断片３２０と一本鎖ＤＮＡ断片３４０とが置換される逆反応が進む。

【0019】

足場依存型鎖交換反応は、上述した足場を介しない鎖交換反応と比較して、速度定数ｋ（Ｍ^−１ｓ^−１）が１０^５〜１０^７倍増加することが知られている。また、足場の長さは４〜６塩基で十分であることが知られている。

【0020】

後述するように、本実施形態の複合体では、第１の粒子と第２の粒子とを結合する、第１の核酸構造体上で行われる足場依存型鎖交換反応によって、前記第１の粒子と前記第２の粒子との結合が解離する。そして、解離した第１の粒子を検出することにより、対象核酸を検出することができる。

【0021】

実施例において後述するように、本実施形態の複合体を利用することにより、対象核酸を簡便に検出する技術を提供することができる。また、実施例において後述するように、本実施形態の複合体を利用した対象核酸の検出では、対象核酸を精製することなく、細胞抽出液等の生体試料中の対象核酸を直接検出することもできる。したがって、例えば、血中からｍｉＲＮＡを高感度にその場で検出すること等が可能となる。

【0022】

本実施形態の複合体において、第１の粒子１１０は光学的に識別可能であってもよい。ここで、光学的に識別可能とは、例えば、可視光の吸収、蛍光、酵素反応により発色、蛍光又は化学発光を生じること等により、第１の粒子１１０の存在を検出可能であることを意味する。

【0023】

例えば、第１の粒子１１０はナノオーダーの直径を有する金粒子（金ナノ粒子）であってもよい。金ナノ粒子は、そのサイズ、形状、表面の修飾、凝集状態等に依存して吸光特性が変化することが知られている。あるいは、第１の粒子１１０は、量子ドットであってもよく、色素、蛍光物質、酵素（アルカリフォスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等）等で修飾した樹脂粒子等であってもよい。

【0024】

また、第１の粒子１１０には、水溶性高分子化合物が結合していてもよい。水溶性高分子化合物としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、デキストラン等が挙げられる。水溶性高分子化合物は、非イオン性であってもよく、イオン性であってもよい。水溶性高分子化合物が非イオン性であると、第１の粒子１１０の表面の電荷を減らす効果が高い傾向にあり、好ましい。

【0025】

第１の粒子１１０の表面に水溶性高分子化合物を結合させることにより、第１の粒子１１０の表面への生体物質の非特異的吸着を抑制することができる。また、水溶性高分子化合物を結合させることにより、第１の粒子１１０の表面の電荷を減らすことができる。この結果、水溶性高分子化合物を有しない第１の粒子１１０における鎖交換反応よりも、水溶性高分子化合物が結合した第１の粒子１１０における鎖交換反応の方が、反応速度が向上する傾向にある。

【0026】

水溶性高分子化合物の分子量は、第１の粒子１１０の表面の第１の核酸構造体を水溶性高分子化合物の分子量が覆ってしまわない（第１の核酸構造体が露出する）程度の分子量であることが好ましい。水溶性高分子化合物の分子量としては、例えば２００〜１５０００程度が挙げられる。

【0027】

本実施形態の複合体において、第２の粒子１２０は、遠心分離又は磁石を近接させることにより凝集するものであることが好ましい。第２の粒子１２０が、遠心分離又は磁石を近接させることにより凝集するものであると、上述した足場依存型鎖交換反応で第１の粒子１１０と第２の粒子１２０との結合が解離した後、遊離の第１の粒子１１０とそれ以外の粒子（第２の粒子１２０、第１の粒子１１０と第２の粒子１２０との結合が維持されている未反応の複合体等）を容易に分離することができる。その結果、遊離の第１の粒子１１０の量を測定することが容易になる。

【0028】

遠心分離の条件としては、遊離の第１の粒子１１０とそれ以外の粒子を簡便且つ確実に分離することができれば特に制限されず、例えば１５，０００×ｇ以下で５分間以内の条件等が挙げられる。

【0029】

あるいは、第２の粒子１２０は、磁気粒子であってもよい。第２の粒子１２０が磁気粒子であると、磁気スタンド等により磁場を適用することにより、反応チューブの壁面等に第２の粒子１２０を容易に凝集させることができる。これにより、遊離の第１の粒子１１０とそれ以外の粒子を簡便且つ確実に分離することができる。

【0030】

（複合体：第１実施形態）
１実施形態において、上述した複合体は下記式（１）で表されるものであってもよい。

【0031】

【化9】

【0032】

式（１）中、Ｘ^１又はＸ^２は一方が前記第１の粒子を表し、他方が前記第２の粒子を表し、γ及びδ’はそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、γ’は前記γと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。

【0033】

式（１）において、粒子Ｘ^１は一本鎖核酸断片γと結合している。また、一本鎖核酸断片γ’及びδ’は連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、粒子Ｘ^２は一本鎖核酸断片δ’と結合している。また、一本鎖核酸断片γとγ’とはハイブリダイズしている。その結果、一本鎖核酸断片γ、γ’及びδ’は第１の核酸構造体を形成しており、第１の核酸構造体を介して粒子Ｘ^１と粒子Ｘ^２とが結合し、複合体を形成している。

【0034】

ここで、粒子Ｘ^１又はＸ^２と核酸断片とは直接結合していてもよいし、スペーサーを介して結合していてもよい。スペーサーとしては任意の２価の基が挙げられ、例えば炭素数１〜２０のアルキレン基、炭素数２〜２０のポリオキシエチレン基、オリゴヌクレオチド鎖、ペプチド鎖等が挙げられる。

【0035】

式（１）で表される複合体にγ−δ［但し、γは上記式（１）における定義に同じであり、δは上記式（１）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を接触させると、式（１）におけるδ’の領域を足場として足場依存型鎖交換反応が生じる。その結果、式（１）におけるＸ^１−γが解離する。その結果、粒子Ｘ^１と粒子Ｘ^２との結合が解離する。粒子Ｘ^１と粒子Ｘ^２との結合が解離した状態を下記式（１−１）に示す。

【化10】

【0036】

式（１−１）において、一本鎖核酸断片γ及びγ’、δ及びδ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、Ｘ^１−γは遊離している。

【0037】

（複合体：第２実施形態）
１実施形態において、上述した複合体は下記式（２）で表されるものであってもよい。

【0038】

【化11】

【0039】

式（２）中、Ｘ^１、Ｘ^２、γ、γ’及びδ’は上記式（１）における定義に同じであり、α及びβはそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、α’及びβ’はそれぞれ前記α又は前記βと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。

【0040】

式（２）で表される複合体において、粒子Ｘ^１は一本鎖核酸断片αと結合している。また、一本鎖核酸断片β及びγは連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、一本鎖核酸断片α’、β’、γ’及びδ’は連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、粒子Ｘ^２は一本鎖核酸断片δ’と結合している。また、一本鎖核酸断片α及びα’、β及びβ’、γ及びγ’は、それぞれハイブリダイズしているが、αとβとは結合していない。その結果、一本鎖核酸断片α、α’、β、β’、γ、γ’及びδ’は第１の核酸構造体を形成しており、第１の核酸構造体を介して粒子Ｘ^１と粒子Ｘ^２とが結合し、複合体を形成している。

【0041】

式（１）で表される複合体と同様に、式（２）で表される複合体において、粒子Ｘ^１又はＸ^２と核酸断片とは直接結合していてもよいし、スペーサーを介して結合していてもよい。スペーサーとしては上述したものと同様のものが挙げられる。

【0042】

ここで、式（２）で表される複合体にγ−δ［但し、γは上記式（１）における定義に同じであり、δは上記式（１）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を接触させた場合の反応について説明する。γ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片は、例えば、対象核酸（検出対象である一本鎖核酸断片）である。

【0043】

式（２）で表される複合体にγ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片を接触させると、式（２）におけるδ’の領域を足場として足場依存型鎖交換反応が生じる。その結果、式（２）におけるβ−γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が解離する。β−γが解離した状態を下記式（２−１）に示す。

【化12】

【0044】

式（２−１）において、一本鎖核酸断片α及びα’、γ及びγ’、δ及びδ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、β−γは遊離している。

【0045】

続いて、式（２−１）で表される複合体にα−β−γ［但し、α、β、γは、上記式（２）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を接触させると、式（２−１）におけるβ’の領域を足場として足場依存型鎖交換反応が生じる。その結果、式（２−１）におけるγ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片、及びＸ^１−αが解離する。その結果、粒子Ｘ^１と粒子Ｘ^２との結合が解離するとともに、γ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が再生される。ここで、再生されるとは、一度足場依存型鎖交換反応に関与した、γ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が、再び新たな足場依存型鎖交換反応に関与できる状態になることを意味する。

【0046】

γ−δが再生され、粒子Ｘ^１と粒子Ｘ^２との結合が解離した状態を下記式（２−２）に示す。

【0047】

【化13】

【0048】

式（２−２）において、一本鎖核酸断片α及びα’、β及びβ’、γ及びγ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、β−γ、Ｘ^１−α、及びγ−δはそれぞれ遊離している。このように、第２実施形態の複合体は、γ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片を再生することができる。

【0049】

１実施形態において、上述した複合体は下記式（３）又は下記式（４）で表されるものであってもよい。

【0050】

【化14】

【0051】

式（３）中、Ｘ^１、Ｘ^２、α、α’、β、β’、γ、γ’及びδ’は上記式（２）における定義に同じであり、εはそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、ε’は前記εと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。式（３）で表される複合体は、後述する実施例で使用した複合体に相当するものである。

【0052】

【化15】

【0053】

式（４）中、Ｘ^１、Ｘ^２、α、α’、β、β’、γ、γ’、δ’、ε及びε’は上記式（３）における定義に同じである。

【0054】

式（３）で表される複合体は、上述した式（２）で表される複合体と類似した構成を有しており、一本鎖核酸断片ε及びε’が存在する点において、式（２）で表される複合体と相違している。

【0055】

式（３）で表される複合体において、粒子Ｘ^１は一本鎖核酸断片αと結合している。また、一本鎖核酸断片β及びγは連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、一本鎖核酸断片α’、β’、γ’、δ’及びε’は連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、粒子Ｘ^２は一本鎖核酸断片εと結合している。また、一本鎖核酸断片α及びα’、β及びβ’、γ及びγ’、ε及びε’は、それぞれハイブリダイズしているが、αとβとは結合していない。また、γとεとは結合していない。その結果、一本鎖核酸断片α、α’、β、β’、γ、γ’、δ’、ε及びε’は第１の核酸構造体を形成しており、第１の核酸構造体を介して粒子Ｘ^１と粒子Ｘ^２とが結合し、複合体を形成している。

【0056】

式（１）で表される複合体と同様に、式（３）で表される複合体において、粒子Ｘ^１又はＸ^２と核酸断片とは直接結合していてもよいし、スペーサーを介して結合していてもよい。スペーサーとしては上述したものと同様のものが挙げられる。

【0057】

式（４）で表される複合体は、式（３）で表される複合体と類似した構成を有しており、粒子Ｘ^２が結合している一本鎖核酸断片がεではなくε’である点において相違している。式（４）で表される複合体も、式（３）で表される複合体と同様に機能することができる。

【0058】

ここで、式（３）で表される複合体にγ−δ［但し、γは上記式（１）における定義に同じであり、δは上記式（１）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を接触させた場合の反応について説明する。γ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片は、例えば、対象核酸（検出対象である一本鎖核酸断片）である。

【0059】

式（３）で表される複合体にγ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片を接触させると、式（３）におけるδ’の領域を足場として足場依存型鎖交換反応が生じる。その結果、式（３）におけるβ−γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が解離する。β−γが解離した状態を下記式（３−１）に示す。

【0060】

【化16】

【0061】

式（３−１）において、一本鎖核酸断片α及びα’、γ及びγ’、δ及びδ’、ε及びε’は、それぞれハイブリダイズしている。また、β−γは遊離している。

【0062】

続いて、式（３−１）で表される複合体にα−β−γ［但し、α、β、γは、上記式（２）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を反応させると、式（３−１）におけるβ’の領域を足場として足場依存型鎖交換反応が生じる。その結果、式（３−１）におけるγ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片、及びＸ^１−αが解離する。その結果、粒子Ｘ^１と粒子Ｘ^２との結合が解離するとともに、γ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が再生される。ここで、再生されるとは、一度足場依存型鎖交換反応に関与した、γ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が、再び新たな足場依存型鎖交換反応に関与できる状態になることを意味する。

【0063】

γ−δが再生され、粒子Ｘ^１と粒子Ｘ^２との結合が解離した状態を下記式（３−２）に示す。

【0064】

【化17】

【0065】

式（３−２）において、一本鎖核酸断片α及びα’、β及びβ’、γ及びγ’、ε及びε’は、それぞれハイブリダイズしている。また、β−γ、Ｘ^１−α、及びγ−δはそれぞれ遊離している。このように、第２実施形態の複合体は、γ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片を再生することができる。

【0066】

式（４）で表される複合体に、上述したγ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片、及びα−β−γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片を接触させた場合においても、粒子Ｘ^２がεでなくε’と結合している点以外は、式（３）で表される複合体と同様の反応が生じる。

【0067】

（複合体：第３実施形態）
１実施形態において、本発明は、第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した複合体であって、前記第１の核酸構造体の足場依存型鎖交換反応によって、対象核酸が生成される、複合体を提供する。

【0068】

本明細書において、対象核酸とは、検出対象である核酸を意味する。本実施形態の複合体によれば、第１の核酸構造体の足場依存型鎖交換反応によって、対象核酸が生成され、試料中の対象核酸を増幅することができる。このため、本実施形態の複合体を使用することにより、対象核酸の検出感度を飛躍的に向上することができる。

【0069】

本実施形態の複合体は、第１の核酸構造体の足場依存型鎖交換反応によって、対象核酸が生成されるとともに、第１の粒子と第２の粒子との結合が解離するものであってもよい。

【0070】

また、本実施形態の複合体においても、上述した第１実施形態の複合体と同様に、第１の粒子が光学的に識別可能であってもよい。光学的に識別可能な第１の粒子としては、上述したものと同様のものが挙げられる。

【0071】

また、本実施形態の複合体においても、上述した第１実施形態の複合体と同様に、第１の粒子に水溶性高分子化合物が結合していてもよい。これにより、第１の粒子の表面への生体物質の非特異的吸着を抑制することができる。また、水溶性高分子化合物を結合させることにより、第１の粒子の表面の電荷を減らすことができ、反応速度を向上させることができる傾向にある。水溶性高分子化合物の種類及び分子量は上述したものと同様のものが挙げられる。

【0072】

また、本実施形態の複合体においても、上述した第１実施形態の複合体と同様に、遠心分離又は磁石を近接させることにより第２の粒子が凝集するものであることが好ましい。第２の粒子としては、上述したものと同様のものが挙げられる。

【0073】

本実施形態の複合体は、例えば、下記式（５）で表されるものであってもよい。

【0074】

【化18】

【0075】

式（５）中、Ｘ^１、Ｘ^２、α、α’、β’、γ、γ’及びδ’は上記式（３）における定義に同じであり、δは前記δ’又と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。

【0076】

式（１）で表される複合体と同様に、式（５）で表される複合体において、粒子Ｘ^１又はＸ^２と核酸断片とは直接結合していてもよいし、スペーサーを介して結合していてもよい。スペーサーとしては上述したものと同様のものが挙げられる。

【0077】

ここで、式（５）で表される複合体にα−β−γ［但し、α、β、γは、上記式（２）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を接触させた場合の反応について説明する。

【0078】

式（５）で表される複合体にα−β−γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片を接触させると、式（５）におけるβ’の領域を足場として足場依存型鎖交換反応が生じる。その結果、式（５）におけるγ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片、及びＸ^１−αが解離する。その結果、粒子Ｘ^１と粒子Ｘ^２との結合が解離するとともに、γ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が生成される。ここで、γ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片は、対象核酸である（対象核酸と同一の塩基配列を有している。）。

【0079】

γ−δが生成され、粒子Ｘ^１と粒子Ｘ^２との結合が解離した状態を下記式（５−１）に示す。

【0080】

【化19】

【0081】

式（５−１）において、一本鎖核酸断片α及びα’、β及びβ’、γ及びγ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、Ｘ^１−α及びγ−δはそれぞれ遊離している。このように、第３実施形態の複合体は、γ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片を新たに生成することができる。

【0082】

［試料中の対象核酸の検出方法］
１実施形態において、本発明は、下記工程（ａ）〜（ｃ）を備える、試料中の対象核酸の検出方法を提供する。
工程（ａ）：前記試料と、上述した第１実施形態又は第２実施形態の複合体とを含む混合液をインキュベートする工程であって、前記混合液中で、前記試料中の対象核酸が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の粒子と前記第２の粒子との結合が解離する工程。
工程（ｂ）：工程（ａ）の後に、解離した前記第２の粒子及び未反応の前記複合体を凝集させる工程であって、その結果、解離した前記第１の粒子が前記混合液中に分散する工程。
工程（ｃ）：工程（ｂ）の後に、前記混合液中の前記第１の粒子の存在量を測定する工程であって、測定された前記存在量が前記対象核酸の存在量に対応する工程。

【0083】

本実施形態の検出方法により試料中の対象核酸を簡便に検出することができる。以下各工程について説明する。

【0084】

《工程（ａ）》
対象核酸としては、一本鎖の核酸が好適である。核酸はＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、核酸アナログであってもよい。より具体的な対象核酸としては、ｍｉＲＮＡ、アプタマー等が挙げられる。アプタマーとしては、例えば、標的分子に結合することにより核酸断片をリリースする、構造スイッチングアプタマー等が挙げられる。この場合においては、リリースされた核酸断片を対象核酸としてもよい。

【0085】

対象核酸の長さは、例えば１０〜１００塩基であってもよく、１０〜５０塩基であってもよく、１０〜３０塩基であってもよい。

【0086】

また、対象核酸を含有する試料としては特に制限されず、例えば、血液、血清、血漿等の生体試料が挙げられるがこれに限定されない。

【0087】

混合液のインキュベート温度は、検出対象である対象核酸が足場依存型鎖交換反応を行うことができる温度であればよく、例えば１０〜５０℃の任意の温度であってもよく、例えば室温（約２５℃）であってもよい。また、均一に反応を進行させる観点から、インキュベート中に撹拌することが好ましい。

【0088】

本実施形態の検出方法は、従来法よりも短時間で対象核酸を検出することができる。したがって、インキュベート時間は例えば１０分間〜１０時間であってもよく、１０分間〜５時間であってもよく、１０分間〜３時間であってもよい。

【0089】

《工程（ｂ）》
続いて、本工程において、解離した第１の粒子をその他の粒子と分離する。その他の粒子とは、解離した第２の粒子、及び、未反応の複合体（第１の粒子と第２の粒子とが結合した複合体）である。

【0090】

例えば、第２の粒子が磁性粒子である場合、磁気スタンド等により磁場を適用することにより、解離した第２の粒子及び未反応の複合体を凝集させることができる。あるいは、例えば、第２の粒子が容易に遠心可能な粒子である場合、遠心分離することにより、解離した第２の粒子及び未反応の複合体を凝集させることができる。その結果、解離した第１の粒子を混合液中に分散することができる。

【0091】

《工程（ｃ）》
続いて、本工程において、混合液中に分散した第１の粒子の存在量を測定する。第１の粒子の存在量は、試料中の対象核酸の存在量に対応する。例えば、第１の粒子が特定の波長の光を吸収するものである場合には、分光光度計等により第１の粒子の存在量を測定することができる。

【0092】

また、第１の粒子が蛍光を発するものである場合には、励起光を照射して、発生する蛍光を蛍光分光光度計等により測定することにより、第１の粒子の存在量を測定することができる。

【0093】

また、第１の粒子が酵素で標識されている場合、第１の粒子に適切な基質を反応させることにより生じる、発色、発光、蛍光等を測定することにより、第１の粒子の存在量を測定することができる。

【0094】

（検出方法：第１実施形態）
上述した第１実施形態の複合体を用いて本実施形態の検出方法を実施する場合について説明する。一例として、上記式（１）で表される複合体を使用して試料中の対象核酸を検出する場合について説明する。ここで、対象核酸はγ−δ［但し、γは上記式（１）における定義に同じであり、δは上記式（１）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片（例えば、ｍｉＲＮＡ）であるものとする。

【0095】

《工程（ａ）》
本工程において、試料と、式（１）で表される複合体とを混合して混合液を調製し、インキュベートする。その結果、混合液中で、試料中の対象核酸が、式（１）で表される複合体を構成する第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行う。その結果、第１の粒子と第２の粒子との結合が解離する。この足場依存型鎖交換反応、及び第１の粒子と第２粒子との結合の解離については、第１実施形態の複合体の説明において上述したものと同様である。

【0096】

《工程（ｂ）及び工程（ｃ）》
工程（ｂ）及び工程（ｃ）については、上述したものと同様である。本実施形態の検出方法により、対象核酸を簡便に検出することができる。

【0097】

（検出方法：第２実施形態）
続いて、第２実施形態の検出方法について説明する。本実施形態の検出方法は、上述した第１実施形態の検出方法と、工程（ａ）が異なっている。本実施形態の検出方法の工程（ａ）は、下記工程（ａ１）及び（ａ２）を備える。
工程（ａ１）：試料と、上述した第２実施形態の複合体と、α−β−γ［但し、α、β、γは、前記式（３）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを含む混合液をインキュベートする工程であって、前記混合液中で、前記試料中の対象核酸が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の核酸構造体からβ−γの塩基配列を有する一本鎖核酸が解離する工程。
工程（ａ２）：α−β−γの塩基配列を有する前記一本鎖核酸断片が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の核酸構造体からαの塩基配列を有する一本鎖核酸及び対象核酸が解離することにより、前記第１の粒子と前記第２の粒子の結合が解離し、更に対象核酸が再生される工程。

【0098】

第２実施形態の検出方法では、試料中の対象核酸は、複合体中の第１の粒子及び第２の粒子を解離させた後、再生される。そして、再生された対象核酸は、更に別の複合体と反応し、第１の粒子と第２の粒子を解離させる。このため、本実施形態の検出方法では、対象核酸の検出速度又は検出感度が向上している。

【0099】

ここで、検出速度が向上しているとは、所定のレベルのシグナルを生成するのに要する時間が短縮することを意味する。また、検出感度が向上しているとは、工程（ａ）を所定の時間実施した場合に得られるシグナルが高くなることを意味する。

【0100】

ここで、一例として、上記式（２）で表される複合体を使用して試料中の対象核酸を検出する場合についてより詳細に説明する。ここで、対象核酸はγ−δ［但し、γは上記式（１）における定義に同じであり、δは上記式（１）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片（例えば、ｍｉＲＮＡ）であるものとする。

【0101】

《工程（ａ１）》
本工程において、試料と、式（２）で表される複合体と、α−β−γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを混合して混合液を調製し、インキュベートする。その結果、混合液中で、試料中の対象核酸が式（２）で表される複合体を構成する第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行う。その結果、第１の核酸構造体からβ−γの塩基配列を有する一本鎖核酸が解離する。この足場依存型鎖交換反応、及びβ−γの塩基配列を有する一本鎖核酸の解離については、第２実施形態の複合体の説明において上述したものと同様である。

【0102】

《工程（ａ２）》
続いて、本工程において、α−β−γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が、β−γが解離した第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行う。その結果、第１の核酸構造体から、αの塩基配列を有する一本鎖核酸が解離し、対象核酸が再生する。そして、第１の粒子と第２の粒子の結合が解離する。この足場依存型鎖交換反応、第１の粒子と第２粒子との結合の解離、及び対象核酸の再生については、第２実施形態の複合体の説明において上述したものと同様である。再生した対象核酸は、更に別の複合体と反応し、第１の粒子と第２の粒子を解離させる。このため、本実施形態の検出方法では、対象核酸の検出速度又は検出感度が向上している。

【0103】

《工程（ｂ）及び工程（ｃ）》
工程（ｂ）及び工程（ｃ）については、上述したものと同様である。

【0104】

（検出方法：第３実施形態）
続いて、第３実施形態の検出方法について説明する。本実施形態の検出方法は、下記工程（ａａ）、（ｂｂ）及び（ｃｃ）を備えている。
工程（ａａ）：試料と、上述した第３実施形態の複合体とを含む混合液をインキュベートする工程であって、前記混合液中で、足場依存型鎖交換反応により前記第１の粒子と前記第２の粒子との結合が解離するとともに対象核酸が増幅される工程。
工程（ｂｂ）：工程（ａａ）の後に、解離した前記第２の粒子及び未反応の前記複合体を凝集させる工程であって、その結果、解離した前記第１の粒子が前記混合液中に分散する工程。
工程（ｃｃ）：工程（ｂｂ）の後に、前記混合液中の前記第１の粒子の存在量を測定する工程であって、測定された前記存在量が前記対象核酸の存在量に対応する工程。

【0105】

ここで、対象核酸が増幅されるとは、対象核酸が新たに生成され、対象核酸の分子数が増加することを意味する。

【0106】

第３実施形態の検出方法では、試料中の対象核酸は、複合体中の第１の粒子及び第２の粒子を解離させた後再生され、更に新たに生成（増幅）される。そして、再生された対象核酸、及び新たに生成された対象核酸は、更に別の複合体と反応し、第１の粒子と第２の粒子を解離させ、更に対象核酸を増幅させる。このため、本実施形態の検出方法では、対象核酸の検出速度又は検出感度が格段に向上している。

【0107】

第３実施形態の複合体としては、上述した式（５）で表される複合体を利用することができる。第３実施形態の複合体は、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。

【0108】

ここで、一例として、第３実施形態の複合体を２種類用いる検出方法について、より詳細に説明する。ここで、対象核酸はγ−δ［但し、γは上記式（１）における定義に同じであり、δは上記式（１）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片（例えば、ｍｉＲＮＡ）であるものとする。

【0109】

本例においては、上述した工程（ａａ）は、後述する工程（ａａ１）、工程（ａａ２）、工程（ａａ３）及び工程（ａａ４）を備えている。また、対象核酸はγ−δ［但し、γは上記式（３）における定義に同じであり、δは上記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片（例えば、ｍｉＲＮＡ）であるものとする。

【0110】

《工程（ａａ１）》
本工程において、試料と、下記式（６）で表され、第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した第１の複合体と、下記式（７）で表され、第２の核酸構造体を介して前記第１の粒子と前記第２の粒子とが結合した第２の複合体と、下記式（８）で表される第３の核酸構造体と、λ−γ−β−γ［但し、λ、β、γは、下記式（８）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを混合して混合液を調製し、インキュベートする。

【0111】

【化20】

【0112】

式（６）中、Ｘ^１、Ｘ^２、α、α’、β’、γ、γ’及びδ’は上記式（３）における定義に同じであり、δは前記δ’又と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。

【0113】

式（６）で表される第１の複合体において、粒子Ｘ^１は一本鎖核酸断片αと結合している。また、一本鎖核酸断片γ及びδは連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、一本鎖核酸断片α’、β’、γ’及びδ’は連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、粒子Ｘ^２は一本鎖核酸断片δ’と結合している。また、一本鎖核酸断片α及びα’、γ及びγ’、δ及びδ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、αとγとは結合していない。その結果、一本鎖核酸断片α、α’、β’、γ、γ’、δ及びδ’は第１の核酸構造体を形成しており、第１の核酸構造体を介して粒子Ｘ^１と粒子Ｘ^２とが結合し、複合体を形成している。

【0114】

【化21】

【0115】

式（７）中、Ｘ^１、Ｘ^２、γ、γ’、δ及びδ’は上記式（６）における定義に同じであり、θ’及びλ’はそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、θは前記θ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。

【0116】

式（７）で表される第２の複合体において、粒子Ｘ^１は式（６）で表される複合体における粒子Ｘ^１と同じものであり、一本鎖核酸断片θと結合している。また、一本鎖核酸断片γ及びδは連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、一本鎖核酸断片θ’、λ’、γ’及びδ’は連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、粒子Ｘ^２は式（６）で表される複合体における粒子Ｘ^２と同じものであり、一本鎖核酸断片δ’と結合している。また、一本鎖核酸断片θ及びθ’、γ及びγ’、δ及びδ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、θとγとは結合していない。その結果、一本鎖核酸断片θ、θ’、λ’、γ、γ’、δ及びδ’は第２の核酸構造体を形成しており、第２の核酸構造体を介して粒子Ｘ^１と粒子Ｘ^２とが結合し、複合体を形成している。

【0117】

【化22】

【0118】

式（８）中、α、β、β’、γ、γ’、δ’は前記式（３）における定義に同じであり、θ及びλはそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、λ’は前記λと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。

【0119】

式（８）で表される第３の核酸構造体において、一本鎖核酸断片θ、λ及びγは連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、一本鎖核酸断片α、β及びγは連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、一本鎖核酸断片λ’、γ’、β’、γ’及びδ’は連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、一本鎖核酸断片λ及びλ’、２組存在するγ及びγ’、β及びβ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、γとβとは結合していない。

【0120】

ここで、上述した式（７）で表される複合体を構成する第２の核酸構造体、及び式（８）で表される第３の核酸構造体において、θ＝αであってもよい。すなわち、θ及びαは同じ塩基配列を有する一本鎖核酸断片であってもよい。これにより、式（６）で表される第１の複合体におけるＸ^１−αと式（７）で表される第２の複合体におけるＸ^１−θを共通化することができる。

【0121】

第１の複合体と、第２の複合体と、第３の核酸構造体と、λ−γ−β−γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを含む混合液をインキュベートした結果、混合液中で、試料中の対象核酸γ−δが式（８）で表される第３の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行う。その結果、第３の核酸構造体からα−β−γの塩基配列を有する一本鎖核酸が解離する。

【0122】

対象核酸γ−δが第３の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、第３の核酸構造体からα−β−γの塩基配列を有する一本鎖核酸が解離した状態を下記式（８−１）に示す。

【0123】

【化23】

【0124】

式（８−１）において、一本鎖核酸断片λ及びλ’、２組存在するγ及びγ’、δ及びδ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、α−β−γは遊離している。

【0125】

《工程（ａａ２）》
続いて、本工程において、工程（ａａ１）で遊離したα−β−γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が、上述した式（６）で表される複合体を構成する第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行う。その結果、第１の核酸構造体からαの塩基配列を有する一本鎖核酸及びγ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が解離する。そして、第１の粒子と第２の粒子の結合が解離し、更に対象核酸γ−δが生成される。

【0126】

α−β−γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が、式（６）で表される複合体を構成する第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行った結果、粒子Ｘ^１と粒子Ｘ^２との結合が解離し、対象核酸γ−δが生成された状態を下記式（６−１）に示す。

【0127】

【化24】

【0128】

式（６−１）において、一本鎖核酸断片α及びα’、β及びβ’、γ及びγ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、Ｘ^１−α及びγ−δはそれぞれ遊離している。この反応により、第１の粒子と第２の粒子の結合が解離するとともに、試料中のγ−δの分子数が増幅する。

【0129】

《工程（ａａ３）》
一方、工程（ａａ１）でインキュベートした混合液中のλ−γ−β−γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片は、上記式（８−１）で表される前記第３の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行う。その結果、式（８−１）で表される第３の核酸構造体からθ−λ−γの塩基配列を有する一本鎖核酸及び対象核酸γ−δが解離する。すなわち、一度足場依存型鎖交換反応を行った、試料中の対象核酸γ−δが再生され、再び反応に関与できる状態になる。

【0130】

式（８−１）で表される第３の核酸構造体からθ−λ−γの塩基配列を有する一本鎖核酸及び対象核酸γ−δが解離した状態を下記式（８−２）に示す。

【0131】

【化25】

【0132】

式（８−２）において、一本鎖核酸断片λ及びλ’、２組存在するγ及びγ’、β及びβ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、θ−λ−γ及びγ−δはそれぞれ遊離している。

【0133】

《工程（ａａ４）》
本工程において、工程（ａａ３）で遊離したθ−λ−γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が、上述した式（７）で表される複合体を構成する第２の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行う。その結果、第２の核酸構造体からθの塩基配列を有する一本鎖核酸及びγ−δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が解離する。そして、第１の粒子と第２の粒子の結合が解離し、更に対象核酸γ−δが生成される。

【0134】

θ−λ−γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が、式（７）で表される複合体を構成する第２の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行った結果、粒子Ｘ^１と粒子Ｘ^２との結合が解離し、対象核酸γ−δが生成された状態を下記式（７−１）に示す。

【0135】

【化26】

【0136】

式（７−１）において、一本鎖核酸断片θ及びθ’、λ及びλ’、γ及びγ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、Ｘ^１−θ及びγ−δはそれぞれ遊離している。この反応により、第１の粒子と第２の粒子の結合が解離するとともに、試料中のγ−δの分子数が増幅する。

【0137】

以上説明した工程（ａａ１）〜（ａａ４）は、混合液をインキュベートしている間、繰り返し進行する。そして、工程（ａａ２）、工程（ａａ４）で新たに生成された対象核酸γ−δ、及び、工程（ａａ３）で再生された対象核酸γ−δは、更に、未反応の第３の核酸構造体と反応し、第１の粒子Ｘ^１を解離させる。そして、遊離の粒子Ｘ^１の量は、工程（ｂｂ）及び工程（ｃｃ）を経て、試料中の対象核酸の量に対応するシグナルとして検出される。

【0138】

《工程（ｂｂ）及び工程（ｃｃ）》
工程（ｂｂ）は上述した工程（ｂ）と同様である。また、工程（ｃｃ）は上述した工程（ｃ）と同様である。

【0139】

《シグナル及び対象核酸の増幅》
本例の反応においては、工程（ａａ１）〜（ａａ４）が１回ずつ実行された場合を１サイクルとし、反応がｎサイクル実行されると、混合液中の対象核酸の存在量が３^ｎ倍に増幅する。また、遊離の粒子Ｘ^１の量は２×３^ｎ−１倍ずつ増幅する。このように、第３実施形態の検出方法によれば、対象核酸の検出速度又は検出感度が格段に向上している。

【0140】

［試料中の対象核酸の検出キット］
１実施形態において、本発明は、上述したいずれかの複合体を備える、試料中の対象核酸の検出キットを提供する。実施例において後述するように、本実施形態のキットによれば、試料中の対象核酸を簡便に検出することができる。

【0141】

（検出キット：第２実施形態）
１実施形態において、検出キットは、対象核酸がγ−δ［但し、γは前記式（３）における定義に同じであり、δは前記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片であり、上述した第２実施形態の複合体と、α−β−γ［但し、α、β、γは、前記式（３）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを備えるものであってもよい。

【0142】

本実施形態の検出キットは、上述した、第２実施形態の検出方法に使用することができる。本実施形態のキットによれば、対象核酸を再生することができるため、対象核酸の検出速度又は検出感度が向上している。

【0143】

（検出キット：第３実施形態）
１実施形態において、検出キットは、対象核酸がγ−δ［但し、γは前記式（３）における定義に同じであり、δは前記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片であり、上述した第３実施形態の複合体と、上記式（８）で表される核酸構造体と、λ−γ−β−γ［但し、λ、β、γは、前記式（８）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを備えるものであってもよい。

【0144】

第３実施形態の検出キットが備える複合体は、１種であってもよく、２種以上の組み合わせであってもよい。複合体が２種の組み合わせである場合、例えば、上記式（６）で表される第１の複合体と、上記式（７）で表される第２の複合体との組み合わせであってもよい。複合体を２種以上組み合わせることにより、対象核酸及びシグナルの増幅量を更に増大することができる。

【0145】

本実施形態の検出キットは、上述した、第３実施形態の検出方法に使用することができる。本実施形態のキットによれば、対象核酸を再生させるだけでなく、対象核酸を新たに生成（増幅）させることができるため、対象核酸の検出速度又は検出感度を格段に向上させることができる。

【0146】

（増感剤）
上述した検出キットは、更に増感剤を備えていてもよい。増感剤としては、複合体から解離した第１の粒子に由来するシグナルを増幅するものであれば特に制限されない。例えば、第１の粒子が金ナノ粒子である場合、テトラクロリド金（ＩＩＩ）酸と塩酸ヒドロキシルアミンの組み合わせ等が挙げられる。

【実施例】

【0147】

次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。

【0148】

＜実験例１＞
［複合体の調製］
下記式（３）で表される複合体を調製した。より具体的には、下記式（３）において、Ｘ^１が金ナノ粒子であり、Ｘ^２が磁気粒子であり、α、α’、β、β’、γ、γ’、δ’、ε及びε’が下記表１に示す塩基配列の一本鎖ＤＮＡである複合体を調製した。本実験例で調製した複合体は、ｍｉＲＮＡの１種であるｍｉＲ３４ｃ（配列番号１６）を対象核酸として検出できるものである。

【0149】

【化27】

【0150】

【表1】

【0151】

下記表２に、使用したＤＮＡ断片及びＲＮＡ断片の塩基配列の配列番号を示す。

【0152】

【表2】

【0153】

（ＤＮＡ／ＰＥＧ−金ナノ粒子の調製）
表面にＤＮＡ及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合した金ナノ粒子（以下、「ＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ−金ナノ粒子」といい、ここで、ｘは金ナノ粒子１個あたりのＤＮＡ鎖の平均数を表す。）を調製した。

【0154】

クエン酸で安定化した直径１５ｎｍの金ナノ粒子の溶液（２．３ｎＭ、１．４×１０^１２個／ｍＬ）１０００μＬに、１．０（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０水溶液１０μＬ、及び２０μＭのＤＮＡ（上記表２の「ｓ−２」）の水溶液（ｘ＝２２では３０μＬ、ｘ＝３３では３５μＬ、ｘ＝４２では４０μＬ、ｘ＝５５では５０μＬ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。

【0155】

続いて２０μＭのＰＥＧ（重量平均分子量６０００）の水溶液を３０μＬ添加した。１分間インキュベートした後、１０×リン酸バッファー（ＰＢＳ）を添加した。続いて、溶液を更に室温で１時間インキュベートした。

【0156】

続いて、溶液を２０，０００×ｇで２０分遠心し、遊離のＤＮＡ及びＰＥＧを除去することを３回繰り返した。上清を除去し、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５０μＬをＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ−金ナノ粒子の赤い油状の沈殿に添加して懸濁した。

【0157】

得られたＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ−金ナノ粒子の溶液は４℃で保存した。調製の過程で元の量の約３０％の金ナノ粒子が失われた。

【0158】

（ｄｓＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ−金ナノ粒子の調製）
ＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ−金ナノ粒子の０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液２５０μＬ（金ナノ粒子の濃度６ｎＭ、ｘ＝２２、３３、４２、５５）に、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２０μＭのＤＮＡ（上記表２の「ｓ−１」）１４μＬ、及び０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２０μＭのＤＮＡ（上記表２の「ｓ−３」）１２μＬを添加し、室温で６時間インキュベートした。

【0159】

続いて、溶液を２０，０００×ｇで２０分遠心し、遊離のＤＮＡを除去することを３回繰り返した。上清を除去し、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２００μＬをｄｓＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ−金ナノ粒子の赤い油状の沈殿に添加して懸濁した。

【0160】

続いて、各溶液の紫外光／可視光スペクトルを測定し、適切な量の０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加して、金ナノ粒子の濃度を４ｎＭに調整した。得られたｄｓＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ−金ナノ粒子の溶液は４℃で保存した。

【0161】

（複合体の調製）
ストレプトアビジン修飾された磁気粒子（２０μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、６×１０^８個／ｍＬ）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）２０μＬで３回洗浄した。続いて、磁気粒子に２０μＭのＤＮＡ（上記表２の「ｃａｐｔｕｒｅ−ＤＮＡ」）７．５μＬを添加して２５℃で３０分間穏やかに撹拌した。

【0162】

磁気スタンドを用いてＤＮＡ−磁気粒子を反応チューブの壁面に集め、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２０μＬで３回洗浄した。得られたＤＮＡ−磁気粒子に、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のｄｓＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ−金ナノ粒子（２０μＬ、金ナノ粒子の濃度＝４ｎＭ）を添加し、２５℃で３０分間穏やかに撹拌して、複合体を形成させた。磁気スタンドを用いて形成された複合体を反応チューブの壁面に集め、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２０μＬで３回洗浄した。

【0163】

続いて、上清の波長５２２ｎｍにおける吸光度（Ａ_５２２）を測定することにより複合体の収率を決定した。なお、金ナノ粒子は波長５２２ｎｍに吸光のピークを有している。続いて、複合体を０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）３０μＬに懸濁した。金ナノ粒子の終濃度は２．６７ｎＭであった。

【0164】

＜実験例２＞
［金ナノ粒子１個あたりのＤＮＡ鎖の平均数の最適化］
実験例１と同様にして調製した、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）３０μＬ中の各複合体（金ナノ粒子の終濃度＝２．６７ｎＭ、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）の濃度＝５８．６７〜１４６．８５ｎＭ、ｘ＝２２、３３、４２、５５）を９６ウェルプレートのウェルに添加した。

【0165】

続いて、各複合体の溶液に、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）５μＬ、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−１２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）５μＬ、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１．０μＭのＤＮＡ（上記表２の「ｆｕｅｌ−ＤＮＡ」）５μＬ、及び０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１．０μＭの対象核酸（上記表２の「ｍｉＲ３４ｃ」）５μＬを添加し、５０μＬの溶液を調製した。

【0166】

溶液中のＭｇ^２＋、金ナノ粒子、ｄｓＤＮＡ、ｆｕｅｌ−ＤＮＡ及びｍｉＲ３４ｃの終濃度は、それぞれ１２．５ｍＭ、１．６ｎＭ、３５〜８８ｎＭ、１００ｎＭ及び１００ｎＭであった。

【0167】

続いて、各溶液を２５℃で２時間穏やかに撹拌しながらインキュベートした。この過程において、まず、ｍｉＲＮＡ３４ｃが複合体のｄｓＤＮＡと足場依存型鎖交換反応を行う。続いて、ｆｕｅｌ−ＤＮＡが複合体のｄｓＤＮＡと足場依存型鎖交換反応を行う。その結果、金ナノ粒子と磁気粒子との結合が解離する。インキュベーションの過程で、Ａ_５２２を適切な時間間隔で測定した。Ａ_５２２の測定は、磁場の適用下でマイクロプレート分光光度計により行った。

【0168】

図４は、Ａ_５２２の測定結果を示すグラフである。その結果、金ナノ粒子１個あたりのＤＮＡ鎖の平均数ｘが２２である複合体において、Ａ_５２２の変化が最も大きく最も速かった。この結果から、ｘ＝２２が最適であることが明らかとなった。そこで、後の実験においては、ｄｓＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ−金ナノ粒子（ｘ＝２２）を使用した。

【0169】

＜実験例３＞
［ｆｕｅｌ−ＤＮＡ濃度の最適化］
ｄｓＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ−金ナノ粒子（ｘ＝２２）を用いて調製した複合体を用いて、ｆｕｅｌ−ＤＮＡの最適な濃度を検討した。具体的には、ｍｉＲ３４ｃの終濃度を０又は１００ｎＭとし、ｆｕｅｌ−ＤＮＡの終濃度を５０、１００、１２０、１５０又は２００ｎＭとした点以外は、実験例２と同様の反応を行い、Ａ_５２２を適切な時間間隔で測定した。

【0170】

図５は、Ａ_５２２の測定結果を示すグラフである。その結果、ｍｉＲ３４ｃの濃度（図中、［ｍｉＲ３４ｃ］と表す。）が０ｎＭの試料と１００ｎＭの試料との間でＡ_５２２の変化に明確な差が認められた。この結果は、本実験系によりｍｉＲ３４ｃを特異的に検出できることを示す。

【0171】

また、ｆｕｅｌ−ＤＮＡの終濃度（図中、［ｆｕｅｌ］と表す。）が１５０ｎＭである試料において、最も高いシグナル／ノイズ比が得られることが明らかとなった。この結果から、ｆｕｅｌ−ＤＮＡの終濃度は１５０ｎＭが最適であることが明らかとなった。

【0172】

＜実験例４＞
［緩衝液中のｍｉＲ３４ｃの検出］
ｄｓＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ−金ナノ粒子（ｘ＝２２）を用いて調製した複合体を用いて、緩衝液中でｍｉＲ３４ｃの検出を行った。具体的には、実験例１と同様にして調製した、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）３０μＬ中の複合体（金ナノ粒子の終濃度＝２．６７ｎＭ、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）の濃度＝５８．６７ｎＭ、ｘ＝２２）を９６ウェルプレートのウェルに添加した。

【0173】

続いて、複合体の溶液に、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）５μＬ、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−１２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）５μＬ、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１．５μＭのＤＮＡ（上記表２の「ｆｕｅｌ−ＤＮＡ」）５μＬ、及び０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の様々な濃度の対象核酸（上記表２の「ｍｉＲ３４ｃ」）５μＬを添加し、５０μＬの溶液を調製した。

【0174】

溶液中のＭｇ^２＋、金ナノ粒子、ｄｓＤＮＡ、ｆｕｅｌ−ＤＮＡ及びｍｉＲ３４ｃの終濃度は、それぞれ１２．５ｍＭ、１．６ｎＭ、３５ｎＭ、１５０ｎＭ及び０〜１０ｎＭであった。

【0175】

続いて、各溶液を２５℃で２時間穏やかに撹拌しながらインキュベートした。インキュベーションの過程で、Ａ_５２２を適切な時間間隔で測定した。Ａ_５２２の測定は、磁場の適用下でマイクロプレート分光光度計により行った。

【0176】

図６は、Ａ_５２２の測定結果を示すグラフである。図中、ｍｉＲ３４ｃの濃度を［ｍｉＲ３４ｃ］と表す。また、図６における挿入図は、ｍｉＲ３４ｃの濃度０〜１．０ｎＭの範囲の拡大図である。その結果、反応時間２時間での検出限界濃度が０．０５ｎＭであることが明らかとなった。

【0177】

＜実験例５＞
［増幅反応の検討］
実験例４の反応後、金ナノ粒子の増幅反応を行い、検出感度の向上について検討した。具体的には、実験例４の反応後、磁気スタンドを用いて磁気粒子を壁面に集め、解離したＤＮＡ／ＰＥＧ−金ナノ粒子を含む上清を回収して新しい９６ウェルプレートに入れた。

【0178】

続いて、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１０μＬ、２．５ｍＭ ＨＡｕＣｌ_４（テトラクロリド金（ＩＩＩ）酸）水溶液５μＬ、及び１００ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン５μＬを添加して混合し、混合液の波長５７５ｎｍにおける吸光度（Ａ_５７５）を１分以内に測定した。この反応により、溶液中の金ナノ粒子を核として金ナノ粒子が成長し、検出感度が向上した。

【0179】

図７は、Ａ_５７５の測定結果を示すグラフである。図中、ｍｉＲ３４ｃの濃度を［ｍｉＲ３４ｃ］と表す。また、図７における挿入図は、ｍｉＲ３４ｃの濃度０〜０．１ｎＭの範囲の拡大図である。また、図８は、増幅反応の前後における反応液の写真である。その結果、反応時間２時間後の増幅反応（１分間）により、検出限界濃度が０．００５ｎＭに向上し、目視でも検出できることが明らかとなった。

【0180】

＜実験例６＞
［対象核酸の特異性の検討］
ｄｓＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ−金ナノ粒子（ｘ＝２２）を用いて調製した複合体を用いて、実験例４と同様にして、ｍｉＲ３４ｃ、ｍｉＲ３４ａ及びｍｉＲ３４ｂ^＊の検出を行った。なお、使用した複合体は、ｍｉＲ３４ｃ検出用の塩基配列を有していた。ｍｉＲ３４ｃ、ｍｉＲ３４ａ及びｍｉＲ３４ｂ^＊の塩基配列を下記表３に示す。表３中、ｍｉＲ３４ａ及びｍｉＲ３４ｂ^＊の塩基配列のうち、ｍｉＲ３４ｃの塩基配列と相違する部分に下線を付す。

【0181】

【表3】

【0182】

具体的には、実験例１と同様にして調製した、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）３０μＬ中の複合体（金ナノ粒子の終濃度＝２．６７ｎＭ、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）の濃度＝５８．６７ｎＭ、ｘ＝２２）を９６ウェルプレートのウェルに添加した。

【0183】

続いて、複合体の溶液に、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）５μＬ、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−１２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）５μＬ、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１．５μＭのＤＮＡ（上記表２の「ｆｕｅｌ−ＤＮＡ」）５μＬ、及び０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１ｎＭ又は５０ｎＭの各ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ３４ｃ、ｍｉＲ３４ａ及びｍｉＲ３４ｂ^＊）５μＬを添加し、５０μＬの溶液を調製した。

【0184】

溶液中のＭｇ^２＋、金ナノ粒子、ｄｓＤＮＡ及びｆｕｅｌ−ＤＮＡの終濃度は、それぞれ１２．５ｍＭ、１．６ｎＭ、３５ｎＭ及び１５０ｎＭであった。また、溶液中のｍｉＲＮＡの終濃度は１００ｐＭ又は５ｎＭであった。

【0185】

続いて、各溶液を２５℃で２時間穏やかに撹拌しながらインキュベートした後Ａ_５２２を測定した。Ａ_５２２の測定は、磁場の適用下でマイクロプレート分光光度計により行った。また、実験例５と同様の増幅反応を行い、Ａ_５７５を１分以内に測定した。

【0186】

図９は、増幅反応の前後における反応液の写真である。図中、ｍｉＲＮＡの濃度を［ｍｉＲＮＡ］と表す。また、図１０は、増幅反応前のＡ_５２２の測定結果を示すグラフである。また、図１０における挿入図は、増幅反応後のＡ_５７５の測定結果を示すグラフである。

【0187】

その結果、対象核酸としてｍｉＲ３４ｃを反応させた試料において、ｍｉＲ３４ａ、ｍｉＲ３４ｂ^＊を反応させた試料よりも顕著に高い吸光が観察された。この結果は、本実験例の方法により、わずかな塩基配列の違いを識別することができ、ｍｉＲ３４ｃを特異的に検出できることを示す。

【0188】

＜実験例７＞
［細胞抽出液中のｍｉＲ３４ｃの検出］
健康なドナーから採取した口腔粘膜由来の細胞からヒト細胞抽出液を調製した。口腔粘膜由来の細胞は、口を１ｍＬの生理的食塩水で激しくリンスすることにより回収した。回収した細胞懸濁液を２，０００×ｇで９０秒間遠心し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。

【0189】

続いて、細胞の沈殿をＲＮＡ ｌａｔｅｒ（商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィク社）５００μＬに懸濁し、内在性ＲＮＡの酵素的分解を抑制した。細胞数を測定した後、ＲＮＡ ｌａｔｅｒ（商標）７５μＬを更に追加し、細胞密度を１×１０^６個／ｍＬに調整した。細胞懸濁液は使用するまで−２０℃で保存した。

【0190】

続いて、細胞懸濁液１００μＬ（１×１０^５個の細胞に相当）を２，０００×ｇで９０秒間遠心し、ＲＮＡ ｌａｔｅｒ（商標）を除去した。この細胞の沈殿に０．５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５μＬを添加し、２５℃で３０分間穏やかに撹拌しながらインキュベートして細胞を破砕し、細胞抽出液を得た。

【0191】

続いて細胞抽出液を２，０００×ｇで９０秒間遠心し、細胞の破片を除去した。細胞抽出液（上清２５μＬ）（１×１０^５個の細胞に相当）を新しい反応チューブに移し、使用するまで−２０℃で保存した。

【0192】

続いて、複合体を用いてヒト細胞抽出液中のｍｉＲ３４ｃを検出した。具体的には、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の５０ｎＭ又は１ｎＭのｍｉＲ３４ｃ溶液５μＬを、上述したヒト細胞抽出液５μＬ（２×１０^４個の細胞に相当）にそれぞれ添加した。

【0193】

続いて、９６ウェルプレート中の複合体の溶液３０μＬに、ｍｉＲ３４ｃを含むヒト細胞抽出液１０μＬ、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−１２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）５μＬ、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１．５μＭのＤＮＡ（上記表２の「ｆｕｅｌ−ＤＮＡ」）５μＬを添加し、５０μＬの溶液を調製した。ｍｉＲ３４ｃの終濃度は１００ｐＭ又は５ｎＭであった。また、比較のために、細胞抽出液を含まない緩衝液中のｍｉＲ３４ｃの検出も行った。

【0194】

続いて、各溶液を２５℃で２時間穏やかに撹拌しながらインキュベートした後Ａ_５２２を測定した。Ａ_５２２の測定は、磁場の適用下でマイクロプレート分光光度計により行った。

【0195】

下記表４に、細胞抽出液中のｍｉＲ３４ｃを検出した結果を示す。細胞抽出液を含まない緩衝液中のｍｉＲ３４ｃの検出結果も示す。表４中、ＲＳＤは相対標準偏差を表す。

【0196】

【表4】

【0197】

その結果、緩衝液中での測定値及び細胞抽出液中での測定値の間の誤差は８％以内であり、いずれも同じような値が測定された。この結果は、本実験例の方法による対象核酸の検出が、様々な生体物質に阻害されることがないことを示す。したがって、本実験例の方法により、細胞抽出液等の生体試料中の対象核酸を直接検出することができる。

【産業上の利用可能性】

【0198】

本発明によれば、対象核酸を簡便に検出する技術を提供することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]