特許 6775227 細胞移植用組成物及びそれを含む細胞移植用溶液

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6775227

(24)【登録日】2020年10月8日

(45)【発行日】2020年10月28日

(54)【発明の名称】細胞移植用組成物及びそれを含む細胞移植用溶液

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/22 20060101AFI20201019BHJP

   A61L 27/38 20060101ALI20201019BHJP

   A61L 27/44 20060101ALI20201019BHJP

   A61K 35/36 20150101ALI20201019BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20201019BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20201019BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20201019BHJP

   A61K 35/33 20150101ALI20201019BHJP

   A61K 35/34 20150101ALI20201019BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20201019BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20201019BHJP

   C07K 14/00 20060101ALN20201019BHJP

【ＦＩ】

   A61L27/22ZNA

   A61L27/38

   A61L27/44

   A61K35/36

   A61K35/17

   A61K35/545

   A61K35/30

   A61K35/33

   A61K35/34

   A61K38/16

   A61P43/00 107

   !C07K14/00

【請求項の数】9

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2016-136154(P2016-136154)

(22)【出願日】2016年7月8日

(65)【公開番号】特開2018-861(P2018-861A)

(43)【公開日】2018年1月11日

【審査請求日】2019年6月13日

(73)【特許権者】

【識別番号】599029420

【氏名又は名称】田畑 泰彦

(73)【特許権者】

【識別番号】000002288

【氏名又は名称】三洋化成工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000914

【氏名又は名称】特許業務法人 安富国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】田畑 泰彦

(72)【発明者】

【氏名】杣本 千紗

【審査官】 山村 祥子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００２−５０７４３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１４−００７９９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／０４８１６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／１１１４３８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１３−１７６５４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−１４５７９７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｌ ２７／００

Ａ６１Ｋ ３５／００

Ａ６１Ｋ ３８／００

Ｃ０７Ｋ １４／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

幹細胞、上皮細胞、神経系細胞、線維芽細胞、筋細胞及び炎症性細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞（Ｃ）及び人工タンパク質（Ａ）を含む細胞移植用組成物であって、
前記人工タンパク質（Ａ）は、疎水性度が０．２〜１．２であり、
前記人工タンパク質（Ａ）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、
前記人工タンパク質（Ａ）中の前記ポリペプチド鎖（Ｙ）と前記ポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計個数が１〜１００個であり、
前記ポリペプチド鎖（Ｙ）は、ＶＰＧＶＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（３）のうちいずれか１つのアミノ酸配列（Ｘ）が２〜１００個連続したポリペプチド鎖であり、
前記ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、前記ポリペプチド鎖（Ｙ）中の０．１〜５％のアミノ酸残基がリシン残基及び／又はアルギニン残基で置換されたポリペプチド鎖であり、
前記リシン残基及び前記アルギニン残基の合計個数が１〜１００個である
ことを特徴とする細胞移植用組成物。

【請求項2】

前記人工タンパク質（Ａ）が、さらにＧＡＧＡＧＳ配列（４）が２〜１００個連続して結合したポリペプチド鎖（Ｓ）を有する請求項１に記載の細胞移植用組成物。

【請求項3】

前記人工タンパク質（Ａ）１分子中の、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）と前記アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計との配列の数の比率｛ＧＡＧＡＧＳ配列（４）：アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計｝が、１：２〜１：２０であり、
前記アミノ酸配列（Ｘ’）は、アミノ酸配列（Ｘ）中の２０〜８０％のアミノ酸残基がリシン残基及び／又はアルギニン残基で置換されたアミノ酸配列である請求項２に記載の細胞移植用組成物。

【請求項4】

前記人工タンパク質（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子質量が１５〜２００ｋＤａである請求項１〜３のいずれかに記載の細胞移植用組成物。

【請求項5】

前記人工タンパク質（Ａ）が、ポリペプチド鎖（Ｙ’１）を有する人工タンパク質（Ａ１）であり、
前記ポリペプチド鎖（Ｙ’１）は、前記アミノ酸配列（Ｘ）が前記ＧＶＧＶＰ配列（２）であるポリペプチド鎖（Ｙ１）中の１個のアミノ酸残基がリシン残基で置換されたポリペプチド鎖である請求項１〜４のいずれかに記載の細胞移植用組成物。

【請求項6】

前記人工タンパク質（Ａ）が、（ＧＡＧＡＧＳ）_４配列（５）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−１）及び（ＧＶＧＶＰ）_４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）_３配列（６）であるポリペプチド鎖（Ｙ’１１）を有する人工タンパク質（Ａ１１）である請求項２〜５のいずれかに記載の細胞移植用組成物。

【請求項7】

請求項１〜６のいずれかに記載の細胞移植用組成物及び水を含有する細胞移植用溶液。

【請求項8】

前記細胞移植用溶液中の前記人工タンパク質（Ａ）の濃度が、前記細胞移植用溶液の合計重量を基準として１〜４０重量％である請求項７に記載の細胞移植用溶液。

【請求項9】

前記細胞移植用溶液中の前記細胞（Ｃ）の濃度が、前記細胞移植用溶液の合計体積を基準として、１０^５〜１０^８個／ｍＬである請求項７又は８に記載の細胞移植用溶液。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞移植用組成物及びそれを含む細胞移植用溶液に関する。

【背景技術】

【0002】

再生医療は、ケガや病気で損傷によって機能を損失した臓器や組織に、細胞等を移植し、その損傷した組織や臓器の機能の復元を目指すものであり、現在治療が困難な症例に対し、唯一の治療法となり得る可能性を秘めた注目の技術である。しかし、細胞だけを移植すると患部での移植細胞の残存性が低いため、残存性を向上させる材料（マトリックス）と共に移植する研究が多く行われている。例えば、幹細胞等を用いた細胞移植療法に適用できる細胞移植療法用材料としては、生体適合性に優れ、酸素と栄養の供給が不十分な部位での移植細胞の残存性を向上させることができ、所定の細胞増殖因子を含有する、ヒドロゲルが知られている（例えば特許文献１参照）。

【0003】

しかし、特許文献１に記載の細胞移植療法用材料にはヒドロゲルとしてゼラチン等の動物由来の材料を用いるため、感染症の原因となる可能性や、免疫応答を惹起する原因となる可能性がある動物由来の危険物質や、他の不純物等が混入するおそれがあった。また、移植細胞の残存性の向上や、細胞移植療法用材料の生体適合性の向上も求められていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２００２−１４５７９７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の目的は、移植細胞の残存性を向上させることができ、かつ、生体適合性に優れる細胞移植用組成物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、鋭意研究を重ねてきた結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、幹細胞、上皮細胞、神経系細胞、線維芽細胞、筋細胞及び炎症性細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞（Ｃ）及び人工タンパク質（Ａ）を含む細胞移植用組成物であって、前記人工タンパク質（Ａ）は、疎水性度が０．２〜１．２であり、前記人工タンパク質（Ａ）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、前記人工タンパク質（Ａ）中の前記ポリペプチド鎖（Ｙ）と前記ポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計個数が１〜１００個であり、前記ポリペプチド鎖（Ｙ）は、ＶＰＧＶＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（３）のうちいずれか１つのアミノ酸配列（Ｘ）が２〜１００個連続したポリペプチド鎖であり、前記ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、前記ポリペプチド鎖（Ｙ）中の０．１〜５％のアミノ酸残基がリシン残基及び／又はアルギニン残基で置換されたポリペプチド鎖であり、前記リシン残基及びアルギニン残基の合計個数が１〜１００個であることを特徴とする細胞移植用組成物；前記細胞移植用組成物及び水を含有する細胞移植用溶液である。

【発明の効果】

【0007】

本発明の細胞移植用組成物を用いて細胞（Ｃ）を患部に移植すると、患部における細胞（Ｃ）の残存性を向上させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】図１（ａ）は、実施例２の細胞移植用溶液を用いて細胞移植を行った際のゲルの残存範囲を示す写真である。図１（ｂ）は、比較例２の細胞移植用溶液を用いて細胞移植を行った際のゲルの残存範囲を示す写真である。

【図2】図２（ａ）は、実施例２の細胞移植用溶液を用いて細胞移植を行った際の細胞の残存範囲を示す写真である。図２（ｂ）は、比較例２の細胞移植用溶液を用いて細胞移植を行った際の細胞の残存範囲を示す写真である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明において、人工タンパク質（Ａ）は、動物由来成分を排除するために、人工的に製造されるものであり、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等によって製造できる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、人工タンパク質（Ａ）を作製できるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。

【0010】

本発明の細胞移植用組成物は、人工タンパク質（Ａ）を含む細胞移植用組成物であって、前記人工タンパク質（Ａ）は、疎水性度が０．２〜１．２であり、前記人工タンパク質（Ａ）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、前記人工タンパク質（Ａ）中の前記ポリペプチド鎖（Ｙ）と前記ポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計個数が１〜１００個であり、前記ポリペプチド鎖（Ｙ）は、ＶＰＧＶＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（３）のうちいずれか１つのアミノ酸配列（Ｘ）が２〜１００個連続したポリペプチド鎖であり、前記ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、前記ポリペプチド鎖（Ｙ）中の０．１〜５％のアミノ酸残基がリシン残基及び／又は前記アルギニン残基で置換されたポリペプチド鎖であり、前記リシン残基及び前記アルギニン残基の合計個数が１〜１００個であることを特徴とする細胞移植用組成物である。

【0011】

本発明においてポリペプチド鎖（Ｙ）は、具体的には、（ＶＰＧＶＧ）_ｂ配列、（ＧＶＧＶＰ）_ｃ配列、（ＧＰＰ）_ｄ配列、（ＧＡＰ）_ｅ配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）_ｆ配列である。（なお、ｂ〜ｆは、それぞれ、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数であり、２〜２００の整数である）。
人工タンパク質（Ａ）１分子中に、ポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、（ＶＰＧＶＧ）_ｂ配列、（ＧＶＧＶＰ）_ｃ配列、（ＧＰＰ）_ｄ配列、（ＧＡＰ）_ｅ配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）_ｆ配列からなる群から選ばれる１種を有してもよく、２種以上を有してもいい。
また、人工タンパク質（Ａ）中にアミノ酸配列（Ｘ）が同種類のポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数は、ポリペプチド鎖（Ｙ）ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、上記ｂ〜ｆが同じポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよく、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数ｂ〜ｆが異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもいい。

【0012】

ポリペプチド鎖（Ｙ）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）としては、細胞（Ｃ）の残存性の観点から、ＶＰＧＶＧ配列（１）及び／又はＧＶＧＶＰ配列（２）が好ましい。つまり、細胞（Ｃ）の残存性の観点から、ポリペプチド鎖（Ｙ）として（ＶＰＧＶＧ）_ｂ配列及び／又は（ＧＶＧＶＰ）_ｃ配列が好ましい。
人工タンパク質（Ａ）が、アミノ酸配列（Ｘ）の種類が異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を有する場合、ポリペプチド鎖（Ｙ）としては、細胞（Ｃ）の残存性の観点から、（ＧＰＰ）_ｄ配列、（ＧＶＧＶＰ）_ｃ配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）_ｆ配列からなる群より選ばれる２種以上の配列であることが好ましく、特に好ましくは（ＧＶＧＶＰ）_ｃ配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）_ｆ配列である。

【0013】

ポリペプチド鎖（Ｙ）は、アミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続した（上記ｂ〜ｆがそれぞれ２〜２００）ポリペプチド鎖であるが、細胞（Ｃ）の残存性の観点から、連続する個数は２〜５０個（上記ｂ〜ｆがそれぞれ２〜５０）が好ましく、さらに好ましくは２〜３０個（上記ｂ〜ｆがそれぞれ２〜３０）である。

【0014】

本発明において、ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）中の０．１〜５％のアミノ酸残基がリシン残基（Ｋ）及び／又はアルギニン残基（Ｒ）で置換されたポリペプチド鎖であり、リシン残基（Ｋ）及びアルギニン残基（Ｒ）の合計個数が１〜１００個である。具体的には、ポリペプチド鎖（Ｙ）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）の一部又は全部が、下記アミノ酸配列（Ｘ’）に置換され、ポリペプチド鎖（Ｙ）中の１〜１００個のアミノ酸残基がリシン残基（Ｋ）及び／又はアルギニン残基（Ｒ）で置換されたポリペプチド鎖である。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）中の２０〜８０％のアミノ酸残基がリシン残基（Ｋ）及び／又はアルギニン残基（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。

【0015】

アミノ酸配列（Ｘ’）において、アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸残基の置換の数（リシン残基（Ｋ）及び／又はアルギンン残基（Ｒ）で置換された数）は、人工タンパク質（Ａ）の水への溶解性の観点から、１〜５個が好ましく、さらに好ましくは１〜４個であり、次にさらに好ましくは１〜３個である。
また、アミノ酸配列（Ｘ’）において、アミノ酸配列（Ｘ）中の置換されたアミノ酸残基の割合は、人工タンパク質（Ａ）の水への溶解性の観点から、２０〜６０％が好ましい。
また、アミノ酸配列（Ｘ’）としては、人工タンパク質（Ａ）の水への溶解性の観点から、ＧＫＧＶＰ配列（７）、ＧＫＧＫＰ配列（８）、ＧＫＧＲＰ配列（９）及びＧＲＧＲＰ配列（１０）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列が好ましく、さらに好ましくはＧＫＧＶＰ配列（７）及びＧＫＧＫＰ配列（８）からなる群より選ばれる少なくとも１種である。

【0016】

ポリペプチド鎖（Ｙ’）であるかどうかは、人工タンパク質（Ａ）の配列中の全てのＫ及びＲを、他のアミノ酸残基（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ又はＨ）に置きかえたときに、ポリペプチド鎖（Ｙ）となるかによって判断する。
なお、アミノ酸配列（Ｘ）がＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（３）である場合は、配列中にＫが存在するので、判断方法を以下のように変更する。
人工タンパク質（Ａ）の配列中の全てのＫ及びＲを、他のアミノ酸残基（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ又はＨ）に置きかえたときに、ＧＡＨＧＰＡＧＰαという配列が現れたときは（αはＧ、Ａ、Ｖ、Ｐ又はＨ）、さらにαをＫに置きかえる。その結果、その配列がポリペプチド鎖（Ｙ）となる場合、アミノ酸残基を置きかえる前の配列は、ポリペプチド鎖（Ｙ’）と判断する。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）中の置換されるアミノ酸残基の数は、人工タンパク質（Ａ）の水への溶解性及び細胞（Ｃ）の残存性の観点から、１〜７０個が好ましく、さらに好ましくは１〜３０個である。
また、ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）中の０．１〜５％のアミノ酸残基がリシン残基（Ｋ）及び／又はアルギニン残基（Ｒ）で置換されたポリペプチド鎖であるが、人工タンパク質（Ａ）の水への溶解性及び細胞（Ｃ）の残存性の観点から、０．１〜４％が好ましく、さらに好ましくは０．５〜３％である。

【0017】

本発明において、人工タンパク質（Ａ）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、人工タンパク質（Ａ）中のポリペプチド鎖（Ｙ）とポリペプチド鎖（Ｙ’）との合計個数が１〜１００個である。人工タンパク質（Ａ）が、アミノ酸配列（Ｘ）の種類及び／又は連続する個数が異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を有している場合は、それぞれを１個として数え、ポリペプチド鎖（Ｙ）の個数はその合計である。ポリペプチド鎖（Ｙ’）も同様である。

【0018】

人工タンパク質（Ａ）は、人工タンパク質（Ａ）１分子中にポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を合計１〜１００個有するものであるが、細胞（Ｃ）の残存性の観点から、１〜８０個が好ましく、特に好ましくは１〜６０個である。

【0019】

人工タンパク質（Ａ）において、同じアミノ酸配列（Ｘ）が繰り返し結合している部分はポリペプチド鎖（Ｙ）１個とし、アミノ酸配列（Ｘ）とは異なる配列が結合するまでを１個とする。例えば、（ＧＶＧＶＰ）_１００ＧＡＧＡＧＳ（ＶＰＧＶＧ）_２０という配列では、ポリペプチド鎖（Ｙ）は（ＧＶＧＶＰ）_１００と（ＶＰＧＶＧ）_２０との２個である。また、人工タンパク質（Ａ）の配列中の全てのリシン残基（Ｋ）及びアルギニン残基（Ｒ）を、他のアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ又はＨ）に置きかえたときに、アミノ酸配列（Ｘ）が繰り返し結合しているものとなる部分をポリペプチド鎖（Ｙ’）１個とし、アミノ酸配列（Ｘ）とは異なる配列が結合するまでを１個とする。例えば、（ＧＶＧＶＰ）_４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）_３ＧＡＧＡＧＳ（ＧＶＧＶＰ）_４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）_３という配列には、ポリペプチド鎖（Ｙ’）である（ＧＶＧＶＰ）_４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）_３が２個ある。

【0020】

本発明において、人工タンパク質（Ａ）の疎水性度は０．２〜１．２であるが、人工タンパク質（Ａ）の水への溶解性の観点、ゲル化する観点から、０．３〜１．２が好ましく、さらに好ましくは０．４〜１．２であり、次にさらに好ましくは０．４５〜１．２であり、特に好ましくは０．６０〜１．２であり、最も好ましくは０．６０〜０．７５である。
人工タンパク質（Ａ）の疎水性度は、人工タンパク質（Ａ）分子の疎水性の度合いを示すものであり、人工タンパク質（Ａ）分子を構成するそれぞれのアミノ酸残基の数（Ｍ_α）、それぞれのアミノ酸の疎水性度（Ｎ_α）及び人工タンパク質（Ａ）１分子中のアミノ酸残基の総数（Ｍ_Ｔ）を、下記数式に当てはめることにより算出することができる。なお、それぞれのアミノ酸の疎水性度は、非特許文献（アルバート・Ｌ．レーニンジャー、デビット・Ｌ．ネルソン、レ−ニンジャ−の新生化学 上、廣川書店、２０１０年９月、ｐ．３４６−３４７）に記載されている下記の数値を用いる。
疎水性度＝Σ（Ｍ_α×Ｎ_α）／（Ｍ_Ｔ）
Ｍ_α：人工タンパク質（Ａ）１分子中のそれぞれのアミノ酸残基の数
Ｎ_α：各アミノ酸の疎水性度
Ｍ_Ｔ：人工タンパク質（Ａ）１分子中のアミノ酸残基の総数
Ａ（アラニン）：１．８
Ｒ（アルギニン）：−４．５
Ｎ（アスパラギン）：−３．５
Ｄ（アスパラギン酸）：−３．５
Ｃ（システイン）：２．５
Ｑ（グルタミン）：−３．５
Ｅ（グルタミン酸）：−３．５
Ｇ（グリシン）：−０．４
Ｈ（ヒスチジン）：−３．２
Ｉ（イソロイシン）：４．５
Ｌ（ロイシン）：３．８
Ｋ（リシン）：−３．９
Ｍ（メチオニン）：１．９
Ｆ（フェニルアラニン）：２．８
Ｐ（プロリン）：−１．６
Ｓ（セリン）：−０．８
Ｔ（トレオニン）：−０．７
Ｗ（トリプトファン）：−０．９
Ｙ（チロシン）：−１．３
Ｖ（バリン）：４．２
例えば、人工タンパク質（Ａ）が（ＧＶＧＶＰ）_４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）_３配列（６）である場合、人工タンパク質（Ａ）の疎水性度＝｛１６（Ｇの数）×（−０．４）＋１５（Ｖの数）×４．２＋８（Ｐの数）×（−１．６）＋１（Ｋの数）×（−３．９）｝／４０（アミノ酸残基の総数）＝１．０である。

【0021】

本発明において、人工タンパク質（Ａ）は、さらにＧＡＧＡＧＳ配列（４）を有していることが好ましい。人工タンパク質（Ａ）がＧＡＧＡＧＳ配列（４）を有していると、人工タンパク質（Ａ）が生体内でより分解されにくくなり、細胞（Ｃ）が患部に充分に定着するまで人工タンパク質（Ａ）は分解されずに存在しやすくなる。
ＧＡＧＡＧＳ配列（４）は、生体内難分解性の観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）が２〜１００個連続して結合したポリペプチド鎖（Ｓ）を有していることが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｓ）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）が連続する数は、生体内難分解性の観点から、２〜１００個が好ましく、さらに好ましくは２〜５０個であり、次にさらに好ましくは３〜４０個であり、特に好ましくは４〜３０個である。
人工タンパク質（Ａ）が、ポリペプチド鎖（Ｓ）を有する場合、人工タンパク質（Ａ）は、１分子中にポリペプチド鎖（Ｓ）を１個以上有すればよいが、生体内難分解性の観点から、１〜２０個有することが好ましく、さらに好ましくは３〜１０個有することである。

【0022】

人工タンパク質（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）及びポリペプチド鎖（Ｓ）を合計２個以上有する場合は、ポリペプチド鎖とポリペプチド鎖との間に、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有していてもいい。介在アミノ酸配列（Ｚ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したアミノ酸配列であって、ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）又はポリペプチド鎖（Ｓ）では無いアミノ酸配列である。介在アミノ酸配列（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、生体内難分解性の観点から、１〜３０個が好ましく、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個である。介在アミノ酸配列（Ｚ）として、具体的には、ＶＡＡＧＹ配列（１１）、ＧＡＡＧＹ配列（１２）及びＬＧＰ配列等が挙げられる。

【0023】

人工タンパク質（Ａ）中の両末端の各ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）及びポリペプチド鎖（Ｓ）のＮ及び／又はＣ末端には、末端アミノ酸配列（Ｔ）を有していてもいい。末端アミノ酸配列（Ｔ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したアミノ酸配列であって、ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）又はポリペプチド鎖（Ｓ）では無いアミノ酸配列である。末端アミノ酸配列（Ｔ）を構成するアミノ酸の数は、生体内難分解性の観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜５０個、特に好ましくは１〜４０個である。末端アミノ酸配列（Ｔ）として、具体的には、ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（１３）等が挙げられる。

【0024】

人工タンパク質（Ａ）は、上記末端アミノ酸配列（Ｔ）以外に、発現させた人工タンパク質（Ａ）の精製又は検出を容易にするために、人工タンパク質（Ａ）のＮ及び／又はＣ末端に特殊なアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド（以下これらを「精製タグ」と称する）を有してもいい。精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＨＱタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９^ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ２２^ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ４１^ＴＭ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ及びＫＴ３タグ等がある。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ） （ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ） （ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおける人工タンパク質（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。

【0025】

人工タンパク質（Ａ）１分子中のポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計含有量（重量％）は、細胞（Ｃ）との相互作用及び細胞（Ｃ）の残存性の観点から、人工タンパク質（Ａ）の分子質量を基準として、１０〜９０重量％が好ましく、さらに好ましくは２０〜８０重量％である。

【0026】

人工タンパク質（Ａ）中のポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計含有量は、アミノ酸配列決定によって求めることができる。具体的には、下記の測定法によって求めることができる。
＜ポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計含有量の測定法＞
島津製作所社製ペプチドシーケンサ（プロテインシーケンサ）ＰＰＳＱ−３３Ａを用いて、アミノ酸配列を決定する。決定したアミノ酸配列から、下記数式（１）によりポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計含有量を求める。
ポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計含有量＝Σ（γ×β）／Σ（α×β）×１００ （１）
α：人工タンパク質（Ａ）中の各アミノ酸残基の数
β：各アミノ酸の分子質量
γ：ポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｙ’）中の各アミノ酸の個数

【0027】

人工タンパク質（Ａ）１分子中のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量（重量％）は、細胞（Ｃ）の残存性の観点から、人工タンパク質（Ａ）の分子質量を基準として１０〜９０重量％が好ましく、さらに好ましくは２０〜８０重量％である。

【0028】

人工タンパク質（Ａ）中のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量は、プロテインシーケンサによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求めることができる。
＜アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の含有量の測定法＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法から２種類以上を用いて、人工タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシーケンサにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、人工タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量を測定する。
アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量（％）＝［｛アミノ酸配列（Ｘ）の分子質量｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝＋｛アミノ酸配列（Ｘ’）の分子質量｝×｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝］／｛人工タンパク質（Ａ）の分子質量｝×１００

【0029】

人工タンパク質（Ａ）１分子中の、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）とアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計との配列の数の比率｛ＧＡＧＡＧＳ配列（４）：アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計｝は、人工タンパク質（Ａ）の水への溶解性及び細胞（Ｃ）の残存性の観点から、１：２〜１：２０が好ましく、さらに好ましくは１：２〜１：１０である。

【0030】

人工タンパク質（Ａ）の分子質量は、細胞（Ｃ）の残存性の観点から、１５〜２００ｋＤａが好ましく、さらに好ましくは１５〜１００ｋＤａである。
なお、人工タンパク質（Ａ）の分子質量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプルを分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法によって求められる。

【0031】

好ましい人工タンパク質（Ａ）の一部を以下に例示する。
（１）アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（２）の人工タンパク質
（１−１）ＧＶＧＶＰ配列（２）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）中の１個のアミノ酸残基がリシン残基（Ｋ）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’１）を有する人工タンパク質（Ａ１）であり、さらに好ましくは、（ＧＶＧＶＰ）_４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）_３配列（６）であるポリペプチド鎖（Ｙ’１１）及び（ＧＡＧＡＧＳ）_４配列（５）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を有する人工タンパク質（Ａ１１）、ポリペプチド鎖（Ｙ’１１）及び（ＧＡＧＡＧＳ）_２配列（１４）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を有する人工タンパク質（Ａ１２）、並びにポリペプチド鎖（Ｙ’１１）、ポリペプチド鎖（Ｓ１−１）及びポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を有する人工タンパク質（Ａ１３）である。
具体的には、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）_４配列（５）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を１２個及びＧＶＧＶＰ配列（２）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１１）中のバリン残基（Ｖ）のうち１個がリシン残基（Ｋ）に置換された（ＧＶＧＶＰ）_４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）_３配列（６）であるポリペプチド鎖（Ｙ’１１）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）_２配列（１４）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）１個が化学結合した構造を有する分子質量が約８０ｋＤａの配列（１５）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ、疎水性度０．６２）；ＧＡＧＡＧＳ配列（４）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）_２配列（１４）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）及び（ＧＶＧＶＰ）_４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）_３配列（６）のポリペプチド鎖（Ｙ’１１）をそれぞれ１７個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約８２ｋＤａの配列（１６）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ、疎水性度０．７２）等である。
（１−２）ＧＶＧＶＰ配列（２）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ２）を有する人工タンパク質（Ａ２）であり、さらに好ましくは、ＧＶＧＶＰ配列（２）が２個連続したポリペプチド鎖（Ｙ２１）及びＧＡＧＡＧＳ配列（４）が６個連続したポリペプチド鎖（Ｓ２−１）を有する人工タンパク質（Ａ２１）であり、具体的には、ポリペプチド鎖（Ｙ２１）とポリペプチド鎖（Ｓ２−１）が結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−１）が２９個繰り返し化学結合した構造を有する分子質量が約９３ｋＤａの配列（１７）の人工タンパク質（ＳＬＰ４．１、疎水性度０．４７）である。
（１−３）ＧＶＧＶＰ配列（２）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）中の２個のアミノ酸残基がリシン残基（Ｋ）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’３）を有する人工タンパク質（Ａ３）であり、さらに好ましくは、ＧＫＧＶＰ配列（７）が２個連続したポリペプチド鎖（Ｙ’３１）、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）が６個結合したポリペプチド鎖（Ｓ２−１）及びＧＡＧＡＧＳ配列（４）が１０個結合したポリペプチド鎖（Ｓ２−２）を有する人工タンパク質（Ａ３１）である。
具体的には、ポリペプチド鎖（Ｓ２−１）にポリペプチド鎖（Ｙ’３１）が結合し、さらにポリペプチド鎖（Ｓ２−２）が結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−２）が１０個繰り返し化学結合した構造を有する分子質量が約７３ｋＤａの配列（１８）の人工タンパク質（ＳＬＰ４．２、疎水性度０．２０）等である。

【0032】

（２）アミノ酸配列（Ｘ）がＶＰＧＶＧ配列（１）の人工タンパク質
（２−１）ＶＰＧＶＧ配列（１）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ４）を有する人工タンパク質（Ａ４）であり、具体的には、ＶＰＧＶＧ配列（１）が１６０個連続したポリペプチド鎖（Ｙ４１）を有する分子質量が約６５ｋＤａの配列（１９）の人工タンパク質（ＥＬＰ１、疎水性度１．２０）である。
（２−２）ＶＰＧＶＧ配列（１）が４個連続したポリペプチド鎖（Ｙ５−１）及びＶＰＧＶＧ配列（１）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ５−２）を有する人工タンパク質（Ａ５）であり、さらに好ましくは、ＶＰＧＶＧ配列（１）が４個連続したポリペプチド鎖（Ｙ５−１）、ＶＰＧＶＧ配列（１）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ５−２）及びＧＡＧＡＧＳ配列（４）を有する人工タンパク質（Ａ５１）であり、具体的には、ポリペプチド鎖（Ｙ５−１）にＧＡＧＡＧＳ配列（４）が結合し、さらにポリペプチド鎖（Ｙ５−２）が結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−３）が４０個繰り返し化学結合した構造を有する分子質量が約２２０ｋＤａの配列（２０）の人工タンパク質（ＥＬＰ１．１、疎水性度１．１２）である。

【0033】

上記の通り本発明の細胞移植用組成物は、細胞（Ｃ）の患部への残存性を向上させることができる。
本発明の細胞移植用組成物が含有する細胞（Ｃ）は、幹細胞、上皮細胞、神経系細胞、線維芽細胞、筋細胞及び炎症性細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞である。細胞（Ｃ）の由来は、組織から単離されたこれらの細胞であってもよく、継代培養されたこれらの細胞であってもよい。また、継代培養された細胞を用いる場合には不死化細胞であってもよい。
さらに、本発明の細胞移植用組成物には、細胞（Ｃ）が含まれていれば、細胞（Ｃ）の状態は特に限定されず、例えば、単独の細胞であってもよく、複数の細胞が接合した細胞群であってもよく、組織であってもよい。
なお、細胞（Ｃ）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（以下、ＡＴＣＣと略記する）等の生物リソースセンターが配布する培養細胞、及び、市販されている細胞等の第三者から入手できる細胞を用いてもよい。第三者から入手できる細胞（Ｃ）としては、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ−ＢＭ）、ヒト骨格筋細胞（ＳｋＭＣ）、イヌ腎臓由来上皮細胞（ＭＤＣＫ）及びマウス神経芽細胞（Ｎｅｕｒｏ２ａ）、マウス大腸がん由来細胞（ＣＴ２６）等がある。また、細胞（Ｃ）の入手先としては、タカラバイオ株式会社及びＤＳファーマバイオメディカル株式会社等が挙げられる。

【0034】

また、本発明の細胞移植用組成物が用いられる組織としては、特に限定されないが、皮膚、神経、血液、筋肉、腎臓、すい臓等が挙げられる。
また、本発明の細胞移植用組成物が用いられる対象疾患としては、特に限定されないが、心筋梗塞、筋ジストロフィー、糖尿病、腎不全、創傷、熱傷等が挙げられる。

【0035】

本発明の細胞移植用組成物は、動物由来の血清等が含まれていないので、抗原性が低いと推察される。また、人工タンパク質（Ａ）は、生物由来配列を有するので、生体適合性が高いと推察される。さらに、人工タンパク質（Ａ）は大腸菌等の細菌により、安価に大量生産できるので、本発明の細胞移植用組成物は容易に入手できる。
また、本発明の細胞移植用組成物は、体内のプロテアーゼによる分解を受けにくいため、持続性があり、長期的に生体内に存在することができる。

【0036】

本発明の細胞移植用組成物が、細胞（Ｃ）の患部への残存性を向上させる原理について説明する。
本発明の細胞移植用組成物は、水に溶解されて細胞移植用溶液として用いられることになる。なお、このような細胞移植用溶液は、本発明の細胞移植用溶液でもある。
この細胞移植用溶液は、人工タンパク質（Ａ）及び細胞（Ｃ）を含有するので、人工タンパク質（Ａ）及び細胞（Ｃ）を一度に患部に適用することができる。
また、細胞移植用溶液は、室温では液状であるが体温程度の温度（約３７℃）に加温されることで増粘する性質を有する。特に細胞移植用溶液が人工タンパク質（Ａ）を１０重量％以上の濃度で含有する場合には体温程度に加温されることで完全にゲル化する性質を有する。そのため、本発明の細胞移植用組成物を含む細胞移植用溶液は、注射器等で簡易に患部へ注入することができる。さらに、細胞移植用溶液は、注入された患部において体温によって加熱されて増粘、ゲル化して本発明の細胞移植用組成物が患部から流出することを防ぎ、細胞（Ｃ）が特定の移植部位に留まり易くする効果を有する。また、本発明の細胞移植用組成物に含まれる人工タンパク質（Ａ）は細胞（Ｃ）の足場としても機能するため、細胞の死滅を抑制する効果も有する。
加えて、本発明の細胞移植用組成物に含まれる人工タンパク質（Ａ）は、患部において生体組織と置換しながらゆっくりと分解される。そのため、細胞（Ｃ）がおかれた環境が急激に変化することがないため、細胞（Ｃ）の環境適応性と、細胞（Ｃ）の生体組織への残存性が向上することになる。

【0037】

本発明の細胞移植用溶液では、前記細胞移植用溶液中の前記人工タンパク質（Ａ）の濃度が、前記細胞移植用溶液の合計重量を基準として１〜４０重量％であることが好ましく、２〜２０重量％であることがより好ましく、１０〜２０重量％であることがさらに好ましい。
細胞移植用溶液中の人工タンパク質（Ａ）の濃度が細胞移植用溶液の合計重量を基準として１〜４０重量％であると、細胞移植用溶液の粘度が充分に高くなる。そのため、細胞（Ｃ）を好適に患部に定着させることができ、細胞（Ｃ）の残存性が向上する。
特に、細胞移植用溶液中の人工タンパク質（Ａ）の濃度が細胞移植用溶液の合計重量を基準として１０〜２０重量％である場合、細胞移植用溶液が約３７℃に加熱されると、流動性が無くなり、自重によって形状変化が生じない程の固さを有するゲルとなる。
細胞移植用溶液がゲル化すると、細胞（Ｃ）が分散することを防ぐことができ、細胞（Ｃ）の残存性をより向上させることができる。
なお、このゲル化には架橋剤等のゲル化剤を細胞移植用溶液に含有させる必要は無く、細胞移植用組成物及び水のみでゲル化が進行する。
また、本発明の細胞移植用溶液は、架橋剤等のゲル化剤を含まないことが好ましい。

【0038】

本発明の細胞移植用溶液では、前記細胞移植用溶液中の前記細胞（Ｃ）の濃度が、前記細胞移植用溶液の合計体積を基準として、１０^５〜１０^８個／ｍＬであることが好ましい。
細胞移植用溶液中の細胞（Ｃ）の濃度が、細胞移植用溶液の合計体積を基準として、１０^５未満であると、細胞（Ｃ）の数が少なすぎるので、患部に細胞移植する効果が充分に得られにくい。
細胞移植用溶液中の細胞（Ｃ）の濃度が、細胞移植用溶液の合計体積を基準として、１０^８を超えると、細胞（Ｃ）の数が多すぎ、患部に定着されない細胞の数が多くなり、細胞（Ｃ）の残存性が充分でなくなる。また、このような濃度の細胞（Ｃ）を用いる場合、費用対効果の観点から経済的でない。

【0039】

本発明の細胞移植用溶液中の水としては、特に限定するものではなく、滅菌されたものが好ましい。滅菌方法としては、０．２μｍ以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで１２１℃、２０分加熱して加熱滅菌したイオン交換水等が挙げられる。

【0040】

本発明の細胞移植用溶液は、上記細胞移植用組成物及び水以外に無機塩及びリン酸（塩）を含んでもいい。
無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム及び炭酸水素マグネシウム等が挙げられる。リン酸塩は無機塩に含まない。
本発明の細胞移植用溶液中の塩の含有量（重量％）は、細胞（Ｃ）の残存性の観点から、細胞移植用溶液の合計重量を基準として０〜１．３重量％が好ましく、さらに好ましくは０．５〜１．３重量％であり、次にさらに好ましくは０．７〜１．１重量％であり、特に好ましくは０．８５〜０．９５重量％である。

【0041】

リン酸（塩）は、リン酸及び／又はリン酸塩を意味する。
本発明の細胞移植用溶液中のリン酸（塩）としては、リン酸及びリン酸塩が挙げられる。
塩としては、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
細胞移植用溶液中のリン酸（塩）の含有量（重量％）は、人工タンパク質（Ａ）の溶解性の観点から、細胞移植用溶液の合計重量を基準として０〜０．３０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１０〜０．３０重量％であり、次にさらに好ましくは０．１２〜０．２８重量％であり、特に好ましくは０．１４〜０．２６重量％である。

【0042】

また、細胞移植用溶液は、上記以外に、成長因子を含んでもよい。
細胞移植用溶液が成長因子を含む場合、成長因子の種類は、患部や対象疾患の種類に応じて決定することが好ましく、成長因子としては、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＴＧＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ：ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ：Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ：ＧＭ−ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＥＰＯ）、トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＴＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ又はＦＧＦ２）、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）等が挙げられる。
細胞移植用溶液中の成長因子の濃度は細胞増殖の観点から、細胞移植用溶液の合計重量を基準として、０．００３〜９．１重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００３〜６．２５重量％である。

【0043】

細胞移植用溶液は、さらに公知の分化因子、ホルモン、ケモカイン、サイトカイン、細胞接着分子、走化因子、酵素、酵素インヒビター、補酵素、鉱物、脂肪、脂質、糖類、抗生物質、炎症阻害剤、免疫抑制剤、緩衝物質、安定剤及びビタミン等を含んでもいい。

【0044】

細胞移植用溶液のｐＨは、組織親和性の観点から、５〜９が好ましく、さらに好ましくは６〜８である。ｐＨの調整は公知の緩衝物質等を添加することで調整できる。

【実施例】

【0045】

以下、実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0046】

＜製造例１＞
○ＳＥＬＰ８Ｋの生産
特許第４０８８３４１号公報の実施例記載の方法に準じて、ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５を作製した。ＳＥＬＰ８Ｋをコードしている遺伝子の３´末端には、６×Ｈｉｓタグをコードした遺伝子が含まれている。
作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、ＳＥＬＰ８Ｋ生産株を得た。
３０℃で生育させたＳＥＬＰ８Ｋ生産株の一夜培養液を使用して、２５０ｍｌフラスコ中のＬＢ培地５０ｍｌに接種した。カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように加え、該培養液を３０℃で攪拌しながら（２００ｒｐｍ）インキュベートした。培養液の６００ｎｍでの吸光度（ＯＤ_６００）を測定し、培養液がＯＤ_６００＝０．８（吸光度計ＵＶ１７００：島津製作所製を使用）となった時に、４０ｍｌを４２℃に前もって温めたフラスコに移し、同じ温度で約２時間インキュベートした。該培養体を氷上で冷却し、培養液のＯＤ_６００を測定し、培養に異常がないことを確認した。大腸菌を遠心分離で集めた。集菌した大腸菌から人工タンパク質を取り出すために、超音波破砕（４℃、３０秒×１０回）をして溶菌した。
この大腸菌により産生された人工タンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した後、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜にトランスファーした。その後、一次抗体にラビット抗ＳＥＬＰ８Ｋ抗体、２次抗体に抗ラビットＩｇＧ ＨＲＰ標識抗体（ＧＥヘルスケア社製）を用いたウエスタンブロット分析を行なった。該生成物の見かけ分子質量は約８０ｋＤａであった。よってＳＥＬＰ８Ｋ生産株は、見かけ分子質量が約８０ｋＤａのラビット抗ＳＥＬＰ８Ｋ抗体反応性を有するＳＥＬＰ８Ｋを生成したことが分かった。

【0047】

○ＳＥＬＰ８Ｋの精製
上記で得たＳＥＬＰ８Ｋを、菌体溶解、遠心分離による不溶性細片の除去、及びアフィニティークロマトグラフィーにより大腸菌バイオマスから精製した。このようにして、細胞移植用組成物である分子質量が約８０ｋＤａの人工タンパク質（Ａ−１）（ＳＥＬＰ８Ｋ）を得た。

【0048】

○ＳＥＬＰ８Ｋの同定
得られた人工タンパク質（Ａ−１）を下記の手順で同定した。
ラビット抗ＳＥＬＰ８Ｋ抗体及びＣ末端配列の６×Ｈｉｓタグに対するラビット抗６×Ｈｉｓ抗体（Ｒｏｌａｎｄ社製）を用いたウエスタンブロット法により分析した。見かけ分子質量が約８０ｋＤａのタンパク質バンドが、各抗体に抗体反応性を示した。また得られたタンパク質をアミノ分析供した結果、該生成物が、グリシン（４３．７％），アラニン（１２．３％），セリン（５．３％），プロリン（１１．７％）及びバリン（２１．２％）に富むものであった。また、該生成物はリシンを１．５％含んでいた。下記の表１は、精製された生成物の組成と、合成遺伝子配列から推測された予測理論組成との相関関係を示す。
したがって、人工タンパク質（Ａ−１）（ＳＥＬＰ８Ｋ）がＧＶＧＶＰ配列（２）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）においてＶのうち１個がＫに置換された（ＧＶＧＶＰ）_４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）_３配列（６）であるポリペプチド鎖（Ｙ’１１）を１３個及びＧＡＧＡＧＳ配列（４）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）_４配列（５）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を１２個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）_２配列（１４）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）が化学結合した配列（１５）の人工タンパク質であることを確認した。

【0049】

【表1】

【0050】

＜製造例２＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＳＥＬＰ０ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３６４」を用いる以外は同様にして、細胞移植用組成物である分子質量が約８２ｋＤａの配列（１６）の人工タンパク質（Ａ−２）を得た。

【0051】

＜製造例３＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＳＬＰ４．１をコードしたｐＳＹ１３９８−１」を用いる以外は同様にして、細胞移植用組成物である分子質量が約９３ｋＤａの配列（１７）の人工タンパク質（Ａ−３）を得た。

【0052】

＜製造例４＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＥＬＰ１．１をコードしたプラスミドｐＰＴ０１０２−１」を用いる以外は同様にして、細胞移植用組成物である分子質量が約２２０ｋＤａの配列（２０）の人工タンパク質（Ａ−４）を得た。

【0053】

＜製造例５＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＥＬＰ１をコードしたプラスミドｐＰＴ０１０２」を用いる以外は同様にして、細胞移植用組成物である分子質量が約６５ｋＤａの配列（１９）の人工タンパク質（Ａ−５）を得た。

【0054】

製造例１〜５で得られた人工タンパク質を用いて、以下の方法で細胞移植用溶液を作成し、それを用いた場合の細胞残存性を評価した。

【0055】

細胞の残存性試験には、下記の試薬を用いた。
１０重量％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地：ＲＰＭＩ−１６４０培地（和光純薬工業社製）に１００分の１重量のペニシリン・ストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ社製）と、１０分の１重量のＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ））を添加し、４℃の条件下で保管したもの
ＰＢＳ：ＰＢＳ（日本製薬社製）粉末を９．６ｇ／Ｌの濃度になるように、超純水で溶解させたものをオートクレーブ滅菌後、室温で保管したもの

【0056】

＜製造例６：移植細胞の培養＞
移植細胞として、ＧＦＰを定常的に発現しているマウス大腸がん由来細胞であるＣＴ２６細胞を使用し、滅菌シャーレ及び滅菌プレートに播種し、３７℃、ＣＯ_２濃度が５体積％の空気中で３日間培養を行った。１０ｃｍのシャーレで培養したサブコンフルエント状態のＣＴ２６細胞を、５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した後、３ｍＬのトリプシン溶液（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を加えた。トリプシン溶液を除去し、１０重量％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地を２ｍＬ加え、ピペッティングを行い、移植細胞の懸濁液を作製した。
なお、ＣＴ２６細胞としては、ＡＴＣＣが配布する細胞を入手して使用した。

【0057】

＜実施例１＞
滅菌済みの水０．１ｍＬに製造例１で得られた人工タンパク質（Ａ−１）を培養液の体積を基準として０．０５ｇ／ｍＬの濃度となるように添加し、さらに移植細胞の濃度が２．５×１０^６個／ｍＬになるように前記の細胞懸濁液を添加し、マトリックスとして人工タンパク質（Ａ−１）を細胞移植用溶液の合計重量を基準として５重量％含み、移植細胞を細胞移植用溶液の合計体積を基準として２．５×１０^６個／ｍＬ含む実施例１に係る細胞移植用溶液を調製した。

【0058】

＜実施例２〜１５＞
人工タンパク質（Ａ）の種類、及び、細胞移植用溶液中の人工タンパク質（Ａ）の濃度を表２に示すように変更した以外は、実施例１と同様に実施例２〜１５に係る細胞移植用溶液を調製した。

【0059】

＜比較例１＞
人工タンパク質（Ａ−１）を添加しないこと以外は実施例１と同様にして、人工タンパク質（Ａ）を含まず、移植細胞を細胞移植用溶液の合計体積を基準として２．５×１０^６個／ｍＬ含む比較例１に係る細胞移植用溶液を調製した。

【0060】

＜比較例２＞
製造例１の人工タンパク質（Ａ−１）に変えて、マトリックスとしてマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を用いること以外は実施例１と同様に、マトリゲルを細胞移植用溶液の合計重量を基準として１０重量％含み、移植細胞を細胞移植用溶液の合計体積を基準として２．５×１０^６個／ｍＬ含む比較例２に係る細胞移植用溶液を調製した。

【0061】

＜比較例３＞
製造例１の人工タンパク質（Ａ−１）に変えて、マトリックスとしてベリプラスト（ＣＳＬベーリング社製）を用いること以外は実施例１と同様に、ベリプラスト（ＣＳＬベーリング社製）を細胞移植用溶液の合計重量を基準として２５重量％含み、移植細胞を細胞移植用溶液の合計体積を基準として２．５×１０^６個／ｍＬ含む比較例３に係る細胞移植用溶液を調製した。

【0062】

（動物への移植実験及び移植後の細胞残存性評価）
実施例１〜１５及び比較例１〜３で得られた細胞移植用溶液を、４０μＬずつマウス（ＢＡＬＢ／ｃＳｌｃ−ｎｕ、メス、１０週齢）の皮下に注射器を用いて注入し、注入した部位（以下、注入部という）を油性ペンでマークした後、シルキーテックス(アルケア株式会社製)で患部を保護した。その後、マウスを３日間飼育した。
３日間の飼育後、検体を犠死させ、注入部を含む皮膚を１ｃｍ^２になるように採取し、Ｏ．Ｔ．Ｃ．コンパウンド（サクラファインテックジャパン株式会社製）に包埋し、−８０℃で凍結して凍結標本を作製した。作製した凍結標本を、ミクロトームを用いて注入部の中心部分を厚さ１５μｍとなるように切断し、切断した切片をプレパレート用ガラスに塗布し、観察用凍結切片を作製した。

【0063】

観察用凍結切片をヘマトキシリン溶液に３０分間浸漬し、その後緩やかな流水で１０分間洗浄し、さらにエオジン溶液に５分間浸漬した後、７０％エタノールで洗浄し、封入することでＨＥ切片を作製した。作製したＨＥ切片をＢＺ−９０００（キーエンス社製）を用いて観察し、ゲルが残存している領域は濃赤紫色に染まっていること利用し、注入したゲルが局在している場所を同定した。
この操作において実施例２及び比較例２を用いた場合の写真を、それぞれ図１（ａ）及び図１（ｂ）に示す。
図１（ａ）は、実施例２の細胞移植用溶液を用いて細胞移植を行った際のゲルの残存範囲を示す写真である。図１（ｂ）は、比較例２の細胞移植用溶液を用いて細胞移植を行った際のゲルの残存範囲を示す写真である。
図１（ａ）及び図１（ｂ）において矢印で示す部分が、ゲルが残存している領域である。

【0064】

実施例１〜１５、比較例１及び比較例３に係る細胞移植用溶液をそれぞれ用いた場合のＨＥ切片におけるゲルが残存する領域（濃赤紫色の領域）の広さを、比較例２で得られたマトリゲルを含む細胞移植用溶液を用いた場合にゲルが残存する領域（濃赤紫色の領域）の広さに対する割合として、以下の基準で評価し、表２に比較例２のゲルの残存範囲に対するゲルの残存範囲割合としてその結果を記載した。

【0065】

（比較例２のゲルの残存範囲に対するゲルの残存範囲割合の評価基準）
＋：マトリゲルを含む細胞移植用溶液を用いた場合のＨＥ切片における赤紫色の領域の広さに対する、各実施例及び各比較例に係る細胞移植用溶液をそれぞれ用いた場合のＨＥ切片における赤紫色の領域が１０１％以上である。
±：マトリゲルを含む細胞移植用溶液を用いた場合のＨＥ切片における赤紫色の領域の広さに対する、各実施例及び各比較例に係る細胞移植用溶液をそれぞれ用いた場合のＨＥ切片における赤紫色の領域が５０％〜１００％である。
−：マトリゲルを含む細胞移植用溶液を用いた場合のＨＥ切片における赤紫色の領域の広さに対する、各実施例及び各比較例に係る細胞移植用溶液をそれぞれ用いた場合のＨＥ切片における赤紫色の領域が５０％以下である。
これらの結果を表２に示す。

【0066】

また、観察用凍結切片をそのまま封入して蛍光観察用切片として、ＢＺ−９０００を用いて、顕微鏡観察を行い、細胞が残存している領域が緑色蛍光を呈することを利用し、細胞が残存している領域を同定した。
この操作において実施例２及び比較例２を用いた場合の写真を、それぞれ図２（ａ）及び図２（ｂ）に示す。
図２（ａ）は、実施例２の細胞移植用溶液を用いて細胞移植を行った際の細胞の残存範囲を示す写真であり、図２（ｂ）は、比較例２の細胞移植用溶液を用いて細胞移植を行った際の細胞の残存範囲を示す写真である。
図２（ａ）及び図２（ｂ）において矢印で示す部分が、細胞が残存している領域である。

【0067】

実施例１〜１５、比較例１及び比較例３に記載の細胞移植用溶液をそれぞれ用いた場合の蛍光観察用切片における細胞が残存している領域の広さを、比較例２で得られたマトリゲルを含む細胞移植用溶液を用いた場合に細胞が残存している領域の広さに対する割合として、以下の基準で評価し、表２に比較例２の細胞の残存範囲に対する細胞の残存範囲割合としてその結果を記載した。

【0068】

（比較例２の細胞の残存範囲に対する細胞の残存範囲割合の評価基準）
＋：マトリゲルを含む細胞移植用溶液を用いた場合の蛍光観察用切片における緑色蛍光を呈する領域部分の広さに対する、各実施例及び各比較例に係る細胞移植用溶液をそれぞれ用いた場合の蛍光観察用切片における緑色蛍光を呈する領域が１０１％以上である
±：マトリゲルを含む細胞移植用溶液を用いた場合の蛍光観察用切片における緑色蛍光を呈する領域部分の広さに対する、各実施例及び各比較例に係る細胞移植用溶液をそれぞれ用いた場合の蛍光観察用切片における緑色蛍光を呈する領域が５０％〜１００％である
−：マトリゲルを含む細胞移植用溶液を用いた場合の蛍光観察用切片における緑色蛍光を呈する領域部分の広さに対する、各実施例及び各比較例に係る細胞移植用溶液をそれぞれ用いた場合の蛍光観察用切片における緑色蛍光を呈する領域が５０％以下である。
これらの結果を表２に示す。

【0069】

【表2】

【0070】

実施例２、５、８、１１及び１４の細胞移植用溶液中の人工タンパク質（Ａ）の含有量は、細胞移植用溶液の合計重量を基準として１０重量％である。また、比較例２の細胞移植用溶液中のマトリゲルの含有量は、細胞移植用溶液の合計重量を基準として１０重量％である。
ゲルが残存する領域の広さ及び細胞の残存する範囲の広さは、マトリックスの量にも依存すると考えられるが、１０重量％の人工タンパク質（Ａ）を含む実施例２、５、８、１１及び１４の本発明の細胞移植用溶液を用いた場合、１０重量％のマトリゲルを含む比較例２の細胞移植用溶液を用いた場合より、ゲルが残存する領域の広さ、及び、細胞の残存する範囲の広さが広かった。
この結果より、本発明の細胞移植用溶液を用いると、マトリゲル含む細胞移植用溶液を用いるよりも、広範囲にゲル及び細胞を分布させることができることが分かった。

【0071】

（タンパク質定量）
前記の移植後のマウスから採取した注入部を含む皮膚を、はさみを用いてミンチ状にし、１．５ｍｌ遠心管に移した。５００μＬのＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を加え、９５℃で１０分間加温した。２０μＬのサンプルを、１５％ポリアクリルアミドゲル（アトー社製）にアプライし、１次抗体をＧＦＰ抗体（ａｂ２３０、ａｂｃａｍ社製）、２次抗体をＡｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＡＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）、発色試薬をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｕｅ（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いてウエスタンブロット法を行った。画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ）を用いてバンドの定量を行い、検出された人工タンパク質の量と検出された細胞の量とを、比較例２で得られたマトリゲルを含む細胞移植用溶液を用いたときの結果を基準にした相対値で評価し、それぞれマトリックスの含有割合及び細胞の残存率として表３に結果を記載した。

【0072】

【表3】

【0073】

表３から、実施例１〜１５の本発明の細胞移植用溶液を用いた場合、患部に注入された細胞の残存性が高いことが分かる。
特に、実施例１、４、７、１０及び１３の細胞移植用溶液では、マトリックスである人工タンパク質（Ａ）の含有量が少ないにも関わらず、比較例２の細胞移植用溶液よりも細胞の残存性が高かった。

【産業上の利用可能性】

【0074】

本発明の細胞移植用組成物は、移植細胞等を患部に好適に定着させることができ、移植細胞の残存性を向上させることができる。したがって、本発明の細胞移植用組成物を、移植細胞等を患部に移植する際に、移植細胞等と共に用いると、患部への移植細胞等の移植に有効である。

【図1】

【図2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]