特許 6775581 Ｘ線回折像を収集して原子分解で結晶の結晶構造を解明するシステムおよび方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6775581

(24)【登録日】2020年10月8日

(45)【発行日】2020年10月28日

(54)【発明の名称】Ｘ線回折像を収集して原子分解で結晶の結晶構造を解明するシステムおよび方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 23/205 20180101AFI20201019BHJP

【ＦＩ】

   G01N23/205

【請求項の数】11

【全頁数】9

(21)【出願番号】特願2018-526792(P2018-526792)

(86)(22)【出願日】2016年10月28日

(65)【公表番号】特表2019-502102(P2019-502102A)

(43)【公表日】2019年1月24日

(86)【国際出願番号】EP2016076032

(87)【国際公開番号】WO2017089069

(87)【国際公開日】20170601

【審査請求日】2018年7月23日

(31)【優先権主張番号】15195946.7

(32)【優先日】2015年11月24日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】501494414

【氏名又は名称】パウル・シェラー・インスティトゥート

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100098501

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 拓

(74)【代理人】

【識別番号】100116403

【弁理士】

【氏名又は名称】前川 純一

(74)【代理人】

【識別番号】100135633

【弁理士】

【氏名又は名称】二宮 浩康

(74)【代理人】

【識別番号】100162880

【弁理士】

【氏名又は名称】上島 類

(72)【発明者】

【氏名】富崎 孝司

(72)【発明者】

【氏名】辻野 壮一郎

【審査官】 田中 洋介

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１２／０１９７００５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Sabina Santesson et al.，Screening of Nucleation Conditions Using Levitated Drops for Protein Crystallization，Anal.Chem.，２００３年，Vol.75，pp.1733-1740

【文献】 Jork Leiterer et al.，The use of an acoustic levitator to follow crystallization in small droplets by energy-dispersive X-ray diffraction，Journal of Applied Crystallography，２００６年，Vol.39，pp.771-773

【文献】 Alexei S.Soares et al.，Acoustically Mounted Microcrystals Yield High-Resolution X-ray Structures，BIOCHEMISTRY，２０１１年，Vol.50，pp.4399-4401

【文献】 Soichiro Tsujino et al.，Ultrasonic acoustic levitation for fast frame rate X-ray protein crystallography at room temperature，Scientific Reports，２０１６年 ５月 ６日，Vol.6 No.25558，pp.1-9

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ２３／００−２３／２２７６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｘ線回折像を収集して原子分解能で生体高分子の結晶（４）の結晶構造を解明するシステム（２）であって、当該システムは、
ａ）１つまたは複数の、回転している結晶（４）を含んでいる結晶化溶液の流体（３１）の少なくとも１つの液滴（８）を浮揚させる超音波音響浮揚装置（６）を含んでおり、当該超音波音響浮揚装置（６）は、
ｉ）超音波（３０）を生成する１つまたは複数の超音波トランスデューサ（１０）と、
ｉｉ）前記超音波トランスデューサ（１０）の駆動電力を供給する１つまたは複数の電源（１６）と、
を含んでおり、
前記システムはさらに、
ｂ）前記結晶（４）の採取および搬送を１つのステップで行うために、生体高分子の前記１つまたは複数の結晶（４）を含んでいる前記流体（３１）の前記液滴（８）の１つまたは複数を前記超音波音響浮揚装置（６）内へ放射する１つまたは複数の液滴放射器（３０）であって、前記結晶（４）は、結晶化プレートのウェルの一つで生成され、前記流体（３１）中に保存されるか、または、前記流体（３１）とともにキャピラリーを満たし、前記結晶（４）の結晶化条件は、前記結晶のオーダーで構成生体高分子の周期的な配列を有する単結晶を生成するために調整され、前記液滴放射器（３０）は、集中高周波超音波パルスの印加による前記結晶化プレートのウェルからの音響放射、または、パルス状の音響圧の前記キャピラリーへの印加による前記結晶が満たされた前記キャピラリーからの音響放射のために使用される、液滴放射器（３０）と、
ｃ）Ｘ線ビーム（２０）を生成するＸ線源（３４）と、
ｄ）前記Ｘ線ビーム（２０）によって照射された前記結晶（４）によって散乱された前記Ｘ線回折像（２４）を検出する、画素化した２次元Ｘ線検出器（３６）と、
ｅ）前記超音波浮揚装置（６）内の前記浮揚している液滴（８）内の前記結晶（４）の位置を、前記Ｘ線ビーム（２０）に関して位置合わせする装置と、
ｆ）前記結晶の前記位置を前記Ｘ線ビーム（２０）を位置合わせし、前記結晶（４）の回転を制御して浮揚条件を調整するために、前記浮揚している液滴（８）内の前記結晶（４）の前記位置および前記回転を視覚化する装置と、
を含んでいる、
システム（２）。

【請求項2】

音響浮揚圧が、別の超音波トランスデューサ（１４）によって監視される、請求項１記載のシステム。

【請求項3】

前記超音波音響浮揚装置（６）内の超音波伝達媒体の温度および湿度をコントロールする装置が含まれている、請求項１または２記載のシステム。

【請求項4】

前記超音波トランスデューサ（１４）は、音響反射器（１２）と機械的に接触している、請求項２記載のシステム。

【請求項5】

付加的な１つまたは複数の液滴放射器（４０）が、流体（４１）の液滴（４２）の１つまたは複数を、前記超音波音響浮揚装置（６）内の前記浮揚している液滴（８）へ放射すし、前記流体（４１）は、前記浮揚している液滴（８）の前記流体（３１）のｐＨを含む化学物質含有量または化学組成を調整して、前記結晶（４）中の前記生体高分子の立体配座の変化を引き起こすための溶液、または、前記結晶（４）中の前記生体高分子の特定の部位に結合し得るリガンド溶液であり得る、
請求項１から４までのいずれか１項記載のシステム。

【請求項6】

前記浮揚している液滴（８）内の前記結晶（４）の視覚化のための装置は、前記結晶（４）の前記位置および前記回転を監視する、請求項１から５までのいずれか１項記載のシステム。

【請求項7】

Ｘ線回折像を収集して原子分解能で生体高分子の結晶（４）の結晶構造を解明する方法であって、
ａ）１つまたは複数の結晶（４）を含んでいる、流体（３１）の液滴（８）を、液滴放射器（３０）によって、超音波浮揚装置（６）内へ放射して、１つまたは複数の前記結晶（４）の採取および搬送を１つのステップで行うステップであって、前記結晶（４）は、結晶化プレートのウェルの一つで予め生成され、前記流体（３１）中に保存されるか、または、前記流体（３１）とともにキャピラリーを満たし、前記結晶（４）の結晶化条件は、前記結晶のオーダーで構成生体高分子の周期的な配列を有する単結晶を生成するために調整され、前記液滴放射器は、集中高周波超音波パルスの印加による前記結晶化プレートのウェルからの音響放射、または、パルス状の音響圧の前記キャピラリーへの印加による前記結晶が満たされた前記キャピラリーからの音響放射のために使用される、ステップと、ｂ）超音波音響浮揚装置（６）内で、前記結晶（４）を含んでいる前記液滴（８）を浮揚させるステップと、
ｃ）前記結晶の位置をＸ線ビーム（２０）の位置と位置合わせするステップと、
ｄ）Ｘ線ビーム（２０）を前記結晶（４）に印加するステップであって、前記Ｘ線ビーム（２０）はＸ線源（３４）から生じる、ステップと、
ｅ）画素化した２次元Ｘ線検出器（３６）によって、前記Ｘ線ビーム（２０）によって照射された前記単結晶（４）からの前記Ｘ線ビーム（２０）のブラッグ散乱によって生成された、前記Ｘ線回折像（２４）を検出するステップと、
ｆ）前記結晶（４）の複数の方位からのＸ線回折像を記録するために、前記Ｘ線検出器（３６）のフレームレートおよび前記結晶（４）の回転の一方または双方を調整するステップと、
を含む、
方法。

【請求項8】

前記超音波浮揚装置（６）内の前記浮遊している液滴（８）内へ、１つまたは複数の付加的な液滴放射器（４０）によって、適切な流体（４１）の液滴（４２）の１つまたは複数を放射することによって、前記浮揚している液滴の前記流体のｐＨを含む化学物質含有量または化学組成を変えて、特定の化学溶液の液滴を噴射することによって、前記結晶（４）内の溶媒含有量および／または前記結晶（４）の分子立体配座を調整する、
請求項７記載の方法。

【請求項9】

前記結晶（４）内の溶媒含有量および／または前記結晶（４）の分子立体配座を、前記液滴（８）の湿度をコントロールすることおよび／または前記液滴（８）の温度をコントロールすることによって、当該液滴（８）が浮揚している間、前記溶媒をコントロール可能に蒸発させることによって調整する、請求項７または８記載の方法。

【請求項10】

前記結晶（４）中の前記生体高分子の特定の部位でのリガンド分子の結合は、前記浮揚している液滴（８）中にリガンド溶液の前記流体（４１）の液滴（４２）を放射することによって引き起こされ、その場でのＸ線回折実験によって測定される、請求項８記載の方法。

【請求項11】

広帯域の波長の光学的放射の印加、または、特定の波長または磁気パルスによって、生体高分子の前記結晶（４）の分子立体配座を変化させる、請求項７から１０までのいずれか１項記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｘ線回折像を収集して原子分解で結晶の結晶構造を解明するシステムおよび方法に関する。

【0002】

Ｘ線回折は、生体結晶試料や合成分子等の高分子の原子分解構造解析のための最も良く確立された方法のうちの１つである。シンクロトロン光源と２次元高フレームレートピクセル検出器とを組み合わせることで、完全なデータセットを収集する時間が数分に短縮された。今や通常、１０Ｈｚを超える取得レートが、凍結温度で維持されているタンパク質結晶の連続的な回転を可能にする。このようなＸ線回折実験の設定は、全ての主要なシンクロトロンビームラインに共通して、過去１０年の間に、重要なタンパク質分子構造の解明を加速させた。１００〜１０００Ｈｚ以上の、比較的速いデータ取得レートであっても、Ｘ線吸収によって生じたラジカルの拡散を避けることによって、脆弱なタンパク質結晶の損傷を最小限に抑えることができ、このようにして室温での回折データセットの質を大幅に向上させることが提唱されている。比較的速いデータ取得レートはまた、タンパク質結晶が生理学的条件により近づく室温でのみ行うことができる一連の実験、例えばｉｎ−ｓｉｔｕ構造動的研究および時間分解実験を行うことを可能にするだろう。室温での実験は、結晶の迅速なスクリーニングを可能にするだけでなく、凍結試料では研究が困難な生体分子の構造多様性の調査も容易にする。

【0003】

結晶が、音響放射圧によって浮揚されている液滴の内部にあるとき、音響流による液滴の内部循環が、結晶の高速回転および軌道周回を誘発する。その結果、結晶にＸ線ビームを注意深く位置合わせすることによって、高速Ｘ線検出器を用いて短時間で様々な結晶方位で、データセットを取得することが可能になる。

【0004】

しかし、Ｘ線回折データセットを収集する従来の方法および音響浮揚方法では、単結晶試料が手動で採取および搬送されなければならない。試料搬送の自動化された方法、例えば結晶化プレートによる直接的なＸ線回折実験や、固体試料保持機構上への結晶の音響放射ならびに単結晶試料を含んでいる結晶化液体の連続的な流れまたは液滴列の使用は既に報告されている。しかし、このような方法の試料利用効率は、複数の結晶方位で各試料のＸ線回折像を測定することが困難であるため、極めて低い。

【0005】

本発明の目的は、液滴の超音波音響浮揚を自動試料採取および搬送機構と組み合わせることによって、試料を凍結する必要無く、かつ高い試料利用効率で、１００〜１０００Ｈｚ以上のフレームレートでの高速Ｘ線回折データセット取得を実現することである。

【0006】

したがって本発明の課題は、Ｘ線回折像を収集して原子分解で結晶の結晶構造を解明し、それによって脆弱な高分子結晶、例えばタンパク質の結晶構造の原子分解解明を可能にするシステムおよび方法を提供することである。

【0007】

上述の課題は、システムに関しては、本発明に相応に、Ｘ線回折像を収集して原子分解で結晶の結晶構造を解明するシステムによって解決され、このシステムは
ａ）１つまたは複数の、回転している結晶を含んでいる流体の少なくとも１つの液滴を浮揚させる超音波音響浮揚装置を含んでおり、この超音波音響浮揚装置は、
ｉ）１つまたは複数の超音波トランスデューサと、
ｉｉ）上記超音波トランスデューサの駆動電力を供給する１つまたは複数の電源と、
ｉｉｉ）少なくとも１つのＸ線窓と、
ｉｖ）内部で液滴が浮揚されている超音波伝達媒体を、空気と空気の乱れとに関して周囲から隔離する、超音波音響浮揚装置の機械的シールドと、少なくとも１つのＸ線窓とを含んでおり、
このシステムはさらに、
ｂ）上記超音波音響浮揚装置への、上記１つまたは複数の結晶を含んでいる上記流体の１つまたは複数の液滴の１つまたは複数の放射器と、
ｃ）Ｘ線源と、
ｄ）上記Ｘ線源によって照射された上記結晶からのＸ線回折像を検出するＸ線検出器とを含んでいる。

【0008】

方法に関しては、上述の課題は、本発明に相応に、Ｘ線回折像を収集して原子分解で結晶の結晶構造を解明する方法によって解決され、この方法は、
ａ）１つまたは複数の結晶を含んでいる流体の液滴を超音波音響浮揚装置内へ放射するステップと、
ｂ）上記超音波音響浮揚装置内で、上記結晶を含んでいる上記液滴を浮揚させるステップと、
ｃ）上記浮揚している液滴内の上記結晶の空間的な位置および回転を視覚的に監視するステップと、
ｄ）上記浮揚している液滴内の上記結晶に、Ｘ線源から生じているＸ線ビームを印加するステップと、
ｅ）１００〜３０００フレーム／秒以上の範囲のフレームレートで２次元回折パターンを捕捉することができるＸ線検出器によって、上記Ｘ線源によって照射された上記結晶からのＸ線回折像を検出するステップとを含んでいる。

【0009】

本発明は、高いデータ取得レートと高い試料利用効率とを備える、完全に自動化されたＸ線回折実験を実現し、これによって生体分子の構造解析ならびに構造ベースの薬品開発が加速される。

【0010】

本発明の有利な実施形態は、
ａ）１つまたは複数の、回転している結晶を含んでいる流体の少なくとも１つの液滴を浮揚させる超音波音響浮揚装置を含んでいてもよく、この超音波音響浮揚装置は、
ｉ）第１の超音波トランスデューサと、
ｉｉ）超音波反射器と、
ｉｉｉ）上記第１の超音波トランスデューサと上記超音波反射器との間の音響空洞内の音響定在波の圧力を監視する第２の超音波トランスデューサと、
ｉｖ）安定した超音波圧力出力のために第１の超音波トランスデューサの駆動力を供給する電源と、
ｖ）少なくとも１つのＸ線窓と、
ｖｉ）内部で液滴が浮揚されている超音波伝達媒体を、空気と空気の乱れとに関して周囲から隔離する、超音波音響浮揚装置の機械的シールドと、少なくとも１つのＸ線窓と、
ｖｉｉ）上記第１の超音波トランスデューサと上記超音波反射器との間の間隙、平行度、およびずれの調整機構とを含んでおり、
本発明の有利な実施形態はさらに、
ｂ）上記超音波音響浮揚装置内への、上記１つまたは複数の結晶を含んでいる上記流体の液滴の放射器と、
ｃ）上記浮揚されている液滴内の上記結晶の位置および回転を視覚化する装置と、
ｄ）Ｘ線源と、
ｅ）上記Ｘ線源によって照射された上記結晶からのＸ線回折像を検出するＸ線検出器と、
ｆ）上記結晶と上記Ｘ線検出器との間で、入射するＸ線ビームを停止させるビームストップと、
ｇ）内部で上記液滴が浮揚されている超音波伝達媒体の湿度および温度をコントロールする装置とを含んでいてもよい。

【0011】

付加的な手段は、湿度をコントロールすることによって、液滴が浮揚している間、液滴流体をコントロール可能に蒸発させることによって、結晶内の溶媒含有量を調整することであってもよい。

【0012】

付加的にまたは択一的に、結晶の分子立体配座を、超音波浮揚装置内の浮遊している液滴内へ追加の液滴を放射することによって、液滴の温度、溶媒の化学的コンシステンシーまたはｐＨをコントロールすることによって、変えることができる。

【0013】

本発明のさらに有利な実施形態は、液滴に、特定の波長を有する光パルスまたはレーザパルスを印加することによって、結晶の分子立体配座を変化させるステップを提供してもよい。

【0014】

その結晶構造を特定するために、本方法および本システムにおいて使用される結晶を、タンパク質、生体分子結晶、高分子結晶等を含んでいる非排他的なグループから選択することができる。

【0015】

本発明の有利な実施形態を以降で、添付の図面に関してより詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】結晶の結晶構造を解明するＸ線回折イメージングシステムの概略図

【図2】図１に示されたシステムと比較される択一的なシステムの概略図

【図3】図１および図２に示されたシステムと比較される、別の択一的なシステムの概略図

【0017】

図１〜図３は、Ｘ線回折像を収集して原子分解で結晶４の結晶構造を解明するシステム２を示している。このシステム２は、１つまたは複数の、回転している結晶４を含んでいる流体の少なくとも１つの液滴８を浮揚させる超音波音響浮揚装置６を含む。本発明の一実施形態では、上記超音波音響浮揚装置６は、超音波を発生させる超音波トランスデューサ１０と、超音波反射器１２と、音響浮揚圧を監視する超音波トランスデューサ１４とを含む。また、超音波音響浮揚装置６は、駆動電流をフィードバック信号として使用することによって、駆動周波数および電圧出力を変化させて、安定した一定の圧力出力を生成するように、上記超音波トランスデューサ１０の駆動電力を駆動する電源１６を含む。さらに、超音波音響浮揚装置６は、入射するＸ線ビーム２０のための第１のＸ線窓１８と、回折されたＸ線ビーム２４のための第２のＸ線窓２２とを含む。超音波音響浮揚装置６の機械的シールド２６は、上記超音波音響浮揚装置６内の超音波伝達媒体および上記浮揚している液滴８を包囲して、空気と空気の乱れとから隔離するために設けられている。さらに、調整機構２８が、上記超音波トランスデューサ１０と上記超音波反射器１２との間の間隙、平行度およびずれを調整するために設けられている。

【0018】

システム２はさらに、上記１つまたは複数の結晶４を含んでいる上記流体３１の液滴３２の１つまたは複数を、上記超音波音響浮揚装置６内へ放射する放射器３０を含む。浮揚している液滴８内の上記結晶４の位置および回転を視覚化する装置と、Ｘ線源３４と、上記Ｘ線源３４によって照射された１つの上記結晶４からのＸ線回折像２４を検出するＸ線検出器３６とが設けられている。ビームストップ２９は、上記結晶４と上記Ｘ線検出器との間で、入射するＸ線ビーム２０を停止させる。

【0019】

音響的に浮揚されている液滴８は、Ｘ線回折によって解析される１つまたは複数のタンパク質結晶４を含んでいる。高フレームレートの２次元検出器３６は、回折されたＸ線２４を捕捉する。音響浮揚装置６の状態は、結晶方位が、液滴８の内部循環を介して急速に変化するように選択される。これは典型的には１〜３ｋＰａの範囲の音響浮揚圧を設定することによって行われる。１つのタンパク質結晶４を含んでいる液滴８は、自動的にコントロール可能な液滴放射器３０を介して浮揚装置６内に配置される。

【0020】

さらに付加的な１つまたは複数の液滴放射器４０が、超音波音響浮揚装置６内の浮揚している液滴８内へ、特定の化学的コンシステンシーを有する流体４１の液滴４２の１つまたは複数を放射する。

【0021】

システム２の目的は、試料を凍結させることなく、かつ増大された最大線量で、サブｋＨｚからｋＨｚ以上のデータ取得レートで、１つの結晶４からＸ線回折データセットを収集することである。このシステムの別の目的は、オングストローム分解能で結晶構造を解明するための、タンパク質結晶の採取、Ｘ線ビーム路へのタンパク質結晶の搬送およびＸ線回折像のデータセットの取得から成る、完全に自動化された一連のタスクを備える、高速Ｘ線タンパク質構造解析を実現することである。

【0022】

システム２は、音響浮揚装置６と、２次元Ｘ線検出器３６と、Ｘ線源３４と、１つのタンパク質結晶４を含んでいる液滴８の放射器３０とを含む。音響浮揚装置６は、超音波ミラー反射器１２のフィードバックによって出力が安定化される超音波トランスデューサ１０と、浮揚装置６の超音波音響浮揚圧を監視するトランスデューサ１４とを含む。超音波ミラー反射器１２は、上記トランスデューサ１４を上記ミラー反射器１２に取り付けることによって、浮揚装置圧力センサであってもよい。２次元Ｘ線検出器３６は、フレーム間の最小の非アクティブ時間で、サブｋＨｚからｋＨｚ以上の高い繰り返し率で一連のＸ線像を捕捉することができる。

【0023】

音響浮揚装置６の一実施形態では、定在波音響圧力分布３０が、上記トランスデューサ１０と上記反射器１２との間に確立される。ピーク圧力振幅が十分な量であるとき、液滴８を、垂直方向と水平方向の両方で、小さなドリフト振幅で、あらゆる圧力ノードに近い位置で浮揚させることができる。特に重要なのは、音響浮揚圧を調整して、音響流による、浮揚されている液滴８の内部循環を介して、浮揚されている液滴８内のタンパク質結晶４の安定した浮揚状態ならびに高速の回転および／または軌道周回を実現することである。これは例えば、音響圧を、次のような圧力より低く調整することによって実現可能である。すなわち液滴８を噴霧することができるが、その値を下回ると、重力のために浮揚が維持できない圧力閾値よりも十分に（例えば４０〜６０％）大きい圧力より低く調整することによって実現可能である。これは、音響反射器１２を含んでいる浮揚装置の実施形態の場合において、上記トランスデューサ１０と上記反射器１２との間の間隙を調整することによって行われる。

【0024】

放射器３０は、結晶化トレイ内への、１つまたは複数の集中高周波超音波パルスを用いた音響放射を使用してもよい、またはキャピラリーにパルス状の音響圧を印加することによる、結晶化キャピラリーからの音響放射を使用してもよい。

【図1】

【図2】

【図3】