特許 6777837 ヒトノロウイルス不活化評価法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】6777837

(24)【登録日】2020年10月12日

(45)【発行日】2020年10月28日

(54)【発明の名称】ヒトノロウイルス不活化評価法

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/06 20060101AFI20201019BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20201019BHJP

【ＦＩ】

   C12N7/06

   C12Q1/02

【請求項の数】2

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2020-542472(P2020-542472)

(86)(22)【出願日】2020年2月10日

(86)【国際出願番号】JP2020005171

【審査請求日】2020年8月5日

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】000000918

【氏名又は名称】花王株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】598041566

【氏名又は名称】学校法人北里研究所

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】八城 勢造

(72)【発明者】

【氏名】石田 悠記

(72)【発明者】

【氏名】片山 和彦

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／００２０４０６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第００／２０５６５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００７−６８０４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１７／０５９４４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１８／０３８０４２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 COSTANTINI, Veronica et al.，Human Norovirus Replication in Human Intestinal Enteroids as Model to Evaluate Virus Inactivation，Emerg. Infect. Dis.，２０１８年，Vol. 24，pp. 1453-1464

【文献】 戸高玲子 他，ヒト腸管オルガノイドによるヒトノロウイルス消毒薬評価系の構築，臨床とウイルス 第６０回日本臨床ウイルス学会プログラム・抄録集，２０１９年，Vol. 47，S87; 2B-13

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ７／００−７／０８

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト小腸オルガノイドを用いてヒトノロウイルス不活化剤を評価する方法であって、被検薬剤で処理したウイルス溶液に２５体積％濃度以上のウシ胎児血清を添加した後、超遠心分離し、得られた沈殿物をヒト小腸オルガノイドに感染させる工程を含む、方法。

【請求項2】

超遠心分離が１５００００〜１９００００×ｇで１〜２．５時間行われる、請求項１記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒトノロウイルス（ＨＮＶ）の不活化評価法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＨＮＶは、カリシウイルス科、ノロウイルス属に分類されているエンベロープ（膜状構造）を持たないＲＮＡウイルスであり、酸性（胃酸）に対して強い抵抗力を有し、少量（１０〜１００個程度）で感染することが知られている。
現状では、ＨＮＶに対するワクチンや治療薬は存在しないことから、ウイルスが付着し得る調理器具、衣服、手指等を洗浄・消毒することによる除ウイルスやウイルス不活性化により感染を予防することが重要である。

【0003】

ノロウイルスは、物理化学的抵抗性が強いため、その不活化には多くの細菌類に対して有効であるエタノールやカチオン界面活性剤を含む消毒剤等もノロウイルスに対しては一般的な使用法において十分な効果を得られないと考えられ、塩素系消毒剤（次亜塩素酸ナトリウム等）が使用される場合が多い。しかしながら、塩素系消毒剤は、金属に対する腐食作用、皮膚に対する刺激・損傷作用、衣類等に対する漂白（脱色）作用があるため、使用対象が制限されるという問題がある。

【0004】

ＨＮＶは、最近までインビトロで株化培養細胞を用いて増殖させることができなかったため、消毒剤によるＨＮＶ不活化効果を直接評価できなかった。そのため、ＨＮＶと遺伝学上近縁であり、インビトロで増殖させることができるネコカリシウイルス（ＦＣＶ）やネズミノロウイルス（ＭＮＶ）を代替えウイルスとして用いて消毒剤を評価し、ＨＮＶへの効果を推測していた。
斯かる状況下、近年、代替ウイルスでの評価においてエタノールであってもその濃度を高めたり、副成分を添加することや、ｐＨを調整すること等により代替ウイルスに対する不活化効果が高められると考えられるようになり、それらの知見を応用したアルコール系消毒剤の開発も進められている。しかし、ＦＣＶは酸性条件下で、ＭＮＶはアルコール処理で容易に不活化可能であるため（非特許文献１）、ＨＮＶと性質が著しく異なることが報告されている。つまり、これらのウイルスを使用した評価結果からＨＮＶへの消毒効果を類推するのは困難であると考えられる。

【0005】

近年、ヒト小腸オルガノイドｈＳＩＯ：ｈｕｍａｎ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ｏｒｇａｎｏｉｄ（ヒト小腸エンテロイドｈＳＩＥ：ｈｕｍａｎ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ｅｎｔｅｒｏｉｄ）二次元培養法を用いて、インビトロにおいてＨＮＶを安定的に増殖させることに成功したとの報告を受け（非特許文献２）、当該培養系を利用してＨＮＶの不活化を直接評価することが試みられるようになった。然るに、アルコール系消毒剤や塩素系消毒剤は細胞毒性を有することから、斯かる薬剤を当該ＨＮＶ培養系で評価するには、細胞に対する作用を抑制する必要がある。例えば、非特許文献３では、エタノールや次亜塩素酸の効果を評価する場合に、培地にウシ胎児血清（ＦＢＳ：Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）やチオ硫酸ナトリウムを添加することが行われている。

【0006】

（非特許文献１）Cromeans Theresa et al., Appl. Environ. Microbiol. 80.18 (2014): 5743-5751.
(非特許文献２）Science,353(6306),1387-1393,2016 Sep23
（非特許文献３）Costantini, Veronica, et al. Emerging infectious diseases 24.8 (2018): 1453.

【発明の概要】

【0007】

本発明は、ｈＳＩＯを用いてＨＮＶ不活化剤を評価する方法であって、被検薬剤で処理したウイルス溶液に２５体積％濃度以上のＦＢＳを添加した後、超遠心分離し、得られた沈殿物をｈＳＩＯに感染させる工程を含む、方法、に係るものである。

【発明の詳細な説明】

【0008】

本発明は、ｈＳＩＯを用いてＨＮＶ不活化剤を適正に評価する方法を提供することに関する。

【0009】

本発明者らは、上記課題に鑑み検討した結果、被検薬剤で処理したウイルス溶液に、一定濃度以上のＦＢＳを添加した後、超遠心分離し、得られた沈殿物をｈＳＩＯに感染させることにより、ｈＳＩＯを傷害せずに、薬剤によるＨＮＶ不活化効果を安定的に評価できることを見出した。

【0010】

本発明によれば、ｈＳＩＯを用いたＨＮＶ不活化剤の評価系において、ｈＳＩＯを傷害せずに、安定的にＨＮＶ不活化剤の評価ができる。

【0011】

本発明のＨＮＶ不活化剤の評価方法は、ｈＳＩＯを用いてＨＮＶ不活化剤を評価する方法であって、被検薬剤で処理したウイルス溶液に２５体積％濃度以上のＦＢＳを添加した後、超遠心分離し、得られた沈殿物をｈＳＩＯに感染させる工程を含むことを特徴とする。

【0012】

本発明において、ｈＳＩＯとは、オルガノイド技術によって人体外で永続的に三次元培養可能となったヒト小腸上皮細胞である。ｈＳＩＯは、公知の方法（GASTROENTEROLOGY 2011;141:1762-1772）によって樹立できる。

【0013】

斯かるＨＮＶの感染に用いるｈＳＩＯは、公知の方法（国際公開第２０１８／０３８０４２号）によって実施でき、例えば以下の１）〜２）の方法で培養することができる。
１）細胞外マトリクス上にヒト腸管上皮幹細胞、ヒト腸管上皮細胞、又はこれらの細胞の内、少なくともいずれかを含む組織を立体培養し、３Ｄオルガノイドを得る。
２）３Ｄオルガロイドを分散させて単一細胞を調製し、当該単一細胞を細胞外マトリクス上で単層培養し、分化した腸上皮細胞、腸内分泌細胞、ゴブレット細胞、又はパネート細胞を含むヒト腸管上皮細胞が単層構造となっている２Ｄオルガノイドを取得する。
ここで、１）の立体培養は、オルガノイドの長期培養に適する培地（例えば、国際公開第２０１７／１９９８１１号等に示される組成の培地、又はＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｈｕｍａｎ）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等）を用い、ウェルプレート上でマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に包埋することにより行われる。
２）の単一細胞の調製は、３Ｄオルガノイドの立体構造を物理的もしくは化学的に崩すことによってなされる。物理的破壊には口径の小さなキャピラリー、シリンジ、ピペットチップ等を用いることができる。化学的破壊にはトリプシンやトリプシン代替試薬（ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）やＧｅｎｔｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等）を用いることができる。
単層培養は、前記単一細胞を細胞外マトリクス（ＴｙｐｅＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＶコラーゲン、又はマトリゲル等）でコーティングしたウェルプレートに接着させることによって開始される。単層培養における分化誘導は、３Ｄオルガノイドの培養液からＷｎｔアゴニストとｐ３８阻害剤を除いた分化培地で、３日間以上、２日間隔で培地交換を行いながら培養することでなされる。

【0014】

斯かる分化したｈＳＩＯに対して、被検薬剤で処理したウイルス溶液に２５体積％濃度以上のＦＢＳを添加した後、超遠心分離し、得られた沈殿物を感染させる。
ウイルス溶液としては、ＨＮＶを一定量（５０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ以上）含有する溶液であれば使用できるが、例えばＨＮＶ罹患者の糞便を、プロテアーゼ阻害剤を含有する緩衝液に懸濁して調製した糞便懸濁液（ウイルス量：５０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ以上）等を用いることができる。

【0015】

なお、ノロウイルスは、ゲノム塩基配列の相同性に基づき７つの遺伝子群（ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ、ＧＩ〜ＧVII）に分けられ、中でもヒトに感染するＨＮＶはＧＩ９種（ＧＩ.1、ＧＩ.２、ＧＩ.３、ＧＩ.４、ＧＩ.５、ＧＩ.６、ＧＩ.７、ＧＩ.８、ＧＩ.９）、ＧII１９種（ＧII.１、ＧII.２、ＧII.３、ＧII.４、ＧII.５、ＧII.６、ＧII.７、ＧII.８、ＧII.９、ＧII.１０、ＧII.１２、ＧII.１３、ＧII.１４、ＧII.１５、ＧII.１６、ＧII.１７、ＧII.２０、ＧII.２１、ＧII.２２）、ＧIV１種（ＧIV.１）であるが、本発明におけるＨＮＶは、これらのいずれの遺伝子型のものであっても良い。

【0016】

被検薬剤によるウイルス溶液の処理は、被検薬剤とウイルス溶液とを所定の温度、所定の時間で接触させることにより行われる。
接触温度は０〜１００℃であり、好ましくは４〜６０℃である。また、接触時間は、３秒〜１２０分間が好ましく、１０秒〜６０分間がより好ましく、３０秒〜３０分間がより好ましい。
接触は、被検薬剤溶液とウイルス溶液とを混合又は混合攪拌することにより行えばよいが、ピペッティング又は試験管ミキサーを用いて混合攪拌するのが好ましい。

【0017】

被検薬剤としては、特に限定されるものではないが、ＨＮＶ不活化効果が期待される消毒剤や、殺菌・静菌性能、抗ウイルス能が公知である薬剤が挙げられる。
消毒剤としては、例えば、アルコール系（エタノール、イソプロパノールなど）、塩素系（次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸水、次亜塩素酸カルシウム、ジクロロイソシアヌル酸ナトリウム、二酸化塩素等）、アルデヒド系（グルタラール、ホルマリンなど）、過酸化物系（過酸化水素、過酸化ベンゾイル、過酢酸など）、ビグアナイド系、ヨウ素系（ヨードチンキなど）、芳香族系（フェノキシエタノール、安息香酸、パラオキシ安息香酸エステル、クロロキシレノール、トリクロサン等）、界面活性剤系（ジオクチルジメチルアンモニウム塩、ジデシルジメチルアンモニウム塩、ジドデシルジメチルアンモニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、テトラデシルトリメチルアンモニウム塩、テトラデシルジメチルエチルアンモニウム塩、及びヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩カルボベタイン、スルホベタイン、ヒドロキシスルホベタイン、アルキル硫酸エステル塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸又はその塩、アルカンスルホン酸又はその塩、飽和又は不飽和脂肪酸塩、アルキル又はアルケニルエーテルカルボン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、α−スルホ脂肪酸エステル等）、グルコン酸クロルヘキシジン系（グルコネート製剤等）の消毒剤、および漂白活性化剤（テトラアセチルエチレンジアミン、グルコースペンタアセテート、テトラアセチルグリコールウリル、アルカノイル若しくはアルケノイル（これらの基の炭素数は８〜１４）オキシベンゼンカルボン酸又はその塩、アルカノイル又はアルケノイル（これらの基の炭素数は８〜１４）オキシベンゼンスルホン酸塩など）、もしくはチアゾリン系（メチルイソチアゾリノン、クロロメチルイソチアゾリノン、ベンズイソチアゾリノン等）などを含有する消毒剤が挙げられる。
また、過炭酸ナトリウムを含有する酸素系漂白剤等も好適に挙げられる。このうち、エタノール系消毒剤、ヨウ素系消毒剤、酸素系漂白剤が好ましい。

【0018】

次いで、被検薬剤で処理したウイルス溶液に対し、２５体積％濃度以上のＦＢＳが添加される。
ＦＢＳは、５６℃で３０分間非働化処理したウシ胎児血清の原液を用いることができるが、当該ウシ胎児血清の原液を適当な溶媒で希釈した、ＦＢＳを２５体積％濃度以上含有する溶液であってもよい。
ここで、希釈溶媒としては、細胞培養に用いられる培地や緩衝液が用いられる。例えばｈＳＩＯの培養に用いられる基本培地、蒸留水、ＰＢＳ等が挙げられるが、ｈＳＩＯの培養に用いられる基本培地であるのが好ましい。
ｈＳＩＯの培養に用いられる基本培地としては、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ社）にＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（１００×）（Ｇｉｂｃｏ社）、ＨＥＰＥＳ（ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸）、ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を含む培地等が挙げられる。

【0019】

添加するＦＢＳの濃度は、薬剤によるｈＳＩＯへの傷害を抑制（細胞毒性の中和）する点から、２５体積％以上であればよく、好ましくは５０体積％以上、より好ましくは７５体積％以上である。また、希釈しないＦＢＳ原液（１００体積％ＦＢＳ）をそのまま用いるのも好ましい。尚、体積％は５〜３５℃で測定された値を示す。

【0020】

ＦＢＳの添加量は、薬剤処理ウイルス溶液に対して、２倍量以上となるように添加するのが好ましく、薬剤のｈＳＩＯに対する毒性を中和する効果を阻害しない限り１０倍量以上、更に２０倍量以上であってもよく、更には３０倍量程度であってもよい。

【0021】

次いで、ＦＢＳを添加した薬剤処理ウイルス溶液は、超遠心分離にかけて、その沈殿物、すなわち薬剤処理されたＨＮＶが回収される。
超遠心分離は、３８ｎｍのノロウイルスが沈降する条件であれば制限されないが、０〜３７℃、好ましくは４℃で、最大回転半径部分（Ｒｍａｘ）における遠心力が１５００００〜１９００００×ｇ、好ましくは１９００００×ｇの遠心力で、１〜２．５時間、好ましくは１．３５時間行われる。
斯かる薬剤処理されたＨＮＶに対してＦＢＳを添加した後超遠心分離する操作は、薬剤のｈＳＩＯに対する毒性を中和する効果を高める点から、必要に応じて繰り返し行っても良い。

【0022】

斯くして回収された沈殿物（薬剤処理されたＨＮＶを含有）は、分化したｈＳＩＯに供され、適宜、感染効率増加に寄与する胆汁抽出物やセラミド等を添加して、３７℃で、１〜３時間、ＣＯ_２の条件下でインキュベーションすることにより、ｈＳＩＯへのウイルス感染が行われる。感染終了後、基本培地で残存ウイルス溶液を十分に洗浄し、分化培地を添加して３７℃で、１〜７日間、ＣＯ_２の条件下培養する。その後適宜上清を回収してウイルスを検出・測定し、被検薬剤のＨＮＶ不活化効果が評価される。
評価は、例えばＲＴ−ｑＰＣＲ法等を用いてＨＮＶ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｐｙ数を測定することが挙げられ、具体的には、市販のノロウイルス検出キットを用いて行うことができる。

【0023】

上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞ヒト小腸オルガノイドを用いてヒトノロウイルス不活化剤を評価する方法であって、被検薬剤で処理したウイルス溶液に２５体積％濃度以上のウシ胎児血清を添加した後、超遠心分離し、得られた沈殿物をヒト小腸オルガノイドに感染させる工程を含む、方法。
＜２＞超遠心分離が１５００００〜１９００００×ｇで１〜２．５時間行われる、＜１＞の方法。
＜３＞超遠心分離が１９００００×ｇで１〜２．５時間行われる、＜２＞の方法。
＜４＞ウシ胎児血清の濃度が、５０体積％以上、より好ましくは７５体積％以上である＜１＞〜＜３＞のいずれかの方法。
＜５＞ウシ胎児血清を薬剤処理ウイルス溶液に対して２倍量以上、１０倍量以上、２０倍量以上、更には３０倍量程度添加する、＜１＞〜＜４＞のいずれかの方法。
＜６＞被検薬剤が、エタノール系消毒剤、ヨウ素系消毒剤又は酸素系漂白剤である、＜１＞〜＜５＞のいずれかの方法。

【実施例】

【0024】

試験例１：ＦＢＳを用いたＨＮＶ不活化剤の評価
（１）ｈｕｍａｎ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ｏｒｇａｎｏｉｄ（ｈＳＩＯ）の培養
ｈＳＩＯは４８ウェルプレート上でマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５６２３１）に包埋し三次元培養した。培地はＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｈｕｍａｎ）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＳＴ−０６０１０）を用いた。培地交換・継代・９６ウェルプレートを用いた単層化の手技はユーザーマニュアルに従った。トリプシン処理後２日間はアノイキスを阻害するために培地に終濃度１０μＭとなるようにＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤であるＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ Ｙ−２７６３２（富士フィルム和光純薬，０３６−２４０２３）を添加した。５００ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，１２６３４０１０）に５ｍＬのＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，３５０５０−０６１）、５ｍＬの１Ｍ ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ，１５６３００８０）、５ｍＬのＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ，１５１４０１２２）を添加することで基本培地を作成した。基本培地とＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｇｒｏｗｔｈ ＭｅｄｉｕｍのコンポーネントＡとを等量混合することで分化培地を作成した。９６ウェルプレートで単層化させた細胞に分化培地を１ｗｅｌｌあたり２００μＬずつ２日間隔で交換しながら計６日間分化を誘導した。

【0025】

（２）ＨＮＶ（ＨｕＮｏＶ）含有糞便の１０％乳剤の作成
糞便の１０％乳剤はＧII．４型のＨＮＶ罹患者糞便から作成した。プロテアーゼ阻害剤であるｃＯｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ｔａｂｌｅｔｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，１１６９７４９８００１）１錠を５０ｍＬのＤ−ＰＢＳ（−）に懸濁した。糞便１ｇに対して１０ｍＬのｃＯｍｐｌｅｔｅ含有Ｄ−ＰＢＳ（−）で懸濁し、試験管ミキサーを用いてよく混合した。４℃で２０分間静置した後に、２，０００×ｇ ４℃で１０分間遠心した。上清を新たなチューブに回収し、感染実験に供するまで−８０℃に保存した。

【0026】

（３）ＨＮＶの不活化処理と薬剤の細胞毒性中和処理
ＨＮＶ含有１０％糞便乳剤を分化培地で１０倍に希釈し、１ｍＬのシリンジとＭｉｌｌｅｘ ＨＶ Ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＳＬＨＶＲ０４ＮＬ）を用いて濾過した。ＰＡ微量遠心チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ，３５７４４８）中で濾過した糞便溶液５μＬ（２．８×１０^６ ＨＮＶ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｐｙ相当）と表１に示す薬剤溶液４５μＬとを混合し、表１に示す所定の温度と時間で反応させた。次いでこの薬剤処理された糞便溶液に、５６℃で３０分間非働化処理を行ったＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＢＩＯＷＥＳＴ社）１．４５ｍＬを添加した。遠心チューブを固定角ロータＴＬＡ−５５（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）にセットしＯｐｔｉｍａ ＭＡＸ−ＴＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてＲｍａｘにおいて１８６０４７×ｇの遠心力（５５０００ｒｐｍ相当）で１．５時間超遠心した後に上清を除去した。ペレットを１００μＬの分化培地で懸濁し、ｈＳＩＯへの感染溶液とした。尚、薬剤溶液に代わり基本培地を用いて同様の操作を行い調製したｈＳＩＯへの感染溶液を薬剤非処理のコントロールとした。

【0027】

（４）分化ｈＳＩＯへの感染
ウェル中の既存の培地を除去した６〜７日間分化誘導後のｈＳＩＯに上述の方法で調製した感染溶液をアプライした。インキュベートは３７℃で３時間実施した。３００μＬの基本培地で３回洗浄した後に、終濃度が１２５ｐｐｍとなるようにブタ胆汁抽出物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｂ８６３１−１００Ｇ）を加えた分化培地を２５０μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下でサンプリングのタイミングまで培養した。培養開始直後（ｄａｙ ０）と培養３日後（ｄａｙ ３）に１０μＬの上清を回収した。回収した上清はＲＴ−ｑＰＣＲに供するまで−８０℃で保存した。

【0028】

（５）ＲＴ−ｑＰＣＲ
回収した上清中のＨＮＶ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｐｙ数の定量にはノロウイルス検出キット Ｇ１／Ｇ２（東洋紡，ＦＩＫ−２７３）を用いた。操作はプロトコールに従った。ＰＣＲ増幅とデータ測定はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０II（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。
測定されたウイルス量に基づき、Ａ：ＨＮＶを検出下限にまで不活化されている、Ｂ：コントロール（薬剤処理無し）よりも減少、Ｃ：コントロール（薬剤処理無し）と同等にＨＮＶが増殖している、の３段階で評価した。

【0029】

（６）細胞傷害性の確認
細胞傷害性について、細胞の生死（○：細胞生存、×：細胞死亡）を、顕微鏡観察により判定した。

【0030】

比較試験例１：１０体積％ＦＢＳを用いたＨＮＶ不活化剤の評価
上記試験例１と同様に調製したＨＮＶ含有１０％糞便乳剤を１ｍＬのシリンジとＭｉｌｌｅｘ ＨＶ Ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＳＬＨＶＲ０４ＮＬ）を用いて濾過した。濾過した糞便溶液５μＬと表１に示す薬剤溶液４５μＬを混合し、表１に示す所定の温度と時間で反応させた。次いでこの薬剤処理された糞便溶液に１４５０μＬの１０体積％ＦＢＳ（ＦＢＳ原液は５６℃で３０分間非働化）を含有する基本培地溶液を添加混合した。遠心チューブを固定角ロータＴＬＡ−５５（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）にセットしＯｐｔｉｍａ ＭＡＸ−ＴＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてＲｍａｘにおいて１８６０４７×ｇの遠心力（５５０００ｒｐｍ相当）で１．５時間超遠心した後に上清を除去した。ペレットを１００μＬの分化培地で懸濁し、ｈＳＩＯへの感染溶液とした。上記試験例と同様に、分化ｈＳＩＯへ感染させた後に細胞傷害性を顕微鏡観察により判定した。
比較試験例１では被検薬剤の細胞毒性を十分に中和できず、細胞が死滅したことによりＨＮＶの不活化効果の評価が実施できなかった。一方、試験例１では披検薬剤の細胞毒性を十分に中和することができＨＮＶの不活化効果の評価を実施できた。

【0031】

【表1】

【0032】

試験例２：各濃度のＦＢＳを用いた細胞傷害性の評価
上記試験例１と同様に調製したＨＮＶ含有１０％糞便乳剤を分化培地で１０倍に希釈し、１ｍＬのシリンジとＭｉｌｌｅｘ ＨＶ Ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＳＬＨＶＲ０４ＮＬ）を用いて濾過した。ＰＡ微量遠心チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ，３５７４４８）中で濾過した糞便溶液５μＬと表２に示す薬剤溶液４５μＬとを混合し、室温で３０秒間反応させた。次いでこの薬剤処理された糞便溶液に、表２に示す所定濃度のＦＢＳを含有する基本培地溶液又はＦＢＳ原液１．４５ｍＬを添加した。遠心チューブを固定角ロータＴＬＡ−５５（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）にセットしＯｐｔｉｍａ ＭＡＸ−ＴＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてＲｍａｘにおいて１８６０４７×ｇの遠心力（５５０００ｒｐｍ相当）で１．５時間超遠心した後に上清を除去した。ペレットを１００μＬの分化培地で懸濁し、ｈＳＩＯへの感染溶液とした。上記試験例１と同様に、分化ｈＳＩＯへ感染させて、細胞傷害性を確認した（表２）。試験例２より披検薬剤の細胞傷害性を十分に中和するためには２５体積％以上のＦＢＳを含有する基本培地を用いたウイルスと薬剤の反応液の中和処理が必要であることが分かった。

【0033】

【表2】

【要約】

ｈＳＩＯを用いてＨＮＶ不活化剤を適正に評価する方法を提供する。
ｈＳＩＯを用いてＨＮＶ不活化剤を評価する方法であって、被検薬剤で処理したウイルス溶液に２５体積％濃度以上のＦＢＳを添加した後、超遠心分離し、得られた沈殿物をｈＳＩＯに感染させる工程を含む、方法。