特許 6779776 酸化ＨＤＬの測定方法、及び酸化ＨＤＬ測定用キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6779776

(24)【登録日】2020年10月16日

(45)【発行日】2020年11月4日

(54)【発明の名称】酸化ＨＤＬの測定方法、及び酸化ＨＤＬ測定用キット

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/92 20060101AFI20201026BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/92 Z

【請求項の数】5

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2016-252416(P2016-252416)

(22)【出願日】2016年12月27日

(65)【公開番号】特開2017-227618(P2017-227618A)

(43)【公開日】2017年12月28日

【審査請求日】2019年9月18日

(31)【優先権主張番号】特願2016-119118(P2016-119118)

(32)【優先日】2016年6月15日

(33)【優先権主張国】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 １．公開日 ２０１６年７月１日 刊行物等 第４８回日本動脈硬化学会総会・学術集会プログラム・抄録集（アプリ） ２．発行日 ２０１６年７月１４日 刊行物等 第４８回日本動脈硬化学会総会・学術集会プログラム・抄録集（ＣＤ−ＲＯＭ） ３．開催日 ２０１６年７月１４日から２０１６年７月１５日 集会名、開催場所 第４８回日本動脈硬化学会総会・学術集会 京王プラザホテル（東京都新宿区西新宿２−２−１）

(73)【特許権者】

【識別番号】000106324

【氏名又は名称】サンスター株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 文昭

【審査官】 三木 隆

(56)【参考文献】

【文献】 特開昭５７−１４２５６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−０８９８２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−１７９２１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−２０８１１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／００５５７９６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Shu-Ping Hui，Detection and characterization of cholesteryl ester hydroperoxides in oxidized LDL and oxidized HDL by use of an Orbitrap mass spectrometer，Anal Bioanal Chem，２０１２年，Vol.404，Page.101-112

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／９２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（１）被検体から採取した血液試料又はその分離物と、遷移金属化合物及び酸性緩衝液を含む溶液とを混合する工程、及び
（２）前記工程（１）により産生されたフリーラジカルを測定する工程
を含む、酸化ＨＤＬの測定方法であり、
前記酸性緩衝液のｐＨが４．５〜６である、方法。

【請求項2】

前記酸性緩衝液が酢酸緩衝液である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記遷移金属化合物が鉄化合物である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記鉄化合物が２価の鉄化合物である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

遷移金属化合物、及び酸性緩衝液を含む、酸化ＨＤＬ測定用キットであり、
前記酸性緩衝液のｐＨが４．５〜６である、酸化ＨＤＬ測定用キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、酸化ＨＤＬの測定方法、酸化ＨＤＬ測定用キットに関する。

【背景技術】

【0002】

高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、抗酸化能、コレステロール回収、酸化脂質の除去等の作用を有し、動脈硬化を抑制する働きを有することが知られており、善玉コレステロールとも呼ばれる。一方、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）は、増加すると血管にコレステロールが蓄積し、動脈硬化や心筋梗塞を引き起こすことから、悪玉コレステロールとも呼ばれる。従って、ＬＤＬを低下させＨＤＬを高めることが動脈硬化の防止につながると考えられている。しかしながら、酸化されたＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）ではコレステロール回収能などの機能の低下が起きていることから、ＨＤＬ量を高めるだけでなく、酸化ＨＤＬを減少させることが動脈硬化の予防に重要であると考えられている。

【0003】

以上のように、酸化ＨＤＬは動脈硬化・心筋梗塞のリスクの予測や、生活習慣の改善によるリスク低下の判定に有用であると考えられていることから、酸化ＨＤＬを測定する方法が研究されている。例えば、特許文献１では、酸化脂質に対する抗体とアポリポタンパク質に対する抗体とを用い、ＥＬＩＳＡ法により酸化ＨＤＬを測定する方法が提案されている。また、例えば、非特許文献１及び２では、血液試料から有機溶媒を用いて脂質を抽出した後、高速液体クロマトグラフィーでＨＤＬを分画し、紫外線吸収や化学発光により酸化ＨＤＬを定量する方法が提案されている。

【0004】

しかしながら、上記した方法では、ＥＬＩＳＡ法により酸化ＨＤＬを測定するため操作が煩雑であり、また、血漿成分を単離する場合、精製が必要になり、測定に時間を要するという欠点もある。そのため、簡便かつ低コストで、少量の血液試料を用いて酸化ＨＤＬを選択的に測定する方法が望まれているが、そのような技術は未だ報告されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開平９−３３５２５号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．，２００９，２９，２１６９−２１７５

【非特許文献2】日本農芸化学会誌，１９８８，６２，Ｎｏ．１０，１４９１−１４９４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、上記した従来技術の問題点に鑑みてなされたものであり、簡便な方法により、酸化ＨＤＬを選択的に測定する方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者は、上記した目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに、被検体から採取した血液試料と特定の溶液とを混合するという簡便な操作により、当該血液試料に含まれる酸化ＨＤＬを精度良く測定することができることを見出し、さらには酸化ＨＤＬのみを選択的に測定する方法も見出した。本発明者はかかる知見に基づき、さらなる研究を重ねることにより本発明を完成させるに至った。

【0009】

即ち、本発明は以下の項に記載の酸化ＨＤＬの測定方法及び酸化ＨＤＬ測定用キットを包含する。
項１．
（１）被検体から採取した血液試料又はその分離物と、遷移金属化合物及び酸性緩衝液を含む溶液とを混合する工程
を含む、酸化ＨＤＬの測定方法。
項２．
前記酸性緩衝液が酢酸緩衝液である、上記項１に記載の方法。
項３．
前記酸性緩衝液のｐＨが２〜６．９である、上記項１又は２に記載の方法。
項４．
前記遷移金属化合物が鉄化合物である、上記項１〜３のいずれかに記載の方法。
項５．
前記鉄化合物が２価の鉄化合物である、上記項４に記載の方法。
項６．
さらに、
（２）前記工程（１）により産生されたフリーラジカルを測定する工程
を含む、上記項１〜５のいずれかに記載の方法。
項７．
遷移金属化合物、及び酸性緩衝液を含む、酸化ＨＤＬ測定用キット。
項８．
前記酸性緩衝液が酢酸緩衝液である、上記項７に記載のキット。
項９．
前記酸性緩衝液のｐＨが２〜６．９である、上記項７又は８に記載のキット。
項１０．
前記遷移金属化合物が鉄化合物である、上記項７〜９のいずれかに記載のキット。
項１１．
前記鉄化合物が２価の鉄化合物である、上記項１０に記載のキット。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、簡便な操作により、血液試料に含まれる酸化ＨＤＬを精度良く測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】試験例１の結果を示す図である。

【図2】試験例２−３の結果を示す図である。

【図3】試験例４の結果を示す図である。

【図4】試験例５の結果を示す図である。

【図5】試験例６の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、本発明について詳細に説明する。

【0013】

１．酸化ＨＤＬの測定方法
本発明は、酸化ＨＤＬの測定方法を包含する。本明細書において、当該方法を「本発明の方法」と記載する場合がある。

【0014】

本発明の方法は、（１）被検体から採取した血液試料又はその分離物と、遷移金属化合物及び酸性緩衝液を含む溶液とを混合する工程を含む。本明細書において、当該工程を「工程（１）」と記載する場合がある。工程（１）では、血液試料又はその分離物中に含まれる酸化ＨＤＬにおけるヒドロペルオキシド（Ｒ−ＯＯＨ）と遷移金属イオンとが反応することによってペルオキシラジカル（Ｒ−ＯＯ^・）、アルコキシラジカル（Ｒ−Ｏ^・）等のフリーラジカルが産生される。

【0015】

工程（１）において用いる被検体から採取した血液試料としては、例えば、全血、血清、血漿等が挙げられる。また、血液試料として、血液試料からＨＤＬを分離したもの（本明細書において「血液試料の分離物」とも記載する。）を用いることもできる。血液試料からＨＤＬを分離する方法としては特に限定的ではなく、公知の方法を採用することができる。例えば、デキストラン硫酸とマグネシウムイオンを用いたデキストラン硫酸法などの方法を採用することができる。

【0016】

血液試料を採取する被検体としては、特に限定的ではなく、ヒトのみならず、非ヒト哺乳動物であってもよい。被検体となるヒトとしては特に制限されず、例えば、健常者、動脈硬化患者、糖尿病患者、心血管患者、酸化ＨＤＬ値や酸化ＬＤＬ値が高いと疑われるヒトなどが挙げられる。また、非ヒト哺乳動物としては特に限定的ではなく、ペット、家畜、実験動物等として飼育される哺乳動物が好ましい。このような非ヒト哺乳動物としては、例えば、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、ラクダ、リャマ等が挙げられる。

【0017】

被検体から血液試料を採取する方法としては特に限定的ではなく、公知の器具、機器などを用いて常法に従って行うことができる。なお、血液試料として血清又は血漿を用いる場合には、取り扱い易さ、感染防止等の観点から、血清又は血漿分離剤を含む真空採血管などを用いることが好ましい。また、被検体から採取した血液試料は、そのまま、工程（１）に供してもよいし、凍結乾燥等して保存した後、当該凍結乾燥物を後述する適当な溶媒に溶解して用いてもよい。さらに、被検体から採取した血液試料を、そのまま冷凍保存した後、あるいは適当な溶媒に溶解する等して冷凍保存した後、使用時に解凍して用いてもよい。なお、被検体から採取した血液試料を保存する方法、条件等については特に制限されず、常法に従って行うことができる。

【0018】

酸性緩衝液としては、ｐＨが酸性であり、かつ緩衝作用を有するものであれば特に制限されず、公知の緩衝液を用いることができる。例えば、酢酸緩衝液などが挙げられる。

【0019】

酸性緩衝液のｐＨは、酸性であれば特に限定的ではなく、２〜６．９程度であることが好ましく、３〜６．５程度であることがより好ましく、４．５〜６程度であることがさらに好ましい。なお、下述する工程（２）において、フリーラジカルを測定する方法として、発色法を採用する場合には、酸性緩衝液のｐＨは３〜６．９程度であることが特に好ましい。

【0020】

酸性緩衝液の濃度としては、特に限定的ではなく、例えば、０．００５〜０．５Ｍ、好ましくは、０．０１〜０．２Ｍである。

【0021】

遷移金属化合物は、混合液中で電離して金属イオンになり得るものであり、かつヒドロペルオキシド（Ｒ−ＯＯＨ）と反応してフリーラジカルを産生し得るものであれば特に限定的ではなく、例えば、銅（ＩＩ）化合物、鉄（ＩＩ）化合物（２価の鉄化合物）、鉄（ＩＩＩ）化合物（３価の鉄化合物）などが挙げられる。これらの中でも、鉄（ＩＩ）化合物、鉄（ＩＩＩ）化合物などの鉄化合物が好ましい。鉄化合物としては、例えば、硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物などが挙げられる。工程（１）において遷移金属化合物を用いることにより、１）ヒドロキシペルオキシドと反応する遷移金属イオンが十分量存在することにより少量の血液サンプルで酸化ＨＤＬの測定が可能となる、２）血液に含まれる鉄分の量に影響されることなく酸化ＨＤＬの測定が可能となる、などの有利な効果が奏される。

【0022】

なお、２価の鉄化合物は、３価の鉄化合物よりも少量で酸化ＨＤＬを測定することができる。換言すると、２価の鉄化合物は、３価の鉄化合物よりも酸化ＨＤＬの測定感度が高い。従って、上記した鉄化合物の中でも、２価の鉄化合物が特に好ましい。

【0023】

混合液中における遷移金属化合物の濃度としては、特に限定的ではなく、例えば、０．１〜１５０μＭ程度、好ましくは１〜１００μＭとすることができる。

【0024】

工程（１）における反応温度としては、特に限定的ではなく、例えば、２０〜４０℃程度とすることができる。

【0025】

上記の通り、工程（１）では、血液試料又はその分離物中に含まれる酸化ＨＤＬにおけるヒドロペルオキシド（Ｒ−ＯＯＨ）と遷移金属イオンとが反応することによってペルオキシラジカル（Ｒ−ＯＯ^・）やアルコキシラジカル（Ｒ−Ｏ^・）等のフリーラジカルが産生される。工程（１）において産生されたフリーラジカルを測定することにより、酸化ＨＤＬを測定することができる。

【0026】

従って、本発明の方法は、さらに、（２）上記工程（１）により産生されたフリーラジカルを測定する工程を含むことが好ましい。なお、本明細書において当該工程を「工程（２）」と記載する場合がある。

【0027】

フリーラジカルを測定する方法としては特に限定的ではなく、公知の方法を採用することができる。例えば、発色法、化学発光法、電子スピン共鳴法（ＥＳＲ法）などが挙げられる。

【0028】

発色法は、フリーラジカルと反応して発色する作用を有する物質（発色性物質）を用い、発色した物質の吸光度を分光吸光計などを用いて測定する方法である。

【0029】

発色性物質としては、フリーラジカルやアルコキシラジカルと反応して呈色する作用を有する化合物であれば特に制限されず、公知の化合物を用いることができる。例えば、下記一般式（１）で表される化合物又はその塩などが挙げられる。

【0030】

【化1】

【0031】

上記一般式（１）中、各Ｒは同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、メチル、又はエチルを示す。特に、各Ｒの少なくとも２つがメチル又はエチルであることが好ましく、同一の窒素原子に置換するＲが共にメチル又はエチルであることがより好ましい。

【0032】

一般式（１）で表される化合物としては、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＤＭＰＤ）、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＤＰＤ）が好ましい。

【0033】

一般式（１）で表される化合物の塩としては、例えば、硫酸塩、シュウ酸塩、二酢酸塩などが挙げられる。

【0034】

反応工程において用いる一般式（１）で表される化合物又はその塩は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0035】

また、一般式（１）で表される化合物は、必要に応じて、溶媒に溶解して使用することもできる。溶媒としては、特に限定的ではなく、例えば、純水、緩衝液、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられる。溶液とする場合の濃度としては特に限定的ではなく、例えば、０．１〜５０ｍＭ程度、好ましくは、１〜２０ｍＭ程度とすることができる。

【0036】

発色した物質の吸光度を測定する方法としては、特に限定的ではなく、常法により行うことができる。例えば、フリーラジカルと発色性物質とが反応することによって赤紫色を呈するラジカル陽イオンが生成されることから、公知の機器を用いて吸光度を測定することによってラジカル陽イオンを測定することができる。吸光度を測定する際の波長としては、例えば、４６０〜５７０ｎｍ、好ましくは、５００〜５６０ｎｍとすることができる。

【0037】

また、吸光度の測定を行う際、定量的に測定するために、測定開始時間と測定終了時間との間の吸光度の時間経過を測定することが好ましい。例えば、フリーラジカルと発色性物質との反応開始時点から２分経過時点を始点とし、反応開始時点から５分経過時点を終点として、吸光度の上昇速度を測定することが好ましい。

【0038】

化学発光法は、フリーラジカルと反応して発光する作用を有する物質（発光性物質）を用い、励起した物質が基底状態に戻る際に放出する光を発光光度計などを用いて測定する方法である。

【0039】

発光性物質としては、フリーラジカルと反応して発光する作用を有する化合物であれば特に制限されず、公知の化合物を用いることができる。例えば、ルミノール、Ｄａｎｓｙｌ−ＴＥＭＰＯ、ルシゲニンル、２−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｐ‐ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｐｙｒａｚｉｎｏｎｅ（ＭＰＥＣ）、Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＨＰＦ）、Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＡＰＦ）、ウミホタル・ルシフェリン誘導体（ＭＣＬＡ）などが挙げられる。

【0040】

発光した物質の光を測定する方法としては特に限定的ではなく、用いる発光性物質の種類等に応じて適宜決定することができる。

【0041】

電子スピン共鳴法（ＥＳＲ法）は、不対電子が磁場中に置かれた際に生じる準位間の遷移を観測する分光分析である。電子スピン共鳴法としては特に限定的ではなく、公知の方法及び機器を用いて行うことができ、フリーラジカルを直接測定する直接法、スピントラップ剤とフリーラジカルとを反応させて行う間接法のいずれであってもよい。間接法を採用する場合、スピントラッピング剤としては特に制限されず、公知のスピントラップ剤を用いることができる。スピントラップ剤としては、例えば、５，５−ジメチルー１−ピロリンーＮ―オキシド（ＤＭＰＯ）、２，５，５−トリエチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド（Ｍ_３ＰＯ）、３，３，５，５−テトラメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド（ＴＭＰＯ）、Ｎ−ｔｅｒｔ−α−フェニルニトロン（ＰＢＮ）などのニトロン系スピントラップ剤；２−メチル−２−ニトロソプロパン（ＭＮＰ）、ニトロソベンゼン（ＮＤ）などのニトロソ系スピントラップ剤などが挙げられる。

【0042】

２．酸化ＨＤＬ測定用キット
本発明は、さらに、酸化ＨＤＬの測定用キットをも包含する。本明細書において、当該キットを「本発明のキット」と記載する場合がある。

【0043】

本発明のキットは、上記した遷移金属化合物及び酸性緩衝液を含む。なお、本発明のキットに含まれる遷移金属化合物、及び酸性緩衝液は、上記した本発明の方法におけるものと同一である。

【0044】

さらに、本発明のキットは、フリーラジカルを測定するための試薬を含むことができる。例えば、フリーラジカルを測定するために上記した発色法を採用する場合には、上記した発色性物質を含むことができる。

【0045】

また、本発明のキットは、上記したものの他、必要に応じて、その他の試薬、器具等が含まれていてもよい。例えば、血清又は血漿分離剤、採血用器具などが挙げられる。

【0046】

さらに、本発明のキットは、上記したものの他、必要に応じて、フリーラジカルを測定するための機器を備えていてもよい。例えば、フリーラジカルを測定するために上記した発色法を採用する場合には、分光吸光計などを備えていてもよい。

【実施例】

【0047】

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。

【0048】

試験例１
本試験例１では、以下の手順に従って、酸化ＨＤＬの測定を行った。
（１）血液試料の調製
真空採血管を用いて被検体の静脈から血液を採取し、４℃、３５００ｒｐｍ（１１００ｇ）の条件で１５分間遠心分離を行い、上清（血漿）を血液試料として得た後、−８０℃で保存した。

【0049】

（２）酸化ＨＤＬの測定
０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）と１００μＭ硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物との混合液（Ｆｅ^２＋添加群）、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）と１００μＭ塩化鉄（ＩＩＩ）との混合液（Ｆｅ^３＋添加群）、及び０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）（Ｆｅ未添加群）の３群に分け、各群の混合液をマイクロプレートの各ｗｅｌｌにそれぞれ加え、３７℃に保温した。次いで、各群の混合液を添加した各ｗｅｌｌにＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン硫酸塩溶液（溶媒：ＤＭＳＯ）を加えた後、上記（１）で得られた血漿を加えた（血漿添加群）。また、対照として、Ｆｅ^２＋添加群及びＦｅ^３＋添加群の混合液を添加した各ｗｅｌｌにＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン硫酸塩溶液（ＤＭＳＯ）のみを加えた（血漿未添加群）。３７℃に設定したマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）を用い、波長５０５ｎｍの吸光度を測定した。なお、吸光度の測定は、Ｋｉｎｅｔｉｃｓに設定し、１０秒毎に計３０回（合計５分間）測定し、測定開始２分後から５分後の各値から吸光度（単位：ｍＯＤ／ｍｉｎ）を算出することにより行った。結果を図１に示す。

【0050】

Ｆｅ^２＋添加群、Ｆｅ^３＋添加群、及びＦｅ未添加群の各群の比較から、鉄化合物を添加した場合の方が吸光度の値が大きいことが確認された。さらに、Ｆｅ^２＋添加群は、Ｆｅ^３＋添加群よりも吸光度の値が大きいことが確認されたことから、２価の鉄化合物は、３価の鉄化合物よりも高感度で酸化ＨＤＬを測定できることが分かった。

【0051】

試験例２
本試験例２では、試験例１の試験結果が酸化ＨＤＬを測定していることを実証するために各種試験を行った。

【0052】

＜試験例２−１＞
血漿０．３ｍｌを限外濾過膜付き遠心カラム（ミリポア社製、商品名：アミコンウルトラ−０．５ １００ｋＤａ）に入れ、２０℃、１４０００ｇの条件で１０分間遠心し、濾液及び膜上に残った液（濃縮液）をそれぞれ回収した。その後、血液試料を濾液及び濃縮液に代えた以外は試験例１のＦｅ^２＋添加群と同様にして吸光度の測定を行った。なお、当該試験は３回行った。結果は、遠心を行わなかった試料（血漿）の吸光度の測定結果を１００％とした場合、濾液は０．４％、濃縮液は９９．３％であった（いずれも３回の平均値を示す。）。

【0053】

当該結果から、試験例１において測定された吸光度の値は血漿に含まれるリポタンパク質等の高分子に由来するものであることが強く示唆された。

【0054】

＜試験例２−２＞
試験例２−１において、血漿に含まれるリポタンパク質等の高分子が関与していることが分かったことから、本試験例２−２では、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）及び超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）に着眼して試験を行った。

【0055】

実験には、ＬＤＬ／ＶＬＤＬ精製キット（セルバイオラボ社製、商品名：ＳＴＡ−６０６）を用い、当該キットに添付のマニュアルに従ってＬＤＬ／ＶＬＤＬの精製を行った。具体的には、血漿にキットに付属のデキストラン溶液及び沈殿溶液Ａを加え、氷上で５分間反応させた後、６０００ｇの条件で１０分間遠心分離を行った。遠心分離後、上清を回収し、−８０℃で保存し、ペレットについては、マニュアルに従ってＬＤＬ／ＶＬＤＬの精製を行った。その後、血液試料を上清及び精製したＬＤＬ／ＶＬＤＬに代えた以外は試験例１のＦｅ^２＋添加群と同様にして吸光度の測定を行った。結果は、精製を行わなかった試料（血漿）の吸光度の測定結果を１００％とした場合、上清は１０５％、精製したＬＤＬ／ＶＬＤＬは３％未満であった。

【0056】

当該結果から、試験例１において測定された吸光度の値は血漿に含まれるリポタンパク質のうち、ＬＤＬ及びＶＬＤＬに由来するものではないことが示唆された。

【0057】

＜試験例２−３＞
試験例２−２において、血漿に含まれるＬＤＬ及びＶＬＤＬが関与していないことが分かったことから、本試験例２−３では、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に着眼して試験を行った。

【0058】

血漿をポアサイズ０．４５μｍの濾過膜（ミリポア社製、商品名：マイレクス−ＨＶ）で濾過し、得られた濾液（濾液Ａ）にデキストラン硫酸ナトリウム（分子量：３６０００〜５００００）溶液（ｐＨ７．３）（０．５Ｍ 塩化マグネシウムを含む）を加え、撹拌し室温で静置した。次いで、１５００ｇの条件で３０分間遠心分離を行い、上清を回収し、上記と同様の濾過膜を用いて濾過し、濾液（濾液Ｂ）を回収した。その後、血液試料を濾液Ａ、上清及び濾液Ｂに代えた以外は試験例１のＦｅ^２＋添加群と同様にして吸光度の測定を行った。結果は、濾過を行わなかった試料（血漿）の吸光度の測定結果を１００％とした場合、濾液Ａは９９％、上清は１０４％、濾液Ｂは１１５％であった。

【0059】

さらに、ゲル濾過ＨＰＬＣにより、濾液Ａ及び濾液Ｂに含まれるリポタンパク質を分析した。ゲル濾過ＨＰＬＣによるクロマトグラムを図２に、各リポタンパク質の定量結果を下記表１に示す。なお、下記表１中、「ＣＭ」はカイロミクロン、「ＶＬＤＬ」は超低密度リポタンパク質、「ＬＤＬ」は低密度リポタンパク質、「ＨＤＬ」は高密度リポタンパク質をそれぞれ示し、各用語に付した括弧内の数値は、各リポタンパク質の粒子径を示す。

【0060】

【表1】

【0061】

図２の結果から、濾液Ａ及び濾液Ｂでは共に、２６．０ｍｉｎ付近にＨＤＬ−Ｃに由来するピークが観察された。また、濾液Ａでは、２３．２ｍｉｎ付近にＬＤＬ−Ｃに由来するピークが観察されたのに対して、濾液Ｂでは、ＬＤＬ−Ｃに由来するピークは観察されなかった。図２、表１及び吸光度測定試験の結果から、試験例１において測定された吸光度の値は血漿に含まれるリポタンパク質のうち、ＨＤＬに由来するものであることが強く示唆された。

【0062】

試験例３
本試験例３では、血漿と血漿から分離したＨＤＬとを試料として用い、両者の測定値が相関しているか否かを検討した。具体的には、３名の健常人の血漿（血漿群）、及び試験例２−３の濾液Ｂ（ＨＤＬ分離群）を試料とした以外は試験例１のＦｅ^２＋添加群と同様にして吸光度の測定を行った。その後、３名の各群による結果の相関関係を解析した。

【0063】

解析結果から、ＨＤＬ分離群と血漿群とは、高い正の相関関係（Ｒ＝０．９６６）があることが分かった。従って、血漿などの血液試料だけでなく、血液試料から分離したＨＤＬを試料として使用できることが分かった。

【0064】

試験例４
本試験例４では、従来のＥＬＩＳＡ法を利用した酸化ＨＤＬの測定方法と本発明の方法とで得られる測定値が相関しているか否かを検討した。具体的には、３名の健常人の血漿を用い、試験例２−３と同様にして吸光度の測定を行った（本発明の方法群）。また、ＥＬＩＳＡ法として、酸化ＨＤＬ測定キット（セルバイオラボ社製、商品名：ＳＴＡ−８６９）を用い、当該キットに添付のマニュアルに従って酸化ＨＤＬの測定を行った（ＥＬＩＳＡ法群）。その後、３名の本発明の方法群及びＥＬＩＳＡ法群による結果の相関関係を解析した。結果を図４に示す。

【0065】

当該結果から、本発明の方法群における試験結果と、ＥＬＩＳＡ法群における試験結果とは、高い正の相関関係（Ｒ＝０．９８７）があることが分かった。

【0066】

試験例５
本試験例５では、血液試料として、全血及び血漿を用いて酸化ＨＤＬの測定を行った。ヘパリン管に採血し、そのうち一部を全血測定用として４℃で保存した。残りを４℃、１０００ｇの条件で１０分間遠心分離をし、血漿を得た。その後、血液試料を全血（１０μｌ及び２０μｌ）及び血漿（１０μｌ）に代え、さらに、全血を用いた試料については溶血を防止するためグルコースを加えたこと以外は試験例１のＦｅ^２＋添加群と同様にして吸光度の測定を行った。結果を図５示す。

【0067】

当該結果から、血液試料として、血漿だけでなく、全血も使用できることが分かった。

【0068】

試験例６
本試験例６では、試験例１の結果（図１）において、Ｆｅ^２＋添加群とＦｅ^３＋添加群とを比較した場合にＦｅ^２＋添加群の方が吸光度の値が大きいことが確認されたことから、２価の鉄化合物の濃度による測定結果への影響を検討した。

【0069】

（１）血液試料の調製
試験例１と同様にして、真空採血管を用いて被検体の静脈から血液を採取し、４℃、３５００ｒｐｍ（１１００ｇ）の条件で１５分間遠心分離を行い、上清（血漿）を血液試料として得た後、−８０℃で保存した。なお、Ｎｉｔｒｏｓｏ−ＰＡＳＰ法により、被検体１及び被検体２から得られた血液試料中に含まれる血清鉄（トランスフェリンと３価の鉄との複合体）を測定したところ、７６．８μｇ／ｄＬであった。

【0070】

（２）酸化ＨＤＬの測定
０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）と、１μＭ、１０μＭ、又は１００μＭの硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物との混合液を調製した。

【0071】

上記で調製した各混合液をマイクロプレートの各ｗｅｌｌにそれぞれ加え、３７℃に保温した。次いで、各群の混合液を添加した各ｗｅｌｌにＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン硫酸塩溶液（溶媒：ＤＭＳＯ）を加えた後、上記（１）で得られた血液試料を加えた。また、対照として、各群の混合液を各ｗｅｌｌに添加せず、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン硫酸塩溶液（溶媒：ＤＭＳＯ）及び血液試料を加えた。そして、３７℃に設定したマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）を用い、波長５０５ｎｍの吸光度を測定した。なお、吸光度の測定は、Ｋｉｎｅｔｉｃｓに設定し、１０秒毎に計３０回（合計５分間）測定し、測定開始２分後から５分後の各値から吸光度（単位：ｍＯＤ／ｍｉｎ）を算出することにより行った。測定結果を図５に示す。

【0072】

図５の結果から、２価の鉄化合物の濃度が上昇するに従って、吸光度の値が大きくなることが確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】