特許 6779920 システムおよび方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6779920

(24)【登録日】2020年10月16日

(45)【発行日】2020年11月4日

(54)【発明の名称】システムおよび方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 35/08 20060101AFI20201026BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20201026BHJP

   G01N 35/10 20060101ALI20201026BHJP

   B01J 4/02 20060101ALI20201026BHJP

   C12M 1/00 20060101ALN20201026BHJP

【ＦＩ】

   G01N35/08 B

   G01N37/00 101

   G01N35/10 B

   B01J4/02 B

   !C12M1/00 A

【請求項の数】34

【全頁数】57

(21)【出願番号】特願2017-563104(P2017-563104)

(86)(22)【出願日】2016年6月3日

(65)【公表番号】特表2018-524568(P2018-524568A)

(43)【公表日】2018年8月30日

(86)【国際出願番号】GB2016051654

(87)【国際公開番号】WO2016193758

(87)【国際公開日】20161208

【審査請求日】2019年5月22日

(31)【優先権主張番号】1509640.7

(32)【優先日】2015年6月3日

(33)【優先権主張国】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】517131204

【氏名又は名称】スフィア フルイディクス リミテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｓｐｈｅｒｅ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】フランク・エフ・クレイグ

(72)【発明者】

【氏名】マリアン・リハク

(72)【発明者】

【氏名】ディヴィッド・ホームズ

(72)【発明者】

【氏名】クライヴ・エー・スミス

(72)【発明者】

【氏名】シン・リウ

(72)【発明者】

【氏名】ジュゼッペ・ベナッツィ

(72)【発明者】

【氏名】シン・リ

(72)【発明者】

【氏名】ヴィナヤカ・シー・パワテ

(72)【発明者】

【氏名】ロバート・フランク・マーチントン

(72)【発明者】

【氏名】リチャード・フランシス・デイ

(72)【発明者】

【氏名】マイケル・スチュアート・ヘイゼル

【審査官】 三木 隆

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００４−０００１４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−０１５５３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５２２３２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／１３３７１０（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 米国特許出願公開第２００３／００１５４２５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００５／０２２１３３９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 英国特許出願公開第０２５１６６８４（ＧＢ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／１１１２３１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１２／００９１０５９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００８／００５３２０５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００４／００９１３９８（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３５／０８

Ｂ０１Ｊ ４／０２

Ｇ０１Ｎ ３５／１０

Ｇ０１Ｎ ３７／００

Ｃ１２Ｍ １／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１つまたは複数の実体を含有する液滴を供給する方法であって、
流体中に複数の実体を供給するステップと、
前記流体から液滴を調製するステップと、
前記液滴が前記複数の実体のうちの１つまたは複数の実体を含有しているかどうか、または前記液滴が前記実体を含有していないかどうかを決定するステップと、
前記決定の結果に応じて前記液滴を選別するステップであって、異なる時点において流体流路の複数の所定のセンサ場所で前記液滴を検出し、前記流体流路内の前記液滴の速度を決定して前記選別を計時するステップを含む、前記液滴を選別するステップと、
前記選別された液滴を貯留容器内に分注するステップと、
を含み、分注する前記ステップは、選別する前記ステップの後に、
前記選別された液滴を含有する流体のための流体流路を選択するステップと、
前記選択された経路から前記選別された液滴を排出するステップと、
を含む、方法。

【請求項2】

分注する前記ステップは、
分注する前記選別された液滴を識別するステップと、
前記選別された液滴を前記流体の第１の流体流路から、前記選別された液滴を前記第１の流体流路から第２の流体流路内に移送することによって抽出するステップと、
前記選別された液滴を前記第２の流体流路から前記貯留容器内に、圧力を前記第２の流体流路に印加することによって排出するステップと、
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

移送する前記ステップは、前記選別された液滴に圧力を印加して、前記第１の流体流路の一部にある間に分注し、その後、前記選別された液滴を前記第１の流体流路から第２の流体流路内に移送し、前記選別された液滴を排出するステップを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

分注する前記ステップは、前記選別された液滴を前記第１の流体流路から前記第２の流体流路に移送し、次いで、圧力を前記第２の流体流路に印加して前記液滴を排出させるステップを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

抽出する前記ステップは、前記選別された液滴が定められた数の前記実体を含むとき、および／または前記選別された液滴が定められた特性を持つ前記実体を含むときにのみ前記選別された液滴を抽出するステップを含む、請求項１、２、３、または４に記載の方法。

【請求項6】

抽出する前記ステップは、前記排出された液滴が単一のターゲット実体または前記実体の単一のターゲット組合せを含有する確率が、前記調製、決定、選別、および分注に基づき、９９．９％を超えるときにのみ前記選別された液滴を抽出するステップを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

抽出する前記ステップは、前記排出された液滴が前記単一のターゲット実体または前記実体の単一のターゲット組合せを含有する確率が、前記調製、決定、選別、および分注に基づき、９９．９９％を超えるときにのみ前記選別された液滴を抽出するステップを含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

抽出する前記ステップは、前記排出された液滴が前記単一のターゲット実体または前記実体の単一のターゲット組合せを含有する確率が、前記調製、決定、選別、および分注に基づき、９９．９９７％を超えるときにのみ前記選別された液滴を抽出するステップを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

排出する前記ステップは、前記決定および／または前記実体の特性に応じて定められた位置で前記選別された液滴を排出するステップを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記１つまたは複数の実体を培養し、および／または維持するために前記液滴をインキュベートするステップをさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記インキュベーション時に前記１つまたは複数の実体に対して安定性試験を実施するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記選別された液滴を前記第１の流体流路から前記第２の流体流路に移送する前記ステップは、前記選別された液滴をデカップラ内の前記第１の流体流路からデカップルするステップを含み、前記デカップラは、前記選別された液滴を前記第１の流体流路から分離し、前記分離された液滴を前記第２の流体流路に誘導するように構成される、請求項２に記載の方法。

【請求項13】

排出する前記ステップは、前記選別された液滴が輸送される流体を加熱するステップを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

培養培地流体を前記第２の流体流路内に注入して前記選別された液滴を前記培養培地流体内で排出するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。

【請求項15】

第２の複数の実体を第２の流体に入れるステップと、
第２の流体から第２の液滴を調製するステップと、
第１の流体から調製された第１の液滴と前記第２の流体から調製された第２の液滴とを融合させて融合液滴を取得するステップとをさらに含み、
抽出する前記ステップは、前記第１の流体流路から前記第２の流体流路内に前記融合液滴を移送することによって前記融合液滴を抽出するステップを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項16】

前記決定および／または選別は、前記融合の前に実行される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記第２の液滴が前記第２の複数の実体のうちの１つまたは複数の実体を含有しているかどうか、または前記第２の液滴が前記第２の複数の実体のうちの前記実体を含有していないかどうかを決定するステップと、
前記決定の結果に応じて前記第２の液滴を選別するステップと、
をさらに含む、請求項１５または１６に記載の方法。

【請求項18】

融合する前記ステップは、それぞれ、第１および第２の複数の実体のうちの単一のターゲット実体を含有すると決定されている前記第１の液滴および前記第２の液滴、および／またはそれぞれ、前記第１および第２の複数の実体の単一のターゲット組合せを含有すると決定されている前記第１の液滴および前記第２の液滴についてのみ実行される、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記融合液滴は、２つの細胞の単一の対、または１つもしくは複数の細胞の単一の組合せを含有する、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記融合液滴は、細胞と試薬との単一の対、または、１つもしくは複数の細胞と１つもしくは複数の試薬との単一の組合せを含有する、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

試薬は、生体分子である、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

１つまたは複数の実体を含有する液滴を供給するための微小流体システムであって、
複数の実体を含有する流体から液滴を調製するための液滴形成デバイスと、
前記液滴が前記複数の実体のうちの１つまたは複数の実体を含有するかどうかを決定するための分析器と、
前記決定の結果に応じて前記液滴を選別するための液滴選別デバイスと、
前記選別された液滴を前記微小流体システム内の前記流体の流体流路からデカップルするためのデカップラと、
を備え、
前記分析器および／または液滴選別デバイスは、前記微小流体システムの複数の所定の異なる場所で異なる時点に前記液滴を検出して前記微小流体システム内の前記液滴の速度を決定するための複数のセンサを備え、前記液滴選別デバイスは、速度決定の結果に応じて前記液滴を選別するように構成される、微小流体システム。

【請求項23】

前記デカップラは、前記流体流路から前記選別された液滴を分離するための分離ユニットと、前記分離された液滴を前記微小流体システムの第２の流体流路内に誘導するためのガイドとを備える、請求項２２に記載の微小流体システム。

【請求項24】

前記ガイドは、回転ユニットを備え、前記回転ユニットは、前記分離された液滴を貯蔵するための液滴貯蔵ユニットを備え、前記回転ユニットは、前記液滴貯蔵ユニット内に貯蔵されている前記分離された液滴を前記第２の流体流路内に輸送するために回転されるように構成される、請求項２３に記載の微小流体システム。

【請求項25】

前記ガイドは、並進ユニットを備え、前記並進ユニットは、前記分離された液滴を貯蔵するための液滴貯蔵ユニットを備え、前記並進ユニットは、前記液滴貯蔵ユニット内に貯蔵されている前記分離された液滴を前記第２の流体流路内に輸送するために並進方向に移動されるように構成される、請求項２３に記載の微小流体システム。

【請求項26】

前記１つまたは複数の実体を培養し、および／または維持するために前記液滴をインキュベートするためのインキュベータをさらに備える、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の微小流体システム。

【請求項27】

前記インキュベータは、前記インキュベーション時に前記１つまたは複数の実体に対して安定性試験を実行するための安定性試験ユニットを備える、請求項２６に記載の微小流体システム。

【請求項28】

前記デカップルされた液滴を分注するための分注ユニットをさらに備える、請求項２２から２７のいずれか一項に記載の微小流体システム。

【請求項29】

前記分注ユニットは、培養培地流体を貯蔵するための貯留容器を備え、前記分注ユニットは、前記デカップルされた液滴を前記培養培地流体内に分注するように構成される、請求項２８に記載の微小流体システム。

【請求項30】

前記分注ユニットは、加圧流体排出を介して前記液滴を分注するための高圧ユニットを備える、請求項２８または２９に記載の微小流体システム。

【請求項31】

前記液滴形成デバイスは、複数の液滴形成デバイスを含み、前記微小流体システムは、前記複数の液滴形成デバイスを使用して調製された複数の液滴を融合させるための液滴融合デバイスをさらに備える、請求項２２から３０のいずれか一項に記載の微小流体システム。

【請求項32】

前記液滴融合デバイスは、電界を発生させて電気合体によって前記液滴を融合させるための電界発生器を備える、請求項３１に記載の微小流体システム。

【請求項33】

前記液滴融合デバイスは、液滴を帯電させて静電気引力により前記液滴を融合させるための１つまたは複数の帯電デバイスを含む、請求項３１に記載の微小流体システム。

【請求項34】

前記分析器は、蛍光検出器、散乱光検出器、撮像検出器、音波発生および検出ユニット、ならびに磁気活性化細胞選別デバイスのうちの１つまたは複数を備える、請求項２２から３３のいずれか一項に記載の微小流体システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一般的に、１つまたは複数の実体、特に生物学的実体を含有する液滴を供給するためのシステムおよび方法に関する。

【背景技術】

【0002】

本明細書において、本発明者らは、エマルジョン、典型的には、一般的に界面活性剤安定化された、油中水のマイクロドロップレットを含むエマルジョンに関心がある。１つまたは複数の生体細胞などの１つまたは複数の生物学的実体が各液滴中に組み込まれ、次いで、たとえば、生物学的検定法を実施するために液滴内で実験が実施され得る。マイクロドロップレットは、潜在的に毎秒数千個を超える速度で生成され、処理され得る。

【0003】

典型的には、油組成物は、フッ素および／または鉱物油、および好ましくは界面活性剤を、たとえば、約０．５〜５％の体積比で含む。フルオラス油（fluorous oil）はマイクロドロップレットに酸素を輸送する能力に長けているので、フルオラス油の使用はマイクロドロップレットが生命体（living entity）を含有するときに特に有利である。界面活性剤は、重合体であるか、または小分子のいずれかであり得、たとえば、Ｋｒｙｔｏｘ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのペルフルオロエーテルのブロック共重合体から誘導された界面活性剤が使用され得る。マイクロドロップレット内の物質または検体は、たとえば、細胞、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド、ビード、粒子、結晶、ミセル、巨大分子、酵素アッセイ用の物質、細胞小器官、細胞、たとえば、哺乳類細胞、酵母細胞、藻細胞もしくは細菌、ウイルス、プリオンなどの有機体を含み得る。典型的には、液滴は、大きい（または小さい）場合もあり得るが１〜１２０μｍの範囲内の直径を有し、ナノリットルからフェムトリットルの範囲内にあり得る体積を構成する。

【0004】

微小流体デバイス上に集積化された能動素子は、個別の液滴を制御するために使用することができ、たとえば、本発明者らは、特許文献１においてすでに説明しており、この技術は、連続流内に組み込むことによってマイクロドロップレットの含有物のオンチップで抽出を可能にする。マイクロドロップレットに関する他の一般的な背景先行技術は、ＲａｉｎＤａｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．の名前による特許／出願、たとえば、特許文献２に見ることができる。単細胞または粒子選別は、従来技術、たとえば、特許文献３、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３から知られている。

【0005】

これらの技術は有用であるが、これらは拡張できる。たとえば、薬物耐性に関連するものなどの、非常に希な生物学的実体または事象における生物学的挙動を診断することを伴うあるクラスの厄介な問題がある。別の難題は、単一クローン性を保証することである、すなわち、薬物規制機関は、生物医薬品および他の化学的または生化学的実体が単一の生存可能な実体、または実体の特定の組合せから培養されることを要求することが多い。これは、たとえば、単細胞から、または複数の実質的に同一の生存可能な細胞から生じる細胞集団の培養は、細胞集団にまたがって単一クローン性が高い確率で生じることを保証するからである。なおも別の難題は、高い生産収率を有する発酵のために細胞のグループを選択するステップを伴う。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】ＷＯ国際公開第２００９／０５０５１２号

【特許文献2】国際公開第２００８／０６３２２７号

【特許文献3】米国特許出願公開第２００８／００５３２０５号

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】「Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ａ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｄｒｏｐｌｅｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｄｒｏｐｌｅｔ ｓｏｒｔｉｎｇ」、Ｂｉｏｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ ２０１３年、１５（３）：５５３−６０

【非特許文献2】「Ａｎａｌｙｚｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ａｔ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、ＲａｉｎＤａｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ

【非特許文献3】ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｒａｉｎｄａｎｃｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｒｄｔ／ｗｐ−ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１２／０５／ ｐｏｓｔｅｒ＿ａｎａｌｙｚｉｎｇ＿ｃａｎｃｅｒ＿ｗｉｔｈ＿ｄｒｏｐｌｅｔ＿ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｐｄｆ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

これらの問題に対処するために使用できる技術が必要である。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の第１の態様によれば、１つまたは複数の実体を含有する液滴を供給する方法が提供され、この方法は、流体中に複数の実体を供給するステップと、前記流体から液滴を調製するステップと、前記液滴が前記複数の実体のうちの１つまたは複数の実体を含有しているかどうか、または前記液滴が前記実体を含有していないかどうかを決定するステップと、前記決定の結果に応じて前記液滴を選別するステップと、前記選別された液滴を貯留容器内に分注するステップとを含み、分注する前記ステップは、選別する前記ステップの後に、選別された液滴を含有する流体のための流体流路を選択するステップと、選択された経路から選別された液滴を排出するステップとを含む。

【0010】

発明者らは、単一の実体、または単一の液滴、たとえば、ピコドロップレット（その体積は約１０００または数千ピコリットル未満である）中の実体の画成された単一の組合せを取得する確率は、この方法の実施形態を使用して高くすることができることを理解している。方法の調製ステップ、決定／選別ステップ、および分注ステップの各々は、単一の液滴中の１つまたは複数のターゲット実体を取得することに対する特定の確率を有している。この方法において、これらのステップを組み合わせることによって、９９．９％を超える、特に９９．９９％を超える高い確率で単一の液滴中の単一のターゲット実体または前記実体の単一のターゲット組合せを取得することができる。たとえば、これは、選択の３つの段階、すなわち、ポアソン統計（後述）によるカプセル化、接合部での選別、および分注時点における選別／選択で達成されるものとしてよく、各々、たとえば、９０％を超える選択による。類似の仕方で、この方法の実施形態は、大きな集団から非常に希なターゲット液滴を抽出することを円滑にする。

【0011】

本発明者らは、本明細書全体を通して実体の単一の（ターゲット）組合せへの参照がなされれば、これは、定められた数の実質的に同一の実体（たとえば、定められた数の細胞種類）、または定められた範囲内の数の実質的に同一の実体、または（特定のもしくはある範囲内の）定められた数の第１の実体（たとえば、定められた数の第１の細胞種類）と（特定のもしくはある範囲内の）定められた数の第２のもしくはさらなる実体（たとえば、定められた数の第２のもしくはさらなる細胞腫類）の組合せを含み得ることを述べておく。したがって、液滴中の１つまたは複数のターゲット実体は、たとえば、種類Ａの定められた数（１以上）の実体、種類Ａの定められた数（１以上）の実体および種類Ｂの定められた数（１以上）の実体、３つまたそれ以上の異なる種類の定められた数（１以上）の実体の各々であってよい。

【0012】

好ましい一実施形態において、方法は、分注するため選別された液滴を識別するステップと、選別された液滴を前記流体の第１の流体流路から、前記選別された液滴を第１の流体流路から第２の流体流路内に移送することによって抽出するステップと、選別された液滴を第２の流体流路から貯留容器内に、圧力を第２の流体流路に印加することによって排出するステップとをさらに含む。

【0013】

方法の好ましい一実施形態において、移送するステップは、選別された液滴に圧力を印加して、第１の流体流路の一部にある間に分注し、その後、選別された液滴を第１の流体流路から第２の流体流路内に移送し、選別された液滴を排出するステップを含む。実施形態では、（油中水）エマルジョンは、第１の流体流路に沿って流れ、流路の共有された領域を通り、次いで、第１の流体に沿って続くか、または流路もしくは共有されている流路のいずれかに印加される陽圧および／または陰圧（吸引）によって第２の流路内に迂回され得る。したがって、実施形態では、分注するステップは、適宜に、ただし好ましくは、経路を選択するために液滴選択／選別機構と連動して、流れの共有領域のある分岐もしくはＴ字型接合チャネル配置構成を採用し得る。

【0014】

このアプローチは、いくつかの実施形態において、すでに以前に選別された液滴のさらなる選別ステップを実行できる。それによって、液滴は、第２の選別ステップの前に検出され、適宜その構成物質が分析され得る。それによって、選別された液滴の検出および／または分析は、第１の流体流路および圧力が印加され得る経路の共有流路で実行されてよい。代替的に、またはそれに加えて、液滴は、共有流路の前に検出され、および／または分析され得る。好ましい一実施形態において、液体の排出元となり得る第２の流体流路は、第１および第２の（またはさらなる）放出チャネルを備え得る。第２の放出チャネル内の圧力は、減少させられ得る（たとえば、第２の放出チャネルに接続されているポンプを使用することによって）。次いで、液滴は、選別された液滴の検出および／または分析に応答して第１の流体流路内にある間に、上で概要が述べられているように、圧力を選別された液滴に印加することによって第１の放出チャネルを介して分注されるものとしてよい。これは、選別された液滴が、ポンプを使用して第２の放出チャネル内に抽出されないことを確実にし得る。液滴が、第２の放出チャネルから分注されるべきである場合、たとえば、液滴に注目していない場合、圧力は印加され得ず、それにより、ポンプは液滴を第２の放出チャネル内に吸引する。それが注目するものかどうかを決定する液滴の分析は、定められた数の液滴中のターゲット実体、および／または液滴中の１つまたは複数の実体の特性（たとえば、蛍光レベル、伝導率、および他の物理的もしくは化学的特性）に関する分析を含み得る。そのようなチャネル網の一実施形態について、以下でさらに説明する。

【0015】

方法の別の好ましい実施形態において、分注するステップは、選別された液滴を第１の流体流路から第２の流体流路に移送し、次いで、圧力を第２の流体流路に印加して液滴を排出させるステップを含む。これは、圧力が第２の流体流路のみに印加されるため第１の流体流路内の他の液滴の流れが中断され得ないので好ましいものと言える。しかし、代替的に、この種類の分注では、液滴が望ましくないときに、後で説明するような「デカップルユニット」を使用して望ましくない液滴を第１の流体流路から第２の廃棄経路に移送移動することができ、液滴は第１の流路から、たとえば、第１の流路内の弁を閉じて圧力をエマルジョンに印加して液滴をノズルまたは同様のものから第１の流路の末端で排出することによって分注される。

【0016】

液滴を第１の流体流路から第２の流体流路に移送するために使用されるデバイスの実施形態については、以下でさらに説明され、たとえば、後で説明されるような回転ユニット、並進ユニット、またはデカップルユニットが採用され得る。液滴が第１の流体流路から第２の流体流路に移送されるべきかどうかは、液滴が移送ユニット内に入る前に、および／または液滴が移送ユニット内にある間に決定され得る。液滴が第１の流体流路から第２の流体流路に移送されるべきかどうかに関する決定は、定められた数のターゲット実体、および／または液滴中の１つまたは複数の実体の特性（たとえば、蛍光レベル、伝導率、および他の物理的もしくは化学的特性）にさらに依存し得る。

【0017】

方法の好ましい一実施形態において、抽出するステップは、選別された液滴が定められた数の前記実体を含むとき、および／または前記選別された液滴が定められた特性を持つ前記実体を含むときにのみ選別された液滴を抽出するステップを含む。それによって、定められた数の実体は、定められた範囲内にあり得る。定められた特性は、たとえば、物理的特性（たとえば、蛍光レベルまたは他の物理的特性）および／または化学的特性であってよい。

【0018】

これは、たとえば、さらなる分析および／または培養のために、貯留容器内に排出されるべき、１つまたは複数のターゲット実体を含有する、液滴の収量が増加させられ得るので好ましいものとしてよい。上で概要を述べたように、ターゲット実体である実体は、これによって、限定はしないが、物理的特性、および／もしくは化学的特性などの定められた特性を有する実体、ならびに／または定められた数の実体を含有する液滴を含み得る。

【0019】

液滴中の実体の数は、たとえば、光学的に決定され得る。実体の数は、代替的に、またはそれに加えて、液滴および／または（１つもしくは複数の）実体の物理的特性（たとえば、蛍光レベル）および／または化学的特性を分析することによって決定され、特性は液滴中に含有されている実体の数に対応し得る。物理的および／または化学的特性は、標準的な技術を使用して決定され得る。

【0020】

流体から液滴を調製するための様々な方法およびデバイスが使用され得る。例は、限定はしないが、Ｔ字接合部、Ｙ字接合部、流動集束デバイス、および他のものを含む。

【0021】

液滴が１つまたは複数の実体、特に１つまたは複数のターゲット実体を含有するか、または実体を全く含有しないかは、液滴の電気的、光学的、熱的、音響的、機械的、時間的、空間的、および他の特性、たとえば、他の物理的または化学的特性のうちの１つまたは複数に基づき決定され得る。

【0022】

液滴を選別するための技術は、限定はしないが、磁場ベースの液滴選別、誘電泳動、音波液滴選別、および他のものを含む。

【0023】

抽出および／または識別ステップは、単一の液滴が１つまたは複数のターゲット実体を含有するかどうかに関するさらなる決定を可能にするものとしてよく、それによって、単一の液滴中の単一のターゲット実体または実体の単一のターゲット組合せを取得することに対する確率を高める。

【0024】

本明細書で説明されている方法の実施形態は、以下でさらに説明されるように、たとえば、液滴中の生存可能な細胞の単一クローン性保証（monoclonality assurance）を高めるのに特に適している。

【0025】

方法の好ましい一実施形態において、排出するステップは、前記決定および／または前記実体の特性に応じて定められた位置で前記選別された液滴を排出するステップを含む。選別された液滴は、それによって、たとえば、マイクロタイタープレートのウェル内に排出され得る。選別された液滴が分注されるべきマイクロタイタープレートの特定のウェルは、それによって、液滴中の以前に決定された数の実体（１つの種類の定められた数の実体または複数の種類の実体の各々であってよい）によって、および／もしくは１つもしくは複数の実体の特性、たとえば、物理的特性（たとえば、蛍光レベルまたは他の物理的特性）ならびに／または化学的特性によって選択される。

【0026】

本明細書で説明されている方法の好ましい実施形態において、液滴は、５０〜１，０００ピコリットル、好ましくは３００〜７００ピコリットルの体積を有する（融合液滴は大きくなり得る）。そのような体積は、流体の消耗品コストを最低限度に維持しながら、たとえば、細胞もしくは生体分子の単一の実体、または少数の実体を含有することを円滑にし、それに加えて、液滴が小さければ小さいほど高速な処理が円滑に進むので好ましい。しかしながら、より大きい液滴も採用され得る。

【0027】

たとえば、微生物培養物もしくは細胞を培養し、および／または維持することが好ましい場合がある。したがって、好ましい一実施形態において、方法は、１つまたは複数の実体を培養し、および／または維持するために液滴をインキュベートするステップをさらに含む。単一の液滴中の単一のターゲット実体または実体の単一のターゲット組合せを取得することに対する確率は、実施形態において、９９．９９７％を超える高さなので、高い単一クローン性保証は、本明細書で説明されている方法の実施形態を使用してもたらされる１つまたは複数の実体を培養したときに多数の、たとえば生存可能な細胞を取得することを可能にする。

【0028】

液滴は、液滴が１つもしくは複数の実体を含有する（または実体を全く含有しない）かどうかに関する決定の前にインキュベータに送られるものとしてよく、ならびに／または決定および選別ステップの後にインキュベータに送られ得る。それに加えて、または代替的に、液滴は、抽出ステップの後にインキュベートされてよい。

【0029】

さらなる好ましい一実施形態において、方法は、インキュベーション時に１つまたは複数の実体に対して安定性試験を実行するステップをさらに含む。たとえば、単一の液滴中の１つまたは複数の細胞に対して安定性試験を実行することで、安定性試験中に重要な検体もしくは生体分子の生産を低下させるか、変更するか、または死んでいる、ということのない生存可能な細胞を選別することが可能になる。これは、たとえば、生存可能な細胞または高産生体または重要な検体または同様のもののなおいっそう高い単一クローン性保証を取得することを可能にする。

【0030】

方法の好ましい一実施形態において、選別された液滴を第１の流体流路から第２の流体流路に移送するステップは、選別された液滴をデカップラ（decoupler）内の第１の流体流路からデカップルするステップを含み、デカップラは、前記選別された液滴を第１の流体流路から分離し、前記分離された液滴を第２の流体流路に誘導するように構成される。

【0031】

この方法で、単一の液滴が、１つまたは複数の液滴を含有する流体から分離され得る。次いで、液滴は、一方の流体流路から別の流体流路へ平行移動されるものとしてよく、そこから、その後、たとえば、この方法が実装される微小流体チップから分注され得る。液滴が生存可能な単一の実体（または生存可能な実体のみの特定の組合せもしくは複数の生存可能な実体のみ）、たとえば、生存可能な単細胞を含有するかどうかを決定することが特に望ましい場合がある。これは、流体から生存可能な単一の実体（または生存可能な実体のみの特定の組合せもしくは複数の生存可能な実体のみ）を含有する液滴を単に分離することを可能にし得る。その結果、各々液滴が生存可能な単一の実体（または生存可能な実体のみの特定の組合せもしくは複数の生存可能な実体のみ）を含有する単一の液滴をもたらすことに対する単一クローン性保証は、さらに高まり得る。

【0032】

移送された液滴を、たとえば、微小流体チップから排出するステップは、単一の液滴中に含有されている１つまたは複数の実体がさらにオフチップで分析され得るので特に好ましいものとしてよい。

【0033】

方法の好ましい一実施形態において、排出するステップは、前記選別された液滴が給送される輸送流体（限定はしないが、油など）を加熱するステップを含む。これは、流体がインクジェットプリンタから排出されるのと同様にして液滴を排出することを可能にする。

【0034】

好ましい一実施形態において、方法は、培養培地流体を第２の流体流路内に注入して選別された液滴を培養培地流体内で排出するステップをさらに含む。これは、たとえば、集団が単一の排出された液滴中に含有される１つまたは複数の実体から培養され得るので特に好ましいものとしてよく、排出される液滴は、たとえば、集団、たとえば、細胞集団もしくは生体分子の集団を培養するために培養培地流体においてマイクロタイターウェル内に排出され得る。

【0035】

さらなる好ましい一実施形態において、排出するステップは、加圧流体排出を介して識別された液滴を排出するステップを含む。これは、１つまたは複数の実体を含有する液滴として特に好ましいものとしてよく、特に１つまたは複数の生存可能な実体は、より高速におよび／または制御されながら分注され得る。この点において、複数の液滴を運ぶ流体の第１の流体流路から１つまたは複数の生存可能な実体を含有する液滴を分離し、液滴を第２の流路に送ることは、このことが第１の流体流路内の他の液滴の流れに影響を及ぼすことなく第２の流路から単一の液滴の加圧流体排出を行うことを可能にするので、特に重要であり得る。これによって、単一の液滴中の、たとえば、１つまたは複数の生存可能な細胞もしくは生体分子の制御された排出が達成され得る。

【0036】

本明細書で説明されている方法およびシステムは、限定はしないが、生体分子などの、細胞および／または試薬に特に適しているものとしてよいが、それは、上で概要を述べたように、たとえば細胞集団の培養は、法的規制の下で、単一の生存可能な細胞（または多数の生存可能な細胞のみ）に由来する必要があり得るからである。

【0037】

本明細書で説明されている方法およびシステムを実現することによって、消耗品コスト、特に実体を含有する流体の消耗品コスト、および／またはリード薬剤を送達するのに要する時間の長さは、特に低減され得る。

【0038】

好ましい実施形態において、方法は、第２の流体中に第２の複数の実体を供給するステップと、第２の流体から第２の液滴を調製するステップと、第１の流体から調製された第１の液滴と第２の流体から調製された第２の液滴とを融合させて融合液滴を取得するステップとをさらに含み、抽出する前記ステップは、第１の流体流路から第２の流体流路内に融合液滴を移送することによって融合液滴を抽出するステップを含む。これは、第１および第２の細胞、細胞と試薬、ならびに他の組合せを含有する融合液滴を取得することを可能にし得る。液滴を融合するステップは、電気合体（electrocoalescence）を使用して、第１および第２の液滴の一方または両方を帯電させることによって、受動的もしくは機械的融合によって、たとえば、流動チャネルに形状形成もしくは他の構成をとらせて強制的に液滴を集めることによって、化学的に促進された融合（chemically facilitated fusion）を採用することによって、および／または他の技術を使用することによって、実行され得る。

【0039】

したがって、第１および第２の液滴を融合するステップは、たとえば、単細胞（または多数の細胞）が試薬と反応する仕方を詳しく調べることを可能にし得る。さらに、安定性試験が、試薬に暴露されている単細胞（もしくは多数の細胞）について実施され得るか、または単細胞対（もしくは細胞の組合せ）間の相互作用が分析され得る。

【0040】

たとえば、（１つまたは複数の）単細胞を試薬と融合させるために、最初に、第１の液滴が単一の実体（または多数の実体）を含有するかしないかを決定することが望ましいものとしてよい。したがって、好ましい一実施形態において、液滴の融合の前に、決定および／または選別が実行される。

【0041】

さらなる好ましい実施形態において、方法は、第２の液滴が第２の複数の実体のうちの１つまたは複数の実体を含有しているかどうか、または第２の液滴が第２の複数の実体のうちの１つの前記実体を含有していないかどうかを決定するステップと、決定の結果に応じて第２の液滴を選別するステップとをさらに含む。これは、たとえば、第１の液滴が第２の液滴と融合させられることを、第２の液滴が１つまたは複数のターゲット実体を含有する場合にのみ確実にし得る。好ましくは、融合は、それぞれ、第１および第２の複数の実体のうちの１つまたは複数のターゲット実体を含有すると決定されている前記第１の液滴および前記第２の液滴についてのみ実行される。

【0042】

したがって、方法の実施形態は、たとえば、単一の液滴中に含有されている、生体分子、または１つもしくは複数の細胞と１つもしくは複数の試薬との単一のターゲット組合せなどの、細胞の単一の対、または細胞と試薬との単一の対を分析することを可能にする。

【0043】

したがって、方法の好ましい一実施形態において、融合液滴は、２つの細胞の単一の対、または細胞と試薬との単一の対、または１つもしくは複数の細胞の単一の組合せ、または１つもしくは複数の細胞と１つもしくは複数の試薬との単一の組合せを含有し、特に試薬は生体分子である。単一の液滴中に含有される２つの実体の単一の対の他の組合せが、本明細書で説明されている方法の実施形態を使用して分析され、および／またはさらに処理され得ることは理解されるであろう。

【0044】

当業者であれば、方法は、複数の実体／試薬を組み合わせるためにも使用され得ることを理解するであろう。

【0045】

方法のさらなる好ましい実施形態において、選別するステップは、異なる時点において前記流体流路の複数の場所で前記液滴を検出し、前記流体流路内の前記液滴の速度を決定して前記選別を計時するステップを含む。方法の実施形態は、流体流路内の液滴の特定の場所が決定され、および／または予測され得るので液滴を選別するステップの制御を改善することができる。したがって、たとえば、光ゲートセンサなどの一対のセンサは、液滴の移動速度を推定するために使用され得る。次いで、融合時の液滴の位置が予測され得る。これは、たとえば、液滴が正しいチャネル内に存在するか、または向き付けられ／選別されていることを、液滴が予想された時刻および場所に存在していることをチェックすることによって、チェックするために使用され得る。

【0046】

本発明の関係する態様において、２つの生物学的実体の単一の対を含有する液滴を供給する方法が提供され、この方法は、第１の流体中に第１の複数の生物学的実体を供給し、第２の流体中に第２の複数の生物学的実体を供給するステップと、第１の流体から第１の液滴を調製し、第２の流体から第２の液滴を調製するステップと、第１の液滴が第１の複数の生物学的実体のうちの１つの単一の実体を含有するかどうか、および第２の液滴が第２の複数の生物学的実体のうちの１つの単一の実体を含有しているかどうかを決定するステップと、それぞれ、前記単一の実体を含有していると決定されている第１の液滴と第２の液滴とを融合させるステップとを含む。したがって、単一の液滴中の２つの実体の単一の対を取得することに対する確率は、この例では、第１および第２の液滴の両方について、決定ステップが、それぞれ、液滴を融合させる前に実行されるので、高められ得る。

【0047】

本発明の上で説明されている第１の態様の好ましい実施形態は、ここで等しく適用される。したがって、たとえば、融合液滴は、その後、選別された液滴を第１の流体流路から第２の流体流路内に移送することによって流体の第１の流体流路から抽出され得る。好ましくは、第１および第２の液滴は、各々、本発明の上で説明されている第１の態様およびその好ましい実施形態のすべてのステップを受けるものとしてよい。それぞれ第１の複数の生物学的実体および第２の複数の生物学的実体から実体の単一の対を含有する融合液滴を取得することに対する確率は、それによって著しく高められ得る。

【0048】

液滴を融合させるステップは、電気合体によって、静電気引力により第１および第２の液滴の一方または両方を帯電させて液滴を融合させることによって、受動的もしくは機械的融合によって、化学的に促進された融合によって、または他の技術によって実行され得る。

【0049】

本発明の関係する一態様において、液滴中に含有される生物学的実体を代謝させる、および／または分析する方法が提供され、生物学的実体は、単細胞、または２つの細胞の単一の対、または細胞と試薬との単一の対を含み、この方法は上で説明されている態様および実施形態のうちのいずれか１つの方法を使用して液滴中に含有される生物学的実体を提供するステップを含む。

【0050】

代謝させる（培養する）ステップは、たとえば、細菌の場合に、実体の数を増やすステップを含み得るか、または哺乳類細胞などの実体を代謝させて、たとえば、産生物を産生させるステップを含み得る。

【0051】

本明細書で説明されている方法の実施形態は、結果として非常に高い単一クローン性保証をもたらすので、これらは、たとえば、単一の液滴中に含有される単細胞（または生体分子、または別の実体）を培養するのに特に適しているが、それは、単細胞から培養された細胞集団内の細胞は、すべてが互いに実質的に同一になる非常に高い確率を有するからである。同様に、単一の液滴中の単細胞を分析するステップは、注目している細胞に対して測定が実行されることを確実にすることを可能にする。たとえば、突然変異の結果、すべが実質的に同一になるとは限らない細胞（または他の実体）の統計的分布が生じるので、これは、単一の液滴中に含有される多数の細胞について保証され得ない。

【0052】

本発明のさらなる態様において、１つまたは複数の実体を含有する液滴を供給するための微小流体システムが実現され、このシステムは、複数の実体を含有する流体から液滴を調製するための液滴形成デバイスと、前記液滴が複数の実体のうちの１つまたは複数の実体を含有するかどうかを決定するための分析器と、決定の結果に応じて前記液滴を選別するための液滴選別デバイスと、前記選別された液滴を微小流体システム内の流体の流体流路からデカップルするためのデカップラとを備える。

【0053】

好ましい実施形態において、微小流体システムは、前記デカップルされた液滴（または、たとえば、デカップラを介して第１の流体流路から第２の流体流路に移送された前記選別された液滴）を識別するように構成されているさらなる分析器と、識別された液滴を、たとえば、貯留容器（たとえば、マイクロタイタープレート）内に排出するように構成されている液滴分注ユニットとをさらに備える。

【0054】

好ましくは、分析器は、液滴が複数の実体のうちの単一のターゲット実体を含有するかどうか、および／または液滴が複数の実体のうちの実体の単一のターゲット組合せを含有するかどうかを決定するように構成される。

【0055】

したがって、微小流体システムの実施形態は、単一の液滴中の、単一の実体、たとえば、単細胞もしくは生物学的実体の単一の対、または実体の単一のターゲット組合せを取得することを可能にする。液滴形成デバイス、分析器および液滴選別デバイス、およびデカップラの各々は、ある確率で単一の液滴中の１つまたは複数のターゲット実体を取得することを可能にする。微小流体システムの実施形態を使用して単一の液滴中の単一の実体または実体の単一の組合せを取得することに対する組合せ確率は、９９．９％を超える、特に９９．９９％を超え得る。デカップラは、それによって、単一の液滴が単一の実体を含有するかどうかに関するさらなる決定のための分析器を備え得る。

【0056】

微小流体システムの好ましい一実施形態において、デカップラは、流体流路から前記選別された液滴を分離するための分離ユニットと、前記分離された液滴を微小流体システムの第２の流体流路内に誘導するためのガイドとを備える。これは、単一の液滴中に含有される単一の実体（または実体の単一の組合せ）がその後分離され、他の液滴または流体から別々に分注されおよび／または分析され得るので特に好ましいものとしてよい。

【0057】

微小流体システムのさらなる好ましい一実施形態において、ガイドは回転ユニットを備え、回転ユニットは、前記分離された液滴を貯蔵するための液滴貯蔵ユニットを備え、回転ユニットは、液滴貯蔵ユニット内に貯蔵されている前記分離された液滴を第２の流体流路内に輸送するために回転されるように構成される。

【0058】

注目している実体（または複数の実体）を含有する液滴が検出された後、液滴は、液滴貯蔵ユニット内に留置されてよく、回転ユニットは回転されて、液滴を第２の流体流路に送るものとしてよい。いくつかの実施形態において、回転ユニットは、第１および第２の流体流路を完成させる。

【0059】

いくつかの他の実施形態において、分岐流動チャネルは、類似の目的のために、より具体的には液滴を選択／分注するために使用され得る。

【0060】

いくつかの実施形態において、液滴貯蔵ユニットは、それぞれ第１および第２の流体流路を完成させるチャネルであってよい。

【0061】

微小流体システムのさらなる好ましい一実施形態において、ガイドは並進ユニットを備え、並進ユニットは、前記分離された液滴を貯蔵するための液滴貯蔵ユニットを備え、並進ユニットは、液滴貯蔵ユニット内に貯蔵されている前記分離された液滴を第２の流体流路内に輸送するために並進方向に移動されるように構成される。

【0062】

回転ユニットと同様に、注目している実体（または複数の実体）を含有する液滴が検出された後、液滴は、並進ユニットの液滴貯蔵ユニット内に留置されてよく、並進ユニットは移動されて、液滴を第２の流体流路に送るものとしてよい。いくつかの実施形態において、並進ユニットは、第１および第２の流体流路を完成させる。

【0063】

いくつかの実施形態において、液滴貯蔵ユニットは、それぞれ第１および第２の流体流路を完成させるチャネルであってよい。

【0064】

好ましい一実施形態において、ガイドは、投入チャネルを２つ以上の放出チャネルと組み合わせるように構成され得る。それによって、ガイドのチャネルは揺れるような動きで移動されてよく、投入流体流路を複数の放出流体流路と接続することを可能にする。

【0065】

好ましい一実施形態において、微小流体システムは、１つまたは複数の実体を培養し、および／または維持するために液滴をインキュベートするためのインキュベータさらに備える。上で概要を述べたように、単一の液滴中の単一のターゲット実体または実体の単一のターゲット組合せ（複数の実質的に同一の実体であってよい）を取得することに対する確率は、実施形態において、９９．９９％を超える高さなので、高い単一クローン性保証は、本明細書で説明されている微小流体システムの実施形態を使用して１つまたは複数の実体を培養したときに多数の、たとえば生存可能な実体（たとえば、細胞、生体分子、または他の実体）を取得することを可能にする。

【0066】

インキュベータは、流体流路方向で分析器の前に留置されてよく、および／または流体流路方向で分析器および液滴貯蔵デバイスの背後に留置されてよい。それに加えて、または代替的に、インキュベータは、微小流体システム内の流体流路方向でデカップラの背後に留置されてよい。

【0067】

微小流体システムの好ましい一実施形態において、インキュベータは、インキュベーション時に１つまたは複数の実体に対して安定性試験を実行するための安定性試験ユニットを備える。単一の液滴中の１つまたは複数の実体、たとえば、（１つまたは複数の）細胞に対して安定性試験を実行することで、安定性試験中に重要な検体または生体分子の産生を低下させるか、変更するか、または死んでいる、ということのない生存可能な実体を選別することが可能になる。これは、限定はしないが、生存可能な細胞、生体分子、もしくは他の実体などの生存可能な実体、および／または高いレベルの重要な検体または同様のものを産生する細胞のなおいっそう高い単一クローン性保証を得ることを可能にする。

【0068】

好ましい一実施形態において、微小流体システムは、デカップルされた液滴を分注するための分注ユニットをさらに備える。それによって、デカップルされた液滴は、たとえば、マイクロタイタープレートの個別のウェル内に分注されるものとしてよく、そこで、単一の液滴（または複数の液滴）中に含有される１つまたは複数の実体は、貯蔵され、その後、さらなる処理もしくは分析のために、またはその後に、たとえば、発酵もしくは同様の処理において使用するために取り出され得る。

【0069】

微小流体システムのさらなる好ましい一実施形態において、分注ユニットは、培養培地流体を貯蔵するための貯留容器を備え、分注ユニットは、前記デカップルされた液滴を培養培地流体内に分注するように構成される。これは、特に好ましいものとしてよいが、それは、分注するステップおよび１つまたは複数の実体を含有する単一の液滴を培養培地流体内に留置するステップが、単一のステップに組み合わされ得るからである。実体または実体含有液滴を含有する培養培地流体から液滴が調製されてよく、次いで、たとえば、マイクロタイタープレートの個別のウェル内に分注され得る。

【0070】

微小流体システムの好ましい一実施形態において、分注ユニットは、加圧流体排出を介して液滴を分注するための昇圧（または減圧）ユニットを備える。圧力の変化は、限定はしないが、圧電、熱、および加圧ガスの方法を含む多くの技術によって引き起こされ得る。加圧流体排出を介して液滴を排出するステップは、微小流体システムから液滴を分注する時間が著しく短縮される可能性があり、および／または以下でさらに説明されるように、異なる放出部を介する排出が制御され得るので、特に好ましいものとしてよい。微小流体システムから分注されるべき注目している液滴を第１の流体流路から分離またはデカップルすることによって、分注されるべき液滴は、高圧ユニットに曝されるだけである。分析器および液滴選別デバイス内の液滴分析および選別は、液滴が高圧ユニットに曝される場合には達成が困難であり得るので、デカップルされた液滴を高圧ユニットに曝すだけにすることが好ましいものとしてよい。

【0071】

微小流体システムの好ましい一実施形態において、液滴形成デバイスは、複数の液滴形成デバイスを含み、微小流体システムは、複数の液滴形成デバイスを使用して調製された複数の液滴を融合させるための液滴融合デバイスをさらに備える。したがって、微小流体システムの実施形態は、たとえば、細胞の単一の対、または細胞と試薬との単一の対、または単一の融合された液滴中に含有されている特定の実体の単一の組合せのアッセイを作製することを可能にする。

【0072】

液滴融合デバイスは、微小流体システム内の流体流路方向で分析器および液滴選別デバイスの前に留置されてよい。好ましくは、液滴融合デバイスは、流体流路方向で分析器および液滴選別デバイスの背後に留置されてよいが、これはそれぞれ第１および第２の複数の実体のうちの１つまたは複数のターゲット実体を含有すると決定されている液滴のみを融合させることを可能にするからである。

【0073】

液滴融合デバイスは、代替的に、デカップラの背後に留置されてよい。そうする利点は、２つの液滴が各々注目している１つまたは複数の実体を含有する確率が、それらの液滴を融合させる前に比較的高い可能性があるということにある。

【0074】

液滴融合デバイスは、電界を発生させて電気合体によって液滴を融合させるための電界発生器を備え得る。代替的に、またはそれに加えて、液滴融合デバイスは、液滴を帯電させるための１つまたは複数の帯電デバイスを備え得る。液滴の融合は、それによって、液滴の静電気引力を介して促進される。液滴融合は、代替的に、またはそれに加えて、たとえば、液滴が別の液滴に衝突しそれによって他の液滴と融合し得るチャネル構築を介して、受動的液滴融合を可能にするチャネル幾何学的形状を備える液滴融合デバイスを実現することによって達成され得る。

【0075】

微小流体システムの好ましい一実施形態において、分析器は、蛍光検出器、散乱光検出器、音波発生および検出ユニット、ならびに磁気活性化細胞選別デバイスのうちの１つまたは複数を備える。液滴の含有物は、これらのデバイスのうちの１つまたは複数を介して決定されるものとしてよく、液滴は、この決定に従って液滴選別デバイスにおいて選別され得る。液滴の含有物を分析するための１つまたは複数の特定の方法もしくはデバイスは、液滴中で検出されるべきターゲット含有物に応じて他の方法もしくはデバイスよりも好ましい場合があることは理解されるであろう。

【0076】

微小流体システムのさらなる好ましい一実施形態において、分析器および／または液滴選別デバイスは、前記微小流体システムの異なる場所で（異なる時点に）前記液滴を検出して前記微小流体システム内の前記液滴の速度を決定するための複数のセンサを備え、前記液滴選別デバイスは、前記速度決定の結果に応じて前記液滴を選別するように構成される。これは、微小流体システムの流体流路内の液滴の場所が決定され、および／または予測され得るので液滴の改善された選別を可能にする。

【0077】

本発明のさらなる一態様において、液滴選別または分注デバイスが実現され、このデバイスは一組の１つまたは複数の微小流体投入チャネルと、一組の微小流体放出チャネルと、投入チャネルと放出チャネルとの間の移動可能な選別要素とを有する基材を備え、選別要素は、投入チャネルを放出チャネルに接続するための一組の微小流体チャネルを備え、選別要素は、第１の投入チャネルから第１の前記放出チャネルへの流体流を可能にするため少なくとも第１の前記投入チャネルが接続される第１の位置と、前記チャネル内にあり、１つまたは複数の液滴を運ぶ一定の長さの流体がその長さ分の流体が第２の前記放出チャネル内に流れ込むように移動される第２の位置との間で移動可能である。

【0078】

したがって、液滴選別／分注デバイスの実施形態は、液滴を第１の流体流路から第２の流体流路内に移送することによって第１の流体流路から液滴を抽出することを可能にする。したがって、液滴選別デバイスは、微小流体デバイスの微小流体チャネルを接続し、および／または完成させるために使用され得る。上で概要を述べたように、これは、液滴が微小流体システムの第１の流体流路からデカップルされ、たとえば、第２の流体流路からの加圧流体排出によってシステムから分注され得るので、特に好ましいものとしてよい。

【0079】

液滴選別／分注デバイスの好ましい一実施形態において、選別要素は、第１の位置と第２の位置との間で回転可能であり、それにより、第１および第２の投入チャネルから流体の長さ分だけスワップしてそれらがそれぞれの第１および第２の放出チャネルに流れるか、またはスワップされてそれぞれの第２および第１の放出チャネルに流れるかのいずれかとなる。したがって、液滴の構成要素に関する以前の決定は、第１の流体流路から注目している液滴（または代替的に注目していない液滴）を抽出することによって液滴を選別することを可能にし、それを決定に基づき第２の流体流路に送るものとしてよい。

【0080】

したがって、液滴選別／分注デバイスの実施形態は、微小流体システム内の流体流路を妨げることなく流体流路から液滴を抽出することを可能にする。

【0081】

本発明の関係する一態様において、液滴を選別するか、または分注する方法が提供され、この方法は第１および第２の微小流体流を供給するステップであって、前記流れの少なくとも一方は液滴を含有する、ステップと、前記流れの一部分を含むターンテーブルを回転させて液滴を第１および第２の放出微小流体流のうちの一方に選択的に向けるステップとを含む。したがって、この方法の実施形態は、たとえば、液滴および／またはその含有物の特性に関する以前の決定に基づき、液滴を選別することを可能にする。

【0082】

本発明の関係する一態様において、微小流体流中で液滴を選別するか、または分注するためのデバイスが実現され、このデバイスは第１および第２の投入微小流体流であって、流れの少なくとも一方は液滴を含有する、第１および第２の投入微小流体流と、第１および第２の放出微小流体流と、投入流と放出流との間の流れの一部を含む回転するターンテーブルと、液滴を第１および第２の放出微小流体流に選択的に向けるようにターンテーブルの回転を制御するためのコントローラとを備える。

【0083】

液滴が、たとえば、第１の投入微小流体流から回転するターンテーブルの流れの一部分のうちの１つの中に入った後、ターンテーブルは、液滴が第２の放出微小流体流のところで出るように回され得る。液滴および／またはその含有物の前の分析結果に基づき、液滴をチャネル内に維持することが望ましい場合に、ターンテーブルは、液滴が、たとえば、回転するターンテーブルの流れの一部分を介して第１の投入微小流体流から第１の放出微小流体流に流れるように回されない。

【0084】

本発明の関係する一態様において、ピコドロップレットを第１の流体流路から第２の流体流路に移送するための細胞、生体分子、および実体の選別または分注デバイスが実現され、選別デバイスは、前記ピコドロップレットを前記第１の流体流路からデカップルするためのデカップラと、前記デカップルされたピコドロップレットを前記第２の流体流路に誘導するためのガイドとを備え、ガイドは、前記デカップルされたピコドロップレットを前記第２の流体流路に輸送するために回転されるように構成されている回転ユニット、および／または前記デカップルされたピコドロップレットを前記第２の流体流路に輸送するために並進方向に移動されるように構成されている並進ユニットを備える。液滴がデカップルされ第１の流体流路から第２の流体流路に誘導されるべきかどうかに関しては、液滴が選別デバイスに入る前に決定されているものとしてよい。代替的に、またはそれに加えて、この決定は、液滴が選別デバイスの中にあるときに下され得る。

【0085】

好ましい一実施形態において、細胞、生体分子および実体の選別デバイスは、１つもしくは複数のマイクロタイタープレート、および／または１つもしくは複数のガラススライド、および／またはピコドロップレットのうちの１つまたは複数が１つまたは複数のアドレス可能な場所で分注可能である１つもしくは複数のアレイもしくは他のフォーマットを備えるｘ−ｙ移動プラットフォームをさらに具備する。したがって、液滴は、マイクロタイタープレートの１つもしくは複数の個別のウェル、および／または１つもしくは複数のガラススライド、および／または事前定義されたパターンによる１つもしくは複数のアレイもしくは他のフォーマットに分注されてよく、液滴およびその含有物は、分析されおよび／またはさらに処理されて、たとえば、集団を培養するものとしてよい。

【0086】

液滴選別／分注デバイスの実施形態および／または本明細書で説明されている細胞、生体分子、および実体の選別／分注デバイスの実施形態は、液滴分注器、特にピコドロップレット分注器内に組み込まれ得る。そのような液滴分注器は、選択された（選別された）液滴を微小流体チャネルから貯留容器内に選択的に分注するように構成される。

【0087】

さらに、液滴選別／分注デバイスの実施形態および／または細胞、生体分子、および実体の選別／分注デバイスの実施形態、および／または本明細書で説明されているピコドロップレット分注器の実施形態は、微小流体デバイス内に実装され得る。

【0088】

カートリッジ
さらなる一態様において、本発明は、選別された微小流体液滴の自動化された選別および分注を行うための微小流体カートリッジを実現し、カートリッジは、選別領域に結合されている選別投入チャネルであって、前記選別領域は前記投入チャネルおよび液滴向き付け器に結合され、液滴を前記選別投入チャネルから前記選別放出チャネルのうちの選択された１つに選択的に向ける２つ以上の選別放出チャネルを備える、選別投入チャネルと、前記選別放出チャネルのうちの１つに結合され、選択された前記液滴を前記カートリッジから分注して貯留容器内に回収する、液滴分注器とを備え、前記液滴分注器は、液滴をエマルジョン流から分注器放出チャネル内に排出して前記貯留容器内に回収するための液滴排出機構を備える。

【0089】

そのようなカートリッジの実施形態は、１０^６または１０^９個の液滴、たとえば、薬物耐性菌のうちの１つにのみ存在し得るターゲットを識別し、回収するなど、多数の重要な問題を解決するために使用できる使い捨て／消費可能デバイスを実現する。大まかに言うと、これは、原理上、共通の貯留容器内で、ただし、いくつかの好ましい実施形態では、別々の識別可能な貯留容器内で、注目している液滴からの信号を識別し、次いで、これらの液滴を回収してさらに分析することによって行われ得る。この後者のアプローチは、個別に識別される特性を持つ細胞もしくは他の実体を、たとえば、マルチウェルプレートから取り出し、その後、分析するか、または使用することを可能にし、そのようなマルチウェル貯留容器の事実上個別のウェルは、選択された特性を有する個別の実体を回収するために使用され得る。

【0090】

補完する形で、カートリッジの実施形態は、アッセイに直接使用されるのではなく、「安定性試験モード」で使用され、それにより、概念上すべて同一である液滴（たとえば、細胞）の集団における変更された（たとえば、否定的）応答を識別するものとしてよい。一例として、この動作モードでは、カートリッジは、たとえば、細胞による物質の産生が、たとえば、発酵バッチでの収量落ち込みをトラブルシューティングするためにオフに切り替えられた個別の場合を識別するために使用できる。

【0091】

好ましい実施形態において、カートリッジは、制御放出の前に液滴の含有物のインキュベーションを可能にするために液滴を好ましくは制御された温度に保持することができるインキュベーション領域またはチャンバを備える。実施形態において、この領域は、エマルジョン内に分散されたときよりも高い密度で液滴を保持するように構成され、これは、液滴（典型的には「浮遊している」）をチャンバの上側部分に保持し、弁または類似のものをチャンバの頂部に設けて液滴の制御放出を行うようにすることによって達成され得るが、使用時に、カートリッジはインキュベーションチャンバの頂部が上向きになるように配向される。過剰な分散媒（油）は、放出されて廃棄されるものとしてよい。好ましくは、ただし本質的ではないが、インキュベーション領域は、選別領域の上流にある。

【0092】

当業者であれば、エマルジョン（ダブルエマルジョンであってよい）が一般的に油中水型エマルジョンであることを理解するであろう。カートリッジは、好ましくは、マイクロドロップレット処理システムと接続するように構成される、すなわち、実施形態において、カートリッジは感知および制御機能を付与するマイクロドロップレット処理システムに取り付けられ、そこから放出されるものとしてよい。実施形態において、マイクロドロップレット処理システムは、液滴選別のためにインキュベーションチャンバおよび液滴特性感知のための温度制御を行い、分注器放出チャネルと貯留容器ウェルとの間の相対的運動も行わせて液滴を回収してもよい。

【0093】

典型的な一実施形態において、カートリッジは、一般的に、微小流体チャネル、１つまたは複数の保持領域、弁、および同様のものを載せた平板の形態を有する。これは、好ましくは実質的に光学的に透明であり、様々なプラスチック材料、たとえば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）または環状オレフィン重合体もしくは共重合体（ＣＯＰもしくはＣＯＣ）から加工され得る。次いで、カートリッジは、システム／器具内に垂直に、または好適な角度で装着されてよく、分注器放出チャネルは下に向かってマルチウェルもしくはマイクロタイタープレートの方へ向き付けられている。次いで、器具は、カートリッジおよび／またはプレートを移動して、放出チャネルを選択されたウェル内に向き付けるものとしてよい。

【0094】

好ましい実施形態において、カートリッジは複数の流体接続部を備えており、これは器具内にカートリッジが挿入されたときに自動的に行われ得る。エマルジョンの生成は、オンカートリッジまたはオフカートリッジで実行されるものとしてよい。たとえば、実施形態において、カートリッジは、一方のエッジに沿って貯留容器を備え（これらはカートリッジが垂直であるときに正しい配向となるように）、これによりドロップレットオンチップで液滴生成を行うための油および水媒体（水および培養培地）を保持し得る。

【0095】

微小流体カートリッジの実施形態は、以前に説明されており、非常に大きな集団から注目している生物学的実体を含有するごく少数の、極めて希な液滴を識別することに向けられている。液滴選別器は、液滴分注器よりも１桁または２桁速く動作するものとしてよく、たとえば、分注器は、１〜１０Ｈｚで動作するものとしてよいが、選別器は１００〜１，０００Ｈｚで動作し得る。しかしながら、ターゲット実体の統計量により、分注器は連続的に動作し得ない。したがって、カートリッジのいくつかの好ましい実装形態において、１つまたは複数のエマルジョン流緩衝領域が、カートリッジの選別領域と分注領域との間に設けられ、液滴分注器へのエマルジョン流量を制御する。実施形態において、そのような緩衝領域は、すでに説明されているインキュベーション領域に幾分類似するチャンバを備えるものとしてよく、そこで過剰な油がサイホン現象により吸い上げられるか、放出して廃棄される間に液滴が溜まることができる。たとえば、液滴は、それらが弁または類似のものによって制御されながら放出され得る場所からチャンバの頂部へ浮遊して移動することを許され得る。

【0096】

緩衝領域が含まれる場合、実施形態において、これは、液滴のオーダーが維持されるように構成されている、たとえば、蛇行構成の一定の長さの微小流体チャネルを備え得る。この方式で、緩衝部の上流で測定される液滴特性を有する液滴の同一性は、液滴のオーダーまたはシーケンスが維持されるので維持され得る。しかしながら、他の配置構成では、幅広のチャネルまたはチャンバが採用されてよく、これはより大きな容量を容易に持たせられるという利点を有する。この場合、液滴の特性は、緩衝領域から（順に）出た後に測定され得る。両方の場合において、好ましい実施形態は、液滴の１つまたは複数の特性を液滴の識別可能な特性、典型的にはその位置にリンクし、それにより、液滴がウェル／貯留容器内に分注されたときに、ウェル／貯留容器内の液滴の特性が知られる。

【0097】

したがって、本明細書で説明されているこれらのおよび他の方法／装置の好ましい実施形態において、識別されたウェル／貯留容器内の分注された液滴の含有物が知られ、後で使用できるように貯蔵される。このようにして、所望の／ターゲット特性を有する液滴含有物（たとえば、細胞、タンパク質、抗体、試薬、または検体）は、所望の／ターゲット特性を持つ内容物を有することが知られている（記録されている）ウェル／貯留容器の内容物を取り出すことによって液滴分注後に取り出され得る。

【0098】

いくつかの好ましい実施形態において、分注器の放出チャネルは、エマルジョンからの液滴、または液滴の含有物の遊離を促進するための機構を備える。以前に述べたように、液滴の含有物は、典型的には、多くの場合に培養培地において、細胞などの、水と生物学的実体とを含む。カートリッジの目的は、特定の特性または特質を有するそれらの（希な）生物学的実体を抽出することであり、これは、ターゲット液滴を、マイクロタイタープレートのウェル内に、たとえば、２０〜５０μｌの水／培養培地をすでに含んでいる可能性のある１つまたは複数の貯留容器内に回収することによって行われる。比較すると、エマルジョンの排出されたスラグは、５０〜３００ｎｌの体積を有するものとしてよいが（一部はチャネル幅に依存する）、液滴は、５０ｐｌ以上のオーダーの体積を有し得る。実際、エマルジョンのスラグが分注器放出チャネルから排出されたときに、液滴からの水、およびその含有物は、最終的に、油の表面に浮遊して終わるものとしてよい（一部は油密度、およびそれがフッ素処理されているかどうかに応じて）ということがわかっている。したがって、液滴排出機構の実施形態は、好ましくは、エマルジョンから液滴を抽出し、および／または液滴を粉砕するためのシステムを備える。これは、たとえば、分注器放出チャネルのノズルを整形する、たとえば、狭めることによって、および／または放出チャネルにメッシュを設けることによって機械的に達成されるものとしてよく、および／またはたとえば、電界を発生させてエマルジョン／液滴を崩壊させるために電圧を印加できる分注器放出チャネルの放出部に隣接して一対の電極を設けることによって、電気的に達成されるものとしてよく、および／または化学的機構が、たとえば、ペルフルオロオクタノールなどの抗乳化剤の流れを分注器放出チャネル内に加えることによって採用され得る。

【0099】

いくつかの好ましい実施形態において、微小流体カートリッジは、前記微小流体カートリッジの異なる場所で（異なる時点に）前記液滴を検出して前記微小流体カートリッジ内の前記液滴の速度を決定するための複数のセンサをさらに備え、前記液滴方向付け器は、前記速度決定の結果に応じて前記液滴を向き付けるように構成される。これは、カートリッジ内の液滴の場所が決定され、および／または予測され、選別領域内で液滴を選別するステップの制御をさらに改善し得るので特に有利であり得る。

【0100】

いくつかの好ましい実施形態において、液滴排出機構は、エマルジョン流の圧力を高めて液滴を分注器放出チャネル内に向けるための機構を備える。いくつかの実施形態において、これは、主チャネルおよびサイドチャネルを（後で説明されているように、Ｔ字接合部の形態で）有するように分注器放出部を構成し、次いで、圧力パルスを印加して液滴をサイドチャネル（分注器放出チャネル）内に送り込んで放出させることによって達成され得る。一実施形態において、そのような配置構成は、サイドチャネル（分注器放出チャネル）とともにエマルジョン流の長さ分に沿って、ピンチ弁などの一対の弁を備え得る。このようにして、弁は、流れを分離するように閉じられ、次いで圧力がエマルジョンの分離されたスラグに印加されて、液滴を含むエマルジョンを分注器放出チャネル内に送り込むことができる。別のアプローチでは、エマルジョンのスラグは第１のチャネル／流れから第２のチャネル／流れに移送されてよく、そこで、圧力パルスが印加され、スラグおよびその関連する液滴を排出し得る。当業者は、他の構成が可能であることを認めるであろう。好適な圧力パルスが、たとえば、圧電トランスデューサを使用して、機械的に供給され得る。代替的に、圧力パルスが、たとえば、電気発熱体および泡膨張を用いて（インクジェットプリンタに似た方式で）電気的に生成され得る。いくつかの好ましい実施形態において、高められた圧力パルスが印加され、エマルジョンのスラグをその液滴とともに排出するが、当業者であれば、原理上、本発明者らが後で説明する配置構成がその代わりに低い圧力のパルスが液滴をエマルジョン流から分注器放出チャネル内に排出するために使用されるように適合され得ることを理解するであろう。

【0101】

いくつかの好ましい実装形態において、液滴排出機構を排出する液滴の存在を感知／検出するために使用されるシステムから物理的に分離すると都合がよい。実施形態において、これは、カートリッジ（マイクロドロップレット処理システム）を収納する器具を使用して排出のため選別システムによって選択された液滴の位置および速度の一方または両方を感知することによって達成される。感知は、液滴が排出機構に到達したときに液滴の位置が予測できるように液滴排出機構の上流で実行され得る。原理上、液滴速度は、エマルジョンの流速が十分正確に制御され得る場合には測定される必要がないが、実際には、速度を測定することは有利である。チャネルサイズ公差を制御して、チャネルサイズの変動を、したがって液滴速度変動を低減することはさらに有利である。この方式で液滴排出機構への別の場所で液滴を撮像すると、カートリッジ／器具が簡素化され、効果が高まる。

【0102】

すでに述べたように、いくつかの好ましい実施形態において、液滴は、複数の別々のウェルを備える、マイクロタイタープレートまたは同様のものの個別のウェル内に分注される。次いで、器具（マイクロドロップレット処理システム）は、分注された液滴を貯留容器に選択的に向けるための制御システムを備え得る。実施形態において、カートリッジまたはマルチウェルプレートのいずれかが、カートリッジおよびプレートが互いに相対的に移動され分注器放出チャネルを選択された貯留容器に向けることができるようにＸ−Ｙ移動可能ステージ上に装着される。すでに述べたように、ウェルは、器具の適用／アッセイ／動作モードに応じて、１つまたは複数の液滴を保持し得る。

【0103】

いくつかの好ましい実装形態において、選別について液滴の１つまたは複数の特性の問い合わせが器具によって行われたときに、所望の特性を有する選択されたターゲット液滴について対応するデータが記憶される。次いで、データは、液滴が分注される特定のウェルまたは貯留容器を識別する情報に関連付けられる。このようにして、特定の特性を有する液滴は、その後、後で分析できるように貯留容器から取り出されるものとしてよく、および／またはマルチウェル貯留容器が、特定の特性または特性の範囲を有する一組の液滴を抽出するために使用され得る。選別は、たとえば、測定された値と閾値との比較に基づくものとしてよいが、選択された液滴がパラメータのある範囲の値を有することが可能性あり、次いで、これは、液滴内の生物学的実体の活動を測定する他の何らかの特性と相関し得る。したがって、１つまたは複数のパラメータの尺度を貯留容器の特定のウェル内の液滴とリンクすることができることは有益である。器具によって感知され得る特性の例は（限定はしないが）、蛍光度、散乱度、発光度、吸光度のうちの１つまたは複数などの光学的特性、電気伝導度などの電気的または磁気的特性、細胞が生きているか、または死んでいるか（光学的測定から推論され得る）などの、１つまたは複数の導き出された、または推論された特性を含む。当業者であれば、液滴を選別するときに個別の液滴の１つまたは複数の特性を感知することは実施形態において都合がよいが、原理上、貯留容器識別データに関連して記憶されている感知データは、それに加えて、または代替的に、センサの別々の配置構成によって、選別した後にそれに加えて、または代替的に感知され得る。両方の場合において、組み合わされたカートリッジおよび器具の実施形態は、後で分析または使用できるように個別の分注された液滴の追跡を円滑にする。

【0104】

以前に説明されているように、カートリッジ実施形態に対してなされる使用は、直接液滴アッセイおよび生物学的実体安定性／生存可能性アッセイを含む。いくつかのアプリケーションにおいて、単一クローン性の保証は重要である、すなわち、これは、単一のそのような実体だけを含有するために細胞などの生物学的実体を含む個別の貯留容器／ウェルに対して望ましいものとしてよい。これは、たとえば、抗体が細胞株から生成されている場合に重要である、すなわち、規制の目的のために、たとえば、抗体が薬物を作製するために使用されている場合に抗体が細胞の単一クローンから導出されていることを実質的に保証することができることは重要であり得る。これらのアプリケーションについて、インキュベーションチャンバは、通常は必要なく、したがって、そのようなチャンバのないカートリッジバージョンが採用されてもよい。代替的に、インキュベーションチャンバがバイパスされ得るか、または別のバージョンでは、液滴がインキュベーションなしで以前に説明されているようにインキュベーションチャンバを通過し得るより一般的なカートリッジが実現され得る。

【0105】

微小流体カートリッジの実施形態が、単一クローン性保証に使用され得る一方法は、液滴選別器を使用して単細胞だけを含有する液滴を選択し、空の液滴および２つ以上の細胞を含む液滴を廃棄させることである。液滴中の細胞の数は、たとえば、光学的吸収、散乱光、螢光を検出することによって、または（いくつかの好ましい実施形態では）液滴内の個別の細胞を視覚化し、カウントすることによって、光学的に決定され得る。そのようなアプローチは、空の液滴の形成に向かう強い統計的バイアスにより液滴を生成することによって円滑にされる。典型的には、液滴生成システムは、流れ集束を採用し、ポアソン統計に従う多数の生物学的実体を含有する液滴を生成する。単一クローン性保証は、半分未満の数の液滴が生物学的実体を、好ましくは３０％、２０％、または１０％未満の割合で含有するようにそのようなシステムを動作させることによって円滑にされ、たとえば、システムは、液滴の５％程度のみが単一の実体／単細胞を含有するように動作させられるものとしてよい。

【0106】

これらの技術は、合わさって、単一クローン性の実質的な保証をもたらすことができる、すなわち、ウェル／貯留容器あたり単細胞１つしかない。しかしながら、実施形態において、なおもさらなる保証が望ましく、これは、第１の段階に続く第２の選別段階を追加することによってもたらされるものとしてよい。理論上、第１の段階は、単一の生物学的実体／単細胞を含有する液滴のみが選択された放出チャネルに入ることを許すべきであるとしてもそうである。実施形態において、この第２の選別段階は、液滴分注器と効果的に組み合わされるものとしてよい、すなわち、分注器は、実施形態において、液滴１個あたり定められた数（または数値範囲）の生物学的実体を有する液滴をそれ自体選択するように構成され得る。したがって、液滴排出機構は、液滴が単一の生物学的実体のみ、またはより一般的には、定められた数もしくは数値範囲の生物学的実体を含有しているという確認に応じて、選択的であり得る。都合のよいことに、液滴１個あたりの実体の数／数値範囲の検出は、すでに説明されているように、選択された液滴の速度／位置を感知するために使用されるセンサによってなされるものとしてよい。このようにして、単一クローン性保証の極端に高い程度がもたらされ得る。

【0107】

本発明者らは、単一クローン性保証の特定の適用について説明したが、上で説明されている技術は、特に液滴１個あたりの単一の実体ではなく液滴１個あたりの定められた数の生物学的実体をターゲットとするように適合され得る。例として、たとえば哺乳類細胞ではなく細菌を含有する液滴を操作するときに、数値範囲はより適切であり、これは、液滴１個あたり数十個の有機体、たとえば、液滴１個あたりの２５〜３５個の実体を定め得る。

【0108】

技術のなおもさらなるアプリケーションにおいて、上で説明されている一般的な種類の微小流体カートリッジは、「融合アッセイ」または機能アッセイ動作モードを備えるものとしてよい。

【0109】

この動作モードを提供するために、微小流体カートリッジは、少なくとも２つの投入チャネルおよび少なくとも１つの放出チャネルを有する液滴融合領域を備え、選別領域への投入部とする（インキュベーション領域は、存在する場合に、選別領域の前または後のいずれかにあり得る）。当業者であれば、物理的融合技術および電界または他の界を採用して液滴融合を引き起こす技術を含む、マイクロドロップレットを融合させる多くの技術がある（いくつかの例は、本発明者らの以前の出願である特許文献１（参照により本明細書に組み込まれている）において説明されている）。大まかに言えば、液滴融合領域は、融合された液滴が組み合わされた実体の間の潜在的に希である相互作用に基づき選択され得るように選別領域の上流で生物学的実体を組み合わせるために使用される。以前に説明したように、融合されるべき液滴を含む２つ（またはそれ以上）のエマルジョンは、カートリッジ上で、またはカートリッジから離れて生成され得る。いくつかの好ましい実施形態において、そのようなシステムは、一方の生物学的実体が他方に耐性を示すときに非常に希な事例、潜在的に１００万分の１または１０億分の１の確率まで下がる事例を識別するために使用され得る。したがって、例は、ＨＩＶによる感染に耐性を示すＴ細胞または食細胞に耐性を示す細菌を含むものとしてよく、当業者であれば、システムの実施形態が他の類似の状況を識別するために使用され得ることを理解することが容易にできるであろう。ここでもまた、当業者であれば認識するであろうが、細胞選別は様々な物理的特性のうちのどれか、典型的には光学的特性に基づくものとしてよく、一アプローチでは、液滴内の実体が生きているか死んでいるかの決定が行われる。

【0110】

本発明者らは、２つの放出チャネルを有する選別領域を説明したが、原理上、３つ以上の放出チャネルが、たとえば、実体の混合集団を選別してグループまたはカテゴリに分けるために用意されてよい（複数のチャネルに選別することは、たとえば、電極対を使用して電界を印加し液滴を選択的に向き付けることによって達成され得る）。たとえば、発酵を意図した細胞の集団において、この集団は、選別されて高、中、および低の産生効率のグループに分けられてよく、たとえば、中産生効率を有する細胞は、その後、大規模発酵システムにおいてより頑丈であるため高い産生効率を有するものよりも望ましいという可能性もある。したがって、そのような配置構成において、放出チャネルのうちの１つまたは複数が選択された液滴の含有物を回収してさらなる処理／分析を行うために採用され得ることは理解されるであろう。

【0111】

カートリッジの実施形態において、使用時に、大まかに言って、サンプルおよび油がカートリッジの１つのエッジにある別個の殺菌済み貯留容器内に装填され（カートリッジは、垂直に、または好適な角度で装着される）、エマルジョンが生成される。エマルジョンは、ポンプでインキュベーションチャンバに送られ、そこで、液滴が上方へ浮遊し、過剰な油が廃棄される。次いで、インキュベーションチャンバは、たとえば、数分間から数時間の期間にわたって３７℃に加熱され、次いで、たとえば、約８℃まで冷却され、代謝を制限する。次いで、液滴集団は、選別領域に移動され（ポンプにより）、そこで、ターゲット液滴が選択され、そこから保持領域へ移動され、再び、過剰な油を取り除き（過剰分をサイホンで吸い上げるか、または廃棄させることができる）、次いで、液滴は保持領域から１つずつ放出され（追加の油が加えられてこのプロセスを円滑にする）、分注領域に移動され、そこで、液滴排出機構が選択された液滴を液滴用の共通または個別の貯留容器内に排出する。

【0112】

本発明者らは、特に液滴生成、液滴インキュベーション、液滴選別、液滴保持（「緩衝」）、および液滴分注のための、多数の液滴処理領域を有し得るカートリッジについて説明した。実施形態において、カートリッジはモジュール式のカートリッジであり、これらの機能の一部または全部を実行する別々のモジュールが望み通りに取り付けられ得る基部または基材を有する。これは、そのような配置構成のモジュール間の標準的なインターフェースまたは一組のインターフェースを有することによって円滑にされ得る。

【0113】

本発明の関係する態様において、液滴中に１つまたは複数のターゲット実体を供給するための微小流体システムが実現され、この微小流体システムは、前記液滴が前記１つまたは複数のターゲット実体を含有するかどうか、および前記１つまたは複数のターゲット実体の特性のうちの一方または両方を検出するための第１の検出器を備え、微小流体システムは、前記検出の結果に応じて前記液滴を選別するための選別デバイスと、１つまたは複数のターゲット位置で前記選別された液滴を分注するための液滴分注ユニットとをさらに備え、前記微小流体システムは、前記ターゲット位置を前記第１の検出器で検出された前記１つまたは複数のターゲット実体の前記特性と相関させるように構成される。

【0114】

これによって、液滴は、マイクロタイタープレートの個別のウェル内に、または別の培地上に分注され得る。液滴は、第１の検出器における検出結果に基づき分注され得るので、特定のターゲット位置（たとえば、マイクロタイタープレートのウェルであってよい）にある液滴は、全体としておよび／またはその構成要素（もしあれば）として液滴の特性に相関し得る。これらの特性は、限定はしないが、蛍光レベル、散乱発光レベル、吸光度レベル、伝導レベル、ならびに他の化学的および／または地理的特性のうちの１つまたは複数であってよい。

【0115】

したがって、たとえば、本発明者らが説明している方法／システムの実施形態は、本発明のこの態様および他の態様の両方に従って、どの液滴／貯留容器（たとえば、マルチウェルプレートのどのウェル）がどの特性を有するかを決定するために使用され得る。これは、どのようなアッセイまたは試験が微小流体システムによって実行されるかに特定の仕方で応じて細胞または生物学的実体を識別し、より具体的には、その試料を供給することができるように後で使用され得る（なぜなら、識別された特性を有するターゲット実体／液滴は識別されたウェル内に保持され、実施形態において、どの液滴／細胞／実体がどの貯留容器／ウェル内に分注されるかを示すログの記録が保持されるから）。

【0116】

代替的に、選別され分析された液滴は、単一の貯留容器内に分注され得る。

【0117】

液滴がどのターゲット位置に分注され得るかに関する決定が下され得る前に液滴および／またはその構成要素のさらなる分析を１回以上実行することが好ましい場合がある。

【0118】

したがって、好ましい一実施形態において、微小流体システムは、前記１つまたは複数のターゲット実体の前記特性を検出するための第２の検出器をさらに備え、前記液滴分注ユニットは、前記ターゲット位置を前記第２の検出器で検出された前記１つまたは複数のターゲット実体の前記特性と相関させるようにさらに構成される。

【0119】

これらの１回以上のさらなる分析は、これによって、たとえば、液滴中の１つまたは複数のターゲット実体、特に、特定の数値のターゲット実体を識別する確率、および／または特定の特性（たとえば、蛍光レベルの特定の範囲内にあり得る、特定の蛍光レベル）を有する１つまたは複数のターゲット実体を識別する確率を高め得る。

【0120】

微小流体システムのさらなる好ましい実施形態において、液滴分注ユニットは、前記液滴を第１の流体流路から第２の流体流路に移送するための第２の選別デバイスを備え、前記第２の選別デバイスは、前記液滴を前記第１の流体流路からデカップルするためのデカップラと、前記デカップルされた液滴を前記第２の流体流路に誘導するためのガイドとを備え、前記ガイドは、前記デカップルされた液滴を前記第２の流体流路に輸送するために回転されるように構成されている回転ユニット、および／または前記デカップルされた液滴を前記第２の流体流路に輸送するために並進方向に移動されるように構成されている並進ユニットを備える。

【0121】

第２の選別デバイスは、事前分析に基づき注目している液滴を分離するために使用され得る。したがって、分注された液滴が液滴中に１つまたは複数のターゲット実体、特に、特定の個数のターゲット実体を、および／または特定の特性を持つ１つまたは複数のターゲット実体を有する確率は、液滴を第１の流体流路から分離することによって高められ得る。

【0122】

微小流体システムのさらなる好ましい一実施形態において、液滴分注ユニットは、投入チャネルおよび複数の放出チャネルを備える微小流体チャネル接合部を具備し、前記液滴分注ユニットは、前記第１および／または第２の検出器を介して前記検出結果に基づき前記液滴が前記複数の放出チャネルのうちのどのチャネルに誘導されるかを制御するように構成される。

【0123】

したがって、好ましくは、注目していない液滴は、廃棄され得る。他の液滴は、液滴が第１および／または第２の検出器における以前の分析結果に基づき微小流体システムから分注される間にその構成要素（もしあれば）の特性に従って選別され得る。

【0124】

さらなる１つもしくは複数の検出器および／または分析器が微小流体システム内で活用されるものとしてよく、微小流体システムからの液滴の分注は、１つもしくは複数の検出器および／または分析器におけるこれらのさらなる分析のうちの１つまたは複数と相関し得ることは理解されるであろう。

【0125】

微小流体システムの好ましい一実施形態において、液滴分注ユニットは、前記液滴分注ユニットの流体流路内の圧力を変化させて前記液滴が前記複数の放出チャネルのうちのどれに誘導されるかを制御するための圧力変調ユニットを備える。たとえば異なる放出チャネルの間の圧力を変化させることによって、液滴は、液滴の以前の分析または検出結果に応じて特定の放出チャネルの方へ誘導され、この放出チャネルから分注され得る。

【0126】

代替的に、またはそれに加えて、液滴の分注元となる放出チャネルを制御するステップは、加熱装置を使用して液滴の温度を制御するステップ、圧電電極を使用するステップ、音響アクチュエータを使用するステップ、ならびに液滴の他の物理的および／または機械的特性を利用するステップのうちの１つまたは複数によって制御され得る。

【0127】

微小流体システムのさらなる好ましい実施形態において、第１の前記放出チャネルが、概ね前記投入チャネルの流体流路方向で前記投入チャネルに接続され、第２の前記放出チャネルは、前記投入チャネルから枝分かれし、前記液滴分注ユニットは、前記第２の放出チャネルに接続されているポンプをさらに備え、前記ポンプは、前記投入チャネルから前記液滴を吸い上げるように構成され、前記圧力変調ユニットは、前記第１および／または第２の検出器内の前記検出に応答して前記投入チャネル内の圧力を高めて、前記第１の放出チャネルを介して前記液滴を排出するように構成される。

【0128】

注目している液滴が検出された後、圧力は投入チャネル内で高められるものとしてよく、それにより、液滴は、第２の放出チャネル内にポンプで吸引される代わりに、第１の放出チャネルに送られる。

【0129】

代替的に、投入チャネルの圧力は、一般的に、液滴が投入チャネル内の圧力変化なしで第１の放出チャネルに送られるように閾値よりも高くしてよいことは理解されるであろう。注目している液滴が検出された後、投入チャネル内の圧力は、ターゲット液滴がポンプで第２の放出チャネル内に吸引されるように減じられ得る。

【0130】

好ましい一実施形態において、微小流体システムは、１つまたは複数の液滴保持領域をさらに備え、前記保持領域は、前記選別デバイスと前記液滴分注ユニットとの間に配置され、前記保持領域は、前記液滴分注ユニットへの前記選別された液滴の流れを制御するように構成される。この実施形態は、液滴分注ユニット内への液滴の流れのより精度の高い正確な制御を可能にする。

【0131】

さらなる好ましい一実施形態において、微小流体システムは、前記微小流体システムの異なる場所で（異なる時点に）前記液滴を検出して前記微小流体システム内の前記液滴の速度を決定するための複数のセンサをさらに備え、前記選別デバイスは、前記速度決定の結果に応じて前記液滴を選別するように構成される。これは、微小流体システム内の液滴の場所が決定され、および／または予測されるものとしてよく、選別デバイス内で液滴を選別するステップの制御を改善することを可能にするので特に有利であり得る。

【0132】

本発明のさらなる関係する態様において、微小流体チップが実現され、これは、１つまたは複数の生物学的実体を含有するマイクロドロップレットを生成するための液滴生成領域と、前記生物学的実体をインキュベートし、および／または貯蔵するための液滴インキュベータおよび／または貯蔵領域と、前記生物学的実体の１つまたは複数の特性に基づき前記マイクロドロップレットを選別するための液滴選別領域と、前記選別されたマイクロドロップレットを分注するための液滴分注領域とを備え、前記液滴生成領域、前記液滴インキュベータおよび／または貯蔵領域、前記液滴選別領域、および前記液滴分注領域は、前記微小流体チップの単一チップ設計上に組み込まれる。

【0133】

微小流体チップは、殺菌、使いやすさを確実にし、生成器、インキュベータ、選別チップ、および分注器が単一の微小流体チップに組み込まれるために著しいコスト削減をもたらし得る。

【0134】

好ましい一実施形態において、微小流体チップは、前記領域の間の前記マイクロドロップレットの微小流体流路を変更するための微小流体流路迂回ユニットと、前記微小流体流路迂回ユニットを制御するための第１のプロセッサを備える制御ユニットとを具備する。これは、微小流体チップの特定の１つまたは複数の部分、たとえば、インキュベーション領域は省かれ得るので好ましい場合があり、したがって、特定の１つまたは複数の液滴を処理するためには使用され得ない。

【0135】

様々な弁が微小流体チップ上に設けられるものとしてよく、これらは微小流体チップの異なる領域を通るマイクロドロップレットの流れまたは流量を制御することを可能にする。

【0136】

好ましい一実施形態において、微小流体チップは、液滴インキュベータおよび／または貯蔵領域で（および／または他の特定の領域で）液滴を局所的に加熱するための加熱装置をさらに備え、前記加熱装置を制御するための第２のプロセッサをさらに備える。第１および第２のプロセッサは、単一のプロセッサであってよい。したがって、実施形態は、有利には、微小流体チップの特定の場所または領域でのみ液滴およびその構成要素を加熱することを可能にするものとしてよく、したがって、微小流体チップの他の領域内の液滴の加熱は回避され得る。

【0137】

さらなる好ましい一実施形態において、微小流体チップは、液滴インキュベータおよび／または貯蔵領域で（および／または他の特定の領域で）液滴を局所的に冷却するための冷却装置をさらに備え、前記冷却装置を制御するための第３のプロセッサをさらに備える。第１、第２、および／または第３のプロセッサは、単一のプロセッサであってよい。したがって、実施形態は、有利には、微小流体チップの特定の場所または領域でのみ液滴およびその構成要素を冷却することを可能にするものとしてよく、したがって、微小流体チップの他の領域内の液滴の冷却は回避され得る。

【0138】

加熱（および適宜冷却）を行える実施形態は、微小流体チップの１つまたは複数の特定の領域で、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応を行わせることを可能にし得る。

【0139】

微小流体システム、液滴選別または分注デバイス、液滴分注器、微小流体デバイス、微小流体カートリッジ、マイクロドロップレット処理システム、および生物学的実体のマイクロドロップレットベースの処理のための器具に関して上で説明されている好ましい実施形態は、微小流体チップにおける好ましい実施形態としても実装され得る。

【0140】

マルチモード動作
別の態様において、本発明は、生物学的実体の微小流体液滴ベースの処理のための器具を実現し、この器具は、生物学的実体を含む液滴の１つまたは複数の油中水型エマルジョンを生成するための液滴生成システムと、前記液滴を処理するため液滴処理システムと、処理された前記液滴を１つまたは複数の貯留容器内に分注するための液滴分注システムとを備え、前記液滴処理システムは、少なくとも単一クローン性動作モードとアッセイ動作モードとを含む複数の異なる動作モードに対して構成可能である。

【0141】

実施形態において、液滴処理システムは、少なくとも液滴選別機能／ユニットを備え、単一クローン性動作モードは、生物学的実体による液滴の占有度に基づき液滴を選別することを含む。アッセイ動作モードは、選別の前に、液滴を、好ましくはただし本質的ではなく液滴インキュベーションユニット内で、インキュベートすることを含む。次いで、選別は、インキュベーション時に生物学的実体の産生物に基づくものとしてよい。液滴処理システムは、少なくとも１つの液滴融合ユニットをさらに備えるものとしてよく、次いで、動作モードは、融合アッセイモードを含むものとしてよく、一方の一組の液滴中の生物学的実体と第２の一組の液滴中の物質、たとえば、他の生物学的実体との組合せの結果に基づき選別を行う。実施形態において、液滴処理システムは、１つまたは複数の交換可能な、またはモジュール式カートリッジ内に具現化される、すなわち、たとえば、異なる動作モードの各々について異なるカートリッジが用意され得るか、または代替的に、選別機能、インキュベーション機能、分注機能、および同様のものなどの異なる液滴処理機能がカートリッジ基材上に選択的に組み立てられ得るモジュール式カートリッジが採用され得る。

【0142】

より詳細には、単一クローン性動作モードは、生物学的実体、典型的には細胞を、好ましくは空の液滴の大半に向けてバイアスされる方式で、液滴内にカプセル化することを含み得る。次いで選別ユニットにおいて単細胞によって占有されていると識別される液滴は、液滴分注ユニットへ選択的に向けられ、そこで、処理され分注される。実施形態において、単一の液滴が個別のウェルまたは貯留容器内に分注され得るが、２つ以上の液滴を貯留容器もしくはウェル内に分注することも許容可能であるものとしてよい。たとえば、実体または細胞がさらなる処理のために再注入されることになっている場合、ウェル／貯留容器は、より多くの液滴を保持し得る。

【0143】

アッセイモードでは、液滴１個あたり複数の実体／細胞、たとえば、液滴１個あたり２または３個の細胞をカプセル化することが許容可能であり得る。次いで、実施形態において、これらは、インキュベーションチャンバに送られ、そこで、温められ、代謝してタンパク質または同様のものなどの産生物を産生する。典型的には、産生物は、液滴内の１つまたは複数の試薬と反応して、測定可能な信号、たとえば、蛍光信号を発生し、次いで、これは液滴を選別し、たとえば最良の産生体を回収し、分注するために使用され得る。適宜、選別ユニットは、特にインキュベーション前に空の液滴を取り除くために、インキュベーション領域の前に設けられるものとしてよい。これは、インキュベーションチャンバの容積を減らすのに役立ち、液滴生成／実体カプセル化の結果、大きなパーセンテージの空の液滴が生じる場合に特に有益であり、使用されるプロセスによっては、液滴の９０％以上が空であり得る。

【0144】

安定性アッセイモードと称され得る、別のアッセイモードでは、類似のインキュベーション、選択、および分注プロセスが採用され得るが、初期集団のサブグループを識別することを目指している。そのようなサブグループは、たとえば薬剤生産のために、典型的にはタンパク質の最適な産生を示すサブグループであってよい。最適な産生は、必ずしも最大の産生である必要はないが、たとえば、安定した産生（時間とともに減衰するのではなく一定期間にわたって維持される産生）、または（広い）範囲の環境条件にわたって維持される産生であってよい。したがって、そのような安定性アッセイの実施形態は、安定した産生体である実体を識別する、たとえば、発酵プロセスなどの産生プロセス、または産生プロセスの品質管理のために産生体を選択するために採用され得る。実施形態において、実体は、液滴内に１つまたは複数の試薬とともにカプセル化され、次いでインキュベートされ、その後、蛍光信号などの測定可能な信号を探し、次いで、それを使用して、実体のターゲット部分集団を区別し、１つまたは複数の貯留容器における分注および回収を行うものとしてよい。

【0145】

さらなる一態様において、融合動作モードでは、典型的な手順は二組の液滴を生成するステップであって、少なくとも１つは生物学的実体をカプセル化する、ステップを伴い、これらは、予め生成され、それぞれの貯留容器内に用意され得るか、またはたとえば、オンカートリッジで生成され得る。次いで、融合アッセイは、液滴融合、インキュベーション、選別、および分注を含み得る。適宜、事前選別が、以前に説明されているようにインキュベーション前に、および／または液滴融合後に採用され得る。たとえば、毒物学的研究、環境研究、メタゲノム研究、薬物摂取の研究、または同様のもののために融合アッセイが採用され得る。たとえば、後者の場合には、薬物が知られている濃度で一組のマイクロドロップレットに入れて供給されるものとしてよく、次いで、薬物の濃度は、インキュベーション（離れた場所で、または一定分量を取ることによって）の後測定され、薬物摂取が推論され得る薬物の濃度の変化を決定するものとしてよい。

【0146】

上で説明されている動作モードの各々について、実施形態では、分注ユニットは、追加の選択ステップももたらし得る、すなわち、液滴分注システムは、液滴選別および分注の組み合わされた段階を備え得る。

【0147】

本発明のこれらおよび他の態様は、添付図面を参照しつつ、例のみを用いて、さらに説明される。

【図面の簡単な説明】

【0148】

【図1】本発明の実施形態による液滴の検出、選別、および分注を示す概略図である。

【図2】本発明の実施形態による液滴の検出、選別、および分注のさらなる例を示す概略図である。

【図3】本発明の実施形態による液滴の検出、選別、および分注のさらなる例を示す概略図である。

【図4a】本発明の実施形態による微小流体カートリッジを示す概略図である。

【図4b】本発明の実施形態による微小流体カートリッジを示す概略図である。

【図5a】本発明の実施形態によるデカップラおよび制御ユニットを示す概略図である。

【図5b】本発明の実施形態によるデカップラおよび制御ユニットを示す概略図である。

【図6】本発明の実施形態による流体流およびデカップラを示す概略図である。

【図7a】本発明の実施形態によるデカップラを示す概略図である。

【図7b】本発明の実施形態によるデカップラを示す概略図である。

【図7c】本発明の実施形態によるデカップラを示す概略図である。

【図8】本発明の実施形態による分注器を示す概略図である。

【図9】本発明の実施形態において使用するための例示的な液滴生成および選別システムを示す図である。

【図10a】本発明の実施形態によるさらなる微小流体カートリッジを示す概略図である。

【図10b】本発明の実施形態によるさらなる微小流体カートリッジを示す概略図である。

【図11a】本発明の一実施形態による液滴処理システムを制御するための例示的な制御システムを示す図である。

【図11b】本発明の一実施形態による液滴処理システムを制御するための例示的な制御システムを示す図である。

【図11c】本発明の一実施形態による液滴処理システムを制御するための例示的な制御システムを示す図である。

【図11d】本発明の一実施形態による液滴処理システムを制御するための例示的な制御システムを示す図である。

【図12】本発明の一実施形態による液滴処理システムの例示的な物理的構成を示す図である。

【図13】細胞分析に対するフェーズを示す概略図である。

【図14a】液滴の含有物を決定する方法の概略図である。

【図14b】液滴の含有物を決定する方法の概略図である。

【図15】ハイブリドーマ細胞によるピコドロップレット内の単一クローン性抗体を示す図である。

【図16a】チャイニーズハムスター卵巣細胞の集団を示す図である。

【図16b】チャイニーズハムスター卵巣細胞の集団を示す図である。

【図17】異なるピコドロップレットサイズに対する生存可能なＣＨＯ−Ｓ細胞のパーセンテージ対培養時間を示す図である。

【図18a】本発明の実施形態による、微小流体チップを示す概略図である。

【図18b】本発明の実施形態による、制御システムを示す概略ブロック図である。

【図19a】本発明の実施形態を使用するピコドロップレット内の単細胞の検出を示す概略図である。

【図19b】本発明の実施形態を使用するピコドロップレット内の単細胞の検出を示す概略図である。

【図19c】本発明の実施形態を使用するピコドロップレット内の単細胞の検出を示す概略図である。

【図20a】ピコドロップレットからの赤色および緑色蛍光の散布図の時間経過を示す図である。

【図20b】ピコドロップレットからの赤色および緑色蛍光の散布図の時間経過を示す図である。

【図20c】ピコドロップレットからの赤色および緑色蛍光の散布図の時間経過を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0149】

図１は、本明細書で説明されている実施形態による液滴の検出、選別、および分注の第１の例を示す概略図である。このモードは、この例では、単一クローン性保証モードと称される。

【0150】

この例では、複数の細胞が、適宜培養培地を含む流体、この例では水に入れられて用意される。第１のステップにおいて、個別の液滴が流体から形成される。上で概要を述べたように、これは、たとえば、Ｔ字接合部、Ｙ字接合部、流動集束デバイス、および他のデバイスを使用することによって達成され得る。生成されている液滴は、この例では、油の流体で輸送される。

【0151】

次いで、個別の液滴は、１つまたは複数の細胞を含有している場合も含有していない場合もあり、油エマルジョン内の微小流体デバイスを通して誘導される。

【0152】

この例では、ピコドロップレット細胞懸濁液、すなわち、油エマルジョン内の液滴は、検出および選別デバイスの方へ誘導される。単一の液滴が１つまたは複数の細胞を含有するかしないかは、液滴の電気的、光学的、熱的、音響的、機械的、時間的、空間的、および他の物理的特性のうちの１つまたは複数に基づき、分析器内で検出され得る。分析器における分析、すなわち、単一の液滴が１つまたは複数のターゲット細胞を含有するかどうかに関する決定に基づき、液滴は液滴選別デバイスにおいて選別され得る。この例では、１つまたは複数の細胞を含有しないピコドロップレットは廃棄される。さらに、この例では、注目している単細胞を含有する液滴は、微小流体システムのデカップラの方へ誘導される。

【0153】

次いで、注目している１つまたは複数の細胞を含有する液滴が、第１の流体流路から抽出され、第２の流体流路内に移送される。この例では、ターゲット液滴は、培養培地流体内の第１の流体流路から抽出される。ターゲット細胞を含有する液滴は、これにより培養培地流体に組み込まれるが、その後、加圧流体排出を介してマイクロタイタープレート内に分注される。圧力源は、この例では、培養培地流体が注入される流路に取り付けられる。ピコドロップレットは、これにより希釈され得る。この例では、液滴をマイクロタイタープレートの異なるウェル内に分注するためにロボットｘｙ並進運動段階が用意される。

【0154】

液滴検出、選別、および細胞分注は、この例では、温度制御環境において実行される。

【0155】

この例では、単細胞を含有し、マイクロタイタープレート内に配設されるべきでないピコドロップレットは、第１の流体流路内で誘導され廃棄される。

【0156】

上で概要を述べたように、マイクロタイタープレート内に配設されている単一の液滴中で単細胞を見つける確率は、９９．９９７％を超える高さであり得る。

【0157】

図１の例では、自動化されたプレートスタッカーインターフェースが用意され、様々なマイクロタイタープレートを次々に積み重ねるものとしてよい。

【0158】

図１のシステムの、および同様に後で説明されるシステムの、いくつかの好ましい実装形態において、液滴が（マイクロタイタープレート内に）分注される地点に、またはその近くにカメラなどの撮像デバイスが設けられる。撮像デバイスは、液滴を撮像して、液滴が単細胞（または他の生物学的実体）だけを含有するか、または代替的に２つ以上の細胞を含有するか、または細胞を全く含有しないかを決定し得る。他のアプローチでは、液滴からの散乱の光学的検出がこの目的のために行われ得る。そのような光学的システムは、単一クローン性を監視するためのツールとして、より具体的には制御システムと併せて使用されてよく、これにより、ウェルが単細胞だけを含有しないとき（またはその逆）を識別し、ログに記録し、たとえば、その後、システムは識別されたウェルに対してエラーのフラグを立てるものとしてよい。

【0159】

図２は、本明細書で説明されている実施形態による液滴の検出、選別、および分注のさらなる例を示す概略図である。２つの異なる動作モード、すなわち、直接アッセイモードと安定性試験モードが表示される。

【0160】

この例では、細胞は、アッセイ試薬と一緒に流体に入れて用意される。次いで、個別の液滴が、図１に示されている例で概要が述べられているように流体から形成される。

【0161】

次いで、細胞およびアッセイ試薬を含有する流体から調製された液滴が、インキュベータ内に誘導される。インキュベータは、液滴内の細胞を培養し、および／または維持するために使用され得る。上で概要を述べたように、インキュベータは、インキュベーション時に細胞に対して安定性試験を実行することを可能にする安定性試験ユニットを備え得る。単一の液滴中の細胞に対して安定性試験を実行することで、分析器および液滴選別デバイスにおいて検出および選別ステップで生存可能な細胞のみを選別することを可能にするが、これらは安定性試験の際に低下した、または死んでいる、ということがない。

【0162】

液滴の含有物を決定し、決定に基づき液滴を選別し、デカップラ内の注目している液滴を潜在的に抽出するさらなるステップが、図１の概略図に関して概要が示されているように実行される。

【0163】

図３は、本明細書で説明されている実施形態による液滴の検出、選別、および分注のさらなる例を示す概略図である。このモードは、この例では、ピコドロップレット融合アッセイモードと称される。

【0164】

この例では、ピコドロップレット融合アッセイモードが図示されている。第１の細胞種類Ａは、第１の流体中に用意される。次いで、個別の液滴が、この第１の流体から形成される。第２の細胞種類Ｂが第２の流体中に用意され、そこから個別の液滴が形成される。第１の流体から調製された液滴、さらには第２の流体から調製された液滴は、融合デバイス（図３の電極）の方へ誘導される。この例では、第１および第２の流体からの２つの液滴は、それぞれ、電気合体によって調製される。融合された液滴は、図１および／または図２の概略図に示されているようにさらに処理され得る。

【0165】

上で概要を述べたように、液滴融合デバイスは、たとえば、微小流体システムの流体流方向で分析器および液滴選別デバイスの背後に留置されてよい。そのような構成は、この例では、培養および／またはさらなる分析と処理のために注目している細胞を含有すると決定された液滴についてのみ液滴融合デバイス内で液滴を融合させることを可能にし得る。

【0166】

次に図４ａを参照すると、これは、本発明の一実施形態による（使い捨て）微小流体カートリッジ４１０を組み込んだマイクロドロップレット処理システム／器具４００の一実施形態のブロック図を示している。器具４００は、一般的に培養培地を含む、水媒体を保持する貯留容器４０２を有し、その中に、哺乳類細胞、細菌、または同様のものなどの生物学的実体が処理のために保持される。一組の貯留容器４０４ａ〜ｄは、システムの様々な段階においてエマルジョンを形成するための油を保持する。貯留容器４０２、４０４は、カートリッジの一部ではなく器具の一部として示されているが、カートリッジの一部であり得る他の実施形態では（後で図１０ａに示されているように）、カートリッジの機能に応じて、たとえば、融合または機能アッセイに使用されるべきかどうかに応じて、複数の水貯留容器４０２があり得る。貯留容器４０２、４０４からの流体は、流体駆動モジュール４０６によって示されている図４ａのそれぞれのポンプによって汲み上げられ、これはここでもまたカートリッジと一体化され得る。図１２を参照しつつ後からも示されているように、カートリッジが器具内に挿入されたときに、一組の流体流管路４０８がカートリッジ上のそれぞれのポートに接続する。

【0167】

図示されているカートリッジ４１０は、液滴生成領域４１２、液滴インキュベーション／貯蔵領域４１４、液滴選別領域４１６、流れ緩衝領域４１８、および液滴分注器４２０を備える。カートリッジの実施形態において、これらの領域の各々はモジュール式であり、エマルジョン流処理構成は、カートリッジ基部またはホルダに取り付けるモジュールを選択することによって選択されるものとしてよく、これにより、選択されたモジュールは互いに接合し、特定のカートリッジに対する所望の機能を実行する。

【0168】

図４ａにおいて、小さい方の円形領域は、カートリッジ構成に応じて、オンカートリッジまたはオフカートリッジ接続を表し得る液滴処理領域に対する投入／放出ポートを表し、大きい方の円形領域は、光学的液滴感知領域を表し、十字付き円は弁を表す。

【0169】

実施形態において、カートリッジの液滴生成モジュールまたは領域４１２は、エマルジョンを生成するための水性試料投入部４２２と油投入部４２４とを備える。これらの液体の流れは、流れ集束接合部４２６に送られ、そこで、エマルジョンが生成され、領域の放出チャネル４２８に送られる。例として、いくつかの例示的な数を挙げると、生成油は、毎時１４００μｌの流量を有するものとしてよく、試料、たとえば、細胞懸濁液は、毎時１０００μｌの流量を有するものとしてよく、放出チャネル内の油中水型エマルジョンは、１０００Ｈｚで７００ピコリットルの液滴を含み毎時２４００μｌの流量を有するものとしてよい。

【0170】

次いで、エマルジョン（代替的に、オフカートリッジで作製され、貯留容器に加えられ得る）は、この例では、インキュベート／貯蔵領域４１４に送られる。これは貯蔵チャンバ４３０を備え、その中で個別の液滴４３２が上方へ浮遊し、過剰な油はチャネル４３４を通して（弁を介して）流れて貯留容器４３６内に廃棄され、そこから潜在的に油はリサイクルされ得る。実施形態において、油はフルオラス油を含み、これは、チャンバ４３０内に貯蔵されている間に液滴中の、たとえば、細胞などの生物学的実体の成長促進をたとえば可能にする酸素を捕捉するのに特に適している。したがって、チャンバ４３０は、閾値を超える（たとえば、チャンバ４３０の容積の５０％、またはそれを超える）フルオラス油を充填されてよく、それにより、特定の期間にわたって液滴中の実体に十分な酸素が供給され得る。実施形態において、カートリッジが配置される器具は、インキュベーションチャンバ４３０に隣接して、好ましくは温度制御用の温度センサと一緒に、ヒータープレートなどの加熱デバイスおよび／またはペルチェ効果素子などの冷却デバイスを備える。このようにして、チャンバは、液滴の含有物をインキュベートするために制御された期間の間加熱され、次いで、インキュベーションを実質的に阻止するように冷却され得る。インキュベーションチャンバは、チャンバ４３０から外に供給されるときに放出部内のエマルジョン中で液滴の間隔をあけるためのスペーシングオイル（spacing oil）を受け入れるオプションの側部チャネル４４０を備える放出チャネル４３８を有す。引き続き前の数値例において、２００，０００個程度の液滴が０．２２ｍｌの容積中に貯蔵され、２兆個よりも少し下回る個数の液滴が２．２ｍｌ程度の容積中に貯蔵され（６７％の充填を仮定する）、したがって、２．２ｍｌ程度の油が廃棄され得る（それらの液滴がチャンバをすでに満たしている油を追い出したため）。インキュベーション領域からの放出チャネル４３８は、毎時３５０μｌ程度の流量を有するものとしてよく、スペーシングオイルがポート４４０のところに、またはその後の選別領域（この後を参照）内に毎時８，０００〜１１，０００μｌ程度の流量で追加されてよい。

【0171】

選別領域４１６は、この実施形態における投入チャネル４４２として、インキュベーション領域の放出チャネル４３８、および一対の放出チャネル４４４、４４６に結合され、チャネル４４４は選択されたターゲット検体（１つまたは複数の実体）の装填とともに望ましい液滴を含む。チャネル４４６は、廃棄物貯留容器４３６につながっている。適宜、投入部４４８は、選別領域内への流れにスペーシングオイルを追加するために設けられている。選別領域は、液滴含有物が（光学的に）カートリッジを保持する器具によって問い合わせがなされ、次いで電極４５２を駆動して液滴をチャネル４４４またはチャネル４４６のいずれかに選択的に向ける、領域４５０を含む（電極４５２への接続部は、簡単にするために図４ａに示されていない）。引き続き前の数値例において、選別領域４１６に対する投入エマルジョン内の液滴のマーク：スペース比は１：１０から１：２０のオーダーであってよく、液滴は、数１００Ｈｚの速度で選別領域に入るものとしてよい。チャネル４４４内の流量は、１，０００から１０，０００個の間の液滴を含む、毎時５，０００μｌのオーダーであってよく、チャネル４４６内のエマルジョンの流量は、実質的に同じであってよいが、このエマルジョンは（毎時）１９０，０００〜２，０００，０００個のオーダーの液滴を含み得る。

【0172】

選別領域の「ターゲット」放出チャネル４４４は、スペース／保持または「流れ緩衝」領域４１８の投入チャネル４５４に結合される。これは、典型的にはインキュベーションチャンバ４３０よりもいくらか小さい、チャンバ４５６を備え、この中に、放出チャネル４５８内に放出される前に液滴が一時的に保持される（たとえば、チャンバの頂部に浮遊している）。実施形態において、油はフルオラス油を含み、これは、チャンバ４５６内に貯蔵されている間に液滴中の、たとえば、細胞などの生物学的実体の成長促進をたとえば可能にする酸素を捕捉するのに特に適している。したがって、チャンバ４５６は、閾値を超える（たとえば、チャンバ４５６の容積の５０％、またはそれを超える）フルオラス油を充填されてよく、それにより、特定の期間にわたって液滴中の実体に十分な酸素が供給され得る。チャンバ４５６からの放出は、投入チャネル４６０を介してスペーシングオイルを加えることによって円滑にされる。インキュベーション領域と同様に、流れ緩衝領域も、廃棄物貯留容器４３６への放出チャネル４６２を備える。数値例を用いると、容積１０ｍｌのチャンバ４５６は、１０，０００個の液滴を保持し得る。チャネル４５８内の放出流量は、毎時４μｌのオーダーであってよく、チャネル４６０内のスペーシングオイルは、毎時５，０００μｌで流れるものとしてよく、チャネル４６２内の廃棄物は、たとえば毎時１０〜５，０００μｌの様々な流量で流れ得る。

【0173】

例示されている実施形態において、流れ緩衝領域４１８の放出チャネル４５８は、液滴分注器領域４２０へのチャネル４６４を介して投入部を備える。分注器の例示されている実施形態において、チャネル４６６は、溶離液、すなわち、ターゲット液滴の抽出および排出に／そのために使用される油を入れた分注器への第２の投入部を備える。

【0174】

分注器は、再び流れて廃棄する第１の放出チャネル４６８と、選択された液滴を排出して貯留容器内に回収するための分注器用の放出部４７２を備える第２の放出チャネル４７０とを有する。さらなるチャネル４７６が投入部４７８に結合されており、この例では、たとえば、０〜２．５ｂａｒの範囲内の圧力の圧縮空気を受け入れる。このようにして、圧力パルスが放出チャネル４７０内を流れるエマルジョンに印加され（弁４７７を閉じた後）、選択されたターゲット液滴４８２を含むエマルジョン４８０のスラグを排出し、マルチウェル貯留容器４８４内に回収することができる。例示されている実施形態において、分注器４２０は液滴を分注器放出チャネル４７０とリンクする流体流にまたは廃棄物チャネル４６８とリンクする流体流に選択的に向き付けるために使用され得る回転弁４７４を有する。

【0175】

適宜、分注器４２０は、４８６用の１つまたは複数の液滴感知領域を備え得る。これらは、液滴が流れの中にいつ存在しているかを識別し、エマルジョンスラグ４８０を排出するために液滴排出のタイミングをしかるべく制御するために使用され得る。それに加えて、または代替的に、これらの感知領域のうちの１つまたは複数は、ターゲット液滴の含有物を感知するために使用されてよく、実施形態において、この感知は、さらなるレベルの選択を排出される液滴に適用し、たとえば、液滴４８２の含有物の単一クローン性のさらなる保証を行うか、または液滴含有物または液滴４８２内の多数のまたは数値範囲の個数の実体に対する何らかのさらなる選択性をもたらすために使用され得る。

【0176】

実施形態において、マルチウェルプレート４８４は、適宜水性（培養）培地４９０が用意され得る複数のウェル４８８を備え得る。実施形態において、マルチウェルプレート４８４は、各ウェルが単一の液滴だけを含むエマルジョンのただ１つのスラグを受け入れるように、たとえば、Ｘ−Ｙステージ（図示せず）によって移動される。さらに、実施形態において、図４ａのシステムを制御する器具は、選別器内の、液滴、より具体的には液滴の含有物のいずれかの特性を感知する（または液滴が緩衝領域を通過する際に容易に追跡されない場合は、分注器において後で）。したがって、ログが生成されて記憶され、それぞれのウェル内の各液滴の１つまたは複数の特性、たとえば、蛍光または同様のものを定めるものとしてよい。このようにして、注目している１つまたは複数の特性を有する少数の、または個別の単一の実体が、さらなる研究または使用のために、たとえば、分析、抗体作製、発酵、または同様の工程のために選択され得る。

【0177】

様々なセンサが、たとえば、マイクロドロップレット処理システム／器具４００の領域４１４、４１６、および４２０において使用されてよく、これは液滴の検出を可能にする。これらのセンサは、光学的センサおよび／または電気的センサであってよい。電気的センサは、液滴中に細胞が存在する場合に、絶縁細胞は、液滴の電気的特性に影響を及ぼし、したがってキャパシタンス測定は細胞を貯蔵する液滴が存在するかどうかに関する検出を可能にするという事実を使用し得る。キャパシタンス測定を使用することで、液滴のサイズがさらに決定され得る。当業者は、液滴および／または液滴構成要素を検出するための代替的方法および技術に精通しているであろう。

【0178】

センサは、液滴をカウントするために使用されるものとしてよく、複数のセンサを順に設けることによって、処理システム／器具を通って流れる液滴の速度が決定され得る。これは、たとえば、適切な時点において液滴の選別を活性化することを可能にする。これは、特定の時刻においてのみ液滴選別を可能にするユニットが活性化される必要があり得るので液滴処理システムまたは微小流体チップをより効率的にし得る。

【0179】

いくつかの例において、流れ方向で選別接合部の背後にさらなるセンサが設けられる。さらなるセンサは、さらなるセンサによる液滴の検出結果を選別接合部から上流のセンサからの検出データと比較することにより、および決定された速度データに基づき、液滴が正しい流路／チャネルに選別されているかどうかをダブルチェックするために使用され得る。液滴が正しく選別されていなかった場合、さらに複数の流路／チャネルの間で前に選別された液滴を選別することによって選別接合部から下流でさらなるアクションが実行されてよい。

【0180】

次に図４ｂを参照すると、これは、マイクロドロップレット処理システム／器具４００’の別の実施形態を示しており、そこでは前に説明したのと類似している要素は、類似の参照番号によって指示されている。図４ｂの配置構成は、以前に説明したカートリッジとは部分的にまたはさらには完全に別に、たとえば、器具内のリンクされているモジュール上に実装されてよい。図４ｂの配置構成の好ましい一実装形態は、「半モジュール式」カートリッジとしてのものであり、オフボードの液滴生成およびオフボードの液滴選別がなされるが、オンボードの液滴インキュベーション／貯蔵および分注が行われる。以前に、十字付き円が弁を示していたように、図４ｂの変更形態では、２つの流れ緩衝領域が図示されている。当業者であれば、複数の異なるシステムが要求条件に従って異なる機能を持つように組み立てられ得ることを理解するであろう。

【0181】

次に、器具の好ましい実施形態において使用される光学システムのうちのいくつかについて、図４ｂを参照しつつ説明され、類似の光学システムは、図４ａの配置構成とともに使用されてよく、アプリケーションによっては、説明可能なシステムのすべてが必要であるとは限らないことは理解されるであろう。したがって、図４ｂの配置構成では、液滴のサイズを決めるために光学システムによって第１の光学的感知領域４９１が使用され、光学的診断目的のために第２の光学的感知領域４９２が使用される。光学的細胞検出および選別のために（たとえば、液滴内の細胞を撮像することによって）第３の光学的感知領域４９３が使用され、選別後診断のために第４の光学的感知領域４９４が使用され得る。光学的感知領域４９５は、同様に、診断目的に使用されてよく、光学的感知領域４９６は、計時目的に使用されてよく（たとえば、分注器に対して液滴位置／速度／時刻を確立する）、液滴光学感知領域４９７は、液滴含有物（細胞）検出、たとえば、（選択的）分注で使用するために使用されてよい。図４ｂの器具内の分注領域４２０’は、以下で図８を参照しつつ説明されている種類の分注器を備え得る。

【0182】

図５ａは、本明細書で説明され得る実施形態によるデカップラ５００の概略図を示しており、それによって、液滴は液滴を第１の流体流路から第２の流体流路（チャネル）５０４に移送することによって第１の流体流路（チャネル）５０２から抽出され得る。

【0183】

この例では、個別の液滴は、油中水型エマルジョン中の第１のチャネル５０２でデカップラの方へ誘導される。注目している液滴がデカップラに入った後、デカップラの回転ユニット５０６が、注目している液滴がデバイスの第１のチャネルから第２のチャネル５０４内に移送されるように回転され得る。次いで、第２のチャネル内で流れる油は、液滴を第２のチャネルの放出部５０８に誘導し得る。液滴がデバイスの第２のチャネル５０４内に入った後、これは、第１のチャネルからデカップルされ、次いで、圧力が好ましくは第２のチャネルに印加され、放出部５０８から選択された液滴を排出する。

【0184】

デカップラは、たとえば、微小流体チップ上で使用され、注目しているピコドロップレットまたは他の集塊（たとえば、細胞、細菌、および他のもの）を含む流体の集塊（エマルジョンのスラグ）を分離し、流体のこの集塊を第１の流体流路から第２の流体流路へ並進運動させるものとしてよく、そこから、液滴はその後微小流体チップから分注され得る。

【0185】

この例において、回転ユニットを備えるデカップラは、微小流体チャネル網内の第１の流体流路に大きな途絶を引き起こすことなく流体塊の正確な捕捉および分離を可能にする。デカップラは、オフチップの分注機構のデカップルをさらに可能にし、分離された流体塊のチップからの正確で迅速な排除を確実にする、この例では、デカップラの回転ユニットは、最大５Ｈｚまたはそれを超える速度で動作し得る（実施形態ではマイクロタイタープレートのステップ移動の速度によって制限される）。

【0186】

図５ａに示されているようなデカップラは、液滴分注器の一部を形成し得る。一アプローチでは、図示されているように、排出について選択された液滴は、チャネル５０２からチャネル５０４へ移送され、次いで、空気圧などの圧力がチャネル５０４に印加されて液滴（エマルジョンのスラグ内の）を排出し得る。液滴が望ましくない／排出されるべきでない場合、これはチャネル５０２内に残されるものとしてよく、廃棄される。代替的に、チャネル５０４は廃棄され、望ましくない液滴はチャネル５０３からチャネル５０４に移送されるものとしてよく、次いで、排出する液滴が、ここもまた、空気圧または同様のものによって、チャネル５０２の開口から排出され得る。

【0187】

図５ｂは、デカップラに対する例示的な制御ユニットのブロック図を示している。制御ユニット５００は、この例では、液滴の含有物およびその物理的特性を検出するために使用され得る、検出器５０２を備える。検出器５０２、さらには制御ユニット５００の他のユニットは、バス５０４を介して互いに接続される。

【0188】

プロセッサ５０６は、検出器５０２から取得される信号を処理するように構成される。オペレーティングシステム／ソフトウェア５０８が制御ユニット５００内に備えられ、プロセッサ５０６内で処理され、検出器５０２を介して取得される信号に適用されものとしてよく、この例では、液滴中の細胞の構成要素およびその物理的特性を決定する。オペレーティングシステム／ソフトウェア５０８は、メモリ５１２に記憶され得る。

【0189】

検出器５０２からプロセッサ５０６に供給される信号の結果に応じて、信号がデカップラ５１０に送られるものとしてよい。信号は、この例では、デカップラ５１０の回転ユニットを制御するために使用され、それによって、第１の流体流路内の液滴を維持するか、または液滴を第１の流体流路から第２の流体流路に移送する。

【0190】

たとえば、分析された液滴の構成要素、第１の流体流路から第２の流体流路に移送された液滴の数に関する情報、および他の情報は、メモリ５１２と一体であってよい、メモリに記憶されてよい。

【0191】

図６は、本明細書で説明されている実施形態による例示的な流体流およびデカップラを示す概略図である。これからわかるように、注目している試料は、容器、たとえば、微小流体デバイスに貯蔵され得る流体に入れて用意される。ピコドロップレットは、上で概要を述べたように一般的に流体から調製され得る。この例では、溶離液および希釈液用に、さらなる容器が用意される。油貯留容器は、油の流れが１つまたは複数の実体を含有する水滴を誘導してデバイスに通すことを可能にし得る。

【0192】

この例では、溶離液容器、希釈液（油）容器、および試料流体容器の各々は、微小流体チャネルによってデカップラの異なる投入部に接続されている。液滴がデカップラ投入部に入った後、液滴は、デカップラチャネル網を介して、この例では、回転ユニットへ誘導されてよい。次いで、液滴は、回転ユニットを回転させることによって一方のチャネルから他方のチャネルへ移送され得る。

【0193】

この例では、回転ユニットを回転させるために、回転ソレノイドが使用される。回転ユニットは、図５ｂに関して上で概要を述べたように制御され得る。

【0194】

液滴がデカップラの特定の放出部から出ると決定された後、液滴は、デカップラまたは微小流体デバイスまたはチップから分注され得る。この例では、ｘｙステージが設けられ、ｘｙ平面内の所望の場所の液滴を、たとえば、マイクロタイタープレートまたは他のフォーマット内に分注する。さらに、空気圧式流量制限器が設けられ、デバイスから液滴を分注する際の流量をより正確に制御し得る。熱電対が、この例では、デカップラの放出部と空気圧式流量制限器との間のチャネルに接続される。１つまたは複数のノズルが、デカップラの放出部に設けられ得る。この例では、追加の高速ソレノイド弁が、液滴の分注を制御するために設けられる。

【0195】

図６の例示的なデバイスにおいて、加圧流体排出を介してデバイスから液滴を分注することを可能にする高圧ユニットが装備される。高圧ユニットは、この例では、圧縮ガス容器、チャネル網内の圧力を調整するための様々な圧力調整器、および圧縮ガス容器および調整器を圧力センサと接続するＴ字接合部を備える。代替的構成は、加圧流体排出を介して液滴を排出するためにチャネル網内の圧力を制御することを可能にし得ることは理解されるであろう。

【0196】

この例では、廃棄物容器が、液滴選別デバイスの放出部に接続されている。注目していない実体を含有するか、または実体を全く含有していない液滴は、廃棄され得る。

【0197】

図６に示されているデカップラの投入部のどれかが、放出部として使用され、またその逆もあり得ることは理解されるであろう。

【0198】

図７は、本明細書で説明されている実施形態によるデカップラを示す概略図である。

【0199】

図７ａは、例示的なデカップラの概略上面図である。これからわかるように、様々な投入部がデカップラに設けられている。投入部は、デカップラの回転ユニットにチャネルを介して接続される。回転ユニットは、デバイスから液滴が分注され得るデカップラの放出部にチャネル網を介してさらに接続される。

【0200】

図７ｂは、デカップラの回転ユニットの概略側面図である。回転ユニットの寸法は、単なる例にすぎないことは理解されるであろう。回転ユニットは、液滴が回転ユニットに入り、および／または出る開口部（図７ｂのＤ）を備え得る。

【0201】

図７ｃは、回転ユニットを備えるデカップラの概略斜視図である。この例では、４つの投入部および１つの放出部が設けられている。しかしながら、上で概要を述べたように、デバイスの特定の要求条件に応じて、これらの投入部は各々、放出部としても使用されてよく、放出部は、等しく、投入部として使用されてよい。

【0202】

次に図８を参照すると、これは、液滴分注器８００の例示的な一実施形態を示している。これは、共有チャネル（流れ）部分８０８を有する投入チャネル８０２と第１の放出チャネル８０４および第２の放出チャネル８０６とを備える。チャネル８０４は、液滴８１４を含むエマルジョン８１２のスラグを分注するために放出部のところにノズル８１０を備える。チャネル８０６は、吸引の下で実施形態において、廃棄に進む。分注器は、また、加圧空気源のための空気投入部８１６を有する。投入チャネル８０２は、間隔を置いて液滴８２０とともに油供給物８１８を受け入れる。投入チャネル８０２は、フィード弁８２２を備え、廃棄物放出チャネル８０６は、遮断弁８２４を備え、空気供給投入部８１６は、空気弁８２６を備える。図の例では、領域８２８は、光学的液滴検出領域を画成する。空気投入部８１６とチャネル８０６との間の分離８３０は、２つの放出チャネル８０４、８０６の間の共有流路の長さを定め、エマルジョン８１２の排出されるスラグの長さを定める。

【0203】

液滴を伴わない油、または望ましくない液滴を伴う油が分注器を通過しているときに、フィード弁８２２が開き、遮断弁８２４が開き、投入流体流が共有チャネル領域８０８に沿って通り、チャネル８０６に吸い込まれて廃棄される。分注する液滴がチャネル８０８内で検出されたときに、弁８２２および８２４は遮断され、空気弁８２６は開かれて、液滴８１４を含むエマルジョン８１２のスラグをチャネル８０８から放出チャネル８０４に沿って排出され、ノズル挿入部８１０を介して出される。液滴検出が上流で実行されるシステムにおいて分注する液滴がチャネル８０８内に存在すると予測されるときに対応する手順が実行され得る。

【0204】

実施形態において、ノズルは、エマルジョンのスラグ、より具体的には液滴をバラバラにするような形状をとり、および／または類似の目的のためにメッシュを備えるものとしてよく、スラグ／液滴が水媒体を含むウェル内に分注されたときに、液滴含有物は上に浮遊するのではなくウェルの水媒体内へ遊離する。適宜、ノズル８１０は、類似の目的のための他の手段を装備してよく、たとえば、電界を発生させるための１つまたは複数の電極、および／または抗乳化剤を運ぶ追加のチャネルを装備し得る。

【0205】

液滴が液滴分注器８００内に流れ込む流量を制御するために流量制御ユニットが適宜備えられるものとしてよい。流量制御ユニットは、液滴分注器８００の前にある保持チャンバに結合されてよく、これは液滴を液滴分注器に定められた流量で供給することを可能にする。

【0206】

いくつかの実施形態において、チャネル８０６は、チャネル８０４に比べて幅広であり、そのため、廃棄物チャネル８０６の方への液滴のバイアスが発生する。これは、液滴分注器８００が組み込まれている微小流体システムまたはチップが垂直配向で使用される実施形態において特に有用であるものとしてよく、水性液滴はシステムまたはチップの頂部の方へ流れる傾向を有する。したがって、システムまたは微小流体チップが垂直に使用される実施形態において、チャネル８０６は、好ましくは、液滴分注器８００の上側部に配置される。

【0207】

図９は、本発明の実施形態において使用するための例示的な液滴生成および選別システムを示す。したがって、図９は、以前に説明された液滴生成および選別機能を実装するためにカートリッジ上に実装され得るシステムの一例を示している。液滴の構成要素（もしあれば）が、たとえば、図１４ａおよび図１４ｂに関して概要を説明したように分析された後、液滴は、この分析結果に基づき、この例では、電極（差し込み図中黒色で示されている）を使用して電界を印加することによって選別され得る。液滴選別は、この例では、液滴の双極子モーメントに基づいており、それによって、液滴はその構成要素に応じて異なる電気力の作用を受ける。

【0208】

図１０ａは、試料／油貯留容器がカートリッジ内に組み立てられる本発明の一実施形態による液滴処理カートリッジ１０００の斜視図を示している。例示されているように、カートリッジは、カートリッジの弁を作動させるための領域１００２、選別領域のための電気的接続部１００４、および分注ノズル１００６（示されている斜視図では隠されている）を備える。

【0209】

図１０ｂは、本発明の一実施形態によるモジュール式カートリッジ１０５０の上から見た図を示している。例示されているモジュール式実装形態は、液滴生成モジュール１０５２、液滴インキュベーション／貯蔵モジュール１０５４、液滴選別モジュール１０５６、液滴／保持（流れ緩衝）領域１０５８、および液滴分注領域１０６０を備える。図は、モジュール間のオンカートリッジ接続部１０６２（「マニホールドチャネル」）、さらには例示的な弁１０６４およびデータム配置ビン（datum location bin）１０６６の配置も示している。実施形態において、チャネル１０６２は、ガスケットが設けられているカートリッジのベースプレート内に画成され、次いで、モジュール式液滴処理領域１０５２〜１０６０は、好ましくはデータムピン１０６６によって配置される、ガスケットの上に別個のプレートを取り付けることによって実装される。

【0210】

次に図１１を参照すると、これは本発明の一実施形態によるマイクロドロップレット処理器具用の制御システムの態様を示している。制御システムは、以下でさらに説明されているように、様々なセンサおよびアクチュエータを備えた汎用または専用コンピュータ上に実装され得る。

【0211】

したがって、図１１ａを参照すると、これは、試料１１０４および油１１０６に対するセンサに結合され、エマルジョン生成を制御する弁１１０８を制御するための制御コンピュータシステム１１０２を備える液滴生成制御システム１１００を示している。コントローラ１１０２は、インテリジェント型カメラ１１１０、すなわち、オンボード処理機能を有するカメラにも結合される。しかしながら、代替的に、カメラにおいて示されている処理は、コントローラ１１０２によって実装され得ること、および逆も同様に、原理上、コントローラ１１０２の機能は、カメラ１１１０上に実装され得ることは理解されるであろう。インテリジェント型カメラは、照明１１１４、たとえば、発光ダイオード（ＬＥＤ）照明を制御する画像キャプチャシステム１１１２を備える。画像キャプチャモジュール１１１２は、画像をキャプチャするためのカメラ（図示せず）も備える。キャプチャされた画像は、ポンプ１１２０、１１２２を制御して試料および油の流量を制御しエマルジョン形成を制御するための制御ループ１１１８を実装する、液滴サイズ制御手順１１１６によって処理される。

【0212】

図１１ｂは、この例ではＰＩＤ（比例積分微分）コントローラ１１３２に結合されている、この例では同じコントローラ１１０２を使用する、温度制御システム１１３０を示している。これは１つのまたは複数の制御ループを実装するものとしてよく、各々のループは温度センサ１１３４および温度制御デバイス、たとえば、加熱装置（図示せず）および／またはペルチェ効果素子１１３６などの冷却デバイスを備える。適宜、他のセンサ／制御も実装され得る。

【0213】

いくつかの実施形態において、システム全体または微小流体チップを加熱し、冷却することを可能にする加熱／冷却ユニットが備えられ得る。加熱および冷却は、いくつかの領域、たとえば、微小流体チップのみの特定の領域内で局所的に実行されてよい。たとえば、加熱および冷却は、システムまたは微小流体チップのインキュベータのところで行われてよい。いくつかの実施形態において、システムまたは微小流体チップの温度は、８〜１０℃に設定される。次いで、加熱／冷却ユニットは、たとえば、インキュベータ内で温度を３７℃まで上げるために使用されてよく、温度は、その後、８〜１０℃の温度まで下げられ、たとえば、液滴中に貯蔵されている細胞または他の実体の生物学的活動を停止させるものとしてよい。したがって、本明細書で説明されている実施形態は、一般的に加熱および冷却を繰り返すサイクルからなる、生物学的実体のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を生じさせ得る。次いで、液滴は、加熱／冷却サイクルの後に選別され得る。

【0214】

図１１ｃは、インテリジェント型カメラ１１４２も備える、液滴選別制御システム１１４０を例示している（ただし、ここでもまた、ダムカメラが代替的に使用されてよい）。図の例では、選別システムは、液滴フラッシュ照明デバイス１１４４、細胞検出用の光電子増倍管１１４６、および細胞検出確認用のオプションのさらなる撮像デバイス１１４８を備え、好ましくはすべて、細胞検出アルゴリズム１１５０の制御の下で動作する。選別制御システムは、信号発生器１１５２およびオプションの増幅器１１５４も備え、制御信号を以前に説明されている選別電極に送る。

【0215】

図１１ｄは、液滴分注制御システム１１６０を示しており、これは図の例において、さらなるインテリジェント型カメラ１１６２（ただし、ここでもまた、これはダムカメラであってもよい）を備え、処理はコントローラ１１０２によって実行される。図の例では、カメラ１１６２は、液滴照明、特にフラッシュデバイス１１６４を制御し、撮像デバイス（図示せず）からの画像キャプチャ手順１１６６を実装し、細胞検出アルゴリズム１１６８を使用して、液滴含有物、たとえば、細胞を検出する。制御手順１１７０は、圧縮空気源１１７２、適宜弁１１７４（図４ａの弁４７７など）、およびマルチウェルプレート４８４を保持するＸ−Ｙステージ１１７６を制御する。

【0216】

図１２は、液滴処理器具１２００の例示的な物理的構成を示しており、そこでは、以前に説明したものと類似の要素は類似の参照番号によって指示される。図１２は、それぞれ、液滴生成、選別、および分注のためのインテリジェント型カメラ１２０２、１２０４、１２０６の配置を示している。これらは、ＬＥＤコントローラ１２０８の制御の下にあるそれぞれの（ＬＥＤ）照明１１１４、１１４４、１１６４を有する。システムは、カートリッジ４１０およびカートリッジ用のインキュベータのヒータープレート１２１０、ならびに液滴生成およびインキュベーション用の弁アクチュエータ１２１２も例示している。マルチウェルプレート４８４は、Ｘ−Ｙステージ１２１４上に装着される。図１２は、試料貯留容器４０２ならびに液滴生成、選別、間隔あけ、および分注用の油を供給するための油貯留容器およびポンプ４０４ａ〜ｄをさらに示している。器具は、これらの貯留容器に供給するための内部油容器１２１６、および廃油容器４３６も備える。器具は、以前に説明されている制御システム、さらにはユーザインターフェース１２１８を備える。

【0217】

図１３は、細胞分析に対するフェーズを示す概略図である。当業者に知られているデバイスおよび方法は、フェーズＡ、Ｂ、およびＤで実装される。標準的な技術に従って、フェーズＡにおいて抗原が選択され産生される。この例ではＢ細胞の免疫付与および分離は、フェーズＢで実行されてよく、それにより、本明細書で説明されている実施形態により選別され、および／または分析されるべき細胞を含有する流体を取得し得る。フェーズＣでは、単細胞が、本明細書で説明されているデバイスおよび方法の実施形態を使用して単一の液滴中の単細胞が取得され得る。単一のピコドロップレット内の生存可能な細胞が用意されるものとしてよく、これに基づき、フェーズＤでさらなる実験、この例では、トランスクリプトミクスおよび配列決定実験が実施され得る。

【0218】

図１４ａおよび図１４ｂは、液滴の含有物を決定する方法の概略図である。この例では、２つの蛍光色素ＡＦ６４７およびＡＦ４８８がピコドロップレット内に入れられる。この例では、ハイブリドーマ細胞がピコドロップレット内に存在しているときに、タンパク質または抗体などのハイブリドーマ細胞の産生物は、ＡＦ６４７およびＡＦ４８８蛍光色素の各々に結合し得る（それらの各々は、ハイブリドーマ細胞産物の異なるそれぞれの部分に結合する関連する抗体を有する）。これによって、結合は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）をＡＦ６４７およびＡＦ４８８蛍光色素の間で生じさせ、その結果、蛍光の変化が生じる。したがって、相互作用が生じた場合に信号、この例では光信号が生成され、生物学的実体、この例では細胞の産物の選択的検出を可能にする。

【0219】

図１４ｂは、この例ではピコドロップレット内の１つまたは複数のハイブリドーマ細胞の存在に基づく蛍光検出を示している。閾値よりも高い信号が検出された後、ハイブリドーマ細胞がピコドロップレット内で識別されている。この例では約０．５Ｖの背景は、分析器に供給される空のピコドロップレットによるものである。したがって、この例では約１．１Ｖの、閾値よりも高い信号を結果としてもたらす液滴は、さらなる選別、および／または分析、および／または培養のために回収されてよい。この閾値よりも低い信号を発生させる液滴は、望ましければ廃棄されてよい。

【0220】

供与体および受容体の蛍光は、一定範囲のＦＲＥＴアッセイについて、および液滴中で検出されるべき１つまたは複数の特定の細胞もしくは他の実体に応じて最適化され得ることが理解されよう。

【0221】

図１４ａおよび図１４ｂに示されている蛍光検出は、たとえば、上で概要を述べたように液滴選別デバイスおよび／またはデカップラ内で使用され得る。

【0222】

図１５は、ハイブリドーマ細胞によるピコドロップレット内の単一クローン性抗体分泌物を示している。測定は、ＦＲＥＴベースのＥＬＩＳＡを使用して実行された。

【0223】

グラフは、産生された抗体の濃度対培養持続時間のグラフである。暗色のバーは、複数の細胞を組み込んだ標準試験管から形成されるバルク培養を表す。赤色バーは、単細胞がピコドロップレット内に入れられている試料を表す（その体積は約７００ｐｌであった）。図１５の差し込み図は、蛍光強度対濃度のグラフを示している。

【0224】

これからわかるように、産生される抗体の数は、バルク培養から形成された培養物と１時間以上の期間を置いて単細胞から形成された培養物との間で比較可能であり、ピコドロップレット中の単細胞のｔ＝０における濃度は無視できるくらいに小さいことは理解されるであろう。しかしながら、上で概要を述べたように、これは細胞集団にわたる高い単一クローン性を保証するので単細胞から細胞培養を行うことは有利であり得る。これは、本明細書で説明されている実施形態により調製されたピコドロップレット中の細胞から培養された細胞の濃度が、標準試験管中の複数の細胞から培養された場合と比べて同程度であるかまたはなおいそう高くなり得ることを示しており、それによって、単一の実体から培養された集団に対してより高い単一クローン性保証が達成される。

【0225】

図１６ａから図１６ｃは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｓ）細胞の集団の視像を示している。この例では、ピコドロップレットは、約８４μｍの平均直径および約３００ｐｌの平均体積を有する。図１６ａでは、細胞は、明視野の下で見ることができる。細胞が生存可能であるかどうかを決定するために、蛍光色素、この例ではＤＲＡＱ−７が用意され得る（図１６ｂ）。マージされた画像は、図１６ｃに示されており、生存可能な細胞は、図１６ｃにおいて緑色の蛍光を示す。

【0226】

生存可能な（すなわち、生体）ＣＨＯ−Ｓ細胞のパーセンテージ対培養時間は、様々な技術について図１６ｄに示されている。青色バーは、対照培養物を示している。緑色バーは、本明細書で説明されている実施形態によるピコドロップレット調製技術を介して得られる細胞培養物を表す。紫色バーは、ＦＡＣＳによって選別された液滴から培養された集団に対する分析結果を示し、ピンク色バーは、ＦＡＣＳを使用して選別され分注された集団を表す。

【0227】

これからわかるように、本明細書で説明されている実施形態を使用して調製された試料から培養された生存可能な細胞のパーセンテージは、ＦＡＣＳ技術を介して得られたものと比べて著しく高い。この結果は、ピコドロップレット中の（１つまたは複数の）細胞のカプセル化は、細胞生存可能性に対して測定可能な効果を有さず、上で説明されている実施形態による液滴の調製、選別、および分注が有利であることを実証している。

【0228】

図１７は、異なるピコドロップレットサイズ、この例では３００ｐｌ、５００ｐｌ、および７００ｐｌに対する生存可能なＣＨＯ−Ｓ細胞のパーセンテージ対培養時間を示す図である。この分析結果は、生成率を高めるためにピコドロップレットのサイズが縮小され得るかどうかを決定することを可能にし得る。

【0229】

一般的に、生存可能な細胞のパーセンテージは、調査されたすべてのピコドロップレットサイズについて類似していることがわかる。しかしながら、いくつかの培養時間、たとえば９時間が経過した後、体積７００ｐｌのピコドロップレットは最高パーセンテージの生存可能な細胞を含有していた。これは、液滴の体積が大きければ大きいほど細胞に栄養物を提供する期間が長くなり、細胞は長い期間にわたって生存し得るので予測され得ることである。

【0230】

図１８ａは、本明細書で説明されている実施形態による微小流体チップ１８０の画像を示している。

【0231】

微小流体チップ１８０は、本明細書全体を通して説明されているようなシステムの様々なモジュールを単一のチップ設計に統合したものである。微小流体チップ１８０は、この例では、液滴生成領域４１２、液滴インキュベータ／貯蔵領域４１４、液滴選別領域４１６、および液滴分注領域４２０を備える。この例では、微小流体チップ１８０は、液滴は制御可能な期間にわたって（たとえば、数秒から数分）チャンバ４５６内に保持され得るので望ましい場合に微小流体チップ１８０全体を通して液滴の輸送を遅延させることを可能にする貯蔵チャンバ４５６および弁１８２を備える。

【0232】

微小流体チップ１８０の保持チャンバ４５６は、好ましくは、液滴分注領域４２０に技術的に可能な限り近い位置にある。これは、水滴が油と比較して異なる流量を有し得るので特に難しい場合がある液滴輸送および分注の制御をしやすくすることができる。保持チャンバ４５６が液滴分注領域４２０（または液滴分注ユニット）に近ければ近いほど、保持チャンバ４５６と液滴分注領域４２０との間で液滴が輸送される時間が短縮され得るので、液滴分注は制御可能性が高まる。これは、垂直に動作し、それによって液滴がチップの上へ浮遊する、チップ設計において特に重要であり得る。

【0233】

微小流体チップ１８０の実施形態において、微小流体チップ１８０の異なる部分および領域の異なるワークフローを分離することを可能にする制御シーケンスが使用される。たとえば、液滴が、液滴生成領域４１２から直接液滴選別領域４１６に送られ、その後、液滴分注領域４２０に到達するものとしてよい。この例では、液滴生成領域４１２と液滴選別領域４１６との間の液滴インキュベーション／貯蔵領域４１４は省かれる。微小流体チップ１８０の異なる（１つまたは複数の）部分／領域は、省かれ得ることが理解されよう。

【0234】

図１８ｂは、図１８ａに示されている微小流体チップを操作するための制御システム１８００の概略ブロック図を示している。制御システム１８００は、上で説明されている微小流体システム、液滴選別または分注デバイス、液滴分注器、微小流体デバイス、微小流体カートリッジ、微小流体処理システム、および生物学的実体のマイクロドロップレットベースの処理のための器具を操作するために等しく使用され得ることは理解されるであろう。したがって、制御システム１８００は、液滴生成デバイス／ユニット、液滴貯蔵／インキュベーションデバイス／ユニット、液滴選別デバイス／ユニット、および液滴分注ユニット／液滴分注器のうちの１つまたは複数が単一チップ設計に組み込まれていないシステムにおいて使用され得る。

【0235】

大まかに言って、制御システム１８００は、適当にプログラムされた汎用プロセッサ１８０２を備える。制御システム１８００は、作業メモリ１８０４、永久的プログラムメモリ１８０６、およびデータストア１８０８をさらに備え、これらはすべて共通のデータおよびコントローラ１８１０によってリンクされる。この例では、ユーザインターフェース１８１２も、システムを構成するために用意される。制御システム１８００は、また、ディスプレイ、メモリ、プリンタ、データストア、およびネットワーク１８１６のうちの１つまたは複数に接続されている出力１８１４も備え、たとえば、液滴の１つまたは複数の特性（または液滴中の１つもしくは複数の実体の１つもしくは複数の特性）をたとえばマイクロタイタープレート内の配置と相関させるデータを表示するか、記憶するか、印刷するか、または配布する。当業者であれば、それに加えて、または代替的に、記憶／出力の他の形態が採用され得ることを理解するであろう。

【0236】

この例では、作業メモリ１８０４は、液滴実体データ、液滴サイズデータ、液滴蛍光データ、液滴速度データ、ならびに液滴および／またはその１つまたは複数の実体に関する他の物理的および／または化学的データ／特性を保持し（一時的であってよい）、処理し、操作するために使用される。

【0237】

永久的プログラムメモリ１８０６は、この例では、（オプションの）ユーザインターフェースコード、オペレーティングシステムコード、出力へのインターフェースを制御するためのデータ通信制御コード、たとえば、貯留容器から液滴処理システム／微小流体チップから液滴を供給することを制御するための液滴供給コード、たとえば生物学的実体を含む、たとえば溶液からの液滴調製を制御するための液滴調製コード、液滴処理システム／微小流体チップ内の油中水型エマルジョン中の液滴の流量を制御するための液滴流量コード、液滴処理システム／微小流体チップの１つまたは複数の部分における液滴の流路を制御するための液滴流路コード（たとえば、１つの領域もしくは処理ステップ、たとえば、インキュベーションは省いてよく、液滴は一方の領域／処理ユニットから直接他方に供給されてよい）、液滴の融合を制御するための液滴融合コード、液滴中の１つまたは複数の実体の決定／識別を制御するための液滴実体決定コード、液滴の蛍光の検出およびその処理を制御するための液滴蛍光検出コード、液滴処理システム／微小流体チップ内の液滴の速度の決定を制御するための液滴速度決定コード、液滴選別ユニット／領域内の液滴の選別を制御するための液滴選別コード、第１の流体流路から第２の流体流路への液滴のデカップルを制御するための液滴デカップルコード、たとえば、液滴および／またはその実体の１つまたは複数の特性の以前に取得されたデータに基づき液滴の選択を制御するための液滴選択コード、たとえば、１つまたは複数の流路の１つまたは複数の領域で液滴処理システム／微小流体チップ内の圧力を調整することによって液滴の排出／分注を制御するための液滴排出／分注コード、液滴のインキュベーションを制御するための液滴インキュベーションコード、１つまたは複数の液滴に対して実行される安定性試験を制御するための液滴安定性試験コード、および保持チャンバ内の液滴の保持を制御するための液滴保持コードを含むオペレーティングシステムコード（プラットフォーム独立であってよい）を記憶する。

【0238】

これらのコードは、制御システム１８００に対する対応する機能を実現するためにプロセッサ１８０２によってロードされ実装される。

【0239】

これらのコードのうちのいくつかまたはすべては、取り外し可能記憶媒体１８１８、たとえば、ＣＤ−ＲＯＭによって図示されている、キャリア媒体上に用意され得る。

【0240】

データストア１８０８は、この例では、液滴中に貯蔵される１つまたは複数の実体に関する情報（および液滴が実体、たとえば、生物学的実体を含んでいるかどうか）をもたらす液滴実体データ、液滴のサイズの情報をもたらす液滴サイズデータ、液滴の蛍光特性に関する情報をもたらす液滴蛍光データ、および所与の時刻の液滴処理システム／微小流体チップ内の特定の位置および／または領域における液滴の速度に関する情報をもたらす液滴速度データを記憶する。当業者であれば、液滴および／またはその実体の他の物理的および／または化学的特性がデータストア１８０８に記憶され得ることを理解するであろう。

【0241】

本発明は、上で説明されているシステムおよび方法を、たとえば、汎用コンピュータシステムまたはデジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）上に実装するためのプロセッサ制御コードをさらに提供する。コードは、ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、不揮発性メモリ（たとえば、フラッシュメモリ）またはリードオンリーメモリ（ファームウェア）などのプログラムメモリなどの非一時的物理的データキャリア上に用意される。本発明の実施形態を実装するためのコード（および／またはデータ）は、Ｃなどの従来のプログラミング言語（インタプリタ型またはコンパイル型）、またはアセンブリコード、またはハードウェア記述言語用のコードによるソース、オブジェクト、または実行可能コードを含み得る。当業者であれば、そのようなコードおよび／またはデータが互いに通信する複数の結合されたコンポーネントの間に分散され得ることを理解するであろう。

【0242】

次に、本発明者らは、チップの実施形態とともに使用するいくつかの例示的な制御シーケンスを説明する。微小流体チップ（カートリッジ）の制御は、器具のソフトウェア制御を通じて達成され得る。実施形態において、ハードウェア制御コマンドまたはスクリプトのシーケンスは、ハードウェア／ソフトウェア制御インタプリタに送られ、この情報は、ハードウェアコンポーネントに特有のコマンドに変換される。

【0243】

チップ上に試料（たとえば、細胞または他の生物学的もしくはアッセイ関係の物質の試料）を装填した後、チップは器具に装填される。様々な動作モードが可能であり、これらのモードは、好適なコマンド制御シーケンス（制御スクリプト）の選択によって実装される。器具の動作モードの２つの例、（１）単一クローン性保証モードおよび（２）直接アッセイモードについて以下で概要を述べる。

【0244】

単一クローン性保証モードシーケンスに対するチップ制御シーケンスの一例は次のとおりである。

【0245】

典型的な初期化ステップは、試料装填およびチップ呼び水である（チップのチャネルおよびキャビティは、気泡ができないように油を充填される）。次いで、ステップは次のように続く。
１． ピコドロップレット生成および試料カプセル化
２． 単一クローン性の光学的検出（たとえば、撮像および／または散乱光に基づく）
３． ピコドロップレット選別（光信号に基づく）
４． ピコドロップレット回収
５． ピコドロップレット分注（好ましくは以前に説明したような単一クローン性の光学的検出／確認を含む）。

【0246】

液滴がエマルジョンのスラグ内に分注された後、スラグは、典型的にはすでに水を含んでいる（マイクロタイタープレート）ウェルに入る。そこで、物理的アクションを通じて、および／または他の手段、たとえば、電界を用いて、細胞が液滴から水の中へ放出され、ウェル内に回収され、油が水から分離する。システム動作が完了すると、システム／チップは、好ましくはクリーニングされる。

【0247】

直接アッセイモードに対するチップ制御シーケンスの一例は、単一クローン性保証モードについて上で説明されているのと同じ初期化およびペイロード回収ステップを有するものとしてよい。それに加えて、直接アッセイモードは、次のステップを含み得る。
１． ピコドロップレット生成および試料カプセル化
２． インキュベーション（たとえば、３７℃で）
３． 単一クローン性の光学的検出（たとえば、撮像および／または散乱光に基づく）
４． アッセイに対する光学的検出（たとえば、蛍光および／または発光）
５． ピコドロップレット選別（光信号に基づく）
６． ピコドロップレット回収（アッセイ陽性）
７． ピコドロップレット分注（好ましくは以前に説明したような単一クローン性の光学的検出／確認を含む）。

【0248】

図１９ａ〜図１９ｃは、本明細書で説明されている実施形態を使用するピコドロップレット内の単細胞の検出を示している。この例では、産生される抗体の量は、決定される。

【0249】

図１９ａ〜図１９ｃのグラフのｘ軸は任意の単位で緑色蛍光強度を示し、ｙ軸は任意の単位で赤色／緑色蛍光比強度を示す。液滴は、緑色光に暴露される。この例では、チャイニーズハムスター卵巣細胞から産生される抗体が多ければ多いほど、ＦＲＥＴ強度が高くなる結果として蛍光信号中に存在する緑色から赤色への偏移が大きくなる。当業者であれば、抗体の数が増えた結果として緑色−赤色偏移の観察結果を熟知している。本明細書で説明されている方法およびシステムは、本明細書で説明されている実施形態を使用して、２時間後にかなりの数の抗体がチャイニーズハムスター卵巣細胞から産生され得ることを示しており、ここで、「Ａ」のラベルを付けられているクラスタは抗体の集団を示している。クラスタ「Ｂ」は、細胞を全く含有しないか、または抗体を全く含有しないピコドロップレット集団を表している。

【0250】

次いで、方法は、たとえば、特定の範囲内にある赤色および緑色の蛍光強度を示す液滴のみを選別するために実施され得る。これは、ピコドロップレットからの赤色および緑色蛍光の散布図の時間経過を示す図２０ａ〜図２０ｃに示されている。赤色の正方形は、ピコドロップレット選別に対するゲーティングセット（gating set）を定め、特定の範囲内にある赤色蛍光および特定の範囲内にある緑色蛍光を示すピコドロップレットのみが選別され得る。ピコドロップレット選別に対するゲーティングセットを定める赤色正方形の形状、サイズ、および配置は、液滴（およびその実体）が有するべき特定の特性（たとえば、蛍光特性）に従って選択され得ることは理解されるであろう。

【0251】

本発明者らは、好ましい実施形態において、生物学的実体を含む油中水型エマルジョンの液滴を処理することに応用される技術を説明した。しかしながら、原理上、有機物または無機物などの非生物学的実体も、同様にして処理され得る。同様に、本発明者らが説明している技術は、また、原理上、油中水型エマルジョン中の油の液滴を処理することにも応用可能である。

【0252】

間違いなく、当業者は他の多くの効果的な代替的形態を思いつく。本発明は、説明されている実施形態に限定されず、付属の請求項の精神および範囲のうちにある当業者にとって明らかな修正形態も包含することは理解されるであろう。

【符号の説明】

【0253】

１８０ 微小流体チップ
１８２ 弁
４００ マイクロドロップレット処理システム／器具
４００’ マイクロドロップレット処理システム／器具
４０２ 貯留容器
４０４ａ〜ｄ 一組の貯留容器
４０６ 流体駆動モジュール
４０８ 一組の流体流管路
４１０ （使い捨て）微小流体カートリッジ
４１２ 液滴生成領域
４１４ 液滴インキュベーション／貯蔵領域
４１６ 液滴選別領域
４１８ 流れ緩衝領域
４２０ 液滴分注器、液滴分注領域
４２０’ 分注領域
４２２ 水性試料投入部
４２４ 油投入部
４２６ 流れ集束接合部
４２８ 放出チャネル
４３０ 貯蔵チャンバ
４３２ 液滴
４３４ チャネル
４３６ 貯留容器
４３８ 放出チャネル
４４０ 側部チャネル
４４２ 投入チャネル
４４４、４４６ 放出チャネル
４４８ 投入部
４５０ 領域
４５２ 電極
４５４ 投入チャネル
４５６ チャンバ
４５８ 放出チャネル
４６０ 投入チャネル
４６２ 放出チャネル
４６４ チャネル
４６６ チャネル
４６８ 放出チャネル
４７０ 第２の放出チャネル
４７２ 放出部
４７４ 回転弁
４７６ チャネル
４７７ 弁
４７８ 投入部
４８０ エマルジョン
４８２ ターゲット液滴
４８４ マルチウェル貯留容器
４８８ ウェル
４９０ 水性（培養）培地
４９１ 第１の光学的感知領域
４９２ 第２の光学的感知領域
４９３ 第３の光学的感知領域
４９４ 第４の光学的感知領域
４９５、４９６、４９７ 光学的感知領域
５００ デカップラ
５００ 制御ユニット
５０２ 第１の流体流路（チャネル）
５０２ 検出器
５０４ 第２の流体流路（チャネル）
５０４ バス
５０６ 回転ユニット
５０６ プロセッサ
５０８ 放出部
５０８ オペレーティングシステム／ソフトウェア
５１０ デカップラ
５１２ メモリ
８００ 液滴分注器
８０２ 投入チャネル
８０４ 第１の放出チャネル
８０６ 第２の放出チャネル
８０８ 共有チャネル（流れ）部分
８１０ ノズル
８１２ エマルジョン
８１４ 液滴
８１６ 空気投入部
８１８ 油供給物
８２０ 液滴
８２２ フィード弁
８２４ 遮断弁
８２６ 空気弁
８２８ 領域
８３０ 分離
１０００ 液滴処理カートリッジ
１００２ 領域
１００４ 電気的接続部
１００６ 分注ノズル
１０５０ モジュール式カートリッジ
１０５２ 液滴生成モジュール
１０５４ 液滴インキュベーション／貯蔵モジュール
１０５６ 液滴選別モジュール
１０５８ 液滴／保持（流れ緩衝）領域
１０６０ 液滴分注領域
１０６２ チャネル
１０６４ 弁
１０６６ データム配置ビン
１１００ 液滴生成制御システム
１１０２ 制御コンピュータシステム、コントローラ
１１０４ 試料
１１０６ 油
１１０８ 弁
１１１０ インテリジェント型カメラ
１１１２ 画像キャプチャシステム
１１１４ 照明
１１１６ 液滴サイズ制御手順
１１１８ 制御ループ
１１２０、１１２２ ポンプ
１１３０ 温度制御システム
１１３２ ＰＩＤ（比例積分微分）コントローラ
１１３４ 温度センサ
１１３６ ペルチェ効果素子
１１４０ 液滴選別制御システム
１１４２ インテリジェント型カメラ
１１４４ 液滴フラッシュ照明デバイス
１１４６ 光電子増倍管
１１４８ 撮像デバイス
１１５０ 細胞検出アルゴリズム
１１５２ 信号発生器
１１５４ 増幅器
１１６０ 液滴分注制御システム
１１６２ インテリジェント型カメラ
１１６４ フラッシュデバイス
１１６６ 画像キャプチャ手順
１１６８ 細胞検出アルゴリズム
１１７０ 制御手順
１１７２ 圧縮空気源
１１７４ 弁
１１７６ Ｘ−Ｙステージ
１２００ 液滴処理器具
１２０２、１２０４、１２０６ インテリジェント型カメラ
１２０８ ＬＥＤコントローラ
１２１０ ヒータープレート
１２１２ 弁アクチュエータ
１２１４ Ｘ−Ｙステージ
１２１６ 内部油容器
１２１８ ユーザインターフェース
１８００ 制御システム
１８０２ 汎用プロセッサ
１８０４ 作業メモリ
１８０６ 永久的プログラムメモリ
１８０８ データストア
１８１０ 共通のデータおよびコントローラ
１８１２ ユーザインターフェース
１８１４ 出力
１８１６ ネットワーク
１８１８ 取り外し可能記憶媒体

【図1】

【図2】

【図3】

【図4a】

【図4b】

【図5a】

【図5b】

【図6】

【図7a】

【図7b】

【図7c】

【図8】

【図9】

【図10a】

【図10b】

【図11a】

【図11b】

【図11c】

【図11d】

【図12】

【図13】

【図14a】

【図14b】

【図15】

【図16a】

【図16b】

【図17】

【図18a】

【図18b】

【図19a】

【図19b】

【図19c】

【図20a】

【図20b】

【図20c】