特許 6782405 腎性貧血のバイオマーカーとしての赤血球ＡＤＭＡの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6782405

(24)【登録日】2020年10月22日

(45)【発行日】2020年11月11日

(54)【発明の名称】腎性貧血のバイオマーカーとしての赤血球ＡＤＭＡの使用

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20201102BHJP

   G01N 33/49 20060101ALI20201102BHJP

   G01N 33/72 20060101ALI20201102BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20201102BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/68

   G01N33/49 Z

   G01N33/72 A

   G01N33/53 B

【請求項の数】11

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2015-242083(P2015-242083)

(22)【出願日】2015年12月11日

(65)【公開番号】特開2016-114606(P2016-114606A)

(43)【公開日】2016年6月23日

【審査請求日】2018年12月10日

(31)【優先権主張番号】特願2014-253078(P2014-253078)

(32)【優先日】2014年12月15日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】599045903

【氏名又は名称】学校法人 久留米大学

(73)【特許権者】

【識別番号】504157024

【氏名又は名称】国立大学法人東北大学

(73)【特許権者】

【識別番号】307020545

【氏名又は名称】公立大学法人岡山県立大学

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100084146

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 宏

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100156111

【弁理士】

【氏名又は名称】山中 伸一郎

(72)【発明者】

【氏名】横路 三有紀

(72)【発明者】

【氏名】中山 陽介

(72)【発明者】

【氏名】三枝 大輔

(72)【発明者】

【氏名】上田 誠二

(72)【発明者】

【氏名】木本 眞順美

(72)【発明者】

【氏名】阿部 高明

(72)【発明者】

【氏名】奥田 誠也

【審査官】 草川 貴史

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００４／０２１４２５２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５１３３８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０７２１７７（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 「慢性透析症例での心血管疾患をいかに治療するか？」慢性腎臓病における貧血と心疾患，J Cardiol Jpn Ed，２０１２年，Vol.7,No.3 ，Page.268-272

【文献】 横路三有紀、他８名，CKDにおける赤血球ADMA代謝系の病態生理学的役割の解明，第37回日本高血圧学会総会 プログラム・抄録集，日本，２０１４年１０月１７日，PB7-3，第405頁

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の（１）から（３）をモニターするための、哺乳動物またはＥＳＡ治療中の上記哺乳動物から得られた血液試料の赤血球中に存在する非対称性ジメチルアルギニン（以下、ＡＤＭＡという）のバイオマーカーとしての使用：
（１）哺乳動物における腎性貧血の発症；
（２）赤血球造血刺激因子製剤（ＥＳＡ）の投与治療を行っている哺乳動物のＥＳＡ低反応性；または
（３）哺乳動物における心疾患の発症。

【請求項2】

哺乳動物がヒトである請求項１に記載の使用。

【請求項3】

哺乳動物から得られた血液試料の赤血球中のＡＤＭＡ濃度を測定またはモニターすることを含む、以下の（１）から（３）に記載の方法：
（１）哺乳動物における腎性貧血の検査方法；
（２）ＥＳＡ投与治療哺乳動物のＥＳＡ低反応性をモニターする方法；または
（３）哺乳動物における心疾患の検査方法。

【請求項4】

哺乳動物がヒトである請求項３に記載の方法。

【請求項5】

以下を含む哺乳動物における腎性貧血発症および／または心疾患発症モニター用キット：
ＡＤＭＡと牛血清アルブミン（ＢＳＡ）をＮ−スクシンイミジル３−マレイミドベンゾエート（ＳＭＢ）で架橋した複合体をコーティングしたプレート；
検量線を作成するためのＳＭＢ−ＡＤＭＡ標品；
サンプル中ＡＤＭＡを誘導体化するためのＳＭＢ標品；
一次抗体としてＡＤＭＡ−ＳＭＢを認識する抗体；
二次抗体として前記抗体に対するＨＲＰ標識抗体；
発色試薬；および
遠心式限外濾過ユニット。

【請求項6】

哺乳動物がヒトである請求項５に記載のキット。

【請求項7】

哺乳動物から得られた血液試料の赤血球中のＡＤＭＡ濃度の増大をスクリーニングすることを含む、（１）から（３）に記載のモニターする方法：
（１）哺乳動物における腎性貧血発症をモニターする方法；
（２）ＥＳＡ投与治療哺乳動物におけるＥＳＡ低反応性をモニターする方法；または
（３）哺乳動物における心疾患発症をモニターする方法。

【請求項8】

ＡＤＭＡ濃度の増大がヘモグロビン（Ｈｂ）濃度の減少と相関する、請求項７に記載の腎性貧血発症をモニターする方法。

【請求項9】

ＡＤＭＡ濃度の増大が造血に対する鉄利用能の低下と相関する、請求項７に記載の腎臓貧血発症をモニターする方法。

【請求項10】

ＡＤＭＡ濃度の増大が、血清鉄および／またはトランスフェリン飽和度（ＴＳＡＴ）の低下と相関する、請求項７に記載の腎臓貧血発症をモニターする方法。

【請求項11】

ＡＤＭＡ濃度の増大が、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度の増大と相関する、請求項７に記載の心疾患の発症をモニターする方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、腎性貧血のバイオマーカーとしての非対称性ジメチルアルギニン（以下、ＡＤＭＡという）の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

貧血は疾患名でなく、血液単位容積中のヘモグロビン（Ｈｂ）量が減少した状態と定義され、ＷＨＯ基準では、成人男子は１３ｇ／ｄｌ未満、成人女子や小児は１２ｇ／ｄｌ未満、妊婦や幼児は１１ｇ／ｄｌ未満と定められている。通常、Ｈｂ濃度の低下とともに赤血球数やヘマトクリット値も減少するが、赤血球の主な生理機能がＨｂによる肺から全身組織への酸素運搬であることから、Ｈｂ濃度が生体にとって最も重要な指標となる。

【0003】

貧血は、ＭＣＶ（mean corpuscular volume；平均赤血球容積）に基づいて、小球性（鉄欠乏性貧血、慢性疾患に伴う貧血、鉄芽球性貧血、サラセミア、無トランスフェリン血症）、正球性（腎性貧血、溶血性貧血、再生不良性貧血、赤芽球癆、骨髄異形成症候群、慢性疾患に伴う貧血、白血病）および大球性（腎性貧血、巨赤芽球性貧血（ビタミンＢ１２欠乏、葉酸欠乏）、肝障害、甲状腺機能低下症、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、薬剤によるＤＮＡ合成障害）に分類される。腎性貧血は、正球性あるいは大球性貧血を示すといわれている。

【0004】

骨髄における赤血球の産生は、腎臓で産生されるエリスロポエチン（ＥＰＯ：１６５個のアミノ酸からなるペプチドホルモン）によって刺激される。すなわち、腎臓で生成され、流血中に出て骨髄に到達したＥＰＯは、赤血球前駆細胞上の受容体に結合し、その分化と増殖を促進する。このように、ＥＰＯは主に腎臓で産生されるので、腎臓が荒廃している腎不全患者では、ＥＰＯが生成されないか、あるいは生成が極めて低下する。そのため、腎不全患者では赤血球の産生が抑制されて高度の貧血が生じる。この機序による貧血が腎性貧血である。すなわち、腎性貧血とは、腎障害による腎でのＥＰＯ産生能の低下による貧血をいう。腎性貧血には、赤血球寿命の短縮、造血細胞のＥＰＯ反応性の低下、栄養障害、血液透析（ＨＤ）患者における回路内残血などの要因も含まれる。

【0005】

そこで、透析患者など、腎性貧血の患者に対してＥＰＯを補充するために、遺伝子組換えヒトエリスロポエチン製剤（ｒＨｕＥＰＯ）が開発された。遺伝子組換えヒトエリスロポエチン製剤は、ハムスターの細胞にヒトのＥＰＯ産生遺伝子を組み込んで大量培養することにより生産される。現在市販されている遺伝子組換えヒトエリスロポエチン製剤にはエポエチンαとエポエチンβがある。その後、ｒＨｕＥＰＯにもダルベポエチンアルファなどの第２世代が現れ、これにともなってヒトエリスロポエチン製剤という名称に代わって第２世代をも包括する赤血球造血刺激因子製剤（以下、ＥＳＡという）の名称が用いられるようになった。腎性貧血に対する第一選択薬は、ＥＳＡである。

【0006】

ＥＳＡは約８割の末期腎不全患者に使用される。我が国では３０万人を超える維持透析患者や保存期腎不全患者がＥＳＡを使用している現状である。また患者数も多いのみならず、２０１５年度のＥＰＯ市場予測では全世界で１,４３０億ドル（日本では１５億ドル）を超えると予想されており、企業の新薬研究も盛んな分野である。

【0007】

慢性腎障害（ＣＫＤ）では腎疾患の進行に伴い内因性ＥＰＯの産生が低下し、栄養低下、鉄欠乏、出血傾向、赤血球寿命の短縮などと相まって、貧血をきたすことがある。通常はＣＫＤステージ３より貧血患者の割合が増加するが、ＣＫＤの原疾患によっては早期のステージにおいても貧血を呈する症例もある。ステージ３では６カ月ごと、ステージ４では３カ月ごと、ステージ５では毎月貧血のチェックを行うとされている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。

【0008】

貧血は心不全の独立した増悪因子であり（非特許文献４；非特許文献５）、貧血の治療により生命予後の改善が期待できる。さらにＣＫＤ患者において、腎疾患、貧血、心疾患が互いに影響し合う悪循環を形成するという心腎貧血症候群（Cardio-Renal-Anemia syndrome）が提唱され（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）、貧血治療が勧められている。

【0009】

貧血は独立したＣＫＤの進行要因であり、ＥＳＡにより貧血を早期に改善することにより、ＣＫＤの進行を抑制するとの報告がある（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。ＣＫＤ患者において貧血を認めた場合は、ＥＳＡなどを用いて積極的に加療することが必要であると主張されている。

【0010】

ところが、２００６年秋に報告された大規模無作為化介入試験ＣＲＥＡＴＥ研究（非特許文献１１）とＣＨＯＩＲ研究（非特許文献１２）において、これらの目標値の設定にそぐわない結果が報告された。すなわち、前者でＨｂ値を正常範囲内（１３.０〜１５.０ｇ／ｄＬ）に維持した群とＨｂ値をやや低め（１０.５〜１１.５ｇ／ｄＬ）に維持した群を比較すると、正常範囲まで改善させた群で心血管合併症の発症は減少せず、また腎機能低下速度も差がなかった。後者では、Ｈｂを高値（１３.５ｇ／ｄＬ）に維持した群が低値（１１.３ｇ／ｄＬ）に維持した群より、死亡、心筋梗塞、心不全による入院、脳卒中の発症が増加した。その後、透析患者および保存期慢性腎不全患者を対象とした９つのＲＣＴをメタ解析した成績でも（非特許文献１３）、Ｈｂ高値群の総死亡が多く、高血圧のコントロールが不良で、シャントの閉塞率が高いと報告された。Ｈｂ値を高値に維持した群で予後が増悪する理由としては、高血圧・血栓症の増悪によるものや、ＥＳＡの高用量投与による直接作用が推測されている（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。これらの成績を基に、ＦＤＡの指示による能書の改訂が行われ、Ｋ／ＤＯＱＩガイドラインも改訂され、現在、目標Ｈｂ値１１.０〜１２.０ｇ／ｄＬとされている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。

【0011】

このように、腎性貧血は独立したＣＫＤや心血管疾患（ＣＶＤ）の発症・進展因子であることが知られている。それゆえ、ＥＳＡによる腎性貧血治療はＣＫＤ進展抑制や生命予後の改善に寄与することが期待されるものの、その腎保護効果や合併症予防に対する明らかな効果は見出せていない。これより２０１０年米国ＦＤＡにより腎性貧血治療効果をＨｂ値の上昇のみで評価することは適切でないことが示唆された（非特許文献１４）。

【0012】

ＡＤＭＡは、アミノ酸の一種であるアルギニンに２つのメチル基が付加された修飾アミノ酸である。アルギニンのメチル化は、翻訳によって合成されたタンパク質上において行われ、タンパク質アルギニンメチル基転移酵素（protein arginine methyltransferases；ＰＲＭＴ）によってタンパク質に組み込まれているアルギニン残基のグアニジノ基の窒素に１つずつメチル基が付加される。ＰＲＭＴは、アルギニン残基を非対称的にメチル化するタイプＩと、対称的にメチル化するタイプＩＩが存在し、ＡＤＭＡはタイプＩＰＲＭＴによって産生される（図１）。

【0013】

タンパク質中のアルギニン残基のメチル基は、ＰＲＭＴがＳ−アデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔまたはＳＡＭ）をメチル基供与体として、アルギニン側鎖のδ−グアノジノ基に存在するω−窒素原子にメチル基の導入を触媒することで生じる。ＰＲＭＴは酵母からヒトまで高度に保存されたタンパク質であり、４つの特徴的なモチーフ（モチーフとそれに続くｐｏｓｔＩ、ＩＩ、ＩＩＩ）、そしてＴＨＷループを持つ。モチーフＩとｐｏｓｔＩ、そしてＴＨＷループはＳＡＭとの結合ポケットを形成している。ＰＲＭＴはそのメチル基転移の様式の違いからタイプＩとタイプＩＩに分類されている（図１）。タイプＩに属するＰＲＭＴはＰＲＭＴ１、２、３、４、６、８が知られており、タンパク質中のアルギニン残基をモノメチル化、および非対称性ジメチル化する。一方、タイプＩＩに属するＰＲＭＴはＰＲＭＴ５、７（ＰＲＭＴ７はモノメチル化しか触媒しないタイプＩＩＩのアルギニンメチル基転移酵素であると主張する報告もある）が知られており、これらはアルギニン残基のモノメチル化、および対称性ジメチル化を触媒している。どちらの反応においてもタンパク質の（ジ）メチル基の転移の副産物としてＳ−アデノシルホモシステイン（ＡｄｏＨｃｙ）を生成する。

【0014】

アルギニン残基がメチル化されたタンパク質は、代謝回転に伴って分解される（図２）。このタンパク質分解により遊離されたメチルアルギニン類は、常に一定濃度で細胞内や体液中に存在している。クリアランス経路は、尿中排泄されたり、肝臓で代謝されたりするが、モノメチルアルギニン（ＭＭＡ）とＡＤＭＡはそれらに特異的な加水分解酵素であるジメチルアルギニンジメチルアミノ基加水分解酵素（Dimethylarginine Dimethylaminohydrolase：ＤＤＡＨ）によって、シトルリンとメチルアミン類に分解される。この代謝バランスが崩れ、生体内のＡＤＭＡ濃度が上昇すると、血管内皮由来血管弛緩因子である一酸化窒素（ＮＯ）の合成酵素（ＮＯＳ）活性を阻害し、ＮＯ産生量を低下させ、血管内皮障害を惹起し、動脈硬化、高血圧、糖尿病を始め、心血管疾患や腎疾患など様々な疾患の発症や進展に関わっていることが知られている（非特許文献１５）。

【0015】

近年、本発明らは赤血球中にメチル化タンパク質および遊離型ＡＤＭＡが豊富に存在するという先行研究をもとに赤血球自身にＡＤＭＡ代謝系全体が存在していることを明らかとしてきた（図３；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）。

【0016】

メチル化アルギニン誘導体は３０年以上も前に同定・単離されていたものの、その生理学的役割については長らく不明なままであった。ここ１０年の間に、ＰＲＭＴの同定、またメチル化を検出する解析技術の進歩により、アルギニン残基のメチル化がシグナル伝達やＲＮＡプロセシング、転写制御やＤＮＡ修復など、多岐に渡る細胞機能に関与していることが示されてきている。

【0017】

これまで、ＡＤＭＡの用途としては、子癇前症のためのスクリーニング（特許文献１）、肝機能を評価するためのバイオマーカー（特許文献２）、染色体優性多発性嚢胞腎の判定（特許文献３）、透析膜の評価（特許文献４）およびうつ病のバイオマーカー（特許文献５）が知られているが、腎性貧血との相関については知られていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0018】

【特許文献1】特表２００６−５２４３２５号公報

【特許文献2】特表２０１０−５０２９７９号公報

【特許文献3】特開２０１２−１１２７８４号公報

【特許文献4】特開２０１２−１１２７８５号公報

【特許文献5】特開２０１２−２１１９０８号公報

【非特許文献】

【0019】

【非特許文献1】日本透析医学会、２００８年版「慢性腎臓病における腎性貧血治療ガイドライン」透析会誌41; 2008: 661-716

【非特許文献2】National Kidney Foundation. K/DOQI clinical practice guidelines and clinical practice recommendations for anemia in chronic kidney disease, Am J Kidney Dis 2006; 47(Suppl 3):S11-S145

【非特許文献3】National Kidney Foundation, K/DOQI clinical practice guidelines and clinical practice recommendations for anemia in chronic kidney disease: 2007 Update of Hemoglobin Target, Am J Kidney Dis 2007; 50:471-530

【非特許文献4】Vlagopoulos PT, et al., J Am Soc Nephrol 2005; 16: 3403-3410

【非特許文献5】Al−Ahmad A, et al., J Am Coll Cardiol 2001; 38:955-962

【非特許文献6】Hayashi T, et al., Am J Kidney Dis 2000; 35:250-256

【非特許文献7】Roth D, et al., Am J Kidney Dis 1994; 24:777-784

【非特許文献8】Silverberg DS, et al., J Am Coll Cardiol 2001; 37:1775-1780

【非特許文献9】Kuriyama S, et al., Nephron 1997; 77:176-185

【非特許文献10】Gouva C, et al., Kidney Int 2004; 66:753-760

【非特許文献11】Drueeke TB, et al., N Engl J Med 2006; 355:2071-2084

【非特許文献12】Singh AK, et al., N Engl J Med 2006; 355:2085-2098

【非特許文献13】Phrommintikul A, et al., Lancet 2007; 369:381-388

【非特許文献14】Unger EF, et al. N Engl J Med, 2010, 362(3); 189-192

【非特許文献15】Ueda S, et al., J Nephrol., 2010, 23 ; 377-386

【非特許文献16】Kang ES, Kimoto M, et al., Free Radic Res, 2001, 35 (6); 693-707

【非特許文献17】Billecke SS, Kimoto M, et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2006, 91; H1788-H1796

【非特許文献18】Yokoro M, Kimoto M, et al., Biosci Biotechnol Biochem, 2012, 76 (7); 1334-1342

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0020】

これまで、腎性貧血に対するＥＳＡ使用に関して適切な投与のためのモニター法は存在せず、Ｈｂ濃度でのみＥＳＡ投与量を調節している現状である。その結果、短期間でのＥＳＡの過量投与や、ＥＳＡ低反応性患者の出現、ＥＳＡ低反応性患者への長期間にわたるＥＳＡ使用といった問題が生じている。ＥＳＡの過量投与はＨｂ上昇による体液量増多や末梢血管収縮作用などにより高血圧を起こす可能性がある。また、知らないうちにＥＳＡ低反応性患者へ使用しており、結果的に過剰投与につながっている。

【0021】

慢性腎不全患者数は増加の一途を辿っており、ＥＳＡを投与される患者数も増加している。ＥＳＡの需要は全世界で増加しており、薬剤販売額の統計においても常に上位を占めている。そのため我が国のみならず、多くの国の医療経済に対する負担は大きく、ＥＳＡの適正使用ができるバイオマーカーの確立、腎性貧血治療を把握しうるモニター方法の創出が急務の課題となっている。また、新たな腎性貧血治療薬の開発の際には、Ｈｂ以外の適切な指標が必要である。

【課題を解決するための手段】

【0022】

本発明らは、腎性貧血のバイオマーカーを確立することでＥＳＡの適正使用が可能になると考え、腎性貧血を惹起する因子として赤血球ＡＤＭＡに着目し、鋭意研究した。その結果、赤血球ＡＤＭＡ濃度とＨｂ値との間に相関関係があること、それゆえ、ＣＫＤ患者において赤血球ＡＤＭＡが腎性貧血のマーカーとして使用でき、赤血球ＡＤＭＡ濃度を指標としてＥＳＡの適正使用の判別に応用しうることを見出した。また、ＥＳＡ治療がすでに行われている患者における赤血球ＡＤＭＡ濃度がＥＳＡ低反応性指数と有意な正相関を示すこと、それゆえ、赤血球ＡＤＭＡ濃度はＥＳＡ低反応性を反映し、赤血球ＡＤＭＡ濃度の低下はＥＳＡ低反応性の改善の有用な指標となることを見出した。さらに、赤血球ＡＤＭＡ濃度は、心疾患のリスク因子として知られるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと強い正相関を示したことから、赤血球ＡＤＭＡ濃度は貧血の程度のみならず心疾患合併リスクも予測することができ、心疾患合併予防効果のある貧血治療判定に有用なマーカーとなることを見出した。

【0023】

すなわち、本発明は、赤血球ＡＤＭＡと腎性貧血との相関関係に基づいて、腎性貧血の発症をモニターするためのバイオマーカーとしてのＡＤＭＡの使用に関する。本発明に従って、バイオマーカーとしてのＡＤＭＡは、（i）ＥＳＡの適正使用の指標、（ii）ＥＳＡ低反応性患者の判別、（iii）心疾患合併リスクの予測に用いることができる。

【0024】

本発明は、以下を含む。
［１］以下の（１）から（３）をモニターするための、ＡＤＭＡのバイオマーカーとしての使用：
（１）哺乳動物における腎性貧血の発症；
（２）ＥＳＡの投与治療を行っている哺乳動物のＥＳＡ低反応性；または
（３）哺乳動物における心疾患の発症。
［２］ＡＤＭＡが、哺乳動物またはＥＳＡ治療中の上記哺乳動物から得られた血液試料の赤血球中に存在するＡＤＭＡである、上記［１］記載のＡＤＭＡのバイオマーカーとしての使用。
［３］哺乳動物から得られた血液試料の赤血球中のＡＤＭＡ濃度を測定またはモニターすることを含む、以下の（１）から（３）に記載の方法：
（１）哺乳動物における腎臓貧血の検査方法；
（２）ＥＳＡ投与治療哺乳動物のＥＳＡ低反応性をモニターする方法；または
（３）哺乳動物における心疾患の検査方法。
［４］哺乳動物から得られた血液試料の赤血球中のＡＤＭＡ濃度を測定する手段を含む、以下の（１）から（３）に記載のモニター用キット：
（１）哺乳動物における腎臓貧血発症モニター用キット；
（２）ＥＳＡ投与治療哺乳動物におけるＥＳＡ低反応性モニター用キット；または
（３）哺乳動物における心疾患発症モニター用キット。
［５］上記［４］記載の哺乳動物における腎臓貧血発症モニター用キットが、哺乳動物からの血液試料を受領する手段と、血液試料に含まれる赤血球中のＡＤＭＡ濃度を測定する手段と、測定したＡＤＭＡ濃度を基準値と比較する手段と、基準値との比較から該哺乳動物が腎性貧血を発症しているかおよび／または腎性貧血の程度を判定する手段を含む、上記［４］記載の哺乳動物における腎性貧血発症モニター用キット。
［６］上記［４］記載のＥＳＡ投与治療哺乳動物におけるＥＳＡ低反応性モニター用キットが、ＥＳＡ治療を行っている患者からの血液試料を受領する手段と、ＥＳＡ治療を行っている患者から得た血液試料に含まれる赤血球中のＡＤＭＡ濃度をモニターする手段と、測定したＡＤＭＡ濃度を基準値と比較する手段と、基準値との比較から該患者がＥＳＡ低反応性を示すかを判定する手段を含む、上記［４］記載のＥＳＡ投与治療哺乳動物におけるＥＳＡ低反応性モニター用キット。
［７］上記［４］記載の哺乳動物における心疾患発症用モニターキットが、哺乳動物からの血液試料を受領する手段と、血液試料に含まれる赤血球中のＡＤＭＡ濃度を測定する手段と、測定したＡＤＭＡ濃度を基準値と比較する手段と、基準値との比較から該哺乳動物が心疾患を発症しているかを判定する手段を含む、上記［４］記載の哺乳動物における心疾患発症モニター用キット。
［８］哺乳動物から得られた血液試料の赤血球中のＡＤＭＡ濃度の増大をスクリーニングすることを含む、（１）から（３）に記載のモニターする方法：
（１）哺乳動物における腎臓貧血発症をモニターする方法；
（２）ＥＳＡ投与治療哺乳動物におけるＥＳＡ低反応性をモニターする方法；または
（３）哺乳動物における心疾患発症をモニターする方法。
［９］ＡＤＭＡ濃度の増大がヘモグロビン（Ｈｂ）濃度の減少と相関する、上記［８］記載の腎臓貧血発症をモニターする方法。
［１０］ＡＤＭＡ濃度の増大が造血に対する鉄利用能の低下と相関する、上記［８］記載の腎臓貧血発症をモニターする方法。
［１１］ＡＤＭＡ濃度の増大が、血清鉄および／またはトランスフェリン飽和度（ＴＳＡＴ）の低下と相関する、上記［８］記載の腎臓貧血発症をモニターする方法。
［１２］ＡＤＭＡ濃度の増大が、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度の増大と相関する、上記［８］記載の心疾患の発症をモニターする方法。
［１３］哺乳動物の赤血球中のＡＤＭＡの濃度の増大をスクリーニングすることを含む、哺乳動物における腎性貧血または心疾患の診断方法。
［１４］哺乳動物の赤血球中のＡＤＭＡ濃度の増大をスクリーニングし、赤血球中のＡＤＭＡ濃度が基準値を超えた場合にＥＳＡの投与量を適正値まで低下させることを含む、哺乳動物におけるＥＳＡの過剰投与を防止するＥＳＡの投与方法。
［１５］上記［８］記載のＥＳＡ投与治療哺乳動物のＥＳＡ低反応性をモニターする方法が、ＥＳＡ治療抵抗性を判別することを含む、上記［８］記載のＥＳＡ投与治療哺乳動物のＥＳＡ低反応性をモニターする方法。
［１６］哺乳動物がヒトである上記［１］〜［８］、または［１３］〜［１５］のいずれかに記載の使用、方法またはキット。

【0025】

本発明の第１の態様は、以下の（１）から（３）をモニターするための、ＡＤＭＡのバイオマーカーとしての使用に関する：（１）哺乳動物における腎性貧血の発症；（２）ＥＳＡの投与治療を行っている哺乳動物のＥＳＡ低反応性；または（３）哺乳動物における心疾患の発症。ここで、ＡＤＭＡは、哺乳動物またはＥＳＡ治療中の上記哺乳動物から得られた血液試料の赤血球中に存在するＡＤＭＡである。

【0026】

本発明の第２の態様は、哺乳動物から得られた血液試料の赤血球中のＡＤＭＡ濃度を測定またはモニターすることを含む、以下の（１）から（３）に記載の方法に関する：（１）哺乳動物における腎臓貧血の検査方法；（２）ＥＳＡ投与治療哺乳動物のＥＳＡ低反応性をモニターする方法；または（３）哺乳動物における心疾患の検査方法。

【0027】

本発明の第３の態様は、哺乳動物から得られた血液試料の赤血球中のＡＤＭＡ濃度を測定する手段を含む、以下の（１）から（３）に記載のモニター用キットに関する：（１）哺乳動物における腎臓貧血発症モニター用キット；（２）ＥＳＡ投与治療哺乳動物におけるＥＳＡ低反応性モニター用キット；または（３）哺乳動物における心疾患発症モニター用キット。

【0028】

本発明による哺乳動物における腎臓貧血発症モニター用キットは、哺乳動物からの血液試料を受領する手段と、血液試料に含まれる赤血球中のＡＤＭＡ濃度を測定する手段と、測定したＡＤＭＡ濃度を基準値と比較する手段と、基準値との比較から該哺乳動物が腎性貧血を発症しているかおよび／または腎性貧血の程度を判定する手段を含んでいてよい。

【0029】

本発明によるＥＳＡ投与治療哺乳動物におけるＥＳＡ低反応性モニター用キットは、ＥＳＡ治療を行っている患者からの血液試料を受領する手段と、ＥＳＡ治療を行っている患者から得た血液試料に含まれる赤血球中のＡＤＭＡ濃度をモニターする手段と、測定したＡＤＭＡ濃度を基準値と比較する手段と、基準値との比較から該患者がＥＳＡ低反応性を示すかを判定する手段を含んでいてよい。

【0030】

本発明による哺乳動物における心疾患発症用モニターキットは、哺乳動物からの血液試料を受領する手段と、血液試料に含まれる赤血球中のＡＤＭＡ濃度を測定する手段と、測定したＡＤＭＡ濃度を基準値と比較する手段と、基準値との比較から該哺乳動物が心疾患を発症しているかを判定する手段を含んでいてよい。

【0031】

本発明の第４の態様は、哺乳動物から得られた血液試料の赤血球中のＡＤＭＡ濃度の増大をスクリーニングすることを含む、（１）から（３）に記載のモニターする方法に関する：（１）哺乳動物における腎臓貧血発症をモニターする方法；（２）ＥＳＡ投与治療哺乳動物におけるＥＳＡ低反応性をモニターする方法；または（３）哺乳動物における心疾患発症をモニターする方法。ここで、上記腎臓貧血発症をモニターする方法において、ＡＤＭＡ濃度の増大は、ヘモグロビン（Ｈｂ）濃度の減少と相関している。上記腎臓貧血発症をモニターする方法において、ＡＤＭＡ濃度の増大はまた、造血に対する鉄利用能の低下と相関している。さらに、上記腎臓貧血発症をモニターする方法において、ＡＤＭＡ濃度の増大はまた、血清鉄および／またはトランスフェリン飽和度（ＴＳＡＴ）の低下と相関している。上記ＥＳＡ投与治療哺乳動物のＥＳＡ低反応性をモニターする方法は、ＥＳＡ治療抵抗性を判別することを含むのが好ましい。上記心疾患発症をモニターする方法において、ＡＤＭＡ濃度の増大は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度の増大と相関している。

【0032】

本発明の第５の態様は、哺乳動物の赤血球中のＡＤＭＡの濃度の増大をスクリーニングすることを含む、哺乳動物における腎性貧血または心疾患の診断方法に関する。

【0033】

本発明の第６の態様は、哺乳動物の赤血球中のＡＤＭＡ濃度の増大をスクリーニングし、赤血球中のＡＤＭＡ濃度が基準値を超えた場合にＥＳＡの投与量を適正値まで低下させることを含む、哺乳動物におけるＥＳＡの過剰投与を防止するＥＳＡの投与方法に関する。

【0034】

本発明はまた、哺乳動物から得た血液試料の赤血球中のＡＤＭＡの濃度を測定することを含む、腎性貧血および心疾患の同時検査方法を包含する。

【0035】

本発明のさらなる態様はまた、哺乳動物から得た血液試料に含まれる赤血球中のＡＤＭＡ濃度を測定する手段を含む、腎性貧血発症および心疾患発症を同時にモニターするキットを包含する。

【0036】

さらに、本発明はまた、腎性貧血におけるＥＳＡ治療抵抗性患者を判別する方法であって、ＥＳＡ治療を行っている患者から得た血液試料に含まれる赤血球中のＡＤＭＡ濃度をモニターすることを含む、方法に関する。

【発明の効果】

【0037】

赤血球ＡＤＭＡはＥＰＯと独立して腎性貧血と強い相関を認めるため、ＥＰＯ産生低下以外の腎性貧血バイオマーカーになり得る。またＥＳＡ投与が過剰な場合やＥＳＡ低反応性に対しても赤血球ＡＤＭＡは有意に上昇するため、腎性貧血でのＥＳＡの適正使用の指標に最適である。この結果、腎性貧血におけるＥＳＡ治療抵抗性患者を判別できる。またＥＳＡ使用時に赤血球ＡＤＭＡをモニターすることで、ＥＳＡ量が適正化され、ＥＳＡ治療抵抗性患者の減少や医療費削減につながる。さらに、新たな腎性貧血治療薬の開発の際には、Ｈｂ以外の適切な指標が必要であり、赤血球ＡＤＭＡは新薬開発時のマーカーとして貢献ができる。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1】図１は、アルギニンからのＡＤＭＡの生成過程を示す模式図である。

【図2】図２は、ＡＤＭＡの代謝経路とＮＯ産生低下を示す模式図である。

【図3】図３は、赤血球中のＡＤＭＡ代謝経路を示す模式図である。

【図4】図４は、赤血球ＡＤＭＡ濃度と貧血との関係を示す図である。

【図5】図５は、赤血球ＡＤＭＡ濃度と鉄代謝指標の相関を示す図である。（Ａ）は赤血球ＡＤＭＡ濃度と血清鉄との相関、（Ｂ）は赤血球ＡＤＭＡ濃度とＴＳＡＴとの相関をそれぞれ示す。

【図6】図６は、赤血球ＡＤＭＡ濃度と心疾患マーカーであるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰとの相関を示す図である。

【図7】図７は、ＥＳＡ治療後の赤血球ＡＤＭＡ濃度とＥＳＡ低反応性の関係を示す図である。

【図8】図８は、健常者とＣＫＤ患者の血清中、赤血球中ＡＤＭＡ濃度比較を示す図である。

【図9】図９は、ＣＫＤモデルマウスにおける赤芽球関連遺伝子の発現を示す図である。

【図10】図１０は、エリスロポエチンシグナルとＡＤＭＡ蓄積によるエリスロポエチン受容体発現阻害を介した赤血球産生障害を示す図である。

【図11】図１１は、ＬＣ−ＭＳとＥＬＩＳＡによる測定値比較を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0039】

本発明は、腎性貧血のバイオマーカーとしてのＡＤＭＡの使用に関する。詳細には、以下の（１）から（３）をモニターするための、ＡＤＭＡのバイオマーカーとしての使用に関する：（１）哺乳動物における腎性貧血の発症；（２）赤血球造血刺激因子製剤（ＥＳＡ）の投与治療を行っている哺乳動物のＥＳＡ低反応性；または（３）哺乳動物における心疾患の発症。

【0040】

以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。

【0041】

Ａ．腎性貧血
本発明において腎性貧血とは、腎障害による腎でのＥＰＯ産生能の低下による貧血をいう。腎性貧血の原因には、uremic toxinやendotoxin、炎症などによる赤血球寿命の短縮、造血細胞のＥＰＯ反応性の低下、栄養障害、血液透析（ＨＤ）患者における回路内残血などの要因も含まれる。腎性貧血の頻度が急激に増加する糸球体濾過量（ＧＦＲ）低下の目安は、血清クレアチニン（Ｃｒ）値≧２ｍｇ／ｄＬまたはクレアチニンクリアランス（Ｃｃｒ）値＜２０〜３５ｍＬ／分程度（ＣＫＤステージ４〜５）である（Hakim RMら、Am J Kidney Dis 11: 238-247, 1988；Chandra Mら、J Pediatr 113: 1015-1021, 1988；Chandra Mら、J Pediatr）。

【0042】

健常人の生理的なＨｂ値は年齢、性、人種などにより異なる。従って貧血の診断基準はこれらの要因を考慮して設定する必要がある。貧血の診断に際しては、貧血をきたすさまざまな疾患を鑑別する必要がある。その際、平均赤血球容積（ＭＣＶ）による分類が有用である。腎性貧血の主因は腎障害に伴うＥＰＯの産生低下であり、これ以外に貧血の原因疾患が認められない時に初めて診断される。

【0043】

日本人における貧血の診断基準値は、成人男性ではＨｂ値＜１３.５ｇ／ｄＬ（ヘマトクリット（Ｈｔ）値＜４０％）、成人女性ではＨｂ値＜１１.５ｇ／ｄＬ（Ｈｔ値＜３５％）である。

【0044】

一方、ＥＰＯ抵抗性貧血は、厳密な定義はないが、通例として、血液透析患者ではｒＨｕＥＰＯ最高投与量９,０００ＩＵ／週、ＣＡＰＤ患者ではｒＨｕＥＰＯ最高投与量６,０００ＩＵ／週を投与してもＨｔ値≧２５％に維持できない高度の貧血を有する者、あるいは、血液透析患者では最高投与量９,０００ＩＵ／週、ＣＡＰＤ患者では最高投与量６,０００ＩＵ／週を投与してもＨｔ値≧６％［Ｈｂ値≧２ｇ／ｄＬ］の上昇がみられない者とされている。

【0045】

ＥＰＯ反応性低下の原因としては、（１）赤血球の産生低下（鉄欠乏状態（最多の原因）、慢性感染症（ＩＬ−１、ＴＮＦ）、悪性腫瘍の合併、骨髄線維症、高度の二次性副甲状腺機能亢進症、アルミニウム蓄積（治療初期の抵抗性に関与）、透析量の不足、栄養不足（特に葉酸、ビタミンＢ_６、Ｂ_１２の欠乏）、骨髄機能抑制作用のある薬剤使用）、および（２）赤血球の喪失（出血（顕性、潜在性）、多量の採血、高度の脾機能亢進症（肝硬変などに合併）、溶血亢進状態（人工弁など）、ダイアライザー再利用時の残留物）が挙げられる。

【0046】

Ｂ．赤血球造血刺激因子製剤（ＥＳＡ）
腎性貧血に対する第一選択薬はＥＳＡである。現在市販されている遺伝子組換えヒトエリスロポエチン製剤にはエポエチンαとエポエチンβがある。その後、遺伝子組換えヒトエリスロポエチン製剤にもダルベポエチンアルファなどの第２世代が現れ、これにともなってヒトエリスロポエチン製剤（ＥＰＯ）という名称に代わって第２世代をも包括する赤血球造血刺激因子製剤（ＥＳＡ）の名称が用いられるようになった。

【0047】

投与量や投与回数は、ＥＳＡの種類、投与開始時のＨｂ値、貧血改善目標値、予測される、あるいは目標とする貧血改善速度などを勘案して決定されるべきである。

【0048】

本発明のモニター法は、いずれのＥＳＡに対しても用いることができる。以下に示す各ＥＳＡの投与量の調整に際し、本発明に従ってＨｂ濃度の代わりに赤血球ＡＤＭＡ濃度を用いることができる。

【0049】

１．エポエチンαとエポエチンβ
エポエチンαとエポエチンβは、腎性貧血に対し、初期量として週３回、１回１５００単位を投与する。その後は、Ｈｂ濃度が１０〜１１ｇ／ｄＬ（ヘマトクリット値に換算して３０〜３３％）に維持されるように投与量と投与頻度を調整する。エポエチンαとエポエチンβは、血液回路から、原則として透析終了時にゆっくりと静注する。エポエチンαあるいはエポエチンβの投与量の上限は、通常、週３回、１回３０００単位である。エポエチンアルファ（遺伝子組換え）epoetin alfaは、エスポー（協和発酵キリン）として市販されている。エポエチンベータ（遺伝子組換え）epoetin betaは、エポジン（中外製薬）として市販されている。

【0050】

２．ダルベポエチンα
ダルベポエチンαは、エポエチンαの１６５個のアミノ酸残基のうちの５ヶ所が別のアミノ酸残基に置き換えられ、さらに２本の糖鎖が付加された遺伝子組換えヒトエリスロポエチン製剤である。ダルベポエチンαの半減期は２５.３時間と、エポエチンαの半減期（８.５時間）の３倍である。したがって、ダルベポエチンαでは、エポエチンαやエポエチンβよりも少ない投与頻度（週１回ないし２週１回）でＨｂ濃度（本発明に従えば、赤血球ＡＤＭＡ濃度）を目標域に維持することができる。

【0051】

ダルベポエチンαは、以前は、すでにエポエチンαあるいはエポエチンβを使用している患者において、これらの製剤から切り替えて使用することになっていた。しかし、平成２２年８月より、腎性貧血に対して、最初からダルベポエチンαを使用してもよいこととなった。ダルベポエチンαは、週１回、２０μｇから開始する。ダルベポエチンαの投与量の上限については、週１回、１回６０μｇとすることが多い。ダルベポエチンαも、透析終了時に血液回路からゆっくりと静注する。ダルベポエチンアルファは、ネスプ（協和発酵キリン）として市販されている。

【0052】

３．エポエチンベータペゴル
エポエチンネスプベータペゴルは、エポエチンβに１分子の直鎖メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を化学的に結合させた遺伝子組換えヒトエリスロポエチン製剤である。このような化学的修飾により、エポエチンベータペゴルの半減期は１６８〜２１７時間と、エポエチンβの半減期である９.４時間の約２０倍、ダルベポエチンアルファの半減期である３２〜４９時間の約４倍となった。したがって、エポエチンベータペゴルは４週間に１回の投与（初回は２週間に１回）で、Ｈｂ濃度（本発明に従えば、赤血球ＡＤＭＡ濃度）を至適範囲内まで上昇させることができる。エポエチンベータペゴルは、ミルセラ（中外製薬）として市販されている。

【0053】

ａ．初期用量
エポエチンベータペゴルは、初期には１回５０μｇを２週に１回静脈内投与する。これによってはＨｂ濃度に適度な上昇がみられなかった場合（本発明に従えば、赤血球ＡＤＭＡ濃度に適度な低下がみられなかった場合）、エポエチンベータペゴルの投与量を増やす。エポエチンベータペゴルの造血効果は長時間持続するので、エポエチンベータペゴルの投与開始後はＨｂ濃度（本発明に従えば、赤血球ＡＤＭＡ濃度）の推移を十分に観察し、効果が不十分であったり、あるいは効果が予想以上であれば、早めに投与量の増減を検討する。なお、エポエチンベータペゴルの投与量を増やす場合には原則として、表１にしたがって１段階ずつ増量していく。

【0054】

表１：エポエチンベータペゴルの投与量を増やす場合の投与段階

【0055】

初期投与期間中、目標とするＨｂ濃度が得られ、かつ、濃度が安定したら、エポエチンベータペゴルの投与間隔を延長することができる。その場合には１回の投与量を２倍にし、投与間隔を２週１回から４週１回に変更する。４週に１回の投与間隔ではＨｂ濃度（本発明に従えば、赤血球ＡＤＭＡ濃度）を目標範囲に維持できない場合、１回の投与量を半分にし、かつ２週に１回の投与間隔に戻す。

【0056】

ｂ．エポエチンαやエポエチンβからエポエチンベータペゴルに切替える場合の初回用量
エポエチンαやエポエチンβからエポエチンベータペゴルに切替える場合には、Ｈｂ濃度（本発明に従えば、赤血球ＡＤＭＡ濃度）の推移が安定していることを確認したうえで、エポエチンαあるいはエポエチンβの週あたりの投与量が４,５００ＩＵ未満の患者ではエポエチンベータペゴルの１００μｇを、４,５００ＩＵ以上の患者では１５０μｇを４週に１回、静脈内投与する。なお、ダルベポエチンアルファからエポエチンベータペゴルへ切替える際の初回用量については報告がない。

【0057】

ｃ．維持用量
目標とするＨｂ濃度（本発明に従えば、赤血球ＡＤＭＡ濃度）が得られ、かつ、濃度が安定したら、そのときのエポエチンベータペゴル投与量を維持投与量とする。維持投与量の上限は１回２５０μｇとする。

【0058】

腎性貧血治療の目標としては、保存期慢性腎臓病の腎性貧血目標Ｈｂ値は、１１ｇ／ｄＬ以上とし、ＥＳＡの投与開始基準は複数回の検査でＨｂ値１１ｇ／ｄＬ未満となった時点とする。貧血の過剰な改善はＥＳＡ高用量投与による弊害など、生命予後の悪化をもたらす可能性があるので、１３ｇ／ｄＬ超をＥＳＡ減量・休薬基準とする。すでに心血管合併症を有する患者や、医学的に必要と考えられる患者の上限は１２ｇ／ｄＬにとどめる。本発明では、これらＨｂ値に代えて赤血球ＡＤＭＡ濃度をモニターすることができる。

【0059】

Ｃ．ＡＤＭＡ
ＡＤＭＡは、アミノ酸の一種であるアルギニンに２つのメチル基が付加された修飾アミノ酸である。ＡＤＭＡは、一酸化窒素（ＮＯ）生成酵素の内因性阻害物質である。ＡＤＭＡは、メチル化タンパク質の分解過程で形成された後、腎臓で排泄されるか、ジメチルアルギニンジメチルアミノ基加水分解酵素（Dimethylarginine Dimethylaminohydrolase：ＤＤＡＨ）により代謝分解される。ヒト内皮細胞および尿細管細胞などの多くの細胞種では、ＡＤＭＡの合成能と代謝能を有する。ＡＤＭＡの血中濃度の上昇は、内皮機能障害に関連する数多くの疾患に相関性がある。例えば、透析患者の血中ＡＤＭＡ濃度の上昇は、動脈硬化および心臓血管疾患リスクと相関性を示す。さらに、ＡＤＭＡ濃度の上昇は高コレステロール血症、高血圧、動脈硬化、慢性腎不全、慢性心不全などの患者でも確認されており、内皮血管拡張の制限と関連があると考えられている。近年では、ＡＤＭＡは重要な新規心臓血管危険因子となる可能性が示されている。

【0060】

本発明では、腎性貧血の発症・程度の指標として赤血球ＡＤＭＡ濃度を用いる。これまで、赤血球ＡＤＭＡ濃度が腎性貧血と相関を有することは知られていなかった。

【0061】

Ｄ．赤血球ＡＤＭＡ濃度のモニター
赤血球ＡＤＭＡ濃度を測定するには、まず赤血球試料の調製を行い、ついでＡＤＭＡ濃度測定を行えばよい。赤血球試料の調製は、以下のようにして行う。ヘパリン採血した全血を遠心（３,０００ｒｐｍ、４℃、１０分）し、血漿を採取する。血球画分に２倍量のＰＢＳを加え、軽く転倒混和し、遠心（３,０００ｒｐｍ、４℃、１０分）する。ＰＢＳおよびbuffy coatを除去し、赤血球画分とする。赤血球画分に等量の０.１Ｍリン酸緩衝液を加え、溶血させる（保存の場合はここで−８０℃保存）。溶血試料を遠心し（１２,０００ｒｐｍ、４℃、２０分）、上清を赤血球試料とする。

【0062】

ＡＤＭＡ濃度測定は、以下のようにして行う。試料（１０ｕＬ）をチューブに採取する。０.１％ＦＡ−アセトニトリル（７０ｕＬ）およびＩＳ（内標準物質）（２０ｕＬ）を添加する。ミキサーにて撹拌（３０秒）、ついで超音波水浴上にて撹拌（５分）する。遠心分離（１６,４００×ｇ、４℃、１０分）の後、上清をフィルター（０.２μｍ）に通し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにて分析する。また、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに代えてＥＬＩＳＡにより測定することもできる。ＥＬＩＳＡにより測定する場合、以下のようにして行う。赤血球試料（１００ｕＬ）に等量の１０%トリクロロ酢酸を加え混和後、遠心（１５,０００ｒｐｍ、４℃、２０分）し、上清（８０ｕＬ）を新しいチューブにとり、適量の１Ｍリン酸水素二ナトリウム溶液（ｐＨ１２）で中和し、測定試料とする。測定試料および検量線用ＡＤＭＡ溶液（各１０ｕＬ）に０．１Ｍリン酸緩衝液（５０ｕＬ）、０.１ＭＮ−スクシンイミジル３−マレイミドベンゾエート／ＤＭＳＯ（２０ｕＬ）を加え、３０分撹拌後、遠心分離（１５,０００ｒｐｍ、４℃、３０分）した上清を用い、競合阻害ＥＬＩＳＡ法にて測定する。

【0063】

赤血球ＡＤＭＡ濃度が測定されたら、これをＨｂ濃度との相関関係から腎性貧血の発症・程度を判定し、ＥＳＡの使用量を適正にすることができ、これによりＥＳＡの過量投与やＥＳＡ低反応性患者への長期間の使用を回避することができる。具体的には、例えばエポエチンαやエポエチンβで治療を行っている場合、Ｈｂ濃度が１０〜１１ｇ／ｄＬ（ヘマトクリット値に換算して３０〜３３％）に維持されるように投与量と投与頻度を調整する必要があるが、これを赤血球ＡＤＭＡ濃度のモニターにより行うことができる。ダルベポエチンαやエポエチンベータペゴルでも同様である。エポエチンベータペゴルの場合は、造血効果が長時間持続するので、エポエチンベータペゴルの投与開始後は赤血球ＡＤＭＡ濃度の推移を十分に観察し、効果が不十分であったり、あるいは効果が予想以上であれば、早めに投与量の増減を検討する。なお、エポエチンベータペゴルの投与量を増やす場合には原則として、表１にしたがって１段階ずつ増量していく。

【0064】

ＥＰＯ抵抗性貧血は、厳密な定義はないが、通例として、血液透析患者ではｒＨｕＥＰＯ最高投与量９,０００ＩＵ／週、ＣＡＰＤ患者ではｒＨｕＥＰＯ最高投与量６,０００ＩＵ／週を投与してもＨｔ値≧２５％に維持できない高度の貧血を有する者、あるいは、血液透析患者では最高投与量９,０００ＩＵ／週、ＣＡＰＤ患者では最高投与量６,０００ＩＵ／週を投与してもＨｔ値≧６％［Ｈｂ値≧２ｇ／ｄＬ］の上昇がみられない者とされている。

【0065】

本発明により、ＥＳＡ治療がすでに行われている患者における赤血球ＡＤＭＡ濃度はＥＳＡ低反応性指数と有意な正相関を示すことがわかった。この結果から赤血球ＡＤＭＡ濃度はＥＳＡ低反応性を反映し、赤血球ＡＤＭＡ濃度の低下はＥＳＡ低反応性の改善の有用な指標となる。ここで、ＥＳＡ低反応性指数（ESA resistant index）とは、ESA dose/week/Hb/BWで示され、１週間当たりのＥＳＡ使用量をＨｂ値、体重で補正した値をいう。

【0066】

腎性貧血はＣＫＤ進展だけでなく心疾患のリスク因子でもあり、腎性貧血による病態の把握や治療効果の判定において貧血の程度と心疾患リスクの両方を反映することは重要である。赤血球ＡＤＭＡ濃度は、心疾患のリスク因子として知られるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと強い正相関を示した。このことから、赤血球ＡＤＭＡ濃度は貧血の程度のみならず心疾患合併リスクをも予測しうることが示唆され、心疾患合併予防効果のある貧血治療判定に有用なマーカーとなると考えられる。

【0067】

Ｅ．キット
本発明はまた、哺乳動物における腎性貧血発症モニター用キットおよび哺乳動物における心疾患発症モニター用キットをも提供する。

【0068】

本発明による腎性貧血発症および／または心疾患発症モニター用キットは、哺乳動物から得た血液試料に含まれる赤血球中のＡＤＭＡ濃度を測定する手段を含む。本発明による腎性貧血発症モニター用キットはまた、哺乳動物からの血液試料を受領する手段、測定したＡＤＭＡ濃度を基準値と比較する手段、および基準値との比較から腎性貧血を発症しているかおよび／または腎性貧血の程度および／または心疾患を発症しているかを判定する手段を含んでいてよい。

【0069】

本発明によるＥＳＡ治療を行っている患者におけるＥＳＡ低反応性モニター用キットは、ＥＳＡ治療を行っている患者から得た血液試料に含まれる赤血球中のＡＤＭＡ濃度をモニターする手段を含む。本発明によるＥＳＡ治療を行っている患者におけるＥＳＡ低反応性モニター用キットはまた、ＥＳＡ治療を行っている患者からの血液試料を受領する手段、測定したＡＤＭＡ濃度を基準値と比較する手段、および基準値との比較から該患者がＥＳＡ低反応性を示すかを判定する手段を含んでいてよい。

【0070】

上記基準値としては、ＥＳＡ低反応性について現在も明確な判断基準がなく、日本透析医学会、２００８年版「慢性腎臓病における腎性貧血治療ガイドライン」においても「ＥＳＡ療法低反応性の明確な定義は存在しない」とされているが、目安として以下のように規定されている。
「ＨＤ（血液透析）患者：ｒＨｕＥＰＯは１回３,０００単位を週３回（週当たり９,０００単位）静注で使用、ＤＡでは６０ｍｇを週１回静注使用しても貧血の改善が得られず、目標Ｈｂ値が達成できない場合をＥＳＡ療法低反応性とする。
ＰＤ（腹膜透析）患者：ｒＨｕＥＰＯは１回６,０００単位を週１回（週当たり６,０００単位）皮下注で使用、ＤＡでは６０ｍｇを週１回静注で使用しても貧血の改善が得られず、目標Ｈｂ値が達成できない場合をＥＳＡ療法低反応性とする。
ＮＤ（保存期慢性腎臓病）患者：ＮＤ患者ではｒＨｕＥＰＯを１回６,０００単位，週１回（週当たり６,０００単位）皮下注で使用しても貧血の改善が得られず、目標Ｈｂ値が達成できない場合をｒＨｕＥＰＯ療法低反応性とする。」

【0071】

本発明において、赤血球中ＡＤＭＡは誘導体化し、競合ＥＬＩＳＡで測定することができる。例えば、本発明によるキットは、以下を含んでいてよい。
・ＡＤＭＡ−ＳＭＢ−ＢＳＡ（ＡＤＭＡと牛血清アルブミン（ＢＳＡ）をＮ−スクシンイミジル３−マレイミドベンゾエート（ＳＭＢ）で架橋した複合体）をコーティングした９６ｗｅｌｌプレート
・検量線を作成するためのＳＭＢ−ＡＤＭＡ標品
・サンプル中ＡＤＭＡを誘導体化するためのＳＭＢ標品
・一次抗体；ＡＤＭＡ−ＳＭＢを認識するマウスモノクローナル抗体
・二次抗体：ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体
・発色試薬
・必要に応じて遠心式限外濾過ユニット（赤血球溶血サンプルの除タンパクのため）

【0072】

検量線は、０〜５００ｎＭの濃度範囲のＡＤＭＡに対して、０ｎＭのＯＤ値を１００％とした各濃度の阻害率を求めることにより作成することができる。
Ｆ．診断方法
本発明はさらに、哺乳動物の赤血球中のＡＤＭＡ濃度の増大をスクリーニングすることを含む、哺乳動物における腎性貧血の診断方法、および哺乳動物の赤血球中のＡＤＭＡ濃度の増大をスクリーニングすることを含む、哺乳動物における心疾患の診断方法をも提供する。

【0073】

本発明に従って、赤血球ＡＤＭＡ濃度は腎性貧血と負の相関関係があるため、被験者からの血液試料中の赤血球ＡＤＭＡ濃度を測定し、一定の基準値を超える赤血球ＡＤＭＡ濃度に基づいて腎性貧血の診断を行うことができる。

【0074】

Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）とＮ末端プロＢＮＰ（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）の血中濃度は、急性冠症候群（ＡＣＳ）発症早期から上昇し、ＢＮＰとＮＴ−ｐｒｏＢＮＰとは心機能・心不全のバイオマーカーとして知られている。本発明に従い、赤血球ＡＤＭＡ濃度が心疾患のリスク因子として知られるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと強い正の相関関係があることがわかった。このため、被験者からの血液試料中の赤血球ＡＤＭＡ濃度を測定し、一定の基準値を超える赤血球ＡＤＭＡ濃度に基づいて心疾患の診断を行うことができる。ここで、本発明に従って診断できる心疾患としては、心不全、急性冠症候群（ＡＣＳ）、急性心筋梗塞等が挙げられる。

【0075】

本発明において、「哺乳動物」には、ヒト、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウサギなどが含まれるが、ヒトが好ましい。

【0076】

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。

【実施例1】

【0077】

赤血球ＡＤＭＡ濃度と貧血との相関関係
保存期ＣＫＤ患者（＜ｅＧＦＲ６０ｍｌ／分／１.７３ｍ^２）６１人を対象にして、赤血球ＡＤＭＡ濃度と貧血との相関関係を調べた。このうち、強い炎症や重篤な肝障害のある患者およびその時点または直近に急性腎障害と診断された、手術を受けた後の患者４人は除外し、患者５７人について調査した。

【0078】

朝の採血時に採血および採尿を行った。ＡＤＭＡ濃度は東北大学にてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により測定を行った。赤血球中の濃度はＢＣＡ法にて測定したタンパク質濃度で補正し、g proteinあたりのmol数で表した。

【0079】

１．赤血球ＡＤＭＡの測定方法
（１）赤血球試料の調製
ヘパリン採血した全血（１０ｍｌ）を遠心（３,０００ｒｐｍ、４℃、１０分）し、血漿を採取した。血球画分に２倍量のＰＢＳを加え、軽く転倒混和し、遠心（３,０００ｒｐｍ、４℃、１０分）した。ＰＢＳおよびbuffy coatを除去し、赤血球画分とした。赤血球画分（０.２ｍｌ）に等量の０.１Ｍリン酸緩衝液を加え、溶血させた（保存の場合はここで−８０℃保存した）。溶血試料（０.４ｍｌ）を遠心し（１２,０００ｒｐｍ、４℃、２０分）、上清を赤血球試料とした。

【0080】

（２）ＡＤＭＡ濃度測定
試料（１０ｕＬ）をチューブに採取した。０.１％ＦＡ−アセトニトリル（７０ｕＬ）およびＩＳ（内標準物質）（２０ｕＬ）を添加した。ミキサーにて撹拌（３０秒）、ついで超音波水浴上にて撹拌（５分）した。遠心分離（１６,４００×ｇ、４℃、１０分）の後、上清をフィルター（０.２μｍ）に通し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにて分析した。

【0081】

（３）赤血球ＡＤＭＡ濃度と貧血との関係
保存期ＣＫＤ患者における赤血球ＡＤＭＡ濃度と貧血との関係を見るために、横軸に赤血球ＡＤＭＡ濃度と縦軸にＨｂの値をとり、単回帰分析を行った。その結果を図４に示す。図４から明らかなように、赤血球ＡＤＭＡ濃度が高いほどＨｂ値が低下する有意な負の相関がみられた。このことから、赤血球ＡＤＭＡ濃度は貧血の指標なると考えられた。

【0082】

このとき赤血球ＡＤＭＡ濃度はｅＧＦＲとも相関関係を示したので、赤血球ＡＤＭＡ濃度を中央値で分け、二項ロジスティック回帰分析を行った。その結果を表２に示す。

【0083】

表２：二項ロジスティック回帰分析（Low rADMA <7.09 vs High rADMA >7.09）

表２から明らかなように、赤血球ＡＤＭＡ濃度は年齢や性別、ＢＭＩ、トータルコレステロール、ｅＧＦＲよりも強くＨｂと関係することがわかった。

【実施例2】

【0084】

赤血球ＡＤＭＡと鉄代謝指標の相関関係
赤血球ＡＤＭＡ濃度がＨｂ値を反映する理由を明らかとするため、貧血増悪因子である鉄代謝との関連を確認した。具体的には、赤血球ＡＤＭＡ濃度と血清鉄およびトランスフェリン飽和度（ＴＳＡＴ）との相関を調べた。

【0085】

（１）血清鉄の測定
プレイン採血した全血（１０ｍｌ）を遠心（３,０００ｒｐｍ、４℃、１０分）し、血清を採取した。自動分析装置ＬＡＢＯＳＰＥＣＴ００８（ヒタチハイテクノロジー）および試薬Ｌ−タイプワコーＦｅ（和光純薬工業株式会社）を使用し、血清試料（７.５ｕｌ）を用いて測定した。

【0086】

（２）ＴＳＡＴの測定
プレイン採血した全血（１０ｍｌ）を遠心（３,０００ｒｐｍ、４℃、１０分）し、血清を採取した。自動分析装置ＬＡＢＯＳＰＥＣＴ００８（ヒタチハイテクノロジー）および試薬Ｌ−タイプワコーＵＩＢＣ（和光純薬工業株式会社）を使用し、血清試料（７.５ｕｌ）を用いてＵＩＢＣ（unsaturated iron binding capacity；不飽和鉄結合能）を測定した。ＴＳＡＴは血清鉄／（血清鉄＋ＵＩＢＣ）の式で算出した。

【0087】

（３）赤血球ＡＤＭＡ濃度と血清鉄およびＴＳＡＴとの相関
赤血球ＡＤＭＡ濃度と血清鉄およびＴＳＡＴとの相関を図５に示す。図５に示す結果から明らかなように、赤血球ＡＤＭＡ濃度は血清鉄（パネル（Ａ））およびＴＳＡＴ（パネル（Ｂ））と有意な負の相関を示した。このことから、赤血球ＡＤＭＡ濃度の上昇は造血に対する鉄利用能の低下と関連し、貧血の増悪を反映すると考えられた。

【実施例3】

【0088】

赤血球ＡＤＭＡとＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（心疾患マーカー）の相関関係
腎性貧血はＣＫＤ進展だけでなく心疾患のリスク因子であり、腎性貧血による病態の把握や治療効果の判定において貧血の程度と心疾患リスクの両方を反映することは重要であると考えられた。そこで、赤血球ＡＤＭＡ濃度と、心疾患のリスク因子として知られるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰとの相関を調べた。

【0089】

（１）ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの測定
プレイン採血した全血（１０ｍｌ）を遠心（３,０００ｒｐｍ、４℃、１０分）し、血清を採取した。免疫分析装置スフィアライトワコー（和光純薬工業株式会社）および専用試薬スフィアライトｐｒｏＢＮＰ（三洋化成工業株式会社）を使用し、血清試料（４０ｕｌ）を用いてＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを測定した。

【0090】

（２）赤血球ＡＤＭＡ濃度とＮＴ−ｐｒｏＢＮＰとの相関
赤血球ＡＤＭＡ濃度とＮＴ−ｐｒｏＢＮＰとの相関を調べた。その結果を図６に示す。図６に示す結果から明らかなように、赤血球ＡＤＭＡ濃度は、心疾患のリスク因子として知られるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと強い正相関を示した。このことから、赤血球ＡＤＭＡ濃度は貧血の程度のみならず心疾患合併リスクも予測しうることが示唆され、心疾患合併予防効果のある貧血治療判定に有用なマーカーとなると考えられた。

【0091】

Ｈｂと同様に赤血球ＡＤＭＡ濃度を中央値で分けた二項ロジスティック回帰分析を行った。その結果を表３に示す。
表３：二項ロジスティック回帰分析（Low rADMA <7.09 vs High rADMA >7.09）

表３から明らかなように、腎機能の影響を除いてもＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは赤血球ＡＤＭＡ濃度と強い相関関係が認められた。

【実施例4】

【0092】

ＥＳＡ治療がすでに行われている患者における赤血球ＡＤＭＡ濃度とＥＳＡ低反応性指数の相関関係
ＥＳＡ治療がすでに行われている患者における赤血球ＡＤＭＡ濃度について、ＥＳＡ低反応性指数（ESA resistant index）との相関を調べた。ＥＳＡ低反応性指数は、ESA dose/week/Hb/BWと定義した。つまり、ＥＳＡ低反応性指数は、１週間当たりのＥＳＡ使用量をＨｂ値、体重で補正した値をいう。その結果を図７に示す。

【0093】

図７に示す結果から明らかなように、ＥＳＡ治療がすでに行われている患者における赤血球ＡＤＭＡ濃度はＥＳＡ低反応性指数と有意な正相関を示すことがわかった。このことから、赤血球ＡＤＭＡ濃度はＥＳＡ低反応性を反映し、赤血球ＡＤＭＡ濃度の低下はＥＳＡ低反応性の改善の有用な指標となる。

【実施例5】

【0094】

健常者とＣＫＤ患者の血清中、赤血球中ＡＤＭＡ濃度比較
明らかな疾患を有さない健常者３１名（男性／女性；２４／７、平均年齢±標準偏差；３９.７±７.９歳）とＣＫＤ患者５４名の血漿ＡＤＭＡ濃度および赤血球ＡＤＭＡ濃度を比較した。赤血球試料の調製およびＡＤＭＡ濃度測定法は、実施例１の「赤血球ＡＤＭＡの測定方法」の記載と同様にして行った。二群の比較は、独立したｔ検定で行った。

【0095】

その結果を図８に示す（Ａ：＊＊Ｐ＜０.０１；Ｂ：＊Ｐ＜０.０５）。図８の結果から明らかなように、ＣＫＤ患者は、血漿ＡＤＭＡ濃度のみならず赤血球ＡＤＭＡ濃度においても健常者に比べて上昇していた。これまでＣＫＤ患者において血漿ＡＤＭＡ濃度が上昇することは報告されていたが、ＣＫＤ患者において赤血球ＡＤＭＡ濃度も有意に上昇していることが本発明によって初めて示された。

【実施例6】

【0096】

ＣＫＤモデルマウスにおける赤芽球関連遺伝子の発現
ＡＤＭＡ分解酵素ＤＤＡＨ１ＴｇマウスとワイルドタイプとしてＣ５７ＢＬ６マウスを用い、ＣＫＤモデルは５／６腎摘を行い作成した。５／６腎摘後１２週目に評価したところ、ＷＴ−ＣＫＤ群において、血漿および赤血球のＡＤＭＡ濃度は疑似手術（ｓｈａｍ）群と比較し有意に上昇したが、ＤＤＡＨ１Ｔｇマウスにおいてどちらも有意に抑制されていた。ＣＫＤ群における血圧および腎機能は、ＷＴとＴｇ間に有意な差は認められなかった。一方、興味深いことに、ＷＴ―ＣＫＤマウスで観察されるＨｂおよびＨｔの低下は、Ｔｇマウスにおいて軽度ではあったが有意な改善を認め、網状赤血球の割合も有意に上昇しており、貧血、造血障害が改善された。

【0097】

マウスにおいて脾臓は造血組織である。脾臓のｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果を図９に示す。図９の結果から明らかなように、ＷＴ−ＣＫＤにおいて、ＷＴ−ｓｈａｍと比較しＥｐｏ受容体（ＥｐｏＲ）の発現が有意に低下したが、ＤＤＡＨ１−Ｔｇ−ＣＫＤにおいてＥｐｏＲ発現が有意に上昇していた。それにともない、Ｅｐｏ／ＥｐｏＲシグナルの下流にあって赤芽球の鉄利用に関わる遺伝子（ＴｆＲ−１、ＴｆＲ−２、エリスロフェロン）の発現がＤＤＡＨ−１Ｔｇマウスにおいて有意に上昇していた。

【0098】

この結果から、ＣＫＤにおいて赤芽球中でのＡＤＭＡ蓄積は、ＥｐｏＲの発現を低下させ、Ｅｐｏ／ＥｐｏＲシグナルを阻害し、赤芽球の成熟障害を惹起する結果、貧血やＥＳＡ抵抗性の発症に関与することが示唆された（図１０）。赤血球中ＡＤＭＡ濃度は、この赤芽球でのＡＤＭＡ蓄積を反映するため、貧血やＥＳＡ抵抗性指数と相関したと考えられる。

【実施例7】

【0099】

ＬＣ−ＭＳとＥＬＩＳＡによる測定値比較
ＡＤＭＡ濃度測定をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで行った場合とＥＬＩＳＡにより行った場合との相関を調べた。
健常者からの赤血球検体（(n=16)について、赤血球溶血サンプル中のＡＤＭＡ濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳおよびＥＬＩＳＡの両方法で測定し、得られた測定濃度の相関を調べた。
その結果を図１１に示す。得られたピアソンの相関係数は０.５５２であり、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳとＥＬＩＳＡとの間で正の相関が認められた。

【産業上の利用可能性】

【0100】

慢性腎不全患者数は増加の一途を辿っており、ＥＳＡを投与される患者数も増加している。ＥＳＡの需要は全世界で増加しており、薬剤販売額の統計においても常に上位を占めている。そのため我が国のみならず、多くの国の医療経済に対する負担は大きく、ＥＳＡの適正使用ができるバイオマーカーの確立、腎性貧血治療を把握しうるモニター方法の創出が急務となっている。本発明は斯かるバイオマーカーやモニター方法として、腎性貧血におけるＥＳＡ適正使用のモニターに用いることができる。本発明はさらに、赤血球中ＡＤＭＡ阻害剤の探索におけるリサーチツールやバイオマーカーとして用いることができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】