特許 6783729 標的遺伝子発現の確率モデルを使用した細胞シグナル経路の活性の評価

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6783729

(24)【登録日】2020年10月26日

(45)【発行日】2020年11月11日

(54)【発明の名称】標的遺伝子発現の確率モデルを使用した細胞シグナル経路の活性の評価

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/01 20060101AFI20201102BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20201102BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20201102BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20201102BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/01

   C12M1/34 B

   C12Q1/06

   C12Q1/68ZNA

【請求項の数】15

【全頁数】68

(21)【出願番号】特願2017-167175(P2017-167175)

(22)【出願日】2017年8月31日

(62)【分割の表示】特願2014-520772(P2014-520772)の分割

【原出願日】2012年7月19日

(65)【公開番号】特開2017-205129(P2017-205129A)

(43)【公開日】2017年11月24日

【審査請求日】2017年8月31日

【審判番号】不服2019-5803(P2019-5803/J1)

【審判請求日】2019年5月7日

(31)【優先権主張番号】61/509,137

(32)【優先日】2011年7月19日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】11178148.0

(32)【優先日】2011年8月19日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】590000248

【氏名又は名称】コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェ

【氏名又は名称原語表記】ＫＯＮＩＮＫＬＩＪＫＥ ＰＨＩＬＩＰＳ Ｎ．Ｖ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(74)【代理人】

【識別番号】100091214

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 進介

(72)【発明者】

【氏名】フェルハーフ，ウィルヘルミュス フランシスキュス ヨハネス

(72)【発明者】

【氏名】ファン デ ストルペ，アニャ

(72)【発明者】

【氏名】ファン オーイエン，ヘンドリク ヤン

(72)【発明者】

【氏名】ドゥラ，カリアナ チャクラヴァーティ

(72)【発明者】

【氏名】アルヴェス デ インダ，マルシア

(72)【発明者】

【氏名】ホフマン，ラルフ

【合議体】

【審判長】 長井 啓子

【審判官】 大久保 智之

【審判官】 小暮 道明

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１０−１７８６５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００９年，ｖｏｌ．６９， ｎｏ．２３，ｐ．９１２５−９１３２

【文献】 ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００８年，ｖｏｌ．９， ｎｏ．９１，ｐ．１−１４

【文献】 Ｐｈｉｌ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｂ，２００８年，ｖｏｌ．３６３，ｐ．１３３３−１３４７

【文献】 Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２００６年，ｖｏｌ．５，ｐ．９９７−１０１４

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12Q1/00-1/70

C12N15/00-15/90

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

医療対象者の組織における１つ又は複数の細胞シグナル経路の活性を、抽出された前記医療対象者の組織の試料において測定される前記１つ又は複数の細胞シグナル経路のそれぞれ少なくとも９つの標的遺伝子の発現レベルを少なくとも含む入力の組に対する１つ又は複数の細胞シグナル経路を表す、確率モデル、好ましくはベイジアンネットワークに少なくとも基づき、推量するステップを含む方法であって、前記推量するステップは、
前記医療対象者の組織における、前記１つ又は複数の細胞シグナル経路のそれぞれ少なくとも９つの標的遺伝子の転写を制御する少なくとも１つの転写因子（ＴＦ）要素のレベルを推定するステップであって、前記少なくとも１つのＴＦ要素、及び、前記抽出された医療対象者の組織の試料において測定される１つ又は複数の細胞シグナル経路のそれぞれ少なくとも９つの標的遺伝子の発現レベルを関連づける前記確率モデル、好ましくはベイジアンネットワークの条件付き確率に基づき、前記少なくとも１つのＴＦ要素のレベルを推定するステップ、及び
前記組織の試料における前記ＴＦ要素の前記推定されたレベルに基づき、前記１つ又は複数の細胞シグナル経路の活性を推量するステップ、
を含み、
前記推量するステップは、前記１つ又は複数の細胞シグナル経路の前記確率モデルを使用してデジタル処理装置によって行われる、方法。

【請求項2】

前記推量するステップは、
前記確率モデルのＴＦノードによって表される前記医療対象者の組織における少なくとも１つの転写因子（ＴＦ）要素のレベルを推定するステップを含み、前記ＴＦ要素は、前記１つ又は複数の細胞シグナル経路のそれぞれ少なくとも９つの標的遺伝子の転写を制御し、当該推定するステップは、前記ＴＦノード、及び、前記抽出された医療対象者の組織の試料において測定される１つ又は複数の細胞シグナル経路のそれぞれ少なくとも９つの標的遺伝子を表す前記確率モデルにおけるノードを関連づける、前記確率モデルの条件付き確率に少なくとも部分的に基づき、
前記推量するステップは、前記１つ又は複数のシグナル経路に関する情報を表すノードを含むベイジアンネットワーク、及び、ベイジアンネットワークの接続されたノード間の条件付き確率の関係を使用することによって好ましくは行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記医療対象者の組織における推量された前記１つ又は複数の細胞シグナル経路の活性に基づき、前記１つ又は複数の細胞シグナル経路が前記医療対象者の組織において異常に機能しているかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記１つ又は複数の細胞シグナル経路は、Ｗｎｔ経路、ＥＲ経路、ＡＲ経路、及び／又は、ヘッジホッグ経路を含む、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記推量するステップは、
ＫＩＡＡ１１９９、ＡＸＩＮ２、ＲＮＦ４３、ＴＢＸ３、ＴＤＧＦ１、ＳＯＸ９、ＡＳＣＬ２、ＩＬ８、ＳＰ５、ＺＮＲＦ３、ＫＬＦ６、ＣＣＮＤ１、ＤＥＦＡ６、及びＦＺＤ７を含む群から選択される前記抽出された医療対象者の組織の試料において測定されるＷｎｔ経路の少なくとも９つの標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて前記医療対象者の組織におけるＷｎｔ経路の活性を推量するステップを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記推量するステップは、
ＣＤＨ２６、ＳＧＫ３、ＰＧＲ、ＧＲＥＢ１、ＣＡ１２、ＸＢＰ１、ＣＥＬＳＲ２、ＷＩＳＰ２、ＤＳＣＡＭ、ＥＲＢＢ２、ＣＴＳＤ、ＴＦＦ１、及びＮＲＩＰ１を含む群から選択される前記抽出された医療対象者の組織の試料において測定されるＥＲ経路の少なくとも９つの標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて前記医療対象者の組織におけるＥＲ経路の活性を推量するステップを（も）含む、請求項４又は５に記載の方法。

【請求項7】

前記推量するステップは、
ＧＬＩ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＩＧＦＢＰ６、ＳＰＰ１、ＣＣＮＤ２、ＦＳＴ、ＦＯＸＬ１、ＣＦＬＡＲ、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＲＡＢ３４、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ７、ＭＹＣＮ、ＦＯＸＭ１、ＧＬＩ３、ＴＣＥＡ２、ＦＹＮ、及びＣＴＳＬ１を含む群から選択される前記抽出された医療対象者の組織の試料において測定されるヘッジホッグ経路の少なくとも９つの標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて前記医療対象者の組織におけるヘッジホッグ経路の活性を推量するステップを（も）含む、請求項４乃至６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記推量するステップは、
ＫＬＫ２、ＰＭＥＰＡ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＫＸ３−１、ＡＢＣＣ４、ＫＬＫ３、ＦＫＢＰ５、ＥＬＬ２、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＤＨＣＲ２４、ＰＰＡＰ２Ａ、ＮＤＲＧ１、ＬＲＩＧ１、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＬＣＰ１、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＡＲ、及びＥＡＦ２を含む群から選択される前記抽出された医療対象者の組織の試料において測定されるＡＲ経路の少なくとも９つの標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて前記医療対象者の組織におけるＡＲ経路の活性を推量するステップを（も）含む、請求項４乃至７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記推量するステップがさらに、ＮＫＤ１、ＯＡＴ、ＦＡＴ１、ＬＥＦ１、ＧＬＵＬ、ＲＥＧ１Ｂ、ＴＣＦ７Ｌ２、ＣＯＬ１８Ａ１、ＢＭＰ７、ＳＬＣ１Ａ２、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＰＰＡＲＧ、ＤＫＫ１、ＨＮＦ１Ａ、及びＬＥＣＴ２を含む群から選択される前記抽出された医療対象者の組織の試料において測定されるＷｎｔ経路の少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルに基づく、請求項５に記載の方法。

【請求項10】

前記推量するステップがさらに、ＡＰ１Ｂ１、ＡＴＰ５Ｊ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＯＸ７Ａ２Ｌ、ＥＢＡＧ９、ＥＳＲ１、ＨＳＰＢ１、ＩＧＦＢＰ４、ＫＲＴ１９、ＭＹＣ、ＮＤＵＦＶ３、ＰＩＳＤ、ＰＲＤＭ１５、ＰＴＭＡ、ＲＡＲＡ、ＳＯＤ１、及びＴＲＩＭ２５を含む群から選択される前記抽出された医療対象者の組織の試料において測定されるＥＲ経路の少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルに基づく、請求項６に記載の方法。

【請求項11】

前記推量するステップがさらに、ＢＣＬ２、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＦ１、Ｈ１９、ＨＨＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＪＡＧ２、ＪＵＰ、ＭＩＦ、ＭＹＬＫ、ＮＫＸ２−２、ＮＫＸ２−８、ＰＩＴＲＭ１、及びＴＯＭ１を含む群から選択される前記抽出された医療対象者の組織の試料において測定されるヘッジホッグ経路の少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルに基づく、請求項７に記載の方法。

【請求項12】

前記推量するステップがさらに、ＡＰＰ、ＮＴＳ、ＰＬＡＵ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＲＧ１、ＦＧＦ８、ＩＧＦ１、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＮ１、ＳＧＫ１、及びＴＡＣＣ２を含む群から選択される前記抽出された医療対象者の組織の試料において測定されるＡＲ経路の少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルに基づく、請求項８に記載の方法。

【請求項13】

前記Ｗｎｔ経路の標的遺伝子の組は、ＫＩＡＡ１１９９、ＡＸＩＮ２、ＲＮＦ４３、ＴＢＸ３、ＴＤＧＦ１、ＳＯＸ９、ＡＳＣＬ２、ＩＬ８、ＳＰ５、ＺＮＲＦ３、ＫＬＦ６、ＣＣＮＤ１、ＤＥＦＡ６、及びＦＺＤ７を含み、及び／又は、
前記ＥＲ経路の標的遺伝子の組は、ＣＤＨ２６、ＳＧＫ３、ＰＧＲ、ＧＲＥＢ１、ＣＡ１２、ＸＢＰ１、ＣＥＬＳＲ２、ＷＩＳＰ２、ＤＳＣＡＭ、ＥＲＢＢ２、ＣＴＳＤ、ＴＦＦ１、及びＮＲＩＰ１を含み、及び／又は、
前記ヘッジホッグ経路の標的遺伝子の組は、ＧＬＩ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＩＧＦＢＰ６、ＳＰＰ１、ＣＣＮＤ２、ＦＳＴ、ＦＯＸＬ１、ＣＦＬＡＲ、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＲＡＢ３４、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ７、ＭＹＣＮ、ＦＯＸＭ１、ＧＬＩ３、ＴＣＥＡ２、ＦＹＮ、及びＣＴＳＬ１を含み、及び／又は、
前記ＡＲ経路の標的遺伝子の組は、ＫＬＫ２、ＰＭＥＰＡ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＫＸ３−１、ＡＢＣＣ４、ＫＬＫ３、ＦＫＢＰ５、ＥＬＬ２、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＤＨＣＲ２４、ＰＰＡＰ２Ａ、ＮＤＲＧ１、ＬＲＩＧ１、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＬＣＰ１、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＡＲ、及びＥＡＦ２を含む、請求項４乃至１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記Ｗｎｔ経路の標的遺伝子の組が、ＮＫＤ１、ＯＡＴ、ＦＡＴ１、ＬＥＦ１、ＧＬＵＬ、ＲＥＧ１Ｂ、ＴＣＦ７Ｌ２、ＣＯＬ１８Ａ１、ＢＭＰ７、ＳＬＣ１Ａ２、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＰＰＡＲＧ、ＤＫＫ１、ＨＮＦ１Ａ、及びＬＥＣＴ２を含む群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子をさらに含み、及び／又は、
前記ＥＲ経路の標的遺伝子の組が、ＡＰ１Ｂ１、ＡＴＰ５Ｊ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＯＸ７Ａ２Ｌ、ＥＢＡＧ９、ＥＳＲ１、ＨＳＰＢ１、ＩＧＦＢＰ４、ＫＲＴ１９、ＭＹＣ、ＮＤＵＦＶ３、ＰＩＳＤ、ＰＲＤＭ１５、ＰＴＭＡ、ＲＡＲＡ、ＳＯＤ１、及びＴＲＩＭ２５を含む群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子をさらに含み、及び／又は、
前記ヘッジホッグ経路の標的遺伝子の組が、ＢＣＬ２、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＦ１、Ｈ１９、ＨＨＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＪＡＧ２、ＪＵＰ、ＭＩＦ、ＭＹＬＫ、ＮＫＸ２−２、ＮＫＸ２−８、ＰＩＴＲＭ１、及びＴＯＭ１を含む群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子をさらに含み、及び／又は、
前記ＡＲ経路の標的遺伝子の組が、ＡＰＰ、ＮＴＳ、ＰＬＡＵ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＲＧ１、ＦＧＦ８、ＩＧＦ１、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＮ１、ＳＧＫ１、及びＴＡＣＣ２を含む群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子をさらに含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の方法を行うように構成されたデジタルプロセッサを含む装置、又は、請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の方法を行うためにデジタル処理装置により実行可能な命令を記憶する非一過性の記憶媒体、又は、デジタル処理装置に請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の方法を行わせるプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書において記載される対象は、主に、生物情報学、ゲノム処理技術、プロテオミクス処理技術、及び関連技術に関する。

【背景技術】

【0002】

種々の癌が、例えば細胞増殖及び転移等の癌の増殖及び進化において役割を果たすゲノム変異／変種の特定の組み合わせ、並びに／又は、特定の遺伝子に対する高い若しくは低い発現レベルと付随していると既知である腫瘍学等の医学分野における臨床適用に対して、ゲノム及びプロテオミクス解析は、実質的な実現化される且つ有望な見込みを有する。例えば、Ｗｎｔシグナル経路は、細胞増殖の調節に影響を与え、且つ、高度に調節される。調節の損失による高度なＷｎｔ経路の活性は癌と関連づけられ、中でも、悪性の結腸腫瘍を有した癌と関連づけられてきた。いかなる特定の動作原理にも限定されないけれども、悪性の結腸細胞におけるＷｎｔ経路の調節解除は高度なＷｎｔ経路の活性を生じ、続いて、悪性の結腸細胞の細胞増殖、すなわち、結腸癌の転移を引き起こすと信じられている。一方、異常に低い経路の活性も、例えば骨粗鬆症の場合に関心のあるものであり得る。

【0003】

ゲノム及びプロテオミクスデータを取得するための技術は、臨床設定において容易に利用可能になってきている。例えば、マイクロアレイによる測定は、遺伝子発現レベル、タンパク質レベル、及びメチル化等を評価するために日常的に利用されている。自動遺伝子配列決定は、対費用効果の高いＤＮＡ及びｍＲＮＡにおける遺伝的変異の同定を可能にする。遺伝子配列決定の間のｍＲＮＡレベルの定量評価は、遺伝子発現レベルを評価するためのさらに別の臨床ツールとして見込みを持つ。

【0004】

これらの進歩にもかかわらず（又或いは、これらの進歩のため）、ゲノム及びプロテオミクス解析の臨床適用は、実質的な困難、データのオーバーロードに直面している。例えば、１つの臨床試料における同定可能な変異の数は、数十万以上に達し得る。これらの変異のほとんどは、癌増殖への特定の寄与はないいわゆるバイスタンダー変異であり、少数の変異のみが癌増殖及び機能の発展に対して寄与し、これらは効果的な治療に対する標的をもたらす。１つのマイクロアレイが、数万の遺伝子に対する遺伝子発現レベルを生じ得る。これらの多量なデータを処理して、例えば正しい療法を選ぶことの適用における臨床的に有用な情報を同定することは、困難である。

【0005】

１つのアプローチは、アメリカ食料医薬品局（Ｕ．Ｓ． Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ））によって認められているテスト等、いくつかの基準のテスト又は標準化されたテストに解析を限定することである。そのようなアプローチにおいて、特定の指標又は指標の組み合わせ（例えば、変異及び／又は特定化された高い若しくは低い遺伝子発現レベル）が、示された疾患の条件（例えば、特定のタイプの癌）に対する「陽性」をテストするために検出される。基準のテストは、疾患の条件又は治療の有効性との強い相互関係を示してきた臨床研究によって支持される。このアプローチは、例えば、特定の疾患の診断又は特定のステージの特定の癌のタイプにおける薬物への応答を予測する等、基準のテストが開発されてきた臨床条件に対してのみ有用であり、また標準的条件に対してのみ適用可能であるように柔軟性に欠ける。

【0006】

別のアプローチは、機能的に関連するゲノム又はプロテオミクス指標の群の同定に基づいている。例えば、Ｗｎｔ経路は、プロテオミクス反応のカスケードを含む。この鎖の主要構成成分は、（それだけに限定されないが）ディシブルドタンパク質ファミリーのタンパク質の活性化を引き起こし、次に細胞核におけるβ−カテニン／ＴＣＦ４ベースのタンパク質複合体等の転写作用剤のレベルに影響を与える細胞のＦｒｉｚｚｌｅｄ表面受容体へのＷｎｔシグナルタンパク質の結合を含む。これらの転写作用剤は、次に、標的ｍＲＮＡ分子の転写を制御し、標的ｍＲＮＡ分子は、次に、Ｗｎｔ経路の標的タンパク質に翻訳される。臨床研究は、Ｗｎｔ経路の調節タンパク質とＷｎｔ経路の活性との相互関係をいくつか示してきた。

【0007】

しかし、そのような臨床研究の結果を、特定の患者の診断及び臨床評価に適用することは、例えばＷｎｔ経路等のシグナル経路の複雑さのため困難である。シンプルな例として、Ｗｎｔ経路において「上流」であるタンパク質の発現レベルの測定は、Ｗｎｔ経路において「下流」であるタンパク質の異常行動を検出できない場合がある。Ｗｎｔ経路は多数のフィードバック機構を含み、且つ、単純化された「上流」及び「下流」の概念は、Ｗｎｔ経路の重要な部分に対して不適当でありえ、さらに一般的には、Ｗｎｔ経路を含むタンパク質カスケードの一部分における異常行動はタンパク質カスケードの他の部分に対して、及び、全体としてＷｎｔ経路の活性に対して多かれ少なかれ影響を有し得ると信じられている。他の一部の臨床研究において、シグナルカスケードの調節タンパク質に対するタンパク質発現レベルは、調節タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定することによって評価される。これは、調節タンパク質の発現レベルを正確に評価することができない間接測定であり、（リン酸化のような特定の翻訳後修飾の後の）活性タンパク質の量をこれまでほとんど反映しない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の根底にある主な問題は、従って、ゲノム解析及びプロテオミクス解析をそれぞれ行うための適した方法及び手段を提供することであった。本発明と関連した、根底にある問題だけでなく、さらなる異論の特定の態様は、本明細書において提供される説明及び実施例を熟読した場合に、特に、付随の特許請求の範囲を熟読した場合に明らかになる。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、本明細書において開示される新たな且つ改善された方法及び装置を提供する。

【0010】

本発明の主な態様によると、上記の問題は、標的遺伝子発現の確率モデルを使用して細胞シグナル経路の活性を評価するための特定の方法、すなわち、
抽出された医療対象者の組織の試料において測定される１つ又は複数の細胞シグナル経路の１つ又は複数の標的遺伝子の１つ又は複数の発現レベル（特に、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質レベル）に少なくとも基づき、医療対象者の組織における１つ又は複数の細胞シグナル経路の活性を推量するステップを含む方法によって解決され、前記推量するステップは、
抽出された医療対象者の組織の試料において測定される１つ又は複数の細胞シグナル経路の１つ又は複数の標的遺伝子の１つ又は複数の発現レベルを少なくとも含む入力の組に対する１つ又は複数の細胞シグナル経路を表す、確率モデル、好ましくはベイジアンネットワークの少なくとも一部を評価することによって、医療対象者の組織における１つ又は複数の細胞シグナル経路の活性を推量するステップ、
医療対象者の組織における、少なくとも１つの転写因子（ＴＦ）要素のレベルを推定するステップであり、前記少なくとも１つのＴＦ要素は、前記１つ又は複数の細胞シグナル経路の１つ又は複数の標的遺伝子の転写を制御し、当該推定するステップは、前記少なくとも１つのＴＦ要素、及び、抽出された医療対象者の組織の試料において測定される１つ又は複数の細胞シグナル経路の１つ又は複数の標的遺伝子の１つ又は複数の発現レベルを関連づける条件付き確率に少なくとも部分的に基づくステップ、並びに、
組織試料における転写因子の前記推定されたレベルに基づき、１つ又は複数の細胞シグナル経路の活性を推量するステップ、さらに、
医療対象者の組織において推量された１つ又は複数の細胞シグナル経路の活性に基づき、１つ又は複数の細胞シグナル経路が医療対象者の組織において異常に機能しているかどうかを決定するステップ、
を含み、前記推量するステップは、１つ又は複数の細胞シグナル経路の確率モデルを使用してデジタル処理装置によって行われる。

【0011】

「１つ又は複数の標的遺伝子」は、（本明細書において記載される場合）「直接の標的遺伝子」及び／又は「間接の標的遺伝子」であり得る。

【0012】

好ましくは、前記推量するステップは、確率モデルのＴＦノードによって表される医療対象者の組織における少なくとも１つの転写因子（ＴＦ）要素のレベルを推定するステップを含み、ＴＦ要素は、１つ又は複数の細胞シグナル経路の１つ又は複数の標的遺伝子の転写を制御し、前記推定するステップは、前記ＴＦノード、及び、抽出された医療対象者の組織の試料において測定される１つ又は複数の細胞シグナル経路の１つ又は複数の標的遺伝子を表す前記確率モデルにおけるノードを関連づける、確率モデルの条件付き確率に少なくとも部分的に基づく。

【0013】

確率モデルは、ベイジアンネットワークモデルであり得る。従って、好ましい実施形態によると、前記推量するステップは、１つ又は複数のシグナル経路に関する情報を表すノードを含むベイジアンネットワーク、及び、ベイジアンネットワークの接続されたノード間の条件付き確率の関係を使用することによって行われる。

【0014】

１つ又は複数の細胞シグナル経路は、Ｗｎｔ経路、ＥＲ（エストロゲン受容体）経路、ＡＲ（アンドロゲン受容体）経路、及び／又は、ヘッジホッグ経路であり得る。従って、好ましい実施形態によると、１つ又は複数の細胞シグナル経路は、Ｗｎｔ経路、ＥＲ経路、ＡＲ経路、及び／又は、ヘッジホッグ経路を含む。

【0015】

特に、適した標的遺伝子は、以下のテキストの一節並びに下記の実施例（例えば表１から９を参照）において記載されている。

【0016】

従って、好ましい実施形態によると、１つ又は複数の標的遺伝子は、（Ｗｎｔ経路に対して）表１又は表６において収載された標的遺伝子、（ＥＲ経路に対して）表２、表５、又は表７において収載された標的遺伝子、（ヘッジホッグ経路に対して）表３又は表８において収載された標的遺伝子、及び、（ＡＲ経路に対して）表４又は表９において収載された標的遺伝子を含むか若しくは該標的遺伝子から成る群から選択される。

【0017】

特に好ましいのは、前記推量するステップが、
ＫＩＡＡ１１９９、ＡＸＩＮ２、ＲＮＦ４３、ＴＢＸ３、ＴＤＧＦ１、ＳＯＸ９、ＡＳＣＬ２、ＩＬ８、ＳＰ５、ＺＮＲＦ３、ＫＬＦ６、ＣＣＮＤ１、ＤＥＦＡ６、及びＦＺＤ７を含むか又は該標的遺伝子から成る群から選択される抽出された医療対象者の組織の試料において測定されるＷｎｔ経路の１つ又は複数の、好ましくは少なくとも３つの標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて医療対象者の組織におけるＷｎｔ経路の活性を推量するステップを含む方法である。

【0018】

さらに好ましいのは、前記推量するステップがさらに、ＮＫＤ１、ＯＡＴ、ＦＡＴ１、ＬＥＦ１、ＧＬＵＬ、ＲＥＧ１Ｂ、ＴＣＦ７Ｌ２、ＣＯＬ１８Ａ１、ＢＭＰ７、ＳＬＣ１Ａ２、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＰＰＡＲＧ、ＤＫＫ１、ＨＮＦ１Ａ、及びＬＥＣＴ２を含むか又は該標的遺伝子から成る群から選択される抽出された医療対象者の組織の試料において測定されるＷｎｔ経路の少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルに基づく方法である。

【0019】

特に好ましいのは、前記推量するステップが、
ＣＤＨ２６、ＳＧＫ３、ＰＧＲ、ＧＲＥＢ１、ＣＡ１２、ＸＢＰ１、ＣＥＬＳＲ２、ＷＩＳＰ２、ＤＳＣＡＭ、ＥＲＢＢ２、ＣＴＳＤ、ＴＦＦ１、及びＮＲＩＰ１を含むか又は該標的遺伝子から成る群から選択される抽出された医療対象者の組織の試料において測定されるＥＲ経路の１つ又は複数の、好ましくは少なくとも３つの標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて医療対象者の組織におけるＥＲ経路の活性を推量するステップを（も）含む方法である。

【0020】

さらに好ましいのは、前記推量するステップがさらに、ＡＰ１Ｂ１、ＡＴＰ５Ｊ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＯＸ７Ａ２Ｌ、ＥＢＡＧ９、ＥＳＲ１、ＨＳＰＢ１、ＩＧＦＢＰ４、ＫＲＴ１９、ＭＹＣ、ＮＤＵＦＶ３、ＰＩＳＤ、ＰＲＥＤＭ１５、ＰＴＭＡ、ＲＡＲＡ、ＳＯＤ１、及びＴＲＩＭ２５を含むか又は該標的遺伝子から成る群から選択される抽出された医療対象者の組織の試料において測定されるＥＲ経路の少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルに基づく方法である。

【0021】

前記推量するステップが、
ＧＬＩ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＩＧＦＢＰ６、ＳＰＰ１、ＣＣＮＤ２、ＦＳＴ、ＦＯＸＬ１、ＣＦＬＡＲ、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＲＡＢ３４、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ７、ＭＹＣＮ、ＦＯＸＭ１、ＧＬＩ３、ＴＣＥＡ２、ＦＹＮ、及びＣＴＳＬ１を含むか又は該標的遺伝子から成る群から選択される抽出された医療対象者の組織の試料において測定されるヘッジホッグ経路の１つ又は複数の、好ましくは少なくとも３つの標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて医療対象者の組織におけるヘッジホッグ経路の活性を推量するステップを（も）含む方法も好ましい。

【0022】

さらに好ましいのは、前記推量するステップがさらに、ＢＣＬ２、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＦ１、Ｈ１９、ＨＨＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＪＡＧ２、ＪＵＰ、ＭＩＦ、ＭＹＬＫ、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ２．８、ＰＩＴＲＭ１、及びＴＯＭ１を含むか又は該標的遺伝子から成る群から選択される抽出された医療対象者の組織の試料において測定されるヘッジホッグ経路の少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルに基づく方法である。

【0023】

前記推量するステップが、
ＫＬＫ２、ＰＭＥＰＡ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＫＸ３＿１、ＡＢＣＣ４、ＫＬＫ３、ＦＫＢＰ５、ＥＬＬ２、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＤＨＣＲ２４、ＰＰＡＰ２Ａ、ＮＤＲＧ１、ＬＲＩＧ１、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＬＣＰ１、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＡＲ、及びＥＡＦ２を含むか又は該標的遺伝子から成る群から選択される抽出された医療対象者の組織の試料において測定されるＡＲ経路の１つ又は複数の、好ましくは少なくとも３つの標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて医療対象者の組織におけるＡＲ経路の活性を推量するステップを（も）含む方法も好ましい。

【0024】

さらに好ましいのは、前記推量するステップがさらに、ＡＰＰ、ＮＴＳ、ＰＬＡＵ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＲＧ１、ＦＧＦ８、ＩＧＦ１、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＮ１、ＳＧＫ１、及びＴＡＣＣ２を含むか又は該標的遺伝子から成る群から選択される抽出された医療対象者の組織の試料において測定されるＡＲ経路の少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルに基づく方法である。

【0025】

本発明の別の態様は、（本明細書において記載される）方法に関し、当該方法はさらに、
１つ又は複数の細胞シグナル経路の異常な機能を矯正する薬物を医療対象者に対して処方することを勧めるステップを含み、
該勧めるステップは、前記１つ又は複数の細胞シグナル経路が、医療対象者の組織において異常に機能していると前記１つ又は複数の細胞シグナル経路の推量された活性に基づき決定される場合のみに行われる。

【0026】

本発明は、（本明細書において記載される）方法にも関し、当該方法は、
抽出された医療対象者の組織の試料において測定されるＷｎｔ経路の標的遺伝子の組のうち２つ、３つ、若しくはそれ以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づき医療対象者の組織におけるＷｎｔ経路の活性を推量するステップ、
及び／又は、
抽出された医療対象者の組織の試料において測定されるＥＲ経路の標的遺伝子の組のうち２つ、３つ、若しくはそれ以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づき医療対象者の組織におけるＥＲ経路の活性を推量するステップ、
及び／又は、
抽出された医療対象者の組織の試料において測定されるヘッジホッグ経路の標的遺伝子の組のうち２つ、３つ、若しくはそれ以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づき医療対象者の組織におけるヘッジホッグ経路の活性を推量するステップ、
及び／又は、
抽出された医療対象者の組織の試料において測定されるＡＲ経路の標的遺伝子の組のうち２つ、３つ、若しくはそれ以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づき医療対象者の組織におけるＡＲ経路の活性を推量するステップ、
を含む。

【0027】

好ましくは、
前記Ｗｎｔ経路の標的遺伝子の組は、ＫＩＡＡ１１９９、ＡＸＩＮ２、ＲＮＦ４３、ＴＢＸ３、ＴＤＧＦ１、ＳＯＸ９、ＡＳＣＬ２、ＩＬ８、ＳＰ５、ＺＮＲＦ３、ＫＬＦ６、ＣＣＮＤ１、ＤＥＦＡ６、及びＦＺＤ７を含むか若しくは該標的遺伝子から成る群から選択される少なくとも９つ、好ましくは全ての標的遺伝子を含み、
並びに／又は、
前記ＥＲ経路の標的遺伝子の組は、ＣＤＨ２６、ＳＧＫ３、ＰＧＲ、ＧＲＥＢ１、ＣＡ１２、ＸＢＰ１、ＣＥＬＳＲ２、ＷＩＳＰ２、ＤＳＣＡＭ、ＥＲＢＢ２、ＣＴＳＤ、ＴＦＦ１、及びＮＲＩＰ１を含むか若しくは該標的遺伝子から成る群から選択される少なくとも９つ、好ましくは全ての標的遺伝子を含み、
並びに／又は、
前記ヘッジホッグ経路の標的遺伝子の組は、ＧＬＩ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＩＧＦＢＰ６、ＳＰＰ１、ＣＣＮＤ２、ＦＳＴ、ＦＯＸＬ１、ＣＦＬＡＲ、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＲＡＢ３４、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ７、ＭＹＣＮ、ＦＯＸＭ１、ＧＬＩ３、ＴＣＥＡ２、ＦＹＮ、及びＣＴＳＬ１を含むか若しくは該標的遺伝子から成る群から選択される少なくとも９つ、好ましくは全ての標的遺伝子を含み、
並びに／又は、
前記ＡＲ経路の標的遺伝子の組は、ＫＬＫ２、ＰＭＥＰＡ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＫＸ３＿１、ＡＢＣＣ４、ＫＬＫ３、ＦＫＢＰ５、ＥＬＬ２、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＤＨＣＲ２４、ＰＰＡＰ２Ａ、ＮＤＲＧ１、ＬＲＩＧ１、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＬＣＰ１、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＡＲ、及びＥＡＦ２を含むか若しくは該標的遺伝子から成る群から選択される少なくとも９つ、好ましくは全ての標的遺伝子を含む。

【0028】

前記Ｗｎｔ経路の標的遺伝子の組が、ＮＫＤ１、ＯＡＴ、ＦＡＴ１、ＬＥＦ１、ＧＬＵＬ、ＲＥＧ１Ｂ、ＴＣＦ７Ｌ２、ＣＯＬ１８Ａ１、ＢＭＰ７、ＳＬＣ１Ａ２、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＰＰＡＲＧ、ＤＫＫ１、ＨＮＦ１Ａ、及びＬＥＣＴ２を含むか若しくは該標的遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子をさらに含み、 並びに／又は、 前記ＥＲ経路の標的遺伝子の組が、ＡＰ１Ｂ１、ＡＴＰ５Ｊ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＯＸ７Ａ２Ｌ、ＥＢＡＧ９、ＥＳＲ１、ＨＳＰＢ１、ＩＧＦＢＰ４、ＫＲＴ１９、ＭＹＣ、ＮＤＵＦＶ３、ＰＩＳＤ、ＰＲＥＤＭ１５、ＰＴＭＡ、ＲＡＲＡ、ＳＯＤ１、及びＴＲＩＭ２５を含むか若しくは該標的遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子をさらに含み、 並びに／又は、 前記ヘッジホッグ経路の標的遺伝子の組が、ＢＣＬ２、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＦ１、Ｈ１９、ＨＨＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＪＡＧ２、ＪＵＰ、ＭＩＦ、ＭＹＬＫ、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ２．８、ＰＩＴＲＭ１、及びＴＯＭ１を含むか若しくは該標的遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子をさらに含み、 並びに／又は、
前記ＡＲ経路の標的遺伝子の組が、ＡＰＰ、ＮＴＳ、ＰＬＡＵ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＲＧ１、ＦＧＦ８、ＩＧＦ１、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＮ１、ＳＧＫ１、及びＴＡＣＣ２を含むか若しくは該標的遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つの標的遺伝子をさらに含む方法が特に好ましい。

【0029】

本発明に従って使用されることになる１つ又は複数の試料は、好ましくは生検手順又は他の試料抽出手順を介した、例えば、乳房病変から、又は、結腸癌を有すると知られるか若しくは結腸癌を有するのではないかと疑われる医療対象者の結腸から、又は、肝癌を有すると知られるか若しくは肝癌を有するのではないかと疑われる医療対象者の肝臓等から得られる試料であり得る。試料が抽出される組織は、例えば、結腸、乳房、肝臓、又は、結腸、乳房、肝臓、若しくは他の臓器の外に広がる他の臓器から生じる（疑われる）悪性の組織等、転移性の組織であってもよい。一部の例において、組織試料は、循環性腫瘍細胞、すなわち、血流に入った腫瘍細胞であってもよく、さらに、適した単離技術を使用して抽出される組織試料として抽出してもよい。

【0030】

本発明の別の開示される態様は、特定の疾患の診断、又は、特定のステージの特定の癌タイプにおける薬物に対する応答の予測に対する、本明細書において記載される非一過性の記憶媒体、又は、本明細書において記載されるコンピュータプログラムの使用に関係する。

【0031】

別の開示される態様によると、デジタルプロセッサを含む装置が、本明細書において記載される本発明による方法を行うように構成される。

【0032】

別の開示される態様によると、非一過性の記憶媒体は、本明細書において記載される本発明による方法を行うためにデジタル処理装置により実行可能な指示を記憶する。非一過性の記憶媒体は、ハードドライブ又は他の磁気記憶媒体、光ディスク又は他の光記憶装置、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、フラッシュメモリ、又は他の電子記憶媒体、ネットワークサーバー等のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体であってもよい。デジタル処理装置は、ハンドヘルドの装置（例えば携帯情報端末又はスマートフォン等）、ノートブック型コンピュータ、デスクトップ型コンピュータ、タブレット型のコンピュータ又は装置、遠隔ネットワークサーバー等であってもよい。

【0033】

別の開示される態様によると、コンピュータプログラムは、デジタル処理装置に、本明細書において記載される本発明による方法を行わせるためのプログラムコード手段を含む。デジタル処理装置は、ハンドヘルドの装置（例えば携帯情報端末又はスマートフォン等）、ノートブック型コンピュータ、デスクトップ型コンピュータ、タブレット型のコンピュータ又は装置、遠隔ネットワークサーバー等であってもよい。

【0034】

１つの利点は、例えば、Ｗｎｔ経路、ＥＲ経路、ＡＲ経路、及び／又は、ヘッジホッグ経路のベイジアンネットワークモデルを使用した、１つ又は複数の細胞シグナル経路の確率の解析に基づき臨床勧告を提供する臨床判断支援（ＣＤＳ）システムに属する。

【0035】

別の利点は、エラーに感受性の低い改善された細胞シグナル経路活性の評価に属する。

【0036】

別の利点は、細胞シグナル経路の調節の損失に対する標的治療を勧告するＣＤＳシステムを提供することに属する。

【0037】

別の利点は、Ｗｎｔ経路、ＥＲ経路、ＡＲ経路、又は、ヘッジホッグ経路等の特定の細胞シグナル経路に対する調節の損失を検出するように設計され、且つ、その特定の細胞シグナル経路によって出所が明らかになる種々のタイプの癌に対する勧告を提供するように容易に適応するＣＤＳシステムを提供することに属する。

【0038】

本明細書において記載される本発明は、例えば、
−予測される（推量される）活性に基づく診断、
−予測される（推量される）活性に基づく予後、
−予測される（推量される）活性に基づく薬物処方、
−予測される（推量される）活性に基づく薬効の予測、
−予測される（推量される）活性に基づく副作用の予測、
−薬効のモニタリング、
−医薬品開発、
−アッセイ開発、
−経路の研究、
−癌進行度分類、
−予測される（推量される）活性に基づく臨床治験における対象の登録、
−行われることになる後の試験の選択、及び／又は、
−コンパニオン診断試験の選択、
に関しても有利に使用することができる。

【0039】

さらなる利点が、付随の図面、以下の説明を読み且つ理解した後、特に、本明細書において以下に提供される詳細な実施例を読んだ後に当業者には明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0040】

【図1】細胞シグナル経路の一部を表したシンプルなベイジアンネットワークを示した図である。細胞シグナル経路は、転写因子（ＴＦ）複合体、及び、存在する転写因子複合体の結果として産生される標的遺伝子によって象徴化されている。二進数離散化（Ｂｉｎａｒｙ ｄｉｓｃｒｅｔｉｚａｔｉｏｎ）の場合のＴＦ要素と標的遺伝子との確率の関係は、図において描かれている条件付き確率の表によって表すことができる。

【図2】仮説の細胞シグナル経路を記載した例示的なベイジアンネットワークを示した図である。上流のタンパク質も下流の標的ｍＲＮＡノードも図に描かれている。上流のタンパク質は、転写因子複合体における入力として役立つ一方、標的ｍＲＮＡは転写因子複合体の出力ノードである。

【図3】ベイジアンネットワークの例示的な例を示した図であり、多数の転写因子複合体を有した１つの細胞シグナル経路、若しくは、１つのベイジアンネットワークに組み合わされるその独自の転写因子複合体を有した多数の細胞シグナル経路、又は、その組み合わせを表している。

【図4】ベイジアンネットワークの例を示した図であり、図１に類似の細胞シグナル経路のシンプルな説明を例示している。ここでは、さらなるノードが付け加えられて、標的タンパク質への標的ｍＲＮＡの翻訳を表している。

【図5】ベイジアンネットワークの例示を示した図であり、細胞シグナル経路の別のシンプルな説明を例示している。経路は、転写因子複合体及びその標的タンパク質レベルを使用して表されている。

【図6】さらなるノードの層を有した図１の例示的なベイジアンネットワークを示した図であり、プローブの強度を対応する標的ｍＲＮＡレベルに関係づけるマイクロアレイチップ上のプローブセットを表している。

【図7】図１のベイジアンネットワークの異なる実施形態の例示的な例を示した図であり、この特定の例において、含まれる標的ｍＲＮＡレベルのいずれにも対するさらなる情報のノードに対しての例としてメチル化及びコピー数多型を表したノードを含んでいる。

【図8】結腸試料のデータセット（ＧＳＥ２０９１６）における本明細書において記載されるベイジアンネットワーク及び最近隣セントロイド法（ｎｅａｒｅｓｔ ｃｅｎｔｒｏｉｄ ｍｅｔｈｏｄ）の予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図9】結腸試料のデータセット（ＧＳＥ４１８３）における本明細書において記載されるベイジアンネットワーク及び最近隣セントロイド法の予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図10】結腸試料のデータセット（ＧＳＥ１５９６０）における本明細書において記載されるベイジアンネットワーク及び最近隣セントロイド法の予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図11】乳癌試料のデータセット（ＧＳＥ１２７７７）における本明細書において記載されるベイジアンネットワーク及び最近隣セントロイド法の予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図12】乳癌試料のデータセット（ＧＳＥ２１６５３）における本明細書において記載されるベイジアンネットワーク及び最近隣セントロイド法の予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図13】肝癌試料のデータセット（ＧＳＥ９８４３）における本明細書において記載されるベイジアンネットワーク及び最近隣セントロイド法の予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図14-I】結腸試料のデータセット（ＧＳＥ２０９１６）における本明細書において記載される広範な文献によるリスト（ｂｒｏａｄ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ｌｉｓｔ）の標的遺伝子と比較される証拠により精選されたリスト（ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｃｕｒａｔｅｄ ｌｉｓｔ）の標的遺伝子を使用したベイジアンネットワークを使用し予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図14-II】結腸試料のデータセット（ＧＳＥ２０９１６）における本明細書において記載される広範な文献によるリスト（ｂｒｏａｄ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ｌｉｓｔ）の標的遺伝子と比較される証拠により精選されたリスト（ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｃｕｒａｔｅｄ ｌｉｓｔ）の標的遺伝子を使用したベイジアンネットワークを使用し予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図15-I】結腸試料のデータセット（ＧＳＥ４１８３）における本明細書において記載される広範な文献によるリストの標的遺伝子と比較される証拠により精選されたリストの標的遺伝子を使用したベイジアンネットワークを使用し予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図15-II】結腸試料のデータセット（ＧＳＥ４１８３）における本明細書において記載される広範な文献によるリストの標的遺伝子と比較される証拠により精選されたリストの標的遺伝子を使用したベイジアンネットワークを使用し予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図16-I】結腸試料のデータセット（ＧＳＥ１５９６０）における本明細書において記載される広範な文献によるリストの標的遺伝子と比較される証拠により精選されたリストの標的遺伝子を使用したベイジアンネットワークを使用し予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図16-II】結腸試料のデータセット（ＧＳＥ１５９６０）における本明細書において記載される広範な文献によるリストの標的遺伝子と比較される証拠により精選されたリストの標的遺伝子を使用したベイジアンネットワークを使用し予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図17-I】乳癌試料のデータセット（ＧＳＥ１２７７７）における本明細書において記載される広範な文献によるリストの標的遺伝子と比較される証拠により精選されたリストの標的遺伝子を使用したベイジアンネットワークを使用し予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図17-II】乳癌試料のデータセット（ＧＳＥ１２７７７）における本明細書において記載される広範な文献によるリストの標的遺伝子と比較される証拠により精選されたリストの標的遺伝子を使用したベイジアンネットワークを使用し予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図18-I】肝癌試料のデータセット（ＧＳＥ９８４３）における本明細書において記載される広範な文献によるリストの標的遺伝子と比較される証拠により精選されたリストの標的遺伝子を使用したベイジアンネットワークを使用し予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図18-II】肝癌試料のデータセット（ＧＳＥ９８４３）における本明細書において記載される広範な文献によるリストの標的遺伝子と比較される証拠により精選されたリストの標的遺伝子を使用したベイジアンネットワークを使用し予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図19-I】髄芽腫試料のデータセット（ＧＳＥ１０３２７）における本明細書において記載される広範な文献によるリストの標的遺伝子と比較される証拠により精選されたリストの標的遺伝子を使用したベイジアンネットワークを使用し予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図19-II】髄芽腫試料のデータセット（ＧＳＥ１０３２７）における本明細書において記載される広範な文献によるリストの標的遺伝子と比較される証拠により精選されたリストの標的遺伝子を使用したベイジアンネットワークを使用し予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図20】本明細書において開示される（Ｗｎｔ経路に対して例証的に示されている）１つ又は複数の細胞シグナル経路を評価するように構成される臨床判断支援（ＣＤＳ）システムを示した概略図である。

【図21】ＧＳＥ４１８３からの結腸試料における予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図22】ＧＳＥ１０３２７からの髄芽腫試料における予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図23】ＧＳＥ９８４３からの肝癌試料における予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図24】ＧＳＥ１２７７７からの乳癌細胞株における予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図25】ＧＳＥ１２７７７からの乳癌細胞株における予測されるＥＲ経路の活性を示した図である。

【図26】ＧＳＥ１２２７６からの乳癌試料における予測されるＥＲ経路の活性を示した図である。

【図27】ＧＳＥ３６１３３からの癌細胞株における予測されるＥＲ経路の活性を示した図である。

【図28】ＧＳＥ３４２１１からの癌細胞株における予測されるヘッジホッグ経路の活性を示した図である。

【図29】ＧＳＥ１０３２７からの髄芽腫試料における予測されるヘッジホッグ経路の活性を示した図である。

【図30】ＧＳＥ１２２７６からの乳癌試料における予測されるヘッジホッグ経路の活性を示した図である。

【図31】ＧＳＥ２１６１８からのＭＣＦ７及びタモキシフェン耐性細胞株における予測されるＥＲ経路の活性を示した図である。

【図32】ＧＳＥ１１３２４からの時系列のエストロゲンにより刺激されたＭＣＦ７細胞株試料における予測されるＥＲ経路の活性を示した図である。

【図33】ＧＳＥ１２２７６のルミナール（ｌｕｍｉｎａｌ）Ａ試料におけるＷｎｔ、ＥＲ及びヘッジホッグ経路の活性を示した図である。

【図34】ＧＳＥ１２２７６の基底試料（ｂａｓａｌ ｓａｍｐｌｅ）におけるＷｎｔ、ＥＲ及びヘッジホッグ経路の活性を示した図である。

【図35】ＧＳＥ２０９１６からの結腸試料における予測されるＷｎｔ経路の活性を示した図である。

【図36】エストロゲンで刺激されたＭＣＦ７細胞株（Ｅ２）又は負の対照（ＥｔＯＨ）における予測されるＥＲ経路の活性を示した図である（ＧＳＥ９２５３）。

【図37】経路の活性に従ってグループ化されたＧＳＥ１２２７６データセットからの患者のカプラン・マイヤーの生存曲線を示した図である。

【図38】ＧＳＥ７７０８からの異なる処理レジメで処理したＬＮＣａＰ細胞株における予測されるＡＲ経路の活性を示した図である。

【図39】ＧＳＥ１７９５１からの前立腺癌試料における予測されるＡＲ経路の活性を示した図である。

【図40】ＧＳＥ１２２７６からの乳癌試料における予測されるＡＲ経路の活性を示した図である。

【図41】種々の癌タイプを表す細胞株試料を含有するＧＳＥ３６１３３データセットにおける予測されるＡＲ経路の活性を示した図である。

【図42】種々の癌タイプを表す細胞株試料を含有するＧＳＥ３４２１１データセットにおける予測されるＡＲ経路の活性を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0041】

以下の例は、特に好ましい方法、及び、それに関して選択される態様を単に例示している。そこに提供される教示は、いくつかのテスト及び／又はキットを構築して、例えば、１つ又は複数の細胞シグナル経路の異常な活性を検出、予測、及び／又は診断するために使用してもよい。さらに、本明細書において記載される方法を使用すると、薬の処方を有利に導くことができ、薬の予測並びに薬効（及び／又は副作用）のモニタリングをすることができ、薬物耐性を予測及びモニターして、例えば、（コンパニオン診断テストのような）行われることになる後の１つ又は複数のテストを選択することができる。以下の例は、本発明の範囲を限定するとして解釈されることはない。

【実施例1】

【0042】

ベイジアンネットワークの構築
本明細書で開示するように、確率モデル（例：図６に示す例示的なベイジアンモデル）を構築し、且つ多くの異なる標的遺伝子の発現と細胞シグナル経路の活性レベルとの間の条件付き確率の関係を取り入れることによって、かかるモデルは高い確度でもって、細胞シグナル経路の活性の決定に用いることができる。また、確率モデルは、条件付き確率を調整し且つ／又は新しいノードをモデルに追加して追加的な情報源を表すようにすることで、即座に更新されて、後の臨床研究で得られる追加的な知識を取り入れることができる。このようにして、確率モデルは、最新の医学知識を取り入れるよう適切に更新することができる。

【0043】

細胞シグナル経路を表すもっとも単純なベイジアンネットワークモデルの一つは、転写因子要素及び関連する標的遺伝子を含む２レベルモデルである（図１参照）。転写因子複合体要素は、転写因子複合体のレベルを表す。転写因子要素のタンパク質レベルは、転写因子の標的遺伝子の多くのｍＲＮＡレベルに結びつけられる（当該例示的なベイジアンネットワークにおいては、標的遺伝子が３つのみ表示されているが、これらは転写因子が利用可能である場合に組織内に発現することが知られている）。多くの、ほとんどの又はすべての経路の標的遺伝子（Ｗｎｔ、ＥＲ、ヘッジホッグ及びＡＲ経路の場合、特に表１、表２、表３及び表４にそれぞれ言及されている標的遺伝子）は、ＴＦ要素によって同じように調節される。ＴＦ要素のレベルと標的遺伝子のｍＲＮＡレベルとの間の関係は、エッジによって、ベイジアンネットワークにおいてモデル化される。各標的遺伝子に対し、条件付き確率の分布が、遺伝子のｍＲＮＡレベルがいかにＴＦ要素のレベルに依存しているかを特定する。

【0044】

ＴＦ要素及び標的遺伝子のレベルは、多様に表されてもよい。１つの選択肢は、二進数離散化を使用してＴＦ要素の「非存在」及び「存在」を、標的遺伝子のｍＲＮＡレベルの「減る」「増える」の状態を示すことである（図１参照）。ＴＦ要素及び標的遺伝子間の確率の関係は、条件付き確率の表によって表すことができる（同図参照）。レベルは、二進数離散化の代わりに、連続的なレベル値又は３つ以上の量子化レベル（例：標的遺伝子について、「減る」「標準」及び「増える」）を有する量子化値で表すこともできる。

【0045】

上述の単純なベイジアンネットワークの例示は、ベイジアンネットワークモデルの例示的な実施形態に過ぎない（図１）。一般的には、ベイジアンネットワークモデルは、エッジによって接続されたノードを有する非循環有向グラフを有する。各ノードは、間近の経路（又は、より一般的には細胞シグナル経路）に関する情報アイテムを表す。各経路要素ノードは、細胞シグナル経路のゲノム又はプロテオミクス要素を表す。例示的な例として、経路要素ノードは、タンパク質、タンパク質複合体、細胞シグナル経路の標的遺伝子から転写された標的ｍＲＮＡ分子、メチル化遺伝子、リン酸化タンパク質、リン酸化タンパク質複合体等のうち一つを表してもよいが、それらに限定されない。後述するとおり、例示のものに限定されないが、幾つかのほかの種類のノードがベイジアンネットワークに含まれて、特定の測定データ要素や遺伝子の変異の出現等の他のタイプの情報を表してもよい。

【0046】

経路の（活性状態又は非活性状態の）調節タンパク質を表す追加的な「上流」レベルが、かかるタンパク質のレベルの知識が臨床判断支援の勧告を決定する証明になる場合に、典型的に加えられる。例えば、ベイジアンネットワークにおいて転写因子の元のタンパク質又は転写因子の上流にある必須タンパク質を含むこと（図２参照）は、経路全体ではなくかかるタンパク質を特異的に標的とする薬物が利用可能な場合、有用であり得る。転写因子（ＴＦ）要素は、シグナル経路の大部分においてタンパク質複合体（すなわち、標的遺伝子からの転写を調節する機能を実行する特定の構造において、合わせて結合されているタンパク質の組み合わせ）であると考えられている。他の経路については、ＴＦ要素は単一のタンパク質であってよい。加えて、シグナル経路は、１つより多い転写因子を介して活性であってもよく、その結果、多数の転写因子を標的遺伝子に送り込む、より複雑なベイジアンネットワークとなる（多数の転写因子要素が標的遺伝子転写に影響を及ぼしている仮定図について、図３を参照）。かかる多数の転写因子のベイジアンネットワークは、１つのベイジアンネットワークに結合された複数の経路の組み合せの結果であってもよい。

【0047】

標的遺伝子のさらに下流の追加的な情報ノードもまた、ベイジアンネットワークに含まれてもよい。この例示的な例が、タンパク質への標的遺伝子のｍＲＮＡの翻訳（図４）又は標的遺伝子のｍＲＮＡレベルの代替ノードとしての標的遺伝子のタンパク質レベルノードである（図５）。標的遺伝子の標的ｍＲＮＡ分子は、リボソーム分子との相互作用によって翻訳されてｍＲＮＡ分子と標的遺伝子とに対応するタンパク質を形成する。これは、タンパク質レベルでの標的遺伝子の発現である。たとえば、これらに限定はされないが、質量分析、免疫組織化学、ゲル電気泳動技術によるタンパク質レベルの測定は、これらの標的タンパク質レベルの証拠として作用し得る。

【0048】

標的遺伝子の発現レベルは、マイクロアレイの対応するプローブセットの測定された強度に基づいて計算されてもよく、たとえば加算平均又は他の技術の他の手段（たとえば、ＲＮＡ配列）によって計算されてもよい。幾つかの実施例において、この計算は、図６に示し本明細書に記載のとおり、使用される各プローブセットについてのノードでベイジアンネットワークを延ばし、且つ対応する標的遺伝子ノードから各「測定」ノードに及ぶエッジを含むことによって、ベイジアンネットワークに組み込まれる。

【0049】

確率モデルは、任意で、変異、コピー数多型、遺伝子発現、メチル化、転座情報などの、ゲノム配列を変更する追加のゲノム情報を取り入れてもよく、当該ゲノム配列は、経路のシグナルカスケードに関連して経路の活性を推量し且つ（活性又は不活性のいずれかの）機能異常を引き起こすＷｎｔ経路における欠陥を特定し、このことはメチル化及びコピー数データの例示的なケースについての図７の例示的な参照に記載の通りである。しかしながら、標的遺伝子に関する他の種類の情報は、同じように情報ノードに翻訳されることが理解される。かかるゲノム情報は、ＲＮＡ配列およびＳＮＰ分析を介して利用可能であるが、これらに限定されない。

【0050】

また、本明細書に後述されるＷｎｔ、ＥＲ、ＡＲ及びヘッジホッグ経路に関する実施例が、例示的な例として記載されているが、本明細書に開示されている細胞シグナル経路分析のアプローチは、上述の経路に加えて他の細胞内シグナル経路にも容易に適用される。他の細胞内シグナル経路とは、細胞膜内に受容体を備える細胞内シグナル経路（例：ＮＯＴＣＨ、ＨＥＲ２／ＰＩ３Ｋ、ＴＧＦｂｅｔａ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦおよびＴＮＦ−ＮＦｋａｐｐａＢ細胞シグナル経路）及び細胞内に受容体を備える細胞内シグナル経路（例：プロゲステロン、レチノイン酸及びビタミンＤ細胞シグナル経路）等である。

【実施例2】

【0051】

機械学習方法の比較
二種類の機械学習技術の実行を、Ｗｎｔ経路を例として互いに比較する。最近隣セントロイド法を用いたＷｎｔ活性の予測を、本発明によれば最適の方法、たとえばベイジアンネットワークを用いたものと比較する。

【0052】

上記で検証したとおり、ベイジアンネットワークアプローチを、確率論的アプローチにおいて存在する利点に基づいて選択した。確率論的アプローチは、利用可能な情報を「ソフト」、たとえば証明となる特性を呈する研究対象のパーセンテージ、及び条件付き確率の関係を用いた「ハード」形式のどちらにおいても採用することができる。加えて、確率モデルは、根本的な細胞シグナル経路の（包括的というよりはむしろ）部分的な知識に基づいて情報が取り入れられることを可能にし、この場合もやはり条件付き確率の表を用いる。

【0053】

ここで、他の機械学習方法、たとえば既知の方法である最近隣セントロイド分類（ｎｅａｒｅｓｔ ｃｅｎｔｒｏｉｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と比較して、本発明者等は、既知の生物学的特性及びベイジアンネットワークを用いたソフトエビデンスの利用可能性を含んだやり方で値を加えることが実証される。最近隣セントロイド分類は、機械学習方法であり、訓練試料の各クラスについて平均プロファイル（＝セントロイド）が計算され、次に、分類される試料について、ラベルが最近隣のセントロイドに基づいて予測される（最近隣のセントロイドのラベルが、予測結果である）。２つのセントロイドが、ベイジアンネットワークに用いられるプローブセットの同一リスト上で計算され、「Ｗｎｔオン」及び「Ｗｎｔオフ」セントロイドについては、ＧＳＥ８６７１の同一のｆＲＭＡ処理データの腺腫試料及び正常な結腸試料にそれぞれ基づく。試料と２つのセントロイドとの間の２つのユークリッド距離のｌｏｇ２比を続けて用いて、種々のデータセットから試料を分類して試料の分類を推量した。このことは、０のｌｏｇ２比が試料の２つのセントロイドに対して等しい距離と対応し、値＞０が活性Ｗｎｔシグナル伝達として分類された試料に相当するが、値＜０は、不活性Ｗｎｔシグナル伝達を有すると識別された試料に相当することを意味する。

【0054】

ベイジアンネットワークを、図６及び本明細書に記載された手順と同様に構築した。Ｗｎｔベイジアンネットワークの記載と同様、プローブセット間のエッジの条件付き確率の表及びそれらのそれぞれの遺伝子を、遺伝子発現情報データベース（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／、最終アクセス日２０１１年７月１３日）からのデータセットＧＳＥ８６７１からの３２の正常な結腸試料及び３２の腺腫試料のｆＲＭＡ処理データを使用して、訓練した。訓練したベイジアンネットワークを次に、種々のデータセットに対してテストして、Ｗｎｔ経路が「オン」である、すなわち活性であるという確率Ｐ（Ｗｎｔオン）を推量したが、これはＷｎｔ経路転写複合体が「存在」するという推量された確率と等しいと解釈する。

【0055】

訓練されたベイジアンネットワーク及び最近隣セントロイドモデルを、次に、種々のｆＲＭＡ処理されたマイクロアレイデータセットに対してテストしてＷｎｔ経路が「オン」である確率を推量したが、それはＰ（Ｗｎｔオン）及び距離のｌｏｇ２比によって測定した。ベイジアンネットワーク及び最近隣セントロイドモデルの結果のまとめを、図８及び図１３に示す。読者は、２つの方法の出力メトリックは１対１の関係ではないが、方法における出力メトリックの相対的な大きさとサインは、比較可能であることに留意されたい。

【0056】

結腸（癌）試料（ＧＳＥ２０９１６、ＧＳＥ４１８３）の圧倒的多数が、活性Ｗｎｔ経路と不活性Ｗｎｔ経路との間に等しく分類されるが、最近隣セントロイド法（偽陰性）において高いフラクションの誤って分類されたネガティブな試料を有したＧＳＥ１５９６０は、除く。高いフラクションのこの偽陰性の認知は、他の癌のタイプにおいても維持される。これは特に乳癌試料（ＧＳＥ１２７７７、ＧＳＥ２１６５３）及び肝癌（ＧＳＥ９８４３）にあてはまり、いくつかの例外を除いて、すべての試料が不活性のＷｎｔ経路を有すると予測されるが、基底乳癌及びＣＴＮＮＢ１肝癌試料の場合は正しくないことが知られている。一部の例では、例えばＧＳＥ１５９６０において明白であるが、最近隣セントロイド分類の閾値を増減することで、分類を修正することができる。この考えの背景には、Ｗｎｔ活性の閾値が、異なる組織タイプにおいて変更され得ることがある。しかしながら、このことは、他の組織タイプに適応可能な最近隣セントロイド法の追加的な訓練を伴う。ベイジアンネットワークモデルの強みの一つは、組織タイプに関して非特異的であることが確立されているため、組織用の訓練が要求されないことである。

【実施例3】

【0057】

標的遺伝子の選択
転写因子（ＴＦ）は、特定のＤＮＡ配列に結合することで標的遺伝子からの転写を調節することができるタンパク質の複合体（すなわち、特定の構造において、合わせて結合されているタンパク質の組み合わせ）または１つのタンパク質であり、それによりＤＮＡからｍＲＮＡへの遺伝子情報の転写を制御する。転写複合体のこの作用により直接生成されたｍＲＮＡを、本明細書では「直接の標的遺伝子」と呼ぶ。経路の活性化は、より二次的な遺伝子転写をもたらしてもよく、これを「間接の標的遺伝子」と呼ぶ。以下、経路の活性とｍＲＮＡレベルとの間の直接リンクとして、直接の標的遺伝子を含むか又は該直接の標的遺伝子からなる（例示的な確率モデルとしての）ベイジアンネットワークモデルが望ましいが、直接の標的遺伝子及び間接の標的遺伝子の区別が、必ずしも明白であるとは限らない。ここで、利用可能な文献データに基づくスコアリング機能を用いて、直接の標的遺伝子を選択する方法を提示する。とはいえ、限られた情報及び生物学的な変種及び不確実性のせいで、間接の標的遺伝子を誤って選択してしまうことは排除できない。

【0058】

特定経路のｍＲＮＡ標的遺伝子を、科学文献から選択したが、その選択は、証拠が蓄積された科学的実験のタイプに応じて、特定の標的遺伝子についての科学的証拠を格付けした格付け法を用いることによって行った。幾つかの実験的証拠は、例えばヘッジホッグ経路が活性であると知られている胚のマイクロアレイ上でｍＲＮＡが増加している、といった、遺伝子が標的遺伝子であることを示唆するに過ぎないものであるが、他の証拠は非常に強力であり得る。例えば、識別された経路の転写因子結合部位、及び、細胞における特定の経路の刺激の後のクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイにおける当該部位の取得と、細胞株における経路の特定の刺激後のｍＲＮＡの増加との組み合せである。

【0059】

特定経路の標的遺伝子を見つけるための実験を、科学文献において数種類識別することができる。
１．経路−転写因子をゲノム上のその結合部位へ直接結合させるＣｈＩＰ実験が実証される。例：クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）技術を用いることによって、活性Ｗｎｔ経路有り無し両方の結腸細胞株のＤＮＡにおける、後に推定される機能的ＴＣＦ４転写因子結合部位を、純粋にヌクレオチド配列に基づいて認識された結合部位の部分集合として、識別した。推定される機能性を、転写因子がＤＮＡ結合部位に結合することが判明したＣｈＩＰ由来の証拠として、識別した。
２．結合配列を含有するＤＮＡ断片に転写因子をｉｎ ｖｉｔｒｏで結合することを示す、ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）。ＥＭＳＡに基づく証拠はｉｎ ｖｉｖｏ状況に翻訳することができないので、ＣｈＩＰに基づく証拠と比べて強くない。
３．経路の刺激及びマイクロアレイ上のｍＲＮＡプロファイルの測定又はＲＮＡ配列決定の使用、経路−誘導性細胞株の使用、並びに誘導後に数回測定されるｍＲＮＡプロファイルの測定であって、タンパク質への翻訳を妨げるシクロヘキシミドがある状態で測定され、それにより誘導されたｍＲＮＡが直接の標的遺伝子と仮定される。
４．３と同様であるが、定量的ＰＣＲを用いてｍＲＮＡの量を測定する。
５．生物情報学アプローチを用いた、ゲノムにおける転写因子結合部位の識別。Ｗｎｔ経路の例：既知のＴＣＦ４−β−カテニン転写因子ＤＮＡ結合配列を用いて、ソフトウェアプログラムをヒトゲノム配列に対して実行し、遺伝子プロモータ領域及び他のゲノム領域の両方において、潜在的な結合部位を識別した。
６．３と同様であるが、シクロヘキシミドは存在しない。
７．４と同様であるが、シクロヘキシミドは存在しない。
８．経路が活性であることが知られている特定の組織又は細胞試料のｍＲＮＡ発現プロファイリング。しかしながら、適切なネガティブコントロール条件は存在しない。

【0060】

最も単純な形式では、標的ｍＲＮＡを識別したこれらの各実験的アプローチにつき、潜在的な標的ｍＲＮＡ毎に１ポイント付与することができる。

【0061】

或いは、１の技術に１ポイント、２の技術に２つめのポイントを加える等といった意味で、ポイントを追加的に付与することができる。この相対的な格付けストラテジーを使用することで、最も信頼性のある標的遺伝子のリストを作成することができる。

【0062】

或いは、別の格付け法を用いて直接の標的遺伝子である可能性が高い標的遺伝子を識別してもよい。その方法は、ｉｎ ｖｉｖｏの直接の標的遺伝子について最大限の証拠を提供する技術により高い点数を付与することによってなされ、上記リストにおいては実験的アプローチ１）７から２）に対する８ポイントを意味し、実験的アプローチ８に対して１ポイントに下がる。かかるリストを、「一般的標的遺伝子リスト」と称してもよい。

【0063】

生物学的な変種及び不確実性にもかかわらず、本発明者等は、直接の標的遺伝子は組織に依存しないやり方で誘導される可能性が高いと仮定した。これらの標的遺伝子のリストを、「証拠により精選された標的遺伝子リスト」と称してもよい。これらの精選された標的リストを用いて、異なった組織起源からの試料に適用可能な計算モデルを構築してきた。

【0064】

「一般的標的遺伝子リスト」は、恐らくより組織特異的な遺伝子を含み、且つ乳癌試料等の特異的組織からの試料で適用するためのモデルの感度及び特異性を最適化させるよう潜在的に用いることができる。

【0065】

以下に、証拠により精選された標的遺伝子リストの選択が、具体的にどのようにＥＲ経路に対して構築されたかという例示を示す。

【0066】

「モデル」のための入力として用いられるＥＲ標的遺伝子を選択する目的で、以下の３つの基準を用いた。
１．遺伝子プロモータ／エンハンサー領域が、エストロゲン応答要素（ＥＲＥ）モチーフを含有する。
ａ．ＥＲＥモチーフは、例えば、特定のＥＲＥモチーフがレポーター遺伝子にリンクされている一過性導入アッセイを用いて、エストロゲンに応答することを証明されなければならない。
ｂ．ＥＲＥモチーフの存在は、例えば遺伝子プロモータ／エンハンサー領域の強化モチーフ分析によって確認されなければならない。
２．例えばＣｈＩＰ／ＣＨＩＰ実験又はクロマチン免疫沈降アッセイによって実証されることによって、ＥＲは（差次的に）、問題となっている遺伝子のプロモータ／エンハンサー領域にｉｎ ｖｉｖｏで結合する。
ａ．ＥＲ経路が活性であるときに、ＥＲは遺伝子のプロモータ／エンハンサー領域に結合すると証明される。
ｂ．ＥＲ経路が活性でない場合、（好ましくは）遺伝子の遺伝子プロモータ／エンハンサー領域に結合しない（又は弱く結合する）。
３．ＥＲ経路が活性であるとき、遺伝子は差次的に転写され、例えば、以下ａ．ｂ．によって実証される。
ａ．リアルタイムＰＣＲ又はマイクロアレイ実験を介した、問題となっている遺伝子のｍＲＮＡのｆｏｌｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ、または
ｂ．ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩが、免疫沈澱アッセイを介して遺伝子のプロモータ領域に結合することの実証。

【0067】

ＥＲ標的遺伝子であって、上述した３つの全ての基準を満たしたことを証明した、十分かつ適切に文書化された実験的証拠が集められたＥＲ標的遺伝子を定めることによって、選択を行った。ＥＲ差次的結合の証拠を収集するための好適な実験は、例えば、エストロゲンに暴露した場合とされない場合のエストロゲン（例：ＭＣＦ−７細胞株）に反応する癌細胞株におけるＣｈＩＰ／ＣＨＩＰ実験結果を比較することである。ｍＲＮＡ転写の証拠の収集についても、同様である。

【0068】

以下は、包括的なアプローチ、及び上述したアプローチを用いて発見された証拠に基づいて多くの標的遺伝子を選択するために用いられてきた、標的遺伝子選択手順のより具体的な例について検討している。例示的な経路、すなわちＷｎｔ、ＥＲ、ヘッジホッグ及びＡＲ経路についてベイジアンネットワークモデルにおいて用いられた標的遺伝子のリストを、表１、表２、表３及び表４にそれぞれ示す。

【0069】

本明細書に記載の（表２参照）ＥＲ経路のベイジアンネットワークモデルに用いられたＥＲ経路の標的遺伝子は、文献証拠スコアに基づく標的遺伝子の選択を含有し、最も高い証拠スコアを有する標的遺伝子（本発明による好適な標的遺伝子）のみを、このショートリストに加えた。低い証拠スコアを有する遺伝子を含むＥＲ標的遺伝子の完全なリストを、表５に示す。

【0070】

表１、表２、表３及び表４に示したＷｎｔ、ＥＲ、ヘッジホッグ及びＡＲ経路の標的遺伝子のさらなる下位選択又は格付けを、プローブセットノードを対応する標的遺伝子ノードにリンクさせる訓練された条件付き確率の表を用いて計算したオッズ比と文献証拠スコアの組み合せに基づいて行った。オッズ比は、経路の活性を推量するにあたっての標的遺伝子の重要性の評価である。一般的に、経路の全体的な活性について、より低いオッズ比を有する標的遺伝子と比べて、より高いオッズ比を有する標的遺伝子の発現レベルのようが、より参考になる可能性が高いことが予想される。しかしながら、細胞シグナル経路の複雑さのせいで、標的遺伝子と経路の活性との間により複雑な相関関係が存在し得ることが理解される。例えば、より高いオッズ比を有する標的遺伝子を単体で考慮するより、低いオッズ比を有する標的遺伝子の種々の組み合せの発現レベルを考慮することが、より証明力があるかもしれない。本明細書で報告したＷｎｔ、ＥＲ、ヘッジホッグ及びＡＲモデリングにおいて、表６、表７、表８及び表９に示された標的遺伝子が、Ｗｎｔ、ＥＲ、ヘッジホッグ及びＡＲ経路活性の予測に対して、より低い格付けの標的遺伝子と比べてより高い証明性があることが判った（したがって、本発明によると、表６及び９に示された標的遺伝子が、特に好ましい）。とはいえ、マイクロアレイなどの取得技術が多くの遺伝子の組についての発現レベルを取得できるという相対的な容易さを前提とすると、表６、表７、表８及び表９の幾つかもしくは全ての標的遺伝子を利用し、且つ任意で追加で、表１、表２、表３及び表４に示される１つ、２つ、幾つか又は全ての追加の標的遺伝子の格付けを、図６に記載のベイジアンモデルに用いることが考えられる。

【0071】

【表1】

【0072】

【表2】

【0073】

【表3】

【0074】

【表4】

【0075】

【表5】

【0076】

【表6】

【0077】

【表7】

【0078】

【表8】

【0079】

【表9】

【実施例4】

【0080】

証拠により精選されたリストと広範な文献によるリストとの比較
本明細書において記載される手順に従い文献証拠に基づき構築されたＷｎｔ標的遺伝子のリスト（表１）が、上述の手順に従わない別の標的遺伝子のリストと比較される。もう１つの別のリストは、分子生物学及びＷｎｔ経路の領域における専門家には既知の名高い研究室によって３つの公然の情報源において発表されたＷｎｔ標的遺伝子になることになる、いろいろな実験的アプローチからの種々のデータによって示された遺伝子の寄せ集めである。もう１つの別のリストは、Ｈａｔｚｉｓ等（Ｈａｔｚｉｓ Ｐ、２００８）からの表Ｓ３、ｄｅ Ｓｏｕｓａ ｅ Ｍｅｌｏ（ｄｅ Ｓｏｕｓａ Ｅ Ｍｅｌｏ Ｆ、２０１１）からのテキスト及び表Ｓ１Ａ、並びに、Ｗｎｔシグナルの分野におけるパイオニアであるＲｏｅｌ Ｎｕｓｓｅによって集められ且つ主張された標的遺伝子のリスト（Ｎｕｓｓｅ、２０１２）に記載の遺伝子の組み合わせである。これら３つの情報源の組み合わせは、１２４個の遺伝子のリストを生じた（＝広範な文献によるリスト、表１０を参照）。ここでは、このもう１つの別のリストから得られるアルゴリズムによる臨床試料におけるＷｎｔ活性を予測することの実行が、既存の遺伝子のリスト（＝証拠により精選されたリスト、表１）に基づき構築されたモデルと比較して同様に又はより優れて実行することかどうかという問題が論議されている。

【0081】

【表10】

次のステップは、前記遺伝子と一致するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ２．０アレイのプローブセットを見つけることから成り立った。このプロセスは、Ｒのバイオコンダクタープラグイン（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｐｌｕｇｉｎ）、及び、ＵＣＳＣゲノムブラウザに基づくプローブセットの関連性に対する手動の精選を使用して行い、その結果、例えば反対の鎖上又は外側の遺伝子エクソン領域のプローブセットを除去した。１２４個の遺伝子のうち２つの遺伝子に対して、このマイクロアレイチップ上で利用可能なプローブセットがなく、従って、ベイジアンネットワークに挿入することはできなかった。これらの遺伝子は、ＬＯＣ２８３８５９及びＷＮＴ３Ａである。全部で２８７個のプローブセットが、残りの１２２個の遺伝子に相当すると分かった（表１１）。

【0082】

【表11】

後に、図６及び本明細書において説明される手順と同様にベイジアンネットワークを構築した。証拠により精選されたリストに基づくＷｎｔベイジアンネットワークの記載と同様に、証拠により精選されたリストも広範な文献によるリストも、プローブセットとそのそれぞれの遺伝子との間のエッジの条件付き確率の表を、（２０１１年７月１３日に最後にアクセスしたｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／にて入手可能な）遺伝子発現オムニバスからのデータセットＧＳＥ８６７１由来の３２の正常な結腸試料及び３２の腺腫試料のｆＲＭＡ処理データを使用して訓練した。

【0083】

訓練したベイジアンネットワークを、次に、種々のデータセットに対してテストし、Ｗｎｔ経路が「オン」、すなわち活性である確率Ｐ（Ｗｎｔオン）を推量し、該確率は、Ｗｎｔ経路転写複合体が「存在」するという推量した確率に等しいと解される。訓練した広範な文献によるモデル及び証拠により精選されたモデルの要約された結果が、図１４乃至１９において示されている。

【0084】

明らかに、広範な文献によるモデルは、一般的に、オン又はオフであるＷｎｔシグナルに対してより極端な確率を予測するということを推定することができる。加えて、もう１つの別のモデルは、結腸癌のデータセット（ＧＳＥ２０９１６、ＧＳＥ４１８３、ＧＳＥ１５９６０）に対して類似の結果を予測するが、予想を超える試料が、乳癌（ＧＳＥ１２７７７）、肝癌（ＧＳＥ９８４３）、及び髄芽腫試料（ＧＳＥ１０３２７）のデータセットにおいて予測された活性のＷｎｔシグナルを有する。

【0085】

結論として、広範な文献による標的遺伝子のリストは、一方で結腸癌におけるＷｎｔ活性をほぼ等しく優れて予測するが、もう一方で他の癌タイプにおいてはより劣って予測する（偽陽性が多すぎる）。これは、特異的に結腸細胞に偏り過ぎている、従って組織特異的過ぎるもう１つの別の標的遺伝子のリストの結果であり得る。ｄｅ Ｓｏｕｓａ Ｅ Ｍｅｌｏ等もＨａｔｚｉｓ等も、主な関心は、非結腸特異的Ｗｎｔ標的遺伝子が含まれ得るけれども、結腸直腸癌であった。加えて、これらのリストにおそらく含まれる非Ｗｎｔ特異的な標的遺伝子は、他の癌タイプにおける悪化したＷｎｔ活性の予測の原因であり得る。もう１つの別のリストは、より間接的に制御される標的遺伝子を含有する可能性が高く、おそらくこのリストをより組織特異的にする。もともとのリストは、全ての組織においてＷｎｔ感受性であり、従って、組織特異性を減らす遺伝子を表す可能性が最もある直接的な標的遺伝子を含有することに対して調整される。

【実施例5】

【0086】

ベイジアンネットワークの訓練及び使用
ベイジアンネットワーク使用して、テスト試料における経路の活性を推量することができる前に、ネットワーク要素間の確率の関係を描くパラメータを決定しなければならない。さらに、入力する測定値が分散した状態である場合に、離散化の仕方を描く閾値を設定しなければならない。

【0087】

典型的に、ベイジアンネットワークは、好ましくは全ネットワークノードの全ての状態が既知である代表的な訓練試料のセットを使用して訓練される。しかし、モデルをすることになる経路のどの活性状態であるのか既知である多くの異なる種類の癌から訓練試料を得ることは非実用的である。結果として、入手可能な訓練セットは、限定された数の試料から成り、典型的には１つのタイプの癌のみからの試料から成る。ベイジアンネットワークが他のタイプの試料によく一般化するのを可能にするために、従って、パラメータが決定される方法に特別注意を払わなくてはならず、好ましくは本明細書において記載されるアプローチにおいて以下のように行われる。

【0088】

ＴＦノードに対しては、「非存在」及び「存在」という状態にある（無条件の）確率は、多くの試料のセットにおける予想される出現によって与えられる。或いは、正の結果又は負の結果にたいしていかなる偏りも有さないように、図１において行われているように０．５に設定することができる。

【0089】

標的遺伝子ノードに対しては、条件付き確率が、図１のように設定される。ＴＦ要素が「非存在」である場合、標的遺伝子は「減る」可能性が最も高く、従って、０．９５の確率がこれに対して選ばれ、標的遺伝子が「増える」確率は０．０５である。後者の（ゼロではない）確率は、他の因子によって標的遺伝子が制御されるか、又は、（例えば測定ノイズのために）偶然に「増える」が観察される（まれな）可能性に相当することになる。ＴＦ要素が「存在」する場合、従って、０．７０というまずまずの確率を有して標的遺伝子は「増え」、０．３０という確率を有して標的遺伝子は「減る」。後者の値は、例えば遺伝子のプロモータ領域がメチル化されているため等、ＴＦ要素は存在するけれども標的遺伝子が強く発現されない理由がいくつかあり得るため、このように選ばれる。標的遺伝子がＴＦ要素によって上方制御されないが下方制御される場合、確率は同様にして選ばれるが、ＴＦ要素の存在による下方制御を反映している。

【0090】

プローブセットの強度が入力測定値を編成する図６において与えられているベイジアンネットワークモデルに対して、最終的に、プローブセットの強度をそれぞれの標的遺伝子のｍＲＮＡレベルに関係づける離散化及び条件付き確率の表に対するパラメータを決定しなければならない。これらのうちどちらも、本発明における訓練データに基づいている。プローブセットの強度のレベルの、「低い」及び「高い」という状態への離散化に対して、経路が活性化されている訓練試料（「オン」試料）のセットにおける強度値を、経路が活性化されていない訓練試料（「オフ」試料）のセットにおける強度値から最良に分ける適した閾値が決定される。最後に、それぞれの標的遺伝子の「減る」又は「増える」という状態に応じて「低い」又は「高い」強度を有するというプローブセットの確率を記載する条件付き確率の表が、それぞれの閾値の下及び上のプローブセットの強度値を用いて「オン」及び「オフ」試料の数を数えることによって行われる。これは、頻度論的アプローチとして文献において既知である。ゼロの値を有した条件付き確率の表への移行を防ぐ、ベイジアンネットワークの極端なふるまいを防ぐために、ダミーの数値（ｄｕｍｍｙ ｃｏｕｎｔ）が各群に加えられる。

【0091】

図６のベイジアンネットワークを考慮し、且つ、プローブセットに関するマイクロアレイ測定が利用可能であると仮定して、ベイジアンネットワークが訓練された後に、以下のようにテスト試料に対して適用することができる。第一のステップは、上記のようにテスト試料における各プローブセットの強度をそれぞれの閾値と比較することによって、入力測定値を離散化することである。この比較は、各プローブセットを「低い」若しくは「高い」強度に設定したハードな方法（「ハードエビデンス（ｈａｒｄ ｅｖｉｄｅｎｃｅ）」と呼ばれる）で行ってもよく、又は、測定におけるある不確かな状態（ノイズ）を仮定し、各プローブセットに対して、「低い」若しくは「高い」という確率を設定したソフトな方法（「ソフトエビデンス（ｓｏｆｔ ｅｖｉｄｅｎｃｅ）」と呼ばれる）で行うことができる。例えば、閾値よりすぐ下の強度を有したプローブセットのソフトエビデンスは、ノイズの適した推定及び閾値との差に基づき０．８の「低い」という確率、及び、０．２の「高い」という確率であってもよい。

【0092】

次に、このハードエビデンス又はソフトエビデンスが、例えばジャンクションツリーアルゴリズムに基づき、ベイジアンネットワークに対する適した推量エンジンに供給される（（Ｎｅａｐｏｌｉｔａｎ、２００４）を参照）。そのようなエンジンは、従って、「非存在」又は「存在」である、ＴＦ要素の更新された確率を推量することができ、提供される証拠が与えられる。「存在」であるＴＦ要素の推量された確率は、次に、それぞれの経路が活性であると推定された確率として解釈される。

【0093】

好ましくは、Ｗｎｔ、ＥＲ、ヘッジホッグ及びＡＲ経路のベイジアンネットワークモデルの訓練は、（上記のｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／にて入手可能な）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓで入手可能な公衆データを使用して行われる。

【0094】

Ｗｎｔベイジアンネットワークを、不活性のＷｎｔ経路を有するとして考慮される３２の正常な結腸試料、及び、活性のＷｎｔ経路を有するとして知られる３２の確認済み腺腫試料（ＧＳＥ８６７１データセット）を使用して例証的に訓練した。

【0095】

ＥＲ経路のベイジアンネットワークモデルを、同様にＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓにて入手可能なＧＳＥ８５９７データセット由来の、不活性のＥＲ経路を有するとして知られる４つのエストロゲン欠乏性ＭＣＦ７試料、及び、活性のＥＲ経路を有するとしてみなされた４つのエストロゲンで刺激されたＭＣＦ７試料を使用して例証的に訓練した。

【0096】

ヘッジホッグ経路のベイジアンネットワークモデルを、ＧＳＥ７５５３データセットにおいて入手可能な、活性のヘッジホッグ経路を有するとして確認された１５の基底細胞癌試料、及び、不活性のヘッジホッグ経路を有する試料を表す４つの正常な皮膚細胞試料を使用して例証的に訓練した。

【0097】

ＡＲ経路のベイジアンネットワークモデルを、正のＡＲ活性を有する３つの試料、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）で刺激されたＬＮＣａＰ細胞株、強力なＡＲ経路活性化因子、及び、不活性のＡＲ経路のケースを表す３つの無刺激のＬＮＣａＰ細胞株を使用して例証的に訓練した。

【0098】

図３５及び図３６を参考にすると、訓練したＷｎｔ及びＥＲ経路のベイジアンネットワークモデルを使用して、本明細書に記載の訓練手順において使用されていない類似の試料（Ｗｎｔ及びＥＲベイジアンネットワークに対して、それぞれ結腸試料及びＭＣＦ７乳癌細胞株）における経路の活性を予測した（ヘッジホッグベイジアンネットワークに対する適切なデータセットは見つからなかった）。大多数の試料の予測した経路の活性は、検証されることになるモデルに対して臨床的に予想される経路の活性と一致しているべきである。

【0099】

図３５は、ＧＳＥ２０９１６データセットにおける、バーの色によって示された分類によってグループ化された結腸試料の予測したＷｎｔ活性を示しており、試料に対して、縦軸上のロジットＰ（Ｗｎｔオン）として描かれており、横軸上のバーによって例示されている。全ての正常な結腸試料は、健康な組織の試料であることに基づき、不活性の経路を有する（スコア＜０）と正しく予測されている。４つの試料以外の、活性の経路を有すると疑わしい試料は全て、活性のＷｎｔ経路を有すると予測されている。

【0100】

図３６において、訓練したＥＲベイジアンネットワークモデルの検証結果が、ＭＣＦ７乳癌細胞株試料を使用して測定された２つのマイクロアレイに対して示されており、１つは、エストロゲンで刺激され（Ｅ２）、もう１つは、負の対照を有しており（ＥｔＯＨ）、どちらもＧＳＥ９２５３データセットから生じている。疑わしいＥＲ活性との同意において、エストロゲンで刺激した試料は、活性のＥＲ経路を有すると予測される一方、負の対照は、不活性のＥＲ経路を予測する。

【0101】

訓練した（例えばＷｎｔ、ＥＲ、ＡＲ及びヘッジホッグの経路の）ベイジアンネットワークを使用して、それぞれの経路の活性を予測するためのさらなる詳細及び例が、以下の実施例６において説明される。

【0102】

上述の訓練プロセスは、臨床適用の他のベイジアンネットワークに利用することができる。ここでは、細胞シグナル経路、さらに具体的にはＷｎｔ、ＥＲ、ＡＲ及びヘッジホッグの経路を表す本明細書において開示される方法を使用して構築したベイジアンネットワークモデルに対して機能することが示され且つ証明される。

【実施例6】

【0103】

（異常な）経路の活性の診断
以下において、どのようにして例えばベイジアンネットワークモデルを使用して、細胞シグナル経路の活性を診断するかが例証的に例示されている。

【0104】

本明細書において記載される図６と類似し、且つ、本明細書において記載されるように訓練した、転写因子の存在に対するノード、標的遺伝子のｍＲＮＡを表すノードの層、及び、標的遺伝子（表１、表２、表３、表４）に対応するプローブセットの強度を表すノードの層を使用して構築したＷｎｔ、ＥＲ、ヘッジホッグ及びＡＲの経路のベイジアンネットワークを使用し、種々の以前に訓練には使用されていないデータセットにおいて、活性である「オン」又は不活性の「オフ」として経路の活性を予測し、どのくらい適切に推量成分が機能しているかを推量した。予測した経路の活性のスコアは、臨床知識と関係づけられる。テストランの選択に対する結果の要約は、以下の図２１において示されている。

【0105】

以下の図２１を参考にして、本明細書において記載されるベイジアンネットワークモデルを使用した医学的な組織試料に対する経路の活性の推量結果が示される。

【0106】

図２１は、結腸試料のデータセットＧＳＥ４１８３に対するＷｎｔ活性テストの結果を示している。ベイジアンネットワークモデルは、腺腫細胞に対して高い値のＰ（Ｗｎｔオン）、及び、正常な試料に対して低い値を生じ、それは、腺腫及び健康な組織の（病態）生理学に一致している。速い細胞増殖を有し、従って高いＷｎｔ活性を有する腺腫性組織とは相対的に、健康な組織は、ゆっくりとした細胞増殖を有し、従って、低いＷｎｔ活性を有している。ＩＢＤ試料に対して、ベイジアンネットワークモデルは、１つの試料以外の全ての試料に対して、低いＷｎｔ経路の活性（Ｐ（Ｗｎｔオン）〜０）を示した。ここでも、これは、速い細胞増殖を生じないＩＢＤ試料と一貫している。結腸直腸癌細胞試料に対して、結果はまちまちであり、これらの試料のうち約半分において高いＷｎｔ経路の活性が検出された。しかし、これは、良性の腺腫性組織が悪性の癌にかかった組織になった場合の腫瘍ドライバーの役割を仮定する他の経路の結果、又は、例えば多すぎる非腫瘍組織を含有する試料、若しくは、ｍＲＮＡが部分的に分解されている等、試料解析問題の結果であり得る。

【0107】

本明細書において報告される実験において使用されるベイジアンネットワークモデルは、結腸試料のデータセットＧＳＥ８６７１を使用して訓練した。しかし、Ｗｎｔ経路は、（おそらく不活性にもかかわらず）他の細胞タイプにおいて存在している。従って、おそらく、ベイジアンネットワークは、他のタイプの癌と相関的な異常に高いＷｎｔ経路の活性を推量するために適用可能であり得るということを考慮した。これに対する理論的根拠は、結腸試料を使用してベイジアンネットワークモデルを訓練したけれども、他の細胞タイプにおける（おそらく不活性であるにもかかわらず）Ｗｎｔ経路が存在するということの働きの第一原理に基づいているということである。図２２乃至２４は、そのような「交差組織タイプ」の推量を調査するいくつかの結果を示している。

【0108】

図２２は、髄芽腫試料（データセットＧＳＥ１０３２７）におけるＷｎｔ経路の活性を推量するために適用されている、結腸試料を使用して訓練したベイジアンネットワークモデルを使用したテストに対する結果を示している。このデータセットに含まれる試料を、いくつかのサブセットにおいてさらに特徴づけた。前記サブセットの１つは、Ｗｎｔ経路が活性の試料である。Ｗｎｔ経路のベイジアンネットワークは、活性のＷｎｔ経路を有したＷｎｔ−活性試料の群を予測する一方、他の試料を不活性のＷｎｔ経路を有するとして正確に予測する。

【0109】

肝癌試料を含有するデータセット（ＧＳＥ９８４３）においてＷｎｔベイジアンネットワークモデルを使用したテスト結果が、図２３において示されている。ここで、試料は、ＧＳＥ９８４３データセットによって割り当てられる以下の事前の注釈：「ＣＴＮＮＢ１」、「炎症」、「多染色体性 ｃｈｒ７」、「増殖」及び「注釈なし」によってグループ化されている。「炎症」グループの試料は、炎症状態が速い細胞増殖を引き起こさないために予想されるように、異常に高いＷｎｔ経路の活性は有していないと一様に推量されている。「多染色体性 ｃｈｒ７」とラベルされた試料も、異常に高いＷｎｔ経路の活性は有していないと一様に推量されている。染色体数７の多染色体性は、３つ以上の第７染色体があるということを意味している。この多染色体性状態がＷｎｔ経路に影響を与えると予想する理由がないため、これらの試料が異常に高いＷｎｔ経路の活性を有さないということは予想外ではない。

【0110】

「増殖」とラベルされた試料のうち約５分の１が、Ｐ（Ｗｎｔオン）＞０．５を有する。増殖によって、速い細胞分裂増殖の状態が示唆される。そのような状態は、異常に高いＷｎｔ経路の活性と付随し得るが、細胞増殖の可能性のある数多くの他の原因とも付随し得る。従って、異常に高いＷｎｔ経路の活性を有するこれらの試料のうち約５分の１が、不合理な結果ではない。

【0111】

「ＣＴＮＮＢ１」グループの試料のうち約半分が、異常に高いＷｎｔ経路の活性を有しているとベイジアンネットワークによって推量されている。ＣＴＮＮＢ１遺伝子は、Ｗｎｔ経路の調節タンパク質であるベータカテニンタンパク質をコード化し、さらに、この遺伝子において変異を活性化することによって、異常なＷｎｔの活性化が引き起こされる。このように、「ＣＴＮＮＢ１」グループと高いＷｎｔ経路の活性との相互関係は、整合した予想である。

【0112】

図２４は、乳癌試料のセットに対する、本明細書において記載されるＷｎｔベイジアンネットワークモデルのテスト結果を描いている。この場合、乳癌細胞株の３つのグループがテストされている。１つのグループは、Ｗｎｔ経路が異常に高いレベルで機能していると事前に知られており（Ｗｎｔオングループ）、１つのグループは、Ｗｎｔ経路が異常に高いレベルで機能していないと事前に知られており（Ｗｎｔオフグループ）、さらに、もう１つのグループは、Ｗｎｔ経路の活性が事前に知らされていない（不明のグループ）。加えて、活性のＷｎｔ経路を有し得るという文献において矛盾する報告があるけれども（しかし、これは少数の報告であり、より多くの研究論文が不活性のＷｎｔ経路を報告している）、低レベルのＷｎｔ活性化を有していると疑われている試料も１つある（Ｗｎｔの疑いあり）。図２４において見られるように、ベイジアンネットワークによって提供される、事前の知識との推量の相互関係は、Ｗｎｔオン及びオフのグループに対して強いものである。また、図の一番右の試料（Ｗｎｔの疑いあり）は、Ｗｎｔ経路はオフであると述べる文献における大部分の報告に一致する推量を示している。Ｗｎｔ経路の活性における事前の知識がない図２４において示されている不明のグループのケースにおいては、ベイジアンネットワークは、Ｐ（Ｗｎｔオン）＞０．５の１つの例以外は、Ｗｎｔ経路に対して低い活性を推量している。文献によると、この細胞株は共受容体ＬＲＰ６の高い発現を有していることが示されており、Ｗｎｔ経路はオンであると説明することができる。

【0113】

図２５は、同じ乳癌細胞株のデータセットに対する結果を示しているが、ここでは、本明細書において記載されるＭＣＦ７乳癌細胞株を使用して訓練したＥＲベイジアンネットワークを使用して、ＥＲ活性に対してテストした。活性のＷｎｔ経路を有すると事前に知らされた試料を、不活性のＥＲ経路を有すると予測した。これは、Ｗｎｔ経路はすでに速い細胞分裂増殖を駆り立てているため、驚くべきことではない。もう一方で、ＥＲ陽性試料を、Ｗｎｔオフ試料及び不明の試料の中から見つけた。図２４を考慮すると、これは驚くべきことではない。

【0114】

癌試料のセット（ＧＳＥ１２２７６）に対する、乳癌細胞株で訓練したＥＲベイジアンネットワークの予測のテスト結果が、図２６において示されている。乳癌試料を、よく知られた分類である、ルミナールＡ（ＬｕｍＡ）、ルミナールＢ（ＬｕｍＢ）、ヒト上皮増殖因子受容体２陽性（ＨＥＲ２）及び基底乳癌サブタイプに細分した。ルミナールＡ及びルミナールＢサブタイプにおける組織試料は、ＥＲを発現すると知られている。大部分の試料が高いＥＲ経路の活性を有すると予測されるのもこれらのサブタイプにおけることである。もう一方で、基底のサブタイプのものであるとして分類される試料は、ＥＲの発現を有さない又はＥＲの低い発現を有するとして知られ、これは、基底グループ試料において予測される活性でないＥＲ経路との相互関係を正確に示す。ＨＥＲ２グループにおいて、３つの試料のみが、Ｐ（ＥＲオン）＞０．５を有する一方で、大多数の試料が、不活性のＥＲ経路を有すると予測される。これは、これらの試料は増幅されるＨＥＲ２発現を有するという事実に対して分類が行われているという事実との相関関係をよく示しており、制御されない細胞複製が、おそらく、ＥＲ経路以外の細胞シグナル経路を介したＨＥＲ２シグナルを介して駆り立てられている（例えば、図２４におけるＷｎｔ活性乳癌細胞株、又は、図３０におけるヘッジホッグ活性乳癌試料を参照）。

【0115】

本明細書に記載される構築且つ訓練したＥＲベイジアンネットワークモデルを使用して、種々の癌の細胞株大パネルにおけるＥＲ経路の活性が予測され、結果が図２７において示されている。予想されたように、ＥＲ活性が予測された試料のみを乳癌細胞株において見つけた。他のタイプの癌細胞株全てを不活性なＥＲ経路を有すると予測し、これは予想通りである。

【0116】

本明細書において記載されるヘッジホッグ経路に対して構築且つ訓練したベイジアンネットワークモデルを使用して、ＧＳＥ３４２１１データセットにおける種々の癌タイプの細胞株に対するヘッジホッグ経路の活性が予測される。ヘッジホッグの活性予測は、図２８において示されている。正の予測されたヘッジホッグ活性の最も高い部分は、中枢神経系（ＣＮＳ）、皮膚、子宮内膜及び子宮癌タイプにおいて見つかり、これは、これらの細胞タイプにおけるヘッジホッグ依存性細胞増殖に関する文献の知識とよく一致している。

【0117】

図２９は、本明細書において記載されるＷｎｔベイジアンネットワークモデルを使用してすでに解析した髄芽腫試料（ＧＳＥ１０３２７）の予測されたヘッジホッグ活性を示している。髄芽腫試料は、サブクラスにおいて特徴づけられており、それらのうち１つは、活性のヘッジホッグシグナル経路を有している（識別子：ＳＨＨ）。ＳＨＨサブタイプにおける試料のうち全てが、活性のヘッジホッグシグナルを有すると予測されている。さらに、Ｗｎｔサブタイプにおける髄芽腫試料も、活性のヘッジホッグ経路を有すると予測した。これは、どちらの経路もこれらの腫瘍において活性であることが多いことを示す臨床的証拠と一致している。それにもかかわらず、Ｗｎｔベイジアンネットワークは、ＷｎｔサブタイプにおいてのみＷｎｔ活性を正確に予測することが明らかにできた。このように、Ｗｎｔ及びヘッジホッグベイジアンネットワークの組み合わせは、これら２つのサブタイプの分類を正確にすることができる。

【0118】

ＥＲベイジアンネットワークモデルを使用してＥＲ活性を予測するために以前に使用したＧＳＥ１２２７６乳癌試料における、ヘッジホッグベイジアンネットワークモデルを使用して予測したヘッジホッグ活性が、図３０において示されている。ヘッジホッグ経路は、全てのサブタイプの試料のうち一部分において活性であると予測される。これは奇妙に思えるが、図２６において示されたＥＲ経路の予測に一致しており、ヘッジホッグの活性は、活性のＥＲ経路を有さない試料においてのみ予測されると見ることができる。これは、（乳房）組織における制御されない細胞増殖は種々のシグナル経路によって駆り立てられ得るという仮説とよく一致している。

【0119】

要約すれば、図２１〜３０に示された種々の癌性組織試料及び細胞に対するテスト結果は、組織／経路特異的試料に対して訓練したＷｎｔ、ＥＲ及びヘッジホッグモデルのベイジアンネットワークが、他のタイプの組織の試料における解析に対して利用可能であることを強く示唆している。これは、細胞シグナル経路解析が「交差組織タイプ」に適用されるのを可能にし得る。このように、（本明細書において記載される）ＣＤＳシステム１０は、ベイジアンネットワークモデル４０を訓練するために使用された試料の組織タイプ以外の組織タイプの範囲における経路の活性を評価するために容易に適用される（例えば、本明細書において開示される（Ｗｎｔ経路に対して例証的に示される）１つ又は複数の細胞シグナル経路を評価するために構成された臨床判断支援（ＣＤＳ）システムを概略的に示す図２０を参照）。推量成分４０、４４、４６、４８が、解析下の組織が異常に高いＷｎｔ、ＥＲ又はヘッジホッグ経路の活性を示すと表すが、組織特異的な薬物が利用可能でない場合、一般的なＷｎｔ、ＥＲ又はヘッジホッグ経路の抑制薬物又は機能障害特異的な薬物が、ＣＤＳシステム１０により提供される勧告２８又は勧告２６にそれぞれ基づき、医師によって考慮されてもよい。

【0120】

図２１〜３０の結果は、Ｗｎｔ、ＥＲ及びヘッジホッグ経路に対するベイジアンネットワークモデルにおける交差組織タイプの適用性を表すけれども、臨床的適用に対して、ベイジアンネットワークモデルは、解析下の特定の組織タイプ（例えば乳房組織若しくは肝臓組織等）に対するその適用性を最大にするために選択的に更新又は適応されてもよいということが予想される。そのような更新又は適応は、例えば、解析下の組織タイプの臨床研究に基づき条件付き確率を調整することを必要とし得るか、又は、調査下の１つ又は複数の経路の組織特異的標的遺伝子を有する本明細書において記載される証拠により精選した標的遺伝子のリストの質を高め得る。加えて、解析下の組織に対してベイジアンネットワークモデルをより良く調整するために、ノードを追加又は除去してもよい。或いは、異なるベイジアンネットワークモデルを、組織タイプに応じて異なる訓練セットを使用して最初から訓練してもよい。さらに、図２１〜３０の結果は、本明細書に記載されるプロセスの、Ｗｎｔ、ＥＲ及びヘッジホッグ以外の経路の証拠により精選した標的遺伝子のリストを使用してベイジアンネットワークモデルを開発及び訓練し、経路の活性を予測及び診断する能力を例示している。

【0121】

本明細書において記載される構築及び訓練したＡＲベイジアンネットワークモデルのテスト結果を例証的に使用して、種々の治療レジメで治療されたＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株（ＧＳＥ７７０８）におけるＡＲの活性を予測した（図３８を参照）。予想したように、ＤＨＴで刺激されていないＬＮＣａＰ細胞は、予測された不活性のＡＲ経路を生じる一方で、ＬＮＣａＰ刺激細胞を、活性のＡＲ経路を有するとして、さらに、抗アンドロゲン薬物であるビカルタミドで治療されたＬＮＣａＰ細胞を、抑制されたＡＲ経路を有するとして正確に予測した。

【0122】

本明細書において記載される訓練したＡＲ経路のベイジアンネットワークを使用して、ＧＳＥ１７９５１データセットからの前立腺癌試料においてＡＲ経路が活性である確率も予測した（結果は図３９において示されている）。大部分の前立腺生検及び腫瘍を、対照試料と比較してより高いＡＲの活性の確率を有するとしては意外なことに予測しなかった。

【0123】

ＡＲベイジアンネットワークモデルを、交差組織テスト、すなわち、ＧＳＥ１２２７６データセットに含まれる乳癌試料にも適用した。このテストに対する結果は、図４０において示されている。全てのサブグループにおいて見つかった、試料のうちごく一部分が、活性の経路を有すると予測される一方で、大多数の試料が、不活性のＡＲ経路を有した。意外なことに、最も高い割合の活性のＡＲ経路を有した試料は、ＨＥＲ２サブグループにおいて見つけられ、これは、ＨＥＲ２とＡＲ経路との間に掛け合い応答があり、さらに、ＡＲ経路はＨＥＲ２シグナル伝達によっても誘発され得ると文献から既知のように予想外のことではない。

【0124】

図４１及び図４２において描かれているように、上述のＡＲＡＲベイジアンネットワークモデルを使用して、種々の癌タイプの細胞株試料の２つのセット（ＧＳＥ３６１３３及びＧＳＥ３４２１１）におけるＡＲ経路の活性も予測した。予想したように、大部分の細胞株が、不活性のＡＲ経路を有すると分かった。これに対する例外は、ＡＲ経路の活性を発現する癌細胞株試料をいくつか有する前立腺癌試料である。表１２において、前立腺癌試料におけるＡＲ経路の活性の予測全てが既知のＡＲ活性と一致していることが示されている。

【0125】

【表12】

【実施例7】

【0126】

経路の活性に基づく予後
Ｗｎｔやヘッジホッグといった初期発生経路は、癌幹細胞と称される、より幹細胞様の表現型に帰属する癌細胞により引き起こされた転移において役割を果たすと考えられている。確かに、Ｗｎｔ経路等の初期発生経路が癌転移における役割を果たすことについて、十分な証拠が入手可能であり、転移性癌細胞が別の臓器又は組織におけるシーディング位置において分裂し始めることを可能にする。転移は、悪い予後と関連するので、癌細胞におけるＷｎｔ及びヘッジホッグ経路等の初期発生経路の活性が、悪い予後に対する前兆となることが予想される。このことは、本明細書に記載のベイジアンネットワークモデルを用いて活性ＥＲ経路を有するが活性Ｗｈｔ又はヘッジホッグ経路を有しないと識別されたＧＳＥ１２２７６データセットからの乳癌患者が、図３７のカプランマイヤープロットに例示された活性のヘッジホッグ又はＷｎｔ経路のいずれか又はその両方を有すると識別された患者よりも良好な予後を有したといった事実によって、支持される。

【実施例8】

【0127】

療法計画、薬効の予測、副作用の予測及び薬効のモニタリング
療法計画、薬効の予測、薬効の予測のモニタリング及び関連する活動について、いかに確率モデル、特にベイジアンネットワークモデルを用いるかを以下に例示する。

【0128】

図６と同様、また本明細書に記載したように訓練したように、転写因子の存在についてノードを用いて構築されたＥＲ経路のベイジアンネットワークモデル、標的遺伝子’ｍＲＮＡレベル（表２）を表すノードの層、及び標的遺伝子（表２）に対応するプローブセットの強度を表すノードの層を用いて、経路の活性を予測した。経路の活性は、薬効の予測又は薬効の予測のモニタリングに関連づけられるよう、後に実証する。結果のまとめを、図３１及び３２に示す。

【0129】

タモキシフェンは、ＥＲ＋（エストロゲン受容体陽性）乳癌の治療について現在用いられている薬物である。ＥＲシグナリングによって誘発されたと考えられた、制御されていない細胞増殖を妨げるエストロゲン受容体の部分アンタゴニストとして作用する。残念なことに、癌組織スライドのルーチン的な組織病理学分析による癌細胞のＥＲタンパク質の存在の実証にもかかわらず、全ての乳癌がタモキシフェンを伴う治療に応答するわけではない。このいわゆるタモキシフェン耐性を調査するため、多くの研究がなされてきた。公的に入手可能なＧＳＥ２１６１８データセットは、かかる研究の一つの結果であり、異なる処理レジメのもとでのタモキシフェン耐性及び野生型ＭＣＦ７細胞株のマイクロアレイデータを含有する。本明細書に記載された、構築され且つ訓練されたＥＲベイジアンネットワークモデルを用いて、タモキシフェン耐性及びＭＣＦ７細胞株を異なる処理レジメで分析し、その結果を図３１に示す。

【0130】

ＴａｍＲ．Ｃｔｒｌにより示される制御タモキシフェン耐性は、タモキシフェン追加（１、２、３、６、１２、２４、及び４８ｈ）後、各時点について不活性ＥＲ経路を有すると予測される。ＴａｍＲ．Ｔａｍによって指摘された、タモキシフェンを伴うタモキシフェン治療に感度の悪いタモキシフェン耐性細胞株の治療が、効果のないことであるのは、驚きではない。タモキシフェン耐性細胞株（ＴａｍＲ．Ｃｔｒｌ）の分析によれば、制御されていない細胞増殖の推進力は、活性ＥＲシグナリングに因るものではない。したがって、ＥＲアンタゴニストで処理することは、細胞増殖を妨げない。このことが例示するのは、タモキシフェンを伴う治療は、負の予測されるＥＲ経路の活性の場合には、推奨されないことである。

【0131】

一方、タモキシフェン感受性であることが知られている、１７ベータエストラジオール（ｗｔ１．Ｅ２）で処理される野生型ＭＣＦ７細胞株は、ゆっくりとホルモン治療に反応し、このことは、増加するＥＲ陽性活性予測において見ることができる。エストロゲン生成を妨げることが知られているアロマターゼ阻害剤でかかる細胞株を処理することは、ＥＲ経路を妨げ、これは、やがて減少するＥＲ経路予測によって例示される。このことは、ＧＳＥ１１３２４データセットにおいて時間を増やすためにエストロゲンで処理するＭＣＦ７試料からのマイクロアレイデータに基づくＥＲ経路予測によって、支持される。結果を、図３２に示す。

【0132】

上記は、療法計画、薬効の予測及び薬効の予測のモニタリングに用いる確率モデルの能力、特に、ベイジアンネットワークモデルを、例示する。しかしながら、同じ手法を、副作用を予測しモニタリングすることに適用することが理解される。

【実施例9】

【0133】

医薬品開発
療法応答モニタリングと同様、経路モデルを医薬品開発に用いて、種々の推定される化合物の有効性を評価することができる。例えば、癌細胞株における或る経路の起こりうる効果について多くの化合物をスクリーニングするとき、それぞれの経路モデルを用いて、化合物の適用後に経路の活性が上昇するか下降するかを決定することができる。しばしば、このチェックは、経路の活性の１つ又は幾つかの推定マーカのみを用いてなされるが、このことは、治療効果の有効でないモニタリングの可能性を上げる。さらに、動物又は患者対象についての追跡研究において、経路モデルを同様に用いて候補薬物の有効性を評価し、且つ経路の活性に最大限に影響を与えるための最適な量を決定することができる。

【0134】

新規の薬剤化合物の有効でないモニタリングの例を、図３８に示すようにＧＳＥ７７０８試料における予測されるＡＲ経路活性によって例示する。本研究において、ポリアミド１及びポリアミド２によって示す、ＡＲ経路活性を妨げる可能性のある２つの薬剤化合物を、開発した。これらの２つのポリアミドが、ＡＲ経路の妨げを可能とすることを実証し、この実証は、ポリアミドがアンドロゲン応答配列（Ａｎｄｒｏｇｅｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ （ＡＲＥ））に結合し、本明細書に記載の標的遺伝子選択にも含まれているＡＲ活性についての周知のマーカであるＫＬＫ３（＝ＰＳＡ）の発現を妨げているという発見、並びにＤＨＴによって誘発された≒３５％の転写に基づいている。対称的に、ＡＲ経路のベイジアンネットワークモデルが、これらの試料が依然として活性ＡＲ経路を有することを予測した。発見によれば、ＡＲベイジアンネットワークモデルを用いた上方制御された標的遺伝子の推量された確率の調査は、ＫＬＫ３が他の標的遺伝子とは対照的に下方制御されたことを示した。一方、全ての他の標的遺伝子（ポリアミド１の場合ＡＲ、ＧＵＣＹ１Ａ３及びＴＭＰＲＳＳ２を除く）は、明らかに差次的にポリアミド１及びポリアミド２処理された試料において発現した。換言すれば、ＡＲ活性についての１つのマーカ、ＫＬＫ３を下方制御したが、識別された大部分の標的遺伝子は、依然として上方制御され、ＡＲ経路が依然として無損傷であり従って活性であることを示した。文献証拠に基づいて多数の標的遺伝子を考慮にいれると、本発明者等は、ポリアミドのＡＲ活性の妨げが限定されていて、且つＫＬＫ３発現のみがこれらのポリアミドを使用して明らかに下方制御されたことを示すことができた。さらに、このことは、医薬品開発における還元主義的なアプローチと比べ、ベイジアンネットワークモデルを用いた体系化されたアプローチの値を例示している。

【実施例10】

【0135】

アッセイの開発
マイクロアレイ又はＲＮＡ配列決定から生じるｍＲＮＡ入力データに対して上述のベイジアンネットワークを適用する代わりに、例えばｑＰＣＲを使用する統合的プラットフォームに対して同じ測定を行って標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを決定するために献身的なアッセイを開発することが、臨床的適用において有益であり得る。従って、開示される標的遺伝子のＲＮＡ／ＤＮＡ配列を使用して、そのようなプラットフォームに対してどのプライマー及びプローブを選択するかを決定することができる。

【0136】

そのような献身的なアッセイの検証を、マイクロアレイに基づくベイジアンネットワークを参照モデルとして使用し、さらに、開発したアッセイが検証試料のセットに対して類似の結果を与えるかどうかを検証することによって行うことができる。献身的なアッセイの次に、これは、ｍＲＮＡ配列決定データを入力測定値として使用する類似のベイジアンネットワークモデルを組み立てる及び較正するために行うこともできる。

【実施例11】

【0137】

経路の研究及び癌病態生理学の研究
以下において、どのようにしてベイジアンネットワークモデルを、（臨床的な）経路の研究、すなわち、どの経路が特定の疾患に関与するかを見つけることに関心がある研究において利用することができるが例示され、これは、さらなる詳しい研究に対して進めて、例えばシグナルタンパク質における変異を（モデルを用いて測定された）経路の活性化における変化に結びつけることができる。これは、特定の癌の始まり、増殖、並びに、進化及び転移（病態生理学）を調査することに関連している。

【0138】

本明細書において記載される図６に類似の、転写因子の存在に対するノード、標的遺伝子のｍＲＮＡレベル（表１、表２、表３及び表４）を表すノードの層、並びに、標的遺伝子（表１、表２、表３及び表４）に対応するプローブセットの強度を表すノードの層を使用して構築し、且つ、本明細書において記載されるように訓練したＷｎｔ、ＥＲ、ヘッジホッグ及びＡｒ経路のベイジアンネットワークモデルを使用して、乳癌試料から成るデータセット（ＧＳＥ１２２７６）の経路の活性を予測した。

【0139】

研究者は、１つ又は複数の細胞シグナル経路、及び、制御されない細胞増殖を駆り立てる１つ又は複数の特異的調節解除を調べることに関心があると想定する。研究者は、上述の確率モデル、特にベイジアンネットワークモデルを使用してマイクロアレイデータを解析し、どの経路がおそらく制御されない細胞増殖の原因であるかを見つけることができる。図３３及び図３４において示され、Ｗｎｔ、ＥＲ及びヘッジホッグの活性のケースに対するそのような解析の例示を見ることができる（ＧＳＥ１２２７６データセットの基底及びルミナールＡ試料）。後に、研究者はより詳細に調査して、経路の調節解除の正確な原因を見つけることができる。

【0140】

図３４を参考にして、基底試料は、３つの負の受容体の状態（ＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ２）を有するとして既知であり、従って、全試料が不活性のＥＲ経路を有すると予測されることを見ることは驚くべきことではない。もう一方で、試料の一部は、図３４において示されるように、Ｗｎｔ若しくはヘッジホッグの活性、又は、両方の活性を有すると予測される。これらの予測した経路の活性は研究者を説得して、例えばＷｎｔ及び／又はヘッジホッグ経路における既知の変異又は他の既知の調節解除に対して等、これらの試料をより詳細に調査させる。

【0141】

別の例が図３３において与えられており、ＧＳＥ１２２７６データセットのルミナールＡ試料におけるＷｎｔ、ＥＲ及びヘッジホッグの活性が例示されている。ルミナールＡ試料はＥＲを発現するとして知られているが、これは、癌特性が活性のＥＲシグナル伝達によるものであるとは必ずしも意味していない。予測した経路の活性から、試料の半分未満が活性のＥＲシグナル伝達を有すると推量することができる。しかし、活性のＥＲシグナル伝達を有さない試料の一部が、活性のＷｎｔ及び／又はヘッジホッグ経路を有するとわかる。これは、それぞれＷｎｔ及び／又はヘッジホッグシグナル経路における欠陥に対して、研究者により徹底的にこれらの試料を調査させるもとであり得る。試料の一部は、含まれた３つの経路のいずれも活性であるとは予測せず、おそらく、他の経路が制御されない細胞増殖を引き起こしている。これもまた、研究者に他の経路における欠陥を調査するためのさらなる情報を与えている。

【0142】

要約すれば、本明細書において記載される例示は、（上記の）訓練したベイジアンネットワークモデルの、より管理された方法で、制御されない細胞増殖の原因を見つけることのプロセスを支援する能力を表している。ベイジアンネットワークを利用して、経路の活性に対して試料を選別することによって、予測した経路の活性は、細胞増殖に対して可能性のある経路を正確に指摘することができ、これは、さらなる詳しい研究に対して進めて、例えばシグナルタンパク質における変異又は他の既知の調節解除を（モデルを用いて測定された）活性化における変化に結びつけることができる。

【0143】

本明細書において記載されるように、細胞シグナル経路のベイジアンネットワークを開発及び訓練するためのプロセスを使用して、本発明と提携して利用することもできる他の経路に対するベイジアンネットワークモデルを構築することができる。

【実施例12】

【0144】

予測した活性に基づく臨床試験における被験者の登録
候補の薬物が、例えば、腫瘍の増殖を駆り立てる特定の経路の活性を遮断するために開発され、さらに、この薬物が、臨床試験に入る場合、従って、そのような試験に登録する被験者の適切な選択が、薬物の潜在的な有効性を提供するためには必要である。そのような場合、その腫瘍において活性化されたそれぞれの経路を有さない患者は、そもそも経路が活性化されていない場合に薬物が効果的ではないということは明らかなため、試験から排除されるべきである。従って、経路の活性を予測することができる経路モデルを選択ツールとして使用して、活性化されたそれぞれの経路を有すると予測される患者のみを選択することができる。

【実施例13】

【0145】

行われることになる後の１つ又は複数のテストの選択
異なる経路モデルを使用して腫瘍が解析され、さらに、モデルが特定の経路の調節解除を予測する場合、従って、これは、行われることになる後のテストの選択を導くことができる。例えば、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を実施して、それぞれの転写複合体の存在を確かめてもよい（Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ Ｏ、２００６）。そのようなＰＬＡは、ＴＦ複合体における２つの鍵となるタンパク質、例えば、Ｗｎｔ経路のＴＦ複合体におけるベータカテニンとＴＣＦ４が実際に共に結合した場合に、肯定的な結果を与えるように設計することができる。

【0146】

別の例は、調節解除されていると予測した経路が、シグナルカスケードに関してより詳細に解析されることである。例えば、この経路における鍵となるタンパク質を解析して、そのそれぞれの遺伝子をコード化するＤＮＡ領域において変異があるかどうかを決定してもよく、又は、これらのタンパク質の存在量に対してテストし、正常値よりも高いか若しくは低いかどうかを見てもよい。そのようなテストは、どのような根本的原因が、経路の調節解除の原因となっているのかを表し、さらに、どの利用可能な薬物を使用して経路の活性を減らすことができたかを洞察することができる。

【0147】

これらのテストは、ベイジアンモデルを使用して同定される経路の活性を確かめるために選択される。しかし、コンパニオン診断テストの選択も可能である。モデルを使用した経路の同定後、標的療法の選択に対して、同定した経路に適用可能であるコンパニオン診断テストのみが行われることが必要とされる（選択）。

【実施例14】

【0148】

コンパニオン診断テストの選択
先の実施例と同様に、腫瘍が解析され、さらに、経路モデルが特定の経路の調節解除を予測し、さらに任意選択で、多くのさらなるテストが調節解除の原因を調査するために行われた場合、従って、腫瘍学者は、多くの候補の薬物を選択して患者を治療してもよい。しかし、そのような薬物を用いた治療は、例えば臨床ガイドラインを満たすか、若しくは、治療費の払い戻しを保証するために、第一に実行されることになるコンパニオン診断テストを必要とし得るか、又は、規制（ＦＤＡ）のため、薬物の投与に先立ちコンパニオン診断テストを行うことが必要とされる。そのようなコンパニオン診断テストの例は、薬物ハーセプチン（トラスツズマブ）を用いた乳癌患者の治療に対するＨｅｒ２テストである。従って、経路モデルの成果を使用して、候補の薬物、及び、行われることになるそれぞれのコンパニオン診断テストを選択することができる。

【実施例15】

【0149】

ＣＤＳ適用
（本明細書において開示される（Ｗｎｔ経路に対して例証的に示された）１つ又は複数の細胞シグナル経路を評価するために構成された臨床判断支援（ＣＤＳ）システムを概略的に示す）図２０を参考にして、臨床判断支援（ＣＤＳ）システム１０が、適切に構成されたコンピュータ１２として実施される。コンピュータ１２は、ハードドライブ若しくは他の磁気記憶媒体、光ディスク若しくは他の光学記憶媒体、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、フラッシュメモリ、若しくは他の電子記憶媒体、又は、ネットワークサーバー等、非一過性の記憶媒体（図示せず）上に記憶された適したソフトウェア、ファームウェア、又は他の支持を実行することによって、ＣＤＳシステム１０として作動するように構成されてもよい。例示的なＣＤＳシステム１０が例示的なコンピュータ１２によって具体化されるけれども、より一般的には、ＣＤＳシステムは、本明細書において定められる臨床判断支援方法を行うように構成されたデジタル処理装置又はデジタルプロセッサを含む器具によって具体化されてもよい。例えば、デジタル処理装置は、（例えば、携帯情報端末、又は、ＣＤＳアプリケーションを動かすスマートフォン等）ハンドヘルドの装置、ノートブックコンピュータ、デスクトップコンピュータ、タブレットコンピュータ若しくは装置、又は、遠隔ネットワークサーバー等であってもよい。コンピュータ１２又は他のデジタル処理装置は、典型的に、ディスプレイ装置１４を含むか、又は、該装置と動作可能に接続され、ディスプレイ装置１４を介して、臨床判断支援の勧告を含む情報が、医療職員に表示される。コンピュータ１２又は他のデジタル処理装置は、典型的に、例示的なキーボード１６、又は、マウス、トラックボール、トラックパッド、（おそらくディスプレイ装置１４と統合される）タッチスクリーン、若しくは、他のポインターに基づくユーザ入力装置等の１つ若しくは複数のユーザ入力装置も含むか、又は、該装置と動作可能に接続され、ユーザ入力装置を介して、医療職員は、ＣＤＳシステム１０、又は、ＣＤＳシステム１０による使用のためのデータ等を制御するためにオペレーションコマンド等の情報を入力することができる。

【0150】

ＣＤＳシステム１０は、（例えば、腫瘍学者、医師、若しくは他の医療職員によって治療されている病院患者又は外来患者、或いは、結腸癌、乳癌、若しくは肝癌等の特定タイプの癌を有するとして知られるか若しくは疑われる癌検診又はいくつか他の医療診断を受ける人等）医療対象者に関連する入力情報として受ける。ＣＤＳシステム１０は、種々のデータ解析アルゴリズムをこの入力情報に適用して、ディスプレイ装置１４を介して（又は、音声合成装置、若しくは、体感可能出力を提供する他の装置を介して）医療職員に与えられる臨床判断支援の勧告を生じる。いくつかの実施形態において、これらのアルゴリズムは、臨床ガイドラインを患者に適用することを含んでもよい。臨床ガイドラインは、典型的には医療専門家のパネルの勧告に基づき構築され、さらに任意選択で、臨床ガイドラインを介して導くことを促進するために臨床的な「フローチャート」の形状でフォーマットされた標準的又は「基準」の治療勧告の記憶されたセットである。種々の実施形態において、本明細書において記載される機械学習法等のＣＤＳ１０のデータ処理アルゴリズムは、さらに、又或いは、臨床判断支援を導き出すために入力情報に対して行われる種々の診断若しくは臨床試験のアルゴリズムを含んでもよい。

【0151】

本明細書において開示される例示的なＣＤＳシステム（例えばＣＤＳシステム１０）において、ＣＤＳデータ解析アルゴリズムは、１つ又は複数の医療研究所１８によって取得された入力するゲノム及び／又はプロテオミクスの情報に対して行われる１つ又は複数の診断若しくは臨床試験アルゴリズムを含む。これらの研究所は、「オン・サイト」でさまざまに位置していてもよく、すなわち、病院、又は、医療対象者が医療検査及び／若しくは治療を受ける他の場所にて位置していてもよいか、或いは、例えば、医療対象者から抽出された医療対象者の組織の試料（例えば、生検手順若しくは他の試料抽出手順を介して、乳房の病変部から、又は、結腸癌を有するとして知られる若しくは疑われる医療対象者の結腸から、又は、肝癌を有するとして知られる若しくは疑われる医療対象者の肝臓から得られた試料等）を（郵便若しくは別の送付サービスを介して）受ける特定化及び集中化した研究所等、「オフ・サイト」でさまざまに位置していてもよい。試料が抽出される組織はまた、例えば結腸、乳房、肝臓、又は、結腸、乳房、肝臓若しくは他の臓器の外側で広がる他の臓器から生じる（疑われる）悪性の組織等、転移性組織であってもよい。いくつかのケースにおいて、組織試料は、循環性腫瘍細胞、すなわち、血流に入った腫瘍細胞であってもよく、さらに、適した単離技術を使用して抽出される組織試料として抽出されてもよい。抽出された試料は、研究所によって処理され、ゲノム又はプロテオミクスの情報を生じる。例えば、抽出された試料は、（遺伝子チップ、ＤＮＡチップ、若しくはバイオチップ等としても当分野においてさまざまに呼ばれる）マイクロアレイを使用して、又は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）処理によって処理して、例えば、遺伝子から転写されるメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）のレベル、又は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質のレベルの形状で、関心のある遺伝子の発現レベル等の証拠となるゲノム又はプロテオミクスの情報を測定してもよい。別の例として、抽出された試料は、遺伝子配列決定の研究所によって処理して、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に対する配列を生じるか、又は、ＲＮＡ配列若しくはコピー数多型等を生じてもよい。他の熟考される測定アプローチは、病理学スライド上で行われる、免疫組織化学（ＩＨＣ）、細胞学、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、又は、近接ライゲーションアッセイ等を含む。マイクロアレイ処理、質量分析、遺伝子配列決定、又は、他の研究技術によって生じることができる他の情報は、メチル化情報を含む。そのようなゲノム及び／又はプロテオミクスの測定の種々の組み合わせもまた行ってもよい。

【0152】

一部の実施形態において、医療研究所１８は、多量なゲノム及び／又はプロテオミクスのデータを生じるように、抽出された医療対象者の組織の試料に対して多くの標準化されたデータ取得を行う。例えば、標準化されたデータ取得技術は、１つ又は複数の染色体若しくは染色体の一部分に対する、又は、組織のゲノム全体に対する（任意選択で整列させた）ＤＮＡ配列を生じてもよい。標準的なマイクロアレイを適用することによって、多数の遺伝子に対する発現レベル及び種々のメチル化データ等、何千又は何万ものデータアイテムを生じることができる。このゲノム及び／又はプロテオミクスのデータ若しくはその選択された部分の過多は、臨床判断支援の勧告を考案するために臨床的に有用な情報を引き出すように、ＣＤＳシステム１０に入力されて処理される。

【0153】

開示されるＣＤＳシステム及び関連する方法は、種々の細胞シグナル経路の活性を評価するためのゲノム及び／又はプロテオミクスのデータの処理に関する。しかし、開示されるＣＤＳシステム（例えばＣＤＳシステム１０等）は、任意選択で、バイタルサイン監視データ、患者の病歴データ、（例えば性別若しくは年齢等の）患者の人口統計学的データ、又は、患者の医用画像データ等、種々の患者データに基づく記憶された臨床ガイドラインに従って臨床判断支援の勧告を生じる等、多様なさらなる能力をさらに含んでもよいことを理解されたい。或いは、一部の実施形態において、ＣＤＳシステム１０の能力は、ゲノム及び／又はプロテオミクスのデータ解析を行って、本明細書において開示される細胞シグナル経路を評価することのみに限定されてもよい。

【0154】

例証的な図２０を続けて参考にして、ＣＤＳシステム１０は、抽出された試料において測定される細胞シグナル経路の標的遺伝子の発現レベルに、それに限定されないが、少なくとも部分的に基づき、医療対象者の組織における細胞シグナル経路の活性を推量し、さらに、この推量した活性に基づき、細胞シグナル経路が医療対象者の組織において異常に機能しているかどうかを決定する。本明細書において開示される例は、例示的な細胞シグナル経路としてＷｎｔ、ＥＲ、ＡＲ及びヘッジホッグ経路に関する。これらの経路は、経路の調節の損失が癌の増殖の原因であり得るため、腫瘍学の種々の領域において関心のあるものである。約１０から１５の関連するシグナル経路があり、さらに、各癌は、原則的に、調節解除されている１つの支配的な経路によって駆り立てられる。いかなる特定の機能の原理に限定されることなく、これらの経路は細胞増殖を調節し、結果として、癌細胞におけるこれらの経路の調節の損失は、「常にオン」である経路をもたらし、従って癌細胞の増殖を速め、次に、癌の増殖、侵入、又は転移（広がり）として現れ得る。

【0155】

細胞シグナル経路を形成するタンパク質カスケードの一部である中間タンパク質等の細胞シグナル経路の調節タンパク質をコード化する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの測定は、調節タンパク質発現レベルの間接測定であり、さらに、（細胞シグナル経路の全活性とははるかに少なく）実際の調節タンパク質発現レベルとの強い相互関係を示してもよく、又は、示さなくてもよい。細胞シグナル経路は、標的遺伝子の転写を直接調節し、従って、標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡの発現レベルは、この調節活性の直接的な結果である。従って、ＣＤＳシステム１０は、細胞シグナル経路の標的遺伝子の発現レベル（代替の測定としてｍＲＮＡ又はタンパク質レベル）に少なくとも基づき（例えばＷｎｔ、ＥＲ、ＡＲ及びヘッジホッグ経路等の）細胞シグナル経路の活性を推量する。これは、ＣＤＳシステム１０が、測定された標的遺伝子の発現レベルによって提供される直接的な情報に基づき経路の活性を推量するということを保証する。

【0156】

しかし、本明細書において開示されるように、全経路の活性を評価するのに効果的であるけれども、測定された経路の標的遺伝子の発現レベル２０は、（実際にそうである場合に）なぜ経路は異常に機能しているのかに関しては特に情報価値のあるものではない。前記別の方法で、測定された経路の標的遺伝子の発現レベル２０は、経路が異常に機能していることを表すことができるが、（例えば、十分な調節を欠く等）経路のどの部分が機能不全であって、全経路に異常に機能させるかは表さない。

【0157】

従って、ＣＤＳシステム１０が特定の経路の異常な活性を検出する場合、ＣＤＳシステム１０は、従って、任意選択で、整列した遺伝子配列２２、及び／又は、経路の１つ又は複数の調節遺伝子に対する測定された１つ又は複数の発現レベル２４等、抽出された試料に対して医療研究所１８によって提供される他の情報を使用するか、或いは、経路のどの部分が機能不全であるかを評価するために次に行われることになる診断テストを選択する。効率を最大にするために、一部の実施形態において、この任意選択の、なぜ経路が機能不全であるかという評価が、測定された経路の標的遺伝子の発現レベル２０の解析が、経路が異常に機能していると表す場合にのみ行われる。他の実施形態において、この評価は、本明細書において記載される細胞シグナル経路の確率の解析に統合される。

【0158】

経路のどの部分が機能不全であるかをＣＤＳシステム１０が評価し、さらに、それが成功している実施形態において、さらなる情報が、特定の機能不全を標的にする薬物を処方するのをＣＤＳシステム１０が勧めるのを可能にする（図２０において示された勧告２６）。特定の経路機能不全が、（任意選択のさらなる評価が行われていないため、又は、評価が、機能不全している経路のいかなる特定の部分の同定も失敗するために）同定されない場合、従って、ＣＤＳシステム１０は、（異常な経路の活性が過度に高い活性であることを仮定して）この特定の経路に対する一般的な抑制薬物の処方を勧めるデフォルトの勧告２８を提供することができる。

【実施例16】

【0159】

経路の活性を測定するキット及び解析ツール
ベイジアンモデルを使用したマイクロアレイ／ＲＮＡ配列決定ベースの調査に基づき特定の経路の活性を最も表すとわかった標的遺伝子のセットは、組織又は細胞の試料に対して行われることになる多重定量的ＰＣＲアッセイに移すことができる。そのようなＦＤＡＳにより承認されたテストを、経路の活性に対して開発するために、臨床試験において臨床的に検証して規制の許可を得る必要がある標準化されたテストキットの開発が必要とされる。

【0160】

一般に、Ｗｎｔ、ＥＲ、ＡＲ及び／又はヘッジホッグ経路に付随する例が例示的な例として提供されるけれども、本明細書において開示される細胞シグナル経路の解析に対するアプローチが、細胞膜における受容体を用いた細胞内シグナル経路（上記参照）、及び、細胞内部の受容体を用いた細胞内シグナル経路（上記参照）に対して等、これらの経路以外の他の細胞シグナル経路に容易に適用されるということを理解されたい。加えて、本願は、いくつか好ましい実施形態を記載している。修正及び変更が、上述の詳細な説明を読み且つ理解した後で他のものに対して生じてもよい。本願は全てのそのような修正及び変更を、付随の特許請求の範囲又はその同等物にある限りにおいて、含むとして解釈されることが意図される。

【0161】

参考文献
de Sousa E Melo F, C. S. (2011). Methylation of cancer-stem-cell-associated Wnt target genes predicts poor prognosis in colorectal cancer patients. Cell Stem Cell, 476-485
Hatzis P, v. d. (2008). Genome-wide pattern of TCF7L2/TCF4 chromatin occupancy in colorectal cancer cells. Mol Cell Biol, 2732-2744
Neapolitan, R. (2004). Learning Bayesian networks. Pearson Prentice Hall
Nusse, R. (2012, May 1). Wnt target genes. Retrieved from The Wnt homepage: http://www.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/target_genes
Soderberg O, G. M. (2006). Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods., 995-1000
van de Wetering M, S. E.-P.-F. (2002). The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell, 241-250.

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14-I】

【図14-II】

【図15-I】

【図15-II】

【図16-I】

【図16-II】

【図17-I】

【図17-II】

【図18-I】

【図18-II】

【図19-I】

【図19-II】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]