特許 6784507 がん診断装置、がん診断方法、及びプログラム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6784507

(24)【登録日】2020年10月27日

(45)【発行日】2020年11月11日

(54)【発明の名称】がん診断装置、がん診断方法、及びプログラム

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/48 20060101AFI20201102BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20201102BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20201102BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20201102BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/48 M

   G01N33/483 C

   C12Q1/02

   C12M1/34 B

【請求項の数】7

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2016-87586(P2016-87586)

(22)【出願日】2016年4月26日

(65)【公開番号】特開2017-198486(P2017-198486A)

(43)【公開日】2017年11月2日

【審査請求日】2019年2月5日

(73)【特許権者】

【識別番号】000230962

【氏名又は名称】日本光電工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100170911

【弁理士】

【氏名又は名称】松山 啓太

(72)【発明者】

【氏名】塩山 高広

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 あかね

(72)【発明者】

【氏名】天野 芳隆

【審査官】 草川 貴史

(56)【参考文献】

【文献】 特表平１０−５０８６９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−０４７５９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１４−００１９４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０５２３５５２２（ＵＳ，Ａ）

【文献】 Bo Baldetorp, Olle Stal, et al.，Different calculation methods for flow cytometric S-phase fraction: Prognostic Implications in Breast Cancer?，Cytometry，米国，１９９８年，vol. 33: 385-393

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象生体組織から生成した懸濁液の蛍光強度の測定結果を用いて、蛍光強度と細胞数の関係を示すヒストグラムを生成するヒストグラム生成部と、
前記ヒストグラムを解析して前記対象生体組織のがん診断を行う判定部と、を備え、
前記判定部は、
前記ヒストグラムのＧ０／Ｇ１期細胞に相当する細胞数ピークの立下り付近の蛍光強度を始点とし、前記ヒストグラムの細胞数ピークに対応する蛍光強度の約２倍のＧ２／Ｍ期細胞に相当する蛍光強度を終点とするＳ期蛍光強度範囲を検出し、
前記Ｓ期蛍光強度範囲内の細胞数のピークまたは細胞数変化の傾き傾向を基にＤＮＡ異数性が生じている腫瘍細胞に対応する異常蛍光強度範囲を検出し、
前記Ｓ期蛍光強度範囲から前記異常蛍光強度範囲を除外した範囲の細胞数の代表値または当該範囲の合計値に基づいて、蛍光強度の全体範囲に対する前記Ｓ期蛍光強度範囲の細胞比率を算出し、当該細胞比率と所定閾値の比較に基づいて前記対象生体組織のがんの種別又は悪性度の判定を行う、がん診断装置。

【請求項2】

前記判定部は、前記Ｓ期蛍光強度範囲から前記異常蛍光強度範囲を除外した範囲の細胞数の代表値と、前記ヒストグラムのピーク値と、を比較して前記細胞比率を算出する、ことを特徴とする請求項１に記載のがん診断装置。

【請求項3】

前記代表値は、平均値、または最頻値、または中央値である、ことを特徴とする請求項２に記載のがん診断装置。

【請求項4】

前記判定部は、前記Ｓ期蛍光強度範囲から前記異常蛍光強度範囲を除外した範囲の曲線下面積と、前記ヒストグラムの曲線下面積と、を比較して前記細胞比率を算出する、ことを特徴とする請求項１に記載のがん診断装置。

【請求項5】

前記判定部は、前記Ｓ期蛍光強度範囲から前記異常蛍光強度範囲を除外した範囲の曲線下面積と、前記ヒストグラムの全範囲からデブリに相当する範囲を除外した範囲の曲線下面積と、を比較して前記細胞比率を算出する、ことを特徴とする請求項１に記載のがん診断装置。

【請求項6】

対象生体組織から生成した懸濁液の蛍光強度の測定結果を用いて、蛍光強度と細胞数の関係を示すヒストグラムを生成するヒストグラム生成ステップと、
前記ヒストグラムを解析して前記対象生体組織のがん診断を行う判定ステップと、を備え、
前記判定ステップでは、
前記ヒストグラムのＧ０／Ｇ１期細胞に相当する細胞数ピークの立下り付近の蛍光強度を始点とし、前記ヒストグラムの細胞数ピークに対応する蛍光強度の約２倍のＧ２／Ｍ期細胞に相当する蛍光強度を終点とするＳ期蛍光強度範囲を検出し、
前記Ｓ期蛍光強度範囲内の細胞数のピークまたは細胞数変化の傾き傾向を基にＤＮＡ異数性が生じている腫瘍細胞に対応する異常蛍光強度範囲を検出し、
前記Ｓ期蛍光強度範囲から前記異常蛍光強度範囲を除外した範囲の細胞数の代表値または当該範囲の合計値に基づいて、蛍光強度の全体範囲に対する前記Ｓ期蛍光強度範囲の細胞比率を算出し、当該細胞比率と所定閾値の比較に基づいて前記対象生体組織のがんの種別又は悪性度の判定を行う、がん診断方法。

【請求項7】

コンピュータに、
対象生体組織から生成した懸濁液の蛍光強度の測定結果を用いて、蛍光強度と細胞数の関係を示すヒストグラムを生成するヒストグラム生成ステップと、
前記ヒストグラムを解析して前記対象生体組織のがん種別の判定を行う判定ステップと、を実行させ、
前記判定ステップでは、
前記ヒストグラムのＧ０／Ｇ１期細胞に相当する細胞数ピークの立下り付近の蛍光強度を始点とし、前記ヒストグラムの細胞数ピークに対応する蛍光強度の約２倍のＧ２／Ｍ期細胞に相当する蛍光強度を終点とするＳ期蛍光強度範囲を検出し、
前記Ｓ期蛍光強度範囲内の細胞数のピークまたは細胞数変化の傾き傾向を基にＤＮＡ異数性が生じている腫瘍細胞に対応する異常蛍光強度範囲を検出し、
前記Ｓ期蛍光強度範囲から前記異常蛍光強度範囲を除外した範囲の細胞数の代表値または当該範囲の合計値に基づいて、蛍光強度の全体範囲に対する前記Ｓ期蛍光強度範囲の細胞比率を算出し、当該細胞比率と所定閾値の比較に基づいて前記対象生体組織のがんの種別又は悪性度の判定を行う、プログラム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はがん診断装置、がん診断方法、及びプログラムに関する。

【背景技術】

【0002】

近年、被験者の細胞を自動的に分析し、当該細胞のがん化に関する情報を提供する分析装置が開発されている。例えば特許文献１は、被験者から採取した細胞を含む測定資料をフローセルに流し、フローセルに光を照射して取得した散乱光を基にがん・異形細胞を弁別する装置を開示している。

【0003】

また特許文献２は、ＤＮＡ量に加えてＮ／Ｃ比（細胞の大きさ（Ｃ）に対する細胞核の大きさ（Ｎ））を基にがんの進行レベルを検出する情報提供方法を開示している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開第２００６／１０３９２０号

【特許文献2】特開２０１３−２１３６９０号公報

【特許文献3】特開２０１４−２３４３９号公報

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】加治正英ほか、“胃癌，大腸癌における腫瘍増殖率の推測および腫瘍マーカーダブリングタイムの比較検討”、日消外会誌(10):2493-2497, 1991

【非特許文献2】森脇義弘ほか、“残胃癌の悪性度に関する臨床的検討”、日消外会誌26(9):2280-2286, 1993

【非特許文献3】米村豊、宮崎逸夫、“ＤＮＡｐｌｏｉｄｙ＊増殖活性分析による癌の予後判定の有用性と今後の展望”、胃のあゆみ 149:31-34, 1989

【非特許文献4】米村豊、宮崎逸夫ほか、“ＤＮＡｐｌｏｉｄｙ ｐａｔｔｅｒｎ，増殖活性からみた胃癌の悪性度”、日外会誌89:1175-1179, 1987

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

細胞は、一定のサイクル（細胞周期）に従ってＤＮＡ複製、染色体の分配、核分散、細胞質分散などの事象を経て２つの細胞となって出発点に戻る。細胞周期はその段階に応じて、Ｇ１期（Ｓ期に入るための準備と点検の時期）、Ｓ期（ＤＮＡ合成期）、Ｇ２期（Ｍ期に入るための準備と点検の時期）、Ｍ期（分裂期）の４期に分けることができる。なお細胞周期は、この４期に加え、細胞増殖が休止しているＧ０期（休止期）を加えた５期に分けることもできる。各細胞は、５期のうちのいずれかのステージにある。

【0007】

細胞周期に従って細胞が増殖する際、細胞内の核の染色体も増加する。そのため、細胞のＤＮＡ量を測定することにより、当該細胞が細胞周期のどの段階にあるかを推定できる。正常な生体組織についてＤＮＡ量と細胞数のヒストグラムを作成した場合、最も高いピークはＤＮＡ量が最も少ないＧ０／Ｇ１期に対応することが一般的である。また正常な生体組織において次に高いピークは、ＤＮＡ量が最も多いＧ２／Ｍ２期に対応することが一般的である。

【0008】

一方、ＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ（ＤＮＡ異数性）が生じている細胞（すなわちがん化している可能性が高い細胞）は、染色体数が多いためにＤＮＡ量も多くなる。これによりがん化細胞を含む生体組織についてヒストグラムを作成した場合、正常組織とは異なるピークが生じる。分析装置は、このＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙに相当するピークを検出することにより、がん化の状態を検出する。

【0009】

しかしながら、ＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ（ＤＮＡ異数性）の影響によってＳ期にある細胞数（割合）が正確に把握できず、詳細ながんの情報を把握できないケースがあった。

【0010】

本発明は上記の課題に鑑みてなされたものであり、ＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ（ＤＮＡ異数性）が生じている細胞がある場合であっても詳細ながんの種別を把握できるがん診断装置、がん診断方法、及びプログラムを提供することを主たる目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明にかかるがん診断装置の一態様は、
対象生体組織から生成した懸濁液の蛍光強度の測定結果を用いて、蛍光強度と細胞数の関係を示すヒストグラムを生成するヒストグラム生成部と、
前記ヒストグラムを解析して前記対象生体組織のがん種別の判定を行う判定部と、を備え、
前記判定部は、
前記ヒストグラムの細胞数のピークに対応する蛍光強度に基づいてＳ期細胞に対応するＳ期蛍光強度範囲を検出し、
前記Ｓ期蛍光強度範囲の細胞数の変化を基に、ＤＮＡ異数性が生じている腫瘍細胞に対応する異常蛍光強度範囲を検出し、
前記Ｓ期蛍光強度範囲から前記異常蛍光強度範囲を除外した範囲の細胞数の指標に基づいて前記対象生体組織のがん診断を行う、ものである。

【0012】

判定部は、ＤＮＡヒストグラムからＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙに相当する範囲を除外したＳ期細胞の範囲の細胞数の指標を検出している。判定部は、この範囲の細胞数指標を用いてがんの診断を行う。判定部は、ＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙの影響を除外することによって正確にがんの診断をすることができる。

【発明の効果】

【0013】

本発明は、ＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ（ＤＮＡ異数性）が生じている細胞がある場合であっても詳細ながん診断を行うことができるがん診断装置、がん診断方法、及びプログラムを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】実施の形態１にかかるがん診断装置１の外観図である。

【図2】実施の形態１にかかる細胞単離装置２の分解外観図である。

【図3】実施の形態１にかかるがん診断装置１の機能ブロック図である。

【図4】実施の形態１にかかるＤＮＡヒストグラムの一例を示す図である。

【図5】実施の形態１にかかるＤＮＡヒストグラムの一例を示す拡大図である。

【図6】実施の形態１にかかるがん診断装置１の処理の流れを示すフローチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0015】

＜実施の形態１＞
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。図１は、本実施の形態にかかるがん診断装置１の外観例を示す斜視図である。なお図１に示すがん診断装置１の外観はあくまでも一例であり、この他の形状であっても勿論構わない。がん診断装置１は、フローサイトメトリ（Flow Cytometry）に用いられる装置である。フローサイトメトリとは、微細な粒子を流体中に分散させ、その液体（懸濁液）を流して個々の粒子を光学的に分析する手法である。がん診断装置１は、がん診断の対象となる生体組織（以下、対象生体組織とも呼称する。）の細胞核染色された細胞数を計測し、その計測結果を用いて細胞数と蛍光強度（ＤＮＡ量）の関係を示すＤＮＡヒストグラムを生成する。がん診断装置１は、ＤＮＡヒストグラムを用いたがん解析を行う。

【0016】

がん診断装置１の細胞前処理部１２にはノズル１１が設けられている。このノズル１１に細胞単離装置２を接続して懸濁液を生成する。図２は細胞単離装置２の分解外観図である。細胞単離装置２は、ピペット部材２０と容器２４を備える。ピペット部材２０は、本体２１、フィルタ２２、及び蓋体２３を有する。

【0017】

界面活性剤、ＲＮＡ（リボ核酸）除去剤、及び蛍光染料色素を含む試薬２５が、乾燥あるいは凍結乾燥された状態で容器２４に収容される。解析対象となる生体組織及び細胞処理液を容器２４内に投入すると、試薬２５が細胞処理液中に溶解する。

【0018】

細胞単離装置２は、後述する撹拌による細胞単離処理と並行して、界面活性剤による組織細胞の裸核化、ＲＮＡ除去剤によるＲＮＡ除去、及び蛍光染料色素による裸核化されたＤＮＡ細胞核の染色を遂行できる。これによりがん診断装置１内部に回収された後に、フローサイトメトリによる測定が可能な状態となる。

【0019】

生体組織及び細胞処理液（試薬２５を含む）を収容した容器２４にピペット部材２０が装着される。本体２１の先端は、容器２４の中心軸上に配置され、容器２４の底と一定間隔を置いて対向する。本体２１と容器２４の底との間には、投入された生体組織が位置する。本体２１の先端部は、投入された細胞処理液に浸かった状態となる。

【0020】

再び図１を参照する。細胞単離装置２の上端部（蓋体２３）をノズル１１に差し込むようにして接続する。ノズル１１の通路と蓋体２３内の通路とが、適宜の係合構造を介して連通する。細胞前処理部１２は、以下のような手順で細胞単離処理を実行する。

【0021】

細胞前処理部１２は、ノズル１１に接続されたポンプ機構（図示省略）を備えている。細胞前処理部１２は、ユーザによって設定された撹拌条件（撹拌強さ、繰り返し回数、継続時間等）に基づいてポンプ機構を制御し、加圧状態と減圧状態を形成する。加圧状態においてはノズル１１から空気が吹き出し、減圧状態においてはノズル１１から空気が吸入される。

【0022】

加圧と減圧を繰り返すピペッティング処理により、ノズル１１に接続されたピペット部材２０を通じて容器２４内の生体組織及び組織処理液（試薬２５を含む）を撹拌する。一定時間の撹拌処理を行うことにより、生体組織は次第に細かく粉砕され、ミンスされた状態となる。これにより単離された細胞を含む懸濁液を得ることができる。この処理において、細胞の核が壊され、その中の染色体が蛍光に反応させるように色付けされる。

【0023】

その後に細胞前処理部１２は、ピペット部材２０の通路を介して懸濁液を吸引する。懸濁液はフィルタ２２を通過することによって濾過される。これにより不純物が取り除かれた懸濁液（細胞浮遊液）ががん診断装置１の内部に取り込まれる。

【0024】

なお上述の細胞前処理部１２による細胞単離処理は、ピペッティング以外の手法で細胞を単離しても構わない。また予め手技等により懸濁液を生成しておき、がん診断装置１が当該懸濁液を取り込むようにしても構わない。

【0025】

続いて図３を参照してがん診断装置１内部での処理について説明する。図３は、がん診断装置１の機能ブロック図である。がん診断装置１は、前述の細胞前処理部１２に加え、光学処理部１３、ヒストグラム生成部１４、判定部１５、及び出力部１６を有する。

【0026】

光学処理部１３は、懸濁液を流路に流し、当該流路にレーザー光を照射する。光学処理部１３は、懸濁液からの光（例えば前方散乱光、後方散乱光、側方蛍光）の強度を検出する。

【0027】

ヒストグラム生成部１４は、光学処理部１３の蛍光強度の測定結果を取得する。染色体はＤＮＡからできている。また染色色素は二本鎖ＤＮＡにインターカレートするため、蛍光強度を測定することによってＤＮＡ量が測定できる。すなわち蛍光強度の測定結果は、各細胞のＤＮＡ量を示すデータとなる。ヒストグラム生成部１４は、各細胞のＤＮＡ量を基に、ＤＮＡ量（蛍光強度）と細胞数の関係を示すＤＮＡヒストグラムを生成する。なおヒストグラム生成部１４は、ヒストグラムを作る前に任意の前処理（平坦化等）を行ってもよい。

【0028】

図４は、ヒストグラム生成部１４が生成するＤＮＡヒストグラムの一例を示す図である。図４においてＡの領域は、デブリ（Debris）、すなわち破壊された細胞（ゴミ）もしくは間質組織に染色体が付着したものが現れる領域である。この領域のＤＮＡ量は、正常なＧ０／Ｇ１期細胞のＤＮＡ量よりも少ない。

【0029】

またＢの領域は、Ｇ０／Ｇ１期細胞群、すなわち正常ＤＮＡ量の細胞が現れる領域である。

【0030】

Ｃの領域は、Ｓ期細胞群が現れる領域である。Ｓ期細胞群のうち、細胞のＤＮＡ合成を開始したばかりの細胞のＤＮＡ量は、正常なＧ０／Ｇ１期細胞のＤＮＡ量よりもわずかに多い。このＤＮＡ量は、Ｇ２期レベル（Ｇ２期は後述するＥ領域）になるまで増加し続ける。

【0031】

Ｄの領域は、ＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ（ＤＮＡ異数性）の細胞群が現れる領域である。この領域の細胞のＤＮＡ量は、異数対（正常ＤＮＡ量の整数倍ではない）に分布を示す。腫瘍の組織において検出されることが多く、その出現場所は様々である。なお腫瘍が存在しない組織においてはＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙは検出されない。

【0032】

Ｅの領域は、Ｇ２／Ｍ期細胞群が現れる領域である。Ｇ２期細胞のＤＮＡ量は、正常なＧ０／Ｇ１期細胞の２倍のＤＮＡ量を含む。Ｍ期細胞は母細胞が２つの嬢細胞に細胞分裂し、そのＤＮＡ量は正常なＧ０／Ｇ１期細胞の２倍のＤＮＡ量を含む。

【0033】

Ｆの領域は、その他のＤＮＡ量を有する細胞群が現れる領域である。

【0034】

なお図４に示すＤＮＡヒストグラムはあくまでも一例であり、対象生体組織のがん化の進行具合やがん種別によってＤＮＡヒストグラムの形状は変化する。ヒストグラム生成部１４は、生成したＤＮＡヒストグラムを判定部１５に供給する。

【0035】

判定部１５は、ＤＮＡヒストグラムを解析し、対象生体組織のがん化判定を行う。詳細には判定部１５は、ＤＮＡヒストグラム内のＳ期細胞に対応するＤＮＡ量の範囲（以下、Ｓ期蛍光強度範囲と呼称する。）を検出し、Ｓ期蛍光強度範囲から腫瘍細胞（ＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ）に対応するＤＮＡ量の範囲（以下、異常蛍光強度範囲と呼称する。）を除外し、除外した後の範囲の細胞数の指標（詳細には細胞数の代表値やＡＵＣ等）を用いてがん種別の診断を行う。以下、判定部１５の詳細な動作や意義等を説明する。

【0036】

がんの悪性腫瘍にはいくつかの種別があり、その種別によって治療方針が大きく異なる。例えばＧＢＭ（glioblastoma multiforme）は、大脳に発生する悪性腫瘍である。ＧＢＭの治療は、開頭手術で腫瘍を可能な限り摘出することが最も効果的と言われている。一方でＰＣＮＳＬ（Primary Central Nervous System Lymphoma）は、頭蓋内にリンパリンパ球が急激に増殖する悪性腫瘍である。ＰＣＮＳＬの治療では、外科摘出による切除ではなく放射線治療や化学療法が効果的である。

【0037】

ＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙの検出では、がんの陽性の検出を行うことは可能であるものの、上述のがんの詳細な診断を行うことは困難である。がんの悪性度は、一般的に全体細胞に対するＳ期細胞の比率により判断できることが知られている（例えば非特許文献１〜４）。しかしながら一般的な解析では、ＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙの影響によりＳ期細胞の比率を正確に把握できないことがある。当該事象を図５を参照して説明する。

【0038】

図５は、ＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙが生じている場合のＤＮＡヒストグラムの拡大模式図である。当該ＤＮＡヒストグラムは、Ｓ期に対応するＤＮＡ量（蛍光強度）の区分を拡大して表示した模式図である。なお図５は、説明の明確化のために記載した図であり、細胞の分布等は適宜簡略化している。

【0039】

上述のようにＳ期細胞は、Ｇ０／Ｇ１期細胞からＧ２／Ｍ期細胞に移行する段階にある細胞である。ここでＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙが生じている細胞がある場合、Ｓ期細胞と同様のＤＮＡ量を有する場合がある。この場合、Ｓ期細胞のＤＮＡ量の範囲（Ｓ期蛍光強度範囲）にＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙが生じている細胞の細胞数が加算された状態となってＤＮＡヒストグラム上に現れる（図５における“腫瘍細胞”部分）。

【0040】

そこで判定部１５は、このＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙが生じている細胞群をキャンセルし、キャンセル後のＳ期細胞の細胞数の指標（細胞数の代表値やＡＵＣ）を用いてがんの診断（種別や悪性度）の判定を行う手法を提供する。詳細は以下の通りである。

【0041】

判定部１５は、はじめにＳ期細胞のＤＮＡ量の範囲（Ｓ期蛍光強度範囲）を検出する。上述のようにＧ２／Ｍ期細胞は、Ｇ０／Ｇ１期細胞の約２倍のＤＮＡ量を含む。ＤＮＡヒストグラムを生成する場合、細胞数のピークはＧ０／Ｇ１期細胞のＤＮＡ量に対応する箇所となる。そこで判定部１５は、Ｇ／Ｇ１期細胞に対応するＤＮＡ量（細胞量のピーク）付近からＧ２／Ｍ期細胞のＤＮＡ量の付近の範囲までをＳ期細胞に対応するＤＮＡ量の範囲（Ｓ期蛍光強度範囲）とする。例えばＤＮＡヒストグラム全体の細胞数のピークがＤＮＡ量＝１９５の箇所とする（図５）。この場合に判定部１５は、ＤＮＡヒストグラム全体の細胞数のピークの立ち下がり点（Ｐ１）をＳ期蛍光強度範囲の始点とする。また判定部１５は、ＤＮＡ量＝３９０（１９５×２）付近の細胞数分布の立ち上がり点（Ｐ２）をＳ期蛍光強度範囲の終点とすればよい。なお判定部１５は、ＤＮＡヒストグラムのピーク（Ｇ０／Ｇ１期細胞のＤＮＡ量）を基にした任意の方法でＳ期蛍光強度範囲の始点と終点を定めればよい。

【0042】

判定部１５は、Ｓ期蛍光強度範囲内においてＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙが生じている腫瘍細胞に対応する範囲（異常蛍光強度範囲）を検出する。例えば判定部１５は、Ｓ期蛍光強度範囲において細胞数のピーク点（Ｐ３）を検出し、ピーク点を頂点とする立ち上がり点（Ｐ４）と立ち下がり点（Ｐ５）を検出する。そして判定部１５は、当該立ち上がり点（Ｐ４）を異常蛍光強度範囲の始点とし、立ち下がり点（Ｐ５）を異常蛍光強度範囲の終点とする。なお判定部１５は、細胞数のピーク点（Ｐ３）を検出して異常蛍光強度範囲を定めるのではなく、細胞数変化の傾きの傾向を基に異常蛍光強度範囲の始点と終点を定めてもよい。

【0043】

判定部１５は、Ｓ期蛍光強度範囲から異常蛍光強度範囲を除外した範囲（図５の例ではＰ１〜Ｐ４の範囲とＰ５〜Ｐ２の範囲）の細胞数の指標（Ｓ期細胞の相対的な数の多さを示すものであり、詳細には後述する代表値やＡＵＣ）を基にがん化判定を行う。

【0044】

例えば判定部１５は、Ｓ期蛍光強度範囲から異常蛍光強度範囲を除外した範囲（図５の例ではＰ１〜Ｐ４の範囲とＰ５〜Ｐ２の範囲）の細胞数の代表値を算出する。ここで代表数とは、例えば細胞数の平均値であってもよく、最頻値や中央値であってもよい。判定部１５は、この代表値（図５の例では平均値Ｎ１）とＤＮＡヒストグラムのピーク値（Ｇ０／Ｇ１期細胞の細胞数に対応する値であり、図５の例ではＮ２）を比較する。この比較により、ＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙの影響を除いた簡易的なＳ期細胞の比率（全体細胞数に対するＳ期細胞の比率）を算出することができる。

【0045】

判定部１５は、この比率と所定の閾値を比較することによってがんの種別や悪性度の推定を行う。例えばＧＢＭを起因とする腫瘍がある生体組織では、Ｓ期細胞の細胞数（ＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙの影響を除外した細胞数）が少ない。一方、ＰＣＮＳＬを起因とする腫瘍がある生体組織では、Ｓ期細胞の細胞数（ＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙの影響を除外した細胞数）がＧＢＭの場合と比較して多い。そのため判定部１５は、上記比率（ＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙの影響を除いた簡易的なＳ期細胞の比率）の大きさを閾値と比較することによってがんの種別を推定すればよい。またＤＮＡヒストグラムのパターンはがん細胞の悪性度を反映すること、ひいてはＳ期の細胞（増殖細胞）の割合とがんの悪性度の間には有意な関係があること、が知られている（例えば非特許文献１〜４）。そのため判定部１５は、Ｓ期細胞の割合と所定の閾値を比較すること等によってがんの悪性度（悪性レベル）を推定してもよい。

【0046】

また判定部１５は、Ｓ期蛍光強度範囲から異常蛍光強度範囲を除外した範囲（図５の例ではＰ１〜Ｐ４の範囲とＰ５〜Ｐ２の範囲）の曲線下面積（ＡＵＣ：Area Under the Curve）と、全範囲の曲線下面積と、を比較してもよい。ＤＮＡヒストグラムはＤＮＡ量と細胞数の分布を示すものであるため、曲線下面積はある範囲の細胞数の合計値に対応する。当該比較によりＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙの影響を除外したＳ期細胞の比率（全細胞数に対するＳ期細胞の比率）を算出できる。判定部１５は、この比率と予め定めた閾値を比較することによってがんの種別を推定してもよい。また判定部１５は、この比率を用いてがんの悪性度の推定を行ってもよい。

【0047】

なお判定部１５は、全範囲（図４における領域Ａ〜Ｆ）からデブリに相当する範囲（領域Ａ）を除外した範囲（領域Ｂ〜Ｆ）を比較対象としてもよい。これによりデブリの影響を除外してＳ期細胞の比率を算出することができ、より正確ながん種別や悪性度の判定を行うことができる。

【0048】

このように判定部１５は、Ｓ期蛍光強度範囲から異常蛍光強度範囲を除外した範囲（図５の例ではＰ１〜Ｐ４の範囲とＰ５〜Ｐ２の範囲）を算出し、その範囲の細胞数を示す指標値（代表値やＡＵＣ）の大小を基にがん種別や悪性度の判定を行えばよい。

【0049】

再び図３を参照する。出力部１６は、がん診断の結果を任意の方法で出力する。例えば出力部１６は、がん診断の結果をがん診断装置１の筐体上のディスプレイに表示してもよい。また出力部１６は、対象生体組織のがんの種別等を音声により報知してもよい。

【0050】

続いて図６を参照してがん診断装置１の動作について改めて説明する。図６は、がん診断装置１のがん種別の判定の流れを示すフローチャートである。なお本例では、ＧＢＭとＰＣＮＳＬを見分ける場合の処理の流れを示す。なお図６では、がんの悪性度については言及していないものの同等の処理を行うことが可能である。

【0051】

細胞前処理部１２は、対象生体組織に対するピペッティング処理により細胞の単離を行うと共に、細胞の蛍光を行った懸濁液を生成する（Ｓ１）。なお細胞前処理部１２は、他の方法により細胞の単離を行ってもよい。また予め生成された懸濁液ががん診断装置１に供給されてもよい。

【0052】

光学処理部１３は、流路に流した懸濁液にレーザー光を照射し、懸濁液からの光（側方蛍光を含む）の強度を検出する（Ｓ２）。ヒストグラム生成部１４は、光学処理部１３が検出した蛍光強度の測定結果を基に、ＤＮＡ量（蛍光強度）と細胞数の関係を示すＤＮＡヒストグラムを生成する（Ｓ３）。

【0053】

判定部１５は、ＤＮＡヒストグラムからＧ０／Ｇ１期細胞に対応するＤＮＡ量（蛍光強度）を検出し、当該ＤＮＡ量を基にＳ期細胞に対応するＤＮＡ量の範囲（Ｓ期蛍光強度範囲）を検出する（Ｓ４）。その後に判定部１５は、Ｓ期蛍光強度範囲内においてＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙが生じている腫瘍細胞に対応する範囲（異常蛍光強度範囲）を検出する（Ｓ５）。

【0054】

判定部１５は、Ｓ期蛍光強度範囲から異常蛍光強度範囲を除外した範囲の細胞数の平均値（指標の一種）と、Ｇ０／Ｇ１期細胞の細胞数（ヒストグラムのピーク値）と、を比較した比率を算出する（Ｓ６）。なお判定部１５は、前述のように当該範囲のＡＵＣ等を用いた比較を行ってもよい。

【0055】

判定部１５は、算出した比率（Ｓ期細胞比率）と所定閾値を比較する（Ｓ７）。Ｓ期細胞比率が所定閾値よりも大きい場合（Ｓ７：ＹＥＳ）、判定部１５は対象生体組織がＰＣＮＳＬの疑いがあると判定する（Ｓ８）。一方でＳ期細胞比率が所定閾値よりも大きくない場合（Ｓ７：ＮＯ）、判定部１５は対象生体組織がＧＢＭの疑いがあると判定する（Ｓ９）。なお比較に用いる所定閾値は、病理診断の経験に基づいて決定すればよい。

【0056】

なお判定部１５は、複数の種類の閾値とＳ期細胞比率を比較することにより、３つ以上のがん種別を弁別してもよい。また判定部１５は、胃がんや大腸がんなどの様々な種別のがんを対象として、上述の比率（Ｓ期細胞比率）を用いた判定を行ってもよい。

【0057】

続いて本実施の形態にかかるがん診断装置１の効果について説明する。上述のようにＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙが生じている細胞の影響によりＳ期細胞の細胞数について正確に把握できないという問題があった。

【0058】

本実施の形態にかかる判定部１５は、ＤＮＡヒストグラムからＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙに相当する範囲を除外したＳ期細胞の範囲（例えば図５におけるＰ１〜Ｐ４の範囲及びＰ５〜Ｐ２の範囲）を検出している。判定部１５は、この範囲の細胞数の指標を用いてがんの種別の判定を行う。ＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙの影響を除外することによって、判定部１５は正確にがんの種別や悪性度を判定することができる。

【0059】

判定部１５は、ＤＮＡヒストグラムからＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙに相当する範囲を除外したＳ期細胞の範囲（例えば図５におけるＰ１〜Ｐ４の範囲及びＰ５〜Ｐ２の範囲）の代表値を算出する。判定部１５は、代表値（好適には平均値であり、図５の例ではＮ１）とＤＮＡヒストグラムのピーク値（Ｇ０／Ｇ１期細胞に対応する細胞数であり、図５の例ではＮ２）を比較することにより全体細胞数に対するＳ期細胞の細胞数の指標（比率）を簡易的かつ正確に把握することができる。判定部１５は、この比率を用いることにより簡易的かつ正確にがん種別や悪性度の判定を行うことができる。

【0060】

また判定部１５は、ＤＮＡヒストグラムからＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙに相当する範囲を除外したＳ期細胞の範囲（例えば図５におけるＰ１〜Ｐ４の範囲及びＰ５〜Ｐ２の範囲）のＡＵＣとＤＮＡヒストグラム全体のＡＵＣを比較してもよい。この場合であっても一般的な統計処理を行うのみで全体細胞数に対する正常なＳ期細胞の比率の指標を算出することができるため、簡易的かつ精度良くがん種別や悪性度の判定を行うことができる。

【0061】

以上、本発明者によってなされた発明を実施の形態に基づき具体的に説明したが、本発明は既に述べた実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることはいうまでもない。

【0062】

例えば判定部１５は、ＤＮＡヒストグラムを用いた種々のがん化検出も合わせて行ってもよい。詳細には判定部１５は、一般的なＤＮＡ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙの検出により対象生体組織のがん化検出を行ってもよい。また判定部１５は、特許文献３に記載の解析を行っても構わない。

【0063】

光学処理部１３の処理の一部、ヒストグラム生成部１４の処理、及び判定部１５の処理は、がん診断装置１内に設けられたＣＰＵ（Central Processing Unit、図示せず）がプログラムを記憶部（例えばがん診断装置１内のハードディスク）から読み出して実行することにより実現してもよい。

【0064】

ここでプログラムは、様々なタイプの非一時的なコンピュータ可読媒体（non-transitory computer readable medium）を用いて格納され、コンピュータに供給することができる。非一時的なコンピュータ可読媒体は、様々なタイプの実体のある記録媒体（tangible storage medium）を含む。非一時的なコンピュータ可読媒体の例は、磁気記録媒体（例えばフレキシブルディスク、磁気テープ、ハードディスクドライブ）、光磁気記録媒体（例えば光磁気ディスク）、ＣＤ−ＲＯＭ（Read Only Memory）、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−Ｒ／Ｗ、半導体メモリ（例えば、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ（Programmable ROM）、ＥＰＲＯＭ（Erasable PROM）、フラッシュＲＯＭ、ＲＡＭ（random access memory））を含む。また、プログラムは、様々なタイプの一時的なコンピュータ可読媒体（transitory computer readable medium）によってコンピュータに供給されてもよい。一時的なコンピュータ可読媒体の例は、電気信号、光信号、及び電磁波を含む。一時的なコンピュータ可読媒体は、電線及び光ファイバ等の有線通信路、又は無線通信路を介して、プログラムをコンピュータに供給できる。

【符号の説明】

【0065】

１ がん診断装置
２ 細胞単離装置
１１ ノズル
１２ 細胞前処理部
１３ 光学処理部
１４ ヒストグラム生成部
１５ 判定部
１６ 出力部
２０ ピペット部材
２１ 本体
２２ フィルタ
２３ 蓋体
２４ 容器
２５ 試薬

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】