特許 6784775 ｈｕＴＮＦＲ１相互作用の一価阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6784775

(24)【登録日】2020年10月27日

(45)【発行日】2020年11月11日

(54)【発明の名称】ｈｕＴＮＦＲ１相互作用の一価阻害剤

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20201102BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20201102BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20201102BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20201102BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20201102BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20201102BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20201102BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20201102BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20201102BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20201102BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20201102BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20201102BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20201102BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20201102BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20201102BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20201102BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20201102BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20201102BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20201102BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20201102BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20201102BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20201102BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20201102BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20201102BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20201102BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20201102BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20201102BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/13ZNA

   C12N15/63 Z

   C07K16/28

   C07K16/46

   C12N1/21

   C12N1/19

   C12N1/15

   C12N5/10

   C12P21/08

   A61K39/395 N

   A61P29/00 101

   A61P19/02

   A61P17/00

   A61P1/00

   A61P29/00

   A61P37/06

   A61P17/06

   A61P3/00

   A61P25/00

   A61P9/04

   A61P1/04

   A61P1/18

   A61P25/28

   A61P25/16

   A61P11/00

   A61P31/12

   A61P31/04

   A61P35/00

【請求項の数】23

【全頁数】77

(21)【出願番号】特願2018-552682(P2018-552682)

(86)(22)【出願日】2017年4月4日

(65)【公表番号】特表2019-516354(P2019-516354A)

(43)【公表日】2019年6月20日

(86)【国際出願番号】EP2017057997

(87)【国際公開番号】WO2017174586

(87)【国際公開日】20171012

【審査請求日】2020年3月30日

(31)【優先権主張番号】16163822.6

(32)【優先日】2016年4月5日

(33)【優先権主張国】EP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】504329034

【氏名又は名称】ウニヴェルズィテート シュトゥットガルト

(73)【特許権者】

【識別番号】513064184

【氏名又は名称】バリオファルム・アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【弁理士】

【氏名又は名称】中西 基晴

(74)【代理人】

【識別番号】100135415

【弁理士】

【氏名又は名称】中濱 明子

(72)【発明者】

【氏名】コンターマン，ローラント

(72)【発明者】

【氏名】プフィツェンマイアー，クラウス

(72)【発明者】

【氏名】リヒター，ファビアン

(72)【発明者】

【氏名】ツェットリッツ，キルスティン

(72)【発明者】

【氏名】シューリッヒ，ペーター

(72)【発明者】

【氏名】ヘルマン，アンドレアス

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／１１３５１５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０３５１４１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 KIRSTIN ANJA ZETTLITZ，ENGINEERED ANTIBODIES FOR THE THERAPY OF CANCER AND INFLAMMATORY DISEASES，[ONLINE]，２０１２年，pp. 1-90，ＵＲＬ，http://elib.uni-stuttgart.de/bitstream/11682/2035/1/Diss_Kirstin_Zettlitz.pdf

【文献】 KONTERMANN, ROLAND E. et al.，A HUMANIZED TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR 1 (TNFR1)-SPECIFIC ANTAGONISTIC ANTIBODY FOR SELECTIVE INHIBITION OF TUMOR NECROSIS FACTOR (TNF) ACTION，JOURNAL OF IMMUNOTHERAPY，２００８年 ４月，Vol. 31，pp. 225-234，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18317365

【文献】 RICHTER, FABIAN et al.，ANTAGONISTIC TNF RECEPTOR ONE-SPECIFIC ANTIBODY (ATROSAB): RECEPTOR BINDING AND IN VITRO BIOACTIVITY，PLOS ONE，２０１３年 ８月１９日，Vol. 8; e72156，pp. 1-13，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0072156

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ａ６１Ｋ ３８／００−３９／４４

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗原結合部分を通じてヒト腫瘍壊死因子受容体１（ｈｕＴＮＦＲ１）を一価で認識するヒトまたはヒト化抗体構築物である、ｈｕＴＮＦＲ１受容体の阻害剤であって、抗原結合部分が
−相補性決定領域（ＣＤＲ）配列ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含む、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ならびに
−ＣＤＲ配列ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、および
ヒト化またはヒトフレームワーク配列
を含む、ここで：
ａ）ＣＤＲＨ１配列が配列番号１と同定され；
ｂ）ＣＤＲＨ２配列が配列番号１０と同定され、５位のＸはＳであり；
ｃ）ＣＤＲＨ３配列が配列番号３と同定され；
ｄ）ＣＤＲＬ１配列が配列番号４と同定され；
ｅ）ＣＤＲＬ２配列が配列番号５と同定され；そして
ｆ）ＣＤＲＬ３配列が配列番号１１と同定される、
前記阻害剤。

【請求項2】

抗体構築物が、Ｆａｂ分子、ｓｃＦｖ分子、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ハーフＩｇＧ１抗体、およびＦｖドメインからなる群より選択される抗体を含む、請求項１の阻害剤。

【請求項3】

抗体構築物が、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦｖドメインのいずれかであり、抗体Ｆｃ断片に融合している、請求項２の阻害剤。

【請求項4】

抗体構築物が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、グリコシル化ＰＥＧ、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ化）、またはポリシアル酸（ＰＳＡ）への連結によって修飾されている、請求項１の阻害剤。

【請求項5】

ａ）ＶＨドメインが、配列番号１３、または配列番号１３への少なくとも９５％の配列同一性を含むその機能的活性変異体を含むか、または該配列からなり；そして
ｂ）ＶＬドメインが、配列番号１７または配列番号１９、または配列番号１７または配列番号１９への少なくとも９５％の配列同一性を含むその機能的活性変異体からなる群より選択される配列を含むか、または該配列からなる、
請求項１の阻害剤。

【請求項6】

以下のグループメンバーｉ）〜ｉｉ）からなる群より選択される、ＶＨおよびＶＬドメインの組み合わせを含む、請求項１の阻害剤：
ｉ）ＶＨが配列番号１３を含むかまたは配列番号１３からなり、そして
ＶＬが配列番号１７を含むかまたは配列番号１７からなる；
ｉｉ）ＶＨが配列番号１３を含むかまたは配列番号１３からなり、そして
ＶＬが配列番号１９を含むかまたは配列番号１９からなる。

【請求項7】

動的光散乱法によって決定される、少なくとも６０℃の熱安定性を、抗体構築物が有する、請求項１の阻害剤。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれかの阻害剤および薬学的に許容されうるキャリアーを含む薬学的調製物。

【請求項9】

組換え哺乳動物発現系を使用して抗体構築物を発現する、請求項１〜７のいずれかの阻害剤を産生する方法。

【請求項10】

抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）療法または非生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬剤（ＤＭＡＲＤ）が必要とされる疾患に罹患しているヒト被験体を治療する際に使用するための、請求項１〜７のいずれかの阻害剤。

【請求項11】

被験体が抗薬剤抗体を発展させている、請求項１０記載の使用のための阻害剤。

【請求項12】

請求項１０に記載の使用のための阻害剤であって、被験体が
ａ）関節、皮膚および腸の急性または慢性炎症；または
ｂ）自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、若年性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、多発性硬化症、うっ血性心不全、代謝性疾患、サイトカイン放出症候群、敗血症ショック、急性および慢性神経変性疾患、脳卒中、アルツハイマーおよびパーキンソン病、潰瘍性結腸炎、膵炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性劇症ウイルスまたは細菌感染、慢性神経変性疾患、原因病理学的仲介因子としてＴＮＦ／ＴＮＦＲ１を伴う遺伝病、周期熱症候群、ケルビズム症候群、または癌
のいずれかに罹患している、前記阻害剤。

【請求項13】

請求項１〜７のいずれかの阻害剤の有効量を含む、抗ＴＮＦ療法が必要なヒト被験体を治療するための医薬。

【請求項14】

被験体が、抗ＴＮＦ療法または非生物学的ＤＭＡＲＤ療法剤が適用される疾患に罹患しており、好ましくは第一選択治療として、あるいは抗ＴＮＦまたは非生物学的ＤＭＡＲＤ療法剤が失敗した場合の第二選択治療としての、請求項１３の医薬。

【請求項15】

被験体が抗薬剤抗体を発展させている、請求項１３の医薬。

【請求項16】

請求項１３の医薬であって、被験体が
ａ）関節、皮膚および腸の急性または慢性炎症；または
ｂ）自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、若年性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、多発性硬化症、うっ血性心不全、代謝性疾患、サイトカイン放出症候群、敗血症ショック、急性および慢性神経変性疾患、脳卒中、アルツハイマーおよびパーキンソン病、潰瘍性結腸炎、膵炎、ＣＯＰＤ、急性劇症ウイルスまたは細菌感染、慢性神経変性疾患、原因病理学的仲介因子としてＴＮＦ／ＴＮＦＲ１を伴う遺伝病、周期熱症候群、ケルビズム症候群、または癌
のいずれかに罹患している、前記医薬。

【請求項17】

請求項１〜７のいずれかの阻害剤をコードする単離核酸。

【請求項18】

請求項１７の核酸を含む発現ベクター。

【請求項19】

請求項１７の核酸を含む、単離組換え宿主細胞。

【請求項20】

調製物が非経口使用による使用のために配合されている、請求項８の薬学的調製物。

【請求項21】

非経口使用が、静脈内または皮下投与によるものである、請求項２０の薬学的調製物。

【請求項22】

チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)産生細胞株を使用する、請求項９の方法。

【請求項23】

第一選択治療として、あるいは抗ＴＮＦまたは非生物学的ＤＭＡＲＤ療法剤が失敗した場合の第二選択治療として使用するための、請求項１０の阻害剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一価で高アフィニティにｈｕＴＮＦＲ１を認識する、ＴＮＦ−ｈｕＴＮＦＲ１受容体相互作用の阻害剤に関する。

【背景技術】

【0002】

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、多面的サイトカインおよび炎症の中心的仲介因子である。上昇したレベルのＴＮＦは、関節リウマチ、乾癬、およびクローン病を含む多様な炎症性疾患に関連する。これらの疾患の治療のため、可溶性ＴＮＦ受容体（エタネルセプト）ならびに抗ＴＮＦ抗体（インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ）を含む、いくつかのＴＮＦ中和試薬が認可されてきており、そしてさらに多くのものが開発中である。ＴＮＦアンタゴニストで治療されている患者は１００万人を超えており、療法有効性はよく文書化されている。しかし、長期にわたるＴＮＦ全般の阻害は、結核再活性化、深刻な感染およびさらに悪性腫瘍のリスクを増加させる。その結果、すべての認可された抗ＴＮＦ薬剤の医学的情報には、広範囲の警告および注意が含まれる。

【0003】

２つのＴＮＦ受容体（ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲ１およびＣＤ１２０ｂ、ＴＮＦＲ２）は、ＴＮＦの結合に際して、シグナル伝達を仲介する（Ｌｏｃｋｓｌｅｙら， ２００１， Ｃｅｌｌ １０４：４８７−５０１）。炎症促進性反応は、主に、遍在性に発現しているＴＮＦＲ１によって仲介される。ＴＮＦＲ１は、ＴＮＦの膜結合型（ｍＴＮＦ）、およびタンパク質分解性切断によってｍＴＮＦから産生される可溶性ＴＮＦ（ｓＴＮＦ）の両方によって活性化される。対照的に、例えば免疫細胞、内皮細胞およびニューロンによって、より限定された方式で発現されるＴＮＦＲ２は、ｍＴＮＦによってのみ活性化される。ＴＮＦＲ２の活性化は主に、抗アポトーシスシグナルを誘導し、そしてこれはｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖を導きうる。さらに、ＴＮＦＲ２は、組織ホメオスタシスおよび再生に役割を果たすようである。

【0004】

ＴＮＦＲ１シグナル伝達の選択的阻害は、両方のＴＮＦ受容体に影響を及ぼすＴＮＦ全般の中和の代替法として、ますます注目を集めてきている（Ｆｉｓｃｈｅｒら ２０１５， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ４：４８−７０）。最近、ＴＮＦＲ１の活性を選択的に中和するＴＮＦ変異タンパク質（Ｒ１ａｎｔＴＮＦ）が記載されてきている（Ｓｈｉｂａｔａら ２００８， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ２：２２９−３３）。未修飾またはＰＥＧ化タンパク質（ＰＥＧ−Ｒ１ａｎｔＴＮＦ）のいずれかとして投与された、このＴＮＦ変異タンパク質は、急性ネズミ肝炎モデルおよびネズミコラーゲン誘導性関節炎モデルにおいて、療法的有効性を示した。ＴＮＦＲ１を選択的に阻害する有益な効果は、ｓＴＮＦと不活性複合体を形成可能であり、したがって感染に対する生得的な免疫を保持しながら、ＴＮＦＲ１によって仲介される炎症促進作用を選択的に阻害する、ドミナントネガティブＴＮＦ変異タンパク質（ＸＰｒｏ１５９５）からの結果によってさらに裏付けられた（Ｏｌｌｅｒｏｓら ２００９， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １９９：１０５３−６３）。

【0005】

ＴＮＦＲ１選択的阻害はまた、ＴＮＦＲ１特異的抗体でも達成可能である。例えば、モノクローナルネズミ抗体Ｈ３９８、およびヒトＴＮＦＲ１に関する選択性を持つＵＳ５７３６１３８に記載される抗体は、ＴＮＦ仲介性シグナル伝達および細胞傷害性の強力な阻害を示した（Ｍｏｏｓｍａｙｅｒら １９９５， Ｔｈｅｒ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２：３１−４０）。

【0006】

Ｈ３９８のヒト化型は、ＷＯ２００８／１１３５１５Ａ２に記載される。特に、ヒト化抗体は、Ｆａｂ断片（ＩＺＩ−０６．１）として産生され、そして親抗体のＦａｂ断片のものと匹敵するｉｎ ｖｉｔｒｏ中和活性を示した。重要なことに、Ｈ３９８抗体は、ＴＮＦ活性の完全な遮断には至らず、これは、高濃度ではアンタゴニストから部分的にアゴニストに変換されることによると解釈された。これは、ＴＮＦＲ１架橋が用量依存性に増加し、したがって、リガンド非依存性に、機能するＴＮＦＲ１シグナル伝達複合体が形成される可能性があることによって、説明される。

【0007】

ＩＺＩ−０６．１のアフィニティ成熟に向けての試みは、抗原結合アフィニティの２倍の増加を示し、またそれが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＮＦ仲介性細胞傷害性のわずかに改善された阻害も生む、突然変異体（ｓｃＦｖＩＧ１１）を生じた（Ｚｅｔｔｌｉｔｚ ＫＡ， ｔｈｅｓｉｓ ２０１２， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）。

【0008】

Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ２００８， ３１（３）：２２５−２３４）は、ＴＮＦＲ１選択的ＴＮＦアンタゴニストとして、ＩＺＩ−０６．１の一価抗体断片を記載する。

【0009】

ＴＮＦＲ１に対する抗体は、リガンドを模倣する反応を誘導することによって、アゴニスト潜在能力を有することが見いだされた。この反応は、シグナル伝達が、多価ＴＮＦ三量体の結合による受容体の凝集によって開始されることを示唆する。特に、二価抗ＴＮＦＲ１抗体は、受容体架橋によってＴＮＦＲを活性化し、それ自体が細胞傷害性およびアポトーシスを含む炎症促進性反応を引き起こし、これがＴＮＦ仲介性疾患状態を治療する際に逆効果になるであろうリスクを所持することが知られた。

【0010】

ＷＯ２０１２０３５１４１Ａ１は、抗体のアゴニスト潜在能力を制限することが見いだされた、エフェクター機能の仲介が欠損している修飾Ｆｃ領域を有する、ＡＴＲＯＳＡＢと呼ばれるＩｇＧ１型の抗ｈｕＴＮＦＲ１抗体を記載する。

【0011】

Ｒｉｃｈｔｅｒら（２０１３， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８：ｅ７２１５６）は、ＴＮＦまたはＬＴαに誘導される、それぞれ、ＨｅＬａおよびＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−６およびＩＬ−８の放出によって測定されるような、ＴＮＦＲ１が天然リガンドＴＮＦおよびリンホトキシン・アルファ（ＬＴα）と相互作用する際の、ＡＴＲＯＳＡＢによる阻害を記載する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】ＵＳ５７３６１３８

【特許文献2】ＷＯ２００８／１１３５１５Ａ２

【特許文献3】ＷＯ２０１２０３５１４１Ａ１

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】Ｌｏｃｋｓｌｅｙら， ２００１， Ｃｅｌｌ １０４：４８７−５０１

【非特許文献2】Ｆｉｓｃｈｅｒら ２０１５， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ４：４８−７０

【非特許文献3】Ｓｈｉｂａｔａら ２００８， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ２：２２９−３３

【非特許文献4】Ｏｌｌｅｒｏｓら ２００９， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １９９：１０５３−６３

【非特許文献5】Ｍｏｏｓｍａｙｅｒら １９９５， Ｔｈｅｒ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２：３１−４０

【非特許文献6】Ｚｅｔｔｌｉｔｚ ＫＡ， ｔｈｅｓｉｓ ２０１２， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ

【非特許文献7】Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ２００８， ３１（３）：２２５−２３４）

【非特許文献8】Ｒｉｃｈｔｅｒら（２０１３， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８：ｅ７２１５６）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

改善されたＴＮＦＲ１阻害特性を持つ一方、生得的なＴＮＦ模倣アゴニスト活性によって引き起こされるいかなる副作用も回避する、改善された抗ｈｕＴＮＦＲ１剤を提供することが目的であった。

【0015】

この目的は、特許請求される主題によって解決される。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明にしたがって、抗原結合部分を通じてｈｕＴＮＦＲ１を一価で認識するヒトまたはヒト化抗体構築物である、ＴＮＦ−ｈｕＴＮＦＲ１受容体相互作用の阻害剤を提供する。

【0017】

特に、抗原結合部分は
−ＣＤＲ配列ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ２を含む、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ならびに
−ＣＤＲ配列ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ２を含む、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン
を含む、ここで：
Ａ
ａ）ＣＤＲＨ１配列が配列番号１と同定され；
ｂ）ＣＤＲＨ２配列が配列番号１０と同定され；
ｃ）ＣＤＲＨ３配列が配列番号３と同定され；
ｄ）ＣＤＲＬ１配列が配列番号４と同定され；
ｅ）ＣＤＲＬ２配列が配列番号５と同定され；そして
ｆ）ＣＤＲＬ３配列が配列番号１１と同定される；
あるいは
Ｂ
ａ）ＣＤＲＨ１配列が配列番号１の機能的活性ＣＤＲ変異体であり；そして／または
ｂ）ＣＤＲＨ２配列が配列番号１０の機能的活性ＣＤＲ変異体であり；そして／または
ｃ）ＣＤＲＨ３配列が配列番号３の機能的活性ＣＤＲ変異体であり；そして／または
ｄ）ＣＤＲＬ１配列が配列番号４の機能的活性ＣＤＲ変異体であり；そして／または
ｅ）ＣＤＲＬ２配列が配列番号５の機能的活性ＣＤＲ変異体であり；そして／または
ｆ）ＣＤＲＬ３配列が配列番号１１の機能的活性ＣＤＲ変異体である；
あるいは
ここで、機能的活性ＣＤＲ変異体は、ＣＤＲＨ２の５位およびＣＤＲＬ３の３位を除いて、いかなる位でも、それぞれのＣＤＲ配列に１または２の点突然変異より多くを含まない。

【0018】

態様Ｂの機能的活性ＣＤＲ変異体は、態様Ａの阻害剤の機能的活性変異体を決定し、ここで、ＣＤＲＨ２配列の機能的活性ＣＤＲ変異体は、ＧまたはＳのいずれかである５位のアミノ酸配列を特に含み；そしてＣＤＲＬ３配列の機能的活性ＣＤＲ変異体は、ＧまたはＳのいずれかである３位のアミノ酸配列を特に含む。機能的活性ＣＤＲ変異体は、本明細書にさらに記載するような、ｈｕＴＮＦＲ１に結合する高アフィニティを特に決定する。特に、機能的活性変異体は、態様Ａの阻害剤のアフィニティ成熟変異体であり、特に、ＣＤＲ配列の１、２、３、４、５、または６が機能的活性ＣＤＲ変異体であるものである。

【0019】

特に、本明細書記載の阻害剤は、驚くべきことに、ＩＺＩ−０６．１の改善型として以前操作されたｓｃＦｖＩＧ１１に比較した際、改善された結合特性を示すことが明らかになった。

【0020】

特に、抗原結合部分は、５ｘ１０^−９Ｍ未満のＫ_Ｄおよび１０^−３ｓ^−１未満のｋ_оｆｆで、ｈｕＴＮＦＲ１に結合する。結合アフィニティおよび結合特性（会合および解離）は、特に、二価結合のアビディティ効果を実質的に排除した、一価結合を決定するための標準的試験において決定される。標準試験は、生理学的温度（約３７℃、または３７℃＋／−１℃）での水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）による測定に基づく。こうしたアフィニティ測定は、特に、Ｆａｂ形式で実行される。したがって、抗体構築物がＦａｂ分子以外のいずれかである場合、抗原結合部位は特に、３７℃でＱＣＭによるアフィニティ測定のため、それぞれのＦａｂ分子内に導入される。これにより、アフィニティ測定に干渉しうるアビディティ効果と無関係に、一価結合剤のアフィニティ測定の結果の比較性が確実になる。特に好ましいＱＣＭは、中程度の受容体密度で行われる。特に、ｈｕＴＮＦＲ１に結合する抗体構築物のアフィニティを、３７℃、および５０〜１００Ｈｚの範囲内、例えば約５０Ｈｚ、または５０Ｈｚ＋／−１０Ｈｚ、または５０Ｈｚ＋／−５Ｈｚの中程度の受容体密度で、ＱＣＭによってＦａｂ形式に関して決定する。ＱＣＭによる結合アフィニティの決定のための標準的試験を、以下の実施例セクションに記載する。

【0021】

特に、Ｋ_Ｄは４ｘ１０^−９Ｍ未満、または３ｘ１０^−９Ｍ未満、または２ｘ１０^−９Ｍ未満、または１０^−９Ｍ未満、またはさらに１０^−１０Ｍ未満である。
特に、ｋ_оｆｆは１０^−３、または５ｘ１０^−４ｓ^−１未満、または１０^−４ｓ^−１未満、または１０^−５ｓ^−１未満である。

【0022】

特に、抗原結合部分は、少なくとも１０^５Ｍ^−１ｓ^−１のｋ_оｎで、ｈｕＴＮＦＲ１を認識する。
特定の側面にしたがって、阻害剤は、細胞に基づくアッセイにおいて、好ましくはＫｙｍ−１細胞におけるＴＮＦＲ１仲介性細胞死の阻害に関するアッセイによって、あるいはそれぞれＨｅＬａ細胞またはＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−６またはＩＬ−８放出の阻害に関するアッセイによって決定した際、ＴＮＦ−ｈｕＴＮＦＲ１受容体相互作用を直接阻害する。特に、Ｋｙｍ−１細胞におけるＴＮＦＲ１仲介性細胞死の阻害に関するアッセイにおいて、ＩＣ_５０値は、５．０ｘ１０^−９Ｍ未満である。特に、ＨｅＬａ細胞からのＩＬ−６放出の阻害に関するアッセイにおいて、ＩＣ_５０値は、４．０ｘ１０^−８Ｍ未満であり、またはＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−８放出の阻害に関するアッセイにおいて、ＩＣ_５０値は、２．０ｘ１０^−８Ｍ未満である。

【0023】

一価相互作用のため、抗体構築物のＴＮＦ模倣アゴニスト潜在能力は、特に排除されている一方、ＴＮＦＲ１への結合の増加したアフィニティ、特に低いオフ速度が、ＴＮＦＲ１依存性ＴＮＦ反応の優れた阻害を提供する。

【0024】

さらなる特異的な側面にしたがって、阻害剤は、細胞に基づくアッセイにおいて、好ましくはＫｙｍ−１細胞におけるＴＮＦＲ１仲介性細胞死の阻害に関するアッセイによって、あるいはＨｅＬａ細胞および／またはＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−６またはＩＬ−８放出の阻害に関するアッセイによって決定した際、リンホトキシン・アルファとのｈｕＴＮＦＲ１−受容体相互作用を直接阻害する。

【0025】

特に、抗原結合部分は、一価結合部位を形成する１またはそれより多いＦｖドメインを含むかまたは該ドメインからなる。特異的側面にしたがって、Ｆｖドメインは、どちらもドメインのベータシート構造の相互作用を通じて互いに関連している、ＶＨおよびＶＬドメインである。

【0026】

１つの側面にしたがって、抗原結合部分は、ｈｕＴＮＦＲ１の膜遠位ＣＲＤ１およびＣＤＲ２のサブドメインＡ１を含むエピトープを特異的に認識する。
特異的結合エピトープは、ｈｕＴＮＦＲ１のＮ末端領域中のアミノ酸１〜１１５によって示される。

【0027】

特定の態様にしたがって、抗体構築物は、本明細書にさらに記載するように、Ｈ３９８抗体によって認識されるようなエピトープと同じエピトープであるかまたはこれと重複しているエピトープに、特異的に結合する。特に、抗体構築物は、ｈｕＴＮＦＲ１に競合的に結合するように、そのエピトープへのＨ３９８抗体結合に干渉する。

【0028】

特に、抗体構築物は、アフィニティ成熟されたヒト化Ｈ３９８抗体の少なくともＶＨドメインおよび場合によってＦｖドメイン（ＶＬと会合しているかまたは結合しているＶＨとして）を含む。特に、Ｈ３９８抗体およびヒト化ＡＴＲＯＳＡＢ抗体（本明細書にさらに記載するようなもの）は、以下：
配列番号１：Ｈ３９８ ＣＤＲＨ１
配列番号２：Ｈ３９８ ＣＤＲＨ２
配列番号３：Ｈ３９８ ＣＤＲＨ３
配列番号４：Ｈ３９８ ＣＤＲＬ１
配列番号５：Ｈ３９８ ＣＤＲＬ２
配列番号６：Ｈ３９８ ＣＤＲＬ３
を含むかまたはこれらからなるＣＤＲ配列によって特徴付けられる。

【0029】

特に、抗体構築物は、ＶＨおよびＶＬドメインを含み、ＶＨおよびＶＬドメインの少なくとも１つが相補性決定領域（ＣＤＲ）配列のいずれかに少なくとも１つの点突然変異を含む親ドメインのアフィニティ成熟機能的変異体であり、
ａ）親ＶＨドメインは、ＣＤＲ配列：配列番号１（ＣＤＲＨ１）、配列番号２（ＣＤＲＨ２）、および配列番号３（ＣＤＲＨ３）によって特徴付けられ；そして
ｂ）親ＶＬドメインは、ＣＤＲ配列：配列番号４（ＣＤＲＬ１）、配列番号５（ＣＤＲＬ２）、および配列番号６（ＣＤＲＬ３）によって特徴付けられ；
ＣＤＲ配列はＫａｂａｔ番号付けスキームにしたがっている。

【0030】

特に、少なくとも１つの点突然変異は、配列番号２（ＣＤＲＨ２）および／または配列番号６（ＣＤＲＬ３）のいずれかにおけるものであり、好ましくはＣＤＲＨ２配列は配列番号７であり、そしてＣＤＲＬ３配列は配列番号８である。

【0031】

特に、１または２の点突然変異をＣＤＲ配列のいずれかに導入して、機能的活性ＣＤＲ変異体を産生することも可能である。特に、機能的活性ＣＤＲ変異体は、親ドメインのＣＤＲ配列のいずれかに比較した際、少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％、または少なくとも９０％、またはＣＤＲ配列あたり１つのみの点突然変異を有し、好ましくは、ＣＤＲ配列は、ＣＤＲＨ２またはＣＤＲＬ３配列のいずれかである。

【0032】

特に、抗体構築物は、アフィニティ成熟目的のためのＶＨおよびＶＬ配列を含む、ＡＴＲＯＳＡＢと称されるヒト化抗体のアフィニティ成熟配列を含む。ＡＴＲＯＳＡＢは、以下のＶＨおよびＶＬ配列：
配列番号２２：ＡＴＲＯＳＡＢ ＶＨ
配列番号２３：ＡＴＲＯＳＡＢ ＶＬ
によって特に特徴付けられる。

【0033】

特に、抗原結合部分は
Ａ
グループメンバーｉ）〜ｉｉ）からなる群より選択されるもの、ここで
ｉ）
ａ）配列番号１によって同定されるＣＤＲＨ１配列；
ｂ）配列番号１０によって同定されるＣＤＲＨ２配列、式中、５位のＸはＳである；
ｃ）配列番号３によって同定されるＣＤＲＨ３配列；
ｄ）配列番号４によって同定されるＣＤＲＬ１配列；
ｅ）配列番号５によって同定されるＣＤＲＬ２配列；および
ｆ）配列番号１１によって同定されるＣＤＲＬ３配列、式中、３位のＸはＧである
を含む抗原結合部分であるもの；
ならびに
ｉｉ）
ａ）配列番号１によって同定されるＣＤＲＨ１配列；
ｂ）配列番号１０によって同定されるＣＤＲＨ２配列、式中、５位のＸはＳである；
ｃ）配列番号３によって同定されるＣＤＲＨ３配列；
ｄ）配列番号４によって同定されるＣＤＲＬ１配列；
ｅ）配列番号５によって同定されるＣＤＲＬ２配列；および
ｆ）配列番号１１によって同定されるＣＤＲＬ３配列、式中、３位のＸはＳである
を含む抗原結合部分であるもの；
あるいは
Ｂ
Ａのグループメンバーいずれかである親抗原結合部分の機能的活性変異体である、抗原結合部分
である。

【0034】

特に、機能的活性変異体は
ａ）ＣＤＲＨ２の５位およびＣＤＲＬ３の３位以外の任意の位でのそれぞれのＣＤＲ配列における１または２の点突然変異より多くを含まない、親抗体のＣＤＲ配列いずれかの、少なくとも１つの機能的活性ＣＤＲ変異体；および／または
ｂ）ＶＨまたはＶＬ配列のいずれかのフレームワーク領域における少なくとも１つの点突然変異
を含む。

【0035】

機能的活性ＣＤＲ変異体は、特に、５位のアミノ酸配列がＧまたはＳのいずれかであるＣＤＲＨ２配列；および３位のアミノ酸配列がＧまたはＳのいずれかであるＣＤＲＬ３配列によって特徴付けられる。機能的活性ＣＤＲ変異体は、特に、本明細書にさらに記載するようなｈｕＴＮＦＲ１に結合する高アフィニティによって特徴付けられる。

【0036】

特に、１またはそれより多い点突然変異が、機能的活性ＦＲ変異体を産生するために、ＦＲ配列、特にヒトまたはヒト化ＦＲ配列のいずれかに導入されることも可能である。
特に、ＶＨまたはＶＬ配列のいずれかの機能的活性ＦＲ１変異体には、親ＦＲ１配列に比較した際に、少なくとも４０％、または少なくとも４５％の配列同一性、または少なくとも５０％の配列同一性、または少なくとも６０％の配列同一性、または少なくとも７０％の配列同一性、または少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性を持つ変異体配列を得るために、１またはそれより多い、例えばいくつかの点突然変異、例えば、最大２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の点突然変異が含まれる。

【0037】

特に、ＶＨまたはＶＬ配列のいずれかの機能的活性ＦＲ２変異体には、親ＦＲ２配列に比較した際に、少なくとも７０％の配列同一性、または少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性を持つ変異体配列を得るために、１またはそれより多い、例えばいくつかの点突然変異、例えば、最大２、３、４、または５の点突然変異が含まれる。

【0038】

特に、ＶＨまたはＶＬ配列のいずれかの機能的活性ＦＲ３変異体には、親ＦＲ３配列に比較した際に、少なくとも５０％の配列同一性、または少なくとも６０％の配列同一性、または少なくとも７０％の配列同一性、または少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性を持つ変異体配列を得るために、１またはそれより多い、例えばいくつかの点突然変異、例えば、最大２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の点突然変異が含まれる。

【0039】

特に、ＶＨまたはＶＬ配列のいずれかの機能的活性ＦＲ４変異体には、親ＦＲ４配列に比較した際に、少なくとも７０％、または少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性を持つ変異体配列を得るために、１またはそれより多い、例えばいくつかの点突然変異、例えば、最大２、３、４、または５の点突然変異が含まれる。

【0040】

特定の態様にしたがって、抗体構築物は、Ｆａｂ分子、ｓｃＦｖ分子、単一可変ドメイン、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ハーフＩｇＧ１抗体、およびＦｖドメイン、または前述のいずれかの機能的活性誘導体からなる群より選択され、好ましくは、抗体構築物は、親水性ポリマー、例えばＰＥＧにカップリングされ、そして／またはポリペプチド、例えばヒト（またはマウス）血清アルブミン、トランスフェリン、アルブミン結合ドメインまたはペプチド、Ｉｇ結合ドメインまたはペプチド、ＰＥＧ模倣ポリペプチド伸長、抗体Ｆｃ断片、（ホモ二量体化よりも）好ましいヘテロ二量体化を可能にする突然変異を所持する抗体Ｆｃ断片、あるいは前述のポリペプチドいずれかの機能的変異体に融合している。

【0041】

特に、抗体構築物は、抗体Ｆｃ断片に融合したＦａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦｖドメインのいずれかであり、ＦｃがＣＨ２およびＣＨ３ドメインのヘテロ二量体からなり、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインがホモ二量体化よりも優先的なヘテロ二量体化を可能にする１またはそれより多い点突然変異を所持する。特に、ＦｃにおけるＣＨ３ドメインの一方または両方が、ＣＨ３／ＣＨ３ドメインのヘテロ二量体を含有するＦｃを得るように、アミノ酸構造を変化させるように修飾されている。

【0042】

特に、抗体構築物は、なお抗体構築物の一価結合構造を維持しつつ、さらなる抗体ドメインを含みまたは含まず、抗体Ｆｃ領域または断片に融合したＦｖドメインを含む。特定の例は、Ｆｃまたは修飾Ｆｃに融合したＦａｂ部分またはＦｖ部分を指す。

【0043】

特定の態様は、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインが、１またはそれより多い「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」突然変異、例えば
ＣＨ３ベータ−シート表面を修飾し、一方のＣＨ３ドメイン単量体上に存在し、Ｔ３６６Ｗである、「ノブ」突然変異
ＣＨ３ベータ−シート表面を修飾し、他方のＣＨ３ドメイン単量体上に存在し、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖからなる群より選択される、「ホール」突然変異
を通じてヘテロ二量体を形成する、ヒトＩｇＧ１Ｆｃを含む。

【0044】

特に、抗体構築物は、エフェクター機能を下方調節する１またはそれより多い突然変異を含むＦｃ領域を含む。特定の側面にしたがって、Ｆｃ領域はエフェクター機能を下方調節するように糖鎖操作（ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒ）されている。

【0045】

特に、抗体構築物は、例えば、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、ΔＧ２３６、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌからなる群より選択される１またはそれより多い突然変異を通じて、ＦｃγＲサイレンシングされたＣＨ２およびＣＨ３ドメインによって特徴付けられる（ヒトＩｇＧ１）Ｆｃ領域を含む。

【0046】

好ましい態様にしたがって、抗体構築物は、エフェクター機能を下方制御するように突然変異されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。好ましくは、Ｆｃ領域は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、ΔＧ２３６、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）からなる群より選択される少なくとも１つの突然変異を持つ重鎖を含む。好ましくは、前記突然変異の少なくとも２つ、より好ましくは６つの突然変異の少なくとも３つ、４つ、５つまたはすべてがヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列内に操作される。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列は、配列番号２４として同定されるアミノ酸配列に特に含まれる。配列番号２４は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃおよびヒンジ領域の配列を同定する（野生型ＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号３５）に加えてＣＨ２−ＣＨ３ドメイン）。

【0047】

特に、抗体構築物は、ヒト化またはヒトフレームワーク領域を含む。
特に、抗体構築物は、ＰＥＧ化、ＨＥＳ化、またはＰＳＡ化されている。
特に、抗体構築物は、５．０００〜１５０．０００ｇ／ｍｏｌの間の範囲の分子量のＰＥＧでＰＥＧ化される。例示的な抗体構築物、例えばＦａｂは、ＰＥＧ ４０．０００でＰＥＧ化される。

【0048】

特に、抗体構築物は、ハーフ抗体（half antibody）ＩｇＧ１であり、１つのみのＦａｂ部分、ヒンジ領域および１つのＦｃ部分によって特徴付けられ、ここで、ヒンジ領域および／またはＦｃ部分（特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）は重鎖二量体化を回避するための１またはそれより多い突然変異（Ｇｕら（２０１５） ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０（１）：ｅ０１１６４１９）、例えば
−ヒンジ領域（配列番号３５）における突然変異：Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ（ＥＵ番号付け）、および
−Ｆｃ部分における突然変異：Ｐ３９５Ａ、Ｆ４０５Ｒ、Ｙ４０７Ｒ、Ｋ４０９Ｄ（ＥＵ番号付け）
からなる群より選択される突然変異を含む。

【0049】

特に、抗体構築物は、Ｆｖ−Ｆｃ融合タンパク質であり、ＶＨは第一のヒンジ領域を通じて第一のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン鎖に融合しており、そしてＶＬは第二のヒンジ領域を通じて第二のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン鎖に融合している。好ましくは、第一および第二のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン鎖は、例えば第一および第二のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン鎖の間の優先的なヘテロ二量体化を可能にし、それによって例えば上に示すような「ノブ・イントゥ・ホール」突然変異を通じた、Ｆｃヘテロ二量体によって特徴付けられるＦｖ−Ｆｃ調製物を得る、１またはそれより多い点突然変異において互いに異なる。さらに、第一および第二のヒンジ領域は、以下のように修飾されていることも可能である：ＧＴＤＫＴＨＴＳＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧ（配列番号４２）、ＧＴＤＫＴＨＴＣＰＰＳＰＡＰＰＶＡＧ（配列番号４３）、またはＧＴＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＰＶＡＧ（配列番号４４）。

【0050】

特に、抗体構築物は、１またはそれより多いさらなる（人工的な）ドメイン間ジスルフィド結合によって特徴付けられる、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）である。こうしたジスルフィド結合は、ＶＨおよびＶＬドメインを架橋するジスルフィド結合の架橋橋脚として使用可能な適切な位で、ＶＨおよびＶＬドメインのいずれかに１またはそれより多いさらなるシステイン残基を導入することによって得られ、ジスルフィド結合は、システインを還元した際に得られる。特定の例にしたがって、ジスルフィド結合は、ＶＨの以下の位およびＶＬの対応する位のいずれかでＦｖ内に導入されることも可能である：ＶＨの４４ＣおよびＶＬの１００Ｃ、ＶＨの１０８ＣおよびＶＬの５５Ｃ、ＶＨの１０６ＣおよびＶＬの５６Ｃ、またはＶＨの１０１ＣおよびＶＬの４６Ｃ。

【0051】

特定の側面にしたがって、抗体構築物は、親Ｆｖドメインに比較した際に、ｈｕＴＮＦＲ１に結合する増加したアフィニティを持つＦｖドメインを含み、ここで親Ｆｖドメインは配列番号１２と同定される親ＶＨドメインおよび配列番号１６と同定される親ＶＬドメインによって特徴付けられる。

【0052】

特に、ＶＨおよびＶＬドメインの少なくとも１つは、ＣＤＲまたはフレームワーク（ＦＲ）配列のいずれかに少なくとも１つの点突然変異を含む、親ドメインのアフィニティ成熟機能的変異体である。

【0053】

特に、
ａ）ＶＨドメインは、配列番号１３〜１５、または配列番号１３〜１５のいずれかの機能的活性変異体からなる群より選択される配列を含むか、または該配列からなり；そして／または
ｂ）ＶＬドメインは、配列番号１７〜１９、または配列番号１７〜１９のいずれかの機能的活性変異体からなる群より選択される配列を含むか、または該配列からなる；または
ｃ）ａ）またはｂ）の機能的変異体は、ＣＤＲまたはＦＲ配列のいずれかにおいて、少なくとも１つの点突然変異を含む。特にａ）またはｂ）の機能的活性変異体は
ａ）ＣＤＲＨ２の５位およびＣＤＲＬ３の３位以外の任意の位でのＣＤＲ配列のいずれかにおける１または２の点突然変異；および／または
ｂ）ＶＨまたはＶＬ配列のいずれかのフレームワーク領域における少なくとも１つの点突然変異
によって特徴付けられる。

【0054】

特に、阻害剤は、
Ａ
ｉ）ＶＨが配列番号１３を含むかまたは配列番号１３からなり、そして
ＶＬが配列番号１７を含むかまたは配列番号１７からなる；
ｉｉ）ＶＨが配列番号１４を含むかまたは配列番号１４からなり、そして
ＶＬが配列番号１８を含むかまたは配列番号１８からなる；
ｉｉｉ）ＶＨが配列番号１５を含むかまたは配列番号１５からなり、そして
ＶＬが配列番号１９を含むかまたは配列番号１９からなる；
ｉｖ）ＶＨが配列番号１４を含むかまたは配列番号１４からなり、そして
ＶＬが配列番号１９を含むかまたは配列番号１９からなる；
ｖ）ＶＨが配列番号１５を含むかまたは配列番号１５からなり、そして
ＶＬが配列番号１８を含むかまたは配列番号１８からなる；
ｖｉ）ＶＨが配列番号１３を含むかまたは配列番号１３からなり、そして
ＶＬが配列番号１８を含むかまたは配列番号１８からなる；
ｖｉｉ）ＶＨが配列番号１４を含むかまたは配列番号１４からなり、そして
ＶＬが配列番号１７を含むかまたは配列番号１７からなる；
ｖｉｉｉ）ＶＨが配列番号１３を含むかまたは配列番号１３からなり、そして
ＶＬが配列番号１９を含むかまたは配列番号１９からなる；
ｉｘ）ＶＨが配列番号１５を含むかまたは配列番号１５からなり、そして
ＶＬが配列番号１７を含むかまたは配列番号１７からなる；
グループメンバーｉ）〜ｉｘ）からなる群より選択されるもの
または
Ｂ
Ａのグループメンバーｉ）〜ｉｘ）のいずれかのＶＨおよびＶＬドメインの組み合わせであって、ＶＨドメインが配列番号１３〜１５のいずれかの機能的活性変異体であり、そして／またはＶＬドメインが配列番号１７〜１９のいずれかの機能的活性変異体である、前記組み合わせ
である、ＶＨおよびＶＬドメインの組み合わせを含み、ここで、機能的活性変異体は
ａ）ＣＤＲＨ２の５位およびＣＤＲＬ３の３位以外の任意の位でのＣＤＲ配列のいずれかにおける１または２の点突然変異；および／または
ｂ）ＶＨまたはＶＬ配列のいずれかのフレームワーク領域における少なくとも１つの点突然変異
によって特徴付けられる。

【0055】

機能的活性変異体は、ＣＤＲ配列のいずれかに少なくとも１つの点突然変異を含む機能的活性ＣＤＲ変異体、および／またはＦＲ配列のいずれかに少なくとも１つの点突然変異を含む機能的活性変異体であることも可能である。しかし、機能的活性ＣＤＲ変異体は、特に、５位のアミノ酸配列がＧまたはＳのいずれかであるＣＤＲＨ２配列；および３位のアミノ酸配列がＧまたはＳのいずれかであるＣＤＲＬ３配列によって特徴付けられる。機能的活性ＣＤＲ変異体は、特に、本明細書にさらに記載するように、ｈｕＴＮＦＲ１に結合する高アフィニティによって特徴付けられる。

【0056】

特定の側面にしたがって、抗体構築物は、親抗体構築物に比較した際に、増加した熱安定性を有し、ここで抗体構築物は、ＶＨまたはＶＬ配列いずれかのフレームワーク領域に少なくとも１つの点突然変異を含む親Ｆｖドメインの機能的変異体であるＦｖドメインを含み、好ましくはＶＨドメイン配列は、（親）ＩＺＩ０６．１ ＶＨ配列（配列番号２０）の変異体であり、そして以下のアミノ酸（Ｋａｂａｔ番号付け）のいずれかを含む：
ａ）ＦＲ１における１位：ＱまたはＨ；
ｂ）ＣＤＲＨ２における
ｉ）３位：ＹまたはＶ；
ｉｉ）５位：Ｙ、Ｔ、またはＳ；
ｉｉｉ）６位：ＳまたはＱ；
ｉｖ）８位：ＨまたはＥ；
ｖ）１０位：ＹまたはＫ；
ｖｉ）１３位：ＥまたはＤ。

【0057】

さらに好ましい変異は、ＶＬ配列（配列番号２１）に関し、そしてＣＤＲＬ３（３位）にＳ９１Ｇ点突然変異を含む。
特に、好ましい抗体構築物変異体または阻害剤の熱安定性は、動的光散乱法によって決定した際、少なくとも６０℃、または少なくとも６１℃、または少なくとも６２℃、または少なくとも６３℃、または少なくとも６４℃、または少なくとも６５℃である。

【0058】

本発明はさらに、本明細書記載の阻害剤および薬学的に許容されうるキャリアーを含む薬学的調製物を提供する。
阻害剤および抗体構築物のアンタゴニスト特性のため、薬学的調製物は、アゴニスト活性を生じる副作用を回避しつつ、高濃度の阻害剤を含むことも可能である。

【0059】

全長免疫グロブリン構造が存在しないため、該阻害剤は特に、減少した免疫原性を有することも可能であり、そして阻害剤、例えば抗薬剤抗体（ＡＤＡ）の形成を伴わずに繰り返し使用可能である。

【0060】

驚くべきことに、例えば免疫グロブリンまたは抗体免疫療法に対する抗体を発展させているＡＤＡが発展した患者を治療するために、該阻害剤を使用可能であることがわかってきている。先行技術において、ＡＤＡは細胞表面上のＴＮＦＲ１に結合した際に抗体を架橋し、それによってＴＮＦＲ１シグナル伝達をアゴナイズするため、こうしたＡＤＡの存在は、特に、ＴＮＦＲ１に対して向けられる抗体を用いたさらなる免疫療法を排除するであろう。しかし、本明細書記載の阻害剤は、驚くべきことに、ＡＤＡの存在下であってさえ、ＴＮＦＲ１シグナル伝達をアゴナイズしない。

【0061】

特に、ＡＤＡ、例えば抗ｈｕＴＮＦＲ１抗体またはＩｇＧ構造いずれかに対するＡＤＡを発展させている被験体に、該薬学的調製物を投与することも可能である。
特に、該調製物は、非経口使用のために、好ましくは静脈内または皮下投与による使用のために配合されている。

【0062】

本発明は、抗体構築物を発現するために組換え哺乳動物発現系を使用する、本明細書記載のｈｕＴＮＦＲ１阻害剤を産生する方法をさらに提供する。
特に、異なる起源の細胞株、例えばヒト、例えばＨＥＫまたはＰＥＲ．Ｃ６；ハムスター、例えばＣＨＯまたはＢＨＫ；サル、例えばＣＯＳ−１またはＣＯＳ−７；マウス、例えばＣ１２７、ＳＰ２／０またはＮＳ０；あるいは酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含む、真核または哺乳動物細胞株である、産生細胞株を用いる。

【0063】

特に、ＣＨＯ産生細胞株を使用する。
別の原核産生細胞株には、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が含まれる。

【0064】

本発明はさらに、医学的使用のための、特に抗ＴＮＦ療法の必要があるヒト被験体を治療する際に使用するための阻害剤をさらに提供する。
したがって、本発明は、本明細書記載の阻害剤の有効量を投与することによる、抗ＴＮＦ療法の必要があるヒト被験体を治療する方法をさらに提供する。

【0065】

特に、ＴＮＦＲ１特異的阻害剤は、抗ＴＮＦ療法剤での治療の代替法として、ＴＮＦＲ１を架橋不能なＴＮＦアンタゴニストとして用いられる。こうしたＴＮＦアンタゴニストはまた、生物学的ＴＮＦアンタゴニストとも見なされ、典型的には、関節、皮膚および腸の慢性非感染性炎症の病因形成において、ＴＮＦＲ１仲介性ＴＮＦ機能の生物学的関連性が立証されている場合の療法的使用のために提供される。

【0066】

療法抗体または天然存在抗体によって誘導される薬剤特異的抗体（ＡＤＡ）はまた、薬剤が結合したＴＮＦＲ１を架橋し、そしてＴＮＦＲ１シグナル伝達を活性化する潜在能力を有するため、望ましくないアゴニスト活性を導く可能性もある。したがって、好ましい抗体構築物は、ホモ二量体形成Ｆｃ領域を欠くかまたはＦｃ領域を欠き、例えばＦａｂまたはｓｃＦｖ形式であり、そしてそれぞれの薬学的組成物は、架橋および炎症プロセスへの増加した刺激活性を生じる可能性がより低い。

【0067】

特定の態様にしたがって、阻害剤を被験体に反復投与する。
本明細書記載の阻害剤または抗体は、低い免疫原潜在能力を有し、そして抗体に対する望ましくない免疫反応を誘導することなく、被験体を治療するために使用可能であることが望ましい。

【0068】

この目的に向けて、好ましい抗体構築物は、ヒト化またはヒト抗体配列からなり、そして例えばホモ二量体化Ｆｃ領域を欠くかまたはＦｃ領域を欠き、例えばＦａｂまたはｓｃＦｖ形式である。それぞれの薬学的組成物は、（例えば反復投与に際して）耐性の喪失を生じる可能性がより低く、それによって、療法剤の安全性および有効性プロファイルの両方を改善する。

【0069】

特定の態様は、以前の療法に用いられてきた療法抗体、特にＦｃ領域を含む抗体に対する免疫反応または高レベルの抗体に苦しむ被験体の治療に関する。こうした患者は、好ましくは、ホモ二量体化Ｆｃ領域を欠くかまたはＦｃ領域を欠く、本明細書記載の抗体構築物で治療される。

【0070】

特に、本明細書記載の阻害剤は、抗ＴＮＦ療法または非生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬剤（ＤＭＡＲＤ）が必要とされる疾患に罹患しているヒト被験体を治療する際の医学的使用のために提供される。特に、医学的使用は、抗ＴＮＦ療法または非生物学的ＤＭＡＲＤが必要とされる場合の、阻害剤の有効量を用いた第一選択治療を、あるいは抗ＴＮＦまたは非生物学的ＤＭＡＲＤ療法剤が失敗した際の第二選択の治療としての治療を含む。

【0071】

特に、被験体は
ａ）関節、皮膚および腸の急性または慢性炎症（感染性または非感染性）；および／または
ｂ）自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、若年性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病（Ｍｏｒｂｕｓ Ｃｒｏｈｎ）、多発性硬化症、うっ血性心不全、代謝性疾患、サイトカイン放出症候群、敗血症ショック、急性および慢性神経変性疾患、脳卒中、アルツハイマーおよびパーキンソン病、潰瘍性結腸炎、膵炎、ＣＯＰＤ、急性劇症ウイルスまたは細菌感染、代謝性疾患、慢性神経変性疾患、原因病理学的仲介因子としてＴＮＦ／ＴＮＦＲ１を伴う遺伝病、周期熱症候群、ケルビズム症候群、および癌
に罹患している。

【0072】

特に、上記に列挙する疾患いずれかに関連する、炎症性疾患状態を治療する。特に上記のａ）の疾患のいずれかおよびｂ）の疾患のいずれかに罹患している被験体を治療する。
特定の側面にしたがって、本発明は、本明細書記載の阻害剤をコードする単離核酸を提供する。特に、核酸は、該核酸と天然にはともに存在しない非コードまたはコード核酸配列、例えば異種プロモーターまたは制御配列を含む配列に、機能可能であるように連結されている。特に、核酸は人工核酸である。

【0073】

本発明は、本明細書に記載するような、阻害剤抗体の抗原結合部位またはＶＨおよび／またはＶＬを含む、ポリペプチドまたはタンパク質、またはタンパク質誘導体を含むかまたはこれらからなるタンパク質性構築物を発現するためのコード配列を、各々含む、発現カセットまたはプラスミドを含むベクターをさらに提供する。

【0074】

本発明は、本明細書に記載するような発現カセット、発現ベクターまたはプラスミドを含む宿主細胞をさらに提供する。
本発明は、前記抗体を産生する条件下で、宿主細胞を培養するかまたは維持する、本明細書に記載するような阻害剤を産生する方法をさらに提供する。

【0075】

特に好ましいのは、
−抗体軽鎖を発現するコード配列を取り込む発現ベクター；および
−抗体重鎖を発現するコード配列を取り込む発現ベクター
を含む宿主細胞、およびこうした宿主細胞を使用する産生法である。

【0076】

特定の側面にしたがって、本発明は、本明細書記載の核酸または発現ベクターを含む組換え宿主細胞をさらに提供する。

【図面の簡単な説明】

【0077】

【図1】ヒトＴＮＦＲ１−ＦｃへのＨ３９８およびＡＴＲＯＳＡＢの結合。ａ）ＡＴＲＯＳＡＢおよびＨ３９８の平衡結合を、標準的ＥＬＩＳＡによって分析した（ｎ＝３、平均＋ＳＤ）。高受容体密度（１９５Ｈｚ）の条件下で試験した、ＡＴＲＯＳＡＢ（ｂ）およびＨ３９８（ｃ）のＱＣＭ結合動力学。適用したのは、３．９ｎＭ〜６２．５ｎＭの間の５つの濃度の３つ組であった。

【図2】ＡＴＲＯＳＡＢおよびＨ３９８によるＴＮＦ作用の阻害。０．１ｎＭ ＴＮＦ（ａ）およびＬＴα（ｂ）によって誘導される、ＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−８分泌の、増加する濃度のＡＴＲＯＳＡＢおよびＨ３９８での阻害。ｎ＝３の実験由来のデータを、ＴＮＦまたはＬＴαのみによって誘発される最大ＩＬ放出のパーセントとして示す。

【図3】低受容体密度での結合動力学。４８Ｈｚの受容体密度でのＱＣＭによる、ヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃに関するＡｔｒｏｓａｂ（ａ）およびＨ３９８（ｂ）のアフィニティの決定。

【図4】ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１（ＶＨ：配列番号２０、ＶＬ：配列番号２１）と親ＶＨおよびＶＬ配列およびアフィニティ成熟変異体との配列整列。ａ）ＡＴＲＯＳＡＢ（ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１）、ｓｃＦｖＩＧ１１、ｓｃＦｖＴ１２ＢおよびｓｃＦｖＦＲＫ１３．７の整列ＶＨ配列。ｂ）ＶＬ配列の整列。残基はＫａｂａｔ番号付けスキームにしたがって番号付けされ、そしてドットは、ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１と比較して同一であるアミノ酸を示す。４アミノ酸またはそれより多い配列を、以下のように示す。ｓｃＦｖＦＲＫ１３．７のＦＲ１における配列：ＳＡＳＶ（配列番号３６）；ＤＲＶＴ（配列番号３７）。ｓｃＦｖＦＲＫ１３．７のＦＲ３における配列：ＳＬＱＰ（配列番号３８）。

【図5】ライブラリーＥＰ０３の選択。選択の各周期後、ＥＬＩＳＡにおいて、ヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃに対する総結合に関して、増幅したファージのプールを分析した（ａ）。選択した候補を、可溶性ｓｃＦｖ形式で発現し、そしてＱＣＭ測定におけるヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃへの結合に関して試験した（ｂ）。示すのは、２つ組での単一実験の平均およびＳＤであり、ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１およびｓｃＦｖＩＧ１１は、ｂにおいて対照として働いた。

【図6】ｓｃＦｖＴ１２Ｂの発現および特徴付け。Ａ）ｓｃＦｖＴ１２Ｂならびに対照抗体ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１およびｓｃＦｖＩＧ１１のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）。ヒトＴＮＦＲ−Ｆｃへの結合を、ＥＬＩＳＡ（ｂ）およびＱＣＭ分析（ｃ）において試験し、ここで、測定（破線）および適合（実線）を示す。ＴＮＦ（０．１ｎＭ）が誘導するＩＬ−８放出の阻害を、ｄ）に示した。Ｂ）およびｄ）は、２つ組で行った２回（ｄ）および３回（ｂ）の個々の実験の平均およびＳＤを示す。

【図7】ヒト化配列とｓｃＦｖＩＺＩ０６．１（ＶＨ：配列番号２０、ＶＬ：配列番号２１）の整列。ＶＨ（ａ）およびＶＬ（ｂ）のヒト化配列を、ＡＴＲＯＳＡＢの一本鎖可変断片の配列に整列させた。同一残基をドットによって示す。４アミノ酸またはそれより多い配列を以下に示す。ＦＲＫ１３．１およびＦＲＫ１３．２のＶＨ（ａ）ＦＲ１における配列：ＧＧＬＶ（配列番号３９）。ＦＲＫ１３．１およびＦＲＫ１３．２のＶＨ（ａ）ＦＲ３における配列：ＮＡＫＮＳＬ（配列番号４０）、ＬＱＭＮ（配列番号４１）。ＦＲＫ１３．１およびＦＲＫ１３．２のＶＬ（ｂ）ＦＲ１における配列：ＳＡＳＶ（配列番号３６）；ＤＲＶＴ（配列番号３７）。ＦＲＫ１３．１およびＦＲＫ１３．２のＶＬ（ｂ）ＦＲ３における配列：ＳＬＱＰ（配列番号３８）。

【図8】ヒト化ｓｃＦｖ抗体の産生。Ａ）ｓｃＦｖＴ１２Ｂと組み合わせたヒト化ｓｃＦｖ変異体の遺伝子型。精製ｓｃＦｖ断片を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって（ｂ、１２％、クーマシー染色）、そして適切な発現の場合は、続いてＳＥＣ（ｃ、Ｙａｒｒａ ＳＥＣ−２０００カラム、流速０．５ｍｌ／分）によって分析した。

【図9】ヒトＴＮＦＲ１への結合およびその遮断。ヒト化ｓｃＦｖ抗体を、ヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃへの結合（ａ）およびＴＮＦ（０．１ｎＭ）が誘導するＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−８放出の阻害（ｂ、強く結合するｓｃＦｖに関してのみ実行）に関して、ＥＬＩＳＡによって試験した。ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１およびｓｃＦｖＴ１２Ｂは、対照として働いた（示すのは、平均およびＳＤ、ｎ＝３）。

【図10】ヒト化ｓｃＦｖ断片の熱安定性。動的光散乱法によって、ｓｃＦｖ抗体の分子安定性を分析した。示すデータポイントの視覚的解釈によって、Ｔ_ｍを決定した。

【図11】ＩｇＧ１３．７およびＦａｂ１３．７の発現および精製。発現および精製を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ａ、１２％分離ゲル、還元条件；ｂ、８％分離ゲル、還元条件）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ｃ、Ｙａｒｒａ ＳＥＣ−２０００カラム、流速０．５ｍｌ／分）によって評価した。既知の質量および保持時間の標準タンパク質にしたがって、示す分子量を内挿した。

【図12】ｓｃＦｖ１３．７誘導体の種選択性。ヒトおよびマウス起源両方のＴＮＦＲ１および２へのＩｇＧ１３．７およびＦａｂ１３．７の結合を、標準ＥＬＩＳＡにおいて試験した。示すのは、２回の個々の実験の平均およびＳＤである。

【図13】ヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃに対するＦＲＫ１３．７抗体の平衡結合。ＥＬＩＳＡにおいて、ｈｕＴＮＦＲ１−Ｆｃへの結合に関して、増加する濃度を試験した（ｎ＝３、平均±ＳＤ）。

【図14】ｓｃＦｖＦＲＫ１３．７由来のＩｇＧおよびＦａｂのＱＣＭ分析。水晶振動子マイクロバランスを用いて、ヒトＴＮＦＲ１−ＦｃとＡＴＲＯＳＡＢ（ａ）、ＦａｂＡＴＲ（ｂ）、ＩｇＧ１３．７（ｃ）およびＦａｂ１３．７（ｄ）の相互作用のリアルタイム動力学データを収集した。分析したのは、６４ｎＭ〜４ｎＭ（ＡＴＲＯＳＡＢおよびＩｇＧ１３．７）または１２８ｎＭ〜８ｎＭ（ＦａｂＡＴＲおよびＦａｂ１３．７）の間の濃度の３つ組であった。

【図15】ＦＲＫ１３．７抗体の生物活性。ＦＲＫ１３．７抗体形式によって誘発される、ＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−８放出を、ＨｅＬａ細胞からのＩＬ−６放出（ｃ）とともに、ａおよびｂ（低および非アゴニスト性構築物を示すために増加したサイズで）に示す。ＴＮＦ、ＡＴＲＯＳＡＢおよびＦａｂＡＴＲＯＳＡＢ（ＦａｂＡＴＲ）は対照として働いた。提示するのは、２回の個々の実験の平均およびＳＤである。

【図16】Ｆａｂ１３．７によるＴＮＦ誘導性インターロイキン放出の阻害。提示するのは、０．１ｎＭ ＴＮＦによって誘導されたＩＬ−８（ａ）およびＩＬ−６放出（ｂ）の阻害である。ＡＴＲＯＳＡＢおよびＦａｂＡＴＲＯＳＡＢ（ＦａｂＡＴＲ）は対照として働いた。提示するのは、３回の個々の実験の平均およびＳＤである。

【図17】Ｋｙｍ−１細胞傷害性の誘導および阻害。残った接着細胞（ａ）のＫＶ染色によって、ＩｇＧ１３．７およびＦａｂ１３．７がＫｙｍ−１細胞において細胞死を誘発する潜在能力を分析した。同じアッセイにおいて、０．０１ｎＭ ＴＮＦによって誘導される細胞傷害性をＦａｂ１３．７が阻害する阻害潜在能力を分析した（ｂ）。ＡＴＲＯＳＡＢおよびＦａｂＡＴＲは対照として働いた。提示するのは、２〜３回の個々の実験の平均およびＳＤである（細胞傷害性の刺激［ａ］ｎ＝２、阻害［ｂ］ｎ＝３）。

【図18】ＡＴＲＯＳＡＢおよびＦａｂ１３．７の架橋。Ｆａｂ３．７へのＦａｂ特異的ポリクローナルヤギ血清の濃度依存性結合を、ＥＬＩＳＡによって示した（ａ）。ＩＬ−８放出アッセイにおいて、６４μｇ／ｍｌのＦａｂ特異的ヤギ血清を用いて、ＡＴＲＯＳＡＢと比較して、ＨＴ１０８０に対する架橋Ｆａｂ１３．７の影響を分析した（ｎ＝２、平均±ＳＤ）。

【図19】Ｆａｂ１３．７およびＦａｂＡＴＲの薬物動態学的研究。ＡＴＲＯＳＡＢの単回用量注射（２５μｇ）の初期および終期血漿半減期、ならびに生物学的利用能（曲線下面積）を、マウス遺伝子の遺伝子座で、ヒトＴＮＦＲ１の細胞外ドメインをホモ接合性に所持するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３）を用いて、決定した。血清試料中に残る活性抗体をＥＬＩＳＡによって検出した。

【図20】Ｆａｂ１３．７_ＰＥＧの産生および生物活性。ａ）Ｆａｂ１３．７ＰＥＧの遺伝子型。ｂ）精製タンパク質のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）での修飾を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％、クーマシー染色）によって分析した。多様なＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン）濃度および異なる長さのＰＥＧ鎖（５ｋＤａ、２０ｋＤａ、４０ｋＤａ）を用いた。ｃ）ヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃへの結合に関して、ＥＬＩＳＡによってＦａｂ１３．７_ＰＥＧを試験した（ｎ＝３、平均±ＳＤ）。ｄ）Ｆａｂ１３．７_ＰＥＧによって誘発されるＨｅＬａ細胞からのＩＬ−６放出、ならびに０．１ｎＭ組換えヒトＴＮＦを用いたＴＮＦ誘導性ＩＬ−６放出の阻害を分析した（ｅ、ｎ＝３、平均±ＳＤ）。ｆ）Ｆａｂ１３．７_ＰＥＧ、ならびに参照タンパク質Ｆａｂ１３．７およびＡＴＲＯＳＡＢの単回用量注射（２５μｇ）後の初期および終期血漿半減期、ならびに生物学的利用能（曲線下面積）を、マウス遺伝子の遺伝子座で、ヒトＴＮＦＲ１の細胞外ドメインをホモ接合性に所持するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３）を用いて、決定した。血清試料中に残る活性抗体をＥＬＩＳＡによって検出した。

【図21】Ｆａｂ１３．７−ＭＳＡの産生および生物活性。ａ）Ｆａｂ１３．７−ＭＳＡの遺伝子型。ｂ）精製タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％、クーマシー染色）によって、そして続いてＳＥＣ（ｃ、Ｙａｒｒａ ＳＥＣ−２０００カラム、流速０．５ｍｌ／分）によって分析した。ｄ）ヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃへの結合に関して、ＥＬＩＳＡによってＦａｂ１３．７−ＭＳＡを試験した（ｎ＝２、平均±ＳＤ）。ｅ）Ｆａｂ１３．７−ＭＳＡによって誘発されるＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−８放出（ｎ＝１、２つ組の平均±ＳＤ）、ならびに０．１ｎＭ組換えヒトＴＮＦを用いたＴＮＦ誘導性ＩＬ−８放出の阻害を分析した（ｆ、ｎ＝２、平均±ＳＤ）。ｇ）Ｆａｂ１３．７−ＭＳＡ、ならびに参照タンパク質Ｆａｂ１３．７およびＡＴＲＯＳＡＢの単回用量注射（２５μｇ）後の初期および終期血漿半減期、ならびに生物学的利用能（曲線下面積）を、マウス遺伝子の遺伝子座で、ヒトＴＮＦＲ１の細胞外ドメインをホモ接合性に所持するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３）を用いて、決定した。血清試料中に残る活性抗体をＥＬＩＳＡによって検出した。

【図22】ＩｇＧ１３．７_ハーフの産生および生物活性。ａ）ＩｇＧ１３．７_ハーフの遺伝子型。ｂ）精製タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％、クーマシー染色）によって、そして続いてＳＥＣ（ｃ、Ｙａｒｒａ ＳＥＣ−２０００カラム、流速０．５ｍｌ／分）によって分析した。ｄ）ヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃへの結合に関して、ＥＬＩＳＡによってＩｇＧ１３．７_ハーフを試験した（ｎ＝２、平均±ＳＤ）。ｅ）ＩｇＧ１３．７_ハーフによって誘発されるＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−８放出（ｎ＝１、２つ組の平均±ＳＤ）、ならびに０．１ｎＭ組換えヒトＴＮＦを用いたＴＮＦ誘導性ＩＬ−８放出の阻害を分析した（ｆ、ｎ＝３、平均±ＳＤ）。ｇ）ＩｇＧ１３．７_ハーフ、ならびに参照タンパク質Ｆａｂ１３．７およびＡＴＲＯＳＡＢの単回用量注射（２５μｇ）後の初期および終期血漿半減期、ならびに生物学的利用能（曲線下面積）を、マウス遺伝子の遺伝子座で、ヒトＴＮＦＲ１の細胞外ドメインをホモ接合性に所持するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３）を用いて、決定した。血清試料中に残る活性抗体をＥＬＩＳＡによって検出した。

【図23】Ｆａｂ１３．７−Ｆｃ_ｋｉｈ０ＤＳの産生および生物活性。ａ）Ｆａｂ１３．７−Ｆｃ_ｋｉｈ０ＤＳの遺伝子型。ｂ）精製タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％、クーマシー染色）によって、そして続いてＳＥＣ（ｃ、Ｙａｒｒａ ＳＥＣ−３０００カラム、流速０．５ｍｌ／分）によって分析した。ｄ）ヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃへの結合に関して、ＥＬＩＳＡによってＦａｂ１３．７−Ｆｃ_ｋｉｈ０ＤＳを試験した（ｎ＝２、平均±ＳＤ）。ｅ）Ｆａｂ１３．７−Ｆｃ_ｋｉｈ０ＤＳによって誘発されるＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−８放出（ｎ＝２、平均±ＳＤ）、ならびに０．１ｎＭ組換えヒトＴＮＦを用いたＴＮＦ誘導性ＩＬ−８放出の阻害を分析した（ｆ、ｎ＝３、平均±ＳＤ）。ｇ）Ｆａｂ１３．７−Ｆｃ_ｋｉｈ０ＤＳ、ならびに参照タンパク質Ｆａｂ１３．７およびＡＴＲＯＳＡＢの単回用量注射（２５μｇ）後の初期および終期血漿半減期、ならびに生物学的利用能（曲線下面積）を、マウス遺伝子の遺伝子座で、ヒトＴＮＦＲ１の細胞外ドメインをホモ接合性に所持するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３）を用いて、決定した。血清試料中に残る活性抗体をＥＬＩＳＡによって検出した。

【図24】Ｆｖ１３．７−Ｆｃ_ｋｉｈ０ＤＳの産生および生物活性。ａ）Ｆｖ１３．７−Ｆｃ_ｋｉｈ０ＤＳの遺伝子型。ｂ）精製タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％、クーマシー染色）によって、そして続いてＳＥＣ（ｃ、Ｙａｒｒａ ＳＥＣ−３０００カラム、流速０．５ｍｌ／分）によって分析した。ｄ）ヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃへの結合に関して、ＥＬＩＳＡによってＦｖ１３．７−Ｆｃ_ｋｉｈ０ＤＳを試験した（ｎ＝１、２つ組の平均±ＳＤ）。ｅ）Ｆｖ１３．７−Ｆｃ_ｋｉｈ０ＤＳによって誘発されるＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−８放出（ｎ＝２、平均±ＳＤ）、ならびに０．１ｎＭ組換えヒトＴＮＦを用いたＴＮＦ誘導性ＩＬ−８放出の阻害を分析した（ｆ、ｎ＝２、平均±ＳＤ）。ｇ）Ｆｖ１３．７−Ｆｃ_ｋｉｈ０ＤＳ、ならびに参照タンパク質Ｆａｂ１３．７およびＡＴＲＯＳＡＢの単回用量注射（２５μｇ）後の初期および終期血漿半減期、ならびに生物学的利用能（曲線下面積）を、マウス遺伝子の遺伝子座で、ヒトＴＮＦＲ１の細胞外ドメインをホモ接合性に所持するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３）を用いて、決定した。血清試料中に残る活性抗体をＥＬＩＳＡによって検出した。

【図25-1】抗体配列（配列番号１〜３３）： 配列番号１：Ｈ３９８またはＡＴＲＯＳＡＢのＣＤＲＨ１； 配列番号２：Ｈ３９８またはＡＴＲＯＳＡＢのＣＤＲＨ２； 配列番号３：Ｈ３９８またはＡＴＲＯＳＡＢのＣＤＲＨ３； 配列番号４：Ｈ３９８またはＡＴＲＯＳＡＢのＣＤＲＬ１； 配列番号５：Ｈ３９８またはＡＴＲＯＳＡＢのＣＤＲＬ２； 配列番号６：Ｈ３９８またはＡＴＲＯＳＡＢのＣＤＲＬ３； 配列番号７：配列番号２のＣＤＲＨ２変異体； 配列番号８：配列番号６のＣＤＲＬ３変異体； 配列番号９：ＣＤＲＨ２変異体ＩＧ１１； 配列番号１０：ＣＤＲＨ２変異体Ｔ１２ＢまたはＦａｂ１３．７； 配列番号１１：ＣＤＲＬ３変異体Ｔ１２Ｂ； 配列番号１２：ＩＧ１１のＶＨ配列； 配列番号１３：Ｔ１２Ｂまたは１３．５または１３．７のＶＨ配列

【図25-2】図２５（続き）。 配列番号１４：１３．１または１３．３または１３．６のＶＨ配列； 配列番号１５：１３．２または１３．４または１３．８のＶＨ配列； 配列番号１６：ＩＧ１１のＶＬ配列； 配列番号１７：Ｔ１２Ｂまたは１３．６または１３．８のＶＬ配列； 配列番号１８：１３．１または１３．４または１３．５のＶＬ配列； 配列番号１９：１３．２または１３．３または１３．７のＶＬ配列； 配列番号２０：ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１のＶＨ配列； 配列番号２１：ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１のＶＬ配列； 配列番号２２：ＡＴＲＯＳＡＢ ＶＨ； 配列番号２３：ＡＴＲＯＳＡＢ ＶＬ； 配列番号２４：ヒトＩｇＧ Ｆｃ

【図25-3】図２５（続き）。 配列番号２５：Ｆａｂ１３．７の重鎖； 配列番号２６：Ｆａｂ１３．７の軽鎖； 配列番号２７：Ｆａｂ１３．７_ＰＥＧの重鎖； 配列番号２８：Ｆａｂ１３．７−ＭＳＡの重鎖； 配列番号２９：ＩｇＧ１３．７_ハーフの重鎖

【図25-4】図２５（続き）。 配列番号３０：Ｆｄ１３．７−Ｆｃ０ＤＳ； 配列番号３１：ＬＣ１３．７−Ｆｃ０ＤＳ； 配列番号３２：ＶＨ１３．７−Ｆｃ０ＤＳ； 配列番号３３：ＶＬ１３．７−Ｆｃ０ＤＳ； 配列番号３４：ＰＥＧを挿入するＦａｂ１３．７修飾； 配列番号３５：ヒンジ_０ＤＳ； 配列番号３６：ｓｃＦｖＦＲＫ１３．７のＦＲ１に導入された配列

【図25-5】図２５（続き）。 配列番号３７：ｓｃＦｖＦＲＫ１３．７のＦＲ１に導入された配列； 配列番号３８：ｓｃＦｖＦＲＫ１３．７のＦＲ３に導入された配列； 配列番号３９：ＦＲＫ１３．１およびＦＲＫ１３．２のＦＲ１に導入された配列； 配列番号４０：ＦＲＫ１３．１およびＦＲＫ１３．２のＦＲ３に導入された配列； 配列番号４１：ＦＲＫ１３．１およびＦＲＫ１３．２のＦＲ３に導入された配列； 配列番号４２〜４４：修飾ヒンジ領域

【発明を実施するための形態】

【0078】

本明細書で用いる命名法は、以下の意味を有するものとする：
ＶＨ ＣＤＲ１＝ＣＤＲＨ１
ＶＨ ＣＤＲ２＝ＣＤＲＨ２
ＶＨ ＣＤＲ３＝ＣＤＲＨ３
ＶＬ ＣＤＲ１＝ＣＤＲＬ１
ＶＬ ＣＤＲ２＝ＣＤＲＬ２
ＶＬ ＣＤＲ３＝ＣＤＲＬ３
別に示さない限り、本明細書において、ＣＤＲ配列、特に図に列挙するようなＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔにしたがって番号付けられたもの、すなわちＫａｂａｔの命名法にしたがって決定されたものとして言及する（Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版 Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ． （１９９１）を参照されたい）。本発明および請求項の範囲はまた、同じ抗体およびＣＤＲを含むが、ＣＤＲ領域がＩＭＧＴ系（Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ， Ｌｅｆｒａｎｃら， １９９９， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７： ２０９−２１２）にしたがって定義されている場合、異なる番号付けおよび指定ＣＤＲ領域を伴うことがよく理解される。

【0079】

発明の詳細な説明
本発明を記載する文脈において（特に以下の請求項の文脈において）、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに類似の指示語の使用は、本明細書において別に示さない限りまたは文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を含むと見なされるものとする。

【0080】

用語「含む」、「有する」、「含まれる」、および「含有する」は、別に明記されない限り、無制限の用語（すなわち「限定されるわけではないが、含む」）と見なされるものとする。本発明の目的のため、用語「からなる」は、用語「含む」の好ましい態様であると見なされる。本明細書において、今後、群が、少なくとも特定の数の態様を含むと定義される場合、好ましくは、これらの態様のみからなる群もまた含むことが意味される。

【0081】

本明細書において、「阻害剤」は、「抗体構築物」または「抗体」と記載される。本明細書においてまた、単純に「抗体」または「本発明の抗体」とも称される、用語「抗体構築物」は、ｈｕＴＮＦＲ１ターゲットに一価で結合するよう操作された人工的構築物であるか、または天然存在抗体を断片に切断することによって得られた、非天然存在抗体を指すものとする。この目的に向け、用語「抗体」は、リンカー配列を含みまたは含まず、免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の定常および／または可変ドメインと理解される、抗体ドメインからなるかまたは該ドメインを含む、ポリペプチドまたはタンパク質を含むと理解される。ポリペプチドは、ループ配列によって連結された抗体ドメイン構造の少なくとも２つのベータ鎖からなるベータ−バレル構造を含む場合、抗体ドメインと理解される。抗体ドメインは、天然構造であってもよいし、あるいは突然変異誘発または誘導体化によって、例えば抗原結合特性または任意の他の特性、例えば安定性もしくは機能特性、例えばＦｃ受容体ＦｃＲｎおよび／またはＦｃガンマ受容体への結合を修飾するように修飾されていてもよい。

【0082】

抗体構築物は、本明細書において、少なくとも１つの抗原結合部分を含み、抗体の１つの抗原結合のみがｈｕＴＮＦＲ１ターゲットを認識する。したがって、ｈｕＴＮＦＲ１受容体への抗体構築物の結合は、一価のみである。特に、抗原結合部分は、抗原結合部位または抗原結合部位を所持する抗体ドメインを含む。可変抗体ドメインはいずれも、単独でまたは組み合わせて、抗原結合部位を構築するために使用されることも可能である。特に、抗原結合部位は、ＣＤＲ配列の組み合わせによって形成される。ＣＤＲ配列のこうした組み合わせはまた、ＣＤＲ結合部位、例えば１つの可変ドメインの３つのＣＤＲ配列、例えばＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３の組み合わせ、またはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３の組み合わせ、またはそうでなければ２つの可変ドメインの６つのＣＤＲ配列、例えばＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３の組み合わせによって形成される抗原結合ポケットと理解される。あるいは、受容体に対する天然リガンドから得られたか、または人工的構築物である、抗原結合部位が使用可能である。

【0083】

特に、単一可変抗体ドメインのＣＤＲ結合部位を、抗原結合部位、例えば可変領域の重鎖および軽鎖のドメインの結合部位（例えばｄＡｂ、Ｆｄ、ＶＬ、Ｖカッパ、Ｖラムダ、ＶＨ、ＶＨＨ）、または可変抗体ドメイン対、例えばＶＨ／ＶＬ対の結合部位として用いることも可能である。

【0084】

したがって、ＣＤＲ結合部位を含む抗体構築物は、単一可変抗体ドメイン、または可変結合ドメインの対を含むことも可能であり、そして場合によって他の可変ドメインであるが異なる抗原結合特異性を持つものをさらに含み、すなわち二重特異性または多重特異性抗体構築物であり、１つの抗原結合部位のみがｈｕＴＮＦＲ１に向けられ、そして少なくとも１つの別の抗原結合部位がｈｕＴＮＦＲ１とは異なるターゲットに向けられており、これは、本明細書にさらに記載されるような抗体構築物が、ｈｕＴＮＦＲ１ターゲットに一価のみで結合するためである。場合によって、抗体構築物は、定常抗体ドメイン、または可変および／または定常抗体ドメインの組み合わせを、連結配列またはヒンジ領域を伴いまたは伴わずに、さらに含む。例示的な抗体構築物は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）_２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、または全長抗体である。

【0085】

例示的な一価、単一特異性結合剤は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ドメイン抗体、ＩｇＧハーフ抗体、または一価ＩｇＧ、例えば完全軽鎖、１つの完全重鎖、および重鎖のホモ二量体化を回避するように、ノブ・イントゥ・ホール技術にしたがって産生可能であるＦｄ（Ｆｄ＝ＶＨ−ＣＨ１）を欠くさらなるＦｃ鎖（または他の非対称Ｆｃ部分）からなる１アームＩｇＧである。

【0086】

１つの価のみがＴＮＦＲ１ターゲットを認識し、そしてもう一方の価は異なるターゲットを認識する、二価形式もまた使用可能である。したがって、１つの抗原結合部位のみがＴＮＦＲ１受容体に向けられる限り、２またはそれより多い抗原結合部位を含む二重特異性またはオリゴ特異性構築物を使用することも可能である。

【0087】

用語「全長抗体」は、天然存在抗体単量体において一般的にみられるＦｃドメインの少なくとも大部分および他のドメインを含む、任意の二価抗体分子を指すよう用いられる。この句は、本明細書において、特定の抗体分子が抗体断片ではないことを強調するために用いられる。

【0088】

用語「Ｆｖ」は、本明細書において、例えばＶＨ、ＶＬまたはＶＨ／ＶＬの、ＣＤＲ結合部位を取り込む、可変ドメインの領域と理解される。用語「Ｆｖ」は、したがって、特に、ＶＨ、ＶＬ、あるいはリンカーを伴いまたは伴わず、両可変ドメインのベータ−シート構造間の相互作用によって、ＶＬドメインに会合したＶＨドメインである、ＶＨ／ＶＬのいずれかに当てはまる。

【0089】

さらに、用語「抗体」には特に、異なるターゲット抗原に対して向けられる他の抗体を実質的に含まないか、または抗体ドメインの異なる構造配置を含む、単離型の抗体が含まれるものとする。しかし、単離抗体は、例えば少なくとも１つの他の抗体、例えば異なる特異性を有するモノクローナル抗体または抗体断片、あるいはさらなる療法的活性物質および／または補助剤の組み合わせと、単離抗体の組み合わせを含有する、組み合わせ調製物中に含まれることも可能である。

【0090】

用語「抗体」は、ヒト種を含む、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、ラマ、ウシおよびウマを含む哺乳動物、あるいは雌鶏などの鳥類を含む、動物起源の抗体に適用されるものとし、この用語には、特に、動物起源の配列、例えばヒト配列に基づく組換え抗体が含まれるものとする。特に、該用語は、ヒト化またはヒト配列を含むかまたはこうした配列からなる抗体構築物に適用され、これは、抗体構築物が、ヒト被験体を治療する薬学的目的のために提供される場合に好ましい。

【0091】

いくつかの態様において、異なる種の起源の配列、例えばネズミおよびヒト起源の配列を含む、キメラ抗体を用いることも可能である。
用語「キメラ」は、抗体に関して用いた場合、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列各々の１つの部分が、特定の種由来のまたは特定のクラスに属する抗体における対応する配列と相同である一方、鎖の残りのセグメントが、別の種またはクラスにおける対応する配列に相同である抗体を指す。典型的には、軽鎖および重鎖両方の可変領域は、哺乳動物の１つの種由来の抗体の可変領域を模倣する一方、定常部分は、別の種由来の抗体の配列に相同である。例えば、可変領域は、例えばヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせて、非ヒト宿主生物由来の容易に入手可能なＢ細胞またはハイブリドーマを用いた、現在知られる供給源に由来することも可能である。

【0092】

用語「ヒト化」は、抗体に関して用いる場合、非ヒト種由来の免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有し、分子の残りの免疫グロブリン構造がヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメイン上に融合される完全可変ドメイン、または可変ドメインの適切なフレームワーク領域上に移植される相補性決定領域（ＣＤＲ）のみのいずれかを含むことも可能である。抗原結合部位は、野生型であるか、あるいは例えば１またはそれより多いアミノ酸置換によって修飾される、好ましくはより緊密にヒト免疫グロブリンに似るように修飾されることも可能である。ヒト化抗体のいくつかの型は、すべてのＣＤＲ配列を保持する（例えばマウス抗体由来の６つすべてのＣＤＲを含有するヒト化マウス抗体）。他の型は、元来の抗体に関して改変されている１またはそれより多いＣＤＲを有する。

【0093】

抗体が望ましい抗原に結合する限り、抗体のヒト化技術に関して限定はない。ヒト化の例には、限定なしに、相補性決定領域移植（ＣＤＲ移植）（Ｊｏｎｅｓら １９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３２１， ５２２−５２５）、特異性決定残基移植（ＳＤＲ移植）（Ｋａｓｈｍｉｒｉら， ２００５， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６， ２５−３４）、可変ドメインのリサーフェシング（Ｒｏｇｕｓｋａら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ９６９−９７３）、構造に基づく選択およびＣＤＲ移植によるヒト化（Ｈｗａｎｇら， ２００５， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６， ３５−４２）、および脱免疫化戦略（Ｈｅｌｌｅｎｄｏｍら， ２００４， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ４（補遺Ｉ）， ２０）が含まれる。

【0094】

本発明の特定の態様において、本明細書記載の抗体は、ヒト起源のアミノ酸配列および非ヒト起源、例えば齧歯類起源のアミノ酸配列を含有する、ヒト化抗体である。
好ましい態様において、本明細書記載の抗体は、例えば組換え核酸技術によって得られうるヒト化抗体由来のＦｃ領域を含むことも可能である。これに関連して、抗体またはその少なくとも１つの断片は、ｈｕＴＮＦＲ１との相互作用に対して負の影響がない限り、１またはそれより多い突然変異または変異、例えば付加、欠失または置換されたアミノ酸または核酸を含有することも可能である。さらに、抗体は、ｈｕＴＮＦＲ１の相互作用に対して正の影響を有し、そして前記分子のアンタゴニスト活性を改善する、１またはそれより多い突然変異または変異、例えば付加、欠失または置換されたアミノ酸または核酸を含有することも可能である。特に、こうした突然変異変異体は、より優れたアフィニティおよび／またはより優れた阻害活性を有する。

【0095】

例えば、抗体は、ネズミ抗体Ｈ３９８と同じ結合特異性を有するが、ターゲットｈｕＴＮＦＲ１に一価で結合する、ヒト化抗体であることも可能であり、そして好ましくは、Ｈ３９８抗体を親抗体として用いて、Ｈ３９８に由来する。好ましくは結合特異性は同じであるが、ヒト化または他の突然変異技術のため、細かい特異性は変化している可能性もある。

【0096】

マウス抗ヒトＴＮＦＲ１モノクローナル抗体Ｈ３９８は、ＷＯ２００８１１３５１５Ａ２に示されるようなＶＨおよびＶＬ配列によって特徴付けられる。ヒト化に際して、ＷＯ２００８１１３５１５Ａ２に示されるような配列によって特徴付けられる、ヒト化ＶＨおよびＶＬ配列が得られた（ＩＺＩ−０６．１ ＶＨ（配列番号２０）、ＩＺＩ−０６．１ ＶＬ（配列番号２１））。ヒト化抗体は、エフェクター機能を仲介することができず、そしてなおＩＺＩ−０６．１ ＶＨおよびＩＺＩ−０６．１ ＶＬのＶＨおよびＶＬ配列によって特徴付けられる、修飾Ｆｃ領域を含有するＩｇＧ１分子（ＡＴＲＯＳＡＢ）に変換されている。ＷＯ２００８１１３５１５Ａ２の配列は、本明細書に援用される。

【0097】

ＣＨＯ細胞において産生された精製ＡＴＲＯＳＡＢは、ヒトおよびアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）ＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合タンパク質、ならびに組換えＴＮＦＲ１融合タンパク質でトランスフェクションされたマウス胚性線維芽細胞に、親マウス抗体Ｈ３９８と同一のアフィニティの強い結合を示した。キメラヒト／マウスＴＮＦＲ１分子を用いて、ＡＴＲＯＳＡＢのエピトープは、最初のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ１）およびＣＲＤ２のＡ１サブドメインを含む、Ｎ末端領域（アミノ酸残基１〜７０）にマッピングされた。ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＡＴＲＯＳＡＢは、アポトーシス誘導、ならびにＮＦκＢ依存性遺伝子発現、例えばＩＬ−６およびＩＬ−８産生の活性化のような、典型的なＴＮＦ仲介性反応を有効に阻害した。

【0098】

Ｈ３９８またはＡＴＲＯＳＡＢ抗体は、高アビディティであるが、生理学的条件でＱＣＭにより、Ｆａｂ形式（例えば抗原結合部位がそれぞれのＦａｂ断片の形で提供される場合）に関して測定した際、中程度のアフィニティによって特徴付けられるため、ＴＮＦＲ１に対するアフィニティを増加させることによって、療法潜在能力を改善することが目的であった。しかし、ＡＴＲＯＳＡＢのアフィニティ成熟に際して、より高いアフィニティでＴＮＦＲ１に結合する完全な二価誘導体は、非常にアゴニスト性であり、これは患者の治療に問題を課すことが判明した。

【0099】

本明細書記載の抗体は、一価でターゲットに結合し、そしてそれによって驚くべきことに、受容体からの抗体の解離が低い（低ｋ_оｆｆ速度）場合であってさえ、高アフィニティでのアゴニスト活性のこうした問題を克服する。

【0100】

好ましくは、本明細書記載の抗体は、ｈｕＴＮＦＲ１の少なくとも膜遠位ＣＲＤ１およびＣＤＲ２のサブドメインＡ１を含むか、または本質的にこれらからなるエピトープに結合する特異性を有する。

【0101】

特定の態様において、本明細書記載の抗体は、ｈｕＴＮＦＲ１への結合を与える、ＷＯ２００８／１１３５１５Ａ２に記載されるようなＨ３９８の相補性決定領域（ＣＤＲ）、またはその部分の１またはそれより多くを含む。Ｈ３９８またはＡＴＲＯＳＡＢのＣＤＲは、任意の組み合わせで存在可能であり、例えば２、３、４、５または６の前記ＣＤＲが存在可能である。さらに、抗体がヒトＴＮＦＲ１に対する十分なアフィニティを示す限り、任意のＣＤＲの多数のコピーまたは遺伝子変異体が、本明細書記載のｈｕＴＮＦＲ１抗体に存在可能である。

【0102】

用語「ヒト」は、抗体に関して用いた際、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する抗体が含まれると理解される。本明細書記載のヒト抗体には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えばランダムまたは部位特異的突然変異誘発によってｉｎ ｖｉｔｒｏで、あるいはｉｎ ｖｉｖｏの体細胞突然変異によって導入された突然変異）が、例えばＣＤＲ中に、含まれることも可能である。ヒト抗体には、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、あるいは１またはそれより多いヒト免疫グロブリンに関して遺伝子導入された動物から単離された抗体が含まれる。

【0103】

用語「抗体」には、特に、任意のクラスまたはサブクラスの抗体が含まれる。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体は、抗体ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの主要なクラスに割り当てられることも可能であり、そしてこれらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けられることも可能である。

【0104】

該用語はさらに、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、特に組換え抗体にもさらに適用され、該用語には、組換え手段によって調製されるか、発現されるか、生成されるかまたは単離されるすべての抗体および抗体構造が含まれ、例えば異なる起源、例えばネズミ、キメラ、ヒト化抗体またはハイブリドーマ由来抗体由来の遺伝子または配列を含む、動物、例えばヒトを含む哺乳動物から生じる抗体が含まれる。さらなる例は、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、あるいは抗体または抗体ドメインの組換えコンビナトリアルライブラリーから単離される抗体、あるいは抗体遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む、任意の他の手段によって、調製されるか、発現されるか、生成されるかまたは単離される抗体を指す。

【0105】

用語「抗体」はまた、抗体誘導体、特に機能的活性誘導体も指すことが理解される。抗体誘導体は、１またはそれより多い抗体ドメインまたは抗体および／または融合タンパク質の任意の組み合わせであって、抗体の任意のドメインが、１またはそれより多い他のタンパク質または化学薬品、例えば他の抗体、例えばＣＤＲループを含む結合構造、受容体ポリペプチドだけでなく、リガンド、足場タンパク質、酵素、毒素等の任意の位で融合しているかまたは連結されていることも可能である。抗体誘導体は、多様な化学技術、例えば共有カップリング、静電相互作用、ジスルフィド結合等によって、他の物質に会合するかまたは結合することによって得られうる。抗体に結合している他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機および無機分子またはその任意の組み合わせ、例えばプロドラッグまたは薬剤であることも可能である。特定の態様は、親水性ポリマー、例えばＰＥＧにカップリングした抗体構築物の機能的活性誘導体を得るための親水性ポリマーへの抗体の結合、および／またはポリペプチド、例えばヒト血清アルブミン、トランスフェリン、Ｉｇ結合ドメイン、ＰＥＧ模倣ポリペプチド伸長、抗体Ｆｃ断片、または前述のポリペプチドのいずれかの機能的変異体への融合を指す。こうした機能的活性誘導体は、例えば、ＰＥＧ化、ＨＥＳ化、またはＰＳＡ化抗体構築物である。こうした抗体構築物は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、グリコシル化ＰＥＧ、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ化）、またはポリシアル酸（ＰＳＡ）などの半減期延長部分への連結によって修飾される。特に、誘導体は、半減期延長部分の１またはそれより多い分子の共有結合によって産生される。

【0106】

特定の側面にしたがって、本明細書記載の抗体構築物は、ヒトＩｇＧ Ｆｃの天然存在変異体（配列番号２４）のいずれかに由来する、機能的活性Ｆｃ変異体を含む。
機能的活性Ｆｃ変異体は、上記配列を変化させることによって得られることが可能であり、そして抗体を安定化させるかまたは半減期延長を与える能力を含む、それぞれの配列によって示されるものと類似の生物学的活性を有することによって特徴付けられる。好ましいＦｃ変異体は、本明細書記載の抗体において用いた際、Ｆｃエフェクター機能を減少させる突然変異を含む。

【0107】

機能的活性誘導体は、特に、抗体自体の一次アミノ酸配列を改変しない融合または共有化学修飾によって産生される。誘導体は、例えば、循環半減期を延長するか、安定性を増加させるか、クリアランスを減少させるか、または免疫原性を改変することを含む、望ましい特性を有することも可能である。

【0108】

本発明の特定の態様において、ｈｕＴＮＦＲ１抗体は、生物学的に許容されうる化合物との特異的相互作用を可能にするさらなるタグを含む。ヒトに投与した際に、ｈｕＴＮＦＲ１へのｈｕＴＮＦＲ１抗体の一価結合または免疫原性反応に、まったく負の影響がないか、許容されうる負の影響しかない限り、本発明において使用可能なタグには、特に制限はない。適切なタグの例には、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、カルモジュリンタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、およびＳタグが含まれる。

【0109】

本明細書記載の抗体は、例えば有機分子、酵素標識、放射性標識、着色標識、蛍光標識、色素原標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属、コロイド性金およびその混合物からなる群より選択される、標識またはレポーター分子にコンジュゲート化されることも可能である。標識またはレポーター分子にコンジュゲート化された抗体を、例えばアッセイ系または診断法において、使用することも可能である。

【0110】

本明細書記載の抗体は、前記コンジュゲートの、例えば結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）および結合研究における単純な検出を可能にする、他の分子にコンジュゲート化されることも可能である。

【0111】

用語「抗体」はまた、親ＣＤＲ配列の機能的活性ＣＤＲ変異体を含む抗体、および親抗体の機能的活性変異体抗体を含む、抗体変異体も指すことが理解される。
特に、本明細書において、そのＣＤＲ配列によって、そして場合によってそのＶＨおよび／またはＶＬ配列によって例示されるような抗体に由来する抗体が使用可能である。したがって、例示される抗体は、１またはそれより多いＣＤＲ領域またはＣＤＲ変異体が、機能的活性を維持しながら産生される誘導体を得るための親抗体として働くことも可能である。

【0112】

親抗体または抗体配列、例えば親ＣＤＲまたはＦＲ配列由来の抗体は、本明細書において、特に、例えばｉｎ ｓｉｌｉｃｏまたは組換え操作あるいは化学誘導体化または合成によるその他のものによって得られる、親配列の突然変異体または変異体と理解される。

【0113】

特に、本明細書に記載するような抗体由来の抗体は、機能的に活性でありつつ、ＣＤＲまたはＦＲ領域の少なくとも１つに、あるいはＨＣまたはＬＣの定常領域に、少なくとも１つの点突然変異を含む、ＣＤＲ領域またはそのＣＤＲ変異体の少なくとも１またはそれより多く、例えば重鎖可変領域の少なくとも３のＣＤＲおよび／または軽鎖可変領域の少なくとも３のＣＤＲを含むことも可能である。

【0114】

用語「変異体」は、特に例えば当該技術分野において利用可能なアフィニティ成熟技術によって、例えば抗体安定性、エフェクター機能または半減期を操作するために定常ドメインにおいて、あるいは抗原結合特性を改善するために可変領域において、特に特定の抗体アミノ酸配列または領域内で、欠失させるか、交換するか、挿入を導入するか、あるいはアミノ酸配列を化学的に誘導体化するために、例えば突然変異誘発法によって得られる、抗体、例えば突然変異抗体または抗体の断片を指すものとする。既知の突然変異誘発法のいずれを使用してもよく、これには、望ましい位で、例えばランダム化技術によって得られる点突然変異が含まれる。いくつかの場合において、位はランダムに選択され、例えば可能なアミノ酸いずれか、または抗体配列をランダム化するために好ましいアミノ酸の選択を伴うかいずれかであってもよい。用語「突然変異誘発」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を改変するための当該技術分野に認識される任意の技術を指す。好ましいタイプの突然変異誘発には、エラープローンＰＣＲ突然変異誘発、飽和突然変異誘発、または他の部位特異的突然変異誘発が含まれる。

【0115】

用語「変異体」は、機能的活性変異体を特に含むものとする。
用語、ＣＤＲ配列の「機能的活性変異体」は、本明細書において、「機能的活性ＣＤＲ変異体」と理解され、そして抗体の「機能的活性変異体」は、本明細書において、「機能的活性抗体変異体」と理解される。機能的活性変異体は、１またはそれより多いアミノ酸の挿入、欠失または置換、あるいはアミノ酸配列における１またはそれより多いアミノ酸残基またはヌクレオチド配列内のヌクレオチド、あるいは配列の遠位のいずれかまたは両端での、例えばＣＤＲ配列におけるＮ末端および／またはＣ末端の１または２のアミノ酸での、および／または中央の１またはそれより多いアミノ酸（すなわちＣＤＲ配列の中央）での化学的誘導体化による、この配列（親抗体または親配列）の修飾から生じる配列を意味し、そしてこうした修飾は、この配列の活性に影響を及ぼさず、特にこれを損なわない。結合部位が、選択したターゲット抗原に特異性を有する場合、これは、変化させる、例えば特定のエピトープに対する細かい特異性、アフィニティ、アビディティ、Ｋ_ｏｎまたはＫ_ｏｆｆ速度等が変化するように変化する可能性もあるが、抗体の機能的活性変異体は、なお、同じかまたはあらかじめ決定した結合特異性を有するであろう。例えば、アフィニティ成熟抗体は、機能的活性変異体抗体と特に理解される。したがって、アフィニティ成熟抗体における修飾ＣＤＲ配列は、機能的活性ＣＤＲ変異体と理解される。

【0116】

好ましい態様において、親抗体の機能的活性変異体は
ａ）分子の配列の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％を含む、抗体の生物学的活性断片であり；
ｂ）少なくとも１つのアミノ酸置換、付加および／または欠失によって抗体に由来し、機能的活性変異体は、分子またはその部分に配列同一性を有し、例えば少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％そして最も好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の配列同一性の抗体であり；そして／または
ｃ）抗体またはその機能的活性変異体およびさらにポリペプチドまたはヌクレオチド配列に対して異種性である少なくとも１つのアミノ酸またはヌクレオチドからなる。

【0117】

本発明の１つの好ましい態様において、本明細書記載の抗体の機能的活性変異体は、上述の変異体と本質的に同一であるが、異なる種の相同配列に由来する点で、それぞれ、そのポリペプチドまたはヌクレオチド配列とは異なる。

【0118】

特に、本明細書に記載するような、機能的活性抗体構築物、変異体または誘導体は、ＴＮＦＲ１抗原結合に関して機能的に活性であり、特に、高アフィニティの結合（特にＫ_Ｄおよびｋ_ｏｆｆ速度によって決定されるようなもの）を示し、そしてさらに、例えば細胞に基づくアッセイにおいて決定されるように、いかなる潜在的なアゴニスト性副作用も回避するよう考慮される。ＴＮＦＲ１仲介性細胞死の阻害を決定するための例示的アッセイは、Ｋｙｍ−１細胞を使用する。ＴＮＦまたはＬＴアルファ仲介性炎症反応を決定するためのさらなる例示的アッセイは、それぞれ、ＨｅＬａ細胞またはＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−６またはＩＬ−８放出の阻害を決定する。こうしたアッセイは、実施例セクションに例示される。

【0119】

機能的活性変異体は、例えば親抗体の配列を変化させることによって得られることも可能であり、例えば図に列挙するような抗体いずれかと同じ結合部位を含むが、結合部位以外の抗体領域内に修飾を含むか、または親抗体から結合部位内の修飾によって得られるが、抗原結合を損なわず、そして好ましくは、ＴＮＦＲ１抗原に特異的にまたは選択的に、例えば高アフィニティでそして場合によって高会合および低解離によって抗原に結合する能力を含めて、親抗体と実質的に同じ生物学的活性を有するかまたはさらに改善された活性を有する。

【0120】

本明細書に記載するような抗体構築物の一次機能は、ＴＮＦ−ｈｕＴＮＦＲ１相互作用の阻害剤としての機能である。本明細書で理解されるような用語「阻害剤」は、ＴＮＦＲ１シグナル伝達の阻害または異なる機構によって、
ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでＴＮＦＲ１シグナル伝達を調節し（例えば減少させるかまたは排除し）；そして／または
ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでＴＮＦＲ１仲介性細胞死を阻害し、そして／または
ｃ）ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでＴＮＦ仲介性細胞性刺激が、炎症性サイトカインを放出することを阻害する
能力を有する物質である。こうした能力または機能は、特に、本発明にしたがって望ましい生物学的活性であると考慮される。特に、本明細書に記載するような阻害剤は、細胞表面上のＴＮＦＲ１の１またはそれより多い分子に対する、ＴＮＦの１またはそれより多い分子の結合に干渉する。療法適用のため、理論によって束縛されることなく、本発明のＴＮＦ−ｈｕＴＮＦＲ１相互作用阻害剤は、ＴＮＦの存在下でのｈｕＴＮＦＲ１シグナル伝達、またはＴＮＦの存在下でのｈｕＴＮＦＲ１仲介性細胞死を阻害する能力、あるいはＴＮＦの存在下で炎症性サイトカインを放出する細胞性刺激を阻害する能力を有することも可能である。根底にある機構とは関わりなく、炎症性障害または疾患の治療は、ＴＮＦ−ｈｕＴＮＦＲ１相互作用阻害剤の抗炎症活性によって進行可能である。ＴＮＦ−ｈｕＴＮＦＲ１タンパク質−タンパク質相互作用を下方調節するかまたは遮断することによって、炎症性疾患に対する効果を達成可能である。

【0121】

本明細書において、用語「シグナリング」および「シグナル伝達」は、特異的でそして連続した一連の分子を通じ、細胞表面受容体を介した、核中の遺伝子への細胞外刺激の伝達を伴い、刺激に対する特定の細胞性反応を生じる、生化学的プロセスを示す。

【0122】

ｈｕＴＮＦＲ１相互作用の阻害は、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞に基づくアッセイにおいて、またはｉｎ ｖｉｖｏで用量依存性方式で測定されるように、ＴＮＦＲ１シグナリングまたはシグナル伝達の影響の下方調節を導きうる。阻害剤または抗体構築物および変異体または誘導体の機能的活性は、ｅｘ ｖｉｖｏの細胞に基づくアッセイで決定されるように、ｉｎ ｖｉｖｏでＴＮＦ−ｈｕＴＮＦＲ１相互作用またはＬＴα−ｈｕＴＮＦＲ１相互作用を阻害する、阻害性機能によって特に特徴付けられる。さらなるアッセイを使用して、ＴＮＦ−ＴＮＦＲ１相互作用をアゴナイズするであろう、ＴＮＦＲ１受容体の架橋と関連する実質的な副作用を排除することも可能である。適切なアッセイは、それぞれ、炎症性サイトカインＩＬ−６またはＩＬ−８を産生する刺激活性の非存在下で、ＨｅＬａまたはＨＴ１０８０細胞に対する抗体または変異体の活性を決定する。例示的な試験は、以下の実施例セクションに記載される。

【0123】

阻害は、典型的には、ｈｕＴＮＦＲ１相互作用または活性の影響の、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または最大レベルの減少を導く。本明細書記載の阻害剤または抗体を産生しそして特徴付けるための方法は、当該技術分野に周知である。好ましい態様において、抗体変異体は、ｈｕＴＮＦＲ１発現細胞を使用した１またはそれより多い細胞に基づくアッセイ、あるいはｉｎ ｖｉｖｏアッセイを用いて、産生され、そしてあらかじめ定義された特性に関してスクリーニングされる。こうしたアッセイに関して、細胞が結合され、例えばＴＮＦの存在下および非存在下で、アンタゴニストおよびアゴニスト活性を決定可能であるように、抗体は典型的には外因性に添加される。これらのアッセイは、典型的には、免疫グロブリンの機能に基づき；すなわち抗体がｈｕＴＮＦＲ１に結合し、そして何らかの生化学的事象、例えば競合結合アッセイにおける前記細胞へのＴＮＦ結合の遮断、ＴＮＦ／受容体結合阻害、ＴＮＦの存在下または非存在下でのサイトカイン発現の減少、特に炎症性インターロイキン、例えばＩＬ−６またはＩＬ−８、アポトーシス等を仲介する。

【0124】

こうしたアッセイは、しばしば、抗体に対する細胞の反応、例えば細胞生存、細胞死、細胞形態の変化、あるいは転写活性化、例えば天然遺伝子またはレポーター遺伝子の細胞発現の監視を伴う。いくつかのアッセイに関して、ターゲット細胞に加えて、さらなる細胞または構成要素、例えば血清補体、またはエフェクター細胞、例えば末梢血単球（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、マクロファージ等が添加される必要がありうる。こうしたさらなる細胞は、任意の生物、好ましくはヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサル由来であることも可能である。

【0125】

細胞死または生存を監視するための方法は当該技術分野に知られ、そしてこれには、色素、免疫化学試薬、細胞化学試薬、および放射性試薬の使用が含まれる。例えば、カスパーゼ染色アッセイは、アポトーシスが測定されることを可能にし、そして放射性物質または蛍光色素、例えばアラマーブルーの取り込みまたは放出は、細胞増殖または活性化が監視されることを可能にする。

【0126】

転写活性化はまた、細胞に基づくアッセイにおいて機能をアッセイするための方法としても働きうる。この場合、上方制御されうる天然遺伝子または免疫グロブリンに関してアッセイすることによって、反応を監視することも可能であり、例えば、特定のインターロイキンの放出を測定することも可能であるし、あるいはレポーター構築物を通じて読み取ることも可能である。細胞に基づくアッセイはまた、本明細書記載の抗体の存在に対する反応として、細胞の形態学的変化の測定を伴うことも可能である。

【0127】

本明細書記載の抗体は、好ましくは、ＴＮＦアンタゴニスト活性のみを有し（特に検出可能なアゴニスト活性を持たず）、したがって、望ましくない炎症反応、アポトーシスおよび壊死、臓器不全および敗血症ショックを生じうる、循環中のＴＮＦレベル増加によって引き起こされる炎症反応を減少させる。好ましい抗体は、例えば以下の実施例にさらに記載するような試験系によって、ＴＮＦまたはＬＴアルファを半最大飽和濃度で、好ましくは、それぞれ０．０１〜０．１ｎＭの範囲のＴＮＦおよびＬＴアルファを使用した、細胞に基づくアッセイにおいて測定した際に、１００ｎＭ未満、好ましくは２０ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、最も好ましくは一桁のナノモル範囲またはそれ未満のＩＣ_５０に対応するアンタゴニスト活性を有する。

【0128】

潜在的なＴＮＦ模倣アゴニスト活性は、好ましくは、同じ細胞に基づくアッセイであるが、ＴＮＦを使用せず、例えば以下の実施例にさらに記載するような試験系によって、測定される。本明細書記載の抗体は、好ましくは、有意なアゴニスト活性を持たず、ＴＮＦの非存在下でのＨｅＬａまたはＨＴ１０８０細胞のインキュベーションが、サイトカインの誘導をまったくまたは最低限度でしか生じない、例えば抗体の少なくとも５ｎＭまたはおよそ１０ｎＭの濃度で、０．５ｎｇ／ｍｌ未満のＩＬ−６またはＩＬ−８レベル上昇しか生じない。好ましくは、サイトカイン産生はまったくないか、あるいは最低限度または負であり、これは、１０ｐｇ／１０^５細胞未満の量によって決定可能である。好ましい例において、サイトカイン発現および放出は、１８時間で２，５ｐｇ／１００．０００細胞未満である。好ましくは、したがって、アゴニスト活性は、基底レベル未満、または匹敵するＴＮＦ濃度の反応の２％未満、好ましくは同等のまたは最大のＴＮＦ反応の１％未満である。

【0129】

本明細書記載の抗体は、好ましくは、ＨｅＬａまたはＨＴ１０８０細胞のインキュベーションが、ＴＮＦの非存在下で、匹敵するＴＮＦ濃度の反応の２％未満、好ましくは同等のＴＮＦ反応の１％未満のサイトカインの最低限度の誘導しか生じない場合、有意なアゴニスト活性を持たない。

【0130】

本明細書記載の例示的な抗体が、炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−６またはＩＬ−８の発現または放出を誘発しないことが、特に立証されてきている。それによって、ＴＮＦＲ１に結合するアフィニティが高いにもかかわらず、望ましくない炎症状態または組織損傷を回避することが可能である。こうした副反応の減少は、慢性疾患を治療するための薬学的調製物を提供するために特に有用である。

【0131】

用語「実質的に同じ生物学的活性」は、本明細書において、匹敵するまたは親抗体に関して決定されるような活性と実質的に同じ活性である、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、例えば少なくとも１００％、または少なくとも１２５％、または少なくとも１５０％、または少なくとも１７５％、または例えば最大２００％、またはそれより高い活性によって示されるような活性を指す。

【0132】

本明細書に記載されるような好ましい抗体構築物は、ｈｕＴＮＦＲ１抗原結合に関して機能的に活性であり、好ましくは５ｘ１０^−９Ｍ未満、または４ｘ１０^−９Ｍ未満、または３ｘ１０^−９Ｍ未満、または２ｘ１０^−９Ｍ未満、または１０^−９Ｍ未満、または１０^−１０Ｍ未満のＫ_Ｄで、抗原に結合する高アフィニティを有する。特に、解離傾向が低く、１０^−３ｓ^−１未満、または５ｘ１０^−４ｓ^−１未満、または１０^−５ｓ^−１未満のｋ_ｏｆｆである。特に、会合傾向が高く、少なくとも１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、または１０^６Ｍ^−１ｓ^−１のｋ_ｏｎである。

【0133】

好ましい抗体変異体はなお、ｈｕＴＮＦＲ１ターゲットを特異的に認識し、アフィニティは増加している可能性があり、そして／またはより低い解離および／またはより高い会合を伴い、ターゲットに有効に結合し、そしてより長い期間に渡って、抗原−抗体相互作用を維持する可能性がある。なお、Ｋ_Ｄ、ｋ_ｏｆｆ、および／またはｋ_ｏｎ値の相違は、例えば抗体のアフィニティ成熟によって得られる、１、２、または３対数であることも可能である。

【0134】

抗体の結合アフィニティは、通常、抗原結合部位の半分が占有される、抗体の濃度に関して特徴付けられ、解離定数（ＫｄまたはＫ_Ｄ）として知られるものである。通常、結合剤は、Ｋ_Ｄ＜１０^−８Ｍで高アフィニティ結合剤と見なされ、いくつかの場合、例えば療法目的のため、より高いアフィニティであり、例えばＫ_Ｄ＜１０^−９Ｍ、さらにより好ましくはＫ_Ｄ＜１０^−１０Ｍである。

【0135】

さらに特に好ましい態様において、抗原結合アフィニティは、中程度のアフィニティ、例えば１０^−７未満のＫ_Ｄである。中程度のアフィニティの結合剤が提供されることも可能であり、そしてこれは特に、本明細書記載の阻害剤として使用可能な望ましいアフィニティ特性を持つアフィニティ成熟変異体を操作するために用いられることも可能である。

【0136】

アフィニティ成熟は、ターゲット抗原に対するアフィニティが増加した抗体を産生するプロセスである。本明細書に開示する、本発明の多様な態様にしたがって、アフィニティ成熟抗体を生成するため、当該技術分野で利用可能なアフィニティ成熟ライブラリーを調製し、そして／または用いる１またはそれより多い方法のいずれかを使用することも可能である。例示的なこうしたアフィニティ成熟法および使用、例えばランダム突然変異誘発、細菌変異誘発系統継代培養、部位特異的突然変異誘発、突然変異ホットスポットターゲティング、簡潔突然変異誘発、抗体シャッフリング、軽鎖シャッフリング、重鎖シャッフリング、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ１突然変異誘発、ならびに本明細書に開示する本発明の多様な態様にしたがって方法および使用を実行するために使用可能なアフィニティ成熟ライブラリーを産生し、そして用いる方法には、例えば：Ｗａｒｋ ＆ Ｈｕｄｓｏｎ， ２００６， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５８： ６５７−６７０に開示されるものが含まれる。

【0137】

アミノ酸突然変異誘発を含むか、または免疫グロブリン遺伝子セグメントにおける体細胞突然変異の結果としての抗体の構造的変化を含む、抗原に対する結合部位の変異体を産生し、そしてより高いアフィニティに関して選択する。アフィニティ成熟抗体は、親抗体よりも数対数倍優れたアフィニティを示すことも可能である。単一の親抗体をアフィニティ成熟に供することも可能である。あるいは、ターゲット抗原に対する類似の結合アフィニティを有する抗体のプールを、アフィニティ成熟単一抗体またはこうした抗体のアフィニティ成熟プールを得るための、親構造と見なすことも可能である。

【0138】

本明細書記載の抗体の好ましいアフィニティ成熟変異体は、結合のアフィニティに、少なくとも２倍の増加、好ましくは少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも５０倍、または好ましくは少なくとも１００倍の増加を示す。中程度の結合アフィニティを有する抗体いずれかと、親分子のそれぞれのライブラリーを使用した選択キャンペーンの経過において、アフィニティ成熟を使用して、本明細書記載の抗体を得ることも可能である。あるいは、本明細書記載の抗体のアフィニティ成熟によって、アフィニティをさらにより増加させて、１０^−１０Ｍ未満、またはさらに１０^−１１Ｍ未満のＫ_Ｄに対応する高い値を得ることも可能である。

【0139】

特定の態様において、アフィニティＥＬＩＳＡアッセイによって、結合アフィニティを決定する。特定の態様において、ＢＩＡｃｏｒｅ ＦｏｒｔｅＢｉｏまたはＭＳＤアッセイによって、結合アフィニティを決定する。特定の態様において、動力学的方法によって、結合アフィニティを決定する。特定の態様において、平衡／溶液法によって、結合アフィニティを決定する。特定の態様において、特に、生理的条件に似た（約３７℃、約５０Ｈｚの密度）あらかじめ決定した条件での、標準水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定によって、結合アフィニティを決定する。

【0140】

用語「機能的活性変異体」にはまた、天然存在アレル変異体、ならびに突然変異体または任意の他の非天然存在変異体も含まれる。当該技術分野に知られるように、アレル変異体は、ポリペプチドの生物学的機能を本質的には改変しない、１またはそれより多いアミノ酸の置換、欠失、または付加を有すると特徴付けられる、（ポリ）ペプチドの代替型である。

【0141】

機能的活性変異体は、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列における配列改変によって、例えば１またはそれより多い点突然変異によって得られることが可能であり、配列改変は、本発明の組み合わせで用いた際に、改変されないポリペプチドまたはヌクレオチド配列の機能を保持するかまたは改善する。こうした配列改変には、限定されるわけではないが、（保存的）置換、付加、欠失、突然変異および挿入が含まれることも可能である。

【0142】

特定の機能的活性変異体は、ＣＤＲ変異体を含む抗体構築物である。ＣＤＲ変異体には、ＣＤＲ領域中の少なくとも１つのアミノ酸が修飾されているアミノ酸配列が含まれ、前記修飾は、アミノ酸配列の化学的または部分的改変であることも可能であり、該修飾は、変異体が、未修飾配列の生物学的特性を保持することを可能にする。ＣＤＲアミノ酸配列の部分的改変は、１からいくつかのアミノ酸、例えば１または２、またはさらに多く、最大３、４または５のアミノ酸の欠失または置換によるか、あるいは１からいくつかのアミノ酸、例えば１または２、またはさらに多く、最大３、４または５のアミノ酸の付加または挿入によるか、あるいは１からいくつかのアミノ酸、例えば１または２、またはさらに多く、最大３、４または５のアミノ酸の化学的誘導体化、あるいはその組み合わせによることも可能である。アミノ酸残基の置換は、保存的置換、例えば１つの疎水性アミノ酸の別の疎水性アミノ酸に対する置換であることも可能である。

【0143】

保存的置換は、その側鎖および化学特性に関連するアミノ酸ファミリー内で行われるものである。こうしたファミリーの例は、塩基性側鎖、酸性側鎖、非極性脂肪族側鎖、非極性芳香族側鎖、非荷電極性側鎖、小側鎖、大側鎖等のアミノ酸である。

【0144】

点突然変異は、異なるアミノ酸に関する、１またはそれより多い単一の（非保存的）または２つ組のアミノ酸の置換または交換、欠失または挿入がある点で、非操作アミノ酸配列と異なるアミノ酸配列の発現を生じる、ポリヌクレオチドの操作と特に理解される。

【0145】

フレームワーク領域のいくつかの点突然変異は、例えば組換え産生宿主細胞株による発現を改善することによって、製造可能性を増加させるであろう。いくつかの態様にはまた、例えば熱安定性によって決定されるような、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏの安定性を改善させる、フレームワーク領域中の点突然変異も含まれるであろう。例えば、ＶＨ配列は、抗体の熱安定性を実質的に増加させることが立証された、１またはそれより多い、いくつかの点突然変異を含むことも可能である。熱安定化変異体は、例えばＩＺＩ０６．１のＶＨおよびＶＬ配列（ＶＨ：配列番号２０、ＶＬ：配列番号２１）を含む抗体構築物の変異体であり、ここでＶＨドメイン配列は、（親）ＩＺＩ０６．１ ＶＨ配列（配列番号２０）の変形であり、そして以下のアミノ酸（Ｋａｂａｔ番号付け）のいずれかを含む：
ａ）ＦＲ１における１位：ＱまたはＨ；
ｂ）ＣＤＲＨ２における
ｉ）３位：ＹまたはＶ；
ｉｉ）５位：Ｙ、Ｔ、またはＳ；
ｉｉｉ）６位：ＳまたはＱ；
ｉｖ）８位：ＨまたはＥ；
ｖ）１０位：ＹまたはＫ；
ｖｉ）１３位：ＥまたはＤ。

【0146】

さらに好ましい変異は、ＶＬ配列（配列番号２１）に関し、そしてこれはＣＤＲＬ３（３位）にＳ９１Ｇ点突然変異を含む。
別の生殖系列配列をヒト化目的のために用いることも可能であり、これは、限定された数の点突然変異を含むさらなるＦＲ変異体を導くことも可能であり、そしてこの変異体はやはり増加した熱安定性を有するであろう。

【0147】

熱安定性を決定するための例示的なアッセイを、以下の実施例セクションに提供する。
好ましい点突然変異は、同じ極性および／または電荷のアミノ酸の交換を指す。これに関連して、アミノ酸は、６４の３つ組コドンにコードされる、２０の天然存在アミノ酸を指す。これらの２０のアミノ酸は、中性電荷、正電荷、および負電荷を有するものに分けられうる：
「中性」アミノ酸を、それぞれの３文字および１文字コードおよび極性とともに、以下に示す：
アラニン：（Ａｌａ、Ａ）非極性、中性；
アスパラギン：（Ａｓｎ、Ｎ）極性、中性；
システイン：（Ｃｙｓ、Ｃ）非極性、中性；
グルタミン：（Ｇｌｎ、Ｑ）極性、中性；
グリシン：（Ｇｌｙ、Ｇ）非極性、中性；
イソロイシン：（Ｉｌｅ、Ｉ）非極性、中性；
ロイシン：（Ｌｅｕ、Ｌ）非極性、中性；
メチオニン：（Ｍｅｔ、Ｍ）非極性、中性；
フェニルアラニン：（Ｐｈｅ、Ｆ）非極性、中性；
プロリン：（Ｐｒｏ、Ｐ）非極性、中性；
セリン：（Ｓｅｒ、Ｓ）極性、中性；
スレオニン：（Ｔｈｒ、Ｔ）極性、中性；
トリプトファン：（Ｔｒｐ、Ｗ）非極性、中性；
チロシン：（Ｔｙｒ、Ｙ）極性、中性；
バリン：（Ｖａｌ、Ｖ）非極性、中性；および
ヒスチジン：（Ｈｉｓ、Ｈ）極性、正（１０％）中性（９０％）。

【0148】

「正」荷電アミノ酸は以下の通りである：
アルギニン：（Ａｒｇ、Ｒ）極性、正；および
リジン：（Ｌｙｓ、Ｋ）極性、正。

【0149】

「負」荷電アミノ酸は以下の通りである：
アスパラギン酸：（Ａｓｐ、Ｄ）極性、負；および
グルタミン酸：（Ｇｌｕ、Ｅ）極性、負。

【0150】

「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、本明細書記載の抗体配列および相同体に関して、配列を整列させ、そして必要であればギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を達成した後、そして配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せずに、特定のポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義される。当業者は、比較しようとする配列の全長に渡って、最大整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めて、整列を測定するための適切なパラメータを決定することも可能である。

【0151】

抗体変異体は、機能性であり、そして機能的同等物として働きうる、例えば特定のターゲットに結合し、そして機能的特性を持つ、相同体、類似体、断片、特定のグリコシル化パターンを有する、例えば糖鎖操作によって産生された修飾または変異体を含むと特に理解される。

【0152】

本明細書記載の抗体は、Ｆｃエフェクター機能を示してもまたは示さなくてもよい。作用様式は、Ｆｃエフェクター機能を含まない抗体を中和することによって主に仲介されるが、Ｆｃは、補体を補充し、そして免疫複合体の形成を通じて、ターゲット抗原、例えば毒素の、循環からの排除を補助することも可能である。

【0153】

特定の抗体は、活性Ｆｃ部分を回避することも可能であり、したがって、抗体のＦｃ部分を含有しないかまたはＦｃガンマ受容体結合部位を含有しない抗体ドメインで構成されるか、あるいは例えばＦｃエフェクター機能を減少させる、特にＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を抑止するかまたは減少させる修飾によって、Ｆｃエフェクター機能を欠く抗体ドメインを含むかいずれかであることも可能である。別の抗体を操作して、Ｆｃエフェクター機能を増加させる、特にＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を増進する修飾を取り込むことも可能である。

【0154】

用語「Ｆｃ断片」または「Ｆｃ領域」には、本明細書において、特に、Ｆｃ受容体結合特性が不全である、例えば糖鎖操作されたＦｃ領域を含む突然変異体または機能的活性変異体、あるいはエフェクター機能が下方制御されたおよび／または半減期が延長されたものが含まれるものとする。

【0155】

用語「エフェクター機能」は、本明細書において、抗体のＦｃ領域に結合するエフェクターリガンドによって仲介される効果を意味するものとする。例示的なエフェクターリガンドは、Ｆｃ受容体、または免疫グロブリンに結合するＦｃ受容体様分子である。Ｆｃ受容体は、免疫系の防御機能に貢献する、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、およびマスト細胞を含む、特定の細胞表面上に見られるタンパク質である。いくつかの異なるタイプのＦｃ受容体があり、認識する抗体のタイプに基づいて分類される：最も一般的な抗体クラス、ＩｇＧに結合するものは、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲまたはＦｃｇＲ）と称される。ＦｃγＲファミリーには、いくつかのメンバー：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）が含まれる。エフェクター分子の中には、補体タンパク質、例えばＣ１ｑもある。

【0156】

別のＦｃ受容体、新生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）もまたＩｇＧに結合し、そしてこの抗体の保存および半減期に関与する。本発明にしたがって、ＦｃＲｎによって仲介される機能は下方調節されないことが好ましい。

【0157】

用語「下方調節」は、遺伝子または遺伝子群、あるいはポリペプチドによって仲介される影響の、遺伝子突然変異あるいは遺伝子発現または遺伝子発現産物、例えば核酸もしくはポリペプチド活性の下方制御による、特にリガンド、例えばエフェクターリガンドの結合の阻害を含めて、アフィニティ、アビディティまたは特異性のような結合特性の減少による、少なくとも部分的な減少を指すものとする。それによって、減少したＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを示す抗体を得ることも可能である。

【0158】

抗体依存性細胞仲介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）は、結合した抗体の定常領域を認識するＦｃ受容体を含む細胞による、抗体でコーティングされたターゲット細胞の殺傷である。大部分のＡＤＣＣは、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩまたはＣＤ１６を表面上に有するＮＫ細胞によって仲介される。典型的なアッセイは、新鮮に単離されたエフェクター細胞を添加する前に、連続希釈した抗体とインキュベーションした、ラモス細胞のようなターゲット細胞を使用する。ＡＤＣＣアッセイは次いで、さらに数時間インキュベーションされ、そして％細胞傷害性を検出する。通常、ターゲット：エフェクター比は、約１：１６であるが、１：１から最大１：５０であることも可能である。

【0159】

補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）は、ターゲット細胞表面に結合した抗体が、補体を固定し、これが膜攻撃複合体の組み立てを生じて、ターゲット細胞膜に穴を開け、続いて細胞溶解が生じる、細胞殺傷機構である。一般的に用いられるＣＤＣアッセイは、ＡＤＣＣ決定と同じ方法にしたがうが、エフェクター細胞の代わりに補体含有血清を用いる。

【0160】

本明細書記載の抗体は、エフェクター機能を仲介することができないＦｃ領域を有し、好ましくはＡＤＣＣおよびＣＤＣアッセイのいずれかによって決定されるような下方調節された細胞傷害活性を有し、これは、好ましくは対照と比較した際に、細胞溶解の割合の有意な減少を提供するようなものである。絶対割合減少は、好ましくは１０％より高く、より好ましくは２０％より高く、さらにより好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％より高い。最も好ましくは、抗体は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性の少なくとも１つを本質的に含まず、例えば天然（非修飾）抗体に比較した際、典型的なＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性の１０％未満を有する。用語「本質的に含まない」はまた、本明細書において、標準アッセイにおいて測定した際、こうした活性を完全に欠く抗体変異体を指すものとする。

【0161】

Ｆｃ領域内の特定の点突然変異は、エフェクター機能を有効に下方調節することが当該技術分野において周知である。特に好ましい突然変異は、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃｇＲ）を通じた免疫補充の抑止を提供する、異なるＦｃｇＲに関するヒトＩｇＧ上の結合部位の領域において使用される。ヒトおよびネズミＩｇＧ上のＦｃｇＲに関する結合部位は、ＩｇＧ残基２３３〜２３９で構成される下部ヒンジ領域に主にマッピングされる。さらなる広いセグメント、例えばＧｌｙ３１６〜Ｌｙｓ３３８がヒトＦｃγＲＩに関して、Ｌｙｓ２７４〜Ａｒｇ３０１およびＴｙｒ４０７〜Ａｒｇ４１６がヒトＦｃγＲＩＩＩに関して決定された。ヒトＦｃガンマＲＩＩＩＡとヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片の３．２Å結晶構造は、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合に関与するものとして、ＩｇＧ１残基Ｌｅｕ２３４〜Ｓｅｒ２３９、Ａｓｐ２６５〜Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７〜Ｔｈｒ２９９、およびＡｌａ３２７〜Ｉｌｅ３３２を示した。ヒトＦｃγＲ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦＣγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＩＡ）に関するヒトＩｇＧ１の高解像度マッピングに言及する概説が、Ｓｈｉｅｌｄｓら ２００１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：６５９１−６０４に提供される。

【0162】

抗体またはＦｃ領域は、特定の突然変異または発現系の選択によって、グリコシル化されるかまたはされず、あるいは特定のグリコシル化パターンを得るために糖鎖操作されることも可能である。

【0163】

用語「糖鎖操作」は、抗体配列またはＦｃ領域に関して、糖鎖操作の結果として、修飾ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを有するグリコシル化変異体を指すものとする。すべての抗体は、重鎖定常領域において保存された位で炭水化物構造を含有し、各アイソタイプは、Ｎ連結炭水化物構造の別個のアレイを所持し、これが多様にタンパク質組み立て、分泌または機能活性に影響を及ぼす。ＩｇＧ１型抗体は、各ＣＨ２ドメインにおいて、Ａｓｎ２９７で保存されたＮ連結グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に付着した２つの複合二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメインの間に包埋され、ポリペプチド主鎖と広範な接触を形成し、そしてその存在は、抗体が、抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を仲介するために必須である（Ｌｉｆｅｌｙら， １９９５， Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：８１３−８２２）。例えばＮ２９７を、例えばＡに突然変異させることを通じたＮ２９７での、またはＴ２９９でのＮ−グリカンの除去は、典型的には、減少したＡＤＣＣを伴う無グリコシル化Ｆｃを生じる。

【0164】

抗体グリコシル化の大きな相違は、細胞株間で起こり、そしてさらに、異なる培養条件下で増殖させた所定の細胞株に関して、重要でない相違が見られる。細菌細胞における発現は、典型的には、無グリコシル化抗体を提供し、これは本質的に、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を含まない。二分ＧｌｃＮＡｃ形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）のテトラサイクリン制御発現を伴うＣＨＯ細胞は、改善されたＡＤＣＣ活性を有すると報告された（Ｕｍａｎａら， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １７：１７６−１８０）。宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え産生中にグリコシル化に影響を及ぼす要因には、増殖様式、培地配合、培養密度、酸素添加、ｐＨ、精製スキーム等が含まれる。

【0165】

用語「抗原結合部位」または「結合部位」は、抗原結合に関与する抗体の部分を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および／または軽（「Ｌ」）鎖、またはその可変ドメインのＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と称される、重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの非常に多様なストレッチは、フレームワーク領域として知られるより保存された隣接ストレッチの間に挿入される。抗原結合部位は、結合したエピトープまたは抗原の三次元表面に相補的である表面を提供し、そして超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。ＣＤＲに取り込まれる結合部位はまた、本明細書において、また、「ＣＤＲ結合部位」とも称される。

【0166】

用語「抗原」は、本明細書において、用語「ターゲット」または「ターゲット抗原」と交換可能に用いられ、抗体結合部位によって認識される、全ターゲット分子またはこうした分子の断片を指すものとする。特に、抗原の下位構造、例えばポリペプチドまたは炭水化物構造は、一般的に「エピトープ」、例えばＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープと称され、免疫学的に適切であり、こうした結合部位によって認識されうる。ｈｕＴＮＦＲ１抗原は、大部分のヒト細胞表面上の単量体または多量体サイトカイン受容体として、三量体ＴＮＦまたはＬＴαに特異的に結合可能な受容体構造を含む抗原である。

【0167】

用語「ｈｕＴＮＦＲ１」は、本明細書において、大部分のヒト細胞上に遍在性に発現されているＴＮＦのＣＤ１２０ａ ＴＮＦＲ１（ｐ５５／６０、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１Ａ［ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（ヒト）］）受容体を指すものとする。

【0168】

用語「エピトープ」は、本明細書において、特に、抗体の結合部位に対する特異的結合パートナーまたは特異的結合パートナーの一部を完全に構成しうる分子構造を指す。エピトープは、炭水化物、ペプチド性構造、脂肪酸、有機、生化学的または無機物質またはその誘導体、およびそれらの任意の組み合わせのいずれで構成されることも可能である。エピトープが、ペプチド性構造、例えばペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質で構成される場合、これは通常、少なくとも３アミノ酸、好ましくは５〜４０アミノ酸、そしてより好ましくは約１０〜２０アミノ酸の間のアミノ酸を含むであろう。エピトープは直鎖またはコンホメーションエピトープのいずれであることも可能である。直鎖エピトープは、ポリペプチドの一次配列または炭水化物鎖の単一セグメントで構成される。直鎖エピトープは、連続または重複であることも可能である。

【0169】

コンホメーションエピトープは、三次構造を形成するためにポリペプチドをフォールディングすることによって近づけられた、アミノ酸または炭水化物で構成され、そしてアミノ酸は、直鎖配列においては、互いに必ずしも隣接していない。特に、そしてポリペプチド抗原に関して、コンホメーションまたは不連続エピトープは、一次配列においては分離されているが、ポリペプチドが天然タンパク質／抗原にフォールディングした際に、分子表面上の一貫した構造に組み立てられる、２またはそれより多い別個のアミノ酸残基の存在によって特徴付けられる。

【0170】

本明細書において、用語「エピトープ」は、特に、少なくともｈｕＴＮＦＲ１の膜遠位ＣＲＤ１およびＣＤＲ２のサブドメインＡ１を含むかまたはこれらから本質的になるエピトープである、ＡＴＲＯＳＡＢによって認識されるエピトープを指す。

【0171】

用語「発現」は、以下のように理解される。発現産物、例えば本明細書に記載するような抗体の所望のコード配列、および制御配列、例えばプロモーターを、機能可能であるように連結されて含有する核酸分子を、発現目的のために用いることも可能である。これらの配列で形質転換またはトランスフェクションされた宿主は、コードされるタンパク質を産生可能である。形質転換を達成するため、発現系はベクター中に含まれることも可能であり；しかしまた、適切なＤＮＡが宿主染色体に組み込まれることも可能である。特に、該用語は、宿主細胞、および例えばベクターに所持され、そして宿主細胞内に導入される外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のための、適切な条件下での適合するベクターを指す。

【0172】

コードＤＮＡは、特定のポリペプチドまたはタンパク質、例えば抗体の特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コードＤＮＡの発現を開始するか、制御するか、または別の方式で仲介するかまたは調節するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡおよびコードＤＮＡは、同じ遺伝子に由来してもよいし、または異なる遺伝子に由来してもよく、そして同じまたは異なる生物に由来することも可能である。組換えクローニングベクターには、しばしば、クローニングまたは発現のための１またはそれより多い複製系、宿主における選択のための１またはそれより多いマーカー、例えば抗生物質耐性、および１またはそれより多い発現カセットが含まれるであろう。

【0173】

「ベクター」は、本明細書において、適切な宿主生物における、クローニングされた組換えヌクレオチド配列の、すなわち組換え遺伝子の転写、およびそのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列と定義される。

【0174】

「発現カセット」は、定義される制限部位で、ベクター内に挿入可能な発現産物をコードする、ＤＮＡコード配列またはＤＮＡセグメントを指す。カセット制限部位は、適切な読み枠でのカセットの挿入を確実にするよう設計される。一般に、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１またはそれより多い制限部位で挿入され、そして次いで、ベクターによって、伝達性のベクターＤＮＡとともに、宿主細胞内に運ばれる。挿入されたまたは付加されたＤＮＡを有するＤＮＡ、例えば発現ベクターのセグメントまたは配列もまた、「ＤＮＡ構築物」と称されることも可能である。

【0175】

発現ベクターは、発現カセットを含み、そしてさらに、通常、宿主細胞またはゲノム組込み部位における自律複製起点、１またはそれより多い選択可能マーカー（例えばアミノ酸合成遺伝子、あるいはゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８またはハイグロマイシンなどの抗生物質に対する耐性を与える遺伝子）、いくつかの制限酵素切断部位、適切なプロモーター配列および転写ターミネーターを含み、これらの構成要素はともに機能可能であるように連結されている。用語「ベクター」には、本明細書において、自律複製ヌクレオチド配列ならびにゲノム組込みヌクレオチド配列が含まれる。一般的なタイプのベクターは、「プラスミド」であり、これは一般的に、さらなる（外来）ＤＮＡを容易に受け入れ可能であり、そして適切な宿主細胞内に容易に導入可能である、二本鎖ＤＮＡの自己充足分子である。プラスミドベクターは、しばしば、コードＤＮＡおよびプロモーターＤＮＡを含有し、そして外来ＤＮＡを挿入するために適した１またはそれより多い制限部位を有する。特に、用語「ベクター」または「プラスミド」は、宿主を形質転換し、そして導入された配列の発現（例えば転写および翻訳）を促進するように、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）が宿主細胞内に導入されうるビヒクルを指す。

【0176】

用語「宿主細胞」は、本明細書において、本明細書に記載するような抗体などの特定の組換えタンパク質を産生するように形質転換された初代対象細胞、およびその子孫いずれかを指すものとする。すべての子孫が親細胞に正確に同一ではない（意図的なまたは不測の突然変異あるいは環境の相違による）が、こうした改変された子孫は、子孫が元来の形質転換された細胞のものと同じ機能性を保持する限り、これらの用語に含まれることを理解しなければならない。用語「宿主細胞株」は、組換え抗体などの組換えポリペプチドを産生するために、組換え遺伝子を発現するために用いられるような宿主細胞の細胞株を指す。用語「細胞株」は、本明細書において、長期間にわたって、増殖する能力を獲得している、特定の細胞タイプの樹立されたクローンを指す。こうした宿主細胞または宿主細胞株は、細胞培養に維持され、そして／または培養されて組換えポリペプチドを産生することも可能である。

【0177】

用語「単離された」または「単離」は、核酸、抗体または他の化合物に関して本明細書において用いられる際、「実質的に純粋な」形で存在するように、天然に関連している環境から十分に分離されている、こうした化合物を指すものとする。「単離された」は、必ずしも、他の化合物または物質を含む人工的または合成混合物、あるいは基本的な活性に干渉せず、そして例えば不完全な精製のために存在する可能性もある不純物の存在の排除を意味しない。特に、本発明の単離された核酸分子はまた、天然存在でない、例えばコドン最適化核酸またはｃＤＮＡ、あるいは化学合成されたものも含むよう意味される。

【0178】

同様に、本明細書にさらに記載するような単離抗体は、例えば、組み合わせが天然には起こらない別の抗体または活性剤との組み合わせ調製物において提供されるような、あるいは天然存在抗体の誘導体または変異体、あるいは天然存在抗体の最適化またはアフィニティ成熟変異体、あるいは抗体の安定性を改善するために操作されたフレームワーク領域を含む抗体として、特に非天然存在のものである。こうした最適化または操作によって、抗体は、天然の抗体の背景においては見られないであろう、１またはそれより多い合成構造または配列または特性を含む。

【0179】

本明細書記載の核酸に関連して、用語「単離核酸」がときに用いられる。この用語は、ＤＮＡに適用された場合、由来した生物の天然存在ゲノムにおいて、すぐ近接している配列から分離されたＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離核酸」は、ベクター内に挿入されたＤＮＡ分子、例えばプラスミドまたはウイルスベクター、あるいは原核または真核細胞または宿主生物のゲノムＤＮＡ内に組み込まれたＤＮＡ分子を含むことも可能である。ＲＮＡに適用された場合、用語「単離核酸」は、主に、上に定義するような単離ＤＮＡ分子にコードされるＲＮＡ分子を指す。あるいは、該用語は、天然状態で（すなわち細胞または組織において）関連している他の核酸から十分に分離されているＲＮＡ分子を指すことも可能である。「単離核酸」（ＤＮＡまたはＲＮＡいずれか）は、さらに、生物学的または合成手段によって直接産生され、そしてその産生中に存在する他の構成要素から分離されている分子を示すことも可能である。

【0180】

ポリペプチドまたはタンパク質、例えば本明細書記載の単離抗体に関して、用語「単離された」は、天然環境において、または調製が、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施された組換えＤＮＡ技術による場合は、調製された環境（例えば細胞培養）において、これらとともに見られる他の化合物などの、天然に関連している物質を含まないかまたは実質的に含まない化合物を特に指すものとする。単離化合物は、希釈剤またはアジュバントとともに配合されていることも可能であり、そしてなお、実質的な目的のためには、単離されており、例えばポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、診断または療法で用いた際に、薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤と混合されることも可能である。

【0181】

用語「組換え」は、本明細書において、「遺伝子操作によって調製されている、またはその結果」を意味するものとする。組換え宿主は、特に、発現ベクターまたはクローニングベクターを含むか、あるいは特に宿主に対して外来であるヌクレオチド配列を使用して、組換え核酸配列を含有するよう遺伝子操作されている。組換えタンパク質は、宿主において、それぞれの組換え核酸を発現することによって産生される。

【0182】

本明細書にさらに記載する抗体構築物は、組換え抗体であることも可能である。この目的に向けて、用語「組換え抗体」には、本明細書において、組換え手段によって調製され、発現され、生成されるかまたは単離された抗体、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子に関して遺伝子導入されたか、または染色体導入された動物（例えばマウス）またはそこから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するよう形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーまたは抗体の抗原結合配列のライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを伴う、任意の他の手段によって調製されたか、発現されたか、生成されたかまたは単離された抗体が含まれる。こうした組換え抗体は、例えば抗体成熟中に起こる再編成および突然変異を含むように操作された抗体を含む。本発明にしたがって、当該技術分野の技術範囲内である、慣用的な分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を使用可能である。こうした技術は、文献に詳細に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， （１９８２）を参照されたい。

【0183】

本明細書記載の抗体は、好ましくは、宿主細胞を使用した組換え発現系によって、例えば大腸菌の周辺質空間における発現によって、あるいは真核発現系、例えば酵母または哺乳動物における分泌タンパク質としての発現によって、例えばＣＨＯ、ＨＥＫまたはヒト産生宿主細胞株によって、産生される組換えタンパク質として提供される。

【0184】

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、抗体産生に最も一般的に用いられてきている。適切なグリコシル化パターンを提供することに加えて、これらの細胞は、遺伝的に安定で非常に産生性であるクローン細胞株の一貫した生成を可能にする。これらは、血清不含培地を用いて、単純なバイオリアクターにおいて高密度に培養可能であり、そして安全でそして再現可能なバイオプロセスの発展を可能にしうる。

【0185】

樹立され、適応し、そして血清不含条件下で、そして場合によって、動物起源のいかなるタンパク質／ペプチドも含まない培地中で完全に培養される宿主細胞が、最も好ましい。

【0186】

「特異的」結合、認識またはターゲティングは、本明細書において、結合剤、例えば抗体または抗原結合部分が、分子の異種集団において、ターゲット抗原またはそれぞれのエピトープに関して、認識可能なアフィニティを示すことを意味する。したがって、示す条件下で（例えばイムノアッセイ）、結合剤は、ターゲット抗原に特異的に結合し、そして試料中に存在する他の分子に、有意な量では結合しない。特異的結合は、結合が、選択するように、ターゲット同一性、高、中または低結合アフィニティまたはアビディティに関して選択性であることを意味する。選択的結合は、通常、結合定数または結合動力学が、別のターゲットに比較した際、少なくとも１０倍異なる（少なくとも１対数の相違と理解される）場合に達成され、好ましくは相違は少なくとも１００倍（少なくとも２対数の相違と理解される）、そしてより好ましくは、少なくとも１０００倍（少なくとも３対数の相違と理解される）異なる。示差結合は、イムノアッセイ、好ましくはイムノブロッティング、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫学的方法によって決定可能である。特定のターゲットに関する抗体分子の特異性は、例えばＨａｒｌｏｗら， ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８８に記載されるように、競合アッセイによって決定可能である。選択的結合は、当該技術分野に知られる組換え抗体最適化法によって操作されるかまたは改善されることも可能である。例えば、本明細書記載の免疫グロブリン鎖の可変領域の特定の領域を、軽鎖シャッフリング、目標地（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎａｌ）突然変異誘発、ＣＤＲ融合（ａｍａｌｇａｍａｔｉｏｎ）、ならびに選択したＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域の定方向突然変異誘発を含む、１またはそれより多い最適化戦略に供することも可能である。

【0187】

本明細書記載の阻害剤は、特に、ＴＮＦＲ１ターゲットに結合する特異的ＣＤＲ配列（配列番号１〜６またはその機能的ＣＤＲ変異体）によって決定されるものと同じ特異性、または同じ抗原結合部位を有するか、あるいはＨ３９８またはＡＴＲＯＳＡＢと同じエピトープまたは重複エピトープに結合する抗体を含む。

【0188】

用語「同じ特異性を有する」、「同じ結合部位を有する」または「同じエピトープに結合する」の使用は、同等のモノクローナル抗体が、同じかまたは本質的に同じ、すなわち類似の免疫反応（結合）特性を示し、そしてあらかじめ選択したターゲット結合配列への結合に関して競合することを示す。特定のターゲットに対する抗体分子の相対特異性は、例えばＨａｒｌｏｗら， ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８８に記載されるように、競合アッセイによって、相対的に決定することも可能である。

【0189】

本明細書において、競合は、競合ＥＬＩＳＡ分析によって、またはＦｏｒｔｅＢｉｏ分析によって決定した際、約３０％より大きい相対阻害を意味する。特定の背景において、例えば競合分析を用いて、抗原結合の意図する機能を伴って設計される新規抗体に関して選択するかまたはスクリーニングするために競合分析を用いる場合の競合の適切なレベルの基準として、相対阻害のより高い閾値を設定することが望ましい可能性もある。したがって、例えば、抗体が十分に競合性であると見なされる前に、少なくとも４０％の相対阻害を検出する、または少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはさらに少なくとも１００％の相対阻害が検出されるように、競合結合に関する基準を設定することも可能である。

【0190】

用語「被験体」は、本明細書において、温血哺乳動物、特にヒトまたは非ヒト動物を指すものとする。特に、本明細書記載の医学的使用または治療のそれぞれの方法は、炎症に関連する疾患状態の予防または治療が必要な被験体に適用される。被験体は、初期段階または後期段階疾患を含む、炎症性疾患のリスクがあるかまたはこうした疾患に罹患している患者であることも可能である。用語「患者」には、予防的または療法的治療のいずれかを受けているヒトおよび他の哺乳動物被験体が含まれる。用語「治療」は、したがって、予防的および療法的治療の両方を含むと意味される。

【0191】

被験体は、例えば、炎症性疾患状態の予防または療法のために治療される。特に、急性または慢性炎症性疾患のリスクがあるか、あるいはこうした疾患または疾患再発を発展させている被験体、あるいはこうした炎症性疾患に罹患している被験体が治療される。

【0192】

特に、用語「療法」は、疾患を治癒させるかまたは疾患症状を減少させるための投与を含むよう意図される、療法的手段を指す。
特に、用語「予防」は、疾患発生のリスク、または疾患再発を減少させるよう意図される、防御手段を指す。

【0193】

本明細書記載の阻害剤は、ＴＮＦ−ＴＮＦＲ１相互作用を阻害することによって、特に、細胞生存を制御し、ＴＮＦＲのシグナル伝達経路下流の活性化を防止し、それによって、免疫細胞において開始されるであろう炎症促進性プログラムを最小限にし、そして自己免疫および炎症性疾患の病因を減少させることも可能である。阻害剤を用いて、ＴＮＦリガンドとのＴＮＦＲ１相互作用を防止すると、病原性細胞集団の拡大および生存が減少し、そして炎症促進性サイトカインの産生が減少し、そしてＴＮＦ仲介性炎症が軽減されるであろう。自己免疫疾患の背景において、ＴＮＦ−ＴＮＦＲ相互作用は、主に、免疫反応中に起こる。特定の免疫細胞タイプの機能が、ＴＮＦ−ＴＮＦＲ相互作用によって調節され、そして本明細書に記載するような阻害剤によって制御可能である。

【0194】

炎症性疾患の中には、抗ＴＮＦ療法剤が指示されるものがある。したがって、本明細書記載の阻害剤または抗体は、慣用的な抗ＴＮＦ療法剤の代替物として用いられる。
特に、本明細書記載の薬学的組成物は、以下の疾患またはそれに関連する炎症性状態（または炎症性疾患）のいずれかを治療するために適しており、これらの疾患は、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、若年性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、多発性硬化症、うっ血性心不全、代謝性疾患、サイトカイン放出症候群、敗血症ショック、脳卒中、アルツハイマーおよびパーキンソン病を含む急性および慢性神経変性疾患からなる群より選択される。さらなる適切な適応症には、潰瘍性結腸炎、膵炎、ＣＯＰＤ、および他の慢性炎症性および／または自己免疫疾患、急性劇症ウイルスまたは細菌感染、代謝性疾患、慢性神経変性疾患、原因病理学的仲介因子としてＴＮＦ／ＴＮＦＲ１を伴う遺伝病、好ましくは周期熱症候群およびケルビズム症候群より選択されるもの、ならびに癌からなる群より選択される。

【0195】

用語「療法的有効量」は、本明細書において、用語、化合物、例えば本明細書記載の抗体の「有効量」または「十分な量」のいずれかと交換可能に用いられ、被験体に投与した際に、臨床的結果を含む有益なまたは望ましい結果を達成するために十分な量または活性であり、そしてこうしたものとして、有効量またはその同義語は、適用される背景に応じる。

【0196】

有効量は、こうした疾患または障害を治療するか、防止するかまたは阻害するために十分な化合物の量を意味するよう意図される。疾患の背景において、本明細書に記載するような抗体の療法的有効量は、ＴＮＦ−ＴＮＦＲ１相互作用の阻害から利益を得る、疾患または状態を治療し、調節し、減弱し、逆転させ、または影響を及ぼすために特に用いられる。

【0197】

こうした有効量に対応するであろう化合物の量は、多様な要因、例えば所定の薬剤または化合物、薬学的配合物、投与経路、疾患または障害のタイプ、治療される被験体または宿主の同一性等の多様な要因に応じるであろうが、にもかかわらず、当業者によってルーチンに決定可能である。

【0198】

本明細書記載の好ましい薬学的組成物は、上に定義されるようなｈｕＴＮＦＲ１抗体の療法的有効量、ならびに場合によって、薬学的に許容されうるキャリアー、薬学的に許容されうる塩、補助剤、安定化剤、希釈剤および溶媒、またはその任意の組み合わせからなる群より選択される１またはそれより多いさらなる構成要素を含む。

【0199】

本発明にしたがって、患者を治療する方法は、その必要がある患者に、上に定義するｈｕＴＮＦＲ１抗体の療法的有効量を投与する工程を含む。療法的有効量は、典型的には、０．５〜５００ｍｇ、好ましくは１〜４００ｍｇ、さらにより好ましくは最大３００ｍｇ、最大２００ｍｇ、最大１００ｍｇまたは最大１０ｍｇの範囲であるが、例えば急性疾患状態を治療するためには、より高い用量が示されうる。

【0200】

１つの態様において、本明細書記載の抗体は、患者に投与する唯一の療法的活性剤である。あるいは、本明細書記載の抗体は、限定されるわけではないが、ＴＮＦアンタゴニスト、抗炎症剤、サイトカイン、増殖因子、または他の療法剤を含む、１またはそれより多い他の療法剤と組み合わせて投与される。ＴＮＦＲ１−アンタゴニスト抗体は、１またはそれより多い他の療法措置と、好ましくは抗ＴＮＦ療法剤、例えば抗ＴＮＦ抗体と、同時にまたは連続して投与されることも可能である。本明細書記載の抗体は、好ましくは、第一選択治療として、あるいは抗ＴＮＦ療法剤が、急性または慢性治療のいずれかとして有効でなかった場合に、第二選択療法として、患者に投与される。特に好ましい医学的使用は、慢性疾患を治療するためのものである。

【0201】

さらに、本明細書記載の抗体の療法的有効量での被験体の治療または防止措置は、単回投与からなることも可能であるし、または一連の適用を含むことも可能である。例えば、抗体は、少なくとも年１回、少なくとも半年に１回または少なくとも月１回、投与されることも可能である。しかし、別の態様において、所定の治療に関して、週あたり約１回からほぼ毎日の投与までを、被験体に投与することも可能である。治療期間の長さは、多様な要因、例えば疾患の重症度、急性または慢性疾患いずれか、患者の年齢、濃度および抗体形式の活性に応じる。治療または予防のために用いられる有効投薬量は、特定の治療または予防措置の経過に渡って、増加するかまたは減少することも可能であることもまた、認識されるであろう。投薬量の変化は、当該技術分野に知られる標準的診断アッセイによって生じ、そして明らかになりうる。いくつかの例において、長期投与が必要である可能性もある。

【0202】

所望の結合特性を持つ抗体がひとたび同定されたら、抗体断片を含むこうした抗体を、例えばハイブリドーマ技術または組換えＤＮＡ技術を含む、当該技術分野に周知の方法によって産生することも可能である。

【0203】

組換えモノクローナル抗体は、例えば、必要とされる抗体鎖をコードするＤＮＡを単離し、そして抗体配列をコードするヌクレオチド配列を含む、周知の組換え発現ベクター、例えば本明細書記載のプラスミドまたは発現カセットを用いて、発現のためにコード配列で組換え宿主細胞をトランスフェクションすることによって、産生可能である。組換え宿主細胞は、上述のものなどの原核および真核細胞であることも可能である。

【0204】

特定の側面にしたがって、ヌクレオチド配列を遺伝子操作に用いて、抗体をヒト化するか、あるいは抗体のアフィニティ、または他の特性を改善することも可能である。例えば、抗体をヒトにおける臨床試験および治療に用いる場合、定常領域がヒト定常領域により緊密に似るように操作して、免疫反応を回避することも可能である。ターゲットに対するより高いアフィニティを得るために、抗体配列を遺伝子操作することが望ましい可能性もある。１またはそれより多いポリヌクレオチド変化を抗体に行い、そしてなおターゲット抗原に対する結合能を維持することも可能であることが、当業者には明らかであろう。

【0205】

多様な手段による抗体分子の産生は、一般的によく理解される。米国特許６３３１４１５（Ｃａｂｉｌｌｙら）は、例えば、重鎖および軽鎖が単一ベクターから、または単一細胞中の２つの別個のベクターから、同時に発現される、抗体の組換え産生法を記載する。Ｗｉｂｂｅｎｍｅｙｅｒら（１９９９， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４３０：１９１−２０２）ならびにＬｅｅおよびＫｗａｋ（２００３， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０１：１８９−１９８）は、宿主細胞の別個の培養において発現されたプラスミドを用いた、別個に産生された重鎖および軽鎖からのモノクローナル抗体の産生を記載する。抗体産生に適切な、多様な他の技術が、例えばＨａｒｌｏｗら， ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）に提供される。

【0206】

特定の側面にしたがって、本明細書記載の抗体を配列決定し、そして次いで、ポリヌクレオチド配列を、発現または増殖のため、ベクター内にクローニングすることも可能である。抗体をコードする配列を、宿主細胞中のベクター中で維持することも可能であり、そして次いで、宿主細胞を拡大し、そして将来の使用のために凍結することも可能である。細胞培養中の組換えモノクローナル抗体の産生を、当該技術分野に知られる手段によって、Ｂ細胞からの抗体遺伝子のクローニングを通じて、実行することも可能である。

【0207】

別の側面において、本発明は、本明細書記載の組換え抗体の産生のためのコード配列を含む単離核酸を提供する。
核酸をコードする抗体は、任意の適切な特性を有することも可能であり、そして任意の適切な特徴またはその組み合わせを含むことも可能である。したがって、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそのハイブリッドの形の抗体コード核酸には、非天然存在塩基および修飾主鎖、例えば核酸の安定性を促進するホスホロチオエート主鎖、またはその両方が含まれることも可能である。好ましくは、核酸は、コドン最適化配列であることも可能である。核酸は、好適には、ターゲット宿主細胞（単数または複数）における所望の核酸、複製および／または選択を促進する特徴を含む、本明細書記載の発現カセット、ベクターまたはプラスミドに取り込まれることも可能である。こうした特徴の例には、複製起点構成要素、選択遺伝子構成要素、プロモーター構成要素、エンハンサー要素構成要素、ポリアデニル化配列構成要素、終結構成要素等が含まれ、これらの多くの適切な例が知られる。

【0208】

本開示はさらに、本明細書記載のヌクレオチド配列の１またはそれより多くを含む、組換えＤＮＡ構築物を提供する。これらの組換え構築物は、ベクター、例えばプラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターと関連して用いられ、ベクター内に任意の開示する抗体をコードするＤＮＡ分子を挿入する。

【0209】

培養中の細胞株によって、抗体分子を産生する任意の方法を用いて、例えば組換え真核（哺乳動物または昆虫）または原核（細菌）宿主細胞を培養して、モノクローナル抗体を産生する。モノクローナル抗体を調製するための適切な方法の例には、Ｋｏｅｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）のハイブリドーマ法およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ， １９８４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３３：３００１；およびＢｒｏｄｅｕｒら， １９８７， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）， ｐｐ． ５１−６３）が含まれる。

【0210】

ハイブリドーマ法を使用して、本明細書記載の抗体を同定するかまたは得ることも可能である。こうした方法において、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターを免疫して、免疫に用いたタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するかまたは産生可能であるリンパ球を誘発する。あるいは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでリンパ球を免疫することも可能である。次いで、適切な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する。

【0211】

ハイブリドーマ細胞を増殖させる培地を、抗原に対して向けられるモノクローナル抗体の産生に関してアッセイする。好ましくは、免疫沈降によって、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を決定する。

【0212】

次いで、ターゲット抗原の特異的結合、および例えば異なる診断または療法目的のため、抗体の操作に関してさらに試験するため、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）をハイブリドーマ上清から精製することも可能である。

【0213】

ｈｕＴＮＦＲ１特異的抗体は、いくつかの場合、ｈｕＴＮＦＲ１抗原に対するスクリーニングを通じて現れる。示差結合クローンを単離する可能性を増加させるため、異なる抗原またはエピトープに対して進行性にスクリーニングすることによって、多数の選択圧が適用されるであろう。

【0214】

所望の選択結合特性を持つ抗体を同定するためのスクリーニング法は、抗体配列またはその抗原結合配列をディスプレイするライブラリーを用いて（例えばファージ、細菌、酵母または哺乳動物細胞；あるいは核酸情報をそれぞれの（ポリ）ペプチドに翻訳するｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイ系を用いて）、ディスプレイ技術によって行うことも可能である。例えば標準アッセイを用いて、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティングまたはフローサイトメトリーでの表面染色に基づいて、反応性を評価することも可能である。

【0215】

抗体ライブラリー、例えばファージ、ファージミドまたは酵母ディスプレイ抗体ライブラリーから、抗体を選択するために、単離抗原（単数または複数）を用いることも可能である。

【0216】

本発明はさらに、本明細書に記載するような阻害剤または抗体、および薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤を含む、薬学的組成物を提供する。これらの薬学的組成物は、ボーラス注射または注入として、あるいは連続注入によって、本発明にしたがって投与されることも可能である。こうした投与手段を容易にするために適した薬学的キャリアーは、当該技術分野に周知である。

【0217】

薬学的に許容されうるキャリアーには、一般的に、本明細書記載の抗体または関連組成物または組み合わせに生理学的に適合する、あらゆる適切な溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に許容されうるキャリアーのさらなる例には、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、ならびにそのいずれかの組み合わせが含まれる。

【0218】

１つのこうした側面において、抗体を、所望の投与経路に適した１またはそれより多いキャリアーと組み合わせることも可能であり、抗体を、例えばラクトース、スクロース、デンプン、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリジン、ポリビニルアルコールのいずれかと混合することも可能であり、そして場合によって、慣用的な投与のため、さらに錠剤化するか被包することも可能である。あるいは、抗体は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、エタノール、コーン油、ピーナツ油、綿実油、ゴマ油、トラガカントゴム、および／または多様な緩衝剤中に溶解されることも可能である。他のキャリアー、アジュバント、および投与様式が、薬学業に周知である。キャリアーには、徐放物質または時間遅延物質、例えば単独またはワックスを伴うモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル、あるいは当該技術分野に周知の他の物質が含まれることも可能である。

【0219】

さらなる薬学的に許容されうるキャリアーが当該技術分野に知られ、そしてこれらは、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳに記載される。液体配合物は、溶液、エマルジョンまたは懸濁物であることも可能であり、そしてこれらには、賦形剤、例えば懸濁剤、可溶化剤、界面活性剤、保存剤およびキレート剤が含まれることも可能である。

【0220】

本明細書記載の阻害剤または抗体および１またはそれより多い療法的活性剤が配合されている、薬学的組成物が意図される。本明細書記載の抗体の安定配合物は、望ましい純度を有する前記抗体を、最適な薬学的に許容されうるキャリアー、賦形剤または安定化剤と、凍結乾燥配合物または水溶液の形で、混合することによって、貯蔵用に調製される。ｉｎ ｖｉｖｏ投与に用いられる配合物は無菌である。これは、滅菌ろ過膜を通じたろ過または他の方法によって、容易に達成される。本明細書に開示する抗体および他の療法活性剤はまた、免疫リポソームとして配合され、そして／またはマイクロカプセル中に封入されることも可能である。

【0221】

本明細書記載の阻害剤または抗体を含む、薬学的組成物の投与は、経口、皮下、静脈内、鼻内、耳内、経皮、粘膜、局所、例えばジェル、軟膏、クリーム等で、腹腔内、筋内、肺内、例えば吸入可能技術または肺送達系を使用して、膣内、非経口、直腸、または眼内を含む多様な方法で行われることも可能である。

【0222】

非経口投与のために用いられるような例示的な配合物には、例えば無菌溶液、エマルジョンまたは懸濁物としての、皮下、筋内または静脈内注射に適したものが含まれる。
１つの態様において、本明細書記載の抗体は、疾患修飾または防止単一療法として、被験体に投与される唯一の療法的活性剤である。

【0223】

別の態様において、本明細書記載の抗体は、例えば混合物または部分のキットにおいて、疾患修飾または防止併用療法などの療法または予防を必要とする被験体を治療するためのさらなる活性物質と組み合わされる。

【0224】

１またはそれより多い他の療法または予防剤との組み合わせには、標準治療、例えば抗生物質、炎症のステロイドおよび非ステロイド阻害剤、例えばメトトレキセートおよび／またはパラセタモールおよび／または他の抗体に基づく療法が含まれることも可能である。組み合わせは特に、原発性疾患を治療するために用いられる剤を含むことも可能であり、この場合、炎症プロセスが、続発性の炎症性疾患状態を導く。原発性疾患は、例えば癌であり、そして組み合わせには、例えば抗増殖性化学療法剤および／または細胞分裂停止剤が含まれるであろう。

【0225】

併用療法において、抗体を混合物として、あるいは１またはそれより多い他の療法措置に付随して、例えば付随療法の前、それと同時、またはその後に、投与することも可能である。

【0226】

本明細書記載の抗体またはそれぞれの薬学的調製物の生物学的特性は、細胞、組織、および全生物実験において、ｅｘ ｖｉｖｏで特徴付け可能である。当該技術分野に知られるように、薬剤はしばしば、疾患または疾患モデルに対する治療のための薬剤有効性を測定するため、あるいは薬剤の薬物動態学、薬力学、毒性、および他の特性を測定するため、限定されるわけではないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタおよびサルを含む動物において、ｉｎ ｖｉｖｏで試験される。動物は、疾患モデルとして言及される可能性もある。療法剤はしばしば、限定されるわけではないが、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植片マウス、およびトランスジェニックマウス（ノックインおよびノックアウトを含む）を含むマウスにおいて試験される。こうした実験は、適切な半減期、エフェクター機能、阻害剤活性および／または受動免疫療法に際しての免疫反応を伴う療法剤または予防剤として用いようとする抗体の潜在能力の決定のため、意味があるデータを提供可能である。任意の生物、好ましくは哺乳動物が、試験に使用可能である。例えば、ヒトに対する遺伝的類似性のため、霊長類、サルが、適切な療法モデルである可能性があり、そしてしたがって、対象の剤または組成物の有効性、毒性、薬物動態学、薬力学、半減期、または他の特性を試験するために使用可能である。薬剤としての認可のため、ヒトにおける試験が最終的には必要であり、そしてしたがって、もちろん、これらの実験が意図される。したがって、本明細書記載の抗体およびそれぞれの薬学的組成物が、ヒトにおいて試験されて、その療法的または予防的有効性、毒性、免疫原性、薬物動態学、および／または他の臨床特性を決定することも可能である。

【0227】

本発明にしたがって、アゴニスト性交差反応性を持たない、ヒトＴＮＦＲ１をターゲティングする抗体構築物が産生された。ＴＮＦＲ１の選択的阻害は、ＴＮＦの炎症促進活性または炎症反応を中和する機会を提供する。特に、驚くべきことに、対応する二価抗体の望ましくない副作用を回避するだけでなく、より驚くべきことに、慢性疾患治療スケジュールには典型的である反復投薬の経過中に、潜在的に発展する抗ヒトＩｇ抗体（ＡＤＡ）による架橋に際して、アゴニストに変換されない、一価高アフィニティ結合剤を提供する。

【0228】

ＷＯ２０１２０３５１４１Ａ１にしたがって調製されたＡＴＲＯＳＡＢと称される抗ＴＮＦＲ１抗体は、哺乳動物細胞で産生されたヒト化抗体であり、そして親マウスＨ３９８ＩｇＧと類似の結合および中和挙動を示した。該抗体は、こうした全長抗体で予期されてきたアゴニスト活性は示さなかった。

【0229】

しかし、ＡＴＲＯＳＡＢ抗体は、驚くべきことに、増加したアフィニティの変異体が産生されると直ちにアゴニスト活性を有することがわかった。したがって、アフィニティ成熟は、望ましくない副作用を減少させるために、原則として回避された。本発明は、ここで、ｈｕＴＮＦＲ１受容体に一価で結合する抗体構築物が、アフィニティを１０^−８Ｍ未満のＫ_Ｄまで増加しても、そして特にｋ_оｆｆが実質的に低下しても、こうしたアゴニスト活性を示さないという驚くべき知見に基づく。

【0230】

本明細書記載の阻害剤は、強力なＴＮＦＲ１選択的アンタゴニストであり、そして抗ＴＮＦ療法剤が必要とされるか、あるいは抗ＴＮＦ療法剤が失敗するかまたは疾患進行をさらに悪化させる場合に、疾患の新規療法オプションを可能にし、こうした疾患には、多発性硬化症、うっ血性心不全、代謝性疾患（ＩＩ型糖尿病）、サイトカイン放出症候群、敗血症ショック、急性（脳卒中）および慢性（アルツハイマーおよびパーキンソン病）神経変性疾患が含まれる。阻害剤は、抗ＴＮＦ治療に臨床的に反応することがすでに知られている疾患において、特に有用な療法代替物である可能性もあり、そして特に、ＴＮＦＲ１の特異的遮断およびＴＮＦＲ２機能の維持が有望な療法アプローチであるようである疾患において当てはまる。

【0231】

以下の定義の主題は、本発明の態様であるとみなされる：
１． ３７℃で水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）により、Ｆａｂ形式に関して決定した際、５ｘ１０^−９Ｍ未満のＫ_Ｄおよび１０^−３ｓ^−１未満のｋ_оｆｆで、抗原結合部分を通じてｈｕＴＮＦＲ１を一価で認識するヒトまたはヒト化抗体構築物である、ｈｕＴＮＦＲ１受容体の阻害剤。

【0232】

２． 細胞に基づくアッセイにおいて、好ましくはＫｙｍ−１細胞におけるＴＮＦＲ１仲介性細胞死の阻害に関するアッセイによって決定した際、５．０ｘ１０^−９未満のＩＣ_５０値で、あるいはＨｅＬａ細胞からのＩＬ−６放出の阻害に関するアッセイによって、４．０ｘ１０^−８未満のＩＣ_５０値で、またはＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−８放出の阻害に関するアッセイによって、２．０ｘ１０^−８未満のＩＣ_５０値で、ＴＮＦ−ｈｕＴＮＦＲ１受容体相互作用またはリンホトキシンアルファとｈｕＴＮＦＲ１受容体の相互作用を直接阻害する、定義１の阻害剤。

【0233】

３． 抗原結合部分がＶＨおよびＶＬドメインを含み、ＶＨおよびＶＬドメインの少なくとも１つが、相補性決定領域（ＣＤＲ）配列いずれかにおいて、少なくとも１つの点突然変異を含む親ドメインのアフィニティ成熟機能的変異体であり、ここで
ａ）親ＶＨドメインが、ＣＤＲ配列：配列番号１（ＣＤＲＨ１）、配列番号２（ＣＤＲＨ２）、および配列番号３（ＣＤＲＨ３）によって特徴付けられ；そして
ｂ）親ＶＬドメインが、ＣＤＲ配列：配列番号４（ＣＤＲＬ１）、配列番号５（ＣＤＲＬ２）、および配列番号６（ＣＤＲＬ３）によって特徴付けられ；
ＣＤＲ配列はＫａｂａｔ番号付けスキームにしたがっている
定義１または２の阻害剤。

【0234】

４． 少なくとも１つの点突然変異が、配列番号２（ＣＤＲＨ２）および／または配列番号６（ＣＤＲＬ３）のいずれかにおけるものであり、好ましくはＣＤＲＨ２配列が配列番号７であり、そしてＣＤＲＬ３配列が配列番号８である、定義３の阻害剤。

【0235】

５． 抗原結合部分が
Ａ
グループメンバーｉ）〜ｉｉ）からなる群より選択されるもの
ｉ）
ａ）配列番号１によって同定されるＣＤＲＨ１配列；
ｂ）配列番号１０によって同定されるＣＤＲＨ２配列；
ｃ）配列番号３によって同定されるＣＤＲＨ３配列；
ｄ）配列番号４によって同定されるＣＤＲＬ１配列；
ｅ）配列番号５によって同定されるＣＤＲＬ２配列；および
ｆ）配列番号１１によって同定されるＣＤＲＬ３配列；
を含む抗原結合部分
ならびに
ｉｉ）
ａ）配列番号１によって同定されるＣＤＲＨ１配列；
ｂ）配列番号１０によって同定されるＣＤＲＨ２配列；
ｃ）配列番号３によって同定されるＣＤＲＨ３配列；
ｄ）配列番号４によって同定されるＣＤＲＬ１配列；
ｅ）配列番号５によって同定されるＣＤＲＬ２配列；および
ｆ）配列番号６によって同定されるＣＤＲＬ３配列；
を含む抗原結合部分
または
Ｂ
Ａのグループメンバーいずれかである親抗原結合部分の機能的活性変異体である抗原結合部分
である、定義４または５の阻害剤。

【0236】

６． 機能的活性変異体が
ａ）親抗体のＣＤＲ配列のいずれかの少なくとも１つの機能的活性ＣＤＲ変異体；および／または
ｂ）ＶＨまたはＶＬ配列のいずれかのフレームワーク領域における少なくとも１つの点突然変異
を含む、定義５の阻害剤。

【0237】

７． 抗体構築物が、Ｆａｂ分子、ｓｃＦｖ分子、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ハーフＩｇＧ１抗体、およびＦｖドメイン、または前述のいずれかの機能的活性誘導体からなる群より選択され、好ましくは、抗体構築物が、親水性ポリマー、例えばＰＥＧにカップリングされ、そして／またはポリペプチド、例えばヒト血清アルブミン、トランスフェリン、アルブミン結合ドメインまたはペプチド、Ｉｇ結合ドメイン、ＰＥＧ模倣ポリペプチド伸長、抗体Ｆｃ断片、好ましいヘテロ二量体化を可能にする突然変異を所持する抗体Ｆｃ断片、あるいは前述のポリペプチドいずれかの機能的変異体に融合している、定義１〜６のいずれかの阻害剤。

【0238】

８． 抗体構築物が、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦｖドメインのいずれかであり、抗体Ｆｃ断片に融合しており、ＦｃがＣＨ２およびＣＨ３ドメインのヘテロ二量体からなり、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインがホモ二量体化よりも優先的なヘテロ二量体化を可能にする１またはそれより多い点突然変異を所持する、定義７の阻害剤。

【0239】

９． 抗体構築物がＰＥＧ化、ＨＥＳ化、またはＰＳＡ化されている、定義１〜８のいずれかの阻害剤。
１０． 抗体構築物が、親Ｆｖドメインに比較した際に、ｈｕＴＮＦＲ１に結合する増加したアフィニティを持つＦｖドメインを含み、親Ｆｖドメインが配列番号１２と同定される親ＶＨドメインおよび配列番号１６と同定される親ＶＬドメインによって特徴付けられる、定義１〜９のいずれかの阻害剤。

【0240】

１１． ＶＨおよびＶＬドメインの少なくとも１つが、ＣＤＲまたはフレームワーク（ＦＲ）配列のいずれかに少なくとも１つの点突然変異を含む、親ドメインのアフィニティ成熟機能的変異体である、定義１０の阻害剤。

【0241】

１２．
ａ）ＶＨドメインが、配列番号１２〜１５からなる群より選択される配列を含むか、または該配列からなるか；
ｂ）ＶＬドメインが、配列番号１６〜１９からなる群より選択される配列を含むか、または該配列からなるか；あるいは
ｃ）少なくとも１つのＦｖドメインが、ａ）またはｂ）のいずれかの機能的活性変異体を含み、機能的活性変異体が、ＣＤＲまたはＦＲ配列のいずれかに少なくとも１つの点突然変異を含む
定義１１の阻害剤。

【0242】

１３．
ＦｖドメインがＶＨおよびＶＬドメインの組み合わせであり、
Ａ
ｉ）ＶＨが配列番号１３を含むかまたは配列番号１３からなり、そして
ＶＬが配列番号１７を含むかまたは配列番号１７からなる；
ｉｉ）ＶＨが配列番号１４を含むかまたは配列番号１４からなり、そして
ＶＬが配列番号１８を含むかまたは配列番号１８からなる；
ｉｉｉ）ＶＨが配列番号１５を含むかまたは配列番号１５からなり、そして
ＶＬが配列番号１９を含むかまたは配列番号１９からなる；
ｉｖ）ＶＨが配列番号１４を含むかまたは配列番号１４からなり、そして
ＶＬが配列番号１９を含むかまたは配列番号１９からなる；
ｖ）ＶＨが配列番号１５を含むかまたは配列番号１５からなり、そして
ＶＬが配列番号１８を含むかまたは配列番号１８からなる；
ｖｉ）ＶＨが配列番号１３を含むかまたは配列番号１３からなり、そして
ＶＬが配列番号１８を含むかまたは配列番号１８からなる；
ｖｉｉ）ＶＨが配列番号１４を含むかまたは配列番号１４からなり、そして
ＶＬが配列番号１７を含むかまたは配列番号１７からなる；
ｖｉｉｉ）ＶＨが配列番号１３を含むかまたは配列番号１３からなり、そして
ＶＬが配列番号１９を含むかまたは配列番号１９からなる；そして
ｉｘ）ＶＨが配列番号１５を含むかまたは配列番号１５からなり、そして
ＶＬが配列番号１７を含むかまたは配列番号１７からなる；
グループメンバーｉ）〜ｉｘ）からなる群より選択されるもの
または
Ｂ
ＦｖドメインがＶＨおよびＶＬドメインの組み合わせであり、ＶＨおよびＶＬドメインのいずれかが、Ａのグループメンバーのいずれかの親ドメインの機能的活性変異体であるもの
である、定義１０〜１２のいずれかの阻害剤。

【0243】

１４． 抗体構築物が、動的光散乱法によって決定した際、少なくとも６０℃、または少なくとも６１℃、または少なくとも６２℃、または少なくとも６３℃、または少なくとも６４℃、または少なくとも６５℃の増加した熱安定性を有する、ここで、抗体構築物が、ＶＨまたはＶＬ配列のいずれかのフレームワーク領域において、少なくとも１つの点突然変異を含む親Ｆｖドメインの機能的変異体であるＦｖドメインを含む、定義１０〜１３のいずれかの阻害剤。

【0244】

１５． 定義１〜１４のいずれかの阻害剤および薬学的に許容されうるキャリアーを含む薬学的調製物。
１６． 非経口使用、好ましくは静脈内または皮下投与による使用のために配合されている、定義１５の調製物。

【0245】

１７． 抗体構築物を発現するために組換え哺乳動物発現系を使用する、定義１〜１４のいずれかの阻害剤を産生する方法。
１８． ＣＨＯ産生細胞株を使用する、定義１７記載の方法。

【0246】

１９． 抗ＴＮＦ療法の必要があるヒト被験体を治療する際に使用するための、定義１〜１４のいずれかの阻害剤。
２０． 阻害剤を被験体に反復投与する、定義１９記載の使用のための阻害剤。

【0247】

２１． 被験体が抗ＤＭＡＲＤまたは抗薬剤抗体を発展させている、定義１９または２０記載の使用のための阻害剤。
２２． 抗ＴＮＦ療法または非生物学的ＤＭＡＲＤ療法剤が必要とされる場合の第一選択治療として、あるいは抗ＴＮＦまたは非生物学的ＤＭＡＲＤ療法剤が失敗した場合の第二選択治療としての、定義１９〜２１のいずれか記載の使用のための阻害剤。

【0248】

２３． 定義２０〜２２のいずれか記載の使用のための阻害剤であって、被験体が
ａ）関節、皮膚および腸の急性または慢性炎症；および／または
ｂ）自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、若年性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、多発性硬化症、うっ血性心不全、代謝性疾患、サイトカイン放出症候群、敗血症ショック、急性および慢性神経変性疾患、脳卒中、アルツハイマーおよびパーキンソン病、潰瘍性結腸炎、膵炎、ＣＯＰＤ、急性劇症ウイルスまたは細菌感染、代謝性疾患、慢性神経変性疾患、原因病理学的仲介因子としてＴＮＦ／ＴＮＦＲ１を伴う遺伝病、周期熱症候群、ケルビズム症候群、および癌
に罹患している、前記阻害剤。

【0249】

本発明は、限定されることなく、以下の実施例によってさらに例示される。

【実施例】

【0250】

実施例１：ＡＴＲＯＳＡＢおよびＨ３９８の結合および生物活性
ＡＴＲＯＳＡＢ（ＷＯ２０１２０３５１４１にしたがって産生した全長抗体）およびその親マウス抗体Ｈ３９８（ＷＯ２００８１１３５１５Ａ２に記載されるようなもの）は、それぞれ、標準ＥＬＩＳＡにおける０．２５ｎＭおよび０．１５ｎＭのＥＣ_５０値で、ヒトＴＮＦＲ１に類似の結合活性を示す（図１ａ）。さらに、高受容体密度の条件下で、ＱＣＭ技術によって、ＡＴＲＯＳＡＢに関する０．３５ｎＭおよびＨ３９８の場合の０．２３ｎＭの類似のアフィニティ（Ｋ_Ｄ値）が決定された（図１ｂおよびｃ）。

【0251】

ＥＬＩＳＡおよびＱＣＭにおける類似の結合にもかかわらず、Ｈ３９８はＡＴＲＯＳＡＢに比較して、ＨＴ１０８０細胞からのＴＮＦまたはＬＴ誘導性ＩＬ−８放出の１０〜１２倍強い阻害を示した（図２）。ＥＬＩＳＡおよびＱＣＭ測定（高密度チップ上で実施）の両方において、受容体はＩＬ−８放出アッセイにおけるＨＴ１０８０細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ状況と比較して、過剰提示されていることを考慮して、より低い受容体密度のチップを用いて、ＱＣＭ測定を反復することが決定された。図３に示すように、ＡＴＲＯＳＡＢに関しては４．５ｎＭのＫ_Ｄ値が得られ、そしてＨ３９８に関しては、１．６ｎＭのＫ_Ｄ値が得られた（表１もまた参照されたい）。興味深いことにＡＴＲＯＳＡＢおよびＨ３９８のＫ_Ｄ値は２．８の係数で異なるが、ＡＴＲＯＳＡＢの会合速度（ｋ_оｎ）は、Ｈ３９８のｋ_оｎより２．６倍速く、そしてＨ３９８の解離速度（ｋ_оｆｆ）は、ＡＴＲＯＳＡＢの解離より約７．６倍遅かった（図３、表１）。したがって、受容体結合に関するＴＮＦまたはＬＴと競合して、ＡＴＲＯＳＡＢ（より迅速なオン速度）は、未結合受容体をより迅速に占有し、そしてＨ３９８（より遅いオフ速度）は占有した受容体をより長く遮断する。

【0252】

標準的ＩＬ−８放出アッセイ（以下を参照されたい）のセッティングにおいて、受容体が連続内在化の根底にあり、そして内在化された受容体はなおシグナル伝達を仲介することを考慮すると、受容体により長く結合したままである（より遅いオフ速度の）抗体は、より強い阻害剤である可能性が高い。ＥＬＩＳＡにおける、ＡＴＲＯＳＡＢおよびＨ３９８のヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃへの結合が、ｐＨ５．４、ｐＨ６．４、ｐＨ７．４およびｐＨ８．４で行った実験において互いの間で有意に異ならなかったため、エンドソーム区画中の酸性化条件によるｐＨ依存性効果は、排除可能であった（データ未提示）。したがって、ＡＴＲＯＳＡＢの「オフ速度成熟」変異体の発展に努力を注ぐことが決定された。

【0253】

表１．ＡＴＲＯＳＡＢおよびＨ３９８の結合および生物活性

【0254】

【表1】

【0255】

実施例２：ファージディスプレイ、パート１−部位特異的突然変異誘発および平衡選択
以前の研究（Ｋｉｒｓｔｉｎ Ｚｅｔｔｌｉｔｚ、２０１０の博士論文）において、ＡＴＲＯＳＡＢは、個々にランダム化されたＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＬ１、およびＣＤＲＬ２のファージディスプレイライブラリーを用いて、アフィニティ成熟に供された。これらのＣＤＲ内で、抗原結合部位において、ＩＺＩ０６．１のモデル構造で曝露されると同定された位をランダム化した。ストレプトアビジン・コーティング磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓと組み合わせて、可溶性ビオチン化ｈｕＴＮＦＲ１−Ｆｃを用いて、平衡条件下で、選択を行った。選択条件を表２に提示する。４つのＣＤＲすべてに関して、好ましい残基が同定されたが、ＣＤＲＨ２の突然変異のみ（表３）が、ＴＮＦＲ１結合にある程度の改善を示すことが見いだされた。ｓｃＦｖＩＧ１１が６周期から単離され、そしてＱＣＭによって決定した際、ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１（ＡＴＲＯＳＡＢ）に比較して、２倍高いＫ_ＤでＴＮＦＲ１−Ｆｃに結合することが明らかになった。ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１（７．６ｘ１０^−４ｓ^−１）に比較して、ほぼ３倍減少した２．６ｘ１０^−４ｓ^−１のオフ速度定数ｋ_оｆｆを有し、これは抗体−受容体複合体からの抗体のより緩慢な解離を示すため、ｓｃＦｖＩＧ１１をさらなる実験のために選択した。ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１およびｓｃＦｖＩＧ１１の配列整列を図４に示す。

【0256】

表２． ビオチン化抗原を用いた平衡選択のための条件

【0257】

【表2】

【0258】

表３： 部位特異的突然変異誘発のための位、ライブラリーＬ２ａ

【0259】

【表3】

【0260】

実施例３：ファージディスプレイ、パート２−ランダム突然変異誘発および競合選択
ｓｃＦｖＩＧ１１（６．２ｘ１０^５コロニー形成単位）のＶＨおよびＶＬを含む全配列のエラープローンＰＣＲによって、以下の選択実験のために用いるライブラリーを生成した。１０の分析した単一クローンは、キロ塩基対あたり７．５の突然変異の全体の突然変異誘発率（７．５／ｋｂｐ）を示した。全ｓｃＦｖ配列の２５％を含む（７２９ｂｐのうち１８０ｂｐ）ＣＤＲ内で、５５の突然変異のうち１５が観察され（２７％）、かなり同等の突然変異分布が示された。

【0261】

アフィニティ成熟クローンｓｃＦｖＴ１２Ｂの選択
ヒトＴＮＦＲ１に対するパニングの前に、ヒトＴＮＦＲ２を用いた負の選択周期を行って、選択プロセス中の受容体選択性を保持した。イムノチューブに固定されたヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃを使用して、改善された結合挙動を有するディスプレイｓｃＦｖ断片を選択した。各周期後に、ポリクローナルファージＥＬＩＳＡによって、選択プールの総結合変化を記録し、これは３回の選択周期後、約２倍の改善を示した（図５ａ、選択条件を表４に概説する）。

【0262】

表４．選択条件

【0263】

【表4】

【0264】

^＊溶液中の非標識ヒトＴＮＦＲ１を、ＤｙｎａＢｅａｄｓ上でのおよびイムノチューブ中での選択の両方に関して、競合に用いた。
ＥＬＩＳＡにおいてヒトＴＮＦＲ１への最強の結合を示す候補ファージ（表５）を、可溶性ｓｃＦｖ断片として発現し、そして中程度の受容体密度を持つセンサーチップを用いて、ＱＣＭによる動力学的分析に供した。クローンｓｃＦｖＴ１２Ｂは、受容体から最も緩慢な放出を示し、これは最低のｋ_оｆｆ値によって示された（図５ｂ、表５）。

【0265】

表５． ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１に比較した、ファージ候補、ディスプレイライブラリーＥＰ０３の相対ＥＣ_５０およびｋ_оｆｆ値

【0266】

【表5】

【0267】

総合すると、ｓｃＦｖＴ１２Ｂは、受容体遮断改善のための重要な特質と推定される、ＱＣＭオフ速度スクリーニングの最適な結合特性を示した。ｓｃＦｖＴ１２ＢのＤＮＡ配列を、ｓｃＦｖＩＧ１１と比較して３つの位で変化させた。重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲＨ２のＱ１ＨおよびＴ５３Ｓならびに軽鎖可変ドメイン（ＶＬ、図４）のＣＤＲＬ３のＳ９１Ｇ。

【0268】

ｓｃＦｖＴ１２Ｂの特徴付け
可溶性抗体断片ｓｃＦｖＴ１２Ｂ、ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１およびｓｃＦｖＩＧ１１を、大腸菌ＴＧ１の周辺質において産生し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって適切な発現を確認すると、精製試料の重大でない混入が観察可能であった（図６ａ）。ヒトＴＮＦＲ１への濃度依存性結合がＥＬＩＳＡにおいて示され、ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１、ｓｃＦｖＩＧ１１およびｓｃＦｖＴ１２Ｂに関して、それぞれ、３．８ｎＭ、２．６ｎＭおよび２．０ｎＭのＥＣ_５０値が明らかになった（図６ｂ、表６）。したがって、ｓｃＦｖＴ１２Ｂは、ｓｃＦｖＩＧ１１に比較して、適用条件下で１．３倍の改善された結合を示した。ＱＣＭによって決定した際、Ｋ_Ｄ値は、ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１に関して２８．９ｎＭ、ｓｃＦｖＩＧ１１に関して２４．９、そしてｓｃＦｖＴ１２Ｂに関して６．０であり、これはｓｃＦｖＩＧ１１に比較してｓｃＦｖＴ１２Ｂの４．１倍改善された結合に相当した（図６ｃ、表６）。アフィニティ変化は、改善された会合（２．１倍増加したｋ_оｎ）および解離速度定数（２．０倍減少したｋ_оｆｆ、表６）から生じた。最終的に、ｓｃＦｖＴ１２Ｂは、ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１およびｓｃＦｖＩＧ１１に比較して、改善されたアンタゴニスト活性で、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＴＮＦ誘導性インターロイキン−８放出を遮断した（図６ｄ）。適用したｓｃＦｖが高濃度になるとシグナルが増加するため、得られたデータは、標準阻害曲線に収束不能であった。しかし、半最大阻害のおよその濃度は、ｓｃＦｖＩＧ１１に比較してｓｃＦｖＴ１２ＢによるヒトＴＮＦＲ１の約７倍強い遮断を反映した（表６）。

【0269】

表６． ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１およびｓｃＦｖＩＧ１１に比較したｓｃＦｖＴ１２Ｂの特徴付け。改善を、ｓｃＦｖＩＧ１１の値に関する係数として示す。

【0270】

【表6】

【0271】

^＊最後の１〜２データポイントの排除に際して、得たＩＬ−８データの評価から生じる、およそのＩＣ_５０値。
実施例３：Ｈ３９８の反復ヒト化
上述のように、Ｈ３９８は、ＡＴＲＯＳＡＢに比較してＴＮＦ仲介性細胞反応をより有効に遮断することが立証され（Ｚｅｔｔｌｉｔｚら、２０１０）、したがって、ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１（ＡＴＲＯＳＡＢ）を生じるヒト化プロセスが反復された。別のヒト生殖系列遺伝子を同定するため、配列同一性よりもヒトらしさ（ｈｕｍａｎｎｅｓｓ）を優先し、そしてｓｃＦｖＨ３９８に対してむしろ低い相同性のクローンを、ＶＨおよびＶＬの反復ヒト化に用いた。より高い値の正のｚスコアによって示されるような（表７）、広範なヒトらしさのため、３−１１^＊０１および１−３９^＊０２と称される遺伝子を選択した（ＡｂｈｉｎａｎｄａｎおよびＭａｒｔｉｎ ２００７）。ネズミ抗体Ｈ３９８のＣＤＲ配列を、選択した生殖系列配列のフレームワークにトランスファーし、抗体断片ｓｃＦｖＦＲＫ１３を生じた。自動生成ＳＤＲテンプレート（著作権１９９５、Ａｎｄｒｅｗ Ｃ．Ｒ． Ｍａｒｔｉｎ、ＵＣＬ）を用いた新規生成ｓｃＦｖの規範構造の分析によって、Ｈ７１およびＬ２の位で、非典型的なアミノ酸が示された。したがって、ＡＴＲＯＳＡＢの生成に用いるアミノ酸によって、これらの残基を置換した（ＶＨ：Ｒ７１Ａ、ＶＬ：Ｉ２Ｖ）。ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１に比較した、アミノ酸置換の前（ｓｃＦｖＦＲＫ１３．１）および置換後（ｓｃＦｖＦＲＫ１３．２）のヒト化ｓｃＦｖの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列中の変化を、図７の整列中に概説する。

【0272】

表７． Ｈ３９８のヒト化

【0273】

【表7】

【0274】

^＊ヒト化ＩＺＩ０６．１（ＡＴＲＯＳＡＢ ｓｃＦｖ）に用いた生殖系列遺伝子
ｓｃＦｖＦＲＫ１３の発現および特徴付け
ｓｃＦｖＦＲＫ１３．１およびｓｃＦｖＦＲＫ１３．２に加えて、その重鎖および軽鎖可変ドメインの組み合わせ、ならびにｓｃＦｖＴ１２Ｂの重鎖または軽鎖との組み合わせをクローニングし、そして産生した（図８）。ｓｃＦｖ断片を還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ｓｃＦｖＦＲＫ１３．５およびｓｃＦｖＦＲＫ１３．７に関してのみ、完全な発現およびきれいな精製が示された（図８ｂ）。すべての他の構築物に関しては、より高いおよびより低い分子量のバンドが観察され、タンパク質試料または分解産物の混入が示された。さらに、ｓｃＦｖＦＲＫ１３．５およびｓｃＦｖＦＲＫ１３．７のみが、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、計算分子量に対応する、きれいなピークを示した（図８ｃ）。より短い保持時間のより低いシグナルがどちらのタンパク質に関しても検出され、これはおそらく、二量体ｓｃＦｖまたはより高い次元の凝集物の存在を示すと考えられる。これらの知見は、新規ヒト化ＶＨドメインが、不安定なｓｃＦｖ分子を生じることを示す。

【0275】

ｓｃＦｖＦＲＫ１３．１〜１３．８の受容体結合を、対照タンパク質としてｓｃＦｖ抗体Ｔ１２ＢおよびＩＺＩ０６．１を用いて、ＥＬＩＳＡにおいてさらに分析した（図９ａ）。ｓｃＦｖＦＲＫ１３．５、ｓｃＦｖＦＲＫ１３．７およびｓｃＦｖＴ１２Ｂは、およそ１ｎＭの匹敵するＥＣ_５０値でヒトＴＮＦＲ１に結合したが（表８）、残りのｓｃＦｖセットは１００ｎＭを超える濃度でのみ弱い結合を示した。同様に、ｓｃＦｖＦＲＫ１３．５、ｓｃＦｖＦＲＫ１３．７およびｓｃＦｖＴ１２Ｂは、およそ３００ｎＭのＩＣ_５０値で、ＨＴ１０８０細胞からのＴＮＦ誘導性ＩＬ−８放出を阻害した。対照タンパク質ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１は、９３２ｎＭのＩＣ_５０値でＴＮＦＲ１遮断を示した（図９ｂ、表８）。さらに、動的光散乱法によって、熱安定性を調べた。ｓｃＦｖＦＲＫ１３．５およびｓｃＦｖＦＲＫ１３．７は、それぞれ、ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１およびｓｃＦｖＴ１２Ｂの５９℃および５５℃に比較して、６３℃および６５℃の融解温度を示した（図１０）。注目すべきことに、ｓｃＦｖＩＺＩ０６．１は、より低い温度で、すでに、平均カウント速度の増加を示し、タンパク質構造の部分的脱安定化が示された。対照的に、ｓｃＦｖＴ１２Ｂ、ｓｃＦｖＦＫＲ１３．５およびｓｃＦｖＦＲＫ１３．７のシグナルは、融点未満ではほぼ一定しており、より低い温度範囲での改善された安定性もまた明らかになった。

【0276】

表８．ヒト化ｓｃＦｖＨ３９８抗体断片の特徴付け

【0277】

【表8】

【0278】

要約すると、新規ヒト化ＶＨドメインを含有するｓｃＦｖ抗体は、適切には発現されず、そしてヒトＴＮＦＲ１への結合が破壊されているようであった。ｓｃＦｖＴ１２Ｂの再ヒト化ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含有するｓｃＦｖＦＲＫ１３．７を十分な純度で発現させ、そして該抗体は、「オフ速度成熟」一本鎖Ｆｖ抗体ｓｃＦｖＴ１２Ｂと比較して、同等に強く、ｈｕＴＮＦＲ１−Ｆｃに結合した。さらに、ｓｃＦｖＦＲＫ１３．７は、改善された熱安定性を明らかにした。

【0279】

実施例４： ＩｇＧおよびＦａｂ断片へのｓｃＦｖＦＲＫ１３．７の変換
ｓｃＦｖＦＲＫ１３．７の重鎖および軽鎖可変ドメインを、標準的クローニングおよびＰＣＲ技術によって、ＡＴＲＯＳＡＢ ＩｇＧおよびＡＴＲＯＳＡＢ Ｆａｂのバックグラウンド内に導入した。ＩｇＧ−ＦＲＫ１３．７およびＦａｂ−ＦＲＫ１３．７は、以下において、それぞれＩｇＧ１３．７およびＦａｂ１３．７と称される。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてタンパク質を一過性に産生し、そしてプロテインＡ（ＩｇＧ１３．７）または抗体（Ｆａｂ１３．７）アフィニティクロマトグラフィによって精製した。より高い分子量の小さいピークがあったため、ＩｇＧ１３．７をさらなる調製用ＳＥＣ（ＦＰＬＣ）に供した。還元（図１１ａ）および非還元条件（図１１ｃ）下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ならびにサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ、図１１ｃ）によって、発現およびタンパク質完全性を監視した。ＡＴＲＯＳＡＢおよびＦａｂＡＴＲＯＳＡＢ（ＦａｂＡＴＲ）をすべての実験で対照として用いた。４つのタンパク質はすべて、電気泳動中、計算分子量と相関するバンドを示した。同様に、ゲルろ過において観察される吸収ピークは、均質なタンパク質調製を確認し、見かけの分子量すべてが予期されるサイズと一致した。Ｆａｂ１３．７およびＩｇＧ１３．７は、ヒトＴＮＦＲ２およびマウスＴＮＦ受容体両方と比較して、ＥＬＩＳＡにおいてヒトＴＮＦＲ１に対するその特異性を保持した（図１２）。

【0280】

ヒトＴＮＦＲ１へのＦＲＫ１３．７抗体の結合
ＩｇＧ１３．７およびＦａｂ１３．７は、ＥＬＩＳＡにおいて、Ｆａｂ１３．７に関しては１．４ｎＭ、ならびにＩｇＧ１３．７の場合は０．７６ｎＭのＥＣ_５０値で、ヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃに結合した。対照タンパク質ＡＴＲＯＳＡＢおよびＦａｂＡＴＲは、より高いＥＣ_５０値によって示されるように、ＩｇＧ１３．７およびＦａｂ１３．７に比較して、それぞれ、１．４倍および８．７倍弱い結合を示した（図１３）。

【0281】

さらに、中程度の（８６Ｈｚ）または高い（１８４Ｈｚ）受容体密度のセンサーチップを用いて、水晶振動子マイクロバランスによって、結合動力学の評価を行った。対照抗体ＡＴＲＯＳＡＢは、中程度の受容体密度のヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃと、それぞれ０．３８ｎＭおよび７８ｎＭのＫ_Ｄ値によって示されるように、高アフィニティまたは低アフィニティのいずれかの比率で構成される、明らかな二相性の相互作用を示した（図１４ａ、表９）。対照的に、ＩｇＧ１３．７は、１対２結合分析において、１．７７ｘ１０^−４〜９．３０ｘ１０^−４の範囲のｋ_оｆｆ値を示し（データ未提示）、その結果、解離タンパク質の量が非常に少なく、そしてしたがって、一価および二価結合および解離下位集団間で相違がほとんど検出不能であった。したがって、ＩｇＧ１３．７を高密度チップ上で試験し、ここで、二価相互作用が明らかに優勢であり、そして結合シグナルに対する一価相互作用の寄与は大部分無視可能であり、１対１分析における評価が可能になった。０．１１ｎＭの決定されたＫ_Ｄ値は、二価結合状況を考慮すると、ＡＴＲＯＳＡＢに比較して、３．５倍の改善を反映した（図１４ｃ）。一価対照タンパク質ＦａｂＡＴＲは、検出期間（５分間）中に中程度の受容体密度のチップから、ほぼ完全に解離し、１．５ｘ１０^−２ｓ^−１の解離速度定数（ｋ_оｆｆ）および３０ｎＭのＫ_Ｄ値が明らかになった（図１４ｂ）。対照的に、抗体受容体複合体からのＦａｂ１３．７の解離は、７．３ｘ１０^−４ｓ^−１のｋ_оｆｆ値によって示されるように、かなりより緩慢であり、一方、会合速度定数（ｋ_оｎ）は、ＦａｂＡＴＲに比較してほぼ同一であった。これは、１．６ｎＭのＫ_Ｄ値を持つヒトＴＮＦＲ１に対して、Ｆａｂ１３．７の１９倍強いアフィニティを生じた（図１４ｄ、表９）。

【0282】

表９． ＩｇＧ１３．７およびＦａｂ１３．７のアフィニティ決定

【0283】

【表9】

【0284】

したがって、ＡＴＲＯＳＡＢの一価抗体構築物（ＦａｂＡＴＲ）は、Ｆａｂ１３．７に比較した際、ｈｕＴＮＦＲ１に対するはるかに劣った結合剤であることが立証された。ｈｕＴＮＦＲ１に対するｓｃＦｖ ＩＺＩ−０６．１結合のアフィニティは、ｓｃＦｖアフィニティをＦａｂ形式で測定すると、ＦａｂＡＴＲと同様である。ｓｃＦｖ ＩＺＩ−０６．１の先行技術の測定は、より優れた結果を示すことが可能である（二量体化ｓｃＦｖ分子のアビディティ効果のため）が、結合（Ｆａｂ形式）のアフィニティは、はるかに劣っており、そしてＦａｂＡＴＲと同等である。

【0285】

ｓｃＦｖＦＲＫ１３．７由来タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性および薬物動態学
それ自体はアンタゴニスト性である抗体ＡＴＲＯＳＡＢに対する、アフィニティ成熟および再ヒト化の影響を調べるため、ｓｃＦｖＦＲＫ１３．７由来ＩｇＧおよびＦａｂが、ＨＴ１０８０およびＨｅＬａ細胞から、それぞれ、インターロイキン−８および−６の放出を誘導する潜在能力を試験した。対照として含まれるＡＴＲＯＳＡＢは、ＩＬ−８の場合にのみ、記載する最低限の受容体活性化を示し（Ｒｉｃｈｔｅｒら ２０１３）、実行したＩＬ−６放出実験においては、細胞バックグラウンドを超える刺激は観察されなかった（図１５ｂおよびｃ）。一価対照タンパク質ＦａｂＡＴＲは、それぞれの細胞タイプから、ＩＬ−８もまたＩＬ−６放出も刺激しなかった。これと一致して、未処理細胞に比較して、Ｆａｂ１３．７によって誘導されるインターロイキン放出増加は観察されなかった。しかし、ＩｇＧ１３．７は、ＩＬ−８およびＩＬ−６の放出を明らかに刺激し、３３ｎＭ ＴＮＦの影響と比較して、２０％〜８７％のインターロイキンレベルを生じ、これは以前の実験において、ＴＮＦによって刺激される最大の反応に近かった。

【0286】

興味深いことに、０．１ｎＭ ＴＮＦによって誘発されたＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−８放出は、それぞれ、１１８ｎＭおよび１５１ｎＭの匹敵するＩＣ_５０値でＡＴＲＯＳＡＢおよびＦａｂＡＴＲによって阻害された（図１６ａ）。同様に、ＡＴＲＯＳＡＢおよびＦａｂＡＴＲは、０．１ｎＭ ＴＮＦによって引き起こされるＨｅＬａ細胞からのＩＬ−６放出の同等に強い阻害を明らかにした（図１６ｂ、表１０）。そのアゴニスト性活性のため、ＩｇＧ１３．７の半最大阻害（ＩＣ_５０）の濃度は決定されなかった。対照的に、Ｆａｂ１３．７は、それぞれ１８．７ｎＭおよび３１．４ｎＭのＩＣ_５０値で、用量依存方式で、０．１ｎＭ ＴＮＦに反応してＩＬ−８およびＩＬ−６放出を阻害し、全長ＩｇＧ ＡＴＲＯＳＡＢに比較して、５．８倍〜６．２倍、改善されたＴＮＦ中和を明らかにした。

【0287】

さらに、ｓｃＦｖＦＲＫ１３．７から生じた全長ＩｇＧおよびＦａｂ断片が、Ｋｙｍ−１細胞におけるＴＮＦＲ１仲介性細胞死を促進するかまたは阻害する潜在能力を調べた。対照タンパク質ＡＴＲＯＳＡＢおよびＦａｂＡＴＲと一致して、Ｆａｂ１３．７による刺激は、いかなる検出可能な細胞傷害性も導かなかった（図１７ａ）。一方、ＩｇＧ１３．７は、３３ｎＭで用いられる陽性対照ＴＮＦと同等に、広範囲の濃度で、Ｋｙｍ−１細胞のほぼ１００％を根絶した。非アゴニスト性Ｆａｂ１３．７の阻害能を調べるため、Ｋｙｍ−１細胞を０．０１ｎＭ ＴＮＦとインキュベーションすると、１回の処理で、細胞のほぼ９０％が死んだ。Ｆａｂ１３．７および対照タンパク質ＡＴＲＯＳＡＢおよびＦａｂＡＴＲは、それぞれ４．７ｎＭ、２４ｎＭおよび３７ｎＭのＩＣ_５０値で、ＴＮＦ仲介性細胞死を阻害し、インターロイキン放出アッセイの観察を裏付けた（図１７ｂ、表１０）。

【0288】

表１０． ＡＴＲＯＳＡＢおよびＦＲＫ１３．７抗体の生物活性

【0289】

【表10】

【0290】

薬剤特異的抗体の存在下で、Ｆａｂ１３．７の潜在的なアゴニスト活性のリスクを評価するため、ヤギから単離したポリクローナル抗ヒトＦａｂ血清と組み合わせて、ＨＴ１０８０細胞に対するＦａｂ１３．７の生物活性を試験した。標準的結合ＥＬＩＳＡにおいて、Ｆａｂ１３．７へのヒトＦａｂ特異的ヤギ血清の結合を示すことが可能であった（図１８ａ）が、ＩＬ−８放出アッセイにおいて、６４μｇ／ｍｌの血清とともに、Ｆａｂ１３．７の細胞バックグラウンドより高い刺激活性の増加は検出されなかった（図１８ｂ）。しかし、ＡＴＲＯＳＡＢは、抗ヒトＦａｂ血清との同時処理に反応して、ＩＬ−８の明らかに増加した誘導を示した（図１８ｂ）。抗ヒトＦｃ抗体とともに、ＡＴＲＯＳＡＢを用いた以前の実験（未公表、データ未提示）において、類似の結果が得られた。

【0291】

ヒト対応物によって置換されたＴＮＦＲ１細胞外ドメインを有するトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用いて、ＦａｂＡＴＲおよびＦａｂ１３．７の薬物動態学的特性を分析した（図１９）。およそ０．２５時間の初期半減期は、体内の迅速な分布を示した。Ｆａｂ断片はどちらも、ＦａｂＡＴＲに関しては１．７時間、そしてＦａｂ１３．７の場合は１．５６時間の最終半減期によって、血液から迅速に除去された。これらの結果は、ＡＴＲＯＳＡＢのＦａｂ断片に比較して、進化したＴＮＦＲ１アンタゴニスト性Ｆａｂ１３．７の不変の薬物動態学的プロファイルを明らかにした。データの要約を表１１に示す。

【0292】

表１１． ＦａｂＡＴＲおよびＦａｂ１３．７の薬物動態学的分析

【0293】

【表11】

【0294】

実施例５： Ｆａｂ１３．７のＰＥＧ化誘導体
ｉｎ ｖｉｖｏのＦａｂ１３．７のかなり短い循環時間を回避するため、一方で、流体力学半径を増加させ、そして他方でＦｃＲｎ仲介性薬剤リサイクリングを可能にすることを意図する、いくつかの戦略が研究の対象となった。

【0295】

まず、Ｆａｂ１３．７（Ｆｄ：配列番号２５、軽鎖：配列番号２６）を、記載されるように（Ｃｈｏｙら ２００２）、重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）で修飾した。簡潔には、最初のシステイン残基を含み、２つのアラニン残基が続く、ＩｇＧ１ヒンジ領域の天然存在アミノ酸配列部分を、ＣＨ１ドメインに、Ｃ末端で付加し（・・・ＤＫＴＨＴＣＡＡ（配列番号３４）、図２０ａ、配列番号２７、軽鎖、Ｆａｂ１３．７を参照されたい、配列番号２６）、Ｆａｂ１３．７’を生じた。新規導入システイン残基の潜在的に形成されるジスルフィド連結を減少させるため、０．６２５ｍＭ ＴＣＥＰを用いて、ＰＥＧ_{４０．０００}をＦａｂ１３．７’にコンジュゲート化した（図２０ｂ）。こうして生成されたＦａｂ１３．７_ＰＥＧは、ＥＬＩＳＡにおいて、非修飾Ｆａｂ１３．７と比較した際、２．６倍増加したＥＣ_５０値で、固定されたヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合タンパク質に結合した（図２０ｃ、表１２）。Ｆａｂ１３．７_ＰＥＧは、ＨＴ１０８０細胞を用いたＩＬ−８放出アッセイにおいて決定されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＴＮＦＲ１の有意な活性化は示さなかった（図２０ｄ）。同じアッセイ条件下で、Ｆａｂ１３．７_ＰＥＧは、Ｆａｂ１３．７と比較した際、４．９倍より高いＩＣ_５０値で、０．１ｎＭ可溶性ＴＮＦによって誘導される、ＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−８放出を阻害した（図２０ｅ、表１２）。ＰＥＧ_{４０．０００}でのＦａｂ１３．７の修飾は、改善されたｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態学的プロファイルを生じた。Ｆａｂ１３．７に比較して、初期および終期半減期および曲線下面積は、それぞれ、３．８、１８．０および２２．２の係数で増加した（図２０ｆ、表１２）。

【0296】

表１２．一価Ｆａｂ１３．７変異体の生物活性

【0297】

【表12】

【0298】

^＊異なる単一実験において、多様な値が検出された
実施例６： Ｆａｂ１３．７ ＭＳＡ融合タンパク質
別のアプローチにおいて、Ｆａｂ１３．７を、１２アミノ酸リンカーによって連結して、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に遺伝子融合させた（図２１ａ、Ｆｄ−ＭＳＡ：配列番号２８、軽鎖、Ｆａｂ１３．７を参照されたい、配列番号２６）。こうして生成されたＦａｂ１３．７−ＭＳＡは、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、１つの単一バンドを示し、これは１１４ｋＤａの計算分子量に対応した（図２１ｂ）。還元条件下で、２つのバンドが観察され、これは、ＭＳＡ部分に融合した、解離軽鎖およびＦｄ断片に相当した。サイズ排除クロマトグラフィによって、タンパク質構造の完全性および凝集またはオリゴマー化タンパク質分画の非存在が確認された（図２０ｃ）。Ｆａｂ１３．７−ＭＳＡは、ＥＬＩＳＡにおいて、非修飾Ｆａｂ１３．７に比較した際、１．７倍増加したＥＣ_５０値で、固定されたヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合タンパク質に結合し（図２１ｄ、表１２）、そしてＨＴ１０８０細胞を用いたＩＬ−８放出アッセイにおいて決定した際、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＮＦＲ１の有意な活性化は示さなかった（図２１ｅ）。同じアッセイ条件下で、Ｆａｂ１３．７−ＭＳＡは、Ｆａｂ１３．７に比較した際、１．９倍より高いＩＣ_５０値で、０．１ｎＭ可溶性ＴＮＦによって誘導された、ＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−８放出を阻害した（図２１ｆ、表１２）。ＭＳＡへのＦａｂ１３．７の融合は、改善されたｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態学的プロファイルを生じた。Ｆａｂ１３．７に比較して、初期および終期半減期、ならびに曲線下面積は、それぞれ、７．８、４．３および２１．３の係数で増加した（図２１ｇ、表１２）。

【0299】

実施例７： ＩｇＧ−１３．７ハーフ抗体
損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）Ｆａｂ１３．７部分を、そして加えて、ＣＨ２−ＣＨ３遷移に位置するＦｃＲｎ結合部位を含有する一価ＩｇＧ分子を生成するため、重鎖二量体化を回避するために、ＩｇＧ１ヒンジ領域およびＦｃ部分のアミノ酸組成を変化させた（図２２ａ、重鎖ＩｇＧ１３．７_ハーフ：配列番号２９、軽鎖、Ｆａｂ１３．７を参照されたい、配列番号２６）。簡潔には、鎖間ジスルフィド連結の形成を妨害するため、ヒンジ領域の２つのシステインをセリンによって置換した（Ｃ２２４Ｓ、Ｃ２２７Ｓ）。ホモマーＣＨ３−ＣＨ３相互作用を妨害する意図で、ＣＨ３ドメイン内に、４つのさらなる突然変異を導入した（Ｐ３９３Ａ、Ｆ４０３Ｒ、Ｙ４０５Ｒ、Ｋ４０７Ｄ）（Ｇｕら、２０１５もまた参照されたい、配列番号２９、軽鎖、Ｆａｂ１３．７を参照されたい、配列番号２６）。こうして生成されたＩｇＧ１３．７_ハーフは、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、７３ｋＤａの計算分子量に対応する、１つの単一バンドを示した（図２２ｂ）。還元条件下で、重鎖および軽鎖に相当する、２つのバンドが観察された。サイズ排除クロマトグラフィによって、タンパク質構造の完全性および凝集またはオリゴマー化タンパク質分画の非存在が確認された（図２１ｃ）。ＩｇＧ１３．７_ハーフは、ＥＬＩＳＡにおいて、非修飾Ｆａｂ１３．７に比較した際、１．９倍増加したＥＣ_５０値で、固定されたヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合タンパク質に結合し（図２２ｄ、表１２）、そしてＨＴ１０８０細胞を用いたＩＬ−８放出アッセイにおいて決定した際、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＮＦＲ１の有意な活性化は示さなかった（図２２ｅ）。同じアッセイ条件下で、ＩｇＧ１３．７_ハーフは、Ｆａｂ１３．７に比較した際、１．８倍より高いＩＣ_５０値で、０．１ｎＭ可溶性ＴＮＦによって誘導された、ＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−８放出を阻害した（図２２ｆ、表１２）。単量体Ｆｃ部分へのＦａｂ１３．７の融合は、改善されたｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態学的プロファイルを生じた。Ｆａｂ１３．７に比較して、ＩｇＧ１３．７_ハーフの初期および終期半減期、ならびに曲線下面積は、それぞれ、３．７、２．３および４．５の係数で増加した（図２２ｇ、表１２）。

【0300】

実施例８：一価Ｆａｂ１３．７−Ｆｃ融合タンパク質
ＩｇＧ１３．７_ハーフの場合の薬物動態学的特性の限定された改善を克服するため、Ｆａｂ１３．７のＦｄおよび軽鎖をどちらも、「ノブ・イントゥ・ホール」修飾を適用して、ヘテロ二量体化を助長するさらなる突然変異を含有するＦｃγＲサイレンシングＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなるタンパク質部分に融合させた（図２３ａ、Ｍｅｒｃｈａｎｔら ２０１３、Ｆｄ１３．７−Ｆｃ_ホール：配列番号３０、ＬＣ１３．７−Ｆｃ_ノブ：配列番号３１）。簡潔には、Ｆｃγ受容体への結合を抑制すると報告された、ＣＨ１、ヒンジ領域およびＣＨ２における突然変異（Ａｒｍｏｕｒら １９９９、Ｒｉｃｈｔｅｒら ２０１３、Ｓｈｉｅｌｄｓら ２００１、Ｚｅｔｔｌｉｔｚら ２０１０）、ならびにヒンジ領域における上記のシステインからセリンへの変化に加えて、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを、Ｆｄ断片に連結されたＣＨ３ドメインに導入する一方、Ｆａｂ１３．７軽鎖に連結したＣＨ３ドメインの単一のスレオニン残基をトリプトファン（Ｔ３６６Ｗ）に変化させた。それによって生成されたＦａｂ１３．７−Ｆｃ_ｋｉｈ０ＤＳ（ノブ・イントゥ・ホール［ｋｉｈ］駆動ヘテロ二量体化を含み、そしてヒンジ領域中のジスルフィド結合を持たない［０ＤＳ］Ｆｃ部分に連結されたＦａｂ１３．７）は、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、全タンパク質に関する９８ｋＤａの計算分子量に対応する、１つの単一バンドを示した（図２３ｂ）。還元条件下で、重鎖および軽鎖に相当する、２つのバンドが観察された。サイズ排除クロマトグラフィによって、タンパク質構造の完全性および凝集またはオリゴマー化タンパク質分画の非存在が確認された（図２３ｃ）。Ｆａｂ１３．７−Ｆｃ_ｋｉｈ０ＤＳは、ＥＬＩＳＡにおいて、非修飾Ｆａｂ１３．７に比較した際、類似の活性で、固定されたヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合タンパク質に結合し（図２３ｄ、表１２）、そしてＨＴ１０８０細胞を用いたＩＬ−８放出アッセイにおいて決定した際、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＮＦＲ１の有意な活性化は示さなかった（図２３ｅ）。同じアッセイ条件下で、Ｆａｂ１３．７−Ｆｃ_ｋｉｈ０ＤＳは、Ｆａｂ１３．７に比較した際、２．３倍より高いＩＣ_５０値で、０．１ｎＭ可溶性ＴＮＦによって誘導された、ＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−８放出を阻害した（図２３ｆ、表１２）。ヘテロ二量体Ｆｃ部分へのＦａｂ１３．７の融合は、改善されたｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態学的プロファイルを生じた。Ｆａｂ１３．７に比較して、Ｆａｂ１３．７−Ｆｃ_ｋｉｈ０ＤＳの初期および終期半減期、ならびに曲線下面積は、それぞれ、７．０、８．９および２１．３の係数で増加した（図２３ｇ、表１２）。

【0301】

実施例９：一価Ｆｖ１３．７−Ｆｃ融合タンパク質
別の形式において、Ｆｖ１３．７の可変ドメイン（ＶＨ、ＶＬ）を別個に、Ｆａｂ１３．７−Ｆｃ_ｋｉｈ０ＤＳに関して記載するように、Ｆｃ鎖のヒンジ領域（ＶＨ−ヒンジ−Ｆｃ（ノブ）、ＶＬ−ヒンジ−Ｆｃ（ホール））に融合させた（図２４ａ、ＶＨ１３．７−Ｆｃ_ホール：配列番号３２、ＶＬ１３．７−Ｆｃ_ノブ：配列番号３３）。それによって生成されたＦｖ１３．７−Ｆｃ_ｋｉｈ０ＤＳは、還元および非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、類似の分子量である両方の個々のポリペプチド鎖に相当する、１つの単一バンドを示し、全タンパク質に関する９８ｋＤａの計算ＭＷを生じた（図２４ｂ）。サイズ排除クロマトグラフィによって、タンパク質構造の完全性および凝集またはオリゴマー化タンパク質分画の非存在が確認された（図２４ｃ）。Ｆｖ１３．７−Ｆｃ_ｋｉｈ０ＤＳは、ＥＬＩＳＡにおいて、非修飾Ｆａｂ１３．７に比較した際、わずかに増加した活性で、固定されたヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合タンパク質に結合し（図２４ｄ、表１２）、そしてＨＴ１０８０細胞を用いたＩＬ−８放出アッセイにおいて決定した際、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＮＦＲ１の有意な活性化は示さなかった（図２４ｅ）。同じアッセイ条件下で、Ｆｖ１３．７−Ｆｃ_ｋｉｈ０ＤＳは、Ｆａｂ１３．７に比較した際、類似のＩＣ_５０値で、０．１ｎＭ可溶性ＴＮＦによって誘導された、ＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−８放出を阻害した（図２４ｆ、表１２）。ヘテロ二量体Ｆｃ部分へのＦｖ１３．７の融合は、改善されたｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態学的プロファイルを生じた。Ｆａｂ１３．７に比較して、Ｆｖ１３．７−Ｆｃ_ｋｉｈ０ＤＳの初期および終期半減期、ならびに曲線下面積は、それぞれ、４．１、１０．５および１５．４の係数で増加した（図２４ｇ、表１２）。

【0302】

本データは、抗体受容体複合体のかなりより緩慢な解離から生じる、ＡＴＲＯＳＡＢおよびＦａｂＡＴＲに比較した、Ｆａｂ１３．７の改善されたアンタゴニスト強度を立証した。インターロイキン放出および細胞傷害性アッセイにおいて、ＡＴＲＯＳＡＢおよびＦａｂＡＴＲに関して、類似のＩＣ_５０値が観察されたため、２ではなく１つのみの受容体結合部位の存在は、ＴＮＦ仲介性ＴＮＦＲ１活性化を阻害する能力を減少させないようである。対照的に、ヒトＴＮＦＲ１の第二の結合部位の非存在は、ＩｇＧ１３．７の場合に観察されるアゴニスト性強度を排除した。さらに、単独で、あるいは抗体仲介性架橋による二価または多価の回復を意図した、ヒトＦａｂに特異的なポリクローナルヤギ血清の存在下で、Ｆａｂ１３．７のアゴニスト活性は検出不能であった。これはおそらく、ｉｎ ｖｉｖｏ状況下で、抗薬剤免疫反応の場合であっても、炎症関連副作用のリスクが減少していることを示しうる。最後に、減少したサイズおよびＦｃＲｎ仲介性薬剤リサイクリングの欠如のため、Ｆａｂ１３．７は、全ＩｇＧ分子と比較して、血中でかなり短い循環時間を示す。半減期延長戦略の実行はこの欠点を克服することを可能にし、将来の臨床適用に関する、ヒト体内での長い循環の必要性を満たすためにＦａｂ１３．７が成功裡に修飾される潜在能力が強調された。

【0303】

実施例１０：標準アッセイの特定の材料および方法
材料
セイヨウワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体、ＨＲＰコンジュゲート化抗ヒトＩｇＧ（全分子、Ｆｃ特異的、Ｆａｂ特異的）抗体を、それぞれ、Ｓｉｇｍａ（ドイツ・タウフキルヘン）から購入した。ｓｃＦｖ抗体のＨｉｓタグをターゲティングするＨＲＰコンジュゲート化抗体をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国サンタクルーズ）から購入した。ヒト横紋筋肉腫細胞株Ｋｙｍ−１を、ＲＰＭＩ １６４０培地、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン中で増殖させ、そしてＨＴ１０８０ｗｔ細胞およびＨｅＬａ細胞をＲＰＭＩ １６４０培地、５％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン中で増殖させた。ヒトＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（Ｍｏｈｌｅｒら １９９３， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５１． Ｊｇ．， Ｎｒ． ３， Ｓ． １５４８−１５６１）。化学薬品をＲｏｔｈ（ドイツ・カールスルーエ）より購入し、一方、酵素（クローニングおよびＰＣＲ）および補充試薬をＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（ドイツ・ミュンヘン）より購入した。消耗品のいかなる異なる供給源も、以下に明らかに記述する。

【0304】

ＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合タンパク質の発現
ヒトＴＮＦＲ１（ａａ２９〜２１１）、マウスＴＮＦＲ１（ａａ３０〜２１２）、およびマウスＴＮＦＲ２（ａａ２３〜２５８）の細胞外領域をコードするＤＮＡは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）エントリーＰ１９４３８（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＴＮＦＲ１）、Ｐ２０３３３（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＴＮＦＲ２）、およびＰ２５１１９（マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＴＮＦＲ２）の配列情報を用い、個々のドメイン間に適切な制限部位を導入し、そしてｐＳｅｃＴａｇＬ１−Ｆｃ（ｐＳｅｃＴａｇ−ＦｃＨｉｓ（Ｍｕｌｌｅｒら Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ （２００８） ３３９（１）： ９０−８）より修飾）内にクローニングして、合成的に産生された。ＨＥＫ２９３細胞を、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ・カールスルーエ）を用いてプラスミドＤＮＡでトランスフェクションし、そして安定トランスフェクションクローンを、記載されるように、ゼオシンの存在下で選択した（Ｍｕｌｌｅｒら Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ （２００７） ２８２（１７）：１２６５０−６０）。ＲＰＭＩ、５％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン中で、細胞を９０％集密まで拡大した。タンパク質産生のため、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ・カールスルーエ）で培地を置換し、そして上清を３〜４日ごとに収集した。以下に記載するように、細胞培養上清からタンパク質を精製した。

【0305】

大腸菌ＴＧ１の周辺質におけるｓｃＦｖ抗体断片の発現
発現プラスミドを含有する大腸菌ＴＧ１の出発培養を、２０ｍｌ ２ｘＴＹ（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１％グルコース）中、３７℃で一晩インキュベーションした。翌日、１リットル２ｘＴＹ（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．１％グルコース）に１０ｍｌの一晩培養物を接種し、そして３７℃で０．８〜１．０のＯＤ［６００ｎｍ］に到達するまで、振盪しながらインキュベーションした。１ｍｌ ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）の添加に続いて、培養を室温でさらに３〜４時間インキュベーションした。４５００^＊ｇの遠心分離によって、細菌を採取し、そしてペレットをＰＰＢ中で、５０ｍｌの最終体積に再懸濁した。周辺質から抗体断片を放出させるため、０．２５ｍｌのリゾチーム（ｄｄＨ２Ｏ中１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、そして懸濁物をその後、氷上で３０分間インキュベーションした。次の遠心分離工程（１０，０００^＊ｇ、１０分間、４℃）前に、０．５ｍｌの１Ｍ ＭｇＳＯ４を添加することによって、残ったスフェロブラストを安定化した。上清を、ＰＢＳに対して４℃で一晩透析した。以下に記載するように、さらなる遠心分離工程（１０００^＊ｇ、１５分間、４℃）後、透析した溶液から抗体断片を精製した。

【0306】

一過性トランスフェクション後のＩｇＧ１３．７およびＦａｂ３．７の発現
５つの１７５ｃｍ^２ボトルが７０〜９０％集密に到達するまで、ＨＥＫ２９３細胞を培養した。１００μｇのベクターＤＮＡおよび２５０μｌリポフェクタミンをまず、各々７ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと個々に混合し、そして次いでともに混合し、そしてＲＴで３０分間インキュベーションした。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭを用いて、２５ｍｌの体積までトランスフェクション混合物を調節し、各ボトルの培地を５ｍｌのトランスフェクション溶液で置換し、そして細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４〜６時間インキュベーションした。トランスフェクション培地を５０ｍｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭによって置換することで産生を開始し、この培地を２日ごとに、少なくとも１リットルが収集されるまで置換した。上清を以下のように滅菌ろ過し、そして精製した。

【0307】

タンパク質精製−固定金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）
滅菌ろ過した組織培養上清または透析した周辺質抽出物を、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｎｉ−ＮＴＡアガロース、６４−１７−５、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、ドイツ・デューレン）とともに、回転させながら４℃で一晩インキュベーションした。精製樹脂を収集するため、ビーズを含有する上清を、Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ（登録商標）クロマトグラフィカラムに引力流動または中程度の真空圧によって装填した。２０ｍＭイミダゾールを含有するＩＭＡＣ緩衝剤を用いて、同時に行うブラッドフォード試験（９６ウェルマイクロタイタープレート中で混合される、９０μｌブラッドフォード試薬（５００−０００６、ＢＩＯ−ＲＡＤ、ドイツ・ミュンヘン）＋１０μｌ試料）によって、フロースルー中にタンパク質がほぼ検出されなくなるまで、洗浄を行った。ＩＭＡＣ緩衝剤中の２５０ｍＭのイミダゾールで樹脂からタンパク質を溶出させ、そして５００μｌの分画を収集した。タンパク質含有分画（記載するように、ブラッドフォード迅速試験によって決定）をプールし、そしてＰＢＳに対して透析した。

【0308】

タンパク質精製−抗体およびプロテインＡアフィニティクロマトグラフィ
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＡＦｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−６５０Ｆ（プロテインＡ樹脂、２２８０５、Ｔｏｓｏｈ、ドイツ・シュトゥットガルト）またはＨｉＴｒａｐ ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（アガロースマトリックスにコンジュゲート化されたカッパ鎖選択的抗体断片、１７−５４５８−１２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国チャルフォント・セント・ジャイルズ）樹脂のいずれかを用いて、ＩＭＡＣに関して記載されるように、方法を正確に行った。ＰＢＳを用いて洗浄を行い、そして１００ｍＭグリシン、ｐＨ２〜３で、樹脂からタンパク質を溶出させた。溶出した分画を直接プールし、そしてＰＢＳに対して直ちに透析した。

【0309】

調製用サイズ排除クロマトグラフィ
調製物中に凝集したかまたは多量体として集合したタンパク質がある場合、Ａｅｋｔａ精製装置を用いて、さらなるサイズ排除工程を行った。液相としてＰＢＳを用い、０．５ｍｌ／分の流速で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬカラム上で、タンパク質を分離した。２００μｌの分画を収集し、そして試料を含有するピークをさらなる実験のためにプールした。

【0310】

タンパク質特徴付け−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
Ｌａｅｍｍｌｉ １９７０に厳密にしたがって、３μｇのタンパク質調製物、ならびにスタッキングおよび分離ゲルの示す割合を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。

【0311】

タンパク質特徴付け−サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）
流体力学半径を決定するため、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｙａｒｒａ ＳＥＣ−２０００カラム（３００ｘ７．８ｍｍ、０．５ｍｌ／分の流速）と組み合わせてＷａｔｅｒｓ ２６９５ ＨＰＬＣを用いて、３０μｇの精製タンパク質試料を分析した。可動相は０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、０．１Ｍ Ｎａ２ＳＯ４、ｐＨ６．７であった。以下の標準タンパク質を用いた：チログロブリン（６６９ｋＤａ）、アポフェリン（４４３ｋＤａ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（１５０ｋＤａ）、ＢＳＡ（６６ｋＤａ）、カルボニックアンヒドラーゼ（２９ｋＤａ）、ＦＬＡＧペプチド（１ｋＤａ）。

【0312】

タンパク質特徴付け−動的光散乱法による熱安定性
増加する温度に対する安定性を、ＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ドイツ・ヘレンバーグ）を用いた動的光散乱法によって測定した。およそ１００μｇの精製タンパク質試料をＰＢＳの使用によって総体積１ｍｌに調節し、そして水晶キュベットに適用した。秒あたりのキロカウント（ｋｃｐｓ）を測定し、これは溶液中の変性タンパク質粒子のサイズを示し、このサイズは、タンパク質が加熱に際して凝集する間、増加する。温度を段階的に３５℃から８０℃（１℃間隔、各測定前に２分間平衡）まで、段階的に増加させた。

【0313】

酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
マイクロタイタープレートを１００μｌの示すタンパク質（ＰＢＳ中、１μｇ／ｍｌ、表３．３を参照されたい）でコーティングし、そして４℃で一晩インキュベーションした。残った結合部位を２％ＭＰＢＳ（ＰＢＳ中のスキムミルク、ウェルあたり２００μｌ）で室温で２時間ブロッキングし、そして続いてＰＢＳで２回洗浄した。２％ＭＰＢＳ中で希釈した試料１００μｌを、室温で１時間インキュベーションした後、２％ＭＰＢＳ中、ＨＲＰコンジュゲート化検出抗体１００μｌを伴う、最後のインキュベーション工程を行った。競合実験の場合、どちらの分析タンパク質試料も、個々に（例えば滴定するかまたは単一濃度に希釈するかいずれかで）調製し、そしてプレートに適用する前に混合した。結合したタンパク質を、１００μｌ ＴＭＢ基質溶液で検出し、ＨＲＰ反応を５０μｌ １Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって停止し、そしてＩｎｆｉｎｉｔｅマイクロタイタープレート読み取り装置（ＴＥＣＡＮ、スイス・メンネドルフ）を用いて４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。各インキュベーション工程の間で、そして検出の前に、プレートをＰＢＳＴで３回そしてＰＢＳで２回洗浄した。

【0314】

水晶振動子マイクロバランスを用いたアフィニティ測定
タンパク質−タンパク質相互作用におけるリアルタイム結合動力学を、水晶振動子マイクロバランス測定（Ａ−１００ Ｃ−ＦａｓｔまたはＣｅｌｌ−２００ Ｃ−Ｆａｓｔ、Ａｔｔａｎａ、スウェーデン・ストックホルム）によって決定した。結合パートナーの一方（リガンド、例えばＴＮＦＲ１−Ｆｃ）を、異なる密度で（以前公表された結果を確認するための飽和条件の場合はほぼ２００Ｈｚ、および細胞表面の状況により類似した、より低い受容体密度の条件を確立するためには、５０〜１００Ｈｚ、特に約５０Ｈｚ）、製造者のプロトコルにしたがって、カルボキシルセンサーチップ上に化学的に固定した。ｐＨ７．４のＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で希釈した試料（分析物）を用い、２５μｌ／分の流速、３７℃で、結合実験を行った。２５μｌの５ｍＭ ＮａＯＨまたは２０ｍＭグリシン、ｐＨ２．０でチップを再生した。３回目の測定ごとに、流動緩衝液注入を測定し、これを結合曲線から減じた。特定のデバイスに関してＡｔｔａｎａによって提供されるソフトウェアを用いてデータを収集し、そしてＡｔｔａｃｈｅ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ａｔｔａｎａ、スウェーデン・ストックホルム）およびＴｒａｃｅＤｒａｗｅ（ｒｉｄｇｖｉｅｗ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、スウェーデン・バンジ）によって分析した。

【0315】

Ｋｙｍ−１細胞傷害性アッセイ
Ｋｙｍ−１細胞（ウェルあたり１ｘ１０^４）を９６ウェルマイクロタイタープレートに植え付け、そして３７℃および５％ＣＯ_２で一晩インキュベーションした。ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＣＳ中でタンパク質を希釈した。２つのタンパク質種を競合実験においてともに用いる場合、両方の試料を個々に調製し（滴定するかまたは単一濃度に希釈するかいずれかで）、そしてプレートに適用する前に混合した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションした後、上清を廃棄し、そして５０μｌクリスタルバイオレット溶液を細胞に添加した。続いて、プレートをｄｄＨ_２Ｏ中で２０回洗浄し、そして乾燥させた。染色溶液中に含有されるメタノールによって固定された、生存および接着細胞から生じる残りのバイオレット色素を、１００μｌメタノールを添加し、ＲＴで１０分間振盪することによって溶解した。Ｉｎｆｉｎｉｔｅマイクロタイタープレート読み取り装置（Ｔｅｃａｎ、スイス・メンネドルフ）を用いて、プレートを測定した。

【0316】

インターロイキン放出アッセイ
ウェルあたり２ｘ１０^４ ＨｅＬａまたはＨＴ１０８０細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートに植え付け、そして１００μｌのＲＭＰＩ １６４０＋５％ＦＣＳ中で一晩増殖させた。翌日、連続して産生されるサイトカインを除去するため、上清を交換した。ＲＰＭＩ １６４０＋５％ＦＳＣ中の試料の希釈シリーズとともに、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベーションした。競合実験の場合、分析したタンパク質試料をどちらも、個々に調製し（滴定するかまたは単一濃度に希釈するかいずれかで）、そしてプレートに適用する前に混合した。非刺激細胞は対照として働いた。１６〜２０時間後、プレートを５００ｇで５分間遠心分離し、そして製造者のプロトコルにしたがって実行するＥＬＩＳＡによって、細胞上清を直接分析した。上清をＲＰＭＩ １６４０（ＦＣＳ不含）中で希釈し、そして抗体を試薬希釈剤（０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、２０ｍＭ ＴＲＩＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で希釈した。コーティングしたマイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いてブロッキングし、そしてＥＬＩＳＡに関して上述するように、洗浄ならびに検出および測定を行った。細胞培養上清中のＩＬ−６およびＩＬ−８の検出のためのサンドイッチＥＬＩＳＡキットを、ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ（ドイツ・フリーゾイテ）から購入した。

【0317】

薬物動態学
特定のマウス遺伝子の遺伝子座にヒトＴＮＦＲ−１の細胞外ドメインの遺伝子を所持するトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｈｕＴＮＦＲＳＦ１Ａｅｃｄｔｍ１ＵＥＧ／ｉｚｉ）に、１２〜２５μｇの分析タンパク質を静脈内注射した。非改変遺伝的バックグラウンドのＣ５７ＢＬ／６Ｊは対照として働いた。３分、３０分、１時間、３時間、および６時間後、ならびに３日および７日後に血液試料を収集し、そして直ちに氷上でインキュベーションした。遠心分離によって血清を分離し（１３．０００ｇ、４℃、１０分間）、そして−２０℃で保存した。上述のような結合ＥＬＩＳＡによって、血清中の残りのタンパク質を検出した。データを３分の値の割合として示した。あるいは、注射時点のＥＬＩＳＡシグナルを、得た曲線から内挿し、そして注射用量およびマウスの平均血液体積に基づいて、初期ｉｎ ｖｉｖｏ濃度に設定し、測定時点での示す濃度を生じた。

【0318】

ファージディスプレイ−アクセプターベクターｐＨＥＮＩＳ＿ｓｃＦｖＩＧ１１−ｆｓＳＴＯＰのクローニング
ｓｃＦｖＩＧ１１をコードするＤＮＡ配列を、プライマーＮｃｏＩ＿ＶＨＩＺＩ０６．１＿ｂａｃｋおよびＢｓｔＺ１７Ｉ＿ｆｓＳＴＯＰ＿ ＢｓｓＨＩＩ＿ｆｏｒを用いて、テンプレートｐＨＥＮＩＳ−ｓｃＦｖＬ２ａ＿ｈｕＢＲ６＿ＩＧ１１（Ｚｅｔｔｌｉｔｚ ２０１０ｂ）から、ＰＣＲ（上述）によって増幅した。停止コドンと組み合わせてフレームシフトを含有する、得たＤＮＡ断片を、ＮｃｏＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉで消化した後、再び、ｐＨＥＮＩＳｓｃＦｖＬ２ａ＿ｈｕＢＲ６＿ＩＧ１１に挿入して、アクセプターベクター、ｐＨＥＮＩＳ＿ｓｃＦｖＩＧ１１−ｆｓＳＴＯＰを生じた。

【0319】

ファージディスプレイ−選択ライブラリーＥＰ０３の生成
ｓｃＦｖＴ１２Ｂを生じるｓｃＦｖＩＧ１１のアフィニティ成熟のための選択ライブラリーＥＰ０３は、製造者のプロトコルにしたがって、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩランダム突然変異誘発キット（２００５５０、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州サンタクララ）を用いて、エラープローンＰＣＲによって生成された。テンプレートＤＮＡ ｐＨＥＮＩＳ−ｓｃＦｖＬｉｂ２ａ＿ｈｕＢＲ６＿ＩＧ１１を、プライマーＬＭＢ２およびｆｄＳｅｑ１の使用によって増幅した。突然変異の中程度の発生率を生じることを意図し、０．１μｇテンプレートＤＮＡを３０周期のＰＣＲ反応で用いた。生じたＰＣＲ産物を、酵素ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩによって消化した後、アクセプターベクターｐＨＥＮＩＳ＿ｓｃＦｖＩＧ１１＿ ｆｓＳＴＯＰにクローニングした。１６℃で一晩、連結を行った。翌日、連結混合物体積（ＬＭＶ）の１／１０の３Ｍ ＮａＡｃ ｐＨ５．２、５μｌグリコーゲン（２０μｇ／μｌ）および２．７ ＬＭＶの１００％エタノールを添加することによって、連結されたＤＮＡを沈殿させた。−８０℃で１時間インキュベーションした後、ＤＮＡを遠心分離し（１３．０００^＊ｇ、ＲＴ、５分間）、そして風乾したペレットを４０μｌ ｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、そして２〜４μｌアリコット中で、−２０℃で再び凍結した。３．１８．３．エレクトロコンピテント大腸菌ＴＧ１の調製。ＳＯＢ培地（１％グルコースを含有）中の大腸菌ＴＧ１の一晩培養５ｍｌを５００ｍｌの新鮮なＳＯＢにトランスファーすることで、培養を接種してそして０．５〜１．０のＯＤ［６００ｎｍ］に到達するまで増殖させた。細胞を続いて氷上で少なくとも１５分間冷却し、そして遠心分離によって採取した（２０００^＊ｇ、４℃、１５分間）。細胞ペレットを２００ｍｌの氷冷ｄｄＨ２Ｏ（まず２０ｍｌを用い、再懸濁後、さらに１８０ｍｌを添加した）に穏やかに再懸濁した。遠心分離／再懸濁周期を、正確に上述するように２回目に繰り返し、次いで、再懸濁された細胞を氷上に３０分間維持し、そして再び遠心分離した（２０００^＊ｇ、４℃、１５分間）。１０％グリセロール５０ｍｌ中に細菌を再懸濁し、氷上でさらに３０分間インキュベーションし、そして再び、遠心分離によって収集した（１５００^＊ｇ、４℃、１５分間）。生じたペレットを５００〜１０００μｌの最終体積に再懸濁し、氷上で維持し、そしてエレクトロポレーションに直接用いた。

【0320】

ファージディスプレイ−大腸菌ＴＧ１のエレクトロポレーション
エレクトロコンピテント大腸菌ＴＧ１（ＳｔｒａｔａＧｅｎ、米国ワシントン州カークランド）を新鮮に調製し、そして４０μｌの細胞懸濁物を、連結ＤＮＡの凍結アリコットと混合した。氷上で１分間インキュベーションした後、ＤＮＡ細菌混合物を、エレクトロポレーションキュベット（ＢＩＯ−ＲＡＤ、ドイツ・ミュンヘン）に移し、そして直ちにエレクトロポレーションした（１７ｋＶ／ｃｍ、２００Ω、２５μＦ、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（登録商標）ＸＣｅｌｌ、ＢＩＯ−ＲＡＤ、ドイツ・ミュンヘン）。続いて、キュベットを１ｍｌのＬＢでフラッシュすることによって、形質転換細胞をレスキューし、培養チューブにトランスファーし、そして振盪しながら３７℃で１時間インキュベーションした後、ＬＢａｍｐ寒天プレート上にプレーティングした。対照目的のため、１０μｌ、１μｌおよび０．１μｌの形質転換試料を、ＬＢａｍｐ寒天プレート上に別個にプレーティングし、同時に、コンピテント細胞と混合した、２μｌ ｄｄＨ２Ｏまたは１μｌ ｐＵＣ ＤＮＡ（０．１ｎｇ／μｌ）いずれかを含有するエレクトロポレーション試料２．５μｌをプレーティングした。

【0321】

ファージディスプレイ−ヘルパーファージの調製
最少プレート上に新鮮にストリークした細菌から出発した一晩培養由来の大腸菌ＴＧを用いて、５００ｍｌ ２ｘＴＹ培地に接種した（ＯＤ［６００ｎｍ］０．０５〜０．０７）。０．４〜０．５のＯＤ［６００ｎｍ］で、１ｍｌ ＶＳＣ Ｍ１３ヘルパーファージ（ＳｔｒａｔａＧｅｎ、米国ワシントン州カークランド）を添加し、そして培養を振盪せずに３７℃で３０分間インキュベーションし、そしてさらに３７℃で３０分間、振盪しながらインキュベーションした。続いて、カナマイシンを３０μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、そして培養を、振盪しながら３０℃で一晩インキュベーションした。最後に、遠心分離（４０００^＊ｇ、４５分間、ＲＴ）によって細菌を分離し、そしてファージを含有する上清を、１ｍｌアリコット中、−２０℃で保存した。

【0322】

ファージディスプレイ−ファージレスキューおよび沈殿
ＬＢ寒天プレートから形質転換細菌を収集し、そして５０ｍｌ ２ｘＴＹ（２％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）を０．０５〜０．０７の出発ＯＤ［５００ｎｍ］まで接種した。３７℃で振盪インキュベーションした後、培養が０．４〜０．５のＯＤ［６００ｎｍ］に到達したら、１ｍｌのＶＳＣ Ｍ１３ヘルパーファージを添加し、そして培養を、３７℃で、最初は振盪せず（３０分間）、そして次いで振盪しながら（３０分間）インキュベーションした。続いて、遠心分離（４０００^＊ｇ、ＲＴ、１５分間）によって細菌を採取し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび３０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する５０ｍｌ新鮮２ｘＴＹ中に再懸濁し、そして振盪しながら３０℃で一晩インキュベーションした。翌日、細菌を遠心分離（４０００^＊ｇ、ＲＴ、３０分間）し、そして１０ｍｌの２０％ＰＥＧ６０００を４０ｍｌの上清に添加し、穏やかに混合し、そして４℃で１時間回転させた。遠心分離（４０００^＊ｇ、ＲＴ、３０分間）後、沈殿したファージを１ｍｌ ＰＢＳ中に溶解し、そして１３．０００^＊ｇおよびＲＴで１０分間、再び遠心分離した。増幅したファージを含有する細菌不含上清を選択のために直ちに用いた（または後の使用のために４℃で保存した）。

【0323】

ファージディスプレイ−イムノチューブ選択
イムノチューブを、各選択周期とともに減少する濃度でヒトＴＮＦＲ１−ＦｃまたはヒトＴＮＦＲ２−Ｆｃでコーティングした（周期１：１および０．１μｇ／ｍｌ、周期２：０．１および０．０１μｇ／ｍｌ等；ｈｕＴＮＦＲ２は、常に２μｇ／ｍｌを用いてコーティングされた）。チューブを２％ＭＰＢＳでブロッキングした。１または１０μｌの沈殿したファージを１ｍｌの２％ＭＰＢＳに添加し、そしてヒトＴＮＦＲ２−Ｆｃコーティングチューブ中でインキュベーションして、交差反応ファージを除去した。この負の選択は、もっぱら、最初の選択周期の前に行った。ＲＴで１時間インキュベーションした後、上清をヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃでコーティングしたイムノチューブに移し、そしてさらに１時間インキュベーションした。迅速に解離するファージを捕捉し、そして固定された受容体へのその結合を妨害するため、周期２から、可溶性ヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃを最終濃度５μｇ／ｍｌで添加した。続いて、上清を廃棄し、そしてチューブをＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄した。７分間インキュベーションすると、１ｍｌの１００ｍＭ ＴＥＡ（トリエチルアミン）でファージが溶出した。５００μｌの１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝剤（ｐＨ７．５）を用いて、溶出したファージを直ちに中和し、そして８．５ｍｌの初期対数期大腸菌ＴＧ１に添加した。形質導入のため、上述のようにインキュベーションを行った（３７℃、静置、３０分；３７℃、振盪、３０分）。遠心分離（４０００^＊ｇ、ＲＴ、１０分間）によって細菌を分離し、そしてＬＢａｍｐプレートにプレーティングした。

【0324】

ファージディスプレイ−受容体−Ｆｃ融合タンパク質のビオチン化
タンパク質試料を２０倍モル過剰のスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、米国ロックフォード）と混合し、そしてＲＴで２時間インキュベーションして、ヒトＴＮＦＲ１−ＦｃおよびヒトＴＮＦＲ２−Ｆｃをビオチン化した。ＰＢＳに対して４℃で一晩透析することによって、残りの未結合スルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンを試料から除去した。固定ＴＮＦに対する標準的結合ＥＬＩＳＡにおいてＴＮＦＲ１−ＦｃおよびＴＮＦＲ２−Ｆｃのビオチン化成功を試験した。ポリＨＲＰ−Ｓｔｒｅｐによって、結合した受容体−Ｆｃ融合タンパク質を検出した。上述のようにＥＬＩＳＡを行った。

【0325】

ファージディスプレイ−磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ上での平衡選択
交差反応様式でヒトＴＮＦＲ２または融合Ｆｃ部分に結合しているファージを除去するため、１μｌまたは１０μｌの沈殿したファージを、０．１μＭヒトＴＮＦＲ２−Ｆｃを含有する１ｍｌの２％ＭＰＢＳに添加して、そして回転させながら、ＲＴで１時間インキュベーションした。続いて、５０μｌの磁気ストレプトアビジンコーティングＤｙｎａｂｅａｄｓを選択混合物に添加し、そしてさらに５分間回転させた。次いで、２ｍｌ反応チューブを磁気デバイス（ＤＹＮＡＬ（登録商標）ＭＰＣ（登録商標）−Ｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州カールスバッド）に入れることによってビーズを分離し、選択混合物を新規２ｍｌ反応チューブに移し、そしてヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃを選択混合物に添加した（周期１：１０ｎＭ／１ｎＭ、周期２：１ｎＭ／０．１ｎＭ、周期３：０．１ｎＭ／０．０１ｎＭ）。ＲＴでインキュベーションした後（回転しながら１時間）、１０μｌ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを選択混合物に添加し、そしてヒトＴＮＦＲ２−Ｆｃとの負の選択周期に関して記載したようにインキュベーションし、そして分離した。上清を廃棄し、そして１ｍｌの１０ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール）をビーズに添加して、結合したファージを抗原から遊離させた。イムノチューブ選択に関して記載したように、形質導入を行った。

【0326】

ファージディスプレイ―ポリクローナルファージＥＬＩＳＡ
ポリクローナルファージＥＬＩＳＡによって、ファージプールのすべての結合における変化を試験した。ＥＬＩＳＡ選択において実験法を記載し、ここでファージディスプレイ選択に供した抗原をコーティングに用いた。１０μｌの沈殿したファージを、９０μｌの２％ＭＰＢＳと混合し、マイクロタイタープレートに適用し、そして抗Ｍ１３−ＨＲＰ抗体（２７９４２１０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国チャルフォント・セント・ジャイルズ）を用いて、結合したファージを検出した。

【0327】

ファージディスプレイ―ファージディスプレイ選択のスクリーニング
１〜４のマイクロタイタープレートのウェルあたり、１００μｌの２ｘＴＹ ＬＢａｍｐに、最終選択周期の形質導入後、プレートからピックした単一クローン（１００〜４００コロニー）を接種し、そして振盪しながら３７℃でインキュベーションした。濁りが見えるようになったら、２５μｌのＶＣＳ Ｍ１３ヘルパーファージ含有ＬＢ（マイクロタイタープレートあたり１ｍｌ）を添加し、そして記載するように形質導入のためにインキュベーションした。続いて、２４０μｇ／ｍｌカナマイシン（最終濃度３０μｇ／ｍｌ）を含有する２５μｌ ＬＢをマイクロタイタープレートに添加し、そしてプレートを３０℃で振盪しながら一晩インキュベーションした。翌日、遠心分離（５００^＊ｇ、ＲＴ、５分間）によって細菌を分離し、そして上清を１：１で２％ＭＰＢＳと混合し、そしてポリクローナルファージＥＬＩＳＡにおいて記載されるようなＥＬＩＳＡによって、１点測定または滴定のいずれかで分析した。

【0328】

ファージディスプレイ―ファージを含有する細菌培養上清のオフ速度スクリーニング
ｓｃＦｖ所持ファージの解離速度定数を、ＱＣＭ技術を用いたオフ速度スクリーニングによって決定した。記載するプロトコルと類似のファージレスキューを行ったが、５ｍｌ ＬＢ培養にスケールダウンした。１００μｌの一晩培養（または精製ｓｃＦｖ調製物）を接種に用いて、そして培養が可視の濁りを示したら、ＶＳＣ Ｍ１３ヘルパーファージを添加した。上述のように、続く工程を行った。沈殿を伴わずに、ファージを含有する上清を、ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中で１：２に希釈し、そして４８Ｈｚの中程度の密度でｈｕＴＮＦＲ１−Ｆｃを固定したセンサーチップに適用した。流動緩衝液もまた、緩衝効果を最小限にするため、ＬＢと１：１で混合した。Ａｔｔａｃｈｅオフィスソフトウェア（Ａｔｔａｎａ、スウェーデン・ストックホルム）を用いて、３つの測定値の平均値を分析した。

【0329】

ポリエチレングリコールへのＦａｂ１３．７のカップリング
システイン修飾Ｆａｂ１３．７（Ｆａｂ１３．７’）をメトキシ−ＰＥＧ４０ｋＤａ２マレイミド（ｍＰＥＧ−Ｍａｌ）にカップリングした。前日に、ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン、最終濃度５ｍＭ）を添加し、そして室温で２時間インキュベーションすることによって、タンパク質を還元した。次いで、Ｄ−Ｔｕｂｅ^ＴＭ透析装置ミニ（６〜８ｋＤａのＭＷカットオフ）において、窒素飽和１ｘＮｅｌｌｉｓ緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７）に対して、磁気撹拌装置を用いて、４℃で一晩透析することによって、ＴＣＥＰを除去した。還元Ｆａｂ１３．７’をｍＰＥＧ−Ｍａｌと、１：１０（タンパク質：ｍＰＥＧ−Ｍａｌ）のモル比で混合し、そして室温で１時間インキュベーションした。Ｆａｂ１３．７’の再酸化を回避するため、インキュベーションに窒素を上層した。最後に、Ｌ−システイン（最終濃度１００μＭ）を室温で１０分間添加することによって、未結合および反応性マレイミド基を反応停止した。

【0330】

参考文献

【0331】

【化1】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25-1】

【図25-2】

【図25-3】

【図25-4】

【図25-5】