特許 6785324 α−グルコシダーゼ阻害剤を多量生産するバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6785324

(24)【登録日】2020年10月28日

(45)【発行日】2020年11月18日

(54)【発明の名称】α−グルコシダーゼ阻害剤を多量生産するバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20201109BHJP

   A23L 33/135 20160101ALI20201109BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20201109BHJP

   C12R 1/10 20060101ALN20201109BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/20 AZNA

   A23L33/135

   !C12N15/11 Z

   C12R1:10

【請求項の数】12

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2018-565720(P2018-565720)

(86)(22)【出願日】2017年2月17日

(65)【公表番号】特表2019-517810(P2019-517810A)

(43)【公表日】2019年6月27日

(86)【国際出願番号】KR2017001754

(87)【国際公開番号】WO2017222142

(87)【国際公開日】20171228

【審査請求日】2018年12月14日

(31)【優先権主張番号】10-2016-0076424

(32)【優先日】2016年6月20日

(33)【優先権主張国】KR

【微生物の受託番号】KCTC  KCTC13021BP

(73)【特許権者】

【識別番号】517428355

【氏名又は名称】カンウォン ナショナル ユニバーシティ−インダストリー コーポレーション ファウンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】100079049

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100084995

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 和詳

(72)【発明者】

【氏名】イ、 ヘイク

(72)【発明者】

【氏名】キム、 ヘ ウン

【審査官】 佐久 敬

(56)【参考文献】

【文献】 韓国公開特許第１０−２０１５−０１１６２６２（ＫＲ，Ａ）

【文献】 Food Research International，２０１４年，56，100-107

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ

Ａ２３Ｌ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１の１６ｓ ＲＮＡを含み、α−グルコシダーゼ阻害剤を高生産するバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株（受託番号ＫＣＴＣ１３０２１ＢＰ）。

【請求項2】

前記菌株が、嫌気性であることを特徴とする請求項１に記載の菌株。

【請求項3】

前記菌株が、好気性であることを特徴とする請求項２に記載の菌株。

【請求項4】

前記菌株が、胞子を形成することを特徴とする請求項１に記載の菌株。

【請求項5】

前記菌株が、生物体から投与後２週以内に排泄されることを特徴とする請求項１に記載の菌株。

【請求項6】

前記菌株が、腸内でα−グルコシダーゼ阻害剤を生産することを特徴とする請求項１に記載の菌株。

【請求項7】

腸内で生産されたα−グルコシダーゼ阻害剤が、生物体から菌株投与後、２週以内に排泄されることを特徴とする請求項６に記載の菌株。

【請求項8】

請求項１から請求項７のうち何れか一項に記載の菌株を含む食品組成物。

【請求項9】

前記菌株が、胞子形態で含まれることを特徴とする請求項８に記載の食品組成物。

【請求項10】

前記菌株が、１ｋｇ当たり１０^６〜１０^１０個の胞子で含まれることを特徴とする請求項９に記載の食品組成物。

【請求項11】

前記食品組成物が、前記菌株の発酵物をさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の食品組成物。

【請求項12】

前記発酵物が、大豆発酵物であることを特徴とする請求項１１に記載の食品組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、α−グルコシダーゼ阻害剤を多量生産する新菌株であるバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＮＹ１５０５）に関する。

【背景技術】

【0002】

α−グルコシダーゼ阻害剤（α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）は、一部の植物や微生物に分布し、オリゴ糖の単糖類への分解を抑制する作用を行う物質である。

【0003】

α−グルコシダーゼ活性の阻害は、腸内で糖類の円滑な吸収を阻害することにより、食後血糖上昇抑制はもとより、肥満治療のような付随的な効果が期待されるので、α−グルコシダーゼ阻害剤を経済的に量産するための必要性は次第に高まりつつある。

【0004】

植物由来のα−グルコシダーゼ阻害剤としては、桑の葉に含有された１−デオキシノジリマイシン（１−ｄｅｏｘｙｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ）のようなアザ糖（ａｚａ ｓｕｇａｒ）類、大豆に含有されたゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）のようなイソフラボン（ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ）、一部のフラボン配糖体（ｆｌａｖｏｎｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）などが知られており、微生物由来のα−グルコシダーゼ阻害剤としては、アクチノプラネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）菌株由来の類似オリゴ糖（ｐｓｅｕｄｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などの微生物が生産する１−デオキシノジリマイシン、トリス塩（ｔｒｉｓ ｂａｓｅ）などが知られており、医薬品としては、アカルボース（ａｃａｒｂｏｓｅ）、ボグリボース（ｖｏｇｌｉｂｏｓｅ）のようなα−グルコシダーゼ阻害剤が既に糖尿病治療剤として販売されている。

【0005】

最近、血糖降下に効果があるα−グルコシダーゼ阻害剤を食品として摂取するために、食用可能な天産物についての研究が活発に進められている。食品として使われる天産物由来のα−グルコシダーゼ阻害剤は、植物の場合、桑の葉、微生物の場合、一部の納豆を代表的な例として挙げられる。これらの１次加工品または抽出物は、量産されているが、共通してにおい、色沢のような嗜好性を落とす因子を有しているので、製品の多様化に制限がある。また、これらは、植物または微生物が生産した二次代謝産物を利用する場合なので、一日に数回一定量を服用して初めて、所期の目的を果たすことができるという短所がある。

【0006】

一方、乳酸菌のような腸内細菌は、腸内で生息しながら増殖する特性を有している。したがって、α−グルコシダーゼ阻害剤のような二次代謝産物を生産する腸内細菌は、腸内で増殖しながら切れ目なく腸内環境にα−グルコシダーゼ阻害剤を生産して供給すると予想される。しかし、従来に知られたバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような一部の納豆菌は、α−グルコシダーゼ阻害剤を生産すると知られているが、バチルス・サブチリスは、好気性菌で腸内で生息しにくいために、バチルス・サブチリスの増殖でα−グルコシダーゼ阻害剤を腸内で供給されることは難しく、納豆の摂取を通じてα−グルコシダーゼ阻害剤を供給されるためには、多量摂取しなければならないという問題点がある。

【0007】

したがって、腸内で生息が可能であり、α−グルコシダーゼ阻害剤を多量生成することができて、体重減量と血糖降下などのための目的として効果的に活用可能な新たな菌株についての研究及び開発が必要である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】大韓民国公開特許第１０−２０１４−０１２３８４７号（２０１４．１０．２３）

【特許文献2】大韓民国公開特許第１０−２００７−００２８９９７号（２００７．０３．１３）

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】海外論文（Ｚｈｕ Ｙ．Ｐ，Ｌｉ Ｘ．Ｔ，Ｔｅｎｇ Ｃ，Ｓｕｎ Ｂ．Ｇ，“Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｂｙ ａ ｎｅｗｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｂ２ ｕｓｉｎｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ”ＦＯＯＤ ＡＮＤ ＢＩＯＰＲＯＤＵＣＴＳ ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ Ｖｏｌ．９１ Ｎｏ．３ ２６４ｐ〜２７０ｐ）

【非特許文献2】大韓民国論文（キム・ヒョンス、リ・ゼヨン、ファン・ギョヨル、チョ・ヨンソク、パク・ヨンシク、カン・ギョンドン、ソン・スイル、“α−グルコシダーゼ阻害剤１−デオキシノジリマイシンを生産するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株の分離及び同定”Ｋｏｒｅａｎ Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．１，４９−５５（２０１１）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明者らは、α−グルコシダーゼ阻害活性が強い腸内微生物を選抜するために鋭意研究した結果、α−グルコシダーゼ阻害活性を示す微生物のうちから通性嫌気性であり、胞子を形成し、腸内で増殖が可能なＧＲＡＳ菌としてα−グルコシダーゼ阻害剤を多量で生産する新規なバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株を分離・同定し、前記微生物の発酵物または胞子を含んだ栄養細胞は、体重減量と血糖降下とを目的として食品、医薬品、飼料などに有用に使われうるということを確認した。

【0011】

これにより、本発明では、α−グルコシダーゼ阻害剤を多量生産する新菌株であるバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株に関する技術内容を提供することをその目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

前記のような技術的課題を果たすために、本発明は、α−グルコシダーゼ阻害剤を高生産するバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株（受託番号ＫＣＴＣ１３０２１ＢＰ）を提供する。

【0013】

また、前記菌株は、配列番号１の１６ｓ ＲＮＡを含むことを特徴とする。

【0014】

また、前記菌株は、嫌気性であるか、または、好気性であり得る。

【0015】

また、前記菌株は、胞子を形成し、前記菌株が投与された後、生物体から２週以内に排泄されうる。

【0016】

また、前記菌株は、動物の腸内でα−グルコシダーゼ阻害剤を生産し、腸内で生産されたα−グルコシダーゼ阻害剤は、前記菌株が投与された後、生物体から２週以内に排泄されうる。

【0017】

また、本発明は、前記菌株を含む食品組成物を提供する。

【0018】

また、前記食品組成物には、前記菌株が胞子の形態で含まれ、１ｋｇ当たり１０^６〜１０^１０個の胞子で含まれうる。

【0019】

また、前記食品組成物は、前記菌株の発酵物をさらに含み、前記発酵物は、大豆発酵物であり得る。

【発明の効果】

【0020】

本発明によるバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株は、嫌気性条件でも生息が可能な新菌株であって、腸内でα−グルコシダーゼ阻害剤を生産して供給するので、有効濃度を一定に保持して、優れた体重減量及び血糖降下の効果を示し、腸内に固着せず、一時的に生息する特性を示して、必要に応じて投与された菌株または菌株が生産したα−グルコシダーゼ阻害剤は、排出が可能であって、安全に使用することができる。

【0021】

また、α−グルコシダーゼ阻害剤の生成のための別途の発酵コスト及び加工費が不要であって、生産コストを節減し、発酵臭などの問題が発生せず、多様な形態の食品に適用が可能である。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】高炭水化物食餌の給与時に、バチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株胞子の投与がマウスの体重に及ぼす影響を示すグラフである（対照群、高炭水化物食餌群及び高炭水化物食餌＋胞子群）。

【図2】高脂肪食餌の給与時に、バチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌胞子の投与がマウスの体重に及ぼす影響を示すグラフである（対照群、高脂肪食餌群及び高脂肪食餌＋胞子群）。

【図3】マウスの糞便に含まれた菌株数の変化を示すグラフである（高炭水化物食餌＋胞子群及び高脂肪食餌＋胞子群）。

【図4】マウスの糞便に含まれたα−グルコシダーゼの阻害活性を示すグラフである（高炭水化物食餌＋胞子群及び高脂肪食餌＋胞子群）。

【図5】バチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株の電子顕微鏡写真である。

【図6】バチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株の分類学上の位置を示す概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

以下、本発明を詳しく説明する。

【0024】

本発明は、α−グルコシダーゼ阻害剤を高生産するバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株（受託番号ＫＣＴＣ１３０２１ＢＰ）を提供する。

【0025】

前記菌株は、稲わら及び乾草を試料として耐熱性胞子を形成する菌を分離し、生体内で生育が可能であり、α−グルコシダーゼ阻害剤を高生産する菌株を選別することで得られる。

【0026】

前記菌株は、下記の配列番号１の１６ｓ ＲＮＡを含むことを特徴とする。

【0027】

配列番号１：
ＡＧＧＧＣＴＴＣＣＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＧＡＴＣＴＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＣＡＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＡＡＧＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＣＴＴＡＴＧＡＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＡＡＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＧＡＡＧＣＣＧＣＧＡＧＧＣＴＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＣＡＣＡＡＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＡＴＣＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＣＧＡＧＡＧＴＴＴＧＴＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＣＣＴＴＴＴＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＴＡＣＡＧＧＧＡＡＡＡ

【0028】

前記菌株は、α−グルコシダーゼ阻害剤を腸内で高収率で生産可能な嫌気性特性と生体外でもα−グルコシダーゼ阻害剤を生産可能な好気的特性とを同時に有しうる。

【0029】

前記菌株は、胞子を形成し、腸内に固着せず、一時的に生息する特性を示して、必要に応じて投与された菌株の除去が可能であって、安全に使用することができる。望ましくは、前記菌株は、生物体に投与された後、２週経過する時点に生物体外に排泄され、より望ましくは、１週経過する時点に排泄されうる。

【0030】

また、前記菌株は、腸内で前記α−グルコシダーゼ阻害剤を生産することができて、α−グルコシダーゼ阻害剤の有効濃度を一定に保持し、腸内で生産した前記α−グルコシダーゼ阻害剤は、排泄が可能であって、安全に使用することができる。望ましくは、前記α−グルコシダーゼ阻害剤は、菌株が生物体に投与された後、２週経過する時点に生物体外に排泄されうる。

【0031】

これにより、前記菌株を含む食品を摂取する方法によって投与して、腸内でα−グルコシダーゼ阻害剤を高収率で生産することができて、生物体外に排出が可能であって、体重減量と血糖降下との目的として効果的に使用することができる。

【0032】

本発明は、前記菌株を含む食品組成物を提供する。

【0033】

前記食品組成物は、通用されるバチルス・リケニフォルミスの培養方法によって培養された菌株、菌株の胞子または菌株の発酵物を含みうる。

【0034】

一例として、前記食品組成物は、前記菌株の胞子を含み、前記食品組成物は、１ｋｇ当たり１０^６〜１０^１０個の胞子であって、前記菌株を含んで前記菌株が、腸内でα−グルコシダーゼ阻害剤を多量生産することができる。

【0035】

さらに他の例として、前記食品組成物は、前記菌株の発酵物をさらに含み、前記発酵物は、前記菌株を大豆に接種して発酵した大豆発酵物であり得る。

【0036】

以下、本発明を実施例を挙げてより詳しく説明する。

【0037】

提示された実施例は、本発明の具体的な例示であり、本発明の範囲を制限するためのものではない。

【0038】

＜実施例＞
１．菌株の探索
韓国、中国、日本、米国など世界各地から収集した約５００余点の稲わら及び乾草を試料として微生物を分離した。各試料を滅菌食塩水に少量加えて懸濁させた後、８０℃恒温水槽で２０分間熱処理して得た胞子液を２％寒天を含有するＬＢ平板培地（１％トリプトン、０．２％砂糖、０．５％酵母抽出物及び０．５％ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に塗抹し、５５℃培養器で２日間嫌気的に培養し、培養後、菌集落を形成する菌体を分離した。α−グルコシダーゼ阻害剤の生産量を調査するために、分離された菌株を５ｍｌの５％大豆粉を懸濁した培地に接種し、３７℃で２４時間培養した。培養液を遠心分離して、上澄み液からα−グルコシダーゼ阻害剤活性を測定した（表１の好気的培養）。前記の過程で約６０種の通性嫌気性細菌をα−グルコシダーゼ阻害剤生産菌として１次選抜した後、５０℃で嫌気的に生育が可能であり、プロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を磁化する菌株を選抜して、α−グルコシダーゼ阻害活性が高い３種を２次選抜し、培養液を遠心分離して、上澄み液からα−グルコシダーゼ阻害剤活性を測定した（表１の嫌気的培養）。前記３種の菌株は、バージェイズマニュアル（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、２００２）による分類学的特性の分析方法によって分類し、そのうち、１種が食用可能な菌であるバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に同定されてバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５と名付け、前記菌株が、下記の配列番号１の１６Ｓ ＲＮＡ配列を有するということを確認し、前記配列を韓国生命工学研究院生物資源センター（ＫＣＴＣ）に２０１６年５月３日付で寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ１３０２１ＢＰ）。

【0039】

配列番号１：
ＡＧＧＧＣＴＴＣＣＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＧＡＴＣＴＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＣＡＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＡＡＧＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＣＴＴＡＴＧＡＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＡＡＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＧＡＡＧＣＣＧＣＧＡＧＧＣＴＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＣＡＣＡＡＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＡＴＣＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＣＧＡＧＡＧＴＴＴＧＴＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＣＣＴＴＴＴＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＴＡＣＡＧＧＧＡＡＡＡ

【0040】

２．納豆の製造
大豆を常温で１２時間ふやかした後、１２１℃で４０分間煮た。煮た大豆を冷却する前、ｇ当たり１０^３匹の胞子を接種した後、５０ｇずつ納豆製造用発泡スチレン容器に入れ、ビニールカバーを被せた後、３７℃で２０時間培養した。該培養された納豆を１２時間冷蔵保管した後、α−グルコシダーゼ阻害活性を測定及び官能評価を行った。（表１の納豆）。

【0041】

３．α−グルコシダーゼ阻害活性の測定
α−グルコシダーゼは、豚の小腸から抽出して部分精製したものを酵素源として使用した。α−グルコシダーゼ酵素液は、２４ｕｎｉｔ／ｍｌになるように０．５Ｍリン酸塩緩衝溶液（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．０）に適当に希釈して使用し、基質は、ｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−グルコピラノシド（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ｐＮＰＧ）を利用した。試験管に培養上澄み液３０μｌと酵素５０μｌとを混ぜて３７℃で１０分間予備保温を行った後、３ｍＭ ｐＮＰＧ ５０μｌを添加し、３７℃で２０分間反応させた。反応液に０．１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３を加えて反応を停止し、４０５ｎｍで吸光度を測定して、下記数式１で阻害活性を測定し、α−グルコシダーゼ阻害活性の測定結果を下記の表１に示した。この際、α−グルコシダーゼ阻害単位（α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｕｎｉｔ、ＡＧＩ ｕｎｉｔ）は、下記数式１で活性測定に使われたα−グルコシダーゼ（α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を１００％阻害する時の阻害剤の量と定義した。

【0042】

【数1】

【0043】

【表1】

【0044】

表１に示されたように、酸素の供給有無に関係なく、均一なＡＧＩ阻害活性を示して、バチルス・リケニフォルミスが通性嫌気性細菌なので、嫌気的な条件でも生育が可能であるという事実を確認することができた。したがって、動物の腸管内でバチルス・リケニフォルミスは、増殖を行い、有用な生理活性物質を生産することができると確認された。

【0045】

４．バチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株の食餌実験
バチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株が、動物の腸管内で有用物質を生産するか否かを確認するために、マウスの飼料にバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５胞子を混合して投与することにより、バチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株の腸内増殖有無、腸内でのα−グルコシダーゼ阻害剤の生成有無などを検討した。

【0046】

まず、α−グルコシダーゼ阻害剤を生産するバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株の胞子を混合した飼料（１０^８胞子／ｋｇ飼料）をマウスに給与し、体重の変化を観察した。このために、販売される標準飼料と水とを自在に給与し、雄マウス（００週齢）を１週間予備飼育した後に使用した。明暗サイクルは、午前０８：００時から午後２０：００を明期、午後２０：００から午前０８：００を暗期にし、２２．５±０．５℃の温度及び５０〜６０％の湿度が保持される環境下で飼育した。肥満誘導式で下記表２及び表３の高炭水化物食餌と高脂肪食餌とにし、バチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株の胞子が含有された飼料は、それぞれの肥満誘導式１ｋｇ当たり１０^８胞子を混合して製造した。マウスは、５個の群（各８匹）に分けて、対照群、高炭水化物食餌群、高炭水化物食餌＋胞子群、高脂肪食餌群、高脂肪食餌＋胞子群に分けて、それぞれ７週間飼育した。

【0047】

【表2】

【0048】

【表3】

【0049】

（１）高炭水化物食餌の給与時に、バチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌胞子の投与がマウスの体重に及ぼす影響分析
高炭水化物食餌給与されたマウスの体重（ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ、単位ｇｒａｍ）にバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌胞子の投与が及ぼす影響を分析した結果、図１に示されたように、高炭水化物飼料群は、対照群に比べて、明らかな体重増加を示すが、バチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株の胞子が混合された高炭水化物飼料群では、対照群と同様の体重増加の態様を示すことを確認することができた。

【0050】

（２）高脂肪食餌の給与時に、バチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌胞子の投与がマウスの体重に及ぼす影響
高脂肪食餌給与されたマウスの体重にバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌胞子の投与がマウスの体重に及ぼす影響を分析した結果、図２に示されたように、高脂肪飼料群は、対照群に比べて、明らかな体重増加を示すが、バチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株の胞子が混合された高脂肪飼料群では、対照群と同様の体重増加の態様を示すことを確認することができた。

【0051】

（３）糞便で排泄されるバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌数の変化
バチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌胞子が投与されたマウスの便に含まれた胞子数を測定して、便で排泄される菌株の変化を分析した結果、図３に示されたように、飼料１ｇ当たり１０^５匹の胞子が混合されており、一匹当たり一日に約５ｇの飼料を摂取するので、一日に約５ｘ１０^５匹の胞子を摂取する。胞子投与３週後には、糞便１ｇ当たり約１０^７匹のバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５が検出されるので、腸内で本菌株が旺盛に増殖して排出されることが分かった。胞子を７週間投与した場合、胞子を投与していない１週間である８週次には、菌の数字が格段に減少するので、腸内に固着せず、一時的に生息すると判断することができた。したがって、本菌株の投与を中断すれば、腸内菌叢の変化が予想されるので、必要に応じて腸内で本菌株の除去も可能な長所があるということを確認することができた。

【0052】

（４）便で排泄されるα−グルコシダーゼ阻害活性の変化
バチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌胞子が投与されたマウスの便に含まれたα−グルコシダーゼの阻害活性を分析した結果、図４に示されたように、バチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株は、便で排出される程度に腸内で旺盛に増殖し、α−グルコシダーゼ阻害剤を生産することを確認することができた。胞子が投与されたマウスの２週経過した時点の便で腸内で増殖したバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株が便で排出されて活性が検出された。また、４週次からは、７週までは排出されるバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株の量が安定化される時期に排出されるα−グルコシダーゼ阻害剤の量も一定していることを確認することができた。すなわち、α−グルコシダーゼ阻害剤は、常に腸内で生産されるので、腸内での濃度が一定量保持され、効率が高く作用する長所を有し、生産された阻害剤の一定量が排出されることが分かる。糞便で排出されるα−グルコシダーゼ阻害剤の活性を見れば、バチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株で製造した納豆の活性（表１）と比べると、相当量のα−グルコシダーゼ阻害剤が腸内で生産され、その一部が排出されるという事実を確認することができた。

【0053】

前記のような結果を通じて、本発明によるバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株が発酵によって生成された生理活性物質を使用することではなく、体内で菌株が生理活性物質を連続して作って供給するので、α−グルコシダーゼ阻害剤の生成のための別途の発酵コスト及び加工費が不要であって、生産コストを節減し、体内で連続して生産することにより、有効な濃度を一定に保持できるという長所があるということを確認することができ、有用菌の胞子を利用することにより、発酵臭などの問題が発生せず、多様な加工食品に添加物として使用することができるので、多様な形態の食品に適用することができるという事実を確認することができた。

【0054】

５．分離された菌株の形態学的及び生化学的特性の究明
（１）分離された菌株の形態学的特性
前記のように分離されたバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株は、ＬＢ寒天平板培地でコロニーの中央部分は薄いさび色を示し、縁部は不規則な外形を示した（図５）。菌の生育が可能な温度範囲は、２５〜５０℃の範囲で成長が良好であり、６０℃以上では、菌体成長が確認されていない。ＬＢ液体培地を利用した菌体成長の対数期で顕微鏡観察した結果、グラム陽性の短い棒状を示せれば、比較菌株であるバチルス・リケニフォルミスと類似した。また、分離した菌株は、下記表４に示されたように、グラム陽性であり、細胞のサイズは、ほぼ０．５〜０．７×１．５〜１．８μｍであることを確認することができ、前記結果を総合して、バチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株の分類学上の位置を図６に示した。

【0055】

【表4】

【0056】

（２）分離された菌株の生化学的特性
バージェイズマニュアルによるバチルス属菌株の分類学的特性の分析方法とＡＰＩ５０ＣＨＢキット（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、Ｆｒａｎｃｅ）とを使用して、分離された菌株の生化学的特性などを調査した結果、分離した菌株は、グラム陽性の円筒状であって、胞子は細胞中央に形成され、硝酸塩の還元力は陽性であり、インドール形成は陰性であった。また、カゼインと澱粉とを分解し、カタラーゼ陽性であり、好気的条件及び嫌気的条件で成長すると確認され、下記表５に示すような生化学的特性（ＡＰＩ ｔｅｓｔ結果）を有することを確認することができた。

【0057】

【表5】

【産業上の利用可能性】

【0058】

本発明によるバチルス・リケニフォルミスＮＹ１５０５菌株は、腸内でα−グルコシダーゼ阻害剤を生産して供給するので、食品組成物に使われる。

【受託番号】

【0059】

寄託機関名：韓国生命工学研究院韓国生物資源センター（ＫＣＴＣ）
受託番号：ＫＣＴＣ１３０２１ＢＰ
受託日：２０１６０５０３

【0060】

（受託証）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]