特許 6786477 ３−ＨＰを生産することができる組換え酵母およびこれを利用した３−ＨＰの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6786477

(24)【登録日】2020年10月30日

(45)【発行日】2020年11月18日

(54)【発明の名称】３−ＨＰを生産することができる組換え酵母およびこれを利用した３−ＨＰの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/19 20060101AFI20201109BHJP

   C12N 15/52 20060101ALI20201109BHJP

   C12P 7/42 20060101ALI20201109BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/19ZNA

   C12N15/52 Z

   C12P7/42

【請求項の数】5

【全頁数】59

(21)【出願番号】特願2017-510862(P2017-510862)

(86)(22)【出願日】2015年8月28日

(65)【公表番号】特表2017-525372(P2017-525372A)

(43)【公表日】2017年9月7日

(86)【国際出願番号】KR2015009061

(87)【国際公開番号】WO2016032279

(87)【国際公開日】20160303

【審査請求日】2017年4月6日

【審判番号】不服2019-4038(P2019-4038/J1)

【審判請求日】2019年3月27日

(31)【優先権主張番号】10-2014-0114505

(32)【優先日】2014年8月29日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】308007044

【氏名又は名称】エスケー イノベーション カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＫ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ ＣＯ．，ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100106002

【弁理士】

【氏名又は名称】正林 真之

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(72)【発明者】

【氏名】パク ジョン ミン

(72)【発明者】

【氏名】パク ジェ ヨン

(72)【発明者】

【氏名】パク ウー チャン

(72)【発明者】

【氏名】イ サン ミン

(72)【発明者】

【氏名】ソ ヨン ビン

(72)【発明者】

【氏名】オヤ メルヤ

(72)【発明者】

【氏名】コイヴィストイネン オウティ

(72)【発明者】

【氏名】コンレイ アンドリュー

(72)【発明者】

【氏名】イルメン マルヤ

(72)【発明者】

【氏名】ルオホネン ローラ

(72)【発明者】

【氏名】ヨウフテン パウラ

【合議体】

【審判長】 田村 聖子

【審判官】 高堀 栄二

【審判官】 千葉 直紀

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０２４８２３３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２００８−０３５７２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，２０１４年２月，Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．１０４−１０９

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12N1/19

C12P7/42

C12N15/00-15/61

ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの組換え体である組換え酵母であって、
外因性ＡＡＤＨ遺伝子、内因性または外因性ＡＣＣ遺伝子、外因性ＭＣＲ遺伝子、および外因性ＨＰＤＨ遺伝子を含有して、［ピルビン酸→アセトアルデヒド→アセチル−ＣｏＡ→マロニル−ＣｏＡ→マロネートセミアルデヒド→３−ＨＰ］生合成経路を介して３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）を生産することができ、
前記酵母は、
アセトアルデヒドからアセチル−ＣｏＡに直接転換し、配列番号７４、７６、７７、８０、８３、９０、９１、９３、９４、９６〜９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、アセチル基を含有したアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＡＤＨ）をコードする外因性遺伝子と、
配列番号９９〜１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）をコードする内因性または外因性の遺伝子と、
配列番号１０７〜１０９、及び１１４、並びに、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＷＰ＿０２０１９８９５４．１、ＡＧＥ７４５６８．１、ＡＧＥ７４３５７．１、及びＢＡＢ６７２７６．１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するマロニル−ＣｏＡレダクターゼ（ＭＣＲ）をコードする外因性遺伝子と、
配列番号１１７〜１３１、及び１３３〜１４４、並びに、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＥＳＭ３２０５７．１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するヒドロキシプロピオネートデヒドロゲナーゼ（ＨＰＤＨ）をコードする外因性遺伝子と、
を含む、組換え酵母。

【請求項2】

前記組換え酵母は、耐酸性を有することを特徴とする請求項１に記載の組換え酵母。

【請求項3】

下記の段階を含む３−ＨＰの製造方法：
（ａ）請求項１に記載の組換え酵母を少なくとも一つの炭素源を含有する培地で培養して、３−ＨＰを生成させる段階、および
（ｂ）前記生成された３−ＨＰを回収する段階。

【請求項4】

前記炭素源は、グルコース、キシロース、アラビノース、スクロース、プルクトース、セルロース、グルコースオリゴマーおよびグリセロールで構成された群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項３に記載の製造方法。

【請求項5】

前記培養は、ｐＨが２．６〜４．０で行うことを特徴とする請求項４に記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、３−ＨＰを生産することができる組換え酵母およびこれを利用した３−ＨＰの製造方法に関し、より具体的には外因性ＡＡＤＨ遺伝子、内因性または外因性ＡＣＣ遺伝子、および外因性ＭＣＲ遺伝子を含有して、［ピルビン酸→アセトアルデヒド→アセチル−ＣｏＡ→マロニル−ＣｏＡ→３−ＨＰ］生合成経路を介して３−ＨＰを生産することができる組換え酵母およびこれを利用した３−ＨＰ製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

３−ＨＰ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｎｏｉｎｃ ａｃｉｄ，Ｃ３）は、乳酸（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ，２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）の異性体であり、両末端にカルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｇｒｏｕｐ）とヒドロキシル基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）を有して、１，３−プロパンジオール、アクリル酸、アクリルアミド、高分子（ｐｏｌｙｍｅｒ）等種々の化学物質に転換可能な有用な物質である。実際にこのような理由から２００４年米国エネルギー省（Ｄｅｐａｒｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ）は、３−ＨＰを有望な物質の中の一つと選定したことがある。特に、アクリル酸は、コーティング剤、接着剤、添加剤、おむつなど市場性が高い物質であり、３−ＨＰの主な応用事例になり得る。３−ＨＰはさらに、発酵を介してブドウ糖から理論的に１００％の収率で生産することができ、微生物を利用した発酵工程は、最近の環境に配慮した再生可能物質に対する要求を受けるのに適している。

【0003】

３−ＨＰをブドウ糖に利用して商業的に生産した事例はまだないが、様々な方法への研究が進行されていて、経済性のある３−ＨＰ生産菌株の確保が障害要因として浮上している。バクテリアは有機酸を生産する代表的な微生物として知られていて、食品などの産業に広く使われている。しかし、大腸菌のような代表的な産業用バクテリアを利用した有機酸生産は、３−ＨＰのような大規模化学産業に応用されるには短所がある。有機酸は、生産量が増加するほど酸性が強くなり、それにつれて酸度が上がり（ｐＨは減少）、これは多くの大腸菌の活性を低下させる。大腸菌は、高濃度の有機酸を生産する際に酸度を中性に維持するために、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化アンモニウム（ＮＨ_４ＯＨ）のような中和剤（ｂａｓｅ）を必要とする。これは、投入される中和剤により発酵工程の費用を増加させ、抽出および分離過程を難しくさせ、または費用を大きく増加させる要因になる。

【0004】

近年、有機酸生産の化学産業への応用事例では、酵母を利用してブドウ糖から有機酸を生産している。酵母は、バクテリアに比べて有機酸に対する耐性が高くて高い酸度（低ｐＨ）でも活性が大きく阻害されなく、有機酸を生産する母体（ｈｏｓｔ）としてより適すると言える。特に酵母は、伝統的に酒精、産業用エタノールなどを生産する産業用生触媒として広く使用されてきて、大量培養が可能でバクテリオファージに対する汚染性の可能性がなく化学産業への応用性がバクテリアより良いと見なせる。

【0005】

有機酸生産には酵母がよりメリットがあるが、３−ＨＰをはじめとする有機酸生産のための酵母を活用するにはいくつかの短所がある。まず、酵母を遺伝的に改良することはバクテリアより難しく、バクテリアとは異なりミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）、ペルオキシソーム（ｐｅｒｏｓｉｘｏｍｅ）等のような細胞内構造体によって区分される細胞の形態のため、特定代謝酵素を発現するためには共に発現する代謝経路の発現位置を同一化しなければならない。代表的な代謝中間物質であるアセチル−ＣｏＡ（Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）の場合、酵母はミトコンドリアでほとんどが生成されるので、目的産物が細胞基質（ｃｙｔｏｓｏｌ）で生成されてアセチル−ＣｏＡを経る場合なら、細胞基質内でアセチル−ＣｏＡを生産する対応方法が必要である。また、全ての酵母が高い生産性と有機酸に対する抵抗性、大量培養の要求を充足しないため、有機酸生産に適した母体（ｈｏｓｔ）を効果的に選別しなければならない。

【0006】

ほとんどの酵母は、六炭糖であるブドウ糖から効果的にエタノールを生産して少数の酵母種は有機酸を生産すると知られている。微生物を利用した目的産物を生産するための改良の際には、代謝反応に対する全体的な酸化・還元の均衡を維持することが重要で、ブドウ糖からエタノールを発酵する代謝反応もこのような均衡がよく維持される反応である。酵母を遺伝的に操作して有機酸を生産する場合にもこのような均衡をよく維持すべきで、酵母の改良を介して乳酸（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）を生産する事例では、アセトアルデヒド（ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ）からエタノールを生産する還元反応を補完するためのさらに他の還元反応のＬＤＨ（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）のバランスの取れた導入が重要であることがわかる。

【0007】

３−ＨＰは、緑色滑走性糸状体細菌（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）のような少数の微生物から少量が生産されると知られていて、アルカリゲネスフェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）のような微生物のジメチルスルホニオプロピネート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｎｉｏ ｐｒｏｐｉｎａｔｅ）の分解過程や酵母のウラシル（ｕｒａｃｉｌ）の分解過程でも３−ＨＰが一部発生すると知られている。このような自然界に存在する３−ＨＰの発見により、３−ＨＰ代謝経路と該当酵素に対する研究が進行されてきて、これを基に近年大腸菌に３−ＨＰ生合成に必要な遺伝子を導入することによって、３−ＨＰを生産したり、これらの高分子（ｐｏｌｙｍｅｒ）形態であるＰＨＡを生産する研究が進行されている。さらに、このように自然界で代謝中間物質や少量でだけ生産される３−ＨＰの生産性と生産収率を最大化するために代謝工学、システム生物学、合成生物学などの手法が活用されている。

【0008】

代謝工学技術の発展により微生物を利用した様々な物質の生産経路に対する予測が可能になり、ブドウ糖から３−ＨＰの生産経路は中間代謝物質により大きくアクリロイル−ＣｏＡ（Ａｃｒｙｌｏｙｌ−ＣｏＡ）経路、β−アラニン（β−ａｌａｎｉｎｅ）経路、マロニル−ＣｏＡ（Ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ）経路、グリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）経路に分けられる。

【0009】

Ａｃｒｙｌｏｙｌ−ＣｏＡ経路は、ブドウ糖の解糖過程から得られたピルビン酸またはホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）からラクテートやβ−アラニンなどを経てアクリロイル−ＣｏＡに変換された後、これから水和反応と還元反応を介して３−ＨＰに転換する代謝経路をいう（ピルビン酸またはＰＥＰ→ラクテートまたはβ−アラニン→アクリロイル−ＣｏＡ→３−ＨＰ）。アクリロイル−ＣｏＡは、プロピオン酸の分解過程で発見される代謝物質で、物質に到達するためのギブス自由エネルギー値が正数であるため、正反応が非自発的な反応である。またアクリロイル−ＣｏＡチオエテラーゼの基質に対する特異性が低下して、３−ＨＰを大量生産するための代謝経路として好ましくない。

【0010】

β−アラニン経路は、ピルビン酸またはオキサロアセテートからアミノ基転移（ｔｒａｎｓａｍｉｎａｔｉｏｎ）反応を介してアミノ酸に転換された後、β−アラニンを経て再びアミノ基転移反応を介して３−ＨＰに転換される代謝経路をいう（ピルビン酸またはオキサロアセテート→アミノ酸→β−アラニン→３−ＨＰ、米国公開特許公報ＵＳ２０１２／０１３５４８１Ａ１）。β−アラニンが３−ＨＰにアミノ基転移される反応は、微生物に毒性が大きいマロネートセミアルデヒドを経ることになるので、高い活性を有する３−ＨＰデヒドロゲナーゼを必要とする。また、アミノ基転移反応は、一般に定常状態（ｓｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅ）でアミノ酸分子構造のラジカル（ｒａｄｉｃａｌ）形態を誘発するので、この反応の酵素はラジカルの反応性を緩和するための構造を有している。このラジカルは、酸素との強い反応性を示すので、アミノ基転移の円滑な反応のためには、必ず嫌気条件やラジカル分子の安定化のための補酵素を必要とする。

【0011】

マロニル−ＣｏＡ経路は、アセチル−ＣｏＡがカルボキシ化を介してマロニル−ＣｏＡに転換された後、還元反応を介して３−ＨＰに転換される代謝経路であり（アセチル−ＣｏＡ→マロニル−ＣｏＡ→３−ＨＰ）、グリセロール経路は、ブドウ糖からグリセロールに転換された後、グリセロールの脱水反応によって３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ）を経て３−ＨＰに転換される代謝経路である（ブドウ糖→グリセロール→３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド→３−ＨＰ）。マロニル−ＣｏＡ経路とグリセロール経路は、大腸菌をはじめとする微生物が一般に生産する中間物質を経るので、３−ＨＰ生産経路として最も多く研究されている（米国公開特許公報ＵＳ ２０１３／００７１８９３ Ａ１）。マロニル−ＣｏＡは、マロネートレダクターゼと３−ＨＰデヒドロゲナーゼ、グリセロールは、グリセロールデヒドラターゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼの作用を介して３−ＨＰに転換されるので、組換え大腸菌を利用してブドウ糖やグリセロールを利用して３−ＨＰに転換する方法が良く知られている。グリセロール脱水は、アミノ基転移と同様にラジカルを伴う反応で、酸素が存在する条件で反応するためには、補酵素であるコエンザイムＢ１２（Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ｂ１２）を必須的に必要とする。

【0012】

産業用発酵の観点から、コエンザイムＢ１２のような補酵素は、費用面で培地の物質として使用することが困難で、酵母のような微生物は、該当物質を生合成したり、細胞内部へ吸収できないため、酵母を利用して３−ＨＰを生産するための代謝経路としてβ−アラニン経路やグリセロール経路は適しないことがある。最近では、このような問題点を克服するためのアミノ基転移関与酵素に対する改良研究が知られている。

【0013】

マロニル−ＣｏＡは、細胞基質内のアセチル−ＣｏＡで合成されて３−ＨＰに還元される。大腸菌のようなバクテリアは、細胞基質内でピルビン酸からアセチル−ＣｏＡが生成されてＴＣＡサイクルや他の代謝反応の基質として使用される。しかし、上述した通り、独立的な小体を有している酵母は、一般にアセチル−ＣｏＡをミトコンドリアで合成してＴＣＡサイクルの基質として使用し、細胞基質内のアセチル−ＣｏＡは、エタノール生成反応の副反応であるアセテート生成反応やクエン酸（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）循環反応を介して生成される。アセテートからアセチル−ＣｏＡを生成したり、クエン酸からアセチル−ＣｏＡを得る反応は、いずれもＡＴＰを消費する反応で、バクテリアに比べて酵母は細胞基質内アセチル−ＣｏＡを得るためには、エネルギーをさらに消費するので、代謝の観点から不利である。

【0014】

酵母は、細胞基質の還元状態やタンパク質合成後、折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）、コドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）等の環境がバクテリアと異なってバクテリア由来の外来酵素を発現する時、その活性が現れないか活性度が大きく落ちる場合が多い。また、酸素やその他金属イオンの有無による活性度の変化が大きいので、同じ機能を有する外来酵素でもその酵素の由来により酵母での発現結果は異なり得る。実際ｘｙｌｏｓｅ代謝の重要な酵素であるキシロースイソメラーゼ（ｘｙｌｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、ＸＩ）の場合、バクテリア由来のＸＩは酵母で発現時ほとんどその活性が顕著に低い結果を示すが、好気性菌類（ａｅｒｏｂｉｃ ｆｕｎｇｕｓ）由来のＸＩ導入を介して活性が比較的高いキシロース代謝が可能に酵母の改良に成功したと知られている。従って、マロニル−ＣｏＡ経路のようにバクテリアや古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）由来の代謝経路を酵母に導入する場合には、同じ機能を行う多様なもの由来の遺伝子を介して活性度が高い遺伝子を確保しなければならない。

【0015】

様々な酵母種のうちサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を遺伝的に操作して３−ＨＰを製造する方法に関連した数多くの論文および特許が存在するか、サッカロマイセスセレビシエの場合には［ピルビン酸→アセトアルデヒド→アセト酸→アセチル−ＣｏＡ→マロニル−ＣｏＡ→マロネートセミアルデヒド→３−ＨＰ］の代謝経路を経て３−ＨＰを生成するが、３−ＨＰ製造に至る代謝経路が複雑で３−ＨＰ生産性が相対的に低い問題がある（米国公開特許公報ＵＳ ２０１０／０２４８２３３Ａ１、Ｙ．Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２２：１０４−１０９，２０１４）。

【0016】

これに対して、本発明者等は、前記問題を解決するために鋭意努力した結果、細胞基質内でアセチル−ＣｏＡを取得する過程において、ＡＴＰ消費が発生する酵母の短所を克服するために、アセトアルデヒドからアセテートを経由せず直接アセチル−ＣｏＡに転換する代謝経路［ピルビン酸→アセトアルデヒド→アセチル−ＣｏＡ→マロニル−ＣｏＡ→３−ＨＰ］に着目して、前記代謝経路を含む組換え酵母を利用する場合、大腸菌を利用する場合とは異なりｐＨ調節物質の使用削減およびこれに伴う塩（ｓａｌｔ）生成減少効果があると共に、低ｐＨでもブドウ糖から３−ＨＰを高濃度および高収率で生産することができることを確認して本発明を完成するようになった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0017】

本発明の目的は、アセトアルデヒドからアセテートを経由せず直接アセチル−ＣｏＡに転換する代謝経路［ピルビン酸→アセトアルデヒド→アセチル−ＣｏＡ→マロニル−ＣｏＡ→３−ＨＰ］を介して３−ＨＰを生産することができる組換え酵母を提供するところにある。
本発明の他の目的は、前記組換え酵母を利用して３−ＨＰを製造する方法を提供するところにある。

【課題を解決するための手段】

【0018】

前記目的を達成するために、本発明は、外因性ＡＡＤＨ遺伝子、内因性または外因性ＡＣＣ遺伝子、および外因性ＭＣＲ遺伝子を含有して、［ピルビン酸→アセトアルデヒド→アセチル−ＣｏＡ→マロニル−ＣｏＡ→３−ＨＰ］生合成経路を介して３−ＨＰを生産することができる組換え酵母を提供する。

【0019】

本発明において、前記酵母は、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カザクスタニアエキシグア（Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ ｅｘｉｇｕａ）、カザクスタニアブルデリ（Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ ｂｕｌｄｅｒｉ）、およびカンジダヒュミリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｈｕｍｉｌｉｓ）で構成された群で選択される耐酸性を有する酵母であることを特徴とする。

【0020】

本発明はまた、（ａ）前記組換え酵母を少なくとも一つの炭素源を含有する培地で培養して、３−ＨＰを生成させる段階、および（ｂ）前記培養液から３−ＨＰを分離する段階を含む３−ＨＰの製造方法を提供する 。

【発明の効果】

【0021】

本発明の組換え酵母とこれを利用した３−ＨＰ製造方法を介して、ブドウ糖など有用性がある糖から低ｐＨで３−ＨＰを高濃度および高収率で生産することができるため、バイオ物質由来３−ＨＰおよびこれらの応用製品の経済的な産業的生産に大きく寄与することができる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】本発明の組換え酵母のブドウ糖から３−ＨＰに到達する代謝経路（変形されたマロニル−ＣｏＡ代謝経路）および核心酵素を示す。

【図2】Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅの酵素のＡＣＣ１活性の相対的な順位を示したものである。

【図3】アキアＭＣＲ変異体の相対的活性（左）と発現レベル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：右）を確認した結果を示したものである。

【図4】３−ＨＰの経路に関連する酵素を発現させるための酵母発現プラスミドであるｐＳＫ−０８４とｐＳＫ−０８５を示したものである。

【図5】３−ＨＰの生産に影響を与えることができる培養条件のテストの結果を示したものである。

【図6】確立された３−ＨＰの生産菌株でｆｅｄ−ｂａｔｃｈ（ｔａｂｌｅｔ ｓｐｉｋｉｎｇ）培養条件を使用して３−ＨＰを生産した結果を示したものである。

【発明を実施するための形態】

【0023】

他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
一般に酵母でアセチル−ＣｏＡは［アセトアルデヒド→酢酸→アセチル−ＣｏＡ］の代謝経路を経て取得されて、酢酸は、酵母の細胞基質内で生成されて、アセチル−ＣｏＡ取得過程でＡＴＰがＡＭＰに転換されてエネルギーが消費される（図１、Ｙ．Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２２：１０４−１０９，２０１４）。

【0024】

しかし、本発明では、細胞基質内でアセチル−ＣｏＡを取得する過程において、酢酸を経由せず、アセトアルデヒドで直接アセチル−ＣｏＡを取得することによって、ＡＴＰ消費が生じる酵母の短所を克服および改善させた代謝経路（図１）を考案して適用した。その結果、本発明の組換え酵母を利用する場合、低ｐＨでもブドウ糖から３−ＨＰを高濃度および高収率で生産する可能性があることを確認した。

【0025】

従って、本発明は一観点で、外因性ＡＡＤＨ遺伝子、内因性または外因性ＡＣＣ遺伝子、および外因性ＭＣＲ遺伝子を含有して、［ピルビン酸→アセトアルデヒド→アセチル−ＣｏＡ→マロニル−ＣｏＡ→３−ＨＰ］の生合成経路を介して３−ＨＰを生産することができる組換え酵母に関する。

【0026】

前記［ピルビン酸→アセトアルデヒド→アセチル−ＣｏＡ→マロニル−ＣｏＡ→３−ＨＰ］の生合成経路は、ブドウ糖などの炭素源から３−ＨＰを生成する経路に該当するものとして、（ｉ）「ピルビン酸→アセトアルデヒド」は、ピルベートデカルボキシラーゼ（Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ、ＰＤＣ）を利用して中間体を生成せずピルビン酸からアセトアルデヒドを生合成する経路を意味し、（ｉｉ）「アセトアルデヒド→アセチル−ＣｏＡ」は、アセチル基を含有したアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ａｃｅｔｙｌａｔｉｎｇ ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＡＡＤＨ）を利用してアセトアルデヒドから、アセテートのような中間体を経由せず、直接アセチル−ＣｏＡを生合成する経路を意味し、（ｉｉｉ）「アセチル−ＣｏＡ→マロニル−ＣｏＡ」は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ、ＡＣＣ）を利用して中間体を生成せずアセチル−ＣｏＡからマロニル−ＣｏＡを生合成する経路を意味し、（ｉｖ）「マロニル−ＣｏＡ→３−ＨＰ」は、二機能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）マロニル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＭＣＲ）を利用して中間体を生成せずマロニル−ＣｏＡから３−ＨＰを生合成する経路または単一機能性（ｍｏｎｏ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）マロニル−ＣｏＡレダクターゼを利用してマロネートセミアルデヒドを生合成した後マロネートセミアルデヒドから３−ＨＰを生合成する経路を意味する（図１）。

【0027】

本発明において、ＰＤＣ遺伝子は特別な操作を加えないが、当業界に知られている公知の技術を適用して、酵母に内在したＰＤＣ遺伝子を増幅させるなど３−ＨＰ生成効率を上げるためのＰＤＣ遺伝子操作を行ってもよい。

【0028】

本発明の一実施例では、経路酵素候補群に対する生物情報学的ゲノムマイニング（ｇｅｎｏｍｅ ｍｉｎｉｎｇ）を介して、特定の機能を有する経路酵素をエンコードする遺伝子を抽出した。
本発明において、ＡＡＤＨ遺伝子は、下記の表１〜３に記載された遺伝子で構成された群から選択された遺伝子と６０％以上の相同性を有する核酸であることを特徴とし、アセトアルデヒドからアセチル−ＣｏＡを生合成する機能を有する限り特別な制限はない。

【0029】

【表1】

【0030】

【表2】

【0031】

【表3】

【0032】

本発明において、ＡＣＣ遺伝子が下記の表４に記載された遺伝子で構成された群から選択された遺伝子と６０％以上の相同性を有する核酸であることを特徴とし、アセチル−ＣｏＡからマロニル−ＣｏＡを生合成する機能を有する限り特別な制限はない。

【0033】

【表4】

【0034】

本発明において、外因性ＭＣＲ遺伝子は、マロニル−ＣｏＡのマロネートセミアルデヒドへの転換とマロネートセミアルデヒドの３−ＨＰへの転換の二機能性（ｂｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）を有すること、またはマロニル−ＣｏＡのマロネートセミアルデヒドへの転換の単一機能性（ｍｏｎｏ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）を有することを特徴とする。

【0035】

本発明において、前記二機能性ＭＣＲ遺伝子は、表５に記載された遺伝子で構成された群から選択された遺伝子と６０％以上の相同性を有する核酸であることを特徴とし、マロニル−ＣｏＡからマロネートセミアルデヒドの生合成する機能とマロネートセミアルデヒドから３−ＨＰの生合成する機能を同時に有する限り特別な制限はない。

【0036】

【表5】

【0037】

本発明において、前記外因性ＭＣＲ遺伝子がマロニル−ＣｏＡのマロネートセミアルデヒドへの転換の単一機能性（ｍｏｎｏ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）を有する場合には、マロネートセミアルデヒドを３−ＨＰに転換させることができる酵素の遺伝子を追加で含有することを特徴とする。

【0038】

本発明において、前記単一機能性ＭＣＲ遺伝子は表６に記載された遺伝子で構成された群から選択された遺伝子と６０％以上の相同性を有する核酸であることを特徴とし、マロニル−ＣｏＡからマロネートセミアルデヒドの生合成機能を有する限り特別な制限はない。

【0039】

【表6】

【0040】

本発明において、前記マロネートセミアルデヒドを３−ＨＰに転換させることができる酵素の遺伝子は、下記の表７〜１０に記載された遺伝子で構成された群から選択された遺伝子と６０％以上の相同性を有する核酸であることを特徴とし、マロネートセミアルデヒドから３−ＨＰの生合成機能を有する限り特別な制限はない。

【0041】

下記の表７に記載されたＨＰＤＨ−エンコード遺伝子、表８に記載されたＨＩＢＡＤＨ−エンコード遺伝子、表９に記載されたＨＢＤＨ−エンコード遺伝子、および表１０に記載されたＢＤＨ−エンコード遺伝子はいずれもマロネートセミアルデヒドから３−ＨＰを生合成する機能を有するものである。

【0042】

【表7】

【0043】

【表8】

【0044】

【表9】

【0045】

【表10】

【0046】

本発明に係る具体的な実施例では、３−ＨＰの生産経路を持つ組換え酵母は、表１１に記載されているように、例えば、配列番号７４〜８９からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するＡＡＤＨをコードする外因性遺伝子、配列番号９９〜１０６で構成された群から選択されたアミノ酸配列を有するＡＣＣをコードする内因または外因性遺伝子、配列番号１０７〜１１６に構成された群から選択されたアミノ酸配列を有するＭＣＲをコードする外因性遺伝子と配列番号１１７〜１４４に構成された群から選択されたアミノ酸配列を有するＨＰＤＨをコードする外因性遺伝子を含むことができる。

【0047】

【表11-1】

【0048】

【表11-2】

【0049】

【表11-3】

【0050】

本発明において、組換え酵母が耐酸性があることを特徴とすることができ、上記耐酸性酵母はサッカロマイセス属、コサックスターニアサッカロマイセスとカンジダの中に構成された群から選択されることができ、例えば、サッカロマイセスセレビィジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、コサックスターニアアキシアルグア（Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ ｅｘｉｇｕａ）、コサックスターニアブルデリ（Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ ｂｕｌｄｅｒｉ）、およびカンジダヒュミリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｈｕｍｉｌｉｓ）で構成された群から選択されたことを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。

【0051】

本発明に適した耐酸性組換え酵母を作製するためには有機酸（特に、３−ＨＰ、および／または３−ＨＰの生産時に副産物として生成される有機酸）に耐酸性を有する宿主酵母を使用していることが望ましい。

【0052】

上記耐酸性酵母はサッカロマイセスセレビィジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、コサックスターニアアキシアルグア（Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ ｅｘｉｇｕａ）、コサックスターニアブルデリ（Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ ｂｕｌｄｅｒｉ）、およびカンジダヒュミリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｈｕｍｉｌｉｓ）で構成された群から選択できるが、これに限定されるものではない。

【0053】

本発明において、組換え酵母が耐酸性を有することを特徴とし、前記耐酸性酵母は、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カザクスタニアエキシグア（Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ ｅｘｉｇｕａ）、カザクスタニアブルデリ（Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ ｂｕｌｄｅｒｉ）、およびカンジダヒュミリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｈｕｍｉｌｉｓ）で構成された群から選択されたことを特徴とするが、これに限定されない。

【0054】

本発明に係る変形微生物は、通常の方法により前記遺伝子を微生物の染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）上に挿入させるか、前記組換えベクターを微生物のプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）上に導入させることによって製造することができる。

【0055】

前記組換え微生物は、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い母体（宿主細胞）が通常使用されて、本発明の一実施例では酵母を利用するが、これに限定されず、目的ＤＮＡが十分に発現することができるものであればどのような種類の微生物であってもよい。

【0056】

前記組換え微生物は、任意の形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）方法により製造することができる。「形質転換」とは、ＤＮＡを宿主に導入してＤＮＡが染色体外因子としてまたは染色体統合完成によって複製可能になるものとして、外部のＤＮＡを細胞内に導入して人為的に遺伝的な変化を起こす現象を意味し、一般的な形質転換方法としては、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ_４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）沈殿、マイクロインジェクション法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、酢酸リチウム−ＤＭＳＯ法などが挙げられる。

【0057】

また、本発明で遺伝子を母体（宿主細胞）の染色体上に挿入する方法としては通常知られている任意の遺伝子操作方法を使用することができ、一例としてレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスシンプレックスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、非ウイルス性ベクターなどを利用する方法がある。「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、適切な宿主内でＤＮＡを発現させることができる適切な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子または単に潜在的ゲノム挿入物であってもよい。適当な宿主で形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムと関係がなく複製して機能できるか、または、一部の場合にはゲノムそれ自体に統合される。プラスミドが現在のベクターの最も通常的に用いられる形態である。

【0058】

典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たり数個〜数百個のプラスミドベクターを含むように複製が効率的に行われるようにする複製開始点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞が選抜できるようにする抗生剤耐性遺伝子及び（ｃ）外来ＤＮＡ切片が挿入できるようにする制限酵素切断部位を含む構造を持っている。適切な制限酵素切断部位が存在しなくても、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄａｐｔｏｒ）または、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使えば、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）することができる。

【0059】

また、前記遺伝子は、他の核酸配列と機能的関係で配置される時、「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列（等）に結合する時遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子および調節配列（等）であってもよい。例えば、プレ配列（ｐｒｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結されて、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されたり、またはリボソーム結合部位は、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されたり、またはリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コード配列に作動可能に連結される。

【0060】

一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されたＤＮＡ配列が接触して、また、分泌リーダーの場合、接触してリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）は、接触する必要がない。これらの配列の連結は、便利な制限酵素部位でライゲーション（連結）により行われる。そのような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄａｐｔｏｒ）またはリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使用する。

【0061】

もちろん、全ベクターが本発明のＤＮＡ配列を発現するのに全部同等に機能を発揮することはなく、同様に全ての宿主が同じ発現システムに対して同じ機能を発揮することはない。しかし、当業者なら、過度な実験的負担なしに本発明の範囲を逸脱しない状態で、他の種々のベクター、発現調節配列および宿主の中から適切に選択して適用することができる。例えば、ベクターを選択するには宿主を考慮しなければならないが、これはベクターがその中で複製されなければならないためである。ベクターの複製数、複製数を調節できる能力および当該ベクターによってコードされる他のタンパク質、例えば抗生剤マーカーの発現もさらに考慮されなければならない。

【0062】

他の観点において、本発明は、（ａ）前記組換え酵母を少なくとも一つの炭素源を含有する培地で培養して、３−ＨＰを生成させる段階、および（ｂ）前記生成された３−ＨＰを回収する段階を含む３−ＨＰの製造方法に関する。

【0063】

本発明において、炭素源は、グルコース、キシロース、アラビノース、スクロース、プルクトース、セルロース、グルコースオリゴマーおよびグリセロールで構成された群から選択された一つ以上であることを特徴するが、これに限定されない。

【0064】

本発明において、培養をｐＨが好ましくは１．０〜７．０、より好ましくは２．６〜４．０で行うことを特徴とするが、これに限定されない。

【実施例】

【0065】

以下、本発明について実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業界において通常の知識を有する者にとって自明である。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらと均等の範囲により定義されると言える。

【0066】

［実施例１：３−ＨＰ耐性基盤、母体酵母菌株の選別］
３−ＨＰ生成個体の必須の特徴は、高濃度の３−ＨＰに対する相当な耐性を有して、菌株能力の最小限の損失だけで発酵時産物を蓄積できることである。低ｐＨで高濃度の３−ＨＰに対する耐性を有するか否かおよび前記条件下で成長してブドウ糖代謝できるか否かを確認するために、７１８個の種々の野生型酵母菌株を調べた（表１２）。

【0067】

全体菌株セットの酸耐性（ａｃｉｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を調べるために、成長分析（ｇｒｏｗｔｈ ａｓｓａｙｓ）をベースにした、多くのアガープレートおよび液体培地マイクロタイター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ）プレートを最初に使用した。その後、三角フラスコ培養液（ｓｈａｋｅ ｆｌａｓｋ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｓ）内菌株のサブセットに対する低ｐＨに過量の３−ＨＰに対する耐性を評価した。分離時、前記調査方法のいずれも産業現場で３−ＨＰ耐性の完ぺきな指標ではなかったが、多様な方法の組み合わせが有望な３−ＨＰ生産酵母菌株製造に対する隙間なくしっかりとした手段を提供する。

【0068】

最初に、様々な量の３−ＨＰを含有する固体ＹＰＤ−基盤アガー培地で７１８個の酵母菌株の成長を評価した：０ｇ／Ｌ ３−ＨＰ（ｐＨ６．６２）、５０ｇ／Ｌ ３−ＨＰ（ｐＨ３．４４）、７５ｇ／Ｌ ３−ＨＰ（ｐＨ３．２８）、１００ｇ／Ｌ ３−ＨＰ（ｐＨ３．１７）および１２５ｇ／Ｌ ３−ＨＰ（ｐＨ３．０８）。その後、様々な量の３−ＨＰに対する耐性をベースに菌株の点数を付けた。

【0069】

その後、自動で培養して、振盪して、培養液の濁度を測定するＢＩＯＳＣＲＥＥＮ Ｃ機械を利用して、マイクロタイタープレート液体培養液内３−ＨＰの不在（ＳＣＤ−基盤培地、０ｇ／Ｌ ３−ＨＰ、ｐＨ６．０）または、存在（ＳＣＤ−基盤培地、７０ｇ／Ｌ ３−ＨＰ、ｐＨ３．５）時７１８個の酵母菌株の成長を評価した。各実験条件下で、各菌株の過渡期、最大成長率および最大細胞密度を作るために、微生物成長曲線モデリングのための既存ソフトを適用した。前記分析方法の間、３−ＨＰ不在時最大成長率、３−ＨＰ存在時最大成長率および前記二つの最大成長率値の相対誤差を基に、各菌株の点数を付けた。

【0070】

液体操作ロボットを利用して、マイクロタイタープレート内８５ｇ／Ｌ ３−ＨＰ（ｐＨ３．５）を含有するＹＰＤ−基盤液体培地内で７１８個の酵母菌株の成長率およびブドウ糖利用率を評価した。成長プレートを培養させて、指定された時間（ｔｉｍｅ−ｐｏｉｎｔｓ）にＯＤ測定のためのサンプルを希釈して、指定された時間に残りのブドウ糖の量を測定するためのＨＰＬＣ分析のための上澄み液を集めるために、自動化された作業の流れ（ｗｏｒｋ−ｆｌｏｗ）を利用した。ＢＩＯＳＣＲＥＥＮ Ｃ成長分析とは反対に、ロボットのマイクロタイタープレート成長分析は、前記二種類の方法のように単に成長率だけを評価する代わりに、ブドウ糖利用率を評価させて、より多くの通気（ａｅｒａｔｉｏｎ）およびより高い最大細胞密度を有するようにする。このような調査方法の間、３−ＨＰ存在時最大細胞密度および低ｐＨで３−ＨＰ存在時ブドウ糖消費能を基に各菌株の点数を付けた。

【0071】

様々な３−ＨＰ耐性評価分析方法の個別的な点数は、各菌株の３−ＨＰ耐性に対する最終点数を得るために共に平均を計算した（表１２）。その結果、酵母種カンジダアピコラ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｐｉｃｏｌａ）、カンジダヒュミリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｈｕｍｉｌｉｓ）， 、イサチェンキア オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）， 、カザクスタニアブルデリ（Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ ｂｕｌｄｅｒｉ）， 、カザクスタニアエキシグア（Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ ｅｘｉｇｕａ）， 、ピキア・メンブラニファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ）， 、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が様々な条件下で低ｐＨで３−ＨＰに対する一般的耐性が相当であることを確認することができた。

【0072】

前記８種類の３−ＨＰ耐性酵母種に対し三角フラスコ培養液内の低ｐＨで３−ＨＰ耐性に対する追加分析を行った。前記培養液（精製されたＳＣＤ−基盤培地、高い初期バイオマス、低い通気）で、菌株の成長能、ブドウ糖消費能およびエタノール生成能を様々なｐＨで様々な濃度の３−ＨＰ存在下で評価した：１００ｇ／Ｌ ３−ＨＰ（ｐＨ４．０）、１００ｇ／Ｌ ３−ＨＰ（ｐＨ３．５）、１００ｇ／Ｌ ３−ＨＰ（ｐＨ３．０）および８０ｇ／Ｌ ３−ＨＰ（ｐＨ２．６）。前記三角フラスコ培養液は、特定のＣ． ｈｕｍｉｌｉｓ， Ｋ． ｂｕｌｄｅｒｉ， Ｋ． ｅｘｉｇｕａおよびＳ． ｃｅｒｅｖｉｓａｉｅ 酵母が前記厳しい条件下で様々な酵母菌株中で最も速いブドウ糖利用率、バイオマス生成率およびエタノール生成率を有するが、低ｐＨで高濃度の３−ＨＰに対する非常にしっかりとした耐性を有することを示す。一方、Ｃ． ａｐｉｃｏｌａ， Ｉ． ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ， Ｐ． ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓおよびＹ． ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ 酵母菌株は、このような非常に制限的な成長条件下で性能をよく発揮できなかった。種々の三角フラスコ培養液を利用した具体的な後続的分析で特定のＣ． ｈｕｍｉｌｉｓ， Ｋ． ｂｕｌｄｅｒｉ， Ｋ． ｅｘｉｇｕａおよびＳ． ｃｅｒｅｖｉｓａｉｅ 酵母菌株が産業的に適した条件下で３−ＨＰに高い自然な耐性を示し、３−ＨＰ生成母体として大きい潜在性を有することが分かった。

【0073】

【表12-1】

【0074】

【表12-2】

【0075】

【表12-3】

【0076】

【表12-4】

【0077】

【表12-5】

【0078】

【表12-6】

【0079】

【表12-7】

【0080】

【表12-8】

【0081】

【表12-9】

【0082】

【表12-10】

【0083】

【表12-11】

【0084】

【表12-12】

【0085】

【表12-13】

【0086】

【表12-14】

【0087】

【表12-15】

【0088】

【表12-16】

【0089】

【表12-17】

【0090】

［実施例２：経路酵素候補に対する生物情報学的ゲノムマイニング（ｇｅｎｏｍｅ ｍｉｎｉｎｇ）］
特定の機能を有する候補酵素を確認するために、相同性−基盤データベース調査を行った。それぞれ多くの探索配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）でデータベースを調べた。追加で、関連があるタンパク質族（ｆａｍｉｌｙ）をＩｎｔｅｒＰｒｏドメイン注釈を基盤としたＵｎｉｐｒｏｔ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔから調べた。相同性−基盤調査は、Ｕｎｉｐｒｏｔ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔおよびＴｒＥＭＢＬ）およびｂｌａｓｔｐを利用したＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベース、ｔｂｌａｓｔｎを利用したＧｅｎＢａｎｋヌクレオチドデータベース（ｔｓａ＿ｎｔ、ｅｎｙ＿ｎｔおよびｐａｔ）で行った。Ｅ−値（Ｅ−ｖａｌｕｅ）が１ｅ−３０より小さい配列を抜き取った。しかし、いくつかの場合においては、Ｅ−値が１ｅ−８０より小さい配列を対象に追加的な分析を行った。翻訳に対する案内として探索配列を利用したＧｅｎｅＷｉｓｅでヌクレオチドヒットをタンパク質配列で翻訳した。ＧｅｎｅＷｉｓｅで長いＡＣＣ配列を翻訳することは難しすぎるので、その代わりにｂｌａｓｔ−ｘｍｌ ｏｕｔｐｕｔからタンパク質配列（探索配列と一致する部分）を抜き取った。不要な配列を除去するために、調べられた配列をＢＬＡＳＴＣＬＵＳＴまたはＣＤ−ＨＩＴを利用して、各々相同性が８０％以上である配列を含むクラスターで集合化した。各クラスターでただ一つの代表配列だけを保存した。配列の必要なセットをタンパク質族のＰＦＡＭドメインまたはＭＡＦＦＴを利用してアラインメントした。ＭＡＦＦＴによる全域アラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）は、タンパク質族がどのようなＰＦＡＭとも関連がないか、タンパク質の配列が数個のＰＦＡＭドメインで分離する場合に適用した。系統数はＰＨＹＬＩＰまたはＦＡＳＴＴＲＥＥを利用した様々な配列アラインメントをベースに作った。系統数はＥ．Ｃ．数字、個体名、ｂｌａｓｔ Ｅ−値で注釈を付けて、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトを利用して可視化した。

【0091】

［２−１：アセチル基を含有したアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ａｃｅｔｙｌａｔｉｎｇ ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）］
ＣｏＡへの還元は、アセチル基を含有したアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＡＤＨ，Ｅ．Ｃ．１．２．１．１０）により行われる。ＡＡＤＨは、機能的に相同性がある三つのグループに分けられる（ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ４：２５８０， ２０１３）：１）ＡＡＤＨおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する二機能タンパク質（Ｅ． ｃｏｌｉａｄｈＥ ｔｙｐｅ ｇｅｎｅｓ， ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ： ＮＰ＿４１５７５７， ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、２）エタノールアミン異化作用に関与するタンパク質（Ｅ． ｃｏｌｉｅｕｔＥ ｔｙｐｅ ｇｅｎｅｓ， ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ： ＡＡＧ５７５６４， ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、および３）４−ヒドロキシ−２−ケト吉草酸塩（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｋｅｔｏｖａｌｅｒａｔｅ）異化作用に関与するアルドラーゼ−デヒドロゲナーゼ複合体の一部である二機能タンパク質（Ｅ． ｃｏｌｉ ｍｐｈＦ ｔｙｐｅ ｇｅｎｅｓ， ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ： ＮＰ＿４１４８８５）。関心対象はグループ１（ａｄｈＥ ｔｙｐｅ）とグループ２（ｅｕｔＥ ｔｙｐｅ）酵素である。

【0092】

ａｄｈＥタンパク質のＮ−末端ドメインは、アルデヒド：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼと高い相同性がある一方、Ｃ−末端部位は、Ｆｅ２＋−依存性エタノール：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼと相同性がある（Ｍｅｍｂｒｉｌｌｏ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：３３８６９−３３８７５，２０００）。アセチル基を含有したアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、アルコールデヒドロゲナーゼドメインを除去することによって、単にＮ−末端のアルデヒドレダクターゼドメインだけを有する二機能ａｄｈＥタンパク質を切断して細胞内に導入することができる。このような二機能ＡＡＤＨ活性を有する追加的な遺伝子を生物情報学的分析および配列相同性をベースに推論した。様々な遺伝子は表１の通りである。

【0093】

ほとんどの場内細菌は、炭素源および窒素源としてエタノールアミンを利用することができる（Ｓｔｏｊｉｌｊｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７：１３５７−１３６６，１９９５）。このような異化経路は、アセトアルデヒドがアセチル基を含有したアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＥｕｔＥによってアセチル−ＣｏＡに変換される段階と関連がある。ＡＡＤＨ活性を有する追加的な遺伝子を生物情報学的分析および配列相同性をベースに推論した。様々な遺伝子は表２の通りである。

【0094】

追加的に、ａｄｈＥおよびｅｕｔＥタイプ遺伝子に対する生物情報学的分析および配列相同性をベースに、ＡＡＤＨ活性を有すると推測することができるアルデヒドデヒドロゲナーゼと見ることができる一つのグループの遺伝子を確認した。様々な遺伝子は表３の通りである。

【0095】

［２−２：真核アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）］
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ，ＥＣ ６．４．１．２）は、脂肪酸生合成に重要な酵素である多機能ビオチン−依存性カルボキシラーゼである。アセチル−ＣｏＡのマロニル−ＣｏＡへの転換に対する触媒作用をするために、助酵素としてＡＴＰおよびビオチンを使用する。まず、ビオチンカルボキシラーゼが炭酸水素塩（ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）と共にビオチンのＡＴＰ−依存性カルボキシ化に対する触媒作用をする。次に、カルボキシトランスフェラーゼが、マロニル−ＣｏＡを形成するためにビオチンからアセチル−ＣｏＡにカルボキシル基を移動させる。真核酵素は、大きいマルチドメイン酵素である反面、これに相応する原核酵素は、別の遺伝子によってコードされる様々なサブユニットで構成されている。ＡＣＣの活性は、アセチル−ＣｏＡ恒常性を維持するために、翻訳段階および翻訳後段階で調節される（例えば、リン酸化反応および凝集）。他の酵母種におけるＡＣＣ操作は、増加したＡＣＣ活性および増加したマロニル−ＣｏＡ由来産物の生成を引き起こした。ＡＣＣ活性を有する酵素をエンコードする遺伝子をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ： ＣＡＡ９６２９４．１， ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ： ＸＰ＿５０１７２１．１， ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）及びＭｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ： ＥＰＢ８２６５２．１， ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）で確認または想定した。候補アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子をＫａｚａｃｈｓｔａｎｉａ ｅｘｉｇｕａ（配列番号 １）およびＣａｎｄｉｄａ ｈｕｍｉｌｉｓ（配列番号 ２）の新しく配列化されたゲノムで確認して、酵母発現プラスミドでクローニングした。ＡＣＣ活性を有する追加的な遺伝子を生物情報学的分析および配列相同性をベースに推論した。様々な真核マルチドメインＡＣＣ遺伝子は表４の通りである。

【0096】

［２−３：二機能マロニル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）］
マロニル−ＣｏＡで３−ＨＰへの還元（マロネートセミアルデヒド中間体を経る）は、Ｃ−末端アルデヒドデヒドロゲナーゼドメインおよびＮ−末端アルコールデヒドロゲナーゼドメイン機能基を共に有する二機能マロニル−ＣｏＡレダクターゼによって行われることができる。このような活性を有する非常に基質−特異的でＮＡＤＰＨ−依存的な酵素は、３−ヒドロキシプロピオネートサイクルと呼ばれる独立栄養ＣＯ_２固定化経路に関与する光栄養緑色非硫黄細菌Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ： ＡＡＳ２０４２９．１、 ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）内で特性化される（Ｈｕｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２４０４−２４１０，２００２）。このような二機能マロニル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有する追加的な遺伝子を生物情報学的分析および配列相同性をベースに推論した。様々な遺伝子は表５の通りである。

【0097】

［２−４：マロニル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）］
実施例２−３の二機能マロニル−ＣｏＡレダクターゼとは異なり、マロニル−ＣｏＡは二種類の個別的な酵素によって３−ＨＰで触媒できる。この経路によると、マロニル−ＣｏＡがまずマロニル−ＣｏＡレダクターゼ（ＭＣＲ、ＥＣ １．２．１．７５）またはＣｏＡ−アシル基を含有したマロネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼによりマロネートセミアルデヒドに還元された後、連続的に３−ヒドロキシプロピオネートデヒドロゲナーゼ（３−ＨＰＤＨ、ＥＣ １．１．１．５９またはＥＣ １．１．１．２９８）により３−ＨＰに還元される。ＭＣＲは、３−ヒドロキシプロピオネート／４−ヒドロキシブチレートサイクルを介して有機物質内に炭素を自己栄養で固定するいくつかの耐熱好酸性古細菌（ｔｈｅｒｍｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｃｈａｅａ）により利用されるＮＡＤＰＨ−依存性酵素である（Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１７８２−１７８６，２００７）。ＭＣＲ活性を有する酵素をエンコードする遺伝子は、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ： ＡＢＰ９４８８４．１， ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）及びＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ： ＢＡＢ６７２７６．１， ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）内で特性化される。たとえ前記ＭＣＲは、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ二機能マロニル−ＣｏＡレダクターゼ酵素に対する類似のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を共有するとしても、これらはＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓおよびＳｕｌｆｏｌｏｂａｃｅａｅ内自己栄養経路が収束的に進化する点および他の遺伝子が分類学上群内類似の代謝過程を実行するために利用される点を示すいかなる相当する配列類似性を示さない（Ａｌｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８８：８５５１−８５５９，２００６）。特に、古細菌ＭＣＲは、アスパルテート−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼと高い配列類似性を示す。ＭＣＲ活性を有する追加的な遺伝子を生物情報学的分析および配列相同性をベースに推論した。様々な遺伝子は表６の通りである。

【0098】

［２−５：３−ヒドロキシプロピオネートデヒドロゲナーゼ（３−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）］
マロネートセミアルデヒドは、可逆３−ヒドロキシプロピオネートデヒドロゲナーゼ（ＨＰＤＨ、ＥＣ １．１．１．５９、ＮＡＤＨ−依存的）またはマロネートセミアルデヒドレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．２９８、ＮＡＤＰＨ−依存的）により３−ＨＰに還元される。このような酵素は、自然にバクテリアおよび植物内β−アラニン代謝、プロパノエート代謝またはウラ室分解に関与する。さらに、このような酵素は、３−ヒドロキシプロピオネート／４−ヒドロキシブチレートサイクルを介した炭素固定化のためにいくつかの耐熱好酸性古細菌で必要とする（Ｋｏｃｋｅｌｋｏｒｎ ａｎｄ Ｆｕｃｈｓ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９１：６３５２−６３６２，２００９）。３−ヒドロキシプロピオネートデヒドロゲナーゼまたはマロネートセミアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素をエンコードする遺伝子をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ： ＥＦＶ０００８０．１， ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）， Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ： ＤＡＡ１０１２５．１， ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）， Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ： ＡＢＰ９６１３３．１， ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）， Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ： ＢＡＫ５４６０８．１， ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ： ＡＣＲ６４７３０．１， ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）で確認または想定した。３−ヒドロキシプロピオネートデヒドロゲナーゼまたはマロネートセミアルデヒドレダクターゼ活性を有する追加的な遺伝子を生物情報学的分析および配列相同性をベースに推論した。様々な遺伝子は表７の通りである。

【0099】

［２−６：３−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼ（３−Ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｂｕｔｙｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）］
３−ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼ（ＨＩＢＡＤＨ、ＥＣ １．１．１．３１）はバリンおよび他の分岐鎖アミノ酸の代謝に関与する重要な酵素である。ＨＩＢＡＤＨは、３−ヒドロキシイソブチレートのメチルマロネートセミアルデヒドへのＮＡＤＨ−またはＮＡＤＰＨ依存性可逆的転換を触媒する。しかし、広範囲な基質特異性により、ＨＩＢＡＤＨはマロネートセミアルデヒドを３−ＨＰに転換することによって３−ヒドロキシプロピオネートデヒドロゲナーゼ活性も示す（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６０：６９４−７０３，２０１０）。ＨＩＢＡＤＨ活性を有する酵素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ： ＡＤＲ６１９３８．１， ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）， Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ： ＡＡＧ０６９５７．１， ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ： ＡＡＰ１０９６１．１， ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）及びＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ： ＥＪＣ６５５５９．１， ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）内で確認した。ＨＩＢＡＤＨ活性を有する追加的な遺伝子を生物情報学的分析および配列相同性をベースに推論した。様々な遺伝子は表８の通りである。

【0100】

［２−７：４−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（４−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）］
４−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（ＨＢＤＨ、ＥＣ １．１．１．６１）は、ブタノエート代謝に自然に関与する酵素である。ＨＢＤＨは４−ヒドロキシブタノエートのサクシネートセミアルデヒドへの遺伝子ＮＡＤ＋−依存的可逆転換を触媒する。しかし、ＨＢＤＨは酵素反応が類似するので、マロネートセミアルデヒドを３−ＨＰに転換させてもよい。ＨＢＤＨ活性を有する酵素をＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ： ＡＡＣ４１４２５．１， ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ： ＥＤＫ３５０２２．１， ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）内で確認した。ＨＢＤＨ活性を有する追加的な遺伝子を生物情報学的分析および配列相同性をベースに推論した。様々な遺伝子は表９の通りである。

【0101】

［２−８：３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（３−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）］
３−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（ＢＤＨ、ＥＣ １．１．１．３０）は、ブタノエート代謝に自然に関与する酵素である。ＢＤＨは、３−ヒドロキシブチレートのアセトアセテートへのＮＡＤ＋−依存的可逆転換を触媒するが、他の３−ヒドロキシモノカルボキシ酸も酸化させることができる。例えば、ＢＤＨは、酵素反応が類似するので、マロネートセミアルデヒドを３−ＨＰに転換させることができる。ＢＤＨ活性を有する酵素をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ：ＧＡＡ１７５５７．１， ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）内で確認した。ＢＤＨ活性を有する追加的な遺伝子を生物情報学的分析および配列相同性をベースに推論した。様々な遺伝子は表１０の通りである。

【0102】

［実施例３：酵素力価測定］
［ＡＣＣ分光光度酵素アッセイ］
分光光度ＡＣＣアッセイは、カップリングされたアッセイで、補助者ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが必要とされる反応で、ＡＣＣ反応によって生成された産物が追加で消費されて、異議酸化を分光光度計で監視することができる。

【0103】

Ｋｒｏｅｇｅｒら（２０１１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１１：１００−１０５）は、ＡＣＣ１によって生成されたｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡがＮＡＤＰＨを補助因子として必要とされる反応で、精製されたｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＭＣＲ）によってマロン酸セミアルデヒドにより変換されているカップリングされたアッセイを記載している。

【0104】

Ｄｉａｃｏｖｉｃｈら（２００２，Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３１２２８−３１２３６）は、ＡＤＰとＡＣＣ反応で補助因子として使用されているＡＴＰ加水分解産物を、ピルビン酸キナーゼ反応を必要とするＡＤＰ（ＡＤＰ−ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）に転換することと乳酸脱水素酵素を使用してフィールベイトを形成することと、さらにカップリングして組み合わせた。後者は、ＮＡＤＨを補助因子として必要とし、異議酸化が連続されている。

【0105】

［ＡＣＣ放射性酵素アッセイ］
インビトロで最も顕著に使用されるのは１４Ｃカーボネートの使用に基づくものである。放射能炭酸を酸および非揮発性物質（即ち、マロニル−ＣｏＡ）に導入する過程が続く。マロニル−ＣｏＡに転換されなかった１４Ｃ標識した炭酸水素ナトリウムを酸及び熱処理で除去し、残りのＮａＨ１４ＣＯ_３及び可能な反応副産物を１４Ｃ標識したＣＯ_２に転換する。

【0106】

Ｄｉａｃｏｖｉｃｈら（２００２、Ｊ． Ｂｉｏｌ。Ｃｈｅｍ。２７７：３１２２８−３１２３６）に記載されたこのアッセイは、少し変形して酵母溶解物からＡＣＣ活性を検出するために使用されてきた（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４、ｍＢＩＯ５：３ ｅ０１１３０−１４）。指数関数的後期またはｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅの収穫した酵母細胞から細胞溶解物を準備した。細胞を水洗し、１００ｍＭカリウムリン酸、ｐＨ７．５、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌと１Ｘ ＥＤＴＡフリー完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含む溶解バッファに再サスペンションした。細胞をガラスビーズで破砕し、４℃で遠心分離した後、上澄み液を収集した。

【0107】

ＡＣＣ酵素アッセイ反応混合物は、１００ｍＭカリウムリン酸（ｐＨ８．０）、３００μｇＢＳＡ、３ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＮａＨ１４ＣＯ_３（比活性ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）２００μＣｉｍｍｏｌ−１（７４００ｋＢｑｍｍｏｌ）］と０．５ｍＭアセチル−ＣｏＡを含んでいる。反応総体積は１００μＬであり、２０μＬの細胞抽出物を含んでいる。

【0108】

反応物を３０℃で１５分間インキュベーションし、５０μＬの５ＭＨＣｌを追加して停止した。チューブ内容物を９５℃で乾燥して蒸発させ、残留物を１００μＬの水に再サスペンションし、３ｍＬのシンチレーションカクテル（Ｕｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄ ＡＢ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）と混合した。液体シンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ２８１０ＴＲ）を使用して、サンプルの１４Ｃ含量を測定した。

【0109】

［ＡＡＤＨ酵素アッセイ］
Ｋｏｚａｋら（２０１４、Ｍｅｔａｂ。Ｅｎｇ。２１：４６−５９）に記載されたように、３０℃で３４０ｎｍ ＮＡＤ＋還元をモニタリングしてＡＡＤＨ活性を測定した。細胞溶解物のために酵母細胞を収集、または水で水洗し、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．５）、および１Ｘ ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテル（１Ｘ ＥＤＴＡ ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ））を含む溶解バッファに再サスペンションした。細胞を５５００ｒｐｍ Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ２４ホモジナイザーで３ｘ４０秒間ガラスビーズで溶解し、各回の間に氷で維持した。溶解物１６０００ｇを、４℃で２０分間遠心分離し、上澄み液を収集した。ブラッドフォード法を使用して総タンパク質濃度を測定した。

【0110】

酵素アッセイ反応混合物は、総反応体積２００μＬに０．１ｍＭコエンザイムＡ、５０ｍＭ ＣＨＥＳバッファ（ｐＨ９．５）、０．８ｍＭ ＮＡＤ＋、０．２ｍＭ ＤＴＴ、および１０μＬ細胞抽出物を含んだ。１０ｍＭの未反応した状態で用意されたアセトアルデヒド溶液を追加して反応を開始し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｋｏｎｅｌａｂ２０ＸＴアナライザを介してＮＡＤ＋の還元が連続された。

【0111】

［酵母細胞溶解物からＭＣＲ酵素アッセイ］
Ｃｈｅら（２０１４，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．２２：１０４−１０９）に記載された方法を少し変形してＭＣＲ酵素活性を測定した。この方法は、３４０ｎｍでＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酸化をモニタリングしたことに基づくものである。

【0112】

細胞を収集し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ ＮａＮ_３を含む冷たい水洗バッファに水洗した後、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１Ｘ ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む１ｍＬ遮断バッファに再サスペンションした。細胞を５５００ｒｐｍ Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ２４ホモジナイザーで３ｘ４０秒間ガラスビーズで溶解し、各回の間に氷で維持した。溶解物１６０００ｇを２０分間４℃で遠心分離して、上澄み液を収集した。ブラッドフォード法を使用して総タンパク質濃度を測定した。

【0113】

ＭＣＲアッセイ混合物は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および０．３ｍＭ ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを含んだ。２０μＬ細胞溶解物を総反応体積２００μＬに追加して、反応物を５分間、３０℃で事前インキュベーションした後、０．１５ｍＭ マロニル−ＣｏＡを追加して反応を開始した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｋｏｎｅｌａｂ２０ＸＴアナライザで３４０ｎｍでアッセイをモニタリングした。

【0114】

［酵母発現ベクターの作製］
候補遺伝子の発現と酵母で活性能を評価するために、一連の酵母発現プラスミドを作製した。まず、新規ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベースＭＣＳ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）をデザインして、全ての可能なＲＥ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ）サイトの組み合わせを使用することができる。以降の変形されたＭＣＳをｐＲＳ−ベースのシリアルの酵母同原体および多コピープラスミドに位置させた。以降、１０個のＲＥサイトのセットを使用して、９つの異なるセットのプロモーターとターミネーターをｐＲＳ−ベース酵母発現ベクターにクローニングした。以後、３−ＨＰの生産のための様々な経路の酵素の組み合わせを評価するために、これらのプラスミドシステムを使用して連続的に９つの遺伝子を、低または高コピー数で同時に、適切な酵母菌株で発現した。

【0115】

［ＡＣＣ遺伝子クローニング］
ＳＮＦ１結実があるまたはない、産業的に利用されるＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＶＳＫ−１２８菌株に形質転換させたＡＣＣ１遺伝子を表１３に示した。多コピープラスミドでＡＣＣ遺伝子を発現しており、これらはＰＤＣ１ ｐプロモーターの調節下にあった。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＳｈｉ ｅｔら（２０１４）に記載された変形されたＡＣＣ１ｓｃ遺伝子を構築した。

【0116】

【表13】

【0117】

［ＡＣＣ酵素アッセイ］
文献では、ＡＣＣ酵素活性を検出するために精製されたまたは一部精製されたＡＣＣ酵素と一緒に分光光学的アッセイ（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙｓ）が使用されてきた。対照群と比較して、吸光の変化が検出されないが、ＡＣＣが過発現した酵母細胞溶解物を分光光学的アッセイで試験した。

【0118】

放射性ＡＣＣ酵素アッセイは、非常に敏感で、さらにｐｍｏｌ／ｍｇ／ｍｉｎ活性を検出することができる。商業的に入手可能な精製されたヒトＡＣＣ酵素を使用して、最初にテストした。十分な活性が検出されることによって、酵母細胞溶解物からＡＣＣ活性を検出するために方法をより最適化した。表１３にリストされた菌株のＡＣＣ１活性についてアッセイし、その結果に基づいて、ＡＣＣ１の相対的な順位を記載したリストを作製した（図２）。最も有望な候補として、ＡＣＣｙｌに対して追加の研究し、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ−１２８野生型菌株とＡＣＣ１が過発現された同一菌株の結果を表１４に示した。

【0119】

【表14】

【0120】

［ＡＡＤＨ ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性アッセイ］
５つのＡＡＤＨ遺伝子（すなわち、ＡＤＨＥｐｍ、ＡＤＨＥｅｃ、ＥＵＴｅｃ、ＥＵＴｄｚとＬＩＮ１１２９ｌｉ）を優先的に選択して、ＣＥＮ．ＰＫ ｌａｂ菌株に形質転換した。ＴＥＦ１プロモーター調節下にある全て多コピープラスミドで、これらのＡＡＤＨが発現した。全ての５つのＡＡＤＨ遺伝子はＡＡＤＨ活性を示したが、３つのｅｕｔＥ−ｔｙｐｅ ＡＡＤＨ遺伝子（すなわち、ＥＵＴｅｃ、ＥＵＴｄｚとＬＩＮ１１２９ｌｉ）は、ａｄｈＥ−ｔｙｐｅ ＡＡＤＨｓ（つまり、ＡＤＨＥｐｍとＡＤＨＥｅｃ）と比較して、酵母ではるかに高いＡＡＤＨ活性を示した。

【0121】

２０個の追加新規ＡＡＤＨ遺伝子をゲノムマイニング分析から選択して、酵母で発現および酵素活性を評価した。これらの２０個の新規ＡＡＤＨ遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性についてテストし、これらの４つ（つまり、ＡＡＤＨｍｍ、ＡＡＤＨａｂ、ＡＡＤＨｂｗとＡＡＤＨｖｓ）は、ＡＡＤＨ活性を持つことが分かった。

【0122】

［ＡＡＤＨ ｉｎ ｖｉｖｏ成長アッセイ］
グルコースベース培地で成長できないようにＰＤＨバイパスが欠けていた菌株を製作しようと、産業Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＶＳＫ−１２８菌株からの全てのコピーのＡＣＳ２遺伝子を欠失させた。２５個の異なるＡＡＤＨ変異体を含む発現ベクターを、これらのＡＣＳ２結実菌株に形質転換して、グルコース上で、これらの菌株の成長回復能を評価した。

【0123】

１２個の他のＡＡＤＨ変異体（すなわち、ＥＵＴＥｅｃ、ＥＵＴＥｄｚ、ＬＩＮ１１２９ｌｉ、ＡＡＤＨｍｍ、ＡＡＤＨｔｌ、ＡＡＤＨａｂ、ＡＡＤＨｔａ、ＡＡＤＨｂｓ、ＡＡＤＨｂｗ、ＡＡＤＨｖｓ、ＡＡＤＨｈｓとＡＤＨＥｅｃ）は、グルコースベースの寒天プレートで成長能に基づいて、ＡＣＳ２−結実菌株の成長不全を回復することができた。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＡＤＨ酵素活性アッセイおよびｉｎ ｖｉｖｏ成長回復の分析の間に優れた相関性があった。

【0124】

ＡＣＳ２結実菌株の成長を回復することができると思われる最初の９つのＡＡＤＨ変異体菌株の成長率を液状シェイクフラスコ培養で評価し、変形されていないＰＤＨバイパスを含む野生型菌株と比較した。これらの９つのＡＡＤＨ変異体の両方は、グルコースで培養されたときＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＶＳＫ−１２８菌株の好気性の成長率について＞５０％を維持することができた、ＡＡＤＨ変異体のうちの６つはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＶＳＫ−１２８菌株の好気性成長率について≧８０％を維持することができた。

【0125】

［酵母でＭＣＲ酵素アッセイ］
８つの全長Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ＭＣＲホモログを２つの機能性ドメインで切断し、酵母から６個アキアＭＣＲと一緒に酵素活性についてＭＣＲ−特異的ドメインをアッセイした。これらのＭＣＲは、多コピープラスミドで発現され、これらはＴＥＦ１プロモーター下で調節され、ＣＥＮ．ＰＫ ｌａｂ菌株に形質転換された。

【0126】

ＭＣＲｃａ（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）とこれらのホモルログＭＣＲｒｃ（Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ）は、ＮＡＤＰＨを補助因子として使用したときに、野生型菌株よりも高いＭＣＲ酵素活性を示す２つのＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ＭＣＲホモルログである。ＮＡＤＨを補助因子として使用したときは、８つのＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ＭＣＲホモルログからいかなる酵素活性が観察されなかった。

【0127】

３つのアキアＭＣＲ［Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ ａｒｃｈａｅｏｎ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（ｘ２）］は、ＮＡＤＰＨを補助因子として使用したときに、野生型菌株よりも高いＭＣＲ酵素活性を示し、全ての６つのアキアＭＣＲはＮＡＤＨを補助因子として使用したときに、野生型菌株よりより高いＭＣＲ酵素活性を示した。

【0128】

［アキアＭＣＲの異種発現と特性］
４つの異なるアキアＭＣＲ Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａ（ＭＣＲｍｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉ（ＭＣＲｓｔ）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｃａｌｄｉａｒｃｈａｅｕｍ（ＭＣＲｃｃ）、およびＳｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ ａｒｃｈａｅｏｎ（ＭＣＲｓａ１）についてｐＢＡＴ Ｔ７プロモーターベースの発現構築物を作製した。これらの構造物は、精製のタグが含まれていない、Ｅ． ｃｏｌｉコドン最適化され、先に記載した条件で発現された（表１５）。

【0129】

【表15】

【0130】

次のアッセイ条件を使用して活性を分析した。
０．４ｍＭ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、０．１５ｍＭ Ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２。２０倍希釈された溶解物に対して室温でＭＴＰ（マイクロタイタープレート）フォーマットでアッセイを行った。以降、Ａ３６５でＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの酸化が連続された。テストした４つのアキア遺伝子の中で、ＭＣＲｓａ１とＭＣＲｓｔが最も高いＭＣＲ活性を示した。しかし、タグ付けされたＭＣＲｃａに対して測定されたものよりも、ＭＣＲ活性がより少なかった。Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｃａｌｄｉａｒｃｈａｅｕｍ ＭＣＲ（ＭＣＲｃｃ）について（Ｅ．ｃｏｌｉ細胞溶解物中）ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの活性は測定されなかった。

【0131】

ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して、これらの構造物を分析する場合、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物からＭＣＲｓａ１が最も高い発現レベルを示す一方、ＭＣＲｃｃは溶解された形で発現されなかった（３のゲル（ｓａ１＞ｃａ＞ｓｔ＞ｍｓ＞ｃｃ）を参照）。構造ＭＣＲｓａ１とＭＣＲｓｔは二重補助因子が友好的なようで、ＮＡＤＰＨに対して測定したものと比較したとき、約４０〜５０％の相対ＮＡＤＨ活性を示した。非アクティブ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）の観点から、ＭＣＲｓｔはテストした４つのアキアＭＣＲの中で最も活性のある酵素であることができるが、これは比較的最も低い発現レベルで比較的高い活性レベルを示すたからである。

【0132】

］
［実施例４：組換え酵母培養を通じた３−ＨＰの製造］
［Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのシェイクフラスコ培養］
選別的アガベースプレートで新鮮な培養された菌株から小さなリングの細胞を取って２５０ｍＬフラスコで２０ｍＬの選別的ＳＣベースの培地を接種するために使用されて、全てのグルコースおよびエタノールが消費されるまでの２日間（３０℃、２５０ｒｐｍ）培養した。最終的な細胞密度を測定し、培養物を５分間４０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄み液をＨＰＬＣまたはＧＣ／ＭＳで分析して、培養上澄み液で３−ＨＰ、およびその他の主要な代謝物の蓄積を測定した。しかし、他の培養条件はまた、特定の菌株、目的（例えば、グルコース開始量、空気の量、バッジの種類とバッジに追加物質の追加など）に応じてテストした。

【0133】

［実施例５：Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅバイオリアクター培養］
２５０〜５００ｍＬ培地を含むＭｕｌｔｉｆｏｒｓバイオリアクター（最大動作体積５００ｍＬ、２４−ブレードのＲｕｓｔｈｏｎタービンインペラ、Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ、スイス）で培養した。培養物を、初期１．２、２．４、または３．６のボリュームガス（体積培養）−１ｍｉｎ−１（ｖｖｍ）で３０℃、３００または９００〜９５０ｒｐｍで維持した。培養物のｐＨは、２Ｍ ＮａＯＨまたは２Ｍ Ｈ_３ＰＯ_４を追加してｐＨ５．５±０．２で一定に維持された。Ｃｌｅｒｏｌ ＦＢＡ３１０７消泡剤（Ｃｏｇｎｉｓ Ｆｒａｎｃｅ、Ｐｏｎｔｈｉｅｒｒｙ Ｐａｒｉｓ、０．０３％ｖ／ｖ）を追加して泡の生成を調節した。Ａｒ中３％ＣＯ_２、５％ＣＯ_２と０．９９％ＡｒとＮ_２のうち１５％Ｏ_２、Ｎ_２中２０％Ｏ_２プラス２０％ＡｒとＮ_２の０．０４％エタノールで調整されたＰｒｉｍａ Ｐｒｏ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒでガス濃度（ＣＯ_２、Ｏ_２、Ｎ_２とＡｒ）を継続的に分析した。

【0134】

菌株をシェイクフラスコでＳＣＤベース選別培地中、オーバーナイトで事前培養し、バイオリアクターに接種するために使用した。培養物の配置のステップ（２０ｇ／Ｌの初期グルコース）を可能にして１４〜２０時間の間持続し、グルコースが消費された後にのみ、ただし、エタノールが消費された後、または以前の両方のいずれか（培養目的に応じて）にグルコースフィードを開始した。グルコースフィード率は０．３８〜０．６５ｇＬ−１ｈ−１（培養目的に応じて）に維持した。以降、上澄み液のサンプルをＨＰＬＣで分析して培養物中の３−ＨＰとその他の主要な代謝物の蓄積を測定した。

【0135】

［実施例６：ＨＰＬＣによる細胞培養上清で３−ＨＰの分析］
注入体積は１０μＬのＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ｅ２６９５ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＵＳＡ）を使用して培養上清サンプルを分析した。ＨＰＬＣでＦａｓｔ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｌｕｍｎ（１００ｍｍ Ｘ７．８ｍｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）に接続されたＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏｌｕｍｎ（３００ｍｍ Ｘ７．８ｍｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を停滞期に使用した。カラムを＋５５℃に維持し、０．３または０．５ｍｌ ｍｉｎ−１の流量で５．０ｍＭ Ｈ_２ＳＯ_４（Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を溶出液として使用した。

【0136】

３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ、グルコース、酢酸、サクシネート、フィールベイト、グリセロールおよびエタノールの検出にＷａｔｅｒｓ２４８９ ｄｕａｌ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ＵＶ（２１０ｎｍ）検出器（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＵＳＡ）、およびＷａｔｅｒｓ２４１４示差屈折計（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＵＳＡ）を使用した。

【0137】

［実施例７：ＧＣ／ＭＳを用いて、細胞培養上清液から３−ＨＰ分析］
テストサンプルおよび標準曲線は次の方法で準備した。
５０μＬＨＣｌ（６Ｎ）で上澄み液（０．５ｍｌ）を酸性化し、３−ＨＰＡ（ＴＣＩ）標準溶液とスパイクした。５μＬ乳酸内部標準溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（ＩＳＯＴＥＣ）ｓｏｄｉｕｍ Ｌ−ｌａｃｔａｔｅ−３，３，３−ｄ３ ９８ａｔｏｍ％、５．５ｇ／ｌ）と約０．２ｇのＮａＣｌを追加した。ラベリングされた３−ＨＰは、商業的に入手不可能なので、このような乳酸安定同位体製品を内部標準として選択し、サンプルマトリックスに存在していないことで利用可能でありながら、３−ＨＰと構造的に／化学的に最も類似した化合物であるためである。混合物を約３分間ボルテックスミキサーでシェイクした。以降のサンプルを約３分間ボルテックスミキサーで混合して、酢酸エチル０．５ｍｌで２回抽出した。１００００ｒｐｍで５分間遠心分離して層を分離した。ＧＣバイアルに上層を収集し、蒸発させた。乾燥された残留物は、６０℃で１時間インキュベーションし、１％ＴＭＣＳを含むＭＳＴＦＡ（５０μＬ）に誘導した。誤差を最小化するために、サンプルと同じ方法で黒カーブ（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）の標準を抽出した。

【0138】

ＭＳＤ（Ａｇｉｌｅｎｔ５９７３ ｍａｓｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）が装着されたＡｇｉｌｅｎｔ６８９０ガスクロマトグラフ（ＧＣ）にサンプルを流した。インジェクター（注入体積１μＬであり、分割比（ｓｐｌｉｔ ｒａｔｉｏ）２０：１）とＭＳＤインターフェイスの温度は、２８０℃であった、オーブンの温度プログラムは、２０℃／ｍｉｎの速度で５０℃〜２８０℃であった。Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰ−５ＭＳキャピラリーカラム（３０ｍ、ＩＤ２００μｍ、フィルムの厚さ０．２５μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ１９０９１Ｓ−４３３）上で分析を行った。化合物の確認は、ＮＩＳＴライブラリからスペクトルサーチに基づいた。ｍ／ｚ１４７とｍ／ｚ２１９をモニタリングして、３−ＨＰを確認し、ｍ／ｚ１７７をモニタリングして、３−ＨＰ二量体を検出した。３−ＨＰの反応を使用して、５点の黒の曲線（ｃ＝１−４００ｍｇ／ｌ）のルールを構築して、正規化のために、内部標準を使用した。これらの濃度範囲で定量は、線形であることが証明された。サンプルと一緒に、スペースのサンプルを分析した。

【0139】

［実施例８：Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプラスミド発現菌株の評価］
３−ＨＰプラスミド発現菌株は、２つの異なる発現プラスミド（即ち、ｐＳＫ−０８４および／またはｐＳＫ−０８５）から３−ＨＰのパス酵素（即ち、ＡＡＤＨ、ＡＣＣ１、ＭＣＲとＨＰＤＨ）一つ、二つまたは３つのことを同時に発現した（図４）。これらの菌株を使用してＶＳＫ−１２８酸耐性Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株で３−ＨＰの生産のための他の３−ＨＰのパス酵素（およびこれらの酵素の組み合わせ）の効果を評価した。菌株を２５０ｍＬフラスコ中、２０ｍＬの選別ＳＣベース培地（２０ｇ／Ｌグルコース）で培養し、全てのグルコースおよびエタノールが消費されるまでの２日間（３０℃、２５０ｒｐｍ）で培養した。

【0140】

［実施例９：ｉｎ ｖｉｖｏパス酵素活性分析の要約］
必要に応じて追加の３−ＨＰのパス酵素を発現することもある様々なＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株で表１６に示すように、２５個のＡＡＤＨ、８つのＡＣＣ１、１０個の２機能性ＨＰＤＨ−ＭＣＲ（二官能性ＨＰＤＨ−ＭＣＲ）、６つのアキアＭＣＲと２８個ＨＰＤＨの３−ＨＰの生産能について分析した。多くの新規３−ＨＰのパス酵素（ゲノムマイニング分析を介して得）が酵素で前の公開された３−ＨＰのパス酵素と比較して活性があることを示し、優れた特性（すなわち、より高い活性、より優れた補助因子評価）を保持することを示した。

【0141】

【表16-1】

【0142】

【表16-2】

【0143】

【表16-3】

【0144】

［実施例１０：３−ＨＰの生産のためのＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシェイクフラスコ培養を試み］
［培養条件］
最初のテストした菌株について、様々な他の培養条件を評価することにより、様々な培養条件は、菌株の３−ＨＰの生産パフォーマンスに影響を与えるかを確認した。Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＶＳＫ−１２８（Δｕｒａ３、Δｈｉｓ３）菌株は、２つのプラスミドを発現するのには、１つはＨＩＢＡＤＨｐａまたはＨＰＤＨｅｃ遺伝子を含み、２回目プラスミドはＭＣＲｓａ２遺伝子を含んでいる。２つの菌株は、培養中に同様に行動して、非常によく似代謝物のプロファイルを有する。

【0145】

６個の他のシェイクフラスコ培養条件を試験した。
１．好気性、バッチプロセス、初期高濃度グルコース（１２０ｇ／Ｌ）
３日目に追加グルコース１００ｇ／Ｌ添加した。
２．嫌気性、バッチプロセス、初期高濃度グルコース（１００ｇ／Ｌ）
フラスコを密封し、１００ｒｐｍｓでもっとゆっくりシェイクした。
３．好気性、バッチプロセス、繰り返しグルコーススパイキング
初期グルコース２０ｇ／Ｌ、以後毎日４０ｇ／Ｌを添加した。
４．好気性、仮想の流加バッチプロセス、初期多数のグルコース精製（ｇｌｕｃｏｓｅ ｔａｂｌｅｔｓ）
５つのタブレットを最初に添加し、さらに５つのタブレットを３日目に添加した。さまざまな量のＥｎｚｙｍｅ Ａ溶液（５０〜１５０μＬ／日）を毎日添加した。
５．好気性、仮想の流加バッチプロセス、繰り返しグルコース精製スパイキング
１つのタブレットを最初に添加し、２つのタブレットを１日と２日に添加して、３つのタブレットを３日と４日に添加した。さまざまな量のＥｎｚｙｍｅ Ａ溶液（５０〜１５０μＬ／日）を毎日添加した。
６．好気性、バッチプロセス、繰り返しガラクトーススパイキング
初期ガラクトースは、２０ｇ／Ｌであり、以後毎日４０ｇ／Ｌ添加した。

【0146】

仮想の流加バッチプロセスに対して、各錠剤は、０．５ｇのグルコース（２５ｍＬの培養体積に対して２０ｇ／Ｌのグルコースに対応さ）を放出すると考えられる。精製は、必須的にグルコース（すなわち、澱粉）、およびＥｎｚｙｍｅ Ａ溶液（アミラーゼ）で構成されており、シェイクフラスコ培養中に培地にグルコースが調節されてゆっくり放出されるようにする。グルコースが制限され流加バッチ条件によって成長へのフラックスが促進され、これにより、３−ＨＰの生産が促進されると考えられる。

【0147】

［細胞の成長］
全ての一般的なグルコースベースの培養によって同様に培養され、ガラクトース流加培養によって、よりゆっくり培養される。一方、他の培養条件と比較して、流加培養条件によって細胞の成長がさらに促進される。特に、流加培養（精製スパイキング）の条件は、初期培養からの成長を大幅に向上させる。

【0148】

［３−ＨＰの生産］
これらの培養を介して、ほとんどの成長は、一般的に２日の後半に起こって、かなり多くの３−ＨＰはまた、２日目の生産されており、これは成長と３−ＨＰの生産は、互いに関連性があることを示唆している。流加培養（精製スパイキング）培養条件で３−ＨＰ（〜０．８５ｇ／Ｌ）が最も多く生産され、ガラクトース流加培養を介して最も少ない量の３−ＨＰ（〜０．１２ｇ／Ｌ）が生産されており、他の培養条件から全て約０．３乃至０．４ｇ／Ｌの３−ＨＰを生産した。これらの結果は、培養条件に３−ＨＰの生産レベルに大きな影響を与えることができる（図５）。

【0149】

［グルコース消費］
全ての培養から２〜３日までのグルコースが急速に消費され、以降、グルコース消費は成長および３−ＨＰの生産と大幅に減少した（４−５日目）。流加培養では、グルコースは精製から放出されるように急速に消費されるように見える、これは、これらの培養がグルコース制限条件下で行われたことを示す。

【0150】

［グリセロール、酢酸およびエタノール蓄積］
グルコース流加培養でグリセロール蓄積はかなり高く、ガラクトース流加培養よりもはるかに低い。酢酸の蓄積は、他の培養条件の間ではかなり似ているが、流加培養（多数の錠剤）の条件で、より多くの酢酸が生産された。

【0151】

これらのシェイクフラスコ培養、特にグルコース回分式培養とグルコーススパイキング培養ほとんどで高濃度のエタノールが蓄積された。流加培養は、グルコース制限された濃度を代表して、エタノールでの過量の過流量代謝物を減少させ、これらのアプローチは、エタノールの蓄積が流加培養ではかなり低いので成功したかのように見える。

【0152】

［さらに確立された３−ＨＰの生産菌株培養］
追加の３−ＨＰの生産菌株［（ＥｕｔＥｅｃ、ＨＰＤＨ−ＭＣＲｃａ、ＡＣＣ１ｓｃ＿Ｓ１１５７Ａ）と（ＨＩＢＡＤＨｐａ、ＭＣＲｓａ２）］を最も有望な流加培養（精製スパイキング）培養条件に応じて、培養して、性能を確認した。

【0153】

ほとんどの成長は３日目に起こり、ほとんどの３−ＨＰの生産も３日目に起こった。このような培養条件下では、これらの菌株から３−ＨＰの生産が１．２ｇ／Ｌを超えた（図６）。

【0154】

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]