特許 6787795 抗Ａｘｌ抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6787795

(24)【登録日】2020年11月2日

(45)【発行日】2020年11月18日

(54)【発明の名称】抗Ａｘｌ抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20201109BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20201109BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20201109BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20201109BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20201109BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20201109BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20201109BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20201109BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20201109BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20201109BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/13ZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12P21/08

   C07K16/30

   A61K39/395 N

   A61K45/00

   A61P35/04

   A61K39/395 P

【請求項の数】29

【全頁数】73

(21)【出願番号】特願2016-573833(P2016-573833)

(86)(22)【出願日】2015年6月18日

(65)【公表番号】特表2017-519501(P2017-519501A)

(43)【公表日】2017年7月20日

(86)【国際出願番号】EP2015063700

(87)【国際公開番号】WO2015193428

(87)【国際公開日】20151223

【審査請求日】2018年3月20日

(31)【優先権主張番号】1410826.0

(32)【優先日】2014年6月18日

(33)【優先権主張国】GB

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】514276920

【氏名又は名称】ベルゲンビオ アーエスアー

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(74)【代理人】

【識別番号】100091214

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 進介

(72)【発明者】

【氏名】ミクレム，ダーヴィド ロベルト

(72)【発明者】

【氏名】クプリヤノフ，セルゲイ

(72)【発明者】

【氏名】ニルソン，リン ホーデネランド

(72)【発明者】

【氏名】アハメド，ラヴィーナ

(72)【発明者】

【氏名】ホーゲン，ハルヴァルド

【審査官】 渡邉 潤也

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／１７５６９１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５３８５５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０１４４５７（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ａｘｌに結合する抗体であって、
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１と、配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２と、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨＣＤＲ３とを含むＶＨドメインと；及び
配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１と、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３とを含むＶＬドメインと；
を含む、抗体。

【請求項2】

１Ｈ１２ＶＨドメイン（配列番号３）を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

１Ｈ１２ＶＬドメイン（配列番号４）を含む、請求項２に記載の抗体。

【請求項4】

ｓｃＦｖ抗体分子を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項5】

抗体定常領域又は全抗体を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項6】

当該抗体がＦｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ミニボディ、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、タンデムｓｃＦｖ、ＴａｎｄＡｂ、バイボディ、トリボディ、κ（λ）ボディ、ＢｉＴＥ、ＤＶＤ−ｌｇ、ＳＩＰ、ＳＭＩＰ、又はＤＡＲＴなどの抗原結合抗体断片である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項7】

抗原に結合する能力に加えて、別の機能特性をもたらす追加アミノ酸を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項8】

５×１０^−１１Ｍ以下のＫ_ＤでＡｘｌに結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項9】

１．５×１０^−１１Ｍ以下のＫ_ＤでＡｘｌに結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項10】

２×１０^−５ｓ^−１以下のＫ_ｏｆｆでＡｘｌに結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項11】

３×１０^−６ｓ^−１以下のＫ_ｏｆｆでＡｘｌに結合する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項12】

前記ＡｘｌがヒトＡｘｌ又は霊長類Ａｘｌである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項13】

請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体であって、
（ｉ）１０^−３Ｍを超えるＫ_ＤでマウスＡｘｌに結合し；
（ｉｉ）１０^−３Ｍを超えるＫ_ＤでヒトＭｅｒに結合し；及び／又は
（ｉｉｉ）１０^−３Ｍを超えるＫ_ＤでヒトＴｙｒｏ３に結合する、抗体。

【請求項14】

当該抗体がＡｘｌアゴニストであり、且つ、Ａｘｌシグナル伝達が少なくとも１０％高い、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項15】

当該抗体がキメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項16】

当該抗体は、
（ｉ）１Ｈ１２抗体と同じエピトープ、又は
（ｉｉ）前記１Ｈ１２抗体により結合される前記エピトープとオーバーラップするエピトープ
に結合する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項17】

当該抗体が細胞表面に存在するＡｘｌと結合した後に内在化される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項18】

検出可能な標識、酵素、又は毒素に、任意選択でペプチジル結合又はリンカーを介して結合される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項19】

前記毒素が、ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦを含む群から選択される、請求項１８に記載の抗体。

【請求項20】

前記検出可能な標識がＦＩＴＣである、請求項１８に記載の抗体。

【請求項21】

請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体の抗体ＶＨ若しくはＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。

【請求項22】

請求項２１に記載の核酸で形質転換された宿主細胞。

【請求項23】

抗体又は抗体ＶＨ若しくはＶＬドメインを生成する方法であって、前記抗体又は抗体ＶＨ若しくはＶＬドメインの生成のための条件下で、請求項２２に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、方法。

【請求項24】

前記抗体又は抗体ＶＨ若しくはＶＬ可変ドメインを単離するステップ及び／又は精製するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

少なくとも１つの追加成分を含む組成物に、前記抗体又は抗体ＶＨ若しくはＶＬ可変ドメインを製剤化するステップをさらに含む、請求項２３又は２４に記載の方法。

【請求項26】

請求項１〜２５のいずれか一項に記載のＡｘｌに結合する抗体を、Ａｘｌ又はＡｘｌの断片に結合させるステップを含み、前記結合がｉｎ ｖｉｔｒｏで起こる、方法。

【請求項27】

Ａｘｌ又はＡｘｌの断片に対する抗体の結合の量を測定するステップを含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

Ａｘｌの過剰発現を特徴とする疾患又は障害の検出のための診断薬の製造における、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体と、転移性癌細胞に対する前記抗体の結合の測定を可能にする１種又は複数種の試薬との使用。

【請求項29】

請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体と、転移性癌細胞に対する前記抗体の結合の測定を可能にする１種又は複数種の試薬とを含む、診断キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、Ａｘｌタンパク質に特異的に結合する抗体に関する。さらに、抗Ａｘｌ抗体の生成及び使用のための方法も開示される。

【背景技術】

【0002】

Ａｘｌは、ビタミンＫ依存性リガンドＧａｓ６（成長停止特異的６）を共有するＴＡＭ（チロ３−Ａｘｌ−Ｍｅｒ）受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のメンバーである。ＴＡＭファミリーＲＴＫは、細胞の生存、増殖、オートファジー、移動、血管新生、血小板凝集、及びナチュラルキラー細胞分化を含む多様な細胞応答を調節する。Ａｘｌは、多くの胚組織に発現され、間葉及び神経の発達に関与すると考えられており、成体の組織における発現は、主として平滑筋細胞に限定される（ＭＧＩ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ；ｗｗｗ．ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｊａｘ．ｏｒｇ）。Ａｘｌ活性は、Ａｋｔ、ＭＡＰキナーゼ、ＮＦ−κＢ、ＳＴＡＴなどを含むいくつかのシグナル伝達経路と関連している。Ａｘｌは初め、慢性骨髄性白血病の親からの形質転換遺伝子として同定され、その後、悪性度の高い癌と関連付けられ、さらには不良な予後との相関が明らかにされた。

【0003】

Ａｘｌ受容体過剰発現は、多種多様な固形腫瘍及び骨髄性白血病に検出されている（Ｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１００：３５，２００８；Ｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ．１４：１０７３，２０１０）。

【0004】

Ａｘｌ発現は、悪性腫瘍の進行と相関し、膵臓（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ．１１７：７３４，２０１１）、前立腺（Ｐａｃｃｅｚ ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．３２：６９８，２０１３）、肺（Ｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ．２０１２；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．４４：８５２，２０１２）、乳房（Ｇｊｅｒｄｒｕｍ，Ｐｒｏｃ ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７：１１２４，２０１０）、結腸癌（Ｙｕｅｎ ｅｔ ａｌ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，８：ｅ５４２１１，２０１３）及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（Ｂｅｎ−Ｂａｔａｌｌａ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ １２２：２４４３，２０１３）を含む複数の悪性腫瘍における患者の全生存不良の独立した予測因子である。

【0005】

Ａｘｌシグナル伝達は、腫瘍関連マクロファージ（Ｌｏｇｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．１１５：２２６４，２０１０）又はオートクリン機構（Ｇｊｅｒｄｒｕｍ，Ｐｒｏｃ ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７：１１２４，２０１０）によって分泌されるタンパク質リガンド（Ｇａｓ６）により活性化され、これが、受容体二量体化、自己リン酸化及び下流シグナル伝達、例えば、ＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−ＡＫＴ、特にＡＫＴ及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を介したものなどを駆動する（Ｋｏｒｓｈｕｎｏｖ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．１２２：３６１，２０１２）。他のチロシンキナーゼ受容体、例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）とのヘテロ二量体化も起こることが報告されている（Ｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ．１４：１０７３，２０１０；Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ６：ｒａ６６，２０１３）。

【0006】

腫瘍細胞におけるＡｘｌの異常な活性化は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの標的治療薬に対する薬物耐性獲得と広範囲に関連している（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．４４：８５２，２０１２；Ｂｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９：２７９，２０１３）。Ａｘｌターゲティング薬剤は、トリプルネガティブ乳癌、ホルモン耐性前立腺癌及び肺の腺癌を含む複数の実験癌モデルにおいて、ＥＭＴ／ＣＳＣ特性を逆転することにより、腫瘍形成、転移を阻止し、薬物耐性（例えば、エルロチニブに対する）を逆転する（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７０：１５４４，２０１０；Ｇｊｅｒｄｒｕｍ，Ｐｒｏｃ ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７：１１２４，２０１０；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．４４：８５２，２０１２；Ｐａｃｃｅｚ ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．３２：６９８，２０１３）。

【0007】

Ａｘｌ及び抗Ａｘｌ抗体に関する他の出願として、以下のものが挙げられる：欧州特許出願公開第２２６７４５４Ａ２号明細書［Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ．．．Ａｘｌ − Ｍａｘ Ｐｌａｎｃｋ］；国際公開第２００９０６３９６５号パンフレット［ａｎｔｉ Ａｘｌ − Ｃｈｕｇａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ］；国際公開第２０１１１５９９８０Ａ１号パンフレット［ａｎｔｉ−Ａｘｌ − Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ］、国際公開第２０１１０１４４５７Ａ１号パンフレット［ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ Ａｘｌ ａｎｄ ＶＥＧＦ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ − Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ］；国際公開第２０１２−１７５６９１Ａ１号パンフレット［Ａｎｔｉ Ａｘｌ ２０Ｇ７−Ｄ９ − ＩＮＳＥＲＭ］、国際公開第２０１２−１７５６９２Ａ１号パンフレット［Ａｎｔｉ Ａｘｌ ３Ｅ３Ｅ８ − ＩＮＳＥＲＭ］；国際公開第２００９／０６２６９０Ａ１号パンフレット［ａｎｔｉ Ａｘｌ − Ｕ３ Ｐｈａｒｍａ］及び国際公開第２０１０／１３０７５１Ａ１号パンフレット［ｈｕｍａｎｉｓｅｄ ａｎｔｉ Ａｘｌ − Ｕ３ Ｐｈａｒｍａ］。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

腫瘍発生におけるＡｘｌの役割を考慮すると、Ａｘｌに特異的に結合する、有利な特性を備えたさらなる抗体を特定することが望ましい。本開示は、こうした抗体に関する。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】フローサイトメトリーによる、Ａｘｌ^＋トリプルネガティブ乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）１Ｈ１２の結合である。ＭＡｂ１Ｈ１２をＡｌｅｘａ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と結合させた後、ノックダウンＡｘｌ発現を有するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞又は対照ｓｈＲＮＡでトランスフェクトした細胞のいずれかと一緒にインキュベートした。Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、細胞染色を測定した。幾何平均蛍光強度の値を用いて、ノックダウンレベルを測定した。

【図2】ＭＡｂ１Ｈ１２と組換えヒト（ｒｈ）Ａｘｌ、ｒｈＭｅｒ及びｒｈＴｙｒｏ３との相互作用を示す結合分析からのセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）のオーバーレイプロットである。ブランク表面シグナルを差し引いた後の曲線を示す。

【図3】ｒｈＡｘｌ、ｒｍＡｘｌ及びｒｈＴｙｒｏ３−ＦｃをコーティングしたセンサーチップＣＭ５と相互作用するリガンド（ＭＡｂ１Ｈ１２及びｒｍＧａｓ６）のＢｉａｃｏｒｅ分析である。ブランク表面シグナルを差し引いた後の曲線を示す。

【図4】Ｂｉａｃｏｒｅセンサーチップの表面に固定化したｒｈＡｘｌと相互作用するＭＡｂ１Ｈ１２の速度論的分析である。様々な濃度（１．３〜６６６．７ｎＭ）のＭＡｂ１Ｈ１２についてのセンサーグラムのオーバーレイプロットである。正確な速度論的分析は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア及びモデル「物質移動を伴う１：１結合」に従う曲線当てはめを用いて実施した。親和定数（運動及び定常状態）並びに２５℃での抗体結合の半減期計算値を差し込み表に示す。

【図5】Ｂｉａｃｏｒｅ３０００を用いたＭＡｂ１Ｈ１２（第１サンプル）と、抗ＡｘｌＭＡｂ１Ｈ１２、ＭＡｂ１〜３、ｒｈＧａｓ６及びｒｍＧａｓ６（第２サンプル）との競合の分析である。異なる第２サンプルを用いたセンサーグラムのオーバーレイプロットである。第１サンプル（１Ｈ１２）及び第２サンプルの注射の開始点を矢印で示す。

【図6】還元及び非還元条件下での組換えヒト（ｒｈ）Ｍｅｒ−Ｆｃ及びＡｘｌ−Ｆｃ抗原に対する抗Ａｘｌ ＭＡｂ１Ｈ１２結合のウェスタンブロット分析である。レーン：Ｍ、分子量マーカ（Ｍａｇｉｃ Ｍａｒｋ）、ｋＤａのＭＷ値を左側に示す；１、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃ、非還元；２、ｒｈＭｅｒ−Ｆｃ、非還元；３、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃ、還元；４、ｒｈＭｅｒ−Ｆｃ、還元。ｒｈＡｘｌ−Ｆｃに対応するタンパク質バンドを矢印で示す。

【図7】還元及び非還元条件下でのＡｘｌ＋及びＡｘｌ−細胞の溶解物に対する抗Ａｘｌ ＭＡｂ１Ｈ１２結合のウェスタンブロット分析である。レーン：Ｍ、分子量マーカ（Ｍａｇｉｃ Ｍａｒｋ）、ｋＤａのＭＷ値を左側に示す；１、Ａｘｌ−ＬＮＣａＰ細胞の溶解物（前立腺腺癌）、還元；２、Ａｘｌ＋ＮＣｌ−Ｈ１２９９の溶解物（非小細胞肺癌）、還元；３、Ａｘｌ＋ＮＣｌ−Ｈ１２９９の溶解物、非還元。Ａｘｌ受容体に対応するタンパク質バンドを矢印で示す。

【図8】抗Ａｘｌモノクローナル抗体１Ｈ１２由来のＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列である。

【図9】Ａｘｌ陽性細胞に対する抗Ａｘｌマウス抗体１Ｈ１２及びそのキメラ（マウス可変／ヒト定常）対応物の用量依存性結合である。様々な濃度のマウス（ｍ１Ｈ１２）及びキメラ（ｃｈ１Ｈ１２）抗体を、フローサイトメトリーにより、トリプルネガティブ乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する結合について試験した。結合したマウス及びキメラ抗体は、それぞれマウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、１：５００希釈、又はヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、１：３００希釈（いずれも、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）のいずれかに対して特異的なＡＰＣ結合ロバＦ（ａｂ’）_２断片を用いて検出した。Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、細胞染色を測定した。ＭＦＩ、幾何平均蛍光強度。

【図10】Ｂｉａｃｏｒｅセンサーチップの表面に固定化したｒｈＡｘｌと相互作用するキメラＭＡｂｃｈ１Ｈ１２の速度論的分析である。様々な濃度（１．３〜６６６．７ｎＭ）のＭＡｂｃｈ１Ｈ１２についてのセンサーグラムのオーバーレイプロットである。正確な速度論的分析は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア及び１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに従う曲線当てはめを用いて実施した。親和定数（運動及び定常状態）並びに２５℃での抗体結合の半減期計算値を差し込み表に示す。

【図11】ヒト−Ａｘｌ−Ｆｃ、ｃｙｎｏ−Ａｘｌ−Ｆｃ及びｒｈｅｓｕｓ−Ａｘｌ−Ｆｃをコーティングしたセンサーチップと相互作用するマウス抗体１Ｈ１２のＢｉａｃｏｒｅ分析である。

【図12】抗体−サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）コンジュゲートを用いた腫瘍細胞の殺傷である。非結合サポリン及びサポリン（対照サポリン）に結合したアイソタイプ対照抗体（ヒトＩｇＧ１）を陰性対照として用いた。５０％の細胞殺傷を達成する有効濃度（ＥＣ_５０、ｐＭ）を差し込み表に示す。

【図13】二次抗マウス抗体と架橋した１Ｈ１２抗体のアゴニスト活性を例証するウェスタンブロット分析である。Ｓｅｒ^４７３でのＡｋｔのリン酸化をＡｘｌ活性の代用読み出しとして使用した。レーン：１、分子量マーカ；２、陽性対照（前立腺腺癌由来のＬＮＣａＰ細胞の溶解物）；３、飢餓後のヒーラ（ＨｅＬａ）細胞の溶解物；４、架橋１Ｈ１２で処理した飢餓後のヒーラ細胞。全細胞溶解物のイムノブロットを抗ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ^４７３）でプローブした。

【図14】二次抗マウス抗体と架橋した１Ｈ１２抗体の用量依存的アゴニスト活性を例証するウェスタンブロット分析である。Ｓｅｒ^４７３でのＡｋｔのリン酸化をＡｘｌ活性の代用読み出しとして使用した。レーン：１、分子量マーカ；２、陽性対照（前立腺腺癌由来のＬＮＣａＰ細胞の溶解物）；３、飢餓後のヒーラ細胞の溶解物；４〜７、様々な用量（それぞれ、０．２、０．６、２．０及び６．０μｇ／ｍｌ）の架橋１Ｈ１２で処理した飢餓後のヒーラ細胞。全細胞溶解物のイムノブロットを抗ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ^４７３）でプローブした。

【図15】１Ｈ１２抗体単独のアゴニスト活性を例証するウェスタンブロット分析である。Ｓｅｒ^４７３でのＡｋｔのリン酸化をＡｘｌ活性の代用読み出しとして使用した。レーン：１、分子量マーカ；２、陽性対照（前立腺腺癌由来のＬＮＣａＰ細胞の溶解物）；３、飢餓後ヒーラ細胞の溶解物；４、さらにＡｘｌ−Ｆｃで処理した飢餓後のヒーラ細胞の溶解物；５、架橋１Ｈ１２で処理した飢餓後のヒーラ細胞；６、架橋１Ｈ１２のみで処理した飢餓後のヒーラ細胞。全細胞溶解物のイムノブロットを抗ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ^４７３）でプローブした。

【図16】Ｂｉａｃｏｒｅ３０００を用いた、第１サンプルとしてのＭＡｂ１Ｈ１２と、第２サンプルとしての抗ＡｘｌＭＡＢ１５４又はｒｍＧａｓ６のいずれかとの競合の分析である。異なる第２サンプルを用いたセンサーグラムのオーバーレイプロットである。第１サンプル（１Ｈ１２）及び第２サンプルの開始点を矢印で示す。

【図17】ＭＡｂ１Ｈ１２、市販の抗体ポリクローナルＡＦ１５４、及びモノクローナルＭＡＢ１５４を用いた、Ａｘｌ＋及びＡｘｌ−（Ａ）細胞の比較ＩＨＣ染色である。野生型（ｗｔ）及びＡｘｌノックダウンＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をそれぞれＡｘｌ＋及びＡｘｌ−細胞として用いた。（Ｂ）ＭＡｂ１Ｈ１２又はポリクローナルＡＦ１５４のいずれか及びモノクローナルＭＡＢ１５４を用いて展開したＡｘｌ＋及びＡｘｌ−細胞溶解物（野生型及びＡｘｌノックダウンＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）の比較ウェスタンブロット分析である。ローディング対照として、ＧＡＰＤＨ検出を全てのブロットに示す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下の配列を本明細書に開示する（完全な配列については、以下の「配列」セクションを参照されたい）。
配列番号１→１Ｈ１２ＶＨコードヌクレオチド配列
配列番号２→１Ｈ１２ＶＬコードヌクレオチド配列
配列番号３→１Ｈ１２ＶＨコードアミノ酸配列
配列番号４→１Ｈ１２ＶＬコードアミノ酸配列
配列番号５→１Ｈ１２ＶＨＣＤＲ１コードアミノ酸配列
配列番号６→１Ｈ１２ＶＨＣＤＲ２コードアミノ酸配列
配列番号７→１Ｈ１２ＶＨＣＤＲ３コードアミノ酸配列
配列番号８→１Ｈ１２ＶＬＣＤＲ１コードアミノ酸配列
配列番号９→１Ｈ１２ＶＬＣＤＲ２コードアミノ酸配列
配列番号１０→１Ｈ１２ＶＬＣＤＲ３コードアミノ酸配列
配列番号１１→１Ｈ１２ＶＨＦＲ１コードアミノ酸配列
配列番号１２→１Ｈ１２ＶＨＦＲ２コードアミノ酸配列
配列番号１３→１Ｈ１２ＶＨＦＲ３コードアミノ酸配列
配列番号１４→１Ｈ１２ＶＨＦＲ４コードアミノ酸配列
配列番号１５→１Ｈ１２ＶＬＦＲ１コードアミノ酸配列
配列番号１６→１Ｈ１２ＶＬＦＲ２コードアミノ酸配列
配列番号１７→１Ｈ１２ＶＬＦＲ３コードアミノ酸配列
配列番号１８→１Ｈ１２ＶＬＦＲ４コードアミノ酸配列
配列番号１９→ヒトＡｘｌコードアミノ酸配列
配列番号２０→マウスＡｘｌコードアミノ酸配列
配列番号２１→ヒトＴｙｒｏ３コードアミノ酸配列
配列番号２２→ヒトＭｅｒコードアミノ酸配列

【0011】

一態様では、本発明は、Ａｘｌに結合し、且つ１Ｈ１２ＶＨドメイン（配列番号３）及び／又は１Ｈ１２ＶＬドメイン（配列番号４）を含む、単離された抗体を提供する。結合Ａｘｌは、ヒトＡｘｌであるのが好ましい。

【0012】

一般に、ＶＨドメインは、ＶＨドメインと対形成して、抗体抗原結合部位をもたらすが、以下にさらに詳しく論じるように、抗原に結合させるために、ＶＨドメインを単独で用いてもよい。一実施形態では、１Ｈ１２ＶＨドメイン（配列番号３）は、１Ｈ１２ＶＬドメイン（配列番号４）と対形成して、これにより、１Ｈ１２ＶＨドメインとＶＬドメインとの両方を含む抗体抗原結合部位が形成される。他の実施形態では、１Ｈ１２ＶＨは、１Ｈ１２ＶＬ以外のＶＬドメインと対形成する。当技術分野において、軽鎖乱交雑は十分に確立されている。

【0013】

１つ又は複数のＣＤＲを１Ｈ１２ＶＨ又はＶＬドメインから取得して、好適なフレームワーク中に組み込んでもよい。これについては以下に詳しく説明する。１Ｈ１２ＶＨＣＤＲ１、２及び３は、それぞれ配列番号５、６及び７に示される。１Ｈ１２ＶＬＣＤＲ１、２及び３は、それぞれ配列番号８、９及び１０に示される。

【0014】

本発明の一態様では、Ａｘｌに結合する抗体が提供され、これは、
１Ｈ１２ＶＨドメイン（配列番号３）と、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨＣＤＲ３、及び任意選択で配列番号６及び配列番号５から選択されるアミノ酸配列を有する１つ又は複数のＶＨＣＤＲを含むＶＨドメインとからなる群から選択される抗体ＶＨドメイン；及び／又は
１Ｈ１２ＶＬドメイン（配列番号４）と、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有する１つ又は複数のＶＬＣＤＲを含むＶＬドメインとからなる群から選択される抗体ＶＬドメイン;
を含む。

【0015】

例えば、抗体は、配列番号５、配列番号６及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨＣＤＲを含む抗体ＶＨドメインを含んでよい。抗体はさらに、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬＣＤＲを含む抗体ＶＬドメインを含んでもよい。

【0016】

一部の実施形態では、抗体は、（ｉ）配列番号５、配列番号６及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨＣＤＲを含む抗体ＶＨドメインと、（ｉｉ）配列番号８、配列番号９及び配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬＣＤＲを含む抗体ＶＬドメインとを含む。

【0017】

抗体は、１Ｈ１２ＶＨドメイン（配列番号３）を含んでもよく、また、任意選択で、１Ｈ１２ＶＬドメイン（配列番号４）をさらに含んでもよい。

【0018】

好ましくは、抗体は、ヒトＡｘｌに対する結合について、１Ｈ１２ＶＨドメイン（配列番号３）及び１Ｈ１２ＶＬドメイン（配列番号４）を含む抗体のＡｘｌ結合ドメインと競合する。

【0019】

本発明のさらに別の態様によれば、配列が本明細書に記載されるＶＨ及びＶＬドメインの変異体が提供され、これは、Ａｘｌについて抗体に使用することができ、配列改変又は突然変異及びスクリーニングの方法を用いて得ることができる。このような方法も本発明によって提供される。

【0020】

論述するように、その配列が本明細書で具体的に開示される、ＶＨ及びＶＬドメインのいずれの可変ドメインアミノ酸配列変異体を本発明に従って使用してもよい。特定の変異体は、１つ又は複数のアミノ酸配列改変（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）を含んでもよく、約２０未満の改変、約１５未満の改変、約１０未満の改変又は約５未満、４、３、２若しくは１の改変であってよい。改変は、１つ又は複数のフレームワーク領域及び／又は１つ又は複数のＣＤＲに実施してもよい。

【0021】

本発明の抗体は、抗原に結合すると共に、本明細書に開示する抗体ＶＨ及び／若しくはＶＬドメイン、又は本明細書に開示するＶＨＣＤＲ３、又はこれらのいずれかの変異体を含む任意の抗体と、上記抗原に対する結合について競合するものであってもよい。すなわち、一部の実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に開示する抗体ＶＨ及び／若しくはＶＬドメイン、又は本明細書に開示するＶＨＣＤＲ３、又はこれらのいずれかの変異体を含む抗体と同じエピトープ又はオーバーラップエピトープに結合する抗体である。抗体同士の競合は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００装置（例えば、実施例１５及び図１６を参照）による結合分析を用いたＥＬＩＳＡを用いて、及び／又は同じエピトープ若しくはオーバーラップエピトープに結合する抗体の同定を可能にするために、別の非タグ付け抗体の存在下で検出することができる１抗体に特定のリポータ分子をタグ付けすることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで容易にアッセイすることができる。

【0022】

従って、本発明は、本明細書に具体的に開示するいずれかの変異体を含み、ここで、この変異体は、１つ若しくは複数のフレームワーク領域及び／又は１つ若しくは複数のＣＤＲに１つ又は複数のアミノ酸配列改変を含む。例えば、変異型抗体は、いずれか１つのＣＤＲに４つ以下の配列改変、例えば、いずれか１つのＣＤＲ（例えば、ＶＨドメインのＣＤＲ３）に３つ以下、２つ以下、１つ以下の配列改変含んでもよく、又は配列改変を一切含まなくてもよい。変異型抗体は、Ａｘｌ（例えば、ヒトＡｘｌ）に対する結合について、１Ｈ１２ＶＨドメイン（配列番号３）及び１Ｈ１２ＶＬドメイン（配列番号４）を含む抗体のＡｘｌ結合ドメインと競合し得る。

【0023】

従って、本発明の別の態様は、ヒトＡｘｌとの結合について１Ｈ１２と競合するヒト抗体抗原結合部位を含む抗体を提供する。

【0024】

Ａｘｌに対する抗体であり、且つＡｘｌとの結合について１Ｈ１２と競合し得る抗体を取得する様々な方法が当技術分野において入手可能である。

【0025】

別の態様では、本発明は、抗原に結合することができる１つ又は複数の抗体を取得する方法を提供し、この方法は、本発明の抗体のライブラリーと前記抗原を接触させるステップ、及び前記抗原に結合することができるライブラリーの１つ又は複数の抗体メンバーを選択するステップを含む。

【0026】

ライブラリーは、バクテリオファージ粒子の表面上に展示され得るが、各粒子は、その表面に展示される抗体ＶＨ可変ドメインを含有し、さらには任意選択で、存在する場合、展示されるＶＬドメインをコードする核酸も含有する。

【0027】

抗原に結合することができ、且つバクテリオファージ粒子上に展示される抗体の選択後、選択した抗体を展示するバクテリオファージ粒子から核酸を取り出すことができる。このような核酸は、続いて、前記選択抗体を展示するバクテリオファージ粒子から取得した核酸の配列を有する核酸からの発現による、抗体又は抗体ＶＨ可変ドメイン（任意選択で抗体ＶＬ可変ドメイン）の生成に使用することができる。

【0028】

前記選択抗体の抗体ＶＨ可変ドメインのアミノ酸配列を有する抗体ＶＨ可変ドメインは、こうしたＶＨドメインを含む抗体と同様に、単離された形態で提供することができる。

【0029】

Ａｘｌに結合する能力、さらにはＡｘｌとの結合について１Ｈ１２と競合する能力をさらに試験してもよい。

【0030】

本発明の抗体は、１Ｈ１２の親和性でＡｘｌに結合し得る。

【0031】

本発明の抗体は、マウス、ラット、サル、非ヒト霊長類(primate)及び／又はヒトＡｘｌに結合し得る。抗体は、ヒト及びサルＡｘｌに結合するのが好ましい。一部の実施形態では、抗体は、霊長類Ａｘｌに特異的に結合する。例えば、抗体は、ヒト及びサルＡｘｌに特異的に結合する。一実施形態では、抗体は、ヒトＡｘｌにのみ特異的に結合する。

【0032】

抗体は、キメラ、ヒト化、又はＣＤＲ移植抗Ａｘｌ抗体であってもよい。例えば、抗体は、キメラヒト／マウス抗体であってもよい。

【0033】

様々な抗体の結合親和性及び中和能力を適切な条件下で比較することができる。

【0034】

抗体配列に加えて、本発明の抗体は、例えば、折り畳まれたドメインなどのペプチド若しくはポリペプチドを形成する他のアミノ酸、又は抗原に結合する能力以外の別の機能特性を分子に付与する他のアミノ酸を含んでもよい。

【0035】

本発明の抗体は、検出可能な標識を担持してもよく、又は毒素（細胞毒など）、酵素、若しくは有機部分（例えば、ペプチジル結合若しくリンカー）に結合させてもよい。

【0036】

当業者は、分子をタンパク質に化学的に結合させる多数の手法を認識している。本発明の一実施形態では、抗体は、検出可能な蛍光標識、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのリポータ酵素に結合させることができる。

【0037】

好ましい実施形態では、抗体は、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）の形成によって、細胞傷害性薬物と結合させる。抗体が、製剤用途である場合、抗体と薬物を連結する結合は、循環（例えば、血液循環）中で安定しているが、上記複合体が細胞内に隔離されると不安定になるのが好ましい。従って、免疫複合体として結合された抗体は、例えば、癌の治療方法に使用することができる。

【0038】

別の態様では、本発明は、本発明の抗体、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインをコードする配列を含む単離された核酸、並びに本発明の抗体、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを調製する方法を提供し、この方法は、前記抗体、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインの生成をもたらす条件下で前記核酸を発現させるステップと、それを回収するステップとを含む。

【0039】

本発明の抗体は、ヒト若しくは動物身体の治療又は診断方法、例えば、ヒト患者の疾患若しくは障害の治療（予防的処置を含み得る）の方法に用いてもよく、この方法は、有効量の本発明の抗体若しくはその複合体、又は薬物−複合体を前記患者に投与するステップを含む。本発明に従って治療が可能な状態には、本明細書の別の箇所で論じるものが含まれる。

【0040】

本発明の抗体は、例えば、抗体が結合する細胞の存在又は位置を決定するために、イメージング方法に用いることもできる。

【0041】

別の態様では、本発明は、本発明の抗体と、抗原に対する抗体の結合を測定する１種又は複数種の試薬とを含む、診断キットを提供する。

【0042】

本発明のさらに別の態様は、本明細書に開示する抗体ＶＨ可変ドメイン（配列番号３）及び／又はＶＬ可変ドメイン（配列番号４）をコードする、概して単離された核酸を提供する。一部の実施形態では、ＶＨコード核酸は、配列番号１に記載の配列を有する。一部の実施形態では、ＶＬコード核酸は、配列番号２に記載の配列を有する。

【0043】

本発明の別の態様は、本明細書に開示するＶＨＣＤＲ又はＶＬＣＤＲ配列、特に、配列番号５、６、及び７から選択されるＶＨＣＤＲ、又は配列番号８、９、若しくは１０から選択されるＶＬＣＤＲ、最も好ましくは、１Ｈ１２ＣＤＲ３（配列番号７）をコードする、概して単離された核酸を提供する。

【0044】

さらに別の態様は、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞を提供する。

【0045】

さらにまた別の態様は、抗体ＶＨ可変ドメインの生成方法を提供し、この方法は、コード核酸から発現を引き起こすステップを含む。このような方法は、前記抗体ＶＨ可変ドメインの生成のための条件下で宿主細胞を培養するステップを含み得る。

【0046】

ＶＬ可変ドメイン並びにＶＨ及び／又はＶＬドメインを含む抗体を生成する類似の方法が、本発明の別の態様として提供される。

【0047】

生成方法は、生成物の単離及び／又は精製のステップを含み得る。

【0048】

生成方法は、薬学的に許容される賦形剤などの少なくとも１つの別の成分を含む組成物に、生成物を配合するステップを含み得る。

【0049】

本発明の上記及びその他の態様は、以下にさらに詳しく記載する。

【0050】

抗体特性
Ａｘｌに対する高い親和性
本明細書に記載する１Ｈ１２抗体は、高い親和性でヒトＡｘｌに結合する。実施例４に記載するように、１Ｈ１２抗体は、４．９８×１０^−１１ＭのＫ_Ｄを有することが判明した。これは、抗Ａｘｌ抗体について記載される依然として最も低いＫ_Ｄである。

【0051】

意外なことに、キメラＭＡｂｃｈ１Ｈ１２（実施例１１及び図１０を参照）は、Ｋ_Ｄ＝１．１０×１０^−１１Ｍというさらに高い親和性を有し；この数値は、親マウス抗体より４．５倍低く、これは、恐らく、ヒトの定常ドメインスカフォールド上にマウントした場合に、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインのより優れた配向によるものであろう。

【0052】

従って、本明細書に記載する抗体は、高い親和性でＡｘｌに結合し；好ましくは、高い親和性でヒトＡｘｌに結合する。一部の実施形態では、抗体は、１０^−６Ｍ以下、例えば、５×１０^−７Ｍ以下、１０^−７Ｍ以下、５×１０^−８Ｍ以下、１０^−８Ｍ以下、５×１０^−９Ｍ以下、１０^−９Ｍ以下、５×１０^−１０Ｍ以下、１０^−１０Ｍ以下、５×１０^−１１Ｍ以下、１．５×１０^−１１Ｍ以下、１０^−１１Ｍ以下、５×１０^−１２Ｍ以下、１０^−１２Ｍ以下、５×１０^−１３Ｍ以下、１０^−１３Ｍ以下、５×１０^−１４Ｍ以下、１０^−１４Ｍ以下、５×１０^−１５Ｍ以下、１０^−１５Ｍ以下のＫ_ＤでＡｘｌ（又はヒトＡｘｌ）に結合する。

【0053】

一部の実施形態では、抗体は、１０^−８Ｍ〜１０^−１０Ｍ、１０^−１０Ｍ〜１０^−１２Ｍ、１０^−１２Ｍ〜１０^−１４Ｍ、又は１０^−１４Ｍ〜１０^−１６ＭのＫ_ＤでＡｘｌ（又はヒトＡｘｌ）に結合する。

【0054】

Ｋ_Ｄは、実施例４に記載のように決定及び計算することができる。

【0055】

本明細書に記載の１Ｈ１２抗体は、非常に低い解離速度(dissociation rate)（ｋ_ｏｆｆ）を有することを特徴とする。特に、実施例４では、１Ｈ１２抗体は、非常に低い解離速度を有することが判明した（ｋ_ｏｆｆ＝１．０７×１０^−５ｓ^−１）。

【0056】

意外なことに、キメラＭＡｂｃｈ１Ｈ１２（実施例１１及び図１０を参照）は、ｋ_ｏｆｆ＝２．９９×１０^−６ｓ^−１）というさらに低い解離速度を有し、これによって、６４．４時間というｃｈ１Ｈ１２／Ａｘｌ複合体の半減期が得られた。

【0057】

従って、本明細書に記載する抗体は、低い解離速度でヒトＡｘｌに結合するのが好ましい。一部の実施形態では、抗体は、１０^−３ｓ^−１以下、例えば、５×１０^−４ｓ^−１以下、１０^−４ｓ^−１以下、５×１０^−５ｓ^−１以下、２×１０^−５ｓ^−１以下、１０^−５ｓ^−１以下、３×１０^−６ｓ^−１以下、５×１０^−６ｓ^−１以下、１０^−６ｓ^−１以下、５×１０^−７ｓ^−１以下、１０^−７ｓ^−１以下、５×１０^−８ｓ^−１以下、１０^−８ｓ^−１以下のｋ_ｏｆｆでＡｘｌ（又はヒトＡｘｌ）に結合する。

【0058】

特異的結合
一般に、「特異的」及び「特異的に結合する」という用語は、抗体が、その特定の結合パートナー以外の分子と有意な結合を何ら示さない状況を指すのに用いられ得る。例えば、ヒトＡｘｌに「特異的に結合する」抗体は、マウスＡｘｌに対する任意の有意な結合を何ら示さない。

【0059】

この用語はまた、例えば、抗体が、いくつかの抗原が担持する特定のエピトープに対して特異的である場合にも適用可能であり、この場合、エピトープに「特異的に結合する」抗体は、認識されるエピトープを担持する様々な抗原の全てに結合することができる。

【0060】

典型的に、特異性は、１群の抗原を使用するＥＬＩＳＡなどの結合アッセイを用いて決定することができる。

【0061】

本明細書に記載の１Ｈ１２抗体は、高い特異性でヒトＡｘｌに結合する。これは、実施例において立証され、ここで、以下のことが明らかにされる：
（１）実施例２において、１Ｈ１２は、ヒトＴＡＭ受容体チロシンキナーゼファミリーの他のメンバーである、ｈＭｅｒ及びｈＴｙｒｏ３由来の組換え抗原に対して有意な結合を示さない。
（２）実施例３では、１Ｈ１２は、ヒトＡｘｌに強力に結合するが、マウスＡｘｌに対する結合は全く示さない（これは、マウス及びヒトＡｘｌに強力に結合すると共に、（これより弱く）ヒトＴｙｒｏ３に結合する、マウスＡｘｌリガンド、マウスＧａｓ６とは対照的である）。
（３）実施例９では、１Ｈ１２は、試験組織サンプルの圧倒的多数に対して全く、又はほとんど結合を示さない。

【0062】

従って、本明細書に記載する抗体は、霊長類Ａｘｌに特異的に結合するのが好ましい。一部の実施形態では、本明細書に記載する抗体は、ヒト及びサルＡｘｌに特異的に結合する。一実施形態では、抗体は、ヒトＡｘｌにのみ特異的に結合する。

【0063】

本発明の一部の実施形態では、本明細書に記載する抗体は、ヒトＴｙｒｏ３及び／又はヒトＭｅｒに対して有意な結合を一切示さない。一部の実施形態では、本明細書に記載する抗体は、マウスＡｘｌに対して有意な結合を一切示さない。一部の実施形態では、本明細書に記載する抗体は、ヒトＴｙｒｏ３、ヒトＭｅｒ、又はマウスＡｘｌに対して有意な結合を一切示さない。

【0064】

抗体が、抗原に対して「有意な結合を一切示さない」か否かは、例えば、実施例２及び３に記載する技術を用いて、当業者により容易に決定することができる。一部の実施形態では、抗体は、それが、１０^−３Ｍを超える、例えば、１０^−２Ｍを超える、１０^−１Ｍを超える、又は１Ｍを超えるＫ_Ｄで抗原に結合する場合に、特定の抗原に対して「有意な結合を一切示さない」とみなされる。Ｋ_Ｄは、実施例４に記載するように決定及び計算することができる。

【0065】

一態様では、本発明の抗体は、１Ｈ１２抗体と同じエピトープ、又は１Ｈ１２抗体が結合するエピトープとオーバーラップするエピトープに結合する。異なる抗体同士の競合は、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて、及び／又は同じエピトープ若しくはオーバーラップエピトープに結合する抗体の識別ができるように、一方の結合メンバーに特定のリポータ分子をタグ付けする（これは、タグ付けしていない別の抗体（複数可）の存在下で検出することができる）ことによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで容易にアッセイすることができる。

【0066】

抗体の内在化
本明細書に記載する１Ｈ１２抗体は、その標的であるＡｘｌに結合すると、良好な細胞内在化を示す。内在化は、抗体が、サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）などの細胞毒素に結合すると観察される（例１３及び図１２を参照）。

【0067】

従って、本発明の抗体、又はそのコンジュゲートは、細胞表面に存在するＡｘｌに結合した後、内在化するのが好ましい。

【0068】

Ａｘｌ検出における有用性
本明細書に記載する抗体の予想外の優れた結合特性によって、これらの抗体は、Ａｘｌの検出を含む用途に特に有効となる。例えば、比較試験により、１Ｈ１２抗体は、免疫組織化学及びウェスタンブロッティング用途の両方で、市販の抗Ａｘｌ抗体より著しく強力なシグナルをＡＦ１５４及びＭＡＢ１５４に付与することが証明され（実施例１６及び図１７を参照）；競合分析は、１Ｈ１２及びＭＡＢ１５４が、同じエピトープ又はオーバーラップエピトープに結合することを示している（図１６参照）。こうしたＡｘｌ検出の強力なシグナル及び高い感受性によって、検出及び分析アッセイに大きい利点がもたらされる。

【0069】

Ａｘｌシグナル伝達のアゴニズム
本明細書に記載する１Ｈ１２抗体は、Ａｘｌに結合するとＡｘｌシグナル伝達を誘導することができる。これは、図１３〜１５と共に、実施例１４で立証され、ここで、１Ｈ１２結合は、Ｓｅｒ^４７３でのＡｘｌエフェクターＡｋｔのリン酸化の測定により決定すると、用量依存的に強力なＡｘｌシグナル伝達を誘導することがわかる。

【0070】

従って、一態様では、本明細書に記載する抗体は、Ａｘｌシグナル伝達を刺激する；すなわち、本明細書に記載する抗体は、Ａｘｌアゴニストであるのが好ましい。

【0071】

別の態様では、本発明は、本明細書に開示する抗体ＶＨ及び／若しくはＶＬドメイン、又は本明細書に開示するＶＨＣＤＲ３、又はこれらのいずれかの変異体を含む抗体と同じエピトープ若しくはオーバーラップエピトープに結合する抗体を提供し、ここで、抗体は、Ａｘｌアゴニストである。同じエピトープ又はオーバーラップエピトープとの結合は、本明細書に記載するように、完了試験によってｉｎ ｖｉｔｒｏで容易に決定することができる。

【0072】

一部の実施形態では、Ａｘｌシグナル伝達は、非Ａｘｌ結合対照抗体の存在下よりも本発明の抗体の存在下で少なくとも１０％大きく；例えば、非Ａｘｌ結合対照抗体の存在下よりも本発明の抗体の存在下で少なくとも１０％大きい、少なくとも２０％大きい、少なくとも３０％大きい、少なくとも４０％大きい、少なくとも５０％大きい、少なくとも６０％大きい、少なくとも７０％大きい、少なくとも８０％大きい、少なくとも９０％大きい、少なくとも１００％大きい、少なくとも２００％大きい、少なくとも５００％大きい又は少なくとも１０００％大きい。Ａｘｌシグナル伝達のレベルは、実施例１４に記載するように、Ｓｅｒ^４７３でのＡｘｌエフェクターＡｋｔのリン酸化の測定により決定することができる。

【0073】

Ａｘｌ発現及び／又は活性の下方制御
一部の実施形態では、抗Ａｘｌ抗体は、細胞表面（例えば、腫瘍細胞表面）上のＡｘｌ受容体発現の下方制御を誘導する。

【0074】

一部の実施形態では、細胞表面Ａｘｌ発現は、Ａｘｌ抗体処置の非存在下のＡｘｌ細胞表面発現の８０％未満に低減される。一部の実施形態では、細胞表面発現は、Ａｘｌ抗体処置の非存在下のＡｘｌ細胞表面発現の７０％未満、６０％未満、５０％未満又は４０％未満に低減される。

【0075】

一部の実施形態では、細胞（例えば、腫瘍細胞）における全Ａｘｌ発現は、Ａｘｌ抗体処置の非存在下の全Ａｘｌ発現の８０％未満に低減される。一部の実施形態では、Ａｘｌ発現は、Ａｘｌ抗体処置の非存在下の全Ａｘｌ発現の７０％未満、６０％未満、５０％未満又は４０％未満に低減される。一部の実施形態では、Ａｘｌ発現の下方制御は、急速に起こり、少なくとも２４時間にわたり持続する。

【0076】

一部の実施形態では、抗Ａｘｌ抗体は、構成的Ａｘｌ活性を阻害する。

【0077】

一部の実施形態では、抗Ａｘｌ抗体は、Ａｘｌ活性を阻害する。

【0078】

一部の実施形態では、抗Ａｘｌ抗体は、例えば、アポトーシスによる細胞死、例えば、Ａ５４９細胞などの腫瘍細胞の細胞死を促進し；これは、例えば、ＢｒｄＵ組み込みアッセイ、ＭＴＴ、［^３Ｈ］−チミジン組み込み（例えば、ＴｏｐＣｏｕｎｔアッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））、細胞生存性アッセイ（例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、ＤＮＡ断片化アッセイ、カスパーゼ活性化アッセイ、トリパンブルー色素排除、クロマチンモルフォロジーアッセイなどにより測定することができる。

【0079】

一部の実施形態では、抗Ａｘｌ抗体は、Ａｘｌ下流シグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、抗Ａｘｌ抗体は、Ｇａｓ６依存性細胞増殖を阻害する。

【0080】

一部の実施形態では、抗Ａｘｌ抗体は、腫瘍関連マクロファージからの炎症性サイトカイン発現を阻害する。

【0081】

一部の実施形態では、抗Ａｘｌ抗体は、腫瘍間質機能を調節することにより、腫瘍増殖及び／又は転移を阻害する。

【0082】

定義
抗体
この用語は、天然であるか又は部分的若しくは完全に合成により生成されたかのいずれにかかわらず、免疫グロブリンを表す。この用語はまた、抗体抗原結合ドメインを含む任意のポリペプチド又はタンパク質も包含する。抗体抗原結合ドメインを含む抗体断片は、全抗体（例えば、標準的構成でＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＬ、及びＣＬドメインを含むＩｇＧ抗体）、又は標的抗原に対する結合活性を保持する全抗体の断片を含む。こうした断片として、Ｆｖ（断片可変）、Ｆａｂ（断片抗体結合）及びＦ（ａｂ’）^２断片、並びに単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、タンデムｓｃＦｖ、ＴａｎｄＡｂ、バイボディ（ｂｉ−ｂｏｄｙ）、トリボディ（ｔｒｉ−ｂｏｄｙ）、κ（λ）ボディ、ＢｉＴＥ、ＤＶＤ−ｌｇ、ＳＩＰ、ＳＭＩＰ、又はＤＡＲＴが挙げられる。さらに、それらの抗体及び断片は、例えば、欧州特許出願公開第２３９４００Ａ号明細書に記載のように、ヒト化抗体であってもよい。例えば、モノクローナル及びポリクローナル抗体、組換え抗体、抗体のタンパク質分解及び組換え断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ）、単一ドメイン抗体（ＶＨＨ、ｓｄＡｂ、ナノボディ、ＩｇＮＡＲ、ＶＮＡＲ）、及び抗体に無関係なタンパク質であって、限定はしないが、下記のような抗体様特異的結合（抗体模倣物）を有するように操作されているものである。

【0083】

【表1】

【0084】

抗体は、抗体重鎖定常領域及び／又は抗体軽鎖定常領域の全部又は一部(apportion)を含んでよい。

【0085】

モノクローナル抗体及びその他の抗体を採用し、組換えＤＮＡ断片技術の技法を使用して、元の抗体の特異性を保持する改変抗体若しくはキメラ分子を生成することが可能である。こうした技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡ断片と、別の免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域、又は定常領域及びフレームワークをコードする遺伝子との連結を含み得る。例えば、欧州特許出願公開第Ａ１８４１８７号明細書、英国特許第２１８８６３８Ａ号明細書又は欧州特許出願公開第Ａ２３９４００号明細書を参照されたい。抗体を産生するハイブリドーマ又はその他の細胞を遺伝子突然変異又はその他の変更に付してもよく、これによって、産生される抗体の結合特異性が改変されるか、又は改変されない場合もある。

【0086】

抗体は多数の方法で改変することができるため、「抗体分子」という用語は、必要な特異性を備えた抗体由来の抗原結合ドメインを有するあらゆるポリペプチド又は他の分子を包含するものとして解釈すべきである。従って、この用語は、天然又は完全若しくは部分的合成のいずれにかかわらず、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドなどの抗体断片及び誘導体を包含する。従って、別のポリペプチドに融合された免疫グロブリンドメイン、又は均等物を含むキメラ分子も含まれる。キメラ抗体のクローン化及び発現は、欧州特許出願公開第Ａ−０１２０６９４号明細書及び同第Ａ−０１２５０２３号明細書に記載されている。

【0087】

全抗体の断片が、結合抗原の機能を果たし得ることが証明されている。結合断片の例として、以下のものが挙げられる：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから構成されるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから構成されるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインから構成されるＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨドメインから構成されるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４−５４６（１９８９））；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの連結したＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｖｉｉ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、ペプチドリンカーにより連結され、これによって、２つのドメインが結合して、抗原結合部位を形成することが可能になる、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８）；（ｖｉｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／米国特許第９２／０９９６５号明細書）並びに（ｉｘ）遺伝子融合により構築される多価若しくは多重特異性断片である、「ダイアボディ」（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，６４４４−６４４８，１９９３）。Ｆｖ、ｓｃＦｖ又はダイアボディ分子は、ＶＨ及びＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みにより安定化させることができる（Ｙ．Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９−１２４５，１９９６）。ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含むミニボディも作製することができる（Ｓ．Ｈｕ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，３０５５−３０６１，１９９６）。

【0088】

抗体は、二重特異性又は多重特異性のいずれであってもよい。二重特異性抗体を用いようとする場合、これらは、一般的二重特異性抗体であってよく、様々な方法（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．及びＷｉｎｔｅｒ Ｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４，４４６−４４９（１９９３））で製造することができ、例えば、化学的に若しくはハイブリッドハイブリドーマから調製してもよく、又は前述した二重特異性抗体断片のいずれであってもよい。ダイアボディ及びｓｃＦｖは、可変ドメインのみを用いて、Ｆｃ領域なしで構築することもでき、これにより、副作用、例えば、抗体エフェクター機能、又はマウス起源の抗体を使用する場合、ヒト抗マウス（ＨＡＭＡ）応答などによる副作用などを軽減し得る。

【0089】

二重特異性全抗体とは反対に、二重特異性ダイアボディは容易に構築することができ、且つ細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））に発現させることができるため、二重特異性ダイアボディも特に有用である。適切な結合特異性のダイアボディ（及び抗体断片などの多くの他のポリペプチド）は、抗体ライブラリーからのファージディスプレイ（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット）を用いて、容易に選択することができる。例えば、Ａｘｌに対して特異性を向けながら、ダイアボディの一方のアームを一定に維持しようとする場合、他方のアームを改変したライブラリーを作製して、適切な特異性の抗体を選択することができる。二重特異性全抗体は、ノブズイントゥーホールズ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）工学（Ｊ．Ｂ．Ｂ．Ｒｉｄｇｅｗａｙ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９，６１６−６２１，１９９６）により作製することができる。

【0090】

抗原結合ドメイン
これは、抗原を認識して、特異的に結合し、且つその抗原の相補性部分又は全部である領域を含む抗体分子の一部を表す。抗原が大きい場合、抗体は、抗原の特定部分にのみ結合し得るが、この部分は、エピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、１つ又は複数の抗体可変ドメイン（例えば、ＶＨドメインから構成されるいわゆるＦｄ抗体断片）によって提供され得る。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むのが好ましい。

【0091】

具体的なタンパク質
ヒトＡｘｌ
本明細書で用いられるとき、「ヒトＡｘｌ」は、受容体チロシンキナーゼのヒトＴＡＭファミリーのＡｘｌメンバーを指す。一部の実施形態では、ヒトＡｘｌポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ３２２２９、バージョン番号ＡＡＨ３２２２９．１ ＧＩ：２１６１９００４、記録更新日：２０１２年３月６日、０１：１８ＰＭ（配列番号１９）に対応する。一実施形態では、ヒトＡｘｌポリペプチドをコードする核酸は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ７６１２５、バージョン番号Ｍ７６１２５．１ ＧＩ：２９２８６９、記録更新日：２０１０年６月２３日、０８：５３ＡＭに対応する。

【0092】

マウス(murine)Ａｘｌ
本明細書で用いられるとき、「マウスＡｘｌ」は、受容体チロシンキナーゼのマウスＴＡＭファミリーのＡｘｌメンバーを指す。一部の実施形態では、マウスＡｘｌポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ４６６１８、バージョン番号ＡＡＨ４６６１８．１ ＧＩ：５５７７７０８２、記録更新日：２０１２年３月６日、０１：３６ＰＭ（配列番号２０）に対応する。一実施形態では、マウスＡｘｌポリペプチドをコードする核酸は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００９４６５、バージョン番号ＮＭ＿００９４６５．４ ＧＩ：３００７９４８３６、記録更新日：２０１４年３月１２日、０３：５２ＰＭに対応する。

【0093】

ヒトＴｙｒｏ３
本明細書で用いられるとき、「ヒトＴｙｒｏ３」は、受容体チロシンキナーゼのヒトＴＡＭファミリーのＴｙｒｏ３メンバーを指す。一部の実施形態では、ヒトＴｙｒｏ３ポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｑ０６４１８、バージョン番号Ｑ０６４１８．１ ＧＩ：１７１７８２９、記録更新日：２０１４年４月２２日、１２：０７ＰＭ（配列番号２１）に対応する。一実施形態では、ヒトＴｙｒｏ３ポリペプチドをコードする核酸は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＣ０５１７５６、バージョン番号ＢＣ０５１７５６．１ ＧＩ：３０７０４３７２、記録更新日：２０１２年３月６日、０１：４３ＰＭに対応する。

【0094】

ヒトＭｅｒ
本明細書で用いられるとき、「ヒトＭｅｒ」は、受容体チロシンキナーゼのヒトＴＡＭファミリーのＭｅｒメンバー（公式名称＝ＭＥＲＴＫ、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ＝Ｑ１２８６６）を指す。一部の実施形態では、ヒトＭｅｒポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＩ１４９１８、バージョン番号ＡＡＩ１４９１８．１ ＧＩ：１０９７３２０５２、記録更新日：２０１２年３月６日、０４：２１ＰＭ（配列番号２２）に対応する。一実施形態では、ヒトＭｅｒポリペプチドをコードする核酸は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６３４３、バージョン番号ＮＭ＿００６３４３．２ ＧＩ：６６９３２９１７、記録更新日：２０１４年３月１６日、０８：５２ＰＭに対応する。

【0095】

ＢＳＡ
本明細書で用いられるとき、「ＢＳＡ」は、ウシ血清アルブミンを指す。一部の実施形態では、ＢＳＡは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ７６８４７、バージョン番号ＣＡＡ７６８４７．１ ＧＩ：３３３６８４２、記録更新日：２０１１年１月７日、０２：３０ＰＭに対応する。

【0096】

含む(comprise)
これは、一般に、「包含する」、すなわち、１つ又は複数の特徴又は成分の存在を可能にするという意味で用いられる。

【0097】

単離された(isolated)
これは、本発明の抗体、又はそのような抗体をコードする核酸が、概して本発明に従うものである状況を指す。抗体及び核酸は、それらが天然に結合している材料、例えば、他のポリペプチドなど、又はそれらの天然の環境、若しくはその調製がｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏで実施される組換えＤＮＡ技術による場合には、それらが調製された環境（例えば、細胞培養物）にそれらと一緒に存在する核酸を含まないか、又は実質的に含まない。抗体及び核酸は、希釈剤又はアジュバントと一緒に製剤化しても(formulated)、また実用目的で単離してもよく、例えば、抗体は、免疫アッセイで使用するマイクロプレートのコーティングに用いられる場合、通常、ゼラチン若しくは他の担体と混合され、或いは診断又は治療に用いられる場合には、薬学的に許容される担体若しくは希釈剤と混合される。抗体は、自然に、若しくは異種真核細胞（例えば、ＣＨＯ若しくはＮＳ０（ＥＣＡＣＣ８５１１０５０３）細胞）の系によりグルコシル化されていてもよく、又は非グルコシル化であってもよい（例えば、原核細胞での発現により生成される場合）。

【0098】

実質的に記載される通り
「実質的に記載される通り」とは、本発明の関連ＣＤＲ又はＶＨ若しくはＶＬドメインが、指定の領域（その配列は本明細書に記載される）と同一であるか、又は高度に類似しているかのいずれかであることを意味する。「高度に類似している」とは、ＣＤＲ及び／又はＶＨ若しくはＶＬドメインに、１〜５つ、好ましくは１〜４つ、例えば、１〜３つ又は１若しくは２つ、又は３若しくは４つのアミノ酸置換がなされていてもよいと考慮される。

【0099】

ＣＤＲを支持するフレームワーク
本発明のＣＤＲを担持するための構造は、一般に、再編成された免疫グロブリン遺伝子によりコードされる天然のＶＨ及びＶＬ抗体可変ドメインのＣＤＲに対応する位置にＣＤＲが位置している、抗体の重鎖若しくは軽鎖配列又はその実質的部分からなる。免疫グロブリン可変ドメインの構造及び位置は、以下：（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．１９８７、及びその更新内容を参照にして決定することができ、現在ではインターネットでも入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ、又はいずれかの検索エンジンを用いて「Ｋａｂａｔ」を検索）。

【0100】

本発明で使用される可変ドメインは、任意の生殖細胞系、又は再編成マウス若しくはヒト改変ドメインから取得してもよく、又は既知マウス若しくはヒト可変ドメインのコンセンサス配列に基づく合成可変ドメインであってもよい。本発明のＣＤＲ配列（例えば、ＣＤＲ３）は、組換えＤＮＡ技術を用いて、ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）が欠失した可変ドメインのレパトア(repertoire)に導入してもよい。

【0101】

例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：７７９−７８３）は、抗体可変ドメインのレパトアを生成する方法を記載しており、この方法では、可変ドメイン領域の５’末端に向けられた、又はそれと隣接するコンセンサスプライマーを、ヒトＶＨ遺伝子の第３フレームワークに対するコンセンサスプライマーと一緒に使用することにより、ＣＤＲ３を欠失したＶＨ可変ドメインのレパトアを提供する。Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．はさらに、上記レパトアを特定の抗体のＣＤＲ３とどのように組み合わせるかについても記載している。類似の技術を用いて、本発明のＣＤＲ３由来の配列を、ＣＤＲ３を欠失したＶＨ若しくはＶＬドメインのレパトアとシャッフルした後、シャッフルした完全ＶＨ若しくはＶＬドメインをコグネイトＶＬ若しくはＶＨドメインと組み合わせて、本発明の抗体を提供することもできる。次に、国際公開第９２／０１０４７号パンフレットのファージディスプレイ系などの好適な宿主系において、レパトアを展示することにより、好適な抗体を選択することができる。レパトアは、１０^４を超える個別の抗体、例えば、１０^６〜１０^８個若しくは１０^１０個の抗体から構成され得る。

【0102】

類似のシャッフリング又はコンビナトリアル技術が、Ｓｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３７０：３８９−３９１）によっても開示されており、Ｓｔｅｍｍｅｒは、β−ラクタマーゼ遺伝子に関するＤＮＡシャッフリングの技術を記載しているが、この手法が、抗体の生成のために用いられ得ると述べている。

【0103】

さらに別の方法は、１つ又は複数の選択したＶＨ及び／又はＶＬ遺伝子のランダム突然変異誘発を用いて、可変ドメイン全体に突然変異を発生させることにより、本発明のＣＤＲ由来の配列を担持する新規のＶＨ及びＶＬ領域を作製するものである。こうした技術は、誤りがちなＰＣＲを用いたＧｒａｍ ｅｔ ａｌ（１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０）により記載されている。

【0104】

使用することができる別の方法は、ＶＨ又はＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に対して突然変異誘発を指令するものである。こうした技術は、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：３８０９−３８１３）及びＳｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５６７）により開示されている。

【0105】

前述した技術は全て、当技術分野においてそれ自体公知であり、それ自体で本発明の一部を形成するものではない。当業者は、このような技術を使用することにより、当技術分野で常用の方法を用いて本発明の抗体を提供することができるであろう。

【0106】

エピトープ特異的抗体
本発明の別の態様は、Ａｘｌエピトープに特異的な抗体を取得する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載するＶＨドメインのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入により、ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインを提供し、任意選択で、こうして提供されたＶＨドメインのアミノ酸配列を１つ又は複数のＶＬドメインと組み合わせるステップ、及びＶＨドメイン又は１つ若しくは複数のＶＨ／ＶＬ組み合わせを試験して、Ａｘｌに特異的な抗体又は抗体抗原結合ドメインを特定するステップを含む。前記ＶＬドメインは、アミノ酸配列を有し、これは、実質的に本明細書に記載される通りである。

【0107】

本明細書に開示するＶＬドメインの１つ又は複数の配列変異体を１つ又は複数のＶＨドメインと組み合わせる、類似の方法を使用してもよい。

【0108】

本発明の別の態様は、Ａｘｌに特異的な抗体を調製する方法を提供し、この方法は、以下：
（ａ）置換しようとするＣＤＲ３を含むか、又はＣＤＲ３コード領域を欠失しているかのいずれかであるＶＨドメインをコードする核酸の出発レパトアを用意するステップ；
（ｂ）前記レパトアを、ＶＨＣＤＲ３について実質的に本明細書に記載される通りのアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせるステップであって、それにより、前記ドナー核酸がレパトア内のＣＤＲ３領域に挿入されて、ＶＨドメインをコードする核酸の産物レパトアを提供する、ステップ；
（ｃ）前記産物レパトアの核酸を発現させるステップ；
（ｄ）Ａｘｌに特異的な抗体を選択するステップ；及び
（ｅ）前記抗体又はそれをコードする核酸を回収するステップ
を含む。

【0109】

さらには、置換しようとするＣＤＲ３を含むか、又はＣＤＲ３コード領域を欠失しているかのいずれかであるＶＬドメインをコードする核酸のレパトアと、本発明のＶＬＣＤＲ３を組み合わせる、類似の方法を使用してもよい。

【0110】

同様に、１つ若しくは複数、又は３つ全てのＣＤＲをＶＨ若しくはＶＬドメインのレパトアに移植してもよく、次に、これをＡｘｌに特異的な抗体についてスクリーニングする。

【0111】

免疫グロブリン可変ドメインの実質的部分は、その介在フレームワーク領域と一緒に、少なくとも３つのＣＤＲ領域を含む。この部分は、第１及び第４フレームワーク領域のいずれか又は両方の少なくとも約５０％を含むのが好ましく、この５０％は、第１フレームワーク領域のＣ末端５０％及び第４フレームワーク領域のＮ末端５０％である。可変ドメインの実質的部分のＮ末端又はＣ末端の追加残基は、天然に存在する可変ドメイン領域と通常結合していないものであってもよい。例えば、本発明の抗体の構築は、組換えＤＮＡ技術により実施される本発明の抗体の構築によって、クローン化又は他の操作ステップを促進するために導入されたリンカーによりコードされるＮ又はＣ末端残基の導入が起こり得る。他の操作ステップは、免疫グロブリン重鎖、他の可変ドメイン（例えば、ダイアボディの生成において）、又は以下に詳述するタンパク質標識を含むタンパク質配列に、本発明の可変ドメインを結合させるためのリンカーの導入を含む。

【0112】

本発明の好ましい態様では、１対のＶＨ及びＶＬドメインの対を含む抗体が好ましいが、ＶＨ又はＶＬドメイン配列のいずれかに基づく単一結合ドメインも、本発明のさらなる態様を形成する。単一免疫グロブリンドメイン、特にＶＨドメインは、特定の方法で標的抗原に結合し得ることがわかっている。

【0113】

いずれかの単一結合ドメインの場合、これらのドメインを用いて、Ａｘｌに結合することができる２ドメイン抗体を形成することができる相補的ドメインをスクリーニングしてもよい。

【0114】

これは、国際公開第９２／０１０４７号パンフレットに開示されているように、いわゆるヒエラルキーデュアルコンビナトリアル手法を用いるファージディスプレイスクリーニング法によって達成することができ、この方法では、Ｈ又はＬ鎖クローンのいずれかを含む個別のコロニーを用いて、他方の鎖（Ｌ又はＨ）をコードするクローンの完全なライブラリーを感染させ、得られた２鎖抗体を、その参照箇所に記載されているものなどのファージディスプレイ技術に従って選択する。この技術は、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（同上）にも開示されている。

【0115】

本発明の抗体は、抗体定常領域又はその部分をさらに含んでもよい。例えば、本発明の抗体は、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、及び／若しくはＣＨ３ドメイン（又はその任意の組み合わせ）を含んでよい。ＶＬドメインは、そのＣ末端で、ヒトＣκ又はＣλ鎖、好ましくはＣκ鎖を含む抗体軽鎖定常ドメインに結合させてもよい。同様に、ＶＨドメインに基づく抗体を、そのＣ末端で、任意の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＭ並びにアイソタイプサブクラスのいずれかに由来する免疫グロブリン重鎖の全部又は一部に結合させてもよい。国際公開第９９／５８５７２号パンフレットに開示されるΔｎａｂ及びΔｎａｃなどのＦｃ領域を使用してもよい。

【0116】

キメラ、ヒト化及びＣＤＲ移植抗体
本明細書で用いられるとき、「キメラ」抗体又は「ヒト化」抗体又は「ＣＤＲ移植」抗体は、本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体の任意の組み合わせ、又はそれに由来する任意のＣＤＲと非マウス、好ましくはヒト抗体由来の１つ又は複数のタンパク質若しくはペプチドとの組み合わせを含む。

【0117】

キメラ又はヒト化抗体は、ＣＤＲが、本明細書に記載する１つ又は複数の抗Ａｘｌ抗体及び少なくともその一部に由来するか、又は上記抗体の残り部分が、１つ又は複数のヒト抗体に由来するものを含む。従って、抗体のヒト部分は、フレームワーク、ＣＬ（例えば、Ｃκ若しくはＣλ）、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であるヒンジ領域を含んでもよい。

【0118】

ヒト抗体に由来する抗体の領域は、ヒト抗体と１００％同一性を有する必要はない。好ましい実施形態では、免疫原性を無視できるようにするために、可能な限り少数のマウスアミノ酸残基を保持するが、抗体のヒト化を最大限にすると同時に、ＣＤＲにより形成される抗原結合部位を支持するうえでの必要に応じて、マウス残基を保持してもよい。こうした変化又は変異は、任意選択で、また好ましくは非修飾抗体に対してヒト又は他の種における免疫原性を保持又は低減する。

【0119】

ヒト化抗体は、再編成ヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖及び／又は軽鎖）遺伝子を機能的に発現することができる非ヒト動物又は原核若しくは真核細胞により生成され得ることに留意すべきである。さらに、抗体が単鎖抗体であるとき、この抗体は、ネイティブヒト抗体に見出されないリンカーペプチドを含んでもよい。例えば、ｓｃＦｖは、２〜約２０個のグリセリン又は他のアミノ酸残基（好ましくは、グリセリン及びセリン残基（例えば、Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ若しくはＧｌｙ_２Ｓｅｒ反復単位））などのリンカーペプチドを含んでよく、これは、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域を連結する。こうしたリンカーペプチドは、ヒトにおいて非免疫原性であると考えられる。一部の実施形態では、リンカーは、長さが少なくとも１２アミノ酸である。

【0120】

抗体のヒト化は、例えば、フレーム内で個々のヒトフレームワークのプールに融合した非ヒト標的モノクローナル抗体の６つのＣＤＲ全てを含むコンビナトリアルライブラリーを合成することにより、実施することができる。全ての既知重鎖及び軽鎖ヒト生殖系列配列を代表する遺伝子を含むヒトフレームワークライブラリーを使用することができる。続いて、得られたコンビナトリアルライブラリーを目的の抗原との結合についてスクリーニングすることができる。この手法により、親抗体の結合活性の維持に関して、完全ヒトフレームワークの最も好ましい組み合わせの選択が可能になる。次に、ヒト化抗体を様々な方法により最適化することができる。

【0121】

完全長抗体分子の場合、免疫グロブリン遺伝子は、ハイブリドーマ細胞株のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡから取得することができる。抗体重鎖及び軽鎖は、哺乳動物ベクター系にクローン化する。アセンブリは、当技術分野で公知の方法を用いて、配列決定することにより確認する。抗体構築物は、他のヒト又は哺乳動物宿主細胞株に発現させることができる。次に、目的の発現抗体の一過性トランスフェクション及びウェスタンブロット分析により、構築物を検証することができる。最も高い生産性を有する安定な細胞株を単離した後、高速アッセイ方法を用いてスクリーニングすることができる。

【0122】

ヒト化抗体、断片及び領域の定常（Ｃ）領域をコードするヒト遺伝子は、公知の方法によりヒト胎児肝臓ライブラリーから取得することができる。ヒトＣ領域遺伝子は、ヒト免疫グロブリンを発現して生成するものなど、任意のヒト細胞から取得することができる。ヒトＣＨ領域は、γ、μ、α、δ、εを含むヒト重鎖の既知のクラス若しくはアイソタイプ、並びにＧ１、Ｇ２、Ｇ３及びＧ４などのそれらのサブクラスのいずれかに由来するものであってよい。重鎖アイソタイプは、抗体の様々なエフェクター機能を担うため、ＣＨドメインの選択は、補体結合、又は抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の活性など、所望のエフェクター機能によって誘導されることになる。ＣＨドメインは、γ１（ＩｇＧ１）に由来するのが好ましい。

【0123】

ヒトＣＬ領域は、ヒトＬ鎖アイソタイプ、κ又はλのいずれかに由来するものであってよく、κに由来するのが好ましい。

【0124】

ヒト免疫グロブリンＣ領域をコードする遺伝子は、標準的クローン化技術によってヒト細胞から取得することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７−１９９３））。ヒトＣ領域遺伝子は、２つのタイプの軽鎖、５つのクラスの重鎖及びそれらのサブクラスを呈示する遺伝子を含有する既知クローンから容易に入手可能である。

【0125】

Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２などのキメラ抗体断片は、適切に切断されるキメラ重鎖遺伝子を設計することにより調製することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）_２断片の重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、重鎖のＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列、これに続いて、切断分子を取得するための翻訳停止コドンを含む。

【0126】

非ヒト若しくはヒト抗体を操作又はヒト化する方法を用いることができ、こうした方法は、当技術分野ではよく知られている。一般に、ヒト化又は改変抗体は、非ヒト、例えば、限定はしないが、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類又はその他の哺乳類である供給源に由来する１つ又は複数のアミノ酸残基を有する。これらのヒトアミノ酸残基は、往々にして「移入」残基と呼ばれ、典型的には既知のヒト配列の「移入」可変、定常又は他のドメインから得られる。既知のヒトＩｇ配列は、例えば、以下に開示されている：
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｍｇｅｎ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＳＤ／ＩＴ／ＩＴ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｌｉｂｒａｒｙ．ｔｈｉｎｋｑｕｅｓｔ．ｏｒｇ／１２４２９／Ｉｍｍｕｎｅ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ／；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｍｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／；ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ．ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ／；ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｌ／；ｗｗｗ．ｐｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐａ／３４０９１３／３４０９１３．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／；ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／．ａｂｏｕｔ．ｙａｓｕｈｉｔｏ／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／ｔａｂｌｅ．ａｓｐ；ｗｗｗ．ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／ａｘｐ／ｆａｃｓ／ｄａｖｉｅｓ／ｌｉｎｋｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｆｃｃｌ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ＿ｇｅｏ．ｈｔｍｌ；ａｘｉｍｔ１．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／．ａｂｏｕｔ．ｒｅｋ／ＡＥＰＳｔａｒｔ．ｈｔｍｌ；ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／．ａｂｏｕｔ．ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓ１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｖｕ．ｅｄｕ／；ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ；ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／；ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍａｒｔｉｎ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ／；ａｂｇｅｎ．ｃｖｍ．ｔａｍｕ．ｅｄｕ／ｌａｂ／ｗｗｗａｂｇｅｎ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／．ａｂｏｕｔ．ｈｏｎｅｇｇｅｒ／ＡＨＯｓｅｍｉｎａｒ／Ｓｌｉｄｅ０１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｕｂｃｇ０７ｓ／；ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｉｏｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｆｍｏｌｉｎａ／Ｗｅｂ−ｐａｇｅｓ／Ｐｅｐｔ／ｓｐｏｔｔｅｃｈ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ／ｆｒ＿ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｅｎｔｓ．ｉｂｍ．ｃｏｎ／ｉｂｍ．ｈｔｍｌ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0127】

こうした移入配列を用いて、免疫原性を低減するか、又は当技術分野において周知のように、結合、親和性、結合速度(on-rate)、解離速度(off-rate)、結合力、特異性、半減期、若しくはその他いずれかの好適な特徴を低減、増強、又は修飾することができる。一般に、可変及び定常領域の非ヒト配列をヒト又は他のアミノ酸で置換すると同時に、非ヒト又はヒトＣＤＲ配列の一部若しくは全部を維持する。

【0128】

抗体はまた、任意選択で、抗原に対する高い親和性及びその他の好都合な生物学的特性を保持してヒト化することもできる。この目的を達成するために、ヒト化抗体は、任意選択で、親及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスにより調製することができる。三次元の免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者には周知である。選択した候補免疫グロブリン配列の考えられる三次元立体配座構造を図示及びディスプレイするコンピュータプログラムが入手可能である。これらのディスプレイの精査によって、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の考えられる役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原に対する高い親和性などの所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をコンセンサス配列及び移入配列から選択して、組み合わせることができる。

【0129】

一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に直接、且つ最も実質的に関与している。抗体のヒト化及び操作は、いずれか公知の方法を用いて実施することができ、こうした方法として、限定はしないが、以下に記載されているものがある：Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８）），Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７），Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、米国特許第５，７２３，３２３号明細書、同第５，９７６，８６２号明細書、同第５，８２４，５１４号明細書、同第５，８１７，４８３号明細書、同第５，８１４，４７６号明細書、同第５，７６３，１９２号明細書、同第５，７２３，３２３号明細書、同第５，７６６，８８６号明細書、同第５，７１４，３５２号明細書、同第６，２０４，０２３号明細書、同第６，１８０，３７０号明細書、同第５，６９３，７６２号明細書、同第５，５３０，１０１号明細書、同第５，５８５，０８９号明細書、同第５，２２５，５３９号明細書；同第４，８１６，５６７明細書、ＰＣＴ／米国特許第９８／１６２８０号明細書、同第９６／１８９７８号明細書、同第９１／０９６３０号明細書、同第９１／０５９３９号明細書、同第９４／０１２３４号明細書、英国特許第８９／０１３３４号明細書、同第９１／０１１３４号明細書、同第９２／０１７５５号明細書；国際公開第９０／１４４４３号パンフレット、同第９０／１４４２４号パンフレット、同第９０／１４４３０号パンフレット、欧州特許第２２９２４６号明細書。

【0130】

ヒト化抗体のヒト定常領域は、任意のクラス又はアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤなど）のものであってよく、κ又はλ軽鎖を含んでもよい。一実施形態では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ重鎖又は規定断片、例えば、ＩｇＧサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４の少なくとも１つを含む。

【0131】

標識抗体
本発明の抗体は、検出可能又は機能性標識で標識してもよい。検出可能な標識としては、［^１３１Ｉ］又は［^９９Ｔｃ］などの放射性標識があり、これらは、放射性免疫複合体の分野において公知の従来の化学を用いて、本発明の抗体に結合することができる。標識は、セイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識も含む。標識はさらに、ビオチンなどの化学的部分も含み、これは、特定のコグネイト検出可能部分、例えば、標識アビジン若しくはストレプトアビジンへの結合により検出することができる。標識は、ＦＩＴＣなどの蛍光標識を含むのが好ましい。

【0132】

有機部分
修飾抗体及び抗原結合断片は、抗体に直接若しくは間接的に共有結合した１つ又は複数の有機部分を含んでよい。本明細書に記載する抗体又は抗原結合断片に結合した各有機部分は、独立に、親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であってよい。本明細書で用いられるとき、「脂肪酸」という用語は、モノカルボン酸及びジカルボン酸を包含する。「親水性ポリマー基」は、この用語が本明細書で用いられるとき、オクタンよりも水に可溶性の有機ポリマーを指す。例えば、ポリリシンは、オクタンよりも水に可溶性である。このように、ポリリシンの共有結合により修飾される抗体は、本開示により包含される。本明細書に記載する抗体を修飾するのに好適な親水性ポリマーは、直鎖又は分岐状のいずれであってもよく、例えば、ポリ−アルカングリコール、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧなど、炭水化物（例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えば、ポリ−リシン、ポリ−アルギニン、ポリ−アスパラギン酸塩など）、ポリ−アルカンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど）、並びにポリビニルピロリドンが挙げられる。本明細書に記載する抗体を修飾する親水性ポリマーは、個別の分子実体として、約８００〜約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えば、ＰＥＧ５０００及びＰＥＧ２０，０００（添え字は、ポリマーの平均分子量（ダルトン）である）を用いることができる。親水性ポリマー基は、１〜約６のアルキル、脂肪酸又は脂肪酸エステル基で置換することができる。脂肪酸又は脂肪酸エステル基で置換された親水性ポリマーは、好適な方法を用いることにより調製することができる。例えば、アミン基を含むポリマーを脂肪酸又は脂肪酸エステルのカルボン酸塩と結合させてから、脂肪酸又は脂肪酸エステル上の活性化カルボン酸塩（例えば、Ｎ，Ｎ−カルボニルジイミダゾールで活性化）をポリマー上のヒドロキシル基と結合させることができる。

【0133】

本明細書に記載する抗体を修飾するのに好適な脂肪酸及び脂肪酸エステルは、飽和であってもよく、１つ又は複数の不飽和単位を含有してもよい。本明細書に記載する抗体を修飾するのに好適な脂肪酸として、例えば、ｎ−ドデカノアート（Ｃ１２、ラウリン酸塩）、ｎ−テトラデカノアート（Ｃ１４、ミリスチン酸塩）、ｎ−オクタデカノアート（Ｃ１８、ステアリン酸塩）、ｎ−エイコサノアート（Ｃ２０、アラキジン酸塩）、ｎ−ドコサノアート（Ｃ２２、ベヘン酸塩）、ｎ−トリコンタノアート（Ｃ３０）、ｎ−テトラコンタノアート（Ｃ４０）、シス−δ９−オクタデカノアート（Ｃ１８、オレイン酸塩）、ａｌｌ ｃｉｓ−δ５，８，１１，１４−エイコサテトラエノアート（Ｃ２０、アラキドン酸塩）、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などが挙げられる。好適な脂肪酸エステルとしては、直鎖又は分岐状の低級アルキル基を含むジカルボン酸のモノエステルが挙げられる。低級アルキル基は、１〜約１２個、好ましくは１〜約６つの炭素原子を含んでよい。

【0134】

修飾されたヒト抗体及び抗原結合断片は、１種又は複数種の改変剤との反応などの好適な方法を用いて調製することができる。「改変剤」は、この用語が本明細書で用いられるとき、活性化基を含む好適な有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）を指す。「活性化基」は、適切な条件下で、第２の化学基と反応し、これにより、改変剤と第２化学基との間に共有結合を形成することができる化学部分又は官能基である。例えば、アミン反応性活性化基としては、トシレート、メシレート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）などが挙げられる。チオールと反応することができる活性化基としては、例えば、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロイル、ピリジルジスルフィド、５−チオ−２−ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ−チオール）などが挙げられる。無水物官能基は、アミン−又はヒドラジド含有基に結合させることができ、アジド基は、三価リン基と反応して、ホスホロアミデート又はホスホロイミド結合を形成することができる。分子に活性化基を導入する好適な方法は、当技術分野において公知である（例えば、Ｈｅｒｎａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９６）を参照）。活性化基は、有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に直接、又はリンカー部分、例えば、二価Ｃ１〜Ｃ１２基を介して結合することができ、ここで、１つ又は複数の炭素原子を酸素、窒素又はイオウなどのヘテロ原子で置換することができる。好適なリンカー部分として、例えば、テトラ−エチレングリコール、−−（ＣＨ_２）_３−−、−−ＮＨ−−（ＣＨ_２）_６−−ＮＨ−−、−−（ＣＨ_２）_２−−ＮＨ−−及び−−ＣＨ_２−−Ｏ−−ＣＨ_２−−ＣＨ_２−−Ｏ−−ＣＨ_２−−ＣＨ_２−−Ｏ−−ＣＨ−−ＮＨ−−が挙げられる。リンカー部分を含む改変剤は、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で、モノ−Ｂｏｃ−アルキルジアミン（例えば、モノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン、モノ−Ｂｏｃ−ジアミノヘキサン）を脂肪酸と反応させて、遊離アミンと脂肪酸カルボン酸塩との間にアミド結合を形成することにより、生成することができる。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での処理により産物からＢｏｃ保護基を除去して、一級アミンを露出させることもでき、これを、記載のように、別のカルボン酸塩と結合させるか、又は無水マレイン酸と反応させて、得られた産物を環状化することにより、脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成することができる（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，国際公開第９２／１６２２１号パンフレットを参照）。

【0135】

修飾抗体は、ヒト抗体又は抗原結合断片を改変剤と反応させることにより生成することができる。例えば、有機部分は、アミン反応性改変剤、例えば、ＰＥＧのＮＨＳエステルを使用することにより、非部位特異的な方法で抗体に結合することができる。さらに、修飾ヒト抗体又は抗原結合断片は、抗体若しくは抗原結合断片のジスルフィド結合（例えば、鎖内ジスルフィド結合）を還元することにより、調製することもできる。続いて、還元された抗体又は抗原結合断片をチオール反応性改変剤と反応させて、本明細書に記載の修飾抗体を生成することができる。本明細書に記載の抗体の特定の部位に結合した有機部分を含む修飾ヒト抗体及び抗原結合断片は、逆タンパク質分解（Ｆｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，３：１４７−１５３（１９９２）；Ｗｅｒｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，５：４１１−４１７（１９９４）；Ｋｕｍａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６（１０）：２２３３−２２４１（１９９７）；Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２４（１）：５９−６８（１９９６）；Ｃａｐｅｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５６（４）：４５６−４６３（１９９７））、並びにＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９６）に記載されている方法などの好適な方法を用いて調製することができる。

【0136】

免疫複合体
本発明はまた、化学療法剤若しくは薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源のタンパク質毒素、酵素的に活性毒素、若しくはそれらの断片）、又は放射性同位体などの１種又は複数種の細胞傷害剤に結合した本明細書に記載の抗Ａｘｌ抗体を含む免疫複合体も提供する。

【0137】

一実施形態では、免疫複合体は、抗体が、１種又は複数種の薬物に結合した抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）であり、こうした薬物として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：メイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号明細書、同第５，４１６，０６４号明細書、及び欧州特許第０ ４２５ ２３５Ｂ１号明細書を参照）；モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）などのオーリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号明細書及び同第５，７８０，５８８号明細書、及び同第７，４９８，２９８号明細書を参照）；ドラスタチン；カリケアミシン若しくはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号明細書、同第５，７１４，５８６号明細書、同第５，７３９，１１６号明細書、同第５，７６７，２８５号明細書、同第５，７７０，７０１号明細書、同第５，７７０，７１０号明細書、同第５，７７３，００１号明細書、及び同第５，８７７，２９６号明細書；Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２（１９９３）；及びＬｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２５−２９２８（１９９８））；ダウノマイシン若しくはドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｒｎ．１３：４７７−５２３（２００６）；Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｒｎ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １６：３５８−３６２（２００６）；Ｔｏｒｇｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｒｎ．１６：７１７−７２１（２００５）；Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８２９−８３４（２０００）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｒｎ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：１５２９−１５３２（２００２）；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｒｎ．４５：４３３６−４３４３（２００２）；並びに米国特許第６，６３０，５７９号明細書を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；並びにＣＣ１０６５。

【0138】

別の実施形態では、免疫複合体は、酵素的に活性の毒素又はその断片に結合した本明細書に記載の抗体を含み、こうした毒素として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：ジフテリア毒素Ａ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α−サクリン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（Ｐ ＡＰＩ、Ｐ ＡＰＩＩ、ＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）。

【0139】

別の実施形態では、免疫複合体は、放射性原子に結合して、放射性免疫複合体を形成する本明細書に記載の抗体を含む。放射性免疫複合体の生成のために、様々な放射性同位体が利用可能である。例として、［^２１１Ａｔ］、［^１３１Ｉ］、［^１２５Ｉ］、［^９０Ｙ］、［^１８６Ｒｅ］、［^１８８Ｒｅ］、［^１５３Ｓｍ］、［^２１２Ｂｉ］、［^３２Ｐ］、［^２１２Ｐｂ］及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性免疫複合体が診断のために使用される場合、これは、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えば［^９９Ｔｃ］又は［^１２３Ｉ」、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ＭＲＩとしても知られている）用のスピン標識、例えば、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでもよい。

【0140】

抗体及び細胞傷害剤のコンジュゲートは、下記のような各種二官能性タンパク質結合剤を用いて調製することもできる：Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。炭素−１４標識１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドと抗体の結合のための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号パンフレットを参照されたい。リンカーは、細胞中での細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号明細書）を用いてもよい。

【0141】

免疫複合体又はＡＤＣは、本明細書において、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳｌＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、並びにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）安息香酸塩）（これらは、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａから））などの架橋試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明確に考慮するが、これらに限定されるわけではない。

【0142】

グリコシル化変異体
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増大又は低減するように改変される。抗体に対するグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ又は複数のグリコシル化部位が形成又は除去されるように、アミノ酸配列を改変することによって、好都合に達成され得る。

【0143】

抗体が、Ｆｃ領域を含む場合には、それに結合した炭水化物を改変してもよい。哺乳動物細胞によって産生されるネイティブ抗体は、典型的に、分岐状の二本鎖オリゴ糖を含み、これは、一般に、Ｎ−結合により、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に結合されている。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６−３２（１９９７）を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二本鎖オリゴ糖構造の「ステム」内のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含み得る。一部の実施形態では、いくつかの改善された特性を備える抗体変異体を作出するために、本発明の抗体中のオリゴ糖の修飾を実施してもよい。

【0144】

一実施形態では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合したフコースを欠失した炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、このような抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、又は２０％〜４０％であってよい。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号パンフレットに記載のように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により測定して、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）の合計に対して、Ａｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することにより決定する。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域において概ね２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ番号付与）に位置するアスパラギン残基を指すが；Ａｓｎ２９７はまた、抗体における若干の配列変化のために、２９７位の約±３アミノ酸上流又は下流、すなわち２９４〜３００位に位置する場合もある。こうしたフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号明細書（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；同第２００４／００９３６２１号明細書（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｌｗ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例としては、以下のものが挙げられる：米国特許出願公開第２００３／０１５７１号明細書；国際公開第２０００／６１７３９号パンフレット；同第２００１／２９２４６号パンフレット；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号明細書；同第２００２／０１６４３２８号明細書；同第２００４／００９３６２１号明細書；同第２００４／０１３２１４０号明細書；同第２００４／０１１０７０４号明細書；同第２００４／０１１０２８２号明細書；同第２００４／０１０９８６５号明細書；国際公開第２００３／０８５１１９号パンフレット；同第２００３／０８４５７０号パンフレット；同第２００５／０３５５８６号パンフレット；同第２００５／０３５７７８号パンフレット；同第２００５／０５３７４２号パンフレット；同第２００２／０３１１４０号パンフレット；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）。

【0145】

脱フコシル化抗体を生成することができる細胞株の例として、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃｌ３ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８ Ａ１号明細書、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及び国際公開第２００４／０５６３１２ Ａ１号パンフレット、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．、特に実施例１１）、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）；及び国際公開第２００３／０８５１０７号パンフレット）が挙げられる。

【0146】

さらに、二分されたオリゴ糖を備える抗体変異体も提供され、ここで、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二本鎖オリゴ糖が、ＧｌｃＮＡｃによって二分される。このような抗体変異体は、低減したフコシル化且つ／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。こうした抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号パンフレット（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）；米国特許第６，６０２，６８４号明細書（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号明細書（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。また、Ｆｅ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。こうした抗体変異体は、国際公開第１９９７／３００８７号パンフレット（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．）；国際公開第１９９８／５８９６４号パンフレット（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；並びに国際公開第１９９９／２２７６４号パンフレット（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。

【0147】

Ｆｃ領域変異体
いくつかの実施形態では、１つ又は複数のアミノ酸修飾を本明細書に記載の抗体のＦｃ領域に導入し、これにより、Ｆｃ領域変異体を作製することができる。Ｆｃ領域変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含んでよい。

【0148】

いくつかの実施形態では、本発明は、全部ではなく、一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を考慮し、これによって、この変異体は、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗体の半減期は重要だが、特定のエフェクター機能（補体結合及びＡＤＣＣなど）は不必要か、又は有害である用途について、望ましい候補となる。ＣＤＣの低減／欠失及び／又はＡＤＣＣ活性を確認するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイを実施することができる。例えば、抗体がＦｃγ結合を欠失している（従って、ＡＤＣＣ活性を欠失していることが見込まれる）が、ＦｃＲｎ結合能力は保持していることを確認するために、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施することができる。ＡＤＣＣを媒介するための一次細胞である、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的例が、米国特許第５，５００，３６２号明細書（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９−１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照）に記載されている。或いは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照。こうしたアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。上記に代わり、又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性をｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて評価することもできる。抗体がＣ１ｑに結合することができないため、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を欠失していることを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施してもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号パンフレット及び同第２００５／１００４０２号パンフレットにおけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５−１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ． ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照）。また、ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期Ｆｃ決定も、当技術分野で公知の方法を用いて実施することもできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照）。

【0149】

低減したエフェクター機能を有する抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ又は複数の置換を有するものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号明細書）。こうしたＦｃ突然変異体には、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２つ以上の置換を有するＦｃ突然変異体があり、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を含むいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号明細書）。

【0150】

ＦｃＲに対する結合が向上又は低減した特定の抗体変異体が記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号明細書；国際公開第２００４／０５６３１２号パンフレット、及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照）。

【0151】

いくつかの実施形態では、抗体変異体は、ＡＤＣＣ活性を改善する１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、２９８位、３３３位での置換及び／又はＦｃ領域の置換（残基のＥＵ番号付与）を有するＦｃ領域を含む。

【0152】

一部の実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号明細書、国際公開第９９／５１６４２号パンフレット、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されているように、Ｆｃ領域に改変を実施して、これにより、改変された（すなわち、向上若しくは低減した）Ｃ１ｑ結合及び／又はＣＤＣ活性がもたらされる。

【0153】

半減期が増加し、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合が向上した抗体は、胎児への母系ＩｇＧの輸送を担い（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））、こうした抗体は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号明細書（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。これらの抗体は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎの結合を向上させる１つ又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。こうしたＦｃ変異体としては、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４若しくは４３４のうち１つ又は複数の置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものである（米国特許第７，３７１，８２６号明細書）。また、Ｆｃ領域変異体の他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号明細書；米国特許第５，６２４，８２１号明細書；及び国際公開第９４／２９３５１号パンフレットを参照されたい。

【0154】

システイン改変抗体変異体
いくつかの実施形態では、抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換される、「ｔｈｉｏＭＡｂ」などのシステイン改変抗体を作出することが望ましい場合もある。

【0155】

特定の実施形態では、置換される残基は、抗体の接触可能な部位に存在する。本明細書でさらに詳述するように、これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が抗体の接触可能部位に配置され、これを用いて、薬物部分又はリンカー−薬物部分などの他の部分に抗体を結合させて、免疫複合体を作出する。いくつかの実施形態では、以下の残基のいずれか１つ又は複数をシステインで置換してもよい：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付与）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付与）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付与）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号明細書に記載されているように作製することもできる。

【0156】

診断及び治療の方法
本発明の抗体は、ヒト又は動物被験者、好ましくはヒトの診断又は治療の方法に使用されるように設計される。

【0157】

従って、本発明の別の態様は、例えば、ＦＩＴＣなどの検出可能な標識に結合した１種又は複数種の試薬と一緒に、記載される抗体を投与するステップを含む診断方法を提供する。記載の抗体は、生検組織から得た癌細胞についての高速且つ信頼性の高い試験の開発に用いることもできる。例えば、抗体は、血液又はリンパなどの体液中に循環しているのが見出され得る循環腫瘍細胞などの転移癌細胞についての試験として用いることもできる。目的とする他の癌としては、乳癌、肺癌、胃癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、内膜及び前立腺癌、並びにリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ＮＨＬ）及び白血病（特に、急性骨髄性白血病、ＡＭＬ）が挙げられる。

【0158】

本発明のさらに別の態様は、記載される抗体の投与を含む治療方法、こうした抗体を含む医薬組成物、治療方法に使用するための本明細書に記載の抗体、本明細書に記載する特定の臨床的適応の治療方法に使用するための本明細書に記載の抗体、並びに投与のための薬剤の製造、例えば、薬学的に許容される賦形剤と一緒に抗体を製剤化するステップ(formulating)を含む薬剤又は医薬組成物の製造方法における抗体の使用を提供する。

【0159】

臨床的適応
ヒトＡｘｌに対して高い特異性を有する抗体を用いて、治療利益をもたらし得る臨床的適応は、Ａｘｌが過剰発現される、又はＡｘｌ拮抗作用が臨床的利益をもたらすあらゆる状態を含む。こうした状態として、免疫障害、心臓血管障害、血栓症、糖尿病、免疫チェックポイント障害、又は癌、とりわけ転移性癌などの増殖性疾患が挙げられる。さらに、Ａｘｌは、多くの上皮起源の癌において、ある役割を果たすこともわかっている。

【0160】

目的の免疫チェックポイント障害としては、以下のものが挙げられる：慢性ウイルス感染症、黒色腫、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、前立腺癌、腎細胞癌、膵臓癌、食道癌、膀胱癌、骨髄腫、腎臓癌、膀胱癌、脳腫瘍、及びリンパ腫。

【0161】

目的の癌としては、以下のものが挙げられる：白血病、例えば、限定はしないが、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、例えば、骨髄芽球性、前骨髄性、骨髄単球性、単球性、赤白血病性白血病及び骨髄異形成症候群、慢性白血病、例えば、限定はしないが、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、有毛細胞性白血病；真性赤血球増加；リンパ腫、例えば、限定はしないが、ホジキン病、非ホジキン病；多発性骨髄腫、例えば、限定はしないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞性白血病、孤立性形質細胞腫及び髄外形質細胞腫；ワンデルストレームマクロブリン血症；意義不明の単クローン性グロブリン血症；良性単クローン性ガンマグロブリン血症；Ｈ鎖病；骨及び結合組織肉腫、例えば、限定はしないが、骨肉腫、骨肉腫、軟膏肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨の繊維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟組織肉腫、血管肉腫（血管肉腫）、繊維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、転移性癌、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫；脳腫瘍、例えば、限定はしないが、神経膠腫、膠芽腫、星状細胞腫、脳幹グリオーマ、上衣腫、乏突起膠腫、非グリア腫瘍、聴神経腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽腫、脳原発性リンパ腫；乳癌、例えば、限定はしないが、腺癌、小葉（小細胞）癌、乳管内癌、髄様乳癌、粘液性乳癌、管状乳癌、乳頭乳癌、原発性癌、パジェット病、及び炎症性乳癌；副腎癌、例えば、限定はしないが、褐色細胞腫及び副腎皮質癌；甲状腺癌、例えば、限定はしないが、甲状腺乳頭若しくは濾胞性甲状腺癌、髄様甲状腺癌及び未分化甲状腺癌；膵臓癌、例えば、限定はしないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、及びカルチノイド若しくは膵島細胞腫瘍；下垂体癌、例えば、限定はしないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症、及び尿崩症；眼の癌、例えば、限定はしないが、虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫、及び毛様体黒色腫などの眼内黒色腫、並びに網膜芽細胞腫；膣癌、例えば、扁平上皮癌、腺癌、及び黒色腫；外陰癌、例えば、扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、及びパジェット病；子宮頸癌、例えば、限定はしないが、扁平上皮癌、及び腺癌；子宮癌、例えば、限定はしないが、内膜癌及び子宮肉腫；卵巣癌、例えば、限定はしないが、上皮性卵巣癌、境界型腫瘍、胚細胞腫瘍、及び間質腫瘍；食道癌、例えば、限定はしないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣贅性癌、及び燕麦細胞（小細胞）癌；胃癌、例えば、限定はしないが、腺癌、菌状発育性（ポリープ状）、潰瘍性、表在拡大型、びまん性拡大型、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、繊維肉腫、及び癌肉腫；結腸癌；直腸癌；肝臓癌、例えば、限定はしないが、肝細胞癌及び肝芽腫、胆嚢癌、例えば、腺癌；胆管癌、例えば、限定はしないが、乳頭、結節性、及びびまん性；肺癌、例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、扁平上皮癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌及び小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）；精巣癌、例えば、限定はしないが、胚細胞腫瘍、精上皮腫、未分化、古典的（典型的）、精母細胞性、非セミノーマ、胎生期癌、奇形腫癌、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）、前立腺腺癌、例えば、限定はしないが、腺癌、平滑筋肉腫、及び横紋筋肉腫；性器癌、例えば、陰茎癌；口腔癌、例えば、限定はしないが、扁平上皮癌；基底細胞癌；唾液線癌、例えば、限定はしないが、腺癌、粘表皮癌、及び腺様嚢胞癌；咽頭癌、例えば、限定はしないが、扁平上皮癌、及び疣贅性；皮膚癌、例えば、限定はしないが、基底細胞癌、扁平上皮癌及び黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫；腎臓癌、例えば、限定はしないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、繊維肉腫、移行上皮細胞癌（腎盂及び／又は尿管）；ウィルムス腫瘍；膀胱癌、例えば、限定はしないが、移行上皮細胞癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫。さらに、癌として、粘液肉腫、骨形成肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌及び乳頭腺癌が挙げられる。癌は、乳癌、黒色腫、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌又は神経膠腫癌から選択されるのが好ましい。癌は、転移性乳癌又は肺癌であるのがより好ましい。循環腫瘍のターゲティング及び治療が考慮される。

【0162】

転移性癌の治療は、原発腫瘍がどこに位置するかに左右される。例えば、乳癌が肺にまで広がった場合、癌は乳癌のままであり、治療は、癌が現時点で肺にあることではなく、乳房内の転移性癌起源によって決定される。約５％の確率で、転移性癌が発見されても、原発腫瘍を見出すことができない。これらの転移性癌の治療は、その起源よりむしろその位置によって決定される。転移性癌は、原発腫瘍の組織（わかっている場合）によって命名される。例えば、脳まで広がった乳癌は、脳転移性乳癌と呼ばれる。

【0163】

本発明の抗Ａｘｌ治療は、Ａｘｌが過剰発現しているか、又はＡｘｌ拮抗作用が臨床的利益をもたらすことを条件として、患者に対する明らかな利益を提供するために用いることができる。治療は、注射により（例えば、静脈内）又は局所送達法によって実施することができる。記載の抗体は、標的組織に対して、又は例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）若しくは他の転移性細胞をターゲティングするために、全身に薬学的組成物の送達を向かわせるように使用してもよい。

【0164】

本発明の別の態様では、被験者における癌ステム細胞を阻害する方法も提供され、この方法は、本明細書に記載する抗体（若しくはそのコンジュゲート）と被験者を接触させるステップを含む。このような方法で使用する抗体及びコンジュゲートも考慮される。

【0165】

ＥＧＦＲ拮抗作用
本発明はまた、構成性Ａｘｌ活性化を阻害するステップも提供し、この方法は、構成性Ａｘｌを阻害するために本明細書に開示する抗Ａｘｌ抗体のいずれかの有効量を個体に投与するステップを含む。

【0166】

一態様では、本発明は、ＥＧＦＲ活性化突然変異又はＥＧＦＲ遺伝子増幅に関連する癌に罹患した患者を治療する方法を提供し、ここで、被験者は、ＥＧＦＲアンタゴニストによる治療に対する耐性を形成しており、この方法は、被験者が、Ａｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異又はＡｘｌ遺伝子増幅を有するか否かを決定するステップ、並びにＡｘｌ活性化突然変異又はＡｘｌ遺伝子増幅を有する被験者に、ＥＧＦＲアンタゴニスト及び本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体のいずれかを投与するステップを含む。

【0167】

一態様では、本発明は、ＥＧＦＲ活性化突然変異又はＥＧＦＲ遺伝子増幅に関連する癌に罹患した患者を治療する方法を提供し、この方法は、（ｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストによる治療を受けている被験者をモニタリングして、被験者がＡｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異又はＡｘｌ遺伝子増幅を起こしているか否かを決定するステップ、並びに（ｉｉ）被験者が、Ａｘｌ活性化突然変異又はＡｘｌ遺伝子増幅を起こしている場合、ＥＧＦＲアンタゴニストに加えて、本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体のいずれかを含有させるように、被験者の治療計画を変更するステップを含む。

【0168】

一態様では、本発明は、ＥＧＦＲ活性化突然変異又はＥＧＦＲ遺伝子増幅に関連する癌に罹患した患者を治療する方法を提供し、この方法は、（ｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストによる治療を受けている被験者をモニタリングして、被験者が、阻害剤に対する耐性を形成しているか否かを決定するステップ、（ｉｉ）被験者を試験して、被験者が、Ａｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異又はＡｘｌ遺伝子増幅を有するか否かを決定するステップ、並びに（ｉｉｉ）被験者が、Ａｘｌ活性化突然変異又はＡｘｌ遺伝子増幅を有する場合、ＥＧＦＲアンタゴニストに加えて、本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体のいずれかを含有するように、被験者の治療計画を変更するステップを含む。

【0169】

一態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニストを評価する方法を提供し、この方法は、（ｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストによる治療を受けている被験者の集団をモニタリングして、治療薬に対する耐性を形成している被験者を見出すステップ、（ｉｉ）耐性の被験者を試験して、被験者が、Ａｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異又はＡｘｌ遺伝子増幅を有するか否かを決定するステップ、並びに（ｉｉｉ）被験者が、Ａｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異又はＡｘｌ遺伝子増幅を有する場合、ＥＧＦＲアンタゴニストに加えて、本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体のいずれかを含有するように、被験者の治療計画を変更するステップを含む。

【0170】

一態様では、本発明は、癌細胞におけるＥＧＦＲリン酸化を低減する方法を提供し、ここで、前記癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得しており、且つ前記細胞は、Ａｘｌ活性化突然変異又はＡｘｌ遺伝子増幅を含み、この方法は、本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体のいずれか及びＥＧＦＲアンタゴニストと細胞を接触させるステップを含む。

【0171】

一態様では、本発明は、癌細胞におけるＰＢＫ媒介性シグナル伝達を低減する方法を提供し、ここで、前記癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得しており、且つ前記細胞は、Ａｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異又はＡｘｌ遺伝子増幅を含み、この方法は、本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体のいずれか及びＥＧＦＲアンタゴニストと細胞を接触させるステップを含む。

【0172】

一態様では、本発明は、癌細胞におけるＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達を低減する方法を提供し、ここで、前記癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得しており、且つ前記細胞は、Ａｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異又はＡｘｌ遺伝子増幅を含み、この方法は、本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体のいずれか及びＥＧＦＲアンタゴニストと細胞を接触させるステップを含む。

【0173】

一態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する癌細胞の感受性を回復する方法を提供し、ここで、前記癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得しており、且つ前記細胞は、Ａｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異又はＡｘｌ遺伝子増幅を含み、この方法は、本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体のいずれか及びＥＧＦＲアンタゴニストと細胞を接触させるステップを含む。

【0174】

一態様では、本発明は、癌細胞の成長又は増殖を低減する方法を提供し、ここで、前記癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得しており、且つ前記細胞は、Ａｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異又はＡｘｌ遺伝子増幅を含み、この方法は、本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体のいずれか及びＥＧＦＲアンタゴニストと細胞を接触させるステップを含む。

【0175】

一態様では、本発明は、癌細胞のアポトーシスを増加する方法を提供し、ここで、前記癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得しており、且つ前記細胞は、Ａｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異又はＡｘｌ遺伝子増幅を含み、この方法は、本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体のいずれか及びＥＧＦＲアンタゴニストと細胞を接触させるステップを含む。

【0176】

一態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する癌細胞の耐性を低減する方法を提供し、ここで、前記癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得しており、且つ前記細胞は、Ａｘｌ活性化突然変異又はＡｘｌ遺伝子増幅を含み、この方法は、本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体のいずれか及びＥＧＦＲアンタゴニストと細胞を接触させるステップを含む。

【0177】

一態様では、本発明は、癌細胞における獲得ＥＧＦＲアンタゴニスト耐性を治療する方法を提供し、ここで、前記細胞は、Ａｘｌ活性化突然変異又はＡｘｌ遺伝子増幅を含み、この方法は、本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体のいずれか及びＥＧＦＲアンタゴニストと細胞を接触させるステップを含む。

【0178】

一部の実施形態では、癌細胞は、いずれかのＥＧＦＲ駆動癌である。一部の実施形態では、癌細胞は、ＥＧＦＲ活性化突然変異を含む。一部の実施形態では、癌細胞は、ＥＧＦＲ遺伝子増幅を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ遺伝子増幅は、少なくとも２倍である。一部の実施形態では、Ａｘｌ増幅は、少なくとも２倍である。一部の実施形態では、癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性の増大に関連するＥＧＦＲ遺伝子突然変異を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性の増大に関連するＥＧＦＲ遺伝子突然変異は、ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ突然変異である。

【0179】

一部の実施形態では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、小分子治療薬、核酸治療薬、又はタンパク質治療薬である。一部の実施形態では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、抗体、アンチセンス分子、又は小分子キナーゼ阻害剤である。一部の実施形態では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、ゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、パンチヌムマブからなる群から選択されるＥＧＦＲキナーゼ阻害剤である。一部の実施形態では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、セツキシマブ、パニツムマブからなる群から選択される抗ＥＧＦＲ抗体である。一部の実施形態では、核酸治療薬は、ｓｉＲＮＡ分子である。

【0180】

一態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニスト及び本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体のいずれかによる治療の候補として被験者を識別する方法を提供し、ここで、前記被験者は、ＥＧＦＲアンタゴニストによる治療を受けたことがあり、前記ＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得した癌に罹患しており、この方法は、前記被験者からの癌細胞においてＡｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異又はＡｘｌ遺伝子増幅を検出するステップを含む。

【0181】

一態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニストによる治療を受けており、且つ前記ＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得するリスクがある被験者を識別する方法を提供し、この方法は、前記被験者からの癌細胞においてＡｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異又はＡｘｌ遺伝子増幅の存在を検出するステップを含み、ここで、前記Ａｘｌ発現、Ａｘｌ活性化突然変異又はＡｘｌ遺伝子増幅の存在が、前記耐性を獲得するリスクを示すものである。

【0182】

一態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニストによる治療に対して耐性の癌に罹患した患者を治療する方法を提供し、この方法は、ＥＧＦＲアンタゴニスト及び本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体のいずれかを被験者に投与するステップを含む。

【0183】

一態様では、本発明は、ＥＧＦＲ活性化突然変異又はＥＧＦＲ遺伝子増幅に関連する癌に罹患した被験者を治療する方法を提供し、ここで、被験者は、ＥＧＦＲアンタゴニストによる治療に対する耐性を形成しており、この方法は、被験者が、Ａｘｌ発現、例えば、高いＡｘｌレベル及び／又は活性を有するか否かを決定するステップ、並びにＡｘｌ発現、例えば、高いＡｘｌ活性を有する被験者に、ＥＧＦＲアンタゴニスト及び本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体のいずれかを投与するステップを含む。

【0184】

一態様では、本発明は、ＥＧＦＲ活性化突然変異又はＥＧＦＲ遺伝子増幅に関連する癌に罹患した患者を治療する方法を提供し、この方法は、（ｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストによる治療を受けている被験者をモニタリングして、被験者が、Ａｘｌ発現、例えば、高いＡｘｌレベル及び／又はＡｘｌ活性を起こしているか否かを決定するステップ、並びに（ｉｉ）被験者が、Ａｘｌ発現、例えば、高いＡｘｌレベル及び／又は活性を起こしている場合、ＥＧＦＲアンタゴニストに加えて、本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体のいずれかを含有させるように、被験者の治療計画を変更するステップを含む。

【0185】

一態様では、本発明は、ＥＧＦＲ活性化突然変異又はＥＧＦＲ遺伝子増幅に関連する癌に罹患した患者を治療する方法を提供し、この方法は、（ｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストで治療している被験者をモニタリングして、被験者が、阻害剤に対する耐性を形成しているか否かを決定するステップ、（ｉｉ）被験者を試験して、被験者が、Ａｘｌ発現、例えば、高いＡｘｌレベル及び／又は活性を有するか否かを決定するステップ、並びに（ｉｉｉ）被験者が、高いＡｘｌレベル及び／又は活性を有する場合、ＥＧＦＲアンタゴニストに加えて、本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体のいずれかを含有するように、被験者の治療計画を変更するステップを含む。

【0186】

別の態様では、本発明は、（ｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストに対する癌細胞の感受性を回復し、（ｉｉ）ＥＧＦＲアンタゴニストに対する癌細胞の耐性を低減し、及び／又は（ｉｉｉ）ＥＧＦＲアンタゴニスト及び本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体のいずれかと細胞を接触させることにより、癌細胞における獲得ＥＧＦＲアンタゴニスト耐性を治療する方法を提供する。

【0187】

例示的実施形態では、癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得しており、例えば、Ａｘｌ遺伝子における活性化突然変異、Ａｘｌ遺伝子増幅、又はＧａｓ６媒介性Ａｘｌ活性化に関連する、高レベルのＡｘｌ活性及び／又は発現を含む。本明細書に開示するこの方法は、癌細胞の感受性を回復し、耐性を低減し、且つ／又は獲得耐性を治療するために使用することができる。

【0188】

別の態様では、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニスト及び本明細書に記載する抗Ａｘｌ抗体のいずれかと細胞を接触させることにより、癌細胞の成長及び／若しくは増殖を低減するか、又は癌細胞のアポトーシスを増大する方法を提供する。例示的実施形態では、癌細胞は、ＥＧＦＲアンタゴニストに対する耐性を獲得しており、例えば、Ａｘｌ遺伝子における活性化突然変異、Ａｘｌ遺伝子増幅、又はＧａｓ６媒介性Ａｘｌ活性化に関連する、高いＡｘｌ活性及び／又は発現を含む。

【0189】

医薬組成物
本発明の抗体は、通常、医薬組成物の形態で投与され、この組成物は、抗体に加えて、少なくとも１つの成分を含み得る。

【0190】

従って、本発明の医薬組成物、及び本発明に従う使用のための医薬組成物は、活性成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤又は当業者には周知のその他の材料を含んでもよい。こうした材料は、非毒性でなければならず、且つ活性成分の効果を妨害すべきではない。担体又はその他の材料の正確な性質は、投与経路に左右され、投与経路は、経口、又は注射、例えば、静脈内注射によるものであってよい。医薬組成物は、ヒト及び獣医学におけるヒト又は動物での使用を目的とするものであってよい。

【0191】

本明細書に記載する医薬組成物の多様な形態に好適な賦形剤の例は、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ”，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９９４），Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａ Ｗａｄｅ ａｎｄ ＰＪ Ｗｅｌｌｅｒに見出すことができる。

【0192】

治療用途に許容される担体又は希釈剤は、製薬の分野でよく知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。好適な担体の例として、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。好適な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロール、水及び緩衝食塩水が挙げられる。

【0193】

製薬担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図する投与経路及び標準的薬務に関して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として、又はそれ以外に、任意の好適な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤、バッファー、香味料、界面活性剤、増粘剤、防腐剤（抗酸化剤を含む）など、並びに製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性にする目的で含有される物質を含んでもよい。

【0194】

好適な結合剤の例として、デンプン、ゼラチン、天然の糖、例えば、グルコース、無水ラクトース、易流動性ラクトース、βラクトース、トウモロコシ甘味料、天然及び合成ゴム、例えば、アカシア、トラガカンス又はアルギニン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース及びポリエチレングリコールが挙げられる。

【0195】

好適な潤滑剤の例として、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。防腐剤、安定剤、染料、さらには香味料を医薬組成物中に添加してもよい。防腐剤の例として、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。また、抗酸化剤及び懸濁剤を使用してもよい。

【0196】

医薬製剤は、経口、局所（皮膚、口腔及び舌下を含む）、直腸又は非経口（皮下、皮内、筋内及び静脈内を含む）、鼻内及び肺投与（例えば、吸入による）に好適なものが挙げられる。製剤は、適切であれば、個別の用量単位で表示して、薬学の分野でよく知られている方法のいずれかによって調製するのが好都合である。全ての方法は、活性化合物を、液体担体若しくは微粉砕された固体担体、又はその両方と結合させた後、必要であれば、生成物を所望の製剤に造形するステップを含む。担体が固体である経口投与に好適な医薬製剤は、各々予定量の活性剤を含有するボーラス、カプセル又は錠剤などの単位用量製剤として提供されるのが最も好ましい。錠剤は、任意選択で１種又は複数種の補助成分と一緒に、圧縮又は成形により製造することができる。圧縮した錠剤は、任意選択で結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、潤滑物質、界面活性剤又は分散剤と混合した粉末又は顆粒など、易流動形態の活性剤を好適な機械で圧縮することにより、調製することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤と一緒に活性剤を成形することにより、製造することができる。錠剤は、任意選択でコーティングしてもよく、コーティングしない場合、任意選択で目盛りを付けてもよい。カプセルは、活性剤を単独で、又は１種又は複数種の補助成分と混合して、カプセルシェル中に充填した後、これらを通常の方法で封入することにより、調製することができる。カシェは、カプセルと類似しており、活性剤を任意の補助成分と一緒にライスペーパー包膜中に封入する。活性剤は、分散性の顆粒として製剤化してもよく、これは、例えば、投与前に水に懸濁させるか、又は食品に振り掛けることができる。顆粒は、例えば、サシェにパッケージングしてもよい。担体が液体の場合、経口投与に好適な製剤は、水性若しくは非水性液体中の溶液若しくは懸濁液として、又は水中油形液体乳剤として提供してもよい。

【0197】

経口投与のための製剤としては、制御放出剤形、例えば、錠剤があり、その際、活性剤は、適切な放出制御マトリックス中に製剤化されるか、又は好適な放出制御フィルムでコーティングされる。こうした製剤は、とりわけ予防用途の場合に好都合であろう。

【0198】

担体が固体である直腸投与に好適な医薬製剤は、単位用量座薬として提供するのが最も好ましい。好適な担体として、カカオ脂及び当技術分野で一般に使用されているその他の材料が挙げられる。座薬は、活性剤を、軟化又は溶融担体と混合した後、鋳型中で冷却及び成形することにより好都合に形成することができる。

【0199】

非経口投与に好適な医薬製剤には、水性若しくは油性ビヒクル中の活性剤の滅菌溶液又は懸濁液がある。

【0200】

注射製剤は、ボーラス注射又は持続注入のために改変してもよい。こうした調製物は、使用のために必要となるまで、製剤の導入後に密封された単位用量又は複数用量容器内に提供するのが好都合である。或いは、活性剤は、使用の前に、滅菌の発熱性物質除去蒸留水などの好適なビヒクルと一緒に構成される粉末形態であってもよい。

【0201】

活性化合物はまた、持続性デポー剤として製剤化してもよく、これは、筋内注射、又は例えば皮下若しくは筋内移植により投与することができる。デポー剤は、例えば、好適なポリマー若しくは疎水性材料、又はイオン交換樹脂を含んでもよい。こうした持続性製剤は、とりわけ予防用途に好都合である。

【0202】

口腔を介した肺への投与に好適な製剤が提供され、その場合、活性化合物を含有し、望ましくは直径が０．５〜７ミクロンの範囲である粒子をレシピエントの気管支樹に送達する。１つの可能性として、こうした製剤は、微粉砕された粉末の形態であり、これは、好適には、例えば、吸入装置での使用のためのゼラチン製の透過性カプセル内、或いは活性剤、好適な液体若しくは気体噴射剤、並びに任意選択で界面活性剤及び／若しくは固体希釈剤などの他の成分を含む自己噴射製剤としてのいずれかで提供されるのが好都合である。好適な液体噴射剤としては、プロパン及びクロロフルオロ炭素があり、好適な気体噴射剤としては、二酸化炭素がある。また、活性剤が溶液若しくは懸濁液の液滴の形態で分散されている自己噴射製剤を使用してもよい。

【0203】

こうした自己噴射製剤は、当技術分野で公知のものに類似しており、確立された手順で調製することができる。これらは、所望の噴霧特性を有する手動操作又は自動作動弁のいずれかを備えた容器内に提供され；弁は、毎回の操作時に、例えば、２５〜１００マイクロリットルの一定量を送達する計量タイプであるのが有利である。

【0204】

別の可能性として、活性剤は、噴霧器又はネブライザーでの使用のための溶液若しくは懸濁液の形態であってもよく、これにより、加速した空気流又は超音波攪拌を使用して、吸入のための微細な液滴を生成する。

【0205】

鼻内投与に好適な製剤は、肺投与のために前述したものと概ね類似した調製物を含む。調合する場合、こうした製剤は、鼻腔内に保持することができる１０〜２００ミクロンの範囲の粒径を有し；これは、必要に応じて、好適な粒径の粉末の使用又は適切な弁の選択により達成することができる。他の好適な製剤としては、鼻の近くに保持した容器から鼻腔を介した高速吸入による投与のための２０〜５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末、及び水性若しくは油性溶液又は懸濁液中に０．２〜５％ｗ／ｖの活性剤を含む点鼻剤がある。

【0206】

薬学的に許容される担体は、当業者には周知であり、限定はしないが、０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝剤又は０．８％食塩水がある。さらに、こうした薬学的に許容される担体は、水性又は非水性溶液、懸濁液、及び乳剤であってもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール／水性溶液、乳剤又は懸濁液が挙げられ、食塩水及び緩衝媒体を含む。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー又は不揮発油が挙げられる。また、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの防腐剤及びその他の添加剤が存在してもよい。

【0207】

局所製剤に好適な製剤は、例えば、ゲル、クリーム又は軟膏として提供してもよい。こうした調製物は、例えば、創傷若しくは潰瘍に対して、創傷若しくは潰瘍の表面に直接広げるか、又は包帯、ガーゼ、メッシュなどの好適な支持体に含有させて、これを治療しようとする部位に適用してもよい。

【0208】

さらに、治療しようとする部位、例えば、創傷若しくは潰瘍に直接噴霧するか、又は散布することができる液体又は粉末製剤も提供され得る。或いは、包帯、ガーゼ、メッシュなどの支持体に、製剤を噴霧又は散布した後、これを治療しようとする部位に適用することもできる。

【0209】

本発明のさらに別の態様によれば、前述した医薬組成物又は動物用組成物の調製方法が提供され、この方法は、例えば、混合により、活性化合物を担体と結合させるステップを含む。一般に、製剤は、液体担体若しくは微粉砕された固体担体、又はその両方と活性剤を均一且つ密接に結合させた後、必要であれば、生成物を造形することによって調製される。本発明は、薬学的又は獣医学的に許容される担体若しくはビヒクルと薬剤を結合させるステップを含む、医薬組成物の調製方法まで拡大される。

【0210】

投与
本発明の医薬組成物は、経口、直腸、鼻内、気管支内、局所（口腔及び舌下）、膣又は非経口（皮下、筋内、静脈内、動脈内及び皮内）、腹腔内若しくは髄腔内投与のために改変してもよい。製剤は、静脈内又は皮下投与される製剤であるのが好ましい。

【0211】

製剤は、単位剤形、すなわち、単位用量、又は単位用量の複数若しくは部分単位を含有する個別の部分の形態で、好都合に提供することができる。例として、製剤は、錠剤及び徐放性カプセルの形態であってよく、薬学の分野で公知の任意の方法により調製することができる。

【0212】

本発明における経口投与用の製剤は、各々が予定量の活性剤を含有するカプセル、ゲル剤（ｇｅｌｌｕｌｅｓ）、ドロップ剤、カシェ、ピル又は錠剤などの個別単位として；粉末若しくは顆粒として；水性液体又は非水性液体中の活性剤の溶液、乳剤若しくは懸濁液として；又は水中油形乳剤若しくは油中水形乳剤として；或いはボーラスなどとして提供することができる。これらの組成物は、１用量当たり１〜２５０ｍｇの活性成分を含有するのが好ましく、１０〜１００ｍｇの活性成分を含有するのがより好ましい。

【0213】

経口投与（例えば、錠剤及びカプセル）用の組成物の場合には、「許容される担体」という用語は、一般的賦形剤（例えば、結合剤）などのビヒクル、例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカンス、ポリビニルピロリドン（Ｐｏｖｉｄｏｎｅ）、メチルセルロース、エチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、スクロース及びデンプン；充填剤及び担体、例えば、トウモロコシデンプン、ゼラチン、ラクトース、スクロース、微晶質セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウム及びアルギニン酸；並びに潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム及びその他の金属ステアリン酸塩、ステアリン酸グリセロールステアリン酸、シリコーンオイル、タルクワックス、オイル類及びコロイドシリカを包含する。ペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリー風味などの香味料を用いることもできる。剤形を容易に識別できるようにするために、着色料を添加するのが望ましい場合もある。また、当技術分野で公知の方法により、錠剤をコーティングしてもよい。

【0214】

任意選択で１つ又は複数の補助成分と一緒に、圧縮又は成形することにより錠剤を製造することができる。圧縮錠剤は、任意選択で結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤若しくは分散剤と混合した粉末又は顆粒などの易流動形態の活性剤を、好適な機械で圧縮することにより製造することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿潤させた粉末状の化合物の混合物を、好適な機械で成形することにより製造することができる。錠剤はまた、任意選択でコーティングするか、又は目盛りを付けてもよく、活性剤の緩徐な又は制御された放出を可能にするように製剤化してもよい。

【0215】

経口投与に好適な他の製剤としては、香味基材、通常、スクロース及びアカシア若しくはトラガカンス中に活性剤を含むロゼンジ；ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシアなどの不活性基材中に活性剤を含むトローチ；並びに好適な液体担体中に活性剤を含む洗口液が挙げられる。

【0216】

他の投与形態は、静脈内、動脈内、髄腔内、皮下、皮内、腹腔内又は筋内に注射することができ、滅菌若しくは滅菌可能な溶液から調製される溶液又は乳剤を含む。注射可能な形態は、典型的に、１用量当たり１０〜１０００ｍｇの活性成分を含有し、１０〜２５０ｍｇの活性成分を含有するのが好ましい。

【0217】

本発明の医薬組成物は、座薬、ペッサリー、懸濁液、乳剤、ローション、軟膏、クリーム、ゲル、スプレー、溶液又は粉剤の形態であってもよい。

【0218】

経皮投与の別の手段は、皮膚パッチの使用によるものである。例えば、活性成分をポリエチレングリコール又は液体パラフィンの水性乳剤からなるクリームに含有させることができる。また、必要に応じて上記安定剤及び防腐剤と一緒に、白色ワックス又は白色ワセリン基材からなる軟膏に１〜１０重量％の濃度で活性成分を含有させることもできる。

【0219】

これに代わる製剤化戦略は、経口又は座薬経路に好適な調製物を提供し得る。投与経路は、効果を最適化する、又は副作用を最小限にするために、治療の物理化学的特徴により、疾患の具体的考察事項によって決定することができる。

【0220】

さらに別の投与方法は、留置デバイスの事前のコーティング、或いはそうでなければ、デバイスへの含有を使用するものであり、その際、抗体の最適量は、適切な実験によって決定される。

【0221】

本発明の一部の好ましい実施形態における抗体分子は、Ｆａｂ又はｓｃＦｖなどのモノマー断片である。こうした抗体断片は、比較的短い半減期の特徴を有してもよい。

【0222】

投与量
当業者は、過度の実験なしに、被験者に投与する、本発明の組成物のうちの１つの適切な用量を容易に決定することができる。典型的には、医師は、個別の患者について最も好適となる実際の投与量を決定することができ、これは、使用される特定の薬剤の活性、薬剤の代謝安定性及び作用の長さ、年齢、体重、健康状態、性別、食事、投与方法及び時間、排出速度、薬物併用、特定の状態の重症度、並びに受療中の個別の療法を含む様々な要因に応じて変動し得る。

【0223】

本発明に従って、記載の組成物を個々の患者に投与することができる。投与は、「治療有効量」であるのが好ましく、これは、患者に対する利益を示すうえで十分なものである。こうした利益は、少なくとも１つの症状の少なくとも改善であってよい。投与される実際の量、及び投与の頻度及び時間設定は、治療対象の性質及び重症度に応じて変動し得る。治療の処方、例えば、投与量の決定は、一般開業医及びその他の医師の責任の範囲内である。抗体の適切な用量は、当技術分野において公知であり；Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４７：６５９−６６４；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ４：９１５−９２２を参照されたい。

【0224】

正確な用量は、抗体が診断若しくは治療用のいずれであるか、治療しようとする部位の大きさ及び位置、抗体の正確な性質（例えば、全抗体、抗体断片若しくはダイアボディ）、並びに抗体に結合させたあらゆる検出可能な標識又はその他の分子の性質を含む、いくつかの要因に応じて変動し得る。典型的な抗体用量を静脈内へのボーラスとして投与してもよい。その他の投与方法としては、同様の合計累積用量を達成する、数時間にわたる静脈内注入がある。これは、成人患者の単一の治療のための用量であり、小児及び乳幼児の場合には比例的に調節することができ、また、他の抗体フォーマットについても分子量に合わせて調節してよい。治療は、医師の判断で、毎日、週２回、毎週又は毎月の間隔で反復することができる。

【0225】

本明細書に開示する投与量は、平均的な症例の例示的なものである。勿論、これよりより高い又は低い投与量範囲が望ましい個別の事例もあり得るが、それも本発明の範囲に含まれる。

【0226】

本発明に従い、Ａｘｌを阻害するために、有効量の薬剤を投与することができる。勿論、この投与量は、薬剤の投与の種類に応じてさらに変更され得る。例えば、急性病患者治療のための「有効量」を達成するためには、非経口投与が好ましい。水若しくは通常の食塩水中５％デキストロース中の化合物、又は好適な賦形剤を含む類似の製剤の静脈内注入が最も有効であるが、筋内ボーラス注射も有用である。典型的には、非経口用量は、キナーゼを阻害するか、又は標的受容体を飽和させるのに有効な濃度で血漿中に薬物の濃度を維持するように、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ；好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｋｇであろう。薬剤は、約０．４〜約４００ｍｇ／ｋｇ／日の１日総用量を達成するようなレベルで、毎日１〜４回投与することができる。治療的に有効である活性剤の正確な量、及びこうした薬剤が最適に投与される経路は、薬剤の血中レベルを、治療効果の呈示に必要な濃度と比較することによって、当業者により容易に決定される。

【0227】

本発明の薬剤は、薬物の濃度が、本明細書に開示する治療適応の１つ又は複数を達成するのに十分であるように、患者に経口投与してもよい。典型的には、薬剤を含有する医薬組成物は、患者の状態に合わせて、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇの経口用量で投与される。経口用量は、約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇであるのが好ましい。

【0228】

本発明の薬剤は、所与の薬理学的効果を呈するのに必要な薬剤の濃度を決定する複数の生物学的アッセイの１つで試験することもできる。

【0229】

併用療法
組成物は、単独で、又は治療しようとする状態に応じて同時に若しくは順次、他の療法と組み合わせて投与してもよい。例えば、本発明の抗体若しくはそのコンジュゲートを抗癌単剤療法として、又は後述する他の癌療法との併用療法で使用してもよい。他の療法は、非ステロイド抗炎症薬（例えば、アスピリン、イブプロフェン若しくはケトプロフェン）又はモルヒネなどのオピエートなどの鎮痛薬、或いは制吐薬の好適量の投与を含み得る。

【0230】

好ましい態様では、本発明の抗体（又はそのコンジュゲート）を、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）などの免疫チェックポイント調節剤（ＩＣＭ）と組み合わせて投与する。典型的には、ＩＣＭは、標的受容体に結合する、アプタマー又は抗体などの薬剤である。

【0231】

本発明の抗体（又はそのコンジュゲート）と組み合わせて使用されるＩＣＭは、当技術分野で知られているいずれの好適なＩＣＭであってもよい。特に、好適な免疫チェックポイント調節剤として、以下のものが挙げられる：
イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）及びトレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）などのＣＴＬＡ−４ターゲティング剤。
ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ミボルマブ（Ｍｉｖｏｌｕｍａｂ）及びＡＭＰ−５１４／ＭＥＤＩ０６８０などのＰＤ−１ターゲティング剤。
ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ及びＢＭＳ−９３６５５９などのＢＤ−Ｌ１ターゲティング剤。
ウレルマブ（Ｕｒｅｌｕｍａｂ）及びＰＦ−０５０８２５６６などの４−１ＢＢターゲティング剤。
ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ６３８３（ｒＯＸ４０Ｌ）及びＭＯＸＲ０９１６などのＯＸ−４０ターゲティング剤。
ＴＲＸ５１８などのＧＩＴＲターゲティング剤。
ＣＤＸ−１１２７などのＣＤ２７ターゲティング剤。
ＣＰ−８７０、８９３などのＣＤ４０ターゲティング剤。
ＢＭＳ−９８６０１６などのＬＡＧ３ターゲティング剤。

【0232】

免疫系における阻害経路である免疫チェックポイントは、腫瘍により、免疫耐性を誘導するように利用される恐れがある。Ｔ細胞刺激及び阻害受容体並びに樹状細胞刺激受容体などの免疫チェックポイントを阻止又は調節し、これにより、癌の免疫耐性を低減又は逆転させる薬剤の使用が、癌研究において重要な手段である。

【0233】

ＩＣＭの使用により調節され得るＴ細胞刺激性受容体としては、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＴＷＥＡＫＲ、ＨＶＥＭ及びＴＩＭ−１が挙げられる。ＩＣＭの使用により調節され得るＴ細胞阻害性受容体としては、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３及びＴＩＧＩＴが挙げられる。ＩＣＭの使用により調節され得る樹状細胞刺激性受容体としては、ＣＤ４０及び４−１ＢＢが挙げられる。

【0234】

ＩＣＭの組み合わせを、本発明の抗体（又はそのコンジュゲート）と一緒に使用する場合、ＩＣＭの全てが阻害性受容体をターゲティングするか、使用するＩＣＭの全てが刺激性受容体をターゲティングするか、又は阻害性受容体及び刺激性受容体ターゲティングＩＣＭの組み合わせを用いるかのいずれでもよい。

【0235】

このように、癌の治療方法に用いられる本発明の抗体（又はそのコンジュゲート）が提供され、この治療は、１種又は複数種のＩＣＭを投与するステップをさらに含む。同様に、癌治療のための薬剤の製造における本発明の抗体（又はそのコンジュゲート）の使用が提供され、この治療は、１種又は複数種の免疫チェックポイント調節剤を投与するステップをさらに含む。

【0236】

癌を治療する方法に用いられる本発明の抗体（若しくはそのコンジュゲート）、又は癌の治療のための薬剤の製造における上記抗体（若しくはそのコンジュゲート）の使用も提供され、この治療は、以下：イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、トレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ミボルマブ（Ｍｉｖｏｌｕｍａｂ）、ＡＭＰ−５１４／ＭＥＤＩ０６８０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＢＭＳ−９３６５５９、ウレルマブ（Ｕｒｅｌｕｍａｂ）、ＰＦ−０５０８２５６６、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ６３８３（ｒＯＸ４０Ｌ）、ＭＯＸＲ０９１６、ＴＲＸ５１８、ＣＤＸ−１１２７、ＣＰ−８７０、８９３及びＢＭＳ−９８６０１６から選択される１種又は複数種の免疫チェックポイント調節剤をさらに含む。

【0237】

本発明の抗体（又はそのコンジュゲート）は、１種又は複数種のＩＣＭの前、１種又は複数種のＩＣＭと同時に、又は１種又は複数種のＩＣＭの後に投与することができる。

【0238】

癌の治療の方法に用いられる本発明の抗体（若しくはそのコンジュゲート）、又は癌の治療のための薬剤の製造における上記抗体（若しくはそのコンジュゲート）の使用も提供され、この治療は、１種又は複数種のＩＣＭをさらに含み、癌は、肺癌、黒色腫、乳癌、卵巣癌若しくは癌腫から選択される。

【0239】

併用療法での使用に好適な薬剤
これらの薬剤として、以下のものが挙げられる：アルキル化剤、例えば、ブスルファンなどのスルホン酸アルキル；
クロラムブシル、シクロホスファミド、エストラムスチン、イソスファミド、メクロレタミン、メルファラン、及びウラムスチンなどのナイトロジェンマスタード、チオテパなどのエチレンイミン誘導体；
カルムスチン、ロムスチン、及びストレプトゾシンなどのニトロソウレア、ダカルバジン、プロカルバジン、及びテモゾールアミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）などのトリアゼン；
シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、及びピコプラチン、オナプラチン（ｏｎｎａｐｌａｔｉｎ）、テトラプラチン、スピロプラチン、イプロプラチン、クロロ（ジエチレンジアミノ）−塩化白金（ＩＩ）、ジクロロ（エチレンジアミノ）−白金（ＩＩ）、ジアミノ（２−エチルマロナト）白金（ＩＩ）、（１，２−ジアミノシクロヘキサン）マロナト白金（ＩＩ）、（４−カルボキシフタロ）−（１，２−ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）、（１，２−ジアミノシクロヘキサン）−（イソシトラト）白金（ＩＩ）、及び（１，２−ジアミノシクロヘキサン）−シス−（ピルバト）白金（ＩＩ）などの白金化合物；
メトトレキサート、ペルメトレキセド、ラルチトレキセド、及びトリメトキセドなどの抗葉酸化合物を含む抗代謝物；
アザシチジン、カペシタビン、シタラビン、エダトレキセート、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、及びトロキサシタビンなどのピリミジン類似体；
クラドリビン、クロロデオキシアデノシン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチン、及びチオグアニンなどのプリン類似体；
ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ポルフィロマイシンなどの抗腫瘍抗生物質、並びにダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、及びバルルビシンなどのアントラサイクリンを含む天然産物；
ビンカアルカロイド、ビンブラスチン、ビンベシル、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビンなどの有糸分裂阻害剤；
Ｌ−アスパラギナーゼ及びＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素；
タキサンパクリタキセル及びドセタキセルなどの微小管ポリマー安定剤；
カンプトテシンイリノテカン及びテポテカンなどのトポイソメラーゼＩ阻害剤；ポドフィロトキシン、アムサクリン、エトポシド、テニポシド、ロソキサントロン及びアクチノマイシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤；
フルオキシメステロン及びテストラクトンなどのアンドロゲンを含むホルモン及びホルモンアンタゴニスト、
ビカルタミド、シプロテロン、フルタミド、及びニルタミドなどの抗アンドロゲン；
デキサメタゾン及びプレドニゾンなどのコルチコステロイド；
アミノグルテチミド、アナストロゾール、エキセメスタン、ホルメスタン、及びレトロゾールなどのアロマターゼ阻害剤；
ジエチルスチルベストロールなどのエストロゲン；
フルベストラント、ラロキシフェン、タモキシフェン、及びトレミフィンなどの抗エストロゲン；
アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、ロイプロリド、ヒストレリン、デソレリン、酢酸ナファレリン及びトリプトレリンなどの黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト及びアンタゴニスト；
メドロキシプロゲステロン酢酸エステル及び酢酸メゲストロールなどプロゲスチン、並びにレボチロキシン及びリオチロニンなどの甲状腺ホルモン；
ペリホシン、エンザスタウリン塩酸塩、及びトリシルビンを含むＰＫＢ経路阻害剤；
セマフォア（ｓｅｍａｐｈｏｒｅ）及びＳＦ１１２６などのＰＩ３Ｋ阻害剤；
ラパマイシン及び類似体などのｍＴＯＲ阻害剤；
セリシクリブ、アルボシジブ、及び７−ヒドロキシスタウロスポリンなどのＣＤＫ阻害剤；
セレコキシブなどのＣＯＸ−２阻害剤；
トリコスタチンＡ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、及びクラミドシンなどのＨＤＡＣ阻害剤；
テモゾロミドなどのＤＮＡメチラーゼ阻害剤；並びに
アルトレタミン、三酸化ヒ素、サリドマイド、レナリドミド、硝酸ガリウム、レバミゾール、ミトタン、ヒドロキシ尿素、オクトレオチド、プロカルバジン、スラミン、メトキサレン及びナトリウムポルフィマーなどの光作用性化合物、並びにボルテゾミブなどのプロテアソーム阻害剤を含むその他の多種薬剤。

【0240】

以下を含む分子標的療法薬：
機能性治療薬、例えば、遺伝子治療薬；
アンチセンス療法薬；
エルロチニブ塩酸塩、ゲフィチニブ、イマチニブメシレート、及びセマキサニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤；
ソラフェニブなどのＲＡＦ阻害剤；
レチノイド及びレキシノイドなどの遺伝子発現調節剤、例えば、アダパレン、ベキサロテン、トランス−レチノイン酸、９−シス−レチノイン酸、及びＮ−（４−ヒドロキシフェニル）レチンアミド；
アレムツマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン、リツキシマブ、及びトラスツズマブなどのモノクローナル抗体を含む表現型指定療法薬；
エムタンシンなどの免疫毒素、Ｉ−トシツモバブなどの放射性免疫複合体、本明細書に記載する分子標的のいずれか１つをターゲティングする結合剤、例えば、アプタマー、
並びに癌ワクチン。

【0241】

以下を含む生物学的療法薬：
インターフェロン−［α］２ａ及びインターフェロン−［α］２ｂなどのインターフェロン、並びにアルデスロイキン、デニロイキンジフチトクス、及びオプレルベキンなどのインターロイキン。１−（６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［６，７］シクロヘプタ［１，２−ｃ］ピリダジン−３−イル）−Ｎ３−（（７−（Ｓ）−ピロリジン−１−イル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アニュレン−２−イル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３，５−ジアミン（ＢＧＢ３２４／Ｒ４２８）、スイス特許第５４５１０９８号明細書（Ｒｏｃｈｅ）、並びにＰＣＴ／米国特許出願第０７／０８９１７７号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０２１２７５号明細書、及びＰＣＴ／欧州特許第２０１１／００４４５１号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているＡｘｌ阻害剤。

【0242】

癌細胞に対して作用することを目的とするこれらの薬剤に加えて、抗癌療法薬は、保護及び補助剤の使用を含み、このようなものとして以下のものがある：
アミホスチン、及びデキスラゾキサンなどの細胞保護剤；
パミドロン酸塩及びゾレドロン酸などのホスホン酸塩；並びに
エポエチン、ダルベオペチン、フィルグラスチム、ＰＥＧ−フィルグラスチム、及びサルグラモスチムなどの刺激因子。

【0243】

多くの併用化学療法が当技術分野で公知であり、例えば、単独で、又はカルボプラチンなどとさらに組み合わせた、カルボプラチン／パクリタキセル、カペシタビン／ドセタキセル、フルオロウラシル／レバミソール、フルオロウラシル／ロイコボリン、メトトレキサート／ロイコボリン、及びトラスツズマブ／パクリタキセルがある。

【0244】

本明細書全体を通して、本明細書に記載する方法をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで実施する。

【0245】

本発明は、本明細書に記載の抗体とＡｘｌの結合を起こすか、又はそれを可能にする方法を提供する。記載するように、こうした結合は、例えば、抗体、若しくは抗体をコードする核酸の投与後に、ｉｎ ｖｉｖｏで起こってもよく、又は例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット分析、免疫細胞化学、免疫組織化学、免疫沈降若しくはアフィニティークロマトグラフィーにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施してもよい。

【0246】

Ａｘｌ受容体に結合した抗体の量を測定することができる。定量は、試験サンプル中の抗原の量に関連してもよく、これは診断を目的とするものでもよい。

【0247】

サンプル中の抗体の反応性は、任意の適切な手段により測定することができる。放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）は、１つの可能性である。放射性標識抗原を非標識抗原（試験サンプル）と混合して、抗体との結合を可能にする。結合抗原を非結合抗原から物理的に分離して、抗体に結合した放射性抗原の量を測定する。試験サンプル中に多くの抗原が存在するほど、放射性抗原が抗体に結合する量は少なくなる。また、リポータ分子に連結した抗原又は類似物を用いて、非反応性抗原と一緒に競合結合アッセイを使用してもよい。リポータ分子は、スペクトル分離吸収又は発光特性を有する蛍光色素、蛍光体又はレーザ色素であってもよい。好適な蛍光色素として、フルオロセイン、ローダミン、フィコエリスリン及びテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）が挙げられる。好適な色素原色素として、ジアミノベンジジンが挙げられる。

【0248】

その他のリポータとして、着色された、磁気若しくは常磁性のラテックスビーズなどの高分子コロイド粒子若しくは粒子状材料、並びに検出可能なシグナルの視覚的観察、電子的検出又は記録を直接若しくは間接的に可能にする生物学的若しくは化学的に活性の薬剤が挙げられる。これらの分子は、例えば、発色若しくは変色を起こすか、又は電気的性質に変化を引き起こす反応を触媒する酵素であってもよい。これらは、エネルギー状態の間の電子遷移によって、特有のスペクトル吸収又は発光が起こるように、分子的に励起性であってもよい。これらは、バイオセンサーと一緒に用いられる化学的実体を含んでもよい。ビオチン／アビジン又はビオチン／ストレプトアビジン及びアルカリホスファターゼ検出系を使用してもよい。

【0249】

さらに別のリポータとして、ＤＮＡタグが挙げられる。これらのタグは、例えば、ｑＰＣＲによって、容易に定量することができる。

【0250】

サンプル中の関連抗体結合の定量可能な絶対又は相対データを取得するために、個別の抗体−リポータコンジュゲートにより生成されるシグナルを用いてもよい。

【0251】

本発明はまた、競合アッセイで抗原レベルを測定するための前述の抗体、すなわち、競合アッセイにおいて本発明により提供される抗体を使用することによって、サンプル中の抗原のレベルを測定する方法も提供する。これは、非結合抗原からの結合抗原の物理的分離が必要ない場合であってもよい。抗体にリポータ分子を連結して、結合に物理的又は光学的変化が起こるようにすることは、１つの可能性である。リポータ分子は、検出可能で、好ましくは測定可能なシグナルを、直接又は間接的に生成し得る。リポータ分子の結合は、直接若しくは間接的、例えば、ペプチド結合を介した共有結合、又は非共有結合であってよい。ペプチド結合を介した結合は、抗体及びリポータ分子をコードする遺伝子融合物の組換え発現の結果として起こり得る。

【0252】

本発明はまた、例えば、バイオセンサー系で本発明の抗体を使用することにより、抗原のレベルを直接測定することも可能にする。

【0253】

結合を測定する方法(mode)は、本発明の特徴ではなく、当業者は、その優先事項及び一般的知識に従って好適な方法を選択することができる。

【0254】

本発明はさらに、抗原に結合し、且つ実質的に本明細書に記載される通りのアミノ酸を有するＣＤＲを含む抗体可変ドメイン（ＶＨ若しくはＶＬのいずれか又は両方）、或いは実質的に本明細書に記載される通りのアミノ酸配列を有する可変ドメインを含むいずれかの抗体と、Ａｘｌに対する結合について競合する抗体も包含する。抗体同士の競合は、例えば、他の非タグ付け結合メンバーの存在下で検出することができる１結合メンバーに、特定のリポータ分子をタグ付けして、同じエピトープ若しくはオーバーラップエピトープに結合する抗体の識別を可能にすることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで容易にアッセイすることができる。競合は、例えば、ＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリーを用いて決定することができる。或いは、競合抗体は、実施例５に記載するように、Ｂｉａｃｏｒｅ計器を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により見出すことができる。

【0255】

競合の試験において、抗原のペプチド断片、特に、目的のエピトープを含むペプチドを使用してもよい。エピトープ配列を有し、且ついずれかの末端に１つ又は複数のアミノ酸が加わったペプチドを用いてもよい。こうしたペプチドは、指定の配列から「本質的に構成される」と言う場合もある。本発明の抗体は、抗原に対するその結合が、所与の配列を有する、又はそれを含むペプチドによって阻害される。これについての試験で、１つ又は複数のアミノ酸が加わったいずれかの配列を有するペプチドを用いてもよい。

【0256】

特定のペプチドに結合する抗体は、例えば、ペプチドのパンニング(panning)によりファージディスプレイライブラリーから単離することができる。

【0257】

本発明はさらに、本発明の抗体をコードする単離された核酸も提供する。核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。好ましい態様では、本発明は、前文に定義したように、本発明のＣＤＲ、ＶＨ若しくはＶＬドメインをコードする核酸を提供する。

【0258】

本発明はまた、前述した少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写若しくは発現カセットの形態の構築物も提供する。

【0259】

本発明はさらに、前述した１つ又は複数の構築物を含む組換え宿主細胞も提供する。記載するいずれかのＣＤＲ、ＶＨ若しくはＶＬドメイン、又は抗体をコードする核酸は、それ自体で本発明の態様を形成し、また、コードされた産物の生成方法も同様であり、この方法は、生成のためにコード核酸からの発現を含む。発現は、核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより、達成するのが好都合である。発現による生成後、当技術分野で公知のいずれかの好適な技術を用いて、ＶＨ若しくはＶＬドメイン、又は抗体を単離及び／又は精製することができる。

【0260】

本発明の抗体、ＶＨ及び／又はＶＬドメイン、並びにコード核酸分子及びベクターは、例えばそれらの天然の環境から単離及び／又は精製され、実質的に純粋又は均質な形態で、或いは核酸の場合には、必要とされる機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の元の核酸若しくは遺伝子を含まないか、実質的に含まずに提供することができる。本発明の核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含んでもよく、完全又は部分的に合成であってもよい。本明細書に記載するヌクレオチド配列と言うとき、文脈から別の意味に解釈すべき場合を除いて、これは、指定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、ＴがＵに置換されている指定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。

【0261】

多様な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローン化及び発現のための系はよく知られている。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、酵母、バキュロウイルス、及び昆虫細胞系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のために当技術分野で入手可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒーラ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳ０及びＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト細胞株ＨＥＫ−２９３及びＰＥＲ．Ｃ６並びにその他多種がある。一般的な好ましい細菌宿主は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。

【0262】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞における抗体及び抗体断片の発現は、当技術分野で十分に確立されている。詳細については、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｂｉｏ／ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５−５５１（１９９１）を参照されたい。培養中の真核細胞における発現も、抗体生成のための選択肢として当業者には利用可能であり、詳細については、例えば、Ｒｅｆ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３−５７６；Ｔｒｉｌｌ Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ６：５５３−５６０を参照されたい。

【0263】

プロモータ配列、ターミネータ配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカ遺伝子及び必要に応じた他の配列などの適切な調節配列を含有する好適なベクターを選択又は構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージ、又はファージミドであってもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、シーケンシング、細胞へのＤＮＡの導入及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析が、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２に詳しく記載されている。

【0264】

従って、本発明の別の態様は、本明細書で開示される核酸を含有する宿主細胞を提供する。さらに別の態様は、宿主細胞にこうした核酸を導入するステップを含む方法を提供する。導入には、いずれの利用可能な技術を使用してもよい。真核細胞の場合、好適な技術として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクション、並びにレトロウイルス若しくはその他のウイルス、例えば、ワクシニア、又は昆虫細胞の場合には、バキュロウイルスを用いた形質導入が挙げられる。細菌細胞の場合には、好適な技術は、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、及びバクテリオファージを用いたトランスフェクションが挙げられる。

【0265】

導入の後に、例えば、遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸から発現を引き起こすか、又はそれを可能にすることができる。

【0266】

一実施形態では、本発明の核酸を宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）に組み込む。標準的技術に従って、ゲノムによる組換えを促進する配列の含有により、組み込みを促進することもできる。

【0267】

本発明は、前述のように抗体又はポリペプチドを発現するために、発現系において前述した構築物を用いることを含む方法も提供する。

【0268】

以下の実験を参照にしながら、本発明の態様及び実施形態を、例として説明する。

【0269】

本明細書のあらゆる箇所で引用される文献は全て、参照により組み込むものとする。

【0270】

発明の記述
以下のパラグラフに、いくつかの具体的に考慮される本発明の実施形態及び組み合わせを記載する。

【0271】

１．Ａｘｌに結合する抗体であって、
１Ｈ１２ＶＨドメイン（配列番号３）と、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨＣＤＲ３、及び任意選択で配列番号６及び配列番号５から選択されるアミノ酸配列を有する１つ又は複数のＶＨＣＤＲを含むＶＨドメインとからなる群から選択される抗体ＶＨドメイン；及び／又は
１Ｈ１２ＶＬドメイン（配列番号４）と、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有する１つ又は複数のＶＬＣＤＲを含むＶＬドメインとからなる群から選択される抗体ＶＬドメイン
を含む、抗体。

【0272】

２．配列番号５、配列番号６及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨＣＤＲを含む抗体ＶＨドメインを含み、Ａｘｌに対する結合について、１Ｈ１２ＶＨドメイン（配列番号３）及び１Ｈ１２ＶＬドメイン（配列番号４）を含む抗体のＡｘｌ結合ドメインと競合する、パラグラフ１に記載の抗体。

【0273】

３．１Ｈ１２ＶＨドメイン（配列番号３）を含む、パラグラフ１又はパラグラフ２に記載の抗体。

【0274】

４．１Ｈ１２ＶＬドメイン（配列番号４）を含む、パラグラフ３に記載の抗体。

【0275】

５．パラグラフ１〜４のいずれか１つに記載の抗体の変異体であって、１つ若しくは複数のフレームワーク領域及び／又は１つ若しくは複数のＣＤＲに１つ又は複数のアミノ酸配列改変を含む、変異体。

【0276】

６．１Ｈ１２ＶＨドメイン（配列番号３）及び１Ｈ１２ＶＬドメイン（配列番号４）により形成されるＡｘｌ抗原結合部位の親和性と等しいか、又はそれより良い親和性でＡｘｌに結合する、パラグラフ１〜５のいずれか１つに記載の抗体であって、抗体の親和性及び抗原結合部位の親和性が同じ条件下で測定される、抗体。

【0277】

７．ｓｃＦｖ抗体分子を含む、パラグラフ１〜６のいずれか１つに記載の抗体。

【0278】

８．抗体定常領域を含む、パラグラフ１〜６のいずれか１つに記載の抗体。

【0279】

９．全抗体を含む、パラグラフ８に記載の抗体。

【0280】

１０．単一ドメイン抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ミニボディ、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、タンデムｓｃＦｖ、ＴａｎｄＡｂ、バイボディ、トリボディ、κ（λ）ボディ、ＢｉＴＥ、ＤＶＤ−ｌｇ、ＳＩＰ、ＳＭＩＰ、又はＤＡＲＴなどの抗原結合抗体断片である、パラグラフ１〜６のいずれか１つに記載の抗体。

【0281】

１１．抗原に結合する能力に加えて、別の機能特性をもたらす追加アミノ酸を含む、パラグラフ１〜１０のいずれか１つに記載の抗体。

【0282】

１２．５×１０^−１１Ｍ以下のＫ_ＤでＡｘｌに結合する、パラグラフ１〜１１のいずれか１つに記載の抗体。

【0283】

１３．１．５×１０^−１１Ｍ以下のＫ_ＤでＡｘｌに結合する、パラグラフ１〜１１のいずれか１つに記載の抗体。

【0284】

１４．２×１０^−５ｓ^−１以下のＫ_ｏｆｆでＡｘｌに結合する、パラグラフ１〜１３のいずれか１つに記載の抗体。

【0285】

１５．３×１０^−６ｓ^−１以下のＫ_ｏｆｆでＡｘｌに結合する、パラグラフ１〜１４のいずれか１つに記載の抗体。

【0286】

１６．ＡｘｌがヒトＡｘｌである、パラグラフ１〜１５のいずれか１つに記載の抗体。

【0287】

１７．霊長類Ａｘｌに特異的に結合する、パラグラフ１〜１６のいずれか１つに記載の抗体。

【0288】

１８．パラグラフ１〜１７のいずれか１つに記載の抗体であって、
（ｉ）１０^−３Ｍを超えるＫ_ＤでマウスＡｘｌに結合し；
（ｉｉ）１０^−３Ｍを超えるＫ_ＤでヒトＭｅｒに結合し；及び／又は
（ｉｉｉ）１０^−３Ｍを超えるＫ_ＤでヒトＴｙｒｏ３に結合する、抗体。

【0289】

１９．Ａｘｌアゴニストである、パラグラフ１〜１８のいずれか１つに記載の抗体。

【0290】

２０．Ａｘｌシグナル伝達が少なくとも１０％高い、パラグラフ１９に記載の抗体。

【0291】

２１．キメラ抗体である、パラグラフ１〜２０のいずれか１つに記載の抗体。

【0292】

２２．ヒト化抗体である、パラグラフ１〜２０のいずれか１つに記載の抗体。

【0293】

２３．（ｉ）１Ｈ１２抗体と同じエピトープ、又は
（ｉｉ）１Ｈ１２抗体により結合されるエピトープとオーバーラップするエピトープ
に結合する、パラグラフ１〜２２のいずれか１つに記載の抗体。

【0294】

２４．細胞表面に存在するＡｘｌと結合した後に内在化される、パラグラフ１〜２３のいずれか１つに記載の抗体。

【0295】

２５．検出可能な標識、酵素、又は毒素に、任意選択でペプチジル結合又はリンカーを介して結合される、パラグラフ１〜２４のいずれか１つに記載の抗体。

【0296】

２６．毒素が、ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦを含む群から選択される、パラグラフ２５に記載の抗体。

【0297】

２７．検出可能な標識がＦＩＴＣである、パラグラフ２５に記載の抗体。

【0298】

２８．パラグラフ１〜２４のいずれか１つに記載の抗体、又はパラグラフ１〜２４のいずれか１つに記載の抗体ＶＨ若しくはＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。

【0299】

２９．パラグラフ２８に記載の核酸で形質転換された宿主細胞。

【0300】

３０．抗体又は抗体ＶＨ若しくはＶＬドメインを生成する方法であって、前記抗体又は抗体ＶＨ若しくはＶＬドメインの生成のための条件下で、パラグラフ２９に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、方法。

【0301】

３１．前記抗体又は抗体ＶＨ若しくはＶＬ可変ドメインを単離するステップ及び／又は精製するステップをさらに含む、パラグラフ３０に記載の方法。

【0302】

３２．少なくとも１つの追加成分を含む組成物に、抗体又は抗体ＶＨ若しくはＶＬ可変ドメインを製剤化するステップ(formulating)をさらに含む、パラグラフ３０又はパラグラフ３１に記載の方法。

【0303】

３３．Ａｘｌに結合する抗体を取得する方法であって、
１Ｈ１２ＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３）における１つ又は複数のアミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入により、１つ又は複数のＶＨドメインであって、各々が１Ｈ１２ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体である１つ又は複数のＶＨドメインを提供し、任意選択で、このようにして提供された１つ又は複数のＶＨドメインアミノ酸配列変異体を、１つ又は複数のＶＬドメインと組み合わせて、１つ又は複数のＶＨ／ＶＬ組み合わせを提供するステップ；及び／又は
１Ｈ１２ＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号４）における１つ又は複数のアミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入により、１Ｈ１２ＶＬドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＬドメインを提供し、及びこのようにして提供された１つ又は複数のＶＬドメインアミノ酸配列変異体を、１つ又は複数のＶＨドメインと組み合わせて、１つ又は複数のＶＨ／ＶＬ組み合わせを提供するステップ；及び
ＶＨドメインアミノ酸配列変異体、又は１つ若しくは複数のＶＨ／ＶＬ組み合わせを試験して、Ａｘｌに結合する抗体を特定するステップ
を含む、方法。

【0304】

３４．Ａｘｌに結合する抗体を取得する方法であって、
置換しようとするＣＤＲ３を含むか、又はＣＤＲ３コード領域を欠失しているかのいずれかである１つ又は複数のＶＨドメインをコードする出発核酸を用意し、及び前記出発核酸を、配列番号７のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせるステップであって、それにより、前記ドナー核酸が出発核酸のＣＤＲ３領域に挿入されて、ＶＨドメインをコードする産物核酸を提供する、ステップ；又は
置換しようとするＣＤＲ３を含むか、又はＣＤＲ３コード領域を欠失しているかのいずれかである１つ又は複数のＶＬドメインをコードする出発核酸を用意し、及び前記出発核酸を、配列番号１０のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせるステップであって、それにより、前記ドナー核酸が出発核酸のＣＤＲ３領域に挿入されて、ＶＬドメインをコードする産物核酸を提供する、ステップ；
ＶＨドメインをコードする前記産物核酸の核酸を発現させ、及び任意選択で、このようにして生成されたＶＨドメインを、１つ又は複数のＶＬドメインと組み合わせて、ＶＨ／ＶＬ組み合わせを提供し、且つ／又はＶＬドメインをコードする前記産物核酸の核酸を発現させ、及びこのようにして生成されたＶＬドメインを、１つ又は複数のＶＨドメインと組み合わせて、ＶＨ／ＶＬ組み合わせを提供するステップ；
Ａｘｌに結合するＶＨドメイン又はＶＨ／ＶＬ組み合わせを含む抗体を選択するステップ；及び
Ａｘｌに結合する前記抗体、及び／又はＡｘｌに結合する抗体をコードする核酸を回収するステップ
を含む、方法。

【0305】

３５．Ａｘｌに結合する抗体が、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む抗体断片である、パラグラフ３３又はパラグラフ３４に記載の方法。

【0306】

３６．抗体断片がｓｃＦｖ抗体分子である、パラグラフ３５に記載の方法。

【0307】

３７．抗体断片がＦａｂ抗体分子である、パラグラフ３５に記載の方法。

【0308】

３８．全抗体に抗体断片のＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインをもたらすステップをさらに含む、パラグラフ３６又はパラグラフ３７に記載の方法。

【0309】

３９．Ａｘｌに結合する抗体、又はＡｘｌに結合する抗体の抗体ＶＨ若しくはＶＬ可変ドメインを、少なくとも１つの追加成分を含む組成物に製剤化するステップ(formulating)をさらに含む、パラグラフ３３〜３８のいずれか１つに記載の方法。

【0310】

４０．Ａｘｌに結合する抗体を、Ａｘｌ又はＡｘｌの断片に結合させるステップをさらに含む、パラグラフ３０〜３９のいずれか１つに記載の方法。

【0311】

４１．パラグラフ１〜２７のいずれか１つに記載のＡｘｌに結合する抗体を、Ａｘｌ又はＡｘｌの断片に結合させるステップを含む、方法。

【0312】

４２．前記結合がｉｎ ｖｉｔｒｏで起こる、パラグラフ４０又はパラグラフ４１に記載の方法。

【0313】

４３．Ａｘｌ又はＡｘｌの断片に対する抗体の結合の量を測定するステップを含む、パラグラフ４０〜４２のいずれか１つに記載の方法。

【0314】

４４．Ａｘｌの過剰発現を特徴とする疾患又は障害の治療のための薬剤の製造における抗体の使用をさらに含む、パラグラフ３０〜３９のいずれか１つに記載の方法。

【0315】

４５．別の治療薬と組み合わせたパラグラフ１〜２７のいずれか１つに記載の抗体、又はその免疫複合体。

【0316】

４６．薬学的に許容される賦形剤と一緒に、パラグラフ１〜２７のいずれか１つに記載の抗体、又はその免疫複合体を含む組成物。

【0317】

４７．別の治療薬をさらに含む、パラグラフ４６に記載の組成物。

【0318】

４８．別の治療薬が、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）などの免疫チェックポイント調節剤（ＩＣＭ）である、パラグラフ４５に記載の抗体又はパラグラフ４７に記載の組成物。

【0319】

４９．治療方法での使用のための、パラグラフ１〜２７、４５、若しくは４８のいずれか１つに記載の抗体、又はパラグラフ４６〜４８のいずれか１つに記載の組成物。

【0320】

５０．増殖性疾患を治療する方法での使用のための、パラグラフ４９に記載の抗体又は組成物。

【0321】

５１．増殖性疾患が、ＡＭＬなどの癌である、パラグラフ４０に記載の抗体又は組成物。

【0322】

５２．癌が転移性癌である、パラグラフ５１に記載の抗体又は組成物。

【0323】

５３．Ａｘｌの過剰発現を特徴とする疾患又は障害の治療のための薬剤の製造における、パラグラフ１〜２７、４５、若しくは４８のいずれか１つに記載の抗体、又はパラグラフ４６〜４８のいずれか１つに記載の組成物の使用。

【0324】

５４．Ａｘｌの過剰発現を特徴とする疾患又は障害の治療の方法であって、パラグラフ１〜２７、４５、若しくは４８のいずれか１つに記載の抗体、又はパラグラフ４６〜４８のいずれか１つに記載の組成物を、その疾患若しくは障害を有するか、又はその疾患若しくは障害を発症するリスクがある患者に投与するステップを含む、方法。

【0325】

５５．抗体が、転移性癌細胞をターゲティングするように医薬組成物の送達を指令する、パラグラフ５０に記載の方法。

【0326】

５６．Ａｘｌの過剰発現を特徴とする疾患又は障害の検出のための診断薬の製造における、パラグラフ１〜２７、４５、若しくは４８のいずれか１つに記載の抗体と、転移性癌細胞に対する前記抗体と結合の測定を可能にする１種又は複数種の試薬との使用。

【0327】

５７．Ａｘｌの過剰発現を特徴とする疾患又は障害の診断の方法であって、パラグラフ１〜２７、４５、若しくは４８のいずれか１つに記載の抗体、又はパラグラフ４６〜４８のいずれか１つに記載の組成物と、転移性癌細胞に対する前記抗体の結合の測定を可能にする１種又は複数種の試薬とを、上記の疾患若しくは障害を有するか、又は上記の疾患若しくは障害を発症するリスクがある患者に投与するステップを含む、方法。

【0328】

５８．パラグラフ１〜２７、４５、又は４８のいずれか１つに記載の抗体と、転移性癌細胞に対する前記メンバーの結合の測定を可能にする１種又は複数種の試薬とを含む、診断キット。

【0329】

５９．パラグラフ１〜２７、４５、若しくは４８のいずれか１つに記載の抗体、又はパラグラフ４６〜４８のいずれか１つに記載の組成物を含む、キット。

【0330】

６０．薬学的に許容される賦形剤と一緒に、有効量のパラグラフ１〜２７に記載の抗体を有効成分として含む、医薬組成物。

【実施例】

【0331】

実施例１：マウス抗Ａｘｌモノクローナル抗体の作製
ヒトＡｘｌ受容体に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインに融合したヒトＡｘｌの細胞外ドメインを含む組換え抗原で、免疫応答性ＯＦ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の免疫により作製した（ｒｈＡｘｌ−Ｆｃ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。

【0332】

血液中にｒｈＡｘｌ特異的抗体の存在を示すマウス由来の脾臓細胞を、標準的プロトコルに従ってマウス骨髄腫細胞との融合に用いた。ハイブリドーマ選択のために、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地を含むプレート内で（ウェル当たり１０^５細胞）細胞を培養した。１２日の選択後、上清を回収し、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）及びフローサイトメトリーにおいてＡｘｌ結合について試験した。５つの陽性クローンが、限界希釈による第２ラウンドのサブクローン化の後、最も高い抗原結合活性を示し、これらをｉｎ ｖｉｔｒｏでのラージスケール抗体生成のために増殖させた。プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーにより、細胞培養上清からＭＡｂを精製した。

【0333】

フローサイトメトリーでＡｘｌ^＋細胞に対する特異的結合を示す抗体クローン１Ｈ１２（図１）をさらなる特性決定のために選択した。

【0334】

フローサイトメトリーのために、培養中の接着細胞をＰＢＳで洗浄し、１分間のトリプシン（０．２５％）処理の後、完全な脱離のために培養皿をたたくことよって、脱離させた。組織培養フラスコ中に完全培地を添加することによりトリプシンをクエンチした後、細胞をＰＢＳで洗浄した。洗浄ステップ中に、２００ｇで５分の遠心分離により、細胞を回収した。０．０２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで総濃度のために抗体を希釈した。室温で２０分間１０^５個の細胞を含む２００μＬの細胞懸濁液を用いて、細胞染色を実施した。ＰＢＳ ０．０２％ＢＳＡを用いた２回の洗浄ステップの後、細胞を２００μＬに再懸濁させ、氷上に維持してから、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による分析に付した。

【0335】

実施例２：マウスモノクローナル抗体１Ｈ１２は、ヒトＴＡＭ受容体ファミリーの他のメンバーと交差反応しない
結合実験は全て、２５℃で、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００計器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施した。３９３．０、３０３．６及び３６４．０共鳴単位（ＲＵ）の表面密度でのアミン結合をそれぞれ用いて、ヒトＴＡＭ受容体ファミリーのメンバー、すなわち、Ａｘｌ（ｒｈＡｘｌ−Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．ｎｏ．１５４−ＡＬ）、Ｍｅｒ（ｒｈＭｅｒ−Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．ｎｏ．８９１−ＭＲ）及びＴｙｒｏ３（ｒｈＴｙｒｏ３／Ｄｔｋ−Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．ｎｏ．８５９−ＤＫ）に対応する可溶性組換え抗原をＣＭ５センサーチップの表面に固定化した。Ｂｉａｃｏｒｅランは、結合分析ウィザードを用いて、自動式で実施した。ＨＢＳ−ＥＰバッファー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に濃度１０μｇ／ｍＬでＭＡｂ１Ｈ１２を含有するサンプルを、抗原を固定化した表面に３０μＬ／分の流量で３分間注射し（結合）、その後５分間の解離を実施した。

【0336】

図２に示す結果は、ヒトＡｘｌとの特異的相互作用を示すと共に、組換えヒトＭｅｒ及びＴｙｒｏ３抗原との結合がないことを明らかにしている。

【0337】

実施例３：マウスモノクローナル抗体１Ｈ１２は、マウスＡｘｌと交差反応しない
結合実験は、２５℃で、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００計器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施した。１，３０８．０、２，１１５．９及び１，４２９．０ＲＵの表面密度でのアミン結合をそれぞれ用いて、ヒトＡｘｌ（ｒｈＡｘｌ−Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．ｎｏ．１５４−ＡＬ）、マウスＡｘｌ（ｒｍＡｘｌ−Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｃａｔ．ｎｏ．８５４−Ａｘ）及びヒトＴｙｒｏ３（ｒｈＴｙｒｏ３／Ｄｔｋ−Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．ｎｏ．８５９−ＤＫ）に対応する可溶性組換え抗原をＣＭ５センサーチップの表面に固定化した。Ｂｉａｃｏｒｅランは、結合分析ウィザードを用いて、自動式で実施した。

【0338】

ＨＢＳ−ＥＰバッファー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に濃度１０μｇ／ｍＬでＭＡｂ１Ｈ１２又は組換えマウス（ｒｍ）Ａｘｌ−リガンドＧａｓ６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．ｎｏ．９８６−ＧＳ／ＣＦ）のいずれかを含有するサンプルを、抗原を固定化した表面に３０μＬ／分の流量で３分間注射し（結合）、その後５分間の解離を実施した。

【0339】

図３に示す結果は、ヒトＡｘｌとＭＡｂ１Ｈ１２の特異的相互作用を示すと共に、組換えマウスＡｘｌ及びヒトＭｅｒ抗原との結合がないことを明らかにしている（図３、上部パネル）。対照的に、対照として用いたマウスＧａｓ６は、ヒト及びマウスＡｘｌの両方に結合する強力な結合と、ヒトＴｙｒｏ３に対するやや弱い結合とを明らかにしている（図３、下部パネル）。

【0340】

実施例４：マウスモノクローナル抗体１Ｈ１２の親和性測定
Ｂｉａｃｏｒｅ３０００計器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた表面プラズモン共鳴測定により、抗Ａｘｌ抗体１Ｈ１２の親和性測定を２５℃で実施した。抗原を塗布した固体表面として、密度１９０ＲＵで固定化したｒｈＡｘｌ−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．ｎｏ．１５４−ＡＬ）を有するセンサーチップＣＭ５を使用した。

【0341】

反応速度測定のために、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｃａｔ．ｎｏ．ＢＲ−１００１−８８）中の様々な濃度の抗Ａｘｌ ＭＡｂ１Ｈ１２（１．３〜６６６．７ｎＭ）を注射時間３分、３０μＬ／分の流量で注射した後、５分の解離（バッファーのみ）を行った。各サイクルの後、流量５０μＬ／分の再生溶液（１０ｍＭ ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ）の３０秒の注射により、表面を再生した。

【0342】

物質移動制御実験によって、ＭＡｂ１Ｈ１２の有意な物質移動制限が存在しないことが判明した。別の関連反応制御実験では、解離相（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）が、１、３若しくは２０分間の注射又は１検体濃度（１．８μＭ若しくは２７０μｇ／ｍＬ）の注射後にほぼ同じであったことから、ＭＡｂ１Ｈ１２の関連反応は明らかにされなかった。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア及び１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを用いて、動力学的結合（結合速度、ｋ_ｏｎ）及び解離（解離速度、ｋ_ｏｆｆ）を計算した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）をｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ比として計算した。形成された抗体−抗原複合体の半減期（ｔ_１／２）は、ｌｎ２／ｋ_ｏｆｆ比として計算した。

【0343】

図４に示すように、マウスＭＡｂ１Ｈ１２は、非常に低い解離速度（ｋ_ｏｆｆ＝１．０７×１０^−５１／ｓ）のために、非常に高い親和性（Ｋ_Ｄ＝４．９８×１０^−１１Ｍを示し、これによって、１８時間という１Ｈ１２／Ａｘｌ複合体の半減期が得られた。

【0344】

実施例５：マウスモノクローナル抗体１Ｈ１２は、Ａｘｌに対するＧａｓ６の結合を阻止しない
Ｂｉａｃｏｒｅ３０００計器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＢｉｎｄｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓウィザードを用い、２つのサンプルの数サイクルの注射により、競合結合試験を実施した。第１のサンプルとして、飽和濃度のＭＡｂ１Ｈ１２（１．８μＭ又は２７０μｇ／ｍＬ）を、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃを塗布した（アミン結合を用いて）ＣＭ５センサーチップの表面に３０μＬ／分の流量で３分間注射してから、２．５分の安定化（ＨＢＳ−ＥＰバッファーのみ）の後、第２のサンプルを注射した。次の第２サンプルを使用した：組換えヒト（ｒｈ）Ｇａｓ６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．ｎｏ．８８５−ＧＳ）、組換えマウス（ｒｍ）Ｇａｓ６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．ｎｏ．９８６−ＧＳ／ＣＦ）及び１群の抗Ａｘｌ抗体（Ｍａｂ１、２、３）；全て濃度２５μｇ／ｍＬ。対照として、ＭＡｂ１Ｈ１２を第２サンプルとして同じ条件下（２５μｇ／ｍＬ）で使用した。第２サンプルを３分間注射してから、２．５分の安定化（バッファーのみ）の後、流量５０μＬ／分の再生溶液（１０ｍＭ ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ）の３０秒の注射により、表面の再生を行った。

【0345】

図５に示す結果から、ＭＡｂ１Ｈ１２が、Ａｘｌ結合について、Ｇａｓ６（ヒト及びマウスの両方）並びに実験で用いたいかなるその他の抗Ａｘｌ抗体とも競合しなかったことが判明した。

【0346】

実施例６：マウスモノクローナル抗体１Ｈ１２は、ウェスタンブロット分析において、変性された還元及び非還元変性Ａｘｌの両方に結合する
ウェスタンブロット分析のために、推定分子量が７１．７ｋＤａ（還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける１００〜１１０ｋＤａに相当）の組換えヒト（ｒｈ）Ａｘｌ−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．ｎｏ．１５４−ＡＬ）と、推定分子量が７８．９ｋＤａ（還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける１００〜１１０ｋＤａに相当）のｒｈＭｅｒ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．ｎｏ．８９１−ＭＲ）を抗原として用いた。抗原を含有するサンプルを還元剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在及び非存在下で変性させてから、ＮｕＰＡＧＥ３〜８％トリス−酢酸ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲル、１．０ｍｍ×１２ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルにロードした。分子量マーカとして、ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ＭＷマーカ（Ｎｏｖｅｘ ＬＣ５９２５）を使用した。

【0347】

推奨される条件（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）下でＴｒｉｓ−酢酸ＳＤＳランニングバッファーを用いて電気泳動を実施した後、２０％メタノールを含む転写バッファーを用いて、ＸＣｅｌｌ ＩＩ（商標）Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマニュアルに２つのゲルについて記載されている通りに、タンパク質をニトロセルロース膜上に転移させた。５％脱脂乳を含む１０ｍＬのブロッキングバッファー、すなわちＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）中で膜を室温にて１時間インキュベートした後、１μｇ／ｍＬのＭＡｂ１Ｈ１２を含有する５ｍＬのインキュベーションバッファー（３％脱脂乳を含むＴＢＳＴ）中、４℃で一晩インキュベートした。各々１０ｍＬのＴＢＳＴで膜を５分ずつ３回洗浄した後、５ｍＬのインキュベーションバッファー中でヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ結合二次抗体（１：３０００）と一緒に、穏やかに揺らしながら室温で１時間インキュベートした。その後、１０ｍＬのＴＢＳＴで５分ずつ３回、１０ｍＬのＴＢＳバッファーで２回膜を洗浄した。１ｍＬのＥＣＬ基質と一緒に膜を室温で１分インキュベートした。余剰の基質溶液を吸引し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＸＲＳ＋ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）及びＩｍａｇｅ ｌａｂソフトウェアを用いて、ブロットを展開させた。

【0348】

図６に示す結果から、抗体１Ｈ１２は、還元及び非還元変性Ａｘｌ抗原の両方と特異的に相互作用することが判明した。ｒｈＭｅｒ−Ｆｃに対する結合は検出されなかった。これらの結果は、ＭＡｂ１Ｈ１２が、Ａｘｌ受容体の細胞外部分上の線状エピトープを認識することを示している。

【0349】

実施例７：マウスモノクローナル抗体１Ｈ１２は、その天然の環境において、細胞表面上に発現した還元及び非還元変性Ａｘｌ受容体の両方に結合する
Ａｘｌ^＋及びＡｘｌ⁻細胞株両方からの細胞溶解物、ＮＣｌ−Ｈ１２９９（非小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ）及びＬＮＣａＰ（前立腺腺癌）をそれぞれ標準的プロトコルに従って調製した。還元剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在及び非存在下、細胞溶解物アリコートを変性させてから、ＮｕＰＡＧＥ３〜８％Ｔｒｉｓ−酢酸ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲル、１．０ｍｍ×１２ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルにロードした。実施例６に記載したのとほぼ同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析を実施した。

【0350】

図７に示す結果から、Ａｘｌ^＋ＮＣｌ−Ｈ１２９９細胞中に存在するＭＡｂ１Ｈ１２とＡｘｌ受容体（還元及び非還元の両方）との特異的相互作用が判明した。Ａｘｌ^＋又はＡｘｌ⁻細胞のいずれかに存在する他の細胞タンパク質との相互作用は観察されなかった。

【0351】

実施例８：マウスモノクローナル抗体１Ｈ１２のシーケンシング
ハイブリドーマ１Ｈ１２細胞は、標準的プロトコルに従って条件下で増殖させた。標準的プロトコルに従うｍＲＮＡ単離及びｃＤＮＡ合成のために、５×１０^６個の細胞を使用した。重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれＶＨ及びＶＬ）をコードする遺伝子のＰＣＲ増幅のために、マウスＩｇＧ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｐｒｏｇｅｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｃａｔ．ｎｏ．Ｆ２０１０）を使用した。異なるプライマー組み合わせを用いたＰＣＲ増幅により、ＶＨ遺伝子の７つの異なるプライマー組み合わせを用いたＰＣＲから１４の配列が、またＶＬ遺伝子の４つの異なるプライマー組み合わせを用いたＰＣＲから７つの配列が得られた。ＩＭＧＴデータベースとのヌクレオチドアラインメントにより決定される、対応する生殖系列配列と最も高い相同性に基づき、さらなる試験のためにクローンＶＨ５ Ｃ９−３及びＶκ４Ｇ４−１の配列を選択した。

【0352】

１Ｈ１２ＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列を図８に示す。

【0353】

実施例９：抗Ａｘｌマウスモノクローナル抗体１Ｈ１２は、免疫組織化学において正常ヒト組織と弱い反応を示すか、又は反応を全く示さなかった
検証実験で、抗体１Ｈ１２の最適プロトコル及び濃度を決定した。この試験のために、Ａｘｌ^＋及びＡｘｌ⁻細胞の凍結ペレットを使用した。抗体は、０．０５μｇ／ｍＬ〜１６．０μｇ／ｍＬ（１６、８、４、２、１、０．５、０．１、及び０．０５μｇ／ｍＬ）の濃度で試験した。ＭＡｂ１Ｈ１２は、８〜１μｇ／ｍＬでＡｘｌ^＋細胞において中等度から強度の反応を示し；０．５μｇ／ｍＬで反応は穏やかであった。従って、組織交差反応性（ＴＣＲ）試験で使用するために、１μｇ／ｍＬの最適濃度を設定した。この濃度で、Ａｘｌ陰性細胞に反応は認められなかった。

【0354】

ＢｉｏＣｈａｉｎから購入した市販の凍結組織ミクロアレイ（ＴＭＡ）（製品番号Ｔ６２３４７０１−２）を用いて、ＴＣＲ試験を実施した。組織は全て、ＢｉｏＣｈａｉｎから、凍結切削したアセトン固定凍結ＴＭＡとして配達された。実験は次のように実施した：凍結切片（８μｍ）を室温で一晩空気乾燥した後、アセトン中で１０分間固定してから、５％ヤギ正常血清（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、００５−０００−１２１）中で３０分間遮断した。次に、５％ヤギ正常血清を含むＰＢＳ中の一次抗体（１Ｈ１２）で１時間切片を染色した後、ＰＢＳで３回洗浄した。続いて、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ｍｏｕｓｅ（Ｄａｋｏ，Ｋ４００１）で３０分間切片を染色した。最後に、切片をＴｒｉｓ−ＨＣｌで３回洗浄した後、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色剤で５分間染色した。ＨＴＸイメージングを用いて、画像を撮影した。染色強度を次のように判定した：陰性（０）、弱い反応（１＋）、中等度の反応（２＋）、又は強度の反応（３＋）。正常ヒトＴＣＲの結果を表２に示す。

【0355】

抗体１Ｈ１２は、リンパ節及び脾臓の細胞において弱から中等度又は中等度の反応を示した（膜染色）。肝臓（恐らくクッパー細胞）にも局所的な中等度の反応が認められた（膜染色）。膵臓の上皮細胞にいくらかの局所的中等度又は強度の細胞内反応が認められた。次の組織は、特に陽性染色を示さなかった：副腎、骨髄、各種脳組織及び脊髄、結腸、上皮／大動脈、食道、卵管、心臓、腎臓、肺、卵巣、胎盤、前立腺、皮膚、脊髄、横紋筋、胃、精巣、胸腺、甲状腺、尿管及び子宮。

【0356】

【表2】

【0357】

表２の続き

【表3】

【0358】

表２の続き

【表4】

【0359】

表２の続き

【表5】

【0360】

実施例１０：キメラモノクローナル抗体１Ｈ１２の作製及び試験
哺乳動物細胞（ＧｅｎｅＡｒｔ）での発現のためのコドン最適化により合成遺伝子を作製するために、マウスハイブリドーマ１Ｈ１２から得られたＶＨ及びＶＬ配列を使用した。これらのマウスＶＨ及びＶＬ遺伝子は、哺乳動物細胞での抗体生成に好適な発現ベクターにおいて、ヒトＩｇＧ１重及び軽（Ｃ−κ）鎖の定常ドメインをコードする遺伝子エレメントとフレーム内で連結させた。キメラ（マウス可変／ヒト定常）ＩｇＧ１抗体の生成は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における一過性発現の後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いた精製により達成した。精製キメラ抗体（＞９５％純度）を、Ａｘｌ陽性乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１との結合についてフローサイトメトリーで分析した。比較のために、親マウスＭＡｂ１Ｈ１２を使用した。フローサイトメトリーのために、培養中の接着細胞をＰＢＳで洗浄し、１分間のトリプシン（０．２５％）処理の後、完全な脱離のために培養皿をたたくことよって、脱離させた。組織培養フラスコ中に完全培地を添加することによりトリプシンをクエンチした後、細胞をＰＢＳで洗浄した。洗浄ステップ中に、２００ｇで５分の遠心分離により、細胞を回収した。０．０２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中の総濃度のために抗体を希釈した。室温で２０分間１０^５個の細胞を含む２００μＬの細胞懸濁液を用いて、細胞染色を実施した。細胞結合抗体を、ＡＰＣ結合ロバ抗ヒト又は抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）_２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）でそれぞれ検出した。ＰＢＳ／０．０２％ＢＳＡを用いた２回の洗浄ステップの後、細胞を２００μＬに再懸濁させ、氷上に維持してから、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での分析に付した。図９に示す結果から、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するキメラ抗体の強力な結合が判明した。

【0361】

実施例１１：キメラモノクローナル抗体ｃｈ１Ｈ１２の親和性測定
Ｂｉａｃｏｒｅ３０００計器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、抗Ａｘｌキメラ（マウス可変／ヒト定常ＩｇＧ１）抗体ｃｈ１Ｈ１２の親和性測定を２５℃で実施した。抗原を塗布した固体表面として、密度１９０ＲＵで固定化したｒｈＡｘｌ−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．ｎｏ．１５４−ＡＬ）を有するセンサーチップＣＭ５を使用した。

【0362】

反応速度測定のために、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｃａｔ．ｎｏ．ＢＲ−１００１−８８）中の様々な濃度の抗ＡｘｌキメラＭＡｂｃｈ１Ｈ１２（１．３〜６６６．７ｎＭ）を注射時間３分、３０μＬ／分の流量で注射した後、５分の解離（バッファーのみ）を行った。各サイクルの後、流量５０μＬ／分の再生溶液（１０ｍＭ ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ）の３０秒の注射により、表面を再生した。

【0363】

物質移動制御実験によって、ＭＡｂｃｈ１Ｈ１２の有意な物質移動制限が存在しないことが判明した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア及び１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを用いて、動力学的結合（結合速度、ｋ_ｏｎ）及び解離（解離速度、ｋ_ｏｆｆ）を計算した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）をｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ比として計算した。形成された抗体−抗原複合体の半減期（ｔ_１／２）は、ｌｎ２／ｋ_ｏｆｆ比として計算した。

【0364】

図１０に示すように、キメラＭＡｂｃｈ１Ｈ１２は、主として非常に低い解離速度（ｋ_ｏｆｆ＝２．９９×１０^−６１／ｓ）のために、非常に高い親和性（Ｋ_Ｄ＝１．１０×１０^−１１Ｍ）を示し、これによって、６４．４時間というｃｈ１Ｈ１２／Ａｘｌ複合体の半減期が得られた。得られた親和性の値は、親マウス抗体１Ｈ１２（４．５倍低いＫ_Ｄ）に比べて優れており、これは、ヒト定常ドメインスカフォールドにマウントした場合、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインのより良好な配向を示すと考えられる。

【0365】

実施例１２：マウスモノクローナル抗体１Ｈ１２は、非ヒト霊長類由来のＡｘｌと交差反応する
カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）及びアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）（それぞれ、ｃｙｎｏ−Ａｘｌ及びｒｈｅ−Ａｘｌ）由来のＡｘｌ受容体の細胞外部分を含む組換えＡｘｌ−Ｆｃキメラタンパク質をＣＨＯ細胞での一過性発現により作製した。それぞれ１，３４５．０及び１，５１５．９ＲＵの表面密度でのアミン結合を用いて、ＣＭ５センサーチップの表面上に組換えｃｙｎｏ−Ａｘｌ及びｒｈｅ−Ａｘｌを固定化した。陽性対照として、同じ条件下で生成されたｈｕ−Ａｘｌ−Ｆｃキメラを１，２３４．９ＲＵの密度で同じチップに固定化した。

【0366】

Ｂｉａｃｏｒｅ３０００計器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、２５℃で結合実験を実施した。結合分析ウィザードを用いて、Ｂｉａｃｏｒｅランを自動式で実施した。

【0367】

ＨＢＳ−ＥＰバッファー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に濃度１０μｇ／ｍＬでＭＡｂ１Ｈ１２を含有するサンプルを、抗原が固定化された表面に３０μＬ／分の流量で３分間注射し（結合）、続いて５分間の解離を実施した。

【0368】

図１１に示す結果は、ヒト起源並びにカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）及びアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）由来の全てのＡｘｌ変異体とＭＡｂ１Ｈ１２の強力且つ特異的相互作用を明らかにしている。

【0369】

実施例１３：サポリンに結合したキメラモノクローナル抗体ｃｈ１Ｈ１２を用いた腫瘍細胞の殺傷
免疫毒素の作製のために、ＦａｂＦｃ−ＺＡＰヒトコンジュゲート（４．５ｎＭ最終濃度）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．ｎｏ．ＩＴ−６５）を用いて、キメラＭＡｂｃｈ１Ｈ１２を植物毒素サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）に非共有結合させた。Ａｘｌ陽性腫瘍細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒトトリプルネガティブ乳癌）を用いて、腫瘍細胞生存性に対するｃｈ１Ｈ１２−サポリン内在化の作用を試験した。１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、ストレプトマイシン（５μｇ／ｍｌ）及びペニシリン（５Ｕ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を含む９６ウェルプレート中にウェル当たり８００個の細胞を接種して、１６時間にわたり結合させた。様々な希釈度の免疫毒素ｃｈ１Ｈ１２−サポリンと一緒に、細胞を７２時間インキュベートした。細胞の生存性は、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（登録商標）マイクロプレートリーダ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）を用いて、ＸＴＴ／ＰＭＳアッセイを実施することにより測定した。

【0370】

図１２に示す結果は、ピコモル範囲のＥＣ_５０値（５０％の細胞の殺傷を達成する有効濃度）を有するｃｈ１Ｈ１２ベースの免疫毒素の優れた内在化及び強力な細胞殺傷能力を明らかにしている。

【0371】

実施例１４：抗体１Ｈ１２は、Ａｘｌ下流シグナル伝達を誘導する
ヒト頸癌由来の細胞株ヒーラ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２（商標））を用いて、実験を実施した。Ｔ１７５フラスコ内で、１０％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン及びＬ−グルタミンを補充したＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ）中８０％密集まで細胞を増殖させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシン／ＥＴＤＡ（Ｓｉｇｍａ）での処理により脱離させてから、遠心分離の後、新しい培地（ＭＥＭ／０．５％ＦＢＳ）に懸濁させた。１０％ＦＢＳを補充したＭＥＭ培地を含むペトリ皿（１枚当たり３×１０^６細胞）に細胞を接種した。３７℃で７時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、５００ｎｇ／ｍｌのＡｘｌ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した飢餓培地（ＭＥＭ／０．５％ＦＢ）中に維持することにより、内在性Ｇａｓ６を欠失させた。２４時間のインキュベーション後、培地を吸引してから、濃度７．５μｇ／ｍＬの抗Ａｘｌ抗体１Ｈ１２のみ、又はビオチン−ＳＰ−結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）＃２．２２（抗体架橋混合物）と事前に混合した１Ｈ１２のいずれかを含む新鮮なＭＥＭ／０．５％ＦＢＳ培地を添加した。３７℃で１０〜３０分のインキュベーション後、遠心分離により細胞を回収してから、ＮＰ４０溶解バッファー中に再懸濁させた後、氷上で３０分間インキュベートした。細胞溶解物を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、５分）により清澄化した後、ＢＣＡタンパク質アッセイを用いて、タンパク質濃度を測定した。３５μｇの全タンパク質を含む細胞溶解物サンプルを、還元剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下で変性させてから、ＮｕＰＡＧＥ１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲルのウェルである１．０ｍｍ×１２ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードした。推奨される条件（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）下で、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳランニングバッファーを用いて、電気泳動を実施した後、２０％メタノールを含む転写バッファーを用いて、ＸＣｅｌｌ ＩＩ（商標）Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマニュアルに２つのゲルについて記載されているように、タンパク質をＰＶＤＦ膜上に転移した。５％脱脂乳を含む１０ｍＬのブロッキングバッファー、すなわちＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）中で膜を室温にて１時間インキュベートした後、抗ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ^４７３）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の１：１０００希釈液を含有する５ｍＬのインキュベーションバッファー（３％脱脂乳を含むＴＢＳＴ）中、４℃で一晩インキュベートした。各々１０ｍＬのＴＢＳＴで膜を５分ずつ３回洗浄した後、ヤギ抗ウサギＨＲＰ結合二次抗体と一緒に、室温で穏やかに揺らしながら１時間インキュベートした。その後、１０ｍＬのＴＢＳＴで５分ずつ３回、１０ｍＬのＴＢＳバッファーで２回膜を洗浄した。１ｍＬのＥＣＬ基質と一緒に膜を室温で１分間インキュベートした。余剰の基質溶液を吸引した後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＸＲＳ＋ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）及びＩｍａｇｅ ｌａｂソフトウェアを用いて、ブロットを視覚化した。ローディング対照として、抗マウスアクチン抗体（１：１０，０００；Ｓｉｇｍａ）を用いた検出を同じ条件下で実施した。抗ホスホ−Ａｋｔは、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２及びＡＫＴ３を識別しないため、「ホスホ−Ａｋｔ」の総合レベルがブロット中に示される。抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）による検出をローディング対照として用いた。

【0372】

図１３に示す結果から、二次抗マウス抗体と架橋した抗Ａｘｌ抗体１Ｈ１２は、読み出しとしてＳｅｒ^４７３でのＡｋｔの下流リン酸化を利用したヒーラ細胞において強力なＡｘｌシグナル伝達を誘導したことが判明した。作用は用量依存的であることが証明され、架橋１Ｈ１２の量が多いほど、より強力な受容体シグナル伝達を引き起こした（図１４）。さらに、図１５に示すデータは、１Ｈ１２抗体が、二次抗体との架橋なしに単独で、Ａｘｌ受容体活性化及び下流シグナル伝達を起こし得ることも明らかにしている。この結果は、１Ｈ１２抗体が、強力なアゴニスト活性を有することを示すものである。

【0373】

実施例１５：マウスモノクローナル抗体１Ｈ１２は、市販の抗体ＭＡＢ１５４とＡｘｌ結合について競合する
Ｂｉａｃｏｒｅ３０００計器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＢｉｎｄｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓウィザードを用い、２つのサンプルの数サイクルの注射により、競合結合試験を実施した。第１のサンプルとして、飽和濃度のＭＡｂ１Ｈ１２（１．８μＭ又は２７０μｇ／ｍＬ）を、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃを塗布した（アミン結合を用いて）ＣＭ５センサーチップの表面に３０μＬ／分の流量で３分間注射してから、２．５分の安定化（ＨＢＳ−ＥＰバッファーのみ）の後、第２のサンプルを注射した。次の第２サンプルを使用した：組換えマウス（ｒｍ）Ｇａｓ６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．ｎｏ．９８６−ＧＳ／ＣＦ）及び市販の抗Ａｘｌモノクローナル抗体ＭＡＢ１５４（マウスＩｇＧ１、Ｃｌｏｎｅ＃１０８７２４；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡＢ１５４）；いずれも濃度２５μｇ／ｍＬ。対照として、同じ条件下（２５μｇ／ｍＬ）でＭＡｂ１Ｈ１２を使用した。第２サンプルを３分間注射してから、２．５分の安定化（バッファーのみ）の後、流量５０μＬ／分の再生溶液（１０ｍＭ ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ）の３０秒の注射により、表面の再生を行った。

【0374】

図１６に示す結果から、ＭＡｂ１Ｈ１２が、Ａｘｌに対するＭＡＢ１５４の結合の結合を阻害し、マウスＧａｓ６と競合しなかったことが判明した。

【0375】

実施例１６：１Ｈ１２及び市販の抗体を用いたＡｘｌ検出の比較
ＭＡｂ１Ｈ１２を用いて、免疫組織化学及びウェスタンブロット分析を実施した。

【0376】

Ａｘｌ＋親ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞又はＡｘｌ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ｓｈＡｘｌ２細胞のいずれかを用いて、調製した細胞ペレットからのＦＦＰＥ切片を、ＭＡｂ１Ｈ１２、ポリクローナルＡＦ１５４及びモノクローナルＭＡＢ１５４を用いて染色した（図１７Ａ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ｓｈＡｘｌ２細胞株は、ＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡを発現するレトロウイルス構築物を用いてノックダウンしたＡｘｌ発現を有し；これによって、約１０％の細胞がＡｘｌ＋のままである混合集団が得られる。

【0377】

ＭＡｂ１Ｈ１２によるＡｘｌ＋細胞の最良の染色は、１μｇ／ｍｌの濃度で達成された（細胞膜の高スコア陽性染色、及び弱い細胞質染色又は細胞質染色なし）が、Ａｘｌ−細胞は、主に陰性染色を示し、散在する単一細胞に幾分の発現を有した。単離されたＡｘｌ−発現細胞の存在は、フローサイトメトリーによって、細胞の約９０％が、レトロウイルスｓｈＲＮＡ構築物を担持することが示されたことから、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ｓｈＡｘｌ２の観察された純度と一致した。希釈度１：６４００（０．０３１２５μｇ／ｍｌ０３１２５μｇ／ｍ）でＡＦ１５４を用いた比較染色は、いくらか強い膜染色を示した。しかし、ほとんどの細胞において、幾分弱い発現を有する散在集団におけるＡｘｌ−細胞でも強力な染色が観察された。

【0378】

ＭＡＢ１５４による染色は、同様の濃度でのＡｘｌ＋細胞に対するＭＡｂ１Ｈ１２より弱い作用を示した。しかし、Ａｘｌ−集団では、ＭＡｂ１Ｈ１２及びＡＦ１５４の両方と比較して、弱い染色の細胞は少数であった。これは、１Ｈ１２が、ＩＨＣに対するＡＦ１５４及びＭＡＢ１５４と比較して、改善された結果をもたらすことを示すものである。

【0379】

ＭＡｂ１Ｈ１２、ＡＦ１５４及びＭＡＢ１５４を用いて、Ａｘｌ＋及びＡｘｌ−細胞溶解物のウェスタンブロット分析により同様の比較を実施した（図１７Ｂ）。推奨事項及び可視性の目的で、３つの抗体は全て、１μｇ／ｍｌの濃度で使用した。全てが、Ａｘｌ＋細胞溶解物中１４０ｋＤａでＡｘｌのタンパク質バンドを示した。しかし、このバンドは、ＡＦ１５４を含むＡｘｌ−溶解物ではほぼ検出不能であったが、幾分かの弱いバックグラウンド染色は検出され、これは、以前の研究（Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，２０１５）に指摘されているように、低レベルでの他のタンパク質に対するその反応を示している。ＭＡｂ１Ｈ１２を含むブロットは、ＭＡＢ１５４で見られるより一貫して強かった。これらの結果から、本発明者らは、ＭＡｂ１Ｈ１２が、ウェスタンブロットにおいて、ＡＦ１５４及びＭＡＢ１５４よりかなり良好に作用すると結論付けた。

【0380】

配列
配列番号１［ＶＨドメイン（ｎｔ）］
GAGGTGAAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTAGTGGTGGTAGTTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACATCCCATCTACTATACTTACGACGATACTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCC

配列番号２［ＶＬドメイン（ｎｔ）］
GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCAATCATGGCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCTGGTAACTTTCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCACTTCTCCCAAACTCTGGATTTATAGGACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCCGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTTACAATCAGCAGCATGGAGGCCGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTTACCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCC


配列番号３［ＶＨドメイン（ａａ）］EVKLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPDKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHPIYYTYDDTMDYWGQGTSVTVSS

配列番号４［ＶＬドメイン（ａａ）］
DIVLTQSPAIMAASPGEKVTMTCSASSSVSSGNFHWYQQKPGTSPKLWIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSGYPWTFGGGTKLEIK

配列番号５［重鎖ＣＤＲ１］
ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＳ
配列番号６［重鎖ＣＤＲ２］
ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡ
配列番号７［重鎖ＣＤＲ３］
ＨＰＩＹＹＴＹＤＤＴＭＤＹ
配列番号８［軽鎖ＣＤＲ１］
ＳＡＳＳＳＶＳＳＧＮＦＨ
配列番号９［軽鎖ＣＤＲ２］
ＲＴＳＮＬＡＳ
配列番号１０［軽鎖ＣＤＲ３］
ＱＱＷＳＧＹＰＷＴ
配列番号１１［重鎖ＦＲ１］
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＤＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳ
配列番号１２［重鎖ＦＲ２］
ＷＶＲＱＴＰＤＫＲＬＥＷＶＡ
配列番号１３［重鎖ＦＲ３］
ＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲ
配列番号１４［重鎖ＦＲ４］
ＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
配列番号１５［軽鎖ＦＲ１］
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＡＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣ
配列番号１６［軽鎖ＦＲ２］
ＷＹＱＱＫＰＧＴＳＰＫＬＷＩＹ
配列番号１７［軽鎖ＦＲ３］
ＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣ
配列番号１８［軽鎖ＦＲ４］
ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１９［ヒトＡｘｌ］
ＭＡＷＲＣＰＲＭＧＲＶＰＬＡＷＣＬＡＬＣＧＷＡＣＭＡＰＲＧＴＱＡＥＥＳＰＦＶＧＮＰＧＮＩＴＧＡＲＧＬＴＧＴＬＲＣＱＬＱＶＱＧＥＰＰＥＶＨＷＬＲＤＧＱＩＬＥＬＡＤＳＴＱＴＱＶＰＬＧＥＤＥＱＤＤＷＩＶＶＳＱＬＲＩＴＳＬＱＬＳＤＴＧＱＹＱＣＬＶＦＬＧＨＱＴＦＶＳＱＰＧＹＶＧＬＥＧＬＰＹＦＬＥＥＰＥＤＲＴＶＡＡＮＴＰＦＮＬＳＣＱＡＱＧＰＰＥＰＶＤＬＬＷＬＱＤＡＶＰＬＡＴＡＰＧＨＧＰＱＲＳＬＨＶＰＧＬＮＫＴＳＳＦＳＣＥＡＨＮＡＫＧＶＴＴＳＲＴＡＴＩＴＶＬＰＱＱＰＲＮＬＨＬＶＳＲＱＰＴＥＬＥＶＡＷＴＰＧＬＳＧＩＹＰＬＴＨＣＴＬＱＡＶＬＳＤＤＧＭＧＩＱＡＧＥＰＤＰＰＥＥＰＬＴＳＱＡＳＶＰＰＨＱＬＲＬＧＳＬＨＰＨＴＰＹＨＩＲＶＡＣＴＳＳＱＧＰＳＳＷＴＨＷＬＰＶＥＴＰＥＧＶＰＬＧＰＰＥＮＩＳＡＴＲＮＧＳＱＡＦＶＨＷＱＥＰＲＡＰＬＱＧＴＬＬＧＹＲＬＡＹＱＧＱＤＴＰＥＶＬＭＤＩＧＬＲＱＥＶＴＬＥＬＱＧＤＧＳＶＳＮＬＴＶＣＶＡＡＹＴＡＡＧＤＧＰＷＳＬＰＶＰＬＥＡＷＲＰＧＱＡＱＰＶＨＱＬＶＫＥＰＳＴＰＡＦＳＷＰＷＷＹＶＬＬＧＡＶＶＡＡＡＣＶＬＩＬＡＬＦＬＶＨＲＲＫＫＥＴＲＹＧＥＶＦＥＰＴＶＥＲＧＥＬＶＶＲＹＲＶＲＫＳＹＳＲＲＴＴＥＡＴＬＮＳＬＧＩＳＥＥＬＫＥＫＬＲＤＶＭＶＤＲＨＫＶＡＬＧＫＴＬＧＥＧＥＦＧＡＶＭＥＧＱＬＮＱＤＤＳＩＬＫＶＡＶＫＴＭＫＩＡＩＣＴＲＳＥＬＥＤＦＬＳＥＡＶＣＭＫＥＦＤＨＰＮＶＭＲＬＩＧＶＣＦＱＧＳＥＲＥＳＦＰＡＰＶＶＩＬＰＦＭＫＨＧＤＬＨＳＦＬＬＹＳＲＬＧＤＱＰＶＹＬＰＴＱＭＬＶＫＦＭＡＤＩＡＳＧＭＥＹＬＳＴＫＲＦＩＨＲＤＬＡＡＲＮＣＭＬＮＥＮＭＳＶＣＶＡＤＦＧＬＳＫＫＩＹＮＧＤＹＹＲＱＧＲＩＡＫＭＰＶＫＷＩＡＩＥＳＬＡＤＲＶＹＴＳＫＳＤＶＷＳＦＧＶＴＭＷＥＩＡＴＲＧＱＴＰＹＰＧＶＥＮＳＥＩＹＤＹＬＲＲＧＮＲＬＫＱＰＡＤＣＬＤＧＬＹＡＬＭＳＲＣＷＥＬＮＰＱＤＲＰＳＦＴＥＬＲＥＤＬＥＮＴＬＫＡＬＰＰＡＱＥＰＤＥＩＬＹＶＮＭＤＥＧＧＧＹＰＥＰＰＧＡＡＧＧＡＤＰＰＴＱＰＤＰＫＤＳＣＳＣＬＴＡＡＥＶＨＰＡＧＲＹＶＬＣＰＳＴＴＰＳＰＡＱＰＡＤＲＧＳＰＡＡＰＧＱＥＤＧＡ

配列番号２０［マウスＡｘｌ］
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配列番号２１［ヒトＴｙｒｏ３］
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配列番号２２［ヒトＭｅｒ］
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]