特許 6788573 メトトレキサートによる選択と組み合わせたＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンによる遺伝子改変Ｔ細胞の製造

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6788573

(24)【登録日】2020年11月4日

(45)【発行日】2020年11月25日

(54)【発明の名称】メトトレキサートによる選択と組み合わせたＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンによる遺伝子改変Ｔ細胞の製造

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20201116BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20201116BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20201116BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09 ZZNA

   C12N5/0783

   C12N5/10

【請求項の数】14

【全頁数】86

(21)【出願番号】特願2017-504604(P2017-504604)

(86)(22)【出願日】2015年4月8日

(65)【公表番号】特表2017-513520(P2017-513520A)

(43)【公表日】2017年6月1日

(86)【国際出願番号】US2015024868

(87)【国際公開番号】WO2015157386

(87)【国際公開日】20151015

【審査請求日】2018年4月6日

(31)【優先権主張番号】62/089,730

(32)【優先日】2014年12月9日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/058,973

(32)【優先日】2014年10月2日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/090,845

(32)【優先日】2014年12月11日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/977,751

(32)【優先日】2014年4月10日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/986,479

(32)【優先日】2014年4月30日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/088,363

(32)【優先日】2014年12月5日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】515045617

【氏名又は名称】シアトル チルドレンズ ホスピタル， ディービーエー シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート

(73)【特許権者】

【識別番号】514104933

【氏名又は名称】ユニヴァーシティ オブ ワシントン

(74)【代理人】

【識別番号】100077012

【弁理士】

【氏名又は名称】岩谷 龍

(72)【発明者】

【氏名】ジェンセン，マイケル，シー．

(72)【発明者】

【氏名】プン，スージー

(72)【発明者】

【氏名】カチェロフスキー，ナタリー

【審査官】 宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／１２３０６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 JONNALAGADDA M. et al.，Gene Ther.，20(8) (2013)，p.853-860

【文献】 KACHEROVSKY N. et al.，Nucleic Acids Research，Vol.40 No.11 (2012)，e85

【文献】 金森 利至 他，ヒト細胞を宿主としたヒトtissue-type plasminogen activatorの発現，組織培養研究，8(2)(1990)，p.31-39

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｎ ５／０７８３

Ｃ１２Ｎ ５／１０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変マルチプレックス（multiplexed）Ｔ細胞を製造する方法であって、
ｉ）ゲノムに挿入される核酸を含み、選択可能な遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
ii）前記遺伝子送達ポリヌクレオチドをＴ細胞に導入すること、
iii）Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
iv）Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
ｖ）第１の濃度域のメトトレキサートを加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該メトトレキサートを加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、および
vi）選択した前記Ｔ細胞を単離すること
を含み、
前記遺伝子送達ポリヌクレオチドが、第１〜第７の配列をさらに含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
ゲノムに挿入される前記核酸が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列と第２の逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれており、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子またはｍＲＮＡにより転写される配列をコードする少なくとも１つの遺伝子を含み、
第５の配列が、メトトレキサートに対する親和性が低減されたジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含み、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体が、配列番号２に示すＤＮＡ配列によってコードされ、メトトレキサートを用いて、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞の選択を行うことによって、前記少なくとも１つの遺伝子を発現する細胞の割合を増加させることができ、
第６の配列が、ａｔｔＰ付着部位を含み、
第７の配列が、ａｔｔＢ付着部位を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第７の配列の３’末端が、第１の配列の５’末端に隣接し、第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の配列の５’末端に隣接し、第２の配列の３’末端が、第６の配列の５’末端に隣接していること
を特徴とする方法。

【請求項2】

Ｔ細胞におけるタンパク質の産生を増加させる方法であって、
ｉ）ゲノムに挿入される核酸を含み、選択可能な遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
ii）前記遺伝子送達ポリヌクレオチドをＴ細胞に導入すること、
iii）Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
iv）Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
ｖ）第１の濃度域のメトトレキサートを加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該メトトレキサートを加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、および
vi）選択圧下において表現型を発現する前記細胞を単離すること
を含み、
前記遺伝子送達ポリヌクレオチドが、第１〜第７の配列をさらに含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
ゲノムに挿入される前記核酸が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列と第２の逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれており、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子またはｍＲＮＡにより転写される配列をコードする少なくとも１つの遺伝子を含み、
第５の配列が、メトトレキサートに対する親和性が低減されたジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含み、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体が、配列番号２に示すＤＮＡ配列によってコードされ、メトトレキサートを用いて、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞の選択を行うことによって、前記少なくとも１つの遺伝子を発現する細胞の割合を増加させることができ、
第６の配列が、ａｔｔＰ付着部位を含み、
第７の配列が、ａｔｔＢ付着部位を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第７の配列の３’末端が、第１の配列の５’末端に隣接し、第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の配列の５’末端に隣接し、第２の配列の３’末端が、第６の配列の５’末端に隣接していること
を特徴とする方法。

【請求項3】

前記第１の濃度域が少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、かつ前記第２の濃度域が少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであるか；前記第１の濃度域が少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、かつ前記第２の濃度域が少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭであるか；または前記第１の濃度域が少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、かつ前記第２の濃度域が少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記第１の濃度域が少なくとも２００ｎＭ以上であり、かつ前記第２の濃度域が少なくとも５００ｎＭ以上である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項5】

前記１回目の選択が、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞をメトトレキサートに暴露することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記２回目の選択が、前記Ｔ細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日もしくは１４日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の時間にわたって、前記Ｔ細胞をメトトレキサートに暴露することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記遺伝子送達ポリヌクレオチドが、少なくとも１ｋｂ〜５ｋｂである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記プロモーター領域配列が、ＥＦ１プロモーター配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記第４の配列が、タンパク質をコードする１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの遺伝子を含むこと、前記第４の配列が、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列であること、および前記関連する複数のタンパク質が、同じエピトープに特異的な抗体結合ドメインを含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記第４の配列および／または前記第５の配列の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するように該配列のコドンが最適化されていること、ならびに／またはヒトにおける発現を目的として前記第４の配列および／または前記第５の配列のコドンが最適化されていること、ならびに前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列が、複数の関連配列において使用されている配列および／または核酸塩基の差異を比較することによって作製されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記タンパク質が治療用タンパク質である、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記タンパク質が、抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体が、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記遺伝子送達ポリヌクレオチドがミニサークル（minicircle）である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、2014年10月2日に出願された米国仮特許出願62/058,973号、2014年4月10日に出願された米国仮特許出願61/977,751号、2014年4月30日に出願された米国仮特許出願61/986,479号、2014年12月9日に出願された米国仮特許出願62/089,730号、2014年12月11日に出願された米国仮特許出願62/090845号、および2014年12月5日に出願された米国仮特許出願62/088,363号に係る優先権を主張するものである。前記出願の開示は、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列、配列表またはコンピュータープログラムにより作成した配列に関する情報
本願は電子形式の配列表とともに出願されたものである。この配列表は、SCRI.077PR.TXTのファイル名で2015年3月20日に作成された4kbのファイルとして提供されたものである。この電子形式の配列表に記載された情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0003】

本明細書に記載の本発明の態様は、対象におけるウイルス感染細胞またはがん細胞を治療、抑制、緩和および／または排除する方法であって、ウイルス感染細胞またはがん細胞により提示された分子に結合する受容体を有する遺伝子改変ヒトＴ細胞を使用することによる方法を包含する。

【背景技術】

【0004】

遺伝子改変ヒトＴ細胞は、がん免疫療法およびウイルス療法に対する有望な治療経路である。キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞を別の遺伝子と組み合わせることによってＴ細胞の増殖、生存または腫瘍へのホーミングが増強されたＴ細胞は、改善された有効性を発揮しうるが、これには、複数の遺伝子を安定して移入することが必要とされる。したがって、マルチプレックス遺伝子改変細胞の生産効率を上昇することができる方法が必要とされている。Ｔ細胞の効率的で安定な形質導入は、ヌクレオフェクションにより導入されたミニサークル（minicircle）内のSleeping Beautyトランスポゾンシステムを使用して達成可能である。代謝抑制に抵抗性のあるジヒドロ葉酸還元酵素の変異体（DHFRdm）を発現する形質導入細胞をメトトレキサート（ＭＴＸ）により迅速に選択することも可能である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本明細書において、複数の導入遺伝子を発現するＴ細胞の選択的増幅するアプローチを開示する。このＴ細胞は、ウイルス感染細胞またはがん細胞により提示される分子に特異的な複数の受容体またはキメラ受容体をコードする複数の導入遺伝子を発現することが好ましい。いくつかの実施形態において、形質転換Ｔ細胞は、ＭＴＸの濃度を高めた選択圧下における二段階でのＭＴＸ選択によって選択される。

【0006】

一実施形態において、
オリゴヌクレオチドに核酸を安定に挿入するための遺伝子送達ポリヌクレオチドであって、
該遺伝子送達ポリヌクレオチド内において、挿入される該核酸が逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれていること、
該遺伝子送達ポリヌクレオチドが選択可能であること、
該遺伝子送達ポリヌクレオチドが、第１〜第７の配列を含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子またはｍＲＮＡにより転写される配列をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む最適化された配列であり、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含む最適化された配列であり、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体のメトトレキサートに対する親和性が１５，０００分の１または約１５，０００分の１に低減されており、メトトレキサートを用いて、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞の選択を行うことによって、前記少なくとも１つの遺伝子を発現する細胞の割合を増加させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位（attP）を含み、
第７の配列が、第２の付着部位（attB）を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復を含む第２の配列の５’末端に隣接していること
を特徴とする遺伝子送達ポリヌクレオチドが提供される。
いくつかの実施形態において、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする遺伝子は、
ATGGTTGGTTCGCTAAACTGCATCGTCGCTGTGTCCCAGAACATGGGCATCGGCAAGAACGGGGACTTCCCCTGGCCACCGCTCAGGAATGAATCCAGATATTTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAAGAAGACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGGTAGAATTAATTTAGTTCTCAGCAGAGAACTCAAGGAACCTCCACAAGGAGCTCATTTTCTTTCCAGAAGTCTAGATGATGCCTTAAAACTTACTGAACAACCAGAATTAGCAAATAAAGTAGACATGGTCTGGATAGTTGGTGGCAGTTCTGTTTATAAGGAAGCCATGAATCACCCAGGCCATCTTAAACTATTTGTGACAAGGATCATGCAAGACTTTGAAAGTGACACGTTTTTTCCAGAAATTGATTTGGAGAAATATAAACTTCTGCCAGAATACCCAGGTGTTCTCTCTGATGTCCAGGAGGAGAAAGGCATTAAGTACAAATTTGAAGTATATGAGAAGAATGATTAA（配列番号２）で表されるＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態においては、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、
MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL SRSLDDALKL TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM QDFESDTFFP EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND（配列番号３）で表されるタンパク質配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは環状である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜５ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記プロモーター領域は、ＥＦ１プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、タンパク質をコードする遺伝子を１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインなどの、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記関連する複数のタンパク質は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、ヒトにおける発現および／または該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比の低下を目的としてコドン最適化されている。いくつかの好ましい実施形態においては、前記第５の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態においては、前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列は、複数の関連配列において利用されている配列および／または核酸塩基の可変性を比較することによって作製される。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、抗体またはその一部を含み、該抗体またはその一部はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。

【0007】

いくつかの実施形態においては、
養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞を製造する方法であって、
遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
Ｔ細胞に前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞を単離すること
を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、第１〜第７の配列を含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む最適化された配列であり、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含む最適化された配列であり、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体のメトトレキサートに対する親和性が１５，０００分の１または約１５，０００分の１に低減されており、メトトレキサートを選択メカニズムとして用いることによって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞を選択的に増殖させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位（attP）を含み、
第７の配列が、第２の付着部位（attB）を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復を含む第２の配列の５’末端に隣接していることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする遺伝子は、
ATGGTTGGTTCGCTAAACTGCATCGTCGCTGTGTCCCAGAACATGGGCATCGGCAAGAACGGGGACTTCCCCTGGCCACCGCTCAGGAATGAATCCAGATATTTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAAGAAGACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGGTAGAATTAATTTAGTTCTCAGCAGAGAACTCAAGGAACCTCCACAAGGAGCTCATTTTCTTTCCAGAAGTCTAGATGATGCCTTAAAACTTACTGAACAACCAGAATTAGCAAATAAAGTAGACATGGTCTGGATAGTTGGTGGCAGTTCTGTTTATAAGGAAGCCATGAATCACCCAGGCCATCTTAAACTATTTGTGACAAGGATCATGCAAGACTTTGAAAGTGACACGTTTTTTCCAGAAATTGATTTGGAGAAATATAAACTTCTGCCAGAATACCCAGGTGTTCTCTCTGATGTCCAGGAGGAGAAAGGCATTAAGTACAAATTTGAAGTATATGAGAAGAATGATTAA（配列番号２）で表されるＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態においては、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、
MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL SRSLDDALKL TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM QDFESDTFFP EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND（配列番号３）で表されるタンパク質配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは環状である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜５ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記プロモーター領域は、ＥＦ１プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、タンパク質をコードする遺伝子を１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインなどの、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記関連する複数のタンパク質は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態においては、前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列は、複数の関連配列において利用されている配列および／または核酸塩基の可変性を比較することによって作製される。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、抗体またはその一部を含み、該抗体またはその一部はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記導入をエレクトロポレーションによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択を、選択マーカーカセットを使用して選択圧を高めることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬は選択剤を含む。いくつかの実施形態においては、前記選択剤はメトトレキサートである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域が少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、前記第２の濃度域が少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭもしくは１００ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、７５ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭもしくは１５０ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、７５ｎＭ、８５ｎＭ、９５ｎＭ、１０５ｎＭ、１１５ｎＭ、１２５ｎＭ、１３５ｎＭ、１４５ｎＭもしくは１５０ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、１１２ｎＭ、１２２ｎＭ、１３２ｎＭ、１４２ｎＭ、１５２ｎＭ、１６２ｎＭ、１７２ｎＭ、１８２ｎＭ、１９２ｎＭ、２０２ｎＭ、２１２ｎＭもしくは２２５ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、前記第１の濃度域は少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭもしくは６７５ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、１０００ｎＭもしくは１０１２ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記１回目の選択は、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記２回目の選択は、前記Ｔ細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日もしくは１４日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の時間にわたって、前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。

【0008】

いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞におけるタンパク質の産生を増加させる方法であって、
ポリヌクレオチドを提供すること、
細胞に前記ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記細胞を単離すること
を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、第１〜第７の配列を含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む最適化された配列であり、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含む最適化された配列であり、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体のメトトレキサートに対する親和性が１５，０００分の１または約１５，０００分の１に低減されており、メトトレキサートを選択メカニズムとして用いることによって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞を選択的に増殖させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位（attP）を含み、
第７の配列が、第２の付着部位（attB）を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、
第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復を含む第２の配列の５’末端に隣接していることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする遺伝子は、
ATGGTTGGTTCGCTAAACTGCATCGTCGCTGTGTCCCAGAACATGGGCATCGGCAAGAACGGGGACTTCCCCTGGCCACCGCTCAGGAATGAATCCAGATATTTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAAGAAGACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGGTAGAATTAATTTAGTTCTCAGCAGAGAACTCAAGGAACCTCCACAAGGAGCTCATTTTCTTTCCAGAAGTCTAGATGATGCCTTAAAACTTACTGAACAACCAGAATTAGCAAATAAAGTAGACATGGTCTGGATAGTTGGTGGCAGTTCTGTTTATAAGGAAGCCATGAATCACCCAGGCCATCTTAAACTATTTGTGACAAGGATCATGCAAGACTTTGAAAGTGACACGTTTTTTCCAGAAATTGATTTGGAGAAATATAAACTTCTGCCAGAATACCCAGGTGTTCTCTCTGATGTCCAGGAGGAGAAAGGCATTAAGTACAAATTTGAAGTATATGAGAAGAATGATTAA（配列番号２）で表されるＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態においては、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、
MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL SRSLDDALKL TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM QDFESDTFFP EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND（配列番号３）で表されるタンパク質配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは環状である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜５ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記プロモーター領域は、ＥＦ１プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、タンパク質をコードする遺伝子を１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインなどの、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記関連する複数のタンパク質は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態においては、前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列は、複数の関連配列において利用されている配列および／または核酸塩基の可変性を比較することによって作製される。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、抗体またはその一部を含み、該抗体またはその一部はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記導入をエレクトロポレーションによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択を、選択マーカーカセットを使用して選択圧を高めることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬は選択剤を含む。いくつかの実施形態においては、前記選択剤はメトトレキサートである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域が少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、前記第２の濃度域が少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭもしくは１００ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、７５ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭもしくは１５０ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、７５ｎＭ、８５ｎＭ、９５ｎＭ、１０５ｎＭ、１１５ｎＭ、１２５ｎＭ、１３５ｎＭ、１４５ｎＭもしくは１５０ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、１１２ｎＭ、１２２ｎＭ、１３２ｎＭ、１４２ｎＭ、１５２ｎＭ、１６２ｎＭ、１７２ｎＭ、１８２ｎＭ、１９２ｎＭ、２０２ｎＭ、２１２ｎＭもしくは２２５ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、前記第１の濃度域は少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭもしくは６７５ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、１０００ｎＭもしくは１０１２ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記１回目の選択は、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記２回目の選択は、前記Ｔ細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日もしくは１４日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の時間にわたって、前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。

【0009】

いくつかの実施形態においては、前記方法のいずれかによって製造された、養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞が提供される。
いくつかの実施形態においては、養子Ｔ細胞免疫療法のための前記遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞の製造方法は、
遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
Ｔ細胞に前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞を単離することを含む。
いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、第１〜第７の配列を含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む最適化された配列であり、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含む最適化された配列であり、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体のメトトレキサートに対する親和性が１５，０００分の１または約１５，０００分の１に低減されており、メトトレキサートを選択メカニズムとして用いることによって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞を選択的に増殖させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位（attP）を含み、
第７の配列が、第２の付着部位（attB）を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、
第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復を含む第２の配列の５’末端に隣接していることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする遺伝子は、
ATGGTTGGTTCGCTAAACTGCATCGTCGCTGTGTCCCAGAACATGGGCATCGGCAAGAACGGGGACTTCCCCTGGCCACCGCTCAGGAATGAATCCAGATATTTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAAGAAGACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGGTAGAATTAATTTAGTTCTCAGCAGAGAACTCAAGGAACCTCCACAAGGAGCTCATTTTCTTTCCAGAAGTCTAGATGATGCCTTAAAACTTACTGAACAACCAGAATTAGCAAATAAAGTAGACATGGTCTGGATAGTTGGTGGCAGTTCTGTTTATAAGGAAGCCATGAATCACCCAGGCCATCTTAAACTATTTGTGACAAGGATCATGCAAGACTTTGAAAGTGACACGTTTTTTCCAGAAATTGATTTGGAGAAATATAAACTTCTGCCAGAATACCCAGGTGTTCTCTCTGATGTCCAGGAGGAGAAAGGCATTAAGTACAAATTTGAAGTATATGAGAAGAATGATTAA（配列番号２）で表されるＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態においては、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、
MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL SRSLDDALKL TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM QDFESDTFFP EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND（配列番号３）で表されるタンパク質配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは環状である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜５ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記プロモーター領域は、ＥＦ１プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、タンパク質をコードする遺伝子を１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインなどの、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記関連する複数のタンパク質は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態においては、前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列は、複数の関連配列において利用されている配列および／または核酸塩基の可変性を比較することによって作製される。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、抗体またはその一部を含み、該抗体またはその一部はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記導入をエレクトロポレーションによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択を、選択マーカーカセットを使用して選択圧を高めることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬は選択剤を含む。いくつかの実施形態においては、前記選択剤はメトトレキサートである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域が少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、前記第２の濃度域が少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭもしくは１００ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、７５ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭもしくは１５０ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、７５ｎＭ、８５ｎＭ、９５ｎＭ、１０５ｎＭ、１１５ｎＭ、１２５ｎＭ、１３５ｎＭ、１４５ｎＭもしくは１５０ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、１１２ｎＭ、１２２ｎＭ、１３２ｎＭ、１４２ｎＭ、１５２ｎＭ、１６２ｎＭ、１７２ｎＭ、１８２ｎＭ、１９２ｎＭ、２０２ｎＭ、２１２ｎＭもしくは２２５ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、前記第１の濃度域は少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭもしくは６７５ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、１０００ｎＭもしくは１０１２ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記１回目の選択は、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記２回目の選択は、前記Ｔ細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日もしくは１４日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の時間にわたって、前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。
いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、第１〜第７の配列を含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む最適化された配列であり、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含む最適化された配列であり、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体のメトトレキサートに対する親和性が１５，０００分の１または約１５，０００分の１に低減されており、メトトレキサートを選択メカニズムとして用いることによって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞を選択的に増殖させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位（attP）を含み、
第７の配列が、第２の付着部位（attB）を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復を含む第２の配列の５’末端に隣接していることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする遺伝子は、
ATGGTTGGTTCGCTAAACTGCATCGTCGCTGTGTCCCAGAACATGGGCATCGGCAAGAACGGGGACTTCCCCTGGCCACCGCTCAGGAATGAATCCAGATATTTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAAGAAGACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGGTAGAATTAATTTAGTTCTCAGCAGAGAACTCAAGGAACCTCCACAAGGAGCTCATTTTCTTTCCAGAAGTCTAGATGATGCCTTAAAACTTACTGAACAACCAGAATTAGCAAATAAAGTAGACATGGTCTGGATAGTTGGTGGCAGTTCTGTTTATAAGGAAGCCATGAATCACCCAGGCCATCTTAAACTATTTGTGACAAGGATCATGCAAGACTTTGAAAGTGACACGTTTTTTCCAGAAATTGATTTGGAGAAATATAAACTTCTGCCAGAATACCCAGGTGTTCTCTCTGATGTCCAGGAGGAGAAAGGCATTAAGTACAAATTTGAAGTATATGAGAAGAATGATTAA（配列番号２）で表されるＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態においては、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、
MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL SRSLDDALKL TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM QDFESDTFFP EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND（配列番号３）で表されるタンパク質配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは環状である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜５ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記プロモーター領域は、ＥＦ１プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、タンパク質をコードする遺伝子を１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインなどの、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記関連する複数のタンパク質は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態においては、前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列は、複数の関連配列において利用されている配列および／または核酸塩基の可変性を比較することによって作製される。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、抗体またはその一部を含み、該抗体またはその一部はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記導入をエレクトロポレーションによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択を、選択マーカーカセットを使用して選択圧を高めることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬は選択剤を含む。いくつかの実施形態においては、前記選択剤はメトトレキサートである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域が少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、前記第２の濃度域が少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭもしくは１００ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、７５ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭもしくは１５０ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、７５ｎＭ、８５ｎＭ、９５ｎＭ、１０５ｎＭ、１１５ｎＭ、１２５ｎＭ、１３５ｎＭ、１４５ｎＭもしくは１５０ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、１１２ｎＭ、１２２ｎＭ、１３２ｎＭ、１４２ｎＭ、１５２ｎＭ、１６２ｎＭ、１７２ｎＭ、１８２ｎＭ、１９２ｎＭ、２０２ｎＭ、２１２ｎＭもしくは２２５ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、前記第１の濃度域は少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭもしくは６７５ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、１０００ｎＭもしくは１０１２ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記１回目の選択は、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記２回目の選択は、前記Ｔ細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日もしくは１４日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の時間にわたって、前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。

【0010】

いくつかの実施形態においては、対象におけるがんまたは疾患を治療、抑制または緩和する方法であって、以下の方法によって製造された遺伝子組換えまたは遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞を対象に投与することを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、養子Ｔ細胞免疫療法のための前記遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞の製造方法は、
遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
Ｔ細胞に前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞を単離することを含む。
いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、第１〜第７の配列を含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む最適化された配列であり、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含む最適化された配列であり、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体のメトトレキサートに対する親和性が１５，０００分の１または約１５，０００分の１に低減されており、メトトレキサートを選択メカニズムとして用いることによって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞を選択的に増殖させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位（attP）を含み、
第７の配列が、第２の付着部位（attB）を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復を含む第２の配列の５’末端に隣接していることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする遺伝子は、
ATGGTTGGTTCGCTAAACTGCATCGTCGCTGTGTCCCAGAACATGGGCATCGGCAAGAACGGGGACTTCCCCTGGCCACCGCTCAGGAATGAATCCAGATATTTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAAGAAGACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGGTAGAATTAATTTAGTTCTCAGCAGAGAACTCAAGGAACCTCCACAAGGAGCTCATTTTCTTTCCAGAAGTCTAGATGATGCCTTAAAACTTACTGAACAACCAGAATTAGCAAATAAAGTAGACATGGTCTGGATAGTTGGTGGCAGTTCTGTTTATAAGGAAGCCATGAATCACCCAGGCCATCTTAAACTATTTGTGACAAGGATCATGCAAGACTTTGAAAGTGACACGTTTTTTCCAGAAATTGATTTGGAGAAATATAAACTTCTGCCAGAATACCCAGGTGTTCTCTCTGATGTCCAGGAGGAGAAAGGCATTAAGTACAAATTTGAAGTATATGAGAAGAATGATTAA（配列番号２）で表されるＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態においては、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、
MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL SRSLDDALKL TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM QDFESDTFFP EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND（配列番号３）で表されるタンパク質配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは環状である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜５ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記プロモーター領域は、ＥＦ１プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、タンパク質をコードする遺伝子を１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインなどの、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記関連する複数のタンパク質は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態においては、前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列は、複数の関連配列において利用されている配列および／または核酸塩基の可変性を比較することによって作製される。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、抗体またはその一部を含み、該抗体またはその一部はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態においては、前記導入をエレクトロポレーションによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択を、選択マーカーカセットを使用して選択圧を高めることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬は選択剤を含む。いくつかの実施形態においては、前記選択剤はメトトレキサートである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域が少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、前記第２の濃度域が少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭもしくは１００ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、７５ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭもしくは１５０ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、７５ｎＭ、８５ｎＭ、９５ｎＭ、１０５ｎＭ、１１５ｎＭ、１２５ｎＭ、１３５ｎＭ、１４５ｎＭもしくは１５０ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、１１２ｎＭ、１２２ｎＭ、１３２ｎＭ、１４２ｎＭ、１５２ｎＭ、１６２ｎＭ、１７２ｎＭ、１８２ｎＭ、１９２ｎＭ、２０２ｎＭ、２１２ｎＭもしくは２２５ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、前記第１の濃度域は少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭもしくは６７５ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、１０００ｎＭもしくは１０１２ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記１回目の選択は、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記２回目の選択は、前記Ｔ細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日もしくは１４日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の時間にわたって、前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記対象はヒトである。

【0011】

いくつかの実施形態においては、養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞を製造する方法であって、
遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
Ｔ細胞に前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞を単離することを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、第１〜第７の配列を含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む最適化された配列であり、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含む最適化された配列であり、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体のメトトレキサートに対する親和性が１５，０００分の１または約１５，０００分の１に低減されており、メトトレキサートを選択メカニズムとして用いることによって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞を選択的に増殖させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位（attP）を含み、
第７の配列が、第２の付着部位（attB）を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復を含む第２の配列の５’末端に隣接していることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする遺伝子は、
ATGGTTGGTTCGCTAAACTGCATCGTCGCTGTGTCCCAGAACATGGGCATCGGCAAGAACGGGGACTTCCCCTGGCCACCGCTCAGGAATGAATCCAGATATTTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAAGAAGACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGGTAGAATTAATTTAGTTCTCAGCAGAGAACTCAAGGAACCTCCACAAGGAGCTCATTTTCTTTCCAGAAGTCTAGATGATGCCTTAAAACTTACTGAACAACCAGAATTAGCAAATAAAGTAGACATGGTCTGGATAGTTGGTGGCAGTTCTGTTTATAAGGAAGCCATGAATCACCCAGGCCATCTTAAACTATTTGTGACAAGGATCATGCAAGACTTTGAAAGTGACACGTTTTTTCCAGAAATTGATTTGGAGAAATATAAACTTCTGCCAGAATACCCAGGTGTTCTCTCTGATGTCCAGGAGGAGAAAGGCATTAAGTACAAATTTGAAGTATATGAGAAGAATGATTAA（配列番号２）で表されるＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態においては、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、
MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL SRSLDDALKL TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM QDFESDTFFP EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND（配列番号３）で表されるタンパク質配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは環状である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜５ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記プロモーター領域は、ＥＦ１プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、タンパク質をコードする遺伝子を１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインなどの、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記関連する複数のタンパク質は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態においては、前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列は、複数の関連配列において利用されている配列および／または核酸塩基の可変性を比較することによって作製される。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、抗体またはその一部を含み、該抗体またはその一部はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記導入をエレクトロポレーションによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択を、選択マーカーカセットを使用して選択圧を高めることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬は選択剤を含む。いくつかの実施形態においては、前記選択剤はメトトレキサートである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域が少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、前記第２の濃度域が少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭもしくは１００ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、７５ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭもしくは１５０ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、７５ｎＭ、８５ｎＭ、９５ｎＭ、１０５ｎＭ、１１５ｎＭ、１２５ｎＭ、１３５ｎＭ、１４５ｎＭもしくは１５０ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、１１２ｎＭ、１２２ｎＭ、１３２ｎＭ、１４２ｎＭ、１５２ｎＭ、１６２ｎＭ、１７２ｎＭ、１８２ｎＭ、１９２ｎＭ、２０２ｎＭ、２１２ｎＭもしくは２２５ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、前記第１の濃度域は少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭもしくは６７５ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、１０００ｎＭもしくは１０１２ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記１回目の選択は、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記２回目の選択は、前記Ｔ細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日もしくは１４日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の時間にわたって、前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞はＴ細胞前駆細胞を含む。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。

【0012】

いくつかの実施形態においては、養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変細胞を製造する方法であって、
遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
Ｔ細胞前駆細胞に前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞前駆細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記Ｔ細胞前駆細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞前駆細胞を単離することを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに核酸を安定に挿入するための前記遺伝子送達ポリヌクレオチドであって、
該遺伝子送達ポリヌクレオチド内において、挿入される該核酸が逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれていること、
該遺伝子送達ポリヌクレオチドが選択可能であること、
該遺伝子送達ポリヌクレオチドが、第１〜第７の配列を含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子またはｍＲＮＡにより転写される配列をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む最適化された配列であり、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含む最適化された配列であり、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体のメトトレキサートに対する親和性が１５，０００分の１または約１５，０００分の１に低減されており、メトトレキサートを用いて、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞の選択を行うことによって、前記少なくとも１つの遺伝子を発現する細胞の割合を増加させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位（attP）を含み、
第７の配列が、第２の付着部位（attB）を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復を含む第２の配列の５’末端に隣接していることを特徴とする。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは環状である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜５ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記プロモーター領域は、ＥＦ１プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、タンパク質をコードする遺伝子を１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインなどの、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記関連する複数のタンパク質は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列は、複数の関連配列において利用されている配列および／または核酸塩基の可変性を比較することによって作製される。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、抗体またはその一部を含み、該抗体またはその一部はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記導入をエレクトロポレーションによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択を、選択マーカーカセットを使用して選択圧を高めることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬は選択剤を含む。いくつかの実施形態においては、前記選択剤はメトトレキサートである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域が少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、前記第２の濃度域が少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、前記第１の濃度域は少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記１回目の選択は、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記２回目の選択は、前記Ｔ細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日もしくは１４日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の時間にわたって、前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。

【0013】

いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞前駆細胞におけるタンパク質の産生を増加させる方法であって、
ポリヌクレオチドを提供すること、
細胞に前記ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞前駆細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記Ｔ細胞前駆細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞前駆細胞を単離すること
を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに核酸を安定に挿入するための前記遺伝子送達ポリヌクレオチドであって、
該遺伝子送達ポリヌクレオチド内において、挿入される該核酸が逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれていること、
該遺伝子送達ポリヌクレオチドが選択可能であること、
該遺伝子送達ポリヌクレオチドが、第１〜第７の配列を含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子またはｍＲＮＡにより転写される配列をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む最適化された配列であり、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含む最適化された配列であり、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体のメトトレキサートに対する親和性が１５，０００分の１または約１５，０００分の１に低減されており、メトトレキサートを用いて、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞の選択を行うことによって、前記少なくとも１つの遺伝子を発現する細胞の割合を増加させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位（attP）を含み、
第７の配列が、第２の付着部位（attB）を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復を含む第２の配列の５’末端に隣接していることを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは環状である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜５ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記プロモーター領域は、ＥＦ１プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、タンパク質をコードする遺伝子を１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインなどの、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記関連する複数のタンパク質は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列は、複数の関連配列において利用されている配列および／または核酸塩基の可変性を比較することによって作製される。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、抗体またはその一部を含み、該抗体またはその一部はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記導入をエレクトロポレーションによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択を、選択マーカーカセットを使用して選択圧を高めることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬は選択剤を含む。いくつかの実施形態においては、前記選択剤はメトトレキサートである。

【0014】

いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記１回目の選択は、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記２回目の選択は、前記細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】遺伝子送達ミニサークルを産生するプラスミドであるMC_T3/FP-DHFRdmの全体の概略図を示す。Sleeping BeautyトランスポゾンのＴ３世代を含むミニサークルは、ＥＦ１ａプロモーターと、蛍光タンパク質（ＦＰ；maxGFP、mCherryまたは青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ））およびThosea asignaウイルス２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）およびメトトレキサート（ＭＴＸ）非感受性のジヒドロ葉酸還元酵素（DHFRdm）の二重変異体からなる融合体とを、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ、矢印で示す）の間に含む。attB部位とattP部位との間の組換え体はミニサークルを製造し、残りの細菌性骨格は酵素的に分解される。

【0016】

【図2】トランスポゾン：トランスポゼースのＤＮＡ比の最適化を示す一連の棒グラフを示す。２μｇのMC_T3/eGFP-T2A-DHFRdm DNA（トランスポゾン）と、段階的に濃度を上げたMC_SB100X（トランスポゼース）DNA（０．５μｇ、１μｇ、２μｇ、４μｇ、８μｇ）とを使用して、Ｈ９細胞をヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクションの２４時間後（縞模様の棒）および７日後（黒色の棒）にフローサイトメトリーを実施し、一過性トランスフェクション効率および安定なトランスフェクション効率を評価した。棒の上に示した数字は、一過性のＧＦＰ発現に対する安定なＧＦＰ発現のパーセンテージとして算出された組み込み効率を示す。

【0017】

【図3】選択工程におけるＭＴＸ濃度の影響を示す一連の棒グラフを示す。T3/GFP-T2A-DHFRdmトランスポゾンDNAで安定にトランスフェクトされたＨ９細胞集団を、濃度を段階的に上げたＭＴＸ（０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭおよび２００ｎＭ）の存在下において、３日間（白色の棒）、５日間（横縞）、７日間（縦縞）および１０日間（黒色の棒）培養した後、フローサイトメトリーで分析した。図３のパネルＡは、ＧＦＰ^＋／ＰＩ⁻のパーセンテージを示し、図３のパネルＢは平均ＧＦＰ相対蛍光単位（ＲＦＵ）を示す。

【0018】

【図4】ＭＴＸ除去後の導入遺伝子の持続性を示す一連の棒グラフを示す。T3/GFP-T2A-DHFRdmトランスポゾンで安定にトランスフェクトされたＨ９細胞集団をフローサイトメトリーで分析した結果を示す。まず、このＨ９細胞集団を様々な濃度のＭＴＸ（５０ｎＭ、１００ｎＭおよび２００ｎＭ）を添加した培地中で２週間培養し（黒色の棒）、その後ＭＴＸによる選択を中止し、様々な時点（１週間後（横縞）、２週後（縦縞）、３週後（格子模様の棒）および４週後（白色の棒））においてデータを収集した。図４のパネルＡはＧＦＰ^＋／ＰＩ⁻のパーセンテージを示し、図４のパネルＢは平均ＧＦＰ相対蛍光単位（ＲＦＵ）を示す。

【0019】

【図5A】ヒト半数体ゲノム当たりのトランスポゾンのコピー数を示す。様々な濃度のＭＴＸ（５０ｎＭ、１００ｎＭおよび２００ｎＭ）による選択を行う前および行った後に、T3/GFP-T2A-DHFRdmトランスポゾンDNAが安定にトランスフェクトされたＨ９細胞集団からゲノムＤＮＡを単離した。トランスポゾンの平均コピー数を定量的ＰＣＲにより決定した。「ゴールドスタンダード」クローンは限界希釈法により作製した。「ソーティング」した集団は、元のＨ９集団（トランスポゾンの組み込み率：８％）をソーティングすることによって、ＧＦＰ陽性細胞が１００％を占める集団として作製した。枠で囲まれた棒グラフ上のアスタリスク（^＊）は、スチューデントのｔ検定によって、２００ｎＭのＭＴＸにより選択された集団とソーティングされた集団との間に有意差が見られたことを示す（Ｐ＝０．０４）。

【0020】

【図5B】トランスポゾンの組み込み数の分布を示す。２００ｎＭのＭＴＸを用いた選択によって、T3/GFP-T2A-DHFRdmトランスポゾンが組み込まれた細胞が１００％を占めるＨ９集団を調製し、このＨ９集団から６０個のクローンを限界希釈法により単離した。ゲノムＤＮＡを単離し、相対的ＲＴ−ｑＰＣＲによりトランスポゾンのコピー数を測定した。測定値は最も近い整数値に丸めた（たとえば、０．５〜１．５は１で示した）。Ｎ＝６０で行い、平均±標準偏差＝１．７８±０．６９であった。得られたデータから、組み込みが起こった確率および標準誤差を算出した（挿入図）。

【0021】

【図6】トランスポゾンの多重化の分析結果を表す一連の円グラフを示す。パネルＡ〜Ｃは、異なる蛍光タンパク質（ＦＰ）を含むトランスポゾンを含む３種のミニサークル（MC_T3/GFP-T2A-DHFRdm、 MC_T3/BFP-T2A-DHFRdm、MC_T3/mCherry-T2A-DHFRdm）それぞれ２μｇと、MC_SB100X DNA ６μｇとでヌクレオフェクトしたＨ９細胞集団を、様々な時点においてフローサイトメトリーで分析した結果を示す。（パネルＡ）トランスフェクションの２４時間後（一過性発現）、（パネルＢ）１週間後（安定な組み込み）および（パネルＣ）２００ｎＭのＭＴＸによる選択の１週間後をそれぞれ示す。

【0022】

【図7】１種のＦＰの発現、２種のＦＰの発現および３種のＦＰの発現を選択することによって、その分布を分析した結果を示す棒グラフを示す。３種のトランスポゾンが安定にトランスフェクトされたＨ９細胞集団を２００ｎＭのＭＴＸにより１週間かけて選択し、次いで、５００ｎＭおよび１０００ｎＭに濃度を高めたＭＴＸに暴露させた。

【0023】

【図8】ＭＴＸによる選択後、Sleeping Beautyを用いたトランスポゾンＤＮＡのリンパ球における安定な発現についてフロー分析した結果の一例を示す。新たに解凍したＰＢＭＣに、ミニサークルＧＦＰ（mcGFP）ＤＮＡ（MC_T3/GFP-T2A-DHFRdm）および Sleeping BeautyトランスポゼースＤＮＡ（MC_SB100X）をエレクトロポレーションによって導入した。次いで、ＣＤ３およびＣＤ２８に結合することによってＴ細胞を選択的に活性化するMiltenyi Transactビーズを使用して、前記ＰＢＭＣを刺激した。エレクトロポレーションの１週間後、２５ｎＭ、５０ｎＭおよび１００ｎＭのＭＴＸを使用して、ＰＢＭＣ試料を１２日間かけて選択した（図では５０ｎＭを示す）。パネルＡ、ＢおよびＣは、リンパ球（Ａ）、単一細胞（Ｂ）および生細胞（Ｃ）の逐次選択をそれぞれ示す。パネルＤにおいては、ＣＤ８^＋集団およびＣＤ８⁻集団の両方においてＧＦＰの高レベル発現が示された。このドナーに関しては、刺激後のリンパ球の大部分がＣＤ８^＋Ｔ細胞であったことに留意されたい。

【0024】

【図9】Sleeping Beautyを用いたトランスポゾンＤＮＡのリンパ球における初期発現のヒストグラムを示す。mcGFP DNA単独（１０μｇ）、mcGFP:MC_SB100X＝２：１としてのmcGFP（１０μｇ）およびMC_SB100X DNA（５μｇ）、mcGFP:MC_SB100X＝１：１としてのmcGFP（１０μｇ）およびMC_SB100X ＤＮＡ（１０μｇ）、pMAXGFP（１０μｇ）対照、またはＤＮＡを含まない対照のいずれかでＰＢＭＣをトランスフェクトした。パネルＡは、初期エレクトロポレーション効率の一例として、Transactビーズを加えなかった、トランスフェクションの２日後の細胞の結果を示す。パネルＢにおいて、Transactビーズに暴露させた５日後の細胞の結果を示す。５日目までにmcGFP DNAレベルは対照レベル付近まで低下したが、トランスポゼースを共トランスフェクトした細胞では、mcGFPは上昇したまま維持された。

【0025】

【図10】ＭＴＸを添加する一週間前における、トランスフェクトされたリンパ球のＧＦＰトランスポゾンＤＮＡの発現量および細胞増殖レベルを示す。mcGFP ＤＮＡ単独、mcGFP：MC_SB100X＝２：１のmcGFPおよびMC_SB100X DNA、mcGFP：MC_SB100X＝１：１のmcGFPおよびMC_SB100X DNA、pMAXGFP対照（１０μｇ）またはＤＮＡを含まない対照のいずれかでＰＢＭＣをトランスフェクトした。パネルＡは、２日目〜７日目においてＧＦＰの発現レベルが低下したことを示す。パネルＢは、０日目にMiltenyi Transactビーズで処理したトランスフェクト細胞試料の０日目〜７日目の生細胞量を示す。パネルＣは、Transactビーズ非存在下での、トランスフェクト細胞試料の０日目〜７日目の生細胞量を示す。図に示すように、Miltenyi Transactビーズの存在下での、mcGFP DNAをトランスフェクトした細胞ではゆっくりとした増殖が見られる。

【0026】

【図11】ＭＴＸによる選択を行った１週間後に、Sleeping Beautyを用いたトランスポゾンＤＮＡがＴ細胞において安定に発現されていることを示す。トランスポゾンＤＮＡおよびSleeping BeautyトランスポゼースＤＮＡのトランスフェクションによってＧＦＰを発現するように改変されたＴ細胞のＧＦＰの産生および増殖を調査したフローサイトメトリーの散布図を示す。パネルＡ、Ｂ、ＥおよびＦは、リンパ球を同定するための散布図を示し、パネルＣ、Ｄ、ＧおよびＨはＣＤ８およびＧＦＰの発現を示す。パネルＡ〜Ｄは、１００ｎＭのＭＴＸで処理した細胞のフローサイトメトリー分析を示す。パネルＥ〜Ｈは、ＭＴＸで処理しなかった細胞のフローサイトメトリー分析を示す。パネルＡ、Ｃ、ＥおよびＧは、mcGFPを単独でトランスフェクトした試料を示す。パネルＢ、Ｄ、ＦおよびＨは、mcGFPおよびMC_SB100X（Sleeping Beautyトランスポゼース）DNAを２：１でトランスフェクトした細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。パネルＤに示すように、ＧＦＰ遺伝子が細胞内ゲノムに安定して挿入されるようにmcGFPおよびSB100Xで共トランスフェクトしたＴ細胞（ＣＤ８^＋およびＣＤ８⁻）においては、１００ｎＭのＭＴＸの存在下で約９５％の細胞が安定してＧＦＰを発現し、一方、ＭＴＸの非存在下では、わずか約２３％の細胞死しかＧＦＰを発現しなかった。

【0027】

【図12】ＭＴＸによる選択を行った１４日後における、トランスポゾンをトランスフェクトしたリンパ球の増殖およびＧＦＰ／ＣＤ８の発現を示す。ＤＮＡをトランスフェクトしなかった細胞試料（対照）、mcGFPを単独でトランスフェクトした細胞試料、mcGFP：MC_SB100X＝２：１のmcGFPおよびMC_SB100X DNAをトランスフェクトした細胞試料、またはmcGFP：MC_SB100X＝１：１のmcGFPおよびMC_SB100X DNAをトランスフェクトした細胞試料を調製した。１週間後、これらの細胞を、０ｎＭのＭＴＸ（対照）、２５ｎＭのＭＴＸ、５０ｎＭのＭＴＸまたは１００ｎＭのＭＴＸを使用して選択した。第１の欄、第３の欄、第５の欄および第７の欄に示したリンパ球ウィンドウは、高濃度のＭＴＸの存在下では、安定にトランスフェクトされた細胞のみが生存可能であることを示している。第２の欄、第４の欄、第６の欄および第８の欄においては、ＧＦＰおよびＣＤ８を検出することによって単一の生リンパ球をゲーティングした。mcGFPを単独でトランスフェクトした細胞試料では、ＧＦＰの発現は経時的に消失する（第２欄）。しかし、mcGFPおよびMC_SB100Xの両方がトランスフェクトされた細胞は、ＭＴＸによる選択を行った後でも（＞９０％）、ＭＴＸによる選択を行う前であっても（約２０％）、ＧＦＰを安定に発現する（第４欄および第６欄）。図に示すように、mcGFPおよびMC_SB100X DNAがトランスフェクトされた試料においては、５０ｎＭおよび１００ｎＭの濃度のＭＴＸによって有効に選択を行うことができ、mcGFPとMC_SB100Xとの比率が２：１であっても１：１であっても有意差は見られなかった。リンパ球の大部分がＣＤ８^＋Ｔ細胞であることには留意されたい。

【0028】

【図13】ＭＴＸによる選択を行った１９日後における、トランスポゾンをトランスフェクトした細胞のリンパ球ウィンドウおよびＧＦＰ／ＣＤ８の発現を示す。DNAをトランスフェクトしなかった細胞試料（対照）、mcGFPを単独でトランスフェクトした細胞試料、mcGFP：MC_SB100X＝2：1のmcGFPおよびMC_SB100X DNAをトランスフェクトした細胞試料、またはmcGFP：MC_SB100X＝1：1のmcGFPおよびMC_SB100X DNAをトランスフェクトした細胞試料を調製した。これらの細胞を、０ｎＭのＭＴＸ（対照）、２５ｎＭのＭＴＸ、５０ｎＭのＭＴＸまたは１００ｎＭのＭＴＸを使用して選択した。第１の欄、第３の欄、第５の欄および第７の欄に示したリンパ球ウィンドウは、ＭＴＸの存在下では、安定にトランスフェクトされた細胞のみが生存可能であることを示している。第２の欄、第４の欄、第６の欄および第８の欄においては、ＧＦＰおよびＣＤ８を検出することによって単一の生リンパ球をゲーティングした。mcGFPを単独でトランスフェクトした細胞試料では、ＧＦＰの発現は経時的に消失する（第２欄）。しかし、mcGFPおよびMC_SB100Xの両方がトランスフェクトされた細胞は、ＭＴＸによる選択を行った後でも（＞９０％）、ＭＴＸによる選択を行う前であっても（約２０％）、ＧＦＰを安定に発現する（第４欄および第６欄）。図に示すように、mcGFPおよびMC_SB100X DNAがトランスフェクトされた試料においては、５０ｎＭおよび１００ｎＭの濃度のＭＴＸによって有効に選択を行うことができたが、２５ｎＭでは有効性はわずかに低かった。また、mcGFPとMC_SB100Xとの比率が２：１であっても１：１であっても有効に選択された。

【0029】

【図14】トランスポゾンＤＮＡを安定に発現し、ＭＴＸにより選択された細胞の生細胞数を示す。トランスフェクションの７日後、１４日後および１９日後にトリパンブルー染色による細胞カウントを行った。ＤＮＡをトランスフェクトしなかったＰＢＭＣ試料（対照）、mcGFPを単独でトランスフェクトしたＰＢＭＣ試料、mcGFP：MC_SB100X＝２：１のmcGFPおよびMC_SB100X ＤＮＡをトランスフェクトしたＰＢＭＣ試料、またはmcGFP：MC_SB100X＝１：１のmcGFPおよびMC_SB100X ＤＮＡをトランスフェクトしたＰＢＭＣ試料を調製した。７日目に、これらの細胞を、０ｎＭのＭＴＸ（対照）、２５ｎＭのＭＴＸ、５０ｎＭのＭＴＸまたは１００ｎＭのＭＴＸを使用して選択した。パネルＡは、ＭＴＸの非存在下での生細胞数を示す。パネルＢは、１００ｎＭのＭＴＸに暴露させた後の生細胞数を示す。パネルＣは、５０ｎＭのＭＴＸに暴露させた後の生細胞数を示す。パネルＤは、２５ｎＭのＭＴＸに暴露させた後の生細胞数を示す。ＭＴＸは、葉酸の代謝を抑制することによって細胞の増殖を遅延させるため、ＭＴＸ抵抗性遺伝子（DHFRdm）を共発現するmcGFPトランスポゾンとSleeping BeautyトランスポゼースをコードするMC_SB100Xプラスミドとをトランスフェクトさせた細胞のみが、組み込まれたトランスポゾンＤＮＡを安定に発現したことから、高濃度のＭＴＸの存在下で増殖可能であった。

【0030】

【図15】ＭＴＸによる選択下において、ＧＦＰトランスポゾンＤＮＡおよびSleeping Beautyトランスポゼースを安定して発現するリンパ球によるＧＦＰの発現を分析した結果を示す。mcGFPを単独でトランスフェクトしたＰＢＭＣ試料、mcGFP：MC_SB100X＝２：１のmcGFPおよびMC_SB100XをトランスフェクトしたＰＢＭＣ試料、mcGFP：MC_SB100X＝１：１のmcGFPおよびMC_SB100XをトランスフェクトしたＰＢＭＣ試料、pMAXGFP（１０μｇ）をトランスフェクトしたＰＢＭＣ試料、ＤＮＡをトランスフェクトしなかったＰＢＭＣ試料（対照）を調製した。トランスフェクションの７日後に細胞をＭＴＸに暴露させ、単一の生リンパ球におけるＧＦＰ発現を測定した。パネルＡは、ＭＴＸの非存在下における、２日目、５日目、７日目、１４日目および１９日目のＧＦＰの発現レベルを示す。パネルＢは、０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭおよび１００ｎＭの濃度のＭＴＸによる選択下での、mcGFPが単独でトランスフェクトされたリンパ球の７日目、１４日目および１９日目におけるＧＦＰの発現レベルを示す。パネルＣは、０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭおよび１００ｎＭのＭＴＸによる選択下での、mcGFP：MC_SB100X＝２：１のmcGFPおよびMC_SB100XがトランスフェクトされたＴ細胞におけるＧＦＰの発現を示す。パネルＤは、０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭおよび１００ｎＭの濃度のＭＴＸによる選択制御下での、mcGFP：MC_SB100X＝１：１のmcGFPおよびMC_SB100XがトランスフェクトされたＴ細胞におけるＧＦＰの発現を示す。図に示すように、mcGFPおよびMC_SB100Xを２：１でトランスフェクトさせても１：１でトランスフェクトさせても同様の結果が得られ、ＭＴＸによる選択の１週間後には、２５ｎＭにおいてはＧＦＰの発現レベルは約７５％に達し、５０ｎＭおよび１００ｎＭにおいてはＧＦＰの発現レベルは約９０％に達した。さらに、５０ｎＭのＭＴＸによる処理と１００ｎＭのＭＴＸによる処理との間のＧＦＰの発現の差はごくわずかであった。

【0031】

【図16】Sleeping Beautyトランスポゾン（ミニサークル構築物）を示す。本明細書に記載の実施形態のいくつかのために設計された、いくつかのsleeping beauty構築物の概略図である。

【0032】

【図17】ＧＦＰの発現のための遺伝子を含むSleeping Beautyトランスポゾンがトランスフェクトされた細胞のいくつかの散布図を示す。トランスフェクションの１４日後の細胞を示す。ＧＦＰをコードする遺伝子を含むトランスポゾンまたはSB100Xをエレクトロポレーションにより細胞に導入した。

【0033】

【図18】Sleeping BeautyトランスポゾンおよびＭＴＸ（ＧＦＰトランスポゾン）を示す。図に示すように、mcGFPプラスミドと、ＧＦＰの発現のための遺伝子を含むSleeping Beautyトランスポゾンとを様々な比率で細胞にトランスフェクトした（McGFP：ＳＢ＝１：１および２：１）。図に示すように、ＭＴＸを添加しなかった場合、１８日後のＧＦＰ発現は低値を示した。Sleeping Beautyトランスポゾンを用いた場合、ＭＴＸの存在下でＧＦＰの発現が増加することが示されている。

【0034】

【図19】Sleeping Beautyトランスポゾン（ミニサークル構築物）を示す。本明細書に記載の実施形態のいくつかのために設計された、いくつかのsleeping beauty構築物の概略図である。

【0035】

【図20】Sleeping BeautyトランスポゾンおよびＭＴＸ（ＧＦＰトランスポゾン−SB100X DNAおよびRNA）を示す。GFP、CARもしくはGFP/mCherry/BFPをコードする遺伝子を含むトランスポゾンまたはSB100X（ＤＮＡまたはＲＮＡ）エレクトロポレーションにより細胞に導入した。

【0036】

【図21】Sleeping BeautyトランスポゾンおよびＭＴＸ（ＧＦＰトランスポゾン−SB100X DNAおよびRNA）を示す。ＧＦＰ遺伝子を含むトランスポゾンがトランスフェクトされた細胞の散布図のいくつかを示す。細胞試料のいくつかに、ＧＦＰの発現のための遺伝子を含むＤＮＡ（２．５μｇもしくは５μｇ）、mcGFP単独、またはＲＮＡ（１μｇもしくは３μｇ）をトランスフェクトした。試料を分けて、０μＭ、５０μＭおよび１００μＭの様々な濃度のＭＴＸの影響下で培養した。

【0037】

【図22】Sleeping BeautyトランスポゾンおよびＭＴＸ（ＧＦＰトランスポゾン−SB100X DNAおよびRNA）を示す。左上のパネルに示したように、ＧＦＰの発現のための遺伝子を含むSleeping Beautyトランスポゾンを様々な濃度で細胞にトランスフェクトした。その後、トランスフェクションの７日後にＭＴＸを添加した。図に示すように、５０μｇ〜１００μｇでトランスフェクトされた細胞は、７日目〜１４日目にＧＦＰを発現可能である。

【0038】

【図23】ＭＴＸの存在下でＧＦＰを発現するＤＮＡおよびＲＮＡを示す。図に示すように、mcGFP、GFP:SBおよびGFP:SB RNAがトランスフェクトされた細胞を培養し、トランスフェクションの７日後にＭＴＸに暴露させた。対照として、ＭＴＸに暴露させず細胞を１４日間培養した（左上のパネル）。

【0039】

【図24】ＧＦＰ：ＳＢがトランスフェクトされた細胞におけるＧＦＰの発現を示す。左のパネルに示すように、様々な濃度のGFP:SB（２．５μｇ、５μｇ）を細胞にトランスフェクトし、様々な濃度のＭＴＸ（５０μＭおよび１００μＭ）に暴露させた。図に示すように、５μｇのGFP:SBをトランスフェクトした場合、ＭＴＸの存在下において細胞はＧＦＰを発現可能であり、ＭＴＸの濃度としては５０μＭが最も適していた。ＲＮＡを使用してこの実験をさらに実施したが、前記タンパク質を発現させるにはＤＮＡを使用する方が高効率である。

【0040】

【図25】Sleeping Beautyトランスポゾン（ミニサークル構築物）を示す。本明細書に記載の実施形態のいくつかのために設計された、いくつかのsleeping beauty構築物の概略図である。

【0041】

【図26】CD19 CARの発現を示す。CD19 CARをコードする遺伝子を含むSleeping Beauty構築物を構築した（SB:CD19 CAR）。ＤＮＡ（２．５μｇまたは５μｇ）またはＲＮＡ（１μｇまたは３μｇ）のいずれかを細胞にトランスフェクトした。図に示すように、いずれの濃度のＤＮＡまたはＲＮＡであっても、ＤＮＡまたはＲＮＡがトランスフェクトされた細胞は、５０μＭのＭＴＸの存在下でCD19 CARを発現可能であった。１μｇのＲＮＡがトランスフェクトされた細胞でも、１００μＭのＭＴＸの存在下でCD19 CARを発現可能であった。

【0042】

【図27】CD19 CARの発現を示す。CD19 CARをコードする遺伝子を含むSleeping Beauty構築物を構築した（SB:CD19 CAR）。ＤＮＡ（２．５μｇまたは５μｇ）またはＲＮＡ（１μｇまたは３μｇ）のいずれかを細胞にトランスフェクトした。細胞を培養し、トランスフェクションの７日後にＭＴＸに暴露させた。CD19 CARは、EGFRtタグをさらに含んでいた。図に示すように、タグの検出はCD19 CARの発現と相関する。ＭＴＸに暴露させ後、CAR19をコードする遺伝子を含むSleeping Beauty構築物を含むＤＮＡがトランスフェクトされた細胞、およびCAR19をコードする遺伝子を含むSleeping Beauty構築物を含むＲＮＡがトランスフェクトされた細胞において、タグが検出された。

【0043】

【図28】Sleeping BeautyトランスポゾンおよびＭＴＸ（CD19 CAR）、ＣＤ８^＋細胞の増殖ならびにCD19 CARの発現を示す。CD19 CARをコードする遺伝子を含むSleeping Beauty構築物を構築した（SB:CD19 CAR）。ＤＮＡ（２．５μｇまたは５μｇ）またはＲＮＡ（１μｇまたは３μｇ）のいずれかを細胞にトランスフェクトした。細胞を培養し、トランスフェクションの７日後にＭＴＸに暴露させた。図に示すように、ＣＤ８^＋細胞は低濃度のＤＮＡがトランスフェクトされた場合において増殖可能であった。これに対して、ＲＮＡを使用した場合、濃度が高いほど発現量は多くなったが、濃度が低いほど細胞の初期増殖が多いことが分かった。

【0044】

【図29】Sleeping Beautyトランスポゾン（ミニサークル構築物）を示す。本明細書に記載の実施形態のいくつかのために設計された、いくつかのsleeping beauty構築物の概略図である。

【0045】

【図30】Sleeping BeautyトランスポゾンおよびＭＴＸ（マルチプレックス３ＦＰ）を示す。ＤＮＡまたはmcFPをエレクトロポレーションによって細胞に導入し、ＭＴＸの存在下で細胞を培養した。その後、散布図に示したように、mCherry、BFPおよび／またはGFPの発現について細胞を分析した。

【0046】

【図31】Sleeping BeautyトランスポゾンおよびＭＴＸ（マルチプレックス３ＦＰ）を示す。

【0047】

【図32】Sleeping Beautyトランスポゾン（ミニサークル構築物）を示す。本明細書に記載の実施形態のいくつかのために設計された、いくつかのsleeping beauty構築物の概略図である。

【0048】

【図33】図に示すように、Sleeping Beautyトランスポゾンを含むＤＮＡをエレクトロポレーションにより細胞に導入し、２回目の選択において様々な濃度のＭＴＸに暴露させた。

【0049】

【図34】Sleeping Beautyトランスポゾンを含むＤＮＡをエレクトロポレーションにより導入した細胞における、様々な濃度のＭＴＸ（２ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭおよび５００ｎＭ）の存在下でのマーカータンパク質の発現を示す。

【0050】

【図35】Sleeping Beautyトランスポゾン（ミニサークル構築物）を示す。本明細書に記載の実施形態のいくつかのために設計された、いくつかのsleeping beauty構築物の概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0051】

下記の用語の定義は、本発明の態様または実施形態の理解を容易にするために提供される。

【0052】

本明細書に記載の「１つの（ａまたはａｎ）」は、１または１以上を意味しうる。

【0053】

本明細書において「約」は、特定の値が、値を決定するために用いられる方法に本質的に付随する誤差の変動または複数の実験間の変動を含むことを示す。

【0054】

本明細書に記載の「核酸」または「核酸分子」は、ポリヌクレオチドを指し、たとえば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により作製されたフラグメント、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより作製されたフラグメントなどが挙げられる。核酸分子は、天然のヌクレオチドモノマー（ＤＮＡおよびＲＮＡなど）、または天然に存在するヌクレオチドの類似体（たとえば、天然に存在するヌクレオチドのエナンチオマー）からなるモノマー、またはこれらの組み合わせから構成されうる。改変ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に改変を有していてもよい。糖部分の改変としては、たとえば、ハロゲン、アルキル基、アミンおよびアジド基による１つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げられ、あるいは、糖部分はエーテル化またはエステル化されてもよい。さらに、糖部分全体が、立体構造的に類似の構造や電子的に類似の構造と置換されていてもよく、このような構造として、たとえば、アザ糖および炭素環式糖類似体が挙げられる。改変された塩基部分としては、アルキル化プリンおよびアルキル化ピリミジン、アシル化プリンおよびアシル化ピリミジン、ならびにその他の公知の複素環置換が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこれと似た結合により連結することができる。ホスホジエステル結合と似た結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロセレノエート結合、ホスホロジセレノエート結合、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）結合、ホスホロアニリデート（phosphoranilidate）結合、ホスホロアミデート結合などが挙げられる。「核酸分子」は、いわゆる「ペプチド核酸」も包含し、これは、天然の核酸塩基または改変された核酸塩基が付加されたポリアミド骨格を含む。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、遺伝子に核酸を安定に挿入するための遺伝子送達ポリヌクレオチドが提供される。「オリゴヌクレオチド」という用語は核酸と同じ意味で使用可能であり、ＤＮＡもしくはＲＮＡと呼ぶことができる。オリゴヌクレオチドは、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。

【0055】

「遺伝子」は、生物の遺伝の分子単位であり、生物において特定の機能を有するポリペプチドまたはＲＮＡ鎖をコードする、ある程度の長さのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）である。また、遺伝子は、生物のゲノムにおいてその位置が特定可能な領域でありうる。本明細書のいくつかの実施形態においては、遺伝子に核酸を安定に挿入するための遺伝子送達ポリヌクレオチドであって、該遺伝子送達ポリヌクレオチド内において、挿入される該核酸が逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれていること、該遺伝子送達ポリヌクレオチドが選択可能であることを特徴とする遺伝子送達ポリヌクレオチドが提供される。

【0056】

「染色体」は、ＤＮＡ、タンパク質およびＲＮＡからなるひとまとまりの組織化されたクロマチン、すなわち細胞内に見られる巨大分子の複合体である。いくつかの実施形態においては、遺伝子に核酸を安定に挿入するための遺伝子送達ポリヌクレオチドであって、該遺伝子送達ポリヌクレオチド内において、挿入される該核酸が逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれていること、該遺伝子送達ポリヌクレオチドが選択可能であることを特徴とする遺伝子送達ポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態においては、前記核酸は染色体の遺伝子に挿入される。

【0057】

「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を誘導するヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、プロモーターは遺伝子の５’末端の非コード領域に位置し、構造遺伝子の転写開始点の近傍にある。転写開始において機能するプロモーター配列の要素は、コンセンサスヌクレオチド配列により特徴付けられることが多い。プロモーター配列の要素としては、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ＴＡＴＡ配列、ＣＡＡＴ配列、分化特異的要素（ＤＳＥ；McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)；参照によりその全体が組み込まれる）、環状ＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）、血清応答要素（ＳＲＥ；Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990)；参照によりその全体が組み込まれる）、グルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）、および転写因子に対する結合部位が挙げられ、該転写因子としては、たとえば、ＣＲＥ／ＡＴＦ（O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992）；参照によりその全体が組み込まれる）、ＡＰ２（Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994）；参照によりその全体が組み込まれる）、ＳＰ１、ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質（ＣＲＥＢ；Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993); 参照によりその全体が組み込まれる）および８量体因子（概要は、Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed.（The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987；参照によりその全体が組み込まれる）およびLemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)（参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい）が挙げられる。本明細書において、プロモーターは、構成的に活性プロモーター、抑制可能なプロモーター、および誘導可能なプロモーターのいずれであってもよい。プロモーターが誘導可能なプロモーターである場合、転写率は誘導剤に応答して上昇する。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターである場合、転写率は誘導剤による調節を受けない。抑制可能なプロモーターも公知である。いくつかの実施形態において、遺伝子送達ポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはプロモーター配列を含む。

【0058】

「選択マーカーカセット」は、人為的な選択のための特性を付与するために、ベクターまたは細胞に導入される遺伝子である。選択マーカーカセットは、スクリーニング可能なマーカーであってもよく、このような選択マーカーカセットを使用することによって、研究者が望ましい細胞と望ましくない細胞とを識別すること、または特定の種類の細胞を濃縮することが可能となる。いくつかの実施形態においては、遺伝子送達ポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは選択マーカーカセットを含む。

【0059】

本明細書に記載の「ジヒドロ葉酸還元酵素」すなわちＤＨＦＲは、ＮＡＤＰＨを電子ドナーとして使用して、ジヒドロ葉酸をテトラヒドロ葉酸に還元する酵素であり、このテトラヒドロ葉酸は、Ｃ_１転移反応に使用されるテトラヒドロ葉酸由来の補因子に変換されうる。本明細書の実施形態のいくつかにおいては、遺伝子送達ポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含む。

【0060】

本明細書に記載の「メトトレキサート」（ＭＴＸ）は、代謝拮抗薬および葉酸代謝拮抗薬であり、葉酸の代謝を抑制することによって作用する。いくつかの実施形態においては、養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞を製造する方法が提供される。最も広い解釈では、該方法は、
本明細書に記載の実施形態のいずれかに記載の遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
Ｔ細胞に前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の同じ選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、ならびに
該試薬による選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞を単離することを含むことができる。
本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいては、前記選択試薬は選択剤を含む。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬はＭＴＸである。

【0061】

「逆方向反復配列」すなわちＩＲは、その下流に逆向きの相補配列を持つヌクレオチド配列である。逆方向反復配列は、種々の重要な生物学的機能を有しうる。この逆方向反復配列によってトランスポゾンの境界が決まり、自己相補塩基対の形成が可能な領域（単一の配列内において塩基対を形成しうる複数の領域）を示す。これらの特性は、ゲノムの不安定化において重要な役割を果たし、細胞の進化、遺伝的多様性ならびに突然変異や疾患にも寄与する。いくつかの実施形態においては、遺伝子送達ポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、第１の逆方向末端反復遺伝子配列および第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、２つの逆方向反復配列の間に配置されたSleeping Beautyトランスポゾンを含む。

【0062】

Sleeping beautyトランスポゼースは、Sleeping BeautyトランスポゾンのＩＲに存在する特異的結合部位に結合する。ＩＲ（逆方向反復配列）の配列は、cagttgaagtcggaagtttacatacacttaagttggagtcattaaaactcgtttttcaactacTccacaaatttcttgttaacaaacaatagttttggcaagtcagttaggacatctactttgtgcatgacacaagtcatttttccaacaattgtttacagacagattatttcacttataattcactgtatcacaattccagtgggtcagaagtttacatacactaagttgactgtgcctttaaacagcttggaaaattccagaaaatgatgtcatggctttagaagcttctgatagactaattgacatcatttgagtcaattggaggtgtacctgtggatgtatttcaagg（配列番号１）で表される。

【0063】

「ポリペプチド」は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基のポリマーであり、天然に産生されたものでも合成されたものであってもよい。アミノ酸残基の数が約１０個未満のポリペプチドは一般に「ペプチド」と称される。

【0064】

「タンパク質」は、１つ以上のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。タンパク質は、糖鎖などの非ペプチド成分をさらに含んでいてもよい。タンパク質への糖鎖やその他の非ペプチド性置換基の付加は、該タンパク質を産生する細胞によってなされてもよく、細胞種によっても左右される。本明細書においてタンパク質は、そのアミノ酸配列骨格で定義され、糖鎖などの置換基については規定されないが、このような置換基はタンパク質中に存在していてもよい。いくつかの実施形態においては、遺伝子に核酸を安定に挿入するための遺伝子送達ポリヌクレオチドであって、該遺伝子送達ポリヌクレオチド内において、挿入される該核酸が逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれていること、該遺伝子送達ポリヌクレオチドが選択可能であることを特徴とする遺伝子送達ポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのタンパク質をコードする配列をさらに含む。

【0065】

本明細書に記載の「抗体」は、免疫系で機能する形質細胞により産生され、細菌やウイルスなどの外来物を特定しそれを中和する役割を果たす大きなＹ字型タンパク質を指す。抗体タンパク質は４つのポリペプチド鎖、すなわち、ジスルフィド結合により連結された同一の重鎖２本と同一の軽鎖２本とを含むことができる。それぞれの重鎖および軽鎖は、免疫グロブリンドメインと呼ばれる構造ドメインから構成される。これらのドメインは約７０〜１１０個のアミノ酸を含むことができ、そのサイズおよび機能に従って様々なカテゴリーに分類される。いくつかの実施形態においては、遺伝子に核酸を安定に挿入するための遺伝子送達ポリヌクレオチドであって、該遺伝子送達ポリヌクレオチド内において、挿入される該核酸が逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれていること、該遺伝子送達ポリヌクレオチドが選択可能であることを特徴とする遺伝子送達ポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのタンパク質をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、抗体またはその一部をコードする配列を含むことができ、該抗体またはその一部はヒト化されていてもよい。

【0066】

「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）は、キメラＴ細胞受容体としても知られており、人工のＴ細胞受容体である遺伝子改変受容体を指し、エフェクター免疫細胞に任意の特異性を付与することができる。このような受容体を使用することによって、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に移植することができ、たとえば、レトロウイルスベクターを利用して、この受容体のコード配列をＴ細胞に移入することよって前記移植を達成することができる。ＣＡＲの構造は、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに融合された、モノクローナル抗体由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含んでいてもよい。このような分子は、ｓｃＦｖによる標的の認識に応答してζシグナルの伝達を誘導する。いくつかの実施形態においては、遺伝子に核酸を安定に挿入するための遺伝子送達ポリヌクレオチドであって、該遺伝子送達ポリヌクレオチド内において、挿入される該核酸が逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれていること、該遺伝子送達ポリヌクレオチドが選択可能であることを特徴とする遺伝子送達ポリヌクレオチドを使用する。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのタンパク質をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質はキメラ抗原受容体である。キメラ受容体は、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、キメラ免疫受容体、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とも呼ぶことができる。ＣＡＲは、任意の特異性を免疫受容体細胞に付与することが可能な遺伝子改変受容体である。研究者によっては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗体または抗体フラグメント、スペーサー、シグナル伝達ドメインおよび膜貫通領域を含む場合があると考えられている。しかしながら、ＣＡＲの様々な成分すなわちドメイン（たとえばエピトープ結合領域（たとえば、抗体フラグメント、ｓｃＦｖまたはそれらの一部）、スペーサー、膜貫通ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインなど）は改変されており、この改変によって驚くべき効果が得られたことから、本明細書のいくつかの実施形態においてＣＡＲの成分はそれぞれ独立した特徴を有する。ＣＡＲが様々な特徴を有することから、たとえば、特定のエピトープに対しての結合親和性がさらに強くなることがある。

【0067】

人工のＴ細胞受容体すなわちＣＡＲは、養子細胞移入と呼ばれる技術を使用して、がんまたはウイルス感染症の治療法として使用できる。Ｔ細胞を患者から採取し、がん細胞、ウイルスまたはウイルス感染細胞に提示される分子に特異的な受容体を発現するように該Ｔ細胞を改変する。この遺伝子改変Ｔ細胞は、がん細胞もしくはウイルス感染細胞を認識してこれらを殺傷する能力またはウイルスの排除を促進できる能力を有し、このようにして作製された遺伝子改変Ｔ細胞を前記患者に再度導入する。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、キメラ抗原受容体をコードする配列を含むことができる。いくつかの実施形態においては、養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞を製造する方法が提供される。最も広い解釈では、該方法は、
本明細書に記載の実施形態のいずれかに記載の遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、Ｔ細胞に前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞を単離することを含むことができる。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬はＭＴＸである。

【0068】

効果的な免疫応答を惹起するには、Ｔ細胞を共刺激することが望ましく、このような免疫応答はリンパ球が活性化されたときに起こる。共刺激シグナルは抗原非特異的であり、抗原を有する細胞の膜に発現された共刺激分子とＴ細胞とが相互作用することによって発生する。共刺激分子としては、ＣＤ２８、ＣＤ８０およびＣＤ８６が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態においては、養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞を製造する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を有するＴ細胞である。いくつかの実施形態においては、キメラ抗原受容体を有する前記Ｔ細胞は、共刺激リガンドを発現するように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態においては、対象においてがんまたはウイルス感染症を治療、抑制または緩和する方法が提供される。最も広義では、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかに記載のＴ細胞を対象に投与することを含むことができる。遺伝子改変Ｔ細胞を使用して、がんまたはウイルス疾患を治療、抑制または緩和することが好ましく、該遺伝子改変Ｔ細胞は、ウイルスまたはがん細胞により提示される分子に特異的な受容体またはキメラ受容体をコードする複数の導入遺伝子を発現するように形質転換されたＴ細胞を選択的増幅させること、およびＭＴＸの濃度を高めた選択圧下における二段階でのＭＴＸ選択によって、前記形質転換Ｔ細胞を選択することによって得られる。
前記実施形態のいくつかにおいて、前記対象は家畜や愛玩動物などの動物であり、別の実施形態において前記対象はヒトである。前記実施形態のいくつかにおいては、キメラ抗原を有する前記Ｔ細胞は、共刺激分子を発現するように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの共刺激分子をコードする配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは環状である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜６ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。

【0069】

本明細書に記載の「Ｔ細胞前駆細胞」は、胸腺へと遊走して、Ｔ細胞前駆細胞となり得るリンパ球前駆細胞を指し、Ｔ細胞前駆細胞はＴ細胞受容体を発現しない。すべてのＴ細胞は、骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞由来の造血前駆細胞（リンパ球系前駆細胞）は胸腺に移行し、細胞分裂により増殖し、未熟な胸腺細胞の大集団を作り出す。最も初期の胸腺細胞はＣＤ４もＣＤ８も発現せず、したがって、ダブルネガティブ（ＣＤ４⁻ＣＤ８⁻）細胞に分類される。これらは成長により発達し、ダブルポジティブ胸腺細胞（ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋）となり、最終的にシングルポジティブ（ＣＤ４^＋ＣＤ８⁻またはＣＤ４⁻ＣＤ８^＋）胸腺細胞に成熟して、その後、胸腺から末梢組織に放出される。

【0070】

胸腺細胞の約９８％は、胸腺での発達過程においてポジティブ選択およびネガティブ選択により選抜されずに死滅し、残りの２％が生存して胸腺を去り、成熟した免疫担当Ｔ細胞になる。

【0071】

Ｔ細胞前駆細胞は、ダブルネガティブ（ＤＮ）段階においては主に機能的β鎖を産生し、ダブルポジティブ（ＤＰ）段階では主に機能的α鎖を産生し、その結果、最終的に機能性αβ Ｔ細胞受容体を産生する。４つのＤＮ段階（ＤＮ１、ＤＮ２、ＤＮ３およびＤＮ４）を経て胸腺細胞が発達するに従って、Ｔ細胞はインバリアントα鎖を発現するが、β鎖の遺伝子は再編成される。再編成されたβ鎖がインバリアントα鎖と対を為すことに成功した場合、β鎖の再編成を止めるシグナルが産生され（さらに、もう一方のアレルが抑制され）、細胞の増殖が起こる。これらのシグナルが産生されるには、この前駆ＴＣＲが細胞表面上に発現されていなければならないが、これらのシグナル自体は前駆ＴＣＲに結合するリガンドに依存する。このように発達した胸腺細胞はその後、ＣＤ４およびＣＤ８の両方を発現し、α鎖が選択されるダブルポジティブ（ＤＰ）段階を経る。再編成β鎖がシグナル伝達を全くもたらさない場合（たとえば、インバリアントα鎖との対合ができなかった結果）、この細胞は無視され（シグナル伝達を受けることなく）、死滅すると考えられている。

【0072】

本明細書に記載の「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」は、骨髄系細胞に分化しうる前駆細胞であり、該骨髄系細胞としては、たとえば、マクロファージ、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞およびリンパ系細胞（たとえば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞など）が挙げられる。ＨＳＣは３種の幹細胞が存在する異種細胞集団であり、これらの幹細胞は血液中のリンパ系子孫細胞と骨髄系子孫細胞との比（Ｌ／Ｍ）により識別される。

【0073】

いくつかの実施形態においては、養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞を製造する方法であって、
遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
Ｔ細胞に前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞を単離することを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、第１〜第７の配列を含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む最適化された配列であり、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含む最適化された配列であり、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体のメトトレキサートに対する親和性が１５，０００分の１または約１５，０００分の１に低減されており、メトトレキサートを選択メカニズムとして用いることによって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞を選択的に増殖させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位（attP）を含み、
第７の配列が、第２の付着部位（attB）を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復を含む第２の配列の５’末端に隣接していることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする遺伝子は、
ATGGTTGGTTCGCTAAACTGCATCGTCGCTGTGTCCCAGAACATGGGCATCGGCAAGAACGGGGACTTCCCCTGGCCACCGCTCAGGAATGAATCCAGATATTTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAAGAAGACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGGTAGAATTAATTTAGTTCTCAGCAGAGAACTCAAGGAACCTCCACAAGGAGCTCATTTTCTTTCCAGAAGTCTAGATGATGCCTTAAAACTTACTGAACAACCAGAATTAGCAAATAAAGTAGACATGGTCTGGATAGTTGGTGGCAGTTCTGTTTATAAGGAAGCCATGAATCACCCAGGCCATCTTAAACTATTTGTGACAAGGATCATGCAAGACTTTGAAAGTGACACGTTTTTTCCAGAAATTGATTTGGAGAAATATAAACTTCTGCCAGAATACCCAGGTGTTCTCTCTGATGTCCAGGAGGAGAAAGGCATTAAGTACAAATTTGAAGTATATGAGAAGAATGATTAA（配列番号２）で表されるＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態においては、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、
MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL SRSLDDALKL TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM QDFESDTFFP EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND（配列番号３）で表されるタンパク質配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは環状である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜５ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記プロモーター領域は、ＥＦ１プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、タンパク質をコードする遺伝子を１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインなどの、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記関連する複数のタンパク質は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態においては、前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列は、複数の関連配列において利用されている配列および／または核酸塩基の可変性を比較することによって作製される。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、抗体またはその一部を含み、該抗体またはその一部はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記導入をエレクトロポレーションによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択を、選択マーカーカセットを使用して選択圧を高めることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬は選択剤を含む。いくつかの実施形態においては、前記選択剤はメトトレキサートである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域が少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、前記第２の濃度域が少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭもしくは１００ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、７５ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭもしくは１５０ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、７５ｎＭ、８５ｎＭ、９５ｎＭ、１０５ｎＭ、１１５ｎＭ、１２５ｎＭ、１３５ｎＭ、１４５ｎＭもしくは１５０ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、１１２ｎＭ、１２２ｎＭ、１３２ｎＭ、１４２ｎＭ、１５２ｎＭ、１６２ｎＭ、１７２ｎＭ、１８２ｎＭ、１９２ｎＭ、２０２ｎＭ、２１２ｎＭもしくは２２５ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、前記第１の濃度域は少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭもしくは６７５ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、１０００ｎＭもしくは１０１２ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記１回目の選択は、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記２回目の選択は、前記Ｔ細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日もしくは１４日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の時間にわたって、前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞はＴ細胞前駆細胞を含む。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。

【0074】

いくつかの実施形態においては、養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変細胞を製造する方法であって、
遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
Ｔ細胞前駆細胞に前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞前駆細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記Ｔ細胞前駆細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞前駆細胞を単離することを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに核酸を安定に挿入するための前記遺伝子送達ポリヌクレオチドであって、
該遺伝子送達ポリヌクレオチド内において、挿入される該核酸が逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれていること、
該遺伝子送達ポリヌクレオチドが選択可能であること、
該遺伝子送達ポリヌクレオチドが、第１〜第７の配列を含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子またはｍＲＮＡにより転写される配列をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む最適化された配列であり、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含む最適化された配列であり、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体のメトトレキサートに対する親和性が１５，０００分の１または約１５，０００分の１に低減されており、メトトレキサートを用いて、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞の選択を行うことによって、前記少なくとも１つの遺伝子を発現する細胞の割合を増加させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位（attP）を含み、
第７の配列が、第２の付着部位（attB）を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復を含む第２の配列の５’末端に隣接していることを特徴とする。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは環状である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜５ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記プロモーター領域は、ＥＦ１プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、タンパク質をコードする遺伝子を１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインなどの、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記関連する複数のタンパク質は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列は、複数の関連配列において利用されている配列および／または核酸塩基の可変性を比較することによって作製される。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、抗体またはその一部を含み、該抗体またはその一部はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記導入をエレクトロポレーションによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択を、選択マーカーカセットを使用して選択圧を高めることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬は選択剤を含む。いくつかの実施形態においては、前記選択剤はメトトレキサートである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域が少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、前記第２の濃度域が少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、前記第１の濃度域は少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記１回目の選択は、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記２回目の選択は、前記Ｔ細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日もしくは１４日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の時間にわたって、前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。

【0075】

いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞前駆細胞におけるタンパク質の産生を増加させる方法であって、
ポリヌクレオチドを提供すること、
細胞に前記ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞前駆細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記Ｔ細胞前駆細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞前駆細胞を単離することを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに核酸を安定に挿入するための前記遺伝子送達ポリヌクレオチドであって、
該遺伝子送達ポリヌクレオチド内において、挿入される該核酸が逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれていること、
該遺伝子送達ポリヌクレオチドが選択可能であること、
該遺伝子送達ポリヌクレオチドが、第１〜第７の配列を含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子またはｍＲＮＡにより転写される配列をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む最適化された配列であり、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含む最適化された配列であり、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体のメトトレキサートに対する親和性が１５，０００分の１または約１５，０００分の１に低減されており、メトトレキサートを用いて、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞の選択を行うことによって、前記少なくとも１つの遺伝子を発現する細胞の割合を増加させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位（attP）を含み、
第７の配列が、第２の付着部位（attB）を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復を含む第２の配列の５’末端に隣接していることを特徴とする。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは環状である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜５ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記プロモーター領域は、ＥＦ１プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、タンパク質をコードする遺伝子を１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインなどの、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記関連する複数のタンパク質は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列は、複数の関連配列において利用されている配列および／または核酸塩基の可変性を比較することによって作製される。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、抗体またはその一部を含み、該抗体またはその一部はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記導入をエレクトロポレーションによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択を、選択マーカーカセットを使用して選択圧を高めることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬は選択剤を含む。いくつかの実施形態においては、前記選択剤はメトトレキサートである。

【0076】

いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記１回目の選択は、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記２回目の選択は、前記細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。

【0077】

宿主に由来しないＤＮＡ分子によりコードされるペプチドまたはポリペプチドは、「異種」のペプチドまたはポリペプチドである。

【0078】

「組み込まれた遺伝子要素」は、人為的操作により宿主細胞に導入されることによって、該宿主細胞の染色体に組み込まれたＤＮＡのセグメントである。本発明のいくつかの実施形態において、組み込まれた遺伝子要素は、エレクトロポレーションやその他の技術により宿主細胞内に導入されたミニサークル（minicircle）に由来する。組み込まれた遺伝子要素は、導入された宿主細胞からその子孫に継代される。いくつかの実施形態において、組み込まれた遺伝子要素は、環状の遺伝子送達ポリヌクレオチドにより宿主細胞の染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜６ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。

【0079】

「クローニングベクター」すなわちベクターは、ミニサークル、プラスミド、コスミド、プラストームなどの核酸分子、または宿主細胞において自己複製する能力を有するバクテリオファージである。クローニングベクターは、通常、ベクターの本質的な生物学的機能を喪失することなく制御された方法で核酸分子の挿入を可能にする１個または数個の制限エンドヌクレアーゼ認識部位と、該クローニングベクターによって形質導入された細胞の同定および選択における使用に適したマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含有する。マーカー遺伝子は、通常、テトラサイクリン抵抗性またはアンピシリン抵抗性を提供する遺伝子を含むが、いくつかの実施形態においては、メトトレキサート抵抗性遺伝子を含むこともできる。

【0080】

「発現ベクター」は、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子である。通常、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの制御下に置かれ、プロモーターの制御下に置かれた遺伝子はプロモーターに「作動可能に連結されている」と言われる。同様に、調節因子がコアプロモーターの活性を調節する場合、調節因子とコアプロモーターは作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、発現ベクターが提供される。いくつかの実施形態においては、該発現ベクターはトランスポゼースをコードする。いくつかの実施形態においては、前記トランスポゼースはSleeping Beautyトランスポゼースである。いくつかの実施形態においては、発現ベクターは環状である。いくつかの実施形態においては、前記発現ベクターは少なくとも１ｋｂ〜６ｋｂである。いくつかの実施形態において、前記発現ベクターはミニサークル（minicircle）である。

【0081】

本明細書に記載の「ミニサークル」は、原核生物ベクターの構成要素を全く含まない小型の環状プラスミド誘導体である。ミニサークルは、発現ベクターとして機能することができ、哺乳動物細胞の遺伝子を改変するための導入遺伝子担体として用いられ、細菌性ＤＮＡ配列を含有しないことから、異物として認識されることが少なく、破壊されにくいという利点を有する。したがって、典型的な導入遺伝子送達方法では、外来ＤＮＡを含有するプラスミドを使用する。ミニサークルのサイズが小さいほど、クローニング能力が向上し、細胞への送達がさらに容易になる。本発明をなんら限定するものではないが、ミニサークルの調製は、親プラスミド（真核生物由来のインサートを含む細菌性プラスミド）を大腸菌において製造する工程と、この工程の終了後、該細菌において部位特異的リコンビナーゼを誘導する工程とを含む、２工程の方法で行うことができる。これら工程の後、前記インサートの両端にある２つのリコンビナーゼ標的配列を介して、原核生物ベクター由来の構成要素を切り出し、得られたミニサークル（レシピエント細胞を非常に有効に改変できる媒体）およびミニプラスミドをキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）により回収する。

【0082】

精製されたミニサークルは、トランスフェクション、エレクトロポレーションまたは当業者に知られているその他の方法により、レシピエント細胞に移入可能である。従来のミニサークルは複製起点を欠いているため、標的細胞内で自己複製できず、コードされた遺伝子は細胞が分裂すると消失する（このことは、持続性発現を必要とする用途であるか、あるいは一過性発現を必要とする用途であるかによって、有利とも不利ともなりうる）。いくつかの実施形態においては、遺伝子に核酸を安定に挿入するための遺伝子送達ポリヌクレオチドであって、該遺伝子送達ポリヌクレオチド内において、挿入される該核酸が逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれていること、該遺伝子送達ポリヌクレオチドが選択可能であることを特徴とする遺伝子送達ポリヌクレオチドを使用する。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。

【0083】

本明細書に記載の「ヌクレオフェクション（nucleofection）」は、単一または複数の外因性核酸を宿主細胞に導入する方法を指し、これはエレクトロポレーションによって行われる。いくつかの実施形態においては、養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞を製造する方法が提供される。最も広い解釈では、該方法は、
本明細書に記載の実施形態のいずれかに記載の遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
Ｔ細胞に前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞を単離することを含むことができる。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬はＭＴＸである。いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞への前記遺伝子送達ポリヌクレオチドの導入は、エレクトロポレーションによって行うことができる。

【0084】

本明細書に記載の「宿主細胞」は、１つ以上のヌクレアーゼ（たとえばエンドヌクレアーゼ、末端プロセシング酵素）；ならびに／または本発明の実施形態に包含される、エンドヌクレアーゼ／末端プロセシング酵素との融合タンパク質、もしくは１以上のヌクレアーゼ（たとえば、エンドヌクレアーゼ、末端プロセシング酵素）および／もしくはエンドヌクレアーゼ／末端プロセシング酵素との融合タンパク質の複製および／または転写のみもしくは転写と翻訳の両方（発現）を補助する前記融合タンパク質をコードするベクターを含有する細胞である。
いくつかの実施形態においては、養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞を製造する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、該方法は、
本明細書に記載の実施形態のいずれかに記載の遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
Ｔ細胞に前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞を単離することを含むことができる。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬はＭＴＸである。

【0085】

本明細書に記載の「転移因子」（ＴＥ）、すなわちトランスポゾンまたはレトロトランスポゾンは、ゲノム内で自体を移動できるＤＮＡ配列を指し、場合によっては、突然変異を作製または復帰でき、細胞のゲノムサイズを変化させることができる。転移は多くの場合、ＴＥの重複をもたらす。ＴＥは、真核生物細胞においてＣ値の大部分を占めることがある。本明細書に記載の「Ｃ値」は、真核生物の二倍体の体細胞中におけるＤＮＡ量の半量を含む半数体核に含有されるＤＮＡ量（ピコグラム）を指す。場合によっては、「Ｃ値」および「ゲノムサイズ」という用語は同じ意味で使用されるが、倍数体において、Ｃ値は同じ核内に含有される２つ以上のゲノムに相当する。固有の遺伝子システムを有するオキシトリカ属（Oxytricha）においては、ＴＥは発達に重要な役割を果たす。さらに、ＴＥは生物内でＤＮＡを改変する手段として、研究者にとって非常に有用である。いくつかの実施形態においては、遺伝子に核酸を安定に挿入するための遺伝子送達ポリヌクレオチドであって、該遺伝子送達ポリヌクレオチド内において、挿入される該核酸が逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれていること、該遺伝子送達ポリヌクレオチドが選択可能であることを特徴とする遺伝子送達ポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはトランスポゾンを含む。

【0086】

本明細書に記載の「Sleeping Beautyトランスポゾンシステム」は、Sleeping Beauty（ＳＢ）トランスポゼースおよびトランスポゾンにより構成され、特定のＤＮＡ配列を脊椎動物のゲノムに挿入するために１９９７年に設計された。ＤＮＡトランスポゾンは、カット＆ペーストによって特定のＤＮＡ配列を１つのＤＮＡ部位から別のＤＮＡ部位へと簡便に転移させることができる。転移は正確に行うことができ、定義されたＤＮＡセグメントを１つのＤＮＡ分子から切り取り、同じまたは別のＤＮＡ分子もしくはゲノムの別の部位へと移動させることができる。

【0087】

ＳＢトランスポゼースは、レシピエントのＤＮＡ配列中のＴＡジヌクレオチド塩基対にトランスポゾンを挿入することができる。挿入部位は、同じＤＮＡ分子の他の部位であってもよく、別のＤＮＡ分子（または染色体）であってもよい。ヒトを含む哺乳動物のゲノムにおいては、およそ２億個のＴＡ部位が存在する。これらのＴＡ挿入部位は、トランスポゾンを組み込む過程において複製される。ＴＡ配列のこのような複製は、転移されたことを証明するものであり、いくつかの実験においては転移機序を確認するために使用される。トランスポゼースはトランスポゾン内にコードされていてもよく、あるいは別の供給源から提供されてもよく、この場合、トランスポゾンは非自律型要素である。

【0088】

いくつかの実施形態においては、遺伝子に核酸を安定に挿入するための遺伝子送達ポリヌクレオチドであって、該遺伝子送達ポリヌクレオチド内において、挿入される該核酸が逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれていること、該遺伝子送達ポリヌクレオチドが選択可能であることを特徴とする遺伝子送達ポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはトランスポゾンを含む。いくつかの実施形態においては、前記トランスポゾンはSleeping Beautyトランスポゾンである。いくつかの実施形態においては、前記挿入される核酸は、逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれたSleeping Beautyトランスポゾンである。

【0089】

いくつかの実施形態においては、核酸を安定に挿入するための前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、核酸を安定に挿入するための前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはSleeping Beautyトランスポゾンを含む。いくつかの実施形態においては、遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞の製造方法が提供される。いくつかの実施形態においては、前記方法は、細胞にSleeping Beautyトランスポゼースを送達することを含む。いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞におけるタンパク質の産生を増加させる方法が提供される。いくつかの実施形態においては、前記方法は、Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供することを含む。いくつかの実施形態においては、前記方法は、Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを細胞に送達することを含む。

【0090】

本明細書に記載の「コドン最適化」は、所望の細胞においてタンパク質の発現効率を最大化できることが知られているコドンへと、特定のコドンを変更する設計工程を指す。いくつかの実施形態においては、コドンの最適化が述べられており、コドンの最適化は、タンパク質の収率の増加に最適化された合成遺伝子転写産物を作製するための、当業者に公知のアルゴリズムを使用することによって実施できる。コドン最適化のためのアルゴリズムを含むプログラムは当業者に公知である。このようなプログラムとしては、たとえば、OptimumGene^TMアルゴリズム、GeneGPS（登録商標）アルゴリズムなどが挙げられる。さらに、コドンが最適化された合成配列は、たとえば、Integrated DNA Technologies社および他のＤＮＡシークエンシングサービスから市販品として入手できる。いくつかの実施形態においては、遺伝子に核酸を安定に挿入するための遺伝子送達ポリヌクレオチドであって、該遺伝子送達ポリヌクレオチド内において、挿入される該核酸が逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれていること、該遺伝子送達ポリヌクレオチドが選択可能であることを特徴とする遺伝子送達ポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態においては、遺伝子転写産物全長をコードする遺伝子がヒトにおける発現を目的としてコドン最適化されている遺伝子送達ポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子は、特にヒト細胞におけるタンパク質の発現が最大となる選択されたコドンを有するように最適化されており、このように選択されたコドンによって、Ｔ細胞におけるタンパク質またはＣＡＲの濃度を増加させることができる。

【0091】

コドンを最適化することによって、ポリヌクレオチドの二次構造の形成を低下させることもできる。いくつかの実施形態において、コドンを最適化することによって、総ＧＣ／ＡＴ比を低下させることもできる。コドンの最適化を厳密に行うと、望ましくない二次構造が形成されたり、二次構造が形成されうる望ましくないＧＣ含量となる場合がある。二次構造はそれ自体が転写効率に影響を与える。コドン使用の最適化を行った後にGeneOptimizerなどのプログラムを使用することによって、二次構造の形成を回避したり、ＧＣ含量を最適化したりすることができる。このようなさらなるプログラムは、最初のコドン最適化を行った後にさらに最適化を実施したり、トラブルシューティングを行うために使用することができ、それによって、１回目の最適化の後で起こりうる二次構造の形成を制限することができる。最適化のためのその他のプログラムは当業者に公知である。いくつかの実施形態においては、遺伝子に核酸を安定に挿入するための遺伝子送達ポリヌクレオチドであって、該遺伝子送達ポリヌクレオチド内において、挿入される該核酸が逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれていること、該遺伝子送達ポリヌクレオチドが選択可能であることを特徴とする遺伝子送達ポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、ヒトにおける発現および／または二次構造の除去および／または総ＧＣ／ＡＴ比の低下を目的としてコドン最適化された配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記配列は二次構造の除去を目的として最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記配列は、総ＧＣ／ＡＴ比が低下するように最適化されている。

【0092】

いくつかの実施形態においては、養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞を製造する方法が提供される。最も広い解釈では、該方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかに記載の遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、Ｔ細胞に前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを導入すること、Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、ならびに選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞を単離することを含むことができる。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬はＭＴＸである。

【0093】

がんまたはウイルス疾患のための養子免疫療法
がんに対する養子免疫療法は、患者自身の腫瘍特異的Ｔ細胞を患者に移入し、悪性細胞の破壊を容易にすることを前提とする。Ｔ細胞は、腫瘍特異的抗原を認識して、がん細胞に対して細胞傷害活性を発揮するように遺伝子改変することができる。がんに対する養子免疫療法は、患者のＴ細胞を単離し、次いでキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させることによって、腫瘍認識能力を導入する方法であり、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは、膜貫通セグメントを介して細胞内シグナル伝達ドメインに連結された細胞外腫瘍結合ドメインを含む膜タンパク質である。「養子免疫療法」すなわち「Ｔ細胞養子移入」は、Ｔ細胞に基づく細胞傷害性応答を利用して、がん細胞または特定の細胞標的を攻撃することを指す。患者のがんに対する天然の反応性または遺伝子改変された反応性を有するＴ細胞はインビトロで作製可能であり、その後、このようなＴ細胞による治療を必要とする対象に移入することによって戻される。本発明をなんら限定するものではないが、養子移入の一例においては、がんまたはウイルス疾患を有する対象からＴ細胞を取り出し、がん細胞またはウイルスに存在するバイオマーカーに特異的な受容体を発現するようにＴ細胞を遺伝子改変し、該遺伝子改変Ｔ細胞を移入により対象に戻し、前記遺伝子改変Ｔ細胞にがん細胞またはウイルスもしくはウイルス感染細胞を攻撃させることによって達成することができる。いくつかの実施形態においては、養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞を製造する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、悪性細胞を標的としてこれを破壊する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、対象においてがんまたはウイルス疾患を治療、抑制または緩和する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、対象においてがんまたはウイルス疾患を治療、抑制または緩和する前記方法は、養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞を該対象に投与することを含む。いくつかの実施形態においては、前記対象はヒトである。

【0094】

さらなる遺伝子の同時に組み込むことによって、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の抗腫瘍活性または抗ウイルス活性をさらに高めることができる。広範囲なＴ細胞の活性化には、最初にＣＡＲにより腫瘍またはウイルスを認識し、シグナル伝達を開始することに加えて、共刺激分子とサイトカイン受容体とが結合することが必要とされ、このような共刺激分子とサイトカイン受容体との結合は、腫瘍またはウイルス感染症を有する対象の免疫抑制環境では存在しないと考えられる。腫瘍における免疫抑制性環境に対処することを目的として、たとえば、遺伝子改変されたＣＡＲ発現Ｔ細胞において共刺激リガンド（ＣＤ８０および４−１ＢＢＬなど）を発現させると、腫瘍細胞における共刺激リガンドの発現と比較して、自己共刺激作用によりＴ細胞の増殖が増強されうる。Ｔ細胞免疫療法における別の課題は、患者への移入後の細胞の生存である。抗アポトーシスタンパク質を発現誘導すると、インビボにおいてＴ細胞の生存を改善するためことが報告されている。腫瘍へのホーミングおよび浸潤は、遺伝子改変Ｔ細胞にケモカイン受容体を導入することによって増強することができ、このアプローチは、通常はＴ細胞により認識されないケモカインを発現する腫瘍に対して特に有用であると考えられる。さらに、免疫抑制性の腫瘍微小環境または免疫低下状態のウイルス感染対象において良好な耐性を示すように、サイトカイン発現を誘導することなどによってＴ細胞を遺伝子改変することができる。したがって、複数の導入遺伝子を発現する遺伝子改変Ｔ細胞を迅速に製造する方法は、Ｔ細胞免疫療法の臨床適用にとって重要であり、かつ利点である。いくつかの実施形態においては、養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞を製造する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞はキメラ抗原受容体を発現する。いくつかの実施形態においては、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞は、共刺激リガンドを発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞は、共刺激リガンドを発現する。いくつかの実施形態においては、前記共刺激リガンドはＣＤ８０である。いくつかの実施形態においては、前記共刺激リガンドは４−１ＢＢＬである。

【0095】

養子細胞移入は、免疫由来細胞である細胞が同じ患者に戻される移入、または別のレシピエント宿主への移入を指す。養子移入のための免疫細胞を単離するには、抗凝血剤を含有するチューブに血液を採取し、典型的には密度勾配遠心分離によりＰＢＭ（バフィーコート）細胞を単離することによって行うことができる。Ｔ細胞に基づく療法においては、インターロイキン−２の免疫調節作用に大きく依存した細胞培養法を使用してＴ細胞をインビトロで増殖させることができ、多数のＴ細胞を活性化した状態で静脈内投与することによって患者に戻すことができる。抗ＣＤ３抗体を使用して、培養におけるＴ細胞の増殖を促進することができる。インターロイキン−２１の研究では、インビトロで調製されたＴ細胞に基づく治療法の有効性の増強において、インターロイキン−２１が重要な役目を果たしうることが示されている。養子細胞移入に使用される細胞を使用し、組換えＤＮＡ技術を利用して遺伝子改変リンパ球を送達することによって、様々な目的を達成することができる。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、養子細胞移入を使用して、ＣＡＲ発現リンパ球を対象に移入することができる。
いくつかの実施形態においては、ＣＡＲ発現リンパ球は、養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞の製造方法において宿主細胞として使用される。いくつかの実施形態においては、該方法は、
本明細書に記載の実施形態に記載の遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
Ｔ細胞に前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞を単離することを含む。
いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、共刺激リガンドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、キメラ抗原受容体をコードする配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞はＣＡＲを発現する。本明細書に記載の実施形態において、前記ＣＡＲ発現リンパ球は、Sleeping Beautyトランスポゾンを含むミニサークルによって遺伝子改変されている。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬はＭＴＸである。

【0096】

一例として、遺伝子改変Ｔ細胞は、たとえば腫瘍やウイルス抗原などを認識するような特異性が付与されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子の複製物を含む移入ウイルスを患者の細胞に感染させることによって作製することができるが、遺伝子改変Ｔ細胞の作製方法はこれに限定されない。この移入ウイルスは導入された細胞内で自己複製できないものの、ヒトゲノムには組み込まれることが重要である。これは、新しく導入されたＴＣＲ遺伝子はＴ細胞において安定した状態を保つことができるという点で利点がある。患者自身のＴ細胞をこれらの移入ウイルスに暴露させた後、非特異的に増殖させるか、あるいは前記遺伝子改変ＴＣＲを使用して刺激する。次いで、該Ｔ細胞を移入することにより患者に戻すと、腫瘍、ウイルスまたはウイルス感染細胞に対する免疫応答が即座に惹起される。遺伝子改変Ｔ細胞による養子細胞移入の使用は、様々ながんやウイルス感染症を治療するためのアプローチとして新規かつ有望である。いくつかの実施形態においては、がんのための養子免疫療法を実施する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、ウイルス感染症のための養子免疫療法を実施する方法が提供される。

【0097】

ウイルスベクターを使用することによって遺伝子改変Ｔ細胞を作製する方法には、いくつかの欠点がある。Ｔ細胞の遺伝子改変は、通常、γ−レトロウイルスまたはレンチウイルスを使用して行われる。この方法は効果的である反面、製造コストがかかること、遺伝子をパッケージングする能力に限界があること、および潜在的な安全性が懸念されることなどの欠点がある。Sleeping Beauty（SB）やPiggyBacなどのトランスポゾンシステムを含むプラスミドは、ウイルスを使用せずに遺伝子をＴ細胞に安定に導入するためアプローチを提供する。近年、PiggyBacシステムを使用して複数のトランスポゾンを送達することによって、複数の目的の導入遺伝子を発現する安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞が作製された。まずは哺乳動物細胞における使用のためにIvicsおよび共同研究者によって再び使われ始めたＳＢシステムは、Ｔ細胞免疫療法の臨床試験における遺伝子送達法として使用されてきた。ＳＢによる遺伝子組み込みによる転写単位およびそれらの調節配列に対する選択性は、γ−レトロウイルスやレンチウイルスベクターよりも弱く、したがって、これらのウイルスよりも安全であると考えられる。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいては、Sleeping Beautyシステムを含むミニサークルによる遺伝子改変が実施される。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいては、PiggyBacシステムを含むミニサークルによる遺伝子改変が実施される。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいては、Sleeping Beautyシステムを含むミニサークルによる遺伝子改変が実施される。

【0098】

ミニサークルは、トランスフェクションプラットフォームとして特に魅力的であり、それには３つの理由がある。第１の理由としては、エレクトロポレーションを使用したミニサークルによるトランスフェクション効率は、プラスミド類似体のトランスフェクション効率よりも高いことが挙げられる。第２の理由としては、２つのトランスポゾン末端の間の距離はトランスポゼース効率に影響を与えることが示されているが、ミニサークルは、この２つのトランスポゾン末端の間の距離がプラスミド類似体よりも近いことから、トランスフェクション効率が高いことが挙げられる。第３の理由としては、ヌクレオフェクション後の細胞生存率は構築物のサイズが大きくなるに従って低下するため、ミニサークルのサイズはプラスミド類似体よりも小さいことから、プラスミド類似体よりも有利であることが挙げられる。トランスポゾンの効率をさらに向上させるためには、Izsvakらにより開発された最適化SB100X高活性トランスポゼース（Nature Genet. 2009, 41, 753-761；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）と、Yantらにより開発されたＴ３世代のＳＢ（Mol. Cell. Biol. 2004, 24, 9239-9247；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）とを組み合わせて使用することができる。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいては、養子細胞移入のための遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法が実施される。いくつかの実施形態においては、前記方法は、Ｔ細胞にミニサークルを導入することを含む。いくつかの実施形態においては、前記導入は、エレクトロポレーションによる送達を含む。

【0099】

Ｔ細胞免疫療法における別の課題は、患者への移入後の細胞の生存である。抗アポトーシスタンパク質を発現誘導すると、インビボにおいてＴ細胞の生存を改善するためことが報告されている。腫瘍へのホーミングおよび浸潤は、遺伝子改変Ｔ細胞にケモカイン受容体を導入することによって増強され、このアプローチは、通常はＴ細胞により認識されないケモカインを発現する腫瘍に対して特に有用であると考えられる。さらに、免疫抑制性の腫瘍微小環境において良好な耐性を示すように、サイトカイン発現を誘導することなどによってＴ細胞を遺伝子改変することができる。したがって、複数の導入遺伝子を発現する遺伝子改変Ｔ細胞を迅速に製造する方法は、Ｔ細胞免疫療法の臨床適用にとって重要であり、かつ利点である。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいては、同時に組み込むためのさらなる遺伝子を同時に組み込むことによって、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の抗腫瘍活性をさらに増強する方法が実施される。いくつかの実施形態においては、前記さらなる遺伝子は共刺激リガンドをコードする。いくつかの実施形態においては、前記共刺激リガンドはＣＤ８０である。いくつかの実施形態においては、前記共刺激リガンドは４−１ＢＢＬである。いくつかの実施形態においては、前記さらなる遺伝子は抗アポトーシスタンパク質をコードする。いくつかの実施形態においては、前記さらなる遺伝子はケモカイン受容体をコードする。

【0100】

いくつかの実施形態においては、養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞を製造する方法が提供される。最も広い解釈では、該方法は、
本明細書に記載の実施形態のいずれかに記載の遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
Ｔ細胞に前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞を単離することを含むことができる。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現Ｔ細胞である。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬はＭＴＸである。

【0101】

いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞におけるタンパク質の産生を増加させる方法が提供される。最も広い解釈では、該方法は、
本明細書に記載の実施形態のいずれかに記載の遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
Ｔ細胞に前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞を単離することを含むことができる。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬はＭＴＸである。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現Ｔ細胞である。

【0102】

本明細書に記載のように、前記システムの一実施形態は、遺伝子改変された非ウイルス性遺伝子送達システムを含み、このシステムの３つの重要として、
（１）安定な遺伝子発現のためのSleeping Beautyトランスポゾンシステム、
（２）トランスフェクションを増強するためのミニサークル、および
（３）選択機序としてのヒトジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体（DHFRdm）
が挙げられる（図１）。

【0103】

ミニサークルは、トランスフェクションプラットフォームとして特に魅力的であり、それには３つの理由がある。第１の理由としては、エレクトロポレーションを使用したミニサークルによるトランスフェクション効率は、プラスミド類似体のトランスフェクション効率よりも高いことが挙げられる。第２の理由としては、２つのトランスポゾン末端の間の距離はトランスポゼース効率に影響を与えることが示されているが、ミニサークルは、この２つのトランスポゾン末端の間の距離がプラスミド類似体よりも近いことから、トランスフェクション効率が高いことが挙げられる。第３の理由としては、ヌクレオフェクション後の細胞生存率は構築物のサイズが大きくなるに従って低下するため、ミニサークルのサイズはプラスミド類似体よりも小さいことから、プラスミド類似体よりも望ましいことが挙げられる。トランスポゾンの効率をさらに向上させるために、Izsvakらにより開発された最適化SB100X高活性トランスポゼース（Nature Genet. 2009, 41, 753-761；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）と、Yantらにより開発されたＴ３世代のＳＢトランスポゾン（Mol. Cell. Biol. 2004, 24, 9239-9247；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）とを組み合わせて使用した。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいては、Ｔ細胞の遺伝子改変は、ミニサークルを使用して行われる。いくつかの実施形態においては、前記ミニサークルはトランスポゾンを含む。いくつかの実施形態においては、前記トランスポゾンはSleeping Beautyトランスポゾンを含む。いくつかの実施形態においては、最適化SB100X高活性トランスポゼースを、Ｔ３世代のＳＢトランスポゾンと組み合わせて使用する。

【0104】

さらに、遺伝子改変Ｔ細胞の迅速な選択のための選択機序を使用することもできる。ヒトジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体（DHFRdm、アミノ酸変異Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓを有する）は、メトトレキサートに対する親和性が１５，０００分の１に低減されている。メトトレキサートは、ＤＨＦＲの強力な阻害剤であり、チミジル酸合成およびプリン合成を阻害する。Ｔ細胞においてDHFRdmを発現させると、増殖能力、Ｔ細胞マーカーの発現または細胞溶解能力を損なうことなく、ＭＴＸに対する耐性を付与することができる。この選択システムのさらなる利点としては、臨床グレードのＭＴＸを利用可能であること、遺伝毒性薬剤を使用する必要がないこと、およびDHFRdmの遺伝子サイズが小さいこと（５６１ｂｐ）が挙げられる。したがって、ＭＴＸは、ＳＢによって形質導入された細胞を選択的に増幅する選択機序として使用することができる。いくつかの実施形態において、前記ミニサークルは、ヒトのジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態においては、遺伝子改変されたＴ細胞を迅速に選択するための選択方法が提供される。いくつかの実施形態においては、前記選択方法は、遺伝子改変Ｔ細胞と臨床用メトトレキサートとを接触させることを含む。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞は、ヒトのジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする配列を含むミニサークルを含む。いくつかの実施形態においては、前記ヒトのジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、メトトレキサートに対する特異性が１５，０００分の１または約１５，０００分の１に低減されている。いくつかの実施形態においては、メトトレキサートと前記Ｔ細胞とを接触させることによって、前記ヒトのジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする配列を含むミニサークルで形質導入された細胞を選択的に増殖させることができる。いくつかの実施形態において、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする遺伝子は、
ATGGTTGGTTCGCTAAACTGCATCGTCGCTGTGTCCCAGAACATGGGCATCGGCAAGAACGGGGACTTCCCCTGGCCACCGCTCAGGAATGAATCCAGATATTTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAAGAAGACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGGTAGAATTAATTTAGTTCTCAGCAGAGAACTCAAGGAACCTCCACAAGGAGCTCATTTTCTTTCCAGAAGTCTAGATGATGCCTTAAAACTTACTGAACAACCAGAATTAGCAAATAAAGTAGACATGGTCTGGATAGTTGGTGGCAGTTCTGTTTATAAGGAAGCCATGAATCACCCAGGCCATCTTAAACTATTTGTGACAAGGATCATGCAAGACTTTGAAAGTGACACGTTTTTTCCAGAAATTGATTTGGAGAAATATAAACTTCTGCCAGAATACCCAGGTGTTCTCTCTGATGTCCAGGAGGAGAAAGGCATTAAGTACAAATTTGAAGTATATGAGAAGAATGATTAA（配列番号２）で表されるＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態においては、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、
MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL SRSLDDALKL TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM QDFESDTFFP EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND（配列番号３）で表されるタンパク質配列を含む。

【0105】

ＳＢトランスポゾンを含有するミニサークルを用いたマルチプレックス送達を利用して、最大で３つの導入遺伝子をＨ９ Ｔ細胞株に安定に移入させ、次いでメトトレキサート（ＭＴＸ）による選択を行うことができる。ＭＴＸによる選択圧を高めることによって、より多くの遺伝子が組み込まれた細胞を選択的に得ることができる。２回連続してＭＴＸによる選択を行う２段階選択方法を使用することによって、５０％の細胞が３種の導入遺伝子産物を発現している細胞集団を得ることができる。いくつかの実施形態においては、細胞株に導入遺伝子を安定に移入する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、細胞株にミニサークルを導入する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、前記ミニサークルはSleeping Beautyトランスポゾンを含む。いくつかの実施形態においては、前記方法は、メトトレキサートによる選択圧を高めることをさらに含み、メトトレキサートによる選択圧を高める該工程は、該細胞株と濃度を高めたメトトレキサートとを接触させることを含む。いくつかの実施形態においては、２回目のメトトレキサートによる選択が行われる。

【0106】

さらなる実施形態
いくつかの実施形態においては、遺伝子に核酸を安定に挿入するための遺伝子送達ポリヌクレオチドであって、該遺伝子送達ポリヌクレオチド内において、挿入される該核酸が逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれていること、該遺伝子送達ポリヌクレオチドが選択可能であることを特徴とする遺伝子送達ポリヌクレオチドが提供される。
最も広い解釈では、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、第１〜第７の配列を含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む最適化された配列であり、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含む最適化された配列であり、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体のメトトレキサートに対する親和性が１５，０００分の１または約１５，０００分の１に低減されており、メトトレキサートを選択メカニズムとして用いることによって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞を選択的に増殖させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位（attP）を含み、
第７の配列が、第２の付着部位（attB）を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復を含む第２の配列の５’末端に隣接していることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする遺伝子は、
ATGGTTGGTTCGCTAAACTGCATCGTCGCTGTGTCCCAGAACATGGGCATCGGCAAGAACGGGGACTTCCCCTGGCCACCGCTCAGGAATGAATCCAGATATTTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAAGAAGACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGGTAGAATTAATTTAGTTCTCAGCAGAGAACTCAAGGAACCTCCACAAGGAGCTCATTTTCTTTCCAGAAGTCTAGATGATGCCTTAAAACTTACTGAACAACCAGAATTAGCAAATAAAGTAGACATGGTCTGGATAGTTGGTGGCAGTTCTGTTTATAAGGAAGCCATGAATCACCCAGGCCATCTTAAACTATTTGTGACAAGGATCATGCAAGACTTTGAAAGTGACACGTTTTTTCCAGAAATTGATTTGGAGAAATATAAACTTCTGCCAGAATACCCAGGTGTTCTCTCTGATGTCCAGGAGGAGAAAGGCATTAAGTACAAATTTGAAGTATATGAGAAGAATGATTAA（配列番号２）で表されるＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態においては、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、
MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL SRSLDDALKL TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM QDFESDTFFP EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND（配列番号３）で表されるタンパク質配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは環状である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜６ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記プロモーター領域は、ＥＦ１プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、タンパク質をコードする遺伝子を１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインなどの、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、前記第４の配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列は、複数の関連配列において利用されている配列および／または核酸塩基の可変性を比較することによって作製される。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、抗体またはその一部を含む。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記ミニサークルは、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする配列を含み、該配列は、
ATGGTTGGTTCGCTAAACTGCATCGTCGCTGTGTCCCAGAACATGGGCATCGGCAAGAACGGGGACTTCCCCTGGCCACCGCTCAGGAATGAATCCAGATATTTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAAGAAGACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGGTAGAATTAATTTAGTTCTCAGCAGAGAACTCAAGGAACCTCCACAAGGAGCTCATTTTCTTTCCAGAAGTCTAGATGATGCCTTAAAACTTACTGAACAACCAGAATTAGCAAATAAAGTAGACATGGTCTGGATAGTTGGTGGCAGTTCTGTTTATAAGGAAGCCATGAATCACCCAGGCCATCTTAAACTATTTGTGACAAGGATCATGCAAGACTTTGAAAGTGACACGTTTTTTCCAGAAATTGATTTGGAGAAATATAAACTTCTGCCAGAATACCCAGGTGTTCTCTCTGATGTCCAGGAGGAGAAAGGCATTAAGTACAAATTTGAAGTATATGAGAAGAATGATTAA（配列番号２）で表されるＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、
MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL SRSLDDALKL TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM QDFESDTFFP EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND（配列番号３）で表されるタンパク質配列を含む。

【0107】

いくつかの実施形態においては、養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞を製造する方法が提供される。最も広い解釈では、該方法は、
本明細書に記載の実施形態のいずれかに記載の遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
Ｔ細胞に前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞を単離することを含むことができる。
いくつかの実施形態においては、前記導入をエレクトロポレーションによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択を、選択マーカーカセットを使用して選択圧を高めることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬は選択剤を含む。
いくつかの実施形態においては、前記選択剤はメトトレキサートである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域が少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、前記第２の濃度域が少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭもしくは１００ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、７５ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭもしくは１５０ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、７５ｎＭ、８５ｎＭ、９５ｎＭ、１０５ｎＭ、１１５ｎＭ、１２５ｎＭ、１３５ｎＭ、１４５ｎＭもしくは１５０ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、１１２ｎＭ、１２２ｎＭ、１３２ｎＭ、１４２ｎＭ、１５２ｎＭ、１６２ｎＭ、１７２ｎＭ、１８２ｎＭ、１９２ｎＭ、２０２ｎＭ、２１２ｎＭもしくは２２５ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、前記第１の濃度域は少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭもしくは６７５ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、１０００ｎＭもしくは１０１２ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記１回目の選択は、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記２回目の選択は、前記Ｔ細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。

【0108】

いくつかの実施形態においては、細胞におけるタンパク質の産生を増加させる方法が提供される。最も広い解釈では、該方法は、
本明細書に記載の実施形態のいずれかに記載の遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
Ｔ細胞に前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞を単離することを含むことができる。
いくつかの実施形態においては、前記導入をエレクトロポレーションによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択を、選択マーカーカセットを使用して選択圧を高めることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬は選択剤を含む。いくつかの実施形態においては、前記選択剤はメトトレキサートである。いくつかの実施形態においては、前記低濃度域すなわち第１の濃度域は少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、前記高濃度域すなわち第２の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記低濃度域すなわち第１の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、前記高濃度域すなわち第２の濃度域は少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記低濃度域すなわち第１の濃度域は少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、前記高濃度域すなわち第２の濃度域は少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記１回目の選択は、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記２回目の選択は、前記Ｔ細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。

【0109】

いくつかの実施形態においては、前記方法のいずれかによって製造された、養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞が提供される。
いくつかの実施形態においては、養子Ｔ細胞免疫療法のための前記遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞の製造方法は、
遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
Ｔ細胞に前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞を単離することを含む。
いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、第１〜第７の配列を含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む最適化された配列であり、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含む最適化された配列であり、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体のメトトレキサートに対する親和性が１５，０００分の１または約１５，０００分の１に低減されており、メトトレキサートを選択メカニズムとして用いることによって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞を選択的に増殖させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位（attP）を含み、
第７の配列が、第２の付着部位（attB）を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復を含む第２の配列の５’末端に隣接していることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする遺伝子は、
ATGGTTGGTTCGCTAAACTGCATCGTCGCTGTGTCCCAGAACATGGGCATCGGCAAGAACGGGGACTTCCCCTGGCCACCGCTCAGGAATGAATCCAGATATTTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAAGAAGACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGGTAGAATTAATTTAGTTCTCAGCAGAGAACTCAAGGAACCTCCACAAGGAGCTCATTTTCTTTCCAGAAGTCTAGATGATGCCTTAAAACTTACTGAACAACCAGAATTAGCAAATAAAGTAGACATGGTCTGGATAGTTGGTGGCAGTTCTGTTTATAAGGAAGCCATGAATCACCCAGGCCATCTTAAACTATTTGTGACAAGGATCATGCAAGACTTTGAAAGTGACACGTTTTTTCCAGAAATTGATTTGGAGAAATATAAACTTCTGCCAGAATACCCAGGTGTTCTCTCTGATGTCCAGGAGGAGAAAGGCATTAAGTACAAATTTGAAGTATATGAGAAGAATGATTAA（配列番号２）で表されるＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態においては、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、
MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL SRSLDDALKL TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM QDFESDTFFP EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND（配列番号３）で表されるタンパク質配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは環状である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜５ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記プロモーター領域は、ＥＦ１プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、タンパク質をコードする遺伝子を１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインなどの、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記関連する複数のタンパク質は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態においては、前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列は、複数の関連配列において利用されている配列および／または核酸塩基の可変性を比較することによって作製される。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、抗体またはその一部を含み、該抗体またはその一部はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記導入をエレクトロポレーションによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択を、選択マーカーカセットを使用して選択圧を高めることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬は選択剤を含む。いくつかの実施形態においては、前記選択剤はメトトレキサートである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域が少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、前記第２の濃度域が少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭもしくは１００ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、７５ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭもしくは１５０ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、７５ｎＭ、８５ｎＭ、９５ｎＭ、１０５ｎＭ、１１５ｎＭ、１２５ｎＭ、１３５ｎＭ、１４５ｎＭもしくは１５０ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、１１２ｎＭ、１２２ｎＭ、１３２ｎＭ、１４２ｎＭ、１５２ｎＭ、１６２ｎＭ、１７２ｎＭ、１８２ｎＭ、１９２ｎＭ、２０２ｎＭ、２１２ｎＭもしくは２２５ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、前記第１の濃度域は少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭもしくは６７５ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、１０００ｎＭもしくは１０１２ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記１回目の選択は、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記２回目の選択は、前記Ｔ細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日もしくは１４日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の時間にわたって、前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。
いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、第１〜第７の配列を含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む最適化された配列であり、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含む最適化された配列であり、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体のメトトレキサートに対する親和性が１５，０００分の１または約１５，０００分の１に低減されており、メトトレキサートを選択メカニズムとして用いることによって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞を選択的に増殖させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位（attP）を含み、
第７の配列が、第２の付着部位（attB）を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復を含む第２の配列の５’末端に隣接していることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする遺伝子は、
ATGGTTGGTTCGCTAAACTGCATCGTCGCTGTGTCCCAGAACATGGGCATCGGCAAGAACGGGGACTTCCCCTGGCCACCGCTCAGGAATGAATCCAGATATTTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAAGAAGACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGGTAGAATTAATTTAGTTCTCAGCAGAGAACTCAAGGAACCTCCACAAGGAGCTCATTTTCTTTCCAGAAGTCTAGATGATGCCTTAAAACTTACTGAACAACCAGAATTAGCAAATAAAGTAGACATGGTCTGGATAGTTGGTGGCAGTTCTGTTTATAAGGAAGCCATGAATCACCCAGGCCATCTTAAACTATTTGTGACAAGGATCATGCAAGACTTTGAAAGTGACACGTTTTTTCCAGAAATTGATTTGGAGAAATATAAACTTCTGCCAGAATACCCAGGTGTTCTCTCTGATGTCCAGGAGGAGAAAGGCATTAAGTACAAATTTGAAGTATATGAGAAGAATGATTAA（配列番号２）で表されるＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態においては、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、
MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL SRSLDDALKL TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM QDFESDTFFP EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND（配列番号３）で表されるタンパク質配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは環状である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜５ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記プロモーター領域は、ＥＦ１プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、タンパク質をコードする遺伝子を１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインなどの、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記関連する複数のタンパク質は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態においては、前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列は、複数の関連配列において利用されている配列および／または核酸塩基の可変性を比較することによって作製される。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、抗体またはその一部を含み、該抗体またはその一部はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記導入をエレクトロポレーションによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択を、選択マーカーカセットを使用して選択圧を高めることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬は選択剤を含む。いくつかの実施形態においては、前記選択剤はメトトレキサートである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域が少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、前記第２の濃度域が少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭもしくは１００ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、７５ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭもしくは１５０ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、７５ｎＭ、８５ｎＭ、９５ｎＭ、１０５ｎＭ、１１５ｎＭ、１２５ｎＭ、１３５ｎＭ、１４５ｎＭもしくは１５０ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、１１２ｎＭ、１２２ｎＭ、１３２ｎＭ、１４２ｎＭ、１５２ｎＭ、１６２ｎＭ、１７２ｎＭ、１８２ｎＭ、１９２ｎＭ、２０２ｎＭ、２１２ｎＭもしくは２２５ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、前記第１の濃度域は少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭもしくは６７５ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、１０００ｎＭもしくは１０１２ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記１回目の選択は、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記２回目の選択は、前記Ｔ細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日もしくは１４日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の時間にわたって、前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。

【0110】

いくつかの実施形態においては、対象におけるがんまたは疾患を治療、抑制または緩和する方法であって、以下に記載の遺伝子組換えまたは遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞を対象に投与することを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、養子Ｔ細胞免疫療法のための前記遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞の製造方法は、
遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
Ｔ細胞に前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞を単離することを含む。
いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、第１〜第７の配列を含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む、ヒトにおける発現を目的としてコドン最適化された配列であり、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含む、ヒトにおける発現を目的としてコドン最適化された配列であり、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体のメトトレキサートに対する親和性が１５，０００分の１または約１５，０００分の１に低減されており、メトトレキサートを選択メカニズムとして用いることによって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞を選択的に増殖させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位（attP）を含み、
第７の配列が、第２の付着部位（attB）を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復を含む第２の配列の５’末端に隣接していることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする遺伝子は、
ATGGTTGGTTCGCTAAACTGCATCGTCGCTGTGTCCCAGAACATGGGCATCGGCAAGAACGGGGACTTCCCCTGGCCACCGCTCAGGAATGAATCCAGATATTTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAAGAAGACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGGTAGAATTAATTTAGTTCTCAGCAGAGAACTCAAGGAACCTCCACAAGGAGCTCATTTTCTTTCCAGAAGTCTAGATGATGCCTTAAAACTTACTGAACAACCAGAATTAGCAAATAAAGTAGACATGGTCTGGATAGTTGGTGGCAGTTCTGTTTATAAGGAAGCCATGAATCACCCAGGCCATCTTAAACTATTTGTGACAAGGATCATGCAAGACTTTGAAAGTGACACGTTTTTTCCAGAAATTGATTTGGAGAAATATAAACTTCTGCCAGAATACCCAGGTGTTCTCTCTGATGTCCAGGAGGAGAAAGGCATTAAGTACAAATTTGAAGTATATGAGAAGAATGATTAA（配列番号２）で表されるＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態においては、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、
MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL SRSLDDALKL TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM QDFESDTFFP EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND（配列番号３）で表されるタンパク質配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは環状である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜５ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記プロモーター領域は、ＥＦ１プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、タンパク質をコードする遺伝子を１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインなどの、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記関連する複数のタンパク質は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態においては、前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列は、複数の関連配列において利用されている配列および／または核酸塩基の可変性を比較することによって作製される。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、抗体またはその一部を含み、該抗体またはその一部はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記導入をエレクトロポレーションによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択を、選択マーカーカセットを使用して選択圧を高めることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬は選択剤を含む。いくつかの実施形態においては、前記選択剤はメトトレキサートである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域が少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、前記第２の濃度域が少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭもしくは１００ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、７５ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭもしくは１５０ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、７５ｎＭ、８５ｎＭ、９５ｎＭ、１０５ｎＭ、１１５ｎＭ、１２５ｎＭ、１３５ｎＭ、１４５ｎＭもしくは１５０ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、１１２ｎＭ、１２２ｎＭ、１３２ｎＭ、１４２ｎＭ、１５２ｎＭ、１６２ｎＭ、１７２ｎＭ、１８２ｎＭ、１９２ｎＭ、２０２ｎＭ、２１２ｎＭもしくは２２５ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、前記第１の濃度域は少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭもしくは６７５ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、１０００ｎＭもしくは１０１２ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記１回目の選択は、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記２回目の選択は、前記Ｔ細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日もしくは１４日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の時間にわたって、前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記対象はヒトである。

【実施例】

【0111】

材料および方法のいくつかを、以下により詳細に記載する。

【0112】

プラスミド
pMC_T3/eGFP_IRES_FGFR（Nucleic Acids Research, 2012, 1-10 doi:10.1093/nar/gks213、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を骨格として使用し、GFP-T2A-DHFRdmカセットを作製するための過去に報告されているクローニング戦略（Cold Spring Harbor Protoc; 2012; doi:10.1101/pdb.ip067876）を実行して、ＥＦ１ａプロモーター、maxGFP遺伝子、Thosea asignaウイルス２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）およびメトトレキサート（ＭＴＸ）に非感受性のジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体（DHFRdm）を含有するＴ３ ＳＢトランスポゾンカセットを含むpMC_T3/GFP-T2A-DHFRdmミニサークル（ＭＣ）プラスミドを構築した。MaxGFP（Lonza）およびpEGFRt-T2A-IMPDHdm-T2A-DHFRdm（Michael Jensenのご厚意により提供された）プラスミドを、ＰＣＲの鋳型として使用した。蛍光タンパク質をコードする遺伝子を交換するために、BmtI部位およびBamHI部位を導入した。プラスミドMC_SB100Xは過去に報告されている（Nucleic Acids Research, 2012, 1-10 doi:10.1093/nar/gks213、本明細書にその全体が組み込まれる）。ミニサークルＤＮＡベクター技術に関するSystem Biosciences社のユーザーマニュアルに従って、ミニサークルを作製し、次いで精製した。得られたプラスミドはいずれも、エンドトキシン非存在下においてEndofree Plasmid Kit（Qiagen）を使用することによって増幅させた。

【0113】

Ｈ９の培養およびトランスフェクション
Ｈ９細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにおいて培養した。Ｈ９細胞に対して最適化されたヌクレオフェクションプロトコル（Lonza）に従った（プログラムX-001、Nucleofector Kit V)。１回のヌクレオフェクション当たり、１×１０^６個の細胞と様々な量のＭＣ ＤＮＡとを使用した。ヌクレオフェクションの後、細胞を１週間培養することによって安定にトランスフェクションさせた。ＭＴＸ選択を行うため、様々な濃度のＭＴＸを添加した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭにおいて細胞を培養した。

【0114】

フローサイトメトリー分析
生細胞は、ヨウ化プロピジウムをフローサイトメトリーバッファーに２μｇ／ｍｌの濃度で加え、ヨウ化プロピジウムの排除に基づいて選択した。フローサイトメトリー分析は、MACSQuant Analyzer（Miltenyi Biotec）およびLSRII（BD Biosciences）を使用して実施した。収集したデータはFlowJoソフトウェアを用いて分析した。適切な陰性対照（ヨウ化プロピジウムで染色した非トランスフェクションＨ９細胞およびヨウ化プロピジウムで染色をした非トランスフェクションＨ９細胞、ならびにＧＦＰ、ＢＦＰおよびmCherryをそれぞれコードする単一の遺伝子でトランスフェクトされた細胞）を、コンペンセーションおよびゲーティングのために使用した。Becton Dickinson FACSAria IIを細胞のソーティングに使用した。フローサイトメトリー作業の一部は、UW Immunology Flow Cytometry Facilityにおいて実施した。

【0115】

トランスポゾンコピー数の決定
製造業者の取り扱い説明書（Qiagen）に従ってPuregene Kit Aを使用することによってゲノムＤＮＡを抽出し、Universal SYBR Green Supermix（BioRad）を使用した7300 Real-Time PCR System（Applied Biosystems）においてｑＰＣＲを行った。Primer3ソフトウェアを使用してｑＰＣＲのためのプライマーを設計し、maxGFPフォワードプライマー：5’-ACAAGATCATCCGCAGCAAC-3’（配列番号４）；リバースプライマー：5’-TTGAAGTGCATGTGGCTGTC-3’（配列番号５）；GAPDHフォワードプライマー：5’-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’（配列番号６）；GAPDHリバースプライマー：5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3（配列番号７）を得た。MaxGFPプライマーはトランスポゾン中のmaxGFPに特異的である。標準曲線は、単一のトランスポゾンが挿入されたＨ９クローンを限界希釈法により得た後（「ゴールドスタンダード（最も有用であると広く認められている方法）」）、該Ｈ９クローンのゲノムＤＮＡを使用して作製した。コピー数は、ΔΔＣＴ法（Schmittgen,T.D. and Livak,K.J. (2008)、その全体が本明細書に組み込まれる）を使用して算出した。

【0116】

Sleeping Beautyトランスポゾンシステム（ＳＢＴＳ）の組み込み数の分布の評価
１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭを含む９６ウェルプレートに、放射線を照射した（5000R）Ｈ９フィーダー細胞を５，０００個／ウェルで播種するとともに、２００ｎＭのＭＴＸにより選択したT3/GFP-T2A-DHFRdmトランスフェクトＨ９細胞集団を０．５個／ウェルの濃度で播種した。プレートを２〜３週間インキュベートし、その後、クローン集団をより大きなウェルのプレートに移動し、増殖させた。ＧＦＰの発現をフローサイトメトリーにより確認した。６０個のクローンから個別に得たＤＮＡを使用して相対的RT-qPCR分析を行い、トランスポゾンのコピー数を測定した。

【0117】

Ｈ９細胞への安定な遺伝子移入の最適化
遺伝子移入研究では、いずれにおいても、細菌性プラスミド配列が除去されたミニサークル構築物を使用した。ミニサークルは、Kayらおよび共同研究者による過去の報告に従って作製することができる（Chen, Z. Y.; He, C. Y.; Ehrhardt, A.; Kay, M. A. Molecular Therapy 2003, 8, 495-500およびKay, M. A.; He, C. Y.; Chen, Z. Y. Nat. Biotechnol. 2010, 28, 1287-U96；参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。ＥＦ１αプロモーターの制御下において異なる蛍光タンパク質（maxGFP、mCherryまたはBFP）を発現するトランスポゾンを含有する３種のリポーターミニサークルを構築した。ＭＴＸに対する代謝抵抗性を付与するジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体（DHFRdm）を選択遺伝子としてＴ２Ａ配列の下流のフレームにクローニングした。また、SB100Xトランスポゼース遺伝子を別のミニサークル構築物として調製し、トランスポゾンミサークルとともに共送達した。

【0118】

トランスポゾンには４つのトランスポゼース結合部位が存在する（逆方向末端反復配列１つ当たり２つのトランスポゼース結合部位が存在する）。結合したトランスポゼースは互いに相互作用し、２つのトランスポゾン末端を近接させることが提案された。トランスポゼースが過剰発現すると、遊離のトランスポゼースと結合したトランスポゼースとの相互作用によって、トランスポゾン末端同士の近接が妨げられ、転移が抑制されると仮定されてきた。したがって、トランスポゾン遺伝子とトランスポゼース遺伝子を別々の構築物として送達するための、トランスポゾンとトランスポゼースの最適な比率を決定することが必要であった。抑制現象の報告にはばらつきが見られている。

【0119】

maxGFPを発現する前記リポーターミニサークルを使用して様々なトランスポゾン／トランスポゼース比でヌクレオフェクションを行った２４時間後および安定な転移がなされた後（ヌクレオフェクションの７日後）に、一過性トランスフェクションの効率をフローサイトメトリーにより評価した。トランスポゾン：トランスポゼース比の最適化を示した図２を参照されたい。Ｈ９ Ｔ細胞をトランスフェクションのテストベッドとして使用した。初期のトランスフェクション効率は、４７．５％±２．２％〜６６．９％±４．５％であり、トランスポゼースミニサークルの量が増えるに従って上昇した。トランスポゼースの非存在下では、ヌクレオフェクション７日後に安定なトランスフェクションは最小となった（＜１％）。ＧＦＰ^＋細胞のパーセンテージは、トランスポゾン／トランスポゼース比の増加に伴って上昇し、１：４の比率において３９．２％±３．０％に達し、これは、一過性に組み込まれた初期の集団の組換え効率が５８．６％であったことを反映している。これより高い比率については、細胞生存率が低下するため、試験しなかった。過剰発現による抑制効果は、この試験で使用したトランスポゾン／トランスポゼース比の範囲においては観察されなかった。したがって、これら結果を元に、この最適化されたトランスポゾン／トランスポゼース比である１：４を使用して形質導入実験を実施した。

【0120】

遺伝子改変細胞のメトトレキサートによる選択
ＭＴＸの濃度を上げるとDHFRdmの発現に対する選択圧を高めることができることから、段階的に濃度を上げたＭＴＸを使用することによって、多重組み込みが生じた細胞を選択することができると仮定した。したがって、T3/maxGFP-T2A-DHRFdmトランスポゾンによって安定に形質導入された細胞を、段階的に濃度を上げたＭＴＸ（５０〜２００ｎＭ）の存在下で培養し、１０日間にわたってフローサイトメトリーを行うことによりＧＦＰの発現を評価した。選択におけるメトトレキサート（ＭＴＸ）濃度の効果を示した図３を参照されたい。３日間にわたってＭＴＸによる選択を行うことよって評価した初期の選択効率は、ＭＴＸの濃度の上昇に従って低下した（図３、パネルＡ）。しかし、７日間にわたる選択では、すべての条件下において、ＧＦＰ^＋細胞が全体の９４％を上回る集団が得られた。ＧＦＰ^＋細胞の平均ＧＦＰ蛍光強度は選択圧の上昇に伴って増加し（図３、パネルＢ）、２００ｎＭのＭＴＸにより選択された細胞の平均蛍光強度は、選択を行わなかった細胞の６．４倍であり、５０ｎＭのＭＴＸにより選択された細胞の３．３倍であった。図に示すように、ＧＦＰ^＋細胞における平均ＧＦＰ発現量とＭＴＸ濃度との間に正の相関が見られたことから、ＭＴＸ濃度を高めることによってDHFRdmの発現が多い細胞が選択できることが示唆され、すなわち多重組み込みが生じた細胞を選択できることが示唆された。

【0121】

２週間のＭＴＸ処理により選択された遺伝子増幅細胞集団は、ＭＴＸの除去後、最長４週間にわたって導入遺伝子の発現の大部分を維持した。メトトレキサート（ＭＴＸ）を除去した後の導入遺伝子の持続性を示した図４を参照されたい。ＭＴＸを除去後、４週間にわたって、すべての集団においてＧＦＰ^＋集団が全体の９０％を上回って維持されたが（図４、パネルＡ）、２００ｎＭのＭＴＸにより選択された細胞では、ＧＦＰ^＋集団が全体を占める割合が最も高かった（９７％）。これは、多重組み込みが生じた細胞が選択されたためだと考えられる。ＭＴＸを除去した４週後における各集団の平均ＧＦＰ発現量は、２００ｎＭ、１００ｎＭまたは５０ｎＭのＭＴＸによる選択を行った集団において、それぞれ２１％、２７％または２８％低下した（図４、パネルＢ）。このような平均ＧＦＰ発現量の低下は、選択圧の非存在下において、プロモーターが抑制されたか、あるいはＧＦＰの発現が低い細胞が選択的に増殖したためだと考えられる。

【0122】

組み込み数の分布の分析
ＭＴＸによる選択圧を高めることによって、多重組み込みを生じた細胞を選択することができるという仮説を評価するため、ＧＦＰプライマーを用いたRT-qPCRを使用して、ＭＴＸにより選択された細胞集団中のトランスポゾンのコピー数の平均値を測定した。まず、単一コピーのトランスポゾンが組み込まれた「ゴールドスタンダード」クローンを限界希釈法により作製した。ＭＴＸによる選択を行う前の安定に形質導入された元の集団における平均組み込み数を、細胞ソーティングにより得られたＧＦＰ^＋細胞のRT-qPCR分析により決定した。選択圧の上昇に伴ってトランスポゾンの平均コピー数が増加する傾向が観察された。ヒト半数体ゲノム当たりのトランスポゾンのコピー数を示した図５Ａを参照されたい。ＭＴＸによる選択を行う前のＧＦＰ^＋細胞における平均組み込み数は１．１±０．０２であったのに対して、２００ｎＭのＭＴＸにより選択された細胞における平均組み込み数は２．１±０．４５であった。RT-qPCRを３回行い、ソーティングされた集団から得た単一の生物学的複製のデータ、およびＭＴＸにより選択された集団から得た３つの生物学的複製のデータを示した。統計的差異はスチューデントのｔ検定により評価した。

【0123】

次いで、２００ｎＭのＭＴＸにより選択された細胞における組み込み数の分布を分析した。限界希釈法により６０個のクローンを作製し、フローサイトメトリーによりＧＦＰの発現を確認し、ゲノムＤＮＡを単離し、半数体ゲノム当たりのＧＦＰ遺伝子数をRT-PCRにより分析した。組み込み数の分布を図５Ｂに示す。大部分のクローン（約６５％）はＧＦＰを複数コピー含んでいた。平均組み込み数は１．８であり、これは、２００ｎＭのＭＴＸにより選択された細胞集団におけるトランスポゾンの平均コピー数とよく相関している（図５Ａ）。

【0124】

マルチプレックス遺伝子の組み込みの評価
２００ｎＭのＭＴＸの選択圧下で増殖させた形質導入細胞集団の大部分は複数コピーのトランスポゾンを含んでいたことが示されたことから、マルチプレックス遺伝子の組み込みをこれらの条件下で評価した。トランスポゾンカセット中に３種のリポーター遺伝子（maxGFP、mCherryおよびBFP）を別々に含有する３種のミニサークルおよびSB100XトランスポゼースミニサークルをＨ９細胞にヌクレオフェクトした。次いで、安定に形質導入された細胞を２００ｎＭの濃度において７日間かけて選択し、細胞集団をフローサイトメトリー分析で評価した。図６を参照されたい。図６は、異なる蛍光タンパク質を含むトランスポゾンを有する３種のミニサークル（MC_T3/GFP-T2A-DHFRdm、MC_T3/BFP-T2A-DHFRdm、MC_T3/mCherry-T2A-DHFRdm）それぞれ２μｇと、MC_SB100X DNA ６μｇとでヌクレオフェクトしたＨ９細胞集団を、トランスフェクション後の様々な時点においてフローサイトメトリーで分析した結果を示す。ヌクレオフェクションの２４時間後に評価した初期のトランスフェクション効率は６８％であった（図６パネルＡ）。安定に形質導入された集団は３７±１．４％であり、組み込み効率が５４％であったことを示している。この集団のうち、１９±０．６％は、２種または３種の蛍光タンパク質を発現した。安定に形質導入された細胞を２００ｎＭのＭＴＸの存在下で１週間培養し、その後分析した。この選択された集団のうち、２３±１．０％は３種すべてのリポータータンパク質を発現した（図６、パネルＡ）。３種の導入遺伝子を発現する細胞集団をさらに増加させるため、２００ｎＭのＭＴＸにより選択された細胞を、ＭＴＸの濃度を高めた第２の選択工程に供した。図７を参照されたい。図７は、３種のトランスポゾンが安定にトランスフェクトされたＨ９細胞集団を２００ｎＭのＭＴＸにより１週間かけて選択し、次いで、５００ｎＭおよび１０００ｎＭに濃度を高めたＭＴＸに暴露させた結果を示す棒グラフを示している。図に示すように、５００ｎＭまたは１０００ｎＭのＭＴＸとともに細胞をさらに１週間培養すると、３種の導入遺伝子を発現する細胞集団が増加した（それぞれ、３８．５±１．０％および５３．１±０．３％となった）。２回目の選択によって、細胞生存率は約７０％に回復し、これはDHFRdm遺伝子を過剰発現する細胞がさらに選択されたことによる。

【0125】

メトトレキサートによる選択下での、Sleeping Beautyを用いたトランスポゾンＤＮＡのＴ細胞における安定な発現
Amaxa^TM Nucleofector^TMテクノロジーを使用して、新しく解凍した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）へエレクトロポレーションを行った。この細胞に、１０μｇのミニサークルＧＦＰ（MC_T3/GFP-T2A-DHFRdm）と、様々な量のSB100X高活性トランスポゼース（０μｇ、５μｇまたは１０μｇ）とをトランスフェクトした。対照細胞は、ミニサークルではないpMAXGFPベクター（１０μｇ）をトランスフェクトするか、あるいはＤＮＡによるトランスフェクトを行わなかった。トランスフェクションの４〜６時間後、ＩＬ−２およびＩＬ−１５の存在下において、前記細胞をMiltenyi Transactビーズにより刺激した。次いで、前記細胞を400,000個／ウェルとなるように９６ウェルＵ底プレートに分注した。トランスフェクションの７日後に、前記細胞を０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭまたは１００ｎＭのメトトレキサートで処理した。２日目、５日目、７日目、１４日目および１９日目に前記細胞を採取し、トリパンブルー染色でカウントし、染色し、分析した。

【0126】

ミニサークルをトランスフェクトさせたＧＦＰ発現リンパ球のフローサイトメトリー分析の一例を示す図８を参照されたい。リンパ球ウィンドウ（パネルＡ）由来の単一細胞（パネルＢ）の生存率をInvitrogen社のLIVE/DEAD red stainを用いて分析した（パネルＣ）。次いで、生リンパ球のＣＤ８の発現およびＧＦＰの発現を分析した（パネルＤ）。図８パネルＤに示すように、５０ｎＭのメトトレキサートによる選択後、リンパ球の大部分はＣＤ８^＋であり、ＧＦＰを発現した。

【0127】

１週間経過後の、Sleeping Beautyを用いたトランスポゾンＤＮＡのＴ細胞における安定な発現
ＭＴＸによる選択を行う一週間前のミニサークルＤＮＡの発現を評価するため、pMAXGFPでトランスフェクトした細胞、ＧＦＰトランスポゾン：SB100X＝１：１でトランスフェクトした細胞、ＧＦＰトランスポゾン：SB100X＝１：２でトランスフェクトした細胞、mcGFP単独でトランスフェクトした細胞、またはＤＮＡをトランスフェクトしなかった対照細胞をフローサイトメトリーで分析し比較した。エレクトロポレーションの２日後（Transactビーズなし）および５日後（Transactビーズあり）における細胞に対して行ったＦＡＣＳアッセイの結果を示す図９を参照されたい。図に示すように、ＭＴＸの非存在下ではＧＦＰの発現が経時的に消失する。しかし、SB100Xトランスポゼースが共トランスフェクトされた場合においてのみ、ＧＦＰトランスポゾンＤＮＡをトランスフェクトした細胞においてＧＦＰの発現が維持されている。

【0128】

２日目〜７日目のＧＦＰの発現レベルおよび細胞増殖を示したグラフを示す図１０を参照されたい。図１０のパネルＡに示すように、ＧＦＰの発現量（％）は経時的に低下している（pMAXGFP（１０μｇ）、mcGFP：MC_SB100X＝１：１およびmcGFP：MC_SB100X＝２：１）。Transactビーズの存在下では生細胞は徐々に増加しているが（パネルＢ）、Transactビーズの非存在下では増加せず（パネルＣ）、細胞の増殖にとってTransactビーズが重要であることを示している。

【0129】

７日間および１２日間にわたるＭＴＸによる細胞選択
１週間後、トランスフェクトされた細胞試料を、様々な濃度のＭＴＸ（２５ｎＭ、５０ｎＭまたは１００ｎＭ）に暴露させ、ミニサークルトランスポゾンを発現する細胞を濃縮した。トランスポゼースが組み込まれたことによって、DHFRdm MTX抵抗性遺伝子およびＧＦＰを安定に発現する細胞は、濃度を高めたＭＴＸの存在下でも生存するはずだと考えられる。１００ｎＭのメトトレキサートで７日間処理した後のトランスフェクト細胞のＦＡＣＳアッセイの結果を示す図１１を参照されたい。１００ｎＭのＭＴＸで処理した細胞においては、トランスポゾンおよびトランスポゼースＤＮＡの両方をトランスフェクトした細胞のみがＧＦＰを発現した。図に示すように、mcGFP：MC_SB100X＝２：１でトランスフェクトした細胞、およびmcGFP：MC_SB100X＝１：１でトランスフェクトした細胞のいずれにおいても、１００ｎＭのＭＴＸで７日間処理することによってＧＦＰの発現を有効に選択できた。

【0130】

７日間および１２日間にわたってメトトレキサートで処理したトランスフェクト細胞のＦＡＣＳアッセイの結果を示す図１２および図１３を参照されたい。生リンパ球の散布図および生リンパ球におけるＣＤ８^＋／ＧＦＰの発現について条件ごとに示している。リンパ球におけるＧＦＰの発現量（％）を図１２の各枠に示す。

【0131】

図１２においてに示すように、０ｎＭのＭＴＸで７日間処理した細胞においては、約２５％の細胞がＧＦＰの発現を示し、２５ｎＭのＭＴＸで７日間処理した細胞では、７５％の細胞がＧＦＰの発現を示している。対照的に、５０ｎＭまたは１００ｎＭのＭＴＸで処理した細胞では、少なくとも９０％の細胞がＧＦＰを発現している。図に示すように、mcGFP：MC_SB100X＝２：１およびmcGFP：MC_SB100X＝１：１のいずれにおいても、５０ｎＭおよび１００ｎＭの濃度のＭＴＸで選択することによって、ＧＦＰ発現細胞を有効に濃縮できた。予想されたように、ＳＢトランスポゼースの非存在下およびＤＮＡをトランスフェクトしなかった対照において、ＧＦＰの発現は確認できなかった。ＣＤ８^＋リンパ球およびＣＤ８⁻リンパ球において、ＧＦＰの発現には差がないことには留意されたい。

【0132】

メトトレキサートによる選択下での、Sleeping Beautyを用いたトランスポゾンＤＮＡのＴ細胞における安定な発現−細胞数のカウント
次いで、ＭＴＸによる選択下でトランスポゾンＤＮＡを安定に発現するＰＢＭＣの細胞増殖を評価した。Transactビーズによる刺激およびＩＬ−２およびＩＬ−１５の存在下において増殖させているため、１週目までに見られる生存細胞の大部分はＴ細胞であることに留意されたい。図１４に示すように、０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭおよび１００ｎＭのメトトレキサートで処理した後の生細胞数を、７日後、１４日後および１９日後（ＭＴＸによる処理を行った後０日目、７日目および１２日目）にトリパンブルー染色によりカウントした。対照（０ｎＭのＭＴＸ）においては、すべてのＤＮＡ条件下において生細胞数は経時的に増加した。しかし、ＭＴＸの存在下では、ＧＦＰおよびDHFRdm抵抗性遺伝子を共発現するミニサークルトランスポゾンとＳＢトランスポゼースとをトランスフェクトされた細胞だけが細胞分裂を行うことができ、これは、ＳＢがこのトランスポゾンの安定な発現に必要であることを示している。

【0133】

メトトレキサートによる選択下での、Sleeping Beautyを用いたトランスポゾンＤＮＡのＴ細胞における安定な発現−ＧＦＰの発現
ＭＴＸによる選択を行う際の、Sleeping Beautyを用いたトランスポゾンＤＮＡのＴ細胞における安定な発現を評価するため、このトランスフェクト細胞におけるＧＦＰの発現を１９日間にわたって測定した。図１４を参照されたい。図１４は、トランスポゾンＤＮＡおよびSleeping BeautyがトランスフェクトされたＴ細胞において、７日目に開始したメトトレキサートによる選択（０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭおよび１００ｎＭ）を行った後にＧＦＰの発現が経時的に増加することを示している。メトトレキサートによる選択を行わなかった対照においては、mcGFPおよびSBがトランスフェクトされた細胞におけるＧＦＰの発現は、２日目から５日目、７日目、１４日目および１９日目にわたって、約２０％に維持されており、そのうち、mcGFPが単独でトランスフェクトされた対照およびpMAXGFPがトランスフェクトされた対照においては、ＧＦＰの発現は徐々に低下している。ＭＴＸによる選択の存在下では、ＧＦＰの発現は経時的に増加し、５０ｎＭおよび１００ｎＭのＭＴＸによる選択においてＧＦＰの発現は最も高くなった。図に示すように、mcGFPとMC_SB100Xとの比率が１：１であっても２：１であっても差は見られなかった。さらに、５０ｎＭのＭＴＸに暴露させた細胞と１００ｎＭのＭＴＸに暴露された細胞においても、平均蛍光強度の差はごくわずかであった。mcGFPを単独でトランスフェクトさせた場合における、ＭＴＸの存在下でのＧＦＰの低レベル発現（約２０％）は、独立したトランスポゾンが安定に組み込まれたためと考えられ、この条件下における細胞の絶対数は、図１４に示したように非常に少ないものとなっている。

【0134】

一実施形態において、遺伝子に核酸を安定に挿入するための遺伝子送達ポリヌクレオチドであって、
該遺伝子送達ポリヌクレオチド内において、挿入される該核酸が逆方向末端反復遺伝子配列に挟まれていること、
該遺伝子送達ポリヌクレオチドが選択可能であること、
該遺伝子送達ポリヌクレオチドが、第１〜第７の配列を含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む最適化された配列であり、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含む最適化された配列であり、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体のメトトレキサートに対する親和性が１５，０００分の１または約１５，０００分の１に低減されており、メトトレキサートを選択メカニズムとして用いることによって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞を選択的に増殖させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位（attP）を含み、
第７の配列が、第２の付着部位（attB）を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復を含む第２の配列の５’末端に隣接していることを特徴とする遺伝子送達ポリヌクレオチドが提供される。
いくつかの実施形態において、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする遺伝子は、
ATGGTTGGTTCGCTAAACTGCATCGTCGCTGTGTCCCAGAACATGGGCATCGGCAAGAACGGGGACTTCCCCTGGCCACCGCTCAGGAATGAATCCAGATATTTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAAGAAGACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGGTAGAATTAATTTAGTTCTCAGCAGAGAACTCAAGGAACCTCCACAAGGAGCTCATTTTCTTTCCAGAAGTCTAGATGATGCCTTAAAACTTACTGAACAACCAGAATTAGCAAATAAAGTAGACATGGTCTGGATAGTTGGTGGCAGTTCTGTTTATAAGGAAGCCATGAATCACCCAGGCCATCTTAAACTATTTGTGACAAGGATCATGCAAGACTTTGAAAGTGACACGTTTTTTCCAGAAATTGATTTGGAGAAATATAAACTTCTGCCAGAATACCCAGGTGTTCTCTCTGATGTCCAGGAGGAGAAAGGCATTAAGTACAAATTTGAAGTATATGAGAAGAATGATTAA（配列番号２）で表されるＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態においては、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、
MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL SRSLDDALKL TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM QDFESDTFFP EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND（配列番号３）で表されるタンパク質配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは環状である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜５ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記プロモーター領域は、ＥＦ１プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、タンパク質をコードする遺伝子を１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインなどの、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記関連する複数のタンパク質は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態においては、前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列は、複数の関連配列において利用されている配列および／または核酸塩基の可変性を比較することによって作製される。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、抗体またはその一部を含み、該抗体またはその一部はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。

【0135】

いくつかの実施形態においては、養子Ｔ細胞免疫療法のための遺伝子改変マルチプレックスＴ細胞を製造する方法であって、
本明細書に記載の遺伝子送達ポリヌクレオチドを提供すること、
Ｔ細胞に前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記Ｔ細胞を単離することを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、第１〜第７の配列を含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む最適化された配列であり、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含む最適化された配列であり、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体のメトトレキサートに対する親和性が１５，０００分の１または約１５，０００分の１に低減されており、メトトレキサートを選択メカニズムとして用いることによって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞を選択的に増殖させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位（attP）を含み、
第７の配列が、第２の付着部位（attB）を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復を含む第２の配列の５’末端に隣接していることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする遺伝子は、
ATGGTTGGTTCGCTAAACTGCATCGTCGCTGTGTCCCAGAACATGGGCATCGGCAAGAACGGGGACTTCCCCTGGCCACCGCTCAGGAATGAATCCAGATATTTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAAGAAGACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGGTAGAATTAATTTAGTTCTCAGCAGAGAACTCAAGGAACCTCCACAAGGAGCTCATTTTCTTTCCAGAAGTCTAGATGATGCCTTAAAACTTACTGAACAACCAGAATTAGCAAATAAAGTAGACATGGTCTGGATAGTTGGTGGCAGTTCTGTTTATAAGGAAGCCATGAATCACCCAGGCCATCTTAAACTATTTGTGACAAGGATCATGCAAGACTTTGAAAGTGACACGTTTTTTCCAGAAATTGATTTGGAGAAATATAAACTTCTGCCAGAATACCCAGGTGTTCTCTCTGATGTCCAGGAGGAGAAAGGCATTAAGTACAAATTTGAAGTATATGAGAAGAATGATTAA（配列番号２）で表されるＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態においては、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、
MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL SRSLDDALKL TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM QDFESDTFFP EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND（配列番号３）で表されるタンパク質配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは環状である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜５ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記プロモーター領域は、ＥＦ１プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、タンパク質をコードする遺伝子を１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインなどの、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記関連する複数のタンパク質は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態においては、前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列は、複数の関連配列において利用されている配列および／または核酸塩基の可変性を比較することによって作製される。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、抗体またはその一部を含み、該抗体またはその一部はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記導入をエレクトロポレーションによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択を、選択マーカーカセットを使用して選択圧を高めることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬は選択剤を含む。いくつかの実施形態においては、前記選択剤はメトトレキサートである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域が少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、前記第２の濃度域が少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭもしくは１００ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、７５ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭもしくは１５０ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、７５ｎＭ、８５ｎＭ、９５ｎＭ、１０５ｎＭ、１１５ｎＭ、１２５ｎＭ、１３５ｎＭ、１４５ｎＭもしくは１５０ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、１１２ｎＭ、１２２ｎＭ、１３２ｎＭ、１４２ｎＭ、１５２ｎＭ、１６２ｎＭ、１７２ｎＭ、１８２ｎＭ、１９２ｎＭ、２０２ｎＭ、２１２ｎＭもしくは２２５ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、前記第１の濃度域は少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭもしくは６７５ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、１０００ｎＭもしくは１０１２ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記１回目の選択は、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記２回目の選択は、前記Ｔ細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日もしくは１４日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の時間にわたって、前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。

【0136】

いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞におけるタンパク質の産生を増加させる方法であって、
本明細書に記載のポリヌクレオチドを提供すること、
細胞に前記ポリヌクレオチドを導入すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードするベクターを提供すること、
Sleeping Beautyトランスポゼースをコードする前記ベクターを前記Ｔ細胞に導入すること、
第１の濃度域の選択試薬を加えることを含む１回目の選択と、第１の濃度域よりも高くかつ第１の濃度域の少なくとも１．５倍以上である第２の濃度域の該選択試薬を加えることを含む２回目の選択とを含む操作によって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドを含む前記細胞を選択すること、ならびに
選択圧下において表現型を発現する前記細胞を単離すること
を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記導入をエレクトロポレーションによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択を、選択マーカーカセットを使用して選択圧を高めることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬は選択剤を含む。いくつかの実施形態においては、前記選択剤はメトトレキサートである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域が少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、前記第２の濃度域が少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭもしくは１００ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、７５ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭもしくは１５０ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、７５ｎＭ、８５ｎＭ、９５ｎＭ、１０５ｎＭ、１１５ｎＭ、１２５ｎＭ、１３５ｎＭ、１４５ｎＭもしくは１５０ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、１１２ｎＭ、１２２ｎＭ、１３２ｎＭ、１４２ｎＭ、１５２ｎＭ、１６２ｎＭ、１７２ｎＭ、１８２ｎＭ、１９２ｎＭ、２０２ｎＭ、２１２ｎＭもしくは２２５ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、前記第１の濃度域は少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭもしくは６７５ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、１０００ｎＭもしくは１０１２ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記１回目の選択は、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記２回目の選択は、前記Ｔ細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日もしくは１４日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の時間にわたって、前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。

【0137】

いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、第１〜第７の配列を含み、
第１の配列が、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第２の配列が、第２の逆方向末端反復遺伝子配列を含み、
第３の配列が、プロモーター領域配列を含み、
第４の配列が、タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む最適化された配列であり、
第５の配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする少なくとも１つの選択マーカーカセットを含む最適化された配列であり、該ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体のメトトレキサートに対する親和性が１５，０００分の１または約１５，０００分の１に低減されており、メトトレキサートを選択メカニズムとして用いることによって、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドによって形質導入された細胞を選択的に増殖させることができ、
第６の配列が、第１の付着部位（attP）を含み、
第７の配列が、第２の付着部位（attB）を含むこと、ならびに
第１の配列、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列、第６の配列および第７の配列がそれぞれ５’末端および３’末端を有し、第１の逆方向末端反復遺伝子配列を含む第１の配列の３’末端が、第３の配列の５’末端に隣接し、第３の配列の３’末端が、第４の配列の５’末端に隣接し、第４の配列の３’末端が、第５の配列の５’末端に隣接し、第５の配列の３’末端が、第２の逆方向末端反復を含む第２の配列の５’末端に隣接していることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体をコードする遺伝子は、
ATGGTTGGTTCGCTAAACTGCATCGTCGCTGTGTCCCAGAACATGGGCATCGGCAAGAACGGGGACTTCCCCTGGCCACCGCTCAGGAATGAATCCAGATATTTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAAGAAGACCTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGGTAGAATTAATTTAGTTCTCAGCAGAGAACTCAAGGAACCTCCACAAGGAGCTCATTTTCTTTCCAGAAGTCTAGATGATGCCTTAAAACTTACTGAACAACCAGAATTAGCAAATAAAGTAGACATGGTCTGGATAGTTGGTGGCAGTTCTGTTTATAAGGAAGCCATGAATCACCCAGGCCATCTTAAACTATTTGTGACAAGGATCATGCAAGACTTTGAAAGTGACACGTTTTTTCCAGAAATTGATTTGGAGAAATATAAACTTCTGCCAGAATACCCAGGTGTTCTCTCTGATGTCCAGGAGGAGAAAGGCATTAAGTACAAATTTGAAGTATATGAGAAGAATGATTAA（配列番号２）で表されるＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態においては、ヒトの前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、
MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL SRSLDDALKL TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM QDFESDTFFP EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND（配列番号３）で表されるタンパク質配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは環状である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは少なくとも１ｋｂ〜５ｋｂである。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記プロモーター領域は、ＥＦ１プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、タンパク質をコードする遺伝子を１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ含む。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記第４の配列は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインなどの、関連する複数のタンパク質をコードする複数の核酸から作製されたコンセンサス配列である。いくつかの実施形態においては、前記関連する複数のタンパク質は、同じエピトープに特異的な複数の抗体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、該配列中の総ＧＣ／ＡＴ比が低下するようにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記第５の配列は、ヒトにおける発現を目的としたコドン最適化によって最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記最適化されたコドンおよび／またはコンセンサス配列は、複数の関連配列において利用されている配列および／または核酸塩基の可変性を比較することによって作製される。いくつかの実施形態においては、前記タンパク質は、抗体またはその一部を含み、該抗体またはその一部はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、Ｌ２２ＦおよびＦ３１Ｓのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態においては、前記導入をエレクトロポレーションによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択を、選択マーカーカセットを使用して選択圧を高めることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記選択試薬は選択剤を含む。いくつかの実施形態においては、前記選択剤はメトトレキサートである。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域が少なくとも５０ｎＭ〜１００ｎＭであり、前記第２の濃度域が少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭもしくは１００ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、７５ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭもしくは１５０ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも７５ｎＭ〜１５０ｎＭであり、前記第２の濃度域は少なくとも１１２．５ｎＭ〜２２５ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、７５ｎＭ、８５ｎＭ、９５ｎＭ、１０５ｎＭ、１１５ｎＭ、１２５ｎＭ、１３５ｎＭ、１４５ｎＭもしくは１５０ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、１１２ｎＭ、１２２ｎＭ、１３２ｎＭ、１４２ｎＭ、１５２ｎＭ、１６２ｎＭ、１７２ｎＭ、１８２ｎＭ、１９２ｎＭ、２０２ｎＭ、２１２ｎＭもしくは２２５ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記第１の濃度域は少なくとも３００ｎＭ〜６７５ｎＭであり、前記第１の濃度域は少なくとも４５０ｎＭ〜１０１２ｎＭである。いくつかの実施形態においては、前記第１濃度は、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭもしくは６７５ｎＭ、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度であり、前記第２の濃度域は、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、１０００ｎＭもしくは１０１２ｎＭであり、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される濃度範囲にある任意の濃度である。いくつかの実施形態においては、前記１回目の選択は、前記２回目の選択を行う前に、２日、３日、４日、５日、６日または７日にわたって前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。いくつかの実施形態においては、前記２回目の選択は、前記Ｔ細胞を単離する前に、少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日もしくは１４日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の時間にわたって、前記Ｔ細胞を前記選択剤に暴露することを含む。

【0138】

いくつかの実施形態においては、対象におけるがんまたは疾患を治療、抑制または緩和する方法であって、本明細書に記載の改変Ｔ細胞を対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態においては、前記対象はヒトである。

【0139】

本明細書における実質的に複数形および／または単数形の用語の使用に関して、当業者であれば、本明細書の文脈および／または本明細書に記載の用途を踏まえて、複数個のものを単数のものであると解釈することができ、かつ／または単数のものを複数個のものであると解釈することができる。本発明を明確なものとするため、単数から複数または複数から単数へのさまざまな置き換えが本明細書において記載されている。

【0140】

当業者であれば、通常、本明細書に記載の用語、特に、添付の請求項（たとえば、添付の請求項の本体部）において使用されている用語は「オープンエンドな」用語であることを理解するであろう（たとえば、「含んでいる（including）」という用語は、「含んでいるが、これらに限定されない」と解釈されるべきであり、「有する（having）」という用語は、「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む（includes）」という用語は「含むが、これらに限定されない」と解釈されるべきである）。さらに、当業者であれば、特定の数について請求項に記載する場合、その記載の意図も請求項に明確に記載すべきであり、特定数が記載されない場合はその意図を記載する必要はないことを理解するであろう。分かりやすく説明をすれば、たとえば、後述の特許請求の範囲では、請求項を記載するために、「少なくとも１つ」や「１つ以上」といった前置きが記載されている場合がある。しかしながら、このような前置きが使用されているからといって、不定冠詞「１つ（ａまたはａｎ）」で記載された特定の請求項を、１つのみの要素を含む実施形態に限定すべきではなく、たとえ同じ請求項内に「１つ以上」または「少なくとも１つ」といった前置きと「１つ（ａまたはａｎ）」といった不定冠詞とが含まれていたとしても、１つのみの要素を含む実施形態に限定すべきではない（たとえば、「１つ（ａおよび／またはａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味すると解釈されるべきである）。これは、請求項の記載において定冠詞が使用された場合でも同じである。さらに、請求項に特定の数が明確に記載されていたとしても、当業者であれば、通常、「少なくとも」記載されたその数であるということを理解するであろう（たとえば、修飾語を伴わない「２つ」という記載は、「少なくとも」２つまたは「２つ以上」を意味する）。さらに、たとえば「Ａ、ＢおよびＣのうち少なくとも１つ」などの頻用される語句が使用される場合、通常、そのような文構造は、当業者がその語句を通常理解する意味で記載されている（たとえば、「Ａ、ＢおよびＣのうち少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢの両方を有するシステム、ＡとＣの両方を有するシステム、ＢとＣの両方を有するシステム、ならびに／またはＡ、ＢおよびＣのすべてを有するシステムなどを包含するが、これらに限定されない）。「Ａ、ＢまたはＣのうち少なくとも１つ」などの頻用される語句が使用される場合、通常、そのような文構造は、当業者がその語句を通常理解する意味で記載されている（たとえば、「Ａ、ＢまたはＣのうち少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢの両方を有するシステム、ＡとＣの両方を有するシステム、ＢとＣの両方を有するシステム、ならびに／またはＡ、ＢおよびＣのすべてを有するシステムなどを包含するが、これらに限定されない）。さらに、当業者であれば、２つ以上の選択肢を表すための選言的用語および／または選言的語句は、明細書、特許請求の範囲または図面のいずれにおいても、列記された用語のうちの１つ、列記された用語のいずれか、または列記された用語の両方を含む場合があると理解すべきであると理解するであろう。たとえば、「ＡまたはＢ」という表現は、「ＡまたはＢ」または「ＡおよびＢ」を示す場合を包含する。

【0141】

さらに、本開示の構成要素または態様がマーカッシュ形式で記載されている場合、当業者であれば、マーカッシュ形式で記載された個々のメンバーまたはメンバーのサブグループについても記載されていると理解するであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12-1】

【図12-2】

【図12-3】

【図12-4】

【図12-5】

【図12-6】

【図12-7】

【図12-8】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図13-4】

【図13-5】

【図13-6】

【図13-7】

【図13-8】

【図14-1】

【図14-2】

【図15-1】

【図15-2】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図18-1】

【図18-2】

【図19】

【図20-1】

【図20-2】

【図21-1】

【図21-2】

【図21-3】

【図22】

【図23-1】

【図23-2】

【図24-1】

【図24-2】

【図25】

【図26-1】

【図26-2】

【図26-3】

【図27】

【図28-1】

【図28-2】

【図29】

【図30-1】

【図30-2】

【図30-3】

【図31-1】

【図31-2】

【図31-3】

【図32】

【図33-1】

【図33-2】

【図33-3】

【図34-1】

【図34-2】

【図34-3】

【図35】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]