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特許6789416細胞培養用足場材料からなる樹脂膜、細胞培養用容器及び細胞の培養方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6789416
(24)【登録日】2020年11月5日
(45)【発行日】2020年12月2日
(54)【発明の名称】細胞培養用足場材料からなる樹脂膜、細胞培養用容器及び細胞の培養方法
(51)【国際特許分類】
C12M 3/00 20060101AFI20201119BHJP
C12N 5/074 20100101ALI20201119BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20201119BHJP
C12N 5/0789 20100101ALI20201119BHJP
C12M 1/00 20060101ALN20201119BHJP
【ＦＩ】
C12M3/00 A
C12N5/074
C12N5/0735
C12N5/0789
!C12M1/00 C
【請求項の数】9
【全頁数】26
(21)【出願番号】特願2019-562491(P2019-562491)
(86)(22)【出願日】2018年12月27日
(86)【国際出願番号】JP2018048386
(87)【国際公開番号】WO2019131978
(87)【国際公開日】20190704
【審査請求日】2020年1月24日
(31)【優先権主張番号】特願2017-252420(P2017-252420)
(32)【優先日】2017年12月27日
(33)【優先権主張国】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】000002174
【氏名又は名称】積水化学工業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001232
【氏名又は名称】特許業務法人 宮▲崎▼・目次特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】羽根田 聡
(72)【発明者】
【氏名】真鍋 百里子
(72)【発明者】
【氏名】石井 亮馬
(72)【発明者】
【氏名】井口 博貴
(72)【発明者】
【氏名】山内 博史
(72)【発明者】
【氏名】大村 貴宏
【審査官】
松浦 安紀子
(56)【参考文献】
【文献】
米国特許第０４５３７７９０（ＵＳ，Ａ）
【文献】
特開２０１５−１９５７５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００１−１３１３２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００６−３１４２８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開平１０−０５２２６８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２０１０−１６８４４４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００１−０８９５７４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH A, 2014, Vol.102A, pp.247-253
【文献】
Macromolecular Research, 2011, Vol.19, pp.385-395
【文献】
Phys. Chem. Chem. Phys., 2014, Vol.16, pp.17551-17559
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｍ １／００−１／４２
Ｃ１２Ｍ ３／００−３／１０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
合成樹脂を含有する細胞培養用足場材料からなる樹脂膜であって、
表面自由エネルギーの分散成分γｄが２８．０ｍＪ／ｍ２以上３８．０ｍＪ／ｍ２以下であり、
表面自由エネルギーの双極子成分γｐが１．０ｍＪ／ｍ２以上１０．０ｍＪ／ｍ２以下であり、
前記合成樹脂がポリビニルアセタール骨格、ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格の少なくともいずれか一方を含む、細胞培養用足場材料からなる樹脂膜。
表面自由エネルギーの分散成分γｄが２８．０ｍＪ／ｍ２以上３８．０ｍＪ／ｍ２以下であり、
表面自由エネルギーの双極子成分γｐが１．０ｍＪ／ｍ２以上１０．０ｍＪ／ｍ２以下であり、
前記合成樹脂がポリビニルアセタール骨格、ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格の少なくともいずれか一方を含む、細胞培養用足場材料からなる樹脂膜。
【請求項2】
前記合成樹脂がポリビニルアセタール樹脂である、請求項１に記載の樹脂膜。
【請求項3】
前記合成樹脂がポリビニルアセタール樹脂を含み、
前記ポリビニルアセタール樹脂のアセタール化度が６０モル％よりも高く、
前記ポリビニルアセタール樹脂がポリビニルブチラールである、請求項１に記載の樹脂膜。
前記ポリビニルアセタール樹脂のアセタール化度が６０モル％よりも高く、
前記ポリビニルアセタール樹脂がポリビニルブチラールである、請求項１に記載の樹脂膜。
【請求項4】
前記ポリビニルアセタール樹脂は、アミン構造を有する構成単位、イミン構造を有する構成単位、及びアミド構造を有する構成単位からなる群から選択される少なくとも一種を構成単位として含む、請求項２または３に記載の樹脂膜。
【請求項5】
前記ポリビニルアセタール樹脂は、アミン構造を有する構成単位、イミン構造を有する構成単位、及びアミド構造を有する構成単位の合計の含有量が、０．１モル％以上３０モル％以下である、請求項４に記載の樹脂膜。
【請求項6】
前記細胞が多能性幹細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の樹脂膜。
【請求項7】
細胞の培養領域の少なくとも一部に請求項１〜６のいずれか１項に記載の樹脂膜を含む、細胞培養用容器。
【請求項8】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の樹脂膜を用いる、細胞の培養方法。
【請求項9】
前記樹脂膜上に細胞塊を播種する工程を含む、請求項８に記載の細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、幹細胞培養用足場材料及びそれを用いた幹細胞培養方法に関する。【背景技術】
【0002】
幹細胞は創薬や再生医療への応用が期待されている。幹細胞は、自己複製能と分化能を有する細胞であり、全ての細胞種へ分化可能な多能性幹細胞と、同系列の体組織の構成細胞種へのみ分化可能な組織幹細胞および組織前駆細胞がある。多能性幹細胞は、例えばヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）や、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）などのヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）等が挙げられる。幹細胞を安全に、そして再現性良く培養し、増殖させることは、これらの細胞を医療応用する上では必須の基盤技術となる。特に、再生医療の産業利用上においては、幹細胞を未分化状態で多量に扱う必要がある。そのため、天然および合成の高分子やフィーダー細胞を用いて幹細胞の増殖を行うと共に、多能性能（または多分化能）を維持する技術について広範な研究が行われている。特に天然高分子としてラミニン、ヴィトロネクチンなどの接着タンパク質やマウス肉腫由来のマトリゲルを使用すると播種後の細胞定着性が非常に高いことが知られている。【0003】
しかし、天然高分子は生産性が非常に低いため高価であること、天然由来物質であるためロット間にバラツキが見られること、動物由来の成分による安全性上の懸念があることが課題として挙げられる。【0004】
上記課題を解決するために、合成樹脂を使用した幹細胞培養樹脂担体が提案されている。例えば、特許文献１の実施例の欄には、マウス線維芽細胞の培養において、親水性かつ耐水性に優れる足場材を提供するためにアセタール化度が２０〜６０モル％のポリビニルアセタール化合物が開示されている。特許文献２の実施例の欄にはマウスＥＳ細胞の培養において、アクリルポリマーによって構成されたハイドロゲルが開示されている。特許文献３の実施例の欄にはマウスｉＰＳ細胞の培養において、親水性かつ柔軟なポリロタキサンゲルが開示されている。【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２００６−３１４２８５号公報
【特許文献2】特開２０１０−１５８１８０号公報
【特許文献3】特開２０１７−２３００８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら、特許文献１には、親水性が高いため培地中で膨潤し、足場材樹脂が剥がれる問題がある。また、幹細胞や多能性幹細胞の播種後の定着性が低く、十分に増殖しないという問題がある。特許文献２には、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム塩、および、ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドを使用しており、親水性が高いため培地中で膨潤し、足場材樹脂が剥がれる問題がある。特許文献３には、親水性が高いため培地中で膨潤し、足場材樹脂が剥がれる問題がある。また、柔軟な足場材であるために心筋細胞への分化が促進されるという問題がある。【0007】
以上より、適度な親水性と強度を備える幹細胞培養用足場材料及びそれを用いた幹細胞培養方法が求められていた。本発明は、適度な親水性と強度を備え、幹細胞の播種後の定着性が高く、高効率に細胞増殖が可能な幹細胞培養用足場材料及びそれを用いた幹細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は以下の内容に関する。（１）表面自由エネルギーの分散成分γｄが２４．５以上４５．０未満であり、表面自由エネルギーの双極子成分γｐが１．０以上２０．０未満である幹細胞培養用足場材料。
（２）幹細胞培養用足場材料が合成樹脂を含む、（１）記載の幹細胞培養用足場材料。
（３）合成樹脂がポリビニルアセタール骨格、ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格の少なくともいずれか一方を含む（２）記載の幹細胞培養用足場材料。
（４）合成樹脂がポリビニルアセタール樹脂である（２）記載の幹細胞培養用足場材料。
（５）合成樹脂を含有する幹細胞培養用足場材料であって、合成樹脂がポリビニルアセタール樹脂を含み、ポリビニルアセタール樹脂のアセタール化度が６０モル％よりも高い幹細胞培養用足場材料。
（６）ポリビニルアセタール樹脂は、イミン構造を有する構成単位、アミノ基を有する構成単位、及びアミド構造を有する構成単位からなる群より選択される少なくとも一種を有する、（４）または（５）の幹細胞培養用足場材料。
（７）ポリビニルアセタール樹脂は、イミン構造を有する構成単位、アミノ基を有する構成単位、及びアミド構造を有する構成単位を合計した含有量が、０．１モル％以上２０モル％以下である、（６）記載の幹細胞培養用足場材。
（８）幹細胞が多能性幹細胞である（１）〜（７）のいずれか１項記載の幹細胞培養用足場材料。
（９）細胞の培養領域の少なくとも一部に（１）〜（８）のいずれか１項記載の幹細胞培養用足場材料からなる樹脂膜を備える幹細胞培養用容器。
（１０）（１）〜（８）のいずれか１項記載の幹細胞培養用足場材料を備える幹細胞培養用繊維。
（１１）（１）〜（８）のいずれか１項記載の足場材料を用いる幹細胞の培養方法。
（１２）足場材料上に細胞塊を播種する工程を含む、（１１）記載の幹細胞の培養方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、適度な親水性と強度を備え、幹細胞の播種後の定着性が高い幹細胞培養用足場材料及びそれを用いた幹細胞培養方法が提供される。【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下に、実施形態を挙げて本発明の説明を行うが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書で用いられる用語の説明を行う。
「幹細胞」とは、自己複製能と分化能を有する細胞をいう。幹細胞のうち、自己複製能を有し、かつ、１つの細胞から、内胚葉、中胚葉、外胚葉の全ての細胞へ分化できるものを「多能性幹細胞」という。
多能性幹細胞としては、例えば、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell、以下「ｉＰＳ細胞」という。）、胚性幹細胞（embryonic stem cells、以下「ＥＳ細胞」という。）、Ｍｕｓｅ細胞（multilinege differentiating stress enduring cells）、胚性がん細胞（embryonic germ cell）、胚性生殖幹細胞（embryonic germ cell）、ｍＧＳ細胞（multipotent germ stem cell）等が挙げられる。
幹細胞のうち、自己複製能を有し、外胚葉系組織、内胚葉系組織、中胚葉系組織、生殖系組織のいずれかに属し、それが属している臓器の構成細胞種への限られた分化能を示すものを「組織幹細胞」および「組織前駆細胞」という。
組織幹細胞および組織前駆細胞としては、例えば、神経幹細胞、神経堤幹細胞、網膜幹細胞、角膜幹細胞、ケラチノサイト表皮幹細胞、メラノサイト幹細胞、乳腺幹細胞、肝幹細胞、腸幹細胞、気道幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、血管内皮前駆細胞、血管周皮細胞、骨格筋幹細胞、脂肪幹細胞、腎前駆細胞、精子幹細胞等が挙げられる。この様な幹細胞としては、例えば「もっとよくわかる！幹細胞と再生医療」（羊土社、長船健二著）に記載の幹細胞を挙げることができる。
【0012】
［幹細胞培養用足場材料１］本発明者らは上述の課題を解決するべく、幹細胞培養用足場材料の表面自由エネルギーを制御することで、上述の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明の第一の態様は、表面自由エネルギーの分散成分γｄと双極子成分γｐが、ある一定の範囲にある幹細胞培養用足場材料に関する。
なお、本明細書における表面自由エネルギーの分散成分γｄ及び双極子成分γｐは、Ｋａｅｌｂｌｅ−Ｕｙ理論式を用いて測定することができる。
ここで、Ｋａｅｌｂｌｅ−Ｕｙの理論式は、式（１）で表されるように、トータル表面自由エネルギーγが分散成分γｄと、双極子成分γｐとの和からなるとの仮定に基づく。
【0013】
【数1】
【0014】
【数2】
上記純水の接触角は、足場材料に純水１μＬを着滴させ、３０秒後の液滴像を、接触角計（協和界面化学社製、ＤＭｏ−７０１）を用いて撮影することで得ることができる。また、上記ジヨードメタンの接触角は、足場材料にジヨードメタン１μＬを着滴させ、同様に３０秒後の液滴像を撮影することで得ることができる。
【0015】
上記幹細胞培養用足場材料は、上記表面自由エネルギーの分散成分γｄ、及び双極子成分γｐを好適に調整できる観点から、合成樹脂を含むことが好ましい。また、合成樹脂としては、上記表面自由エネルギーの分散成分γｄ、及び双極子成分γｐを好適に調整できる観点から、ポリビニルアセタール骨格、ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格の少なくともいずれか一方を含むことが好ましい。図１は主な合成樹脂の表面自由エネルギーの分散成分γｄに対する双極子成分γｐの関係をまとめた図である。図２、図３はそれぞれ図１の一部拡大図である。
本発明の幹細胞培養用足場材料の表面自由エネルギーの分散成分γｄは、２４．５以上４５．０未満である。上記分散成分γｄは、２８．０以上３８．０以下がより好ましく、３２．８以上３６．０以下がさらに好ましい。
本発明の幹細胞培養用足場材料の表面自由エネルギーの双極子成分γｐは、１．０以上２０．０未満である。上記双極子成分γｐは、１．０以上１０．０以下がより好ましく、２．５以上５．０以下がさらに好ましい。
上記分散成分γｄおよび上記双極子成分γｐは、例えば、以下で述べる合成樹脂の骨格を適宜変更することにより制御することができる。
上記分散成分γｄは、例えば、合成樹脂の骨格の中から、非極性官能基量を増やすことや環状構造を有する官能基を導入することで大きくすることができ、合成樹脂中のブチル基成分の量を減らすこと等により小さくすることができる。合成樹脂としては、ポリビニルアセタール骨格、ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格の少なくともいずれか一方を含むことが好ましい。
【0016】
双極子成分γｐは、例えば、合成樹脂の骨格の中から、極性官能基量を増やすことや、エーテル構造を含む官能基を大きくすることができ、非極性官能基であるブチル基量を増やすことで小さくすることができる。【0017】
［合成樹脂］合成樹脂は、重合性モノマー（以下、単に「モノマー」ともいう）を重合（重縮合も含む）して得られるポリマー（以下、単に「ポリマー」ともいう）を主成分とするものをいう。上記ポリマーは一種または二種以上の重合性モノマーのコポリマーも含む。
【0018】
上記ポリマーとしては、例えば、（不）飽和炭化水素、芳香族炭化水素、（不）飽和脂肪酸、芳香族カルボン酸、（不）飽和ケトン、芳香族ケトン、（不）飽和アルコール、芳香族アルコール、（不）飽和アミン、芳香族アミン、（不）飽和チオール、芳香族チオール、有機ケイ素化合物等の１種以上の重合性モノマーからなるポリマーが挙げられる。具体的な上記ポリマーとしては、例えば、ポリオレフィン、ポリエーテル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、ポリエステル、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、エポキシ樹脂、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、ポリカーボネート、セルロース、ポリペプチド等が挙げられる。これらのなかでも、幹細胞の定着性の観点から、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、ポリビニルアセタールが好ましく、ポリビニルアセタールがより好ましい。
なお、これらのポリマーは、一種類のみを用いてもよく、二種類以上を組み合わせて用いてもよい。二種類以上のポリマーを組み合わせる場合は、二種類以上のポリマーを混合して用いてもよく、二種類以上のポリマーの骨格を化学結合させたポリマーとして用いてもよい。合成樹脂として、二種類以上のポリマーを組み合わせる場合には、ポリ（メタ）アクリル酸エステルと、ポリビニルアセタールとを組み合わせることが好ましい。
【0019】
本明細書における「（メタ）アクリル酸類」とは、（メタ）アクリル酸エステル及び（メタ）アクリル酸からなる群より選択される少なくとも１種をいう。またポリ（メタ）アクリル酸類は、そのモノマーである（メタ）アクリル酸エステル又は（メタ）アクリル酸を重合することによって得られる重合体であるが、（メタ）アクリル酸エステル又は（メタ）アクリル酸以外のモノマーを共重合したものも含む。上記（メタ）アクリル酸エステルとしては特に限定されないが、（メタ）アクリル酸アルキルエステル、（メタ）アクリル酸環状アルキルエステル、（メタ）アクリル酸アリールエステル、（メタ）アクリルアミド類、（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコール類、（メタ）アクリル酸ホスホリルコリン等が挙げられる。
【0020】
上記（メタ）アクリル酸アルキルエステルとしては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−プロピル（メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、イソオクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、イソノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、イソデシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、イソテトラデシル（メタ）アクリレート等が挙げられる。なお、これらの（メタ）アクリル酸アルキルエステルは、特に制限はないが、炭素原子数１〜３のアルコキシ基、テトラヒドロフルフリル基等の種々の置換基で置換されていてもよい。例としては、メトキシエチルアクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレート等が挙げられる。
上記（メタ）アクリル酸環状アルキルエステルとしては、例えば、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
上記（メタ）アクリル酸アリールエステルとしては、例えば、フェニル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記アクリルアミド類としては、例えば、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチル（メタ）アクリルアミド、(３−（メタ）アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド、４−（メタ）アクリロイルモルホリン、３−（メタ）アクリロイル−２−オキサゾリジノン、 Ｎ−[３−(ジメチルアミノ)プロピル]（メタ）アクリルアミド、Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロール（メタ）アクリルアミド、６−（メタ）アクリルアミドヘキサン酸等が挙げられる。
上記（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコール類としては、例えば、メトキシ-ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシ-ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヒドロキシ-ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシ-ジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシ-ジエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヒドロキシ-ジエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシ-トリエチレングルコール（メタ）アクリレート、エトキシ-トリエチレングルコール（メタ）アクリレート、ヒドロキシ-トリエチレングルコール（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記（メタ）アクリル酸ホスホリルコリンとしては、例えば、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン等が挙げられる。
（メタ）アクリル酸エステル以外のモノマーとしては、特に限定はなく、（メタ）アクリル酸、エチレン、ビニルエステル等が挙げられる。
上記（メタ）アクリル酸エステルは単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。なお、本明細書において、上記（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸及びメタクリル酸を総称するものであり、上記（メタ）アクリレートとは、アクリレート及びメタクリレートを総称するものとする。
なお、本発明の第一の態様は、以下で述べる第二の態様を組み合わせたものが、幹細胞の定着性を高める観点より好ましい。
【0021】
［幹細胞培養用足場材料２］本発明者らは、鋭意検討した結果、ポリビニルアセタール樹脂を含有する合成樹脂を用いることで、上述の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の第二の態様は、合成樹脂を含有する幹細胞培養用足場材料であって、合成樹脂がポリビニルアセタール樹脂を含み、ポリビニルアセタール樹脂のアセタール化度が６０モル％よりも高い幹細胞培養用足場材料に関する。なお、本発明の幹細胞培養用足場材料には、合成樹脂のみからなる態様が含まれる。
この幹細胞培養用足場材料は、適度な親水性と強度を備えるため、幹細胞の播種後の定着性が向上する。特にフィーダー細胞や接着タンパク質を含まない無血清培地培養において、幹細胞播種後の初期定着率が向上する。
【0022】
従来、幹細胞培養用足場材料として合成樹脂を用いる場合に、合成樹脂のアセタール化度を６０モル％よりも高く設定することは報告されていなかった。アセタール化度の増加に伴う水酸基の割合の低下により樹脂の親水性が低下することで、幹細胞培養用足場材料への幹細胞の播種後の定着性の低下や、または細胞培養に必要な多糖類等の透過性の低下が懸念されていたからである。ところが、本発明者等は、親水性よりも強度が重要であることを知見し、アセタール化度を６０モル％よりも高く設定して幹細胞培養用足場材料の強度を向上することで、幹細胞の播種後の定着性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。以下、ポリビニルアセタール樹脂について詳細に説明する。【0023】
（ポリビニルアセタール樹脂）ポリビニルアセタール樹脂は、ポリビニルアルコールをアルデヒドによりアセタール化することにより合成される樹脂であり、側鎖にアセチル基と水酸基、そしてアセタール基を有する。
【0024】
上記ポリビニルアセタール樹脂のアセタール化度は、好ましい下限が６０モル％、好ましい上限は９０モル％である。アセタール化度が６０モル％以上であると、幹細胞の定着性に優れ、高効率に細胞増殖を行うことができる。また、アセタール化度が９０モル％以下であると、溶剤への溶解性を良好なものとすることができる。より好ましい下限が６５モル％、より好ましい上限が８５モル％である。上記ポリビニルアセタール樹脂のアセタール度は１Ｈ-ＮＭＲ測定により測定可能である。
【0025】
上記アセタール化に用いられるアルデヒドとしては、炭素数１〜１０の鎖状脂肪族基、環状脂肪族基又は芳香族基を有するアルデヒドが挙げられる。これらのアルデヒドとしては、従来公知のアルデヒドを使用できる。上記アルデヒドの種類は特に限定されないが、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、ペンタナール、ヘキサナール、ヘプタナール、オクタナール、ノナナール、デカナール、アクロレイン、ベンズアルデヒド、シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ホルミルピリジン、ホルミルイミダゾール、ホルミルピロール、ホルミルピペリジン、ホルミルピペリジン、ホルミルトリアゾール、ホルミルテトラゾール、ホルミルインドール、ホルミルイソインドール、ホルミルプリン、ホルミルプリン、ホルミルベンゾイミダゾール、ホルミルベンゾトリアゾール、ホルミルキノリン、ホルミルイソキノリン、ホルミルキノキサリン、ホルミルシンノリン、ホルミルプテリジン、ホルミルフラン、ホルミルオキソラン、ホルミルオキサン、ホルミルチオフェン、ホルミルチオラン、ホルミルチアン、ホルミルアデニン、ホルミルグアニン、ホルミルシトシン、ホルミルチミン、ホルミルウラシルなどが挙げられる。上記アルデヒドは鎖状であっても環状であっても良い。
【0026】
上記アルデヒドはホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、ペンタナールであることが好ましく、ブチルアルデヒドがさらに好ましい。【0027】
ポリビニルアセタール樹脂の重合度の下限は、１００が好ましく、２００がより好ましく、５００がさらに好ましく、１５００がさらにより好ましい。重合度が上記範囲であると、細胞培養にしようする培地で膨潤しても足場材強度を好適に保つことが出来ることから、細胞増殖性が向上する。重合度の上限は６０００が好ましく、３０００がより好ましく、２５００がさらに好ましい。重合度が上記範囲であると、取り扱い性が良く、足場材を好適に成形出来る。【0028】
上記ポリビニルアルコールは、ビニル化合物との共重合体であっても良い。ビニル化合物としては、エチレン、アリルアミン、ビニルピロリドン、無水マレイン酸、マレイミド、イタコン酸、（メタ）アクリル酸、ビニルアミン、（メタ）アクリル酸エステル等が挙げられる。なお、上記（メタ）アクリル酸エステルとしては、例えば、上述した（メタ）アクリル酸エステルを用いることができる。【0029】
上記ポリビニルアセタール樹脂は、ビニル化合物とのグラフト共重合体であっても良い。ビニル化合物としては、上述の化合物が挙げられる。【0030】
上記グラフト共重合体は「ポリビニルアセタールからなるユニット」と「ビニル化合物からなるユニット」とを有するグラフト共重合体（以下、単に「グラフト共重合体」ともいう）を含有する。ビニル化合物とは、エテニル基（Ｈ２Ｃ＝ＣＨ−）を有する構成単位を有する化合物をいう。本発明において、「ポリビニルアセタールからなるユニット」及び「ビニル化合物からなるユニット」とは、グラフト共重合体中に存在している「ポリビニルアセタール」、「ビニル化合物からなるユニット」のことをいう。また、ポリビニルアセタールからなるユニット及びビニル化合物からなるユニットからなるユニットを有するグラフト共重合体は、主鎖を構成する「ポリビニルアセタールからなるユニット」又は「ビニル化合物からなるユニット」に、該主鎖とは異なる側鎖を構成する「ポリビニルアセタールからなるユニット」又は「ビニル化合物からなるユニット」が結合した分岐状の共重合体のことをいう。
【0031】
上記グラフト共重合体の分子量としては特に制限は無いが、数平均分子量（Ｍｎ）が１００００〜６０００００で、重量平均分子量（Ｍｗ）が２００００〜１２０００００で、これらの比（Ｍｗ／Ｍｎ）が２．０〜４０であることが好ましい。Ｍｎ、Ｍｗ、Ｍｗ／Ｍｎがこのような範囲であると、上記幹細胞足場材料の強度が好適に保たれる。【0032】
上記グラフト共重合体におけるアセタール化度は、例えば上記グラフト共重合体のキシレンにおける可溶分を重水素化ジメチルスルホキシドに溶解し、１Ｈ-ＮＭＲ測定によりアセタール化度を測定する方法が挙げられる。【0033】
上記ポリビニルアセタール樹脂は、その一部にブレンステッド塩基性基またはブレンステッド酸性基を有することが好ましい。すなわち、ポリビニルアセタール樹脂の一部がブレンステッド塩基性基またはブレンステッド酸性基により変性されていることが好ましく、ポリビニルアセタール樹脂の一部がブレンステッド塩基性基で変性されていることがより好ましい。ポリビニルアセタール樹脂の一部がブレンステッド塩基性基またはブレンステッド酸性基により変性されている場合、フィーダー細胞や接着タンパク質を含まない無血清培地培養において、幹細胞播種後の初期定着率が向上し、幹細胞の培養がし易くなる。なお、本明細書において、ポリビニルアセタール樹脂の一部にブレンステッド塩基性基またはブレンステッド酸性基を有するポリビニルアセタール樹脂を変性ポリビニルアセタール樹脂という。
【0034】
上記ブレンステッド塩基性基は、水素イオンＨ＋を他の物質から受け取ることができる官能基の総称である。ブレンステッド塩基性基としては、例えば、アミン構造を有する置換基、イミン構造を有する置換基、アミド構造を有する置換基、イミド構造を有する置換基等のアミン系塩基性基が挙げられる。従って、このようなポリビニルアセタール樹脂としては、アミン構造を有する構成単位、イミン構造を有する構成単位、アミド構造を有する構成単位、及びイミド構造を有する構成単位からなる群から選択される少なくとも一種を構成単位として含むポリビニルアセタール樹脂が好ましい。上記アミン構造を有する構成単位、イミン構造を有する構成単位、アミド構造を有する構成単位、及びイミド構造を有する構成単位の合計の含有量は、ポリビニルアセタール樹脂中、０．１モル％〜３０モル％であることが好ましく、播種直後の細胞接着性の観点から、１モル％〜１０モル％であることがより好ましい。
【0035】
本発明において、上記イミン構造とは、Ｃ＝Ｎ結合を有する構造をいう。上記ポリビニルアセタール樹脂は、イミン構造を側鎖に有することが好ましい。また、上記イミン構造は、ポリビニルアセタール樹脂の主鎖を構成する炭素に直接結合してもよく、アルキレン基等の連結基を介して結合していてもよい。なお、上記イミン構造を側鎖に有するとは、上記イミン構造をポリビニルアセタール樹脂のグラフト鎖に有することを含む。上記イミン構造を有する構成単位としては、例えば、下記式（１）に示す構成単位が挙げられる。【0036】
【化1】
【0037】
上記式（１）中、Ｒ１がアルキレン基である場合、該アルキレン基の炭素数の好ましい下限は１、好ましい上限は１２である。上記アルキレン基の炭素数が１２を超えると、最適な強度が得られないことがある。上記Ｒ１がアルキレン基である場合、上記アルキレン基の炭素数のより好ましい上限は５である。【0038】
上記式（１）中、Ｒ１がアルキレン基である場合、該アルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、オクタメチレン基、デカメチレン基等の直鎖状アルキレン基、メチルメチレン基、メチルエチレン基、１−メチルペンチレン基、１，４−ジメチルブチレン基等の分岐状アルキレン基、シクロプロピレン基、シクロブチレン基、シクロヘキシレン基等の環状アルキレン基等が挙げられる。なかでも、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基等の直鎖状アルキル基が好ましく、メチレン基、エチレン基がより好ましい。【0039】
上記Ｒ２としては、下記式（２）に示す官能基が挙げられる。【0040】
【化2】
【0041】
上記炭化水素基としては、飽和炭化水素基、不飽和炭化水素基、芳香族系炭化水素基等が挙げられる。なお、上記炭化水素基は、飽和炭化水素基、不飽和炭化水素基、芳香族系炭化水素基のいずれか一種のみからなるものであってもよく、これらが２種以上用いられたものであってもよい。【0042】
上記飽和炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、へキシル基、へプチル基、２−エチルヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、オクタデシル基等が挙げられる。なかでも、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基が好ましい。上記芳香族系炭化水素基としては、例えば、フェニル基、トルイル基、キシリル基、ｔ−ブチルフェニル基、ベンジル基等が挙げられる。
【0043】
上記変性ポリビニルアセタール樹脂において、上記イミン構造を有する構成単位中、Ｒ１が単結合、Ｒ３が水素原子、メチル基又はエチル基、Ｒ４がメチル基、又はエチル基又はプロピル基であることが好ましい。【0044】
上記ポリビニルアセタール樹脂は、イミン構造を有する構成単位の含有量の好ましい下限が０．１モル％、好ましい上限が２０．０モル％である。上記イミン構造を有する構成単位の含有量が０．１モル％以上であると、経時粘度安定性が良好なものとなる。上記イミン構造を有する構成単位の含有量が２０．０モル％以下であると、アセタール化を充分に進行させることができる。上記イミン構造を有する構成単位の含有量のより好ましい下限は１．０モル％、より好ましい上限は１５．０モル％である。なお、上記イミン構造を有する構成単位の含有量は、１Ｈ-ＮＭＲ測定により測定することができる。
【0045】
上記ポリビニルアセタール樹脂において、イミン構造を有する構成単位の含有量と、後述するアセタール化度の比率（イミン構造を有する構成単位の含有量／アセタール化度）は、０．００１〜０．５が好ましい。上記範囲内とすることで、高い強度及び優れた接着性を両立して、接着後の耐久性を向上させることが可能となる。【0046】
上記ポリビニルアセタール樹脂は、イミノ基（＝ＮＨ）構造を有する構成単位を有することが好ましい。上記ポリビニルアセタール樹脂は、上記イミノ基を側鎖に有することが好ましい。また、上記イミノ基は、ポリビニルアセタール樹脂の主鎖を構成する炭素に直接結合してもよく、アルキレン基等の連結基を介して結合していてもよい。
【0047】
上記変性ポリビニルアセタール樹脂は、アミン構造を有する構成単位又はアミド構造を有する構成単位を有することが好ましい。上記変性ポリビニルアセタール樹脂は、上記アミン構造又はアミド構造を側鎖に有することが好ましい。また、上記アミン構造又はアミド構造は、変性ポリビニルアセタール樹脂の主鎖を構成する炭素に直接結合してもよく、アルキレン基等の連結基を介して結合していてもよい。更に、上記アミン構造は第一級アミンでもよく、第二級アミンでもよく、第三級アミンでもよく、第四級アミンでもよい。これらのなかでも、幹細胞の定着性を高める観点から、第一級アミンが好ましい。
なお、上記アミン構造又はアミド構造を側鎖に有するとは、上記アミン構造又はアミド構造を変性ポリビニルアセタール樹脂のグラフト鎖に有することを意味する。
特に、上記アミン構造は、−ＮＨ２であることが好ましい。なお、本発明において、アミド構造とは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−を有する構造をいう。なかでも、上記アミン構造を有する構成単位は、下記式（３）に示す構造であることが好ましい。また、上記アミド構造を有する構成単位は、下記式（４）に示す構造であることが好ましい。
【0048】
【化3】
【0049】
【化4】
【0050】
上記アミン構造又はアミド構造を有する構成単位の含有量の好ましい下限は０．１モル％、好ましい上限は２０モル％である。上記アミン構造又はアミド構造を有する構成単位の含有量が０．１モル％以上であると、付加特性を充分なものとすることができる。上記含有量が２０モル％以下であると、溶解性が上がりすぎることがなく、沈殿法による変性ポリビニルアセタール樹脂粉末の取り出しが容易となる。上記含有量のより好ましい下限は０．５モル％、より好ましい上限は１０モル％である。なお、上記アミン構造又はアミド構造を有する構成単位の含有量は１Ｈ-ＮＭＲ測定により測定可能である。また、上記アミン構造又はアミド構造を有する構成単位と、イミン構造を有する構成単位とを合計した含有量の好ましい下限は０．１モル％、好ましい上限は２０モル％である。上記含有量のより好ましい下限は０．５モル％、より好ましい上限は１０モル％である。【0051】
上記ポリビニルアセタール樹脂において、イミン構造を有する構成単位と、アミン構造又はアミド構造を有する構成単位との含有量の比率（イミン構造を有する構成単位／アミノ基又はアミド構造を有する構成単位）は、０．５／９９．５〜９９．５／０．５であることが好ましい。上記比率が０．５／９９．５以上であると、経時粘度安定性を充分なものとすることができ、上記比率が９９．５／０．５以下であると、幹細胞の定着性向上の観点より架橋性能を充分に発揮することができる。上記比率のより好ましい下限は５／９５、より好ましい上限は９０／１０である。【0052】
上記ブレンステッド酸性基は、水素イオンＨ＋を他の物質に渡すことができる官能基の総称である。ブレンステッド酸性基としては、カルボキシル基、スルホン酸基、マレイン酸基、スルフィン酸基、スルフェン酸基、リン酸基、ホスホン酸基、及び、それらの塩等が挙げられる。ブレンステッド酸性基としては、なかでも、カルボキシル基が好ましい。
上記ポリビニルアセタール樹脂を上記ブレンステッド酸性基により変性する方法としては特に限定されないが、上記ポリビニルアルコールを上記イタコン酸や（メタ）アクリル酸と共重合する方法、上記ポリビニルアルコールの側鎖にブレンステッド酸性基を導入する方法等によって得られる。
【0053】
上記ポリビニルアセタール樹脂のアセタール化度は特に限定されないが、好ましい下限が６０モル％、好ましい上限は９０モル％である。アセタール化度が６０モル％以上であると、幹細胞の定着性に優れ、高効率に細胞増殖を行うことができる。また、アセタール化度が９０モル％以下であると、溶剤への溶解性を良好なものとすることができる。より好ましい下限が６５モル％、より好ましい上限が８５モル％である。上記ポリビニルアセタール樹脂のアセタール度は１Ｈ-ＮＭＲ測定により測定可能である。【0054】
上記ポリビニルアセタール樹脂は、アセチル基量は特に限定されず、好ましい下限が０．０００１モル％、好ましい上限が５モル％である。【0055】
上記ポリビニルアセタール樹脂を作製する方法としては、例えば、上記イミン構造を有する単量体と、酢酸ビニルとを共重合させることによって得られたポリ酢酸ビニルをケン化し得られたポリビニルアルコールを、従来公知の方法によりアセタール化する方法が挙げられる。また、アミノ基又はアミド構造を有する構成単位を有するポリビニルアルコールを、従来公知の方法によりアセタール化することでイミン構造を導入する方法を用いてもよい。アミノ基又はアミド構造を有する構成単位を有するポリビニルアルコールを後変性して得られたイミン構造を有する変性ポリビニルアルコールを、従来公知の方法によりアセタール化する方法を用いてもよい。更に、未変性のポリビニルアセタール樹脂を後変性させることでイミン構造を導入してもよい。すなわち、上記変性ポリビニルアセタール樹脂は、アミノ基又はアミド構造を有する構成単位を有するポリビニルアルコールのアセタール化物であってもよい。これらのなかでは、アミノ基又はアミド構造を有する構成単位を有するポリビニルアルコールをアセタール化してなることでイミン構造を有する変性ポリビニルアセタール樹脂を得る方法が好ましい。特に、このような方法を用いる場合、アセタール化に使用するアルデヒド、酸触媒の量を過剰に添加することでイミン構造を得ることが出来る。【0056】
上記アルデヒドを過剰に添加する方法では、アミノ基又はアミド構造を有する構成単位を有するポリビニルアルコール１００重量部に対して、アルデヒドを７０〜１５０重量部添加することが好ましい。特に、アルデヒドとしては、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ｎ−ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、ｎ−バレルアルデヒド、フェニルアルデヒドが好ましい。【0057】
上記酸触媒を過剰に添加する方法では、酸触媒を全体の０．５重量％以上添加することが好ましい。また、アミノ基又はアミド構造を有する構成単位を有するポリビニルアルコール１００重量部に対して、酸触媒を５．０〜７０．０重量部添加することが好ましい。特に、酸触媒としては、塩酸、硝酸、硫酸、パラトルエンスルホン酸が好ましい。なお、このような方法を用いる場合において、アミノ基、アミド構造を有する構成単位、イミン構造を有する構成単位を確認する方法としては、例えば、１Ｈ-ＮＭＲで確認する方法等が挙げられる。【0058】
上記アセタール化は、公知の方法を用いることができ、水溶媒中、水と水との相溶性のある有機溶媒との混合溶媒中、あるいは有機溶媒中で行うことが好ましい。上記水との相溶性のある有機溶媒としては、例えば、アルコール系有機溶剤を用いることができる。上記有機溶媒としては、例えば、アルコール系有機溶剤、芳香族有機溶剤、脂肪族エステル系溶剤、ケトン系溶剤、低級パラフィン系溶剤、エーテル系溶剤、アミン系溶剤等が挙げられる。上記アルコール系有機溶剤としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等が挙げられる。上記芳香族有機溶剤としては、例えば、キシレン、トルエン、エチルベンゼン、安息香酸メチル等が挙げられる。上記脂肪族エステル系溶剤としては、例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、酪酸メチル、酪酸エチル、アセト酢酸メチル、アセト酢酸エチル等が挙げられる。
上記ケトン系溶剤としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、メチルシクロヘキサノン、ベンゾフェノン、アセトフェノン等が挙げられる。上記低級パラフィン系溶剤としては、ヘキサン、ペンタン、オクタン、シクロヘキサン、デカン等が挙げられる。上記エーテル系溶剤としては、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、プロピレングリコールジエチルエーテル等が挙げられる。上記アミド系溶剤としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルテセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、アセトアニリド等が挙げられる。
上記アミン系溶剤としては、アンモニア、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ｎ−ブチルアミン、ジｎ−ブチルアミン、トリｎ−ブチルアミン、アニリン、Ｎ−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ピリジン等が挙げられる。
これらは、単体で用いることもできるし、２種以上の溶媒を混合で用いることもできる。これらのなかでも、樹脂に対する溶解性及び精製時の簡易性の観点から、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、テトラヒドロフランが特に好ましい。
【0059】
上記アセタール化は、酸触媒の存在下において行うことが好ましい。上記酸触媒は特に限定されず、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸等の鉱酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸等のカルボン酸や、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸等のスルホン酸が挙げられる。これらの酸触媒は、単独で用いられてもよく、２種以上の化合物を併用してもよい。なかでも、塩酸、硝酸、硫酸が好ましく、塩酸が特に好ましい。【0060】
本発明の幹細胞足場材料を使用することで、上記幹細胞種は特に問わないが、幹細胞足場材料として使用することができる。なかでも、多能性幹細胞、特にｉＰＳ細胞の培養に用いられることが好ましい。フィーダー細胞や接着タンパク質を含まない無血清培地培養において、幹細胞播種後の初期定着率が向上し、幹細胞の培養を好適に行うことができる。【0061】
［幹細胞の培養方法］上述の幹細胞培養用足場材料によれば、様々な幹細胞を培養することができるが、その特性を考慮すると、幹細胞のなかでも多能性幹細胞の培養に用いることが好ましい。一般的に、多能性幹細胞は播種後の培養の定着率が低いとされているが、上述の幹細胞培養用足場材料は、培養培地の水分によって膨潤し難く、適度な親水性と強度を維持できるので、多能性幹細胞の播種後の定着率が向上するからである。
【0062】
幹細胞培養用足場材料は、幹細胞の培養において、平面培養（二次元培養方法）に用いることの他に、生体内により近い状態、例えば多孔質膜やハイドロゲルなどの基材上での幹細胞の培養（三次元培養方法）に用いることができる。細胞培養用足場材料をバイオリアクター等に用いることにより、効率良く幹細胞を増殖させることができるからである。細胞培養用足場材料は、適度な親水性と強度を備えることから、二次元培養方法に用いられることが好ましい。
【0063】
平面培養（二次元培養方法）用容器としては、形状や大きさは特に限定されないが、１つまたは複数のウェル（穴）を備える細胞培養用テストプレートや、細胞培養用フラスコ等が挙げられる。上記マイクロプレートのウェルの数は限定されないが、例えば、２、４、６、１２、２４、４８、９６、３８４等が挙げられる。上記ウェルの形状は特に限定されないが、真円、楕円、三角形、正方形、長方形、五角形等が挙げられる。上記ウェル底面の形状は特に限定されないが、平底、丸底、凹凸等が挙げられる。１つまたは複数のウェル（穴）を備える細胞培養用テストプレートや、細胞培養用フラスコの材質は特に限定されないが、高分子樹脂や金属、無機材料が挙げられる。上記高分子樹脂としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリイソプレン、シクロオレフィンポリマー、ポリイミド、ポリアミド、ポリアミドイミド、（メタ）アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン等が挙げられる。金属としては、ステンレス、銅、鉄、ニッケル、アルミ、チタン、金、銀、白金等が挙げられる。無機材料としては、酸化ケイ素（ガラス）、酸化アルミ、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化鉄、窒化ケイ素等が挙げられる。
【0064】
上述の他にも、細胞培養用足場材料は、幹細胞を培地中で自由に浮遊させて成長させる浮遊培養方法に用いることができる。【0065】
［多能性幹細胞の培養方法］多能性幹細胞の培養方法においては、合成樹脂を含有する幹細胞培養用足場材料上に細胞塊を播種することが好ましい。
細胞塊は、コンフルエントになった培養容器に細胞剥離剤を添加し、ピペッティングにより均一に破砕処理することで得ることが出来る。細胞剥離剤としては、特に限定されないが、エチレンジアミン／リン酸緩衝溶液が好ましい。細胞塊の大きさは５０〜２００μｍであることが好ましい。
【0066】
［その他の実施の形態］本発明は、上述の幹細胞培養用足場材料の他にも、その他の実施の形態として、幹細胞培養用足場材料を用いた発明が提供される。
例えば、上述の幹細胞培養用足場材料と、多糖類と、を含有する幹細胞培養用担体（媒体）が提供される。多糖類としては、特に制限なく様々な多糖類を用いることができる。なかでも水溶性多糖類が好ましい。
【0067】
細胞の培養領域の少なくとも一部に樹脂膜を備える幹細胞培養用容器であって、樹脂膜として、上述の幹細胞培養用足場材料が用いられた幹細胞培養用容器が提供される。容器としては、細胞の培養領域の少なくとも一部に樹脂膜を備えるものであれば、特に制限はなく、様々な容器を用いることができる。容器としては、上述の平面培養用容器や、バイオリアクター等を用いることができる。【0068】
その他にも、幹細胞培養用足場材料を備える幹細胞培養用繊維が提供される。この場合、幹細胞培養用足場材料は、繊維上に塗布されていることが好ましい。また幹細胞培養用足場材料は、繊維中に含漬されたり、練り込まれている形態であってもよい。幹細胞培養用繊維は、フラスコなどの平面構造には接着しにくいが、線維（fibril）状構造などの立体構造には接着しやすい幹細胞の三次元培養方法に適している。幹細胞のなかでも、特に脂肪幹細胞の培養に適している。【0069】
上記幹細胞培養用足場材料は架橋されていても良い。架橋されることで水膨潤性を抑制し、好適に強度を上げることができるからである。幹細胞培養用足場材料に更に架橋剤を加えて架橋させてもよい。架橋剤としては特に限定されないが、ポリアルコールやポリカルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、金属石鹸、多糖類等が挙げられる。
ポリアルコールとしては特に限定されないが、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオール、ドデカンジオール、ウンデカンジオール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ポリエチレングリコール、カテコール、ピロガロール、ジボロン酸、メチレンジボロン酸、エチレンジボロン酸、プロピレンジボロン酸、フェニレンジボロン酸、ビフェニルジボロン酸、ビスフェノール誘導体等が挙げられる。
ポリカルボン酸としては特に限定されないが、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、ポリ（メタ）アクリル酸等が挙げられる。
ヒドロキシカルボン酸としては特に限定されないが、グリコール酸、乳酸、タルトロン酸、グリセリン酸、ヒドロキシ酪酸、リンゴ酸、酒石酸、シトマル酸、クエン酸、イソクエン酸、ロイシン酸、メバロン酸、パントイン酸、リシノール酸、リシネライジン酸、セレブロン酸、キナ酸、シキミ酸、ヒドロキシ安息香酸、サリチル酸、クレオソート酸、バニリン酸、シリング酸、ピロカテク酸、レソルシル酸、プロトカテク酸、ゲンチジン酸、オルセリン酸、没食子酸、マンデル酸、ベンジル酸、アトロラクチン酸、メリロト酸、フロレト酸、クマル酸、ウンベル酸、コーヒー酸、フェルラ酸、シナピン酸、ヒドロキシステアリン酸等が挙げられる。
金属石鹸としては特に限定されないが、ステアリン酸、ラウリン酸、リシノール酸、オクチル酸などの脂肪酸と、リチウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、バリウム、亜鉛、アルミニウムなどの金属の塩が挙げられる。
多糖類としては特に限定されないが、ペクチン、グアーガム、キサンタンガム、タマリンドガム、カラギーナン、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、キチン、アガロース、カラギーナン、ヘパリン、ヒアルロン酸、キシログルカン、グルコマンナン酸等が挙げられる。
【実施例】
【0070】
以下に、実施例及び比較例を挙げて本発明を説明するが本発明は以下の実施例に限定解釈されることはない。なお、得られた合成樹脂、変性ポリビニルアセタール樹脂における構成単位、例えば、アミン構造を有する構成単位の含有量（モル％）、イミン構造を有する構成単位の含有量（モル％）、アミド構造を有する構成単位の含有量（モル％）、アセタール化度（モル％）、アセチル基量（モル％）、水酸基量（モル％）、（メタ）アクリル酸エステル基量（モル％）は、合成樹脂をＤＭＳＯ−ｄ６（ジメチルスルホキサイド）に溶解し、１Ｈ-ＮＭＲ（核磁気共鳴スペクトル）を用いて測定した。【0071】
［実施例１］（ポリビニルブチラールの調製）
攪拌装置を備えた反応機に、イオン交換水２７００ｍＬ、平均重合度２５０、鹸化度９９モル％のポリビニルアルコールを３００ｇ投入し、攪拌しながら加熱溶解し、溶液を得た。次に、この溶液に触媒として３５重量％塩酸を、塩酸濃度が０．２重量％となるように添加し、温度を１５℃に調整した後、攪拌しながらｎ-ブチルアルデヒド(ｎ-ＢＡ)２２ｇを添加した。その後、ｎ-ブチルアルデヒド(ｎ-ＢＡ)１４８ｇを添加したところ、白色粒子状のポリビニルブチラールが析出した。析出してから１５分後に、３５重量％塩酸を、塩酸濃度が１．８重量％になるように添加し、５０℃に加熱し、５０℃で２時間熟成させた。次いで、溶液を冷却し、中和した後、ポリビニルブチラールを水洗し、乾燥させることにより、ポリビニルブチラールを得た。
得られたポリビニルブチラールは、平均重合度２５０、水酸基量２８モル％、アセチル基量１モル％、アセタール化度７１モル％であった。
【0072】
（細胞培養用容器の調製）得られたポリビニルブチラール１ｇをブタノール１９ｇに溶解させることで、ポリビニルブチラール溶液を得た。得られたポリビニルブチラール溶液１５０μＬをφ２２ｍｍのカバーガラス（松浪社製、２２丸Ｎｏ．１をエアダスターで除塵して使用）上に吐出し、スピンコーターを用いて２０００ｒｐｍ、２０秒回転させて平滑な樹脂膜を得た。得られた上記樹脂膜をカバーガラスごとφ２２ｍｍのポリスチレンディッシュに配置することにより細胞培養用容器を得た。
【0073】
（表面自由エネルギー）上記樹脂膜の表面自由エネルギーについて接触角計（協和界面化学社製、ＤＭｏー７０１）を用いて測定した。上記樹脂膜上に純水１μＬを着滴させ、３０秒後の液滴像を撮影することで純水の接触角を得た。また、上記樹脂膜上にジヨードメタン１μＬを着滴させ、３０秒後の液滴像を撮影することでジヨードメタンの接触角を得た。得られた上記接触角をＫａｅｌｂｌｅ−Ｕｙ理論を用いて表面自由エネルギーγ、分散成分γｄ、双極子成分γｐを導出した。
【0074】
以下の条件において樹脂膜を備える細胞培養用容器について試験を行った。（細胞培養試験の方法）
得られた細胞培養用容器にリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬを加えて３７℃のインキュベーター内で１時間静置した。ディッシュ内のリン酸緩衝生理食塩水を除いた後、ｈ−ｉＰＳ細胞２５３Ｇ１を１．５×１０４を播種し、培地ＴｅＳＲ Ｅ８（ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ社製）１ｍＬおよび、ＲＯＣＫ−Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ２７６３２）１０μＭ存在下、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で培養を行った。２４時間毎に培地を７５０μＬ除き、新たなＴｅＳＲ Ｅ８ ２５０μＬを加え、ＲＯＣＫ−Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ２７６３２）１０μＭに調整することで培地交換を行った。
【0075】
（細胞塊培養試験の方法）得られた細胞培養用容器にリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬを加えて３７℃のインキュベーター内で１時間静置後、培養容器内のリン酸緩衝生理食塩水を除いた。３５ｍｍディッシュにコンフルエント状態になったｈ−ｉＰＳ細胞２５２Ｇ１のコロニーを加え、次に１ｍＬの０．５ｍＭエチレンジアミン／リン酸緩衝溶液を加え、室温で２分静置した。その後、エチレンジアミン/リン酸緩衝溶液を除き、１ｍＬのＴｅＳＲＥ８培地でピペッティングにより５０〜２００μｍに砕かれた細胞塊を１．０×１０５を培養容器に播種し、培地ＴｅＳＲ Ｅ８（ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ社製）１ｍＬおよび、ＲＯＣＫ−Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ２７６３２）１０μＭ存在下、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で培養を行った。２４時間毎に培地を７５０μＬ除き、新たなＴｅＳＲ Ｅ８を２５０μＬ加えることで培地交換を行った。
【0076】
（培養評価の方法）（１）初期接着性
細胞培養試験において、細胞播種後２４時間後の細胞像を位相差顕微鏡１０×１０倍の位相差顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ７３）を用いて取得した。その際、培養容器内の最も平均的な接着形態を示す視野の画像の取得を行った。得られた画像を図４の見本１〜見本１０と照らし合わせて、接着細胞数と接着細胞形態を加味して初期接着性の評価を行った。なお、図４において、見本１から見本８に向かうほど細胞が増加していることが示されている。また見本８から見本１０に向かうほど、細胞の仮足が伸長し、より良好な接着状態にあることが示されている。得られた結果を図５、６にまとめて示す。
（２）細胞増殖性
細胞培養試験において、細胞播種後５日経過後の細胞像を位相差顕微鏡１０×４倍の位相差顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ７３）を用いて取得した。その際、培養容器内の最も平均的な接着形態を示す視野の画像の取得を行った。得られた画像を図７の見本１〜見本１０と照らし合わせることで細胞増殖性の評価を行った。図７において、細胞増殖によりコロニーが成長するほど高評価とした。なお、コロニーは横方向（画面の縦横方向）に成長し過ぎると縦方向（画面の手前側方向）に積み重なり始めるため、光の透過性が低くなる傾向がある。得られた結果を図８、９にまとめて示す。
（３）接着維持性
細胞塊培養試験において、細胞塊の接着維持可能時間を以下の基準に従って評価した。
０：培地交換後３０分未満で全ての細胞が剥離した。
１：培地交換後３０分以上接着維持したが、１時間未満で全ての細胞が剥離した。
２：培地交換後１時間以上接着維持したが、２４時間未満で全ての細胞が剥離した。
３：培地交換後２４時間以上接着維持した。
得られた細胞塊はアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色試験により未分化性が保たれていることを確認した。
【0077】
［実施例２］平均重合度８５０、鹸化度９９モル％のポリビニルアルコールを使用したこと以外は、実施例１同様にして試験を行った。
【0078】
［実施例３］平均重合度１７００、鹸化度９９モル％のポリビニルアルコールを使用したこと以外は、実施例１同様にして試験を行った。
【0079】
［実施例４］平均重合度２４００、鹸化度９９モル％のポリビニルアルコールを使用したこと、および、ｎ-ブチルアルデヒド(ｎ-ＢＡ)の代わりに、アセトアルデヒドを使用すること以外は、実施例１同様にして試験を行った。
【0080】
［実施例５］平均重合度８５０、鹸化度９８モル％、エチレン変性度４モル％のポリビニルアルコールを使用したこと以外は、実施例１同様にして試験を行った。
【0081】
［実施例６］平均重合度２５０、鹸化度９９モル％、上記式（３）に示すアミノ基を有する構成単位を２モル％含有するポリビニルアルコールを使用したこと以外は、実施例１同様にして試験を行った。
【0082】
［実施例７］平均重合度１６００、鹸化度９９モル％、上記式（３）に示すアミノ基を有する構成単位を２モル％含有するポリビニルアルコールを使用したこと以外は、実施例１同様にして試験を行った。
【0083】
［実施例８］実施例１で得られた重合度約２５０のポリビニルアセタール１００重量部、および、Ｎ−ビニルピロリドン１重量部を５００重量部のテトラヒドロフランに溶解させてグラフト共重合体樹脂溶液を得た。得られた樹脂溶液にＩｒｇａｃｕｒｅ１８４（ＢＡＳＦ社製）０．０５重量部を溶解させ、ＰＥＴフィルム上に塗布した。塗布物を２５℃にてアイグラフィックス社製、ＵＶコンベア装置「ＥＣＳ３０１Ｇ１」を用い、３６５ｎｍの波長の光を積算光量２０００ｍＪ／ｃｍ２で照射することで複合樹脂溶液を得た。得られた複合樹脂溶液を８０℃、３時間真空乾燥させることで複合樹脂を得た。得られた樹脂について、カラムとしてＷａｔｅｒｓ社製「２６９０ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｍｏｄｅｌ」を用いて、ＧＰＣ法によってポリスチレン換算による重量平均分子量を測定したところ、約４万であった。得られた複合樹脂を３重量％ブタノール溶液に調整し、実施例１同様にして試験を行った。
【0084】
［実施例９］ポリビニルアセタール１００重量部に対してＮ−ビニルピロリドン１０重量部を添加したこと以外は、実施例８同様にして試験を行った。得られた樹脂の重量平均分子量は約６万であった。
【0085】
［実施例１０］ポリビニルアセタール１００重量部に対してＮ−ビニルピロリドン３０重量部を添加したこと以外は、実施例８同様にして試験を行った。得られた樹脂の重量平均分子量は約５万であった。
【0086】
［実施例１１］ポリビニルアセタール１００重量部に対してテトラヒドロフルフリルアクリレート５重量部を添加したこと以外は、実施例８同様にして試験を行った。得られた樹脂の重量平均分子量は約６万であった。
【0087】
［実施例１２］ポリビニルアセタール１００重量部に対してメトキシエチルアクリレート５重量部を添加したこと以外は、実施例８同様にして試験を行った。得られた樹脂の重量平均分子量は約７万であった。
【0088】
［実施例１３］ポリビニルアセタール１００重量部に対してブチルメタクリレート５重量部を添加したこと以外は、実施例８同様にして試験を行った。得られた樹脂の重量平均分子量は約６万。
【0089】
［実施例１４］Ｎ−イソプロピルアクリルアミド７５重量部、および、ブチルメタクリレート２５重量部をテトラヒドロフラン３００重量部に溶解させてアクリルモノマー溶液を得た。得られたアクリルモノマー溶液にＩｒｇａｃｕｒｅ１８４（ＢＡＳＦ社製）２重量部を溶解させ、ＰＥＴフィル上に塗布した。塗布物を２５℃にてアイグラフィックス社製、ＵＶコンベア装置「ＥＣＳ３０１Ｇ１」を用い、３６５ｎｍの波長の光を積算光量２０００ｍＪ／ｃｍ２で照射することでアクリル樹脂溶液を得た。得られたアクリル樹脂溶液を８０℃、３時間真空乾燥させることでアクリル樹脂を得た。得られたアクリル樹脂を３重量％ブタノール溶液に調整し、実施例１同様にして試験を行った。得られたアクリル樹脂の重量平均分子量は約１０万であった。
【0090】
［実施例１５］Ｎ−イソプロピルアクリルアミド７５重量部、および、ブチルメタクリレート２５重量部に代えて、メトキシエチルアクリレート９０重量部、および、ブチルメタクリレート１０重量部を使用したこと以外は実施例１４と同様にして、アクリル樹脂を得た。得られたアクリル樹脂を３重量％ブタノール溶液に調整し、実施例１同様にして試験を行った。得られたアクリル樹脂の重量平均分子量は約８万であった。
【0091】
［実施例１６］Ｎ−イソプロピルアクリルアミド７５重量部、および、ブチルメタクリレート２５重量部に代えて、メトキシエチルアクリレート７５重量部、および、ブチルメタクリレート２５重量部を使用したこと以外は実施例１４と同様にして、アクリル樹脂を得た。得られたアクリル樹脂を３重量％ブタノール溶液に調整し、実施例１同様にして試験を行った。得られた樹脂の重量平均分子量は約９万であった。
【0092】
［実施例１７］Ｎ−イソプロピルアクリルアミド７５重量部、および、ブチルメタクリレート２５重量部に代えて、ブチルメタクリレート２重量部、および、エチルアクリレート９８重量部を使用したこと以外は実施例１４と同様にして、アクリル樹脂を得た。得られたアクリル樹脂を３重量％ブタノール溶液に調整し、実施例１同様にして試験を行った。得られたアクリル樹脂の重量平均分子量は約８万であった。
【0093】
［比較例１］足場材料を用いず、ポリスチレンディッシュのみで実施例１同様にて試験を行った。
【0094】
［比較例２］２回目のｎ-ブチルアルデヒド(ｎ-ＢＡ)の添加量を１４８ｇから８９ｇに変更したこと以外は、実施例１同様にして試験を行った。
【0095】
［比較例３］合成樹脂として平均重合度１０００、鹸化度９８モル％のポリビニルアルコールを使用したこと以外は、実施例１同様にして試験を行った。
【0096】
［比較例４］Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１００重量部、酢酸エチル７５重量部、アゾビスイソブチロニトリル０．５重量部を混合し、窒素雰囲気下、６５℃で８時間重合を行うことでポリアクリルアミド樹脂を得た。得られた樹脂について、カラムとしてＷａｔｅｒｓ社製「２６９０ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｍｏｄｅｌ」を用いて、ＧＰＣ法によってポリスチレン換算による重量平均分子量を測定したところ、約９万（重合度約８００）であった。その他の操作は実施例１同様にして試験を行った。
【0097】
［比較例５］Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１００重量部に代えてエチルアクリレート１００重量部を使用したこと以外は比較例４と同様にして試験を行った。
【0098】
［比較例６］Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１００重量部に代えてブチルメタクリレート１００重量部を使用したこと以外は比較例４と同様にして試験を行った。得られた樹脂の重量平均分子量は約９万であった。
【0099】
［比較例７］ポリビニルアセタール３０重量部に対してＮ−ビニルピロリドン７０重量部を添加したこと以外は、実施例８同様にして試験を行った。得られた樹脂の重量平均分子量は約９万であった。
【0100】
得られた結果をまとめて表１、表２に示す。図５、図６に播種後２４時間後の細胞の位相差顕微鏡写真を示す。図８、図９に播種後５日後の細胞の位相差顕微鏡写真を示す。なお、いずれの実施例及び比較例においても分化した細胞は観察されなかった。 【表1】
【表2】