特許 6793836 変異体ＩＤＨ１およびＩＤＨ２阻害剤としての７−フェニルエチルアミノ−４Ｈ−ピリミド［４，５−Ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6793836

(24)【登録日】2020年11月12日

(45)【発行日】2020年12月2日

(54)【発明の名称】変異体ＩＤＨ１およびＩＤＨ２阻害剤としての７−フェニルエチルアミノ−４Ｈ−ピリミド［４，５−Ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン化合物

(51)【国際特許分類】

   C07D 498/04 20060101AFI20201119BHJP

   A61K 31/5365 20060101ALI20201119BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20201119BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20201119BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20201119BHJP

【ＦＩ】

   C07D498/04 112T

   C07D498/04CSP

   A61K31/5365

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61P25/00

【請求項の数】11

【全頁数】59

(21)【出願番号】特願2019-532088(P2019-532088)

(86)(22)【出願日】2017年12月8日

(65)【公表番号】特表2020-502157(P2020-502157A)

(43)【公表日】2020年1月23日

(86)【国際出願番号】US2017065246

(87)【国際公開番号】WO2018111707

(87)【国際公開日】20180621

【審査請求日】2019年6月14日

(31)【優先権主張番号】62/435,283

(32)【優先日】2016年12月16日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100150500

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 靖

(74)【代理人】

【識別番号】100176474

【弁理士】

【氏名又は名称】秋山 信彦

(72)【発明者】

【氏名】レナート・アレハンドロ・バウアー

(72)【発明者】

【氏名】セルジュ・ルイ・ブレ

(72)【発明者】

【氏名】ティモシー・ポール・バークホルダー

(72)【発明者】

【氏名】レイモンド・ギルモア

(72)【発明者】

【氏名】パトリック・ジェイムズ・ハーン

(72)【発明者】

【氏名】ゾラン・ランコビック

【審査官】 安藤 倫世

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１４−５２８９５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１６／１７１７１５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／１４７５８６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１６−５１４１２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１８−５２５３６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１９−５１７５７９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式：

【化1】

［式中、
Ｒ^１は、−ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２、−ＣＨ_２ＣＨ_３、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、または−ＣＨ_２−シクロプロピルであり、
Ｒ^２は、−ＣＨ_３または−ＣＨ_２ＣＨ_３である］
の化合物、またはその薬学的に許容される塩。

【請求項2】

７−［［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｒ）−２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン、
７−［［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｓ）−２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン、
１−エチル−７−［［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｓ）−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）プロピル］フェニル］エチル］アミノ］−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン、もしくは
１−エチル−７−［［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｒ）−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）プロピル］フェニル］エチル］アミノ］−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン
である請求項１に記載の化合物、またはそれらのいずれかの薬学的に許容される塩。

【請求項3】

７−［［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｓ）−２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オンである請求項２に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項5】

治療に使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、医薬組成物。

【請求項6】

神経膠腫、膠芽腫、多形性膠芽腫、星細胞腫、乏突起膠腫、傍神経節腫、線維肉腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、甲状腺癌、結腸直腸癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、黒色腫、前立腺癌、軟骨肉腫、または肝内胆管癌である、変異体ＩＤＨ１または変異体ＩＤＨ２を発現する癌の治療に使用するための、請求項４または５に記載の医薬組成物。

【請求項7】

変異体ＩＤＨ１または変異体ＩＤＨ２を発現する前記癌が、線維肉腫、肝内胆管癌、急性骨髄性白血病、神経膠腫、または膠芽腫である、請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項8】

神経膠腫、膠芽腫、多形性膠芽腫、星細胞腫、乏突起膠腫、傍神経節腫、線維肉腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、甲状腺癌、結腸直腸癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、黒色腫、前立腺癌、軟骨肉腫、または肝内胆管癌である、変異体ＩＤＨ１または変異体ＩＤＨ２を発現する癌の治療に使用するための薬剤の製造のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用。

【請求項9】

変異体ＩＤＨ１または変異体ＩＤＨ２を発現する前記癌が、線維肉腫、肝内胆管癌、急性骨髄性白血病、神経膠腫、または膠芽腫である、請求項８に記載の使用。

【請求項10】

変異体ＩＤＨ１または変異体ＩＤＨ２を発現する前記癌が、肝内胆管癌または急性骨髄性白血病である、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項11】

変異体ＩＤＨ１または変異体ＩＤＨ２を発現する前記癌が、肝内胆管癌または急性骨髄性白血病である、請求項９に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）タンパク質は、クエン酸（トリカルボン酸またはクレブス）回路において重要な酵素である。クエン酸回路は多くの生化学的経路にとって中心的に重要であり、細胞代謝の最も初期に確立された構成要素の１つである。

【0002】

イソクエン酸デヒドロゲナーゼは、イソクエン酸のα−ケトグルタル酸（２−オキソグルタル酸）への酸化的脱炭酸を触媒する。これらの酵素は２つの異なるサブクラスに属し、そのうちの１つは電子受容体としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ（＋））を利用し、もう１つはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ（＋））を利用する。３つの哺乳類のイソクエン酸デヒドロゲナーゼが報告されている：１つはミトコンドリアマトリックスに局在するマルチサブユニット酵素である、ＮＡＤ（＋）−依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、そして２つのＮＡＤＰ（＋）−依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（そのうちの１つはミトコンドリアであり、もう１つは主に細胞基質である）。各ＮＡＤＰ（＋）−依存性アイソザイムは二量体である。ＩＤＨ１遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞質およびペルオキシソームに見られるＮＡＤＰ（＋）−依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼである。細胞質酵素は、細胞質ＮＡＤＰＨ産生において重要な役割を果たす。ＩＤＨ１は、完全なクエン酸回路を欠く広範囲の種および生物において発現される。

【0003】

最近、ＩＤＨ１および関連するアイソフォームＩＤＨ２における突然変異がいくつかの種類の癌で発見されている。突然変異は、タンパク質配列に沿った特定のアミノ酸で起こり、ヘテロ接合的に発現され、機能の獲得と一致することが見出された。これらの突然変異は機能的に保存された残基で起こり、ＩＤＨ１およびＩＤＨ２の変異型の生化学的研究は、正常機能の喪失、イソクエン酸のα−ケトグルタル酸への可逆的変換を示した。これらの突然変異の結果は、α−ケトグルタル酸（αＫＧ）から２−ヒドロキシグルタル酸（２ＨＧ）への新規（または新形態）変換を可能にすることである。結果として、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２の変異型を保有する癌細胞は、実質的に高濃度の２ＨＧを形成する。高レベルの２ＨＧは、変異体ＩＤＨ１またはＩＤＨ２阻害によって反転され得る細胞分化の遮断をもたらす。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

ＰＣＴ出願第ＵＳ２０１６／０４３２６４号は、変異体ＩＤＨ１の共有結合阻害剤を開示している。様々な癌の治療のために、変異体ＩＤＨ１およびＩＤＨ２酵素を選択的に阻害する化合物がさらに必要とされている。様々な癌の治療のために、野生型ＩＤＨ１およびＩＤＨ２よりも新形態活性を示す変異体ＩＤＨ１およびＩＤＨ２酵素を選択的に阻害する化合物がさらに必要とされている。本発明は、変異体ＩＤＨ１およびＩＤＨ２の阻害剤である式ＩまたはＩａの化合物を提供する。式ＩまたはＩａの化合物は、変異体ＩＤＨ１およびＩＤＨ２を選択的に阻害する共有結合阻害剤である。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明の一態様は、式：

【化1】

（式中、
Ｒ^１は、−ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２、−ＣＨ_２ＣＨ_３、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、または−ＣＨ_２−シクロプロピルであり、
Ｒ^２は、−ＣＨ_３または−ＣＨ_２ＣＨ_３であり、
Ｘは、ＮまたはＣＨである）の変異体ＩＤＨ１およびＩＤＨ２酵素阻害剤化合物、または
その薬学的に許容される塩を提供することである。

【0006】

本発明のさらなる態様は、式：

【化2】

（式中、
Ｒ^１は、−ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２、−ＣＨ_２ＣＨ_３、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、または−ＣＨ_２−シクロプロピルであり、
Ｒ^２は、−ＣＨ_３または−ＣＨ_２ＣＨ_３である）の変異体ＩＤＨ１およびＩＤＨ２酵素阻害剤化合物、または
その薬学的に許容される塩を提供することである。

【0007】

本発明のさらなる態様は、
７−［［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｒ）−２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン、
７−［［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｓ）−２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン、
１−エチル−７−［［（１Ｓ）−１−［４−［１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）プロピル］フェニル］エチル］アミノ］−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン（異性体１）、
１−エチル−７−［［（１Ｓ）−１−［４−［１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）プロピル］フェニル］エチル］アミノ］−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン（異性体２）である式ＩもしくはＩａの化合物、
またはそれらのいずれかの薬学的に許容される塩を提供する。

【0008】

本発明の別の態様は、７−［［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｓ）−２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オンである式ＩもしくはＩａの化合物、またはその薬学的に許容される塩である。

【0009】

本発明の別の態様は、式ＩもしくはＩａの変異体ＩＤＨ１阻害剤化合物、またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0010】

本発明のさらなる態様は、治療を必要とする患者に、治療有効量の式ＩもしくはＩａの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、患者において、神経膠腫、膠芽腫、多形性膠芽腫、星細胞腫、乏突起膠腫、傍神経節腫、線維肉腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、甲状腺癌、結腸直腸癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、黒色腫、前立腺癌、軟骨肉腫、または肝内胆管癌である、変異体ＩＤＨ１または変異体ＩＤＨ２を発現する癌を治療する方法を提供する。

【0011】

本発明の別の態様は、治療を必要とする患者に、治療有効量の式ＩもしくはＩａの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、患者において、線維肉腫、急性骨髄性白血病、神経膠腫、または膠芽腫である、変異体ＩＤＨ１または変異体ＩＤＨ２を発現する癌を治療する方法を提供する。

【0012】

本発明のさらなる態様は、治療に使用するための、式ＩもしくはＩａの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0013】

本発明の別の態様は、神経膠腫、膠芽腫、多形性膠芽腫、星細胞腫、乏突起膠腫、傍神経節腫、線維肉腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、甲状腺癌、結腸直腸癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、黒色腫、前立腺癌、軟骨肉腫、または肝内胆管癌である、変異体ＩＤＨ１または変異体ＩＤＨ２を発現する癌の治療に使用するための、式ＩもしくはＩａの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0014】

本発明のさらなる態様は、線維肉腫、急性骨髄性白血病、神経膠腫、または膠芽腫である、変異体ＩＤＨ１または変異体ＩＤＨ２を発現する癌の治療に使用するための、式ＩもしくはＩａの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0015】

本発明の別の態様は、神経膠腫、膠芽腫、多形性膠芽腫、星細胞腫、乏突起膠腫、傍神経節腫、線維肉腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、甲状腺癌、結腸直腸癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、黒色腫、前立腺癌、軟骨肉腫、または肝内胆管癌である、変異体ＩＤＨ１または変異体ＩＤＨ２を発現する癌の治療のための薬剤の製造のための、式ＩもしくはＩａの化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。

【0016】

本発明のさらなる態様は、線維肉腫、急性骨髄性白血病、神経膠腫、または膠芽腫である、変異体ＩＤＨ１または変異体ＩＤＨ２を発現する癌の治療のための薬剤の製造のための、式ＩもしくはＩａの化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0017】

「患者」という用語は哺乳動物を意味し、「哺乳動物」はヒトを含むがこれに限定されない。

【0018】

「治療有効量」とは、癌患者において変異体ＩＤＨ１または変異体ＩＤＨ２を阻害するのに必要な、式ＩまたはＩａの化合物、またはその薬学的に許容される塩、またはその化合物を含有する医薬組成物、またはその薬学的に許容される塩の投与量を意味し、その結果、腫瘍細胞成長が阻害され、患者における癌の進行が排除または遅延または停止されて、分化の阻止を解放する。式ＩもしくはＩａの化合物またはその薬学的に許容される塩の予想される投与量は、１ｍｇ／患者／日〜２０００ｍｇ／患者／日の範囲内である。好ましい投与量は、５ｍｇ／患者／日〜１８００ｍｇ／患者／日の範囲であると予想される。最も好ましい投与量は、４０ｍｇ／患者／日〜１６００ｍｇ／患者／日の範囲であると予想される。患者を治療するために必要とされる正確な投与量および治療時間の長さは、疾患の段階および重症度、ならびに個々の患者の特定の必要性および応答を考慮して医師によって決定されるであろう。１日単位当たりの投与量として表現されるが、投薬投与は、患者により最適な治療上の利益を提供し、あらゆる薬物関連毒性を管理または緩和するように調整され得る。毎日の投薬に加えて、１日２回（Ｂ．Ｉ．Ｄ．）の投薬、１日３回（Ｔ．Ｉ．Ｄ．）の投薬、隔日投薬（Ｑ２Ｄ）、５日間にわたって隔日、続いて２日間投薬なし（Ｔ．Ｉ．Ｗ．）、または３日毎（Ｑ３Ｄ）が適切であり得る。

【0019】

「治療」、「治療する」、および「治療すること」という用語は、患者が罹患している癌に対する全範囲の介入、例えば、たとえ癌が実際に排除されなくても、症状のうちの１つ以上を軽減する、緩徐する、または反転させるため、および癌の進行を遅延させるための活性化合物の投与を含むことを意味する。

【0020】

−ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２という用語は、２−メチルプロピルを意味し、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３という用語は、２−メトキシエチルを意味し、−ＣＨ_２−シクロプロピルという用語は、シクロプロピルメチルを意味する。

【0021】

式ＩもしくはＩａの化合物、またはその薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される担体を使用して医薬組成物として製剤化され、様々な経路で投与されるのが好ましい。好ましくは、そのような組成物は経口投与用である。そのような医薬組成物およびそれらを調製するためのプロセスは、当該技術分野において周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ，Ｌ．Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｅｄｉｔｏｒ，２２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０１２を参照されたい。

【0022】

特定の実施態様において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体、および場合によっては、特に一般的に癌または特定の癌の種類の治療のための他の治療成分と一緒に、７−｛［（１Ｓ）−１−｛４−［（１Ｓ）−１−（４−アクリロイルピペラジン−１−イル）−２−シクロプロピルエチル］フェニル｝エチル］アミノ｝−１−エチル−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オンまたはその薬学的に許容される塩を含む。

【0023】

式ＩもしくはＩａの化合物、または薬学的に許容される塩は、１つ以上の他の治療薬と同時に、またはその前に、またはその後のいずれかに投与され得る。式ＩもしくはＩａの化合物、または薬学的に許容される塩は、１つ以上の他の治療薬と共に投与される場合、別個に、同じもしくは異なる投与経路によって、または他の治療薬（複数可）と同じ医薬組成物中で一緒に投与され得る。１つ以上の追加の治療薬が投与される場合、各治療薬の投与は同時、別個で、または連続的であり得る。

【0024】

式ＩまたはＩａの化合物は、いくつかの無機酸および有機酸と反応して薬学的に許容される酸付加塩を形成することができる。そのような薬学的に許容される塩およびそれらを調製するための一般的な方法論は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌ，ｅｔ ａｌ．，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＳＥ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．６６，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ １９７７を参照されたい。

【0025】

式ＩもしくはＩａの化合物、またはその薬学的に許容される塩は、当該技術分野において既知の様々な手順、ならびに以下に記載される手順によって調製することができる。特定の合成工程を異なる順序で組み合わせて、式ＩもしくはＩａの化合物、またはその薬学的に許容される塩を調製することができる。

【0026】

さらに、以下の調製法に記載される特定の中間体は、１つ以上の窒素保護基を含み得る。保護基は、当業者によって理解されるように、特定の反応条件および実施される特定の変換に依存して変動し得ることを理解されたい。保護および脱保護の条件は、当業者に周知であり、文献に記載されている（例えば、“Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．２０１４を参照されたい）。

【0027】

式ＩまたはＩａの化合物は、ＩＵＰＡＣに従って命名され、またＣＡＳに従って命名されてもよく、他の名称は式ＩもしくはＩａの化合物またはその薬学的に許容される塩を明確に特定するために使用され得る。

【0028】

式ＩまたはＩａの化合物は単一の立体異性体として表すことができることが理解されよう。４つのジアステレオマーを生じさせる２つのキラル中心がある。本明細書で使用されるとき、単一の立体異性体への言及は、式ＩまたはＩａの命名または図示された化合物を含む立体異性体混合物も含むことを意味する。本明細書において、（Ｒ）−および（Ｓ）−のＣａｈｎ−Ｉｎｇｏｌｄ−Ｐｒｅｌｏｇ指定は、特定の立体異性体を指すために使用され得る。特定の立体異性体は、鏡像異性的に純粋なまたは濃縮された出発材料を使用した立体特異的合成によって調製することができる。出発材料、中間体、または式ＩもしくはＩａの化合物を含むラセミ混合物のいずれかの特定の立体異性体は、ジアステレオマー塩など、キラル固定相でのクロマトグラフィー、酵素分割、またはその目的のために形成されたジアステレオマーの分別結晶もしくはクロマトグラフィーを含む、Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｅ．Ｉ．Ｅｌｉｅｌ ａｎｄ Ｓ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ（Ｗｉｌｅｙ １９９４）およびＥｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｊ．，Ｊａｃｑｕｅｓ，Ａ．Ｃｏｌｌｅｔ，ａｎｄ Ｓ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ（Ｗｉｌｅｙ １９９１）に見出されるものなど、当該技術分野で周知の技術によって分割することができる。示される全ての立体中心を有する構成を有する式ＩまたはＩａの化合物に関して、「実質的に鏡像異性的に純粋な」とは、異性体純度が９０％超の鏡像異性体過剰であることを意味する。別の実施形態において、式ＩまたはＩａの化合物の異性体純度は、９５％超の鏡像体過剰である。さらに別の実施形態において、式ＩまたはＩａの化合物の異性体純度は、９８％超の鏡像体過剰である。さらに別の実施形態において、式ＩまたはＩａの化合物の異性体純度は、９９％超の鏡像体過剰である。個々にそして式ＩまたはＩａの化合物のジアステレオマー混合物を含む全ての立体異性体は、本発明の範囲内にあると企図される。呼称「異性体１」および「異性体２」ならびに「ジアステレオマー１」および「ジアステレオマー２」は、それぞれキラルクロマトグラフィーから最初に溶出する化合物および２番目に溶出する化合物を指し、キラルクロマトグラフィーが合成において初期に開始される場合、同じ呼称が次の中間体および実施例に適用される。

【0029】

式ＩまたはＩａの化合物の合成において初期出発材料として用いられる化合物は周知であり、市販されていない範囲で、提供される特定の参考文献を使用して、当業者によって一般的に用いられる標準的手順により容易に合成されるか、または一般的な参考書に見出される。

【0030】

既知の手順および方法の例には、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ，１９８９；Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−１０，１９７４−２００２、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂ．Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｅｒｒｙ Ｍａｒｃｈ、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００１；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐａｒｔ Ｂ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒａｎｃｉｓ Ａ．Ｃａｒｅｙ ａｎｄ ＲｉｃｈａｒｄＪ．Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０００など、およびそれらに引用されている参考文献などの一般的な参考書に記載されているものが含まれる。

【0031】

ある特定の略語は以下のように定義される。「ＡＣＮ」はアセトニトリルを意味する。「αＫＧ」は、アルファ−ケトグルタル酸または２−ケトグルタル酸を意味する。「ａｌｌｏｃ」はアリルオキシカルボニルを意味する。「ＡＴＣＣ」は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを意味する。「ＢＣＡ」はビシンコニン酸を意味する。「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを意味する。「ＣＤＩ」は１，１’−カルボニルジイミダゾールを意味する。「ＤＣＣ」は１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドを意味する。「ＤＣＭ」はジクロロメタンを意味する。「ＤＥＡＤ」はジエチルアゾジカルボキシレートを意味する。「ＤＩＡＤ」はジイソプロピルアゾジカルボキシレートを意味する。「ＤＩＣ」はジイソプロピルカルボジイミドを意味する。「ＤＩＰＥＡ」は、ジイソプロピルエチルアミンまたはＮ−エチル−Ｎ−イソプロピル−プロパン−２−アミンを意味する。「ＤＭＡＰ」はジメチルアミノピリジンを意味する。「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを意味する。「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを意味する。「ＤＴＴ」はジチオトレイトールを意味する。「ＥＤＣ」は、ＥＤＡＣ、ＥＤＣＩ、または１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を意味する。「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を意味する。「ＥＧＴＡ」はエチレングリコール四酢酸を意味する。「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを意味する。「ＥｔＯＨ」はエタノールまたはエチルアルコールを意味する。「Ｅｘ」は実施例を意味する。「ＨＡＴＵ」は、（ジメチルアミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル（３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルオキシ）メタンイミニウムヘキサフルオロホスフェートを意味する。「ＨＢＴＵ」は、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートを意味する。「２ＨＧ」は、２−ヒドロキシグルタル酸を意味する。「ｄ_５−３ＨＧ」は、３−ヒドロキシ−１，５−ペンタン二酸−２，２，３，４，４−ｄ_５酸を意味する。「ＨＩＬＩＣ」は親水性相互作用液体クロマトグラフィーを意味する。「ＨＯＡｔ」は、１−ヒドロキシ−７−アゾベンゾトリアゾールを意味する。「ＨＯＢｔ」は、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物を意味する。「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味する。「ＩＣ_５０」は、その剤について可能な最大阻害応答の５０％を生じる剤の濃度を意味する。「ｍＣＰＢＡ」はメタ−クロロ過安息香酸を意味する。「ＭｅＯＨ」はメタノールまたはメチルアルコールを意味する。「ＮＡＤＰ^＋およびＮＡＤＰＨ」はそれぞれ、酸化型および還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを意味する。「ＮＭＰ」は、Ｎ−メチル−２−ピロリドンを意味する。「ＰＧ」は保護基を意味する。「Ｐｒｅｐ」とは調製を意味する。「ＰｙＢＯＰ」はベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを意味する。「ＰｙＢｒｏｐ」は、ブロモ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを意味する。「ｒｐｍ」は毎分回転数を意味する。「（Ｒ）−ＲＵＣＹ（登録商標）−ＸｙｌＢＩＮＡＰ」は、ＲｕＣｌ［（Ｒ）−ｄａｉｐｅｎａ］［（Ｒ）−ｘｙｌｂｉｎａｐ］を意味する。「Ｓ_ＮＡｒ」は求核芳香族置換を意味する。「ＴＥＡ」はトリエチルアミンを意味する。「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸を意味する。「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを意味する。「トリス」はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを意味する。

【0032】

式ＩもしくはＩａの化合物、またはその薬学的に許容される塩は、当該技術分野において既知の様々な手順によって調製することができ、それらのうちのいくつかを、以下のスキーム、調製物、および実施例において図示する。記載される経路の各々についての特定の合成工程は、式ＩまたはＩａの化合物またはその薬学的に許容される塩を調製するために、異なる方法で、または他のスキームからの工程と併せて、組み合わせてもよい。以下のスキームにおける各々の工程の生成物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、濾過、磨砕、および結晶化を含む、当該技術分野で周知の従来の方法によって回収することできる。以下のスキームにおいて、全ての置換基は、別途指示のない限り、以前に定義された通りである。試薬および出発物質は、当業者にとって容易に入手可能である。

【化3】

【0033】

スキーム１において、一連の反応は１−置換−７−（メチルスルホニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン（４）（工程Ｃの生成物）をもたらし、式中、Ｒ^２は、前に定義した通りである。「ＰＧ」は、カルバメート、アミド、またはエステル用などのアミノ基または酸素基用に開発された保護基である。例えば、５−ヒドロキシメチル４−アミノ−２−メチルスルファニル−ピリミジンを、標準的なカルバモイル化条件下で、トリホスゲンおよびＤＩＰＥＡまたはＴＥＡなどの有機塩基を使用して約−３０〜−３５℃の温度でオキサジン−２−オンに環化して、化合物（２）（工程Ａの生成物）を得ることができる。あるいは、カルバモイル化を完了させるために、トリホスゲンの代わりに、ＣＤＩ、ホスゲン、またはジホスゲンなどのジハライドカルボニルまたは二−擬ハライドカルボニルを使用することができる。オキサジンのアミンを、約５０〜６５℃の温度でＮＭＰなどの溶媒およびＫ_２ＣＯ_３などの無機塩基中で、ヨード試薬などの適切な置換ハロゲン化アルキルでアルキル化して、化合物（３）（工程Ｂの生成物）を得ることができる。あるいは、光延反応を実施して、ＭｅＯＨなどの適切なアルコールを使用してオキサジンのアミンをアルキル化することができる。光延反応は当該技術分野で周知であり、ＴＨＦなどの溶媒中でトリフェニルホスフィンおよびＤＩＡＤまたはＤＥＡＤなどのアゾジカルボキシレートを使用して、ヒドロキシル基をカルバメートなどの多種多様な求核剤によって置換される脱離基に変換して、化合物（３）を得ることができる。ＡＣＮまたはＤＣＭなどの溶媒中で、約１０〜２５℃の温度で、ｍＣＰＢＡまたはペルオキシ一硫酸カリウムなどの当該技術分野で周知の条件下でスルフィドをスルホンに酸化して、化合物（４）（工程Ｃの生成物）を得ることができる。

【化4】

【0034】

スキーム２において、（４−（１−アミノエチル）フェニル）メタノール（７）は、当業者に周知の手順を使用して臭化物（５）などのハロゲン化アリールから数工程にわたって生成することができる。アミンはサブ工程１、工程Ｄで保護することができ、ここで「ＰＧ」は、アミドなどのアミノ基のために開発された保護基である。保護された臭化アリール（５）をリチウムカルボニル化条件下でケトンに変換して、サブ工程２、工程Ｄにおいてアリールケトン（６）を得ることができる。次いで、サブ工程１、工程Ｅにおいて、ＭｅＯＨなどの溶媒中、水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤を使用してケトンを還元することができる。アミンをこの工程（サブ工程２、工程Ｅ）または合成の後の時点で脱保護して、化合物（７）を得ることができる。あるいは、化合物（６）を、ＴＨＦなどの溶媒中で、チタン（ＩＶ）イソプロポキシドを使用し、約６０℃に加熱し、続いて冷却し、ＭｅＯＨおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤を添加して、還元アミノ化において化合物（１２）に直接変換して、化合物（１２）を得ることができる。化合物（７）を、ＤＣＭなどの溶媒中、塩化チオニルまたはＰＯＣｌ_３などのハロゲン化剤を使用する標準的なハロゲン化条件下で塩化物などのハロゲン化ベンジルに変換して、化合物（１０）を得ることができる（工程Ｉ）。必要であれば、化合物（１０）を保護し、工程Ｊでアルキル化することができる。例えば、アミン（１０）は、トリフルオロアセチルまたはＣＢＺなどの保護基を使用して、工程Ｊのサブ工程１で保護することができる。そのような保護基は、当該技術分野において周知であり、認識されている。あるいは、化合物１０はアルデヒド、化合物（８）から調製することができる。化合物（８）は、ＤＣＭなどの溶媒中で、デス−マーチンペルヨージナンなどの条件下で対応するベンジルアルコールを酸化することによって調製して、アルデヒド（８）を得ることができる。アルデヒドで工程Ｇでグリニャール反応を達成して、化合物（７）を得ることができる。工程Ｇからの化合物（７）を工程Ｈで塩素化して、工程Ｉについて上述したように化合物（１０）を得ることができる。化合物（１０）の塩化物は、二工程、ワンポット手順においてモノ−保護されたピペラジンで置換することができる。１−フェニルエチルアミンを保護することは必ずしも必要ではないが、保護が選択される場合には、それを選択的に脱保護するために、１−フェニルエチルアミンにピペラジンアミン生成物（１１）とは異なる保護基（工程Ｊ、サブ工程１）または所望の工程で他のＰＧを使用することが有利である。例えば、１−フェニルエチルアミンを、約０〜５℃の温度でＤＣＭなどの溶媒中で、ＴＥＡなどの有機塩基を使用して無水トリフルオロ酢酸と反応させて、サブ工程１、工程Ｊの保護されたアミン生成物を得ることができる。当業者は、他の保護基、例えばＣＢＺがアミンに利用され得ることを理解するであろう。次いで、塩化物の置換は当業者に周知の条件下で達成することができる。例えば、ハロゲン化物は、Ｋ_２ＣＯ_３などの無機塩基を使用し、反応を促進するための求核触媒としてＫＩまたはＮａＩを利用して、保護されたまたは保護されていないピペラジンによって置換することができる。混合物をＡＣＮなどの溶媒中で約６０〜８０℃に加熱して、サブ工程２、工程Ｊの保護された化合物（１１）を得ることができる。１−フェニルエチルアミン上の保護基を、水性の水酸化カリウムなどの塩基で除去して、サブ工程３の化合物（１１）を得ることができる。

【化5】

【0035】

スキーム３において、化合物（１１）を、反応を促進するためのＤＩＰＥＡ、ＣｓＦなどの有機塩基、ＤＭＳＯなどの溶媒、および約７０〜８０℃の温度を使用して、Ｓ_ＮＡｒ反応において、化合物（４）と反応させて（スキーム１）、工程Ｌの生成物を得ることができる。工程Ｍ、サブ工程１において、ｔｅｒｔ−ブトキシ保護されたピペラジンは、ジオキサン中のＨＣｌおよびＤＣＭ中のＭｅＯＨまたはＴＦＡなどの酸を使用して脱保護することができる一方で、ａｌｌｏｃ保護されたピペラジンは、ジメドンなどのソフト求核剤を使用して、ＴＨＦなどの溶媒中で触媒テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）などのパラジウム源の存在下で脱保護されて、サブ工程１、工程Ｍの脱保護されたピペラジンを得ることができる。サブ工程２、工程Ｍにおいて、アミンがＤＣＭなどの溶媒中の酸性塩である場合、ピペラジンを、ＴＥＡなどの有機塩基を用いてまたは用いずに、約−５０〜−７８℃の温度で塩化アクリロイルでアミド化して、式Ｉａの化合物を得ることができる。あるいは、アミドカップリングは、ＤＭＦなどの溶媒中で、ＥＤＣなどのカップリング試薬およびＨＯＢｔなどの添加剤を用いて、アクリル酸および適切なアミンで達成することができる。当業者は、カルボン酸とアミンとの反応から生じるアミド形成のためのいくつかの方法および試薬があることを認識するであろう。例えば、ＤＩＰＥＡまたはＴＥＡなどの有機塩基を用いてまたは用いずに、カップリング試薬の存在下で適切なアミンとアクリル酸とを反応させると、式Ｉａの化合物を得ることができる。他のカップリング試薬としては、ＤＣＣ、ＤＩＣなどのカルボジイミド、またはＣＤＩなどのカルボニルジイミダゾールが挙げられる。ＨＯＡｔなどの他のアミドカップリング添加剤も反応を強化するために使用することができる。加えて、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＰｙＢＯＰ、およびＰｙＢｒＯＰなどの非求核性アニオンのウロニウムまたはホスホニウム塩を、より伝統的なカップリング試薬の代わりに使用することができる。ＤＭＡＰなどの添加剤を使用して所望のアミド化反応を促進することができる。

【化6】

【0036】

あるいは、スキーム４において、スキーム２の化合物（７）の脱保護された生成物のアミンを、Ｓ_ＮＡｒアルキル化においてスキーム３、工程Ｌに記載されるように化合物（４）と反応させて、化合物１３を得ることができる。ヒドロキシルは、工程Ｉ、スキーム２に記載のように塩素化して、化合物１４を得ることができる（工程Ｏ）。化合物（１４）の塩素を、アルキル化においてスキーム２、工程１１、サブ工程２に記載のようにピペラジンで置換して、化合物（５）を得ることができる。保護されたピペラジンを脱保護し、次いでピペラジンをスキーム３、工程Ｍに記載されるようにアミド化して、式Ｉａの化合物を得ることができる。

【化7】

【0037】

スキーム５において、キラル（４−（１−アミノエチル）フェニル）メタノール（７ａ）は、当業者に周知の手順を使用して臭化物（５ａ）などのキラルハロゲン化アリールから数工程にわたって生成することができる。アミンはサブ工程１、工程Ｄで保護することができ、ここで「ＰＧ」は、アミドなどのアミノ基のために開発された保護基である。臭化アリール（５ａ）を、リチウムカルボニル化条件下でケトンに変換して、サブ工程２、工程Ｄにおいてアリールケトン（６ａ）を得ることができる。次いで、サブ工程１、工程Ｅにおいて、ＥｔＯＨなどの溶媒中で（Ｒ）−ＲＵＣＹ−ＸｙｌＢＩＮＡＰなどのキラル還元剤を使用して、ケトンを不斉還元して化合物７ａを得ることができる。化合物（７ａ）を、ｔ−ブチルエーテルなどの溶媒中で塩化ベンゾイルなどのハロゲン化剤を使用して、標準的なハロゲン化条件下で塩化物などのキラルハロゲン化ベンジルに変換して、化合物（１０ａ）を得ることができる（工程Ｉ）。サブ工程１、工程Ｊにおいて、アセトニトリルなどの溶媒中で、重炭酸ナトリウムなどの塩基の存在下で、化合物（１０ａ）を保護されたピペラジン（ＰＧ−ピペラジン）と最初に反応させて、保護された形態を得る。次いで、保護された形態を、ＥｔＯＨなどの溶媒中で、水性の水酸化カリウムなどの塩基で脱保護して、化合物（１１ａ）を得る（サブ工程２、工程Ｊ）。

【化8】

【0038】

スキーム６において、一連の反応は１−置換−７−クロロ−４Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン（１８）（工程Ｃの生成物）をもたらし、式中、Ｒ^２は、前に定義した通りである。例えば、アセトニトリルなどの溶媒中で、エチル４，６−ジクロロピリジン−３−カルボキシレート（１５）を標準的な条件下でアミンと反応させて、６−クロロ−４−（アミノ）ピリジン−３−カルボキシレート（１６）を得ることができる。ＴＨＦなどの溶媒中で水素化アルミニウムリチウムなどの水素化試薬を使用して、化合物（１６）のエステル基を還元して、（４−アミノ−６−クロロ−３−ピリジル）メタノール（１７）を得る。１７などの化合物は、約−２０℃の温度でトリホスゲンおよびＤＩＰＥＡまたはＴＥＡなどの有機塩基を使用して標準的なカルバモイル化条件下でオキサジン−２−オンに環化して、化合物（１８）（工程Ｃの生成物）を得ることができる。あるいは、カルバモイル化を完了させるために、トリホスゲンの代わりに、ＣＤＩ、ホスゲン、またはジホスゲンなどのジハライドカルボニルまたは二−擬ハライドカルボニルを使用することができる。スキーム２または５において上記に示したように、またはいずれかのスキームの代わりに記載されるように調製された化合物１１は、標準的なアルキル化条件下で化合物１８と反応させることができる。次いで、スキーム３または４において上述のように、得られた中間体化合物を脱保護し、アミド化して、ＸがＣＨである式Ｉの化合物を得る。

【0039】

任意の工程において、式ＩまたはＩａの化合物の薬学的に許容される塩は、標準的な条件下で、適切な溶媒中で式ＩまたはＩａの適切な遊離塩基と適切な薬学的に許容される酸との反応によって形成され得る。さらに、そのような塩の形成は、窒素保護基の脱保護時に同時に起こり得る。そのような塩の形成は、当該技術分野で周知であり、また理解されている。例えば、Ｇｏｕｌｄ，Ｐ．Ｌ．，“Ｓａｌｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｂａｓｉｃ ｄｒｕｇｓ，”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３３：２０１−２１７（１９８６）、Ｂａｓｔｉｎ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．“Ｓａｌｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｎｅｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｔｉｔｉｅｓ，”Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４：４２７−４３５（２０００）、およびＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１−１９，（１９７７）を参照されたい。当業者は、式ＩまたはＩａの化合物が容易に変換され、薬学的に許容される塩として単離され得ることを理解するであろう。

【実施例】

【0040】

調製物１
７−メチルスルファニル−１，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン

【化9】

トリホスゲン（８５９ｇ、２．９ｍｏｌ）をＴＨＦ（２２．５Ｌ）中の（４−アミノ−２−メチルスルファニル−ピリミジン−５−イル）メタノール（９００ｇ、５．２６ｍｏｌ）の溶液に−３０℃で１５分かけて添加する。反応温度を−３５〜−３０℃に維持しながら、ＤＩＰＥＡ（２．４４９ｇ、１８．９２ｍｏｌ）を１時間かけて添加する。次いで反応混合物を氷水（３０Ｌ）上に注ぎ、２−メチルテトラヒドロフラン（１０Ｌ）を添加する。有機相を水および食塩水で洗浄する。有機相をＮａ _２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮乾固させる。粗製の生成物を石油エーテル／ＥｔＯＡｃ（１：１）でスラリー化し、濾過し、濃縮して黄色固体を得、これをさらに精製することなく続ける（８９０．５ｇ、１．６２ｍｏｌ、純度８３％、収率８６％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１９８（Ｍ＋Ｈ）。

【0041】

調製物２
１−エチル−７−（メチルチオ）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン

【化10】

ＮＭＰ（２．２４Ｌ）中の７−メチルスルファニル−１，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン（２８０ｇ、１．４２ｍｏｌ）の溶液に、Ｋ_２ＣＯ_３（２９４．２ｇ、２．１３ｍｏｌ）およびヨウ化エチル（３３６．３ｇ、１．９９ｍｏｌ）を室温で添加する。混合物を５０℃で１６時間撹拌し、次いでＤＣＭ（３Ｌ）および水（６Ｌ）で希釈する。有機相を分離し、水および食塩水で洗浄し、濃縮乾固させて、粗製の表題化合物を得る（２８６ｇ、１．２７ｍｏｌ、純度８３％、収率９１％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２２６（Ｍ＋Ｈ）。

【0042】

調製物３
１−メチル−７−メチルスルファニル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン

【化11】

ＴＨＦ（２５ｍＬ）中のトリフェニルホスフィン（１．６１ｇ、６．０８ｍｍｏｌ）および７−メチルスルファニル−１，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン（１．００ｇ、５．０７ｍｍｏｌ）の溶液に、周囲温度でＭｅＯＨ（０．２４８ｍＬ、６．０８ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＤＩＡＤ（１．２１ｍＬ、６．０８ｍｍｏｌ）を滴加する。一晩撹拌した後、溶媒を真空下で除去し、得られた黄色油状物をシリカゲルクロマトグラフィー（４０〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、表題化合物を白色固体として得る（１．０８ｇ、５．１１ｍｍｏｌ、定量的）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２１２（Ｍ＋Ｈ）。

【0043】

調製物４
１−エチル−７−（メチルスルホニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン

【化12】

ＡＣＮ（２．８Ｌ）および水（１．４Ｌ）中の１−エチル−７−（メチルチオ）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン（２８６ｇ、１．２４ｍｏｌ）の撹拌溶液に、ペルオキシ一硫酸カリウム（１５２６ｇ、２．４８ｍｏｌ）を固体として２０分かけて添加し、得られた混合物を１０〜２０℃で１６時間撹拌する。反応混合物を濾過し、得られた濾過ケーキをＤＣＭで洗浄する。合わせた濾液およびＤＣＭを５％Ｎａ_２ＳＯ_３、水、および食塩水で洗浄する。有機相をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮して表題化合物を得る（１３３．８ｇ、純度９３％、収率４１％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２５８（Ｍ＋Ｈ）。

【0044】

以下の化合物は本質的に調製物４の方法によって調製される。

【表1】

【0045】

調製物６
Ｎ−［（１Ｓ）−１−（４−ブロモフェニル）エチル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド

【化13】

無水トリフルオロ酢酸（１６５ｍＬ、１．１７ｍｏｌ）を、５℃でＡＣＮ（１．３Ｌ）中の（１Ｓ）−１−（４−ブロモフェニル）エタンアミン（２１３ｇ、１．０６ｍｏｌ）の溶液に滴加し、続いて１時間かけてＴＥＡ（３２６ｍＬ、２．３４ｍｏｌ）を滴加する。３０分後、水（３Ｌ）および食塩水（１Ｌ）を添加すると、無色の沈殿物が形成される。スラリーを１５分間撹拌し、次いで固体を濾過し、水およびヘキサンで洗浄し、空気流、続いて真空下で４０℃で乾燥させて、表題化合物を得る（２９０ｇ、９２％）。^１Ｈ ＮＭＲ（ｄ_６−ＤＭＳＯ） δ １．４４（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）、４．９８（ｄｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６，７．１，７．１，７．１Ｈｚ）、７．３０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．５５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、９．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）。

【0046】

調製物７
Ｎ−［（１Ｓ）−１−［４−（２−シクロプロピルアセチル）フェニル］エチル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド

【化14】

ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中２．５Ｍ、５３ｍＬ、１３０ｍｍｏｌ）を、内部温度を−７０℃未満に維持するために、−７８℃でＴＨＦ（６００ｍＬ）中のＮ−［（１Ｓ）−１−（４−ブロモフェニル）エチル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド（１８．００ｇ、６０．７９ｍｍｏｌ）の溶液に滴加する。添加が完了した後、混合物を−７８℃で４５分間撹拌し、次いで２−シクロプロピル−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−アセトアミド（１１．４ｇ、７９．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍＬ）中の溶液として添加する。混合物を−７８℃で４５分間撹拌し、飽和水性塩化アンモニウムを添加し、混合物を室温に温める。層を分離し、有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。固体に少量のＤＣＭを添加し、混合物を短時間加熱して固体を溶解させる。混合物を沈殿直前まで濃縮し、次いでヘキサン（１５０ｍＬ）を激しく撹拌しながら滴加して無色固体を得る。固体を濾過により収集し、少量のヘキサンで洗浄し、減圧下で乾燥させて表題化合物（１３．８２ｇ、７６％）を無色固体として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２９８．３（Ｍ−Ｈ）。

【0047】

以下の化合物は本質的に調製物７の方法によって調製される。

【表2】

【0048】

調製物９
１‐［４−［（１Ｓ）‐１‐アミノエチル］フェニル］‐２‐シクロプロピル−エタノール

【化15】

水素化ホウ素ナトリウム（０．１４１１ｇ、２当量、３．７２９ｍｍｏｌ）を、氷水浴中で冷却したＭｅＯＨ（１５ｍＬ）中のＮ−［（１Ｓ）−１−［４−（２−シクロプロピルアセチル）フェニル］エチル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド（５５８ｍｇ、１．８６ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。混合物を約２．５時間撹拌し、次いで水（３ｍＬ）中の水酸化カリウム（８００ｍｇ、１４．２ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を室温で約２０時間撹拌する。混合物を濃縮し、ＤＣＭと水に分配する。有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して標記化合物（３５４ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ、７４％）を白色固体として得る。この材料をさらに精製せずに使用する。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：１８９．０（Ｍ−ＯＨ）。

【0049】

調製物１０
２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−（４−ホルミルフェニル）エチル］アセトアミド

【化16】

デス−マーチンペルヨージナン（２０．９ｇ、４９．３ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（４５０ｍＬ）中の２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］エチル］アセトアミド（１１．１ｇ、４４．９ｍｍｏｌ）の０℃溶液に添加する。反応混合物を一晩撹拌し、室温に温める。反応混合物を追加のＤＣＭで希釈し、飽和水性ＮａＨＣＯ_３、飽和水性Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３、および食塩水で洗浄する。合わせた有機物を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮して残渣を得て、これを０〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物を白色固体として得る（９．５ｇ、３９ｍｍｏｌ、８６％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２４４（Ｍ−Ｈ）。

【0050】

調製物１０ａ
２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］エチル］アセトアミド

【化17】

無水トリフルオロ酢酸（１２ｍＬ、８５．４ｍｍｏｌ）を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１５０ｍＬ）中の［４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］メタノール（１０．８ｇ、７１．４ｍｍｏｌ）の０℃溶液に添加する。１０分後、ＣＨ_２Ｃｌ_２（８ｍＬ）中のトリエチルアミン（２４ｍＬ、１７２ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴加し、冷却浴を取り外し、反応物を一晩撹拌する。反応混合物を真空下で濃縮し、追加のＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、１Ｎ水性ＨＣｌおよび水で洗浄する。有機相を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮する。粗製の材料を０〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物を白色固体として得る（１１．１ｇ、４４．９ｍｍｏｌ、６３％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２４６（Ｍ−Ｈ）。

【0051】

調製物１１
２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−［４−（１−ヒドロキシ−３−メチル−ブチル）フェニル］エチル］アセトアミド

【化18】

氷水浴中で冷却したＴＨＦ（３５ｍＬ）中の２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−（４−ホルミルフェニル）エチル］アセトアミド（１．７２ｇ、７．０１ｍｍｏｌ）の溶液に、イソブチルマグネシウムブロミド（ジエチルエーテル中２Ｍ、７．０ｍＬ、１４．０ｍｍｏｌ）を添加し、約３０分間撹拌した。混合物を飽和水性塩化アンモニウムでクエンチし、ＥｔＯＡｃと水に分配する。有機層を飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して表題化合物を油状物として得（１．４０ｇ、４．１５ｍｍｏｌ、５９％）、これをさらに精製することなく使用する。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０２．０（Ｍ−Ｈ）。

【0052】

以下の化合物は本質的に調製物１１の方法によって調製される。

【表3】

【0053】

調製物１３
ｔｅｒｔ−ブチル４−［２−シクロプロピル−１−［４−［（１Ｓ）−１−［（２，２，２−トリフルオロアセチル）アミノ］エチル］フェニル］エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート

【化19】

ＴＨＦ（８０ｍＬ）中のＮ−［（１Ｓ）−１−［４−（２−シクロプロピルアセチル）フェニル］エチル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド（１２．０ｇ、４０．１ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−１−カルボキシレート（１７．９ｇ、９６．１ｍｍｏｌ）の溶液にチタン（ＩＶ）イソプロポキシド（６０ｍＬ、２００ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を６０℃で一晩撹拌する。混合物を室温に冷却し、ＭｅＯＨ（８０ｍＬ）を添加し、続いてシアノ水素化ホウ素ナトリウム（５．３ｇ、８０ｍｍｏｌ）を少しずつ添加する。混合物を室温で８時間撹拌し、次いで水およびＭｅＯＨを添加し、混合物を室温で一晩撹拌する。混合物を濾過して固体を除去し、この固体をＭｅＯＨおよび水ですすぐ。濾液を部分的に濃縮してＭｅＯＨの大部分を除去し、残渣をＥｔＯＡｃ（２×）で抽出する。合わせた有機抽出物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。粗製の材料を溶媒Ｂ（溶媒Ｂは１：１のヘキサン：ＤＣＭである）中０％〜３０％のＥｔＯＡｃの勾配で溶出するカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物（１０．５ｇ、５６％）を無色固体として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４７０．３（Ｍ＋Ｈ）。

【0054】

調製物１４
ｔｅｒｔ−ブチル４−［１−［４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］−２−シクロプロピル−エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート

【化20】

水性水酸化カリウム（５Ｍ、６９ｍＬ、３５０ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（３５０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［２−シクロプロピル−１−［４−［（１Ｓ）−１−［（２，２，２−トリフルオロアセチル）アミノ］エチル］フェニル］エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（３２．２４ｇ、６８．６７ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、得られた混合物を室温で４時間撹拌する。ＥｔＯＨを減圧下で除去し、残渣に飽和水性重炭酸ナトリウムを添加し、混合物をＤＣＭで抽出する。合わせた有機抽出物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物（２４．３３ｇ、３．５％の残留ＤＣＭを含有する９６．５％の純度、収率９２％）を無色の粘性油状物として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３７４．３（Ｍ＋Ｈ）。

【0055】

以下の化合物は本質的に調製物１４の方法によって調製される。

【表4】

【0056】

代替の調製物１４
水（４ｍＬ）中の水酸化カリウム（１．２８ｇ、２２．９ｍｍｏｌ）の溶液を、ＥｔＯＨ（２３ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［２−シクロプロピル−１−［４−［（１ｓ）−１−［（２，２，２−トリフルオロアセチル）アミノ］エチル］フェニル］エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（２．１５ｇ、４．５８ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、混合物を室温で撹拌する。約６時間後、混合物を濃縮する。残渣をＤＣＭと飽和重炭酸ナトリウム溶液に分配する。有機層を水および飽和水性塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して表題化合物を油状物として得て、それを精製することなく使用する（１．７３ｇ、４．４９ｍｍｏｌ、９８％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３７４．２（Ｍ＋Ｈ）。

【0057】

調製物１８
ｔｅｒｔ−ブチル４−［（１Ｒ）−１−［４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］−２−シクロプロピル−エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（ジアステレオマー１）

【化21】

【0058】

調製物１９
ｔｅｒｔ−ブチル４−［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］−２−シクロプロピル−エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（ジアステレオマー２）

【化22】

ｔｅｒｔ−ブチル４−［（１Ｒ）−１−［４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］−２−シクロプロピル−エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（ジアステレオマー１）およびｔｅｒｔ−ブチル４−［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］−２−シクロプロピル−エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（ジアステレオマー２）の１：１混合物（３．２３ｇ）を、ＭｅＯＨ（４０ｍＬ）に溶解し、以下の条件を用いて分取キラルＨＰＬＣクロマトグラフィーにより個々のジアステレオマーに分離する：カラムＣｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ、２０μｍ、（８×３３ｃｍ）；注入量１０ｍＬ；溶離剤０．２％ＤＭＥＡを含む１００％ＭｅＯＨ；検出波長２２０ｎｍ；流速４００ｍＬ／分。調製物１２、ｔｅｒｔ−ブチル４−［（１Ｒ）−１−［４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］−２−シクロプロピル−エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（ジアステレオマー１）を最初の溶出ピークから透明な粘性油状物として得る（１．５０ｇ、４６％、＞９９％ｄｅ）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３７４．３（Ｍ＋Ｈ）。調製物１３、ｔｅｒｔ−ブチル４−［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］−２−シクロプロピル−エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（ジアステレオマー２）を第２の溶出ピークから透明な粘性油状物として得る（１．４６ｇ、４５％、＞９８．２％ｄｅ）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３７４．３（Ｍ＋Ｈ）。

【0059】

調製物２０
Ｎ，３−ジメトキシ−Ｎ−メチル−プロパンアミド

【化23】

ＤＣＭ（１２００ｍＬ）中の３−メトキシプロパン酸（６２ｇ、５７７．７ｍｍｏｌ）の溶液を、１，１’−カルボニルジイミダゾール（１０３ｇ、６３５．２ｍｍｏｌ）で少しずつゆっくり処理し、室温で２時間撹拌する。Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（６２ｇ、６３５．６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌する。混合物を水（２×）、０．１Ｍ水性ＨＣｌ（２×）、および飽和水性重炭酸ナトリウム（２×）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固させて粗製の材料を得る。粗製の材料を、ヘキサン中２０〜４０％アセトンの勾配で溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーにかける。得られた油状物を真空下で一晩乾燥させて表題化合物を得る（６９．５ｇ、８１．７％）。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３） δ ２．７２（ｔ，２Ｈ）、３．２（ｓ，３Ｈ）、３．３８（ｓ，３Ｈ）、３．７（ｍ，５Ｈ）。

【0060】

調製物２１
２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−［４−（１−ヒドロキシ−３−メトキシ−プロピル）フェニル］エチル］アセトアミド

【化24】

２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−［４−（３−メトキシプロパノイル）フェニル］エチル］アセトアミド（２３．６２ｇ、７３．９８ｍｍｏｌ、９５質量％）をＭｅＯＨ（７００ｍＬ）に溶解し、水素化ホウ素ナトリウム（５．６ｇ、１５０ｍｍｏｌ）で処理する。室温で２時間撹拌した後、混合物を飽和水性塩化アンモニウムで処理し、ＭｅＯＨを蒸発させる。得られた材料を水とＥｔＯＡｃに分配し、分離し、合わせた有機物をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固させる。粗製の材料をヘキサン中４０％ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーにかけ、表題化合物を白色固体として得る（１７．８２ｇ、７９％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０６（Ｍ＋Ｈ）。

【0061】

調製物２２
ｔｅｒｔ−ブチル４−［３−メトキシ−１−［４−［（１Ｓ）−１−［（２，２，２−トリフルオロアセチル）アミノ］エチル］フェニル］プロピル］ピペラジン−１−カルボキシレート

【化25】

２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−［４−（１−ヒドロキシ−３−メトキシ−プロピル）フェニル］エチル］アセトアミド（２１．７６ｇ、７１．２７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３５０ｍＬ）に溶解し、−１０℃に冷却する。塩化チオニル（２６．１２ｇ、１６ｍＬ、２１９．６ｍｍｏｌ）を滴加し、反応物を２時間撹拌する。混合物を濃縮乾固させ、ＤＣＭに再溶解し、再濃縮する。粗製の材料をＡＣＮ（３００ｍＬ）に溶解し、ｔ−ブチルピペラジン−１−カルボキシレート（２６．５５ｇ、１４２．６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（３９．５ｇ、２８６ｍｍｏｌ）、およびヨウ化カリウム（１２．０ｇ、７２．３ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を７２時間８０℃に加熱する。得られた白色固体を濾過し、ＥｔＯＡｃで洗浄する。合わせた濾液を水性塩化アンモニウムで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮する。粗製の材料をヘキサン中４０〜８０％ＥｔＯＡｃの勾配で溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーにかけ、表題化合物を白色泡状物として得る（２９．６３ｇ、８８％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４７４（Ｍ＋Ｈ）。

【0062】

調製物２３
ｔｅｒｔ−ブチル４−［１−［４−（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］−３−メトキシ−プロピル］ピペラジン−１−カルボキシレート（ジアステレオマー１）

【化26】

【0063】

調製物２４
ｔｅｒｔ−ブチル４−［１−［４−（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］−３−メトキシ−プロピル］ピペラジン−１−カルボキシレート（ジアステレオマー２）

【化27】

ＥｔＯＨ（３１０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［３−メトキシ−１−［４−［（１Ｓ）−１−［（２，２，２−トリフルオロアセチル）アミノ］−エチル］プロピル］ピペラジン−１−カルボキシレート（２９．６０ｇ、６２．５ｍｍｏｌ）の溶液に水性水酸化カリウム（６３ｍＬ、５Ｍ）を添加する。溶液を室温で４時間撹拌し、次いで混合物を濃縮乾固させる。粗製の残渣を水および飽和水性重炭酸ナトリウムで処理し、ＤＣＭ（３×）で抽出する。合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して表題化合物（２３．６ｇ）を得、これをＭｅＯＨ（２３６ｍＬ）に溶解し、以下の条件を用いるキラルＳＦＣクロマトグラフィーにより個々のジアステレオマーに分離する：カラム：Ｌｕｘ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−１、（５×２５ｃｍ）；注入量：２．５分毎に１ｍＬ、溶離剤１５％ＭｅＯＨ／ＣＯ_２、検出波長２３０ｎｍ；流速３００ｇ／分；カラム温度：４０℃；ＢＰＲ設定値：１００バール；ＢＰＲ温度：４０℃。調製物２８の表題化合物を、最初の溶出ピークから透明な粘性黄色油状物として得る（１０．１ｇ、４２．８％、９６．６％ｄｅ）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３７８（Ｍ＋Ｈ）。調製物２９の化合物を、第２の溶出ピークとして透明な粘性黄色油状物として単離する（１０．３ｇ、４３．６％、９５．２％ｄｅ）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３７８（Ｍ＋Ｈ）。

【0064】

調製物２５
７−［［（１Ｓ）−１−［４−（１−クロロ−２−シクロプロピル−エチル）フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン

【化28】

塩化チオニル（０．２３ｍＬ、３．２１９ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の７−［［（１Ｓ）−１−［４−（２−シクロプロピル−１−ヒドロキシ−エチル）フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン（４３２ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（７４１ｍｇ、５．３７ｍｍｏｌ）の混合物に添加し、混合物を室温で２０分間撹拌する。混合物を珪藻土を通して濾過し、濃縮して、表題化合物（５１８ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ、１００％）を白色泡状物として得、それをさらに精製することなく使用する。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４０１．２／４０３．２（Ｍ＋Ｈ）。

【0065】

以下の化合物は本質的に調製物２５の方法によって調製される。

【表5】

【0066】

調製物２９
ｔｅｒｔ−ブチル４−［（１Ｒ）−２−シクロプロピル−１−［４−［（１Ｓ）−１−［（１−エチル−２−オキソ−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）アミノ］エチル］フェニル］エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート

【化29】

ＤＭＳＯ（１５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［（１Ｒ）−１−［４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］−２−シクロプロピル−エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（８６４ｍｇ、３．３５ｍｍｏｌ）、および１−エチル−７−（メチルスルホニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン（１．１４ｇ、３．０５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣｓＦ（１．３９ｇ、９．１５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．８０ｍＬ、４．６ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を６０℃で１．５時間撹拌する。混合物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈し、水で洗浄する（２×）。合わせた水性洗浄液をＥｔＯＡｃで抽出し、合わせた有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮乾固させる。得られた粗製の生成物を、ヘキサン中５５％〜９５％ＥｔＯＡｃの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物を無色固体として得る（１．４７ｇ、８８％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：５５１．３（Ｍ＋Ｈ）。

【0067】

以下の化合物は本質的に調製物２９の方法によって調製される。

【表6-1】

【表6-2】

【0068】

調製物３９
７−［［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｒ）−２−シクロプロピル−１−ピペラジン−１−イル−エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン

【化30】

塩酸（９５ｍＬ、イソプロパノール中５．５Ｍ、５２０ｍｍｏｌ）を、４０℃でＥｔＯＡｃ（５７０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［（１Ｒ）−２−シクロプロピル−１−［４−［（１Ｓ）−１−［１−エチル−２−オキソ−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）アミノ］エチル］フェニル］エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（２９．４５ｇ、５３．４８ｍｍｏｌ）の溶液に滴加する。混合物を室温で３時間撹拌し、次いで水（３００ｍＬ）を添加する。層を分離し、有機層を水（２×１５０ｍＬ）で抽出する。合わせた水性抽出物のｐＨを５Ｎ ＮａＯＨの添加によりｐＨ１０に調整し、無色の固体を形成させる。固体を濾過により収集し、水で洗浄し、風乾して表題化合物（２５．１８ｇ、９９％）を無色固体として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４５１．２（Ｍ＋Ｈ）。

【0069】

以下の化合物は本質的に調製物３９の方法によって調製される。

【表7】

【0070】

調製物４１
７−［［（１Ｓ）−１−［４−（２−シクロプロピル−１−ピペラジン−１−イル−エチル）フェニル］エチル］アミノ］−１−メチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン（ジアステレオマー１）

【化31】

ｔｅｒｔ−ブチル４−［２−シクロプロピル−１−［４−［（１Ｓ）−１−［（１−メチル−２−オキソ−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）アミノ］エチル］フェニル］エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（ジアステレオマー１）（２４５ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２．５ｍＬ）に溶解する。ＴＦＡ（０．７ｍＬ、９ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で９０分間撹拌する。混合物を２０％水性Ｋ_２ＣＯ_３でクエンチし、ＤＣＭ（３×）で抽出する。合わせた有機抽出物をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、高真空下で一晩濃縮乾固させて、表題化合物を白色泡状物として得る（１９６ｍｇ、８８．５％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４３７（Ｍ＋Ｈ）。

【0071】

以下の化合物は本質的に調製物４１の方法によって調製される。

【表8-1】

【表8-2】

【0072】

調製物４９
７−［［（１Ｓ）−１−［４−（２−シクロプロピル−１−ピペラジン−１−イル−エチル）フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン

【化32】

ＡＣＮ（３ｍＬ）中の７−［［（１Ｓ）−１−［４−（１−クロロ−２−シクロプロピル−エチル）フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン（５１８ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（４４５ｍｇ、３．２１７ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム（１６１ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）、およびピペラジン（２７７ｍｇ、３．２２ｍｍｏｌ）の混合物を、密封バイアル中で７０℃に加熱する。約８時間後、混合物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈し、珪藻土を通して濾過し、濃縮する。粗製の材料を、ＤＣＭ中１％〜７％の３Ｍ ＮＨ_３／ＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲルで上で精製し、表題化合物（３０６ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ、６２％）を白色固体として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４５１．２（Ｍ＋Ｈ）。

【0073】

以下の化合物は、適切な保護されたピペラジンを使用して、本質的に調製物４９の方法によって調製される。

【表9】

【0074】

調製物５３
ｔｅｒｔ−ブチル４−［１−［４−［（１Ｓ）−１−［（２，２，２−トリフルオロアセチル）アミノ］エチル］フェニル］プロピル］ピペラジン−１−カルボキシレート（異性体１）

【化33】

【0075】

調製物５４
ｔｅｒｔ−ブチル４−［１−［４−［（１Ｓ）−１−［（２，２，２−トリフルオロアセチル）アミノ］エチル］フェニル］プロピル］ピペラジン−１−カルボキシレート（異性体２）

【化34】

ｔｅｒｔ−ブチル４−［１−［４−［（１Ｓ）−１−［（２，２，２−トリフルオロアセチル）アミノ］エチル］−フェニル］プロピル］ピペラジン−１−カルボキシレート（２９．２ｇ、６５．８ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５８４ｍＬ）に溶解し、以下の条件を用いてキラルＳＦＣクロマトグラフィーにより分割する：カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ−Ｈ、５×２５ｃｍ；溶離剤０．５％ジメチルエチルアミンを含む８５／１５のＣＯ_２／ＭｅＯＨ；流速３００ｇ／分；検出波長２３０ｎｍ；カラム温度４０℃；ＢＰＲ設定値１００バール；溶媒温度４０℃。異性体１を最初の溶出ピークとして単離する（１４．１５ｇ、３１．９ｍｍｏｌ）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４４（Ｍ＋Ｈ）。異性体２を第２の溶出ピークとして単離する（１３．８７ｇ、３１．３ｍｍｏｌ）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４４（Ｍ＋Ｈ）。

【0076】

調製物５５
ｔｅｒｔ−ブチル４−［１−［４−［（１Ｓ）−１−［（１−エチル−２−オキソ−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）アミノ］エチル］フェニル］−３−メチル−ブチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（異性体１）

【化35】

【0077】

調製物５６
ｔｅｒｔ−ブチル４−［１−［４−［（１Ｓ）−１−［（１−エチル−２−オキソ−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）アミノ］エチル］フェニル］−３−メチル−ブチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（異性体２）

【化36】

ｔｅｒｔ−ブチル４−［１−［４−［（１Ｓ）−１−［（１−エチル−２−オキソ−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）アミノ］エチル］フェニル］−３−メチル−ブチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（２．６ｇ、４．７０ｍｍｏｌ）を、４：１のイソプロパノール：クロロホルム（５０ｍＬ）に溶解し、以下の条件を用いてキラルＳＦＣクロマトグラフィーにより分割する：カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ−Ｈ、５×２５ｃｍ；注入量１ｍＬ；溶離剤０．５％ジメチルエチルアミンを含む７５／２５のＣＯ_２／ＩＰＡ；流速２８０ｇ／分；検出波長２４０ｎｍ；カラム温度４０℃；ＢＰＲ設定値１００バール；溶媒温度４０℃。調製物４５を最初の溶出ピークとして単離する（１．０２ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５５３．４（Ｍ＋Ｈ）。調製物４６を第２の溶出ピークとして単離する（１．０５ｇ、１．９０ｍｍｏｌ）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５５３．４（Ｍ＋Ｈ）。

【0078】

実施例１
７−［［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｒ）−２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン

【化37】

塩化アクリロイル（３０５μＬ、３．７５ｍｍｏｌ、ＤＣＭ ２ｍＬ中）を、−７８℃でＤＣＭ中の７−［［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｒ）−２−シクロプロピル−１−ピペラジン−１−イル−エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン（１．７３ｇ、３．２６ｍｍｏｌ）の溶液に滴加する。−７８℃で２分後、数滴のＭｅＯＨ、続いて飽和水性重炭酸ナトリウムを添加し、混合物を室温に温める。ＤＣＭを添加し、層を分離し、水層をＤＣＭで抽出する。合わせた有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮乾固させる。得られた粗製の生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶媒Ｂ中２５％〜４０％の溶媒Ａ、ここで溶媒Ａは１０％ＭｅＯＨ／アセトンであり、溶媒Ｂはヘキサンである）により精製して、表題化合物を無色固体として得る（１．１６ｇ、７０％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：５０５．３（Ｍ＋Ｈ）。

【0079】

以下の化合物は本質的に実施例１の方法によって調製される。

【表10-1】

【表10-2】

【0080】

７−［［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｓ）−２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オンと複合したＩＤＨ１ Ｘ線結晶構造の決定。
７−［［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｓ）−２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オンとの複合体におけるＩＤＨ１の結晶構造は、Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｒｇｏｎｎｅ，ＩＬ ６０４３９のＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅで操作されるシンクロトロンビームラインＡＰＳ ３１−ＩＤで収集されたＸ線回折データから決定される。Ｒ１３２Ｈ突然変異を有するＩＤＨ１タンパク質は複数の供給元から市販されている。あるいは、ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈタンパク質は、当業者に周知かつ慣用的に使用されている技術によって、突然変異を保有する市販の細胞株から単離することができる。１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０％グリセロール、５ｍＭジチオトレイトール、および２ｍＭ ７−［［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｓ）−２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オンを含有する緩衝液中１５ｍｇ／ｍｌの濃度の突然変異Ｒ１３２Ｈを有するＩＤＨ１タンパク質を用いて２１℃で平衡化し、１００ｍＭ Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ ｐＨ５、５％ＤＭＳＯ、２２％ＰＥＧ ３３５０、および２００ｍＭ硫酸アンモニウムを含有する等容量のリザーバー溶液と混合したシッティングドロップトレイから結晶を得る。３ｍＭの７−［［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｓ）−２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オンを含有する溶液に結晶を一晩浸漬した後に、２２％エチレングリコールを補充した溶液に移し、データ収集のために急速冷凍する。２．８Å分解能の回折データは、波長０．９７９３ÅのＸ線放射を用いて収集される。結晶は、セルパラメータａ＝８２．７４Å、ｂ＝８２．７４Å、ｃ＝２９９．４Å、α＝β＝γ＝９０°を有する空間群Ｐ４_３２_１２に属する。構造は分子置換によって決定され、１つのＩＤＨ１の二量体分子を含有していた。ＩＤＨ１タンパク質をモデル化した後に計算された差電子密度図は、７−［［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｓ）−２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オンの２つの結合分子の明確な密度を有する。

【0081】

７−［［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｓ）−２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オンの立体化学は電子密度から決定され、７−［［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｓ）−２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オンの両分子がモデル化され、共複合体構造は、Ｒｗｏｒｋ＝０．１９２およびＲｆｒｅｅ＝０．２２８のＲファクタに精密化される。

【化38】

【表11】

【0082】

実施例１３
１−エチル−７−［［（１Ｓ）−１−［４−［３−メトキシ−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）プロピル］フェニル］エチル］アミノ］−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン（ジアステレオマー１）

【化39】

ｔｅｒｔ−ブチル４−［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｓ）−１−［（１−エチル−２−オキソ−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）アミノ］エチル］フェニル］−３−メトキシ−プロピル］ピペラジン−１−カルボキシレート（１．３７２ｇ、２．４７３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１５ｍＬ）に溶解し、ＴＦＡ（１０ｍＬ、１５．０８ｇ、１３２．３ｍｍｏｌ）を添加する。反応物を１時間撹拌し、次いで濃縮乾固させる。粗製の材料をＤＣＭ（１２ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（１．２５ｍＬ、７．１７ｍｍｏｌ）に溶解し、混合物を−７８度に冷却する。塩化アクリロイル（０．１８ｍＬ、０．２０ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を滴加する。１０分後、数滴のメタノールを添加して残りの塩化アクリロイルをクエンチし、反応物を濃縮乾固させる（冷）。粗製の材料をヘキサン中５０〜７０％アセトンの勾配で溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーにかけ、表題化合物を白色泡状物として得る（８６７ｍｇ、７３％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：５０９（Ｍ＋Ｈ）

【0083】

以下の化合物は本質的に実施例１３の方法によって調製される。

【表12】

【0084】

実施例１５
７−［［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｓ）−２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン二硫酸塩

【化40】

７−［［（１Ｓ）−１−［４−［（１Ｓ）−２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン（１８８ｍｇ）を、１０００ｒｐｍ／６０℃で撹拌しながら５ｍＬのアセトン中に入れる。試料は透明な溶液である。４５μＬの硫酸を滴加する（２ｍＬのアセトン中に希釈）。数滴後に濃厚な白色スラリーが生じる。半分の硫酸を添加した後、スラリーの稠度は変化する。残り半分の硫酸の添加はゆっくり滴下して行われる。スラリーは、明るい白色の流動性のある固体のスラリーに変換する少し前にゴム状になる。３０分後にプレートへの熱を遮断し、試料を室温に冷却し、白色固体の濃厚なスラリーを得る。白色固体を真空濾過により単離する。得られたケーキは明るい白色固体である。試料を、フィルター上で空気流下で２０分間、次いで７０℃の真空オーブン中で一晩乾燥させる。２６６ｍｇが回収された（収率９６．９％）。

【0085】

実施例１６
７−［［（１Ｓ）−１−［４−［２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン４−ヒドロキシ安息香酸

【化41】

４−ヒドロキシ安息香酸（０．０２３ｇ、０．１６５ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（５ｍｌ）中の７−［［（１Ｓ）−１−［４−［２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン（８４ｍｇ、０．１６５ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。５分間撹拌した後、溶媒を窒素流下でゆっくり蒸発させる。得られた固体をさらに真空下で乾燥させて、７−［［（１Ｓ）−１−［４−［２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−１−エチル−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン４−ヒドロキシベンゾエート（１０５ｍｇ、０．１６１７ｍｍｏｌ）を白色固体として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４２３．２（Ｍ＋Ｈ）。

【0086】

調製物５７
２−シクロプロピル−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチルアセトアミド

【化42】

撹拌している５００ｍＬ丸底フラスコにジクロロメタン（１６０ｍＬ、８容量）および１，１’−カルボニルジイミダゾール（３５．６３ｇ、１．１当量）を入れる。不均一混合物を１５℃に冷却し、混合物に、内部温度を２０℃未満に制御する速度で、ジクロロメタン（４０ｍＬ、２容量）中の２−シクロプロピル酢酸（２０．０ｇ、１．０当量）の溶液を入れる。得られた溶液を２５℃に温め、２時間撹拌する。次いで、溶液を１５℃に冷却し、それにＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（２１．４３ｇ、１．１当量）を少しずつ入れ、内部温度を２０℃未満に維持する。得られた不均一混合物を２５℃に温め、１５時間撹拌する。次いで、反応混合物を水（１６０ｍＬ、８容量）で希釈し、１５分間撹拌する。撹拌を停止し、下部の水層を分離する。得られた水層をジクロロメタンでさらに２回抽出し（１００ｍＬ、５容量×２）、有機層を合わせる。合わせた有機層を１．５Ｎ ＨＣｌ（１００ｍＬ、５容量×２）で２回洗浄する。次いで、有機層を１０％水性重炭酸ナトリウム（１００ｍＬ、５容量×２）で２回洗浄する。次いで、有機層を水（１００ｍＬ、５容量）、続いて飽和水性塩化ナトリウム（１００ｍＬ、５容量）で洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウム（１．０％ｗ／ｗ）上で乾燥させる。塊を濾過し、ジクロロメタン（２０ｍＬ、１容量）で洗浄し、次いで真空下で濃縮する。得られた固体を高真空下で５時間乾燥させて、表題化合物を得る（２５．９ｇ、収率９０．５％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ １４４．１（Ｍ＋Ｈ）。

【0087】

調製物６の代替合成
（Ｓ）−Ｎ−（１−（４−ブロモフェニル）エチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド

【化43】

撹拌している２５０ｍＬ丸底フラスコにジクロロメタン（１００ｍＬ、１０容量）、続いて（Ｓ）−（−）−１−（４−ブロモフェニル）エチルアミン（１０．０ｇ、１．０当量）を入れる。溶液を０℃に冷却し、冷却した溶液に、内部温度を５℃未満に保ちながら、無水トリフルオロ酢酸（１３．１２ｇ、１．２５当量）をゆっくり入れる。得られた不均一混合物を０℃で２時間撹拌し、その時点で、内部温度を５℃未満に保ちながらトリメチルアミン（１２．６４ｇ、２．５当量）をゆっくり入れる。混合物をさらに１時間撹拌し、次いで水（３０ｍＬ、３容量）を添加することによってクエンチする。二相混合物を２５℃に温め、３０分間撹拌する。次いで、層を分離し、水層をジクロロメタン（５０ｍＬ、５容量×２）でさらに２回抽出する。合わせた有機層を飽和水性塩化ナトリウム（５０ｍＬ、５容量）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム（１重量％）上で乾燥させる。乾燥溶液を濾過し、ジクロロメタン（１０ｍＬ、１容量）で洗浄し、溶液を真空下で濃縮して粗製の白色固体を得る。粗製の固体を石油エーテル（１００ｍＬ、１０容量）中で２５℃で２時間スラリー化し、固体を濾過により収集する。湿った固体を４０℃で８時間真空下で乾燥させて、表題化合物を得る（１３．３ｇ、収率９０％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ２９５．３（Ｍ＋Ｈ）。

【0088】

調製物５８
（Ｓ）−Ｎ−（１−（４−（２−シクロプロピルアセチル）フェニル）エチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド

【化44】

オーバーヘッド撹拌しながら１０Ｌの反応槽にメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１５００ｍＬ、１５容量）を入れる。撹拌溶液に、（Ｓ）−Ｎ−（１−（４−ブロモフェニル）エチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（１００ｇ、１．０当量）を入れる。不均一混合物を２５℃で３０分間撹拌し、次いでテトラヒドロフラン（５００ｍＬ、５容量）を入れる。得られた均一溶液を−８３℃に冷却する。温度を−７８℃未満に維持しながらｎ−ブチルリチウム（２９７ｍＬ、２．２当量）を溶液にゆっくり添加し、得られた溶液を−８３℃で１．５時間撹拌する。冷却した溶液に、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２００ｍＬ、２容量）中の２−シクロプロピル−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチルアセトアミド（５３．１９ｇ、１．１当量）の溶液を添加し、内部温度を−７８℃未満に維持する。得られた溶液を−８３℃で１．５時間撹拌し、その時点で、溶液を−３０℃に温め、飽和水性塩化アンモニウム（５Ｌ、５容量）を添加することによってクエンチする。クエンチした反応混合物を２５℃に温め、層を分離する。水層をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（５００ｍＬ、５容量）で抽出する。合わせた有機層を水（５００ｍＬ、５容量）、続いて飽和水性塩化ナトリウム（５００ｍＬ、５容量）で洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウム（５０ｇ、０．５％ｗ／ｗ）上で乾燥させる。塊を濾過し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（５０ｍＬ、０．５容量）で洗浄する。得られた溶液を約１容量の溶液が残るまで真空下で濃縮する。石油エーテル（１５００ｍＬ、１５容量）を濃縮混合物に入れ、得られたスラリーを３０℃未満で２時間撹拌する。固体を濾過により収集し、４０℃で８時間真空下で乾燥させて、表題化合物を得る（６５．９ｇ、収率６７％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ２９８．０（Ｍ−Ｈ）。

【0089】

調製物５９
Ｎ−（（Ｓ）−１−（４−（（Ｓ）−２−シクロプロピル−１−ヒドロキシエチル）フェニル）エチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド

【化45】

水素化反応器に無水エタノール（７．８９ｋｇ、１０容量）を入れる。撹拌溶液に、（Ｓ）−Ｎ−（１−（４−（２−シクロプロピルアセチル）フェニル）エチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（１．０ｋｇ、１．０当量）を入れる。この溶液に、内部温度を３０℃未満に維持しながら、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（ｔＢｕＯＨ中１．０Ｍ、０．４１ｋｇ、０．５容量）の溶液を入れる。次いで、溶液に（Ｒ）−ＲＵＣＹ（登録商標）−ＸｙｌＢＩＮＡＰ（０．０６７５ｋｇ、０．０１７当量）を入れる。２５℃で撹拌しながら、水素化装置を水素ガスで２回パージする。パージ後、溶液を４．５ｋｇの水素圧下で２５℃で５時間撹拌する。５時間後、溶液を排出し、次いで４２℃の真空で油状物に濃縮する。油状物をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１１．１１５ｋｇ、１５容量）に溶解し、次いで４５℃の真空で油状物に濃縮する。油状物をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１１．１１５ｋｇ、１５容量）に溶解し、次いで４５℃の真空で油状物に濃縮する。この油状物に、２５℃でメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２２．２３ｋｇ、３０容量）を入れる。得られた溶液を水（１５．０ｋｇ、１５容量）、続いて水中のＮａＣｌ溶液（１５．０Ｌの水中５．４ｋｇのＮａＣｌ）で洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウム（１．５ｋｇ、１．５ｗ／ｗ）上で乾燥させ、次いで濾過し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１．１１２ｋｇ、１．５容量）で洗浄する。濾過した溶液に活性炭（０．３ｋｇ、０．３ｗ／ｗ）を入れ、混合物を撹拌し、４０℃で２時間加熱する。次いで、混合物を濾過し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１．１１２ｋｇ、１．５容量）で洗浄する。濾過した溶液を４５℃の真空で油状物に濃縮する。油状物を石油エーテル（９．８４ｋｇ、１５容量）に溶解し、４５℃の真空で油状物に濃縮する。油状物を石油エーテル（９．８４ｋｇ、１５容量）に溶解し、４５℃の真空で油状物に濃縮する。油状物に石油エーテル（１９．６８ｋｇ、３０容量）を入れ、混合物を３０℃で３時間撹拌し、得られた固体を濾過により収集し、石油エーテル（９．８４ｋｇ、１５容量）で洗浄する。単離した固体を４０℃で５時間真空下で乾燥させて、表題化合物を得る（０．７９ｋｇ、７９％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３００．０（Ｍ−Ｈ）。

【0090】

調製物６０
Ｎ−（（Ｓ）−１−（４−（（Ｒ）−１−クロロ−２−シクロプロピルエチル）フェニル）エチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド

【化46】

反応器にメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（４．４５ｋｇ、６容量）およびＮ−（（Ｓ）−１−（４−（（Ｓ）−２−シクロプロピル−１−ヒドロキシエチル）フェニル）エチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（１．０ｋｇ、１．０当量）を入れる。溶液を１０℃に冷却し、それに、内部温度を１３℃未満に維持しながら、１−ホルミルピロリジン（０．０６６ｋｇ、０．２当量）をゆっくり入れる。次いで、溶液に、内部温度を１３℃未満に維持しながら、塩化ベンゾイル（０．５６ｋｇ、１．２当量）をゆっくり入れる。得られた溶液を２５℃に温め、最大３６時間撹拌する（反応過程中に反応を監視することができ、停止した場合には１−ホルミルピロリジンおよび塩化ベンゾイルを追加して入れることができる）。次いで、完了した反応物を４０℃の真空で油状物に濃縮する。油状物を１５℃に冷却し、次いで水性の１０％重炭酸ナトリウム溶液（２２．０ｋｇ、２０容量）でクエンチし、２５℃で３時間撹拌する。二相混合物に石油エーテル（６．５６ｋｇ、１０容量）を入れる。有機層を分離する。水層を石油エーテル（６．５６ｋｇ、１０容量）で抽出する。合わせた有機層を水性の１０％重炭酸ナトリウム（５．０Ｌ、５容量）で３回洗浄する。次いで、有機層を水（５．０Ｌ、５容量）、続いて食塩水（５．０Ｌ、５容量）で洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウム（０．５ｋｇ、０．５ｗ／ｗ）上で乾燥させる。次いで、混合物を濾過し、石油エーテル（０．３３ｋｇ、０．５容量）で洗浄する。濾液を４０℃の真空で油状物に濃縮する。油状物をアセトニトリル（３．９３ｋｇ、５容量）に溶解し、４０℃の真空で油状物に濃縮する。油状物をアセトニトリル（３．９３ｋｇ、５容量）に溶解し、４０℃の真空で油状物に濃縮する。油状物をアセトニトリル（７．８６ｋｇ、１０容量）に溶解し、得られた表題化合物の溶液を次の工程で粗製のまま使用する。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３１８．０（Ｍ−Ｈ）。

【0091】

調製物６１
ｔｅｒｔ−ブチル４−（（Ｓ）−２−シクロプロピル−１−（４−（（Ｓ）−１−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチル）フェニル）エチルピペラジン−１−カルボキシレート

【化47】

先に得たＮ−（（Ｓ）−１−（４−（（Ｒ）−１−クロロ−２−シクロプロピルエチル）フェニル）エチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミドの溶液に、Ｎ−Ｂｏｃ−ピペラジン（０．９２４ｋｇ、１．５当量）、続いて重炭酸ナトリウム（１．１ｋｇ、４．０当量）を入れる。得られた混合物を６０時間８５℃に加熱する。注：反応物を２４時間毎に試料採取し、各試料を採取した後、反応物に追加量のＮ−Ｂｏｃ−ピペラジン（０．３１ｋｇ、０．５当量）を入れる。完了したら、反応物を４５℃の真空で濃縮して油状物を得る。油状物を水（１０．０ｋｇ、１０容量）およびメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（７．４１ｋｇ、１０容量）で希釈する。得られた二相混合物を分離し、水層をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（７．４１ｋｇ、１０容量）で抽出する。合わせた有機層を３０％クエン酸（５．０Ｌ、５容量）で５回抽出する。合わせた水層を石油エーテル（６．５６ｋｇ、１０容量）で２回洗浄する。１５℃で炭酸ナトリウム（約２５．０ｋｇ、２５ｗ／ｗ）を添加して水層をｐＨ９にする。塩基性化した水層をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（７．４１ｋｇ、１０容量）で抽出する。合わせた有機層を水（５．０Ｌ、５容量）および食塩水（５．０Ｌ、５容量）で洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウム（０．５ｋｇ、５０％ｗ／ｗ）上で乾燥させる。混合物を濾過し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（０．３７ｋｇ、０．５容量）で洗浄する。濾液を４０℃の真空により油状物に濃縮する。得られた油状物を無水エタノール（３．９５ｋｇ、５容量）に溶解し、表題化合物の粗製の溶液を次の工程に直接使用する。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３７４．３（Ｍ＋Ｈ−ＣＦ_３ＣＯ）。

【0092】

調製物６２
ｔｅｒｔ−ブチル４−（（Ｓ）−１−（４−（（Ｓ）−１−アミノエチル）フェニル）−２−シクロプロピルエチル）ピペラジン−１−カルボキシレート

【化48】

先に得たｔｅｒｔ−ブチル４−（（Ｓ）−２−シクロプロピル−１−（４−（（Ｓ）−１−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチル）フェニル）エチルピペラジン−１−カルボキシレートの溶液に無水エタノール（３．７ｋｇ、３．７ｗ／ｗ）を入れる。溶液を２０℃に冷却し、それに水性の１Ｍ水酸化カリウム（３．０ｋｇの水中０．１６８ｋｇのＫＯＨ）を入れる。得られた混合物を２５℃で１０時間撹拌し、次いで、内部温度を３０℃未満に保ちながら３０％水性クエン酸（５．０ｋｇ、５ｗ／ｗ）をゆっくり添加することによりクエンチする。クエンチした溶液にメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（７．４１ｋｇ、７．４１ｗ／ｗ）を入れる。層を分離し、有機層を３０％水性クエン酸（５．０ｋｇ、５ｗ／ｗ）で抽出する。１５℃で炭酸ナトリウム（約２５．０ｋｇ、２５ｗ／ｗ）を添加して水層をｐＨ８にする。塩基性化した水層を酢酸エチル（７．４１ｋｇ、７．４１ｗ／ｗ）で２回抽出する。合わせた有機層を水（５．０ｋｇ、５ｗ／ｗ）、次いで食塩水（５．０ｋｇ、５ｗ／ｗ）で洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウム（０．５ｋｇ、５０重量％）上で乾燥させ、次いで濾過し、酢酸エチル（０．３７ｋｇ、０．３７ｗ／ｗ）で洗浄する。溶液を４５℃の真空により油状物に濃縮する。得られた油状物をイソプロピルアルコール（２Ｌ、２容量）に溶解し、得られた溶液を４５℃の真空により油状物に濃縮する。得られた油状物をイソプロピルアルコール（１．２Ｌ、１．２容量）に溶解し、表題化合物の粗製の溶液を次の精製工程に直接使用する。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３７４．２（Ｍ＋Ｈ）。

【0093】

１０００ｍＬ丸底フラスコに、イソプロピルアルコール（２７０ｍＬ、９容量）中のｔｅｒｔ−ブチル４−（（Ｓ）−１−（４−（（Ｓ）−１−アミノエチル）フェニル）−２−シクロプロピルエチル）ピペラジン−１−カルボキシレート（３０．０ｇ、１．０当量）の溶液を入れる。２０〜３０℃の撹拌溶液に、Ｌ−ジベンゾイル酒石酸（Ｌ−ＤＢＴＡ、３４．５ｇ、１．２当量）を入れる。溶液を２０〜３０℃で２〜４時間撹拌する。得られたスラリーを２０〜３０℃で８〜１２時間かけて撹拌する。軽質のスラリーにＭＴＢＥ（３００ｍＬ、１０容量）を入れる。得られたスラリーを２０〜３０℃で１２〜１６時間かけて撹拌し増粘する。次いで、固体を濾過により収集し、ＭＴＢＥ（１５０ｍＬ、５容量）で洗浄する。固体を４５〜５５℃で１２時間減圧下で乾燥させて、ｔｅｒｔ−ブチル４−（（Ｓ）−１−（４−（（Ｓ）−１−アミノエチル）フェニル）−２−シクロプロピルエチル）ピペラジン−１−カルボキシレートＬ−ジベンゾイル酒石酸塩を白色固体として得る（４８．８ｇ、収率８３％、＞９８：２ｄｒ）。

【0094】

撹拌している１０００ｍＬ丸底フラスコに、ｔｅｒｔ−ブチル４−（（Ｓ）−１−（４−（（Ｓ）−１−アミノエチル）フェニル）−２−シクロプロピルエチル）ピペラジン−１−カルボキシレートＬ−ジベンゾイル酒石酸塩（４０．０ｇ、１．０当量）、続いてジクロロメタン（４００ｍＬ、１０容量）を入れる。１５〜２５℃の撹拌溶液に１０％Ｎａ_２ＣＯ_３の水溶液（ｐＨを８〜１０にするのに十分な、約６〜８容量）を入れる。二相混合物を１５〜２５℃で１時間撹拌し、次いで層を分液漏斗に分離する。有機層にＤＭＳＯ（２４０ｍＬ、６容量）を入れる。溶液を４０℃未満の減圧下で濃縮してジクロロメタンを除去する。ＤＭＳＯ中の遊離塩基化されたｔｅｒｔ−ブチル４−（（Ｓ）−１−（４−（（Ｓ）−１−アミノエチル）フェニル）−２−シクロプロピルエチル）ピペラジン−１−カルボキシレートの溶液を次の工程で直接使用する。

【0095】

調製物６３
６−クロロ−４−（メチルアミノ）ピリジン−３−カルボン酸エチル

【化49】

メチルアミン（１６ｍＬ、水中１１．６ｍｏｌ／Ｌ、１８６ｍｍｏｌ）を０℃でアセトニトリル（３００ｍＬ）中の４，６−ジクロロピリジン−３−カルボン酸エチル（２０ｇ、９２ｍｍｏｌ）の溶液に滴加する。反応混合物を２時間かけて室温に温める。反応混合物に水および酢酸エチルを添加し、水層を酢酸エチルで抽出する。合わせた有機抽出物を無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固させる。得られた粗製の材料をシリカゲルクロマトグラフィー（０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、適切な画分を濃縮した後、６−クロロ−４−（メチルアミノ）ピリジン−３−カルボン酸エチルを白色固体として得る（１０．４６ｇ、５２．１４ｍｍｏｌ、収率５７％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２０１（Ｍ＋Ｈ）。

【0096】

調製物６４
［６−クロロ−４−（メチルアミノ）−３−ピリジル］メタノール

【化50】

ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の６−クロロ−４−（メチルアミノ）ピリジン−３−カルボン酸エチル（１０．４６ｇ、５２．１４ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃で水素化リチウムアルミニウム（７８．２ｍＬ、ＴＨＦ中１．０ｍｏｌ／Ｌ、７８．２ｍｍｏｌ）の混合物に滴加する。反応混合物を１．５時間かけて室温に温める。反応混合物に、水（３ｍＬ）、１５％水性ＮａＯＨ（３ｍＬ）、次いで水（９ｍＬ）を順次添加する。撹拌後、反応混合物をセライトパッドを通して濾過する。濾液を水で希釈し、ジクロロメタンで抽出する。合わせた有機抽出物を無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固させて、［６−クロロ−４−（メチルアミノ）−３−ピリジル］メタノールを淡黄色固体として得る（２．７８ｇ、収率２７％）。セライト濾過ケーキをメタノールでさらに洗浄し、濾液を濃縮乾固させる。濾過ケーキからの固体を収集し、ジクロロメタンと共に撹拌し、セライトを通して濾過する。濾液をメタノール洗浄からの残渣と合わせ、その材料を濃縮乾固させて材料を保存する。濾過から収集した固体に４：１のクロロホルム：イソプロピルアルコールを添加し、混合物を一晩撹拌する。混合物をセライトパッドで濾過し、濾液を保存していた残渣と合わせ、濃縮乾固させて、追加量の［６−クロロ−４−（メチルアミノ）−３−ピリジル］メタノールを淡黄色固体として得る（５．０７ｇ、収率５６％）。［６−クロロ−４−（メチルアミノ）−３−ピリジル］メタノールの全回収量は７．８５ｇ、収率８３％）である。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１７３（Ｍ＋Ｈ）。

【0097】

調製物６５
７−クロロ−１−メチル−４Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン

【化51】

トリホスゲン（６．０４ｇ、２０．４ｍｏｌ）を、−２０℃でＴＨＦ（１００ｍＬ）中の［６−クロロ−４−（メチルアミノ）−３−ピリジル］メタノール（５．０７ｇ、２９．１ｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（５１．２ｍＬ、２９１ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。冷浴を取り外し、混合物を室温に温める。３０分後、水を添加し、混合物をジクロロメタンで抽出する。合わせた有機抽出物を無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固させる。得られた粗製の材料をシリカゲルクロマトグラフィー（０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、適切な画分を濃縮した後、７−クロロ−１−メチル−４Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オンをオレンジ色固体として得る（５．１３ｇ、２４．５ｍｍｏｌ、収率８４％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１９９（Ｍ＋Ｈ）。

【0098】

調製物６６
ｔｅｒｔ−ブチル４−［２−シクロプロピル−１−［４−［（１Ｓ）−１−［（１−メチル−２−オキソ−４Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）アミノ］エチル］フェニル］エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（ジアステレオマー１）

【化52】

窒素下で、トルエン（１７．４ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［１−［４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］−２−シクロプロピル−エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（１．３０ｇ、３．４８ｍｍｏｌ）、７−クロロ−１−メチル−４Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン（８６４ｍｇ、４．３５ｍｍｏｌ）、および炭酸セシウム（２．２７ｇ、６．９６ｍｍｏｌ）の溶液に、ジクロロ［１，３−ビス（２，６−ジ−３−ペンチルフェニル）イミダゾール−２−イリデン］（３−クロロピリジル）パラジウム（ＩＩ）（２９１ｍｇ、０．３４８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を７５℃で一晩加熱する。室温に冷却した後、混合物をシリカゲルのプラグを通して濾過し、酢酸エチルで溶出する。濾液を減圧下で濃縮し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（２０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製する。混合画分をシリカゲルクロマトグラフィー（５０〜１００％メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／ヘキサン）により再精製し、両方のカラムからの合わせた純粋な画分を濃縮して、ｔｅｒｔ−ブチル４−［２−シクロプロピル−１−［４−［（１Ｓ）−１−［（１−メチル−２−オキソ−４Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）アミノ］エチル］フェニル］エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（ジアステレオマー１）をオフホワイト色泡状物として得る（１．３１２ｇ、２．４００ｍｍｏｌ、収率６９％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：５３６（Ｍ＋）。

【0099】

癌は、その開始および進行が、ＤＮＡ修復、ゲノム安定性、細胞増殖、細胞死、接着、血管新生、浸潤、ならびに細胞および組織微小環境内転移を調節する１つ以上の遺伝子の異常機能によって誘導される疾患の不均一な集合としてますます認識されている。「癌」遺伝子の変異型または異常機能は、天然に存在するＤＮＡ多型、ゲノムコピー数の変化（増幅、欠失、染色体喪失、または複製による）、遺伝子および染色体構造の変化（染色体転座、逆位、または調節解除された遺伝子発現をもたらす他の再配列）、および点突然変異に起因し得る。癌性新生物は、１つの異常な遺伝子機能によって誘導され、同じ異常な遺伝子機能によって、またはさらなる異常な遺伝子機能によって悪化する維持および進行によって維持され得る。

【0100】

上述の遺伝的染色体異常を超えて、癌のそれぞれはまた、ＤＮＡメチル化、ゲノムインプリンティング、およびアセチル化、メチル化、またはリン酸化によるヒストン修飾を含むゲノムのエピジェネティックな修飾も含み得る。エピジェネティックな修飾は、悪性腫瘍の誘導および／または維持において役割を果たす可能性がある。

【0101】

ヒトの癌における細胞遺伝学的異常の広範なカタログが編集され、オンラインで維持され定期的に更新されている（ＵＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｔｏｍｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＧＡＰ）ウェブサイトのＴｈｅ Ｍｉｔｅｌｍａｎ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒを参照されたい）。Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔは、腫瘍形成と因果関係がある全てのヒト遺伝子の詳細なオンライン「Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｃｅｎｓｕｓ」、ならびにヒト癌における体細胞突然変異のＣＯＳＭＩＣ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ）データベースを維持している。様々な癌と因果関係がある細胞遺伝学的変化の豊富な情報を含むさらなる情報源は、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙである。

【0102】

生検、免疫表現型試験、および他の試験による癌性悪性腫瘍の診断は既知であり、慣用的に使用されている。高解像度の染色体バンドおよび高度な染色体画像技術に加えて、癌の疑いのある症例における染色体異常は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、核型分析、スペクトル核型分析（ＳＫＹ）、多重ＦＩＳＨ（Ｍ−ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、一塩基多型アレイ（ＳＮＰチップ）、ならびに当業者に既知でありかつ使用される他の診断および分析試験などの細胞遺伝学的分析を通じて決定することができる。

【0103】

ＩＤＨ１およびＩＤＨ２の突然変異は、神経膠腫、多形性膠芽腫、星細胞腫、乏突起膠腫、傍神経節腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、甲状腺、結腸直腸、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２０１０，１６：３８７−３９７、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０１２，３１（１９）：２４９１−２４９８）、黒色腫（Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２０１０，１７８（３）：１３９５−１４０２）、前立腺（Ｆｌａｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２０１４，３２（ｓｕｐｐｌ．４；Ａｂｓｔｒａｃｔ ２１３）、Ｃａｉｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１３，３：７３０−７４１）、軟骨肉腫および肝内胆管癌（Ｂａｌｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，２０１２，１２４：８８３−８９１、Ｃａｉｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１３，３：７３０−７４１）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）（Ｃａｉｒｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２０１２．１１９（８）：１９０１−１９０３）を含むが、これらに限定されない複数の癌腫瘍の種類において特定されている。突然変異は、活性部位の特定の残基またはその付近において見出されている：ＩＤＨ１についてはＧ９７Ｄ、Ｒ１００、Ｒ１３２Ｈ、Ｒ１３２Ｃ、Ｒ１３２Ｓ、Ｒ１３２Ｖ、Ｒ１３２Ｇ、Ｖ７１Ｉ、Ｒ１３２Ｌ、およびＧ１２３Ｒ（Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２０１０，１６：３８７−３９７、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１２ ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｔａｂｌｅ ２）。

【0104】

ＩＤＨ１およびＩＤＨ２の変異型は、α−ケトグルタル酸を２−ヒドロキシグルタル酸に還元する新形態活性（機能獲得）を有することが示されている。２−ヒドロキシグルタル酸の内因性産生はエナンチオ特異的であり、その結果Ｄ−エナンチオマー（（Ｒ）エナンチオマーとも呼ばれる）が生成される。通常、細胞は低レベルの２−ヒドロキシグルタル酸を有するが、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２突然変異を保有する細胞は有意に上昇したレベルの２−ヒドロキシグルタル酸を示す。有意に上昇したレベルの２−ヒドロキシグルタル酸が、突然変異を保有する腫瘍および変異体ＩＤＨ１またはＩＤＨ２を有する患者の血漿中に検出される。高レベルの２−ヒドロキシグルタル酸は、高メチル化表現型と関連しており、分化の阻止をもたらし、それが腫瘍形成の増強につながる。

【0105】

特定の不可逆的な共有結合阻害剤の活性は、Ｋ_Ｉによって定義される標的（ＩＤＨ１またはＩＤＨ２）への結合、およびｋ_{ｉｎａｃｔ}によって定義される共有結合形成の潜在的な最大速度によって定義される。これら２つの要因は別個の実体ではなく、むしろ共有結合形成の望ましい効果を生み出すために一緒に働く。これは次の３点により図示される。

【0106】

第１に、求電子剤、例えばアクリルアミドが、求核剤、例えばシステインに対して適切に配置されなければならないという事実は、有機化学における共有結合形成の基本的構成要素である。求核剤が共有結合を形成するために求電子剤に接近しなければならない正確な角度および距離がある。求核剤の近くに求電子剤を単純に配置することは、共有結合形成には十分ではない。

【0107】

第２に、阻害剤の酵素への結合を安定化するために水素結合部分を含有するコア上の反応性基、例えば定位コアを組み込む場合、当業者は、定位コアがどのように標的に結合し、上述の最適な角度および距離を考慮して求核剤に対して求電子剤を配置するかを考慮しなければならない。同様に、求核剤の近くに求電子剤を単純に配置することは、共有結合形成には十分ではない。定位コアの変化は、阻害剤化合物が共有結合を形成する能力に影響を及ぼし得る。

【0108】

第３に、上記の２つの点が一緒に考慮されるとき、定位コア上の求電子部分の単なる存在は、共有結合が形成されることを示唆するのに十分ではない。

【0109】

以下のインビトロおよびインビボ研究は、様々な特定の癌細胞株に対する式ＩまたはＩａの試験化合物の変異体ＩＤＨ１およびＩＤＨ２タンパク質阻害活性および有効性を示す。これらのアッセイは一般に、ヒトの臨床治療活性を示すものとして当業者によって認識されている。開示された研究における変異体ＩＤＨ１またはＩＤＨ２新形態タンパク質の阻害は、さらなる変異体ＩＤＨ１およびＩＤＨ２新形態タンパク質に対して有効であると考えられる。変異体ＩＤＨ１またはＩＤＨ２の阻害活性および有効性を示すアッセイは、実質的に以下のように、または同様のデータをもたらす同様のアッセイによって行うことができる。

【0110】

以下のアッセイの結果は、例示され試験された化合物がＩＤＨ１およびＩＤＨ２変異阻害剤として有用であり、変異体ＩＤＨ１またはＩＤＨ２を発現する癌を治療するのに有用であり得ることを示す。

【0111】

ＩＤＨ１およびＩＤＨ２変異酵素の生化学的アッセイ
ＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ、ＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｃ、ＩＤＨ２−Ｒ１７２Ｋ、およびＩＤＨ２−Ｒ１４０Ｑ変異酵素は、αＫＧの２ＨＧへの変換を触媒する。２ＨＧは、インライン固相抽出および質量分析を用いて分析される。この分析は、６４６０トリプル四重極質量分析計（Ｇ６４６０Ａ Ａｇｉｌｅｎｔ）に接続されたＲａｐｉｄＦｉｒｅ（登録商標）機器で行われる。

【0112】

Ｎ末端Ｈｉｓタグを含有するＩＤＨ１変異体（Ｒ１３２ＨおよびＲ１３２Ｃ）およびＩＤＨ２変異体（Ｒ１４０ＱおよびＲ１７２Ｋ）タンパク質をＥ．ｃｏｌｉで発現させ、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製する。酵素アッセイは、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、１ｍＭ ＤＴＴ、０．００５％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、１２０ｍＭ ＮａＣｌを含有するＶ字底９６ウェルポリプロピレンプレート中で行われる。ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈについては、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＰＨ、およびＭｎＣｌ_２がそれぞれ３００μＭ、２．５μＭ、および３００μＭの最終濃度で含まれる。ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｃについては、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＰＨ、およびＭｎＣｌ_２がそれぞれ１００μＭ、１０μＭ、および１００μＭの最終濃度で含まれる。ＩＤＨ２ Ｒ１７２Ｋについては、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＰＨ、およびＭｎＣｌ_２がそれぞれ１５０μＭ、１０μＭ、および１５０μＭの最終濃度で含まれる。ＩＤＨ２ Ｒ１４０Ｑについては、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＰＨ、およびＭｎＣｌ_２がそれぞれ３０００μＭ、１０μＭおよび１００μＭの最終濃度で含まれる。最終ｐＨ＝７．０。ＤＭＳＯストックに溶解した試験化合物を４％の最終ＤＭＳＯ濃度で反応ミックスに希釈する。化合物を用量応答形式で試験する。アッセイは酵素の添加により開始される。酵素は、以下の最終濃度で使用される：ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈ、２ｎＭ；ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｃ、０．５ｎＭ；ＩＤＨ２ Ｒ１７２Ｋ、１．２ｎＭ；ＩＤＨ２ Ｒ１４０Ｑ、１．２ｎＭ。９０分後、質量分析および反応生成物の定量化のための内部標準として３−ヒドロキシ−１，５−ペンタン二酸−２，２，３，４，４−ｄ_５酸（５ｄ_５−３ＨＧ）を含有するＡＣＮ（５０：５０）を添加することにより、反応をクエンチする。クエンチした試料中の２−ヒドロキシグルタル酸（２ＨＧ）を、強アニオン交換カラムクロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｔｒａｔａ−Ｘ−Ａ ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ）を使用して分離し、６４６０トリプル四重極質量分析計（Ｇ６４６０Ａ Ａｇｉｌｅｎｔ）において質量分析によって分析する。検出された２ＨＧシグナルは、既知の２ＨＧ濃度を使用して生成された較正曲線を使用して分析物濃度に変換される。試験した各化合物について、阻害０％としてＤＭＳＯ対照試料および阻害１００％として無酵素対照を使用して阻害％を計算する。ＩＣ_５０値は、４パラメーター方程式を使用して、異なる化合物濃度における個々の阻害％値から得られる。これらの計算はＡｃｔｉｖｉｔｙ Ｂａｓｅ（ＩＤＢＳ）またはＳｃｒｅｅｎｅｒ（Ｇｅｎｅｄａｔａ）データ分析プログラムを使用して行われる。

【0113】

このアッセイの結果は、例示され試験された化合物が、ＩＤＨ１／Ｒ１３２ＨおよびＩＤＨ１／Ｒ１３２Ｃに対する変異体ＩＤＨ１活性、ならびにＩＤＨ２／Ｒ１４０ＱおよびＩＤＨ２／Ｒ１７２Ｋに対する変異体ＩＤＨ２活性を阻害することを示す。

【0114】

以下の実施例は本質的に上述のように試験され、以下の表１４に示されるように、変異体ＩＤＨ１および変異体ＩＤＨ２に対して活性を示す。

【表13】

【0115】

野生型ＩＤＨ１およびＩＤＨ２酵素の生化学的アッセイ
ＩＤＨ１およびＩＤＨ２酵素は、イソクエン酸のαＫＧへの変換を触媒する。
Ｎ末端Ｈｉｓタグを含有する野生型ＩＤＨ１（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００１２６９３１６．１）およびＩＤＨ２（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＥＡＸ０２０８２．１）タンパク質をＥ．ｃｏｌｉで発現させ、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製する。酵素アッセイは、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＤＴＴ、０．００５％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、１２０ｍＭ ＮａＣｌを含有するＶ字底９６ウェルポリプロピレンプレート中で行われる。ＩＤＨ１野生型アッセイについては、イソクエン酸、ＮＡＤＰ^＋、およびＭｎＣｌ_２がそれぞれ８５μＭ、５０μＭ、および２０μＭの濃度で含まれる。ＩＤＨ２野生型アッセイについては、イソクエン酸、ＮＡＤＰ^＋、およびＭｎＣｌ_２がそれぞれ３０μＭ、５０μＭ、および１０μＭの濃度で含まれる。ＤＭＳＯストック溶液に溶解した阻害剤を４％の最終ＤＭＳＯ濃度で反応混合物に希釈する。質量分析のための内部標準としてｄ６−２−ケトペンタン二酸（ｄ６−αＫＧ）を含有するＡＣＮ（５０：５０）を添加することによって酵素アッセイを終了（クエンチ）する。１０マイクロリットルの反応混合物を、１００μＬの水、ピリジン緩衝液（８．６％ピリジン、ｐＨ５）中の５０μＬの１Ｍ Ｏ−ベンジルヒドロキシルアミン、およびピリジン緩衝液中の５０μＬの１Ｍ Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）と合わせる。室温で１時間誘導体化した後、試料を６００μＬのＥｔＯＡｃで抽出する。４００μＬの上層を取り出し、加熱窒素下で乾燥させ、１００μＬのＭｅＯＨ／水（１：１）で再構成する。１０μＬの誘導体化試料を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ２０Ａ ＨＰＬＣシステムおよびＴｈｅ Ｔｈｅｒｍｏ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ（商標）トリプル四重極質量分析計からなるＬＣ−ＭＳシステム上に注入する。分析物を、０．６ｍＬ／分の流速でＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ（商標）Ｃ１８カラム（２．１×５０ｍｍ、３．５μｍ）で分離する。移動相Ａは水中０．１％ギ酸であり、移動相ＢはＭｅＯＨである。検出されたαＫＧシグナルは、既知のαＫＧ濃度を使用して生成された較正曲線を使用して分析物濃度に変換される。試験した各化合物について、阻害０％としてＤＭＳＯ対照試料および阻害１００％として無酵素対照を使用して％阻害を計算する。ＩＣ_５０値は、４パラメーター方程式を使用して、異なる化合物濃度における個々の阻害％値から得られる。これらの計算はＡｃｔｉｖｉｔｙ Ｂａｓｅ（ＩＤＢＳ）またはＳｃｒｅｅｎｅｒ（Ｇｅｎｅｄａｔａ）データ分析プログラムを使用して行われる。

【0116】

このアッセイの結果は、例示され試験された化合物が、ＩＤＨ１ Ｒ１３２ＨまたはＲ１３２Ｃ変異酵素と比較してＩＤＨ１野生型酵素の阻害において活性が低く、ＩＤＨ２ Ｒ１４０ＱまたはＲ１７２Ｋ変異酵素と比較してＩＤＨ２野生型酵素の阻害において活性が低いことを示す。

【0117】

表１５の以下の実施例は本質的に上述のように試験され、変異酵素と比較して野生型酵素の阻害において活性が低い。

【表14】

【0118】

ＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ）生化学ジャンプ希釈アッセイ
凍結乾燥した実施例化合物を１００％ＤＭＳＯで１０ｍＭまたは１００ｍＭに再構成し、試験するまで室温に保つ。ＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ）−Ｈｉｓタンパク質は、当業者に周知でありかつ一般的に使用されている方法によって発現および精製される。アッセイ試薬は以下のものを含んでいた：α−ケトグルタル酸（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｋ１８７５）、ＭｎＣｌ_２−Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ｍ８７−１００、ＮＡＤＰＨ−Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｎ７５０５、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５６７−０２７）、ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ３０１４）、ジチオトレイトール（Ｓｉｇｍａ、Ｄ５５４５）、およびＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ１００（Ｐｅｉｒｃｅ、２８３１４）。ＰｒｏｍｅｇａからのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−Ｇｌｏ（商標）キット（Ｇ９０６１）。

【0119】

全体を通して使用されるアッセイ緩衝液は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．００５％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、および２％ＤＭＳＯ（試験化合物の添加から）を含有する。各化合物のＩＣ_５０は、Ｅｃｈｏ５５５で調製した化合物の用量応答を、アッセイ緩衝液中１．５ｎＭ ＩＤＨ １（Ｒ１３２Ｈ）、１ｍＭ α−ケトグルタル酸、１ｍＭ ＭｎＣｌ_２、および１５μＭ ＮＡＤＰＨと共にインキュベートすることによって決定する。反応物を室温で２時間インキュベートし、次いで６−シクロプロピル−５−（イソキノリン−５−イル）−２−［（３Ｒ）−４−（３−メトキシプロパノイル）−３−メチルピペラジン−１−イル］ピリジン−３−カルボニトリル（１０μＭ）を使用して停止させる。ＮＡＤＰＨ濃度は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−Ｇｌｏ（商標）キットを使用して、製造業者によって指定されるように測定される。発光シグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；０．１秒／Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅ Ｍｉｒｒｏｒ／Ｌｕｍ７００ ＷＬ４００〜７００フィルター）で読み取る。後続のジャンプ希釈実験において、ＩＣ_５０の１０×に相当する化合物濃度を１００ｎＭ ＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ）と共にプレインキュベートする。化合物の濃度は常に酵素濃度以上である。室温で２時間後、この混合物をα−ケトグルタル酸（１０ｍＭ）、ＭｎＣｌ_２（１０ｍＭ）、およびＮＡＤＰＨ（１５μＭ）を含有する溶液に１：１００に希釈する。この最終酵素反応物は１ｎＭ ＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ）および０．１×［ＩＣ_５０］を含有する。室温で２時間インキュベートした後、ＮＡＤＰＨ濃度を６−シクロプロピル−５−（イソキノリン−５−イル）−２−［（３Ｒ）−４−（３−メトキシプロパノイル）−３−メチルピペラジン−１−イル］ピリジン−３−カルボニトリルおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−Ｇｌｏ（商標）キットを使用して上記に指定されるように測定する。３つの対照が含まれる：１）１ｍＭ α−ケトグルタル酸、１ｍＭ ＭｎＣｌ_２、および１５μＭ ＮＡＤＰＨを酵素活性を測定する最終アッセイに使用することを除いて、プレインキュベーションおよび酵素アッセイにおいて１０×ＩＣ_５０化合物を含有する「１０×対照」、２）プレインキュベーションおよび酵素アッセイの両方において化合物の代わりにＤＭＳＯを含有する「最大活性対照」、ならびに３）プレインキュベーションにおいて化合物の代わりにＤＭＳＯ、および酵素アッセイにおいて０．１×ＩＣ_５０化合物を含有する「０．１×対照」。酵素を欠くがそれ以外は「最大活性制御」と同等の「最小活性対照」が含まれる。１ｍＭ α−ケトグルタル酸、１ｍＭ ＭｎＣｌ_２、および１５μＭ ＮＡＤＰＨを使用して、第２組の最大および最小活性対照を実施する。各アッセイ条件を三つ組で試験し、最大活性対照（１０ｍＭ）および最小活性対照（１０ｍＭ）について３２の複製を実施し、同時に最大活性対照（１ｍＭ）および最小活性対照（１ｍＭ）について１６の複製を実施する。

【0120】

各実験／対照において生成されたＮＡＤＰ（生成物）の濃度は、１５μＭ ＮＡＤＰＨを含有する最小活性対照に対する観察されたシグナルの減少パーセントを使用して決定される。最小活性対照（１ｍＭおよび１０ｍＭ）および最大活性対照（１ｍＭおよび１０ｍＭ）を平均し、それぞれについて標準偏差を計算する。各ジャンプ希釈および０．１×対照のシグナルに１５を掛け、次いで最小活性対照（１０ｍＭ）ウェルの平均計数で割る。この数を１５から引いてＮＡＤＰ（μＭ積）を計算する。同じ計算を１０×対照に使用するが、最小活性対照（１ｍＭ）を使用する。最大活性対照（１ｍＭおよび１０ｍＭ）の生成物のμモルを、平均計数に１５を掛け、次いでそれぞれの最小活性対照（１ｍＭおよび１０ｍＭ）で割ることによって計算する。各ウェルのμＭ ＮＡＤＰを平均最大活性対照（１ｍＭまたは１０ｍＭ）で割り、次いで１００を掛けて、化合物ジャンプ希釈、１０×対照、および０．１×対照の％ＩＤＨ活性を決定する。合格化合物は、１０×対照に対して＜３０％の活性を示さなければならず、プレインキュベーション濃度が酵素を化合物で飽和させるのに十分であることを示す。加えて、化合物は０．１×対照に対して＞７０〜８０％の活性を示さなければならず、これは０．１×／希釈化合物濃度では阻害がないことを確認する。

【0121】

実施例化合物は本質的に上述のように試験され、このアッセイにおけるＩＤＨ１／Ｒ１３２Ｈの回収％データを示す。本発明の例示され試験された化合物は、回収％で希釈２時間後に酵素を阻害しなかった従来の化合物に反して、希釈２時間後に酵素を阻害する。このアッセイからのデータは、阻害剤の希釈が酵素活性の回復をもたらさないため、本発明の試験化合物が変異体ＩＤＨ１の共有結合的阻害と一致する様式で作用することを示す。

【0122】

ＩＤＨ１変異阻害剤の細胞ベースのアッセイ
ＩＤＨ１変異体Ｒ１３２Ｃの細胞阻害を試験するために、線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣから購入）を使用する。Ｒ１３２Ｈ突然変異の細胞ベースの阻害を試験するために、Ｕ８７ＭＧ神経膠腫細胞株（ＡＴＣＣ）を、当業者に周知でありかつ慣用的に使用されている方法により、Ｒ１３２Ｈ変異酵素を発現するＤＮＡ構築物で安定にトランスフェクトした。

【0123】

ＨＴ１０８０細胞アッセイ：
化合物で処理する１８〜２４時間前に、１５，０００個の細胞をポリ−Ｄ−ｌｙｓ被覆９６ウェルプレート（１５，０００細胞／ウェル）に平板培養する。化合物処理の４時間前に、通常の培地を除去し、無グルタミン培地と交換することによって細胞をグルタミン飢餓状態にする。飢餓状態にした後、次いで、細胞を、最終濃度０．２％でＤＭＳＯを含有する無グルタミン培地に溶解した異なる濃度の試験化合物（２０μＭ〜１ｎＭ；または０．２μＭ〜０．０１ｎＭ）で処理する。初期の化合物のインキュベーションは３７℃／５％ＣＯ_２で１時間である。１時間後、グルタミンを最終２ｍＭ濃度まで添加し、次いで処理細胞を３７℃／５％ＣＯ_２でさらに１８時間インキュベートする。１８時間のインキュベーション後、細胞溶解物中の細胞内２ＨＧおよびαＫＧを分析する。溶解物は、培地を除去し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ／１％ＴＲＩＴＯＮ（商標）−Ｘ １００を含有する緩衝液を細胞に添加した後に調製される。溶解物のアリコートを内部標準としてｄ_６−αＫＧおよびｄ_５−３ＨＧのミックスに添加し、混合物をＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびピリジンの存在下でＯ−ベンジルヒドロキシルアミンで処理する。次いで、分析物誘導体をＥｔＯＡｃで抽出し、乾燥し、次いでＨ_２Ｏ中５０％ＭｅＯＨで再構成する。記載されるように調製した試料をＨＰＬＣに注入し、Ｃ１８カラムにおいて逆相クロマトグラフィーを使用して２ＨＧおよびαＫＧ誘導体（および対応する内部標準）を分離する。試料の分析は、６４６０トリプル四重極質量分析計（Ｇ６４６０Ａ Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して行う。検出された２ＨＧおよびαＫＧシグナルは、αＫＧ／ｄ_６−αＫＧの比率および較正曲線内で外挿される２ＨＧ／ｄ_５−３ＨＧの比率を使用して分析物濃度に変換される。計算された２ＨＧまたはαＫＧ濃度を、化合物による細胞処理中にグルタミンの存在下および不在下で得られた最大および最小基準に対して正規化した後、各個々の試料についての阻害パーセントが得られる。ＩＣ_５０値は、シグモイド用量応答４パラメーター方程式を使用して個々の阻害％から得られる。これらの計算は、Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｂａｓｅ（ＩＤＢＳ）またはＳｃｒｅｅｎｅｒ（Ｇｅｎｅｄａｔａ）データ分析プログラムを使用して自動的に行われる。

【0124】

このアッセイの結果は、表１５の試験された実施例が２−ヒドロキシグルタル酸の産生を阻害することを示し、このアッセイにおいて細胞における変異体ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｃの阻害を示す。野生型ＩＤＨ１によって生成される代謝物であるαＫＧは阻害剤による影響を受けず、このアッセイにおいて、化合物が細胞において野生型ＩＤＨ１よりも変異体ＩＤＨ１に対して選択的であることを示す。以下の実施例について得られたＩＣ_５０値を表１６に示す。阻害曲線が５０％に達しなかったアッセイについては、試験した最高濃度が示される（例えばＩＣ５０＞２０μＭまたは＞０．２μＭ）。

【表15】

【0125】

Ｕ８７ＭＧ／ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ細胞アッセイ
化合物で処理する１８〜２４時間前に、細胞をポリ−Ｄ−ｌｙｓ被覆９６ウェルプレート（１２，０００細胞／ウェル）に平板培養する。化合物処理の４時間前に、通常の培地を除去し、無グルタミン培地と交換することによって細胞をグルタミン飢餓状態にする。飢餓状態にした後、次いで、細胞を、最終濃度０．２％でＤＭＳＯを含有する無グルタミン培地に溶解した異なる濃度の試験化合物（２０μＭ〜１ｎＭ）で処理する。初期の化合物のインキュベーションは３７℃／５％ＣＯ_２で１時間である。１時間後、グルタミンを最終２ｍＭ濃度まで添加し、次いで処理細胞を３７℃／５％ＣＯ_２でさらに１８時間インキュベートする。細胞内２ＨＧを、培地除去および溶解緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ／１％ＴＲＩＴＯＮ（商標）−Ｘ１００）での処理後に得られる細胞溶解物において分析する。細胞溶解物は処理するまで−８０℃で保存する。分析物抽出のために、解凍した溶解物のアリコートを深型９６ウェルプレートに移し、内部標準としてｄ_５−３ＨＧを含有する冷ＭｅＯＨ、続いてクロロホルムおよびＨ_２Ｏ（１：４：３：２）で処理する。分離後に上相を収集し、６４６０トリプル四重極質量分析計においてＭＳ／ＭＳ検出と組み合わせた親水性相互作用（ＨＩＬＩＣ）クロマトグラフィーを使用して２ＨＧ（および内部標準）を分離するためにＨＰＬＣに注入する。計算された２ＨＧ濃度を、化合物による細胞処理中にグルタミンの存在下および不在下で得られた最大および最小基準に対して正規化した後、各個々の試料についての阻害パーセントが得られる。ＩＣ_５０値は、シグモイド用量応答４パラメーター方程式を使用して個々の％阻害から得られる。これらの計算は、Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｂａｓｅ（ＩＤＢＳ）またはＳｃｒｅｅｎｅｒ（Ｇｅｎｅｄａｔａ）データ分析プログラムを使用して自動的に行われる。

【0126】

以下の実施例は本質的に上述のように試験され、以下の表１７に示されるように、このアッセイにおいてＵ８７ＭＧ細胞中の変異体ＩＤＨ１／Ｒ１３２Ｈに対して阻害活性を示す。

【表16】

【0127】

インビボ２−ヒドロキシグルタル酸アッセイ
ＩＤＨ１阻害剤のインビボ試験のために、ＨＴ１０８０細胞（Ｒ１３２Ｃ変異体ＩＤＨ１を担持する線維肉腫）またはＴＢ０８細胞（Ｒ１３２Ｈ変異体ＩＤＨ１を担持する二次膠芽腫）のいずれかの移植後、無胸腺ヌードマウス（２０〜２２ｇ、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において皮下異種移植腫瘍を成長させる。マウスに自由に給餌および給水させ、細胞移植の１週間前に馴化させる。腫瘍細胞（ＨＴ１０８０）または腫瘍断片（ＴＢ０８）を右後腹部に移植する。ＨＴ１０８０の場合、５．０×１０^６個の細胞を、最終容量０．２ｍｌでマトリゲルとの１：１の混合物において移植する。ＴＢ０８の場合、外植された腫瘍試料から生成された腫瘍断片を後側腹部に直接移植する。腫瘍体積を週２回キャリパにより測定し、腫瘍体積を０．５３６×Ｌ×Ｗ ^２（Ｌ＝長さ、およびＷ＝幅である）を使用して計算する。腫瘍体積が１５０〜４００ｍｍ^３に達したら、動物を無作為化し、群に分け（１群当たりｎ＝３〜６匹）、ＩＤＨ１阻害剤またはビヒクル対照を投与する。ＩＤＨ１阻害剤については、化合物を、１％ヒドロキシエチルセルロース／０．２５％Ｔｗｅｅｎ（商標）８０／０．０５％の消泡剤または１．１ｍｏｌ当量のＨＣｌを有する１０％アカシアのいずれかを含有するビヒクルに配合する。化合物を浴槽超音波処理（ｂａｔｈ ｓｏｎｉｃａｔｅｄ）して懸濁液を得る。化合物を、最終容量０．２ｍｌで強制経口によりミリグラム／キログラム（ｍｐｋ）単位で投与する。２ＨＧの阻害を測定するために、化合物を３日間１日２回（ＢＩＤ）投与する（全投与数＝６）。化合物処置後、マウスをイソフルオラン麻酔および頸椎脱臼で安楽死させる。腫瘍を切除し、ラベル付きチューブに入れ、直ちに液体窒素で凍結する。腫瘍は処理のために−８０℃で保存する。

【0128】

腫瘍溶解物の調製
ＸＹ Ｌｉｔｅ緩衝液は分子グレードの水中で調製され、以下の構成要素を含有する：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ。ＸＹ Ｌｉｔｅ（４０ｍｌ）に、８００μｌのＨａｌｔプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル、ＥＤＴＡ不含Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号７８４４１）を添加する。試料をボルテックスしてから氷上で冷却する。オレンジキャップ溶解−Ａチューブにラベルを付け、氷上のラックに設置する。セラミックの乳鉢と乳棒をドライアイスに設置して冷却する。乳鉢の底部に２×２インチ四方のアルミニウム箔を設置する。腫瘍試料を箔の正方形上の予め冷却した乳鉢に移す。液体窒素（約５ｍｌ）を添加して蒸発させ、腫瘍を超凍結する。別の箔片を腫瘍の上に置き、腫瘍をセラミックの乳棒で小片に粉砕する。粉砕した腫瘍を速やかに溶解チューブに移す。氷冷ＸＹ Ｌｉｔｅ（５００μＬ）を各チューブに添加して蓋をする。次いで、ＦａｓｔＰｒｅｐ−２４ ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ上で、スピード設定５で３５秒間ずつ２回回転させることによって腫瘍を処理する。次いで、試料を１４，０００ ｒｐｍで４℃で３０分間、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ Ｒで遠心分離する。上清を予め冷却した９６深型ウェルプレートに移す。ペレットは廃棄する。

【0129】

タンパク質アッセイ
タンパク質アッセイ希釈プレートは、最初に、ＸＹ緩衝液（１４５μｌ）を非無菌の９６ウェル丸底Ｃｏｒｎｉｎｇプレートに添加することによって生成される。これに、腫瘍溶解物（５μＬ）を添加して穏やかに混合する。プレートを氷上に保つ。ＢＳＡ標準（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ２３２０９ ２ｍｇ／ｍＬ）の系列希釈を以下のように設定する：５つの０．５ｍＬチューブをラックに設置し、ＸＹ緩衝液（６０μＬ）をそれぞれに添加する。ストックＢＳＡ（６０μｌ）を最初のチューブに添加し、ボルテックスする。以下のように希釈系列が完成するまで、最初のチューブからの６０μｌを次の試験管に移し、ボルテックス等する：チューブ１＝ストックＢＳＡ、チューブ２〜５は１：２系列希釈、チューブ６＝ＸＹ緩衝液単独。Ｔｈｅｒｍｏ ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬は製造業者の指示に従って混合する。混合ＢＣＡ試薬（２００μｌ）を各試料に添加し、１５分間インキュベートする。タンパク質アッセイの結果はＳＯＦＴｍａｘ Ｐｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒで読み取る。タンパク質アッセイの結果に基づいて、適切な量のＸＹ緩衝液を各腫瘍溶解物に添加して、５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を生成する。全ての試料にラベルを付けて−８０℃で保存する。

【0130】

腫瘍溶解物の代謝物分析
全２ＨＧおよびαＫＧの濃度に対するＩＤＨ１阻害のインビボ効果は、腫瘍異種移植片の液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）分析によって決定される。この方法は、ＬＣ−ＭＳによる分析前にＯ−ベンジルヒドロキシルアミンによる誘導体化を利用する。１０マイクロリットルの各腫瘍溶解物を深型ウェル９６ウェルプレートに入れ、１０μＭ ｄ_５−３ＨＧおよび１０μＭ ｄ６−αＫＧを含有する１００μＬの内部標準溶液と合わせる。ピリジン緩衝液（８．６％ピリジン、ｐＨ５）中の５０μＬの１Ｍ Ｏ−ベンジルヒドロキシルアミンおよびピリジン緩衝液中の５０μＬの１Ｍ Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を各試料に添加する。誘導体化反応は室温で１時間進行する。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸリキッドハンドラーを使用して、６００μＬのＥｔＯＡｃを各試料に添加する。プレートを密封し、５分間ボルテックスし、次いでそれらをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０Ｒ遠心分離機において４０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。４００μＬの上層を新しい９６ウェルプレートに移す。試料を５０℃で加熱窒素下で乾燥させ、１００μＬのＭｅＯＨ／水（１：１）で再構成する。１マイクロリットルの誘導体化試料を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ２０Ａ ＨＰＬＣシステムおよびＴｈｅｒｍｏ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ（商標）トリプル四重極質量分析計からなるＬＣ−ＭＳシステム上に注入する。分析物を、０．６ｍＬ／分の流速でＷａｔｅｒ ＸＢｒｉｄｇｅ（商標）Ｃ１８カラム（２．１×５０ｍｍ、３．５μｍ）で分離する。移動相Ａは水中０．１％ギ酸であり、移動相ＢはＭｅＯＨである。勾配プロファイルは、０分、５％Ｂ；３分、１００％Ｂ；４．００分、１００％Ｂ；４．１分、５％Ｂ；５．５０分、停止である。質量分析計は、陽イオン選択反応モニタリングモードで操作されるＨＥＳＩ−ＩＩプローブを利用する。較正曲線は、分析物濃度対分析物／内部標準ピーク面積比をプロットし、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（商標）ソフトウェアを用いて１／濃度重み付けを使用してデータの二次適合を行うことによって構築する。未知の分析物濃度は、較正曲線から逆算される。ＬＣ−ＭＳアッセイからの代謝物データは、ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質で表される。ビヒクル処置群における平均２ＨＧレベルは阻害０％対照を決定するために使用される。次いで、各阻害剤処置動物における阻害％はビヒクル対照に対して決定される。データをＪＭＰソフトウェアで分析して、各用量群における平均阻害％、標準偏差、および標準誤差を決定する。

【0131】

例示され試験された化合物によるＩＤＨ１変異体異種移植片マウスにおける２−ヒドロキシグルタル酸のインビボ阻害を示すデータを以下の表１８に示す。

【表17-1】

【表17-2】