特許 6793918 測定装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6793918

(24)【登録日】2020年11月13日

(45)【発行日】2020年12月2日

(54)【発明の名称】測定装置

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/34 20060101AFI20201119BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20201119BHJP

   C12N 5/071 20100101ALN20201119BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/34 B

   C12Q1/02

   !C12N5/071

【請求項の数】9

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2016-172126(P2016-172126)

(22)【出願日】2016年9月2日

(65)【公開番号】特開2018-33432(P2018-33432A)

(43)【公開日】2018年3月8日

【審査請求日】2019年7月4日

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２８年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、［医療分野研究成果展開事業 研究成果最適展開支援プログラム］「積層化細胞シートを用いた創薬試験用立体組織モデル」委託研究開発、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】000230962

【氏名又は名称】日本光電工業株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】591173198

【氏名又は名称】学校法人東京女子医科大学

(74)【代理人】

【識別番号】110001416

【氏名又は名称】特許業務法人 信栄特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】久保 寛嗣

(72)【発明者】

【氏名】清水 達也

(72)【発明者】

【氏名】菊地 鉄太郎

【審査官】 高山 敏充

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０３８０５５０５（ＣＮ，Ａ）

【文献】 Biomaterials 28 (2007)3508-3516

【文献】 Journal of Neuroscience Methods 180(2009)243-254

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

日経テレコン

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

自律拍動する心筋組織の拍動能力に関する測定装置であって、
液体が収容される収容部を有する測定台と、
前記収容部の内部に設置された圧力センサと、
を備え、
前記測定台は、
前記収容部の一部が開口された開口部と、
前記開口部の周囲に前記心筋組織を取り付ける取付部と、を備え、
前記心筋組織が前記開口部を塞ぐように前記取付部に取り付けられた結果、前記収容部は外部と閉鎖された空間を形成する、
測定装置。

【請求項2】

前記液体として、細胞培養液が収容される、
請求項１に記載の測定装置。

【請求項3】

前記収容部に収容される前記液体を加圧する加圧部を備える、
請求項１または請求項２に記載の測定装置。

【請求項4】

前記加圧部は、液体が充填されたリザーバである、
請求項３に記載の測定装置。

【請求項5】

前記圧力センサは、前記収容部内における前記開口部と対向する位置に設置されている、
請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の測定装置。

【請求項6】

前記心筋組織に取り付けられて前記心筋組織の電位を検出可能な電極を備える、
請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の測定装置。

【請求項7】

前記電極は、前記取付部に貼り付けられる前記心筋組織のうち前記開口部を覆う部分の外周部に取り付けられる、
請求項６に記載の測定装置。

【請求項8】

前記開口部は、重力方向とは逆方向に開口するように設けられた、
請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の測定装置。

【請求項9】

自律拍動する心筋組織の拍動能力に関する測定装置であって、
液体が収容される収容部を有する測定台と、
前記収容部の内部に設置された圧力センサと、
を備え、
前記測定台は、
前記収容部の一部が開口された開口部と、
前記心筋組織が前記開口部を塞ぐように、前記開口部の周囲に前記心筋組織を取り付ける取付部と、を備え、
前記液体が前記収容部に水密に収容された状態で、前記心筋組織と前記液体は接触状態となる、
測定装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、心筋組織の収縮能力を測定する装置に関する。

【背景技術】

【0002】

創薬研究などへの応用目的で、細胞シートを積層させて人の心臓の一部を模した組織体を製造する場合がある。このような組織体の収縮能力を評価するために、例えば、下記の非特許文献１には、フィブリンゲルを支持体とし、その外周に心筋の細胞シートを巻き付けた組織体と、当該組織体の動作を圧力信号として測定可能な測定部と、を有する測定装置が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特表２０１３−５１８５７１

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Kubo H et al, "Creation of myocardial tubes using cardiomyocyte sheets and an in vitro cell sheet-wrapping device.", Biomaterials. 2007 Aug;28(24):3508-16. Epub 2007 Apr 18.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、従来の測定装置では、測定される圧力信号に、信号処理の技術を用いても排除しにくい成分のノイズが多く含まれる場合があり、製造した組織体の収縮能力を精度良く評価することが難しい場合があった。

【0006】

本発明は、細胞シートで形成された心筋組織が有する収縮能力を定量的に精度良く測定することが可能な測定装置を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記課題を解決することのできる本発明の測定装置は、
自律拍動する心筋組織の拍動能力に関する測定装置であって、
液体が収容される収容部を有する測定台と、
前記収容部の内部に設置された圧力センサと、
を備え、
前記測定台は、
前記収容部の一部が開口された開口部と、
前記開口部の周囲に前記心筋組織を取り付ける取付部と、を備える。

【0008】

この測定装置によれば、収容部内の液体に接触した状態で心筋組織が自律拍動を行った場合、その自律拍動の影響を受けて収容部内の液体の圧力が変化する。この自律拍動に起因する圧力の変化を、収容部内に設置された圧力センサにより、圧力信号として精度よく測定することができる。このため、心筋の細胞シートを用いて製造された心筋組織について、その収縮能力を定量的に精度良く測定することができる。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、細胞シートで形成された心筋組織が有する収縮能力を定量的に精度良く測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】本発明の実施形態に係る測定装置を説明する測定装置の構成図である。

【図2】測定装置を構成する測定台の概略断面図である。

【図3】細胞培養液の圧力によってドーム状に膨張した心筋組織の側面図である。

【図4】測定装置によって測定された心筋組織の拍動能力を示す図であって、（ａ）は心筋組織の拍動時に生じる心収縮圧のグラフ、（ｂ）は、心筋組織の拍動時に生じる表面電位のグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下、本発明に係る測定装置の実施の形態の例を、図面を参照して説明する。

【0012】

図１は、本発明の実施形態に係る測定装置１０を説明する測定装置１０の構成図である。
図１に示すように、本実施形態に係る測定装置１０は、測定台２０と、リザーバ５０と、計測装置６０とを備えている。

【0013】

測定台２０及びリザーバ５０は、振動を抑制する除振台１２上に設置された状態で、グローブボックス１３内に収容されている。グローブボックス１３は、温度コントローラ１４及びＣＯ_２コントローラ１５を備えている。また、グローブボックス１３には、その内部に、サーミスタ１６が設けられている。グローブボックス１３の内部は、サーミスタ１６によって検出された温度に基づいて温度コントローラ１４によって一定温度（例えば、３７℃）に保たれる。また、グローブボックス１３の内部は、ＣＯ_２コントローラ１５によってＣＯ_２の濃度が一定濃度（例えば、５％）に保たれる。

【0014】

図２は、測定装置１０を構成する測定台２０の概略断面図である。
図２に示すように、測定台２０は、上面で開口された凹部からなる収容部２１を有しており、収容部２１には、細胞培養液が収容される。そして、測定台２０は、収容部２１の一部が開口された開口部２２を備えている。この開口部２２は、測定台２０における重力方向とは逆方向に設けられている。また、測定台２０は、開口部２２の周囲に、取付部２３を備えている。

【0015】

測定台２０には、培養液注入路２５と、センサ挿入路２６とが形成されている。培養液注入路２５及びセンサ挿入路２６は、それぞれ収容部２１に連通されており、収容部２１から互いに反対方向へ水平に延在されている。培養液注入路２５は、収容部２１に対して、その上下方向の中間部で連通されており、測定台２０の側面で開口されている。また、センサ挿入路２６は、収容部２１に対して、その下端部で連通されており、測定台２０の側面で開口されている。センサ挿入路２６には、圧力センサ２７を有するカテーテル２８が挿し込まれており、圧力センサ２７は、収容部２１内に配置されている。この圧力センサ２７は、収容部２１内の圧力を検知するもので、収容部２１内における開口部２２と対向する位置に設置されている。なお、カテーテル２８が挿し込まれたセンサ挿入路２６には、センサ支持具２９が嵌合されており（図１参照）、これにより、センサ挿入路２６は、センサ支持具２９によってシールされている。

【0016】

測定台２０の取付部２３とされている上面には、環状の内側突条３１と、この内側突条３１よりも大径の環状の外側突条３２とが形成されている。内側突条３１は、開口部２２を囲うように形成されている。また、外側突条３２は、内側突条３１と同心円状に形成されている。これにより、測定台２０の取付部２３には、内側突条３１と外側突条３２との間に、環状凹部３３が形成されている。この環状凹部３３には、シート状に形成された水密シート３４が配置されている。水密シート３４は、例えば、シリコンゴム等からなるシートを環状に形成したもので、環状凹部３３に嵌め込まれる。

【0017】

測定台２０の取付部２３には、水密シート３４を介して収容皿３５が載せられている。この収容皿３５は、例えば、ガラスやプラスチックなどの透明材料から形成されたもので、円板状の底面部３６と、底面部３６の周縁から立設された周面部３７とを有している。この収容皿３５には、底面部３６に、孔部３８が形成されており、この孔部３８が測定台２０の収容部２１の開口部２２に連通されている。この収容皿３５の上部には、ブラケット３９が載置されており、このブラケット３９は、例えば、ゴムやバネ等の弾性部材によって収容皿３５に付勢された状態で固定される。これにより、収容皿３５は、ブラケット３９によって測定台２０の取付部２３に押し付けられた状態で取り付けられる。そして、この収容皿３５が測定台２０の取付部２３に押し付けられることで、水密シート３４が圧縮されて取付部２３と収容皿３５の底面部３６に密着する。これにより、収容皿３５は、その底面部３６が測定台２０の取付部２３に水密状態に固定される。

【0018】

収容皿３５には、心筋組織ＨＭが設けられている。この心筋組織ＨＭは、例えば、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞をシート化し、この細胞シートを積層することでヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を立体（３次元）的な組織としたものである。心筋組織ＨＭは、収容皿３５の底面部３６に予め接着されて取り付けられる。そして、この心筋組織ＨＭが取り付けられた収容皿３５を測定台２０に取り付けることで、心筋組織ＨＭが測定台２０の収容部２１の開口部２２を塞ぐように、測定台２０の取付部２３に貼り付けられる。貼り付けられた結果、収容部２１は外部と閉鎖された空間を形成する。なお、マウス等から作成した細胞シートを用いて作られた心筋組織であっても、本発明は適用可能である。

【0019】

測定台２０の取付部２３に貼り付けられた心筋組織ＨＭには、Ｌ字状に形成された導電性金属板からなる電極４０が取り付けられる。この電極４０は、心筋組織ＨＭの拍動で生じる表面電位を検出するもので、取付部２３に貼り付けられた心筋組織ＨＭのうち開口部２２を覆っている部分の外周部に取り付けられる。

【0020】

図１に示すように、リザーバ５０は、加圧器（加圧部の一例）５１を有している。本例の加圧器５１は、吐出口５２を有する筒状のシリンジ５３と、このシリンダ５３に差し込まれたプランジャ５４とを有している。加圧器５１は、支持台５５によって、吐出口５２を下方へ向けた状態で支持されている。加圧器５１には、シリンジ５３の吐出口５２に、開閉弁５６を有する供給管５７が接続されている。この供給管５７は、測定台２０の培養液注入路２５に接続されている。リザーバ５０には、加圧器５１内に細胞培養液が貯留されており、この細胞培養液は、加圧器５１から供給管５７及び培養液注入路２５を通して、収容部２１に充填される。また、加圧器５１のプランジャ５４をシリンジ５３へ押し込むことで、収容部２１へ充填する細胞培養液が加圧可能とされている。
なお、加圧器５１は、プランジャ５４を有さなない構成であっても良い。この場合、加圧器５１のシリンジ５３に満たされた培養液の水頭圧を制御することにより、収容部２１へ充填する細胞培養液が加圧可能とされる。
また、ここでは細胞培養液を収容部２１へ充填する手法としてシリンジを例示したが、これに限られるものではない。例えば三方活栓を用いて、三方活栓のコックを開閉するなど、収容部２１へ細胞培養液を充填できればいかなる手法であっても良い。

【0021】

計測装置６０は、心筋組織ＨＭの収縮能力を測定する装置である。計測装置６０は、インターフェース６２と、コントローラ６３とを備えている。インターフェース６２は、計測装置６０に接続されており、コントローラ６３は、インターフェース６２を介して計測装置６０に接続されている。インターフェース６２には、電極４０から延びる配線４０ａ及びサーミスタ１６から延びる配線１６ａが接続されている。また、コントローラ６３には、圧力センサ２７から延びる配線２７ａが接続されている。

【0022】

そして、この計測装置６０では、電極４０からの電気信号、サーミスタ１６からの温度の検出信号及び圧力センサ２７からの圧力の検出信号が、インターフェース６２を介して送信される。また、圧力センサ２７は、コントローラ６３によって圧力の測定レンジ等がコントロールされる。

【0023】

次に、上記構成の測定装置１０によって心筋組織ＨＭの収縮能力の測定を行う場合について説明する。

【0024】

図３は、細胞培養液の圧力によってドーム状に膨張した心筋組織ＨＭの側面図である。図４は、測定装置１０によって測定された心筋組織ＨＭの拍動能力を示す図であって、（ａ）は心筋組織ＨＭの拍動時に生じる心収縮圧のグラフ、（ｂ）は、心筋組織ＨＭの拍動時に生じる表面電位のグラフである。

【0025】

まず、心筋組織ＨＭを測定台２０の取付部２３に取り付ける。具体的には、測定台２０の取付部２３の環状凹部３３に水密シート３４を嵌め込む。そして、予め心筋組織ＨＭを底面部３６に接着させた収容皿３５を、水密シート３４を介して取付部２３に載せる。さらに、収容皿３５の上部にブラケット３９を載置させ、このブラケット３９を弾性部材によって収容皿３５へ付勢させた状態で取付部２３へ固定する。その後、心筋組織ＨＭにおける開口部２２を覆っている部分の外周部に電極４０を取り付ける。なお、心筋組織ＨＭを取付部２３に取り付ける際には、予め、収容部２１の開口部２２の付近までリザーバ５０から細胞培養液を送り込んでおき、その状態で開閉弁５６を閉じておく。

【0026】

測定台２０の取付部２３に心筋組織ＨＭを取り付けたら、開閉弁５６を開いてリザーバ５０の加圧器５１のプランジャ５４をシリンジ５３へ押し込み、細胞培養液を加圧する。このようにすると、図３に示すように、細胞培養液の圧力によって、心筋組織ＨＭにおける収容部２１の開口部２２を覆う部分がドーム状に膨張される。このとき、測定台２０の取付部２３の内側突条３１と外側突条３２との間の環状凹部３３に配置された水密シート３４が、取付部２３と収容皿３５の底面部３６とに密着しているので、取付部２３と収容皿３５との隙間からの細胞培養液の漏れが防止される。

【0027】

上記のように、心筋組織ＨＭを収容部２１の開口部２２を塞ぐように、取付部２３に貼り付けると、心筋組織ＨＭは、収容部２１に満たされた細胞培養液と接触した状態となり、自律拍動を継続する。

【0028】

心筋組織ＨＭが自律拍動することで、収容部２１内の圧力が変動し、この圧力変動が、圧力センサ２７によって検出される。これにより、図４（ａ）に示すように、計測装置６０では、圧力センサ２７からの検出信号に基づいて、心筋組織ＨＭの拍動時に生じる筋収縮能が心収縮圧として時系列的に取得される。

【0029】

また、心筋組織ＨＭが自律拍動すると、心筋組織ＨＭには、自律拍動を行う際に微小な電位が生じ、この電位が、電極４０に検出される。これにより、図４（ｂ）に示すように、計測装置６０では、心筋組織ＨＭの拍動時に発生する表面電位が時系列的に取得される。

【0030】

この状態において、創薬研究のために薬剤等の試験化合物のスクリーニング評価を行う。具体的には、注射器ＩＪ（図２参照）等によって心筋組織ＨＭ上に、評価を行う試験化合物を滴下し、心筋組織ＨＭの心収縮圧及び表面電位の変化を観察する。そして、心筋組織ＨＭの心収縮圧及び表面電位の変化から心筋組織ＨＭに対する試験化合物の薬効・毒性等を評価する。

【0031】

このとき、心筋組織ＨＭが取り付けられた収容皿３５が透明材料から形成されたものであるので、心筋組織ＨＭの動きを収容皿３５の周面部３７から目視で容易に観察することができる。

【0032】

ここで、開発した薬剤の安全性・有効性を評価する試験としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験ならびにｉｎ ｖｉｖｏ試験がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験には、単細胞の培養系が用いられ、ｉｎ ｖｉｖｏ試験には、齧歯類を中心とする実験動物などの評価系が使用される。

【0033】

ところで、創薬の成功率は約６０００分の１とされており、数多くの失敗の影響で薬剤の研究開発コストは増大傾向にある。例えば、１種類の新薬を開発するのに数百億円の投資が必要になっている。開発の失敗の主な要因としては、細胞単体での評価スクリーニング系と実際のヒト生体組織との差異、動物実験とヒト臨床試験との差異等である。このため、これらの差異を解消し、創薬の成功率を向上させ、研究開発コストを低減することが創薬開発現場で求められている。

【0034】

本実施形態に係る測定装置１０では、細胞シート工学を利用して、ヒトｉＰＳ細胞由来の３次元の心筋組織ＨＭを作製し、その心筋組織ＨＭに試験化合物を作用させながら心収縮圧及び表面電位の測定を行うことで、心筋組織ＨＭに対する薬効評価、毒性試験を行うものである。

【0035】

このように、本実施形態に係る測定装置１０では、従来の足場材料の中に細胞を埋め込み組織を作製する手法と比して、より生体に近い足場レスの高集積組織を用いて、細胞単体と生体組織との反応の違いを吸収し、また、動物と人間との種の違いによる差異を解消することができ、かつ動物実験自体を減らすことが可能となる。

【0036】

また、本実施形態に係る測定装置１０では、パッチクランプ法などで細胞単体の電気生理学的な解析を行い、心収縮や活動電位形成をつかさどるイオンチャネルへの影響を調査して薬効・毒性試験を行う細胞単体での評価と比較しても、より生体に近い機能発現、遺伝子発現を有するヒトｉＰＳ細胞由来の心筋組織ＨＭを用いることで、生体での反応をダイレクトに反映させた試験結果が期待できる。

【0037】

しかも、本実施形態に係る測定装置１０は、ファーメドチューブ等の柔らかい素材を用いずに、細胞培養液の配管系を全てリジットな素材で構成されており、開閉弁５６の開放・閉塞や加圧器５１による加圧を調整することにより、心筋組織ＨＭの等容収縮・等圧収縮を共に計測することができる。

【0038】

以上、説明したように、本実施形態に係る測定装置１０によれば、収容部２１内の細胞培養液に接触した状態で心筋組織ＨＭが自律拍動を行った場合、その自律拍動の影響を受けて収容部２１内の細胞培養液の圧力が変化する。この自律拍動に起因する圧力の変化を、収容部２１内に設置された圧力センサ２７により、圧力信号として精度よく測定することができる。このため、心筋細胞を用いて製造された心筋組織ＨＭについて、その収縮能力を定量的に精度良く測定することができる。

【0039】

また、心筋組織ＨＭは、細胞培養液から栄養分を吸収して、連続的に自律拍動することができる。このため、心筋組織ＨＭの収縮能力を定量的かつ連続的に精度良く測定し続けることができる。

【0040】

しかも、測定台２０の取付部２３に貼り付けられた心筋組織ＨＭは、細胞培養液が充填されたリザーバ５０の加圧器５１による加圧の影響で、収容部２１の開口部２２を覆っている部分がドーム状に膨らみ、テンションが高い状態（張った状態）で、細胞培養液に接触して自律拍動が可能となる。このように、心筋組織ＨＭで形成された心筋組織を立体化することで、より精度よく、収縮能力を圧力信号として定量的に測定することができる。

【0041】

また、圧力センサ２７は、収容部２１内における開口部２２と対向する位置に設置されているので、圧力センサ２７が、心筋組織ＨＭの自律拍動に起因する収容部２１内の細胞培養液の圧力の変化を捉えやすくなる。このため、更に精度よく、収縮能力を反映する圧力信号を測定することができる。

【0042】

また、心筋組織ＨＭに取り付けた電極４０によって、心筋組織ＨＭの自律拍動に伴って発生する表面電位を、圧力信号と同時に検出して測定することができる。このように、生体でいうところの心電図に相当する圧力信号及び電圧信号などの多パラメータを共通の時間軸上で並行して計測することができ、製造した心筋組織ＨＭの評価がし易くなり、試薬の影響等も評価しやすくなる。

【0043】

しかも、電極４０は、取付部２３に貼り付けられた心筋組織ＨＭのうち開口部２２を覆っている部分の外周部に取り付けられるので、電極４０が心筋組織ＨＭの自律拍動によって位置ずれしてしまう等に起因するノイズの影響を少なくすることができる。

【0044】

また、測定台２０の収容部２１の開口部２２が重力方向とは逆方向に設けられているので、収容部２１へ容易に細胞培養液を収容させることができ、しかも、圧力センサ２７によって圧力の変化をさらに捉えやすくなる。

【0045】

なお、本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、適宜、変形、改良等が自在である。その他、上述した実施形態における各構成要素の材質、形状、寸法、数値、形態、数、配置場所、等は本発明を達成できるものであれば任意であり、限定されない。

【符号の説明】

【0046】

１０：測定装置、２０：測定台、２１：収容部、２２：開口部、２３：取付部、２７：圧力センサ、４０：電極、５０：リザーバ、５１：加圧器、ＨＭ：心筋組織

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】