特許 6795211 分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）結合核酸分子、ｓＩｇＡ分析用センサ、およびｓＩｇＡの分析方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6795211

(24)【登録日】2020年11月16日

(45)【発行日】2020年12月2日

(54)【発明の名称】分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）結合核酸分子、ｓＩｇＡ分析用センサ、およびｓＩｇＡの分析方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/115 20100101AFI20201119BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20201119BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20201119BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20201119BHJP

   G01N 33/566 20060101ALI20201119BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/115 ZZNA

   C12Q1/68

   C12M1/34 Z

   G01N33/53 N

   G01N33/566

【請求項の数】3

【全頁数】35

(21)【出願番号】特願2018-539512(P2018-539512)

(86)(22)【出願日】2017年4月20日

(86)【国際出願番号】JP2017015934

(87)【国際公開番号】WO2018051569

(87)【国際公開日】20180322

【審査請求日】2019年3月13日

(31)【優先権主張番号】特願2016-180892(P2016-180892)

(32)【優先日】2016年9月15日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、研究成果展開事業研究成果最適プログラム シーズ育成タイプ「人工核酸によるバイオマーカー簡易検出センサの技術開発」に係る委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】000232092

【氏名又は名称】ＮＥＣソリューションイノベータ株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504145364

【氏名又は名称】国立大学法人群馬大学

(74)【代理人】

【識別番号】100115255

【弁理士】

【氏名又は名称】辻丸 光一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100154081

【弁理士】

【氏名又は名称】伊佐治 創

(72)【発明者】

【氏名】皆川 宏貴

(72)【発明者】

【氏名】堀井 克紀

(72)【発明者】

【氏名】秋冨 穣

(72)【発明者】

【氏名】金子 直人

(72)【発明者】

【氏名】和賀 巌

(72)【発明者】

【氏名】▲桑▼原 正靖

【審査官】 小倉 梢

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０５７３８６３３（ＣＮ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１５／０６４２２３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１６−０５６１３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−０４０１１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１０−２３９３１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１０−２７４６５４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００ − １５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００ − １／７０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記（ａ）のポリヌクレオチドを含む、ｓＩｇＡ結合核酸分子：
（ａ）配列番号９、１１、１５、および２１のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド；
配列番号９、１１、および２１の塩基配列において、下記表１において、下線で示すチミンを含むヌクレオチド残基が、下記化学式（２）で示すヌクレオチド残基であり、
配列番号１５の塩基配列において、下記表１において、下線で示すチミンを含むヌクレオチド残基が、下記化学式（３）で示すヌクレオチド残基である。

【表1】

【化2】

【化3】

【請求項2】

請求項１に記載の分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）結合核酸分子を含むことを特徴とする、ｓＩｇＡ分析用センサ。

【請求項3】

試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中の分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）を検出する工程を含み、
前記核酸分子が、請求項１に記載のｓＩｇＡ結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のｓＩｇＡと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のｓＩｇＡを検出することを特徴とする、ｓＩｇＡの分析方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ｓＩｇＡ結合核酸分子、ｓＩｇＡ分析用センサ、およびｓＩｇＡの分析方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、ストレスが、疲労や鬱の一因となり得ることから、ストレスのチェックが重要視されている。しかしながら、ストレス状態か否かは、例えば、本人が気づいていない、または、主観的であるが故に他人によって判断することが難しいという問題がある。このため、ストレスを客観的に判断する方法の確立が求められている。

【0003】

ヒトは、ストレスを感じることにより、唾液中のｓＩｇＡの分泌が亢進することが知られている。そこで、前記唾液中のｓＩｇＡを測定することで、間接的にストレスを評価する方法が試みられている。具体的には、ｓＩｇＡを抗原とする抗体を使用したＥＬＩＳＡ法が報告されている（非特許文献１）。

【0004】

しかし、抗体は、タンパク質であり、安定性に問題があるため、低コストで簡易な検査法に抗体を用いることが難しい。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】磯和 勅子、「看護師の職務ストレッサー，バーンアウトおよび身体的健康問題の関連：質問紙および免疫指標からの検討」、行動医学研究、Vol.10、No.1、２５−３３頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

そこで、本発明は、ｓＩｇＡの検出に利用可能な新たな分子の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明のｓＩｇＡ結合核酸分子は、分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）に対する解離定数が、３７．７ｎＭ以下の核酸分子であることを特徴とする。

【0008】

本発明のｓＩｇＡ分析用センサは、前記本発明のｓＩｇＡ結合核酸分子を含むことを特徴とする。

【0009】

本発明のｓＩｇＡの分析方法は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のｓＩｇＡを検出する工程を含み、
前記核酸分子が、前記本発明のｓＩｇＡ結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のｓＩｇＡと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のｓＩｇＡを検出することを特徴とする。

【発明の効果】

【0010】

本発明のｓＩｇＡ結合核酸分子は、ｓＩｇＡに対して前述のような解離定数で結合することができる。このため、本発明のｓＩｇＡ結合核酸分子によれば、例えば、試料中のｓＩｇＡとの結合の有無によって、優れた精度で、ｓＩｇＡを検出できる。したがって、本発明のｓＩｇＡ結合核酸分子は、例えば、予防医学、健康管理、感染症等の診断、およびストレスの診断等の分野におけるｓＩｇＡの検出に、極めて有用なツールといえる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1A】図１Ａは、実施例３におけるアプタマーのｓＩｇＡに対する結合能を示すグラフである。

【図1B】図１Ｂは、実施例３におけるアプタマーのｓＩｇＡに対する結合能を示すグラフである。

【図1C】図１Ｃは、実施例３におけるアプタマーのｓＩｇＡに対する結合能を示すグラフである。

【図1D】図１Ｄは、実施例３におけるアプタマーのｓＩｇＡに対する結合能を示すグラフである。

【図1E】図１Ｅは、実施例３におけるアプタマーのｓＩｇＡに対する結合能を示すグラフである。

【図1F】図１Ｆは、実施例３におけるアプタマーのｓＩｇＡに対する結合能を示すグラフである。

【図2A】図２Ａは、実施例３におけるアプタマーのｓＩｇＡへの結合量の相対値（Relative Unit）を示すグラフである。

【図2B】図２Ｂは、実施例３におけるアプタマーのｓＩｇＡへの結合量の相対値を示すグラフである。

【図2C】図２Ｃは、実施例３におけるアプタマーのｓＩｇＡへの結合量の相対値を示すグラフである。

【図2D】図２Ｄは、実施例３におけるアプタマーのｓＩｇＡへの結合量の相対値を示すグラフである。

【図3】図３は、実施例３におけるアプタマーの結合量の相対値を示すグラフである。

【図4】図４は、実施例４におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明のｓＩｇＡ結合核酸分子は、例えば、前記核酸分子が、下記（ａ）のポリヌクレオチド、またはその部分配列からなるポリヌクレオチドを含む。
（ａ）配列番号１〜１２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド

【0013】

本発明のｓＩｇＡ結合核酸分子は、例えば、前記部分配列からなるポリヌクレオチドが、下記（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、および（ａ４）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドである。
（ａ１）配列番号１３、１４、または１５の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１６または１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ３）配列番号１８または１９の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ４）配列番号２０または２１の塩基配列からなるポリヌクレオチド

【0014】

本発明のｓＩｇＡ結合核酸分子は、例えば、前記結合核酸分子が、塩基が修飾基で修飾された修飾塩基を含む。

【0015】

本発明のｓＩｇＡ結合核酸分子は、例えば、前記修飾塩基が、プリン塩基が修飾基で修飾された修飾プリン塩基である。前記修飾基が、好ましくは、アデニン残基である。

【0016】

本発明のｓＩｇＡ結合核酸分子は、例えば、前記修飾塩基が、チミン塩基が修飾基で修飾された修飾チミンである。前記修飾基が、好ましくは、アデニン残基またはグアニン残基である。

【0017】

本発明のｓＩｇＡ結合核酸分子は、例えば、前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである。

【0018】

本発明のｓＩｇＡの分析方法は、例えば、前記試料が、唾液、尿、血漿、および血清からなる群から選択された少なくとも一つである。

【0019】

以下、本発明について、具体的に説明する。

【0020】

（１）ｓＩｇＡ結合核酸分子
本発明のｓＩｇＡ結合核酸分子（以下、「核酸分子」ともいう）は、前述のように、ｓＩｇＡに対する解離定数が、３７．７ｎＭ以下の核酸分子であることを特徴とする。

【0021】

本発明の核酸分子は、前述のようにｓＩｇＡに結合可能である。本発明の核酸分子は、例えば、ｓＩｇＡを構成する免疫グロブリンの重鎖に結合してもよいし、免疫グロブリンの軽鎖に結合してもよいし、両者に結合してもよいし、２つのＩｇＡの架橋部（Ｊ鎖）に結合してもよいし、ｓＩｇＡと結合している分泌成分（secretory component）と結合してもよい。前記ｓＩｇＡは、特に制限されず、その由来は、例えば、ヒト、非ヒト動物等があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ等があげられる。ヒトＩｇα−１鎖のＣ領域（Ig alpha-1 chain C region）のアミノ酸配列の情報は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（http://www.uniprot.org/）アクセッション番号Ｐ０１８７６に登録されており、また、ヒトＩｇ−α２鎖のＣ領域（Ig alpha-2 chain C region）のアミノ酸配列の情報は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（http://www.uniprot.org/）アクセッション番号Ｐ０１８７７に登録されている。

【0022】

本発明において、「ｓＩｇＡに結合する」とは、例えば、ｓＩｇＡに対する結合能を有している、または、ｓＩｇＡに対する結合活性を有しているともいう。本発明の核酸分子と前記ｓＩｇＡとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface Plasmon resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名 BioRad社）が使用できる。本発明の核酸分子は、ｓＩｇＡに結合することから、例えば、ｓＩｇＡの検出に使用できる。

【0023】

本発明の核酸分子は、前記ｓＩｇＡに対する解離定数が、例えば、３７．７ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、８ｎＭ以下、５ｎＭ以下である。本発明の核酸分子は、前記ｓＩｇＡの検出限界濃度が、例えば、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭである。

【0024】

本発明の核酸分子は、例えば、下記表１に示す、下記（ａ）のポリヌクレオチドを含む核酸分子があげられる。
（ａ）配列番号１〜１２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド

【0025】

【表1】

【0026】

本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列からなるポリヌクレオチドを含む核酸分子があげられる。

【0027】

前記部分配列からなるポリヌクレオチドとしては、例えば、下記（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、および（ａ４）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドがあげられる。
（ａ１）配列番号１３、１４、または１５の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１６または１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ３）配列番号１８または１９の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ４）配列番号２０または２１の塩基配列からなるポリヌクレオチド

【0028】

前記（ａ１）は、配列番号５の部分配列の例であり、前記（ａ２）は、配列番号８の部分配列の例であり、前記（ａ３）は、配列番号１１の部分配列の例であり、前記（ａ４）は、配列番号１２の部分配列の例である。これらの配列を、下記表２に示す。

【0029】

【表2】

【0030】

本発明の結合核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｂ）〜（ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドの意味を含む。
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記ｓＩｇＡに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記ｓＩｇＡに結合するポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、ｓＩｇＡに結合するポリヌクレオチド

【0031】

前記（ｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、ｓＩｇＡに結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、例えば、１〜１０個、１〜７個、１〜５個、１〜３個、１または２個である。本発明において、塩基数および配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜５塩基」との記載は、「１、２、３、４、５塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。

【0032】

前記（ｃ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｃ）のポリヌクレオチドが、ｓＩｇＡに結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。

【0033】

前記（ｄ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドであり、前記ｓＩｇＡに結合する範囲であればよい。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd Ed.）」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕等に記載されている方法を採用することもできる。

【0034】

前記（ｄ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd Ed.）」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕等に記載の条件を採用することもできる。

【0035】

前記（ａ１）〜（ａ４）のポリヌクレオチドは、それぞれ、前記（ａ）のポリヌクレオチドの部分配列であることから、例えば、前記（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の一例ともいえる。また、本発明の核酸分子が、前記（ａ１）〜（ａ４）のポリヌクレオチドである場合、前記（ｂ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドは、前記（ａ）の塩基配列が、それぞれ、前記（ａ１）〜（ａ４）の塩基配列であってもよく、前記（ｂ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドの説明において、「（ａ）のいずれかの塩基配列」および「（ａ）のポリヌクレオチド」を、それぞれ、「（ａ１）のいずれかの塩基配列」および「（ａ１）のいずれかのポリヌクレオチド」、「（ａ２）のいずれかの塩基配列」および「（ａ２）のいずれかのポリヌクレオチド」、「（ａ３）のいずれかの塩基配列」および「（ａ３）のいずれかのポリヌクレオチド」、または「（ａ４）のいずれかの塩基配列」および「（ａ４）のいずれかのポリヌクレオチド」に読み替えてその説明を援用できる。

【0036】

本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。前記ポリヌクレオチドは、後述するように、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡであり、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。本発明のｓＩｇＡ結合核酸分子は、例えば、以下、アプタマーともいう。

【0037】

本発明の核酸分子は、例えば、前記いずれかのポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、後述するように、前記いずれかのポリヌクレオチドを２つ以上含んでもよい。前記２つ以上のポリヌクレオチドは、同じ配列でもよいし、異なる配列でもよい。また、後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、さらに、リンカーおよび／または付加配列等を有してもよい。ここで、前記リンカーとは、例えば、ポリヌクレオチド間の配列であり、前記付加配列とは、例えば、末端に付加された配列である。

【0038】

本発明の核酸分子が、例えば、複数の前記ポリヌクレオチドを含む場合、前記複数のポリヌクレオチドの配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上、２〜２０、２〜１０、２または３である。

【0039】

前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長、１〜２０塩基長、３〜１２塩基長、５〜９塩基長である。前記リンカーの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記リンカーの具体例として、例えば、ポリデオキシチミン（ポリｄＴ）、ポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）、ＡとＴの繰り返し配列であるポリｄＡｄＴ等があげられ、好ましくはポリｄＴ、ポリｄＡｄＴである。

【0040】

本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。

【0041】

本発明の核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）、その部分配列、前記（ｂ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含み、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドがあげられる。本発明の核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。

【0042】

本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。

【0043】

本発明の核酸分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜９１個、１〜３０個、１〜１５個、１〜７個、１〜３個、１または２個である。

【0044】

前記ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド残基における塩基として、天然塩基を含んでもよいし、修飾塩基を含んでもよい。前記天然塩基（非人工塩基）は、特に制限されず、例えば、プリン骨格を有するプリン塩基、ピリミジン骨格を有するピリミジン塩基等があげられる。前記プリン塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン（ａ）、グアニン（ｇ）があげられる。前記ピリミジン塩基は、特に制限されず、例えば、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）、ウラシル（ｕ）等があげられ、好ましくは、シトシン（ｃ）、およびチミン（ｔ）である。

【0045】

前記ポリヌクレオチドが前記修飾塩基を有する場合、その部位および個数は、特に制限されない。前記（ａ）のポリヌクレオチドまたはその部分配列が前記修飾塩基を有する場合、前記表１および表２のポリヌクレオチドにおいては、例えば、下線部のアデニンおよびチミンの一部または全部が、修飾塩基である。前記下線部のアデニンが修飾塩基の場合、前記修飾塩基は、プリン塩基が修飾基で修飾された修飾プリン塩基であることが好ましい。また、前記下線部のチミンが修飾塩基の場合、前記修飾塩基は、チミン塩基が修飾された修飾チミンであることが好ましい。

【0046】

前記修飾塩基は、例えば、塩基が修飾基で修飾されたものである。前記修飾基により修飾される塩基（被修飾塩基）は、例えば、前記天然塩基である。前記天然塩基は、例えば、プリン塩基、ピリミジン塩基等があげられる。前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、修飾アデニン、修飾グアニン、修飾シトシン、修飾チミン、修飾ウラシルがあげられる。

【0047】

前記修飾塩基は、例えば、前記被修飾塩基が、直接、前記修飾基で修飾されてもよいし、前記被修飾塩基が、間接的に、前記修飾基で修飾されてもよい。後者の場合、例えば、前記被修飾塩基が、リンカーを介して、前記修飾基で修飾される形態があげられる。前記リンカーは、特に制限されない。

【0048】

前記被修飾塩基の前記修飾基による修飾部位は、特に制限されない。前記塩基がプリン塩基の場合、前記プリン塩基の修飾部位は、例えば、前記プリン骨格の７位および８位があげられ、７位が好ましい。前記プリン塩基の修飾部位が７位の場合、７位の窒素原子は、炭素原子に置換されていることが好ましい。位前記塩基がピリミジン塩基の場合、前記ピリミジン塩基の修飾部位は、例えば、前記ピリミジン骨格の５位および６位があげられ、５位が好ましい。前記ピリミジン塩基の５位が修飾される場合、チミンは、５位の炭素にメチル基を有することから、例えば、５位の炭素に、直接的または間接的に前記修飾基が結合してもよいし、５位の炭素に結合したメチル基の炭素に、直接的または間接的に前記修飾基が結合してもよい。前記ピリミジン骨格において、４位の炭素に「＝Ｏ」が結合し、５位の炭素に「−ＣＨ_３」または「−Ｈ」以外の基が結合している場合、修飾ウラシルまたは修飾チミンということができる。

【0049】

前記修飾塩基が修飾プリン塩基である場合、前記修飾基は、アデニン残基が好ましい。すなわち、前記修飾プリン塩基は、例えば、塩基が前記アデニン残基で修飾されている。前記アデニン残基が前記被修飾塩基を修飾する部位（前記アデニン残基における被修飾塩基との結合部位）は、特に制限されず、前記アデニン残基における６位の炭素に結合するアミノ基があげられる。前記アデニン残基で修飾される前記被修飾塩基は、特に制限されないが、例えば、プリン塩基が好ましく、プリン塩基の７位の原子が、前記アデニン残基で修飾されていることが好ましい。前記修飾塩基が修飾チミンである場合、前記修飾基は、アデニン残基またはグアニン残基が好ましい。すなわち、前記修飾塩基は、例えば、塩基が前記アデニン残基またはグアニン残基で修飾されている。前記アデニン残基が前記被修飾塩基を修飾する部位は、特に制限されず、例えば、前記アデニン残基における６位の炭素に結合するアミノ基があげられる。前記グアニン残基が前記被修飾塩基を修飾する部位は、特に制限されず、例えば、前記グアニン残基における２位の炭素に結合するアミノ基があげられる。前記アデニン残基または前記グアニン残基で修飾される前記被修飾塩基は、特に制限されないが、例えば、チミンが好ましく、チミンの５位の炭素に結合したメチル基の炭素が、前記アデニン残基または前記グアニン残基で修飾されていることが好ましい。

【0050】

前記修飾基が前記アデニン残基または前記グアニン残基の場合、例えば、以下に示すように、前記リンカーを介して、前記修飾基により前記被修飾塩基が修飾されていることが好ましい。
［ヌクレオチド残基］−［リンカー］−［アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］−［リンカー］−［グアニン残基］

【0051】

前記リンカーは、特に制限されず、例えば、以下のように、前記ヌクレオチド残基と前記アデニン残基または前記グアニン残基との間の式で表されるが、これには限定されない。下記式において、(CH₂)_nにおけるｎの数値は、例えば、１〜１０、２〜１０、２である。
［ヌクレオチド残基］ =C-C(=O)-NH-(CH₂)_n- ［アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］ =C-C(=O)-NH-(CH₂)_n- ［グアニン残基］
［ヌクレオチド残基］ -C=C-C(=O)-NH-(CH₂)_n- ［アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］ =C-C(=O)-NH-CH₂-CH₂- ［アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］ =C-C(=O)-NH-CH₂-CH₂- ［グアニン残基］
［ヌクレオチド残基］ -C=C-C(=O)-NH-CH₂-CH₂- ［アデニン残基］

【0052】

前記式において、前記リンカーの一端［＝Ｃ］および［−Ｃ］は、例えば、ヌクレオチド残基における被修飾塩基の炭素と、それぞれ、二重結合または単結合を形成し、前記リンカーの他端［ＣＨ_２−］は、例えば、アデニン残基またはグアニン残基のアミン（−ＮＨ）と結合している。

【0053】

前記ポリヌクレオチドにおける前記アデニン残基で修飾されたアデノシン（７位の窒素原子が炭素原子に置換されたプリン誘導体）ヌクレオチド残基の具体例として、例えば、下記化学式（１）に示す残基（以下、「ＭＫ４」ともいう）があげられる。また、前記ポリヌクレオチドにおける前記アデニン残基で修飾されたチミジンヌクレオチド残基の具体例として、例えば、下記化学式（２）に示す残基（以下、「ＫＳ９」ともいう）、前記ポリヌクレオチドにおける前記グアニン残基で修飾されたチミジンヌクレオチド残基の具体例として、例えば、下記化学式（３）に示す残基（以下、「ＮＧ７」ともいう）があげられる。なお、本発明は、これには限定されない。

【0054】

【化1】

【0055】

【化2】

【0056】

【化3】

【0057】

前記表１のポリヌクレオチドにおいて、例えば、下線部のアデニンが、前記ＭＫ４のヌクレオチド残基であることが好ましい。また、前記表１および表２のポリヌクレオチドにおいて、下線部のチミンが、前記ＫＳ９および前記ＮＧ７の少なくとも一方のヌクレオチド残基であることが好ましい。さらに、前記表１および表２のポリヌクレオチドにおいて、例えば、配列番号５〜７および１３〜１５の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、下線部のチミンが前記ＮＧ７のヌクレオチド残基であることがより好ましい。前記表１および表２のポリヌクレオチドにおいて、例えば、配列番号８〜１２および１６〜２１の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、下線部のチミンが前記ＫＳ９のヌクレオチド残基であることがより好ましい。

【0058】

本発明の核酸分子がアデノシンヌクレオチド残基を有する場合、前記ポリヌクレオチドの合成には、例えば、下記化学式（４）で表されるヌクレオチド三リン酸（以下、「ＭＫ４モノマー」ともいう）を、モノマー分子として使用することができる。本発明の核酸分子が、例えば、前記チミジンヌクレオチド残基を有する場合、前記ポリヌクレオチドの合成には、例えば、下記化学式（５）に示すヌクレオチド三リン酸（以下、「ＫＳ９モノマー」ともいう）、または、下記化学式（６）に示すヌクレオチド三リン酸（以下、「ＮＧ７モノマー」ともいう）を、モノマー分子として使用することができる。前記ポリヌクレオチドの合成において、例えば、前記モノマー分子は、ホスホジエステル結合により、他のヌクレオチド三リン酸と結合する。前記ＭＫ４モノマーおよび前記ＮＧ７モノマーの製造方法については、後述する。

【0059】

【化4】

【0060】

【化5】

【0061】

【化6】

【0062】

前記修飾基としては、この他に、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基、ベンジルアミノカルボニル基（benzylaminocarbonyl）、トリプタミノカルボニル基（tryptaminocarbonyl）およびイソブチルアミノカルボニル基（isobutylaminocarbonyl）等があげられる。

【0063】

前記修飾アデニンの具体例としては、例えば、７’−デアザアデニン等があげられ、前記修飾グアニンの具体例としては、例えば、７’−デアザグアニン等があげられ、前記修飾シトシンの具体例としては、例えば、５’−メチルシトシン（５−Ｍｅ−ｄＣ）等があげられ、前記修飾チミンの具体例としては、例えば、５’−ベンジルアミノカルボニルチミン、５’−トリプタミノカルボニルチミン、５’−イソブチルアミノカルボニルチミン等があげられ、前記修飾ウラシルの具体例としては、例えば、５’−ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）、５’−トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）および５’−イソブチルアミノカルボニルウラシル等があげられる。例示した前記修飾ウラシルは、チミンの修飾塩基ということもできる。

【0064】

前記ポリヌクレオチドは、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基のみを含んでもよいし、２種類以上の前記修飾塩基を含んでもよい。

【0065】

本発明の核酸分子は、例えば、修飾ヌクレオチドを含んでもよい。前記修飾ヌクレオチドは、前述の前記修飾塩基を有するヌクレオチドでもよいし、糖残基が修飾された修飾糖を有するヌクレオチドでもよいし、前記修飾塩基および前記修飾糖を有するヌクレオチドでもよい。

【0066】

前記糖残基は、特に制限されず、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基があげられる。前記糖残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位または４’位があげられ、いずれか一方でも両方が修飾されてもよい。前記修飾糖の修飾基は、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基等があげられる。

【0067】

前記修飾ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基の２’位が修飾された、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。

【0068】

前記修飾ヌクレオチドの個数は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜１００個、１〜９０個、１〜８０個、１〜７０個である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾ヌクレオチドも、特に制限されず、例えば、１〜９１個または１〜７８個、前述の範囲と同様である。

【0069】

本発明の核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜１００個、１〜５０個、１〜３０個、１〜１０個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。

【0070】

本発明の核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾化ヌクレオチド残基および／または前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。

【0071】

本発明の核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長、１〜５０塩基長、１〜２５塩基長、１８〜２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。

【0072】

本発明の核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明の核酸分子は、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することが好ましく、より好ましくは３’末端である。本発明の核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、例えば、前記付加配列を介して固定化することが好ましい。

【0073】

本発明の核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法等、遺伝子工学的手法、公知の方法により合成できる。本発明の核酸分子は、例えば、いわゆるＳＥＬＥＸ法によっても得ることができる。この場合、ターゲットは、ｓＩｇＡが好ましい。

【0074】

本発明の核酸分子は、前述のように、前記ｓＩｇＡに結合性を示す。このため、本発明の核酸分子の用途は、前記ｓＩｇＡへの結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明の核酸分子は、例えば、前記ｓＩｇＡに対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。

【0075】

（２）ｓＩｇＡ分析用センサ
本発明の分析用センサは、前述のように、ｓＩｇＡの分析用センサであって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の分析用センサは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は、特に制限されない。本発明の分析用センサを使用すれば、例えば、前記核酸分子と前記ｓＩｇＡとを結合させることで、前述のように、前記ｓＩｇＡを検出できる。

【0076】

本発明の分析用センサは、例えば、さらに担体を有し、前記担体に前記核酸分子が配置されている。前記核酸分子は、前記担体に固定化されていることが好ましい。前記担体への前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。本発明の分析用センサの使用方法は、特に制限されず、前記本発明の核酸分子および前記本発明の分析方法を援用できる。

【0077】

（３）分析方法
本発明の分析方法は、前述のように、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のｓＩｇＡを検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のｓＩｇＡ結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のｓＩｇＡと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のｓＩｇＡを検出することを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明の核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明の分析方法は、前記本発明の核酸分子として、前記本発明のｓＩｇＡ分析用センサを使用してもよい。

【0078】

本発明によれば、前記本発明の核酸分子が、ｓＩｇＡに特異的に結合することから、例えば、ｓＩｇＡと前記核酸分子との結合を検出することによって、試料中のｓＩｇＡを特異的に検出可能である。具体的には、例えば、試料中のｓＩｇＡの有無またはｓＩｇＡの量を分析可能であることから、定性または定量も可能といえる。

【0079】

本発明において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、唾液、尿、血漿および血清等があげられる。

【0080】

前記試料は、例えば、液体試料でもよいし、固体試料でもよい。前記試料は、例えば、前記核酸分子と接触させ易く、取扱いが簡便であることから、液体試料が好ましい。前記固体試料の場合、例えば、溶媒を用いて、混合液、抽出液、溶解液等を調製し、これを使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。

【0081】

前記検出工程は、例えば、前記試料と前記核酸分子とを接触させて、前記試料中のｓＩｇＡと前記核酸分子とを結合させる接触工程と、前記ｓＩｇＡと前記核酸分子との結合を検出する結合検出工程とを含む。また、前記検出工程は、例えば、さらに、前記結合検出工程の結果に基づいて、前記試料中のｓＩｇＡの有無または量を分析する工程を含む。

【0082】

前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触方法は、特に制限されない。前記試料と前記核酸分子との接触は、例えば、液体中で行われることが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。

【0083】

前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４〜３７℃、１８〜２５℃であり、接触時間は、例えば、１０〜１２０分、３０〜６０分である。

【0084】

前記接触工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子でもよいし、未固定の遊離した核酸分子でもよい。後者の場合、例えば、容器内で、前記試料と接触させる。前記核酸分子は、例えば、取扱性に優れることから、前記固定化核酸分子が好ましい。前記担体は、特に制限されず、例えば、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。

【0085】

前記結合検出工程は、前述のように、前記試料中のｓＩｇＡと前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記試料中のｓＩｇＡの有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記試料中のｓＩｇＡの量を分析（定量）できる。

【0086】

そして、前記ｓＩｇＡと前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記試料中にｓＩｇＡは存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記試料中にｓＩｇＡが存在すると判断できる。

【0087】

前記ｓＩｇＡと前記核酸分子との結合の分析方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、前述のＳＰＲ等があげられる。また、前記結合は、例えば、前記ｓＩｇＡと前記核酸分子との複合体の検出でもよい。

【0088】

（４）検出キット
本発明の検出キットは、前記本発明のｓＩｇＡ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記ｓＩｇＡの検出等を行うことができる。

【0089】

本発明の検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子として、前記本発明のセンサを含んでもよい。また、前記本発明の検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の他に、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、前記担体、緩衝液、使用説明書等があげられる。

【実施例】

【0090】

つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。

【0091】

［実施例１］
以下に示す合成例により、ＭＫ４を調製した。

【0092】

エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）は、質量分析装置（API2000、販売元：Applied Biosystems社製）を用い、ポジティブイオンモードまたはネガティイオンモードで実施した。¹H NMRスペクトルは、核磁気共鳴装置（JNM-ECS400、JEOL社製）を用い、取得した。化学シフトは、内部標準であるテトラメチルシラン（Ｍｅ_４Ｓｉ）に対する相対値δ（ｐｐｍ）として表される。イオン交換クロマトグラフは、クロマトグラフシステム（ECONO system、Bio-Rad社製）を用いて実施した。前記イオン交換クロマトグラフでは、diethylaminoethyl（ＤＥＡＥ）A-25-Sephadex（Amershambiosciences社製）を充填したガラスカラム（φ２５×５００ｍｍ）を使用した。

【0093】

（合成例１）ＭＫ１の合成

【化7】

【0094】

ＡＺ６（２９０ｍｇ、９．０６×１０^−４ｍｏｌ）を真空乾燥させ、ｄｒｙ−ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、３ｍＬ）に溶かした。これにＨＯＢｔ・Ｈ_２Ｏ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール・一水和物、１７６ｍｇ、１．１５×１０^−５ｍｏｌ、１．２ｅｑ．）、ＰｙＢＯＰ（登録商標）（ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム、５７９ｍｇ、１．１５×１０^−５ｍｏｌ、１．２ｅｑ．）、およびＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、４．６ｍＬ、２．７２×１０^−２ｍｏｌ、３０ｅｑ．）を加え、さらにｄｒｙ−ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶かしたＮＫ１（４９３ｍｇ、９．４８×１０^−４ｍｏｌ、１．１ｅｑ．）を加え、撹拌した。前記攪拌開始４０分後において、減圧留去し、残渣を水に溶かし、吸引ろ過で沈殿物を回収した。ろ液を逆相カラムクロマトグラフで粗精製した後、ろ物と共にカラムクロマトグラフで精製し、ＭＫ１を得た。ＭＫ１の物性値を以下に示す。
収量：２６１ｍｇ 収率：６０％
ESI-MS （positive ion mode） m/z, found = 481.2, calculated for [（M+H）+] = 481.2
found = 503.1, calculated for [（M+Na）+] = 503.2
1HNMR （400 MHz, DMSO-d6） δ8.22 （1H, m）, 8.11 （1H, s）, 8.10 （1H, s）, 7.87 （1H, s）, 7.63 （1H, d）, 6.52 （1H, q）, 6.35 （1H, d）, 5.27 （1H, s）, 3.82 （1H, m）, 2.18 （1H, m）

【0095】

（合成例２）ＭＫ２の合成

【化8】

【0096】

ＭＫ１（１０８ｍｇ、２．２５×１０^−４ｍｏｌ）を真空乾燥させ、Ａｒ（アルゴン）で置換した。つぎに、ｄｒｙ−ＤＭＦで２回（１回目：４０ｍＬ、２回目：４ｍＬ）、およびｄｒｙ−ＭｅＣＮ（アセトニトリル）で３回（１回目：９ｍＬ、２回目：５ｍＬ、３回目：５ｍＬ）共沸した。ｄｒｙ−Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（６ｍＬ）で懸濁させた後、ｄｒｙ−Ｔｒｉｂｕｔｈｙｌ ａｍｉｎｅ（１３０μＬ、５．４４×１０^−４ｍｏｌ、２．５ｅｑ．）を加えた。そして、氷冷下でＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（４２μＬ、４．５０×１０^−４ｍｏｌ、２ｅｑ．）を加え、撹拌した。前記攪拌開始４０分後において、再びｄｒｙ−Ｔｒｉｂｕｔｈｙｌ ａｍｉｎｅ（２５０μＬ、１．０５×１０^−３ｍｏｌ、５ｅｑ．）およびＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（８４μＬ、４．５０×１０^−４ｍｏｌ、４ｅｑ．）を加え、氷冷下で１時間撹拌した。前記撹拌後、冷１ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＢ（Triethylammonium bicarbonate） ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＬ）を加え、５分間撹拌し、クエンチした。そして、減圧留去し、Ｅｔｈｅｒで結晶化させ、吸引ろ過し、黄色固体を得た。前記固体を水に溶かし、陰イオン交換カラムクロマトグラフで精製し、凍結乾燥させ、ＭＫ２を得た。ＭＫ２の物性値を以下に示す。
収量：３０．０μｍｏｌ 収率：１３．４％
ESI-MS （negative ion mode） m/z, found = 559.1, calculated for [（M-H）-] = 559.2

【0097】

（合成例３）ＭＫ３の合成

【化9】

【0098】

ＭＫ２（３０．０３μｍｏｌ）を真空乾燥させ、ｄｒｙ−Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（１０ｍＬ）で３回共沸し、一晩真空乾燥させた。前記乾燥後、Ａｒで置換し、ｄｒｙ−ＤＭＦ（２ｍＬ）およびｄｒｙ−ＴＥＡ（トリエチルアミン、２８μＬ、１．９８×１０^−４ｍｏｌ、６．６ｅｑ．）で溶かした。さらに、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（１６ｍｇ、１４．０２×１０^−４ｍｏｌ、４ｅｑ．）、２，２’−Ｄｉｔｈｉｏｄｉｐｙｒｉｄｉｎｅ（１７ｍｇ、７．７２×１０^−４ｍｏｌ、１．６ｅｑ．）、およびＴｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（２０ｍｇ、７．６３×１０^−４ｍｏｌ、１．６ｅｑ．）を加え、室温で撹拌した。前記攪拌開始６．５時間後、得られた反応液を、Ｓｏｄｉｕｍ ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ（３９ｍｇ、３．１９×１０^−４ｍｏｌ、１０ｅｑ．）をｄｒｙ−Ａｃｅｔｏｎｅ（１８mL）、ｄｒｙ−Ｅｔｈｅｒ（２７ｍＬ）、およびｄｒｙ−ＴＥＡ（２ｍＬ）で溶かした溶液に加え、前記添加後４℃で３０分静置した。そして、沈殿物をｄｒｙ−Ｅｔｈｅｒ（１２ｍＬ）で５回デカンテーションした。これを真空乾燥させ、ＭＫ３をクルードとして得た。
理論収量：３０．０３μｍｏｌ

【0099】

（合成例４）ＭＫ４の合成

【化10】

【0100】

ＭＫ３（３０．０３μｍｏｌ）を真空乾燥させ、Ａｒで置換し、ｄｒｙ−Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（５ｍＬ）で２回共沸した後、ｄｒｙ−ＤＭＦ（１ｍＬ）で懸濁させた。これにｄｒｙ−ｎ−Ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｅ（３０μＬ、１．２５×１０^−４ｍｏｌ、４ｅｑ．）および０．５ｍｏｌ／L ｎ−Ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉn ＤＭＦ（３１０μＬ、１．５３×１０^−４ｍｏｌ、５ｅｑ．）を加え、室温で撹拌した。前記攪拌開始６．５時間後、１ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＢ ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＬ）を加え、３０分間撹拌し、減圧留去した。これに水を加え、Ｅｔｈｅｒで２回分液し、水層を陰イオン交換カラムクロマトグラフで精製し、凍結乾燥することでＭＫ４を得た。ＭＫ４の物性値を以下に示す。
収量：３．３３μｍｏｌ 収率：１１．１%
ESI-MS （negative ion mode） m/z, found = 719.0, calculated for [（M-H）-] = 719.1

【0101】

［実施例２］
以下に示す合成例により、ＮＧ７を調製した。

【0102】

エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）は、質量分析装置（API2000、販売元：Applied Biosystems社製）を用い、ポジティブイオンモードまたはネガティイオンモードで実施した。¹H NMRスペクトルは、核磁気共鳴装置（JNM-ECS400、JEOL社製）を用い、取得した。化学シフトは、内部標準であるテトラメチルシラン（Ｍｅ_４Ｓｉ）に対する相対値δ（ｐｐｍ）として表される。イオン交換クロマトグラフは、クロマトグラフシステム（ECONO system、Bio-Rad社製）を用いて実施した。前記イオン交換クロマトグラフでは、diethylaminoethyl（ＤＥＡＥ）A-25-Sephadex（Amershambiosciences社製）を充填したガラスカラム（φ２５×５００ｍｍ）を使用した。

【0103】

（合成例１）ＮＨ１の合成

【化11】

【0104】

Ethylendiamine(７ｍＬ、１０５ｍｍｏｌ、１ｅｑ．)を溶かしたＣＨＣｌ_３（１２０ｍＬ)に、tert-butyl dicarbonate(５ｇ、２２．９ｍｍｏｌ、０．２ｅｑ．)を溶かしたＣＨＣｌ_３（２０ｍＬ)を、撹拌しながら滴下した。前記滴下から２４時間後、吸引ろ過し、ろ液を減圧留去し、ＮＨ１を得た。ＮＨ１の物性値を以下に示す。
収量：３．５７３ｇ 収率：９７．４％
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found= 161.4, calculated for [(M+H)+] = 161.1
1HNMR(400 MHz, CDCl3) δ3.13 (2H, q) 2.76 (2H, t) 1.41 (9H, s)

【0105】

（合成例２）ＮＧ１の合成

【化12】

【0106】

2,6-Dichloropurine（１０００ｍｇ、５．２９×１０^−３ｍｏｌ、１．０ｅｑ．)をＡｒ（アルゴン）置換し、水酸化ナトリウム水溶液（１０．６ｍＬ、２．１２×１０^−２ｍｏｌ、２Ｎ）に溶かした後、９０℃で還流させ、反応を行った。前記反応後、室温に戻し、吸引ろ過した。得られたろ物を回収し、最小量の水に溶かし、ｐＨを３〜４に調製し、析出したろ物を吸引ろ過で回収することで、ＮＧ１を得た。ＮＧ１の物性値を以下に示す。
収量：７２０ｍｇ 収率：７９％
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found = 171.0, calculated for [(M+H)+] = 171.0
found = 193.1, calculated for [(M+Na)+] = 193.0
found = 209.1, calculated for [(M+K)+] = 209.0
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found = 169.0, calculated for [(M-H)-] = 518.0
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.29 (1H, s)

【0107】

（合成例３）ＮＧ２の合成

【化13】

【0108】

ＮＧ１（８７０ｍｇ、５．１０×１０^−３ｍｏｌ)およびＮＨ１(３．２８１ｇ、２．０５×１０^−２ｍｏｌ, 4ｅｑ．)を、それぞれ真空乾燥させた後、Ａｒ置換した。ＮＧ１をＭｅｔｈｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ（５ｍＬ）で懸濁させ、ＮＨ１をＭｅｔｈｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ（１ｍＬ）に溶解させた。得られたＮＨ１の溶液をＮＧ１の入っているナスフラスコへ移し、１３０℃で還流させ、反応を行った。前記反応後、室温に戻し、減圧留去した。さらに、クロロホルムで再沈後、吸引ろ過し、ろ物を回収することで、ＮＧ２を得た。ＮＧ２の物性値を以下に示す。
収量：１．１１７ｍｇ 収率：７４％
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found = 171.0, calculated for [(M+H)+] = 171.0,
found = 193.1, calculated for [(M+Na)+] = 193.0,
found = 209.1, calculated for [(M+K)+] = 209.0,
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found = 169.0, calculated for [(M-H)-] = 518.0
1HNMR (400 MHz, CD3OD) δ7.73 (1H, s), 3.45 (2H, m), 3.30 (2H,s), 1.39 (9H, s)

【0109】

（合成例４）ＮＧ３の合成

【化14】

【0110】

ＮＧ２（５００ｍｇ、１．７０×１０^−３ｍｏｌ)を、メタノール（３ｍＬ）で懸濁し、Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ（１５ｍＬ）を加え、室温で撹拌し、反応を行った。前記反応後、減圧留去し、Ｅｔｈｅｒで懸濁させた後、吸引ろ過し、ろ物を回収することで、ＮＧ３を得た。ＮＧ３の物性値を以下に示す。
収量：４６７ｍｇ 収率：８９．１％
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found = 195.1, calculated for [(M+H)+] = 195.1,
found = 217.2, calculated for [(M+Na)+] = 217.1,
found = 233.0, calculated for [(M+K)+] = 233.1
1HNMR (400 MHz, D2O) δ7.83 (1H, s), 3.55 (2H, t), 3.11 (2H, t)

【0111】

（合成例５）ＮＧ４の合成

【化15】

【0112】

ナスフラスコＡに、（Ｅ）−５−（２−Ｃａｒｂｏｘｙｒｉｎｙｌ）−２’−deoxyuridine（１０１ｍｇ、３．３９×１０^−４ｍｏｌ）と撹拌子とを入れた。また、ナスフラスコＢに、ＮＧ３（１７１ｍｇ、４．１２×１０^−４ｍｏｌ、１．２ｅｑ．）と撹拌子とを入れた。そして、ナノフラスコＡおよびＢについて、それぞれ、真空乾燥させた。つぎに、ナスフラスコＡをＡｒ置換し、ＨＯＢｔ・Ｈ_２Ｏ（６８ｍｇ、４．４４×１０^−４ｍｏｌ、１．３ｅｑ．）およびＰｙＢＯＰ（登録商標）（ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム、２２９ｍｇ、４．４０×１０^−４ｍｏｌ、１．３ｅｑ．)を加え、ｄｒｙ−ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１ｍＬ）で溶解した。さらに、ナスフラスコＢをＡｒ置換し、ＤＲＹ−ｄｍｆ（０．５ｍＬ）で溶かした。ナスフラスコＡおよびＢに、ＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ナスフラスコＡ：０．７９ｍＬ、４．５１×１０^−３ｍｏｌ、１３．３ｅｑ．、ナスフラスコＢ：０．７９ｍＬ、４．５１×１０^−３ｍｏｌ、６．７ｅｑ．）をそれぞれ加えた後、ナスフラスコＢの中身をナスフラスコＡに素早く加え、室温で撹拌し、反応を行った。前記反応後、減圧留去し、ＣＤＣｌ_３（重水素化クロロホルム）で懸濁した。さらに、得られた懸濁液をソニケーションし、ろ過した。得られたろ物を回収後、ＭｅＯＨで懸濁し、さらに、ソニケーション後、ろ過した。得られたろ物を回収することで、ＮＧ４を得た。ＮＧ４の物性値を以下に示す。
収量：１４７ｍｇ 収率：９１％
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found = 475.1, calculated for [(M+H)+] = 475.2,
found = 497.2, calculated for [(M+Na)+] = 497.2,
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found = 473.1, calculated for [(M-H)-] = 473.2
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.27 (1H, s), 8.20 (1H, s), 7.10 (1H,s), 7.05 (1H, s), 6.13 (1H, t), 5.25 (1H, d), 5.16 (1H, m), 4.09 (1H, m), 3.79 (1H, m), 3.60 (2H, m), 3.16 (2H, d), 2.14 (2H, m)

【0113】

（合成例６）ＮＧ５の合成

【化16】

【0114】

ＮＧ４（１０１ｍｇ、２．１３×１０^−４ｍｏｌ）を真空乾燥後、Ａｒ下、ｄｒｙ−Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（３０ｍＬ）で２回共沸した。つぎに、ｄｒｙ−Trimetyl phosphate（２１ｍＬ）で懸濁後、氷浴下でＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（４００μＬ、４．２９×１０^−３ｍｏｌ、２０ｅｑ．）を加え、２．５時間撹拌した。前記撹拌後、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（２００μＬ、２．１５×１０^−３ｍｏｌ、１０ｅｑ．）を追加し、８．５時間撹拌した。その後、冷水１０ｍＬを加えクエンチし、１０分間撹拌した。ＴＥＡ（トリエチルアミン、２．７ｍＬ、１．９４×１０^−２ｍｏｌ、９０ｅｑ．)を加え、１５分程撹拌した。そして、減圧留去後、ＥｔｈｅｒおよびＭｅＣＮ（アセトニトリル）で結晶化させ、ろ過することにより、黄色沈殿物を回収した。得られた黄色沈殿物を水に溶かし、陰イオン交換カラムクロマトグラフにより精製し、凍結乾燥させることでＮＧ５を得た。ＮＧ５の物性値を以下に示す。
収量：４１．４９μｍｏｌ 収率：１９．５％
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found = 553.1, calculated for [(M-H)-] = 553.1

【0115】

（合成例７）ＮＧ６の合成

【化17】

【0116】

ＮＧ５（７８．６５μｍｏｌ）を真空乾燥後、ｄｒｙ−Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（５ｍＬ）で３回共沸し、さらに一晩真空乾燥させた。前記乾燥後、これをＡｒで置換し、ｄｒｙ−ＤＭＦ（２ｍＬ）およびｄｒｙ−ＴＥＡ（７２μＬ、５．１９×１０^-４ｍｏｌ、４ｅｑ．）で溶かし、さらに、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（２４ｍｇ、３．５３×１０^−４ｍｏｌ、４ｅｑ．）、２，２‘−Ｄｉｔｈｉｏｄｉｐｙｒｉｄｉｎｅ（２９ｍｇ、１．３２×１０^−４ｍｏｌ、１．６ｅｑ．)、およびＴｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（３６ｍｇ、１．３７×１０^−４ｍｏｌ、１．６ｅｑ．）を加えて室温で撹拌した。前記攪拌開始後8時間において、反応液を、Ｓｏｄｉｕｍ ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ（９７ｍｇ、７．９２×１０^−４ｍｏｌ、１０ｅｑ．）をｄｒｙ−Ａｃｅｔｏｎｅ（１８ｍＬ）、ｄｒｙ−Ｅｔｈｅｒ（２７ｍＬ）、およびｄｒｙ−ＴＥＡ（２ｍＬ）で溶かした溶液に入れ、４℃で３０分静置した。前記静置後、沈殿物をｄｒｙ−Ｅｔｈｅｒ（１２ｍＬ）で５回デカンテーションした。デカンテーション後の沈殿物を真空乾燥させ、ＮＧ６をクルードとして得た。
理論収量：７８．６５μｍｏｌ

【0117】

（合成例８）ＮＧ７の合成

【化18】

【0118】

真空乾燥させたＮＧ６（７８．６５μｍｏｌ）を、Ａｒで置換し、ｄｒｙ−Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（５ｍＬ）で２回共沸した後、ｄｒｙ−ＤＭＦ（１ｍＬ）で懸濁した。つぎに、得られた懸濁液に、ｄｒｙ−ｎ−Ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｅ（７５μＬ、３．１５×１０^−４ｍｏｌ、４ｅｑ．）および０．５ｍｏｌ／Ｌ ｎ−Ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉn ＤＭＦ（０．８ｍＬ、３．９３×１０^−４ｍｏｌ、５ｅｑ．）を加え、室温で撹拌した。前記攪拌開始後９時間において、１ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＢ（Triethylammonium bicarbonate） ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＬ）を加えた後、３０分撹拌し、減圧留去した。これに水を加え、Ｅｔｈｅｒで２回分液後、水層を陰イオン交換カラムクロマトグラフおよび逆相カラムクロマトグラフを用いて精製し、凍結乾燥することで、ＮＧ７を得た。ＮＧ７の物性値を以下に示す。
収量：１９．５５μｍｏｌ 収率：２４．９％
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found = 712.9, calculated for [(M-H)-] = 713.1

【0119】

［実施例３］
本例では、配列番号１〜２１のアプタマーについて、ｓＩｇＡに対する結合能および動態パラメータを、ＳＰＲにより確認した。

【0120】

（１）アプタマー
下記ポリヌクレオチドを合成し、実施例のアプタマーとした。配列番号１〜４のアプタマー（以下、「ＭＫ４アプタマー」ともいう）は、下記表３において下線で示すアデニンを含むヌクレオチド残基が、前記化学式（１）で示すヌクレオチド残基である。また、配列番号８〜１２および１６〜２１のアプタマー（以下、「ＫＳ９アプタマー」ともいう）は、下記表３において下線で示すチミンを含むヌクレオチド残基が、前記化学式（２）で示すヌクレオチド残基であり、配列番号５〜７および１３〜１５のアプタマー（以下、「ＮＧ７アプタマー」ともいう）は、下記表３において下線で示すチミンを含むヌクレオチド残基が、前記化学式（３）で示すヌクレオチド残基である。

【0121】

【表3】

【0122】

前記ＭＫ４アプタマーは、その３’末端に、２０塩基長のポリデオキシチミン（ポリｄＴ）を付加し、ポリｄＴ付加アプタマーとして、後述するＳＰＲに使用した。前記ＫＳ９アプタマーおよび前記ＮＧ７アプタマーは、その３’末端に、２０塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＳＰＲに使用した。

【0123】

（２）試料
市販のヒトｓＩｇＡ（IgA (Secretory) ,Human、MP Biomedicals, LLC-Cappel Products社製、カタログ番号： #55905）を、試料として、以下の試験に使用した。

【0124】

（３）ＳＰＲによる結合能の解析
結合能の解析には、ProteON XPR36（BioRad社）を、その使用説明書にしたがって使用した。

【0125】

まず、前記ProteON専用のセンサーチップとして、ストレプトアビジンが固定化されたチップ（商品名 ProteOn NLC Sensor Chip、BioRad社）を、前記ProteON XPR36にセットした。前記センサーチップのフローセルに、超純水（ＤＤＷ）を用いて、５μｍｏｌ／Ｌのビオチン化ポリｄＡをインジェクションし、シグナル強度（ＲＵ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔ）が約９００ＲＵになるまで結合させた。前記ビオチン化ポリｄＡは、２０塩基長のデオキシアデノシンの５’末端をビオチン化して調製した。そして、前記チップの前記フローセルに、ＳＰＲバッファーを用いて、２００ｎｍｏｌ／Ｌの前記ポリｄＴを付加したＭＫ４アプタマーを、流速２５μＬ／ｍｉｎで８０秒間インジェクションし、シグナル強度が約８００ＲＵになるまで結合させた。この結果を、アプタマーのセンサーチップへの固層化量を示すシグナルとして、アプタマー固層化測定値（Ａ）という。続いて、前記試料を、ＳＰＲバッファーを用いて、流速５０μＬ／ｍｉｎで１２０秒間インジェクションし、引き続き、同じ条件で、ＳＰＲバッファーを流して洗浄を３００秒間行った。前記試料における前記ヒトｓＩｇＡ濃度は、４００ｎｍｏｌ／Ｌとした。前記試料のインジェクションおよび前記ＳＰＲバッファーによる洗浄に並行して、シグナル強度の測定を行った。インジェクション開始を０秒として、１１５〜１２５秒の間におけるシグナル強度の平均値を求め、これを、前記アプタマーとタンパク質との結合量を示すシグナルとして、タンパク質結合測定値（Ｂ）という。そして、タンパク質結合測定値（Ｂ）をアプタマー固層化測定値（Ａ）で割った値（Ｂ／Ａ）を、相対値（Relative Unit）として求めた。また、前記ＫＳ９アプタマーおよび前記ＮＧ７アプタマーは、前記ビオチン化ポリｄＡに代えて、２０塩基長のデオキシチミジンの５’末端をビオチン化して調製したビオチン化ポリｄＴを、前記ＭＫ４アプタマーに代えて、前記ＫＳ９アプタマーまたは前記ＮＧ７アプタマーを用いた以外は、同様にして測定した。さらに、比較例３−１は、前記ＭＫ４アプタマーに代えて、ｓＩｇＡに結合性を示さないネガティブコントロールの核酸分子（配列番号２２）を用い、比較例３−２は、ヒトｓＩｇＡに代えてＢＳＡ（Bovine Serum Albumin、SIGMA社製、カタログ番号：#A7906）を含む試料を用いた以外は同様にして、シグナル強度の測定を行った。

【0126】

ネガティブコントロールの核酸分子（N30-0 pool）
5’-GGTAACGCCCAGTCTAGGTCATTTG-(N)₃₀-GTTACGGGAGCCTGCACTTAATG-3’（配列番号２２）

【0127】

前記ＳＰＲバッファーの組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ_２および０．０１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とし、ｐＨは、７．４とした。

【0128】

各アプタマーとｓＩｇＡとの結合の結果を図１Ａ〜Ｆに示す。図１Ａ〜Ｆは、各アプタマーのｓＩｇＡに対する結合能を示すグラフである。図１において、横軸は、試料をインジェクション後の経過時間を示し、縦軸は、結合力の相対値（ＲＵ）を示す。図１Ａ〜Ｆに示すように、いずれのアプタマーも、ｓＩｇＡに結合した。

【0129】

つぎに、タンパク質結合測定値（Ｂ）をアプタマー固層化測定値（Ａ）で割った値（Ｂ／Ａ）を、相対値（Relative Unit）の結果を図２Ａ〜Ｄに示す。図２Ａ〜Ｄは、各アプタマーのｓＩｇＡへの結合量の相対値（Relative Unit）を示すグラフである。図２において、横軸は、アプタマーの種類を示し、縦軸は、相対値を示す。図２Ａ〜Ｄに示すように、ＢＳＡを用いた比較例３−２では結合が確認できなかった。また、ネガティブコントロールの核酸分子を用いた比較例３−１では、ｓＩｇＡへの結合が確認されなかった。これに対し、いずれのアプタマーも、ｓＩｇＡに結合した。中でも、配列番号１５および配列番号２１の核酸分子が、極めて高い結合性を示した。

【0130】

（４）解離定数の測定
前記試料中のｓＩｇＡの濃度を、１２．５、２５、５０、１００、または２００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記（３）と同様にして、結合量の相対値（ＲＵ）を測定した。そして、前記結合量の相対値に基づき、前記ｓＩｇＡ結合核酸分子と前記ｓＩｇＡとの解離定数を算出した。この結果を下記表４に示す。下記表４に示すように、いずれのアプタマーも解離定数が３７．７ｎＭ以下であり、特に、配列番号２、配列番号３、配列番号９、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１９、および配列番号２１の核酸分子は、解離定数が、８ｎＭ以下であり、極め優れたｓＩｇＡとの結合能を有することがわかった。

【0131】

【表4】

【0132】

（５）公差性の確認
配列番号３、５および９のアプタマーを用い、試料として、４００ｎｍｏｌ／ＬとなるようにｓＩｇＡ、ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（比較例３−３、BETHYL社製、カタログ番号：P-80-104）、未標識ヒトＩｇＧ（比較例３−４、BECKMAN COULTER社製、カタログ番号：731696）、未標識ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（比較例３−５、BECKMAN COULTER社製、カタログ番号：731703）またはヒトＩｇＧ１κ（比較例３−６、Southern Biotech社製、カタログ番号：0151K-01）を含む試料を用いた以外は、前記（３）と同様にして、結合量の相対値を求めた。

【0133】

この結果を図３に示す。図３は、結合量の相対値を示すグラフである。図３において、横軸は、試料の種類を示し、縦軸は、結合量の相対値（ＲＵ）を示す。図３に示すように、いずれのアプタマーも、ｓＩｇＡ以外の免疫グロブリンには結合しなかった。これらのことから、本発明の核酸分子が、ｓＩｇＡ特異的であることがわかった。

【0134】

［実施例４］
本例では、配列番号５、９および１１のアプタマーについて、ｓＩｇＡに対する結合能を、磁気ビーズによるプルダウンにより確認した。

【0135】

（１）アプタマー結合ビーズ
磁気ビーズの表面にストレプトアビジン（ＳＡ）が結合したＳＡビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、商品名：ＭｙＯｎｅ−ＳＡ Ｃ１）に、前記配列番号５、９または１１のアプタマーを結合させ、アプタマー結合ビーズを作製した。具体的には、まず、前記アプタマーに１００％相補的な相補鎖を調製した。他方、前記アプタマーの５’領域の配列（配列番号２３、5’-GGATACCTTAACGCCGCCTATTG-3’）を準備し、その５’末端をビオチン化して、ビオチン化プライマーを調製した。そして、前記相補鎖を鋳型として、前記ビオチン化プライマーを用い、ＰＣＲによる増幅を行い、５’末端がビオチン化された前記アプタマーを合成した。前記合成された前記アプタマーと前記相補鎖とからなる二本鎖に対して、前記ＳＡビーズを反応させ、前記二本鎖におけるビオチンと前記ＳＡビーズのアビジンとを結合させた。つぎに、前記二本鎖とＳＡビーズとが結合した複合体を、ＮａＯＨでアルカリ処理し、前記二本鎖の解離を行うことによって、前記相補鎖を除去した。これによって、前記ＳＡビーズに、ビオチン−アビジン結合により前記ビオチン化アプタマーが結合した、前記アプタマー結合ビーズを作製した。

【0136】

（２）試料
５μｇのヒトｓＩｇＡまたはヒトの唾液を、試料として、以下の実験に使用した。

【0137】

（３）プルダウンアッセイ
前記アプタマー結合ビーズ（終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）と前記試料（ｓＩｇＡ：終濃度５０μｇ／ｍＬ、唾液：終濃度９０％）とを、ＳＢ１Ｔ緩衝液（４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ_２および０．０１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．４）中で混合し、この反応液を、室温で３０分間反応させた。前記反応液を遠心して前記ビーズを回収し、前記ＳＢ１Ｔ緩衝液で３回遠心洗浄した。前記アプタマーがｓＩｇＡに結合する場合、前記ビーズには、前記アプタマーを介してｓＩｇＡが結合していることになる。そこで、前記ビーズをＳＤＳバッファー緩衝液に混合し、９５℃で１０分間、加熱処理することによって、前記ビーズからｓＩｇＡを遊離させた。そして、加熱処理後の前記ＳＤＳ緩衝液から、前記ビーズを除去して、ＰＡＧＥＬ（Ｃ５２０Ｌ、アトー社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動用のバッファーは、前記ＳＤＳバッファーを使用した。前記ＳＤＳバッファーの組成は、２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、１９２ｍｍｏｌ／Ｌ グリシン、０．１％ ＳＤＳとした。

【0138】

つぎに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルについて、ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用いて染色を行った。なお、分子量マーカーとして、Ｂｅｎｃｈ Ｍａｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した。また、コントロール１として、前記アプタマー結合ビーズに代えて、前記ビオチン化プライマーを結合させた前記ＳＡビーズを使用した以外は、同様にして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと検出とを行った。また、コントロール２として、前記ヒトｓＩｇＡについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと検出とを行った。

【0139】

これらの結果を図４に示す。図４（Ａ）および（Ｂ）は、前記アプタマー結合ビーズから遊離させたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図４（Ａ）は、ｓＩｇＡを含む試料を用いた結果を示し、（Ｂ）は、唾液を用いた結果を示す。図４（Ａ）および（Ｂ）において、写真の左側が、分子量を示し、レーンＭは、分子量マーカー（Ｍ）、レーン１は、配列番号５のアプタマーを結合させた前記アプタマー結合ビーズを用いた結果、レーン２は、配列番号９のアプタマーを結合させた前記アプタマー結合ビーズを用いた結果、レーン３は、配列番号１１のアプタマーを結合させた前記アプタマー結合ビーズを用いた結果、レーンＣ１は、前記プライマーを結合させた前記ＳＡビーズを用いた結果、レーンＩｇＡは、ヒトｓＩｇＡの結果である。

【0140】

図４（Ａ）および（Ｂ）に示すように、前記アプタマー結合ビーズを用いたレーン１〜３は、ｓＩｇＡを示すレーンＩｇＡと同じ部位にバンドが確認された（図において矢印で示すバンド）。他方、前記プライマー結合ビーズを用いた場合、ｓＩｇＡと同じ部位にバンドは確認できなかった。

【0141】

これらの結果から、本発明のアプタマーは、前記ヒトｓＩｇＡに対して、結合性を示すことがわかった。

【0142】

以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。

【0143】

この出願は、２０１６年９月１５日に出願された日本出願特願２０１６−１８０８９２を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。

【産業上の利用可能性】

【0144】

本発明のｓＩｇＡ結合核酸分子は、ｓＩｇＡに対して前述のような解離定数で結合することができる。このため、本発明のｓＩｇＡ結合核酸分子によれば、例えば、試料中のｓＩｇＡとの結合の有無によって、優れた精度で、ｓＩｇＡを検出できる。したがって、本発明のｓＩｇＡ結合核酸分子は、例えば、予防医学、健康管理、感染症等の診断、およびストレスの診断等の分野におけるｓＩｇＡの検出に、極めて有用なツールといえる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]