特許 6796057 Ｈ因子結合タンパク質変異体及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6796057

(24)【登録日】2020年11月17日

(45)【発行日】2020年12月2日

(54)【発明の名称】Ｈ因子結合タンパク質変異体及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/31 20060101AFI20201119BHJP

   C07K 14/22 20060101ALI20201119BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20201119BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20201119BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20201119BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20201119BHJP

   A61K 39/095 20060101ALI20201119BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20201119BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20201119BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/31ZNA

   C07K14/22

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K39/39

   A61K39/095

   A61P31/04

   A61P37/04

【請求項の数】22

【全頁数】59

(21)【出願番号】特願2017-503089(P2017-503089)

(86)(22)【出願日】2015年7月22日

(65)【公表番号】特表2017-522877(P2017-522877A)

(43)【公表日】2017年8月17日

(86)【国際出願番号】US2015041616

(87)【国際公開番号】WO2016014719

(87)【国際公開日】20160128

【審査請求日】2018年7月20日

(31)【優先権主張番号】62/028,123

(32)【優先日】2014年7月23日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】505307563

【氏名又は名称】チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100114889

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 義弘

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】ベールニンク ピーター ティー．

【審査官】 坂井田 京

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１４−５０３１７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／０２５６１８０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Peter T. Beernink et al.，The Journal of Immunology，２０１１年，Vol.186，p.3606-3614

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １４／００−１４／８２５

Ｃ１２Ｎ １５／０９−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

変異体群１（ｖ．１）Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）であって、該ｖ．１ ｆＨｂｐが、
（ａ）アミノ酸２４８でのヒスチジンからロイシンへの置換（Ｈ２４８Ｌ）、または
（ｂ）アミノ酸２２３でのセリンからアルギニンへの置換（Ｓ２２３Ｒ）
を含み、
該アミノ酸置換が、ｆＨｂｐ ＩＤ１（配列番号１）に対するものであり、
該ｖ．１ ｆＨｂｐが、配列番号１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該ｖ．１ ｆＨｂｐが、ヒトＨ因子（ｆＨ）と、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ１の親和性の５０％以下の親和性で結合し、
該ｖ．１ ｆＨｂｐが、哺乳類宿主において、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）の少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導する、ｖ．１ ｆＨｂｐ。

【請求項2】

Ｒ４１Ｓ及びＲ４１Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を更に含む、請求項１に記載のｖ．１ ｆＨｂｐ。

【請求項3】

前記ｖ．１ ｆＨｂｐが、以下のアミノ酸置換：Ｓ２２３Ｒを含む、請求項１に記載のｖ．１ ｆＨｂｐ。

【請求項4】

前記ｖ．１ ｆＨｂｐが、以下のアミノ酸置換：Ｓ２２３ＲおよびＲ４１ＳまたはＲ４１Ａを含む、請求項１に記載のｖ．１ ｆＨｂｐ。

【請求項5】

前記ｖ．１ ｆＨｂｐが、以下のアミノ酸置換：Ｈ２４８ＬおよびＲ４１ＳまたはＲ４１Ａを含む、請求項１に記載のｖ．１ ｆＨｂｐ。

【請求項6】

前記ｖ．１ ｆＨｂｐが、配列番号１と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｖ．１ ｆＨｂｐ。

【請求項7】

変異体群２（ｖ．２）Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）であって、該ｖ．２ ｆＨｂｐが、以下：
（ａ）位置２２０のグリシン（Ｇ２２０）のアミノ酸置換であって、該Ｇ２２０のアミノ酸置換が、Ｇ２２０Ｓである、アミノ酸置換；
（ｂ）位置２１９のリジン（Ｋ２１９）のアミノ酸置換であって、該Ｋ２１９のアミノ酸置換が、Ｋ２１９Ｎである、アミノ酸置換；
（ｃ）アミノ酸１２９のフェニルアラニンに対するセリン置換（Ｆ１２９Ｓ）；
（ｄ）アミノ酸１２１のアスパラギン酸に対するグリシン置換（Ｄ１２１Ｇ）；
（ｅ）アミノ酸１２８のセリンに対するトレオニン置換（Ｓ１２８Ｔ）；および
（ｆ）位置１３１のバリン（Ｖ１３１）のアミノ酸置換であって、該Ｖ１３１のアミノ酸置換が、Ｖ１３１Ｄである、アミノ酸置換
から選択されるアミノ酸置換を含み、
該アミノ酸置換が、ｆＨｂｐ ＩＤ２２（配列番号２）に対するものであり、
該ｖ．２ ｆＨｂｐが、配列番号２と９０％より高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該ｖ．２ ｆＨｂｐが、ヒトＨ因子（ｆＨ）と、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下の親和性で結合し、
該ｖ．２ ｆＨｂｐが、哺乳類宿主において殺菌性抗体反応を誘導する、ｖ．２ ｆＨｂｐ。

【請求項8】

前記ｖ．２ ｆＨｂｐが、置換：Ｇ２２０Ｓ、Ｌ１３０ＲおよびＧ１３３Ｄを含み、該アミノ酸置換が、ｆＨｂｐ ＩＤ２２に対するものである、請求項７に記載のｖ．２ ｆＨｂｐ。

【請求項9】

前記ｖ．２ ｆＨｂｐが、アミノ酸置換：Ｋ２１９Ｎ、Ｌ１３０ＲおよびＧ１３３Ｄを含み、該アミノ酸置換が、ｆＨｂｐ ＩＤ２２に対するものである、請求項７に記載のｖ．２ ｆＨｂｐ。

【請求項10】

前記ｖ．２ ｆＨｂｐが、配列番号２と９５％を超えるアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載のｖ．２ ｆＨｂｐ。

【請求項11】

前記ｖ．２ ｆＨｂｐが、配列番号２と９９％を超えるアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載のｖ．２ ｆＨｂｐ。

【請求項12】

変異体群１（ｖ．１）Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）であって、該ｖ．１ ｆＨｂｐが、
（ａ）位置２４８のヒスチジンのロイシンへのアミノ酸置換（Ｈ２４８Ｌ）、または
（ｂ）位置２２３のセリンのアルギニンへのアミノ酸置換（Ｓ２２３Ｒ）
を含み、
該アミノ酸置換が、ｆＨｂｐ ＩＤ５５（配列番号３）に対するものであり、
該ｖ．１ ｆＨｂｐが、配列番号３と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該ｖ．１ ｆＨｂｐが、ヒトＨ因子（ｆＨ）と、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ５５の親和性の５０％未満の親和性で結合し、
該ｖ．１ ｆＨｂｐが、哺乳類宿主において殺菌性抗体反応を誘導する、ｖ．１ ｆＨｂｐ。

【請求項13】

前記ｖ．１ ｆＨｂｐが、配列番号３と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のｖ．１ ｆＨｂｐ。

【請求項14】

（ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載のｖ．１ ｆＨｂｐ、請求項７〜１１のいずれか一項に記載のｖ．２ ｆＨｂｐ、または請求項１２〜１３のいずれか一項に記載のｖ．１ ｆＨｂｐ；及び
（ｂ）医薬的に許容される賦形剤
を含む、免疫原性組成物。

【請求項15】

前記医薬的に許容される賦形剤がアジュバントを含む、請求項１４に記載の免疫原性組成物。

【請求項16】

前記アジュバントがリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムである、請求項１５に記載の免疫原性組成物。

【請求項17】

前記ｖ．１ ｆＨｂｐまたはｖ．２ ｆＨｂｐが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株から調製される小胞調製物にある、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項18】

Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの表面プロテインＡを更に含む、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項19】

請求項１〜６のいずれか一項に記載のｖ．１ ｆＨｂｐ、請求項７〜１１のいずれか一項に記載のｖ．２ ｆＨｂｐ、または請求項１２〜１３のいずれか一項に記載のｖ．１ ｆＨｂｐをコードする核酸。

【請求項20】

請求項１９に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。

【請求項21】

請求項１９に記載の核酸、または請求項２０に記載の組換え発現ベクターを含む、インビトロ宿主細胞。

【請求項22】

哺乳類でのＮ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）に対する抗体反応を誘発するための方法における使用のための、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０１４年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／０２８，１２３号の利益を主張し、該仮出願は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

緒言
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）は、ヒト上気道にコロニーを形成するグラム陰性細菌であり、世界規模の散発性で周期的な集団発生、中でも注目すべきは髄膜炎及び敗血症の集団発生の原因である。その発病率及び罹患率は、２歳未満の小児で最も高い。他のグラム陰性細菌と同様、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは通常、細胞質膜、ペプチドグリカン層、外膜を有し、これらは莢膜多糖とともに細菌細胞壁を構成し、また、外部環境に突出する腺毛を有する。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの莢膜保有株は、小児および若年成人における細菌性髄膜炎および敗血症の主な原因である。侵襲性Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染症の流行及び経済的重要性によって、異なる菌株にわたる、特に、異なる血清型または血清亜型を有する遺伝的に多様な血清群Ｂ株にわたる免疫を与えることができる有効なワクチンについての研究が促されてきた。

【0003】

Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ、当技術分野では、リポタンパク質２０８６（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ （２００４） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２：２０８８−２１００（非特許文献1））、ゲノム由来ナイセリア抗原（ＧＮＡ）１８７０（Ｍａｓｉｇｎａｎｉ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９７：７８９−９９（非特許文献2））または「７４１」とも呼ばれる）は、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）のタンパク質であって、表面が露出したリポタンパク質として、該細菌で発現する。ｆＨｂｐの重要な機能は、ヒト補体因子Ｈ（ｆＨ）と結合することであって、これが補体活性化を下方制御する。該細菌表面へのｆＨの結合は、該病原菌が免疫されていないヒト血清または血液中で生存し、生来の宿主防御から逃れる重要な機序である。近年、ヒトＨ因子遺伝子クラスターの遺伝的変異が、髄膜炎菌性疾患の発症に対する感受性に影響を及ぼすことが見出された（Ｄａｖｉｌａ Ｓ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ．６４０（非特許文献3））。ｆＨｂｐへのｆＨの結合は、ヒトｆＨ、及び一部の非ヒト霊長類に対して特異的であり、なぜＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓが専らヒト病原菌であるかが部分的に説明できる。ｆＨｂｐは、多くの天然配列変異体の状態で生じ、これらは、インターネット上のｆＨｂｐデータベース、ｐｕｂｍｌｓｔ（ｄｏｔ）ｏｒｇ／ｎｅｉｓｓｅｒｉａ／ｆＨｂｐにて与えられる登録（ＩＤ）番号で表される。

【0004】

効果的な殺菌性抗体反応を誘発することができるｆＨｂｐポリペプチドに対する必要性がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ （２００４） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２：２０８８−２１００

【非特許文献2】Ｍａｓｉｇｎａｎｉ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９７：７８９−９９

【非特許文献3】Ｄａｖｉｌａ Ｓ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ．６４０

【発明の概要】

【0006】

概要
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対して殺菌性である抗体を誘発できる変異体Ｈ因子結合タンパク質、かかるタンパク質を含む組成物、及びかかるタンパク質の使用方法を提供する。

【0007】

特徴
本開示は、Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）ＩＤ１の変異体を提供する。本開示は、ｆＨｂｐの変異体であって：（ａ）アミノ酸３８のグルタミン（Ｑ３８）のアミノ酸置換；（ｂ）アミノ酸９２のグルタミン酸（Ｅ９２）のアミノ酸置換；（ｃ）アミノ酸１３０のアルギニンに対するグリシン置換（Ｒ１３０Ｇ）；（ｄ）アミノ酸２２３のセリン（Ｓ２２３）のアミノ酸置換；及び（ｅ）アミノ酸２４８のロイシンに対するヒスチジン置換（Ｈ２４８Ｌ）のうちの少なくとも１つから選択されるアミノ酸置換を含む変異体を提供するとともに、該アミノ酸置換は、ｆＨｂｐ ＩＤ１（配列番号１）に対するものであり、該変異体は、配列番号１と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトＨ因子（ｆＨ）と、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ１の親和性の５０％以下の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導する。一部の例では、Ｑ３８でのアミノ酸置換はＱ３８Ｒ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８Ｈ、Ｑ３８Ｆ、Ｑ３８Ｙ、またはＱ３８Ｗである。一部の例では、Ｅ９２でのアミノ酸置換は、Ｅ９２Ｋ、Ｅ９２Ｒ、Ｅ９２Ｈ、Ｅ９２Ｆ、Ｅ９２Ｙ、またはＥ９２Ｗである。一部の例では、Ｓ２２３でのアミノ酸置換は、Ｓ２２３Ｒ、Ｓ２２３Ｋ、Ｓ２２３Ｈ、Ｓ２２３Ｆ、Ｓ２２３Ｙ、またはＳ２２３Ｗである。一部の例では、変異体ｆＨｂｐは、さらに、ｆＨｂｐ ＩＤ１に対して、Ｒ４１ＳまたはＲ４１Ａの置換を含んでよい。例えば、変異体ｆＨｂｐは、ｆＨｂｐ ＩＤ１に対して、Ｒ４１ＳまたはＲ４１Ａの置換及びＳ２２３での置換、例えば、Ｒ４１Ｓ／Ｓ２２３Ｒを含んでよい。他の例では、変異体ｆＨｂｐは、さらに、ｆＨｂｐ ＩＤ１に対して、Ｒ４１ＳまたはＲ４１Ａの置換及びＨ２４８Ｌの置換を含んでよい。ある例では、変異体ｆＨｂｐは、本明細書に開示の置換の２つ、３つ、またはそれより多くを含んでよい。特定の例では、変異体ｆＨｂｐは、ｆＨｂｐ ＩＤ１に対して、置換Ｓ２２３Ｒ及びＨ２４８Ｌを含んでよい。一部の例では、変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ１の親和性の２５％以下の親和性でヒトｆＨに結合する。一部の例では、変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ１の親和性の１０％以下の親和性でヒトｆＨに結合する。一部の例では、変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ１の親和性の５％以下の親和性でヒトｆＨに結合する。

【0008】

本開示は、ｆＨｂｐ ＩＤ２２の変異体を提供する。本開示は、ｆＨｂｐの変異体であって：（ａ）アミノ酸１１５のアスパラギンに対するイソロイシン置換（Ｎ１１５Ｉ）；（ｂ）アミノ酸１２１のアスパラギン酸に対するグリシン置換（Ｄ１２１Ｇ）；（ｃ）アミノ酸１２８のセリンに対するトレオニン置換（Ｓ１２８Ｔ）；（ｄ）位置１３１のバリン（Ｖ１３１）のアミノ酸置換；（ｅ）位置２１９のリジン（Ｋ２１９）のアミノ酸置換；（ｆ）位置２２０のグリシン（Ｇ２２０）のアミノ酸置換から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体を提供するとともに、該アミノ酸置換は、ｆＨｂｐ ＩＤ２２（配列番号２）に対するものであり、該変異体は、配列番号２と８５％より高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトＨ因子（ｆＨ）と、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において殺菌性抗体反応を誘導する。一部の例では、変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の２５％以下の親和性でヒトｆＨに結合する。一部の例では、変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の１０％以下の親和性でヒトｆＨに結合する。一部の例では、変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５％以下の親和性でヒトｆＨに結合する。一部の例では、Ｖ１３１でのアミノ酸置換は、Ｖ１３１Ｄ、Ｖ１３１Ｅ、Ｖ１３１Ｋ、Ｖ１３１Ｒ、Ｖ１３１Ｈ、Ｖ１３１Ｆ、Ｖ１３１Ｙ、またはＶ１３１Ｗである。一部の例では、Ｋ２１９でのアミノ酸置換は、Ｋ２１９Ｎ、Ｋ２１９Ｑ、Ｋ２１９Ｄ、Ｋ２１９Ｅ、Ｋ２１９Ｆ、Ｋ２１９Ｙ、またはＫ２１９Ｗである。一部の例では、Ｇ２２０でのアミノ酸置換は、Ｇ２２０Ｓ、Ｇ２２０Ｎ、Ｇ２２０Ｑ、Ｇ２２０Ｄ、Ｇ２２０Ｅ、Ｇ２２０Ｋ、Ｇ２２０Ｒ、Ｇ２２０Ｈ、Ｇ２２０Ｆ、Ｇ２２０Ｙ、またはＧ２２０Ｗである。

【0009】

一部の例では、変異体ｆＨｂｐは、野生型（ＷＴ）ｆＨｂｐ、例えば、ＷＴ ｆＨｂｐ ＩＤ２２の熱安定性と比較して該変異体ｆＨｂｐの熱安定性を高める二重変異を含む。一部の例では、変異体ｆＨｂｐは、ｆＨｂｐ ＩＤ２２（配列番号２）に対してＬ１３０Ｒ及びＧ１３３Ｄの置換を含んでよく、該変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と８５％より高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトＨ因子（ｆＨ）と、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体は、ｆＨｂｐ ＩＤ２２の熱安定性と比較して高い熱安定性を有する。一部の例では、変異体ｆＨｂｐは、置換の組合せ、例えば、Ｌ１３０Ｒ、Ｇ１３３Ｄ、並びに：（ａ）Ｎ１１５Ｉ；（ｂ）Ｄ１２１Ｇ；（ｃ）Ｓ１２８Ｔ；（ｄ）Ｖ１３１；（ｅ）Ｋ２１９（例えば、Ｋ２１９Ｎ）；及び（ｆ）Ｇ２２０（例えば、Ｇ２２０Ｓ）から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでよいとともに、該アミノ酸置換は、ｆＨｂｐ ＩＤ２２（配列番号２）に対するものであり、該変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と８５％より高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトＨ因子（ｆＨ）と、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において殺菌性抗体反応を誘導する。変異体ｆＨｂｐの熱安定性は、ＷＴ ｆＨｂｐ（例えば、ｆＨｂｐ ＩＤ２２）より、少なくとも５℃、１０℃、１５℃、２０℃、またはそれより高い、例えば、５℃〜３０℃、５℃〜２５℃、５℃〜２０℃、１０℃〜２０℃、もしくは１５℃〜２０℃高いことがある。本明細書で用いられる「熱安定性」は、高温にさらされた場合のタンパク質の安定性を指し；熱安定性変異体タンパク質は、その立体構造を野生型タンパク質より高温で維持する。例えば、野生型（ＷＴ）ｆＨｂｐ、例えば、ＷＴ ｆＨｂｐ ＩＤ２２の熱安定性と比較して熱安定性を高める二重変異を含む変異体ｆＨｂｐは、ＷＴ ｆＨｂｐと比較して高温で変性しうる。ある例では、変異体ｆＨｂｐのＮ末端ドメインは、ＷＴ ｆＨｂｐ（例えば、ｆＨｂｐ ＩＤ２２）のＮ末端ドメインより高温で変性しうる。

【0010】

ＷＴ ｆＨｂｐと比較して熱安定性を高める変異を含み、さらに、ｆＨの結合を低減することが知られるさらなる変異、例えば、ＵＳ２０１１／０２５６１８０に開示の変異を含むｆＨｂｐ変異体もまた本明細書に開示する。ある実施形態では、Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）の変異体を開示するとともに、該変異体は、ｆＨｂｐ ＩＤ２２（配列番号２）に対して、アミノ酸置換Ｌ１３０Ｒ及びＧ１３３Ｄ、並びに置換Ｒ８０Ａ、Ｄ２１１Ａ、Ｅ２１８Ａ、Ｅ２４８Ａ、Ｇ２３６Ｉ、Ｔ２２１Ａ、及びＨ２２３Ａのうちの少なくとも１つを含み、該変異体は、配列番号２と８５％より高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトＨ因子（ｆＨ）と、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において殺菌性抗体反応を誘導する。

【0011】

本開示は、ｆＨｂｐ ＩＤ５５の変異体を提供する。本開示は、ｆＨｂｐの変異体であって：（ａ）位置９２のグルタミン酸（Ｅ９２）のアミノ酸置換；（ｂ）位置２２３のセリン（Ｓ２２３）のアミノ酸置換；及び（ｃ）位置２４８のヒスチジン（Ｈ２４８）のアミノ酸置換からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体を提供するとともに、該アミノ酸置換は、ｆＨｂｐ ＩＤ５５（配列番号３）に対するものであり、該変異体は、配列番号３と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトＨ因子（ｆＨ）と、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ５５の親和性の５０％未満の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において殺菌性抗体反応を誘導する。一部の例では、変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ５５の親和性の２５％以下の親和性で結合する。一部の例では、変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ５５の親和性の１０％以下の親和性で結合する。一部の例では、変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ５５の親和性の５％以下の親和性で結合する。一部の例では、Ｅ９２でのアミノ酸置換は、Ｅ９２Ｋ、Ｅ９２Ｒ、Ｅ９２Ｈ、Ｅ９２Ｆ、Ｅ９２Ｙ、またはＥ９２Ｗである。一部の例では、Ｓ２２３でのアミノ酸置換は、Ｓ２２３Ｒ、Ｓ２２３Ｋ、Ｓ２２３Ｈ、Ｓ２２３Ｆ、Ｓ２２３Ｙ、またはＳ２２３Ｗである。一部の例では、Ｈ２４８でのアミノ酸置換は、Ｈ２４８Ｌ、Ｈ２４８Ｉ、Ｈ２４８Ｖ、Ｈ２４８Ｄ、Ｈ２４８Ｅ、Ｈ２４８Ｆ、Ｈ２４８Ｙ、またはＨ２４８Ｗである。

【0012】

本開示は、本開示の変異体ｆＨｂｐを含む免疫原性組成物を提供する。本開示は：（ａ）上記段落０００７〜００１１のいずれか１つの段落に記載の変異体ｆＨｂｐ；及び（ｂ）医薬的に許容される賦形剤を含む免疫原性組成物を提供する。一部の例では、ｆＨｂｐ変異体は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株から調製される小胞調製物中にある。一部の例では、医薬的に許容される賦形剤は、アジュバントを含み；例えば、アジュバントはリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムである。一部の例では、医薬組成物は、さらに、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの表面プロテインＡを含む。

【0013】

本開示は、上記段落０００７〜００１１のいずれか１つの段落に記載の変異体ｆＨｂｐをコードする核酸を提供する。本開示は、上記段落０００７〜００１１のいずれか１つの段落に記載の変異体ｆＨｂｐをコードする核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。本開示は、上記段落０００７〜００１１のいずれか１つの段落に記載の変異体ｆＨｂｐをコードする核酸を含むインビトロ宿主細胞を提供する。本開示は、上記段落０００７〜００１１のいずれか１つの段落に記載の変異体ｆＨｂｐをコードする核酸を含む組換え発現ベクターを含むインビトロ宿主細胞を提供する。

【0014】

本開示は、哺乳類における抗体反応の誘発方法であって、上記段落００１２の免疫原性組成物を哺乳類に投与する段階を含む方法を提供する。一部の例では、哺乳類はヒトである。一部の例では、抗体反応は、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１つまたは複数の菌株に対する殺菌性抗体反応である。
[本発明1001]
Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）の変異体であって、該変異体が、以下：
（ａ）アミノ酸38のグルタミン（Ｑ38）のアミノ酸置換；
（ｂ）アミノ酸92のグルタミン酸（Ｅ92）のアミノ酸置換；
（ｃ）アミノ酸130のアルギニンに対するグリシン置換（Ｒ130Ｇ）；
（ｄ）アミノ酸223のセリン（Ｓ223）のアミノ酸置換；及び
（ｅ）アミノ酸248のロイシンに対するヒスチジン置換（Ｈ248Ｌ）
のうちの少なくとも1つから選択されるアミノ酸置換を含み、
該アミノ酸置換が、ｆＨｂｐ ＩＤ1（配列番号1）に対するものであり、
該変異体が、配列番号1と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該変異体ｆＨｂｐが、ヒトＨ因子（ｆＨ）と、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ1の親和性の50％以下の親和性で結合し、
該変異体が、哺乳類宿主において、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）の少なくとも1菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導する、変異体。
[本発明1002]
Ｑ38での前記アミノ酸置換が、Ｑ38Ｒ、Ｑ38Ｋ、Ｑ38Ｈ、Ｑ38Ｆ、Ｑ38Ｙ、またはＱ38Ｗである、本発明1001の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1003]
Ｅ92での前記アミノ酸置換が、Ｅ92Ｋ、Ｅ92Ｒ、Ｅ92Ｈ、Ｅ92Ｆ、Ｅ92Ｙ、またはＥ92Ｗである、本発明1001の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1004]
Ｓ223での前記アミノ酸置換が、Ｓ223Ｒ、Ｓ223Ｋ、Ｓ223Ｈ、Ｓ223Ｆ、Ｓ223Ｙ、またはＳ223Ｗである、本発明1001の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1005]
ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ1の親和性の25％以下の親和性で結合する、本発明1001の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1006]
ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ1の親和性の10％以下の親和性で結合する、本発明1001の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1007]
ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ1の親和性の5％以下の親和性で結合する、本発明1001の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1008]
Ｒ41Ｓ及びＲ41Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を更に含む、本発明1001〜1007のいずれかの変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1009]
以下のアミノ酸置換Ｓ223Ｒ及びＨ248Ｌを更に含む、本発明1001〜1008のいずれかの変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1010]
Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）の変異体であって、該変異体が、以下：
（ａ）アミノ酸115のアスパラギンに対するイソロイシン置換（Ｎ115Ｉ）；
（ｂ）アミノ酸121のアスパラギン酸に対するグリシン置換（Ｄ121Ｇ）；
（ｃ）アミノ酸128のセリンに対するトレオニン置換（Ｓ128Ｔ）；
（ｄ）位置131のバリン（Ｖ131）のアミノ酸置換；
（ｅ）位置219のリジン（Ｋ219）のアミノ酸置換；
（ｆ）位置220のグリシン（Ｇ220）のアミノ酸置換
から選択されるアミノ酸置換を含み、
該アミノ酸置換が、ｆＨｂｐ ＩＤ22（配列番号2）に対するものであり、
該変異体が、配列番号2と85％より高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該変異体ｆＨｂｐが、ヒトＨ因子（ｆＨ）と、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ22の親和性の50％以下の親和性で結合し、
該変異体が、哺乳類宿主において殺菌性抗体反応を誘導する、変異体。
[本発明1011]
ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ22の親和性の25％以下の親和性で結合する、本発明1010の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1012]
ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ22の親和性の10％以下の親和性で結合する、本発明1010の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1013]
ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ22の親和性の5％以下の親和性で結合する、本発明1010の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1014]
Ｖ131での前記アミノ酸置換が、Ｖ131Ｄ、Ｖ131Ｅ、Ｖ131Ｋ、Ｖ131Ｒ、Ｖ131Ｈ、Ｖ131Ｆ、Ｖ131Ｙ、またはＶ131Ｗである、本発明1010の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1015]
Ｋ219での前記アミノ酸置換が、Ｋ219Ｎ、Ｋ219Ｑ、Ｋ219Ｄ、Ｋ219Ｅ、Ｋ219Ｆ、Ｋ219Ｙ、またはＫ219Ｗである、本発明1010の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1016]
Ｇ220での前記アミノ酸置換が、Ｇ220Ｓ、Ｇ220Ｎ、Ｇ220Ｑ、Ｇ220Ｄ、Ｇ220Ｅ、Ｇ220Ｋ、Ｇ220Ｒ、Ｇ220Ｈ、Ｇ220Ｆ、Ｇ220Ｙ、またはＧ220Ｗである、本発明1010の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1017]
以下の置換Ｌ130Ｒ及びＧ133Ｄを更に含み、該アミノ酸置換が、ｆＨｂｐ ＩＤ22に対するものである、本発明1010〜1016のいずれかの変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1018]
置換Ｌ130Ｒ、Ｇ133Ｄ、及びＮ115Ｉを含む、本発明1010の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1019]
置換Ｌ130Ｒ、Ｇ133Ｄ、及びＤ121Ｇを含む、本発明1010の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1020]
置換Ｌ130Ｒ、Ｇ133Ｄ、及びＫ219Ｎ、または、置換Ｌ130Ｒ、Ｇ133Ｄ、及びＤ211Ａを含む、本発明1010の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1021]
置換Ｌ130Ｒ、Ｇ133Ｄ、及びＧ220Ｓを含む、本発明1010の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1022]
Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）の変異体であって、該変異体が、以下：
（ａ）位置92のグルタミン酸（Ｅ92）のアミノ酸置換；
（ｂ）位置223のセリン（Ｓ223）のアミノ酸置換；及び
（ｃ）位置248のヒスチジン（Ｈ248）のアミノ酸置換
から選択されるアミノ酸置換を含み、
該アミノ酸置換が、ｆＨｂｐ ＩＤ55（配列番号3）に対するものであり、
該変異体が、配列番号3と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該変異体ｆＨｂｐが、ヒトＨ因子（ｆＨ）と、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ55の親和性の50％未満の親和性で結合し、
該変異体が、哺乳類宿主において殺菌性抗体反応を誘導する、変異体。
[本発明1023]
ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ55の親和性の25％以下の親和性で結合する、本発明1022の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1024]
ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ55の親和性の10％以下の親和性で結合する、本発明1022の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1025]
ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ55の親和性の5％以下の親和性で結合する、本発明1022の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1026]
Ｅ92での前記アミノ酸置換が、Ｅ92Ｋ、Ｅ92Ｒ、Ｅ92Ｈ、Ｅ92Ｆ、Ｅ92Ｙ、またはＥ92Ｗである、本発明1022の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1027]
Ｓ223での前記アミノ酸置換が、Ｓ223Ｒ、Ｓ223Ｋ、Ｓ223Ｈ、Ｓ223Ｆ、Ｓ223Ｙ、またはＳ223Ｗである、本発明1022の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1028]
Ｈ248での前記アミノ酸置換が、Ｈ248Ｌ、Ｈ248Ｉ、Ｈ248Ｖ、Ｈ248Ｄ、Ｈ248Ｅ、Ｈ248Ｆ、Ｈ248Ｙ、またはＨ248Ｗである、本発明1022の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1029]
（ａ）本発明1001〜1028のいずれかの変異体ｆＨｂｐ；及び
（ｂ）医薬的に許容される賦形剤
を含む、免疫原性組成物。
[本発明1030]
前記変異体ｆＨｂｐが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株から調製される小胞調製物にある、本発明1029の免疫原性組成物。
[本発明1031]
前記医薬的に許容される賦形剤がアジュバントを含む、本発明1029または本発明1030の免疫原性組成物。
[本発明1032]
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの表面プロテインＡを更に含む、本発明1029〜1031のいずれかの免疫原性組成物。
[本発明1033]
前記アジュバントが、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムである、本発明1031の免疫原性組成物。
[本発明1034]
本発明1001〜1028のいずれかの変異体ｆＨｂｐをコードする核酸。
[本発明1035]
本発明1034の核酸を含む、組換え発現ベクター。
[本発明1036]
本発明1034の核酸、または本発明1035の組換え発現ベクターを含む、インビトロ宿主細胞。
[本発明1037]
本発明1029〜1033のいずれかの免疫原性組成物を哺乳類に投与する段階を含む、哺乳類での抗体反応の誘発方法。
[本発明1038]
前記哺乳類がヒトである、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記抗体反応が、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）の1つまたは複数の菌株に対する殺菌性抗体反応である、本発明1037の方法。
[本発明1040]
Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）の変異体であって、該変異体が、ｆＨｂｐ ＩＤ22（配列番号2）に対してアミノ酸置換Ｌ130Ｒ及びＧ133Ｄを含み、
該変異体が、配列番号2と85％より高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該変異体ｆＨｂｐが、ヒトＨ因子（ｆＨ）と、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ22の親和性の50％以下の親和性で結合し、
該変異体が、哺乳類宿主において殺菌性抗体反応を誘導する、変異体。
[本発明1041]
以下の置換Ｒ80Ａ、Ｄ211Ａ、Ｅ218Ａ、Ｅ248Ａ、Ｇ236Ｉ、Ｔ221Ａ、及びＨ223Ａのうちの1つまたは複数を更に含む、本発明1040の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1042]
置換Ｒ80Ａを更に含む、本発明1040の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1043]
置換Ｄ211Ａを更に含む、本発明1040または1042の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1044]
置換Ｅ218Ａを更に含む、本発明1040または1043の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1045]
置換Ｅ248Ａを更に含む、本発明1040または1044の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1046]
置換Ｇ236Ｉを更に含む、本発明1040または1045の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1047]
置換Ｔ221Ａ及びＨ223Ａを更に含む、本発明1040または1046の変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1048]
配列番号2と90％より高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1040〜1047のいずれかの変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1049]
配列番号2と95％より高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1040〜1047のいずれかの変異体ｆＨｂｐ。
[本発明1050]
配列番号2と99％より高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1040〜1047のいずれかの変異体ｆＨｂｐ。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】ポリアクリルアミドゲル上でクマシーブルー染色した精製組換えｆＨｂｐ ＩＤ１変異体を示す。レーン１、カレイドスコープ分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；２、ｆＨｂｐ ＩＤ１野生型；３、Ｑ３８Ｒ；４、Ｅ９２Ｋ；５、Ｒ１３０Ｇ；６、Ｓ２２３Ｒ；７、Ｈ２４８Ｌ。

【図2】図２Ａ及び２Ｂは、ＥＬＩＳＡで測定した、ｆＨｂｐ ＩＤ１変異体のヒトｆＨへの結合を示す。反復測定の平均と範囲が示されている。

【図3】図３Ａ〜３Ｅは、表面プラズモン共鳴で測定した、ｆＨｂｐ ＩＤ１変異体のヒトｆＨへの結合を示す。参照用に、ＩＤ１の野生型（ＷＴ）タンパク質に対する同じデータが図３Ａ〜３Ｅの各々に示されている。

【図4】図４Ａ〜４Ｅは、ＥＬＩＳＡで測定した、マウス抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のｆＨｂｐ ＩＤ１変異体タンパク質への結合を示す。繰り返し測定の平均と範囲が示されている。

【図5】図５Ａ及び５Ｂは、ｆＨｂｐ ＩＤ１変異体で免疫化されたマウスの血清の殺菌活性を示す。各記号は各マウスの力価を表し、水平バーは幾何平均力価を表す。図５Ａは、ｆＨｂｐ ＩＤ１変異体で免疫化された野生型マウスの血清の殺菌活性を示す。図５Ｂは、ｆＨｂｐ ＩＤ１変異体で免疫化されたヒトｆＨトランスジェニックマウスマウスの血清の殺菌活性を示す。

【図6】図６Ａ及び６Ｂは、ｆＨｂｐ ＩＤ１の単一または二重変異体の特性評価を示す。図６Ａは、ヒトｆＨのｆＨｂｐ ＩＤ１二重変異体への結合を示す。図６Ｂは、マウス抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＪＡＲ４の変異体への結合を示す。

【図7】ｆＨｂｐ ＩＤ１の単一または二重変異体で免疫化された野生型マウスの血清の殺菌活性を示す。各記号は各マウスの力価を表し、水平バーは幾何平均力価を表す。

【図8】図８Ａ及び８Ｂは、ｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体の特性評価を示す。図８Ａは、ＥＬＩＳＡで測定した、ヒトｆＨの固定化ｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体への結合を示し、図８Ｂは、ＥＬＩＳＡで測定した、マウス抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＪＡＲ４１のｆＨｂｐ変異体ＩＤ５５タンパク質への結合を示す。２〜４回の反復の平均と範囲が示されている。

【図9】ｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体で免疫化された野生型マウスの血清の殺菌活性を示す。各記号は各マウスの力価を表し、水平バーは幾何平均力価を表す。

【図10】図１０Ａ及び１０Ｂは、ｆＨｂｐ ＩＤ５５で免疫化されたマウスの血清の殺菌活性を示す。図１０Ａは、認可Ｔｒｕｍｅｎｂａワクチンまたは試験研究ｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体Ｓ２２３Ｒで免疫化されたヒトｆＨトランスジェニックマウスの血清の殺菌活性を示す。図１０Ｂは、各トランスジェニックマウス血清のヒトｆＨ濃度と該血清の殺菌活性力価（円形記号）の関係を示す。比較のため、野生型（ＷＴ）マウスの力価が示されている（正方形）。

【図11】図１１Ａ〜１１Ｄは、ｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体の特性評価を示す。図１１Ａ〜１１Ｃは、ＥＬＩＳＡで測定した、ｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体のヒトｆＨへの結合を示す。２〜４回の反復の平均と範囲が示されている。図１１Ｄは、ＥＬＩＳＡで測定した、マウス抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＪＡＲ４のｆＨｂｐ変異体ＩＤ２２タンパク質への結合を示す。ｆＨｂｐ ＩＤ２２野生型（ＷＴ）及びＤ２１１Ａ変異体は対照として示されている。繰り返し測定の平均と範囲が示されている。

【図12】図１２Ａ及び１２Ｂは、ｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体で免疫化されたマウスの血清の殺菌活性を示す。各記号は各マウスの力価を表し、水平バーは幾何平均力価を表す。図１２Ａ及び図１２Ｂは、異なるｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体を調べるための２つの実験での野生型マウスの血清の殺菌活性を示す。

【図13】ｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体で免疫化されたヒトｆＨトランスジェニックマウスの血清の殺菌活性を示す。

【図14】示差走査微小熱量測定によって測定されたｆＨｂｐ ＩＤ２２野生型（ＷＴ）及びＬ１３０Ｒ／Ｇ１３３Ｄ二重変異体の熱変性を示す。

【図15】ｆＨｂｐ ＩＤ２２三重変異体の特性評価を示す。図１５Ａは、ヒトｆＨのｆＨｂｐ ＩＤ２２三重変異体への結合を示す。ＤＭはＬ１３０Ｒ／Ｇ１３３Ｄ二重変異体を指す。図１５Ｂは、マウス抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＪＡＲ４のｆＨｂｐ ＩＤ２２三重変異体への結合を示す。

【図16】ｆＨｂｐ ＩＤ２２三重変異体で免疫化されたヒトｆＨトランスジェニックマウスの血清の殺菌活性を示す。ＤＭはＬ１３０Ｒ／Ｇ１３３Ｄ二重変異体を指す。

【図17】ヒトｆＨの結合が低下した例示的なｆＨｂｐ変異体の表を示す。

【図18】野生型ヒトＨ因子のアミノ酸配列を示す。

【図19】Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株由来のｆＨｂｐ ＩＤ１、ＩＤ２２、及びＩＤ５５のアミノ酸配列を示す。

【図20】ｆＨｂｐ ＩＤ１変異体のアミノ酸配列を示す。

【図21】ｆＨｂｐ ＩＤ１変異体のアミノ酸配列を示す。

【図22】ｆＨｂｐ ＩＤ１変異体のアミノ酸配列を示す。

【図23】ｆＨｂｐ ＩＤ１変異体のアミノ酸配列を示す。

【図24】ｆＨｂｐ ＩＤ１変異体のアミノ酸配列を示す。

【図25】ｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体のアミノ酸配列を示す。

【図26】ｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体のアミノ酸配列を示す。

【図27】ｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体のアミノ酸配列を示す。

【図28】ｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体のアミノ酸配列を示す。

【図29】ｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体のアミノ酸配列を示す。

【図30】ｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体のアミノ酸配列を示す。

【図31】ｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体のアミノ酸配列を示す。

【図32】ｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体のアミノ酸配列を示す。

【図33】ｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体のアミノ酸配列を示す。

【図34】ｆＨｂｐ ＩＤ１二重突然変異体のアミノ酸配列を示す。

【図35】ｆＨｂｐ ＩＤ１二重突然変異体のアミノ酸配列を示す。

【図36】ｆＨｂｐ ＩＤ１二重突然変異体のアミノ酸配列を示す。

【図37】ｆＨｂｐ ＩＤ２２二重及び三重突然変異体のアミノ酸配列を示す。

【図38】ｆＨｂｐ ＩＤ２２二重及び三重突然変異体のアミノ酸配列を示す。

【図39】ｆＨｂｐ ＩＤ２２二重及び三重突然変異体のアミノ酸配列を示す。

【図40】ＮｓｐＡのアミノ酸配列を示す。

【発明を実施するための形態】

【0016】

定義
「Ｈ因子結合タンパク質」（ｆＨｂｐ）は、文献ではＧＮＡ１８７０、ＧＮＡ１８７０、ＯＲＦ２０８６、ＬＰ２０８６（リポタンパク質２０８６）、及び「７４１」としても知られ、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチドのクラスを指す。これは、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ細菌表面のリポタンパク質として自然界に見られる。ｆＨｂｐは、３つのｆＨｂｐ変異体群（一部の報告（Ｍａｓｉｇｎａｎｉ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９７：７８９−９９）では、変異体群１（ｖ．１）、変異体群２（ｖ．２）、及び変異体群３（ｖ．３）と呼ばれ、他の報告（例えば、Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２：２０８８−２１００参照）では、サブファミリーＡ及びＢと呼ばれる）に、アミノ酸配列多様性及び免疫学的交差反応性（Ｍａｓｉｇｎａｎｉ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９７：７８９−９９）に基づいて細分されている。ｆＨｂｐはまた、Ｖｕ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｓｃｉ． Ｒｅｐｏｒｔｓ ２：３４１の図２に示される通り、モジュラー群Ｉ〜モジュラー群ＶＩに指定されている６つの最も一般的なｆＨｂｐモジュラー群のうちの１つに分類することもできる。Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに見出される各固有ｆＨｂｐはまた、ウェブサイトｐｕｂｍｌｓｔ．ｏｒｇ／ｎｅｉｓｓｅｒｉａ／ｆＨｂｐ／に準じて、ｆＨｂｐペプチドＩＤが割り当てられる。変異体２（ｖ．２）のｆＨｂｐタンパク質（８０４７株由来、ｆＨｂｐ ＩＤ７７）及び変異体３（ｖ．３）のｆＨｂｐ（Ｍ１２３９株由来、ｆＨｂｐ ＩＤ２８）の長さは、ＭＣ５８株由来のもの（ｆＨｂｐ ＩＤ１）とはそれぞれ−１及び＋７アミノ酸残基が異なるため、ｖ．２及びｖ．３のｆＨｂｐタンパク質に対する残基を指す本明細書で用いられる番号は、これらタンパク質の実際のアミノ酸配列に基づく番号と異なる。ゆえに、例えば、ｖ．２またはｖ．３のｆＨｂｐ配列の１６６位のロイシン残基（Ｌ）への言及は、ｖ．２タンパク質の１６５位及びｖ．３タンパク質の１７３位の残基を指す。特に断りのない限り、これらｆＨｂｐ変異体に存在するアミノ酸置換の番号は、ｆＨｂｐ ＩＤ１のアミノ酸残基の番号に準拠する。

【0017】

本明細書で用いられるヒトＨ因子（「ヒトｆＨ」）とは、図１８（配列番号４）に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び天然に存在するそのヒト対立遺伝子多型を指す。

【0018】

アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列に関連する「由来（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」（例えば、ｆＨｂｐ ＩＤ１「由来」のアミノ酸配列）とは、ポリペプチドまたは核酸が、参照ポリペプチドまたは核酸（例えば、天然に存在するｆＨｂｐタンパク質またはコードする核酸）の配列に基づく配列を有することを示すことを意図し、該タンパク質または核酸が作られる起源や方法に関しては限定することを意図しない。アミノ酸配列やポリヌクレオチド配列が「由来」しうる参照ポリペプチド及び参照ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、天然に存在するｆＨｂｐ、ｆＨｂｐ ＩＤ１、及び天然に存在しないｆＨｂｐが挙げられる。細菌の菌株に関連する「由来」とは、株が親株のインビボ継代もしくはインビトロ培養によって得られたことを示すこと、及び／または、株が親株の改変によって得られる組換え細胞であることを示すことを意図する。

【0019】

「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸側鎖の化学的及び物理的性質（例えば、電荷、サイズ、疎水性／親水性）をさらに共有するために、１つのアミノ酸残基を置換することを指す。「保存的置換」は、以下のアミノ酸残基群内での置換を含むことを意図する：ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；及びｐｈｅ、ｔｙｒ。かかる置換の手引きは、目的のエピトープを提示するポリペプチドのアミノ酸配列アライメントから得ることができる。

【0020】

用語「防御免疫」とは、哺乳類に投与されるワクチンまたは免疫付与計画が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに起因する疾患の予防、進行の遅延、もしくは程度の軽減をする、または、該疾患の症状を減少もしくは完全に取り除く免疫反応を誘導することを意味する。防御免疫は、殺菌性抗体の産生を伴いうる。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する殺菌性抗体の産生は、ヒトでのワクチンの保護効果の予測として、その分野で受け入れられていることに留意されたい（Ｇｏｌｄｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９６９） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １２９：１３０７； Ｂｏｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ６９：１５６８）。

【0021】

「Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）菌株に起因する疾患」という表現は、ヒトのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染した状態で存在する任意の臨床症状または臨床症状の組合せを包含する。これら症状としては、限定されないが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの病原菌株による上気道（例えば、鼻咽頭及び扁桃腺の粘膜）のコロニー形成、粘膜及び粘膜下血管床への該細菌の侵入、敗血症、敗血症性ショック、炎症、出血性の皮膚病変、線維素溶解及び血液凝固の活性化、臓器機能不全、例えば、腎、肺、及び心不全、副腎出血及び筋肉梗塞、毛細血管漏出、浮腫、末梢肢虚血、呼吸窮迫症候群、心膜炎、並びに髄膜炎が挙げられる。

【0022】

抗原（例えば、ポリペプチド抗原）に関連する表現「抗体に特異的に結合する」または「特異的に免疫反応性」とは、不均一な他の分子集団もさらに含んでよい試料中の抗原の存在に基づく、及び／または存在の証拠となる結合反応を指す。ゆえに、指定された条件下、特定の抗体または特定の複数の抗体は、試料中の特定の抗原または特定の複数の抗原に結合し、該試料に存在する他の分子には、有意な量では結合しない。抗原のエピトープ（例えば、ポリペプチドのエピトープ）に関連する「抗体に特異的に結合する」または「特異的に免疫反応性」とは、不均一な他のエピトープ集団及び不均一な抗原集団もさらに含んでよい抗原（例えば、ポリペプチド）中のエピトープの存在に基づく、及び／または存在の証拠となる結合反応を指す。ゆえに、指定された条件下、特定の抗体または特定の複数の抗体は、抗原の特定のエピトープに結合し、該抗原及び／または該試料に存在する他のエピトープには、有意な量では結合しない。

【0023】

「免疫反応を誘発するのに十分な量で」という表現は、特定の抗原調製物の投与の前後で、測定される免疫反応指標間に検出可能な差があることを意味する。免疫反応指標としては、限定されないが、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、殺菌アッセイ、フローサイトメトリー、免疫沈降、オクタロニー免疫拡散法；例えばスポット、ウェスタンブロットまたは抗原アレイの結合検出アッセイ；細胞毒性アッセイ等のアッセイで検出される抗体価または抗体特異性が挙げられる。

【0024】

「表面抗原」は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの表面構造（例えば、外膜、莢膜、腺毛等）に存在する抗原である。

【0025】

「単離された」とは、ある化合物が天然に存在しうる環境とは異なる環境にある、目的の実体を指す。「単離された」とは、目的の化合物に関して実質的に濃縮される、及び／または目的の化合物が部分的もしくは実質的に精製される試料内の化合物を含めることを意図する。一部の例では、単離された成分（例えば、本開示のｆＨｂｐ変異体等のポリペプチド；本開示の核酸；本開示の組換えベクター）は精製され、例えば、単離された成分は、純度が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％超である。

【0026】

「濃縮された」とは、目的の化合物が生体試料（例えば、該化合物が天然に存在する試料、またはそれが投与後に存在する試料）等の出発試料、または該化合物が（例えば、細菌性ポリペプチド、抗体、核酸等として）作製された出発試料中の該化合物の濃度より高い濃度（例えば、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも６４倍高い、またはそれより高い）で存在するように、試料が非自然的に（例えば、実験者または臨床医によって）操作されることを意味する。

【0027】

本発明をさらに説明する前に、本発明が記載の特定の実施形態に限定されず、従って、当然変動することがあることを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのためであって、限定することを意図しないこともまた理解されたい。

【0028】

値域が与えられる場合、その文脈が明らかに他を指示しない限り、その下限の単位の１０分の１までのその範囲の上限と下限の間の各介在値並びに任意の他の表示値またはその表示値における介在値は、本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、これらのより小さい範囲に独立して含まれうるとともに、表示範囲の任意の特定の除外された境界に依存して、本発明の範囲内に同様に包含される。表示範囲が境界の一方または両方を含む場合、それら含まれる境界のどちらかまたは両方を除外する範囲もまた本発明に含まれる。

【0029】

他に規定のない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または等価の任意の方法及び材料もまた、本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法及び材料をここに記載する。本明細書に言及されたすべての刊行物は、参照することによって本明細書に組み込まれ、該刊行物が引用される当該方法及び／または材料を開示並びに記載する。

【0030】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる単数形の「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他を指示しない限り、複数の指示対象を含むことは留意されなければならない。ゆえに、例えば、「Ｈ因子結合タンパク質（ａ ｆａｃｔｏｒ Ｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）」への言及は、複数のかかるＨ因子結合タンパク質を含み、「免疫原性組成物（ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」への言及は、１つまたは複数の免疫原性組成物及び当業者に公知のその等価物等への言及を含む。特許請求の範囲は、いかなる随意的要素も除外するように起草されうることもさらに留意される。従って、本文は、請求項の要素の列挙との関連で「唯一の（ｓｏｌｅｌｙ）」、「唯一の（ｏｎｌｙ）」等の排他的用語の使用、または「負の」限定の使用の、先行詞としての役割を果たすことを意図する。

【0031】

明確にするために別々の実施形態中に記載される本発明の特定の特徴はまた、組み合わせて単一の実施形態に示されてもよいことが理解される。反対に、簡潔にするために単一の実施形態中に記載される本発明の様々な特徴はまた、別々に、または任意の適切なサブコンビネーションで示されてもよい。本発明に関連する実施形態のすべての組合せは、明確に本発明に包含され、まさにありとあらゆる組合せが個々にかつ明確に開示されたものとして本明細書に開示される。さらに、これら様々な実施形態及びそれらの要素のサブコンビネーションのすべてもまた、明確に本発明に包含され、まさにありとあらゆるかかるサブコンビネーションが個々にかつ明確に本明細書に開示されたものとして本明細書に開示される。

【0032】

本明細書で議論される刊行物は、本出願の出願日前にそれらの開示用にのみ提供されている。本発明が、先行発明によるかかる刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきものは本明細書にはない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、別々に確認する必要がありうる。

【0033】

詳細な説明
本開示は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対して殺菌性である抗体を誘発できる変異体Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）を提供する。本開示は、本開示の変異体ｆＨｂｐを含む免疫原性組成物を含めた組成物を提供する。本開示は、本開示の変異体ｆＨｂｐ、または本開示の変異体ｆＨｂｐを含む組成物の使用方法を提供する。

【0034】

変異体ｆＨｂｐ
本開示は、参照ｆＨｂｐと比較して、変異体ｆＨｂｐがヒトＨ因子（ｆＨ）との親和性の低下を示すように、アミノ酸配列が、野生型Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのｆＨｂｐと、１〜１０アミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸から）１０アミノ酸〜１５アミノ酸、１５アミノ酸〜２０アミノ酸、２０アミノ酸〜３０アミノ酸、３０アミノ酸〜４０アミノ酸、または４０アミノ酸〜５０アミノ酸異なる変異体ｆＨｂｐを提供するとともに、該変異体ｆＨｂｐは、哺乳類宿主に投与された場合、１つまたは複数のＮ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株に対する殺菌免疫反応を誘発する。一部の例では、変異体ｆＨｂｐは、アミノ酸配列が、参照野生型Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのｆＨｂｐとわずか１〜１０酸置換異なる。一部の例では、変異体ｆＨｂｐは、アミノ酸配列が、参照野生型Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのｆＨｂｐと１つのアミノ酸置換のみ異なる。

【0035】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、参照ｆＨｂｐ配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；該変異体ｆＨｂｐは、該変異体ｆＨｂｐが、参照ｆＨｂｐのヒトｆＨに対する結合親和性の８５％以下のヒトｆＨに対する親和性を示すように、例えば、該変異体ｆＨｂｐが、該参照ｆＨｂｐのヒトｆＨに対する親和性の約８５％〜約７５％、約７５％〜約６５％、約６５％〜約５５％、約５５％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満の結合親和性である、ヒトｆＨに対する親和性を示すように、該参照ｆＨｂｐ配列に対して１つまたは複数のアミノ酸置換を含み；該変異体ｆＨｂｐは、哺乳類宿主（例えば、ヒト；または非ヒト動物モデル）に投与された場合、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌免疫反応を誘導する。

【0036】

本開示の変異体ｆＨｂｐは、参照ｆＨｂｐがその天然の立体構造にある場合にヒトｆＨに結合する該参照（例えば、野生型）ｆＨｂｐと、実質的に同じ立体構造を維持する。本開示の変異体ｆＨｂｐがヒトｆＨに結合する参照（例えば、野生型）ｆＨｂｐと実質的に同じ立体構造を維持するかどうかは、野生型ｆＨｂｐがその天然の立体構造にある場合に該野生型ｆＨｂｐに結合する抗体を用いて判断できる。かかる抗体としては、例えば、ＪＡＲ４１；ＪＡＲ４；及びＪＡＲ３１が挙げられる。例えば、Ｖｕ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｓｃｉ． Ｒｅｐｏｒｔｓ ２：３４１参照。ハイブリドーマ形成性ＪＡＲ４モノクローナル抗体は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）番号ＰＴＡ−８９４３を有する。ＵＳＰＮ８，４７０，３４０も参照されたい。例えば、一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、ＪＡＲ４に対する結合を保持しており；例えば、本開示の変異体ｆＨｂｐは、天然の立体構造にある参照ｆＨｂｐ（例えば、ｆＨｂｐ ＩＤ１、ｆＨｂｐ ＩＤ２２、またはｆＨｂｐ ＩＤ５５）のＪＡＲ４に対する結合の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を保持する。

【0037】

ｆＨｂｐ ＩＤ１の変異体
本開示の変異体ｆＨｂｐが由来する「参照ｆＨｂｐ」は、一部の例では、ｆＨｂｐ ＩＤ１である。ｆＨｂｐ ＩＤ１のアミノ酸配列を以下に示す。

【0038】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、変異体群１のｆＨｂｐである。一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、変異体群１のｆＨｂｐであって、モジュラー群ＩのｆＨｂｐである。一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；該変異体ｆＨｂｐは、該変異体ｆＨｂｐが、ｆＨｂｐ ＩＤ１のヒトｆＨに対する結合親和性の８５％以下のヒトｆＨに対する親和性を示すように、例えば、該変異体ｆＨｂｐが、ｆＨｂｐ ＩＤ１のヒトｆＨに対する親和性の約８５％〜約７５％、約７５％〜約６５％、約６５％〜約５５％、約５５％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満の結合親和性である、ヒトｆＨに対する親和性を示すように、ｆＨｂｐ ＩＤ１に対して１つまたは複数のアミノ酸置換を含み；該変異体ｆＨｂｐは、哺乳類宿主（例えば、ヒト；または非ヒト動物モデル）に投与された場合、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌免疫反応を誘導する。

【0039】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ１の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、ｆＨｂｐ ＩＤ１の番号に基づいて、該変異体ｆＨｂｐは：（ａ）アミノ酸３８のグルタミン（Ｑ３８）のアミノ酸置換；（ｂ）アミノ酸９２のグルタミン酸（Ｅ９２）のアミノ酸置換；（ｃ）アミノ酸１３０のアルギニンに対するグリシン置換（Ｒ１３０Ｇ）；（ｄ）アミノ酸２２３のセリン（Ｓ２２３）のアミノ酸置換；及び（ｅ）アミノ酸２４８のロイシンに対するヒスチジン置換（Ｈ２４８Ｌ）のうちの少なくとも１つから選択されるアミノ酸置換を含む。

【0040】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ１の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、アミノ酸３８のグルタミン（Ｑ３８）のアミノ酸置換を含む。一部の例では、該変異体ｆＨｂｐは、Ｑ３８Ｒ置換を含む。正電荷または芳香族側鎖を有する他のアミノ酸、例えば、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンもまた、この位置で置換されうる。ゆえに、一部の例では、変異体ｆＨｂｐは、Ｑ３８Ｋ置換、Ｑ３８Ｈ置換、Ｑ３８Ｆ置換、Ｑ３８Ｙ置換、またはＱ３８Ｗ置換を含む。一例として、本開示の変異体ｆＨｂｐは、図２０に示され、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0041】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ１の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、アミノ酸９２のグルタミン酸（Ｅ９２）のアミノ酸置換を含む。一部の例では、該ｆＨｂｐ変異体は、Ｅ９２Ｋ置換を含む。正電荷または芳香族側鎖を有する他のアミノ酸、例えば、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンもまた、この位置で置換されうる。ゆえに、例えば、一部の例では、ｆＨｂｐ変異体は、Ｅ９２Ｒ置換、Ｅ９２Ｈ置換、Ｅ９２Ｆ置換、Ｅ９２Ｙ置換、またはＥ９２Ｗ置換を含む。一例として、本開示の変異体ｆＨｂｐは、図２１に示され、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0042】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ１の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、アミノ酸１３０のアルギニンに対するグリシン置換（Ｒ１３０Ｇ）を含む。例えば、本開示の変異体ｆＨｂｐは、図２２に示され、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むことができる。負電荷または芳香族側鎖を有する他のアミノ酸、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンもまた、Ｒ１３０で置換されうる。ゆえに、例えば、一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ１の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、Ｒ１３０Ｄ置換、Ｒ１３０Ｅ置換、Ｒ１３０Ｆ置換、Ｒ１３０Ｙ置換、またはＲ１３０Ｗ置換を含む。

【0043】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ１の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、アミノ酸２２３のセリン（Ｓ２２３）のアミノ酸置換を含む。一部の例では、該ｆＨｂｐ変異体はＳ２２３Ｒ置換を含む。正電荷または芳香族側鎖を有する他のアミノ酸、例えば、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンもまた、この位置で置換されうる。ゆえに、例えば、一部の例では、ｆＨｂｐ変異体は、Ｓ２２３Ｋ置換、Ｓ２２３Ｈ置換、Ｓ２２３Ｆ置換、Ｓ２２３Ｙ置換、またはＳ２２３Ｗ置換を含む。一例として、本開示の変異体ｆＨｂｐは、図２３に示され、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0044】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ１の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、アミノ酸２４８のロイシンに対するヒスチジン置換（Ｈ２４８Ｌ）を含む。例えば、本開示の変異体ｆＨｂｐは、図２４に示され、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むことができる。非極性の、または負電荷もしくは芳香族側鎖を有する他のアミノ酸、例えば、イソロイシン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンもまた、Ｈ２４８で置換されうる。ゆえに、一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ１の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、Ｈ２４８Ｉ置換、Ｈ２４８Ｖ置換、Ｈ２４８Ｄ置換、Ｈ２４８Ｅ置換、Ｈ２４８Ｆ置換、Ｈ２４８Ｙ置換、またはＨ２４８Ｗ置換を含む。

【0045】

アミノ酸置換の組合せ
一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ１の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、ｆＨｂｐ ＩＤ１の番号に基づいて、該変異体ｆＨｂｐは：（ａ）アミノ酸３８のグルタミン（Ｑ３８）のアミノ酸置換；（ｂ）アミノ酸９２のグルタミン酸（Ｅ９２）のアミノ酸置換；（ｃ）アミノ酸１３０のアルギニンに対するグリシン置換（Ｒ１３０Ｇ）；（ｄ）アミノ酸２２３のセリン（Ｓ２２３）のアミノ酸置換；及び（ｅ）アミノ酸２４８のロイシンに対するヒスチジン置換（Ｈ２４８Ｌ）のうちの２つ以上から選択されるアミノ酸置換を含む。

【0046】

置換の組合せが含まれてもよく、２つの置換は、異なる構造ドメインにあり、各々が独立してｆＨのｆＨｂｐへの結合を低下させる（例えば、Ｃ末端ドメインのアミノ酸置換と組み合わせるＮ末端ドメインの１つの置換。一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、Ｎ末端ドメイン内で第一のアミノ酸置換；及びＣ末端ドメイン内で第二のアミノ酸置換を含む。一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、Ｎ末端ドメイン内で第一のアミノ酸置換；及びＮ末端ドメイン内で第二のアミノ酸置換を含む。一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、Ｃ末端ドメイン内で第一のアミノ酸置換；及びＣ末端ドメイン内で第二のアミノ酸置換を含む。

【0047】

例えば、一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ１の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、ｆＨｂｐ ＩＤ１の番号に基づいて、該変異体ｆＨｂｐは：（ａ）アミノ酸３８のグルタミン（Ｑ３８）のアミノ酸置換及び（ｂ）アミノ酸９２のグルタミン酸（Ｅ９２）のアミノ酸置換を含むか；該変異体ｆＨｂｐは：（ａ）アミノ酸３８のグルタミン（Ｑ３８）のアミノ酸置換及び（ｃ）アミノ酸１３０のアルギニンに対するグリシン置換（Ｒ１３０Ｇ）を含むか；該変異体ｆＨｂｐは：（ａ）アミノ酸３８のグルタミン（Ｑ３８）のアミノ酸置換及び（ｄ）アミノ酸２２３のセリン（Ｓ２２３）のアミノ酸置換を含むか；または、該変異体ｆＨｂｐは：（ａ）アミノ酸３８のグルタミン（Ｑ３８）のアミノ酸置換及び（ｅ）アミノ酸２４８のロイシンに対するヒスチジン置換（Ｈ２４８Ｌ）を含む。

【0048】

さらなる非限定的な例として、一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ１の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、ｆＨｂｐ ＩＤ１の番号に基づいて、該変異体ｆＨｂｐは：（ｂ）アミノ酸９２のグルタミン酸（Ｅ９２）のアミノ酸置換及び（ｃ）アミノ酸１３０のアルギニンに対するグリシン置換（Ｒ１３０Ｇ）を含むか；該変異体ｆＨｂｐは：（ｂ）アミノ酸９２のグルタミン酸（Ｅ９２）のアミノ酸置換及び（ｄ）アミノ酸２２３のセリン（Ｓ２２３）のアミノ酸置換を含むか；該変異体ｆＨｂｐは：（ｂ）アミノ酸９２のグルタミン酸（Ｅ９２）のアミノ酸置換及び（ｅ）アミノ酸２４８のロイシンに対するヒスチジン置換（Ｈ２４８Ｌ）を含むか；該変異体ｆＨｂｐは：（ｃ）アミノ酸１３０のアルギニンに対するグリシン置換（Ｒ１３０Ｇ）及び（ｄ）アミノ酸２２３のセリン（Ｓ２２３）のアミノ酸置換を含むか；該変異体ｆＨｂｐは：（ｃ）アミノ酸１３０のアルギニンに対するグリシン置換（Ｒ１３０Ｇ）及び（ｅ）アミノ酸２４８のロイシンに対するヒスチジン置換（Ｈ２４８Ｌ）を含むか；または、該変異体ｆＨｂｐは：（ｄ）アミノ酸２２３のセリン（Ｓ２２３）のアミノ酸置換及び（ｅ）アミノ酸２４８のロイシンに対するヒスチジン置換（Ｈ２４８Ｌ）を含む。

【0049】

さらなる非限定的な例として、一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ１の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、ｆＨｂｐ ＩＤ１の番号に基づいて：（ｉ）Ｑ３８Ｒ置換；及び（ｉｉ）Ｒ１３０Ｇ置換を含む。

【0050】

上記の通りｆＨｂｐ ＩＤ１のアミノ酸配列に対して１つまたは複数の置換を含み、かつ、さらにＲ４１Ｓの置換を含む変異体ｆＨｂｐタンパク質もまた本明細書で提供する。典型的な変異体ｆＨｂｐは、ｆＨｂｐ ＩＤ１に対して、Ｒ４１Ｓ置換及びＳ２２３の置換、例えば、Ｒ４１Ｓ／Ｓ２２３Ｒ、または、ｆＨｂｐ ＩＤ１に対して、Ｒ４１Ｓ置換及びＨ２４８Ｌ置換を含む。一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、ｆＨｂｐ ＩＤ１の番号に基づいて、以下のアミノ酸置換のうちの２つ以上を含む：（ａ）アミノ酸４１のアルギニンに対するセリン置換（Ｒ４１Ｓ）；（ｂ）アミノ酸２２３のセリンに対するアルギニン置換（Ｓ２２３Ｒ）；（ｃ）アミノ酸２４８のヒスチジンに対するロイシン置換（Ｈ２４８Ｌ）。

【0051】

上記の通りｆＨｂｐ ＩＤ１のアミノ酸配列に対して１つまたは複数の置換を含み、かつ、さらに、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１／０２５６１８０に開示の置換を含む変異体ｆＨｂｐタンパク質もまた本明細書に開示する。

【0052】

ｆＨｂｐ ＩＤ２２の変異体
本開示の変異体ｆＨｂｐが由来する「参照ｆＨｂｐ」は、一部の例では、ｆＨｂｐ ＩＤ２２である。ｆＨｂｐ ＩＤ２２のアミノ酸配列を以下に示す。

【0053】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、変異体群２のｆＨｂｐである。一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、変異体群２のｆＨｂｐであって、モジュラー群ＩＩＩのｆＨｂｐである。一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；該変異体ｆＨｂｐは、該変異体ｆＨｂｐが、ｆＨｂｐ ＩＤ２２のヒトｆＨに対する結合親和性の８５％以下のヒトｆＨに対する親和性を示すように、例えば、該変異体ｆＨｂｐが、ｆＨｂｐ ＩＤ２２のヒトｆＨに対する親和性の約８５％〜約７５％、約７５％〜約６５％、約６５％〜約５５％、約５５％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満の結合親和性である、ヒトｆＨに対する親和性を示すように、ｆＨｂｐ ＩＤ２２に対して１つまたは複数のアミノ酸置換を含み；該変異体ｆＨｂｐは、哺乳類宿主（例えば、ヒト；または非ヒト動物モデル）に投与された場合、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌免疫反応を誘導する。

【0054】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、ｆＨｂｐ ＩＤ２２のアミノ酸配列に対して：（ａ）アミノ酸１１５のアスパラギンに対するイソロイシン置換（Ｎ１１５Ｉ）；（ｂ）アミノ酸１２１のアスパラギン酸に対するグリシン置換（Ｄ１２１Ｇ）；（ｃ）アミノ酸１２８のセリンに対するトレオニン置換（Ｓ１２８Ｔ）；（ｄ）位置１３１のバリン（Ｖ１３１）のアミノ酸置換；（ｅ）位置２１９のリジン（Ｋ２１９）のアミノ酸置換；（ｆ）位置２２０のグリシン（Ｇ２２０）のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つから選択されるアミノ酸置換を含む。本明細書に述べたように、該アミノ酸残基の番号は、ｆＨｂｐ ＩＤ１のそれに基づく。

【0055】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、アミノ酸１１５のアスパラギンに対するイソロイシン置換（Ｎ１１５Ｉ）を含む。例えば、本開示の変異体ｆＨｂｐは、図２５に示され、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むことができる。非極性の、または正電荷もしくは芳香族側鎖を有する他のアミノ酸、例えば、バリン、ロイシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンもまた、Ｎ１１５で置換されうる。ゆえに、例えば、一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、ｆＨｂｐ ＩＤ２２のアミノ酸配列に対して、Ｎ１１５Ｖ置換、Ｎ１１５Ｌ置換、Ｎ１１５Ｋ置換、Ｎ１１５Ｒ置換、Ｎ１１５Ｈ置換、Ｎ１１５Ｆ置換、Ｎ１１５Ｙ置換、またはＮ１１５Ｗ置換を含む。

【0056】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、アミノ酸１２１のアスパラギン酸に対するグリシン置換（Ｄ１２１Ｇ）を含む。例えば、本開示の変異体ｆＨｂｐは、図２６に示され、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むことができる。非極性の、または正電荷もしくは芳香族側鎖を有する他のアミノ酸、例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンもまた、Ｄ１２１で置換されうる。ゆえに、例えば、一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、ｆＨｂｐ ＩＤ２２のアミノ酸配列に対して、Ｄ１２１Ｌ置換、Ｄ１２１Ｉ置換、Ｄ１２１Ｖ置換、Ｄ１２１Ｋ置換、Ｄ１２１Ｒ置換、Ｄ１２１Ｈ置換、Ｄ１２１Ｆ置換、Ｄ１２１Ｙ置換、またはＤ１２１Ｗ置換を含む。

【0057】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、アミノ酸１２８のセリンに対するトレオニン置換（Ｓ１２８Ｔ）を含む。例えば、本開示の変異体ｆＨｂｐは、図２７に示され、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含むことができる。極性の、または電荷もしくは芳香族側鎖を有する他のアミノ酸、例えば、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンもまた、Ｓ１２８で置換されうる。ゆえに、例えば、一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、ｆＨｂｐ ＩＤ２２のアミノ酸配列に対して、Ｓ１２８Ｍ置換、Ｓ１２８Ｎ置換、Ｓ１２８Ｄ置換、Ｓ１２８Ｅ置換、Ｓ１２８Ｋ置換、Ｓ１２８Ｒ置換、Ｓ１２８Ｈ置換、Ｓ１２８Ｆ置換、Ｓ１２８Ｙ置換、またはＳ１２８Ｗ置換を含む。

【0058】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、位置１３１のバリン（Ｖ１３１）のアミノ酸置換を含む。一部の例では、ｆＨｂｐ変異体はＶ１３１Ｄ置換を含む。電荷または芳香族側鎖を有する他のアミノ酸、例えば、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンもまた、この位置で置換されうる。ゆえに、例えば、一部の例では、ｆＨｂｐ変異体は、Ｖ１３１Ｅ置換、Ｖ１３１Ｋ置換、Ｖ１３１Ｒ置換、Ｖ１３１Ｈ置換、Ｖ１３１Ｆ置換、Ｖ１３１Ｙ置換、またはＶ１３１Ｗ置換を含む。一例として、本開示の変異体ｆＨｂｐは、ｆＨｂｐ ＩＤ２２のアミノ酸配列に対して、図２８に示され、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0059】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、位置２１９のリジン（Ｋ２１９）のアミノ酸置換を含む。一部の例では、ｆＨｂｐ変異体はＫ２１９Ｎ置換を含む。極性の、または負電荷もしくは芳香族側鎖を有する他のアミノ酸、例えば、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンもまた、この位置で置換されうる。ゆえに、例えば、一部の例では、ｆＨｂｐ変異体は、Ｋ２１９Ｑ置換、Ｋ２１９Ｄ置換、Ｋ２１９Ｅ置換、Ｋ２１９Ｆ置換、Ｋ２１９Ｙ置換、またはＫ２１９Ｗ置換を含む。一例として、本開示の変異体ｆＨｂｐは、図２９に示され、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0060】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、位置２２０のグリシン（Ｇ２２０）のアミノ酸置換を含む。一部の例では、該ｆＨｂｐ変異体はＧ２２０Ｓ置換を含む。極性の、または電荷もしくは芳香族側鎖を有する他のアミノ酸、例えば、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンもまた、この位置で置換されうる。ゆえに、例えば、一部の例では、ｆＨｂｐ変異体は、Ｇ２２０Ｎ置換、Ｇ２２０Ｑ置換、Ｇ２２０Ｄ置換、Ｇ２２０Ｅ置換、Ｇ２２０Ｋ置換、Ｇ２２０Ｒ置換、Ｇ２２０Ｈ置換、Ｇ２２０Ｆ置換、Ｇ２２０Ｙ置換、またはＧ２２０Ｗ置換を含む。例えば、本開示の変異体ｆＨｂｐは、図３０に示され、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0061】

アミノ酸置換の組合せ
一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、ｆＨｂｐ ＩＤ２２のアミノ酸配列に対して：（ａ）アミノ酸１１５のアスパラギンに対するイソロイシン置換（Ｎ１１５Ｉ）；（ｂ）アミノ酸１２１のアスパラギン酸に対するグリシン置換（Ｄ１２１Ｇ）；（ｃ）アミノ酸１２８のセリンに対するトレオニン置換（Ｓ１２８Ｔ）；（ｄ）位置１３１のバリン（Ｖ１３１）のアミノ酸置換；（ｅ）位置２１９のリジン（Ｋ２１９）のアミノ酸置換；（ｆ）位置２２０のグリシン（Ｇ２２０）のアミノ酸置換のうちの２つ以上から選択されるアミノ酸置換を含む。本明細書に述べたように、該残基の番号は、ｆＨｂｐ ＩＤ１のアミノ酸の番号に基づく。

【0062】

置換の組合せが含まれてもよく、２つの置換は、異なる構造ドメインにあり、各々が独立してｆＨのｆＨｂｐへの結合を低下させる（例えば、Ｃ末端ドメインのアミノ酸置換と組み合わせるＮ末端ドメインの１つの置換。一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、Ｎ末端ドメイン内で第一のアミノ酸置換；及びＣ末端ドメイン内で第二のアミノ酸置換を含む。一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、Ｎ末端ドメイン内で第一のアミノ酸置換；及びＮ末端ドメイン内で第二のアミノ酸置換を含む。一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、Ｃ末端ドメイン内で第一のアミノ酸置換；及びＣ末端ドメイン内で第二のアミノ酸置換を含む。

【0063】

例えば、一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、ｆＨｂｐ ＩＤ２２のアミノ酸配列に対して、該変異体ｆＨｂｐは：（ａ）アミノ酸１１５のアスパラギンに対するイソロイシン置換（Ｎ１１５Ｉ）及び（ｂ）アミノ酸１２１のアスパラギン酸に対するグリシン置換（Ｄ１２１Ｇ）を含むか；該変異体ｆＨｂｐは：（ａ）アミノ酸１１５のアスパラギンに対するイソロイシン置換（Ｎ１１５Ｉ）及び（ｃ）アミノ酸１２８のセリンに対するトレオニン置換（Ｓ１２８Ｔ）を含むか；該変異体ｆＨｂｐは：（ａ）アミノ酸１１５のアスパラギンに対するイソロイシン置換（Ｎ１１５Ｉ）及び（ｄ）位置１３１のバリン（Ｖ１３１）のアミノ酸置換を含むか；該変異体ｆＨｂｐは：（ａ）アミノ酸１１５のアスパラギンに対するイソロイシン置換（Ｎ１１５Ｉ）及び（ｅ）位置２１９のリジン（Ｋ２１９）のアミノ酸置換を含むか；または、該変異体ｆＨｂｐは：（ａ）アミノ酸１１５のアスパラギンに対するイソロイシン置換（Ｎ１１５Ｉ）及び（ｆ）位置２２０のグリシン（Ｇ２２０）のアミノ酸置換を含み、該置換残基の番号は、ｆＨｂｐ ＩＤ１のアミノ酸配列の番号に基づく。

【0064】

さらなる非限定的な例として、一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、ｆＨｂｐ ＩＤ２２のアミノ酸配列に対して、該変異体ｆＨｂｐは：（ｂ）アミノ酸１２１のアスパラギン酸に対するグリシン置換（Ｄ１２１Ｇ）及び（ｃ）アミノ酸１２８のセリンに対するトレオニン置換（Ｓ１２８Ｔ）を含むか；該変異体ｆＨｂｐは：（ｂ）アミノ酸１２１のアスパラギン酸に対するグリシン置換（Ｄ１２１Ｇ）及び（ｄ）位置１３１のバリン（Ｖ１３１）のアミノ酸置換を含むか；該変異体ｆＨｂｐは：（ｂ）アミノ酸１２１のアスパラギン酸に対するグリシン置換（Ｄ１２１Ｇ）及び（ｅ）位置２１９のリジン（Ｋ２１９）のアミノ酸置換を含むか；または、該変異体ｆＨｂｐは：（ｂ）アミノ酸１２１のアスパラギン酸に対するグリシン置換（Ｄ１２１Ｇ）及び（ｆ）位置２２０のグリシン（Ｇ２２０）のアミノ酸置換を含む。該置換残基の番号は、ｆＨｂｐ ＩＤ１のアミノ酸配列の番号に基づく。

【0065】

さらなる非限定的な例として、一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、ｆＨｂｐ ＩＤ２２のアミノ酸配列に対して、該変異体ｆＨｂｐは：（ｃ）アミノ酸１２８のセリンに対するトレオニン置換（Ｓ１２８Ｔ）及び（ｄ）位置１３１のバリン（Ｖ１３１）のアミノ酸置換を含むか；該変異体ｆＨｂｐは：（ｃ）アミノ酸１２８のセリンに対するトレオニン置換（Ｓ１２８Ｔ）及び（ｅ）位置２１９のリジン（Ｋ２１９）のアミノ酸置換を含むか；該変異体ｆＨｂｐは：（ｃ）アミノ酸１２８のセリンに対するトレオニン置換（Ｓ１２８Ｔ）及び（ｆ）位置２２０のグリシン（Ｇ２２０）のアミノ酸置換を含むか；該変異体ｆＨｂｐは：（ｄ）位置１３１のバリン（Ｖ１３１）のアミノ酸置換及び（ｅ）位置２１９のリジン（Ｋ２１９）のアミノ酸置換を含むか；該変異体ｆＨｂｐは：（ｄ）位置１３１のバリン（Ｖ１３１）のアミノ酸置換及び（ｆ）位置２２０のグリシン（Ｇ２２０）のアミノ酸置換を含むか；または、該変異体ｆＨｂｐは：（ｅ）位置２１９のリジン（Ｋ２１９）のアミノ酸置換及び（ｆ）位置２２０のグリシン（Ｇ２２０）のアミノ酸置換を含む。該置換残基の番号は、ｆＨｂｐ ＩＤ１のアミノ酸配列の番号に基づく。

【0066】

置換の組合せが含まれてもよく、２つの置換は、異なる構造ドメインにあり、各々が独立してｆＨのｆＨｂｐへの結合を低下させる（例えば、Ｃ末端ドメインからの１つ（例えば、Ｄ２１１Ａ、Ｋ２１９Ｎ、Ｇ２２０Ｓ）と組み合わせるＮ末端ドメインからの１つ（例えば、Ｎ１１５Ｉ、Ｄ１２１Ｇ、Ｓ１２８Ｔ、またはＶ１３１Ｄ）。

【0067】

例えば、一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは：（ｉ）Ｎ１１５Ｉ置換；及び（ｉｉ）Ｄ２１１Ａ置換を含む。

【0068】

別の例として、一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは：（ｉ）Ｎ１１５Ｉ置換；及び（ｉｉ）Ｋ２１９Ｎ置換を含む。

【0069】

別の例として、一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは：（ｉ）Ｎ１１５Ｉ置換；及び（ｉｉ）Ｇ２２０Ｓ置換を含む。

【0070】

野生型ｆＨｂｐ ＩＤ２２と比較して熱安定性が高い変異体ｆＨｂｐポリペプチドもまた本明細書で開示する。一部の例では、該変異体ｆＨｂｐは、ｆＨｂｐ ＩＤ２２（配列番号２）に対してＬ１３０Ｒ及びＧ１３３Ｄの置換を含んでよく、該変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と８５％より高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトＨ因子（ｆＨ）と、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体は、ＷＴ ｆＨｂｐ ＩＤ２２より高い熱安定性を有する。変異体ｆＨｂｐの熱安定性は、ＷＴ ｆＨｂｐ（例えば、ｆＨｂｐ ＩＤ２２）より、少なくとも５℃、１０℃、１５℃、２０℃、またはそれ以上高い場合、例えば、５℃〜３０℃、５℃〜２５℃、５℃〜２０℃、１０℃〜２０℃、または１５℃〜２０℃高い場合がある。本明細書で用いられる「熱安定性」とは、高温にさらされた場合のタンパク質の安定性を指し；熱安定性変異体タンパク質は、その立体構造を野生型タンパク質より高温で維持する。例えば、野生型（ＷＴ）ｆＨｂｐ、例えば、ＷＴ ｆＨｂｐ ＩＤ２２の熱安定性と比較して熱安定性を高める二重変異を含む変異体ｆＨｂｐは、ＷＴ ｆＨｂｐと比較して高温で変性しうる。ある例では、変異体ｆＨｂｐのＮ末端ドメインは、ＷＴ ｆＨｂｐ（例えば、ｆＨｂｐ ＩＤ２２）のＮ末端ドメインより高温で変性しうる。

【0071】

ある実施形態では、Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）の変異体を開示するとともに、該変異体は、ｆＨｂｐ ＩＤ２２（配列番号２）に対して、アミノ酸置換Ｌ１３０Ｒ及びＧ１３３Ｄ、並びに置換Ｒ８０Ａ、Ｎ１１５Ｉ、Ｄ１２１Ｇ、Ｓ１２８Ｔ、Ｖ１３１、Ｄ２１１Ａ、Ｅ２１８Ａ、Ｋ２１９（例えば、Ｋ２１９Ｎ）、Ｇ２２０（例えば、Ｇ２２０Ｓ）、Ｅ２４８Ａ、Ｇ２３６Ｉ、Ｔ２２１Ａ、及びＨ２２３Ａのうちの少なくとも１つを含み、該変異体は、配列番号２と８５％より高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトＨ因子（ｆＨ）と、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において殺菌性抗体反応を誘導する。

【0072】

一部の例では、変異体ｆＨｂｐは、置換の組合せ、例えば、Ｌ１３０Ｒ、Ｇ１３３Ｄ、及び：（ａ）Ｎ１１５Ｉ；（ｂ）Ｄ１２１Ｇ；（ｃ）Ｓ１２８Ｔ；（ｄ）Ｖ１３１Ｄ；（ｅ）Ｋ２１９（例えば、Ｋ２１９Ｎ）；及び（ｆ）Ｇ２２０（例えば、Ｇ２２０Ｓ）から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでよいとともに、該アミノ酸置換は、ｆＨｂｐ ＩＤ２２（配列番号２）に対するものであり、該変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と８５％より高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトＨ因子（ｆＨ）と、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において殺菌性抗体反応を誘導する。

【0073】

ある実施形態では、Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）の変異体を開示するとともに、該変異体は、ｆＨｂｐ ＩＤ２２（配列番号２）に対して、アミノ酸置換Ｌ１３０Ｒ及びＧ１３３Ｄ、並びに置換Ｒ８０Ａ、Ｄ２１１Ａ、Ｅ２１８Ａ、Ｅ２４８Ａ、Ｇ２３６Ｉ、Ｔ２２１Ａ、及びＨ２２３Ａのうちの少なくとも１つを含み、該変異体は、配列番号２と８５％より高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトＨ因子（ｆＨ）と、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ２２の親和性の５０％以下の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において殺菌性抗体反応を誘導する。

【0074】

典型的な変異体ｆＨｂｐは、配列番号２と、８５％を超えるアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２のアミノ酸配列に対して以下の置換を含むポリペプチドを含む：Ｌ１３０Ｒ及びＧ１３３Ｄ；Ｌ１３０Ｒ、Ｇ１３３Ｄ、及びＫ２１９Ｎ；またはＬ１３０Ｒ、Ｇ１３３Ｄ、及びＧ２２０Ｓ。

【0075】

上記の通りｆＨｂｐ ＩＤ２２のアミノ酸配列に対して１つまたは複数の置換を含み、かつ、さらに、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１／０２５６１８０に開示の置換を含む変異体ｆＨｂｐタンパク質もまた本明細書に開示する。

【0076】

ｆＨｂｐ ＩＤ５５の変異体
本開示の変異体ｆＨｂｐが由来する「参照ｆＨｂｐ」は、一部の例では、ｆＨｂｐ ＩＤ５５である。ｆＨｂｐ ＩＤ５５のアミノ酸配列を以下に示す。

【0077】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、変異体群１のｆＨｂｐである。一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、変異体群１のｆＨｂｐであって、モジュラー群ＩＶのｆＨｂｐである。

【0078】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；該変異体ｆＨｂｐは、該変異体ｆＨｂｐが、ｆＨｂｐ ＩＤ５５のヒトｆＨに対する結合親和性の８５％以下のヒトｆＨに対する親和性を示すように、例えば、該変異体ｆＨｂｐが、ｆＨｂｐ ＩＤ５５のヒトｆＨに対する親和性の約８５％〜約７５％、約７５％〜約６５％、約６５％〜約５５％、約５５％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満の結合親和性である、ヒトｆＨに対する親和性を示すように、ｆＨｂｐ ＩＤ５５に対して１つまたは複数のアミノ酸置換を含み；該変異体ｆＨｂｐは、哺乳類宿主（例えば、ヒト；または非ヒト動物モデル）に投与された場合、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌免疫反応を誘導する。

【0079】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ５５の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、ｆＨｂｐ ＩＤ５５のアミノ酸配列に対して：（ａ）位置９２のグルタミン酸（Ｅ９２）のアミノ酸置換；（ｂ）位置２２３のセリン（Ｓ２２３）のアミノ酸置換；及び（ｃ）位置２４８のヒスチジン（Ｈ２４８）のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つから選択されるアミノ酸置換を含み、該アミノ酸残基の番号は、ｆＨｂｐ ＩＤ１の番号に基づく。

【0080】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ５５の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、位置９２のグルタミン酸（Ｅ９２）のアミノ酸置換を含む。一部の例では、該ｆＨｂｐ変異体はＥ９２Ｋ置換を含む。正電荷または芳香族側鎖を有する他のアミノ酸、例えば、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンもまた、この位置で置換されうる。ゆえに、例えば、一部の例では、該ｆＨｂｐ変異体は、Ｅ９２Ｒ置換、Ｅ９２Ｈ置換、Ｅ９２Ｆ置換、Ｅ９２Ｙ置換、またはＥ９２Ｗ置換を含む。一例として、本開示の変異体ｆＨｂｐは、図３１に示され、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0081】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ５５の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、位置２２３のセリン（Ｓ２２３）のアミノ酸置換を含む。一部の例では、ｆＨｂｐ変異体はＳ２２３Ｒ置換を含む。正電荷または芳香族側鎖を有する他のアミノ酸、例えば、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンもまた、この位置で置換されうる。ゆえに、例えば、一部の例では、ｆＨｂｐ変異体は、Ｓ２２３Ｋ置換、Ｓ２２３Ｈ置換、Ｓ２２３Ｆ置換、Ｓ２２３Ｙ置換、またはＳ２２３Ｗ置換を含む。一例として、本開示の変異体ｆＨｂｐは、図３２に示され、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0082】

一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ５５の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、位置２４８のヒスチジン（Ｈ２４８）のアミノ酸置換を含む。一部の例では、該ｆＨｂｐ変異体はＨ２４８Ｌ置換を含む。非極性の、または負電荷もしくは芳香族側鎖を有する他のアミノ酸、例えば、イソロイシン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンもまた、この位置で置換されうる。ゆえに、例えば、一部の例では、ｆＨｂｐ変異体は、Ｈ２４８Ｉ置換、Ｈ２４８Ｖ置換、Ｈ２４８Ｄ置換、Ｈ２４８Ｅ置換、Ｈ２４８Ｆ置換、Ｈ２４８Ｙ置換、またはＨ２４８Ｗ置換を含む。一例として、本開示の変異体ｆＨｂｐは、図３３に示され、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0083】

アミノ酸置換の組合せ
一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ５５の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、該変異体ｆＨｂｐは、ｆＨｂｐ ＩＤ５５に対して：（ａ）位置９２のグルタミン酸（Ｅ９２）のアミノ酸置換；（ｂ）位置２２３のセリン（Ｓ２２３）のアミノ酸置換；及び（ｃ）位置２４８のヒスチジン（Ｈ２４８）のアミノ酸置換からなる群から選択される２つ以上のアミノ酸置換を含み、該残基の番号は、ｆＨｂｐ ＩＤ１に対する配列におけるアミノ酸の番号に基づく。

【0084】

置換の組合せが含まれてもよく、２つの置換は、異なる構造ドメインにあり、各々が独立してｆＨのｆＨｂｐへの結合を低下させる（例えば、Ｃ末端ドメインのアミノ酸置換と組み合わせるＮ末端ドメインの１つの置換。一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、Ｎ末端ドメイン内で第一のアミノ酸置換；及びＣ末端ドメイン内で第二のアミノ酸置換を含む。一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、Ｎ末端ドメイン内で第一のアミノ酸置換；及びＮ末端ドメイン内で第二のアミノ酸置換を含む。一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、Ｃ末端ドメイン内で第一のアミノ酸置換；及びＣ末端ドメイン内で第二のアミノ酸置換を含む。

【0085】

例えば、一部の例では、本開示の変異体ｆＨｂｐは、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異体ｆＨｂｐは、ヒトｆＨと、ヒトｆＨに対するｆＨｂｐ ＩＤ５５の親和性の５０％以下（例えば、約５０％〜約４５％、約４５％〜約３５％、約３５％〜約２５％、約２５％〜約１５％、約１５％〜約１０％、約１０％〜約５％、約５％〜約２％、約２％〜約１％、もしくは約１％〜約０．１％、または０．１％未満）の親和性で結合し、該変異体は、哺乳類宿主において、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対する殺菌性抗体反応を誘導し、ｆＨｂｐ ＩＤ５５に対して、該変異体ｆＨｂｐは：（ａ）位置９２のグルタミン酸（Ｅ９２）のアミノ酸置換及び（ｂ）位置２２３のセリン（Ｓ２２３）のアミノ酸置換を含むか；該変異体ｆＨｂｐは：（ａ）位置９２のグルタミン酸（Ｅ９２）のアミノ酸置換及び（ｃ）位置２４８のヒスチジン（Ｈ２４８）のアミノ酸置換を含むか；該変異体ｆＨｂｐは：（ｂ）位置２２３のセリン（Ｓ２２３）のアミノ酸置換及び（ｃ）位置２４８のヒスチジン（Ｈ２４８）のアミノ酸置換を含むか；または、該変異体ｆＨｂｐは：（ａ）位置９２のグルタミン酸（Ｅ９２）のアミノ酸置換、（ｂ）位置２２３のセリン（Ｓ２２３）のアミノ酸置換、及び（ｃ）位置２４８のヒスチジン（Ｈ２４８）のアミノ酸置換を含み、該残基の番号は、ｆＨｂｐ ＩＤ１に対する配列におけるアミノ酸の番号に基づく。

【0086】

上記の通りｆＨｂｐ ＩＤ５５のアミノ酸配列に対して１つまたは複数の置換を含み、かつ、さらに、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１／０２５６１８０に開示の置換を含む変異体ｆＨｂｐタンパク質もまた本明細書に開示する。

【0087】

融合ポリペプチド
本開示の変異体ｆＨｂｐは、融合ポリペプチド、例えば、上記の変異体ｆＨｂｐ、及び異種ポリペプチド（例えば、融合パートナー）を含むポリペプチドでありうる。融合パートナーは、変異体ｆＨｂｐのＮ末端、変異体ｆＨｂｐのＣ末端、またはｆＨｂｐの内部部位にありうる。

【0088】

適切な融合パートナーとしては、インビボでの安定性の向上（例えば、血清中半減期の向上）をもたらす；精製の容易さをもたらす、例えば、（Ｈｉｓ）_ｎ、例えば、６Ｈｉｓ等；細胞からの融合タンパク質の分泌をもたらす；エピトープタグをもたらす、例えば、ＧＳＴ、ヘマグルチニン（ＨＡ；例えば、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号２６）、ＦＬＡＧ（例えば、ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号２７）、ｃ−ｍｙｃ（例えば、ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号２８）等；検出可能なシグナル、例えば、検出可能な産物を生成する酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ）、またはそれ自体検出可能なタンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質等をもたらす；多量体化、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分等の多量体化ドメインをもたらす；等のペプチド及びポリペプチドが挙げられる。

【0089】

産生方法
本開示のｆＨｂｐは、組換え法及び非組換え法（例えば、化学合成）を含めた任意の適切な方法で産生できる。対象のｆＨｂｐが組換え技術を用いて製造される場合、方法は、任意の適切な構築物及び任意の適切な宿主細胞を含むことができるとともに、宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよく、通常は細菌または酵母宿主細胞、さらに通常は細菌細胞でありうる。遺伝物質の宿主細胞への導入方法としては、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、接合、リン酸カルシウム法、等が挙げられる。転移方法は、導入されたｆＨｂｐをコードする核酸の安定な発現をもたらすように選択されうる。ｆＨｂｐをコードする核酸は、遺伝性エピソーム要素（例えば、プラスミド）として提供されても、ゲノム的に融合されてもよい。

【0090】

本開示は、本開示のｆＨｂｐ変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（単離された核酸を含む）を提供する。いくつかの実施形態では、ｆＨｂｐ変異体をコードするヌクレオチド配列は、転写調節因子、例えば、プロモーターに機能的に連結される。プロモーターは、一部の例では、構成性である。プロモーターは、一部の例では、誘導性である。一部の例では、プロモーターは、原核宿主細胞の使用に適する（例えば、その中で活性がある）。一部の例では、プロモーターは、真核宿主細胞の使用に適する（例えば、その中で活性がある）。

【0091】

一部の例では、本開示のｆＨｂｐ変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、発現ベクター内に存在する。本開示は、本開示のｆＨｂｐ変異体をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター（例えば、単離された組換え発現ベクター）を提供する。いくつかの実施形態では、ｆＨｂｐ変異体をコードするヌクレオチド配列は、転写調節因子、例えば、プロモーターに機能的に連結される。プロモーターは、一部の例では、構成性である。プロモーターは、一部の例では、誘導性である。一部の例では、プロモーターは、原核宿主細胞の使用に適する（例えば、その中で活性がある）。一部の例では、プロモーターは、真核宿主細胞の使用に適する（例えば、その中で活性がある）。

【0092】

ｆＨｂｐをコードする核酸を転移させるのに適するベクターは、組成物で異なりうる。組み込みベクターは、条件複製型または自殺プラスミド、バクテリオファージ、等でよい。これら構築物は、例えば、プロモーター、選択遺伝子マーカー（例えば、抗生物質（例えば、カナマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、またはゲンタマイシン）への耐性を与える遺伝子）、複製起点（宿主細胞、例えば細菌宿主細胞での複製を促進するため）等の様々な要素を含むことができる。ベクターの選択は、様々な要素、例えば、増殖が望まれる細胞の種類及び増殖の目的による。あるベクターは、所望のＤＮＡ配列の増幅及び大量生産に有用である。他のベクターは、培養細胞での発現に適する。さらに別のベクターは、動物全体の細胞での転移及び発現に適する。適切なベクターの選択は、当業者が備えている技能の十分範囲内である。多くのかかるベクターは市販されている。

【0093】

一例では、ベクターは、選択薬剤耐性マーカー並びに異なる宿主細胞で（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ（大腸菌）及びＮ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの両方で）自己複製をもたらす要素を含むエピソームプラスミドに基づく発現ベクターである。かかる「シャトルベクター」の一例は、ｐＦＰ１０プラスミド（Ｐａｇｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｇｅｎｅ ２４４：１３−１９）である。

【0094】

構築物（組換えベクター）は、例えば、目的のポリヌクレオチドを構築物の骨格に挿入することによって、通常はＤＮＡリガーゼによる、ベクターの切断制限酵素部位への付着によって調製できる。別の方法として、所望のヌクレオチド配列は、相同組換えまたは部位特異的組換えによって挿入できる。通常、相同組換えは、ベクターに対し、所望のヌクレオチド配列の両側に相同領域を付けることによって達成され、部位特異的組換えは、部位特異的組換えを促進する配列（例えば、ｃｒｅ−ｌｏｘ、ａｔｔ部位等）の使用によって達成されうる。かかる配列を含む核酸は、例えば、オリゴヌクレオチドの連結反応によって、または、相同領域及び所望のヌクレオチド配列の部分をともに含むプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって付加されうる。

【0095】

ベクターは、宿主細胞内で染色体外維持が可能であるか、または宿主細胞ゲノムへの組み込みが可能である。ベクターは、例えば、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９９） Ｆ． Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ等の、当業者に周知の多くの刊行物に十分説明されている。ベクターは、対象のｆＨｂｐをコードする核酸の発現をもたらしてもよく、対象の核酸の増殖をもたらしてもよく、または両方でもよい。

【0096】

使用されうるベクターの例としては、限定されないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ由来のものが挙げられる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９／１８、ｐＵＣ１１８、１１９、及びＭ１３ｍｐシリーズのベクター等のプラスミドベクターが使用されうる。ｐＥＴ２１もまた、使用されうる発現ベクターである。バクテリオファージベクターとしては、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λｇｔ１８−２３、λＺＡＰ／Ｒ、及びＥＭＢＬシリーズのバクテリオファージベクターを挙げてもよい。利用されうるさらなるベクターとしては、限定されないが、ｐＪＢ８、ｐＣＶ１０３、ｐＣＶ１０７、ｐＣＶ１０８、ｐＴＭ、ｐＭＣＳ、ｐＮＮＬ、ｐＨＳＧ２７４、ＣＯＳ２０２、ＣＯＳ２０３、ｐＷＥ１５、ｐＷＥ１６、及びｃｈａｒｏｍｉｄ ９シリーズのベクターが挙げられる。

【0097】

対象のｆＨｂｐの発現用に、発現カセットを用いてもよい。ゆえに、本開示は、対象の核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。発現ベクターは、転写及び翻訳調節配列を与え、誘導性または構成性発現をもたらしうるとともに、コード領域は、転写開始領域並びに転写及び翻訳終結領域の転写調節下、機能的に連結される。これらの調節領域は、対象のｆＨｂｐが由来するｆＨｂｐに元々備わっていてもよく、または、外来の起源由来でもよい。一般に、転写及び翻訳調節配列としては、限定されないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、並びにエンハンサーまたはアクチベーター配列を挙げてもよい。プロモーターは、構成性でも誘導性でもよく、強力な構成的プロモーター（例えば、Ｔ７等）であってもよい。

【0098】

発現ベクターは、一般に、目的のタンパク質をコードする核酸配列の挿入をもたらすのに都合の良い、プロモーター配列の近くに位置する制限部位を有する。発現宿主で作動する選択マーカーは、ベクターを含む細胞の選択を容易にするために存在してもよい。さらに、発現構築物は、さらなる要素を含んでもよい。例えば、発現ベクターは、１つまたは２つの複製系を有して、例えば、哺乳類または昆虫細胞では発現のため、原核宿主ではクローニングと増幅のため、生物でのその維持を可能にしてよい。さらに、発現構築物は、選択マーカー遺伝子を含んで、形質転換宿主細胞の選択を可能にしてもよい。選択遺伝子は、当技術分野では周知であり、使用される宿主細胞によって異なる。

【0099】

本開示のｆＨｂｐは、検出可能な標識等のさらなる要素、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチン標識、免疫学的に検出可能な標識（例えば、ヘマグルチニンタグ、ポリヒスチジンタグ）等を含みうることに留意されたい。ｆＨｂｐのさらなる要素は、様々な方法（例えば、親和性捕捉等）によって単離を容易にするために（例えば、ビオチンタグ、免疫学的に検出可能なタグ）提供されうる。対象のｆＨｂｐは、任意で、共有結合または非共有結合によって支持体に固定化されうる。

【0100】

ｆＨｂｐの単離及び精製は、当技術分野で公知の方法に従って達成できる。例えば、ｆＨｂｐは、一般に試料を抗ｆＨｂｐ抗体（例えば、抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、例えば、ＪＡＲ４ ＭＡｂまたは当技術分野で公知の他の適切なＪＡＲ ＭＡｂ）と接触させ、洗浄して非特異的に結合した材料を除去し、特異的に結合したｆＨｂｐを溶出することを含む免疫親和性精製によって、ｆＨｂｐを発現するように遺伝子改変された細胞溶解物から、または、合成反応混合物から単離することができる。単離されたｆＨｂｐは、透析及びタンパク質精製法で通常用いられる他の方法によってさらに精製されうる。一例では、ｆＨｂｐは、金属キレートクロマトグラフィー法を用いて単離されうる。

【0101】

宿主細胞
多数の適切な宿主細胞のいずれかがｆＨｂｐの産生に使用されうる。一般に、本明細書に記載のｆＨｂｐは、原核生物または真核生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）等の細菌内で、従来の技術に従って発現されうる。ゆえに、本開示はさらに、対象のｆＨｂｐをコードする核酸を含む遺伝子改変されたインビトロ宿主細胞を提供する。対象のｆＨｂｐの産生（大規模産生を含む）用の宿主細胞は、様々な入手可能な宿主細胞のいずれかから選択されうる。発現用の宿主細胞の例としては、原核または真核単細胞生物、例えば、細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシエ）、Ｐｉｃｈｉａ（ピキア）種等）のものが挙げられ、また、元々は高等生物、例えば、昆虫、脊椎動物、例えば、哺乳類由来の宿主細胞を挙げてもよい。適切な哺乳類細胞株としては、限定されないが、ＨｅＬａ細胞（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞等）が挙げられる。一部の例では、細菌宿主細胞及び酵母宿主細胞が、対象のｆＨｂｐ産出にとって特に重要である。

【0102】

対象のｆＨｂｐは、実質的に純粋もしくは実質的に単離された形（すなわち、実質的に他のＮｅｉｓｓｅｒｉａまたは宿主細胞のポリペプチドを含まない）または実質的に単離された形で調製されうる。対象のｆＨｂｐは、ポリペプチドが、存在しうる他の成分（例えば、他のポリペプチドまたは他の宿主細胞成分）に比べて濃縮されて組成物中で存在しうる。精製された対象のｆＨｂｐは、ポリペプチドが、他の発現ポリペプチドを実質的に含まない組成物、例えば、組成物の９０％未満、通常は６０％未満、さらに通常は５０％未満が他の発現ポリペプチドで構成されている組成物で存在するように提供されうる。

【0103】

小胞産生用の宿主細胞
対象のｆＨｂｐが膜小胞（以下でより詳細に説明する）で提供される場合、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの宿主細胞は、対象のｆＨｂｐを発現するように遺伝子改変される。様々なＮｅｉｓｓｅｒｉａ種の菌株のいずれかが、対象のｆＨｂｐを産生するために改変されてよく、また、任意で、これらは目的の他の抗原、例えば、ＰｏｒＡを産生するか、または産生するように改変されてもよく、本明細書に開示の方法で使用されうる。

【0104】

Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ菌株の遺伝子改変及び所望のポリペプチドの発現をもたらす方法及びベクターは、当技術分野で公知である。ベクター及び方法の例は、ＷＯ０２／０９７４６及びＯ’Ｄｗｙｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２：６５１１−８０に見出すことができる。強力なプロモーター、特に構成性の強力なプロモーターは、特に重要である。プロモーターの例としては、ｐｏｒＡ、ｐｏｒＢ、ｌｂｐＢ、ｔｂｐＢ、ｐ１１０、ｈｐｕＡＢ、ｌｇｔＦ、ｏｐａ、ｐ１１０、ｌｓｔ、ｈｐｕＡＢ、及びｒｍｐのプロモーターが挙げられる。

【0105】

病原性Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種または病原性Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種由来の菌株、特にヒトに対して病原性の菌株、もしくはヒトに対して病原性もしくは共生的な菌株由来の菌株は、膜小胞産生での使用に特に重要である。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種の例としては、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎ． ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ（ナイセリア・フラベセンス）、Ｎ． ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（淋菌）、Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａ（ナイセリア・ラクタミカ）、Ｎ． ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ（ナイセリア・ポリサッカレア）、Ｎ． ｃｉｎｅｒｅａ（ナイセリア・シネレア）、Ｎ． ｍｕｃｏｓａ（ナイセリア・ムコサ）、Ｎ． ｓｕｂｆｌａｖａ（ナイセリア・サブフラバ）、Ｎ． ｓｉｃｃａ（ナイセリア・シッカ）、Ｎ． ｅｌｏｎｇａｔａ（ナイセリア・エロンガタ）等が挙げられる。

【0106】

Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株は、対象のｆＨｂｐを発現させるための遺伝子改変及び小胞産生での使用のために特に重要である。小胞産生に用いられる菌株は、所望されうる多くの異なる特徴に応じて選択されうる。例えば、菌株は：所望のＰｏｒＡ型（「血清亜型」）、莢膜群、血清型等；莢膜多糖産生の低下；等に応じて選択されうる。例えば、産生株は、任意の所望のＰｏｒＡポリペプチドを産生でき、１つまたは複数のＰｏｒＡポリペプチドを発現しうる（自然に、または遺伝子操作によって）。菌株の例としては、血清亜型Ｐ１．７，１６；Ｐ１．１９，１５；Ｐ１．７，１；Ｐ１．５，２；Ｐ１．２２ａ，１４；Ｐ１．１４；Ｐ１．５，１０；Ｐ１．７，４；Ｐ１．１２，１３を与えるＰｏｒＡポリペプチド；及び血清亜型決定に用いられる従来の血清学的試薬との反応性を保っていてもいなくてもよい、かかるＰｏｒＡポリペプチドの変異体を産生するものが挙げられる。同様に重要なのは、ＰｏｒＡの可変領域（ＶＲ）タイピングに応じて特徴づけられるＰｏｒＡポリペプチドである（例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １０：６７４−６７８； Ｓａｃｃｈｉ ＣＴ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５：８４５−５５； Ｓａｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ （２０００） Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １８２：１１６９−１１７６参照）。相当数の異なるＶＲ型が特定されており、これらは、ＶＲ１及びＶＲ２ファミリーの「プロトタイプ」に分類されうる。この命名法及び以前のタイピングスキームとのその関係を記載しているウェブアクセス可能なデータベースは、ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｏｒｇ／ｎｍ／ｔｙｐｉｎｇ／ｐｏｒａで見出される。特定のＰｏｒＡ ＶＲ１及びＶＲ２型のアライメントは、Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １０：６７４−６７８に提供されている。

【0107】

代替的にまたはさらに、産生菌株は、莢膜欠損菌株でよい。莢膜欠損菌株は、ワクチンが投与される対象において、有意な自己抗体反応の誘発（例えば、宿主細胞表面のシアル酸と交差反応する抗体の産生による）のリスクの減少をもたらす小胞ベースのワクチンを与えることができる。本明細書で用いられる「莢膜欠損」または「莢膜多糖の欠損」とは、天然に存在する菌株のものより低い細菌表面の莢膜多糖のレベルを指すか、または、菌株が遺伝子改変される場合、莢膜欠損菌株が由来する親株のものより低い細菌表面の莢膜多糖のレベルを指す。莢膜欠損菌株としては、少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、またはそれより多く、表面莢膜の多糖産生が減少した菌株、及び、莢膜多糖が細菌表面で検出できない（例えば、抗莢膜多糖抗体を用いた全細胞酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によって）菌株が挙げられる。

【0108】

莢膜欠損菌株としては、天然に生じる、または組換え的に生成される遺伝子改変による莢膜欠損のものが挙げられる。天然に存在する莢膜欠損菌株（例えば、Ｄｏｌａｎ−Ｌｉｖｅｎｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １８７：１６１６−２８参照）、並びに莢膜欠損菌株の特定及び／または生成方法（例えば、Ｆｉｓｓｅｈａ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ７３：４０７０−４０８０； Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５９：４０９７−１０２； Ｆｒｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：１２１５−１２１８参照）が当技術分野で知られている。

【0109】

莢膜多糖の産生の低下をもたらすＮｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞の改変は、莢膜合成に関わる１つまたは複数の遺伝子の改変を含んでよく、改変で、例えば、改変前の親細胞に対して莢膜多糖のレベルが低下する。かかる遺伝子改変は、１つまたは複数の莢膜生合成遺伝子のヌクレオチド及び／またはアミノ酸配列の変化を含むことができ、菌株を莢膜欠損にする（例えば、１つまたは複数の莢膜生合成遺伝子での１つまたは複数の挿入、欠損、置換等によって）。莢膜欠損菌株は、１つまたは複数の莢膜遺伝子を欠いてもよく、１つまたは複数の莢膜遺伝子に対して機能しなくてもよい。

【0110】

特に重要なのは、シアル酸生合成が欠損している菌株である。かかる菌株は、ヒトシアル酸抗原と交差反応する抗シアル酸抗体を誘発するリスクが減少した小胞の産生をもたらすことができ、かつ、さらに、製造の安全の向上をもたらすことができる。シアル酸生合成が欠損している（天然に存在する改変または人工的な改変のどちらかによる）菌株は、シアル酸生合成経路における多数の異なる遺伝子のいずれかに欠損がありうる。特に重要なのは、Ｎ‐アセチルグルコサミン‐６‐ホスフェート２‐エピメラーゼ遺伝子（ｓｙｎＸ ＡＡＦ４０５３７．１またはｓｉａＡ ＡＡＡ２０４７５として知られる）によってコードされる遺伝子産物を欠損している菌株であって、この遺伝子が不活化された菌株は特に興味深い。例えば、１つの実施形態では、莢膜欠損菌株は、機能的ｓｙｎＸ遺伝子産物の産生を妨害することによって生成される（例えば、Ｓｗａｒｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７６：１５３０−４参照）。

【0111】

莢膜欠損菌株はまた、非組換え技術を用いて、例えば、殺菌性抗莢膜抗体を用いて莢膜多糖のレベルが低下した菌株を選択することによって、天然に存在する菌株から生成することもできる。

【0112】

本開示が２つ以上の菌株の使用を含む場合（例えば、対象のｆＨｂｐを提示する小胞を含む抗原性組成物を異なる菌株から産生するため）、該菌株は、１つまたは複数の菌株特性が異なるように、例えば、使用される対象のｆＨｂｐ、ＰｏｒＡ等に差がある小胞をもたらすために選択されうる。

【0113】

小胞の調製
本開示によって企図される抗原性組成物は一般に、対象のｆＨｂｐを発現するＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞から調製される小胞を含む。本明細書で言及される「小胞」は、外膜小胞及び微小胞（ブレブとも呼ばれる）を包含することを意図する。

【0114】

抗原性組成物は、対象のｆＨｂｐを発現するように遺伝子改変されたＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ種の培養株の外膜から調製された外膜小胞（ＯＭＶ）を含みうる。ＯＭＶは、ブロスまたは固体培地培養で増殖させたＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから、好ましくは、該細菌細胞を該培地から分離し（例えば、ろ過、または該細胞をペレットにする低速遠心分離等によって）、該細胞を溶解し（例えば、界面活性剤の添加、浸透圧衝撃、超音波処理、キャビテーション、均質化等によって）、及び、細胞質分子から外膜画分を分離することによって（例えば、ろ過によって；または外膜及び／または外膜小胞の示差沈殿もしくは凝集によって、もしくは外膜分子を特異的に認識するリガンドを用いたアフィニティー分離法によって；または外膜及び／または外膜小胞をペレットにする高速遠心分離によって、等）得てもよく；外膜画分は、ＯＭＶを産生するために用いられうる。

【0115】

抗原性組成物は、対象のｆＨｂｐを含む微小胞（ＭＶ）（または「ブレブ」）を含むことができ、該ＭＶまたはブレブは、対象のｆＨｂｐを発現するように遺伝子改変されたＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株の培養中に放出される。例えば、ＭＶは、ブロス培地でＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの菌株を培養し、該ブロス培地から全細胞を分離し（例えば、ろ過によって、またはより小さいブレブでなく該細胞のみをペレットにする低速遠心分離によって、等）、及び、その後、該無細胞培地に存在する該ＭＶを回収することによって（例えば、ろ過、ＭＶの示差沈殿もしくは凝集、または該ブレブをペレットにする高速遠心分離によって、等）得てもよい。ＭＶの産生用の菌株は、一般に、培養下に産生されるブレブの量を基に選択されうる（例えば、細菌は、単離及び本明細書に記載の方法における投与に適するブレブの産生をもたらす合理的な数で培養することができる）。高濃度のブレブを産生する例示的な菌株は、ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／３４６４２号に記載されている。ブレブの産生に加えて、ＭＶ産生に用いる菌株も同様に、ＮｓｐＡ産生を基に選択されてよく、より高濃度のＮｓｐＡを産生する菌株は、特に重要でありうる（異なるＮｓｐＡ産生濃度を有するＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株の例については、例えば、Ｍｏｅ ｅｔ ａｌ． （１９９９ Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６７： ５６６４）参照。ブレブの産生に用いる目的の他の菌株としては、不活化ＧＮＡ３３遺伝子を有する菌株が挙げられ、これは、細胞分離、膜構造、及び病原性に必要なリポタンパク質をコードする（例えば、Ａｄｕ−Ｂｏｂｉｅ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．７２：１９１４−１９１９参照）。

【0116】

本開示の抗原性組成物は、１つの菌株由来の、または、同種でも異種でもよく、通常は互いに異種である２、３、４、５、もしくはそれより多い菌株由来の小胞を含むことができる。例えば、菌株は、対象のｆＨｂｐが由来するＰｏｒＡ及び／またはｆＨｂｐに対して同種でも異種でもよい。小胞は、異なる変異体（ｖ．１、ｖ．２、もしくはｖ．３）または亜変異体（ｓｕｂｖａｒｉａｎｔ）（例えば、ｖ．1、ｖ．２、もしくはｖ．３の亜変異体）由来のｆＨｂｐのアミノ酸配列からなっていてもよい複数の対象のｆＨｂｐ（例えば、１、２、３、またはそれより多い対象のｆＨｂｐ）を発現する菌株から調製されうる。

【0117】

抗原性組成物は、同一のまたは異なる対象のｆＨｂｐを提示するＯＭＶとＭＶの混合物を含むことができ、対象のｆＨｂｐは、任意で、異なる組合せのｆＨｂｐ変異体及び／または亜変異体由来のエピトープを提示してもよく、ＯＭＶ及び／またはＭＶは、同一のまたは異なる菌株由来でよい。異なる菌株由来の小胞は、混合物として投与することも、順次投与することもできる。

【0118】

必要であれば（例えば、小胞の産生に用いる菌株がエンドトキシンまたは特定の高濃度のエンドトキシンに関連する場合）、小胞は、任意で処理され、エンドトキシンを減少させ、例えば、投与後の毒性を減少させる。以下に述べるように望ましくないが、エンドトキシンの低減は、適切な界面活性剤（例えば、ＢＲＩＪ−９６、デオキシコール酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ノニオン界面活性剤ＴＷＥＥＮ ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、ノニオン界面活性剤ＴＷＥＥＮ ８０、濃度０．１〜１０％、例えば、０．５〜２％、及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））での抽出によって達成されうる。界面活性剤抽出が用いられる場合、デオキシコレート以外の界面活性剤を用いることが好ましい。

【0119】

抗原性組成物の小胞は、界面活性剤なしで、例えばデオキシコレートを用いることなく調製できる。界面活性剤処理はエンドトキシン活性を除去するのに有用であるが、未変性のｆＨｂｐリポタンパク質及び／または対象のｆＨｂｐ（脂質化ｆＨｂｐを含む）を小胞産生の際の抽出によって枯渇させうる。ゆえに、界面活性剤を必要としない技術を用いてエンドトキシン活性を低下させることが特に所望されうる。１つの取り組みでは、比較的低いエンドトキシン（リポ多糖、ＬＰＳ）産生菌株を用いてヒトでの使用前の最終調製物からエンドトキシンを除去する必要性を避ける。例えば、小胞は、ワクチンで望ましくないことがあるリポオリゴ糖や他のワクチン（例えば、Ｒｍｐ）が低減または除去されたＮｅｉｓｓｅｒｉａ変異体から調製することができる。

【0120】

小胞は、リピドＡの毒性活性を低下させるか、または不検出にする遺伝子改変を含むＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株から調製されうる。例えば、かかる菌株は、リピドＡ生合成において遺伝子改変されうる（Ｓｔｅｅｇｈｓ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６７：４９８８−９３； ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６９：５９８１−９０； Ｓｔｅｅｇｈｓ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｊ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｓ １０：１１３−９； Ｆｉｓｓｈａ ｅｔ ａｌ， （２００５） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７３：４０７０）。免疫原性組成物は、ＬＰＳの改変、例えば、ｌｐｘＬ１またはｌｐｘＬ２によってそれぞれコードされる酵素の下方制御及び／または不活化によって無毒化されうる。ｌｐｘＬ１変異体でなされるペンタアシル化リピドＡの産生は、ｌｐｘＬ１でコードされる酵素が、ＧｌｃＮ ＩＩの２’位のＮ結合３−ＯＨ Ｃ１４にＣ１２を付加することを示す。ｌｐｘＬ２変異体で見られる主なリピドＡ種はテトラアシル化であり、ｌｐｘＬ２でコードされる酵素が、他のＣ１２を、すなわちＧｌｃＮ Ｉの２位のＮ結合３−ＯＨ Ｃ１４に付加することを示す。これらの遺伝子の発現を低下させる（または発現させない）（またはこれらの遺伝子産物の活性を低下させる、またはなくす）変異は、リピドＡの毒性活性を変化させる（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６９：５９８１−９０）。テトラアシル化（ｌｐｘＬ２変異体）及びペンタアシル化（ｌｐｘＬ１変異体）リピドＡは、野生型のリピドＡより毒性が低い。リピドＡ４’‐キナーゼをコードする遺伝子（ｌｐｘＫ）の変異もまた、リピドＡの毒性活性を低下させる。小胞（例えば、ＭＶまたはＯＭＶ）の産生における使用に特に重要なのは、機能性ＬｐｘＬ１コードタンパク質の低減または不検出をもたらすように遺伝子改変されたＮ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株であって、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌（例えば、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株）は遺伝子改変されて、ｌｐｘＬ１遺伝子の遺伝子産物の活性を低下させるか、またはなくす。例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌は、遺伝子改変されてｌｐｘＬ１遺伝子ノックアウトを有することができ、例えば、ｌｐｘＬ１遺伝子は破壊される。例えば、米国特許出願公開第２００９／００３５３２８号参照。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌は、遺伝子改変されてｌｐｘＬ２遺伝子の遺伝子産物の活性を低下させるか、またはなくすことができる。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌は、遺伝子改変されてｌｐｘＬ１遺伝子及びｌｐｘＬ２遺伝子の遺伝子産物の活性を低下させるか、またはなくすことができる。かかる小胞は、対象のｆＨｂｐの免疫原性を保持しながら、ＬＰＳ産生について野生型であるＮ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株と比較して毒性が低減される。

【0121】

ＬＰＳの毒性活性はまた、ポリミキシンＢ耐性（かかる耐性は、リピドＡの４’リン酸へのアミノアラビノースの付加に関連付けられている）に関わる遺伝子／座に変異を導入することによって変更されうる。これらの遺伝子／座は、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするｐｍｒＥでありうるか、または、アミノアラビノース合成及び転移に関与しうる多くの腸内細菌科に共通の抗微生物ペプチド耐性遺伝子領域でありうる。この領域に存在するｐｍｒＦ遺伝子は、ドリコールリン酸マンノシルトランスフェラーゼ（ｄｏｌｉｃｏｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍａｎｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をコードする（Ｇｕｎｎ Ｊ． Ｓ．， Ｋｈｅｎｇ， Ｂ． Ｌ．， Ｋｒｕｅｇｅｒ Ｊ．， Ｋｉｍ Ｋ．， Ｇｕｏ Ｌ．， Ｈａｃｋｅｔｔ Ｍ．， Ｍｉｌｌｅｒ Ｓ． Ｉ． １９９８． Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２７： １１７１−１１８２）。

【0122】

ホスホリレー２成分調節系（例えば、ＰｈｏＰ構成的表現型、ＰｈｏＰｃ）であるＰｈｏＰ−ＰｈｏＱ調節系の変異、または、低Ｍｇ^＋＋環境もしくは培養条件（これはＰｈｏＰ−ＰｈｏＱ調節系を活性化する）は、アミノアラビノースの４’‐リン酸への付加及びミリステートの２‐ヒドロキシミリステート置換（ミリステートのヒドロキシル化）につながる。この改変リピドＡは、ヒト内皮細胞によるＥ−セクレチン発現及びヒト単球からのＴＮＦ分泌を刺激する能力の低下を呈する。

【0123】

ポリミキシンＢ耐性菌株はまた、かかる菌株が低下したＬＰＳ毒性を有することが示されているため、使用に適する（例えば、ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９９４）： Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｉｎｔｈ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ． Ｔｈｅ Ｇｕｉｌｄｈａｌｌ， Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ， Ｅｎｇｌａｎｄ参照）。別の方法として、ポリミキシンＢの結合活性を模倣する合成ペプチドを抗原性組成物に添加し、ＬＰＳの毒性活性を減少させてもよい（例えば、Ｒｕｓｔｉｃｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：３６１−３６５； Ｐｏｒｒｏ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｒｏｇ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ．３９７：３１５−２５参照）。

【0124】

エンドトキシンはまた、培養条件の選択によっても低減されうる。例えば、培地１リットル当たりアミノアラビノースを０．１ｍｇ〜１００ｍｇ含む増殖培地で菌株を培養すると、脂質の毒性が低減される（例えば、ＷＯ０２／０９７６４６参照）。

【0125】

組成物及び製剤
「組成物」、「抗原組成物」、「抗原性組成物」、または「免疫原性組成物」は、本明細書では、便宜上、総称的に、本明細書に開示の対象のｆＨｂｐを含む組成物を指すために用いられ、その対象のｆＨｂｐは、任意で結合されてさらに免疫原性を高めてもよい。ヒトにおいて、抗体、例えば、抗Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗体、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する殺菌性抗体を誘発するために有用な組成物は、本開示によって特に企図される。抗原性組成物は、１つの、２つの、またはそれ以上の異なる対象のｆＨｂｐを含むことができる。２種以上のｆＨｂｐがある場合、各対象のｆＨｂｐは、異なる組合せのｆＨｂｐ変異体及び／または亜変異体由来のエピトープを提示しうる。

【0126】

抗原性組成物は、免疫学的に有効な量の対象のｆＨｂｐを含み、さらに、必要に応じて他の相溶性成分を含んでもよい。本開示の組成物は、低ｆＨ結合剤であるｆＨｂｐを含むことができる。組成物は、少なくとも１つのｆＨｂｐが低ｆＨ結合剤である１つまたは複数のｆＨｂｐを含む。組成物中に２つ以上のｆＨｂｐがある場合、各ｆＨｂｐは異なりうる（例えば、アミノ酸配列及び／または結合において）。

【0127】

一部の例では、本開示の抗原性組成物は、本開示の１つのｆＨｂｐ変異体のみを含む。一部の例では、本開示の抗原性組成物は、本開示の２つ以上の異なるｆＨｂｐ変異体を含む。非限定的な例として、一部の例では、本開示の抗原性組成物は、以下を含む：
（１）ｆＨｂｐ ＩＤ１の第一の変異体であって、Ｑ３８でのアミノ酸置換（例えば、Ｑ３８Ｒ）を含む第一のｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ１の第二の変異体であって、Ｅ９２でのアミノ酸置換（例えば、Ｅ９２Ｋ）を含む第二のｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；
（２）ｆＨｂｐ ＩＤ１の第一の変異体であって、Ｑ３８でのアミノ酸置換（例えば、Ｑ３８Ｒ）を含む第一のｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ１の第二の変異体であって、Ｒ１３０でのアミノ酸置換（例えば、Ｒ１３０Ｇ）を含む第二のｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；
（３）ｆＨｂｐ ＩＤ１の第一の変異体であって、Ｑ３８でのアミノ酸置換（例えば、Ｑ３８Ｒ）を含む第一のｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ１の第二の変異体であって、Ｓ２２３でのアミノ酸置換（例えば、Ｓ２２３Ｒ）を含む第二のｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；
（４）ｆＨｂｐ ＩＤ１の第一の変異体であって、Ｑ３８でのアミノ酸置換（例えば、Ｑ３８Ｒ）を含む第一のｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ１の第二の変異体であって、Ｈ２４８でのアミノ酸置換（例えば、Ｈ２４８Ｌ）を含む第二のｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；
（５）ｆＨｂｐ ＩＤ２２の変異体であって、Ｎ１１５でのアミノ酸置換（例えば、Ｎ１１５Ｉ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ１の変異体であって、Ｑ３８でのアミノ酸置換（例えば、Ｑ３８Ｒ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；
（６）ｆＨｂｐ ＩＤ２２の変異体であって、Ｄ１２１でのアミノ酸置換（例えば、Ｄ１２１Ｇ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ１の変異体であって、Ｅ９２でのアミノ酸置換（例えば、Ｅ９２Ｋ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；
（７）ｆＨｂｐ ＩＤ２２の変異体であって、Ｓ１２８でのアミノ酸置換（例えば、Ｓ１２８Ｔ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ１の変異体であって、Ｈ２４８でのアミノ酸置換（例えば、Ｈ２４８Ｌ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；
（８）ｆＨｂｐ ＩＤ２２の変異体であって、Ｖ１３１でのアミノ酸置換（例えば、Ｖ１３１Ｄ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ１の変異体であって、Ｑ３８でのアミノ酸置換（例えば、Ｑ３８Ｒ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；
（９）ｆＨｂｐ ＩＤ２２の変異体であって、Ｋ２１９でのアミノ酸置換（例えば、Ｋ２１９Ｎ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ１の変異体であって、Ｑ３８でのアミノ酸置換（例えば、Ｑ３８Ｒ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；
（１０）ｆＨｂｐ ＩＤ２２の変異体であって、Ｇ２２０でのアミノ酸置換（例えば、Ｇ２２０Ｓ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ１の変異体であって、Ｑ３８でのアミノ酸置換（例えば、Ｑ３８Ｒ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；
（１１）ｆＨｂｐ ＩＤ２２の変異体であって、Ｎ１１５でのアミノ酸置換（例えば、Ｎ１１５Ｉ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ５５の変異体であって、Ｅ９２でのアミノ酸置換（例えば、Ｅ９２Ｋ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体；
（１２）ｆＨｂｐ ＩＤ２２の変異体であって、Ｄ１２１でのアミノ酸置換（例えば、Ｄ１２１Ｇ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ５５の変異体であって、Ｓ２２３でのアミノ酸置換（例えば、Ｓ２２３Ｒ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体；
（１３）ｆＨｂｐ ＩＤ２２の変異体であって、Ｓ１２８でのアミノ酸置換（例えば、Ｓ１２８Ｔ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ５５の変異体であって、Ｈ２４８でのアミノ酸置換（例えば、Ｈ２４８Ｌ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体；
（１４）ｆＨｂｐ ＩＤ２２の変異体であって、Ｖ１３１でのアミノ酸置換（例えば、Ｖ１３１Ｄ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ５５の変異体であって、Ｅ９２でのアミノ酸置換（例えば、Ｅ９２Ｋ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体；
（１５）ｆＨｂｐ ＩＤ２２の変異体であって、Ｋ２１９でのアミノ酸置換（例えば、Ｋ２１９Ｎ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ５５の変異体であって、Ｅ９２でのアミノ酸置換（例えば、Ｅ９２Ｋ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体；
（１６）ｆＨｂｐ ＩＤ２２の変異体であって、Ｇ２２０でのアミノ酸置換（例えば、Ｇ２２０Ｓ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ５５の変異体であって、Ｅ９２でのアミノ酸置換（例えば、Ｅ９２Ｋ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体；
（１７）ｆＨｂｐ ＩＤ１の第一の変異体であって、Ｅ９２でのアミノ酸置換（例えば、Ｅ９２Ｋ）を含む第一のｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ１の第二の変異体であって、Ｈ２４８でのアミノ酸置換（例えば、Ｈ２４８Ｌ）を含む第二のｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；
（１８）ｆＨｂｐ ＩＤ１の第一の変異体であって、Ｅ９２でのアミノ酸置換（例えば、Ｅ９２Ｋ）を含む第一のｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ１の第二の変異体であって、Ｓ２２３でのアミノ酸置換（例えば、Ｓ２２３Ｒ）を含む第二のｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；
（１９）ｆＨｂｐ ＩＤ２２の第一の変異体であって、Ｎ１１５でのアミノ酸置換（例えば、Ｎ１１５Ｉ）を含む第一のｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ２２の第二の変異体であって、Ｄ２１１でのアミノ酸置換（例えば、Ｄ２１１Ａ）を含む第二のｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；
（２０）ｆＨｂｐ ＩＤ２２の第一の変異体であって、Ｎ１１５でのアミノ酸置換（例えば、Ｎ１１５Ｉ）を含む第一のｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ２２の第二の変異体であって、Ｋ２１９でのアミノ酸置換（例えば、Ｋ２１９Ｎ）を含む第二のｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；
（２１）ｆＨｂｐ ＩＤ２２の第一の変異体であって、Ｎ１１５でのアミノ酸置換（例えば、Ｎ１１５Ｉ）を含む第一のｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ２２の第二の変異体であって、Ｇ２２０でのアミノ酸置換（例えば、Ｇ２２０Ｓ）を含む第二のｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；
（２２）ｆＨｂｐ ＩＤ２２の第一の変異体であって、Ｄ１２１でのアミノ酸置換（例えば、Ｄ１２１Ｇ）を含む第一のｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ２２の第二の変異体であって、Ｇ２２０でのアミノ酸置換（例えば、Ｇ２２０Ｓ）を含む第二のｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；
（２３）ｆＨｂｐ ＩＤ２２の第一の変異体であって、Ｓ１２８でのアミノ酸置換（例えば、Ｓ１２８Ｔ）を含む第一のｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ２２の第二の変異体であって、Ｇ２２０でのアミノ酸置換（例えば、Ｇ２２０Ｓ）を含む第二のｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；
（２４）ｆＨｂｐ ＩＤ２２の第一の変異体であって、Ｖ１３１でのアミノ酸置換（例えば、Ｖ１３１Ｄ）を含む第一のｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ２２の第二の変異体であって、Ｇ２２０でのアミノ酸置換（例えば、Ｇ２２０Ｓ）を含む第二のｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体；
（２５）ｆＨｂｐ ＩＤ５５の第一の変異体であって、Ｅ９２でのアミノ酸置換（例えば、Ｅ９２Ｋ）を含む第一のｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ５５の第二の変異体であって、Ｓ２２３でのアミノ酸置換（例えば、Ｓ２２３Ｒ）を含む第二のｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体；
（２６）ｆＨｂｐ ＩＤ５５の第一の変異体であって、Ｅ９２でのアミノ酸置換（例えば、Ｅ９２Ｋ）を含む第一のｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体；及びｆＨｂｐ ＩＤ５５の第二の変異体であって、Ｈ２４８でのアミノ酸置換（例えば、Ｈ２４８Ｌ）を含む第二のｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体；
（２７）アミノ酸置換Ｌ１３０Ｒ及びＧ１３３Ｄを含むｆＨｂｐ ＩＤ２２の変異体並びにｆＨｂｐ ＩＤ１の変異体であって、Ｓ２２３でのアミノ酸置換（例えば、Ｓ２２３Ｒ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；
（２８）アミノ酸置換Ｌ１３０Ｒ及びＧ１３３Ｄを含むｆＨｂｐ ＩＤ２２の変異体並びにｆＨｂｐ ＩＤ１の変異体であって、Ｈ２４８でのアミノ酸置換（例えば、Ｈ２４８Ｌ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；
（２９）アミノ酸置換Ｌ１３０Ｒ、Ｇ１３３Ｄ、及びＫ２１９Ｎを含むｆＨｂｐ ＩＤ２２の変異体並びにｆＨｂｐ ＩＤ１の変異体であって、Ｓ２２３でのアミノ酸置換（例えば、Ｓ２２３Ｒ）もしくはＨ２４８でのアミノ酸置換（例えば、Ｈ２４８Ｌ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ１変異体；または
（３０）アミノ酸置換Ｌ１３０Ｒ、Ｇ１３３Ｄ、及びＧ２２０Ｓを含むｆＨｂｐ ＩＤ２２の変異体並びにｆＨｂｐ ＩＤ１の変異体であって、Ｓ２２３でのアミノ酸置換（例えば、Ｓ２２３Ｒ）もしくはＨ２４８でのアミノ酸置換（例えば、Ｈ２４８Ｌ）を含むｆＨｂｐ ＩＤ１変異体。

【0128】

本開示によって企図される免疫原性組成物としては、限定されないが、
（１）少なくとも１つの本開示の変異体ｆＨｂｐ；及び
（２）ＮｓｐＡを含む組成物
が挙げられ、ｆＨｂｐ及び／またはＮｓｐＡは、組換えタンパク質として、及び／または小胞ベースの組成物（例えば、ＯＭＶもしくはＭＶ）中に提供されうる。組成物がＮｓｐＡ及びｆＨｂｐをともに含む場合、該組成物の投与によって誘発される抗体の殺菌活性は、一方または両方の抗原に対する抗体の協同に起因しうることに留意されたい。本開示が提供する免疫原性組成物の例としては、
（ａ）上記のｆＨｂｐ変異体（例えば、変異体ｆＨｂｐがＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対して殺菌性抗体反応を誘発する場合）を含む免疫原性組成物；
（ｂ）上記のｆＨｂｐ変異体（例えば、変異体ｆＨｂｐがＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも１菌株に対して殺菌性抗体反応を誘発する場合）、及び組換えＮｓｐＡタンパク質を含む免疫原性組成物；
（ｃ）コードされた変異体ｆＨｂｐが遺伝子改変宿主細胞によって産生されるように、本開示の変異体ｆＨｂｐをコードする核酸で遺伝子改変された遺伝子改変Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞から得られる天然ＯＭＶであって、該コードされた変異体ｆＨｂｐを含む、ＯＭＶ
を含む、免疫原性組成物；並びに
（ｄ）コードされた天然に存在しないｆＨｂｐが遺伝子改変宿主細胞によって産生されるように、本開示の変異体ｆＨｂｐをコードする核酸で遺伝子改変された遺伝子改変Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞から得られる天然ＯＭＶであって、該コードされた変異体ｆＨｂｐを含む、ＯＭＶ
を含む、免疫原性組成物
であり、該ＯＭＶがＮｓｐＡも含むように該Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞が高濃度のＮｓｐＡも産生する、組成物
が挙げられる。例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞は、ＮｓｐＡの発現を増加させるために遺伝子改変されるものでありうる。

【0129】

「免疫学的に有効な量」とは、一連の同一または異なる抗原性組成物の一部としての単回投与において、その量の個体への投与が、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、特にＮ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、より具体的にはＮ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＢ群による感染の症状もしくは感染によって引き起こされる疾患の治療または保護に有効な抗体反応を誘発するのに有効であることを意味する。この量は、治療される個体の健康及び身体的状態、年齢、該個体の免疫系の抗体産生能、所望の保護の程度、ワクチンの処方、治療臨床医の医学的状況の判断、及び他の関連する要因によって異なる。量は、通常の試験によって決定されうる比較的広範囲に入ることになることが予測される。

【0130】

ＮｓｐＡポリペプチドのアミノ酸配列は当技術分野で公知である。例えば、ＷＯ９６／２９４１２；及びＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５：１１７３；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ５２０６６；及びＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＤ５３２８６参照。「ＮｓｐＡポリペプチド」は、図４０に示され、配列番号２５に記載のアミノ酸配列の約７５アミノ酸から約１００アミノ酸、約１００アミノ酸から約１５０アミノ酸、または約１５０アミノ酸から約１７４アミノ酸の連続ストレッチと、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。「ＮｓｐＡポリペプチド」は、図４０に示され、配列番号２５に記載のアミノ酸配列のアミノ酸２０〜１７４の、約７５アミノ酸から約１００アミノ酸、または約１００アミノ酸から約１５５アミノ酸の連続ストレッチと、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。一部の例では、ＮｓｐＡポリペプチドはシグナル配列を欠いており；他の例では（例えば、宿主細胞での発現のため）ＮｓｐＡポリペプチドは、シグナル配列を含む。

【0131】

投薬レジメンは、単回投与計画または単位剤形の抗原性組成物を異なる時間に投与する複数回投与計画（例えば、ブースター投与を含む）であってもよい。本明細書で用いられる用語「単位剤形」とは、ヒト及び動物対象用に単一の用量として適する物理的に個別の単位を指し、各単位は本開示の抗原性組成物の所定量を、所望の効果をもたらすために十分な量で含み、この組成物は医薬的に許容される賦形剤（例えば、医薬的に許容される希釈剤、担体、または媒体）を伴って提供される。抗原性組成物は、他の免疫調節剤と組み合わせて投与されうる。

【0132】

抗原性組成物は、多くの場合、生理食塩水である滅菌水溶液等の溶液でありうる医薬的に許容される賦形剤中に提供されうるか、または、粉体形態で提供されうる。かかる賦形剤は、必要に応じて、実質的に不活性でありうる。

【0133】

いくつかの実施形態では、対象の免疫原性組成物は、小胞中に存在する対象のｆＨｂｐを含む。いくつかの実施形態では、対象の免疫原性組成物は、ＭＶ中に存在する対象のｆＨｂｐを含む。いくつかの実施形態では、対象の免疫原性組成物は、ＯＭＶ中に存在する対象のｆＨｂｐを含む。いくつかの実施形態では、対象の免疫原性組成物は、対象のｆＨｂｐを含むＭＶとＯＭＶの混合物を含む。ＭＶ及びＯＭＶ等の小胞は、上記に記載されている。

【0134】

抗原性組成物は、さらにアジュバントを含むことができる。ヒトで使用できる既知の適切なアジュバントの例としては、必ずしも限定されないが、アルミニウムアジュバント（例えば、リン酸アルミニウム、または水酸化アルミニウム）、ＭＦ５９（４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．５％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ８０（商標）、０．５％ｗ／ｖ Ｓｐａｎ８５）、ＣｐＧ含有核酸（シトシンはメチル化されていない）、ＱＳ２１、ＭＰＬ、３ＤＭＰＬ、Ａｑｕｉｌｌａ抽出物、ＩＳＣＯＭＳ、ＬＴ／ＣＴ変異体、ポリ（Ｄ，Ｌ‐ラクチド‐ｃｏ‐グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、Ｑｕｉｌ Ａ、インターロイキン、等が挙げられる。実験動物に対しては、フロイントアジュバント（不完全フロイントアジュバント；完全フロイントアジュバント）、Ｎ‐アセチルムラミル‐Ｌ‐トレオニル‐Ｄ‐イソグルタミン（ｔｈｒ‐ＭＤＰ）、Ｎ‐アセチル‐ノル‐ムラミル‐Ｌ‐アラニル‐Ｄ‐イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル‐ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ‐アセチルムラミル‐Ｌ‐アラニル‐Ｄ‐イソグルタミニル‐Ｌ‐アラニン‐２‐（１’‐２’‐ジパルミトイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ‐ＰＥと呼ばれる）、並びに２％のスクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルションに細菌から抽出された３つの成分であるモノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含むＲＩＢＩを使用することができる。アジュバントの有効性は、免疫原性抗原またはその抗原性エピトープに対する抗体の量を測定することによって判断することができる。

【0135】

組成物の有効性を高めるためのさらなる例示的なアジュバントとして挙げられるのは、限定されないが、（１）水中油型エマルション製剤（ムラミルペプチド（以下参照）または細菌細胞壁成分等の他の特定の免疫促進物質を含むまたは含まない）、例えば、（ａ）５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、及び０．５％Ｓｐａｎ８５を含み（任意でＭＴＰ−ＰＥを含む）、マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に形成されているＭＦ５９（ＷＯ９０／１４８３７；Ｃｈａｐｔｅｒ １０ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ： ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ， ｅｄｓ． Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９５）、（ｂ）１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、及びｔｈｒ‐ＭＤＰを含み、サブミクロンエマルションにミクロ流動化されているか、またはボルテックスされてより大きな粒径のエマルションを生じているＳＡＦ、並びに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、及び１つまたは複数の細菌細胞壁成分、例えば、モノホスホリルリピド（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）を含むＲＩＢＩアジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ；モンタナ州ハミルトン）、例えば、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））；（２）サポニンアジュバント、例えば、ＱＳ２１またはＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、マサチューセッツ州ウースター）が使用されてもよく、またはそれらから形成された粒子、例えば、追加の界面活性剤がなくてもよいＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）、例えば、ＷＯ００／０７６２１；（３）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）または不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（４）サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＷＯ９９／４４６３６）等）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等；（５）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、例えば、ＧＢ−２２２０２２１、ＥＰ−Ａ−０６８９４５４、任意で、肺炎球菌の糖類とともに使用される場合は、実質的にアラムの不在下、例えば、ＷＯ００／５６３５８；（６）３ｄＭＰＬの、例えば、ＱＳ２１及び／または水中油型エマルションとの組合せ、例えば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１；（７）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（例えば、ＷＯ９８／５２５８１参照）、例えば、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含み、シトシンがメチル化されていないオリゴヌクレオチド；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えばＷＯ９９／５２５４９参照）；（９）ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤とオクトキシノールの組合せ（ＷＯ０１／２１２０７）またはポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエステル界面活性剤とオクトキシノール等の少なくとも１つのさらなるノニオン界面活性剤との組合せ（ＷＯ０１／２１１５２）；（１０）サポニン及び免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（ＷＯ００／６２８００）；（１１）免疫刺激剤及び金属塩粒子、例えばＷＯ００／２３１０５；（１２）サポニン及び水中油型エマルション、例えばＷＯ９９／１１２４１；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（任意で、＋ステロール）、例えば、ＷＯ９８／５７６５９；（１４）免疫刺激剤として作用して組成物の有効性を高める他の物質である。ムラミルペプチドとしては、Ｎ‐アセチルムラミル‐Ｌ‐トレオニル‐Ｄ‐イソグルタミン（ｔｈｒ‐ＭＤＰ）、Ｎ‐２５アセチル‐ノルムラミル‐Ｌ‐アラニル‐Ｄ‐イソグルタミン（ノル‐ＭＤＰ）、Ｎ‐アセチルムラミル‐Ｌ‐アラニル‐Ｄ‐イソグルタルニニル‐Ｌ‐アラニン‐２‐（１’‐２’‐ジパルミトイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミンＭＴＰ‐ＰＥ）等が挙げられる。ヒトへの投与に適したアジュバントは特に重要である。一部の例では、アジュバントは、アルミニウム塩アジュバント（例えば、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）である。

【0136】

抗原組成物は、他の成分、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム、カーボネート等を含んでよい。組成物は、必要に応じて生理的条件に近づけるために、ｐＨ調整及び緩衝剤、毒性調整剤等、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等の医薬的に許容される補助物質を含んでよい。

【0137】

対象のｆＨｂｐの製剤中濃度は、大きく変化しうる（例えば、約０．１重量％未満から、例えば、約２重量％または少なくとも約２重量％から２０重量％〜５０重量％もしくはそれより多くまで）とともに、通常は主に液体体積、粘度、並びに選択される特定の投与方法及び患者の必要性による患者に基づく要因に基づいて選択される。

【0138】

ｆＨｂｐ含有製剤は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、エアロゾル等の形態で提供されうる。経口投与は、組成物を消化から保護する必要がありうることが認識される。これは、通常、組成物を酸及び酵素加水分解に対して耐性にする薬剤と関連させるか、または組成物を適切に耐久性のある担体に包装するかのどちらかによって達成される。消化からの保護手段は、当技術分野では周知である。

【0139】

ｆＨｂｐ含有製剤はまた、投与後のｆＨｂｐの血清中半減期を延ばすようにも提供されうる。例えば、単離されたｆＨｂｐが注射用に処方される場合、該ｆＨｂｐは、リポソーム製剤にコロイドとして調製されて提供されても、血清中半減期を延ばすための他の従来の技術で提供されてもよい。Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｅｎｇ． ９：４６７ （１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、及び第４，８３７，０２８号に記載の通り、様々な方法がリポソームの調製に利用可能である。これらの調製物はまた、制御放出または徐放性形態で提供されうる。

【0140】

免疫反応の誘導方法
本開示は、哺乳類宿主において、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの少なくとも１菌株に対する免疫反応の誘導方法を提供する。本方法は、概して、有効量の対象の免疫原性組成物を、それを必要とする個体に投与する段階を含む。

【0141】

ｆＨｂｐ含有抗原性組成物は、一般に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ疾患の罹患リスクにあるヒト対象に投与され、疾患及びその合併症の発症を予防または少なくとも部分的に停止させる。これを達成するために適切な量を「治療有効用量」と定義する。治療的使用に有効な量は、例えば、抗原性組成物、投与方法、患者の体重及び全身健康状態、並びに処方医師の判断によることになる。抗原性組成物の単回または複数回投与は、患者によって必要でかつ認容される用量と頻度、及び投与方法に応じて投与されうる。

【0142】

ｆＨｂｐ含有抗原性組成物は、一般に、免疫反応、特に体液性免疫反応、例えば、殺菌性抗体反応を宿主において誘発するのに有効な量で投与される。上記のように、免疫化のための量は多様であり、一般に、７０ｋｇの患者当たり約１μｇ〜１００μｇ、通常５μｇ〜５０μｇ／７０ｋｇに及びうる。かなり高い用量（例えば、１０ｍｇ〜１００ｍｇまたはそれより多く）が、経口、経鼻、または局所的投与経路に適する場合がある。初回投与の後、異なるｆＨｂｐを含有する同じ抗原性組成物の追加免疫を行うことができる。一部の例では、ワクチン接種は少なくとも１回の追加免疫、また、一部の例では２回の追加免疫を含む。

【0143】

一般に、免疫化は、組成物を、経口的、経鼻的、鼻咽頭的、非経口的、経腸的、経胃的、局所的、経皮的、皮下的、筋肉内投与を含む任意の適切な経路で、錠剤、固体、粉末、液体、エアロゾルの形態で、局部的または全身的に、添加賦形剤の有無にかかわらず投与することによって達成されうる。非経口的に投与可能な組成物の実際的な調製方法は、当業者には既知であるかまたは明白であり、また、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １５ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ． （１９８０）等の刊行物により詳細に記載されている。

【0144】

抗ｆＨｂｐの免疫反応は、既知の方法（例えば、初回免疫化の前後に個体から血清を採取し、個体の免疫状態の変化を示すことによって、例えば、免疫沈降アッセイ、ＥＬＩＳＡ、または殺菌アッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、またはフローサイトメトリーアッセイ等）によって評価されうる。

【0145】

本開示の変異体ｆＨｂｐが、哺乳類宿主においてＮ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１つまたは複数の菌株に対して殺菌反応を誘発するかどうかは、任意の周知のアッセイを用いて判断できる。例えば、ヒトｆＨを発現するヒトｆＨトランスジェニックマウス（例えば、ヒトｆＨが該マウスの血清中に約１００μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌを超える濃度で存在する）を用いることができる。本開示の変異体ｆＨｂｐを、ヒトｆＨトランスジェニックマウスに投与する。一定の時間後、該マウス由来の血清を、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１つまたは複数の菌株に対する殺菌活性について試験する。適切な対照としては、例えばｆＨｂｐ ＩＤ１が挙げられる。適切なアッセイの例は、Ｖｕ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｓｃｉ． Ｒｅｐｏｒｔｓ ２：３４１に記載されている。

【0146】

抗原性組成物は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに関して免疫学的に未感作の哺乳類宿主（例えば、ヒト対象）に投与されうる。特定の実施形態では、対象は約５歳以下、好ましくは約２歳以下のヒト小児であり、抗原性組成物は、以下の時点のいずれか１回以上で投与される：生後２週、１か月、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１ヶ月、もしくは１歳もしくは１５、１８、もしくは２１か月、または２、３、４、もしくは５歳。

【0147】

一般に、疾患の症状の初期徴候に先立って、または感染もしくは疾患への潜在的もしくは実際の暴露の初期徴候の時点（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａによる暴露もしくは感染による）で免疫化を始めることが所望されうる。

【実施例】

【0148】

以下の実施例は、当業者に対して、本発明の作製及び使用方法の完全な開示並びに説明を提供するために記載するものであって、本発明者らが、彼らの発明として見なすものの範囲を限定することを意図せず、また、以下の実験が行われたすべてまたは唯一の実験であることを表すことも意図しない。用いた数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを確保するための試みがなされたが、いくらかの実験誤差及び偏差は考慮されたい。別段の指示のない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。標準的な略語、例えば、ｂｐ、塩基対；ｋｂ、キロベース；ｐｌ、ピコリットル；ｓまたはｓｅｃ、秒；ｍｉｎ、分；ｈまたはｈｒ、時間；ａａ、アミノ酸；ｋｂ、キロベース；ｂｐ、塩基対；ｎｔ、ヌクレオチド；ｉ．ｍ．、筋肉内（に）；ｉ．ｐ．、腹腔内（に）；ｓ．ｃ．、皮下（に）；等が用いられることがある。

【0149】

実施例１：ｆＨｂｐ ＩＤ１変異体の特定及び特性評価
材料及び方法
ライブラリースクリーニング
ランダム変異体ｆＨｂｐライブラリーを、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成し、これに続いて、ＰＣＲ産物を、Ｅ． ｃｏｌｉでの表面提示を可能にするシグナル配列を含むｐＥＴ２８発現プラスミドにクローニングした。蛍光活性化細胞選別を用い、ｆＨｂｐ変異体の十分な発現と適切な折り畳みを確保した、ヒトｆＨの結合が低く対照の抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体の結合が高い変異体クローンを単離した。回収された細胞を寒天プレート（硫酸カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天）上に播種し、これを３７℃で一夜インキュベートした。単一のＥ． ｃｏｌｉコロニーをＰＣＲ増幅の鋳型として用い、ＤＮＡ増幅産物を精製し（ＰＣＲ精製キット；Ｑｉａｇｅｎ）、Ｔ７プロモーター及びＴ７ターミネーターにアニールするプライマーを用いてｆＨｂｐ遺伝子のＤＮＡ配列決定に供した。このランダム変異体ｆＨｂｐライブラリーのスクリーニング手法は：（１）その結晶構造のみからは予測できないｆＨ結合に作用する位置；及び（２）アラニン置換がｆＨ結合の十分な低下をもたらさない場合におけるｆＨの結合に作用するアラニン以外の置換を特定する可能性を有する。

【0150】

詳細検討用の変異体の選択
ＦＡＣＳ実験で特定されたアミノ酸置換の位置を、ｆＨｂｐとヒトｆＨフラグメントとの複合体において、結晶構造で調べた。ｆＨ結合界面の近位（＜５Å）にあった変異体を部位特異的突然変異用に選択した。部位特異的突然変異によるライブラリーの変異体の反復発生は、さらなる特性決定用の可溶性組換えｆＨｂｐタンパク質の生成に必要であった。この手法はまた、これら選別されたクローンの多くに存在しｆＨ結合部位から離れた、所望されない二次変異を排除した。この部位特異的変異体は、Ｐｈｕｓｉｏｎ部位特異的突然変異誘発キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）で構築した。

【0151】

可溶性の変異体ｆＨｂｐの発現及び精製
可溶性の組換えｆＨｂｐをＥ． ｃｏｌｉで発現させ、溶解物を先に記載の通り調製した。ｆＨｂｐは、ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰカラム（５ｍｌ；ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）及びＡｋｔａ Ｐｕｒｉｆｉｅｒクロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたニッケルアフィニティークロマトグラフィーで精製した。イミダゾール勾配を用いた結合及び溶出用緩衝液は、カラムのメーカーのプロトコルに従って調製した。精製されたｆＨｂｐを含む画分を合わせ、スクロース３％を含むＰＢＳに対して透析し、使用まで−８０℃で保存した。

【0152】

マウスの免疫原性の検討用に、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラム（５ｍｌ；ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのイオン交換クロマトグラフィーを用いた第二の精製段階を行った。これらの結合及び溶出緩衝液は、ＮａＣｌをそれぞれ１５０ｍＭ及び７５０ｍＭ含むｐＨ５．５の２５ｍＭ ＭＥＳであった。結合したｆＨｂｐをこのＳＰカラムから、これら結合及び溶出緩衝液で形成した直線勾配で溶出した。精製されたｆＨｂｐを含む画分を合わせ、スクロース３％を含むＰＢＳに対して透析し、使用まで−８０℃で保存した。

【0153】

ヒトＨ因子（ｆＨ）の精製
ヒトｆＨをｆＨｂｐアフィニティーカラムにて精製した。このカラムは、メーカーのプロトコルを用い、５ｍｇのｆＨｂｐ ＩＤ１をＮＨＳ活性化ＨＰカラム（５ｍｌ；ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に結合させて調製した。健常人ドナー由来のヒト血清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１：１に希釈した。この血清を該カラムに載せ、このカラムを１０倍体積（すなわち５０ｍｌ）のＰＢＳで洗浄した。結合したｆＨを５カラム体積のｐＨ２．７の０．１Ｍグリシン−ＨＣｌで溶出した。溶出画分をｐＨ９．０の１Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ５０μｌを含む試験管にとった。ｆＨを含む画分は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で同定した。電気泳動は、１ｘＭＥＳランニング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、２００Ｖで４５分間行った。これらのタンパク質は、クマシーＧ−２５０（ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色することによって可視化した。ｆＨを含む画分をプールし、ＰＢＳに対して透析し、ｆＨの分量を使用まで−３０℃で保存した。

【0154】

ｆＨｂｐ変異体の特性評価
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。精製されたｆＨｂｐ変異体タンパク質のサイズ及び純度を、４〜１２％ポリアクリルアミド勾配ゲル（ＮｕＰＡＧＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにて評価した。各タンパク質２μｇをこのゲルにロードした。ｆＨについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを上記の通り行った。

【0155】

酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によるｆＨのｆＨｂｐへの結合。９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルを、２μｇ／ｍｌの精製組換え野生型ｆＨｂｐ（陽性対照）または変異体ｆＨｂｐ（実験）にて被覆した。これらウェルへの非特異的結合は、１％ＢＳＡ（Ｌｉｆｅｂｌｏｏｄ Ｍｅｄｉｃａｌ， Ｉｎｃ．）または５％脱脂粉乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ；Ｎｅｓｔｌｅ，Ｉｎｃ．）を含むＰＢＳでブロックした。希釈緩衝液（Ｔｗｅｅｎ−２０ ０．１％、アジ化ナトリウム０．０１％、及びＢＳＡ１％を含むＰＢＳ）で２５〜０．００１６μｇ／ｍｌの範囲で５倍連続希釈した精製ヒトｆＨをこれらのウェルに加え、このプレートを室温で２時間インキュベートした。Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ）０．１％及びアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）０．０１％を含むＰＢＳで３回洗浄した後、結合ｆＨを希釈緩衝液中ヒツジ抗ヒトｆＨ（１：７，０００；Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ．）で検出した。このプレートを室温で１時間インキュベートした。これらのウェルを再度洗浄した後、結合一次抗体を、希釈緩衝液中アルカリホスファターゼ結合ロバ抗ヒツジＩｇＧ（１：５，０００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．）で検出した。このプレートを室温で１時間インキュベートし、これらのウェルを再度洗浄した。このＥＬＩＳＡは、基質緩衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ９．８）中ホスファターゼの基質（１ｍｇ／ｍｌのパラ‐ニトロフェニルホスフェート；Ｓｉｇｍａ）を用いて発色させた。室温で３０分間インキュベートした後、４０５ｎｍの吸光度をＵＶ−ＶＩＳプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ １９０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）で測定した。

【0156】

ＥＬＩＳＡによる抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体のｆＨｂｐへの結合。マイクロタイタープレートのウェルをｆＨｂｐで被覆し、ｆＨのＥＬＩＳＡに関して、上記の通りブロック及び洗浄した。希釈緩衝液で２５〜０．００１６μｇ／ｍｌに５倍連続希釈したマウス抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を添加し、このプレートを室温で１時間インキュベートした。これらのウェルを洗浄した後、一次抗体をアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５，０００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で検出した。このＥＬＩＳＡを上記の通り発色し読み取った。

【0157】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるｆＨのｆＨｂｐへの結合。ＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００ Ｐｌｕｓ機器（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて行った。３０００反応単位の精製ヒトｆＨを、アミンカップリングキット（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＣＭ５チップ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に結合させた。ｆＨをフローセル２に固定化し、参照用にブランクの固定化（ｆＨなし）をフローセル１で行った。ＥＤＴＡ３ｍＭ及びＳｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ−２０（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）０．０５％を含むＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水からなる３回のスタートアップサイクル並びに１００ｍＭグリシン、３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．０での再生を行い、チップ表面をコンディショニングした。１００〜１ｎＭ（野生型）または３１６〜３．１６ｎＭに及ぶ精製組換えｆＨｂｐの希釈物を１５０秒間注入した。解離を３００秒間監視し、これらのデータをＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００評価ソフトウェアで分析した。

【0158】

マウスの免疫原性。野生型ＣＤ−１マウス群（Ｎ＝１４〜２１）を、水酸化アルミニウムで吸着したｆＨｂｐワクチンで免疫化した。ワクチンの各用量は、ｆＨｂｐ１０μｇ及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ）６００μｇを１０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５中に含んでいた。２用量を３週間空けて与え、２回目の投与の３週間後、心穿刺によって採血した。血液を処理して血清を得、長期保存（＞２週間）については−８０℃、または短期保存（＜２週間）については４℃で維持した。

【0159】

ヒトｆＨトランスジェニックＢＡＬＢ／ｃマウスを最初にスクリーニングし、ｆＨｂｐ ＥＬＩＳＡ及び精製ヒトｆＨの標準曲線を用いて、血清中のヒトｆＨ濃度が＞２４０μｇ／ｍｌである動物を特定した。このＥＬＩＳＡは、プレートに固定化された精製ｆＨｂｐ ＩＤ１を用いて行い、ｆＨを検出するための一次及び二次抗体は上記と同じであった（「ＥＬＩＳＡによるｆＨのｆＨｂｐへの結合」参照）。

【0160】

トランスジェニックマウス群（Ｎ＝１１〜２１）を、水酸化アルミニウムで吸着したｆＨｂｐワクチンで免疫化した（上記野生型ＣＤ−１マウス用と同量の抗原及びアジュバント）。３用量を３週間間隔で投与し、３回目のワクチン投与の３週間後、採血した。血清を処理し、上記の通り保存した。

【0161】

血清の殺菌性抗体（ＳＢＡ）反応。ヒト補体媒介ＳＢＡ反応を、それぞれのワクチン抗原と比較して同一またはほぼ一致したｆＨｂｐ配列を有する髄膜炎菌株に対して測定した。これらの細菌は、４ｍＭの乳酸及び０．０２ｍＭのＣＭＰ−ＮＡＮＡを含む標準フランツ培地（Ｆｒａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．“Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｖｅｓｉｃｌｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ．”Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｖ． ６６． Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ Ｖａｃｃｉｎｅｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｐｏｌｌａｒｄ， Ａ．Ｊ．ａｎｄ Ｍａｉｄｅｎ， Ｍ．Ｃ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ）で中期対数期（ＯＤ６２０ｎｍ＝０．６）まで増殖させた。これらの細菌を、ＢＳＡ１％を含むダルベッコＰＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ Ｂｉｏ．）で１：２５，０００に希釈した。ヒト補体は、内因性の殺菌性抗体を持たないドナー由来であり、ＨｉＴｒａｐプロテインＧカラム（５ｍｌ；ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＩｇＧ抗体を枯渇させた。各反応物は、２５％のヒト補体、約４００ｃｆｕの細菌、及び試験抗血清または対照抗体の希釈物を含んでいた。ＳＢＡの力価は、３７℃で６０分間のインキュベーション後に陰性対照ウェルと比較してｃｆｕが５０％減少した血清希釈として計算した。タンパク質精製：組換えｆＨｂｐを、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグとともにＥ． ｃｏｌｉで発現させ、金属キレートクロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰ；ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に続いてイオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ ＳＰ；ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製した。これらのタンパク質（各２μｇ）を、ＭＥＳランニング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて４〜１２％ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて分離し、クマシーブルー染色（Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で可視化した。

【0162】

結果
ランダム変異体ライブラリーに基づいた手法を開発し、ヒトｆＨの結合が低下したｆＨｂｐ変異体を特定した。本手法は、構造情報のみに基づいては予測できないことがあるｆＨの結合の低下につながる変異を特定することが可能であったとともに、任意の所与の位置での複数のアミノ酸置換を引き起こすことが可能であった。本手法は、ｆＨの結合に小さな低下を時々もたらす一般的な選択位置でのアラニン置換の手法と対照をなす。

【0163】

このランダム変異体ライブラリー手法を用い、我々は、５種の有望な新たなｆＨｂｐ ＩＤ１変異体を特定した。これらの精製組換え変異体ｆＨｂｐ ＩＤ１抗原Ｑ３８Ｒ、Ｅ９２Ｋ、Ｒ１３０Ｇ、Ｓ２２３Ｒ、及びＨ２４８Ｌを図１に示す。

【0164】

図１．ｆＨｂｐ ＩＤ１変異体の純度。組換えｆＨｂｐを、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグとともにＥ． ｃｏｌｉで発現させ、金属キレートクロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰ；ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に続いてイオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ ＳＰ；ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製した。これらのタンパク質（各２μｇ）を、ＭＥＳランニング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて４〜１２％ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて分離し、クマシーブルー染色（Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で可視化した。レーン１、カレイドスコープ分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；２、ｆＨｂｐ ＩＤ１野生型；３、Ｑ３８Ｒ；４、Ｅ９２Ｋ；５、Ｒ１３０Ｇ；６、Ｓ２２３Ｒ；７、Ｈ２４８Ｌ。

【0165】

これらの変異体は、ｆＨの結合について、約１０倍（Ｒ１３０Ｇ）から約２０倍（Ｑ３８Ｒ）から約１００倍（Ｅ９２Ｋ、Ｓ２２３Ｒ、及びＨ２４８Ｌ）に及ぶ低下を呈した（図２）。

【0166】

図２Ａ及び２Ｂ．ＥＬＩＳＡによるｆＨｂｐ ＩＤ１変異体のｆＨ結合。マイクロタイタープレートのウェルを精製組換えＩＤ １野生型（ＷＴ）または６種の異なる変異体タンパク質のうちの１種で被覆した。異なる濃度の精製ヒトｆＨをこれらのウェルに添加した。結合ｆＨをヒツジ抗ヒトｆＨ（Ａｂｃａｍ）及びアルカリホスファターゼ結合ロバ抗ヒツジＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）で検出した。Ａ、ヒトｆＨの結合が高い陽性対照のｆＨｂｐ ＩＤ１野生型（ＷＴ）タンパク質。ｆＨの結合が低い陰性対照のｆＨｂｐ ＩＤ１ Ｒ４１Ｓ変異体。Ｂ、ｆＨの結合が低下した新たなｆＨｂｐ ＩＤ１変異体。Ｒ１３０Ｇ変異体は中程度のｆＨの結合を示し、Ｑ３８Ｒは低い結合を示し、並びにＥ９２Ｋ、Ｓ２２３Ｒ、及びＨ２４８Ｌは、Ｒ４１Ｓのそれより有意に低い結合を示した。反復測定の平均と標準偏差が示されている。

【0167】

Ｒ１３０Ｇ及びＱ３８Ｒ変異体がいくらかの結合を示し、他の３種の変異体は検出可能な結合を示さない同様のパターンのこれら変異体タンパク質へのｆＨの結合の低下が表面プラズモン実験で得られた。（図３Ａ及び３Ｂ）。

【0168】

図３Ａ〜３Ｅ．表面プラズモン共鳴によるｆＨｂｐ ＩＤ１変異体のｆＨ結合。３０００反応単位の精製ヒトｆＨを、ＣＭ５チップ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に結合させ、３１６ｎＭの精製組換えｆＨｂｐを１５０秒間注入した。参照のため、ＩＤ １野生型（ＷＴ）タンパク質についての同じデータが各パネルに示されている。ＥＬＩＳＡ（図２、上記）と同じパターンの結合；Ｒ１３０Ｇ変異体については中程度のｆＨへの結合、Ｑ３８Ｒについては低い結合、並びにＥ９２Ｋ、Ｓ２２３Ｒ、及びＨ２４８Ｌについては、きわめて低い結合が認められた。すべての実験はＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液及びＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００ Ｐｌｕｓ表面プラズモン共鳴機器を使用した。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００評価ソフトウェアで分析した。

【0169】

これら５種の変異体ｆＨｂｐ ＩＤ１タンパク質のすべてが、抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体によって認識される立体構造エピトープを保持していた。５種の抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体の野生型または変異体ｆＨｂｐに対する濃度依存性結合を図４に示す。

【0170】

図４Ａ〜４Ｅ．ＥＬＩＳＡによって測定されたマウス抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体のｆＨｂｐ変異体タンパク質への結合。抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体の同様の濃度依存性結合は、これら野生型及び変異体ｆＨｂｐがマイクロタイタープレートのウェルに同様の量で存在し、これら変異体ｆＨｂｐが、５種の異なるモノクローナル抗体によって認識される立体構造エピトープを保持していたことを示唆した。二次抗体は、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）であった。繰り返し測定の平均と標準偏差が示されている。

【0171】

これら変異体タンパク質はまた、やや安定性が低下しているＥ９２Ｋ変異体以外、野生型ｆＨｂｐ ＩＤ１と同様の熱安定性を保持している。最後に、これら変異体は、血清群Ｂ株Ｈ４４／７６に対して試験した場合、野生型ＣＤ−１マウスにおいて同様の殺菌性抗体反応を誘発した（図５Ａ〜５Ｂ）。

【0172】

図５Ａ及び５Ｂ．マウスにおけるｆＨｂｐ ＩＤ１変異体についての殺菌性抗体反応。図５Ａ、１２〜１４匹の野生型マウス群を、２用量の精製組換えｆＨｂｐ（投与当たり１０μｇ）を３週間間隔で腹腔内投与して免疫化した。２回目の投与の３週間後、血清を採取した。血清の殺菌活性を、補体源としてＩｇＧを枯渇させたヒト血清を、また試験株として血清群Ｂ株Ｈ４４／７６を用いて測定した。Ｈ４４／７６はｆＨｂｐ ＩＤ１を発現し、これは、対照のｆＨｂｐ ＩＤ１ ＷＴワクチンと一致する。各記号は個々のマウスの力価を表し、水平バーは幾何平均力価を表す。ＷＴ群とこれら変異体群の各々の間の差は、統計的に有意な差ではなかった（ｔ検定によるｐ＞０．４）。図５Ｂ、１４〜１５匹のヒトｆＨトランスジェニックマウスの群を３用量の精製組換えｆＨｂｐ（投与当たり１０μｇ）を３週間間隔で腹腔内投与して免疫化した。３回目の投与の３週間後、血清を採取した。血清の殺菌活性を、野生型マウスについて上記した通りに測定した。

【0173】

図６Ａ及び６Ｂ．ＥＬＩＳＡによるヒトｆＨのｆＨｂｐ ＩＤ１単一及び二重変異体への結合。これらの実験は、図２Ａ〜２Ｂについて上記した通りに行った。図７．マウスにおけるｆＨｂｐ ＩＤ１単一及び二重変異体についての殺菌性抗体反応。２０匹の野生型マウス群を免疫化し、これらの血清の殺菌性抗体反応を図５Ａについて上記した通りに測定した。

【0174】

実施例２：ｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体の特性評価
材料及び方法
これらの実験は、実施例１に記載の通りに行った。

【0175】

結果
ｆＨｂｐ ＩＤ１で特定された３種の有望な変異体を同様にｆＨｂｐ ＩＤ５５で構築し；これらはＥ９２Ｋ、Ｓ２２３Ｒ、及びＨ２４８Ｌを含んでいた。これら３種のｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体のすべては、ｆＨの結合が有意に低下した（図８Ａ）。これら変異体は、マウス抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体ＪＡＲ４１の結合によって判断される立体構造の完全性を保存していた（図８Ｂ）。

【0176】

図８Ａ及び８Ｂ．ｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体のｆＨ結合。Ａ．ＥＬＩＳＡによる固定化ｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体へのｆＨの結合。この実験は、図２に対する説明文に記載の通りに行った。２〜４回の反復に対する平均及び範囲が示されている。Ｂ．抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＪＡＲ４１の濃度依存性結合は、これらの組換えｆＨｂｐがマイクロタイタープレートのウェル内に同様の量で存在し、ＪＡＲ４１によって認識されるエピトープの領域（Ｎ末端ドメイン；Ｖｕ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｓｃｉ． Ｒｅｐｏｒｔｓ、前出）で保存された立体構造を有することを示唆した。二次抗体は、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）であった。

【0177】

図９．野生型マウスにおけるｆＨｂｐ ＩＤ５５変異体ついての殺菌性抗体反応。１２匹のマウス群を免疫化し、その血清の殺菌性抗体反応を図５Ａについて上記した通りに測定した。殺菌活性は、ｆＨｂｐ ＩＤ５５を発現する株Ｈ４４／７６の変異体に対して測定した。

【0178】

図１０Ａ、ヒトｆＨトランスジェニックマウスのｆＨｂｐ ＩＤ５５ Ｓ２２３Ｒ変異体についての殺菌性抗体反応。１１〜１２匹のトランスジェニックマウス群を３用量の精製組換えｆＨｂｐ（投与当たり１２μｇ）または、全部で１２μｇのｆＨｂｐを含む認可Ｔｒｕｍｅｎｂａ（Ｐｆｉｚｅｒ）ワクチンのヒト用量の１０分の１で免疫化した。これらトランスジェニックマウスを免疫化し、その血清の殺菌性抗体反応を図５Ｂについて上記した通りに測定した。図１０Ｂ、血清ヒトｆＨ濃度との関連で、野生型及びヒトｆＨトランスジェニックマウスでのＴｒｕｍｅｎｂａに対する殺菌性抗体反応。血清ヒトｆＨ濃度は、先に記載（Ｂｅｅｒｎｉｎｋ ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８６（６）：３６０６−１４）の通り、ＥＬＩＳＡで測定した。

【0179】

実施例３：ｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体の特定及び特性評価
材料及び方法
これらの実験は、実施例１に記載の通りに行った。

【0180】

結果
ｆＨの結合が低下したランダムｆＨｂｐ変異体の独立した検索を変異体群２（サブファミリーＡ）にあるｆＨｂｐ ＩＤ２２を用いて行った。このスクリーニングは、６種の有望な新たな変異体をもたらした（図１７）。ＥＬＩＳＡによるＩＤ２２の野生型及び先に記載のＤ２１１Ａ変異体に対するｆＨ結合を図１１Ａに示す。これら６種の新たな変異体ＩＤ ２２タンパク質に対するｆＨ結合を図１１Ｂに示す。

【0181】

図１１Ａ〜１１Ｄ．ｆＨｂｐ ＩＤ２２ライブラリー変異体のｆＨ結合。図１１Ａ、ヒトｆＨの結合が高い陽性対照のｆＨｂｐ ＩＤ２２野生型（ＷＴ）タンパク質。ｆＨの結合が低い陰性対照のｆＨｂｐ ＩＤ２２ Ｄ２１１Ａ変異体。図１１Ｂ、ｆＨの結合が低下した新たなｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体。これら変異体のすべてが低結合を示し、Ｖ１３１Ｄは、Ｄ２１１Ａと同様の極めて低い結合を示した。この実験は、図２に対する説明文に記載の通りに行った。２〜４回の反復の平均及び範囲が示されている。図１１Ｃ、ｆＨ濃度１００μｇ／ｍｌ以下でのｆＨｂｐ ＩＤ２２変異体のサブセットのｆＨ結合。図１１Ｄ、これら変異体のサブセットに対する抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体ＪＡＲ４の結合（図１１Ｃと同じ記号を用いた）。新たな変異体Ｋ２１９ＮはＪＡＲ４結合を保持しているが、Ｇ２２０Ｓ変異体はＪＡＲ４の結合が低下している。これらの変異体のすべてが別の抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体ＪＡＲ３１の通常の結合を有していた（データは示さず）。繰り返し測定の平均及び標準偏差が示されている。

【0182】

対照の野生型ＩＤ２２タンパク質及び先に特性評価した変異体Ｄ２１１Ａとともに、これら新たな変異体Ｖ１３１Ｄ及びＫ２１９Ｎに対する野生型ＣＤ−１マウスの殺菌性抗体反応を図１２に示す。

【0183】

図１２Ａ〜１２Ｂ．野生型マウスにおけるｆＨｂｐ ＩＤ２２ライブラリー変異体についての殺菌性抗体反応。ヒトｆＨの結合が低いライブラリー変異体を免疫化用に選択した。１０〜２１匹のマウス群を、２用量の精製組換えｆＨｂｐ（投与当たり１０μｇ）を３週間間隔で与えて免疫化した。２回目の投与の３週間後、血清を採取した。血清殺菌活性を、補体源としてＩｇＧを枯渇させたヒト血清を用い、試験株として血清群Ｂ株ＣＨ５９７を用いて測定した。この株は、ｆＨｂｐ ＩＤ２３を発現し、これは対照のｆＨｂｐ ＩＤ２２ ＷＴワクチンとほぼ一致する。図１２Ａ、新たな変異体Ｖ１３１Ｄ及びＫ２１９Ｎを調べる実験。免疫原性を低下させなかったこのＤ２１１Ａ変異体は、対照の変異体ｆＨｂｐワクチンとして用いた。各記号は、個々のマウスの力価を表し、水平バーは幾何平均力価を表す。図１２Ｂ、新たな変異体Ｄ１２１Ｇ、Ｓ１２８Ｔ、Ｆ１２９Ｓ、及びＧ２２０Ｓを調べる第二の実験。Ｖ１３１Ｄについてのわずかな減少以外、これらの新たな変異体ｆＨｂｐについて、免疫原性の有意な減少は認められなかった。

【0184】

図１３．ヒトｆＨトランスジェニックマウスにおけるｆＨｂｐ ＩＤ２２ライブラリー変異体Ｋ２１９Ｎに対する殺菌性抗体反応。対照の変異体Ｄ２１１Ａがより高い反応を示し、Ｋ２１９Ｎ変異体は、ｆＨｂｐ ＩＤ２２野生型（ＷＴ）抗原と同様の反応を示した。

【0185】

図１４．示差走査微小熱量測定によって測定されたｆＨｂｐ ＩＤ２２の熱安定性。ｆＨｂｐ ＩＤ２２野生型（ＷＴ、実線）は３８℃（Ｎ末端）及び８１℃（Ｃ末端ドメイン）で変性転移を経る。ｆＨｂｐ ＩＤ２２ Ｌ１３０Ｒ／Ｇ１３３Ｄ二重変異体は、Ｎ末端ドメインについて、ＩＤ２２ ＷＴと比較して１９℃高い熱安定性を呈する。

【0186】

図１５Ａ〜１５Ｂ．安定化置換Ｌ１３０Ｒ及びＧ１３３Ｄ（二重変異体、ＤＭ）と、ｆＨ結合を低下させるためのライブラリー由来変異体を組み合わせたｆＨｂｐ ＩＤ２２三重変異体。Ａ、ｆＨｂｐ ＩＤ２２三重変異体に対するｆＨ結合。Ｂ、対照のマウス抗ｆＨｂｐモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＪＡＲ４結合（パネルＡと同じ記号。これら安定化変異体のすべてがｆＨｂｐ ＩＤ２２ＷＴより良好にＪＡＲ４に結合する。

【0187】

図１６．ヒトｆＨトランスジェニックマウスにおけるｆＨｂｐ ＩＤ２２三重変異体についての殺菌性抗体反応。これら２種の試験変異体は、安定性二重変異体（ＤＭ）をそれぞれＫ２１９Ｎ及びＧ２２０Ｓと組み合わせる。これら三重変異体は、対照のＩＤ２２ ＷＴ抗原より８倍及び１８倍高い反応を誘発した。

【0188】

上記の例示的なｆＨｂｐ ＩＤ１及びＩＤ２２変異体の概要を図１７の表に示す。

【0189】

本発明をその具体的な実施形態を参照して説明してきたが、当業者には、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされうること並びに等価物が置換されうることを理解されたい。さらに、多くの変更が、特定の状況、材料、組成物、過程、過程の段階または複数の段階を目標、すなわち、本発明の趣旨及び範囲に適応させるためになされうる。すべてのかかる変更は、本明細書に添付の特許請求の範囲内であることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]