特許 6796591 固体支持体上の官能基の定量方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6796591

(24)【登録日】2020年11月18日

(45)【発行日】2020年12月9日

(54)【発明の名称】固体支持体上の官能基の定量方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20201130BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/543 565E

   G01N33/543 541A

【請求項の数】23

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2017-547401(P2017-547401)

(86)(22)【出願日】2016年3月10日

(65)【公表番号】特表2018-508022(P2018-508022A)

(43)【公表日】2018年3月22日

(86)【国際出願番号】US2016021741

(87)【国際公開番号】WO2016145174

(87)【国際公開日】20160915

【審査請求日】2019年3月7日

(31)【優先権主張番号】62/130,863

(32)【優先日】2015年3月10日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507269175

【氏名又は名称】シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＩＥＭＥＮＳ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100075166

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 巖

(74)【代理人】

【識別番号】100133167

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 浩

(72)【発明者】

【氏名】リン、スペンサー

(72)【発明者】

【氏名】リーマー、クリストファー

(72)【発明者】

【氏名】スピアーズ、ライアン

【審査官】 海野 佳子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５４０３２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／００２９４２８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Quantification of Surface Functional Groups on Polymer Microspheres by Supramolecular Host-Guest Interactions，Chemical Communications，２０１１年，Vol.47, No.27，7842-7844

【文献】 Color Test for the Detection of Resin-Bound Aldehyde in Solid-Phase Combinatorial Synthesis，Journal of Combinatorial Chemistry，２００２年，Vol.4, No.1，120-124

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

固体支持体上に固定された標的官能基を定量する方法であって、以下のステップを含有する方法。
−標的官能基を或る量の選択性化合物と接触させるステップであって、前記選択性化合物の或る量は標的官能基に結合し、前記選択性化合物の或る量は標的官能基に結合しないステップ、
−或る量の前記結合していない選択性化合物を有する副生物を得るステップ、
−前記副生物に、前記副生物中の非結合選択性化合物に結合する指示薬を添加して測定可能な結果を与えるステップ、
−前記測定可能な結果を測定するステップ、
−前記測定結果から前記副生物中の非結合選択性化合物の量を決定するステップ、
−前記非結合選択性化合物の量から前記固体支持体上に固定された選択性化合物の量を決定するステップ、及び
−前記固定された選択性化合物の量から前記固体支持体上に固定された標的官能基の量を決定するステップ。

【請求項2】

前記固体支持体上の前記標的官能基が、前記官能基を前記固体支持体に付加する反応によって、固定される請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記標的官能基が前記固体支持体に結合した連結剤上に生じられる請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記標的官能基がアミノ官能基及びアルデヒド官能基からなる群から選ばれる官能基を含有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記標的官能基がアルデヒド官能基を含有し、前記アルデヒド官能基が、前記アルデヒド官能基を固体支持体上に存在するアミノ基に付加する反応によって、固体支持体上に固定されている請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記アルデヒド官能基が、グルタルアルデヒドと固体支持体上のアミノ基との反応によって、固体支持体上に固定されている請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記選択性化合物が前記固定されたアルデヒド官能基と選択的に反応するアミノ官能基を含有する請求項５及び６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

前記選択性化合物がプロピルアミンを含有する請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記指示薬が２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳＡ）を含有する溶液を含有する請求項７又は８に記載の方法。

【請求項10】

前記固体支持体上に固定された標的官能基がアミノ官能基を含有する請求項２に記載の方法。

【請求項11】

前記固定されたアミノ官能基がアミノシラン化合物と前記固体支持体との反応によって生じられる請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記選択性化合物が前記固体支持体上の固定されたアミノ官能基と選択的に反応するアルデヒド化合物を含有してなる請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記選択性化合物がプロピオンアルデヒドを含有してなる請求項１０に記載の方法。

【請求項14】

前記指示薬が４−アミノ−３−ヒドラジノ−５−メルカプト−１，２，４−トリアゾール、別名４−アミノ−５−ヒドラジノ−１，２，４−トリアゾール−３−チオール（Ｐｕｒｐａｌｄ（登録商標））を含有してなる請求項１２又は１３に記載の方法。

【請求項15】

前記測定可能な結果が測色結果を含む請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記測定可能な結果が吸光度、蛍光及び電流値からなる群から選ばれる結果を含有する請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記固体支持体が常磁性粒子を含有してなる請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

更に下記のステップを含有する請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
−もし決定された前記固体支持体上の標的官能基の数が所定の値より少なかった場合に、前記固体支持体上に固定された追加の標的官能基を含有する追加の固体支持体を製造するステップ。

【請求項19】

更に下記のステップを含有する請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
−前記標的官能基に結合した化合物の化学量論量を含有する追加の固体支持体を製造するステップ。

【請求項20】

前記化合物が試料中の結合対の第二のメンバーに対して選択的な前記結合対の第一のメンバーである請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

或る量の選択性化合物に前記標的官能基を接触させるステップが前記標的官能基を或る量の選択性化合物と反応させるステップを含む請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記標的官能基に選択的に結合する選択性化合物及び前記選択性化合物に選択的に結合する指示薬を含有してなる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を実行するためのキット。

【請求項23】

更に、請求項１〜２１に記載の方法を実行するための包装又は指示書を含有する請求項２２に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、診断検査の分野に、より詳細には、固体支持体上に固定された官能基を定量するための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

医薬及び臨床化学の分野において、生理学的活性な種又は被検体の研究及び判定の多くが、特異的な結合対メンバー間の相互反応を利用して実施されている。例えば、患者試料中の目標被検体そのものが、特異的結合対の一員であり得、固体支持体上に固定された該特異的結合対の対応するメンバーを使用することによって検出され得る。この場合、固定された結合対メンバーは、例えば試料中の目標抗体の検出のための抗原であってよい。この用途のために、種々の固体支持体材料が開発されており、該固体支持体上の特異的な結合対メンバーを固定するために種々の結合手法が必要とされる。

【0003】

例えば、常磁性粒子（ＰＭＰ）は、アミン官能基等の官能基で官能化され得る公知の固体支持体材料である。幾つかの例では、これらの官能基は、結合対メンバーに結合する連結基（例えば、グルタルアルデヒド）と結合するように選択される。結合対メンバーは、典型的には上述のように該結合対の第二のメンバーである試料中の目標被検体に対して選択性であり得る。該支持体上の該結合対メンバーを固定するにあたって、該結合対メンバーの直接的又は間接的な結合に利用できる適切な量の官能基を確保することが必要かもしれない。例えば、利用できる官能基が少なすぎると、該結合対メンバーが添加されたときに結合部位が少なすぎる結果を生じるかもしれない。これは、或る濃度の、特に目標被検体の検出可能な範囲内において比較的高濃度の、目標被検体の量を正確に測定することができない固体支持体を生じる可能性がある。他方、特異的結合対メンバーの固定のために比較的高濃度の官能基を準備すると、製造コストが実質的に増えるが、追加で得られる利点はない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】米国特許第４６６１４０８号明細書

【特許文献2】米国特許第７８４２４７５号明細書

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｃａｕｔｒｅｃａｓａｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７０）２４５：３０５９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

従って、固体支持体に特異的結合対メンバーを最適に固定するために、固体支持体上に存在する官能基の数を直接的に又は間接的に決定し及び／又は確認する必要がある。溶液中の官能基の量を定量的に測定する方法が幾つか知られているが、そのような方法は、典型的には、固体支持体に対しては適切ではない。というのは、そのような定量法において形成された着色した又は蛍光を発する反応生成物は、典型的には、固体支持体に結合し、それにより、検出及び定量が困難になり及び／又は不可能になる。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の一側面において、固体支持体上に固定された官能基を定量する方法が提供される。或る側面において、該方法により、固体支持体生成物の製造中に固体支持体上に配置されるべき官能基の最適の数を決定することが可能になる。このようにして、浪費がなくなり又は少なくなり、固体支持体の性能が改良され得る。例えば、固体支持体上の利用可能な官能基の数を決定することにより、特異的な結合対の第一のメンバーの直接又は間接の付着に、十分な官能基を利用できることが保証される。その後、特異的結合対を最適の量で搭載した同様の固体支持体を製造することができる。かくして、或る実施態様において、本明細書に記載する方法により、固体支持体上に付与された特異的結合対の１つのメンバーの直接又は間接の付着に先立って、利用可能な官能基の定量が可能になる。

【0008】

本発明の幾つかの側面を、図面を参照して、以下に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、本発明の一側面に従う試料中の第二の相補性結合対メンバーを検出するために、第一の結合対メンバーが固定された先行技術の固体支持体を図示する。

【図2】図２は、本発明の一側面に従う、表面官能基及びこの表面官能基に結合した選択性化合物を有する固体支持体を図示する。

【図3】図３は、本発明の一側面に従う支持体に結合した選択性化合物を含有する上澄み液を図示する。

【図4】図４は、本発明の一側面に従う、連結剤及び連結剤に結合した選択性化合物を有する固体支持体を図示する。

【図5】図５は、本発明の一側面に従う、固体支持体上の多数の官能基の数を決定する方法を示す図である。

【図6】図６は、本発明の一側面に従う、プロピオンアルデヒド標準の濃度と吸光度との関係を示すグラフである。

【図7】図７は、本発明の他の一側面に従う、時間依存研究からの試料上澄み液の吸光度を示すグラフである。

【図8】図８は、本発明の他の一側面に従う、プロピオンアルデヒド標準の濃度と吸光度との関係を示すグラフである。

【図9】図９は、本発明の一側面に従う、アルデヒド定量のためのシフ塩基形成の時間依存性を示すグラフである。

【図10】図１０は、本発明の一側面に従う、プロピルアミン標準の濃度と吸光度との関係を示すグラフである。

【図11】図１１は、本発明の一側面に従う、アルデヒド基形成の主要因としての％グルタルアルデヒド（ＧＡ）を指示する効果プロットである。

【図12】図１２は、本発明の他の一側面に従う、％容器占有率（ｖｅｓｓｅｌ ｏｃｃｕｐａｎｃｙ）と交差するＰＭＰｍｇ／ｍＬを示す交互作用プロットである。

【図13】図１３は、本発明の他の一側面に従う、アルデヒド基形成の主効果としてのＢ（％グルタルアルデヒド）を図示するパレート図である。

【図14】図１４は、本発明の他の一側面に従う、ＰＭＰへのアルデヒド負荷を最適化するための最適のＰＭＰ濃度、グルタルアルデヒド濃度及び容器占有率を図示する。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本明細書において、用語「約」は、述べられた値の±１０％の値をいう。
本明細書において、用語「付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）」、「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」、「固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）」「連結（ｌｉｎｋｉｎｇ）」等は、共有結合に限定されないと理解すべきであり、二以上の分子の間のあらゆる型の誘引（ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ）、親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）、立体配座選択（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）、誘導適合（ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｉｔ）又は結合（ｂｏｎｄｉｎｇ）を包含する。
本明細書において、句「効果的な量」は、意図した結果をもたらすのに適切な材料量を意味する。
本明細書において、用語「試料」は、目標被検体を有し又は有すると想定されるあらゆる試料を包含し、生物学的試料であっても非生物学的試料であってもよい。
本明細書において、用語「被験者」は、ヒト又はヒトでない哺乳動物をいう。

【0011】

図１には、表面に表面官能基１２を有する例示的固体支持体１０が示されている。表示された実施態様では、第一の結合対メンバー１６を固体支持体１０に固定するための連結剤１４も、また、準備されている。しかしながら、本発明は、そのような連結剤を必要とせず、代わりに、第一の結合対メンバー１６が表面官能基１２に直接結合してもよいことが理解される。第一の結合対メンバー１６は、表示されているように、試料中の第二の結合対メンバー１８との接合に適していてよい。試料２０は、標準試料であってもよく、第二の結合対メンバー１８を有すると推測される試料（例えば、生物学的試料）であってもよい。従って、第二の結合対メンバー１８は、固体支持体１０の目標被検体と考えることができる。

【0012】

固体支持体１０は、有機又は無機の水に不溶性で不浸透性の材料からなっていてよく、透明でも部分的に透明でもよい。更に、固体支持体１０は、ビーズ、粒子、繊維、チューブ、ウエル、細片、棒、皿のような平面等々の形状をしていてよい。固体支持体１０を使用しようとするアッセイの型により、固体支持体１０は、それが使用される媒体中に懸濁可能であって不可能であってもよい。懸濁可能な支持体の例は、これらに限られないが、ラテックス、脂質二重層又はリポソーム、油滴、細胞、ハイドロゲル、磁性粒子等を含む。他の固体支持体材料には、ニトロセルロースポリマー、酢酸セルロース、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレン テレフタレート）、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）等のポリマーが含まれ、これらは、単独で、また、他の材料と一緒に用いられる。

【0013】

或る実施態様では、固体支持体は、１以上の固体粒子を含有してなる。粒子形状の場合、粒子は、例えば、少なくとも約０．０２ミクロンから約１００ミクロンの平均直径を有していてよい。特定の実施態様では、固体支持体は、約０．０５ミクロンから約２０ミクロン、又は約０．３ミクロンから約１０ミクロンの平均直径を有していてよい。更に、粒子は、約１０〜約１００ｍ^２／ｇの範囲の表面積を有していてよく、幾つかの実施態様では、粒子は、約６０ｍ^２／ｇの範囲の表面積を有していてよい。粒子は、有機でも無機でも、膨張可能であっても不可能であっても、多孔性であってもそうでなくてもよく、水に近似する密度、一般に約０．７ｇ／ｍＬから約１．５ｇ／ｍＬの密度を有してよく、透明な、部分的に透明な又は不透明な材料で構成されていてよい。

【0014】

粒子の形状は、規則的でも不規則であってもよい。粒子は、例えば、球体、楕円体、又は中空若しくは細孔を有する球体であってもよい。粒子は、核−殻粒子と称されているもののような、核と１以上の包囲層とを有する数層からなっていてもよい。或る実施態様では、粒子は、細胞及び微生物、例えば、赤血球、白血球、リンパ球、ハイブリドーマ、連鎖球菌、スタフィロコックス アウレウス、大腸菌、ウイルス等々、の生物学的材料から形成されていてもよい。粒子は、有機及び無機のポリマー、リポソーム、ラテックス粒子、磁性又は非磁性粒子、リン脂質小胞、カイロミクロン、リポ蛋白、染料の結晶、金属ゾル、シリカ粒子、ガラス粒子、磁性粒子、油滴、脂肪粒子、デキストラン及び蛋白凝集体等からなる粒子であってもよい。

【0015】

或る実施態様において、粒子は、ナノ粒子及び／又はミクロ粒子を含有する。そのような粒子は、約２０ｎｍ以上、約２０ミクロン以下、又は４０ｎｍと１０ミクロンとの間の、又は０．１ミクロンと１０ミクロンとの間の、又は０．１ミクロンと５ミクロンとの間の、又は０．１５ミクロンと２ミクロンとの間の、近似直径を有していてよい。特定の実施態様では、ミクロ粒子は、水性溶液に懸濁された粒子であってよい。

【0016】

粒子は、水性溶液内に分散され及び／又は懸濁され得るポリマー粒子を含有していてよい。或る実施態様において、粒子は、水性媒体中に容易に分散可能であってよく、以下に説明するように、特異的結合対のメンバーに、直接又は（連結剤を介して）間接に接合できるように、吸着性であるか又は官能化可能であってよい。粒子は、自然産生材料、合成的に変性された自然産生材料又は合成材料であってよい。有機ポリマーの例には、ポリサッカライド、セファローゼとして入手可能なアガロースのような特別に架橋したポリサッカライド、セファデックス及びセファクリルとして入手可能なデキストラン、セルロース、でんぷん、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、遊離の水酸基官能性を有するエステル及びアミドのようなアクリレート及びメタクリレートの誘導体の単独重合体及び共重合体等が含まれる。

【0017】

或る実施態様において、固体支持体１０は、１以上の常磁性粒子のような磁性粒子を含有する。粒子が磁性を有するとき、粒子に含まれる磁性材料は、永久磁石又は電磁石により誘引されやすい如何なる磁性材料であってもよい。そのような磁性材料の例は、磁性酸化鉄、磁性酸化クロム（ＣｒＯ_２）、ＭｎＦｅＯ_４、ＺｎＦｅＯ_４、ＣｏＦｅＯ_４及び類似の磁性材料を含む。

【0018】

固体支持体１０とともに使用する磁性粒子の更なる例には、ポリマー材料に包囲された磁性核を有するものが含まれる。ポリマー材料は、ポリスチレンやポリスチレン−ジビニルベンゼンのようなアッセイに用いるのに適切な如何なるポリマー材料であってもよい。他の実施態様では、磁性粒子は、酸化クロム磁性粒子（クローム粒子）を含有していてもよい。この後、更に議論するが、これらの粒子は、アルデヒド反応性である又はアルデヒド反応性基を含むように変性されてもよいアミン官能基のような懸垂表面基を有していてよい。

【0019】

酸化クロムの例には、特許文献１に教示されているような、縮小された表面を有する酸化クロムの核からなり、シリカで被覆され、更にシランで被覆されたものが含まれる。その関連する開示を参照により本明細書に導入する。使用し得る磁性及び非磁性の粒子の他の特定の例は、特許文献２に開示されている。その関連する開示を参照により本明細書に導入する。

【0020】

固体支持体１０は、共有結合その他の方法で固体支持体１０に結合されている表面官能基１２を含有するかそれを含むように変性されていて、この表面官能基は、直接又は連結剤、例えば連結剤１４、を介して、第一の結合対メンバー１６に結合し得る。後者の場合、固体支持体１０は、表面官能基１２を含み、これが１以上の連結剤１４に結合する。次に、各連結剤１４は、１以上の特異的な結合対メンバー１６に結合し得る。適切な表面官能基１２の例には、アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、アミノオキシ、シアニド、アルコール基等が含まれる。特定の実施態様では、表面官能基１２は、アミン官能基を含む。

【0021】

或る実施態様においては、図２に示すように、１以上の連結剤１４が固体支持体１０上の官能基１２の間に用いられて、固体支持体１０上の１以上の第一の結合対メンバーを固定する。或る実施態様においては、連結剤１４は、酸素、イオウ、窒素及びリンからなる群から選ばれる１以上のメンバーを含有する。更に、連結剤１４は、脂肪族でも芳香族でもよい。ヘテロ原子が存在するとき、酸素は、オキソ又はオキシとして、炭素、イオウ、窒素又はリンに結合して、存在し得る。窒素は、ニトロ、ニトロソ又はアミノとして、炭素、酸素、イオウ又はリンに結合して、存在し得る。イオウは、酸素と同様である。一方、リンは、ホスホネート又はホスフェートモノ若しくはジエステルとして、炭素、イオウ、酸素又は窒素に結合していてよい。或る実施態様においては、第一の結合対メンバー１６と固体支持体１０上の官能基１２の間に結合を形成するのに有用であれば、如何なる化合物も、連結剤１４として使用することができる。

【0022】

連結剤１４の追加の例としては、これらに限られないが、アルデヒド、ジカルボン酸及び酸無水物、ポリアミン、ポリアルデヒド並びに２−イミノチオランヒドロクロリド、スルフォスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ｍ−マレイミドスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート及び当業者に知られている同様の化学種のようなヘテロ二官能性試薬が含まれる。

【0023】

連結剤は、更に、窒素基、ホスフェート基；アミノ基；ハロ又はトシルアルキル等のアルキル化試薬、オキシ（ヒドロキシ又はイオウ類似体であるメルカプト）；オキソカルボニル（アルデヒド又はケトン等）、又はビニルスルホン若しくはα，β−不飽和エステル等の活性オレフィンを含有する化合物を含む。１つの実施態様において、これらの連結剤１４は、第一の結合対メンバー１６を、表面官能基１２と第一の結合対メンバー１６との反応により、固体支持体１０上に固定することができる。アミンとカルボン酸若しくはその窒素誘導体又はリン酸とが反応すると、アミド、アミジン及びホスホルアミドが形成される。メルカプタンと活性化されたオレフィンとが連結されると、チオエーテルが形成される。メルカプタンとアルキル化試薬とが連結されるとチオエーテルが形成される。アルデヒドとアミンとが縮合条件下で連結されると、アルキルアミンが形成される。ケトン又はアルデヒドとヒドロキシルアミン（ヒドロキシル基の水素の代わりに置換基が存在する誘導体を含む。）とが連結されると、オキシム官能基（＝Ｎ−Ｏ−）が形成される。カルボン酸又はリン酸とアルコールとが連結されると、エステルが形成される。本発明で使用し得る種々の連結剤は、当技術分野において公知である。例えば、非特許文献１を参照せよ。

【0024】

特定の実施態様において、連結剤１４は、一端において固体支持体１０上のアミン基と反応し、他端において第一の結合対メンバー１６のアミン基と反応するものであってもよい。かくして、或る実施態様では、連結剤１４は、少なくとも２つの活性カルボニル基−１つは固体支持体１０上の官能基１２と反応し、１つは第一の結合対メンバー１６と反応する−を含有するグルタルアルデヒドのようなアルデヒドを含有してよい。

【0025】

第一の特異的な結合対１６は、試料中の目標被検体に対して選択性であれば、対応する第二の結合対メンバー１８のような、如何なる化合物を含んでいてもよい。従って、一実施態様において、第一の結合対メンバー１６は、少なくとも特異的結合対の第二のメンバーと結合し又は誘引力、適合性等により結びつくものであれば、一対の成分の如何なるメンバーを含んでいてもよい。或る実施態様において、第一の結合対メンバー１６は、１以上の第二の結合対メンバー１８と結びついてよい。第一の結合対メンバー１６及び１以上の第二の結合対メンバー１８は、それぞれ、当技術分野で知られている特定の結合対の相補性メンバー（抗原−抗体、酵素−基質、ポリヌクレオチド相互作用等）であってよい。結合対メンバー１６、１８の例は、特許文献２に開示されているが、その全体を参照により本明細書に取り入れる。

【0026】

試料２０は、目標被検体、例えば第二の結合対メンバー１８、を有すると推測される適切な材料であれば、如何なる材料でもよい。１つの実施態様において、目標被検体は、適切な被験体からの体液を始めとする生物学的組織のような試料中に直接見出される如何なる分子でもよい。被験体は、ヒト又はヒト以外の哺乳動物であってよく、生物学的試料は、全血、血清、血漿、痰、リンパ液、精液、膣粘液、糞便、尿、脊髄液、唾液、便、脳脊髄液、涙、粘液等；毛髪、皮膚、臓器又は他の身体部分からの切片又は切除組織等の生物学的組織、等々を包含する。試料２０は、当業者が理解するように、固体支持体１０に試料を提供するのに必要な前処理又は下準備を受けてもよい。

【0027】

本発明のいくつかの側面は、第一の結合対メンバー１６の付着に十分な結合部位が存在するかどうかを決定する方法に向けられている。図１を再び参照して、固体支持体１０上の表面官能基１２の数及び／又は第一の結合対１６への結合に利用できる連結剤１４に結合している官能基の数を知ることが決定的に重要である。その上に第一の結合対メンバー１６を固定するための固体支持体１０の準備に際して、固体支持体１０に固定された表面官能基及び／又は連結剤の数を知ることは有用である。更に、支持体上への固定のために第一の結合対メンバー１６の導入に先立って、利用可能な結合部位の数を前以って知ることは、第一の結合対メンバー１６の有効な量を準備するのに役立つ。繰り返すが、第一の結合対メンバー１６への結合に利用できる官能基の数に対して第一の結合対メンバー１６が少なすぎると、特に検出可能域の高濃度域において目標被検体を検出することができない不飽和の固体支持体１０が生じる。一方、本明細書で記述する方法は、結合対メンバー１６の過剰量が添加され、それにより、同様の固体支持体の製造中に浪費が生じるのを防止する。

【0028】

次に図２及び３を参照すると、本発明の側面に従って、固体支持体上の官能基の数を決定するための方法に用いられる成分が図示されている。或る実施態様において、１以上の成分はキットとして提供されてもよく、本明細書に記述する方法を実行するための具体的形態で用意された包装及び／又は指示書を含んでいてもよい。

【0029】

図２の実施態様において、上述のように表面官能基１２を有する固体支持体１０が示されている。更に、共有結合又は他の方法で表面官能基１２（固定された選択性化合物２４として示されている。）に結合し得る選択性化合物２２が準備されている。選択性化合物２２と官能基１２との間の相互作用の間に、選択性化合物２２の一定量は、表面官能基１２に結合しないかもしれない。この量は「フリー」であり、支持体１０に結合していないので、上澄み液のような副生物２６に捕捉されるかもしれない。図３に示されているように、一定量の結合していない選択性化合物２８を含有する副生物２６が示されている。この副生物２６に、結合していない選択性化合物２８に結合しうる指示薬３０が提供され、測定し得る結果が得られる。選択性化合物２２、２８及び指示薬３０を利用した官能基１２の量の測定方法を以下に詳細に述べる。

【0030】

もう１つの実施態様において、図４に示されているように、表面官能基１２を介して固体支持体１０に結合した連結剤１４を有する固体支持体１０が示されている。この実施態様において、選択性化合物２２は、共有結合又は他の方法で連結剤１４の官能基１５に結合して固定された選択性化合物２４を提供し得るものである。更にこの実施態様において、選択性化合物２２と官能基１５との接触の間に、一定量の選択性化合物２２が表面官能基１２に結合しないことが認識された。この量は、「フリー」であり、上澄み液のような副生物２６中に捕捉され得る。再び図３を参照すれば、副生物２６は、収集することが可能で、一定量の結合していない選択性化合物２８を含有する。この副生物２６に、副生物２６中の結合していない選択性化合物２８に結合して測定可能な結果を与え得る指示薬３０が提供される。選択性化合物２２、２８及び指示薬３０を利用して連結剤１４上の官能基１５の量を決定する方法を以下に詳細に記述する。

【0031】

図５を参照すると、固体支持体１０上の標的官能基を定量する方法１００が示されている。用語「標的官能基」は、固体支持体１０上に直接又は間接に固定されているあらゆる官能基を含むと解される。従って、この用語は、上述のような表面官能基１２又は連結剤１４上の官能基１５を指す。方法１００において、一組の定量すべき標的官能基が選択される。一実施態様において、標的官能基は、固体支持体１０上の表面官能基１２であり、このものは、表面官能基１２を固体支持体１０に直接付加する反応によって、固体支持体１０上に固定されている。例えば、固定されたアミノ官能基は、アミノシラン化合物と固体支持体１０との間の反応により提供されてもよい。他の実施態様では、標的官能基は、連結剤１４上に存在して固体支持体１０上の表面官能基１２に結びついてもよい。更に、連結剤１４は、第一の結合対メンバー１６と結びつくための標的官能基を含有する。標的官能基はアミノ官能基、アルデヒド官能基又は本明細書に述べる任意の他の官能基を含有していてもよい。固体支持体１０及び第一の結合対メンバー１６の両方に結びつくための連結剤１４の官能基は、同一であってもよいが、本発明はそれに限定されないことを理解すべきである。

【0032】

一実施態様では、方法１００は、固体支持体１０上に固定された標的官能基を有効量の選択性化合物２２と接触させるステップを有している。この接触の結果、選択性化合物２２の幾つかが、標的官能基（１２又は１５）を介して、固体支持体１０及び（もし存在すれば）結合されていない選択性化合物２２を含有する副生物２６（例えば上澄み液）に結合される。接触ステップ１０２は、結合が完結するために、適切な温度、例えば室温から５０℃、で、適切な期間、例えば１時間から９６時間、起きる。更に、接触ステップ１０２は、適切な容器内で生じる。一実施態様では、接触は、選択性化合物２２と標的官能基（１２又は１５）とを反応させることを含む。

【0033】

一実施態様では、方法１００は、更に、或る量の結合していない選択性化合物２８を含んでいてもよい副生物２６を得るためのステップ１０４を含む。一実施態様では、副生物２６は、標的官能基に（共有結合で又は他の方法で）結合しなかった或る量の選択性化合物２２（非結合選択性化合物２８）を含む上澄み液を含有していてもよい。特定の実施態様では、成分は、容器に添加され、インキュベータ中に載置され、適切な時間に亘って混合されてもよい。その後、上澄み液のような生成した副生物２５は、磁気分離、遠心分離等により、固体支持体１０から分離されてよい。

【0034】

非結合選択性化合物２８の量を決定するために、方法１００は、副生物２６（例えば上澄み液）中の非結合選択性化合物２８と結合して測定可能な結果を生じる指示薬３０を添加するステップ１０６を有していてもよい。指示薬３０の添加は、測定可能な結果を生じるのに有効な、適切な温度、例えば室温から５０℃、で、適切な期間、例えば１時間から９６時間、起きる。測定可能な結果は、これらに限定されないが、吸光度、蛍光値及び電流信号値を含む。或る実施態様では、測定可能な結果は、測色結果を含む。

【0035】

従って、指示薬３０は、測定可能な結果を生じる適切なものであれば、如何なる化合物であってもよい。例えば、指示薬３０は、測色結果を与えるためのプロピルアミン、プロピオンアルデヒド及び２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳＡ）からなる群から選ばれる化合物を含有していてよい。更に、これらの指示薬の各々は、特別の官能基／選択性化合物に対して、他のものよりも、より適切であってよい。例えば、非結合選択性化合物２８が、アルデヒド選択性化合物と反応する１以上のアミノ基を有するものを含有する場合、プロピオンアルデヒドは、適切な指示薬３０である。次に、選択性化合物２２は、少なくとも一時的に標的官能基に結合し、それに指示薬３０が結合してもよいものであれば、如何なる化合物でもよい。このようにして、指示薬３０は、それに結合している選択性化合物の量を指示する測定可能な信号を与える。

【0036】

指示薬３０の添加に続いて、方法１００は、更に、測定可能な結果を測定するステップ１０８を含んでいてもよい。測定は、選択された検出モードを利用するマイクロプレートウエルリーダーのような、当技術分野で公知の適切な手段を用いて行なわれる。一般的な検出モードには、これらに限られないが、吸光度、蛍光強度、発光量、時間分解蛍光及び蛍光偏光が含まれる。検出器は、検出器からデータを受領し、このデータから少なくとも１つの結果を決定するように構成されている１以上のモジュールを含有する計算ユニットを含有するシステムの一部であってよい。このシステムは、計算ユニットにより提供される指示に従って、方法のためのあらゆる又は全ての成分を添加してよい。このようにして、計算ユニットは、電子制御回路として機能し得る。計算ユニットは、例えば、マイクロプロセッサ、マイクロコンピュータ、産業用コントローラ、プログラマブルロジックコントローラ、個別のロジック回路又はその他の適切な制御装置を含有する専用コンピュータを含有してよい。一実施態様では、計算ユニットは、更に１以上の入力チャネル、メモリ、及び出力チャネルを有していてよい。メモリには、コンピュータ可読媒体又は、例えばフロッピーディスク、コンパクトディスクリードオンリーメモリ等の記憶装置が含まれてよい。一実施態様において、計算ユニットは、本発明の任意の側面を実行するための又は本明細書に記述する成分の任意の側面を制御するためのコンピュータ可読指令を含んでいてよい。

【0037】

一実施態様において、方法１０は、更に、測定された結果から、副生物２６中の非結合選択性化合物２８の量を決定するステップを有する。非結合選択性化合物２８の量は、当業者がよく理解している標準及び対照標準を用いて決定される。例えば、当技術分野で知られているように、結果を所定の濃度を有する複数の標準試料から生成された較正曲線の値と比較してもよい。

【0038】

更に、方法１００は、副生物２６、例えば上澄み液、の中の非結合選択性化合物２８の量から固体支持体１０上に固定された固定選択性化合物２４の量を決定するステップ１１２を有してもよい。固定選択性化合物２４の量は、接触ステップ１０２のために添加された選択性化合物２２の出発濃度と決定された非結合選択性化合物２８の量との間の相違を計算することにより決定し得る。固体支持体１０上の固定選択性化合物２４の量は、プロセスの個別の設計に応じて、表面官能基１２又は連結剤１４上の官能基１５に（例えば共有結合で又はその他の方法で）結合された量となる。

【0039】

更に、方法は、固定された選択性化合物２４の量から固体支持体１０上に固定された標的官能基の量を決定するステップ１１４を含んでいてもよい。即ち、固定された選択性化合物２４の量から、標的官能基（例えば官能基１２又は１５）の対応する数が決定される。例えば、或る実施態様において、１つの固定された選択性化合物２４は、固体支持体１０上の１つの標的官能基に対応し得る。或いは、１つの固定された選択性化合物２４は、固体支持体１０上の２以上の官能基に対応し得る。或る実施態様において、標的官能基の数は、特定の官能基の等価物の数として表現し得る。

【0040】

単なる例示として、２つの特別の実施態様を以下に簡潔に説明するが、本発明がそれに限られないことを理解すべきである。

【0041】

第一の特定の実施態様において、固体支持体１０は、表面官能基１２、即ち固定されたアルデヒド官能基、を有する。即ち、この例では、方法の１つの目的は、固体支持体１０上のアルデヒド官能基の数を決定することである。これを達成するために、アルデヒド官能基は、アルデヒド官能基を固体支持体１０上に存在するアミノ基に付加する反応により、固体支持体１０上に固定される。この実施態様において、固体支持体１０は、容易に市場から入手できるアミノ官能化常磁性粒子を含有していてもよい。更に、特定の実施態様において、アルデヒド官能基は、グルタルアルデヒドと固体支持体１０上のアミノ基との反応によって、固体支持体１０上に固定されていてもよい。

【0042】

次のステップで、固定されたアルデヒド官能基と選択的に反応する選択性化合物２２が固体支持体１０を含有する容器に添加され、混合され、有効な時間インキュベートされてもよい。一実施態様において、選択性化合物２２は、プロピルアミンを含有する。プロピルアミンと固定されたアルデヒド官能基との反応の後、プロピルアミンは、理想的には、十分なプロピルアミンが存在するならば、実質的に全ての利用可能なアルデヒド官能基と反応する。反応は、成分を完全に反応させ、上澄み液を生成させるのに有効な適切な条件下で起きる。残存する非結合プロピルアミンは、上澄み液等の副生物２６内に放置してよい。

【0043】

この上澄み液に、指示薬が添加される。指示薬は、この場合、上澄み液中の非結合プロピルアミンと反応する。この実施態様において、本発明者らは、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳＡ）が適切な指示薬として作用することを見出した。ＴＮＢＳＡは、アミノ基を定量するのに用いられる市販の試薬である。ＴＮＢＳＡのアミンとの反応は、マイクロプレートを用いた場合、３３５ｎｍ、より便利には４０５ｎｍ、のピーク波長で容易に測定できる高発色性の生成物を生成する。得られる測定値から、この例における結合プロピルアミン及び非結合プロピルアミンの量が、上述のように決定され、固体支持体１０上のアルデヒド官能基の数は、それから決定される。

【0044】

第二の特定の実施態様において、固体支持体１０は、官能基１２、例えば固定されたアミノ官能基、を含有する。即ち、この例において、方法の１つの目的は、固体支持体１０上のアミノ官能基の数を決定することである。これを達成するために、上述のように、ＰＭＰを、アミノシランと反応させてアミノ官能化ＰＭＰを生成させてもよい。

【0045】

次のステップにおいて、固定されたアミノ官能基と選択的に反応する選択性化合物が固体支持体１０を含有する容器に添加され、混合され、インキュベートされてもよい。この例において、選択性化合物２２は、アルデヒド化合物のような、固定されたアミノ官能基と容易に反応するものであってよい。一実施態様において、選択性化合物は、プロピオンアルデヒドを含有する。プロピオンアルデヒドと固定されたアミノ官能基との反応の後、プロピオンアルデヒドは、理想的には、十分なプロピオンアルデヒドが存在するならば、利用可能なアミノ官能基と反応する。上述の例のように、反応は、上澄み液を生成させるのに有効な適切な条件下で起きる。この例において、残存する非結合プロピオンアルデヒドは、上澄み液内に放置してよい。

【0046】

この上澄み液に、指示薬３０が添加される。指示薬は、この場合、上澄み液中の非結合プロピルアミンと反応する。この実施態様において、本発明者らは、シグマ−アルドリッチ社から入手可能なＰｕｒｐａｌｄ（登録商標）（４−アミノ−３−ヒドラジノ−５−メルカプト−１，２，４−トリアゾール、４−アミノ−５−ヒドラジノ−１，２，４−トリアゾール−３−チオール）が適切な指示薬として作用することを見出した。ＴＮＢＳＡは、アミノ基を定量するのに用いられる市販の試薬である。カルボニル基とのＰｕｒｐａｌｄ（登録商標）の反応は、高発色性の生成物を生じる。一実施態様において、得られる生成物は、４９０−５４０ｎｍに極大吸収を有する。得られる測定値から、この例における結合プロピオンアルデヒド及び非結合プロピオンアルデヒドの量が、上述のように決定され、固体支持体１０上の固定されたアミノ官能基の数は、それから決定される。

【0047】

どちらの場合においても、固定された官能基の数の決定の後、第一結合対メンバー１６の有効量が同様の固体支持体１０上の固定された官能基２４と反応させられる。一実施態様において、固体支持体１０上の標的官能基の測定された数に基づいて、もし固体支持体１０上の標的官能基の測定された数が所定の値より小さい場合、追加の標的官能基を固体支持体１０に添加してよい。所定の値は、第一の結合対メンバー１６の所定量に直接又は間接に結合するのに必要な標的官能基の数であってよい。もう１つの実施態様において、固体支持体１０上の標的官能基の測定された数に基づいて、標的官能基に結合した第一結合対メンバーの化学量論量を含有する１以上の追加の固体支持体を製造してもよい。その結果、ここに記述する方法により測定された官能基の数を、固体支持体を最適に製造するための指針として利用することができる。

【0048】

もう１つの側面において、本明細書に記述する方法又はプロセスを実施するのに必要なあらゆる成分を含有するキットが提供される。一実施態様において、キットは、標的官能基に選択的に結合する選択性化合物及び本明細書で記述する選択性化合物に選択的に結合する指示薬を含有する。もう１つの側面において、キットは、本明細書に記述する方法を実行するための包装及び／又は取扱説明書を含んでいてよい。取扱説明書は、有形の媒体上に、印刷されたものでもよく、他の方法で固定され、記録され及び／又は保存されたものであってよい。

【0049】

本発明の側面を以下の実施例により実証するが、それは如何なる方法においても、制限を意図するものではない。

【実施例】

【0050】

（実施例１）
常磁性粒子（ＰＭＰ）のアミノ当量の定量に必要なインキュベーション時間の決定
［試料調製］
シーメンス社のアミン官能化常磁性粒子（ＡＨＩ−ＰＭＰ）の２つのロットを時間依存性研究のために使用した。各ロットの８００ｍｇに対して、４０ｍＬ ２５ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ１０．０、ホウ酸ナトリウム１０水和物、シグマ社カタログ＃Ｓ９６４０、から調製）を使用して、５０ｍＬＦａｌｃｏｎチューブ内で粒子を５回洗浄した。Ｄｙｎａｍａｇ−５０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）又は等価物を用いた磁気分離の後、上澄み液を除いた。最後の洗浄後、４０ｍＬの緩衝液で再懸濁させた。各１００ｍｇ当たり、５ｍＬを８つの１５ｍＬ Ｆａｌｃｏｎチューブのそれぞれに、等しく分配した。

【0051】

各チューブに、１．６ｍＬの５０ｍＭプロピオンアルデヒド（シグマ社）水溶液を添加した。チューブに２５ｍＭホウ酸塩（ｐＨ１０．０）を８ｍＬまで充填した。１０ｍＭプロピオンアルデヒド付きの１００ｍｇＰＭＰを有するチューブを５０℃インキュベータ内に載置し、軌道ミキサ上で混合した。次の時点：１、２、３、５、１５、２４、４８及び７２時間：で、各１つのチューブを取り除いて、ＤｙａｎＭａｇ−１５又は等価物を用いて磁気分離を行なった。上澄み液を各チューブから取っておいた。

【0052】

０〜２．５ｍＭプロピオンアルデヒド標準試料（水溶液）を準備し、上澄み液の１／４希釈液（水溶液）を準備した。各試料を０．５ｍＬ微量遠心管にピペット採取し、適切なチューブホルダーを用いて８又は１２チャンネルピペットが吸引できるようにした。これらの準備が完了したとき、７ｍｇ／ｍＬのＰｕｒｐａｌｄ（登録商標、アルドリッチ社）を１Ｍ ＮａＯＨに溶解して、ヴォルテックスした。その後、０．３％過酸化水素（ＡＣＲＯＳ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社）の１容を混入させた。マルチチャンネルピペットで、Ｐｕｒｐａｌｄ（登録商標）／ＮａＯＨ／過酸化水素溶液の２００μＬを複数のウエルのそれぞれに移し入れ、次いで、５０μＬの標準試料及び上澄み液試料を続けた。試料を軌道回転ミキサ上で１０〜３０分間、室温で混合した。標準色がピンク色が濃くなってくることで力を増してくるように見えたとき、マイクロプレートをマイクロプレートリーダー（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社のＶｍａｘ ｋｉｎｅｔｉｃ マイクロプレートリーダー）に移し、４９０ｎｍで読み取った。

【0053】

［結果］
図６に示すように、８つの個別の標準について４９０ｎｍにおける平均吸光度（３回測定した）をプロットし、マイクロモルアルデヒド対吸光度の二次フィッティング方程式を確立した。二次フィッティング方程式を使用してプロピオンアルデヒドの非結合マイクロモルを計算し、次いで、これを用いて結合アルデヒドのマイクロモルを計算した。ＰＭＰに結合したアルデヒドのマイクロモルは、希釈倍率の補正後、ＰＭＰ上のアミンのアミン当量に等しかった。

【0054】

更に、図７に示すように、ＰＭＰのプロピオンアルデヒドとの反応の２４時間後、シフ塩基生成が完了したが、これは、アミノ当量の測定がミキサ上の５０℃インキュベータで２４時間以上実行し得ることを示す。

【0055】

（実施例２）
ＰＭＰ１２ロットのアミノ基当量の測定
［試料調製］
ＰＭＰの１２ロットをシーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド社から入手した。各ロットからの材料１００ｍｇを個別の１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに載置し、１０ｍＬの２５ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ１０．０）で５回洗浄した。ＤｙａｎＭａｇ−１５又は等価物を用いた磁気分離の後、上澄み液を除去し、最後の洗浄後、５ｍＬの緩衝液で再懸濁させた。

【0056】

各チューブに、１．６ｍＬの５０ｍＭプロピオンアルデヒド（シグマ社）水溶液を添加した。チューブに２５ｍＭホウ酸塩（ｐＨ１０．０）を８ｍＬまで充填した。１０ｍＭプロピオンアルデヒド付きの１００ｍｇＰＭＰを有するチューブを５０℃インキュベータ内に載置し、軌道ミキサ上で７２時間混合した。次の時点：１、２、３、５、１５、２４、４８及び７２時間：で、各１つのチューブを取り除いて、ＤｙａｎＭａｇ−１５又は等価物を用いて磁気分離を行なった。上澄み液を各チューブから取っておいた。

【0057】

［９６ウエル マイクロプレート上のアッセイ］
０〜２．５ｍＭのプロピオンアルデヒド標準試料水溶液を調製し、１／４希釈上澄み液試料水溶液を調製した。各試料（標準及び上澄み液）を０．５ｍＬ微量遠心管にピペット採取し、適切なチューブホルダーを用いて８又は１２チャンネルピペットが吸引できるようにした。その後、７ｍｇ／ｍＬのＰｕｒｐａｌｄ（登録商標、アルドリッチ社カタログ番号１６２８９２−２５Ｇ）を１ＭＮａＯＨに溶解し、撹拌して完全に溶解させた。０．３％過酸化水素（ＡＣＲＯＳ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社）の１容を混入させた。０．３％過酸化水素（ＡＣＲＯＳ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社、カタログ番号４２６００１０００）の１容をＰｕｒｐａｌｄ（登録商標）溶液に混入させた。マルチチャンネルピペットで、２００μＬのＰｕｒｐａｌｄ（登録商標）／ＮａＯＨ／過酸化水素をウエルに移し、次いで５０μＬの標準及び試料を続けた。その後、試料／標準を軌道回転ミキサ上で、室温で１０〜３０分間混合した。ピンク色が濃くなってくるのが見えたとき、マイクロプレートをマイクロプレートリーダー（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社のＶｍａｘ ｋｉｎｅｔｉｃ マイクロプレートリーダー）に移し、４９０ｎｍで読み取った。

【0058】

［結果］
図８に示すように、８つの標準の平均吸光度（３回測定した）をプロットし、４９０ｎｍにおけるマイクロモルアルデヒド対吸光度の二次フィッティング方程式を確立した。フィッティング方程式を使用してプロピオンアルデヒドの非結合マイクロモルを計算し、次いで、これを用いて結合プロピオンアルデヒドのマイクロモルを計算した。結合したプロピオンアルデヒドのマイクロモルは、ＰＭＰ上のアミン当量に等しかった。ＰＭＰの１ｍｇ当たりのアミン当量のマイクロモルを、このようにして、決定した。試験したロットは、固体１ｍｇ当たり、ほぼ同じアミノ当量を有することが示された。

【0059】

（実施例３）
ＰＭＰ−ＣＨＯ粒子のアルデヒド当量の定量に必要なインキュベーション時間の決定
［試料調製］
アミノ官能化ＰＭＰ（シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド）８００ｍｇを０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）でバッファー交換し、６．２５％グルタルアルデヒド（ポリサイエンシーズ社カタログ＃１９０９）により、５０ｍｇ固形分／ｍＬで３時間活性化し、Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ ３Ｄ軌道振盪器（３Ｄ）により３時間混合して、ＰＭＰ−ＣＨＯ粒子とした。非結合のグルタルアルデヒドを０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）５６ｍＬで４回洗浄除去した。ＰＭＰ−ＣＨＯ粒子を、同じ緩衝液中に２０ｍｇ固形分／ｍＬで、新しいポリプロピレンボトル中に再懸濁させた。

【0060】

８本の１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに、それぞれ、ＰＭＰ−ＣＨＯ１００ｍｇを吸引し、２５ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ１０。ホウ酸ナトリウム１０水和物（シグマ社カタログ＃Ｓ９６４０）から調製）１０ｍＬで５回洗浄し、その後、同じ緩衝液５ｍＬ中に再懸濁させた。各チューブに５０ｍＭプロピルアミン（シグマ社カタログ＃２４０９５８）水溶液１．６ｍＬを添加し、２５ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ１０）で８ｍＬとし、これにより、固体を１０ｍＭプロピルアミンと混合した。８本のチューブを０〜７２時間、５０℃インキュベータ中でインキュベートした。各時点で、上澄み液をＤｙｎａＭａｇ−１５又は同等の磁石で分離し、等量の７８ｍＭのＨＥＰＥＳ（シグマ社カタログ＃Ｈ３３７５、ｐＨ調整なし）と混合して最終ｐＨを約８．５±０．２とした。遠心分離した上澄み液を全時点が完了するまで２〜８℃に保った。

【0061】

［９６ウエル マイクロプレート上のアッセイ］
５ｍＬの２５ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ１０）と等量の０．５Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ７．９）とを混合して１０ｍＬの混合緩衝液を調製し、ｐＨを約８．８とした。等量の１０ｍＭプロピルアミンと７８ｍＭのＨＥＰＥＳとを混合することにより、５ｍＭのプロピルアミン標準を調製し、次いで、混合緩衝液中０〜５ｍＭのプロピルアミンに希釈した。２００μＬの標準を９６のマイクロプレートウエルに、３回吸引した。更に、試料２００μＬを９６のマイクロプレートウエルに、６回吸引した。標準の各ウエル及び試料の３つのウエルに５０μＬの０．０１％ＴＮＢＳＡ（又はピクリルスルホン溶液、シグマ社カタログ＃９２８２３）を添加した。５０ｍＭのホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）５０μＬを試料コントロールのみに添加した。試料を振盪器上で室温で約６０分間混合した。ウエルの溶液が適切な強度（吸光度約０．５〜１）の黄色〜橙色に変わったとき、ウエルのプレートをモレキュラーデヴァイス社のＶｍａｘキネティックマイクロプレートリーダー等のマイクロプレートリーダーに移し、４０５ｎｍで読み取った。

【0062】

［結果］
下表２に各時点で測定したＡ４０５及びマイクロモルアルデヒドを示す。
［各時点で測定したＡ４０５及びマイクロモルアルデヒド／ｇＰＭＰ−ＣＨＯのまとめ］

【表2】

【0063】

更に、図９に、アルデヒド定量のためのシフ塩基生成の依存性を示す。特に、その結果は、５０℃における２２±２時間のインキュベーションで反応が完了することを示している。

【0064】

（実施例４）
ポリアミン及びトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳＡ）を用いるＰＭＰ−ＣＨＯのアルデヒド基等量の測定
［試料調製］
２ｇのＰＭＰ（シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド社）を０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）でバッファー交換し、６．２５％グルタルアルデヒド（ポリサイエンシーズ社カタログ＃１９０９）により、５０ｍｇ固形分／ｍＬで３時間活性化し、Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ ３Ｄ軌道振盪器（３Ｄ）又はＥｂｅｒｂａｃｈミキサー（ＥＢ）により室温で３時間混合した。非結合のグルタルアルデヒドを０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）１４０ｍＬで４回洗浄除去した。ＰＭＰ−ＣＨＯ粒子を、同じ緩衝液中に２０ｍｇ固形分／ｍＬで、新しいポリプロピレンボトル中に再懸濁させた。

【0065】

３Ｄ及びＥＢと標識した２本の１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに１００ｍｇを入れ、２５ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ１０、ホウ酸ナトリウム１０水和物（シグマ社カタログ＃Ｓ９６４０）から調製）１０ｍＬで５回洗浄し、その後、同じ緩衝液５ｍＬ中に再懸濁させた。各チューブに５０ｍＭプロピルアミン（シグマ社カタログ＃２４０９５８）水溶液１．６ｍＬを添加し、２５ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ１０）で充填して８ｍＬとし、これにより、固体を１０ｍＭプロピルアミンと混合した。２本のチューブを２４時間、５０℃インキュベータ中でインキュベートした。その後、上澄み液をＤｙｎａＭａｇ−１５又は同等の磁石で分離し、等量の７８ｍＭのＨＥＰＥＳ（シグマ社カタログ＃Ｈ３３７５、ｐＨ調整なし）と混合して最終ｐＨを約８．５±０．２とした。１０ｍＭプロピルアミンストックを、ＰＭＰ−ＣＨＯが存在しないほかは同様に、試料として調製した。

【0066】

［９６ウエル マイクロプレート上のアッセイ］
５ｍＬの２５ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ１０）と等量の０．５Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ７．９）とを混合して１０ｍＬの混合緩衝液を調製し、ｐＨを約８．８とした。等量のプロピルアミンと７８ｍＭのＨＥＰＥＳとを混合して５ｍＭプロピルアミン標準試料を調製し、次いで希釈して、０〜５ｍＭのプロピルアミンの混合緩衝液溶液を得た。２００μＬの標準試料を９６のマイクロプレートウエルに、３回吸引した。試料２００μＬを９６のマイクロプレートウエルに、６回吸引した。標準の各ウエル及び試料の３つのウエルに、５０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）に溶解した５０μＬの０．０１％ＴＮＢＳＡ（又はピクリルスルホン溶液、シグマ社カタログ＃９２８２３）を添加し、試料コントロールのみには、各５０ｍＭのホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）５０μＬを添加した。プレートを振盪器上で室温で約６０分間混合した。ウエルの溶液が黄色から橙色に変わり適切な強度（吸光度約０．５〜１）に達したとき、ウエルのプレートをモレキュラーデヴァイス社のＶｍａｘキネティックマイクロプレートリーダー等のマイクロプレートリーダーに移し、４０５ｎｍで読み取った。

【0067】

図１０は、プロピルアミンのマイクロモル対Ａ４９０を示す。下表３は、試料コントロールを差し引いた後のアルデヒド等量（マイクロモル）を示す。
［ＰＭＰ−ＣＨＯのアルデヒド等量］

【表3】

【0068】

（実施例５）
ＤＯＥデザイン並びにプロピルアミン及びＴＮＢＳＡを用いたＰＭＰ−ＣＨＯのアルデヒド基等量の決定
［ＤＯＥデザイン］
ＤＯＥ、実験計画、第１７版、実験データの設計及び解析のための統計的方法がペンシルベニア州州立大学においてＭｉｎｉｔａｂ Ｉｎｃ．により販売されている。中心点及び応答変数を有する３要素の完全な要因設計変数が下記にリストされている。
［ＤＯＥデザイン及び応答変数］

【表4】

【0069】

［試料調製］
５〜５．５グラムに亘るＰＭＰを、９つの調製条件（２^３＋１＝９）について、１ＬのＮａｌｇｅｎｅ スクエアボトルに、調製した。ＰＭＰを洗浄緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で３回洗浄し磁気的に分離した。上澄み液をピペット吸引により、排出した。各ウエットケーキに、種々の大きさ（０．２５〜８Ｌ）のスクエアＮａｌｇｅｎｅ容器に入れられた、残存緩衝液を含有するＰＭＰを、希釈グルタルアルデヒドの計算容積まで、添加して、室温で３時間、インディアナ州にあるＧｌａｓ−Ｃｏｌ社製造の３−Ｄ軌道振盪器により混合した。

【0070】

ＰＭＰを２回洗浄したのち、ＰＭＰ−ＣＨＯを新しい１ＬのＮａｌｇｅｎｅ スクエア容器に移し、洗浄緩衝液で更に４回洗浄した。最終的なＰＭＰ−ＣＨＯウエットケーキを０．５ＬのＮａｌｇｅｎｅスクエアボトル中に洗浄緩衝液で再懸濁させて２０ｍｇ／ｍＬとし、アッセイまで２〜８℃で貯蔵した。

【0071】

［９６ウエル マイクロプレート上のアッセイ］
マイクロプレート上でアッセイを実行するのに先立って、上記実施例５で説明したアッセイプロトコルを用いて、試料の各１００ｍｇを２５ｍＭのホウ酸ナトリウム（ｐＨ１０）中で１０ｍＭのプロピルアミンで５０℃で２４時間インキュベートした。

【0072】

［結果］
表５に試料条件及び応答変数値をまとめた。
［ＤＯＥデザイン及び応答変数値のまとめ］

【表5】

【0073】

表６は、統計的解析からのフィッティング モデルを示す。特に、表６は、フィッティング モデルを、唯一の重要な要素である％グルタルアルデヒド（ｐ＝０．０１１＜０．０５）で換算した後のパラメーター値を示す。
［分散分析］

【表6】

【0074】

結果を図１１〜１３に示す。
図１１は、グルタルアルデヒドがアルデヒド基生成の主要因であることを示す効果プロットである。
図１２は、％容器占有率と交差するＰＭＰｍｇ／ｍＬを示す交互作用プロットである。
図１３は、Ｂ（％グルタルアルデヒド）がアルデヒド基生成の主要因であることを図示するパレート図である。
図１４は、０．７４４のＤ（Ｄｅｓｉｒａｂｉｌｉｔｙ）が７０ｍｇ／ｍＬの１２．５％グルタルアルデヒド及び７９％の容器占有率に設定された設計変数で達成されることが、レスポンスオプティマイザーによって示されたことを説明する図である。

【0075】

要するに、実施例５の実験は、ＰＭＰ−ＣＨＯとプロピルアミンとの間のシフ塩基生成を、ＴＮＢＳＡを用いたマイクロプレート試験法と結びつけることにより、ＤＯＥを用いた最適化を達成し得ることを示す。
本発明の種々の実施態様を本明細書に示し述べてきたけれども、そのような実施態様が実施例としてのみ提供されていることは明らかであろう。多数の変動、変化及び置換を本明細書に述べた発明から離れることなくなし得る。従って、本発明は、従属する請求項の精神及び範囲によってのみ、限定される。

【符号の説明】

【0076】

１０：固体支持体
１２：表面官能基
１４：連結剤
１５：官能基
１６：第一の結合対メンバー
１８：第二の結合対メンバー
２０：試料
２２：選択性化合物
２４：固定された選択性化合物
２６：副生物
２８：選択性化合物
３０：指示薬
ＢＰ１：第一の結合対メンバー
ＢＰ２：第二の相補性結合対メンバー

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】