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特許6796660切断された相補的なタグ切片を用いた標的核酸配列の検出方法及びその組成物

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6796660

(24)【登録日】2020年11月18日

(45)【発行日】2020年12月9日

(54)【発明の名称】切断された相補的なタグ切片を用いた標的核酸配列の検出方法及びその組成物

(51)【国際特許分類】

C12Q 1/6874 20180101AFI20201130BHJP

C12Q 1/686 20180101ALI20201130BHJP

C12Q 1/6853 20180101ALI20201130BHJP

C12Q 1/6869 20180101ALI20201130BHJP

C12Q 1/6813 20180101ALI20201130BHJP

C12Q 1/6888 20180101ALI20201130BHJP

C12Q 1/689 20180101ALI20201130BHJP

C12Q 1/6816 20180101ALI20201130BHJP

C12N 15/09 20060101ALN20201130BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6874 Z

C12Q1/686 ZZNA

C12Q1/6853 Z

C12Q1/6869 Z

C12Q1/6813 Z

C12Q1/6888 Z

C12Q1/689 Z

C12Q1/6816 Z

!C12N15/09 Z

【請求項の数】38

【全頁数】53

(21)【出願番号】特願2018-556900(P2018-556900)

(86)(22)【出願日】2017年4月21日

(65)【公表番号】特表2019-514384(P2019-514384A)

(43)【公表日】2019年6月6日

(86)【国際出願番号】KR2017004297

(87)【国際公開番号】WO2017188669

(87)【国際公開日】20171102

【審査請求日】2018年10月24日

(31)【優先権主張番号】10-2016-0050313

(32)【優先日】2016年4月25日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】518378178

【氏名又は名称】ジンメトリックスインコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＭＡＴＲＩＸＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】110002262

【氏名又は名称】ＴＲＹ国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】キムスオク

(72)【発明者】

【氏名】キムソクジュン

(72)【発明者】

【氏名】ホンソンピョ

(72)【発明者】

【氏名】チョンヒョンジェ

(72)【発明者】

【氏名】チョウジェ

(72)【発明者】

【氏名】キムジェイル

(72)【発明者】

【氏名】ヤンスンミン

(72)【発明者】

【氏名】チョエリ

(72)【発明者】

【氏名】ホンソンス

(72)【発明者】

【氏名】キムジョンウ

(72)【発明者】

【氏名】ジョンソンヨン

【審査官】西賢二

(56)【参考文献】

【文献】特表２００６−５０８６７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００６−５０８６３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１５／１９３４８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１０−５１１４０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４−５１５６０４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ１／６８−１／６８９７

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

５’から３’末端に標的配列と非相補的なランダム核酸配列を含み、制限酵素認識配列及び標的配列と相補的な核酸配列を順次含む構造を有するプライマーであって、
前記プライマーから伸長した増幅産物には前記ランダム核酸配列における相補的な配列及び制限酵素認識配列が含まれ、前記増幅産物を制限酵素が切断して、ランダム核酸配列の相補的なタグ切片が放出され、前記相補的なタグ切片以外の切断副産物が生成されず、前記プライマーは、前記制限酵素によって切断される部位に変形されたｄＮＴＰが挿入されていることを特徴とするプライマー。

【請求項2】

前記制限酵素認識配列は、ＰｈｏＩ、ＰｓｐＧＩ、ＢｓｔＮＩ、ＴｆｉＩ、ＡｐｅＫＩ、ＴｓｐＭＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｔＹＩ、ＴａｑＩ、ＭｗｏＩ、ＴｓｅＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＴｓｐＲＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ制限酵素及びＮｉｃｋ制限酵素からなる群から選択された制限酵素に対する認識配列であることを特徴とする、請求項１に記載のプライマー。

【請求項3】

前記切断される部位に挿入される変形されたｄＮＴＰは、ホスホロチオエート化された（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｄ）ｄＮＴＰ、７−デアザプリン（Ｄｅａｚａｐｕｒｉｎｅ）を含有したｄＮＴＰ、またはＤＮＡ鋳型中の２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（ｍｅｔｈｙｌｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；２’−ＯＭｅＮ）を含むことを特徴とする、請求項１に記載のプライマー。

【請求項4】

前記プライマーは、生成される切断された相補的なタグ切片の長さが５ｍｅｒ以上５０ｍｅｒ以下であることを特徴とする、請求項１に記載のプライマー。

【請求項5】

前記プライマーは、配列番号１、３、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５１、１５３、１５５、１５６、１５９、１６１、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、２０４、２０５、２０７、２１８、２２０及び２２２からなる群から選択された１つ以上のプライマーである、請求項１に記載のプライマー。

【請求項6】

ａ）請求項１に記載のプライマーと標的配列をハイブリダイズさせるステップ；
ｂ）前記ａ）ステップのハイブリダイゼーションにより増幅過程が進行するとき、前記プライマーから伸長された増幅産物を制限酵素が切断して、ランダム核酸配列の相補的なタグ切片が生成されて反応液に放出及び流入するステップ；及び
ｃ）前記生成された切断された相補的なタグ切片を分析装置によって同定し、標的核酸配列の存在を確認するステップを含む、重合酵素連鎖反応中に増幅された標的配列の種類を区分及び分析するのに使用される標識を形成し、同定する方法。

【請求項7】

前記方法は、切断された相補的なタグ切片の質量を分析して、切断された相補的なタグ切片を同定することを特徴とする、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記質量の分析に使用される機器は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）、液体クロマトグラフィー質量分析器（ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、または高性能液体クロマトグラフィー質量分析器（ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記質量の分析に使用される切断された相補的なタグ切片の単位電荷当たりの質量（ｍ／ｚ）は、０超１００００Ｄａ以下の間に存在することを特徴とする、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

質量の分析に使用される切断された相補的なタグ切片の質量を保存するために、重合酵素の特性である３’末端のアデニン追加伸長機能が抑制されているＤＮＡ重合酵素を使用することを特徴とする、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

前記方法は、前記切断された相補的なタグ切片の同定方法として、蛍光及びクエンチャー（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が標識されており、切断された相補的なタグ切片の相補的配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて蛍光シグナルを分析することを特徴とする、請求項６に記載の方法。

【請求項12】

前記方法は、オリゴヌクレオチドと切断された相補的なタグ切片の二本鎖が一本鎖に解離される固有の解離温度を多様化して解離温度及び溶融ピークを分析し、切断された相補的なタグ切片を同定して標的配列の存在を確認することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記方法は、２つ以上のターゲットを検出する場合、異なる解離温度を有するようにして、溶融ピークの分析によって２種以上のターゲットを同時に分析するようにする、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記オリゴヌクレオチドの長さは、５個以上から５０個以下の間のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

前記方法は、オリゴヌクレオチドから塩基配列が伸長することを防止するために、オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドをブロッキングすることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。

【請求項16】

前記方法は、オリゴヌクレオチドから塩基配列が伸長することを防止するために、オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドにＳｐａｃｅｒＣ３、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｄｄＣ、ＩｎｖｅｒｔｅｄＥＮＤを付着することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記方法は、オリゴヌクレオチドから塩基配列が伸長することを防止するために、オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドにクエンチャーを付着することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記方法は、性媒介疾患の原因体を同定する、請求項６に記載の方法。

【請求項19】

前記性媒介疾患の原因体は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、ウレアプラズマ・パルバム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａｐａｒｖｕｍ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ヘルペスシンプレックスウイルス１（Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ１）、ヘルペスシンプレックスウイルス２（Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ２）、及びトレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ）からなる群から選択されたことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記方法は、胃腸管疾患の原因体を同定する、請求項６に記載の方法。

【請求項21】

前記胃腸管疾患の原因体は、ロタウイルスＡ（ＲｏｔａｖｉｒｕｓＡ）、アストロウイルス（Ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルスＦ４０（ＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＦ４０）、アデノウイルスＦ４１（ＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＦ４１）、ノロウイルスＧＩ（ＮｏｒｏｖｉｒｕｓＧＩ）、及びノロウイルスＧＩＩ（ＮｏｒｏｖｉｒｕｓＧＩＩ）からなる群から選択されたことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記方法は、ヒト乳頭腫ウイルスを同定する、請求項６に記載の方法。

【請求項23】

前記ヒト乳頭腫ウイルスは、１６型、１８型、３３型、３５型、５１型、５３型、５９型、６８ａ型、及び８２型からなる群から選択されたことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記方法は、呼吸器疾患の原因体を同定する、請求項６に記載の方法。

【請求項25】

前記呼吸器疾患の原因体は、インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ／Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ／Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ）、インフルエンザＢ（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＢ）、パラインフルエンザ１（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ１）、パラインフルエンザ３（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ３）、呼吸器合胞体ウイルスＡ（ＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓＡ）、呼吸器合胞体ウイルスＢ（ＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓＢ）、ヒトメタニューモウイルス（Ｈｕｍａｎｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、及びアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）からなる群から選択されたことを特徴とする、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記方法は、単一塩基多型性（ＳＮＰ）の遺伝子型を分析することができる、請求項６に記載の方法。

【請求項27】

前記単一塩基多型性は、ＢＤＮＦ遺伝子の単一塩基多型性であるｒｓ６２６５の突然変異型であるＡ／Ａ、野生型であるＧ／Ｇ、または異型接合体であるＡ／Ｇの遺伝子型を分析することができる、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記方法は、オリゴヌクレオチドの蛍光シグナルのＣｔ値を分析して、切断された相補的なタグ切片を同定することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。

【請求項29】

請求項１に記載のプライマーを有効成分として含む、性媒介疾患診断用組成物。

【請求項30】

前記性媒介疾患は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、ウレアプラズマ・パルバム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａｐａｒｖｕｍ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ヘルペスシンプレックスウイルス１（Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ１）、ヘルペスシンプレックスウイルス２（Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ２）、及びトレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ）からなる群から選択された菌によって誘発されることを特徴とする、請求項２９に記載の組成物。

【請求項31】

請求項１に記載のプライマーを有効成分として含む胃腸管疾患診断用組成物。

【請求項32】

前記胃腸管疾患は、ロタウイルスＡ（ＲｏｔａｖｉｒｕｓＡ）、アストロウイルス（Ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルスＦ４０（ＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＦ４０）、アデノウイルスＦ４１（ＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＦ４１）、ノロウイルスＧＩ（ＮｏｒｏｖｉｒｕｓＧＩ）、及びノロウイルスＧＩＩ（ＮｏｒｏｖｉｒｕｓＧＩＩ）からなる群から選択された菌によって誘発されることを特徴とする、請求項３１に記載の組成物。

【請求項33】

請求項１に記載のプライマーを有効成分として含むヒト乳頭腫ウイルス診断用組成物。

【請求項34】

前記ヒト乳頭腫ウイルスの亜型は、１６型、１８型、３３型、３５型、５１型、５３型、５９型、６８ａ型、または８２型を診断する、請求項３３に記載の組成物。

【請求項35】

請求項１に記載のプライマーを有効成分として含む呼吸器疾患原因体診断用組成物。

【請求項36】

前記呼吸器疾患は、インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ／Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ／Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ）、インフルエンザＢ（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＢ）、パラインフルエンザ１（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ１）、パラインフルエンザ３（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ３）、呼吸器合胞体ウイルスＡ（ＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓＡ）、呼吸器合胞体ウイルスＢ（ＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓＢ）、ヒトメタニューモウイルス（Ｈｕｍａｎｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、及びアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）からなる群から選択された菌によって誘発されることを特徴とする、請求項３５に記載の組成物。

【請求項37】

請求項１に記載のプライマーを有効成分として含む単一塩基変異分析用組成物。

【請求項38】

前記単一塩基変異は、ＢＤＮＦ遺伝子の単一塩基多型性であるｒｓ６２６５の突然変異型Ａ／Ａ、野生型Ｇ／Ｇ、または異型接合体Ａ／Ｇの遺伝子型を分析することができる、請求項３７に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、切断された相補的なタグ切片を用いた標的核酸配列の検出方法及びその組成物に関し、具体的には、標的配列と特異的に反応するプライマーに標識物質を生成できる標識の鋳型を連結することによって、ＰＣＲ反応中に制限酵素の活性によって標識が合成、放出されて反応液に流入するようにして増幅産物を識別する方法に関する。また、一つの標的配列には一つの種類の標識鋳型配列のみを使用し、反応中に生成された標識を様々な分析装置で分析して標識を識別することを特徴とする標識生成及び標識同定方法、並びにその方法に使用される組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

重合酵素連鎖反応（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）は、低濃度の核酸を検出及び分析する際に非常に有用に活用されている技法の一つである。核酸の検出は、二本のオリゴヌクレオチド配列の相補性及び各ＤＮＡ重合酵素の伸長反応に起因するものであって、これを用いて標的核酸配列を検出することができる。（Ｂａｒｒｙｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：２１，２００１）。

【0003】

多重ＰＣＲは、多数の標的配列の核酸を同時に増幅できる方法であって、他の方法に比べて比較的迅速かつ簡便であるので、遺伝子検査、サンプル内の生物体の同定、微生物又はウイルスの感染の有無などの診断分野で非常に大きな役割を果たしている。

【0004】

このような多重ＰＣＲの結果を確認する最も一般的な方法は、ＰＣＲ中に目的とする標的配列の増幅産物の大きさを多様化してプライマーを設計し、ＰＣＲ結果物を電気泳動を介して増幅産物の大きさを分析することで、当該標的配列の増幅の有無を確認するものである。この場合、一度に増幅させることができる遺伝子の個数が実験的に３〜４個に限定されるが、これは、ＰＣＲ反応中に生成できる増幅産物の大きさに応じて増幅効率が変わってしまい、均一な増幅効率を保証できないため、増幅産物の大きさを狭い範囲に限定しなければならないという制約があるためである。このとき、所望の遺伝子増幅産物の大きさが重なり合う場合も発生し、このように大きさに依存して多重ＰＣＲを分析する場合、検出方法の解析に対する限界点が存在するようになる。

【0005】

ＰＣＲ結果を確認する場合、リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ）は、迅速な結果の確認を保証し、ＰＣＲ中に蛍光物質を標識して、増幅産物の大きさと関係なく増幅の有無を確認することができる。リアルタイム重合酵素連鎖反応を行って検出する方式は、インターカレーティング方式とプローブ方式とに分けることができる。インターカレーティング方式は、二本鎖の塩基配列の間に蛍光物質が挿入されて蛍光強度を確認する方法を指す。このような方法は、二本鎖を形成する増幅産物を区分することができず、全て同じ波長の蛍光で観察し得るため、標的配列別に増幅産物を識別して１つ以上の増幅物を同時に検出、確認するのに限界を有している。プローブ（Ｐｒｏｂｅ）方式は、標的配列別に指定されているプローブの蛍光値を読み取って増幅産物を検出する方法であって、この方式を用いる場合、使用される機器の分析可能蛍光チャネルの個数に限定して増幅物を検出できるので、蛍光チャネルの個数以上の多重分析に適していない。

【0006】

したがって、できる限り多くの個数の多重分析が可能なようにＰＣＲ中に標識を挿入しようとする研究が継続的に行われた。

【0007】

Ｌｕｍｉｎｅｘ社のｘＴＡＧ技術の場合、核酸をなすチミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）のランダム配列で構成された一定の塩基配列を設定し、これをｘＴＡＧと命名した。観察しようとする標的配列の増幅時に、末端にｘＴＡＧ配列が位置するようにプライマーにｘＴＡＧの配列を挿入して、ＰＣＲ過程中にｘＴＡＧが増幅産物に挿入されるようにし、ｘＴＡＧと相補的な配列が付着しているビーズと二次的に結合するようにして、２つの塩基配列の相補的な結合を形成するようにし、これを用いてターゲットを感知し、ビーズの蛍光で標的配列を分析する方法である。前記の方法は、ｘＴＡＧが増幅に関与しなくても、増幅後のプライマーが完全に除去されないと、ビーズの相補的ｘＴＡＧと結合して標識を認識する可能性があり、ｘＴＡＧの相補的配列がＰＣＲによって非特異反応を形成、非特異ターゲットを検出する誤りが生じることもあるという問題を有している。（Ｕ．Ｓ．ｐａｔｅｎｔｎｏ．７，６４５，８６８及び８，６２４，０１４）

【0008】

これを解決するために、ＰＣＲ反応中に標識を構築し、標識がＰＣＲ反応に影響を与えず、できる限り多くの個数の多重検出が可能な技法に関する研究が継続的に行われている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、上記の問題点を解決し、上記の必要性によって案出されたものであって、本発明の目的は、ＰＣＲのような増幅反応を用いた標的配列の増幅及び分析の実行時に、生成産物の長さに依存して結果を判断するときに生じる結果の不確実性を解決し、多重検出する場合、増幅確認の可能な最大個数に対する制約を解決する方法を提供することである。

【0010】

本発明の他の目的はまた、標識を形成して標的配列の増幅を確認する場合、人為的な配列を標識それ自体として使用することによって引き起こされ得る非特異的増幅による誤りを解決して、正確度を高める方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

上記の目的を達成するために、本発明は、標的配列と非相補的なランダム核酸配列を含み、制限酵素認識配列及び標的配列と相補的な核酸配列を順次含む構造を有するプライマーを提供する。

【0012】

本発明の一具現例において、前記制限酵素認識配列は、ＰｈｏＩ、ＰｓｐＧＩ、ＢｓｔＮＩ、ＴｆｉＩ、ＡｐｅＫＩ、ＴｓｐＭＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｔＹＩ、ＴａｑＩ、ＭｗｏＩ、ＴｓｅＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＴｓｐＲＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ制限酵素及びＮｉｃｋ制限酵素からなる群から選択された制限酵素に対する認識配列であることが好ましいが、これに限定されない。

【0013】

本発明の他の具現例において、前記プライマーは、切断された相補的なタグ切片以外の切断副産物が反応に関与しないことを目的として、前記プライマーの制限酵素認識配列中の切断部位に変形されたｄＮＴＰが挿入されていることが好ましく、前記切断部位に挿入される変形されたｄＮＴＰは、ホスホロチオエート化された（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｄ）ｄＮＴＰ、７−デアザプリン（Ｄｅａｚａｐｕｒｉｎｅ）を含有したｄＮＴＰ、またはＤＮＡ鋳型中の２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（ｍｅｔｈｙｌｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；２’−ＯＭｅＮ）を含むことが好ましいが、これに限定されない。

【0014】

本発明は、他の具現例において、前記プライマーは、生成される切断された相補的なタグ切片の長さが５ｍｅｒ以上５０ｍｅｒ以下であることが好ましいが、これに限定されない。

【0015】

本発明の一実施例において、前記プライマーは、配列番号１、３、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５１、１５３、１５５、１５６、１５９、１６１、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、２０４、２０５、２０７、２１８、２２０及び２２２からなる群から選択された１つ以上のプライマーであることが好ましいが、これに限定されない。

【0016】

また、本発明は、ａ）切断された相補的なタグ切片である標識を生成するための標識の鋳型を含む前記本発明のプライマーと標的配列をハイブリダイズさせるステップ；ｂ）前記ａ）ステップのハイブリダイゼーションにより増幅過程が進行するとき、制限酵素の活性によって前記プライマーから切断された相補的なタグ切片が生成されて反応液に流入するステップ；及びｃ）前記生成された切断された相補的なタグ切片を分析装置によって同定し、標的核酸配列の存在を確認するステップを含む、重合酵素連鎖反応中に増幅された標的配列の種類を区分及び分析するのに使用される標識を形成し、同定する方法を提供する。

【0017】

本発明の一具現例において、前記方法は、切断された相補的なタグ切片の質量を分析して、切断された相補的なタグ切片を同定することが好ましく、前記質量の分析に使用される機器は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）、液体クロマトグラフィー質量分析器（ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、または高性能液体クロマトグラフィー質量分析器（ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）であることが好ましいが、これに限定されない。

【0018】

本発明の他の具現例において、質量の分析に使用される切断されたタグ切片の単位電荷当たりの質量（ｍ／ｚ）は、０超１００００Ｄａ以下であることが好ましいが、これに限定されない。

【0019】

本発明の更に他の具現例において、前記増幅過程中に質量の分析に使用される切断された相補的なタグ切片の質量を保存するために、核酸重合酵素の固有の性質である３’末端のアデニン追加伸長効果（Ａテーリング）の機能が抑制されているＤＮＡ重合酵素を使用することが好ましいが、これに限定されない。

【0020】

本発明の更に他の具現例において、前記切断された相補的なタグ切片の同定方法として、蛍光及びクエンチャー（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が標識されており、切断された相補的なタグ切片の相補的配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて蛍光シグナルを分析することが好ましいが、これに限定れない。

【0021】

本発明の他の具現例において、前記方法は、前記オリゴヌクレオチドと切断された相補的なタグ切片の二本鎖が一本鎖に解離される固有の解離温度を多様化して解離温度及び溶融ピークを分析し、切断された相補的なタグ切片を同定して標的配列の存在を確認することが好ましいが、これに限定されない。

【0022】

本発明の更に他の具現例において、前記オリゴヌクレオチドの長さは、５個以上のオリゴヌクレオチドであることが好ましいが、これに限定されない。

【0023】

本発明の更に他の具現例において、前記方法は、オリゴヌクレオチドから塩基配列が伸長することを防止するために、オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドにクエンチャーを付着することが好ましいが、これに限定されない。

【0024】

本発明の更に他の具現例において、前記方法は、オリゴヌクレオチドの蛍光シグナルのＣｔ（Ｃｙｃｌｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値を分析することで、切断された相補的なタグ切片を同定することが好ましいが、これに限定されない。

【0025】

本発明の好ましい実施例において、前記方法は、性媒介疾患の原因菌を同定することが好ましく、前記性媒介疾患の原因菌は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、ウレアプラズマ・パルバム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａｐａｒｖｕｍ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ヘルペスシンプレックスウイルス１（Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ１）、ヘルペスシンプレックスウイルス２（Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ２）、及びトレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ）からなる群から選択されたものが好ましいが、これに限定されない。

【0026】

また、本発明は、前記本発明のプライマーを有効成分として含む性媒介疾患診断用組成物を提供する。

【0027】

本発明の更に他の実施例において、前記方法は、胃腸管疾患の原因体を同定することが好ましく、前記胃腸管疾患の原因体は、ロタウイルスＡ（ＲｏｔａｖｉｒｕｓＡ）、アストロウイルス（Ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルスＦ４０（ＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＦ４０）、アデノウイルスＦ４１（ＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＦ４１）、ノロウイルスＧＩ（ＮｏｒｏｖｉｒｕｓＧＩ）、及びノロウイルスＧＩＩ（ＮｏｒｏｖｉｒｕｓＧＩＩ）からなる群から選択されたものが好ましいが、これに限定されない。

【0028】

また、本発明は、前記本発明のプライマーを有効成分として含む胃腸管疾患原因体診断用組成物を提供する。

【0029】

本発明の更に他の好ましい実施例において、前記方法は、ヒト乳頭腫ウイルスを同定することが好ましく、前記ヒト乳頭腫ウイルスの亜型は、１６型、１８型、３３型、３５型、５１型、５３型、５９型、６８ａ型、及び８２型からなる群から選択されたものが好ましいが、これに限定されない。

【0030】

また、本発明は、前記本発明のプライマーを有効成分として含むヒト乳頭腫ウイルス診断用組成物を提供する。

【0031】

本発明の更に他の好ましい実施例において、前記方法は、呼吸器疾患の原因体を同定することが好ましく、前記呼吸器疾患の原因体は、インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ／Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ／Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ）、インフルエンザＢ（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＢ）、パラインフルエンザ１（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ１）、パラインフルエンザ３（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ３）、呼吸器合胞体ウイルスＡ（ＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓＡ）、呼吸器合胞体ウイルスＢ（ＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓＢ）、ヒトメタニューモウイルス（Ｈｕｍａｎｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、及びアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）からなる群から選択されたものが好ましいが、これに限定されない。

【0032】

また、本発明は、前記本発明のプライマーを有効成分として含む呼吸器疾患診断用組成物を提供する。

【0033】

本発明の更に他の好ましい実施例において、前記方法は、単一塩基多型性（ＳＮＰ、Ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）が好ましく、前記単一塩基変異は、ＢＤＮＦ遺伝子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒｇｅｎｅ）のｒ６２６５からなる群から選択されたものが好ましいが、これに限定されない。

【0034】

また、本発明は、前記本発明のプライマーを有効成分として含むＢＤＮＦ遺伝子のｒｓ６２６５遺伝子分析用組成物を提供する。

【0035】

以下、本発明を説明する。
本発明者は、増幅反応を行い、結果を解析する場合、より容易かつ迅速で、効率的な方法によって各増幅産物を明確に区分できるようにすることによって、一度に多くの標的を対象として多重増幅反応を行い、結果を解析することができる方法を開発するために鋭意研究努力した。

【0036】

その結果、標識として使用できる核酸配列を増幅反応中に生成できるように、標識の鋳型となる配列をプライマーに挿入し、制限酵素を用いて標識のみを切断したとき、生成された標識が標的配列を検出するための標識としての役割を果たすことができることを確認し、これを様々な分析法に適用して、多重増幅反応の分析において既存の他の方法に比べて効率的かつ迅速に増幅の有無を識別できることを確認し、本発明を完成するに至った。

【0037】

本発明は、ＰＣＲ反応中に増幅された標的配列の種類を区分及び分析するのに使用される標識を形成する方法に関する。

【0038】

特に、本発明では、（１）標識を生成するための標識の鋳型を含むプライマーと標的配列のハイブリダイゼーションステップと、（２）ＰＣＲ反応中に制限酵素を用いて標識の鋳型から標識を生成するステップと、（３）生成された標識を様々な分析装置で分析して標識を識別するステップとを有することを特徴とする。

【0039】

（１）標識（ＣＣＴＦ−ＣｌｅａｖｅｄＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＴａｇＦｒａｇｍｅｎｔ、以下、ＣＣＴＦ）を生成するための標識の鋳型を含むプライマー（ＣＴＰＯ−ＣｌｅａｖａｂｌｅＴａｇＰｒｉｍｅｒＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、以下、ＣＴＰＯ）と標的配列をハイブリダイズさせるステップであって；ＣＴＰＯは、標的配列と非相補的な核酸配列を含み（ＣＣＴＦの鋳型）、制限酵素認識配列及び標的配列と相補的な核酸配列を順次含み、３’末端に位置した標的配列と相補的な核酸配列部位が標的配列とハイブリダイズされることによって、ＰＣＲ反応中にプライマーとしての役割を果たす。

【0040】

（２）増幅過程中に制限酵素の活性によってＣＴＰＯからＣＣＴＦが生成されて放出されるステップであって；前記記述されたＣＴＰＯから伸長した増幅産物には制限酵素認識配列が挿入されるようになり、これを認識した熱安定性制限酵素の活性によってＣＣＴＦが生成されて反応液に流入する。

【0041】

（３）前記生成されたＣＣＴＦを様々な分析装置によって分析、同定して標的核酸配列の存在を確認するステップであって；生成されたＣＣＴＦの質量を測定してＣＣＴＦの種類を把握、増幅された物質を区分して標的核酸配列の存在を確認するか、または生成されたＣＣＴＦと相補的配列で構成されており、蛍光及びクエンチャーが標識されているオリゴヌクレオチド（ＳＣＯ−ＳｉｇｎａｌＣａｐｔｕｒｅＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、以下、ＳＣＯ）とＣＣＴＦがハイブリダイズして二本鎖を形成し、再び一本鎖に解離される過程で蛍光の発光がなされ、この固有の解離温度を分析してＣＣＴＦの種類を確認し、標的核酸配列の増幅の有無を確認する。

【0042】

以下、本発明を詳細に説明する。
ステップ（１）において、ＣＴＰＯと標的配列をハイブリダイズさせるに先立ち、ＣＴＰＯの構造は、下記の構造式１のように、ＣＣＴＦの鋳型となる部分と、制限酵素認識配列と、標的と相補的な配列部分とに分けられている。

【0043】

構造式１
５’−Ａ−Ｂ−Ｃ−３’

【0044】

構造式１のＡ部位は、ＣＣＴＦの鋳型となる部分であって、ランダム配列からなっており、標的配列とのアニーリング後、増幅して、ＣＣＴＦの鋳型の相補的配列、すなわち、ＣＣＴＦ部分を伸長した後、増幅中に制限酵素によってＣＣＴＦ部分が放出される。放出されたＣＣＴＦは、標識として標的配列特異的に分析可能なように、オリゴヌクレオチド５個以上の長さを有するランダム配列であることを特徴とする。ランダム配列は、ＰＣＲ反応中に副産物を生成しない範囲であれば、いかなる配列でも使用することができる。ＣＣＴＦの鋳型として使用されるヌクレオチド配列は、増幅反応中にハイブリダイゼーション反応を起こさない限り、いかなる配列でも構わない。

【0045】

Ｂは、制限酵素認識配列であって、増幅過程中に使用できる熱安定性を有する制限酵素及びＮｉｃｋ制限酵素の特異的認識配列を意味する。その例として、ＰｈｏＩ、ＰｓｐＧＩ、ＢｓｔＮＩ、ＴｆｉＩ、ＡｐｅＫＩ、ＴｓｐＭＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｔＹＩ、ＴａｑＩ、ＭｗｏＩ、ＴｓｅＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＴｓｐＲＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩなどがある。

【0046】

そのうち、最も好ましくはＰｓｐＧＩを使用することができ、本発明の実施例で使用した制限酵素はＰｓｐＧＩである。

【0047】

ＣＣＴＦ以外の切断副産物が反応に存在及び関与しないように、ＣＴＰＯの制限酵素認識配列中の制限酵素によって切断される部位に変形されたｄＮＴＰを挿入させる。その種類としては、ホスホロチオエート化された（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｄ）ｄＮＴＰ、７−デアザプリン（Ｄｅａｚａｐｕｒｉｎｅ）を含有したｄＮＴＰ、またはＤＮＡ鋳型中の２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（ｍｅｔｈｙｌｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；２’−ＯＭｅＮ）などがある。従来技術として、論文ＰＮＡＳ８９（１９９２）３９２−３９６、及び核酸リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ）２０（１）１９９１５５−６１などは、本発明に応用できる。最も好ましくは、ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏｌａｔｅｄｂｏｎｄを認識配列中の切断部位に挿入して、制限酵素によるＣＣＴＦの鋳型の切断を防止することで、ＣＣＴＦを生成できる鋳型を確保し、ＣＣＴＦの鋳型が反応液に流入して生じる副産物を防止することで、反応の効率を増大させることができる。ＣＣＴＦを生成し、その鋳型が反応液に流入することを防止するという点で、従来技術であるＳＤＡ（ＳｔｒａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）方法（米国特許９２−８１９，３５８）とは異なる発明の効果を示す。

【0048】

構造式１に示されたＣ部位は、制限酵素認識配列の後から３’末端までを意味し、標的特異的配列で構成され、増幅時に標的特異的に結合してプライマーとしての役割を維持できるようにする。

【0049】

ステップ（２）において、ＣＴＰＯによる増幅産物が形成され、二本鎖として存在する増幅産物から制限酵素によってＣＣＴＦに切断されて反応液に放出されるときに使用される制限酵素の適正濃度は、使用目的に応じて多様に変更可能である。また、使用される重合酵素の種類に応じて結果において差があり、これもまた、使用目的に応じて多様に変更可能である。例えば、質量の分析を目的としてＣＣＴＦを形成する場合、ＣＣＴＦの質量が、増幅過程と関係なく一定の質量を維持しなければならず、核酸重合酵素の固有の性質を反映しないことが好ましい。したがって、核酸重合酵素の固有の性質である３’末端のアデニン追加伸長効果（Ａテーリング）がない核酸重合酵素を選定して使用しなければならない。核酸重合酵素のうち、Ａテーリングをしない酵素としては、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（Ｖｅｎｔｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ＤｅｅｐＶｅｎｔポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、Ｂｓｔポリメラーゼ（Ｂｓｔｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）などがある。

【0050】

しかし、質量の分析ではなく、他の技法を用いたＣＣＴＦの分析法を適用する場合、Ａテーリング効果による結果に変動がないので、いかなる重合酵素を用いても構わない。

【0051】

制限酵素の効率を増大させてＣＣＴＦの生成及び反応液への流入を促進して効果を極大化するために、ＰＣＲ過程中に制限酵素の反応時間を延長することができる。反応時間及び反応温度などは、具体的な制限酵素の種類、反応意図に応じて異ならせて適用することができる。

【0052】

ステップ（３）において、生成されたＣＣＴＦを様々な分析装置によって分析して標的核酸配列を同定するステップであって、生成されたＣＣＴＦの質量を直接分析する場合、ＣＣＴＦの種類を長さ及び配列の組換えによって多様化し、これらの質量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、ＬＣＭＳ、ＨＰＬＣＭＳなどの質量分析器を用いて分析すると、生成されたＣＣＴＦの固有の質量を観察することができ、これを用いて、増幅された標的配列の区分及び確認が可能である。好ましくは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによって観察し、観察の容易なＣＣＴＦの質量の範囲は１２００Ｄａ以上である。前記の範囲の質量において、様々なＣＣＴＦを形成して増幅産物を観察することができる。

【0053】

ＣＣＴＦの蛍光シグナルを観察することにより、増幅された標的配列の識別も可能であり、生成されたＣＣＴＦが、固有の解離温度で蛍光シグナルを提供できるように蛍光及びクエンチャーが標識されており、固有の解離温度を有するＣＣＴＦと相補的な配列であるＳＣＯとハイブリダイズして、固有の解離温度で蛍光シグナルを分析し、ＣＣＴＦの生成の有無を確認し、これによって標的核酸配列の存在を同定する方法である。

【0054】

ＣＣＴＦの放出のためには、上述したように、使用目的による制限酵素の使用濃度を指定し、重合酵素の種類は、質量分析とは異なって、Ａテーリングと関係がない。増幅産物から反応液へ放出されて流入したＣＣＴＦは、反応液に存在していたＳＣＯと反応するようになり、ＳＣＯの構成は、次の通りである。

【0055】

５’末端方向から３’末端方向にＣＣＴＦとのハイブリダイゼーションが可能なように、ＣＣＴＦの相補的配列が存在し、ＳＣＯの配列は、ＣＣＴＦに依存的にＣＣＴＦの長さ、配列の組換えによって決定される。前記の（１）ステップで標識の種類を多様化するためにＣＣＴＦの長さ及び配列の組換えなどの方法を用いたように、ＣＣＴＦ及びＳＣＯの固有の解離温度を付与するために、長さ及び配列の組み合わせを異ならせてデザインすることができる。このとき、ＳＣＯは、ＣＣＴＦの相補的配列で構成され、配列中に蛍光物質を含有しており、蛍光物質の位置は、クエンチャーと一定の長さ以上離れて存在すれば、どこでも構わない。ＳＣＯの３’末端にはブロッカー（Ｂｌｏｃｋｅｒ）が位置して、ＳＣＯが反応中にプライマーとしての役割を果たすことで、塩基配列が伸長することを防止する。ブロッカーとしては、ＳｐａｃｅｒＣ３、Ｐｈｏｓｐｈａｔ、ｄｄＣ、ＩｎｖｅｒｔｅｄＥＮＤ及びクエンチャーなどを使用することができるが、これに限定されない。特に、ＳＣＯの３’末端にクエンチャーが位置すると、ＳＣＯが反応中にプライマーとしての役割を果たすことで、塩基配列が伸長することを防止すると同時に、ＣＣＴＦとハイブリダイズされて二本鎖を形成する前に、ＦＲＥＴ現象によって蛍光物質の発光を抑制する機能を有するようにする。クエンチャーを塩基配列伸長防止物質として混用して使用することによって、ＳＣＯの製造時に不必要なモディフィケーション（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）反応を減少させ、製造反応の収率を高めることができ、さらに、製造コストを低減することができる。反応中に含まれているＳＣＯと反応中に生成されるＣＣＴＦとのハイブリダイゼーションを用いて、指定された温度でハイブリダイズされた二本鎖の解離が観察されるかを蛍光で確認して分析することによって、標的配列によるＣＣＴＦの生成の有無を確認し、これを用いて標的配列を同定することができる。前記のＳＣＯの固有の解離温度として指定できる温度の範囲は、〜９５℃であり、それぞれの二本鎖の解離温度の干渉がなければ、蛍光物質毎に固有の解離温度を指定し、個数の上限に制限はない。

【0056】

ＳＣＯの蛍光物質とクエンチャーの組み合わせは、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ３５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４０５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４３０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５１４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６１０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７９０、ＡＴＴＯ３９０、ＡＴＴＯ４２５、ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ４８８、ＡＴＴＯ４９５、ＡＴＴＯ５１４、ＡＴＴＯ５２０、ＡＴＴＯ５３２、ＡＴＴＯＲｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ５５０、ＡＴＴＯ５６５、ＡＴＴＯＲｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯＲｈｏ１１、ＡＴＴＯＲｈｏ１２、ＡＴＴＯＴｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ５８０Ｑ、ＡＴＴＯＲｈｏ１０１、ＡＴＴＯ５９０、ＡＴＴＯＲｈｏ１３、ＡＴＴＯ５９４、ＡＴＴＯ６１０、ＡＴＴＯ６１２Ｑ、ＡＴＴＯ６２０、ＡＴＴＯＲｈｏ１４、ＡＴＴＯ６３３、ＡＴＴＯ６４７、ＡＴＴＯ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯＯｘａ１２、ＡＴＴＯ６６５、ＡＴＴＯ６８０、ＡＴＴＯ７００、ＡＴＴＯ７２５、ＡＴＴＯ７４０、ＡＴＴＯＭＢ２、ＡＭＣＡ、ＡＭＣＡ−Ｓ、ＢＯＤＩＰＹＦＬ、ＢＯＤＩＰＹＲ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢｉｏｓｅａｒｃｈＢｌｕｅ、ＣＡＬＦｌｕｏｒＧｏｌｄ５４０、ＣＡＬＦｌｕｏｒＯｒａｎｇｅ５６０、ＣＡＬＦｌｕｏｒＲｅｄ５９０、ＣＡＬＦｌｕｏｒＲｅｄ６１０、ＣＡＬＦｌｕｏｒＲｅｄ６３５、Ｐｕｌｓａｒ６５０、Ｑｕａｓａｒ５７０、Ｑｕａｓａｒ６７０、Ｑｕａｓａｒ７０５．ＦＡＭ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｃ３、Ｃａｌｃｅｉｎ、Ｃａｒｂｏｘｙｒｈｏｄａｍｉｎｅ６Ｇ、Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＲＯＸ）、ＣａｓｃａｄｅＢｌｕｅ、ＣａｓｃａｄｅＹｅｌｌｏｗ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｄａｎｓｙｌ、Ｄａｐｏｘｙｌ、Ｄｉａｌｋｙｌａｍｉｎｏｃｏｕｍａｒｉｎ、４’，５’−Ｄｉｃｈｌｏｒｏ−２’，７’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＤＭ−ＮＥＲＦ、Ｅｏｓｉｎ、Ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｎ、ＨＥＸ、Ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ、ＩＲＤ４０、ＩＲＤ７００、ＩＲＤ８００、ＪＯＥ、ＬｉｓｓａｍｉｎｅｒｈｏｄａｍｉｎｅＢ、ＬＣＲｅｄ６１０、ＬＣＲｅｄ６４０、ＭａｒｉｎａＢｌｕｅ、Ｍｅｔｈｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ、Ｎａｐｈｔｈｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＮＥＤ、ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ４８８、ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ５００、ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ５１４、ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ、ＰｙＭＰＯ、Ｐｙｒｅｎｅ、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ６Ｇ、ＲｈｏｄａｍｉｎｅＧｒｅｅｎ、ＲｈｏｄａｍｉｎｅＲｅｄ、ＲｈｏｄｏｌＧｒｅｅｎ、２’，４’，５’，７’−Ｔｅｔｒａ−ｂｒｏｍｏｓｕｌｆｏｎｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＴＭＲ）、Ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＴＡＭＲＡ）、ＴｅｘａｓＲｅｄ、ＴｅｘａｓＲｅｄ−Ｘ．ＴＥＴ、ＶＩＣ、ＹａｋｉｍａＹｅｌｌｏｗ、ＢＭＮ−Ｑ４６０、ＤＤＱ−Ｉ、Ｄａｂｃｙｌ、ＢＭＮ−Ｑ５３０、ＢＭＮ−Ｑ５３５、Ｅｃｌｉｐｓｅ、ＩｏｗａＢｌａｃｋＦＱ、ＢＨＱ−１、ＴＱ２、ＩＱ４、ＱＳＹ−７、ＢＨＱ−２、ＴＱ３、ＤＤＱ−ＩＩ、ＢＢＱ−６５０、ＩｏｗａＢｌａｃｋＲＱ、ＱＳＹ−２１、ＢＨＱ−３などがあり得、前記の羅列に限定されず、いかなる蛍光物質とクエンチャーも含むことができる。

【0057】

また、ＳＣＯとＣＣＴＦとの反応が、増幅反応及びＣＣＴＦ形成反応と同時に起こるようになり、ＳＣＯの二本鎖の形成割合が標的配列の増幅量と同様の効率で示されることを活用して、固有の解離温度を有するＳＣＯのＣｔグラフを作成することができ、これを用いて、固有解離温度分析方法と異なる方式で標的配列の同定が可能である。

【0058】

本発明の解決手段として作成された上記の内容は、本発明の実施例により最も好ましい具現例としてより詳細に記述される。

【発明の効果】

【0059】

本発明は、増幅反応中に制限酵素によって任意の標識（ＣＣＴＦ）が生成及び切断されるので、標識を形成するために添加した人為的な配列（ＣＴＰＯ）が、増幅反応が起こる前に制限酵素認識配列の二本鎖が形成されないため、ランダムに切断される可能性がなく、ＰＣＲ中に標的配列特異的に生成された反応産物によってのみ標識が生成されるので、ＣＣＴＦを形成するのに正確度が高く、ＰＣＲ増幅産物の長さ又は特定の配列の特異度に依存していた既存のＰＣＲ結果分析方法よりも精巧な分析結果を得ることができ、様々な種類の増幅産物を同じ長さに生産しても、特異的に増幅産物の区分及び解析が可能である。また、このように生成されたＣＣＴＦの解析は、塩基配列を活用した分析法にほとんど適用できるので、解析のための装置を汎用的に選択、適用できる。特に、これは、増幅反応を用いた迅速な多重分析が必要な診断などの分野で活用できる。

【図面の簡単な説明】

【0060】

【図1】ＣＣＴＦの形成の模式図であって、ＰＣＲ反応中に使用されるＣＴＰＯ及びＣＣＴＦの生成過程、ＣＣＴＦの分析のための例示を模式化した代表図である。

【図2】デュアルターゲットＰＣＲでのＣＣＴＦの形成及びＭＡＬＤＩ分析結果である。標的配列毎にそれぞれ異なるＣＣＴＦを形成できるようにＣＴＰＯをデザインし、増幅反応を経てＭＡＬＤＩで分析した結果、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、ＮＧ）を増幅して切断されたＣＣＴＦ１とマイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｏｍｉｎｉｓ、ＭＨ）を増幅して切断されたＣＣＴＦ２の質量に該当するピークが観察された。

【図3】性媒介疾患の原因体に対するリアルタイム重合酵素連鎖反応の溶融ピーク（ＭｅｌｔｉｎｇＰｅａｋ）の分析結果である。クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、ＣＴ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、ＮＧ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｏｍｉｎｉｓ、ＭＨ）、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、ＭＧ）、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓｖａｇｉｎａｌｉｓ、ＴＶ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、ＵＵ）、ウレアプラズマ・パルバム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａｐａｒｖｕｍ、ＵＰ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、ＣＡ）、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａｖａｇｉｎａｌｉｓ、ＧＶ）、ヘルペスシンプレックスウイルス１（Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ１、ＨＳＶ１）、ヘルペスシンプレックスウイルス２（Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ２、ＨＳＶ２）、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ、ＴＰ）、及び内部対照物質（ＩｎｔｅｒｎａｌＣｏｎｔｒｏｌ、ＩＣ）のターゲット別の多重固有解離温度測定結果であって、それぞれのＳＣＯが有する固有の解離温度（ＣＴ：ＦＡＭ８０℃、ＮＧ：ＨＥＸ７６．５℃、ＭＨ：ＨＥＸ６８℃、ＭＧ：ＣａｌＲｅｄ６１０６７．５℃、ＴＶ：Ｑｕａｓａｒ６７０７１．５℃、ＵＵ：ＣａｌＲｅｄ６１０７７℃、ＵＰ：ＦＡＭ７７℃、ＣＡ：ＦＡＭ６５℃、ＧＶ：Ｑｕａｓａｒ６７０７８．５℃、ＨＳＶ１：Ｑｕａｓａｒ７０５７３．５℃、ＨＳＶ２：Ｑｕａｓａｒ７０５７９℃、ＴＰ：Ｑｕａｓａｒ７０５６６℃、ＩＣ：Ｑｕａｓａｒ６７０６３．５℃）でピークが観察され（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）（ｅ）（ｆ）、同じ組成において標的配列が投入されなかった場合には、ＣＣＴＦを可視化するＳＣＯのピークが観察されなかった（ｇ）。

【図4】胃腸管疾患の原因体に対するリアルタイム重合酵素連鎖反応の溶融ピーク（ＭｅｌｔｉｎｇＰｅａｋ）の分析結果である。ロタウイルスＡ（ＲｏｔａｖｉｒｕｓＡ、ＲＶＡ）、アストロウイルス（Ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ、ＡｓｔＶ）、アデノウイルスＦ４０（ＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＦ４０、ＡｄＶ４０）、アデノウイルスＦ４１（ＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＦ４１、ＡｄＶ４１）、ノロウイルスＧＩ（ＮｏｒｏｖｉｒｕｓＧＩ、ＮｏＶＧＩ）、ノロウイルスＧＩＩ（ＮｏｒｏｖｉｒｕｓＧＩＩ、ＮｏＶＧＩＩ）、及び外部対照物質（Ｅｘｔｅｒｎａｌｃｏｎｔｒｏｌ）のターゲット別の多重固有解離温度測定結果であって、それぞれのＳＣＯが有する固有の解離温度（ＲＶＡ：ＨＥＸ７８℃、ＡｓｔＶ：ＣａｌＲｅｄ６１０７８℃、ＡｄＶ４０：ＣａｌＲｅｄ６１０６７℃、ＡｄＶ４１：ＣａｌＲｅｄ６１０６７℃、ＮｏＶＧＩ：ＦＡＭ６８℃、ＮｏＶＧＩＩ：ＦＡＭ８４℃、ＥＣ：ＨＥＸ６９℃）でピークが観察され（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）、同じ組成において標的配列が投入されなかった場合には、ＣＣＴＦを可視化するＳＣＯのピークが観察されなかった（ｅ）。

【図5】ヒト乳頭腫ウイルスの検出のためのリアルタイム重合酵素連鎖反応の溶融ピーク（ＭｅｌｔｉｎｇＰｅａｋ）の分析結果である。１６型、１８型、３３型、３５型、５１型、５３型、５９型、６８ａ型、８２型、及びＩＣのターゲット別の多重固有解離温度測定を示した結果であって、それぞれのＳＣＯが有する固有の解離温度（１６型：ＨＥＸ７６．５℃、１８型：ＦＡＭ７８℃、３３型：Ｑｕａｓａｒ６７０７１℃、３５型：Ｑｕａｓａｒ６７０７１℃、５１型：Ｑｕａｓａｒ６７０７１℃、５３型：Ｑｕａｓａｒ６７０７１℃、５９型：Ｑｕａｓａｒ６７０７１℃、６８型ａ：Ｑｕａｓａｒ６７０７１℃、８２型：Ｑｕａｓａｒ６７０７１℃、ＩＣ：Ｑｕａｓａｒ６７０６７．５℃）でピークが観察され（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）、同じ組成において標的配列が投入されなかった場合には、ＣＣＴＦを可視化するＳＣＯのピークが観察されなかった（ｅ）。

【図6】呼吸器疾患誘発ウイルスの検出のためのリアルタイム重合酵素連鎖反応の溶融ピーク（ＭｅｌｔｉｎｇＰｅａｋ）の分析結果である。インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ／Ｈ１Ｎ１、Ｈ１）、インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ／Ｈ３Ｎ２、Ｈ３）、インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ、２００９ｐｄｍ）、インフルエンザＢ（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＢ、ＦｌｕＢ）、パラインフルエンザ１（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ１、ＰＩＶ１）、パラインフルエンザ３（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ３、ＰＩＶ３）、呼吸器合胞体ウイルスＡ（ＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓＡ、ＲＳＶＡ）、呼吸器合胞体ウイルスＢ（ＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓＢ、ＲＳＶＢ）、ヒトメタニューモウイルス（Ｈｕｍａｎｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ、ＭＰＶ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、ＡｄＶ）、及び外部対照物質（ＥＣ、Ｅｘｔｅｒｎａｌｃｏｎｔｒｏｌ）のターゲット別の多重固有解離温度測定結果であって、それぞれのＳＣＯが有する固有の解離温度（Ｈ１：ＦＡＭ６７．５℃、Ｈ３：ＦＡＭ７６．５℃、２００９ｐｄｍ：ＦＡＭ８６．５℃、ＦｌｕＢ：ＣａｌＲｅｄ６１０８３．５℃、ＰＩＶ１：Ｑｕａｓａｒ６７０６６℃、ＰＩＶ３：Ｑｕａｓａｒ６７０７４℃、ＲＳＶＡ：ＨＥＸ６３．５℃、ＲＳＶＢ：ＣａｌＲｅｄ６１０７２℃、ＭＰＶ：ＨＥＸ８６℃、ＡＤＶ：Ｑｕａｓａｒ６７０８５℃、ＥＣ：ＣａｌＲｅｄ６１０６８．５℃）でピークが観察され（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）（ｅ）、同じ組成において標的配列が投入されなかった場合には、ＣＣＴＦを可視化するＳＣＯのピークが観察されなかった（ｆ）。

【図7】ＢＤＮＦ遺伝子の単一塩基多型性であるｒｓ６２６５の遺伝子型を分析するためのリアルタイム重合酵素連鎖反応の溶融ピーク（ＭｅｌｔｉｎｇＰｅａｋ）の分析結果である。突然変異型であるＡ／Ａ、野生型であるＧ／Ｇ、及び異型接合体であるＡ／Ｇのターゲット別の多重固有解離温度測定結果であって、それぞれのＳＣＯが有する固有の解離温度（Ａ／Ａ：７６．５℃、Ａ／Ｇ：７６．５℃と７５℃、Ｇ／Ｇ：７５℃、ＩＣ：６６℃）でピークが観察され（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）、同じ組成において標的配列が投入されなかった場合には、ＣＣＴＦを可視化するＳＣＯのピークが観察されなかった（ｅ）。

【図8】リアルタイム重合酵素連鎖反応のＣｔグラフの結果である。各原因菌別のゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ）を１００ｐｇ／ｕｌの濃度から１０倍ずつ希釈した淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、ＮＧ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ．ｈｏｍｉｎｉｓ、ＭＨ））、ウレアプラズマ・パルバム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ．ｐａｒｖｕｍ、ＵＰ）の多重リアルタイム重合連鎖反応の実験条件で示されたＳＣＯの蛍光増幅曲線（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓ）及び標準曲線（ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｓ）結果であって、（ａ）グラフは、３つの標的配列が濃度別に同時に存在する場合に描かれる蛍光増幅曲線を示し、（ｂ）グラフは、３つの標的配列がいずれも含まれない場合に描かれる陰性結果である。（ａ）グラフ中のＮＧに該当するグラフを単一蛍光増幅曲線で示して標準曲線を示すと、（ｃ）及び（ｄ）で示すことができ、ＭＧに該当するグラフは（ｅ）及び（ｆ）で示すことができ、ＵＰに該当する曲線は（ｇ）及び（ｈ）で示すことができる。

【発明を実施するための形態】

【0061】

以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。

【0062】

実施例１．デュアルターゲットＰＣＲでのＣＣＴＦの形成及びＭＡＬＤＩ分析
多重標的配列の検出のためのＰＣＲ反応中に形成されたＣＣＴＦを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いて質量分析して標的特異的に検出が可能であることを証明するために、本実験を行った。本実施例１では、性媒介疾患の原因体である淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、ＮＧ）及びマイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ．ｈｏｍｉｎｉｓ、ＭＨ）のＤＮＡを対象として行った。

【0063】

１．標的鋳型ＤＮＡ及び配列特異的に作製されたプライマー
本実施例において標的とするＮＧ及びＭＨの順方向プライマーはＣＴＰＯであって、発明の詳細な説明に記述された方法に基づいて作製された。順方向プライマーの５’末端は、ＣＣＴＦの鋳型として使用できるように、ＮＧ及びＭＨのＤＮＡと非相補的な配列で構成された任意の塩基配列であり、すぐに連続して制限酵素認識配列が位置するようにした。制限酵素認識配列の後から３’末端までは、ＮＧ及びＭＨのＤＮＡの標的部位と相補的な配列で構成されているので、プライマーとしての役割を果たす。また、順方向プライマーの５’末端はそれぞれ異なる個数のヌクレオチドで構成して、生成されるＣＣＴＦ毎に異なる質量値を有するようにした。これは、ＣＣＴＦが形成されたときに質量で増幅物を区分できるように設計するためである。逆方向プライマーは、ＮＧ及びＭＨのＤＮＡの標的部位と相補的な配列で構成されている。

【0064】

プライマー情報、及び増幅されて生成される標的配列情報は、次の通りである。

【0065】

プライマー１：５’−ＴＧＡＡＣＴＡＴ＊ＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＣＧＴＴＴＣＧＧＴＴＧＴＧＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧ−３’（配列番号１）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＴＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＴＧＡＡＣＴＡＴ＊ＣＣＴＧＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0066】

プライマー２：５’−ＧＣＴＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＴＧＡＣＣＧＧ−３’（配列番号２）

【0067】

プライマー３：５’−ＡＴＣＴＡＴＧＡＴＡ＊ＣＣＴＧＧＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＡＣＧＴＡＴＴＧＧ−３’（配列番号３）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＴＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＡＴＣＴＡＴＧＡＴＡ＊ＣＣＴＧＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0068】

プライマー４：５’−ＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＡＴＣＴＴＧＴＡＡＴＣＴＴＴＧＧＴＣ−３’（配列番号４）

【0069】

増幅物１：ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０１２０２８．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：２５１４１６−２５１５０６

【0070】

５’ＴＧＡＡＣＴＡＴ＊ＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＣＧＴＴＴＣＧＧＴＴＧＴＧＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＣＧＡＴＡＴＡＡＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣＣＧＧＴＣＡＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＧＣ−３’（配列番号５）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＴＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＴＧＡＡＣＴＡＴ＊ＣＣＴＧＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0071】

増幅物２：ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＪ２４３６９２．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：８３５−９４４

【0072】

５’ＡＴＣＴＡＴＧＡＴＡ＊ＣＣＴＧＧＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＡＣＧＴＡＴＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＧＧＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＴＴ

【0073】

ＴＡＴＧＡＣＡＡＣＡＧＴＣＣＡＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＴＴ
ＡＣＡＡＧＡＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＡ−３’（配列番号６）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＴＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＡＴＣＴＡＴＧＡＴＡ＊ＣＣＴＧＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0074】

本発明の実施例において、＊で表示された部分は、ＰｓｐＧＩ制限酵素が切断する部位をブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）するために認識配列中のＣにｍｏｄｉｆｉｅｄｄＣＴＰが挿入されたという標識である。

【0075】

増幅物から生成されるＣＣＴＦの配列及び質量は、次の通りである。

【0076】

ＣＣＴＦ１：５’−ＣＣＡＧＧＡＴＡＧＴＴＣＡ−３’／４０３８．６Ｄａ（配列番号７）

【0077】

ＣＣＴＦ２：５’−ＣＣＡＧＧＴＡＴＣＡＴＡＧＡＴ−３’／４３５１．８Ｄａ（配列番号８）

【0078】

２．ＰＣＲ増幅
順方向プライマーとしてプライマー１、プライマー３を、逆方向プライマーとしてプライマー２、プライマー４を投入して、同時にＰＣＲ反応を行い、ＣＣＴＦが形成されたか否かを把握した。それぞれのプライマーを３μＭ、ＰｓｐＧＩ（ＮＥＢ、ＵＳＡ）２Ｕ、ＰＣＲバッファ（ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ、１ｘ）、ＭｇＳＯ４３ｍＭ、ｄＮＴＰ４００μＭ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（ＶｅｎｔＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（ＮＥＢ、ＵＳＡ）１Ｕ、及びＮＧ、ＭＨ鋳型ＤＮＡ１００ｐｇ／ｕｌが含まれた総反応液２０μlを、次の条件でＣ１０００ＰＣＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いてＰＣＲ反応を行った。

【0079】

９４℃ １０分、
９４℃ ３０秒、６２℃ ３０秒、７２℃ ３０秒（３５サイクル）、
８５℃ ２．５時間

【0080】

３．ＰＣＲ反応中に切断された切片の精製及び脱塩
ＰＣＲ反応中に制限酵素で処理されて切断されたＤＮＡ切片を、前記溶液から分離するために、Ｏａｓｉｓ（Ｗａｔｅｒｓ）Ｃ１８イオン交換樹脂カラム（Ｃ１８ｒｅｖｅｒｓｅｐｈａｓｅｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いた。前記制限酵素で処理した溶液に０．１５Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ、ｐＨ７．６）７０μlを入れて１分間放置する。カラムに１００％アセトニトリル（ＡＣＮ；Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）と０．１ＭＴＥＡＡ１ｍｌを通過させてレジン（Ｒｅｓｉｎ）を活性化させた後、前記制限酵素で処理した溶液と０．１５ＭＴＥＡＡとの混合液１００μl、０．１ＭＴＥＡＡ２ｍｌ及び３次蒸留水１ｍｌを順に完全に通過させる。収集プレート（ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＰｌａｔｅ）上に前記カラムを位置させ、７０％ＡＣＮ１００μlを入れて通過させる。溶出液が収集プレートに集められると、前記収集プレートを１２０℃で６０分間乾燥させる。

【0081】

４．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析
ＭＡＬＤＩマトリックス（ＭＡＬＤＩｍａｔｒｉｘ）［２２．８ｍｇのクエン酸アンモニウム、１４８．５ｍｇのヒドロキシピコリン酸（ｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｏｌｉｎｉｃａｃｉｄ）、１．１２ｍｌのアセトニトリル、７．８ｍｌのＨ２Ｏ］４μlを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（ＢｉｆｌｅｘＩＶ、Ｂｒｕｋｅｒ）のアンカーチッププレート（Ａｎｃｈｏｒｃｈｉｐｐｌａｔｅ）に予め点滴（ｄｏｔｔｉｎｇ）した後、３７℃で３０分間乾燥させる。精製及び脱塩過程を経た収集プレートのサンプルに３次蒸留水を１０μl入れて溶解させた後、乾燥されたＭＡＬＤＩマトリックス上に２μlを点滴し、ＭＡＬＤＩマトリックスを再び３７℃で３０分間乾燥させた後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器で分析する。分析方法は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器のマニュアルに従う。

【0082】

前記反応によって生成されたＣＣＴＦを質量分析器で分析した結果は、図２に示される通りである。図２の結果、プライマー１とプライマー２との組み合わせでＰＣＲを行ったときに形成されるＣＣＴＦ１の質量である４０８３Ｄａ、及びプライマー３とプライマー４との組み合わせでＰＣＲを行ったときに形成されるＣＣＴＦ２の質量である４３５１Ｄａのピークが確認できた（ａ）。これによって、ＣＴＰＯによって形成されたＣＣＴＦを用いてＰＣＲ増幅産物を分析できることを立証し、なお、種々のプライマーが混入している反応物でも、標的配列を正確に増幅及び区分するのにＣＣＴＦを活用できることを検証した。
したがって、ＣＣＴＦの標識化技法を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲを行った後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを活用した質量分析法によって様々な長さの標識切片を識別することで、既存のＰＣＲ方式よりも精巧に標的核酸配列の検出が可能であることを証明した。

【0083】

実施例２．多重ターゲットＰＣＲでのＣＣＴＦの形成及びＣＣＴＦの固有の解離温度のピーク分析
ＰＣＲ反応中に生成されたＣＣＴＦは、固有の解離温度で蛍光シグナルを出し得るＳＣＯと結合して固有の解離温度のピークを形成するようになり、これを、リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ）機器を用いてＰＣＲ過程後に直接観察が可能なようにした。ＰＣＲ反応中にＣＣＴＦが形成されると同時に、反応容器内に共に投入されているＳＣＯのＣＣＴＦ相補的配列部位とハイブリダイズするようになり、二本鎖を形成するようになる。この二本鎖を一本鎖に解離させるときに示されるＳＣＯの固有の解離温度を測定して、ＣＣＴＦの種類をリアルタイム重合酵素連鎖反応機器によってＰＣＲと同時に区分及び分析することができる。本実施例において使用したＳＣＯは、それぞれ異なる蛍光レポーターを使用し、固有の解離温度を調節してＣＣＴＦの区分が可能なようにした。

【0084】

本実施例では、性媒介疾患の原因体１２種、胃腸管疾患の原因体５種、ヒト乳頭腫ウイルス亜型９種、呼吸器疾患の原因体１０種、ＢＤＮＦ遺伝子の単一塩基変異ｒｓ６２６５核酸を、リアルタイム重合酵素連鎖反応機器を用いてＣＣＴＦ分析を行った。

【0085】

１．性媒介疾患の原因体の検出のための多重ターゲットＰＣＲでのＣＣＴＦの形成及びＣＣＴＦの固有の解離温度のピーク分析
性媒介疾患の原因体であるクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、ＣＴ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、ＮＧ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｏｍｉｎｉｓ、ＭＨ）、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、ＭＧ）、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓｖａｇｉｎａｌｉｓ、ＴＶ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、ＵＵ）、ウレアプラズマ・パルバム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａｐａｒｖｕｍ、ＵＰ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、ＣＡ）、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａｖａｇｉｎａｌｉｓ、ＧＶ）、ヘルペスシンプレックスウイルス１（Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ１、ＨＳＶ１）、ヘルペスシンプレックスウイルス２（Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ２、ＨＳＶ２）、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ、ＴＰ）及び内部対照物質（ＩｎｔｅｒｎａｌＣｏｎｔｒｏｌ、ＩＣ）のＤＮＡのリアルタイム重合酵素連鎖反応機器を用いたＣＣＴＦ分析を行った。

【0086】

１）標的配列鋳型ＤＮＡの配列特異的に作製されたプライマー
本実施例で使用した順方向プライマーはＣＴＰＯであって、上述した実施例１と同じ原理で作製された。ＣＴＰＯの５’末端は、１９〜２０ｍｅｒのヌクレオチド配列で構成されており、ＣＣＴＦを形成できるように標的配列のＤＮＡと非相補的な配列で構成される。その後に制限酵素認識配列が位置し、その後から３’末端までは、それぞれの標的部位と相補的な配列で構成されているので、プライマーとしての役割を果たす。逆方向プライマーは、それぞれの増幅しようとする標的部位と相補的な配列で構成されている。

【0087】

また、ＣＣＴＦと相補的結合を形成して二本鎖の鋳型となるＳＣＯは、３’末端の蛍光相殺分子（ＢＨＱ−１又はＢＨＱ−２）を位置させ、蛍光レポーター分子を一定の距離を有するように位置させた。

【0088】

プライマー情報、及び増幅されて生成される標的配列情報は、次の通りである。

【0089】

プライマー５：５’−ＣＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＡ＊ＣＣＡＧＧＡＣＴＴＧＧＴＧＴＧＡＣＧＣＴＡＴＣＡＧＣＡＴ−３’（配列番号９）

【0090】

プライマー６：５’−ＧＴＴＴＴＣＡＡＡＡＣＡＣＧＧＴＣＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＣ−３’（配列番号１０）

【0091】

プライマー７：５’−ＣＡＴＣＧＣＣＡＣＧＡＧＣＣＧＧＴＴＡＡ＊ＣＣＡＧＧＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＣ−３’（配列番号１１）

【0092】

プライマー８：５’−ＧＣＴＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＴＧＡＣＣＧＧＴ−３’（配列番号１２）

【0093】

プライマー９：５’−ＡＣＴＣＡＣＧＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＧＣＡ＊ＣＣＡＧＧＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＡＣＧＴＡＴＴＧＧ−３’（配列番号１３）

【0094】

プライマー１０：５’−ＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＡＴＣＴＴＧＴＡＡＴＣＴＴＴＧＧＴＣ−３’（配列番号１４）

【0095】

プライマー１１：５’−ＧＣＴＡＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＡＣＡＡＧ＊ＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＴＧＧＴＧＣＴＴＡＴＡＴＴＧＧＴＧＧＣＡＴＧ−３’（配列番号１５）

【0096】

プライマー１２：５’−ＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＴＴＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＴＣ−３’（配列番号１６）

【0097】

プライマー１３：５’−ＴＧＣＣＧＣＧＴＧＡＴＴＣＧＡＴＣＣＣＡ＊ＣＣＡＧＧＴＡＴＧＴＣＣＧＧＣＡＣＡＡＣＡＴＧＣＧＣＴ−３’（配列番号１７）

【0098】

プライマー１４：５’−ＧＡＧＣＴＴＡＣＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＴＧＡ−３’（配列番号１８）

【0099】

プライマー１５：５’−ＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＧＧＧＣＣＧＣＴＧ＊ＣＣＡＧＧＡＡＧＴＡＧＣＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡ−３’（配列番号１９）

【0100】

プライマー１６：５’−ＴＡＡＴＧＣＡＡＣＧＴＧＣＡＴＴＴＧＣＴＴＣＡＡＣ−３’（配列番号２０）

【0101】

プライマー１７：５’−ＣＡＧＡＴＣＧＴＴＧＧＣＡＣＴＣＴＧＣＧＡ＊ＣＣＡＧＧＴＴＡＡＡＧＴＡＧＣＡＴＡＴＧＡＴＣＡＡＧＣＴＣＡＴＴＣＡ−３’（配列番号２１）

【0102】

プライマー１８：５’−ＴＴＧＴＡＡＴＧＡＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＡＡＴ−３’（配列番号２２）

【0103】

プライマー１９：５’−ＧＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＣＴＣＣＡＴＡＴＡ＊ＣＣＡＧＧＣＣＡＡＡＴＣＴＧＧＡＴＣＴＴＣＣＴＣＴＧＣＡＴＣ−３’（配列番号２３）

【0104】

プライマー２０：５’−ＧＡＧＣＴＴＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧ−３’（配列番号２４）

【0105】

プライマー２１：５’−ＡＣＧＴＧＣＣＧＴＧＣＡＴＣＧＴＴＧＣＡ＊ＣＣＡＧＧＣＡＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＡＧ−３’（配列番号２５）

【0106】

プライマー２２：５’−ＣＧＴＣＡＣＧＴＣＣＴＴＣＡＴＣＧＧＴＣＣ−３’（配列番号２６）

【0107】

プライマー２３：５’−ＴＣＧＣＡＧＴＣＣＣＧＴＣＧＡＧＧＡＡ＊ＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＣＴＡＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＣ−３’（配列番号２７）

【0108】

プライマー２４：５’−ＣＧＴＴＧＴＧＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＣ−３’（配列番号２８）

【0109】

プライマー２５：５’−ＣＴＣＡＴＡＧＣＴＡＧＧＣＧＣＣＴＧ＊ＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＡＣＧＴＧＧＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧ−３’（配列番号２９）

【0110】

プライマー２６：５’−ＧＧＡＡＡＣＧＣＡＧＧＣＣＡＣＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号３０）

【0111】

プライマー２７：５’−ＧＣＴＴＣＧＣＧＴＣＴＣＡＧＧＣＣＴＧＴ＊ＣＣＡＧＧＧＧＧＣＡＴＴＡＣＡＧＴＴＴＴＧＣＧＴＣＡＴＧＡＣ−３’（配列番号３１）

【0112】

プライマー２８：５’−ＣＡＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＣＴＴＧＣＡＣＣＧ−３’（配列番号３２）

【0113】

プライマー２９：５’−ＣＴＧＴＴＡＧＣＴＣＴＧＣＧＡＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＧＧＡＧＣＧＡＣＡＣＴＴＧＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＣ−３’（配列番号３３）

【0114】

プライマー３０：５’−ＴＧＡＴＧＡＡＡＴＧＡＡＧＣＣＡＣＣＣＧＴＧＣ−３’（配列番号３４）

【0115】

ＳＣＯ１：ＴＣＧＧＡＧＣＣＡＧＣＧＣＧＧＣＧＴＡＡＡＣ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＡ［ＢＨＱ１］（配列番号３５）

【0116】

ＳＣＯ２：ＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＧＡＧＡＣＧＡＣ［Ｔ（ＨＥＸ）］ＣＡＴＣＧＣＣＡＣＧＡＧＣＣＧＧＴＴＡＡ［ＢＨＱ１］（配列番号３６）

【0117】

ＳＣＯ３：ＡＴＴＴＡＴＴＣＴＴＡＣＴＣＧＡＴＧＴＴＡＡＡ［Ｔ（ＨＥＸ）］ＡＣＴＣＡＣＧＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＧＣＡ［ＢＨＱ１］（配列番号３７）

【0118】

ＳＣＯ４：ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＴＡＴＴＡＴＡＡＡ［Ｔ（ＣａｌＲｅｄ６１０）］ＧＣＴＡＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＡＣＡＡＧ［ＢＨＱ２］（配列番号３８）

【0119】

ＳＣＯ５：ＡＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＣＴＡＣＡＡＴＣＴＡＣＴ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ６７０）］ＴＧＣＣＧＣＧＴＧＡＴＴＣＧＡＴＣＣＣＡ［ＢＨＱ２］（配列番号３９）

【0120】

ＳＣＯ６：ＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＡＴＡ［Ｔ（ＣａｌＲｅｄ６１０）］ＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＧＧＧＣＣＧＣＴＧ［ＢＨＱ２］（配列番号４０）

【0121】

ＳＣＯ７：ＡＡＴＣＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＡＧＡＴＣＧＴＴＧＧＣＡＣＴＣＴＧＣＧＡ［ＢＨＱ１］（配列番号４１）

【0122】

ＳＣＯ８：ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＴＡＴＡ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＧＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＣＴＣＣＡＴＡＴＡ［ＢＨＱ１］（配列番号４２）

【0123】

ＳＣＯ９：ＴＣＧＧＡＧＣＣＡＧＣＧＣＧＧＣＧＴＡＡＣＧ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ６７０）］ＡＣＧＴＧＣＣＧＴＧＣＡＴＣＧＴＴＧＣＡ［ＢＨＱ２］（配列番号４３）

【0124】

ＳＣＯ１０：ＡＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＣＴＡＣＡＡＴＣＴＡＣ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ７０５）］ＴＴＣＧＣＡＧＴＣＣＣＧＴＣＧＡＧＧＡＡ［ＢＨＱ２］（配列番号４４）

【0125】

ＳＣＯ１１：ＴＣＧＧＡＧＣＣＡＧＣＧＣＧＧＣＧＴＡＡ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ７０５）］ＣＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＡＧＧＣＧＣＣＴＧ［ＢＨＱ２］（配列番号４５）

【0126】

ＳＣＯ１２：ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＴＡＴＡＧ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ７０５）］ＣＴＴＣＧＣＧＴＣＴＣＡＧＧＣＣＴＧＴ［ＢＨＱ２］（配列番号４６）

【0127】

ＳＣＯ１３：ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＴＡＴＡ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ６７０）］ＴＣＴＧＴＴＡＧＣＴＣＴＧＣＧＡＧＣＴ［ＢＨＱ２］（配列番号４７）

【0128】

増幅物３：ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ５２５５７．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１５７−２２７

【0129】

ＣＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＡ＊ＣＣＡＧＧＡＣＴＴＧＧＴＧＴＧＡＣＧＣＴＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＧＴＡＴＧＧＧＴＴＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＣＴＴＴＧＴＴＴＴＣＧＡＣＣＧＴＧＴＴＴＴＧＡＡＡＡＣ（配列番号４８）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＣＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＡは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0130】

増幅物４：ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ５２３６４．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：３７５−４５９

【0131】

ＣＧＣＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣＣＣＧＣＧＣＣＣＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡ＊ＣＣＡＧＧＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＣＧＡＴＡＴＡＡＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣＣＧＧＴＣＡＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＧＣ（配列番号４９）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＣＧＣＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣＣＣＧＣＧＣＣＣＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0132】

増幅物５：ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＪ２４３６９２．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：８３５−９４４

【0133】

ＡＣＴＣＡＣＧＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＧＣＡ＊ＣＣＡＧＧＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＡＣＧＴＡＴＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＧＧＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＡＣＡＧＴＣＣＡＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＴＴＡＣＡＡＧＡＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＡ（配列番号５０）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＡＣＴＣＡＣＧＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＧＣＡは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0134】

増幅物６：ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ０９２５１．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：３４６２−３６８７

【0135】

ＧＣＴＡＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＡＣＡＡＧ＊ＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＴＧＧＴＧＣＴＴＡＴＡＴＴＧＧＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＣＡＴＧＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＡＡＧＴＣＴＧＣＧＡＧＧＡＴＴＧＴＴＧＧＴＧＡＴＧＴＡＡＴＧＡＧＴＡＡＡＴＴＣＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＧＴＧＡＴＡＴＧＧＣＡＡＴＡＴＡＴＧＡＣＡＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＡＣＴＴＴＴＣＡＴＴＡＡＧＡＴＡＣＣＴＴＴＴＡＡＴＴＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴＡＡＴＴＴＴＧＧＴＴＣＴＡＴＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＡＣＧＴＴＡＴＡＣＡＧ（配列番号５１）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＧＣＴＡＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＡＣＡＡＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0136】

増幅物７：ＧｅｎＢａｎｋ：ＸＭ＿００１５８２９９３．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：７０５−７６８

【0137】

ＴＧＣＣＧＣＧＴＧＡＴＴＣＧＡＴＣＣＣＡ＊ＣＣＡＧＧＴＡＴＧＴＣＣＧＧＣＡＣＡＡＣＡＴＧＣＧＣＴＴＡＴＧＴＣＣＧＧＣＡＣＡＡＣＡＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＴＣＡＡＣＴＣＣＧＡＣＣＴＴＣＧＴＡＡＧＣＴＣ（配列番号５２）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＴＧＣＣＧＣＧＴＧＡＴＴＣＧＡＴＣＣＣＡは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0138】

増幅物８：ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ０８５７００．２／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：４６７３−４８７３

【0139】

ＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＧＧＧＣＣＧＣＴＧ＊ＣＣＡＧＧＡＡＧＴＡＧＣＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＣＧＣＡＴＡＣＴＧＴＧＴＡＴＴＴＣＡＣＴＡＡＴＴＴＣＴＡＴＣＧＴＴＣＡＴＣＡＡＡＡＣＣＡＣＴＡＴＴＴＴＴＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＣＣＣＡＡＴＴＡＡＴＣＣＣＴＧＴＴＴＴＣＡＡＡＣＴＡＴＴＡＧＴＡＴＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＴＧＴＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＡＧＣＡＡＡＴＧＣＡＣＧＴＴＧＣＡＴＴＡ（配列番号５３）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＧＧＧＣＣＧＣＴＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0140】

増幅物９：ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ０８５７３３．２／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：４６７７−４８８６

【0141】

ＣＡＧＡＴＣＧＴＴＧＧＣＡＣＴＣＴＧＣＧＡ＊ＣＣＡＧＧＴＴＡＡＡＧＴＡＧＣＡＴＡＴＧＡＴＣＡＡＧＣＴＣＡＴＴＣＡＡＡＡＡＴＧＧＣＡＣＡＴＡＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＴＡＣＧＡＡＴＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＣＡＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＡＡＴＣＡＡＣＣＣＣＴＧＴＴＴＴＣＡＡＡＣＡＡＴＴＡＧＴＡＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＧＡＡＡＴＴＴＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＡＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＧＴＴＧＴＡＴＣＡＴＴＡＣＡＡ（配列番号５４）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＣＡＧＡＴＣＧＴＴＧＧＣＡＣＴＣＴＧＣＧＡは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0142】

増幅物１０：ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ９０８１２．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１７３６−１８１１

【0143】

ＧＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＣＴＣＣＡＴＡＴＡ＊ＣＣＡＧＧＣＣＡＡＡＴＣＴＧＧＡＴＣＴＴＣＣＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＣ（配列番号５５）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＧＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＣＴＣＣＡＴＡＴＡは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0144】

増幅物１１：ＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ０８１６７．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：２７３−４３４

【0145】

ＡＣＧＴＧＣＣＧＴＧＣＡＴＣＧＴＴＧＣＡ＊ＣＣＡＧＧＣＡＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＧＣＴＴＧＡＴＣＧＴＴＴＴＧＴＧＡＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＴＧＡＴＧＡＴＴＴＡＴＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡＧＡＧＴＴＡＡＧＣＧＡＴＡＧＧＣＴＴＴＴＡＣＴＧＧＴＧＴＡＴＣＡＣＴＧＴＡＡＧＧＧＣＧＴＡＴＴＧＧＴＴＧＧＡＴＧＣＣＴＴＧＧＴＡＧＡＣＡＧＧＡＣＣＧＡＴＧＡＡＧＧＡＣＧＴＧＡＣＧ（配列番号５６）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＡＣＧＴＧＣＣＧＴＧＣＡＴＣＧＴＴＧＣＡは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0146】

増幅物１２：ＤＱ８８９５０２．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１２３８６０−１２４００７

【0147】

ＴＣＧＣＡＧＴＣＣＣＧＴＣＧＡＧＧＡＡ＊ＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＣＴＡＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＣＡＧＣＡＣＡＣＧＡＣＴＴＧＧＣＧＴＴＣＴＧＴＧＴＧＴＣＧＣＧＡＴＧＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＡＧＴＣＴＧＧＣＡＴＣＴＧＧＧＧＣＴＴＴＴＧＧＧＡＡＧＣＣＴＣＧＴＧＧＧＧＧＣＴＧＴＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＣＡＴＣＧＧＧＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＣＡＡＣＡＣＡＡＣＧ（配列番号５７）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＴＣＧＣＡＧＴＣＣＣＧＴＣＧＡＧＧＡＡは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0148】

増幅物１３：ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＵ０１８１００．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：５６１−７４６

【0149】

ＣＴＣＡＴＡＧＣＴＡＧＧＣＧＣＣＴＧ＊ＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＡＣＧＴＧＧＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＧＧＴＡＧＡＧＧＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＡＣＣＧＣＣＣＣＣＣＣＣＡＣＡＧＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＣＧＧＡＧＧＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＣＧＴＣＣＣＣＣＣＧＧＴＣＣＣＣＧＣＧＧＧＣＣＧＣＣＣＧＴＧＧＣＧＣＴＣＧＧＴＧＣＣＣＣＣＧＧＴＡＴＧＧＴＡＴＴＣＣＧＣＣＣＣＣＡＡＣＣＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＧＧＣＣＴＧＣＧＴＴＴＣＣ（配列番号５８）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＣＴＣＡＴＡＧＣＴＡＧＧＣＧＣＣＴＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0150】

増幅物１４：ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ５７７５７．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：９１０−１０６７

【0151】

ＧＣＴＴＣＧＣＧＴＣＴＣＡＧＧＣＣＴＧＴ＊ＣＣＡＧＧＧＧＧＣＡＴＴＡＣＡＧＴＴＴＴＧＣＧＴＣＡＴＧＡＣＧＧＣＴＴＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＧＡＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＡＣＣＣＴＡＧＣＡＡＡＡＣＧＡＧＴＴＧＣＧＧＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＴＣＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＴＡＴＣＴＣＣＴＣＡＧＡＴＡＡＡＧＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＴＴＧＴＧＴＧＴＧＡＴＡＣＧＧＴＧＣＡＡＧＴＧＣＴＣＡＧＡＣＴＴＧ（配列番号５９）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＧＣＴＴＣＧＣＧＴＣＴＣＡＧＧＣＣＴＧＴは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0152】

増幅物１５：ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００１０３５５５１．２／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：２１４−３６９

【0153】

ＣＴＧＴＴＡＧＣＴＣＴＧＣＧＡＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＧＧＡＧＣＧＡＣＡＣＴＴＧＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＣＡＡＧＴＴＣＧＧＴＡＡＣＡＡＡＴＡＣＴＡＣＣＡＧＡＡＧＣＴＡＧＧＣＧＡＴＡＣＴＣＡＡＴＡＣＧＧＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＴＡＧＡＧＴＡＴＧＣＴＴＣＡＡＡＧＧＡＴＣＧＴＴＡＣＡＡＣＧＣＡＴＣＴＣＡＡＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＣＧＧＧＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＴＣＡ（配列番号６０）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＣＴＧＴＴＡＧＣＴＣＴＧＣＧＡＧＣＴは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0154】

＊で表示された部分は、ＰｓｐＧＩ制限酵素が切断する部位をブロッキングするために認識配列中のＣにｍｏｄｉｆｉｅｄｄＣＴＰが挿入されたという標識である。ＳＣＯにおける括弧は、蛍光相殺分子と蛍光レポーターが位置した塩基配列の位置を意味する。増幅物から生成されるＣＣＴＦの配列は、次の通りである。

【0155】

ＣＣＴＦ３：５’−ＣＣＴＧＧＴＧＴＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧ−３’（配列番号６１）

【0156】

ＣＣＴＦ４：５’−ＣＣＴＧＧＴＴＡＡＣＣＧＧＣＴＣＧＴＧＧＣＧＡＴＧ−３’（配列番号６２）

【0157】

ＣＣＴＦ５：５’−ＣＣＴＧＧＴＧＣＧＣＴＣＣＡＴＴＡＧＣＧＴＧＡＧＴ−３’（配列番号６３）

【0158】

ＣＣＴＦ６：５’−ＣＣＴＧＧＣＴＴＧＴＡＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＴＡＧＣ−３’（配列番号６４）

【0159】

ＣＣＴＦ７：５’−ＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＴＣＧＡＡＴＣＡＣＧＣＧＧＣＡ−３’（配列番号６５）

【0160】

ＣＣＴＦ８：５’−ＣＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＴＡＴＧＡＧＡ−３’（配列番号６６）

【0161】

ＣＣＴＦ９：５’−ＣＣＴＧＧＴＣＧＣＡＧＡＧＴＧＣＣＡＡＣＧＡＴＣＴＧ−３’（配列番号６７）

【0162】

ＣＣＴＦ１０：５’−ＣＣＴＧＧＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＣ−３’（配列番号６８）

【0163】

ＣＣＴＦ１１：５’−ＣＣＴＧＧＴＧＣＡＡＣＧＡＴＧＣＡＣＧＧＣＡＣＧＴ−３’（配列番号６９）

【0164】

ＣＣＴＦ１２：５’−ＣＣＴＧＧＴＴＣＣＴＣＧＡＣＧＧＧＡＣＴＧＣＧＡ−３’（配列番号７０）

【0165】

ＣＣＴＦ１３：５’−ＣＣＴＧＧＣＡＧＧＣＧＣＣＴＡＧＣＴＡＴＧＡＧ−３’（配列番号７１）

【0166】

ＣＣＴＦ１４：５’−ＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＣＴＧＡＧＡＣＧＣＧＡＡＧＣ−３’（配列番号７２）

【0167】

ＣＣＴＦ１５：５’−ＣＣＴＧＧＡＧＣＴＣＧＣＡＧＡＧＣＴＡＡＣＡＧ−３’（配列番号７３）

【0168】

２）ＰＣＲ増幅及びＳＣＯの固有の解離温度の測定

【0169】

それぞれプライマー５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０とＳＣＯ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３にそれぞれ０．１５μＭ、ＰｓｐＧＩ（ＮＥＢ、ＵＳＡ）５Ｕ、ＰＣＲバッファ（ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ、１ｘ）、ＭｇＣｌ２２．５ｍＭ、ｄＮＴＰ２００μＭ、ｈ−ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）１．６Ｕ、及びＣＴ、ＮＧ、ＭＨ、ＭＧ、ＴＶ、ＵＵ、ＵＰ、ＣＡ、ＧＶ、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＴＰ及びＩＣのｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ１００ｐｇ／ｒｘｎのｔｅｍｐｌａｔｅＤＮＡを添加して総反応液２０μlでＣＦＸ９６リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いて、次のＰＣＲ反応を行った。

【0170】

９５℃ １５分、

【0171】

９５℃ ３０秒、６３℃ １分（５０サイクル）、

【0172】

変性温度９５℃で１５分間１回行い、変性温度９５℃で３０秒、アニーリング温度６３℃で１分のサイクルを５０回繰り返して行った。反応後、同一機器内で反応混合物を５０℃に冷却し、５０℃で３０秒間維持した後、５０℃から９５℃にゆっくり加熱することによって、固有解離温度分析曲線を得た。データの分析はＢｉｏ−ＲａｄＣＦＸＭａｎａｇｅｒ１．６を用いた。

【0173】

図３の（ａ）は、ＣＴ、ＮＧ、ＭＨ、ＭＧ、ＴＶ、ＵＵ、ＵＰ、ＣＡ、ＧＶ、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＴＰ、ＩＣの原因菌別の多重固有解離温度測定結果であって、それぞれのＳＣＯが有する固有の解離温度（ＣＴ：ＦＡＭ８０℃、ＮＧ：ＨＥＸ７６．５℃、ＭＨ：ＨＥＸ６８℃、ＭＧ：ＣａｌＲｅｄ６１０６７．５℃、ＴＶ：Ｑｕａｓａｒ６７０７１．５℃、ＵＵ：ＣａｌＲｅｄ６１０７７℃、ＵＰ：ＦＡＭ７７℃、ＣＡ：ＦＡＭ６５℃、ＧＶ：Ｑｕａｓａｒ６７０７８．５℃、ＨＳＶ１：Ｑｕａｓａｒ７０５７３．５℃、ＨＳＶ２：Ｑｕａｓａｒ７０５７９℃、ＴＰ：Ｑｕａｓａｒ７０５６６℃、ＩＣ：Ｑｕａｓａｒ６７０６３．５℃）でピークが観察され（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）（ｅ）（ｆ）、同じ組成において標的配列が投入されなかった場合には、ＣＣＴＦを可視化するＳＣＯのピークが観察されなかった（ｇ）。

【0174】

したがって、ＣＣＴＦの標識化技法を用いてＰＣＲを行うと同時に、ＳＣＯの蛍光をリアルタイム重合酵素連鎖反応機器を活用して分析することによって、既存のＰＣＲ方式よりも迅速かつ簡単に標的核酸配列の検出が可能であることを証明した。

【0175】

２．胃腸管疾患の原因体の検出のための多重ターゲットＰＣＲでのＣＣＴＦの形成及びＣＣＴＦの固有の解離温度のピーク分析

【0176】

胃腸管疾患の原因体であるロタウイルスＡ（ＲｏｔａｖｉｒｕｓＡ、ＲＶＡ）、アストロウイルス（Ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ、ＡｓｔＶ）、アデノウイルスＦ４０（ＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＦ４０、ＡｄＶ４０）、アデノウイルスＦ４１（ＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＦ４１、ＡｄＶ４１）、ノロウイルスＧＩ（ＮｏｒｏｖｉｒｕｓＧＩ、ＮｏＶＧＩ）、ノロウイルスＧＩＩ（ＮｏｒｏｖｉｒｕｓＧＩＩ、ＮｏＶＧＩＩ）及び外部対照物質（Ｅｘｔｅｒｎａｌｃｏｎｔｒｏｌ、ＥＣ）のＤＮＡのリアルタイム重合酵素連鎖反応機器を用いたＣＣＴＦ分析を行った。

【0177】

１）標的配列鋳型ＤＮＡの配列特異的に作製されたプライマー

【0178】

本実施例で使用した順方向プライマーはＣＴＰＯであって、上述した実施例１と同じ原理で作製された。ＣＴＰＯの５’末端は、１９〜２０ｍｅｒのヌクレオチド配列で構成されており、ＣＣＴＦを形成できるように標的配列のＤＮＡと非相補的な配列で構成される。その後に制限酵素認識配列が位置し、その後から３’末端までは、それぞれの標的部位と相補的な配列で構成されているので、プライマーとしての役割を果たす。逆方向プライマーは、それぞれの増幅しようとする標的部位と相補的な配列で構成されている。

【0179】

【0180】

プライマー情報、及び増幅されて生成される標的配列情報は、次の通りである。

【0181】

プライマー３１：５’−ＧＣＡＧＧＡＧＣＣＴＣＴＣＡＴＣＴＣＧ＊ＣＣＡＧＧＣＴＣＡＴＴＴＡＴＡＧＡＣＡＲＣＴＴＣＴＣＡＣＴＡＡＴＴＣ−３’（配列番号７４）

【0182】

プライマー３２：５’−ＡＧＴＴＴＴＴＴＣＴＧＡＴＣＣＡＡＴＹＴＧＹＴＣＴＡＴＴＴＣ−３’（配列番号７５）

【0183】

プライマー３３：５’−ＴＣＡＧＡＣＧＧＴＴＣＧＡＧＧＣＴＣＣ＊ＣＣＡＧＧＡＲＧＡＴＹＡＡＧＣＧＴＧＧＡＧＴＡＴＡＹＡＴＧＧ−３’（配列番号７６）

【0184】

プライマー３４：５’−ＴＴＴＧＣＧＴＧＣＹＴＣＴＴＣＡＣＡＣＧＣ−３’（配列番号７７）

【0185】

プライマー３５：５’−ＡＡＣＧＣＧＡＡＴＣＧＡＣＣＧＧＡＴ＊ＣＣＡＧＧＣＧＣＧＡＴＧＴＧＴＴＴＧＣＣＧＡＴＡＡＡＡＣ−３’（配列番号７８）

【0186】

プライマー３７：５’−ＣＡＴＴＧＣＧＴＣＴＧＣＣＣＣＡＣＴＴＧ−３’（配列番号７９）

【0187】

プライマー３８：５’−ＡＡＣＧＣＧＡＡＴＣＧＡＣＣＧＧＡＴ＊ＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＴＡＴＧＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣ−３’（配列番号８０）

【0188】

プライマー３９：５’−ＡＴＧＴＴＡＡＣＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＣＡＣ−３（配列番号８１）

【0189】

プライマー４０：５’−ＴＡＧＡＴＣＧＧＡＣＴＧＣＧＡＡＴＣＧ＊ＣＣＡＧＧＧＡＧＡＴＣＧＣＲＡＴＣＴＹＣＴＧＣＣＣＧＡ−３（配列番号８２）

【0190】

プライマー４１：５’−ＲＧＣＧＴＣＣＴＴＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＡＴＣ−３（配列番号８３）

【0191】

プライマー４２：５’−ＡＴＣＴＡＣＡＧＣＧＴＣＧＣＡＴＣＡＣＧ＊ＣＣＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＲＴＴＴＴＧＴＧ−３（配列番号８４）

【0192】

プライマー４３：５’−ＧＣＧＴＣＡＹＴＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＹＴＣＡ−３（配列番号８５）

【0193】

プライマー４４：５’−ＣＡＴＡＧＧＴＣＧＡＧＧＴＣＣＴＣＡＣ＊ＣＣＡＧＧＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＡＴＡＧＡＣＧ−３（配列番号８６）

【0194】

プライマー４５：５’−ＡＡＧＣＧＧＴＧＡＴＣＣＧＣＡＣＡＧＴＧ−３（配列番号８７）

【0195】

ＳＣＯ１４：ＴＣＧＧＣＣＧＡＴＣＧＴＣＣＡＴＡＧＡＧＴＣＡＡＧＣ［Ｔ（ＨＥＸ）］ＣＧＣＡＧＧＡＧＣＣＴＣＴＣＡＴＣＴＣＧ［ＢＨＱ１］（配列番号８８）

【0196】

ＳＣＯ１５：ＴＣＡＣＧＡＴＧＡＧＣＧＡＧＴＴＧＡＧＣＴＡＣＧ［Ｔ（Ｃａｌｒｅｄ６１０］ＡＴＣＡＧＡＣＧＧＴＴＣＧＡＧＧＣＴＣＣ［ＢＨＱ２］（配列番号８９）

【0197】

ＳＣＯ１６：ＴＧＴＴＣＡＡＴＡＴＡＴＡＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＧ［Ｔ（Ｃａｌｒｅｄ６１０）］ＡＡＣＧＣＧＡＡＴＣＧＡＣＣＧＧＡＴ［ＢＨＱ２］（配列番号９０）

【0198】

ＳＣＯ１７：ＴＧＴＴＣＡＡＴＡＴＡＴＡＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＧ［Ｔ（Ｃａｌｒｅｄ６１０）］ＡＡＣＧＣＧＡＡＴＣＧＡＣＣＧＧＡＴ［ＢＨＱ２］（配列番号９１）

【0199】

ＳＣＯ１８：ＡＣＡＴＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＧＴＡＴＴＴＴＡ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＴＡＧＡＴＣＧＧＡＣＴＧＣＧＡＡＴＣＧ［ＢＨＱ１］（配列番号９２）

【0200】

ＳＣＯ１９：ＡＧＣＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴＡＣＴＧＣＣＡＴＣＣＡ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＡＴＣＴＡＣＡＧＣＧＴＣＧＣＡＴＣＡＣＧ［ＢＨＱ１］（配列番号９３）

【0201】

ＳＣＯ２０：ＴＡＧＴＴＡＴＡＡＴＧＡＡＴＡＡＣＴＡＴＴＡＴ［Ｔ（ＨＥＸ）］ＣＡＴＡＧＧＴＣＧＡＧＧＴＣＣＴＣＡＣ［ＢＨＱ１］（配列番号９４）

【0202】

増幅物１６：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＴ６９４９４２．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１９−９９

【0203】

ＧＣＡＧＧＡＧＣＣＴＣＴＣＡＴＣＴＣＧ＊ＣＣＡＧＧＣＴＣＡＴＴＴＡＴＡＧＡＣＡＲＣＴＴＣＴＣＡＣＴＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＣＡＧＴＡＧＡＴＴＴＡＣＡＴＧＡＴＧＡＡＡＴＡＧＡＲＣＡＲＡＴＴＧＧＡＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＣＴ（配列番号９５）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＧＣＡＧＧＡＧＣＣＴＣＴＣＡＴＣＴＣＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0204】

増幅物１７：ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０００２８７．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：２２３２−２３２１

【0205】

ＴＣＡＧＡＣＧＧＴＴＣＧＡＧＧＣＴＣＣ＊ＣＣＡＧＧＡＲＧＡＴＹＡＡＧＣＧＴＧＧＡＧＴＡＴＡＹＡＴＧＧＡＣＣＴＧＣＴＴＧＴＣＴＣＧＧＧＧＧＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＣＡＡＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＴＧＣＧＴＧＴＧＡＡＧＡＲＧＣＡＣＧＣＡＡＡ（配列番号９６）
なお、前記プライマー配列中の先のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＴＣＡＧＡＣＧＧＴＴＣＧＡＧＧＣＴＣＣは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0206】

増幅物１８：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＭ２７４９２３．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１２１−１７９

【0207】

ＡＡＣＧＣＧＡＡＴＣＧＡＣＣＧＧＡＴ＊ＣＣＡＧＧＣＧＣＧＡＴＧＴＧＴＴＴＧＣＣＧＡＴＡＡＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣＧＧＡＧＣＣＣＣＡＡＧＴＧＧＧＧＣＡＧＡＣＧＣＡＡＴＧ（配列番号９７）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＡＡＣＧＣＧＡＡＴＣＧＡＣＣＧＧＡＴは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0208】

増幅物１９：ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ３３０１２２．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１４０７−１６９１

【0209】

ＡＡＣＧＣＧＡＡＴＣＧＡＣＣＧＧＡＴ＊ＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＴＡＴＧＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＧＧＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＣＧＡＴＡＣＣＴＡＣＧＴＡＡＡＣＡＴＣＧＧＧＧＣＡＣＧＧＴＧＧＴＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＧＴＴＡＡＣＣＣＣＴＴＣＡＡＴＣＡＣＣＡＣＣＧＴＡＡＣＧＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＴＡＴＣＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＣＴＴＧＧＧＣＡＡＣＧＧＧＣＧＴＴＡＣＧＴＡＣＣＣＴＴＣＣＡＣＡＴＴＣＡＡＧＴＣＣＣＣＣＡＧＡＡＧＴＴＴＴＴＴＧＣＣＡＴＴＡＡＡＡＡＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＴＡＣＣＧＧＧＴＴＣＣＴＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＧＴＧＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＡＡＧＧＡＣＧＴＴＡＡＣＡＴ（配列番号９８）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＡＡＣＧＣＧＡＡＴＣＧＡＣＣＧＧＡＴは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0210】

増幅物２０：ＧｅｎＢａｎｋ：ＬＮ８５４５６４．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：５３２５−５３７８

【0211】

ＴＡＧＡＴＣＧＧＡＣＴＧＣＧＡＡＴＣＧ＊ＣＣＡＧＧＧＡＧＡＴＣＧＣＲＡＴＣＴＹＣＴＧＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＧＴＣＴＡＡＧＧＡＣＧＣＹ（配列番号９９）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＴＡＧＡＴＣＧＧＡＣＴＧＣＧＡＡＴＣＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0212】

増幅物２１：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＴ２０２７９８．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：５０６０−５１０７

【0213】

ＡＴＣＴＡＣＡＧＣＧＴＣＧＣＡＴＣＡＣＧ＊ＣＣＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＲＴＴＴＴＧＴＧＡＡＴＧＡＲＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＲＴＧＡＣＧＣ（配列番号１００）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＡＴＣＴＡＣＡＧＣＧＴＣＧＣＡＴＣＡＣＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0214】

増幅物２２：ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＦ２０４９４０．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１７０７−１８７８

【0215】

ＣＡＴＡＧＧＴＣＧＡＧＧＴＣＣＴＣＡＣ＊ＣＣＡＧＧＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＡＴＡＧＡＣＧＣＣＧＧＣＣＡＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＧＡＡＧＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＣＴＴＴＡＴＧＴＡＴＴＧＡＴＣＴＴＣＣＴＣＧＣＧＡＴＣＴＴＴＣＴＣＴＣＧＡＡＡＴＴＴＡＣＣＡＡＴＣＡＡＴＴＧＣＴＴＣＴＧＴＣＧＣＴＡＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＴＧＡＴＣＣＧＣＡＣＡＧＴＧ（配列番号１０１）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＣＡＴＡＧＧＴＣＧＡＧＧＴＣＣＴＣＡＣは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0216】

【0217】

ＣＣＴＦ１６：５’−ＣＣＴＧＧＴＧＴＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧ−３’（配列番号１０２）

【0218】

ＣＣＴＦ１７：５’−ＣＣＴＧＧＴＴＡＡＣＣＧＧＣＴＣＧＴＧＧＣＧＡＴＧ−３’（配列番号１０３）

【0219】

ＣＣＴＦ１８：５’−ＣＣＴＧＧＴＧＣＧＣＴＣＣＡＴＴＡＧＣＧＴＧＡＧＴ−３’（配列番号１０４）

【0220】

ＣＣＴＦ１９：５’−ＣＣＴＧＧＣＴＴＧＴＡＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＴＡＧＣ−３’（配列番号１０５）

【0221】

ＣＣＴＦ２０：５’−ＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＴＣＧＡＡＴＣＡＣＧＣＧＧＣＡ−３’（配列番号１０６）

【0222】

ＣＣＴＦ２１：５’−ＣＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＴＡＴＧＡＧＡ−３’（配列番号１０７）

【0223】

ＣＣＴＦ２２：５’−ＣＣＴＧＧＴＣＧＣＡＧＡＧＴＧＣＣＡＡＣＧＡＴＣＴＧ−３’（配列番号１０８）

【0224】

ＣＣＴＦ２３：５’−ＣＣＴＧＧＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＣ−３’（配列番号１０９）

【0225】

ＣＣＴＦ２４：５’−ＣＣＴＧＧＴＧＣＡＡＣＧＡＴＧＣＡＣＧＧＣＡＣＧＴ−３’（配列番号１１０）

【0226】

ＣＣＴＦ２５：５’−ＣＣＴＧＧＴＴＣＣＴＣＧＡＣＧＧＧＡＣＴＧＣＧＡ−３’（配列番号１１１）

【0227】

ＣＣＴＦ２６：５’−ＣＣＴＧＧＣＡＧＧＣＧＣＣＴＡＧＣＴＡＴＧＡＧ−３’（配列番号１１２）

【0228】

ＣＣＴＦ２７：５’−ＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＣＴＧＡＧＡＣＧＣＧＡＡＧＣ−３’（配列番号１１３）

【0229】

ＣＣＴＦ２８：５’−ＣＣＴＧＧＡＧＣＴＣＧＣＡＧＡＧＣＴＡＡＣＡＧ−３’（配列番号１１４）

【0230】

２）ＰＣＲ増幅及びＳＣＯの固有の解離温度の測定
それぞれプライマー３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５とＳＣＯ１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０にそれぞれ０．１５μＭ、ＰｓｐＧＩ（ＮＥＢ、ＵＳＡ）１Ｕ、ＰＣＲバッファ（ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ、１ｘ）、ＭｇＣｌ２２．５ｍＭ、ｄＮＴＰ２００μＭ、ＤＴＴ０．１ｍＭ、ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ１Ｕ、ＳｕｐｅｒｉｏｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）１Ｕ、及びＲＶＡ、ＡｓｔＶ、ＡｄＶ４０、ＡｄＶ４１、ＮｏＶＧＩ、ＮｏＶＧＩＩ及びＥＣ（ＭＳ２ｐｈａｇｅ）のｇｅｎｏｍｉｃＲＮＡ１×１０＾４ｐｇ／ｒｘｎの核酸を添加して総反応液２０μlでＣＦＸ９６リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いて、次のＰＣＲ反応を行った。

【0231】

５５℃ ２０分、９５℃ １０分
９５℃ ３０秒、６３℃ １分（５０サイクル）、
逆転写反応温度５５℃で２０分間１回、及び変性温度９５℃で１０分間１回行い、変性温度９５℃で３０秒、アニーリング温度６３℃で１分のサイクルを５０回繰り返して行った。反応後、同一機器内で反応混合物を５０℃に冷却し、５０℃で３０秒間維持した後、５０℃から９５℃にゆっくり加熱することによって、固有解離温度分析曲線を得た。データの分析はＢｉｏ−ＲａｄＣＦＸＭａｎａｇｅｒ１．６を用いた。

【0232】

図４は、ＲＶＡ、ＡｓｔＶ、ＡｄＶ４０、ＡｄＶ４１、ＮｏＶＧＩ、ＮｏＶＧＩＩの原因菌別の多重固有解離温度測定結果であって、それぞれのＳＣＯが有する固有の解離温度（ＲＶＡ：ＨＥＸ７８℃、ＡｓｔＶ：ＣａｌＲｅｄ６１０７８℃、ＡｄＶ４０：ＣａｌＲｅｄ６１０６７℃、ＡｄＶ４１：ＣａｌＲｅｄ６１０６７℃、ＮｏＶＧＩ：ＦＡＭ６８℃、ＮｏＶＧＩＩ：ＦＡＭ８４℃、ＥＣ：ＨＥＸ６９℃）でピークが観察され（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）、同じ組成において標的配列が投入されなかった場合には、ＣＣＴＦを可視化するＳＣＯのピークが観察されないことを確認した（ｅ）。

【0233】

【0234】

３．ヒト乳頭腫ウイルスの検出のための多重ターゲットＰＣＲでのＣＣＴＦの形成及びＣＣＴＦの固有の解離温度のピーク分析
ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ：ＨｕｍａｎＰａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）の亜型である１６型、１８型、３３型、３５型、５１型、５３型、５９型、６８ａ型、８２型及び内部対照物質（ＩｎｔｅｒｎａｌＣｏｎｔｒｏｌ、ＩＣ）のＤＮＡを用いて、リアルタイム重合酵素連鎖反応機器を用いたＣＣＴＦ分析を行った。

【0235】

【0236】

【0237】

プライマー情報、及び増幅されて生成される標的配列情報は、次の通りである。

【0238】

プライマー４６：５’−ＣＴＣＴＧＡＴＡＧＣＧＡＣＴＧＣＴＣＧＣＡ＊ＣＣＡＧＧＡＴＡＡＴＡＴＡＡＧＧＧＧＴＣＧＧＴＧＧＡＣＣＧＧ−３’（配列番号１１５）

【0239】

プライマー４７：５’−ＣＴＣＣＡＴＧＣＡＴＧＡＴＴＡＣＡＧＣＴＧＧＧＴＴ−３’（配列番号１１６）

【0240】

プライマー４８：５’−ＡＴＣＧＧＴＣＴＣＣＴＧＡＡＡＧＣＴＧＣＧ＊ＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＧＴＡＣＡＧＡＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣ−３’（配列番号１１７）

【0241】

プライマー４９：５’−ＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＴＡＡＴ−３’（配列番号１１８）

【0242】

プライマー５０：５’−ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＣＡＡＣＧＡＴＡＡＣＣＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号１１９）

【0243】

プライマー５１：５’−ＣＧＧＧＧＴＣＴＧＣＡＣＡＧＡＡＣＡＧＣＴＴＴ−３’（配列番号１２０）

【0244】

プライマー５２：５’−ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＡＡＣＧＡＣＣＴＴＡＣＡＡ−３’（配列番号１２１）

【0245】

プライマー５３：５’−ＣＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＣＣＡＣＣＧＡＴＧＴＴＡＴＧ−３’（配列番号１２２）

【0246】

プライマー５４：５’−ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＧＣＴＧＧＣＡＡＣＧＴＡＣＡＣＧＡＣＡＡＣＧ−３’（配列番号１２３）

【0247】

プライマー５５：５’−ＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＣＧＡＡＧＧＧＴＧＴＣ−３’（配列番号１２４）

【0248】

プライマー５６：５’−ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＡＴＧＣＡＣＣＧＡＡＡＣＣＴＣＣＡＡ−３’（配列番号１２５）

【0249】

プライマー５７：５’−ＴＧＣＡＧＴＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＣＧＴＧＴＡＧＴＡ−３’（配列番号１２６）

【0250】

プライマー５８：５’−ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＴＡＣＡＣＣＧＴＡＴＧＣＡＧＣＧＴＧ−３’（配列番号１２７）

【0251】

プライマー５９：５’−ＧＣＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＴＡＡ−３’（配列番号１２８）

【0252】

プライマー６０：５’−ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＡＣＡＡＡＣＴＣＧＡＣＧＴＣＧＴＣＴＣＧＧＡＡ−３’（配列番号１２９）

【0253】

プライマー６１：５’−ＣＡＧＧＴＣＡＣＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＣＣＧＴ−３’（配列番号１３０）

【0254】

プライマー６２：５’−ＡＴＣＡＧＧＡＣＧＣＡＧＣＣＧＧＴＴＣＴ＊ＣＣＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣＧＧＣＴＧＴＣＡＴＣ−３’（配列番号１３１）

【0255】

プライマー６３：５’−ＧＧＴＧＣＣＣＴＴＧＡＧＧＴＴＧＴＣＣＡＧＧＴＧ−３’（配列番号１３２）

【0256】

ＳＣＯ２１：ＧＡＧＡＣＧＴＴＴＡＡＧＴＣＣＧＣＧＡＣＣＧＣＴＣ［Ｔ（ＨＥＸ）］ＣＴＧＡＴＡＧＣＧＡＣＴＧＣＴＣＧＣＡ［ＢＨＱ１］（配列番号１３３）

【0257】

ＳＣＯ２２：ＣＡＧＧＣＧＡＣＧＴＣＣＡＴＡＴＧＧＴＧＣＧＣＴＡ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＧＧＴＣＴＣＣＴＧＡＡＡＧＣＴＧＣＧ［ＢＨＱ１］（配列番号１３４）

【0258】

ＳＣＯ２３：ＣＣＣＴＴＡＧＧＴＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣ［Ｔ（Ｑｕｓａｒ６７０）］ＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ［ＢＨＱ２］（配列番号１３５）

【0259】

ＳＣＯ２４：ＡＡＡＣＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＧＴＡＴＡ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＡＧＧＡＣＧＣＡＧＣＣＧＧＴＴＣＴ［ＢＨＱ１］（配列番号１３６）

【0260】

増幅物２３：ＧｅｎＢａｎｋ：ＬＣ１９３８２１．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：４８０−５７１

【0261】

ＣＴＣＴＧＡＴＡＧＣＧＡＣＴＧＣＴＣＧＣＡ＊ＣＣＡＧＧＡＴＡＡＴＡＴＡＡＧＧＧＧＴＣＧＧＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＴＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧ（配列番号１３７）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＣＴＣＴＧＡＴＡＧＣＧＡＣＴＧＣＴＣＧＣＡは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0262】

増幅物２４：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＣ４７０２０９．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：５３８−７４７

【0263】

ＡＴＣＧＧＴＣＴＣＣＴＧＡＡＡＧＣＴＧＣＧ＊ＣＣＡＧＧＣＡＣＧＡＣＡＧＧＡＡＣＧＡＣＴＣＣＡＡＣＧＡＣＧＣＡＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＴＡＴＡＡＴＡＴＴＡＡＧＴＡＴＧＣＡＴＧＧＡＣＣＴＡＡＧＧＣＡＡＣＡＴＴＧＣＡＡＧＡＣＡＴＴＧＴＡＴＴＧＣＡＴＴＴＡＧＡＧＣＣＣＣＡＡＡＡＴＧＡＡＡＴＴＣＣＧＧＴＴＧＡＣＣＴＴＣＴＡＴＧＴＣＡＣＧＡＧＣＡＡＴＴＡＡＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＧＡＴＧＡＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＴＡＡＴＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧ（配列番号１３８）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＡＴＣＧＧＴＣＴＣＣＴＧＡＡＡＧＣＴＧＣＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0264】

増幅物２５：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＵ２９８８９４．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：５３５−８６０

【0265】

ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＡＣＧＣＣＡＴＧＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧＡＡＴＡＴＧＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＡＴＡＴＣＣＴＧＡＡＣＣＡＡＣＴＧＡＣＣＴＡＴＡＣＴＧＣＴＡＴＧＡＧＣＡＡＴＴＡＡＧＴＧＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＡＧＧＣＴＴＧＧＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＣＡＡＣＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＡＴＴＡＣＴＡＣＡＴＴＧＴＡＡＣＣＴＧＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＴＧＴＡＡＣＡＣＣＡＣＡＧＴＴＣＧＴＴＴＡＴＧＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＴＧＡＣＣＴＡＣＧＡＡＣＣＡＴＡＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＴＴＡＴＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＡＡＴＡＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＴＡＣＣＴＧＴＧＣＡＣＡＡＣＡＡＴＡＡＡＣＡＴＣＡＴＣＴＡＣＡＡＴＧＧＣＣＧＡＴＣＣＴＧＡＡ（配列番号１３９）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0266】

増幅物２６：ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ７４１１７．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１１７−５０９

【0267】

ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＡＡＣＧＡＣＣＴＴＡＣＡＡＡＣＴＧＣＡＴＧＡＴＴＴＧＴＧＣＡＡＣＧＡＧＧＴＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣＡＴＣＣＡＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＴＴＧＡＡＴＴＧＴＧＴＡＴＡＣＴＧＣＡＡＡＣＡＡＧＡＡＴＴＡＣＡＧＣＧＧＡＧＴＧＡＧＧＴＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＧＣＡＴＧＣＴＡＴＧＡＴＴＴＧＴＧＴＡＴＡＧＴＡＴＡＴＡＧＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＴＡＴＧＣＡＴＧＡＡＡＴＧＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＡＴＴＣＡＡＡＡＡＴＡＡＧＴＧＡＡＴＡＴＡＧＡＴＧＧＴＡＴＡＧＡＴＡＴＡＧＴＧＴＧＴＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＧＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＴＧＣＡＡＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＴＧＴＣＡＴＴＴＡＴＴＡＡＴＴＡＧＧＴＧＴＡＴＴＡＣＡＴＧＴＣＡＡＡＡＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＣＣＡＧＴＴＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＣＧＡＴＴＣＣＡＴＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＧＡＣＧＧＴＧＧＡＣＡＧ（配列番号１４０）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0268】

増幅物２７：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＵ２９８９０５．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：５１２−８１２

【0269】

ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＧＣＴＧＧＣＡＡＣＧＴＡＣＡＣＧＡＣＡＡＣＧＴＡＡＣＧＡＡＡＣＣＣＡＡＧＴＧＴＡＡＴＡＡＡＧＣＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＡＡＴＧＴＡＣＣＡＣＡＡＴＴＡＡＡＡＧＡＴＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＡＴＴＴＡＡＣＡＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＴＴＧＣＡＡＴＧＣＴＡＣＧＡＧＣＡＡＴＴＴＧＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＡＡＧＴＡＧＡＴＡＡＴＡＴＧＣＧＴＧＡＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＧＧＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＴＡＣＧＴＧＴＴＡＣＡＧＡＡＴＴＧＡＡＧＣＴＣＣＧＴＧＴＴＧＣＡＧＧＴＧＴＴＣＡＡＧＴＧＴＡＧＴＡＣＡＡＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＡＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＣＣＴＴＣＧＣＧＴＴＧＴＡＣＡＧＣ（配列番号１４１）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0270】

増幅物２８：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＵ２９８９０６．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：３３７４−３５５８

【0271】

ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＡＴＧＣＡＣＣＧＡＡＡＣＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣＴＣＣＧＣＡＴＴＧＴＣＣＧＴＧＧＧＴＧＣＣＡＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧＡＡＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＡＧＡＣＧＴＣＡＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＧＴＡＣＣＣＣＡＡＣＡＡＣＣＴＴＴＴＧＣＧＧＧＧＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＧＴＧＧＡＣＡＧＴＡＣＴＡＣＡＣＧＧＧＧＡＣＴＣＧＴＣＡＣＴＧＣＡ（配列番号１４２）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0272】

増幅物２９：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＵ２９８９２２．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：２２６−３６６

【0273】

ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＧＴＴＡＡＧＡＣＣＧＡＡＡＡＣＧＧＴＧＣＡＴＡＴＡＡＡＧＧＴＡＧＴＴＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＣＡＡＣＧＧＣＡＴＧＧＣＡＣＧＣＴＴＴＧＡＧＧＡＴＣＣＴＡＣＡＣＡＡＣＧＡＣＣＡＴＡＣＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＣＴＴＧＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＴＧＡＡＴＡＴＴＣＣＴＣＴＧＣＡＴＧＡＴＡＴＴＣＧＣ（配列番号１４３）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0274】

増幅物３０：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＣ４７０２７１．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：３３８９−３５４１

【0275】

ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＡＴＧＧＣＧＣＴＡＴＴＴＣＡＣＡＡＣＣＣＴＧＡＧＧＡＡＣＧＧＣＣＡＴＡＣＡＡＡＴＴＧＣＣＡＧＡＣＣＴＧＴＧＣＡＧＧＡＣＡＴＴＧＧＡＣＡＣＴＡＣＡＴＴＧＣＡＴＧＡＣＧＴＴＡＣＡＡＴＡＧＡＧＴＧＴＧＴＣＴＡＴＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＧＡＣＡＧＡＧＧＴＡＴＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＣＴＴＴＡＧＴＧＡＣ（配列番号１４４）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0276】

増幅物３１：ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＦ４５０７７８．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：４３１−６８１

【0277】

ＧＣＴＣＡＴＡＴＧＣＧＧＣＧＣＣＡＴＴＴＡ＊ＣＣＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＴＧＧＧＴＴＴＣＴＧＡＴＡＧＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＣＣＴＴＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＴＡＣＣＣＴＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧＧＴＴＣＴＴＴＧＡＧＴＣＣＴＴＴＧＧＧＧＡＴＣＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＴＡＴＧＧＧＣＡＡＣＣＣＴＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＣＴＣＡＴＧＧＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧＣＴＣＧＧ（配列番号１４５）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＧＣＴＣＡＴＡＴＧＣＧＧＣＧＣＣＡＴＴＴＡは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0278】

【0279】

ＣＣＴＦ２９：５’−ＴＧＣＧＡＧＣＡＧＴＣＧＣＴＡＴＣＡＧＡＧ−３’（配列番号１４６）

【0280】

ＣＣＴＦ３０：５’−ＣＧＣＡＧＣＴＴＴＣＡＧＧＡＧＡＣＣＧＡＴ−３’（配列番号１４７）

【0281】

ＣＣＴＦ３１：５’−ＡＧＣＧＴＡＡＧＴＧＣＴＣＴＡＣＧＣＣＡＧ−３’（配列番号１４８）

【0282】

ＣＣＴＦ３２：５’−ＡＧＡＡＣＣＧＧＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号１４９）

【0283】

２）ＰＣＲ増幅及びＳＣＯの固有の解離温度の測定
それぞれプライマー４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３とＳＣＯ２１、２２、２３、２４にそれぞれ０．１５μＭ、ＰｓｐＧＩ（ＮＥＢ、ＵＳＡ）５Ｕ、ＰＣＲバッファ（ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ、１ｘ）、ＭｇＣｌ２２．５ｍＭ、ｄＮＴＰ２００μＭ、ｈ−ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）１．６Ｕ、及びＨＰＶ１６型、１８型、３３型、３５型、５１型、５３型、５９型、６８ａ型、８２型及びＩＣのｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ１００ｐｇ／ｒｘｎのｔｅｍｐｌａｔｅＤＮＡを添加して総反応液２０μlでＣＦＸ９６リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いて、次のＰＣＲ反応を行った。

【0284】

９５℃ １５分、
９５℃ ３０秒、６３℃ １分（５０サイクル）、
変性温度９５℃で１５分間１回行い、変性温度９５℃で３０秒、アニーリング温度６３℃で１分のサイクルを５０回繰り返して行った。反応後、同一機器内で反応混合物を５０℃に冷却し、５０℃で３０秒間維持した後、５０℃から９５℃にゆっくり加熱することによって、固有解離温度分析曲線を得た。データの分析はＢｉｏ−ＲａｄＣＦＸＭａｎａｇｅｒ１．６を用いた。

【0285】

図５は、１６型、１８型、３３型、３５型、５１型、５３型、５９型、６８ａ型、８２型、ＩＣのターゲット別の多重固有解離温度測定結果であって、それぞれのＳＣＯが有する固有の解離温度（１６型：ＨＥＸ７６．５℃、１８型：ＦＡＭ７８℃、３３型：Ｑｕａｓａｒ６７０７１℃、３５型：Ｑｕａｓａｒ６７０７１℃、５１型：Ｑｕａｓａｒ６７０７１℃、５３型：Ｑｕａｓａｒ６７０７１℃、５９型：Ｑｕａｓａｒ６７０７１℃、６８型ａ：Ｑｕａｓａｒ６７０７１℃、８２型：Ｑｕａｓａｒ６７０７１℃、ＩＣ：Ｑｕａｓａｒ６７０６７．５℃）でピークが観察され（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）、同じ組成において標的配列が投入されなかった場合には、ＣＣＴＦを可視化するＳＣＯのピークが観察されないことを確認した（ｅ）。

【0286】

【0287】

４．呼吸器疾患の原因体の検出のための多重ターゲットＰＣＲでのＣＣＴＦの形成及びＣＣＴＦの固有の解離温度のピーク分析
呼吸器疾患の原因体であるインフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ／Ｈ１Ｎ１、ＦｌｕＡ／Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ／Ｈ３Ｎ２、ＦｌｕＡ／Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ、ＦｌｕＡ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ）、インフルエンザＢ（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＢ、ＦｌｕＢ）、パラインフルエンザ１（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ１、ＰＩＶ１）、パラインフルエンザ３（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ３、ＰＩＶ３）、呼吸器合胞体ウイルスＡ（ＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓＡ、ＲＳＶＡ）、呼吸器合胞体ウイルスＢ（ＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓＢ、ＲＳＶＢ）、ヒトメタニューモウイルス（Ｈｕｍａｎｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ、ＭＰＶ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、ＡｄＶ）及び外部対照物質（ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＣｏｎｔｒｏｌ、ＥＣ）の核酸のリアルタイム重合酵素連鎖反応機器を用いたＣＣＴＦ分析を行った。

【0288】

１）標的配列鋳型ＤＮＡの配列特異的に作製されたプライマー

【0289】

【0290】

【0291】

プライマー情報、及び増幅されて生成される標的配列情報は、次の通りである。

【0292】

プライマー６４：５’−ＴＴＧＣＴＡＴＧＧＣＴＧＡＣＧＧＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧ−３’（配列番号１５０）

【0293】

プライマー６５：５’−ＧＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＡＧＣＡＣＧＡＡＴ＊ＣＣＡＧＧＧＧＧＧＴＧＡＡＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＡＡＴＧＴＧＡＡＧＡＣＡＣ−３’（配列番号１５１）

【0294】

プライマー６６：５’−ＧＧＧＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＴＡＣＣＡＡＡＣＧＧＡＡＣ−３’（配列番号１５２）

【0295】

プライマー６７：５’−ＣＣＧＴＧＧＣＧＣＧＡＡＣＴＴＡＴＣＧＡ＊ＣＣＡＧＧＡＴＣＡＣＡＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＣＡＡＴＡＧＡＧＣ−３’（配列番号１５３）

【0296】

プライマー６８：５’−ＴＣＡＡＡＧＡＣＴＡＡＧＴＧＧＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＡＣ−３’（配列番号１５４）

【0297】

プライマー６９：５’−ＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＣＣＡＴＴＧＣＧＣＧ＊ＣＣＡＧＧＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＡＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣ−３’（配列番号１５５）

【0298】

プライマー７０：５’−ＧＧＣＴＴＡＧＡＧＣＡＣＣＧＣＧＴＣＡＴＴ＊ＣＣＡＧＧＴＧＴＣＧＣＴＡＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＴＧＡＴＣ−３’（配列番号１５６）

【0299】

プライマー７１：５’−ＧＣＧＡＴＡＧＣＴＡＡＧＧＴＡＣＧＡＣＧＧＧＴＣ−３’（配列番号１５７）

【0300】

プライマー７２：５’−ＧＴＡＧＡＴＴＣＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＣＣＴＣＴＡＣＴＡＣＣ−３’（配列番号１５８）

【0301】

プライマー７３：５’−ＣＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧ＊ＣＣＡＧＧＴＧＡＴＡＴＴＧＡＧＴＴＣＧＧＴＡＡＴＧＣＡＡＧＡＴＣＴＧＣ−３’（配列番号１５９）

【0302】

プライマー７４：５’−ＣＣＡＴＡＧＡＧＡＴＧＧＣＡＡＴＡＧＡＴＧＡＡＧＡＧＣ−３’（配列番号１６０）

【0303】

プライマー７５：５’−ＡＧＧＣＧＴＴＣＣＧＣＴＴＣＡＡＣＧＡＧ＊ＣＣＡＧＧＴＴＧＴＣＡＧＡＴＴＣＴＧＴＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＧＴＣ−３’（配列番号１６１）

【0304】

プライマー７６：５’−ＧＧＴＧＧＴＧＡＴＣＣＣＡＡＣＴＴＧＴＴＡＴＡＴＣＧＡＡＧ−３’（配列番号１６２）

【0305】

プライマー７７：５’−ＴＣＣＧＴＣＴＧＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣ＊ＣＣＡＧＧＴＴＣＡＡＴＣＴＡＴＣＲＴＣＴＧＡＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＴ−３’（配列番号１６３）

【0306】

プライマー７８：５’−ＧＴＧＴＣＡＣＧＡＣＧＣＧＣＧＡＡＴＣＴ＊ＣＣＡＧＧＡＧＡＴＣＧＴＧＡＣＣＡＧＴＡＴＡＡＴＡＧＣＴＣＡＡＣＡＣ−３’（配列番号１６４）

【0307】

プライマー７９：５’−ＴＴＴＣＡＧＡＣＡＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＣＣＡＧＣ−３’（配列番号１６５）

【0308】

プライマー８０：５’−ＣＣＣＡＧＡＡＣＧＡＴＴＴＧＣＧＧＣＧＴ＊ＣＣＡＧＧＣＴＴＧＧＴＣＣＴＣＴＣＴＴＡＧＧＡＧＧＣＡＡＧＣ−３’（配列番号１６６）

【0309】

プライマー８１：５’−ＡＧＧＡＴＧＣＴＴＣＧＧＡＧＴＡＣＣＴＧＡＧ−３’（配列番号１６７）

【0310】

プライマー８２：５’−ＴＧＣＡＴＴＧＣＣＧＴＣＧＣＡＧＡＧＡＣ＊ＣＣＡＧＧＣＡＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＣＧＣＡＴＣ−３’（配列番号１６８）

【0311】

プライマー８３：ＧＣＣＣＴＡＡＴＧＡＴＡＡＧＡＣＡＧＧＣＡＧＴＴＧＴＧＧ（配列番号１６９）

【0312】

プライマー８４：５’−ＡＴＧＣＧＣＴＴＧＧＡＴＴＧＣＣＧＡＴＧ＊ＣＣＡＧＧＡＧＣＣＣＴＧＴＴＡＧＴＴＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＡＣＡ−３’（配列番号１７０）

【0313】

ＳＣＯ３３：ＣＴＴＡＴＡＧＡＴＴＡＴＡ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＴＧＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＡＧＣＡＣＧＡＡＴ［ＢＨＱ１］（配列番号１７１）

【0314】

ＳＣＯ３４：ＣＴＡＡＧＴＡＡＧＣＣＴＡＴＡＴＣＧＡＡＴ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＣＧＴＧＧＣＧＣＧＡＡＣＴＴＡＴＣＧＡ［ＢＨＱ１］（配列番号１７２）

【0315】

ＳＣＯ３５：ＣＧＴＡＣＴＧＣＡＣＴＣＧＣＣＴＡＣＧＡＣ［Ｔ（ＣａｌＦｌｕｏｒＲｅｄ６１０）］ＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＣＣＡＴＴＧＣＧＣＧ［ＢＨＱ２］（配列番号１７３）

【0316】

ＳＣＯ３６：ＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＡＣＡ［Ｔ（ＣａｌＦｌｕｏｒＲｅｄ６１０）］ＧＧＣＴＴＡＧＡＧＣＡＣＣＧＣＧＴＣＡＴＴ［ＢＨＱ２］（配列番号１７４）

【0317】

ＳＣＯ３７：ＣＴＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ６７０）］ＣＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧ［ＢＨＱ２］（配列番号１７５）

【0318】

ＳＣＯ３８：ＣＴＡＡＴＣＧＴＡＴＧＡＧＡＴＣＴＡＴＧＡ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ６７０）］ＡＧＧＣＧＴＴＣＣＧＣＴＴＣＡＡＣＧＡＧ［ＢＨＱ２］（配列番号１７６）

【0319】

ＳＣＯ３９：ＴＣＡＴＡＧＡＣＡＴＴＴＡ［Ｔ（ＣａｌＦｌｕｏｒＧｏｌｄ５４０）］ＴＣＣＧＴＣＴＧＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣ［ＢＨＱ１］（配列番号１７７）

【0320】

ＳＣＯ４０：ＴＡＣＧＡＡＴＣＴＧＡＣＣＴＡＧＴＡＡＧＡ［Ｔ（ＣａｌＦｌｕｏｒＧｏｌｄ５４０）］ＧＴＧＴＣＡＣＧＡＣＧＣＧＣＧＡＡＴＣＴ［ＢＨＱ１］（配列番号１７８）

【0321】

ＳＣＯ４１：ＴＧＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＧＣＣＧＣＴＡＧＡ［Ｔ（ＣａｌＦｌｕｏｒＧｏｌｄ５４０）］ＣＣＣＡＧＡＡＣＧＡＴＴＴＧＣＧＧＣＧＴ［ＢＨＱ１］（配列番号１７９）

【0322】

ＳＣＯ４２：ＴＣＧＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＧＡＴＣＣＡ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ６７０）］ＴＧＣＡＴＴＧＣＣＧＴＣＧＣＡＧＡＧＡＣ［ＢＨＱ２］（配列番号１８０）

【0323】

ＳＣＯ４３：ＴＣＧＡＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＧＴＣＣＧＴＡ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＡＴＧＣＧＣＴＴＧＧＡＴＴＧＣＣＧＡＴＧ［ＢＨＱ１］（配列番号１８１）

【0324】

増幅物３２：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＵ５５８７８７．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：４２８−６２１

【0325】

ＴＴＧＣＴＡＴＧＧＣＴＧＡＣＧＧＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＴＴＴＧＴＡＣＣＣＡＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＴＣＣＴＡＴＧＴＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＴＣＣＴＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＧＧＴＧＴＴＣＡＴＣＡＣＣＣＡＣＣＴＡＡＣＡＴＡＧＧＧＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＣＣＡＴＡＣＡＧＡＡＡＡＴＧＣＴＴＡＴＧＴＣＴＣＴＧＴＡＧＴＧＴＣＴＴＣＡＣＡＴＴＡＴＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＴＣＡＣＣＣＣ＊ＣＣＴＧＧＡＴＴＣＧＴＧＣＴＣＴＣＡＡＣＧＧＧＧＣ（配列番号１８２）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＴＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＡＴＴＣＧＴＧＣＴＣＴＣＡＡＣＧＧＧＧＣは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0326】

増幅物３３：ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＹ２２１９３４．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１１１−２９６

【0327】

ＧＧＧＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＴＡＣＣＡＡＡＣＧＧＡＡＣＧＡＴＡＧＴＧＡＡＡＡＣＡＡＴＣＡＣＡＡＡＴＧＡＣＣＡＡＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＣＴＡＡＴＧＣＴＡＣＴＧＡＧＴＴＧＧＴＴＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＡＴＡＧＧＴＧＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＴＣＡＧＡＴＣＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＧＡＡＣＴＧＣＡＣＡＣＴＡＡＴＡＧＡＴＧＣＴＣＴＡＴＴＧＧＧＡＧＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＧＡＴ＊ＣＣＴＧＧＴＣＧＡＴＡＡＧＴＴＣＧＣＧＣＣＡＣＧＧ（配列番号１８３）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＴＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＴＣＧＡＴＡＡＧＴＴＣＧＣＧＣＣＡＣＧＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0328】

増幅物３４：ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＹ２２１７５０．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１２９１−１５０１

【0329】

ＴＣＡＡＡＧＡＣＴＡＡＧＴＧＧＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＡＣＡＡＣＧＡＡＡＴＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＡＴＧＡＣＣＴＣＡＧＡＧＣＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＡＧＣＴＣＡＣＡＡＡＴＡＧＡＡＣＴＴＧＣＡＧＴＣＴＴＧＣＴＴＴＣＣＡＡＣＧＡＡＧＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＣＡＴＣＴＡＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＧＧＴＣＣＣＴＣＴＧＣＴＧＴＡＧＡＣＡＴＡ＊ＣＣＴＧＧＣＧＣＧＣＡＡＴＧＧＣＡＧＧＴＣＡＣＴＴ（配列番号１８４）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＴＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＣＧＣＧＣＡＡＴＧＧＣＡＧＧＴＣＡＣＴＴは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0330】

増幅物３５：ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＦ７１９７４３．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１８１６−１９５０

【0331】

ＧＧＣＴＴＡＧＡＧＣＡＣＣＧＣＧＴＣＡＴＴ＊ＣＣＡＧＧＴＧＴＣＧＣＴＡＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＴＧＡＴＣＣＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＧＡＣＴＴＴＡＣＡＧＣＡＡＴＴＧＣＴＴＡＣＴＴＡＡＧＧＧＡＣＧＡＡＴＴＧＣＴＣＧＣＡＡＡＧＣＡＴＣＣＧＡＣＣＴＴＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＡＴＧＡＣＧＡＧＧＣＧＡＣＣＣＧＴＣＧＴＡＣＣＴＴＡＧＣＴＡＴＣＧＣ（配列番号１８５）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＧＧＣＴＴＡＧＡＧＣＡＣＣＧＣＧＴＣＡＴＴは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0332】

増幅物３６：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＸ６３９４９８．１ｚ／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：４０３５−４２５３

【0333】

ＧＴＡＧＡＴＴＣＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＣＣＴＣＴＡＣＴＡＣＣＡＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＡＧＧＧＡＴＧＡＴＡＴＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＴＡＡＡＧＴＡＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＣＣＡＡＴＧＴＣＴＣＣＣＡＧＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＴＡＴＣＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＴＴＧＴＡＴＴＴＧＴＣＡＡＣＧＧＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＧＧＴＡＣＡＡＴＣＡＣＡＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＴＣＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＧＣＡＴＴＡＣＣＧＡＡＣＴＣＡＡＴＡＴＣＡ＊ＣＣＴＧＧＣＣＧＣＴＴＧＣＧＣＡＴＧＴＡＡＧＡＣＧ（配列番号１８６）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＴＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＣＣＧＣＴＴＧＣＧＣＡＴＧＴＡＡＧＡＣＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0334】

増幅物３７：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＹ３６９８７６．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１３１０−１４６３

【0335】

ＣＣＡＴＡＧＡＧＡＴＧＧＣＡＡＴＡＧＡＴＧＡＡＧＡＧＣＣＡＧＡＡＣＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＴＡＧＡＧＣＡＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＧＧＡＡＣＣＴＣＡＡＴＣＡＴＣＴＡＴＡＡＴＣＣＡＡＴＡＴＧＣＴＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＧＡＴＧＡＣＣＧＧＡＣＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＡＧＡＡＴＣＴＧＡＣＡＡ＊ＣＣＴＧＧＣＴＣＧＴＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＣＧＣＣＴ（配列番号１８７）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＴＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＣＴＣＧＴＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＣＧＣＣＴは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0336】

増幅物３８：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＸ８９４８００．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１１３７８−１１５２９

【0337】

ＧＧＴＧＧＴＧＡＴＣＣＣＡＡＣＴＴＧＴＴＡＴＡＴＣＧＡＡＧＴＴＴＣＴＡＴＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＧＣＴＡＴＡＧＴＴＣＡＣＴＣＴＧＴＧＴＴＣＡＴＡＣＴＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＡＣＡＡＡＣＣＡＴＧＡＴＴＴＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＴＧＴＣＡＧＡＹＧＡＴＡＧＡＴＴＧＡＡ＊ＣＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＣＡＧＡＣＧＧＡ（配列番号１８８）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＴＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＧＣＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＣＡＧＡＣＧＧＡは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0338】

増幅物３９：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＹ２４９６８３．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１１４６５−１１５７７

【0339】

ＧＧＴＧＧＴＧＡＴＣＣＴＡＡＴＴＴＧＴＴＡＴＡＴＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＡＧＧＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＡＣＴＴＣＣＴＴＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＴＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＧＴＧＴＴＣＧＴＧＴＴＧＡＧＣＴＡＴＴＡＴＡＣＴＧＧＴＣＡＣＧＡＴＣＴ＊ＣＣＴＧＧＡＧＡＴＴＣＧＣＧＣＧＴＣＧＴＧＡＣＡＣ（配列番号１８９）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＴＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＡＧＡＴＴＣＧＣＧＣＧＴＣＧＴＧＡＣＡＣは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0340】

増幅物４０：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＪ６２７３９１．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：３６３１−３９３３

【0341】

ＴＴＴＣＡＧＡＣＡＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＴＴＧＧＡＣＣＴＡＡＴＧＡＣＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣＡＴＡＣＡＴＧＣＣＡＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＧＡＴＡＡＡＧＣＴＧＡＴＧＴＴＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＧＣＡＡＴＧＧＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＧＧＡＴＴＴＧＧＡＡＴＣＣＴＡＡＴＡＧＧＧＧＴＣＴＡＣＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＴＴＴＡＣＡＴＧＧＴＴＣＡＡＴＴＧＣＣＧＡＴＣＴＴＴＧＧＴＧＴＣＡＴＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＡＴＣＡＡＧＧＣＡＧＣＴＣＣＣＴＣＴＴＧＣＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＣＧＧＧＡＡＴＴＡＴＧＣＴＴＧＣＣＴＣＣＴＡＡＧＡＧＡＧＧＡＣＣＡＡＧ＊ＣＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＣＡＡＡＴＣＧＴＴＣＴＧＧＧ（配列番号１９０）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＴＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＡＣＧＣＣＧＣＡＡＡＴＣＧＴＴＣＴＧＧＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0342】

増幅物４１：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＴ９６３０８１．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１８４３７−１８５９８

【0343】

ＡＧＧＡＴＧＣＴＴＣＧＧＡＧＴＡＣＣＴＧＡＧＴＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＧＣＣＣＧＴＧＣＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＧＴＡＴＧＧＧＧＡＡＣＡＡＧＴＴＴＡＧＡＡＡＣＣＣＣＡＣＡＧＴＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＣＡＣＧＡＴＧＴＧＡＣＣＡＣＣＧＡＣＣＧＴＡＧＣＣＡＧＣＧＡＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＧＣＴＴＣＧＴＧＣＣＣＧＴＴＧ＊ＣＣＴＧＧＧＴＣＴＣＴＧＣＧＡＣＧＧＣＡＡＴＧＣＡ（配列番号１９１）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＴＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＧＴＣＴＣＴＧＣＧＡＣＧＧＣＡＡＴＧＣＡは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0344】

増幅物４２：ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＹ２２１６２４．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：９８８−１２５２

【0345】

ＧＣＣＣＴＡＡＴＧＡＴＡＡＧＡＣＡＧＧＣＡＧＴＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＴＡＴＣＧＴＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＡＡＡＴＧＧＡＧＴＡＡＡＡＧＧＡＴＴＴＴＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＣＧＧＣＡＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＣＴＡＡＡＡＧＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＴＴＴＴＧＡＧＡＴＧＡＴＴＴＧＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＡＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＣＡＡＴＡＡＡＴＴＣＴＣＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＧＡＴＡＴＣＧＴＡＧＧＡＡＴＡＡＡＴＧＡＧＴＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＴＡＧＣＧＧＧＡＧＴＴＴＴＧＴＴＣＡＧＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＴＡＡＣＡＧＧＧＣＴ＊ＣＣＴＧＧＣＡＴＣＧＧＣＡＡＴＣＣＡＡＧＣＧＣＡＴ（配列番号１９２）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＴＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＣＡＴＣＧＧＣＡＡＴＣＣＡＡＧＣＧＣＡＴは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0346】

【0347】

ＣＣＴＦ３３：５’−ＡＴＴＣＧＴＧＣＴＣＴＣＡＡＣＧＧＧＧＣ−３’（配列番号１９３）

【0348】

ＣＣＴＦ３４：５’−ＴＣＧＡＴＡＡＧＴＴＣＧＣＧＣＣＡＣＧＧ−３’（配列番号１９４）

【0349】

ＣＣＴＦ３５：５’−ＣＧＣＧＣＡＡＴＧＧＣＡＧＧＴＣＡＣＴＴ−３’（配列番号１９５）

【0350】

ＣＣＴＦ３６：５’−ＡＡＴＧＡＣＧＣＧＧＴＧＣＴＣＴＡＡＧＣＣ−３’（配列番号１９６）

【0351】

ＣＣＴＦ３７：５’−ＣＣＧＣＴＴＧＣＧＣＡＴＧＴＡＡＧＡＣＧ−３’（配列番号１９７）

【0352】

ＣＣＴＦ３８：５’−ＣＴＣＧＴＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＣＧＣＣＴ−３’（配列番号１９８）

【0353】

ＣＣＴＦ３９：５’−ＧＣＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＣＡＧＡＣＧＧＡ−３’（配列番号１９９）

【0354】

ＣＣＴＦ４０：５’−ＡＧＡＴＴＣＧＣＧＣＧＴＣＧＴＧＡＣＡＣ−３’（配列番号２００）

【0355】

ＣＣＴＦ４１：５’−ＡＣＧＣＣＧＣＡＡＡＴＣＧＴＴＣＴＧＧＧ−３’（配列番号２０１）

【0356】

ＣＣＴＦ４２：５’−ＧＴＣＴＣＴＧＣＧＡＣＧＧＣＡＡＴＧＣＡ−３’（配列番号２０２）

【0357】

ＣＣＴＦ４３：５’−ＣＡＴＣＧＧＣＡＡＴＣＣＡＡＧＣＧＣＡＴ−３’（配列番号２０３）

【0358】

２）ＰＣＲ増幅及びＳＣＯの固有の解離温度の測定
それぞれプライマー６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４とＳＣＯ３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３にそれぞれ０．１５μＭ、ＰｓｐＧＩ（ＮＥＢ、ＵＳＡ）１Ｕ、ＰＣＲバッファ（ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ、１ｘ）、ＭｇＣｌ２２．５ｍＭ、ｄＮＴＰ２００μＭ、ＤＴＴ０．１ｍＭ、ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ１Ｕ、ＳｕｐｅｒｉｏｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）１Ｕ、及びＦｌｕＡ／Ｈ１Ｎ１、ＦｌｕＡ／Ｈ３Ｎ２、ＦｌｕＡ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ、ＦｌｕＢ、ＰＩＶ１、ＰＩＶ３、ＲＳＶＡ、ＲＳＶＢ、ｈＭＰＶ、ＡＤＶ及びＭＳ２ｐｈａｇｅのｇｅｎｏｍｉｃＲＮＡ１×１０＾４ｃｏｐｉｅｓ／ｒｘｎのｔｅｍｐｌａｔｅ核酸を添加して総反応液２０μlでＣＦＸ９６リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いて、次のＰＣＲ反応を行った。

【0359】

【0360】

図６は、ＦｌｕＡ／Ｈ１Ｎ１、ＦｌｕＡ／Ｈ３Ｎ２、ＦｌｕＡ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ、ＦｌｕＢ、ＰＩＶ１、ＰＩＶ３、ＲＳＶＡ、ＲＳＶＢ、ｈＭＰＶ、ＡＤＶ、ＥＣ（Ｍｓ２ｐｈａｇｅ）の原因菌別の多重固有解離温度測定結果であって、それぞれのＳＣＯが有する固有の解離温度（ＦｌｕＡ／Ｈ１Ｎ１：６７．５℃、ＦｌｕＡ／Ｈ３Ｎ２：７６．５℃、ＦｌｕＡ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ：８６．５℃、ＦｌｕＢ：８３．５℃、ＰＩＶ１：６６℃、ＰＩＶ３：７４℃、ＲＳＶＡ：６３．５℃、ＲＳＶＢ：７２℃、ｈＭＰＶ：８６℃、ＡＤＶ：８５℃）でピークが観察され（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）（ｅ）、同じ組成において標的配列が投入されなかった場合には、ＣＣＴＦを可視化するＳＣＯのピークが観察されないことを確認した（ｆ）。

【0361】

【0362】

５．ＢＤＮＦ遺伝子の単一塩基変異の遺伝子型の分析のための多重ターゲットＰＣＲでのＣＣＴＦの形成及びＣＣＴＦの固有の解離温度のピーク分析

【0363】

ＢＤＮＦ遺伝子の単一塩基変異であるｒｓ６２６５の遺伝子型を分析するために、リアルタイム重合酵素連鎖反応機器を用いたＣＣＴＦ分析を行った。

【0364】

【0365】

【0366】

プライマー情報、及び増幅されて生成される標的配列情報は、次の通りである。

【0367】

プライマー８５：５’−ＡＣＧＡＧＧＣＣＴＧＴＣＣＧＣＴＴＡＣＴＡＧ＊ＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＡＴＣＧＣ−３’（配列番号２０４）

【0368】

プライマー８６：５’−ＣＣＧＧＧＴＡＣＧＣＴＡＡＧＴＣＣＧＣＴＡＴ＊ＣＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＡＴＣＧＴ−３’（配列番号２０５）

【0369】

プライマー８７：５’−ＧＡＣＣＣＡＴＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＡ−３’（配列番号２０６）

【0370】

プライマー８８：５’−ＧＣＴＣＡＴＡＴＧＣＧＧＣＧＣＣＡＴＴＴＡ＊ＣＣＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧ−３’（配列番号２０７）

【0371】

プライマー８９：５’−ＣＣＧＡＧＣＡＣＴＴＴＣＴＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＣ−３’（配列番号２０８）

【0372】

ＳＣＯ４４：ＧＴＡＧＣＡＣＧＣＴＴＣＧＡＡＴＧＧＣ［Ｔ（ＨＥＸ）］ＡＴＡＣＧＡＧＧＣＣＴＧＴＣＣＧＣＴＴＡＣＴＡＧ［ＢＨＱ１］（配列番号２０９）

【0373】

ＳＣＯ４５：ＧＡＴＡＣＧＧＡＧＧＴＣＣＧＡＡＧＧＣＡＧ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＧＴＴＧＧＴＴＡＣＣＣＴＡＡＣＧＣＧＣＣＧＧＡ［ＢＨＱ１］（配列番号２１０）

【0374】

ＳＣＯ４６：ＡＴＴＡＧＴＴＴＡＡＣＴＡＴＴＡＴＡＴＴ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＴＡＴＧＣＴＣＡＴＡＴＧＣＧＧＣＧＣＣＡＴＴＴＡ［ＢＨＱ１］（配列番号２１１）

【0375】

増幅物４３：ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＴ＿００９２３７．１９／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：２７５９８３４０−２７５９８４５１

【0376】

ＡＣＧＡＧＧＣＣＴＧＴＣＣＧＣＴＴＡＣＴＡＧ＊ＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＡＴＣＡＣＧＴＧＴＴＣＧＡＡＡＧＴＧＴＣＡＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＴＣＡＡＧＣＣＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＧＣＣＴＴＧＧＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＧＣＴＣＴＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣＡＴＧＧＧＴＣ（配列番号２１２）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＡＣＧＡＧＧＣＣＴＧＴＣＣＧＣＴＴＡＣＴＡＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0377】

増幅物４４：ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＴ＿００９２３７．１９／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：２７５９８３３８−２７５９８４５１

【0378】

ＣＣＧＧＧＴＡＣＧＣＴＡＡＧＴＣＣＧＣＴＡＴ＊ＣＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＡＴＣＡＣＧＴＧＴＴＣＧＡＡＡＧＴＧＴＣＡＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＴＣＡＡＧＣＣＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＧＣＣＴＴＧＧＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＧＣＴＣＴＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣＡＴＧＧＧＴＣ（配列番号２１３）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＣＣＧＧＧＴＡＣＧＣＴＡＡＧＴＣＣＧＣＴＡＴは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0379】

増幅物４５：ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＦ４５０７７８．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：４３１−６８１

【0380】

ＧＣＴＣＡＴＡＴＧＣＧＧＣＧＣＣＡＴＴＴＡ＊ＣＣＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＴＧＧＧＴＴＴＣＴＧＡＴＡＧＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＣＣＴＴＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＴＡＣＣＣＴＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧＧＴＴＣＴＴＴＧＡＧＴＣＣＴＴＴＧＧＧＧＡＴＣＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＴＡＴＧＧＧＣＡＡＣＣＣＴＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＣＴＣＡＴＧＧＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧＣＴＣＧＧ（配列番号２１４）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＧＣＴＣＡＴＡＴＧＣＧＧＣＧＣＣＡＴＴＴＡは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0381】

【0382】

ＣＣＴＦ４４：５’−ＣＴＡＧＴＡＡＧＣＧＧＡＣＡＧＧＣＣＴＣＧＴ−３’（配列番号２１５）

【0383】

ＣＣＴＦ４５：５’−ＡＴＡＧＣＧＧＡＣＴＴＡＧＣＧＴＡＣＣＣＧＧ−３’（配列番号２１６）

【0384】

ＣＣＴＦ４６：５’−ＴＡＡＡＴＧＧＣＧＣＣＧＣＡＴＡＴＧＡＧ−３’（配列番号２１７）

【0385】

２）ＰＣＲ増幅及びＳＣＯの固有の解離温度の測定
それぞれプライマー８５、８６、８７、８８、８９とＳＣＯ４４、４５、４６にそれぞれ０．１５μＭ、ＰｓｐＧＩ（ＮＥＢ、ＵＳＡ）５Ｕ、ＰＣＲバッファ（ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ、１ｘ）、ＭｇＣｌ２２．５ｍＭ、ｄＮＴＰ２００μＭ、ｈ−ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）１．６Ｕ、及びＦｌｕＡ／Ｈ１Ｎ１、ＦｌｕＡ／Ｈ３Ｎ２、ＦｌｕＡ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ、ＦｌｕＢ、ＰＩＶ１、ＰＩＶ３、ＲＳＶＡ、ＲＳＶＢ、ｈＭＰＶ、ＡＤＶ及びＭＳ２ｐｈａｇｅのｇｅｎｏｍｉｃＲＮＡ１×１０＾４ｃｏｐｉｅｓ／ｒｘｎのｔｅｍｐｌａｔｅ核酸を添加して総反応液２０μlでＣＦＸ９６リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いて、次のＰＣＲ反応を行った。

【0386】

９５℃ １５分、
９５℃ ３０秒、６５℃ １分（５０サイクル）、
変性温度９５℃で１５分間１回行い、変性温度９５℃で３０秒、アニーリング温度６５℃で１分のサイクルを５０回繰り返して行った。反応後、同一機器内で反応混合物を５０℃に冷却し、５０℃で３０秒間維持した後、５０℃から９５℃にゆっくり加熱することによって、固有解離温度分析曲線を得た。データの分析はＢｉｏ−ＲａｄＣＦＸＭａｎａｇｅｒ１．６を用いた。

【0387】

図７の（ａ）は、ｒｓ６２６５の突然変異型Ａ／Ａ、野生型Ｇ／Ｇ、及び異型接合体Ａ／Ｇの遺伝子型と内部対照物質（ＩＣ）の多重固有解離温度測定結果であって、それぞれのＳＣＯが有する固有の解離温度（Ａ／Ａ：７６．５℃、Ａ／Ｇ：７６．５℃と７５℃、Ｇ／Ｇ：７５℃、ＩＣ：６６℃）でピークが観察され（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）、同じ組成において標的配列が投入されなかった場合には、ＣＣＴＦを可視化するＳＣＯのピークが観察されないことを確認した（ｅ）。

【0388】

【0389】

実施例３．多重ターゲットＰＣＲでのＣＣＴＦの形成及びＣＣＴＦのＣｔグラフの分析
ＳＣＯを活用してリアルタイム重合酵素連鎖反応機器によりＣＣＴＦの生成有無を確認できることを実施例２で証明している。前記の方法において使用されるＳＣＯは、ＰＣＲ増幅過程中の標的配列が生成される反応中に同時に形成されて、リアルタイム蛍光分析が可能であるので、生成されるＣＣＴＦの同定が可能である。これに基づいて、本実施例では、多重標的配列を有するＰＣＲの場合、ＣＣＴＦの形成をＳＣＯで分析するとき、標準曲線の形成が可能であることを証明しようとした。

【0390】

本実施例を行うために、性媒介感染症（ＳＴＩ）の原因菌である淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、ＮＧ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ．ｈｏｍｉｎｉｓ、ＭＨ）、ウレアプラズマ・パルバム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ．ｐａｒｖｕｍ、ＵＰ）を選別した。

【0391】

１．標的鋳型ＤＮＡの特異的プライマーの作製
本実施例で使用した順方向プライマーはＣＰＴＯであって、前記の発明の詳細な説明に記述された方法に基づいて作製された。順方向プライマーの５’末端は、１９ｍｅｒ又は２１ｍｅｒのヌクレオチド配列で構成され、ＣＣＴＦを形成できるように各原因菌別のＤＮＡと非相補的な配列で構成される。その後に制限酵素認識配列が位置するようになる。制限酵素認識配列の後から３’末端までは、各原因菌別のＤＮＡのターゲット部位と相補的な配列で構成されているので、プライマーとしての役割を果たす。逆方向プライマーは、各原因菌別のＤＮＡのターゲット部位と相補的な配列で構成されている。

【0392】

また、ＣＣＴＦと二量体を形成するＳＣＯは、二重標識を有するようにデザインし、各原因菌別にそれぞれデザインした。ＳＣＯは、３’末端のクエンチャー（ＢＨＱ１又はＢＨＱ２）分子及びレポーター（各ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＣＡＬＦｌｕｏｒＲｅｄ６１０）分子を一定の距離を有するようにしてデザインし、配列は、分析しようとするＣＣＴＦの配列と相補的である。

【0393】

プライマー情報、及び増幅されて生成される標的配列情報は、次の通りである。

【0394】

プライマー９０：５’−ＣＴＣＡＴＣＧＣＣＡＣＧＡＧＣＣＧＧＴＴＡＡ＊ＣＣＡＧＧＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＣ−３’（配列番号２１８）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＣＴＣＡＴＣＧＣＣＡＣＧＡＧＣＣＧＧＴＴＡＡ＊ＣＣＡＧＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0395】

プライマー９１：５’−ＧＣＴＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＴＧＡＣＣＧＧＴ−３’（配列番号２１９）

【0396】

プライマー９２：５’−ＧＣＴＣＧＣＡＧＧＴＡＣＧＧＣＡＣＣＡＴＴＣＡ＊ＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＧＴＡＴＧＡＴＡＡＣＡＡＣＧＧＴＡＧＡＧＣ−３’（配列番号２２０）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＧＣＴＣＧＣＡＧＧＴＡＣＧＧＣＡＣＣＡＴＴＣＡ＊ＣＣＡＧＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0397】

プライマー９３：５’−ＣＣＣＣＴＴＴＧＣＡＣＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧ−３’（配列番号２２１）

【0398】

プライマー９４：５’−ＡＧＴＣＧＡＴＴＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＧ＊ＣＣＡＧＧＴＴＡＡＡＧＴＡＧＣＡＴＡＴＧＡＴＣＡＡＧＣＴＣＡＴＴＣＡ−３’（配列番号２２２）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＡＧＴＣＧＡＴＴＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＧ＊ＣＣＡＧＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0399】

プライマー９５：５’−ＧＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＡＴＡＡＴＣＡＴＴＡＴＣＴＣＣＴＴＴＴＡＴＡＡＡ−３’（配列番号２２３）

【0400】

ＳＣＯ４７：ＴＣ［Ｔ（ＨＥＸ）［ＣＡＴＣＧＣＣＡＣＧＡＧＣＣＧＧＴＴＡＡ［ＢＨＱ］（配列番号２２４）

【0401】

ＳＣＯ４８：ＴＧ［Ｔ（ＣＡＬＦｌｕｏｒＲｅｄ６１０）］ＣＧＣＡＧＧＴＡＣＧＧＣＡＣＣＡＴＴＣＡ［ＢＨＱ２］（配列番号２２５）

【0402】

ＳＣＯ４９：ＴＡＧ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＧＡＴＴＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＧ［ＢＨＱ］（配列番号２２６）

【0403】

増幅物４６：ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ５２３６４．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：３７５−４５９

【0404】

ＣＴＣＡＴＣＧＣＣＡＣＧＡＧＣＣＧＧＴＴＡＡ＊ＣＣＡＧＧＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＣＧＡＴＡＴＡＡＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣＣＧＧＴＣＡＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＧＣ（配列番号２２７）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＣＴＣＡＴＣＧＣＣＡＣＧＡＧＣＣＧＧＴＴＡＡ＊ＣＣＡＧＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0405】

増幅物４７：ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ３１４３１．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１４５５−１５３５

【0406】

ＧＣＴＣＧＣＡＧＧＴＡＣＧＧＣＡＣＣＡＴＴＣＡ＊ＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＧＴＡＴＧＡＴＡＡＣＡＡＣＧＧＴＡＧＡＧＣＴＴＴＡＴＡＴＧＡＴＡＴＴＡＡＣＴＴＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号２２８）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＧＣＴＣＧＣＡＧＧＴＡＣＧＧＣＡＣＣＡＴＴＣＡ＊ＣＣＡＧＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0407】

増幅物４８：ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ０８５７３３．２／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：４１６−５０２

【0408】

ＡＧＴＣＧＡＴＴＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＧ＊ＣＣＡＧＧＧＴＴＴＣＴＧＴＡＣＡＣＧＡＴＣＣＡＡＴＴ［Ｔ／ｃ］ＡＣＡＡＡＴＡＡＣＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＣＧＴＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＡＴＧＡＴＴＡＴＡＴＧＴＣＡＧＧＡＴＣ（配列番号２２９）
なお、前記プライマー配列中のＣＣＡＧＧは、制限酵素認識配列を意味し、ＡＧＴＣＧＡＴＴＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＧ＊ＣＣＡＧＧは、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。

【0409】

＊で表示された部分は、ＰｓｐＧＩ制限酵素が切断する部位をブロッキングするために認識配列中のＣにｍｏｄｉｆｉｅｄｄＣＴＰが挿入されたという標識である。ＳＣＯにおける括弧は、蛍光相殺分子と蛍光レポーターが位置した塩基配列の位置を意味する。プライマー及びＳＣＯ中のＮＧに該当するプライマーは、実施例２で使用したものと同一である。増幅物から生成されるＣＣＴＦの配列は、次の通りである。

【0410】

ＣＣＴＦ４７：５’−ＣＣＴＧＧＴＴＡＡＣＣＧＧＣＴＣＧＴＧＧＣＧＡＴＧＡＧ−３’（配列番号２３０）

【0411】

ＣＣＴＦ４８：５’−ＣＣＴＧＧＴＧＡＡＴＧＧＴＧＣＣＧＴＡＣＣＴＧＣＧＡＧＣ−３’（配列番号２３１）

【0412】

ＣＣＴＦ４９：５’−ＣＣＴＧＧＣＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＴＡＡＴＣＧＡＣＴ−３’（配列番号２３２）

【0413】

２．ＰＣＲ増幅及びＳＣＯの固有の解離温度の測定
前記のプライマーの設計で言及したそれぞれの標的配列の特異的な順方向プライマー３種及び逆方向プライマー３種、ＳＣＯ３種を、それぞれ０．１５ｕＭになるように投入し、ＰｓｐＧＩ（ＮＥＢ、ＵＳＡ）２Ｕ、ＰＣＲバッファ（ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ、１ｘ）、ＭｇＣｌ２２．５ｍＭ、ｄＮＴＰ２００μＭ、ｈ−ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）１．６Ｕ、及び各原因菌別の既存の定量方法で証明された１００ｐｇ／μｌのｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡを１０倍ずつ希釈した鋳型ＤＮＡが含まれた総反応液２０μlを、次の条件でＣＦＸ９６リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｂｉｏ−ＲａｄＩｎｃ．，ＵＳＡ）機器を用いて行った。

【0414】

９５℃ １５分、
９５℃ ３０秒、６３℃ １分（５０サイクル）、
変性温度９５℃で１５分間１回行い、変性温度９５℃で３０秒、アニーリング温度６３℃で１分のサイクルを５０回繰り返して行った。また、アニーリング段階で蛍光シグナルを収集し、データの分析は、Ｂｉｏ−ＲａｄＣＦＸＭａｎａｇｅｒ１．６を用いた。Ｃｔ（Ｃｙｃｌｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）は、知られた数字のＤＮＡ濃度の対数増幅器で始め、菌株に対する標準曲線を作成した。

【0415】

図８の（ａ）に示されたように、予想していたＳＣＯの蛍光増幅曲線を、鋳型の濃度に応じてそれぞれ異なるグラフとして観察することができた。また、鋳型ＤＮＡを投入しない場合、いかなるピークも観察されなかった（ｂ）。各原因菌別のｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡを１００ｐｇの濃度から１０倍ずつ希釈したＮＧ（実線）、ＭＧ（点線）、ＵＰ（円形）の多重リアルタイム重合連鎖反応の実験条件で現れたＳＣＯの蛍光増幅曲線（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓ）及び標準曲線（ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅ）を示した結果であって、グラフ（ａ）は、３つの標的配列が濃度別に同時に存在する場合に描かれる蛍光増幅曲線を示し、グラフ（ｂ）は、３つの標的配列が全て含まれない場合に描かれる陰性結果である。グラフ（ａ）中のＮＧに該当するグラフを単一の蛍光増幅曲線で示して標準曲線を示すと、（ｃ）及び（ｄ）で示すことができ、ＭＧに該当するグラフは（ｅ）及び（ｆ）で示すことができ、ＵＰに該当する曲線は（ｇ）及び（ｈ）で示すことができる。

【0416】

標準曲線の線形回帰分析において回帰係数（Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）（ｒ２）は、それぞれ、ＮＧ０．９９８２、ＭＧ０．９９９、ＵＰ０．９９９２と示された。Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｐｌｏｔの傾きは、ＮＧ−３．８５、ＭＧ−３．８９、ＵＰ−３．６６であった。それぞれの増幅効率（Ｅ＝１０［−１／ｓｌｏｐｅ］−１）は、それぞれＮＧ８１．８％、ＭＧ８０．７％、ＵＰ８７．６％と示され、８０〜１２０％の間の適正範囲内に羅列されることが確認できた。

【0417】

本実施例により、各原因菌別の互いに異なるＣＣＴＦをリアルタイム重合酵素連鎖反応機器で読み取るに当たって、ＳＣＯのリアルタイム蛍光の程度を測定することによって、生成されるＣＣＴＦの相対量を把握し、これを用いて標識形成方法でＣｔ値を確認することによって、標的配列の同定が可能であることを証明した。

【図1】