特許 6797025 細菌に基づくタンパク質送達

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6797025

(24)【登録日】2020年11月19日

(45)【発行日】2020年12月9日

(54)【発明の名称】細菌に基づくタンパク質送達

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20201130BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20201130BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20201130BHJP

   A61K 35/74 20150101ALI20201130BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/21

   C12N15/09 ZZNA

   C12P21/00 C

   A61K35/74 A

【請求項の数】14

【全頁数】71

(21)【出願番号】特願2016-568644(P2016-568644)

(86)(22)【出願日】2015年5月20日

(65)【公表番号】特表2017-517257(P2017-517257A)

(43)【公表日】2017年6月29日

(86)【国際出願番号】EP2015061086

(87)【国際公開番号】WO2015177197

(87)【国際公開日】20151126

【審査請求日】2018年5月17日

(31)【優先権主張番号】14169335.8

(32)【優先日】2014年5月21日

(33)【優先権主張国】EP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】510136264

【氏名又は名称】ウニヴェルズィテート バーゼル

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】アリューメロー， セシール

(72)【発明者】

【氏名】イッティグ， シモン

【審査官】 宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００４／０１４７７１９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／０１９１８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／１１５５３１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００８／０１８７５２０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 WIEDIG C. A. et al.，Vaccine，Vol.23 (2005)，pp.4984-4998

【文献】 BOYD A. P. et al.，Euopean Journal of Cell Biology，Vol.79 (2000)，pp. 659-671

【文献】 MOTA L. J. et al.，Annals of Medicine，２００５年，Vol.37, no.4 (2005)，pp. 234-249

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ａ６１Ｋ ３５／７４

Ｃ１２Ｎ １５／０９−１５／９０

Ｃ１２Ｐ ２１／００−２１／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

組換えグラム陰性菌株であって、
５’から３’の方向に、
プロモーター、
前記プロモーターに作動可能に連結した、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルをコードする第１のＤＮＡ配列、及び
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合した、異種タンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列であって、異種タンパク質がアポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質である、第２のＤＮＡ配列
を含むベクターを用いて形質転換され、
組換えグラム陰性菌株がエルシニア・エンテロコリチカ株であり、第１のＤＮＡ配列によりコードされる細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルがＹｏｐＥエフェクタータンパク質若しくはそのＮ末端断片を含み、当該Ｎ末端断片がＹｏｐＥエフェクタータンパク質の少なくとも最初の２０アミノ酸を含む、
組換えグラム陰性菌株。

【請求項2】

ベクターがプロテアーゼ切断部位をコードする第３のＤＮＡ配列を含み、第３のＤＮＡ配列が前記第１のＤＮＡ配列の３’末端と前記第２のＤＮＡ配列の５’末端の間に位置する、請求項１に記載の組換えグラム陰性菌株。

【請求項3】

組換えグラム陰性菌株がエルシニア・エンテロコリチカ株であり、前記エルシニア・エンテロコリチカ株が野生型であるか若しくは少なくとも１種のＴ３ＳＳエフェクタータンパク質の産生に関して欠損を有し、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルがＹ．エンテロコリチカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）ＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端の１３８アミノ酸を含む、請求項１又は２に記載の組換えグラム陰性菌株。

【請求項4】

真核細胞表面又は細胞外マトリックスに結合する接着タンパク質の産生に関して欠損を有する、請求項１から３の何れか一項に記載の組換えグラム陰性菌株。

【請求項5】

前記アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質が、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質、カスパーゼ、及びアポトーシスのデスレセプター制御の細胞内シグナル伝達タンパク質からなる群から選択される、請求項１から４の何れか一項に記載の組換えグラム陰性菌株。

【請求項6】

前記ベクターが、互いとは独立して前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合した同一の異種タンパク質又は２種の異なる異種タンパク質をコードする２つの第２のＤＮＡ配列を含み、異種タンパク質の両方がアポトーシスまたはアポトーシス調節に関与するタンパク質であり、一方のタンパク質がプロアポトーシスタンパク質であり、他方のタンパク質がアポトーシス防止経路の阻害剤であるか、又は、一方のタンパク質がプロアポトーシスタンパク質であり、他方のタンパク質が生存促進性シグナル伝達又は経路の阻害剤である、請求項１から５の何れか一項に記載の組換えグラム陰性菌株。

【請求項7】

５’から３’の方向に、
プロモーター、
前記プロモーターに作動可能に連結した、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルをコードする第１のＤＮＡ配列であって、第１のＤＮＡ配列によりコードされる細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルが、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片を含み、そのＮ末端断片がＹｏｐＥエフェクタータンパク質の少なくとも最初の２０アミノ酸を含む第１のＤＮＡ配列、
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合した、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与する異種タンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列
を含むベクター。

【請求項8】

５’から３’の方向に、プロテアーゼ切断部位をコードする第３のＤＮＡ配列をさらに含み、前記第３のＤＮＡ配列が前記第１のＤＮＡ配列の３’末端と前記第２のＤＮＡ配列の５’末端の間に位置する、請求項７に記載のベクター。

【請求項9】

アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質が、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質、カスパーゼ、及びアポトーシスのデスレセプター制御の細胞内シグナル伝達タンパク質からなる群から選択される、請求項７又は８に記載のベクター。

【請求項10】

ベクターが、互いとは独立して前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合した同一の異種タンパク質又は２種の異なる異種タンパク質をコードする２つの第２のＤＮＡ配列を含み、異種タンパク質の両方がアポトーシスまたはアポトーシス調節に関与するタンパク質であり、一方のタンパク質がプロアポトーシスタンパク質であり、他方のタンパク質がアポトーシス防止経路の阻害剤であるか、又は、一方のタンパク質がプロアポトーシスタンパク質であり、他方のタンパク質が生存促進性シグナル伝達又は経路の阻害剤である、請求項７から９の何れか一項に記載のベクター。

【請求項11】

真核細胞に異種タンパク質を送達するための方法であって、
ｉ）請求項１から６の何れか一項に記載のグラム陰性菌株を培養する工程と、
ｉｉ）真核細胞とｉ）のグラム陰性菌株をｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる工程であり、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルと異種タンパク質とを含む融合タンパク質がグラム陰性菌株により発現され、真核細胞内に移行する工程と
を含む方法。

【請求項12】

異種タンパク質を精製する方法であって、
請求項１から６の何れか一項に記載のグラム陰性菌株を培養し、したがって、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルと異種タンパク質とを含む融合タンパク質が発現され、培養物の上清中に分泌される工程
を含む方法。

【請求項13】

異種タンパク質を医薬として又はワクチンとして対象に送達することに使用するための、請求項１から６の何れか一項に記載の組換えグラム陰性菌株。

【請求項14】

移行した異種タンパク質（一又は複数）によって誘発される細胞経路又は事象に対する阻害剤のｉｎ ｖｉｔｒｏハイスループットスクリーニングのための、請求項１から６の何れか一項に記載の組換えグラム陰性菌株の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、組換えグラム陰性菌株、及び、真核細胞に異種タンパク質を送達するためのその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞生物学的研究においてタンパク質機能を扱うために一過性トランスフェクション技法が長年にわたり適用されてきた。これらの方法では、一般に、試験下でタンパク質が大きく過剰提示され、これにより、シグナル伝達の単純化しすぎたモデルが導かれる可能性がある［１］。短期シグナル伝達プロセスを制御するタンパク質に関しては、目的のタンパク質は、それが制御するシグナル伝達事象よりもはるかに長く存在する［２］。さらに、ＤＮＡトランスフェクションに基づく一過性過剰発現により、不均一かつ同調性のない細胞集団が導かれ、それにより、機能的研究が複雑になり、オミクス手法が妨害される。これに加えて、そのようなアッセイをより大きな規模にスケールアップするには非常に費用がかかる。上記の点のいくつかは、プラスミド媒介性低分子ＧＴＰアーゼを細胞膜に迅速にターゲティングするための誘導性の移行戦略である、精製タンパク質のマイクロインジェクション若しくはプロテオフェクション［２］又は細胞透過性細菌性毒素と融合した精製タンパク質の添加［３］などの既存の技法によってカバーされる。しかし、これらの技法は全て時間がかかり煩わしいものであり、我々の知見では、言及された基準の全てを満たすものではない。

【0003】

細菌は、タンパク質を標的細胞に直接注射するための異なる機構を進化させた［４］。エルシニア属、シゲラ属及びサルモネラ属のような細菌により使用されるＩＩＩ型分泌装置（Ｔ３ＳＳ）［５］は、いわゆる細菌エフェクタータンパク質を宿主細胞に注射するナノシリンジ様の機能を果たす。エフェクターと称される、Ｔ３ＳＳを介して分泌される細菌タンパク質は、低分子Ｎ末端分泌シグナルを有する［６］。細菌の内部では、一部のエフェクターにシャペロンが結合している。シャペロンは、毒性ドメインを遮蔽することが可能であり［７］、分泌シグナルの露出に寄与し［８、９］、また、基質を分泌コンピテントなコンフォメーションに維持し［１０］、したがって、分泌を容易にする。分泌が誘導されたら、Ｔ３ＳＳに隣接するＡＴＰアーゼによりシャペロンが除去され［１１］、エフェクターがアンフォールディングされて又は部分的にフォールディングされてニードルを通じて移動し［１０］、宿主細胞質においてもう一度フォールディングされる。

【0004】

Ｔ３ＳＳは、ハイブリッドペプチド及びタンパク質を標的細胞に送達するために活用されてきた。試験下の細菌が遺伝学ではほとんど利用できないもの（トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓなど；［１２］））である場合に、異種細菌Ｔ３ＳＳエフェクターが送達されてきた。多くの場合、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）アデニル酸シクラーゼ［１３］、マウスＤＨＦＲ［１０］又はリン酸化可能なタグ［１４］などの、Ｔ３ＳＳ依存性タンパク質送達についての試験要件に関して、レポータータンパク質が可能性のあるＴ３ＳＳ分泌シグナルと融合された。ペプチド送達は、主にワクチン接種を目的として行われた。これらとしては、ウイルスエピトープ［１５、１６］、細菌エピトープ（リステリオリジンＯ、［１７］）並びにヒトがん細胞のエピトープを表すペプチド［１８］が挙げられる。少数の場合には、宿主細胞を調節するために機能性真核生物タンパク質が送達され、これは、ナノボディ［１９］、核タンパク質（Ｃｒｅ−リコンビナーゼ、ＭｙｏＤ）［２０、２１］又はＩｌ１０及びＩＬ１ｒａ［２２］を用いてなされている。上記の系はいずれも、それぞれの場合において、１つ又は多数の内因性エフェクタータンパク質がなおコードされているので、単一タンパク質送達を可能にするものではない。さらに、使用されるベクターは、選択されたタンパク質をコードする他のＤＮＡ断片の単純なクローニングが可能になるようには設計されておらず、それにより、当該系の広範な適用が妨げられている。

【0005】

したがって、目的のタンパク質を生理的濃度でスケーラブルかつ迅速かつ同期的かつ均一かつ調整可能に送達することを可能にする安価かつ単純な方法が多くの細胞生物学者に大きな利益になろう。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、一般に、組換えグラム陰性菌株、及び、真核細胞に異種タンパク質を送達するためのその使用に関する。本発明は、ウイルスタンパク質の種々のＩＩＩ型エフェクター、しかし同様にＩＶ型エフェクター、及び最も重要なことに機能性真核生物タンパク質の移行を可能にするグラム陰性菌株及びその使用を提供する。送達を蛍光追跡するための手段、核に再局在化させるための手段、及び、特に宿主細胞への送達後に細菌付属物を除去するための手段が提供される。これにより、Ｔ３ＳＳのみを使用して、ほぼ天然タンパク質を真核細胞に送達することが初めて可能になる。提示されるＴ３ＳＳに基づく系により、目的のタンパク質のスケーラブルかつ迅速かつ同期的かつ均一かつ調整可能な送達がもたらされる。本発明の送達系は、生きている動物に真核生物タンパク質を注射するために適しており、治療目的で使用することができる。

【0007】

第１の態様では、本発明は、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属及びシュードモナス属からなる群から選択される組換えグラム陰性菌株であって、
５’から３’の方向に、
プロモーター、
前記プロモーターに作動可能に連結した細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルをコードする第１のＤＮＡ配列、及び
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合した、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質からなる群から選択される異種タンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列
を含むベクターを用いて形質転換された組換えグラム陰性菌株に関する。

【0008】

別の態様では、本発明は、５’から３’の方向に、
プロモーター、
前記プロモーターに作動可能に連結した細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルをコードする第１のＤＮＡ配列、
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合した異種タンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列、及び
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端と前記第２のＤＮＡ配列の５’末端の間に位置する、プロテアーゼ切断部位をコードする第３のＤＮＡ配列
を含むベクターを用いて形質転換された組換えグラム陰性菌株に関する。

【0009】

別の態様では、本発明は、組換えグラム陰性菌株がエルシニア属株であり、前記エルシニア属株が野生型であるか又は少なくとも１種のＴ３ＳＳエフェクタータンパク質の産生に関して欠損を有し、かつ、
５’から３’の方向に、
プロモーター、
前記プロモーターに作動可能に連結した、Ｙ．エンテロコリチカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）ＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端の１３８アミノ酸を含む細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルをコードする第１のＤＮＡ配列、及び
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合した異種タンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列
を含むベクターを用いて形質転換されたものである、組換えグラム陰性菌株に関する。

【0010】

別の態様では、本発明は、組換えグラム陰性菌株がサルモネラ属株であり、前記サルモネラ属株が野生型であるか又は少なくとも１種のＴ３ＳＳエフェクタータンパク質の産生に関して欠損を有し、かつ、
５’から３’の方向に、
プロモーター、
前記プロモーターに作動可能に連結した、Ｓ．エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）ＳｔｅＡエフェクタータンパク質又はＳ．エンテリカＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端の８１アミノ酸若しくは１０５アミノ酸を含む細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルをコードする第１のＤＮＡ配列、及び、
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合した異種タンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列
を含むベクターを用いて形質転換されたものである、組換えグラム陰性菌株に関する。

【0011】

別の態様では、本発明は、５’から３’の方向に、
プロモーター、
前記プロモーターに作動可能に連結した細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルをコードする第１のＤＮＡ配列、
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合した異種タンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列、及び
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端と前記第２のＤＮＡ配列の５’末端の間に位置する、プロテアーゼ切断部位をコードする第３のＤＮＡ配列
を含むベクターに関する。

【0012】

本発明は、さらに、真核細胞に異種タンパク質を送達するための方法であって、
ｉ）グラム陰性菌株を培養する工程と、
ｉｉ）真核細胞とｉ）のグラム陰性菌株を接触させる工程であり、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルと異種タンパク質とを含む融合タンパク質がグラム陰性菌株により発現され、真核細胞内に移行する工程と
を含む方法に関する。

【0013】

本発明は、さらに、真核細胞に異種タンパク質を送達するための方法であって、
ｉ）グラム陰性菌株を培養する工程と；
ｉｉ）真核細胞とｉ）のグラム陰性菌株を接触させる工程であり、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルと異種タンパク質とを含む融合タンパク質がグラム陰性菌株により発現され、真核細胞内に移行する工程と、
ｉｉｉ）融合タンパク質を切断し、したがって、異種タンパク質を細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルから切断する工程
を含む方法に関する。

【0014】

本発明は、さらに、異種タンパク質を精製する方法であって、グラム陰性菌株を培養し、したがって、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルと異種タンパク質とを含む融合タンパク質が発現され、培養物の上清中に分泌される工程を含む方法に関する。

【0015】

別の態様では、本発明は、グラム陰性菌株の発現ベクターの第２のＤＮＡ配列によりコードされる異種タンパク質がヒト又はマウスプロテインであり、グラム陰性菌株によって発現されるヒト又はマウスタンパク質それぞれのアミノ酸配列が異なる、グラム陰性菌株のライブラリーに関する。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】Ｔ３ＳＳタンパク質送達の特徴づけを示す図である。（Ａ）周囲の培地中へのＴ３ＳＳ依存性タンパク質分泌（インビトロ分泌）の略図（左側）又は真核細胞内へのＴ３ＳＳ依存性タンパク質分泌の略図（右側）である。Ｉは、３型分泌装置を示す。ＩＩは、周囲の培地中に分泌されたタンパク質を示し、ＩＩＩは、膜を通って真核細胞のサイトゾル（ＶＩＩ）内に移行したタンパク質である。ＶＩは、Ｔ３ＳＳが挿入される２つの細菌の膜のひと続き及びその下の細菌サイトゾルを示す。ＩＶは、ＹｏｐＥ_{１−１３８}Ｎ末端断片（Ｖ）に付着させた融合タンパク質である。（Ｂ）抗ＹｏｐＥ抗体を使用した、総細菌溶解物（ＩＶ）及び沈殿させた培養上清（Ｖ）に対するウェスタンブロット法によって明らかになった、Ｉ：Ｙ．エンテロコリチカＥ４０野生型、ＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ又はＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ｐＢａｄＳｉ＿２のインビトロ分泌を示す。

【図2】上皮細胞へのＴ３ＳＳタンパク質送達の特徴づけを示す図である。（Ａ）Ｉ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ又はＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ２を感染多重度１００で１時間にわたって感染させたＨｅＬａ細胞に対する抗Ｍｙｃ免疫蛍光染色を示す。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞内の、（Ａ）からの抗Ｍｙｃ免疫蛍光染色強度の数量化を示す。データはｎ＝２０部位からのデータを組み合わせたものであり、示されているエラーバーは平均の標準誤差である。Ｉ：感染させていない、ＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ又はＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ２。Ｙ軸は抗Ｍｙｃ染色強度［ａ．ｕ．］を示し、ｘ軸は感染の時間を分単位で示す。（Ｃ）細胞内での抗Ｍｙｃ免疫蛍光染色強度の数量化。ＨｅＬａ細胞に、Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ２をｘ軸に示されている感染多重度で１時間にわたって感染させた。データはｎ＝２０部位からのデータを組み合わせたものであり、示されているエラーバーは平均の標準誤差である。Ｙ軸は抗Ｍｙｃ染色強度［ａ．ｕ．］を示す。

【図3】Ｔ３ＳＳに基づくタンパク質送達の改変により、ＹｏｐＥ_{１−１３８}融合タンパク質（ＥＧＦＰ）の核局在化が可能になることを示す図である。プラスミドＩＩＩ：＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＥＧＦＰ又はＩＶ：＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＥＧＦＰ−ＮＬＳを有するＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ又はＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ ΔｙｏｐＢを感染多重度１００で感染させたＨｅＬａ細胞におけるＥＧＦＰシグナル。ＥＧＦＰシグナルが「ａ」に示されており、それに対して「ｂ」では局在化比較用核を染色したものである。

【図4】Ｔ３ＳＳに基づくタンパク質送達の改変により、ＹｏｐＥ_{１−１３８}付属物の除去が可能になることを示す図である。ＨｅＬａ細胞に、２種の異なるＹ．エンテロコリチカ株を同時に感染させ、これは、２種の細菌懸濁液を単純に混合することによってなされる。一方の株によりＹｏｐＥ_{１−１３８}と融合したＴＥＶプロテアーゼが送達され、他方の株により、二重ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含有するリンカーを用いてＹｏｐＥ_{１−１３８}と融合した目的のタンパク質が送達される。真核細胞にタンパク質が送達された後、ＴＥＶプロテアーゼによりＹｏｐＥ_{１−１３８}付属物が目的のタンパク質が切断される。（Ａ）感染させていないジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞（ＩＩ）、又は、ＩかつＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ｐＢａｄＳｉ＿２を用いて２時間にわたって感染させた（感染多重度１００）後のジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞、ＩかつＩＶ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−２×ＴＥＶ切断部位−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃを用いて２時間にわたって感染させた（感染多重度１００）後のジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞、ＩかつＶ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−２×ＴＥＶ切断部位−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃを用いて２時間にわたって感染させ（感染多重度１００）、精製ＴＥＶプロテアーゼを用いてさらに一晩処理した後のジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞、並びにＩかつＶＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−２×ＴＥＶ切断部位−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ及び第２の株＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＴＥＶを用いて２時間にわたって感染させた（感染多重度１００）後のジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞を、ＹｏｐＥ_{１−１３８}−２×ＴＥＶ切断部位−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ又はその切断型Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃの存在について、抗ＩＮＫ４Ｃでのウェスタンブロット法によって分析した（「ａ」に示されている）。ローディングコントロールとして抗アクチンでのウェスタンブロット法を実施した（「ｂ」に示されている）。１つの場合では（Ｖ）溶解させた細胞を精製ＴＥＶプロテアーゼと一緒に一晩インキュベートした。（Ｂ）完全長ＹｏｐＥ_{１−１３８}−２×ＴＥＶ切断部位−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃのサイズで、試料ＩＶを１００％に設定した、アクチンにより正規化した、（Ａ）からの抗ＩＮＫ４Ｃ染色強度の数量化（ｙ軸に［ａ．ｕ．］で示されている）。ＩかつＩＶ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−２×ＴＥＶ切断部位−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ、ＩかつＶ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−２×ＴＥＶ切断部位−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ、精製ＴＥＶプロテアーゼを用いてさらに一晩処理、並びにＩかつＶＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−２×ＴＥＶ切断部位−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ及び第２の株＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＴＥＶ。ｎ＝２の独立した実験からのデータを組み合わせた。示されているエラーバーは平均の標準誤差である（Ｃ）感染させていないジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞（ＩＩ）、又は、ＩかつＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ｐＢａｄＳｉ＿２を用いて２時間にわたって感染させた（感染多重度１００）後のジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞、ＩかつＩＶ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−２×ＴＥＶ切断部位−ＥＴ１−Ｍｙｃを用いて２時間にわたって感染させた（感染多重度１００）後のジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞、ＩかつＶ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−２×ＴＥＶ切断部位−ＥＴ１−Ｍｙｃを用いて２時間にわたって感染させ（感染多重度１００）、精製ＴＥＶプロテアーゼを用いてさらに一晩処理した後のジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞、並びにＩかつＶＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−２×ＴＥＶ切断部位−ＥＴ１−Ｍｙｃ及び第２の株＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＴＥＶを用いて２時間にわたって感染させた（感染多重度１００）後のジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞を、ＹｏｐＥ_{１−１３８}−２×ＴＥＶ切断部位−ＥＴ１−Ｍｙｃ又はその切断型ＥＴ１−Ｍｙｃの存在について、抗Ｍｙｃでのウェスタンブロット法によって分析した（「ａ」に示されている）。ローディングコントロールとして、抗アクチンでのウェスタンブロット法を実施した（「ｂ」に示されている）。１つの場合では（Ｖ）、溶解させた細胞を精製ＴＥＶプロテアーゼと一緒に一晩インキュベートした。

【図5】真核細胞への細菌エフェクタータンパク質の送達を示す図である。（Ａ）ＨｅＬａ細胞に、ＩＩ：ｐＢａｄ＿Ｓｉ２又はＩＩＩ：ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＳｏｐＥを有するＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄを感染多重度１００で画像の上に示されている時間（２分、１０分又は６０分）にわたって感染させた。固定後、細胞をアクチン細胞骨格について染色した。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞を感染させていないままにした（ＩＩ）、又は、ＩＩＩ：ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＳｏｐＥ−Ｍｙｃを有するＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄを感染させ、いくつかの場合には、ＩＶ：ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＳｐｔＰを同時感染させた。感染多重度は株の下に示されている通りであり（感染多重度５０、感染多重度５０：感染多重度５０、又は感染多重度５０：感染多重度１００）、時間は１時間であった。固定後、細胞をアクチン細胞骨格について染色し（「ａ」に示されている）、ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＳｏｐＥ−Ｍｙｃ融合タンパク質の存在を抗Ｍｙｃでの染色によって追跡した（「ｂ」に示されている）。

【図6】真核細胞への細菌エフェクタータンパク質の送達を示す図である（Ａ）リン酸化ｐ３８（「ａ」）、総ｐ３８（「ｂ」）及びアクチン（「ｃ」）無処理のままにしたＨｅＬａ細胞（ＩＩ）、又は、ＩＩＩ：ｐＢａｄ＿Ｓｉ２又はＩＶ：ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＯｓｐＦを有するＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄを感染多重度１００で７５分にわたって感染させたＨｅＬａ細胞に対するウェスタンブロット分析。細胞を、示されている通り感染の最後の３０分にわたってＴＮＦαを用いて刺激した（＋はＴＮＦαの添加を表し、−はＴＮＦαを用いた処理を行わなかったことを示す）。（Ｂ）無処理のままにしたＨｅＬａ細胞（ＩＩ）、又は、ＩＩＩ：ｐＢａｄ＿Ｓｉ２、ＩＶ：ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＳｏｐＥ又はＶ：ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＳｏｐＢを有するＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄを感染多重度１００で２２．５分又は４５分（プロットの下に示されている）にわたって感染させたＨｅＬａ細胞に対する、リン酸化Ａｋｔ Ｔ３０８（「ａ」）及びＳ４７３（「ｂ」）及びアクチン（「ｃ」）ウェスタンブロット分析。（Ｃ）無処理のままにしたＨｅＬａ細胞（Ｉ）、又は、Ｖ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＢｅｐＡ、ＶＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＢｅｐＡ_{Ｅ３０５−ｅｎｄ}、ＶＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＢｅｐＧ_Ｂｉｄ又はＶＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ２を感染多重度１００で２．５時間にわたって感染させたＨｅＬａ細胞における、ｃＡＭＰレベル（ｙ軸にｆｍｏｌ／ウェルの単位で示されている）を示す。コレラ毒素（ＣＴ）をポジティブコントロールとして１時間にわたって試料ＩＩ（１μｇ／ｍｌ）、ＩＩＩ（２５μｇ／ｍｌ）又はＩＶ（５０μｇ／ｍｌ）に添加した。ｎ＝３の独立した実験からのデータを組み合わせ、示されているエラーバーは平均の標準誤差である。対応のない両側ｔ検定を使用して統計解析を実施した（ｎｓは有意な変化がないことを示し、＊＊はｐ値＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ値＜０．００１を示す）。

【図7】真核細胞へのヒトｔＢｉｄの送達により大規模なアポトーシスが誘導されることを示す図である。（Ａ）無処理のままにしたＨｅＬａ細胞（ＩＩ）、又は、ＩＩＩ：ｐＢａｄ＿Ｓｉ２、ＩＶ：ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｂｉｄ又はＶ：ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ｔ−Ｂｉｄを有するＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄを感染多重度１００で６０分にわたって感染させたＨｅＬａ細胞に対する切断カスパーゼ３ ｐ１７（「ａ」）及びアクチン（「ｂ」）ウェスタンブロット分析。いくつかの場合には、細胞を、ＶＩ：０．５μＭのスタウロスポリン又はＶＩＩ：１μＭのスタウロスポリンを用いて処理した。（Ｂ）無処理のままにしたジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞（ＩＩ）、又は、ＩＩＩ：ｐＢａｄ＿Ｓｉ２、ＩＶ：ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｂｉｄ又はＶ：ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ｔ−Ｂｉｄを有するＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄを感染多重度１００で１時間にわたって感染させた後のジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞を抗Ｂｉｄでのウェスタンブロット法によって分析し（「ａ」）、それにより、内因性Ｂｉｄレベル（Ｚ印）と移行したＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｂｉｄレベル（Ｘ印）又はＹｏｐＥ_{１−１３８}−ｔＢｉｄレベル（Ｙ印）の比較を可能にした。ローディングコントロールとして、抗アクチンでのウェスタンブロット法を実施した（「ｂ」に示されている）。いくつかの場合には、細胞を、ＶＩ：０．５μＭのスタウロスポリン又はＶＩＩ：１μＭのスタウロスポリンを用いて処理した。（Ｃ）ＨｅＬａ細胞を無処理のままにした（Ｉ）、又は、ＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ２、ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｂｉｄ、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ｔＢｉｄを感染多重度１００で１時間にわたって感染させた。いくつかの場合には、細胞を、Ｖ：０．５μＭのスタウロスポリン又はＶＩ：１μＭのスタウロスポリンを用いて処理した。固定後、細胞をアクチン細胞骨格について染色した（灰色）。

【図8】ゼブラフィッシュＢＩＭのＴ３ＳＳ依存性送達により、ゼブラフィッシュ胚におけるアポトーシスが誘導されることを示す図である。（Ａ）２ｄｐｆのゼブラフィッシュ胚に、ＥＧＦＰを発現するＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ１コントロール株（Ｉ）又はｚＢＩＭを移行させる株（ＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ｚＢＩＭ）を、細菌約４００個を後脳領域に注射することによって感染させた。５．５時間後、胚を固定し、活性化カスパーゼ３について染色し（切断カスパーゼ３、ｐ１７；「ｃ」に示されている）、細菌の存在について分析した（ＥＧＦＰシグナル、「ｂ」に示されている）。最大値ｚ投影（ｍａｘｉｍｕｍ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｚ ｐｒｏｊｙｅｃｔｉｏｎ）が蛍光画像で示されている。明視野ｚ投影（ｂｒｉｇｈｔ−ｆｉｅｌｄ ｚ ｐｒｏｊｙｅｃｔｉｏｎ）が「ａ」に示されている。（Ｂ）（Ａ）の記録されたｚスタック画像の最大値ｚ投影に対する自動画像解析。簡単に述べると、細菌をＧＦＰチャネルによって検出した。細菌斑点の各領域の周囲に半径１０ピクセルの円を創出した。重複する領域を接しているメンバーの間で同等に分割した。細菌を密接に取り囲むこれらの領域において、カスパーゼ３ ｐ１７染色強度を測定し、ｙ軸にプロットした（［ａ．ｕ．］として）。マン・ホイットニー検定を使用して統計解析を実施した（＊＊＊はｐ値＜０．００１を示す）。Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ１コントロール株（Ｉ）についてｎ＝１４、又はＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ｚＢＩＭを感染させた動物についてｎ＝１９からのデータを組み合わせ、示されているエラーバーは平均の標準誤差である。

【図9】ｔＢｉＤ依存性リン酸化プロテオームを示す図である。ＨｅＬａ細胞にＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ｔ−Ｂｉｄを感染多重度１００で、及び、対照としてＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ２を３０分にわたって感染させた。（Ａ）ｔＢＩＤリン酸化プロテオームのグラフ表示である。ｔＢｉｄ依存的に有意に調節されたリンペプチドを含有するタンパク質（灰色）（ｑ値＜０．０１）並びに公知のアポトーシス関連タンパク質（濃い灰色）が公知のタンパク質間相互作用及び予測されるタンパク質間相互作用のＳＴＲＩＮＧネットワークで表されている（高信頼度、スコア０．７）。ＳＴＲＩＮＧ内で少なくとも１つのつながりを有するタンパク質のみが表されている。（Ｂ）Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ２（Ｉ）又はＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ｔ−Ｂｉｄ（ＩＩ）のいずれかを感染させたＨｅＬａ細胞の共焦点像により、ｔＢｉｄ送達でアポトーシス性表現型が誘導されることが示される。細胞を、核についてヘキストを用いて（「ａ」）、Ｆ−アクチンについてファロイジンを用いて（「ｂ」）、チューブリンについて抗チューブリン抗体を用いて（「ｃ」）、及びミトコンドリアについてミトトラッカーを用いて（「ｄ」）染色した。スケールバーは４０μｍを表す。

【図10】ＩＩＩ型分泌に基づく送達ツールボックスについて記載した図である。（Ａ）ＹｏｐＥ_{１−１３８}との融合構築物を生成するために使用するクローニングプラスミドｐＢａｄ＿Ｓｉ１及びｐＢａｄ＿Ｓｉ２のベクターマップである_。シャペロンＳｙｃＥ及びＹｏｐＥ_{１−１３８}融合物は天然Ｙ．エンテロコリチカプロモーター下にある。２種のプラスミドは、ｐＢａｄ＿Ｓｉ１にはアラビノース誘導性ＥＧＦＰが存在することのみが異なる。（Ｂ）ｐＢａｄ＿Ｓｉ１プラスミド及びｐＢａｄ＿Ｓｉ２プラスミド上のｙｏｐＥ１−１３８断片のすぐ後ろにある多重クローニング部位である。

【図11】種々の細胞株へのＴ３ＳＳタンパク質送達の特徴づけを示す図である。無処理のままにした（ＩＩ）、又は、Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ２（Ｉ）を画像の上に示されている感染多重度（感染多重度２５、５０、１００、２００、及びＨＵＶＥＣについては４００）で１時間にわたって感染させた、スイス３Ｔ３線維芽細胞（「ａ」）、ジャーカット細胞（「ｂ」）及びＨＵＶＥＣ細胞（「ｃ」）に対する抗Ｍｙｃ免疫蛍光染色。

【図12】真核細胞への細菌エフェクタータンパク質の送達のＴ３ＳＳ依存性を示す図である。Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄΔｙｏｐＢ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＳｏｐＥ−Ｍｙｃ（Ｉ）又はＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＳｏｐＥ−Ｍｙｃ（ＩＩ）を感染多重度１００でブロットの上に示されている時間（０分、５分、１５分、１０分、６０分及び１２０分）にわたって感染させた後のジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞を抗Ｍｙｃでのウェスタンブロット法によって分析した。ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＳｏｐＥ−Ｍｙｃに対応するサイズが「ａ」で示され、内因性ｃ−Ｍｙｃタンパク質のサイズが「ｂ」で示されている。

【図13】培養上清中への種々の他のタンパク質のＴ３ＳＳ依存性分泌を示す図である。Ｉ：示されているタンパク質と融合したＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}インビトロ分泌実験。総細菌溶解物のタンパク質含有量（「Ａ」）及び沈殿させた培養上清のタンパク質含有量（「Ｂ」）を、抗ＹｏｐＥ抗体を使用したウェスタンブロット法によって分析した。記載されている数字は、対応する高さで分子量をｋＤａ単位で示す。

【図14】培養上清中への種々の他のタンパク質のＴ３ＳＳ依存性分泌を示す図である。Ｉ：示されているタンパク質と融合したＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}インビトロ分泌実験。総細菌溶解物のタンパク質含有量（「Ａ」）及び沈殿させた培養上清のタンパク質含有量（「Ｂ」）を、抗ＹｏｐＥ抗体を使用したウェスタンブロット法によって分析した。記載されている数字は、対応する高さで分子量をｋＤａ単位で示す。

【図15A】本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株を示す図である。バックグラウンド株、プラスミド、及び、対応するプラスミド上にコードされるＴ３ＳＳ依存性送達するためのタンパク質に関する情報を提供する、本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株の一覧である。さらに、対応するプラスミドの構築ために使用されるオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報が提供される。

【図15B】本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株を示す図である。バックグラウンド株、プラスミド、及び、対応するプラスミド上にコードされるＴ３ＳＳ依存性送達するためのタンパク質に関する情報を提供する、本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株の一覧である。さらに、対応するプラスミドの構築ために使用されるオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報が提供される。

【図15C】本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株を示す図である。バックグラウンド株、プラスミド、及び、対応するプラスミド上にコードされるＴ３ＳＳ依存性送達するためのタンパク質に関する情報を提供する、本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株の一覧である。さらに、対応するプラスミドの構築ために使用されるオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報が提供される。

【図15D】本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株を示す図である。バックグラウンド株、プラスミド、及び、対応するプラスミド上にコードされるＴ３ＳＳ依存性送達するためのタンパク質に関する情報を提供する、本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株の一覧である。さらに、対応するプラスミドの構築ために使用されるオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報が提供される。

【図15E】本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株を示す図である。バックグラウンド株、プラスミド、及び、対応するプラスミド上にコードされるＴ３ＳＳ依存性送達するためのタンパク質に関する情報を提供する、本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株の一覧である。さらに、対応するプラスミドの構築ために使用されるオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報が提供される。

【図15F】本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株を示す図である。バックグラウンド株、プラスミド、及び、対応するプラスミド上にコードされるＴ３ＳＳ依存性送達するためのタンパク質に関する情報を提供する、本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株の一覧である。さらに、対応するプラスミドの構築ために使用されるオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報が提供される。

【図15G】本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株を示す図である。バックグラウンド株、プラスミド、及び、対応するプラスミド上にコードされるＴ３ＳＳ依存性送達するためのタンパク質に関する情報を提供する、本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株の一覧である。さらに、対応するプラスミドの構築ために使用されるオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報が提供される。

【図15H】本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株を示す図である。バックグラウンド株、プラスミド、及び、対応するプラスミド上にコードされるＴ３ＳＳ依存性送達するためのタンパク質に関する情報を提供する、本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株の一覧である。さらに、対応するプラスミドの構築ために使用されるオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報が提供される。

【図15I】本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株を示す図である。バックグラウンド株、プラスミド、及び、対応するプラスミド上にコードされるＴ３ＳＳ依存性送達するためのタンパク質に関する情報を提供する、本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株の一覧である。さらに、対応するプラスミドの構築ために使用されるオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報が提供される。

【図15J】本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株を示す図である。バックグラウンド株、プラスミド、及び、対応するプラスミド上にコードされるＴ３ＳＳ依存性送達するためのタンパク質に関する情報を提供する、本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株の一覧である。さらに、対応するプラスミドの構築ために使用されるオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報が提供される。

【図15K】本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株を示す図である。バックグラウンド株、プラスミド、及び、対応するプラスミド上にコードされるＴ３ＳＳ依存性送達するためのタンパク質に関する情報を提供する、本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株の一覧である。さらに、対応するプラスミドの構築ために使用されるオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報が提供される。

【図15L】本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株を示す図である。バックグラウンド株、プラスミド、及び、対応するプラスミド上にコードされるＴ３ＳＳ依存性送達するためのタンパク質に関する情報を提供する、本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株の一覧である。さらに、対応するプラスミドの構築ために使用されるオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報が提供される。

【図15M】本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株を示す図である。バックグラウンド株、プラスミド、及び、対応するプラスミド上にコードされるＴ３ＳＳ依存性送達するためのタンパク質に関する情報を提供する、本試験において使用するＹ．エンテロコリチカ株及びＳ．エンテリカ株の一覧である。さらに、対応するプラスミドの構築ために使用されるオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報が提供される。

【図16】図１６：Ｂ１６Ｆ１０細胞へのマウスｔＢｉｄ、マウスＢｉｄ ＢＨ３及びマウスＢａｘ ＢＨ３の送達により大規模なアポトーシスが誘導されることを示す図である。感染させていないＢ１６Ｆ１０細胞（Ｉ）、又は、ＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ｐＢａｄＳｉ＿２、ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｙ．エンテロコリチカコドン最適化マウスｔＢｉｄ、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｙ．エンテロコリチカコドン最適化マウスＢｉｄ ＢＨ３若しくはＶ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｙ．エンテロコリチカコドン最適化マウスＢａｘ ＢＨ３を２．５時間にわたって感染（感染多重度５０）させた後のＢ１６Ｆ１０細胞。固定後、細胞をアクチン細胞骨格及び核について染色した（どちらも灰色）。

【図17】Ｄ２Ａ１細胞へのマウスｔＢｉｄ、マウスＢｉｄ ＢＨ３及びマウスＢａｘ ＢＨ３の送達により大規模なアポトーシスが誘導されることを示す図である。感染させていないＤ２Ａ１細胞（Ｉ）、又は、ＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ｐＢａｄＳｉ＿２、ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｙ．エンテロコリチカコドン最適化マウスｔＢｉｄ、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｙ．エンテロコリチカコドン最適化マウスＢｉｄ ＢＨ３若しくはＶ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｙ．エンテロコリチカコドン最適化マウスＢａｘ ＢＨ３を２．５時間にわたって感染（感染多重度５０）させた後のＤ２Ａ１細胞。固定後、細胞をアクチン細胞骨格及び核について染色した（どちらも灰色）。

【図18】ＨｅＬａ細胞へのマウスｔＢｉｄ、マウスＢｉｄ ＢＨ３及びマウスＢａｘ ＢＨ３の送達により大規模なアポトーシスが誘導されることを示す図である。感染させていないＨｅＬａ細胞（Ｉ）、又は、ＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ｐＢａｄＳｉ＿２、ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｙ．エンテロコリチカコドン最適化マウスｔＢｉｄ、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｙ．エンテロコリチカコドン最適化マウスＢｉｄ ＢＨ３若しくはＶ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｙ．エンテロコリチカコドン最適化マウスＢａｘ ＢＨ３を２．５時間にわたって感染（感染多重度５０）させた後のＨｅＬａ細胞。固定後、細胞をアクチン細胞骨格及び核について染色した（どちらも灰色）。

【図19】４Ｔ１細胞へのマウスｔＢｉｄ、マウスＢｉｄ ＢＨ３及びマウスＢａｘ ＢＨ３の送達により大規模なアポトーシスが誘導されることを示す図である。感染させていない４Ｔ１細胞（Ｉ）、又は、ＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ｐＢａｄＳｉ＿２、ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｙ．エンテロコリチカコドン最適化マウスｔＢｉｄ、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｙ．エンテロコリチカコドン最適化マウスＢｉｄ ＢＨ３若しくはＶ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｙ．エンテロコリチカコドン最適化マウスＢａｘ ＢＨ３を２．５時間にわたって感染（感染多重度５０）させた後の４Ｔ１細胞。固定後、細胞をアクチン細胞骨格及び核について染色した（どちらも灰色）。

【図20】ＳＰＩ−１ Ｔ３ＳＳ誘導条件下で増殖させたＳ．エンテリカによる真核細胞へのマウスｔＢｉｄの送達によりアポトーシスが誘導されることを示す図である。無処理のままにしたＨｅＬａ細胞（Ｉ）、又は、ＩＶ：ＳｔｅＡ_１−２０−ｔ−Ｂｉｄ、Ｖ：ＳｔｅＡ_ＦＬ−Ｂｉｄ、ＶＩ：ＳｏｐＥ_１−８１−ｔ−Ｂｉｄ若しくはＶＩＩ：ＳｏｐＥ_{１−１０５}−ｔ−Ｂｉｄを有するＩＩＩ：Ｓ．エンテリカａｒｏＡを感染多重度１００で４時間にわたって感染させたＨｅＬａ細胞に対する切断カスパーゼ３ ｐ１７ウェスタンブロット分析。本実験に関しては、Ｓ．エンテリカａｒｏＡ株は全てＳＰＩ−１ Ｔ３ＳＳ誘導条件下で増殖させたものであった。いくつかの場合には、細胞を、ＩＩ：１μＭのスタウロスポリンを用いて処理した。記載されている数字は、対応する高さで分子量をｋＤａ単位で示す。

【図21】ＳＰＩ−２ Ｔ３ＳＳ誘導条件下で増殖させたＳ．エンテリカによる真核細胞へのマウスｔＢｉｄの送達によりアポトーシスが誘導されることを示す図である。無処理のままにしたＨｅＬａ細胞（Ｉ）、又は、ＩＶ：ＳｔｅＡ_１−２０−ｔ−Ｂｉｄ、Ｖ：ＳｔｅＡ_ＦＬ−Ｂｉｄ、ＶＩ：ＳｏｐＥ_１−８１−ｔ−Ｂｉｄ若しくはＶＩＩ：ＳｏｐＥ_{１−１０５}−ｔ−Ｂｉｄを有するＩＩＩ：Ｓ．エンテリカａｒｏＡを感染多重度１００で４時間にわたって感染させたＨｅＬａ細胞に対する切断カスパーゼ３ ｐ１７ウェスタンブロット分析。本実験に関しては、Ｓ．エンテリカａｒｏＡ株は全てＳＰＩ−２ Ｔ３ＳＳ誘導条件下で増殖させたものであった。いくつかの場合には、細胞を、ＩＩ：１μＭのスタウロスポリンを用いて処理した。記載されている数字は、対応する高さで分子量をｋＤａ単位で示す。

【図22】培養上清中への種々の細胞周期タンパク質のＳ．エンテリカＴ３ＳＳ依存性分泌を示す図である。Ｓ．エンテリカａｒｏＡ＋以下に列挙するタンパク質と融合したＳｔｅＡ_ＦＬ（Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ）又はＳｏｐＥ_{１−１０５}（ＩＩ、ＩＶ、ＶＩ、ＶＩＩＩ）のいずれかのインビトロ分泌実験。Ｉ及びＩＩ：Ｉｎｋ４ａ−ＭｙｃＨｉｓ；ＩＩＩ及びＩＶ：Ｉｎｋ４ｃ−ＭｙｃＨｉｓ；Ｖ及びＶＩ：Ｍａｄ２−ＭｙｃＨｉｓ；ＶＩＩ及びＶＩＩＩ：Ｃｄｋ１−ＭｙｃＨｉｓ。沈殿させた培養上清のタンパク質含有量（「Ａ」）及び総細菌溶解物のタンパク質含有量（「Ｂ」）を、抗ｍｙｃ抗体を使用したウェスタンブロット法によって分析した。記載されている数字は、対応する高さで分子量をｋＤａ単位で示す。

【図23】培養上清中への種々の公知の細胞周期干渉ペプチドのＴ３ＳＳ依存性分泌を示す図である。以下に列挙するペプチドと融合したＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ２．、ＩＩ−ＶＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}のインビトロ分泌実験：ＩＩ：Ｉｎｋ４Ａ_{８４−１０３}；ＩＩＩ：ｐ１０７／ＲＢＬ１_{６５７−６６２}；ＩＶ：ｐ２１_{１４１−１６０Ｄ１４９Ａ}；Ｖ：ｐ２１_{１４５−１６０Ｄ１４９Ａ}；ＶＩ：ｐ２１_{１７−３３}；ＶＩＩ：サイクリンＤ２_{１３９−１４７}。沈殿させた培養上清のタンパク質含有量（「Ａ」）及び総細菌溶解物のタンパク質含有量（「Ｂ」）を、抗ＹｏｐＥ抗体を使用したウェスタンブロット法によって分析した。記載されている数字は、対応する高さで分子量をｋＤａ単位で示す。

【図24】Ｔ３ＳＳにより送達されるタンパク質とユビキチンの融合によりＹｏｐＥ_{１−１３８}付属物の除去が可能になることを示す図である。ＨｅＬａ細胞に、ユビキチンと直接融合したＹｏｐＥ_{１−１３８}（ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｕｂｉ）と融合した目的のタンパク質を送達する株を感染させる。真核細胞にタンパク質が送達された後、内因性ユビキチン特異的プロテアーゼにより、ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｕｂｉ付属物が目的のタンパク質から切断される。感染させていないジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞（Ｉ）、又は、ＩＩ：Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓ若しくはＩＩＩ：＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｆｌａｇ−ユビキチン−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓを１時間にわたって感染（感染多重度１００）させた後のジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞を、ＩＶ：ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｆｌａｇ−ユビキチン−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓ又はＶ：ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓ、切断された形態であるＶＩ：ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓ及びＶＩＩ：内因性ＩＮＫ４Ｃの存在について抗ＩＮＫ４Ｃでのウェスタンブロット法によって分析した。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明は、組換えグラム陰性菌株及び真核細胞に異種タンパク質を送達するためのその使用を提供する。

【0018】

本明細書を解釈するために、以下の定義を適用し、適切な場合には、単数形で使用される用語には複数形も含まれ、逆もまた同じである。本明細書において使用される用語法は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定的なものではないことが理解されるべきである。

【0019】

「グラム陰性菌株」という用語は、本明細書で使用される場合、以下の細菌を含む：エロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、エロモナス・ベローニ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｖｅｒｏｎｉｉ）、アネロミクソバクター・デハロゲナンス（Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、パラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、クラミジア・ムリダルム（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｍｕｒｉｄａｒｕｍ）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミドフィラ・アボルタス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、シトロバクター・ローデンチウム（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）、デスルホビブリオ・ブルガリス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、エドワージエラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ）、エンドゾイコモナス・エリシコラ（Ｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓ ｅｌｙｓｉｃｏｌａ）、火傷病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、エシェリキア・アルベルティ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、メソルヒゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）、ミキソコッカス・ザンサス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、フォトバクテリウム・ダムセラ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｍｓｅｌａｅ）、フォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、ドトラブダス・テムペラテ（Ｐｈｏｔｏｒａｂｄｕｓ ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）、シュードアルテロモナス・スポンギアエ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐｏｎｇｉａｅ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プレコグロシシダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）、青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、リゾビウム属の種、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）及び他のサルモネラ属の種、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）及び他のシゲラ属の種、ソダリス・グロシニジウス（Ｓｏｄａｌｉｓ ｇｌｏｓｓｉｎｉｄｉｕｓ）、ビブリオ・アルギノリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオ・アズレウス（Ｖｉｂｒｉｏ ａｚｕｒｅｕｓ）、ビブリオ・カンベリー（Ｖｉｂｒｉｏ ｃａｍｐｂｅｌｌｉｉ）、ビブリオ・カリベンチクス（Ｖｉｂｒｉｏ ｃａｒｉｂｂｅｎｔｈｉｃｕｓ）、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙ）、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオ・タスマニエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ）、ビブリオ・ツビアシ（Ｖｉｂｒｉｏ ｔｕｂｉａｓｈｉｉ）、かいよう病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ）、ザントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、イネ白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ）、腸炎エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、仮性結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）。本発明の好ましいグラム陰性菌株は、腸内細菌科及びシュードモナス科に含まれるグラム陰性菌株である。本発明のグラム陰性菌株は、インビトロ及びインビボにおいて細菌Ｔ３ＳＳによって真核細胞に異種タンパク質を送達するために一般に使用される。

【0020】

「組換えグラム陰性菌株」という用語は、本明細書で使用される場合、ベクターを用いて遺伝的に形質転換したグラム陰性菌株を指す。本発明の有用なベクターは、例えば、発現ベクター、染色体若しくは病原性プラスミド挿入のためのベクター又は染色体若しくは病原性プラスミド挿入のためのＤＮＡ断片である。

【0021】

「増殖に必須のアミノ酸の産生に関して欠損を有するグラム陰性菌株」及び「栄養要求突然変異体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、少なくとも１種の外因的にもたらされる必須アミノ酸又はその前駆体が存在しないと増殖することができないグラム陰性菌株を指す。当該株が産生に関して欠損を有するアミノ酸は、例えば、アスパラギン酸、メソ−２，６−ジアミノピメリン酸、芳香族アミノ酸又はロイシン−アルギニンである［２３］。そのような株は、例えばアスパラギン酸−ベータ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失（Δａｓｄ）によって生成することができる。そのような栄養要求突然変異体は、外因性メソ−２，６−ジアミノピメリン酸が存在しないと増殖することができない［２４］。本発明では、本発明の増殖に必須のアミノ酸の産生に関して欠損を有するグラム陰性菌株に関しては、突然変異、例えばアスパラギン酸−ベータ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失が好ましい。

【0022】

「真核細胞表面又は細胞外マトリックスに結合する接着タンパク質の産生に関して欠損を有するグラム陰性菌株」という用語は、対応する野生型株によって発現される接着タンパク質と比較して少なくとも１種の接着タンパク質を発現しない突然変異グラム陰性菌株を指す。接着タンパク質としては、例えば、線毛（ｐｉｌｉ）／フィンブリア（ｆｉｍｂｒｉａｅ）アドヘシン又は非フィンブリアアドヘシンのような伸長ポリマー接着分子を挙げることができる。フィンブリアアドヘシンとしては、１型線毛（例えば、ＦｉｍＨアドヘシンを有する大腸菌Ｆｉｍ線毛など）、Ｐ線毛（例えば、大腸菌由来のＰａｐＧアドヘシンを有するＰａｐ線毛など）、４型線毛（例えば緑膿菌に由来するピリンタンパク質など）又はｃｕｒｌｉ（Ｓ．エンテリカ由来のＣｓｇＡアドヘシンを有するＣｓｇタンパク質）が挙げられる。非フィンブリアアドヘシンとしては、Ｙ．エンテロコリチカ由来のＹａｄＡ、ＢｐａＡ（類鼻疽菌（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ））、Ｈｉａ（インフルエンザ菌（Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、ＢａｄＡ（Ｂ．ヘンセラ（Ｂ． ｈｅｎｓｅｌａｅ））、ＮａｄＡ（髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））又はＵｓｐＡ１（Ｍ．カタラーリス（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ））などの三量体自己輸送体アドヘシン、並びにＡＩＤＡ−１（大腸菌）などの他の自己輸送体アドヘシン、並びに、Ｙ．エンテロコリチカ由来のＩｎｖＡ又はインチミン（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））又はＤｒファミリー又はＡｆａファミリーのメンバー（大腸菌）などの他のアドヘシン／インベイシンが挙げられる。ＹａｄＡ及びＩｎｖＡという用語は、本明細書で使用される場合、Ｙ．エンテロコリチカに由来するタンパク質を指す。自己輸送体ＹａｄＡ［２５、２６］は異なる型のコラーゲン並びにフィブロネクチンに結合し、一方、インベイシンＩｎｖＡ［２７−２９］は真核細胞膜においてβ−インテグリンに結合する。グラム陰性菌株がＹ．エンテロコリチカ株である場合、当該株はＩｎｖＡ及び／又はＹａｄＡの欠損を有することが好ましい。

【0023】

本明細書で使用される場合、「腸内細菌科」という用語は、土壌、水、植物、及び動物において見いだされるグラム陰性、桿状、通性嫌気性の細菌の科を含み、これは、脊椎動物における病原体として頻繁に生じる。この科の細菌は、同様の生理学的性質を共有し、それぞれのゲノムの機能性エレメント及び遺伝子の間の保存が実証されている。オキシダーゼ陰性であるだけでなく、この科のメンバーの全てがグルコース発酵体であり、大多数が硝酸還元体である。

【0024】

本発明の腸内細菌科細菌は、その科の任意の細菌であってよく、具体的には、これだけに限定されないが、以下の属の細菌を含む：大腸菌属、シゲラ属、エドワジエラ属、サルモネラ属、シトロバクター属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、セラチア属、プロテウス属、エルウイニア属、モルガネラ属、プロビデンシア属、又はエルシニア属。より具体的な実施形態では、細菌は、大腸菌、エシェリキア・ブラタエ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｂｌａｔｔａｅ）、エシェリキア・フェルグソニー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）、エシェリキア・ヘルマニー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｈｅｒｍａｎｉｉ）、エシェリキア・ブルネリス（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｖｕｌｎｅｒｉｓ）、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・ボンゴリ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｂｏｎｇｏｒｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ・フレックスネリ、シゲラ・ボイディ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ）、シゲラ・ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・ゲルゴビエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｅｒｇｏｖｉａｅ）、エンテロバクター・サカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、仮性結核菌、ペスト菌、腸炎エルシニア、火傷病菌、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロテウス・ペンネリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｐｅｎｎｅｒｉ）、プロテウス・ハウセリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｈａｕｓｅｒｉ）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、又はモルガン菌（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）の種の細菌である。

【0025】

グラム陰性菌株は、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属、シゲラ属、シュードモナス属、クラミジア、エルウイニア属、パントエア属、ビブリオ属、バークホルデリア属、ラルストニア属、ザントモナス属、クロモバクテリウム属、ソダリス属、シトロバクター属、エドワジエラ属、リゾビア属、エロモナス属、フォトラブダス属、ボルデテラ属及びデスルホビブリオ属からなる群から選択されることが好ましく、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属、及びシュードモナス属からなる群から選択されることがより好ましく、エルシニア属及びサルモネラ属からなる群から選択されることが最も好ましい。

【0026】

「エルニシア属」という用語は、本明細書で使用される場合、腸炎エルシニア、仮性結核菌及びペスト菌を含めたエルシニア属の全ての種を含む。腸炎エルシニアが好ましい。

【0027】

「サルモネラ属」という用語は、本明細書で使用される場合、サルモネラ・エンテリカ及びＳ．ボンゴリ（Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉ）を含めたサルモネラ属の全ての種を含む。サルモネラ・エンテリカが好ましい。

【0028】

「プロモーター」とは、本明細書で使用される場合、転写単位の発現を調節する核酸配列を指す。「プロモーター領域」とは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流の（３’方向）コード配列の転写を開始させることができる調節領域である。プロモーター領域内には、転写開始部位（簡便にはヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって定義される）、並びに推定−３５領域及びプリブノーボックスなどの、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合性ドメイン（コンセンサス配列）が見いだされる。「動作可能に連結された」という用語は、２つのＤＮＡ領域間の関係を説明する場合、単にそれらが互いと機能的に関連し、同じ核酸断片上に位置することを意味する。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御し、当該遺伝子と同じ核酸断片上に位置していれば、当該遺伝子に作動可能に連結されている。通常、プロモーターは、前記グラム陰性菌株において機能するものである、すなわち、プロモーターは、本発明の融合タンパク質を発現させることができる、すなわち、プロモーターは、さらなる遺伝子工学又はさらなるタンパク質の発現を伴わずに本発明の融合タンパク質を発現させることができる。さらに、機能性プロモーターは、細菌Ｔ３ＳＳに対して天然に逆調節されてはならない。

【0029】

「送達」という用語は、本明細書で使用される場合、組換えグラム陰性菌株において異種タンパク質を発現させる工程と、そのようなグラム陰性菌株から発現されたタンパク質（一又は複数）を分泌させる工程と、そのようなグラム陰性菌株により分泌タンパク質（一又は複数）を真核細胞のサイトゾルに移行させる工程とを含む、組換えグラム陰性菌株から真核細胞へのタンパク質の輸送を指す。したがって、「送達シグナル」又は「分泌シグナル」という用語は、本明細書では互換的に使用され、グラム陰性菌株の分泌及び移行系により認識可能であり、グラム陰性菌株から真核細胞へのタンパク質の送達を導くポリペプチド配列を指す。

【0030】

本明細書で使用される場合、タンパク質の「分泌」とは、組換えグラム陰性菌株の細胞膜を渡って外側への異種タンパク質の輸送を指す。タンパク質の「移行」とは、組換えグラム陰性菌株から真核細胞の原形質膜を渡ってそのような真核細胞のサイトゾルへの異種タンパク質の輸送を指す。

【0031】

「真核細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、以下の真核細胞を含む：Ｈｉ−５、ＨｅＬａ、Ｈｅｋ、ＨＵＶＥＣ、３Ｔ３、ＣＨＯ、ジャーカット、Ｓｆ−９、ＨｅｐＧ２、Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫ、Ｍｅｆ、ＴＨＰ−１、Ｊ７７４、ＲＡＷ、Ｃａｃｏ２、ＮＣＩ６０、ＤＵ１４５、Ｌｎｃａｐ、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８、ＰＣ３、Ｔ４７Ｄ、Ａ５４９、Ｕ８７、ＳＨＳＹ５Ｙ、Ｅａ．Ｈｙ９２６、Ｓａｏｓ−２、４Ｔ１、Ｄ２Ａ１、Ｂ１６Ｆ１０、及び初代ヒト肝細胞。「真核細胞」は、本明細書で使用される場合、「標的細胞」又は「標的真核細胞」とも称される。

【0032】

「Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｔ３Ｓ装置によって真核細胞のサイトゾル内に天然に注射されるタンパク質、及び、例えば真核生物膜内への移行ポアを形成し得る、Ｔ３Ｓ装置から天然に分泌されるタンパク質（ポア形成トランスロケーター（エルシニア属ＹｏｐＢ及びＹｏｐＤなど）及びエルシニア属ＬｃｒＶのようなｔｉｐタンパク質を含む）を指す。Ｔ３Ｓ装置によって真核細胞のサイトゾル内に天然に注射されるタンパク質を使用することが好ましい。これらの病原性因子は、病原体の利益のために真核細胞を麻痺させる又は再プログラミングする。Ｔ３Ｓエフェクターは、生化学的活性の大きなレパートリーを示し、極めて重要な宿主調節分子の機能を調節するものであり［５、３０］、それらとして、ＡｖｒＡ、ＡｖｒＢ、ＡｖｒＢｓ２、ＡｖｒＢＳ３、ＡｖｒＢｓＴ、ＡｖｒＤ、ＡｖｒＤ１、ＡｖｒＰｐｈＢ、ＡｖｒＰｐｈＣ、ＡｖｒＰｐｈＥＰｔｏ、ＡｖｒＰｐｉＢＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＡｖｒＲｐｍ１、ＡｖｒＲｐｔ２、ＡｖｒＸｖ３、ＣｉｇＲ、ＥｓｐＦ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺ、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＧｏｇＢ、ＧｔｇＡ、ＧｔｇＥ、ＧＡＬＡファミリーのタンパク質、ＨｏｐＡＢ２、ＨｏｐＡＯ１、ＨｏｐＩ１、ＨｏｐＭ１、ＨｏｐＮ１、ＨｏｐＰｔｏＤ２、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＮ、ＨｏｐＵ１、ＨｓｖＢ、ＩｃｓＢ、ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＩｐａＨ、ＩｐａＨ７．８、ＩｐａＨ９．８、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＢ２、ＩｐｇＤ、ＬｃｒＶ、Ｍａｐ、ＯｓｐＣ１、ＯｓｐＥ２、ＯｓｐＦ、ＯｓｐＧ、ＯｓｐＩ、ＰｉｐＢ、ＰｉｐＢ２、ＰｏｐＢ、ＰｏｐＰ２、ＰｔｈＸｏ１、ＰｔｈＸｏ６、ＰｔｈＸｏ７、ＳｉｆＡ、ＳｉｆＢ、ＳｉｐＡ／ＳｓｐＡ、ＳｉｐＢ、ＳｉｐＣ／ＳｓｐＣ、ＳｉｐＤ／ＳｓｐＤ、ＳｌｒＰ、ＳｏｐＡ、ＳｏｐＢ／ＳｉｇＤ、ＳｏｐＤ、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｐｉＣ／ＳｓａＢ、ＳｐｔＰ、ＳｐｖＢ、ＳｐｖＣ、ＳｒｆＨ、ＳｒｆＪ、Ｓｓｅ、ＳｓｅＢ、ＳｓｅＣ、ＳｓｅＤ、ＳｓｅＦ、ＳｓｅＧ、ＳｓｅＩ／ＳｒｆＨ、ＳｓｅＪ、ＳｓｅＫ１、ＳｓｅＫ２、ＳｓｅＫ３、ＳｓｅＬ、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、ＳｔｅＡ、ＳｔｅＢ、ＳｔｅＣ、ＳｔｅＤ、ＳｔｅＥ、ＴｃｃＰ２、Ｔｉｒ、ＶｉｒＡ、ＶｉｒＰｐｈＡ、ＶｏｐＦ、ＸｏｐＤ、ＹｏｐＢ、ＹｏｐＤ ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＪ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＴ、ＹｐｋＡが挙げられる。

【0033】

エルシニア属のＴ３ＳＳエフェクター遺伝子は、例えばＹ．エンテロコリチカからクローニングされており、それらは、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ／ＹｏｐＪ、及びＹｏｐＴである［３１］。それぞれのエフェクター遺伝子は以下からクローニングすることができる。シゲラ・フレックスネリ（例えば、ＯｓｐＦ、ＩｐｇＤ、ＩｐｇＢ１）、サルモネラ・エンテリカ（例えば、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＢ、ＳｐｔＰ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（例えば、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＵ、ＥｘｏＹ）又は大腸菌（例えば、Ｔｉｒ、Ｍａｐ、ＥｓｐＦ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺ）。当業者は、これらの遺伝子の核酸配列を、例えば、Ｇｅｎｅｂａｎｋデータベースで入手可能である（ＮＣ＿００２１２０ ＧＩ：１０９５５５３６からｙｏｐＨ、ｙｏｐＯ、ｙｏｐＥ、ｙｏｐＰ、ｙｏｐＭ、ｙｏｐＴ； ＡＦ３８６５２６．１ ＧＩ：１８４６２５１５からＳ．フレックスネリ（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）エフェクタータンパク質；ＮＣ＿０１６８１０．１ ＧＩ：３７８６９７９８３又はＦＱ３１２００３．１ ＧＩ：３０１１５６６３１からＳ．エンテリカエフェクター；ＡＥ００４０９１．２ ＧＩ：１１０２２７０５４又はＣＰ０００４３８．１ ＧＩ：１１５５８３７９６から緑膿菌エフェクター、及びＮＣ＿０１１６０１．１ ＧＩ：２１５４８５１６１から大腸菌エフェクタータンパク質）。

【0034】

本発明の目的に関して、遺伝子は、タンパク質と区別するために小文字及びイタリック体の文字で示される。遺伝子（小文字及びイタリック体の文字で示される）が細菌種の名称（大腸菌など）に続く場合、それらは、対応する細菌種における対応する遺伝子の突然変異を指す。例えば、ＹｏｐＥはｙｏｐＥ遺伝子によりコードされるエフェクタータンパク質を指す。Ｙ．エンテロコリチカｙｏｐＥは、ｙｏｐＥ遺伝子に突然変異を有するＹ．エンテロコリチカを表す。

【0035】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」、「ポリペプチド性」及び「ペプチド性」という用語は、互換的に使用され、隣接する残基のアルファ−アミノ基とカルボキシ基のペプチド結合によって互いと接続した一連のアミノ酸残基を示す。少なくとも１０アミノ酸、より好ましくは 少なくとも２０アミノ酸で構成されるアミノ酸配列を有するタンパク質が好ましい。

【0036】

本発明によると、「異種タンパク質」とは、天然に存在するタンパク質又はその一部を包含し、また、人工的に工学的に操作されたタンパク質又はその一部も包含する。本明細書で使用される場合、「異種タンパク質」という用語は、それを融合することができるＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片以外のタンパク質又はその一部を指す。具体的には、異種タンパク質とは、本明細書で使用される場合、本発明により提供され使用される特定の組換えグラム陰性菌株の全天然タンパク質であるプロテオームに属さない、例えば、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属又はシュードモナス属特定の菌株の全天然タンパク質であるプロテオームに属さないタンパク質又はその一部を指す。通常、異種タンパク質は、ヒト起源を含めた動物起源のものである。異種タンパク質はヒトタンパク質であることが好ましい。異種タンパク質は、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、低分子ＧＴＰアーゼ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物及びナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター及びウイルスタンパク質からなる群から選択されることがより好ましい。異種タンパク質は、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、アンキリンリピートタンパク質、レポータータンパク質、低分子ＧＴＰアーゼ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター及びウイルスタンパク質からなる群から選択されることが特に好ましい。異種タンパク質は、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、及びアンキリンリピートタンパク質からなる群から選択されることがよりいっそう好ましい。アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、動物など、好ましくはアポトーシス又はアポトーシス調節に関与するヒト異種タンパク質が最も好ましい。

【0037】

一部の実施形態では、本発明のグラム陰性菌株のベクターは、互いとは独立して前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合した、同一の異種タンパク質又は２種の異なる異種タンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列を２つ含む。

【0038】

一部の実施形態では、本発明のグラム陰性菌株のベクターは、互いとは独立して前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合した、同一の又は３つの異なる異種タンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列を３つ含む。

【0039】

組換えグラム陰性菌株によって発現される異種タンパク質の分子量は、通常１ｋＤから１５０ｋＤの間、好ましくは１ｋＤから１２０ｋＤの間、より好ましくは１ｋＤから１００ｋＤａの間、最も好ましくは１５ｋＤから１００ｋＤａの間である。

【0040】

本発明によると、「アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質」としては、これだけに限定されないが、Ｂａｄ、Ｂｃｌ２、Ｂａｋ、Ｂｍｔ、Ｂａｘ、Ｐｕｍａ、Ｎｏｘａ、Ｂｉｍ、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ａｐａｆ１、カスパーゼ９、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ１０、ＤＦＦＡ、ＤＦＦＢ、ＲＯＣＫ１、ＡＰＰ、ＣＡＤ、ＩＣＡＤ、ＣＡＤ、ＥｎｄｏＧ、ＡＩＦ、ＨｔｒＡ２、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、Ａｒｔ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、Ｂｏｋ／Ｍｔｄ、Ｂｍｆ、Ｍｃｌ−１（Ｓ）、ＩＡＰファミリー、ＬＣ８、ＰＰ２Ｂ、１４−３−３タンパク質、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、Ｅｒｋ１／２、ｐ９０ＲＳＫ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、Ｄａｘｘ、カスパーゼ８、カスパーゼ２、ＲＩＰ、ＲＡＩＤＤ、ＭＫＫ７、ＪＮＫ、ＦＬＩＰ、ＦＫＨＲ、ＧＳＫ３、ＣＤＫ、並びにＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）、ｐ１５（Ｉｎｋ４ｂ）、ｐ１８（Ｉｎｋ４ｃ）、ｐ１９（Ｉｎｋ４ｄ））、及びＣｉｐ１／Ｗａｆ１／Ｋｉｐ１−２ファミリー（ｐ２１（Ｃｉｐ１／Ｗａｆ１）、ｐ２７（Ｋｉｐ１）、ｐ５７（Ｋｉｐ２）のような、それらの阻害剤が挙げられる。好ましくは、Ｂａｄ、Ｂｍｔ、Ｂｃｌ２、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｐｕｍａ、Ｎｏｘａ、Ｂｉｍ、Ｂｃｌ−ｘＬ、カスパーゼ９、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｂｏｋ／Ｍｔｄ、Ｂｍｆ、Ｍｃｌ−１（Ｓ）、ＬＣ８、ＰＰ２Ｂ、ＴＲＡＤＤ、Ｄａｘｘ、カスパーゼ８、カスパーゼ２、ＲＩＰ、ＲＡＩＤＤ、ＦＫＨＲ、ＣＤＫ、及び、ＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）、ｐ１５（Ｉｎｋ４ｂ）、ｐ１８（Ｉｎｋ４ｃ）、ｐ１９（Ｉｎｋ４ｄ））のような、それらの阻害剤、最も好ましくはＢＩＭ、Ｂｉｄ、切除されたＢｉｄ、ＦＡＤＤ、カスパーゼ３（及びそのサブユニット）、Ｂａｘ、Ｂａｄ、Ａｋｔ、ＣＤＫ、及び、ＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）、ｐ１５（Ｉｎｋ４ｂ）、ｐ１８（Ｉｎｋ４ｃ）、ｐ１９（Ｉｎｋ４ｄ））のような、それらの阻害剤を使用する［３２−３４］。さらに、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質として、ＤＩＶＡ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｎｂｋ／Ｂｉｋ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄ、Ｅｇｌ−１、Ｂｃｌ−Ｇｓ、チトクロムＣ、Ｂｅｃｌｉｎ、ＣＥＤ−１３、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｃｌ−Ｂ、Ｂｃｌ−Ｗ、Ｃｅｄ−９、Ａ１、ＮＲ１３、Ｂｆｌ−１、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ８が挙げられる。

【0041】

アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質は、プロアポトーシスタンパク質、抗アポトーシス性のタンパク質、アポトーシス防止経路の阻害剤及び生存促進性シグナル伝達又は経路の阻害剤からなる群から選択される。プロアポトーシスタンパク質は、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｎｂｋ／Ｂｉｋ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、Ｂｍｆ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｍ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄ、Ｂｏｋ、Ａｐａｆ１、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｃｌ−Ｇｓ、Ｂｅｃｌｉｎ １、Ｅｇｌ−１及びＣＥＤ−１３、チトクロムＣ、ＦＡＤＤ、カスパーゼファミリー、及びＣＤＫ、及び、ＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）、ｐ１５（Ｉｎｋ４ｂ）、ｐ１８（Ｉｎｋ４ｃ）、ｐ１９（Ｉｎｋ４ｄ））のような、それらの阻害剤からなる群から選択される、又は、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｎｂｋ／Ｂｉｋ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、Ｂｍｆ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｍ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄ、Ｂｏｋ、Ｅｇｌ−１、Ａｐａｆ１、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｃｌ−Ｇｓ、Ｂｅｃｌｉｎ １、Ｅｇｌ−１及びＣＥＤ−１３、チトクロムＣ、ＦＡＤＤ、及びカスパーゼファミリーからなる群から選択されるタンパク質を含む。Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｎｂｋ／Ｂｉｋ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、Ｂｍｆ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｍ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄ、Ｂｏｋ、Ｅｇｌ−１、Ａｐａｆ１、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｃｌ−Ｇｓ、Ｂｅｃｌｉｎ １、Ｅｇｌ−１及びＣＥＤ−１３、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、ＦＡＤＤ、カスパーゼファミリー、ＣＤＫ、及び、ＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）、ｐ１５（Ｉｎｋ４ｂ）、ｐ１８（Ｉｎｋ４ｃ）、ｐ１９（Ｉｎｋ４ｄ））のような、それらの阻害剤が好ましい。Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｎｂｋ／Ｂｉｋ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、Ｂｍｆ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｍ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄ、Ｂｏｋ、Ａｐａｆ１、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｃｌ−Ｇｓ、Ｂｅｃｌｉｎ １、Ｅｇｌ−１及びＣＥＤ−１３、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、ＦＡＤＤ、カスパーゼファミリーが同等に好ましい。

【0042】

抗アポトーシス性のタンパク質は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘｌ、Ｂｃｌ−Ｂ、Ｂｃｌ−Ｗ、Ｍｃｌ−１、Ｃｅｄ−９、Ａ１、ＮＲ１３、ＩＡＰファミリー及びＢｆｌ−１からなる群から選択されるタンパク質を含む。Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘｌ、Ｂｃｌ−Ｂ、Ｂｃｌ−Ｗ、Ｍｃｌ−１、Ｃｅｄ−９、Ａ１、ＮＲ１３及びＢｆｌ−１が好ましい。

【0043】

アポトーシス防止経路の阻害剤は、Ｂａｄ、Ｎｏｘａ及びＣｄｃ２５Ａからなる群から選択されるタンパク質を含む。Ｂａｄ及びＮｏｘａが好ましい。

【0044】

生存促進性シグナル伝達又は経路の阻害剤は、ＰＴＥＮ、ＲＯＣＫ、ＰＰ２Ａ、ＰＨＬＰＰ、ＪＮＫ、ｐ３８からなる群から選択されるタンパク質を含む。ＰＴＥＮ、ＲＯＣＫ、ＰＰ２Ａ及びＰＨＬＰＰが好ましい。

【0045】

一部の実施形態では、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与する異種タンパク質は、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質、カスパーゼ及びアポトーシスのデスレセプター制御の細胞内シグナル伝達タンパク質からなる群から選択される。

【0046】

ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質は、Ｂａｄ、ＢＩＭ、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｋ／Ｎｂｋ、Ｂｏｄ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｍｆ、Ｎｏｘａ、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−Ｇｓ、Ｂｅｃｌｉｎ １、Ｅｇｌ−１及びＣＥＤ−１３からなる群から選択されるタンパク質を含む。Ｂａｄ、ＢＩＭ、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄが好ましい。

【0047】

カスパーゼは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０からなる群から選択されるタンパク質を含む。カスパーゼ３、カスパーゼ８及びカスパーゼ９が好ましい。

【0048】

アポトーシスのデスレセプター制御の細胞内シグナル伝達タンパク質は、ＦＡＤＤ、ＴＲＡＤＤ、ＡＳＣ、ＢＡＰ３１、ＧＵＬＰ１／ＣＥＤ−６、ＣＩＤＥＡ、ＭＦＧ−Ｅ８、ＣＩＤＥＣ、ＲＩＰＫ１／ＲＩＰ１、ＣＲＡＤＤ、ＲＩＰＫ３／ＲＩＰ３、Ｃｒｋ、ＳＨＢ、ＣｒｋＬ、ＤＡＸＸ、１４−３−３ファミリー、ＦＬＩＰ、ＤＦＦ４０及び４５、ＰＥＡ−１５、ＳＯＤＤからなる群から選択されるタンパク質を含む。ＦＡＤＤ及びＴＲＡＤＤが好ましい。

【0049】

一部の実施形態では、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与する２つの異種タンパク質が本発明のグラム陰性菌株のベクターに含まれ、一方のタンパク質はプロアポトーシスタンパク質であり、他方のタンパク質はアポトーシス防止経路の阻害剤である、又は、一方のタンパク質はプロアポトーシスタンパク質であり、他方のタンパク質は生存促進性シグナル伝達又は経路の阻害剤である。

【0050】

本発明に包含されるプロアポトーシスタンパク質は通常、アルファヘリックス構造、好ましくは両親媒性へリックスで囲まれた疎水性へリックスを有し、通常、ＢＨ１ドメイン、ＢＨ２ドメイン、ＢＨ３ドメイン又はＢＨ４ドメインの少なくとも１つを含み、少なくとも１つのＢＨ３ドメインを含むことが好ましい。本発明に包含されるプロアポトーシスタンパク質は通常、酵素活性を有さない。

【0051】

「プロテアーゼ切断部位」という用語は、本明細書で使用される場合、アミノ酸モチーフを認識する特異的なプロテアーゼによって切断される、アミノ酸配列内、例えば、タンパク質又は融合タンパク質のアミノ酸配列内にある特定のアミノ酸モチーフを指す。総説については［３５］を参照されたい。プロテアーゼ切断部位の例は、エンテロキナーゼ（軽鎖）、エンテロペプチダーゼ、プレシジョンプロテアーゼ、ヒトライノウイルスプロテアーゼ（ＨＲＶ ３Ｃ）、ＴＥＶプロテアーゼ、ＴＶＭＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子プロテアーゼ及びトロンビンからなる群から選択されるプロテアーゼによって切断されるアミノ酸モチーフである。

【0052】

以下のアミノ酸モチーフがそれぞれのプロテアーゼによって認識される：
− Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ：エンテロキナーゼ（軽鎖）／エンテロペプチダーゼ
− Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ／Ｇｌｙ−Ｐｒｏ：プレシジョンプロテアーゼ／ヒトライノウイルスプロテアーゼ（ＨＲＶ ３Ｃ）
− Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ及びＧｌｕ−Ｘ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（Ｘは任意のアミノ酸）に基づいて改変されたモチーフ、ＴＥＶプロテアーゼ（タバコエッチ病ウイルス）によって認識される
− Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ：ＴＶＭＶプロテアーゼ
− Ｉｌｅ−（Ｇｌｕ又はＡｓｐ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ：第Ｘａ因子プロテアーゼ
− Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ：トロンビン。

【0053】

本明細書で使用されるプロテアーゼ切断部位にはユビキチンが包含される。したがって、一部の好ましい実施形態では、ユビキチンをプロテアーゼ切断部位として使用する、すなわち、第３のＤＮＡ配列は、Ｎ末端部位において特異的なユビキチンプロセシングプロテアーゼによって切断することができる、例えば、融合タンパク質が送達された細胞内で内因性にＮ末端部位において脱ユビキチン化酵素と称される特異的なユビキチンプロセシングプロテアーゼによって切断することができるプロテアーゼ切断部位としてユビキチンをコードする。ユビキチンは、内因性ユビキチン特異的Ｃ末端プロテアーゼ（脱ユビキチン化酵素、ＤＵＢ）の群により、Ｃ末端においてプロセシングを受ける。ＤＵＢによるユビキチンの切断は、ユビキチンのちょうどＣ末端（Ｇ７６の後ろ）で起こるはずである。

【0054】

「個体」、「対象」又は「患者」は、脊椎動物である。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、哺乳動物である。哺乳動物としては、これだけに限定されないが、霊長類（ヒト及び非ヒト霊長類を含む）並びにげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。ある特定の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。

【0055】

「突然変異」という用語は、本明細書では、一般用語として使用され、一塩基対及び多数の塩基対のどちらの変化も含む。そのような突然変異は、置換、フレームシフト突然変異、欠失、挿入及びトランケーションを含み得る。

【0056】

「標識分子又は標識分子のアクセプター部位」という用語は、本明細書で使用される場合、特定のアミノ酸配列に結合し、結合した化学化合物の蛍光を生じさせる小さな化学化合物、好ましくはクマリンリガーゼ／クマリンアクセプター部位（及びその誘導体）、レゾルフィンリガーゼ／レゾルフィンアクセプター部位（及びその誘導体）、並びにＦｌＡｓＨ／ＲｅＡｓＨ色素（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のような蛍光タンパク質と共に使用するテトラ−システインモチーフ（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ及びその誘導体のような）を指す。

【0057】

「核局在化シグナル」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質に、真核細胞の核への移入の印を付けるアミノ酸配列を指し、それらとして、好ましくはＳＶ４０ラージＴ−抗原由来ＮＬＳ（ＰＰＫＫＫＲＫＶ）などのウイルス核局在化シグナルが挙げられる。

【0058】

「多重クローニング部位」という用語は、本明細書で使用される場合、制限エンドヌクレアーゼによる切断のための制限部位、例えば、ＡｃｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｐＩ、ＭｌｕＣＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＰｃｉＩ、ＡｇｅＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｆｕＡＩ、ＳｅｘＡＩ、ＭｌｕＩ、ＢｃｅＡＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｇｌＩＩ、ＡｆｅＩ、ＡｌｕＩ、ＳｔｕＩ、ＳｃａＩ、ＣｌａＩ、ＢｓｐＤＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＮｓｉＩ、ＡｓｅＩ、ＳｗａＩ、ＣｓｐＣＩ、ＭｆｅＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｍｇＢＩ、ＰｍｌＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＡｌｅＩ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＰｖｕＩＩ、ＡｌｗＮＩ、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、ＴｓｐＲＩ、ＮｄｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＣｖｉＡＩＩ、ＦａｔＩ、ＭｓｌＩ、ＦｓｐＥＩ、ＸｃｍＩ、ＢｓｔＸＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｃｃＩ、ＮｃｏＩ、ＢｓｅＹＩ、ＦａｕＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＴｓｐＭＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＬｐｎＰＩ、ＡｃｉＩ、ＳａｃＩＩ、ＢｓｒＢＩ、ＭｓｐＩ、ＨｐａＩＩ、ＳｃｒＦＩ、ＢｓｓＫＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、ＢｓａＪＩ、ＢｓｌＩ、ＢｔｇＩ、ＮｃｉＩ、ＡｖｒＩＩ、ＭｎｌＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、ＳｂｆＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＥｃｏＮＩ、ＨｐｙＡＶ、ＢｓｔＮＩ、ＰｓｐＧＩ、ＳｔｙＩ、ＢｃｇＩ、ＰｖｕＩ、ＢｓｔＵＩ、ＥａｇＩ、ＲｓｒＩＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｍＢＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｓｐＪＩ、ＳｇｒＡＩ、ＢｆａＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＸｈｏＩ、ＥａｒＩ、ＡｃｕＩ、ＰｓｔＩ、ＢｐｍＩ、ＤｄｅＩ、ＳｆｃＩ、ＡｆｌＩＩ、ＢｐｕＥＩ、ＳｍｌＩ、ＡｖａＩ、ＢｓｏＢＩ、ＭｂｏＩＩ、ＢｂｓＩ、ＸｍｎＩ、ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｇａＩ、ＡａｔＩＩ、ＺｒａＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ ＰｆｌＦＩ、ＰｓｈＡＩ、ＡｈｄＩ、ＤｒｄＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｅＲＩ、ＰｌｅＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、ＭｌｙＩ、ＨｉｎｆＩ、ＥｃｏＲＶ、ＭｂｏＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＤｐｎＩＩ ＢｆｕＣＩ、ＤｐｎＩ、ＢｓａＢＩ、ＴｆｉＩ、ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、ＢｂｖＩ、ＢｔｓＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｐｈＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＮａｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＢｇｌＩ、ＡｓｉＳＩ、ＢｔｇＺＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｈａＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＮｏｔＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＭｗｏＩ、ＮｈｅＩ、ＢｍｔＩ、ＳａｐＩ、ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、ＢｌｐＩ、ＴｓｅＩ、ＡｐｅＫＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、ＢａｍＨＩ、ＦｏｋＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＰｈｏＩ、ＦｓｅＩ、ＳｆｉＩ、ＮａｒＩ、ＫａｓＩ、ＳｆｏＩ、ＰｌｕＴＩ、ＡｓｃＩ、ＥｃｉＩ、ＢｓｍＦＩ、ＡｐａＩ、ＰｓｐＯＭＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＮｌａＩＶ、ＫｐｎＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＢｓａＩ、ＨｐｈＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｎＩ、ＢａｅＧＩ、ＢｓａＨＩ、ＢａｎＩＩ、ＲｓａＩ、ＣｖｉＱＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＢｃｉＶＩ、ＳａｌＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｃｏＤＩ、ＡｐａＬＩ、ＢｓｇＩ、ＡｃｃＩ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＨｐａＩ、ＰｍｅＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、ＡｐｏＩ、ＮｓｐＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｔＹＩ、ＨａｅＩＩ、ＣｖｉＫＩ−１、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＰｐｕＭＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＳｎａＢＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＥＩ、ＭｍｅＩ、ＴａｑαＩ、ＮｒｕＩ、Ｈｐｙ１８８Ｉ、Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＢｃｌＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＦｓｐＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＭｓｃＩ、ＢｓｒＧＩ、ＭｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｉＩ、ＢｓｔＢＩ、ＤｒａＩ、ＰｓｐＸＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓａＡＩ、ＥａｅＩなど、好ましくはＸｈｏＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＢｓｔＢＩなどをいくつか含有する短いＤＮＡ配列を指す。「多重クローニング部位」という用語は、本明細書で使用される場合、さらに、例えば、Ｇａｔｅｗａｙクローニング戦略における又はＧｉｂｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ又はｔｏｐｏ ｃｌｏｎｉｎｇなどの方法のための組換え事象に使用される短いＤＮＡ配列を指す。

【0059】

「エルシニア属野生型株」という用語は、本明細書で使用される場合、天然に存在する変異体（Ｙ．エンテロコリチカＥ４０のような）、又は、制限エンドヌクレアーゼ又は抗生物質耐性遺伝子の欠失突然変異などの、ベクターの使用を可能にする遺伝子改変を含有する天然に存在する変異体（Ｙ．エンテロコリチカＭＲＳ４０、Ｙ．エンテロコリチカＥ４０のアンピシリン感受性誘導体）を指す。これらの株は、染色体ＤＮＡ並びに非修飾病原性プラスミド（ｐＹＶと称される）を含有する。

【0060】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、一般に、含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）、つまり、１つ又は複数の特徴又は成分の存在が許容されるという意味で使用される。

【0061】

一実施形態では、本発明は、組換えグラム陰性菌株を提供し、当該グラム陰性菌株は、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属及びシュードモナス属からなる群から選択される。一実施形態では、本発明は、組換えグラム陰性菌株を提供し、当該グラム陰性菌株は、エルシニア属及びサルモネラ属からなる群から選択される。グラム陰性菌株は、エルシニア属株であることが好ましく、腸炎エルシニア株であることがより好ましい。腸炎エルシニアＥ４０［１３］又は［３６］に記載されているＹ．エンテロコリチカＭＲＳ４０のような、そのアンピシリン感受性誘導体が最も好ましい。グラム陰性菌株は、サルモネラ属株であることも好ましく、サルモネラ・エンテリカ株であることがより好ましい。Ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＣＴＣ １３３４７）に記載されているネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＳＬ１３４４が最も好ましい。

【0062】

本発明の一実施形態では、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルは細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片を含み、Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片はシャペロン結合部位を含み得る。シャペロン結合部位を含むＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片が本発明における送達シグナルとして特に有用である。好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片は、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｐｔＰ、ＹｏｐＥ、ＥｘｏＳ、ＳｉｐＡ、ＳｉｐＢ、ＳｉｐＤ、ＳｏｐＡ、ＳｏｐＢ、ＳｏｐＤ、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＤ、ＳｉｐＣ、ＳｉｆＡ、ＳｓｅＪ、Ｓｓｅ、ＳｒｆＨ、ＹｏｐＪ、ＡｖｒＡ、ＡｖｒＢｓＴ、ＹｏｐＴ、ＹｏｐＨ、ＹｐｋＡ、Ｔｉｒ、ＥｓｐＦ、ＴｃｃＰ２、ＩｐｇＢ２、ＯｓｐＦ、Ｍａｐ、ＯｓｐＧ、ＯｓｐＩ、ＩｐａＨ、ＳｓｐＨ１，ＶｏｐＦ、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＨｏｐＡＢ２、ＸｏｐＤ、ＡｖｒＲｐｔ２、ＨｏｐＡＯ１、ＨｏｐＰｔｏＤ２、ＨｏｐＵ１、ＧＡＬＡファミリーのタンパク質、ＡｖｒＢｓ２、ＡｖｒＤ１、ＡｖｒＢＳ３、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺ、ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＶｉｒＡ、ＩｃｓＢ、ＯｓｐＣ１、ＯｓｐＥ２、ＩｐａＨ９．８、ＩｐａＨ７．８、ＡｖｒＢ、ＡｖｒＤ、ＡｖｒＰｐｈＢ、ＡｖｒＰｐｈＣ、ＡｖｒＰｐｈＥＰｔｏ、ＡｖｒＰｐｉＢＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＶｉｒＰｐｈＡ、ＡｖｒＲｐｍ１、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＮ、ＰｏｐＢ、ＰｏｐＰ２、ＡｖｒＢｓ３、ＸｏｐＤ、及びＡｖｒＸｖ３からなる群から選択される。より好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片は、ＳｏｐＥ、ＳｐｔＰ、ＹｏｐＥ、ＥｘｏＳ、ＳｏｐＢ、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＤ、ＹｏｐＪ、ＹｏｐＨ、ＥｓｐＦ、ＯｓｐＦ、ＥｘｏＳ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴからなる群から選択され、そのうち最も好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片は、ＩｐｇＢ１、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＢ、ＳｐｔＰ、ＯｓｐＦ、ＩｐｇＤ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴ、特にＹｏｐＥ又はそのＮ末端断片からなる群から選択される。

【0063】

同等に好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片は、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｐｔＰ、ＳｔｅＡ、ＳｉｐＡ、ＳｉｐＢ、ＳｉｐＤ、ＳｏｐＡ、ＳｏｐＢ、ＳｏｐＤ、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＤ、ＳｉｐＣ、ＳｉｆＡ、ＳｉｆＢ、ＳｓｅＪ、Ｓｓｅ、ＳｒｆＨ、ＹｏｐＪ、ＡｖｒＡ、ＡｖｒＢｓＴ、ＹｏｐＨ、ＹｐｋＡ、Ｔｉｒ、ＥｓｐＦ、ＴｃｃＰ２、ＩｐｇＢ２、ＯｓｐＦ、Ｍａｐ、ＯｓｐＧ、ＯｓｐＩ、ＩｐａＨ、ＶｏｐＦ、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＨｏｐＡＢ２、ＡｖｒＲｐｔ２、ＨｏｐＡＯ１、ＨｏｐＵ１、ＧＡＬＡファミリーのタンパク質、ＡｖｒＢｓ２、ＡｖｒＤ１、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＴ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺ、ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＶｉｒＡ、ＩｃｓＢ、ＯｓｐＣ１、ＯｓｐＥ２、ＩｐａＨ９．８、ＩｐａＨ７．８、ＡｖｒＢ、ＡｖｒＤ、ＡｖｒＰｐｈＢ、ＡｖｒＰｐｈＣ、ＡｖｒＰｐｈＥＰｔｏ、ＡｖｒＰｐｉＢＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＶｉｒＰｐｈＡ、ＡｖｒＲｐｍ１、ＨｏｐＰｔｏＤ２、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＮ、ＰｏｐＢ、ＰｏｐＰ２、ＡｖｒＢｓ３、ＸｏｐＤ、及びＡｖｒＸｖ３からなる群から選択される。同等により好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片は、ＳｏｐＥ、ＳｐｔＰ、ＳｔｅＡ、ＳｉｆＢ、ＳｏｐＢ、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＤ、ＹｏｐＪ、ＹｏｐＨ、ＥｓｐＦ、ＯｓｐＦ、ＥｘｏＳ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＴからなる群から選択され、そのうち同等に最も好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片は、ＩｐｇＢ１、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＢ、ＳｐｔＰ、ＳｔｅＡ、ＳｉｆＢ、ＯｓｐＦ、ＩｐｇＤ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、及びＹｏｐＴ、特にＳｏｐＥ、ＳｔｅＡ、又はＹｏｐＥ又はそのＮ末端断片、特にＳｔｅＡ又はＹｏｐＥ又はそのＮ末端断片、特にＹｏｐＥ又はそのＮ末端断片からなる群から選択される。

【0064】

一部の実施形態では、第１のＤＮＡ配列によりコードされる細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルは細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片を含み、そのＮ末端断片は、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質の少なくとも最初の１０アミノ酸、好ましくは少なくとも最初の２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも最初の１００アミノ酸を含む。

【0065】

一部の実施形態では、第１のＤＮＡ配列によりコードされる細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルは細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片を含み、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片はシャペロン結合部位を含む。

【0066】

シャペロン結合部位を含む好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片は、以下のシャペロン結合部位とＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片の組合せを含む：ＳｙｃＥ−ＹｏｐＥ、ＩｎｖＢ−ＳｏｐＥ、ＳｉｃＰ−ＳｐｔＰ、ＳｙｃＴ−ＹｏｐＴ、ＳｙｃＯ−ＹｏｐＯ、ＳｙｃＮ／ＹｓｃＢ−ＹｏｐＮ、ＳｙｃＨ−ＹｏｐＨ、ＳｐｃＳ−ＥｘｏＳ、ＣｅｓＦ−ＥｓｐＦ、ＳｙｃＤ−ＹｏｐＢ、ＳｙｃＤ−ＹｏｐＤ。より好ましくは、以下の組合せを含む：ＳｙｃＥ−ＹｏｐＥ、ＩｎｖＢ−ＳｏｐＥ、ＳｙｃＴ−ＹｏｐＴ、ＳｙｃＯ−ＹｏｐＯ、ＳｙｃＮ／ＹｓｃＢ−ＹｏｐＮ、ＳｙｃＨ−ＹｏｐＨ、ＳｐｃＳ−ＥｘｏＳ、ＣｅｓＦ−ＥｓｐＦ。本明細書ではＹｏｐＥ_{１−１３８}と称され、配列番号２に示されているＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端の１３８アミノ酸を含有するＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片などのＳｙｃＥシャペロン結合部位を含むＹｏｐＥ若しくはそのＮ末端断片、又は、本明細書ではそれぞれＳｏｐＥ_１−８１又はＳｏｐＥ_{１−１０５}と称され、配列番号１４２又は１４３に示されているＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端の８１アミノ酸又は１０５アミノ酸を含有するＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片などのＩｎｖＢシャペロン結合部位を含むＳｏｐＥ若しくはそのＮ末端断片が最も好ましい。

【0067】

本発明の一実施形態では、組換えグラム陰性菌株は、エルシニア属株であり、第１のＤＮＡ配列によりコードされる細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルは、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質又はＮ末端部分、好ましくはＹ．エンテロコリチカＹｏｐＥエフェクタータンパク質又はそのＮ末端部分を含む。ＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端部分にＳｙｃＥ結合部位が含まれることが好ましい。これに関連して、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片は、Ｎ末端１２アミノ酸、１６アミノ酸、１８アミノ酸、５２アミノ酸、５３アミノ酸、８０アミノ酸又は１３８アミノ酸を含み得る［１０、３７、３８］。本明細書ではＹｏｐＥ_{１−１３８}と称され、配列番号２に示されている、例えばＦｏｒｓｂｅｒｇ及びＷｏｌｆ−Ｗａｔｚ［３９］に記載のＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端の１３８アミノ酸を含有するＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片が最も好ましい。

【0068】

本発明の一実施形態では、組換えグラム陰性菌株は、サルモネラ属株であり、第１のＤＮＡ配列によりコードされる細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルは、ＳｏｐＥエフェクタータンパク質又はＳｔｅＡエフェクタータンパク質又はそのＮ末端部分、好ましくはサルモネラ・エンテリカＳｏｐＥエフェクタータンパク質又はＳｔｅＡエフェクタータンパク質又はそのＮ末端部分を含む。ＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端部分にシャペロン結合部位が含まれることが好ましい。これに関連して、ＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片は、Ｎ末端の８１アミノ酸又は１０５アミノ酸を含み得る。例えば、配列番号１４２又は１４３に記載の完全長ＳｔｅＡ及びＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端１０５アミノ酸を含有するＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片が最も好ましい。

【0069】

当業者は、タンパク質を送達することが可能なエフェクタータンパク質のポリペプチド配列を同定するための方法に詳しい。例えば、そのような方法の１つは、Ｓｏｒｙら［１３］により説明されている。簡単に述べると、例えば、Ｙｏｐタンパク質の種々の部分由来のポリペプチド配列を百日咳菌シクロリジンのカルモジュリン活性化アデニル酸シクラーゼドメイン（又はＣｙａ）などのレポーター酵素とインフレームで融合することができる。真核細胞のサイトゾルへのＹｏｐ−Ｃｙａハイブリッドタンパク質の送達は、感染させた真核細胞においてｃＡＭＰの蓄積が生じるシクラーゼ活性が出現することによって示される。そのような手法を使用することにより、当業者は、所望であれば、タンパク質を送達することが可能な最小の配列要件、すなわち、最も短い長さの近接するアミノ酸配列を決定することができる。例えば、［１３］を参照されたい。したがって、本発明の好ましい送達シグナルは、タンパク質を送達することが可能な少なくとも最小のＴ３ＳＳエフェクタータンパク質のアミノ酸の配列からなる。

【0070】

一実施形態では、本発明は、変異組換えグラム陰性菌株、具体的には、少なくとも１種のＴ３ＳＳ機能性エフェクタータンパク質の産生に関して欠損を有する組換えグラム陰性菌株を提供する。

【0071】

本発明によると、そのような突然変異グラム陰性菌株、例えば、そのような変異エルシニア属株は、少なくとも１つのエフェクターをコードする遺伝子に少なくとも１つの突然変異を導入することによって生成することができる。エルシニア属株に関する限りは、好ましくは、そのようなエフェクターをコードする遺伝子として、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ／ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＰ／ＹｏｐＪ及びＹｏｐＴが挙げられる。サルモネラ属株に関する限りは、好ましくは、そのようなエフェクターをコードする遺伝子として、ＡｖｒＡ、ＣｉｇＲ、ＧｏｇＢ、ＧｔｇＡ、ＧｔｇＥ、ＰｉｐＢ、ＳｉｆＢ、ＳｉｐＡ／ＳｓｐＡ、ＳｉｐＢ、ＳｉｐＣ／ＳｓｐＣ、ＳｉｐＤ／ＳｓｐＤ、ＳｌｒＰ、ＳｏｐＢ／ＳｉｇＤ、ＳｏｐＡ、ＳｐｉＣ／ＳｓａＢ、ＳｓｅＢ、ＳｓｅＣ、ＳｓｅＤ、ＳｓｅＦ、ＳｓｅＧ、ＳｓｅＩ／ＳｒｆＨ、ＳｏｐＤ、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、ＰｉｐＢ２、ＳｉｆＡ、ＳｏｐＤ２、ＳｓｅＪ、ＳｓｅＫ１、ＳｓｅＫ２、ＳｓｅＫ３、ＳｓｅＬ、ＳｔｅＣ、ＳｔｅＡ、ＳｔｅＢ、ＳｔｅＤ、ＳｔｅＥ、ＳｐｖＢ、ＳｐｖＣ、ＳｐｖＤ、ＳｒｆＪ、ＳｐｔＰが挙げられる。エフェクターをコードする遺伝子の全てが欠失していることが最も好ましい。当業者は、これらのＴ３ＳＳエフェクター遺伝子に突然変異を生じさせるために任意の数の標準の技法を使用することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋらにより、そのような技法が一般に記載されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら［４０］を参照されたい。

【0072】

本発明によると、エフェクターをコードする遺伝子のプロモーター領域において突然変異を生じさせ、したがって、そのようなエフェクター遺伝子の発現を消失させることができる。

【0073】

エフェクターをコードする遺伝子のコード化領域において突然変異を生じさせ、したがって、コードされるエフェクタータンパク質の触媒活性を消失させることもできる。エフェクタータンパク質の「触媒活性」とは、通常、エフェクタータンパク質の抗標的細胞機能、すなわち、毒性を指す。そのような活性は、エフェクタータンパク質の触媒ドメイン内の触媒モチーフにより支配される。エフェクタータンパク質の触媒ドメイン及び／又は触媒モチーフを同定するための手法は当業者には周知である。例えば、［４１、４２］を参照されたい。

【0074】

したがって、本発明の好ましい突然変異の１つは、触媒ドメイン全体の欠失である。別の好ましい突然変異は、エフェクターをコードする遺伝子のフレームシフト突然変異であり、したがって、触媒ドメインは、そのような「フレームシフトした」遺伝子から発現されるタンパク質産物には存在しない。最も好ましい突然変異は、エフェクタータンパク質のコード化領域全体の欠失を伴う突然変異である。所与のエフェクタータンパク質の触媒活性の破壊が導かれる、エフェクタータンパク質の触媒モチーフに生じる小さな欠失又は塩基対置換などの他の突然変異も本発明により意図されている。

【0075】

Ｔ３ＳＳ機能性エフェクタータンパク質の遺伝子において生じる突然変異をいくつもの方法によって特定の株に導入することができる。そのような方法の１つは、突然変異した遺伝子を、対立遺伝子交換によって当該株に突然変異した配列を導入することが可能な「自殺」ベクターにクローニングすることを伴う。そのような「自殺」ベクターの例は、［４３］により説明されている。

【0076】

このように、グラム陰性菌株に多数の遺伝子において生じる突然変異を連続的に導入し、多突然変異体、例えば六重突然変異組換え株を生じさせることができる。これらの突然変異した配列が導入される順序は重要ではない。いくつかの状況下では、エフェクター遺伝子の全てではなく一部のみを突然変異させることが望ましい。したがって、本発明は、さらに、六重突然変異エルシニア属以外の多変異エルシニア属、例えば、二重突然変異株、三重突然変異株、四重突然変異株及び五重突然変異株を意図している。タンパク質を送達するためには、本突然変異株の分泌及び移行系はインタクトである必要がある。

【0077】

本発明の好ましい組換えグラム陰性菌株は、エフェクターをコードする遺伝子の全てが突然変異し、結果生じるエルシニア属がもはやいかなる機能性エフェクタータンパク質も産生しない、六重変異エルシニア属株である。そのような六重変異エルシニア属株は、Ｙ．エンテロコリチカに関してはΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔと称される。例として、そのような六重突然変異体をＹ．エンテロコリチカＭＲＳ４０株から作製し、好ましいＹ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔを生じさせることができる。

【0078】

本発明の別の態様は、真核細胞に所望のタンパク質を送達するために組換えグラム陰性菌株と組み合わせて使用するためのベクターであって、５’から３’の方向に、
プロモーター、
前記プロモーターに作動可能に連結した細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルをコードする第１のＤＮＡ配列、
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合した異種タンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列、及び代替として
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端と前記第２のＤＮＡ配列の５’末端の間に位置する、プロテアーゼ切断部位をコードする第３のＤＮＡ配列
を含むベクターを対象とする。

【0079】

上記のプロモーター、異種タンパク質及びプロテアーゼ切断部位をグラム陰性菌株のベクターに使用することができる。

【0080】

本発明に従って使用することができるベクターは、当業者に公知の通り、使用されるグラム陰性菌株に左右される。本発明に従って使用することができるベクターとしては、発現ベクター、染色体又は病原性プラスミド挿入のためのベクター及び染色体又は病原性プラスミド挿入のためのＤＮＡ断片が挙げられる。例えば、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属又はシュードモナス属株において有用である発現ベクターは、例えば、ｐＵＣ、ｐＢａｄ、ｐＡＣＹＣ、ｐＵＣＰ２０及びｐＥＴプラスミドである。例えば、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属又はシュードモナス属株において有用である染色体又は病原性プラスミド挿入のためのベクターは、例えば、ｐＫＮＧ１０１である。染色体又は病原性プラスミド挿入のためのＤＮＡ断片とは、例えば、例えば、ラムダレッド遺伝子工学（ｌａｍｂｄａ−ｒｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）のような、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属又はシュードモナス属株において使用される方法を指す。染色体若しくは病原性プラスミド挿入のためのベクター又は染色体若しくは病原性プラスミド挿入のためのＤＮＡ断片を本発明の第１のＤＮＡ配列、第２のＤＮＡ配列及び／又は第３のＤＮＡ配列に挿入し、したがって、第１のＤＮＡ配列、第２のＤＮＡ配列及び／又は第３のＤＮＡ配列を組換えグラム陰性菌株の内因性プロモーターに作動可能に連結させることができる。したがって、染色体若しくは病原性プラスミド挿入のためのベクター又は染色体若しくは病原性プラスミド挿入のためのＤＮＡ断片を使用する場合、内因性プロモーターは内因性細菌ＤＮＡ（染色体又はプラスミドＤＮＡ）上にコードされていてよく、第１のＤＮＡ配列及び第２のＤＮＡ配列のみが、工学的に操作された染色体若しくは病原性プラスミド挿入のためのベクター又は染色体若しくは病原性プラスミド挿入のためのＤＮＡ断片によってもたらされる。したがって、プロモーターは、組換えグラム陰性菌株の形質転換に使用されるベクターに必ずしも含まれていなくてよい、すなわち、本発明の組換えグラム陰性菌株は、プロモーターを含まないベクターを用いて形質転換することができる。発現ベクターを使用することが好ましい。通常、インビトロ及びインビボにおける細菌Ｔ３ＳＳによる真核細胞への異種タンパク質の送達のために本発明のベクターが使用される。

【0081】

エルシニア属に対する好ましい発現ベクターは、ｐＢａｄ＿Ｓｉ＿１及びｐＢａｄ＿Ｓｉ＿２からなる群から選択される。ｐＢａｄ＿Ｓｉ２は、精製ｐＹＶ４０由来のＹｏｐＥ及びＳｙｃＥに対する内因性プロモーターを含有するＳｙｃＥ−ＹｏｐＥ_{１−１３８}断片をｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることによって構築した。追加的な改変は、消化、クレノウ断片処理及び再ライゲーションによるｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡのＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ断片の除去を含む。さらに、ＹｏｐＥ_{１−１３８}の３’末端に、以下の切断部位を付加した：ＸｂａＩ−ＸｈｏＩ−ＢｓｔＢＩ−（ＨｉｎｄＩＩＩ）。ｐＢａｄ＿Ｓｉ１はｐＢａｄ＿Ｓｉ２と同等であるが、アラビノース誘導性プロモーターの下でＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ部位においてｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅されたＥＧＦＰをコードする。

【0082】

サルモネラ属に対して好ましい発現ベクターは、ｐＳｉ＿２６６、ｐＳｉ＿２６７、ｐＳｉ＿２６８及びｐＳｉ＿２６９からなる群から選択される。対応する内因性プロモーター及びＳｔｅＡ_１−２０断片（ｐＳｉ＿２６６）、完全長ＳｔｅＡ配列（ｐＳｉ＿２６７）、ＳｏｐＥ_１−８１断片（ｐＳｉ＿２６８）又はＳｏｐＥ_{１−１０５}断片（ｐＳｉ＿２６９）を含有するプラスミドｐＳｉ＿２６６、ｐＳｉ＿２６７、ｐＳｉ＿２６８及びｐＳｉ＿２６９をＳ．エンテリカＳＬ１３４４ゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ部位にクローニングした。

【0083】

本発明のベクターは、３’終止配列（終止コドン及びポリＡ配列を含む）などの他の配列エレメント、又は本ベクターを受け取った形質転換体の選択を可能にする薬物耐性を付与する遺伝子を含んでよい。

【0084】

いくつもの公知の方法により、本発明のベクターを組換えグラム陰性菌株に導入してそれを形質転換することができる。本発明の目的に関して、ベクターを導入するための形質転換の方法としては、これだけに限定されないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介性形質転換、コンジュゲーション、又はこれらの組合せが挙げられる。例えば、標準のエレクトロポレーション手順によってベクターを第１の細菌株に導入してそれを形質転換する。その後、そのようなベクターを「動員」とも称されるプロセスであるコンジュゲーションによって第１の細菌株から所望の株に移動させることができる。形質転換体（すなわち、ベクターを取り込んだグラム陰性菌株）を、例えば抗生物質を用いて選択することができる。これらの技法は当技術分野で周知である。例えば、［１３］を参照されたい。

【0085】

本発明によると、本発明の組換えグラム陰性菌株の発現ベクターのプロモーターは、それぞれの株又は適合する菌株のＴ３ＳＳエフェクタータンパク質の天然プロモーターであってよく、例えば、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属又はシュードモナス属株において有用である発現ベクター、例えば、ｐＵＣ及びｐＢａｄに使用されるプロモーターであってもよい。そのようなプロモーターは、Ｔ７プロモーター、Ｐｌａｃプロモーター又はＡｒａ−ｂａｄプロモーターである。

【0086】

組換えグラム陰性菌株がエルシニア属株である場合、プロモーターは、エルシニア属ビルロン遺伝子に由来するものであってよい。「エルシニア属ビルロン遺伝子」とは、エルシニア属ｐＹＶプラスミド上にある遺伝子を指し、その発現は温度及び標的細胞との接触の両方によって制御される。そのような遺伝子としては、分泌機構の要素をコードする遺伝子（Ｙｓｃ遺伝子）、トランスロケーターをコードする遺伝子（ＹｏｐＢ、ＹｏｐＤ、及びＬｃｒＶ）、制御エレメントをコードする遺伝子（ＹｏｐＮ、ＴｙｅＡ及びＬｃｒＧ）、Ｔ３ＳＳエフェクターシャペロンをコードする遺伝子（ＳｙｃＤ、ＳｙｃＥ、ＳｙｃＨ、ＳｙｃＮ、ＳｙｃＯ及びＳｙｃＴ）、並びにエフェクターをコードする遺伝子（ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ／ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴ及びＹｏｐＰ／ＹｏｐＪ）並びにＶｉｒＦ及びＹａｄＡなどの他のｐＹＶにコードされるタンパク質が挙げられる。

【0087】

本発明の好ましい実施形態では、プロモーターは、Ｔ３ＳＳ機能性エフェクターをコードする遺伝子の天然プロモーターである。組換えグラム陰性菌株がエルシニア属株である場合、プロモーターは、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ／ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭ及びＹｏｐＰ／ＹｏｐＪのうちの任意の１つから選択される。プロモーターはＹｏｐＥ又はＳｙｃＥ由来のものであることがより好ましい。

【0088】

組換えグラム陰性菌株がサルモネラ属株である場合、プロモーターは、ＳｐｉＩ又はＳｐｉＩＩ病原性アイランドに由来するものであってもコードされる他の箇所のエフェクタータンパク質に由来するものであってもよい。そのような遺伝子としては、分泌機構の要素をコードする遺伝子、トランスロケーターをコードする遺伝子、制御エレメントをコードする遺伝子、Ｔ３ＳＳエフェクターシャペロンをコードする遺伝子、及びエフェクターをコードする遺伝子並びにＳＰＩ−１又はＳＰＩ−２によりコードされる他のタンパク質が挙げられる。本発明の好ましい実施形態では、プロモーターは、Ｔ３ＳＳ機能性エフェクターをコードする遺伝子の天然プロモーターである。組換えグラム陰性菌株がサルモネラ属株である場合、プロモーターは、エフェクタータンパク質のうちの任意の１つから選択される。プロモーターはＳｏｐＥ、ＩｎｖＢ又はＳｔｅＡに由来するものであることがより好ましい。

【0089】

好ましい実施形態では、発現ベクターは、プロテアーゼ切断部位をコードするＤＮＡ配列を含む。機能性かつ一般に適用可能な切断部位の生成により、移行後に送達シグナルを切断することが可能になる。送達シグナルは移行したタンパク質の標的細胞内での正しい局在化及び／又は機能に干渉する可能性があるので、送達シグナルと目的のタンパク質の間にプロテアーゼ切断部位を導入することにより、初めて真核細胞へのほぼ天然のタンパク質の送達がもたらされる。プロテアーゼ切断部位は、エンテロキナーゼ（軽鎖）、エンテロペプチダーゼ、プレシジョンプロテアーゼ、ヒトライノウイルスプロテアーゼ３Ｃ、ＴＥＶプロテアーゼ、ＴＶＭＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子プロテアーゼ及びトロンビンからなる群から選択されるプロテアーゼ又はその触媒ドメインによって切断されるアミノ酸モチーフであることが好ましく、ＴＥＶプロテアーゼによって切断されるアミノ酸モチーフであることがより好ましい。同等に好ましいプロテアーゼ切断部位は、エンテロキナーゼ（軽鎖）、エンテロペプチダーゼ、プレシジョンプロテアーゼ、ヒトライノウイルスプロテアーゼ３Ｃ、ＴＥＶプロテアーゼ、ＴＶＭＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子プロテアーゼ、脱ユビキチン化酵素と称されるユビキチンプロセシングプロテアーゼ、及びトロンビンからなる群から選択されるプロテアーゼ又はその触媒ドメインによって切断されるアミノ酸モチーフである。ＴＥＶプロテアーゼによって切断されるアミノ酸モチーフ又はユビキチンプロセシングプロテアーゼによって切断されるアミノ酸モチーフが最も好ましい。

【0090】

したがって、本発明のさらなる実施形態では、異種タンパク質は、プロテアーゼにより、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルから切断される。好ましい切断方法は、
ａ）プロテアーゼが、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルと異種タンパク質としてプロテアーゼとを含む融合タンパク質を発現する本明細書に記載の組換えグラム陰性菌株によって真核細胞内に移行する、又は、
ｂ）プロテアーゼが、真核細胞において構成的に又は一過性に発現される
方法である。

【0091】

通常、真核細胞に所望のタンパク質を送達するために使用される組換えグラム陰性菌株と真核細胞にプロテアーゼを移行させる組換えグラム陰性菌株は異なる。

【0092】

本発明の一実施形態では、ベクターは、標識分子又は標識分子のアクセプター部位をコードするさらなるＤＮＡ配列を含む。標識分子又は標識分子のアクセプター部位をコードするさらなるＤＮＡ配列は、通常、第２のＤＮＡ配列の５’末端又は３’末端と融合させる。好ましい標識分子又は標識分子のアクセプター部位は、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、クマリン、クマリンリガーゼアクセプター部位、レゾルフィン、レゾルフィンリガーゼアクセプター部位、ＦｌＡｓＨ／ＲｅＡｓＨ色素（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に使用するテトラ−システインモチーフからなる群から選択される。レゾルフィン及びレゾルフィンリガーゼアクセプター部位又はＥＧＦＰが最も好ましい。標識分子又は標識分子のアクセプター部位の使用により、標識分子が目的の異種タンパク質に付着し、次いで、それにより、真核細胞にそのように送達され、例えば生細胞顕微鏡によってタンパク質を追跡することが可能になる。

【0093】

本発明の一実施形態では、ベクターは、ペプチドタグをコードするさらなるＤＮＡ配列を含む。ペプチドタグをコードするさらなるＤＮＡ配列は、通常、第２のＤＮＡ配列の５’末端又は３’末端と融合させる。好ましいペプチドタグは、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグ、Ｓｔｒｅｐタグ又はＶ５タグ又はこれらの群のうちの２種以上の組合せからなる群から選択される。Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、及びＭｙｃタグとＨｉｓタグの混合が最も好ましい。ペプチドタグの使用により、例えば免疫蛍光又は抗タグ抗体を使用したウェスタンブロット法による、タグを付けたタンパク質のトレーサビリティがもたらされる。さらに、ペプチドタグの使用により、培養上清中への分泌後又は真核細胞への移行後のいずれかに、どちらの場合でも対応するタグに適した精製方法（例えば、Ｈｉｓタグとの使用では金属−キレートアフィニティー精製又はＦｌａｇタグとの使用では抗Ｆｌａｇ抗体に基づく精製）を使用して、所望のタンパク質のアフィニティー精製が可能になる。

【0094】

本発明の一実施形態では、ベクターは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードするさらなるＤＮＡ配列を含む。核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードするさらなるＤＮＡ配列は、通常、第２のＤＮＡ配列の５’末端又は３’末端と融合させ、前記さらなるＤＮＡ配列は、核局在化シグナルをコードする（ＮＬＳ）。好ましいＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ−抗原ＮＬＳ及びその誘導体［４４］並びに他のウイルスＮＬＳからなる群から選択される。ＳＶ４０ラージＴ−抗原ＮＬＳ及びその誘導体が最も好ましい。

【0095】

本発明の一実施形態では、ベクターは、多重クローニング部位を含む。多重クローニング部位は、通常、第１のＤＮＡ配列の３’末端及び／又は第２のＤＮＡ配列の５’末端若しくは３’末端に位置する。１又は１を超える多重クローニング部位がベクターに含まれていてよい。好ましい多重クローニング部位は、ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＢｓｔＢＩからなる制限酵素群から選択される。ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＢｓｔＢＩ及びＨｉｎｄＩＩＩが最も好ましい。

【0096】

ベクターの融合した第１のＤＮＡ配列及び第２のＤＮＡ配列及び任意選択の第３のＤＮＡ配列から発現されるタンパク質は、「融合タンパク質」又は「ハイブリッドタンパク質」、すなわち、送達シグナルと異種タンパク質の融合タンパク質又はハイブリッドとも称される。融合タンパク質は、例えば、送達シグナル及び２種以上の異なる異種タンパク質を含んでもよい。

【0097】

本発明は、細胞培養物中で並びにインビボにおいて真核細胞に上記の異種タンパク質を送達するための方法を意図している。

【0098】

したがって、一実施形態では、異種タンパク質を送達するための方法は、
ｉ）本明細書に記載のグラム陰性菌株を培養すること、
ｉｉ）真核細胞とｉ）のグラム陰性菌株を接触させることであり、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルと異種タンパク質とを含む融合タンパク質がグラム陰性菌株により発現され、真核細胞内に移行すること、及び任意選択的に、
ｉｉｉ）融合タンパク質を切断し、したがって、異種タンパク質が細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルから切断されること
を含む。

【0099】

一部の実施形態では、本発明の方法により、それぞれが細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルと異種タンパク質とを含む少なくとも２つの融合タンパク質がグラム陰性菌株により発現され、真核細胞内に移行する。

【0100】

組換えグラム陰性菌株は、当技術分野で公知の方法に従って（例えば、ＦＤＡ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（ＢＡＭ）、第８章：腸炎エルシニア）、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルと異種タンパク質とを含む融合タンパク質が発現されるように培養することができる。好ましくは、組換えグラム陰性菌株は、ブレインハートインフュージョンブロス中、例えば、２８℃で培養することができる。Ｔ３ＳＳ及び例えばＹｏｐＥ／ＳｙｃＥプロモーター依存性遺伝子の発現を誘導するために、細菌を３７℃で増殖させることができる。

【0101】

好ましい実施形態では、真核細胞をｉ）の２種のグラム陰性菌株と接触させ、ここで、第１のグラム陰性菌株は、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルと第１の異種タンパク質とを含む第１の融合タンパク質を発現し、第２のグラム陰性菌株は、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルと第２の異種タンパク質とを含む第２の融合タンパク質を発現し、したがって、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質が真核細胞内に移行する。この実施形態では、例えば、例えば、２種の異なるハイブリッドタンパク質を、それらの機能性相互作用を扱うために単一細胞に送達するために有効な方法として、例えば２種の菌株を用いた真核細胞の同時感染がもたらされる。

【0102】

本発明は、本組換えグラム陰性菌株による標的とすることができる広範囲の真核細胞、例えば、Ｈｉ−５（ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４；ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｂ８５５−０２）、ＨｅＬａ細胞、例えば、ＨｅＬａ Ｃｃｌ２（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２）、線維芽細胞、例えば、３Ｔ３線維芽細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−９２）又はＭｅｆ（ＡＴＣＣ番号ＳＣＲＣ−１０４０）、Ｈｅｋ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）、ＨＵＶＥＣ（ＡＴＣＣ番号ＰＣＳ−１００−０１３）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−６１）、ジャーカット（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１５２）、Ｓｆ−９（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７１１）、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８０６５）、Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−３４）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−２０２）、Ｊ７７４（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−６７）、ＲＡＷ（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−７１）、Ｃａｃｏ２（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−３７）、ＮＣＩ細胞株（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１８２）、ＤＵ１４５（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−８１）、Ｌｎｃａｐ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７４０）、ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−２２）、ＭＤＡ−ＭＢ細胞株（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１２８）、ＰＣ３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４３５）、Ｔ４７Ｄ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２８６５）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１８５）、Ｕ８７（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１４）、ＳＨＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２２６６ｓ）、Ｅａ．Ｈｙ９２６（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２９２２）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢＨ−８５）、４Ｔ１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２５３９）、Ｂ１６Ｆ１０（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−６４７５）、又は初代ヒト肝細胞（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＨＭＣＰＩＳ）、好ましくはＨｅＬａ、Ｈｅｋ、ＨＵＶＥＣ、３Ｔ３、ＣＨＯ、ジャーカット、Ｓｆ−９、ＨｅｐＧ２ Ｖｅｒｏ、ＴＨＰ−１、Ｃａｃｏ２、Ｍｅｆ、Ａ５４９、４Ｔ１、Ｂ１６Ｆ１０及び初代ヒト肝細胞、並びに最も好ましくはＨｅＬａ、Ｈｅｋ、ＨＵＶＥＣ、３Ｔ３、ＣＨＯ、ジャーカット、ＴＨＰ−１、Ａ５４９及びＭｅｆを意図している。「標的」とは、組換えグラム陰性菌株の真核細胞への細胞外接着を意味する。

【0103】

本発明によると、タンパク質の送達は、適切な条件下で真核細胞に組換えグラム陰性菌株を接触させることによって実現することができる。当業者には、所望の温度、Ｃａ^＋＋濃度、コンゴーレッドのような誘導因子の添加、組換えグラム陰性菌株と標的細胞を混合する様式などを含めた、ビルロン遺伝子の発現及び移行を誘導するための条件に関して種々の参考文献及び技法が慣習的に利用可能である。例えば、［４５］を参照されたい。条件は、標的とする真核細胞の型及び使用する組換え細菌株に応じて変動し得る。当業者はそのような変動に従来の技法を使用して対処することができる。

【0104】

当業者は、いくつものアッセイを使用して、融合タンパク質の送達が上手くいったかどうかを決定することもできる。例えば、融合タンパク質は、融合タグ（Ｍｙｃタグのような）を認識する抗体を使用して免疫蛍光によって検出することができる。決定は、送達されるタンパク質の酵素活性、例えば、［１３］に記載されているアッセイに基づくものであってもよい。

【0105】

一実施形態では、本発明は、異種タンパク質を精製する方法であって、本明細書に記載のグラム陰性菌株を培養し、したがって細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルと異種タンパク質とを含む融合タンパク質が発現され、培養物の上清中に分泌される方法を提供する。発現させる融合タンパク質は、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルと異種タンパク質の間のプロテアーゼ切断部位をさらに含んでよく、かつ／又は、ペプチドタグをさらに含んでよい。

【0106】

したがって、特定の実施形態では、異種タンパク質を精製する方法は、
ｉ）本明細書に記載のグラム陰性菌株を培養し、したがって細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナル、異種タンパク質及び細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルと異種タンパク質の間のプロテアーゼ切断部位を含む融合タンパク質が発現され、培養物の上清中に分泌されること、
ｉｉ）プロテアーゼを培養物の上清に添加し、ここで、プロテアーゼにより、融合タンパク質が切断され、したがって異種タンパク質が細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルから切断されること、
ｉｉｉ）任意選択的に、培養物の上清から異種タンパク質を単離こと
を含む。

【0107】

したがって、別の特定の実施形態では、異種タンパク質を精製する方法は、
ｉ）本明細書に記載のグラム陰性菌株を培養し、したがって細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナル、異種タンパク質及びペプチドタグを含む融合タンパク質が発現され、培養物の上清中に分泌されること、
ｉｉ）ペプチドタグを、例えば上清のアフィニティーカラム精製によって標的化すること
を含む。

【0108】

したがって、別の特定の実施形態では、異種タンパク質を精製する方法は、
ｉ）本明細書に記載のグラム陰性菌株を培養し、したがって細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナル、異種タンパク質、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルと異種タンパク質の間のプロテアーゼ切断部位及びペプチドタグを含む融合タンパク質が発現され、培養物の上清中に分泌されること、
ｉｉ）プロテアーゼを培養物の上清に添加し、ここで、プロテアーゼにより、融合タンパク質が切断され、したがって異種タンパク質が細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルから切断されること、
ｉｉ）ペプチドタグを、例えば上清のアフィニティーカラム精製によって標的化すること
を含む。

【0109】

上記の特定の実施形態では、プロテアーゼを、例えば精製プロテアーゼタンパク質の形態で、又は、プロテアーゼを発現し、培養物の上清に分泌する菌株を添加することにより、培養物の上清に添加することができる。さらなる工程は、例えばアフィニティーカラム精製により、プロテアーゼを除去することを含んでよい。

【0110】

一実施形態では、本発明は、薬に使用するための、本明細書に記載の組換えグラム陰性菌株を提供する。

【0111】

一実施形態では、本発明は、異種タンパク質を医薬として又はワクチンとして対象に送達することに使用するための、本明細書に記載の組換えグラム陰性菌株を提供する。異種タンパク質は、例えば生きている動物を用い、インビボにおいてグラム陰性菌株を真核細胞に接触させることにより、ワクチンとして対象に送達することができ、したがって、異種タンパク質が生きている動物内に移行し、次いで、異種タンパク質に対する抗体が産生される。産生された抗体は、直接使用することもでき、単離し、精製し、診断、研究的使用、並びに療法において使用することもできる。抗体を産生するＢ細胞又はそれに含有されるＤＮＡ配列を、診断、研究的使用並びに療法において使用するための特異的抗体のさらなる産生のために使用することができる。

【0112】

一実施形態では、本発明は、異種タンパク質を送達するための方法であって、異種タンパク質をインビトロにおいて真核細胞に送達する方法を提供する。

【0113】

さらなる実施形態では、本発明は、異種タンパク質を送達するための方法であって、真核細胞が生きている動物であり、生きている動物をインビボにおいてグラム陰性菌株と接触させ、したがって、融合タンパク質が生きている動物内に移行する方法を提供する。好ましい動物は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。

【0114】

さらなる実施形態では、本発明は、移行した異種タンパク質（一又は複数）によって誘発される細胞経路又は事象に対する阻害剤のハイスループットスクリーニングのための、上記の組換えグラム陰性菌株の使用を提供する。

【0115】

さらなる実施形態では、本発明は、グラム陰性菌株のライブラリーであって、グラム陰性菌株の発現ベクターの第２のＤＮＡ配列によりコードされる異種タンパク質が、ヒトタンパク質又はマウスタンパク質、好ましくはヒトタンパク質であり、グラム陰性菌株によって発現されるヒトタンパク質又はマウスタンパク質それぞれのアミノ酸配列が異なるライブラリーを提供する。可能性のあるライブラリーは、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ ｈｕｍａｎ ｋｉｎａｓｅ Ｏｒｆ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｎｏ．１０００００００１４）を含有するタンパク質５６０種を含有する。発現させるためのクローニングベクターとして上記の発現ベクターを使用することができる。

【0116】

さらなる実施形態では、本発明は、本明細書に記載のベクター及びベクターに含まれるプロテアーゼ切断部位を切断することが可能なプロテアーゼを発現し、分泌する菌株を含むキットを提供する。特定の有用なベクターは、上記の通り真核細胞に所望のタンパク質を送達するために菌株と組み合わせて使用するためのベクターであり、ベクターは、５’から３’の方向に、
プロモーター、
前記プロモーターに作動可能に連結した、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナルをコードする第１のＤＮＡ配列、
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合した、異種タンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列、及び代替として
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端と前記第２のＤＮＡ配列の５’末端の間に位置する、プロテアーゼ切断部位をコードする第３のＤＮＡ配列
を含む。

【実施例】

【0117】

実施例１
Ａ）材料及び方法
菌株及び増殖条件。本試験において使用した株は図１５Ａ〜Ｍに列挙されている。プラスミド精製及びクローニングのために使用する大腸菌Ｔｏｐ１０、及びコンジュゲーションのために使用する大腸菌Ｓｍ１０ λ ｐｉｒ、並びにｐＫＮＧ１０１を伝播するために使用する大腸菌ＢＷ１９６１０［４６］をＬＢ寒天プレート上、及びＬＢブロス中、３７℃で常套的に増殖させた。発現ベクターを選択するために、アンピシリンを２００μｇ／ｍｌ（エルシニア属）又は１００μｇ／ｍｌ（大腸菌）の濃度で使用した。自殺ベクターを選択するために、ストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌの濃度で使用した。アンピシリン非耐性Ｅ４０−誘導体［１３］であるＹ．エンテロコリチカＭＲＳ４０［３６］及びそれに由来する株をブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ；Ｄｉｆｃｏ）上、室温で常套的に増殖させた。全てのＹ．エンテロコリチカ株にナリジクス酸を添加し（３５μｇ／ｍｌ）、全てのＹ．エンテロコリチカａｓｄ株には、１００μｇ／ｍｌのメソ−２，６−ジアミノピメリン酸（ｍＤＡＰ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をさらに補充した。Ｓ．エンテリカＳＬ１３４４をＬＢ寒天プレート上、及びＬＢブロス中、３７℃で常套的に増殖させた。Ｓ．エンテリカにおける発現ベクターを選択するために、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で使用した。

【0118】

Ｙ．エンテロコリチカの遺伝子操作。Ｙ．エンテロコリチカの遺伝子操作に関しては記載されている［４７、４８］。簡単に述べると、ｐＹＶプラスミド内又は染色体上の遺伝子の改変又は欠失のための突然変異誘発物を、精製ｐＹＶ４０プラスミド又はゲノムＤＮＡを鋳型として使用した２断片オーバーラップＰＣＲによって構築し、それにより、それぞれの遺伝子の欠失又は改変部分の両側の、２００−２５０ｂｐのフランキング配列をもたらした。得られた断片を、大腸菌ＢＷ１９６１０［４６］においてｐＫＮＧ１０１［４３］にクローニングした。配列が検証されたプラスミドを大腸菌Ｓｍ１０ λ ｐｉｒ中に導入してそれを形質転換し、そこからプラスミドを対応するＹ．エンテロコリチカ株に動員した。組み込まれたベクターを有する突然変異体を、選択圧力を伴わずに数世代にわたって繁殖させた。次いで、ショ糖を使用してベクターが失われたクローンを選択した。最終的に、コロニーＰＣＲによって突然変異体を同定した。

【0119】

プラスミドの構築。プラスミドｐＢａｄ＿Ｓｉ２又はｐＢａｄ＿Ｓｉ１（図１０）をＹｏｐＥのＮ末端の１３８アミノ酸を有する融合タンパク質のクローニングのために使用した（配列番号２）。ｐＢａｄ＿Ｓｉ２は、精製ｐＹＶ４０由来のＹｏｐＥ及びＳｙｃＥに対する内因性プロモーターを含有するＳｙｃＥ−ＹｏｐＥ_{１−１３８}断片をｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることによって構築した。追加的な改変は、消化によるｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡのＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ断片の除去、クレノウ断片処理及び再ライゲーションを含む。双方向転写ターミネーター（ＢＢａ＿Ｂ１００６；ｉＧＥＭ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）をＫｐｎＩで切り取りクレノウ処理した部位（ｐＢａｄ＿Ｓｉ２）又はＢｇｌＩＩ切り取り部位（ｐＢａｄ＿Ｓｉ１）にクローニングした。さらにＹｏｐＥ_{１−１３８}の３’末端に以下の切断部位を付加した：ＸｂａＩ−ＸｈｏＩ−ＢｓｔＢＩ−（ＨｉｎｄＩＩＩ）（図１０Ｂ）。ｐＢａｄ＿Ｓｉ１はｐＢａｄ＿Ｓｉ２と同等であるが、アラビノース誘導性プロモーターの下でＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ部位においてｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅されたＥＧＦＰをコードする。対応する内因性プロモーター及びＳｔｅＡ_１−２０断片（ｐＳｉ＿２６６）、完全長ＳｔｅＡ配列（ｐＳｉ＿２６７）、ＳｏｐＥ_１−８１断片（ｐＳｉ＿２６８）又はＳｏｐＥ_{１−１０５}断片（ｐＳｉ＿２６９）を含有するプラスミドｐＳｉ＿２６６、ｐＳｉ＿２６７、ｐＳｉ＿２６８及びｐＳｉ＿２６９をＳ．エンテリカＳＬ１３４４ゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ部位にクローニングした。

【0120】

完全長遺伝子又はその断片を、以下の表Ｉに列挙されている特異的なプライマーを用いて増幅し、ＹｏｐＥ_{１−１３８}との融合物としてプラスミドｐＢａｄ＿Ｓｉ２に、又はｚ−ＢＩＭ（配列番号２１）の場合にはｐＢａｄ＿Ｓｉ１にクローニングした（以下の表ＩＩを参照されたい）。ＳｔｅＡ又はＳｏｐＥと融合するために、合成ＤＮＡ構築物をＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩによって切断し、それぞれｐＳｉ＿２６６、ｐＳｉ＿２６７、ｐＳｉ＿２６８又はｐＳｉ＿２６９にクローニングした。細菌種の遺伝子の場合には、精製ゲノムＤＮＡを鋳型として使用した（Ｓ．フレックスネリＭ９０Ｔ、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＳＬ１３４４、バルトネラ・ヘンセラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）ＡＴＣＣ４９８８２）。ヒト遺伝子に関しては、別途指定のない限りユニバーサルｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し（図１５Ａ〜Ｍ）、ゼブラフィッシュ遺伝子はｃＤＮＡライブラリー（Ｍ．Ａｆｆｏｌｔｅｒからの好意の寄贈品）から増幅した。ライゲーションしたプラスミドを大腸菌Ｔｏｐ１０にクローニングした。配列決定したプラスミドを所望のＹ．エンテロコリチカ又はＳ．エンテリカ株に標準の大腸菌エレクトロポレーションに関する設定を使用してエレクトロポレーションにより導入した。

【0121】

Ｙｏｐ分泌。培養物をＢＨＩ−Ｏｘ中３７℃（分泌許容条件）にシフトさせることによってｙｏｐレギュロンの誘導を実施した［４９］。炭素源としてグルコースを添加した（４ｍｇ／ｍｌ）。

【0122】

総細胞画分及び上清画分を、４℃、２０８００ｇで１０分遠心分離することによって分離した。細胞ペレットを総細胞画分として取得した。上清中のタンパク質を、最終的に１０％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸を用い、４℃で１時間にわたって沈澱させた。遠心分離し（２０８００ｇで１５分）、上清を除去した後、得られたペレットを氷冷のアセトンで一晩洗浄した。試料を再度遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを風乾し、１×ＳＤＳローディング色素中に再懸濁させた。

【0123】

分泌タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。それぞれの場合において、レーン当たり細菌３×１０^８個から分泌されたタンパク質をローディングした。免疫ブロッティングによる特定の分泌タンパク質の検出を、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して実施した。総細胞中のタンパク質を検出するために、別途指定のない限りレーン当たり細菌２×１０^８個をローディングし、タンパク質を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した後、免疫ブロッティングによって検出した。

【0124】

ＹｏｐＥに対するラットモノクローナル抗体（ＭＩＰＡ１９３−１３Ａ９；１：１０００、［５０］）を使用して免疫ブロッティングを行った。バックグラウンド染色を低下させるために、抗血清をＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄに対して２回、一晩にわたって予備吸収させた。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（１：５０００；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｉｏｔｅｃｈ）とコンジュゲートした、ラット抗体を対象とする二次抗体を用いて検出を実施した後、ＥＣＬ化学発光基質（ＬｕｍｉＧｌｏ、ＫＰＭ）を用いて展開した。

【0125】

細胞培養及び感染。ＨｅＬａ Ｃｃｌ２、スイス３Ｔ３線維芽細胞、４Ｔ１、Ｂ１６Ｆ１０及びＤ２Ａ１を、１０％ＦＣＳ及び２ｍＭのＬ−グルタミン（ｃＤＭＥＭ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＨＵＶＥＣを単離し、記載の通り培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｅ）した［５１］。ジャーカット及び４Ｔ１細胞を、１０％ＦＣＳ及び２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０で培養した。Ｙ．エンテロコリチカを、添加剤を伴うＢＨＩ中、室温で一晩増殖させ、新鮮なＢＨＩ中、ＯＤ_６００が０．２になるまで希釈し、室温で２時間増殖させた後、３７℃ウォーターバス振とう機への温度シフトをさらに３０分又はＥＧＦＰの送達の場合には１時間にわたって行った。最後に、細菌を遠心分離によって（６０００ｒｃｆ、３０秒）収集し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＤＭＥＭを用いて１回洗浄した。Ｓ．エンテリカを、添加剤を伴うＬＢ中、３７℃で一晩増殖させ、新鮮なＬＢ中１：４０に希釈し、３７℃で２．５時間増殖させた（ＳｐｉＩ Ｔ３ＳＳ誘導条件）か、又は一晩培養物を３７℃でさらにインキュベートした（ＳｐｉＩＩ Ｔ３ＳＳ誘導条件）。最後に、細菌を遠心分離によって（６０００ｒｃｆ、３０秒）収集し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＤＭＥＭを用いて１回洗浄した。９６ウェルプレート（免疫蛍光用）又は６ウェルプレート（ウェスタンブロット法用）に播種した細胞を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ中、示されている感染多重度で感染させた。細菌を添加した後、プレートを１７５０ｒｐｍで１分遠心分離し、示されている期間にわたって３７℃に置いた。必要であれば細胞外細菌をゲンタマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）によって死滅させた。免疫蛍光法分析の場合、４％ＰＦＡ固定により感染アッセイを停止させた。ウェスタンブロット分析に関しては、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓａｆｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加して細胞を溶解させた。氷上でインキュベートした後、細胞を遠心分離した（１６０００ｒｃｆ、２５分、４℃）。上清を収集し、総タンパク質含有量をＢｒａｄｆｏｒｄ ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって分析した後、ＳＤＳ ＰＡＧＥ、並びに抗リン酸化Ａｋｔ抗体（Ｓｅｒ４７３及びＴ３０８、どちらもＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗アクチン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗Ｂｉｄ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗Ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、抗ｐ３８抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗リン酸化ｐ−３８抗体（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗カスパーゼ−３ ｐ１７抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及び抗Ｉｎｋ４Ｃ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用したウェスタンブロット法を行った。

【0126】

Ｓ．エンテリカを用いた分泌分析。Ｓ．エンテリカによるタンパク質分泌を誘導するために、Ｓ．エンテリカを０．３ＭのＮａＣｌを含有するＬＢ中、オービタルシェーカー（１５０ｒｐｍに設定）で一晩培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｅ）した。次いで、Ｓ．エンテリカを、０．３ＭのＮａＣｌを含有する新鮮なＬＢ中１：５０に希釈し、振とうせずに３７℃で４時間増殖させた。

【0127】

総細胞及び上清画分を、４℃、２０８００ｇで２０分遠心分離することによって分離した。細胞ペレットを総細胞画分として取得した。上清中のタンパク質を、最終的に１０％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸を用いて４℃で１時間にわたって沈澱させた。遠心分離し（２０８００ｇで１５分）、上清を除去した後、得られたペレットを氷冷のアセトンで一晩洗浄した。試料を再度遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを風乾し、１×ＳＤＳローディング色素に再懸濁させた。

【0128】

分泌タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した；それぞれの場合において、レーン当たり細菌３×１０^８個から分泌されたタンパク質をローディングした。免疫ブロッティングによる特定の分泌タンパク質の検出を、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して実施した。総細胞中のタンパク質を検出するために、別途指定のない限りレーン当たり細菌２×１０^８個をローディングし、タンパク質を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した後、免疫ブロッティングによって検出した。抗Ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を使用して免疫ブロッティングを行った。

【0129】

感染細胞からＴ３ＳＳにより移行したタンパク質のウェスタンブロット法。６ウェルプレートに入れたＨｅＬａ細胞を、上記の通り、感染多重度１００で感染させた。ＴＥＶプロテアーゼ移行性Ｙ．エンテロコリチカ株との同時感染の場合には、当該株のＯＤ_６００を設定し、２種の細菌懸濁液をチューブ中、１：１の比（特に指定がない限り）で混合した後、細胞に添加した。感染の最後に、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、小さな体積の氷冷ＰＢＳ中にかき入れることによって収集した。遠心分離した後（１６０００ｒｃｆ、５分、４℃）、ペレットをプロテアーゼ阻害剤反応混液（Ｒｏｃｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ）を補充した０．００２％ジギトニン中に溶解させた。溶解させたペレット氷上で５分インキュベートし、次いで、遠心分離した（１６０００ｒｃｆ、２５分、４℃）。上清を収集し、総タンパク質含有量をＢｒａｄｆｏｒｄ ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって分析した後、ＳＤＳ ＰＡＧＥ、及び抗Ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、９Ｅ１１）又は抗Ｉｎｋ４Ｃ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用したウェスタンブロット法を行った。

【0130】

免疫蛍光。９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した細胞を上記の通り感染させ、４％ＰＦＡを用いて固定した後、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。次いで、ウェルを、０．３％トリトンＸ１００を伴うＰＢＳ中５％ヤギ血清を使用して室温で１時間にわたってブロッキングした。一次抗体（抗Ｍｙｃ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、１：１００）を１％ＢＳＡ及び０．３％トリトンＸ１００を伴うＰＢＳ中に希釈し、細胞４℃で一晩インキュベートした。細胞をＰＢＳで４回洗浄した後、１％ＢＳＡ及び０．３％トリトンＸ１００を伴うＰＢＳ中に希釈した二次抗体（ＡＦ４８８抗マウス、ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：２５０）を添加した。必要であれば、ヘキストＤＮＡ染色（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：２５００）及び／又はアクチン染色（Ｄｙ６４７−ファロイジン、ＤｙｅＯｍｉｃｓ）を含めた。いくつかの場合には、ＰＦＡを洗い流した直ぐ後にＤＮＡ及び／又はアクチン染色のみを適用した。細胞を室温で１時間にわたってインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、下記の通り自動画像解析によって解析した。

【0131】

自動顕微鏡及び画像解析。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＵＳＡ）を用いて画像を自動で取得した。抗Ｍｙｃ染色強度の数量化を、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＵＳＡ）を使用して実施した。核領域及び細菌を含有する領域を除く細胞内の領域を手動で選択し（面積４０ピクセルの円）、平均強度を記録した。

【0132】

リン酸化ｐ３８のＴＮＦα刺激及びウェスタンブロット法。６ウェルプレートに播種したＨｅＬａ細胞を、上記の通り、感染多重度１００で感染させた。感染の３０分後にゲンタマイシンを添加し、感染の４５分後にＴＮＦａを添加した（１０ｎｇ／ｍｌ）。感染の１時間１５分後に細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓａｆｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加して細胞を溶解させた。氷上でインキュベートした後、細胞を遠心分離した（１６０００ｒｃｆ、２５分、４℃）。上清を収集し、総タンパク質含有量をＢｒａｄｆｏｒｄ ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって分析した後、ＳＤＳ ＰＡＧＥ、並びに抗リン酸化ｐ３８、総ｐ３８抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及び抗アクチン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したウェスタンブロット法を行った。

【0133】

感染ＨｅＬａ細胞のｃＡＭＰレベル決定。９６ウェルプレートに播種したＨｅＬａ細胞を上記の通り感染させた。感染の３０分前に、ｃＤＭＥＭを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び２ｍＭのＬ−グルタミン及び１００μＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＤＭＥＭに変えた。感染の６０分後にゲンタマイシンを添加し、細胞を３７℃でさらに９０分インキュベートした。ｃＡＭＰの決定を、競合ＥＬＩＳＡを製造者の説明書（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ｃＡＭＰ Ｂｉｏｔｒａｋ、ＲＰＮ２２５）に従って使用して実施した。ポジティブコントロールとして、示されている量のコレラ毒素（Ｃ８０５２、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び２ｍＭのＬ−グルタミン及び１００μＭのＩＢＭＸを補充したＤＭＥＭ中の細胞に１時間にわたって添加した。

【0134】

ゼブラフィッシュ胚感染、イメージング及び自動画像数量化。動物実験は全て、承認されたガイドラインに従って実施した。ゼブラフィッシュを標準の条件で維持した［５２］。胚を、２８．５℃における受精後の時間（ｈｐｆ）によって段階分けした［５３］。本試験では以下のゼブラフィッシュ系統を使用した：野生型フィッシュ（ＡＢ／ＥＫ及びＥＫ／ＴＬ）。感染プロトコールは［５４］に示されているガイドラインに従った。１２ｈｐｆ胚を、０．２ｍＭのＮ−フェニルチオ尿素（ＰＴＵ）を含有するＥ３培地中で維持して色素形成を防止した。受精後２日（ｄｐｆ）胚を０．２ｍｇ／ｍｌのトリカインによって麻酔し、ヘアループツールを使用してＥ３中１％寒天プレートに並べた［５４］。Ｙ．エンテロコリチカを、０．４％アラビノース、抗生物質及びｍＤａｐを補充したＢＨＩ中、室温で一晩増殖させ、０．５％アラビノース及び他の添加剤を伴う新鮮なＢＨＩ中、ＯＤ_６００が０．２になるまで希釈し、室温で２時間増殖させた後、３７℃ウォーターバス振とう機に温度シフトし、さらに４５分置いた。最後に、細菌を遠心分離によって（６０００ｒｃｆ、３０秒）収集し、ＰＢＳで１回洗浄した。ｍＤＡＰを含有するＰＢＳ中、ＯＤ_６００を２に設定した。この懸濁液１−２ｎＬを並べたゼブラフィッシュ胚の後脳に、Ｆｅｍｔｏｊｅｔ Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用し、ニードルの先端を細かいピンセットで取り除いたＦｅｍｔｏｔｉｐｓ ＩＩ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して注射した。注射時間を０．２秒に設定し、補償圧力を１５ｈＰａに設定し（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｆｅｍｔｏｊｅｔ）、注射圧力を６００ｈＰａから８００ｈＰａの間に調整した。液滴サイズ、したがって種菌を、顕微鏡によって、及びコントロールプレーティングによって確認した。マイクロインジェクション後、フィッシュをトリカイン及びＰＴＵを含有するＥ３中に収集し、３７℃で３０分インキュベートし、２８℃でさらに５時間インキュベートした。感染の１時間後にゼブラフィッシュ後脳における細菌ＥＧＦＰ蛍光を蛍光双眼鏡（Ｌｅｉｃａ）を使用して観察し、適正に注射されなかった胚を廃棄した。感染の最後に、フィッシュを、２％氷冷ＰＦＡを用いて氷上で１時間にわたって固定し、さらに新鮮な氷冷ＰＦＡを用いて４℃で一晩固定した。抗体染色を以前に記載されている通り実施した［５５、５６］。簡単に述べると、胚をＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎを用いて４回、各洗浄について５分にわたって洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ＋０．５％トリトンＸ１００を用いて室温で３０分にわたって透過処理した。胚をブロッキング溶液（ＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎ ０．１％トリトンＸ−１００ ５％ヤギ血清及び１％ＢＳＡ）中、４℃で一晩ブロッキングした。抗体（Ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ−３（Ａｓｐ１７５）、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）をブロッキング溶液中１：１００に希釈し、暗闇中４℃で振とうしながらインキュベートした。フィッシュを、ＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎを用いて３０分にわたって７回洗浄した後、ブロッキング溶液中に希釈した二次抗体（ヤギ抗ウサギＡＦ６４７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：５００）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。幼生を、ＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎを用いて４℃で３０分にわたって４回、及び一晩にわたって１回洗浄し、さらに３−４回洗浄した。４０×水浸対物レンズを使用したＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡を用いて画像を取得した。Ｉｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）及びＩｍａｇｅ Ｊソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を使用して画像を解析した。

【0135】

記録されたｚスタック画像の最大値ｚ投影に対して画像解析（ｐＢａｄ＿Ｓｉ２についてｎ＝１４又はｚ−ＢＩＭについてｎ＝１９）をＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ［５７］によって実施した。簡単に述べると、細菌をＧＦＰチャネルによって検出した。細菌斑点の各領域の周囲に半径１０ピクセルの円を創出した。重複する領域を接しているメンバーの間で同等に分割した。細菌を密接に取り囲むこれらの領域において、カスパーゼ３ ｐ１７染色強度を測定した。

【0136】

リン酸化プロテオミクスのための試料の調製。各条件について、６ウェルプレート２つのＨｅＬａ ＣＣＬ−２細胞をコンフルエンスまで増殖させた。細胞を上記の通り３０分にわたって感染させた。示されている時点で、プレートを氷上に置き、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、試料を尿素溶液［８Ｍの尿素（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）、０．１Ｍの炭酸水素アンモニウム（Ｓｉｇｍａ）、０．１％のＲａｐｉＧｅｓｔ（Ｗａｔｅｒｓ）、１×ＰｈｏｓＳＴＯＰ（Ｒｏｃｈｅ）］中に収集した。試料を手短にボルテックスし、４℃で超音波処理し（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）、ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で５分振とうし、４℃、１６０００ｇで２０分遠心分離した。上清を収集し、さらに処理するために−８０℃で保管した。ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質の濃度を測定した。

【0137】

リンペプチド濃縮。ジスルフィド結合を、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンを最終濃度１０ｍＭで用いて３７℃で１時間にわたって還元した。遊離チオールを、２０ｍＭのヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）を用いて、暗闇中、室温で３０分にわたってアルキル化した。過剰ヨードアセトアミドを、Ｎ−アセチルシステインを最終濃度２５ｍＭで用いて室温で１０分にわたってクエンチした。Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ（Ｗａｋｏ）を添加して最終的な酵素／タンパク質比を１：２００（ｗ／ｗ）にし、３７℃で４時間インキュベートした。その後、溶液を、０．１Ｍの炭酸水素アンモニウム（Ｓｉｇｍａ）を用いて尿素２Ｍ未満の最終濃度まで希釈し、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｇｒａｄｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をタンパク質：酵素比５０：１で用いて３７℃で一晩消化した。ペプチドをＣ１８ Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）で脱塩し、真空下で乾燥した。リンペプチドを総ペプチド質量２ｍｇからＴｉＯ_２を用いて以前に記載されている通り［５８］単離した。簡単に述べると、乾燥したペプチドを、フタル酸を染み込ませた８０％アセトニトリル（ＡＣＮ）−２．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液に溶解させた。ペプチドを、ブロッキングしたＭｏｂｉｃｏｌスピンカラム（ＭｏＢｉＴｅｃ）中、同量の平衡化ＴｉＯ_２（ビーズサイズ５μｍ、ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に添加し、それを転倒回転させながら３０分インキュベートした。カラムを飽和フタル酸酸性溶液で２回洗浄し、８０％ＡＣＮ及び０．１％のＴＦＡで２回洗浄し、最終的に、０．１％のＴＦＡで２回洗浄した。ペプチドを、０．３ＭのＮＨ_４ＯＨ溶液を用いて溶出した。溶出液のｐＨは５％のＴＦＡ溶液及び２ＭのＨＣｌを用いて２．５未満に調整した。リンペプチドを再度、ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ Ｃ１８カートリッジ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて脱塩した。

【0138】

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析。１．９μｍのＣ１８樹脂（Ｒｅｐｒｏｓｉｌ−ＡＱ Ｐｕｒ、Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ）を社内で充填した加熱したＲＰ−ＨＰＬＣカラム（７５μｍ×４５ｃｍ）を備えたＥＡＳＹ ｎａｎｏ−ＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してペプチドのクロマトグラフィーによる分離を行った。毎分２００ｎｌの流速、１２０分にわたって９８％溶媒Ａ（０．１５％ギ酸）及び２％溶媒Ｂ（９８％アセトニトリル、２％水、０．１５％ギ酸）から３０％溶媒Ｂまでの直線勾配を使用して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの実行当たり総リンペプチド試料１μｇのアリコートを分析した。質量分析は、ナノエレクトロスプレーイオン供給源を備えた二重圧力ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（どちらもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施した。各ＭＳ１スキャン（Ｏｒｂｉｔｒａｐで取得）の後、３０秒の動的排除を伴う、２０の最も豊富な前駆イオンの衝突解離（ＣＩＤ、ＬＴＱで取得）を行った。リンペプチド分析のために、１０の最も豊富な前駆イオンを、使用可能な多段階の活性化を伴うＣＩＤに供した。総サイクル時間はおよそ２秒であった。ＭＳ１に関しては、最大の時間３００ｍｓにわたって１０^６のイオンをＯｒｂｉｔｒａｐセルに蓄積し、分解能６０，０００ＦＷＨＭ（４００ｍ／ｚ）でスキャンした。ＭＳ２スキャンは、１０^４のイオンの標的設定である通常のスキャンモード、及び蓄積時間２５ｍｓを使用して取得した。単一荷電イオン及び電荷状態が割り当てられていないイオンはＭＳ２事象の誘発から排除した。正規化衝突エネルギーを３２％に設定し、各スペクトルに対して１つのマイクロスキャンを取得した。

【0139】

標識を用いない数量化及びデータベース検索。初期パラメータを使用した標識を用いない数量化のために、取得した未加工のファイルをＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓソフトウェアツール（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、バージョン４．０）にインポートした。ＭＳ２スペクトルをＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓからｍｇｆ形式で直接エクスポートし、ＭＡＳＣＯＴアルゴリズム（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ、バージョン２．４）を使用して、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェア（バージョン１．０．１３．１３）からのＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅｖｅｒｓｅｒツールを使用して生成されたホモサピエンスの予測ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリー（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ、公開日２０１２年５月１６日）及び一般に観察される夾雑物（全部で４１，２５０配列）の通常及び逆配列を含有する囮データベース［５９］に対して検索した。Ｙ．エンテロコリチカに由来するタンパク質を同定するために、Ｙ．エンテロコリチカの予測ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリー（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ、公開日２０１３年８月１５日）を含む上記と同じデータベースに対して非リンペプチド濃縮試料を検索した。前駆イオン許容誤差を１０ｐｐｍに設定し、フラグメントイオン許容誤差を０．６Ｄａに設定した。検索基準を以下の通り設定した：完全なトリプシン特異性が必要であり（後ろにプロリンが続かない限り、リジン又はアルギニン残基の後で切断）、誤った切断は２つ許容され、カルバミドメチル化（Ｃ）は固定修飾に設定し、ＴｉＯ_２濃縮又は非濃縮試料について、それぞれリン酸化（Ｓ、Ｔ、Ｙ）又は酸化（Ｍ）は可変修飾に設定した。最後に、データベース検索結果をｘｍｌファイルとしてエクスポートし、ＭＳ１特徴を割り当てるためにＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓソフトウェアにインポートし戻した。リンペプチド数量化のために、検出された特徴全てのＭＳ１ピーク存在量を含有するｃｓｖファイルをエクスポートし、非濃縮試料については、タンパク質当たり同定されたペプチド全ての合計した特徴強度に基づくタンパク質測定値の全てを含有するｃｓｖファイルを作成した。重要なことに、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓソフトウェアは、同様のペプチドのセットによって同定されるタンパク質が一緒に群分けされ、データベース内の単一のタンパク質について特異的な配列と矛盾しないペプチドのみがタンパク質数量化に使用されるように設定した。両方のファイルを、自社開発したＳａｆｅＱｕａｎｔ ｖ１．０ Ｒ ｓｃｒｉｐｔ（未発表データ、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｅａｈｒｎｅ／ＳａｆｅＱｕａｎｔ／で入手可能）を使用してさらに処理した。簡単に述べると、当該ソフトウェアでは、同定レベル偽発見率を１％に設定し（囮タンパク質配列データベースヒットの数に基づく）、試料全てにわたって同定されたＭＳ１ピーク存在量（抽出されたイオンクロマトグラム、ＸＩＣ）を正規化する、すなわち、確信的に同定されたペプチド特徴の全てを合計したＸＩＣが全てのＬＣ−ＭＳ実行に関して同等になるように調整する。次に、数量化されたリンペプチド／タンパク質の全てを、時点ごとのＸＩＣの中央値に基づいて各時点についての存在量比に割り当てる。各比率の統計的有意性は、改変ｔ統計量ｐ値を算出すること［６０］及び多重検定に対して調整すること［６１］によって得られるそのｑ値（偽発見率で調整したｐ値）によって示される。リン酸化残基の位置をＭＡＳＣＯＴ（スコア＞１０）によって自動的に割り当てた。アノテートされたスペクトルは全て、ＭＳ未加工ファイル及び使用した検索パラメータと共に、ＰＲＩＤＥ ｐａｒｔｎｅｒ ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ［６２］を介してＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｔｅｏｍｅｃｅｎｔｒａｌ．ｐｒｏｔｅｏｍｅｘｃｈａｎｇｅ．ｏｒｇ）に寄託される。

【0140】

配列アラインメントを、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／のＥＭＢＬ−ＥＢＩウェブに基づくＣｌｕｓｔａｌＷ２多配列アラインメントツールを使用して実施した。

【0141】

Ｂ）結果
ＹｏｐＥ融合タンパク質の３型分泌に基づくタンパク質送達系
Ｙ．エンテロコリチカＴ３ＳＳエフェクターＹｏｐＥ（配列番号１）のちょうどＮ末端は、異種タンパク質を移行させるために十分な分泌シグナルを含有するが［１０］、そのシャペロン（ＳｙｃＥ）に対するシャペロン結合部位（ＣＢＳ）は含まれない［６３］。ＹｏｐＥのＮ末端の１３８アミノ酸（配列番号２）は他の異種Ｔ３Ｓ基質の移行に関して最良の結果が示されているので［３８］、これを、送達するタンパク質と融合するために選択した。これらのＹｏｐＥのＮ末端の１３８アミノ酸はＣＢＳを含有するので、さらに、ＳｙｃＥを同時発現させることに決めた。精製されたＹ．エンテロコリチカｐＹＶ４０病原性プラスミドからクローニングされたＳｙｃＥ−ＹｏｐＥ_{１−１３８}断片は、ＹｏｐＥの内因性プロモーター及びシャペロンＳｙｃＥの内因性プロモーターを含有する（図１０）。したがって、ＳｙｃＥ及び任意のＹｏｐＥ_{１−１３８}融合タンパク質は、室温での増殖から３７℃への迅速な温度シフトによって誘導される。３７℃での培養時間は、細菌内に存在する融合タンパク質量に影響を及ぼす。ＹｏｐＥ_{１−１３８}の３’末端に多重クローニング部位（ＭＣＳ）を付加し（図１０Ｂ）、その後にＭｙｃ及び６×Ｈｉｓタグ並びに終止コドンが続いた。

【0142】

バックグラウンド株を慎重に選択した。まず、内因性エフェクターの移行を制限するために、公知のエフェクター、Ｙｏｐ Ｈ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ及びＴの全てが欠失したＹ．エンテロコリチカ株（名称ΔＨＯＰＥＭＴ）［６４］を使用した。さらに、外因性メソ−２，６−ジアミノピメリン酸が存在しないと増殖することができない栄養要求突然変異体［６５］を使用した。この株は、アスパラギン酸−ベータ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子が欠失したものであり（Δａｓｄ）、Ｓｗｉｓｓ ｓａｆｅｔｙ ａｇｅｎｃｙによるバイオセーフティレベル１に分類される（Ａ０１００８８／２に対する修正）。さらに、バックグラウンド株のより大規模な選択をもたらすために接着タンパク質ＹａｄＡ及び／又はＩｎｖＡを欠失させた。ｙａｄＡ又はｙａｄＡ／ｉｎｖＡ株を使用すると、誘導されるバックグランドシグナルが減少したが［６６］、送達されるタンパク質量も同様に影響を受ける［６７］。

【0143】

真核細胞へのＹｏｐＥ融合タンパク質送達の特徴づけ
インビトロ分泌アッセイ（図１Ａ参照）では、周囲の液体へのタンパク質分泌を人工的に誘導する。ＴＣＡに基づくタンパク質沈殿の後、抗ＹｏｐＥ抗体を用いたウェスタンブロット分析を使用して、分泌されたタンパク質量を決定した（図１Ｂ）。ｗｔ株からは完全長ＹｏｐＥが分泌されたが、ΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ株からは分泌されなかった。ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（今後ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｍｙｃと称する；配列番号３）が存在すると、より小さなＹｏｐＥバンドが目に見えるようになった（図１Ｂ）。したがって、ＹｏｐＥ_{１−１３８}断片は本明細書に記載の設定において十分に分泌された。真核細胞へのタンパク質移行の均一性を分析するために、ＨｅＬａ細胞にＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｍｙｃをコードする株を感染させ、ＩＦによってｍｙｃタグを染色した（図２Ａ及びＢ）。最初は細菌のみが染色されたが、感染後（ｐ．ｉ．）３０分の時点では、細胞の輪郭が目に見え始め、これは感染時間を増大させると増強される（図２Ｂ）。この傾向は、ＨｅＬａ細胞の内部のｍｙｃタグ染色強度によく反映される（図２Ａ及びＢ）。ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｍｙｃは、核内以外は［６８］細胞のどこででも検出することができる（図２Ａ）。驚くべきことに、この手法は、全てではないが大多数の細胞に同等に到達した。Ｙ．エンテロコリチカは多くの異なる細胞型に感染することが公知であるので［６９］、種々の細胞株へのＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｍｙｃ送達を追跡した。感染させたマウス線維芽細胞、ジャーカット細胞及びＨＵＶＥＣにおいて同じ同種抗ＭｙｃＩＦ染色が観察された（図１１）。さらに、感染多重度を高く又は低く調整することにより、なお大多数の細胞を標的としたまま、送達されるタンパク質量を調節することができる（図２Ｃ）。細菌数を少なくすると、送達されるタンパク質を大量に有する少数の細胞がもたらされるのではなく、送達されるタンパク質を少量含有する最多数の細胞がもたらされる（図２Ｃ）。

【0144】

Ｔ３ＳＳにより送達されるタンパク質の核への転送
ＹｏｐＥ自体は細胞質に局在していたので（図２Ａ）、ＹｏｐＥ_{１−１３８}断片により核融合タンパク質の局在化が妨害されるかどうかを決定することが特に興味深い。したがって、ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＥＧＦＰのＣ末端（及びＮ末端、同様の結果）にＳＶ４０ ＮＬＳを付加した（それぞれ配列番号３９及び配列番号３８）。感染させたＨｅＬａ細胞において、ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＥＧＦＰ（配列番号３７）では弱い細胞質染色が導かれたが、ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＥＧＦＰ−ＮＬＳでは、より強力な核内ＥＧＦＰシグナルが生じた（図３）。これにより、ＹｏｐＥ_{１−１３８}断片がＮＬＳの使用と適合することが示される。ｍＣｈｅｒｒｙはすでに植物病原体において使用されていたが［７０］、これにより、Ｔ３ＳＳをコードするヒト又は動物病原性細菌を介したＧＦＰ様タンパク質の送達が上首尾であることが示される。これにより、ＳｙｃＥ及びＹｏｐＥ_{１−１３８}依存性戦略が多くの選択されたタンパク質の送達に関して非常に有望であることが検証される。

【0145】

真核細胞に融合タンパク質を移行させた後のＹｏｐＥ_{１−１３８}付属物の除去
ＹｏｐＥ_{１−１３８}断片の細菌による送達は大いに役立つものであるが、ＹｏｐＥ_{１−１３８}断片は、融合タンパク質機能及び／又は局在化を妨害する可能性がある。したがって、タンパク質送達後に除去することが最適であると思われる。この目的のために、ＹｏｐＥ_{１−１３８}と融合パートナー（転写制御因子ＥＴ１−Ｍｙｃ（配列番号３６及び４１）［７４］及びヒトＩＮＫ４Ｃ（配列番号４０及び配列番号４３））の間に２つのＴＥＶ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＳ）［７１−７３］を導入した。提供される方法の利点を保持するために、別のＹ．エンテロコリチカ株においてＴＥＶプロテアーゼ（Ｓ２１９Ｖ変異体；［７５］）をＹｏｐＥ_{１−１３８}（配列番号４２）とさらに融合した。ＨｅＬａ細胞に、両方の株を一度に感染させた。タンパク質の移行画分のみの分析を可能にするために、感染ＨｅＬａ細胞を、感染の２時間後に（図４）、細菌は溶解させないことが公知であるジギトニンを用いて溶解させた（［７６］；コントロールについては図１２を参照されたい）。ウェスタンブロット分析により、細胞に対応する株を感染させた場合にのみ、ＹｏｐＥ_{１−１３８}−２×ＴＥＶ切断部位−ＥＴ１−Ｍｙｃ又はＹｏｐＥ_{１−１３８}−２×ＴＥＶ切断部位−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−Ｍｙｃが存在することが明らかになった（図４Ａ及びＣ）。この細胞溶解物を精製ＴＥＶプロテアーゼで一晩消化すると、バンドのシフトを観察することができた（図４Ａ及びＣ）。このバンドは、ＥＴ１−Ｍｙｃ（図４Ｃ）又はＦｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ（図４Ａ）に対応し、１つのセリンのみの可能性が最も高い、ＴＥＶ切断部位のＮ末端残余を有する。細胞にＴＥＶプロテアーゼを送達する株を同時感染させると、同じ切断されたＥＴ１−Ｍｙｃ又はＦｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ断片が目に見えるようになり、これにより、Ｔ３ＳＳにより送達されたＴＥＶプロテアーゼが機能性であること、及び単一の細胞に両方の菌株が感染したことが示される（図４Ａ及びＣ）。切断は完全なものではないが、移行したタンパク質の大多数が、感染の２時間後にすでに切断され、さらに、精製ＴＥＶプロテアーゼを用いた一晩消化によってより良好な切断率はもたらされなかった（図４Ｂ）。報告の通り、ＴＥＶプロテアーゼ依存性切断には、融合タンパク質に応じた最適化が必要であり得る［７７、７８］。したがって、移行後のＹｏｐＥ_{１−１３８}付属物のＴＥＶプロテアーゼ依存性除去により、初めて、Ｎ末端アミノ酸の１つのみのアミノ酸組成の変化で、ほぼ天然の異種タンパク質のＴ３ＳＳタンパク質送達がもたらされる。

【0146】

ＹｏｐＥ断片のＴＥＶプロテアーゼ依存性切断の代替の手法は、目的の融合タンパク質にユビキチンを組み入れることからなる。実際、ユビキチンは、内因性ユビキチン特異的Ｃ末端プロテアーゼ（脱ユビキチン化酵素、ＤＵＢ）の群により、Ｃ末端においてプロセシングを受ける。切断はユビキチンのちょうどＣ末端（Ｇ７６の後ろ）で起こるはずであるので、目的のタンパク質は、追加的なアミノ酸配列を含まないべきである。この方法をＹｏｐＥ_{１−１３８}−ユビキチン−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓ融合タンパク質に関して試験した。ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓを発現する細菌を感染させたコントロール細胞では、ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓに対応するバンドが見いだされ、これにより、融合タンパク質が効率的に移行したことが示される（図２４）。細胞にＹｏｐＥ_{１−１３８}−ユビキチン−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓを発現する細菌を１時間にわたって感染させた場合、Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓのサイズに対応する追加的なバンドが目に見え、これにより、融合タンパク質の一部が切断されたことが示される。この結果から、融合タンパク質へのユビキチンの導入により、外因性プロテアーゼを必要とせずにＹｏｐＥ_{１−１３８}断片を切り離すことが可能になることが示される。

【0147】

ＩＩＩ型及びＩＶ型細菌エフェクターの移行
サルモネラ・エンテリカ由来のＳｏｐＥは、Ｃｄｃ４２と相互作用し、それによりアクチン細胞骨格リモデリングを促進する、よく特徴付けられたグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）である［７９］。ＨｅＬａ細胞へのＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｍｙｃの移行の影響はなかったが、移行したＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＳｏｐＥ（配列番号５及び１３５）によりアクチンネットワークの劇的な変化が誘導された（図５Ａ）。別のＧＥＦエフェクタータンパク質、シゲラ・フレックスネリ由来のＩｐｇＢ１（配列番号４）を用いて同様の結果が得られた。驚くべきことに、アクチン細胞骨格の最初の変化は感染後２分という速さで観察された（図５Ａ）。したがって、Ｔ３ＳＳ依存性タンパク質送達は、遠心分離によって感染を開始したすぐ後に起こると結論づけることができる。厳密なＴ３ＳＳ依存性輸送を証明するために、真核細胞膜への移行ポアを形成するＴ３ＳＳタンパク質の１つを欠失させた（ＹｏｐＢ、［８０］参照）（図１２）。

【0148】

サルモネラ属感染の間、ＳｏｐＥ移行の後に、Ｃｄｃ４２に対するＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）として機能するＳｐｔＰが移行する［８１］。ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＳｏｐＥ−Ｍｙｃ（配列番号１３５）単独での移行により、大規模なＦ−アクチン再構成が誘発されたが、ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＳｐｔＰ（配列番号８）を発現する細菌との同時感染により、この影響は用量依存性様式に消失した（図５Ｂ）。抗Ｍｙｃ染色により、この阻害がＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＳｏｐＥ−Ｍｙｃ移行のレベルの低下に起因するものではないことが示された（図５Ｂ）。これらの結果をまとめて、細胞に２種の菌株を同時感染させることは、２種の異なるエフェクターを、それらの機能性相互作用を扱うために単一細胞に送達するための有効な方法であることが示された。

【0149】

Ｓ．フレックスネリＩＩＩ型エフェクターＯｓｐＦは、ＭＡＰキナーゼｐ３８及びＥＲＫを脱リン酸化するホスホスレオニンリアーゼとして機能する［８２］。移行したＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＯｓｐＦ（配列番号７）の機能性を試験するために、ＴＮＦαを用いた刺激後のｐ３８のリン酸化をモニターした。感染させていない細胞又はＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｍｙｃを発現する細菌を感染させた細胞において、ＴＮＦαによりｐ３８リン酸化が誘導された。対照的に、ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＯｓｐＦの移行後には、ＴＮＦαにより誘導されたリン酸化が消失し、これにより、送達されたＯｓｐＦがｐ３８に対して活性であることが示される（図６Ａ）。

【0150】

サルモネラ属感染の間、ＩＩＩ型エフェクターＳｏｐＢは、Ａｋｔの持続的な活性化によって上皮細胞をアポトーシスから保護する［８３］。ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｍｙｃ又はＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＳｏｐＥの移行ではＡｋｔに影響はなかったが、ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ＳｏｐＢ（配列番号６）の移行により、ＡｋｔのＴ３０８及びＳ４７３における強力なリン酸化が誘導され、これは活性型を反映する（図６Ｂ）。Ｓ．フレックスネリ由来のＳｏｐＢホモログ（ＩｐｇＤ、配列番号９）を用いて同様の結果が得られた。総じて、我々の結果から、ＹｏｐＥ_{１−１３８}に基づく送達系がこれまでに試験された全てのＴ３Ｓエフェクターに対して機能すること、及び、ＹｏｐＥ_{１−１３８}に基づく送達系により、細胞骨格、炎症及び細胞生存を含めた中心的な細胞機能を制御するタンパク質を調査することが可能になることが示される。

【0151】

アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）及びバルトネラ・ヘンセラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）を含めたいくつもの細菌は、ＩＶ型分泌を使用してエフェクターを細胞に注射する。Ｂ．ヘンセラ由来のＩＶ型エフェクターＢｅｐＡを我々のツールを使用してＨｅＬａ細胞に移行できるかどうかを試験した。完全長ＢｅｐＡ（配列番号１０）及びＣ末端Ｂｉｄドメインを含有するＢｅｐＡ_{Ｅ３０５−ｅｎｄ}（配列番号１１）をクローニングし、それぞれの株を細胞に感染させた。ＢｅｐＡは、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の産生を誘導することが示されたので［８４］、感染後にＨｅＬａ細胞におけるｃＡＭＰのレベルを測定した。Ｂ．ヘンセラエフェクターＢｅｐＧ（配列番号１３６）のＢｉｄドメインの移行ではｃＡＭＰを誘導できなかったが、完全長ＢｅｐＡ及びＢｅｐＡ_{Ｅ３０５−ｅｎｄ}ではｃＡＭＰ産生が予測された量で誘発された［８４］（図６Ｃ）。この結果から、ＩＶ型エフェクターもＹｏｐＥ_{１−１３８}に基づく送達系によって宿主細胞標的に有効に送達でき、それらが機能性であることが示される。

【0152】

上皮細胞への真核生物タンパク質の移行
ヒトタンパク質をＩＩＩ型分泌によって移行できることを示すために、ヒトアポトーシス誘導因子を、Ｙ．エンテロコリチカによる送達のためにＹｏｐＥ_{１−１３８}と、又は、Ｓ．エンテリカによる送達のためにＳｔｅＡ_１−２０、ＳｔｅＡ、ＳｏｐＥ_１−８１又はＳｏｐＥ_{１−１０５}と融合した。次いで、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーのプロアポトーシスメンバーであるヒトＢＨ３相互作用ドメインデスアゴニスト（Ｂｉｄ、配列番号２４）の移行をモニターした。Ｂｉｄは、カスパーゼ−８（ＣＡＳＰ８）によって誘導されるミトコンドリア損傷のメディエーターである。ＣＡＳＰ８によりＢｉｄが切断され、切除されたＢｉｄ（ｔＢＩＤ、配列番号２５）はミトコンドリアに移行し、そこでチトクロムＣ放出を誘発する。後者により、１７ｋＤａと１２ｋＤａのサブユニットに切断される、カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）活性化の固有の様式が導かれる［８５］。ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｍｙｃ又はＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｂｉｄを発現するＹ．エンテロコリチカの１時間にわたる感染では、アポトーシスを誘導することができなかったが、ヒトｔＢＩＤの移行により、細胞死がよく特徴付けられたアポトーシス誘導因子スタウロスポリンよりも大きな程度で誘発された（図７Ａ及びＣ）。予測通り、ｔＢＩＤの移行により、ＣＡＳＰ３ ｐ１７サブユニットの産生が、スタウロスポリンを用いた場合より大きな量でまで誘導される（図７Ａ）。移行したタンパク質量と内因性Ｂｉｄの比較を可能にするために、ＨｅＬａ細胞をジギトニンを用いて溶解させ、抗Ｂｉｄ抗体を使用したウェスタンブロット法によって分析した（図７Ｂ）。Ｔ３ＳＳにより送達されたＹｏｐＥ_{１−１３８}−ｔＢＩＤは、ほぼＨｅＬａ細胞における内因性Ｂｉｄレベルに達したが、送達されたＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｂｉｄはさらに高分量で存在した（２．５倍）（図７Ｂ）。ＨｅＬａ細胞のディーププロテオーム及びトランスクリプトームマッピングにより、単一細胞当たり４．４倍の１０^５コピーのＢｉｄが推定された［８６］。したがって、３ＳＳ依存性ヒトタンパク質送達が細胞当たり１０^５〜１０^６のタンパク質に達すると結論づけることができる。これらの数は、大腸菌Ｔ３ＳＳにより移行したナノボディの細胞当たりのコピー数と一致する［１９］。感染多重度について及び感染の持続時間について１０の係数、抗生物質添加の時点及び感染前の３７℃での培養時間について３．２の係数のレベリングを仮定すると、送達されるタンパク質コピー／細胞を数１０００コピー／細胞から数１０^６コピー／細胞まで調整することができる。総じて、これらの結果から、移行したｔＢＩＤが機能性であり、有意味なレベルで送達されたことが示された。これにより、細胞生物学の中心的側面であるアポトーシスの調節におけるタンパク質の役割を試験するための移行ツールが検証された。

【0153】

さらに、Ｙ．エンテロコリチカによる送達のために、マウスｔＢＩＤ（Ｙ．エンテロコリチカに対してコドン最適化；配列番号１９４）又はマウスｔＢＩＤ又はマウスＢＡＸ（どちらの場合でもＹ．エンテロコリチカに対してコドン最適化；配列番号１３８及び１３９）のＢＨ３ドメインをＹｏｐＥ_{１−１３８}と融合した。Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄでの２．５時間にわたる感染では、タンパク質は送達されなかった、又はＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｍｙｃによりアポトーシスを誘導することができなかったが、マウスｔＢＩＤ（Ｙ．エンテロコリチカに対してコドン最適化、配列番号１９４）の移行により、Ｂ１６Ｆ１０細胞（図１６）、Ｄ２Ａ１細胞（図１７）、ＨｅＬａ細胞（図１８）及び４Ｔ１細胞（図１９）における細胞死が誘発された。Ｙ．エンテロコリチカに対してコドン最適化されたマウスＢｉｄのＢＨ３ドメインの移行（配列番号１３８）又はＹ．エンテロコリチカに対してコドン最適化されたマウスＢＡＸ（配列番号１３９）によっても同様にＢ１６Ｆ１０細胞（図１６）、Ｄ２Ａ１細胞（図１７）、ＨｅＬａ細胞（図１８）及び４Ｔ１細胞（図１９）における大規模な細胞死が誘導されることが見いだされた。

【0154】

Ｓ．エンテリカａｒｏＡ細菌を用いた４時間にわたる感染ではアポトーシスを誘導することができなかったが、マウスｔＢＩＤの移行では、マウスｔＢＩＤの移行によりＣＡＳＰ３ ｐ１７サブユニットの産生が導かれ、アポトーシスが誘発された（図２０及び２１）。ＳｏｐＥ融合タンパク質についてのアポトーシス誘導の程度は、ＳｐｉＩ Ｔ３ＳＳ誘導条件を使用した場合により大きく（図２０）、これは、ＳｐｉＩ Ｔ３ＳＳによる排他的なＳｏｐＥの輸送を反映する。マウスｔＢＩＤと融合したＳｔｅＡ_１−２０ではアポトーシスを誘導することができず、これは、ＳｔｅＡの２０個のＮ末端アミノ酸内の分泌シグナルが融合タンパク質の送達を可能にするには十分でないことが原因である可能性が高い（図２０及び２１）。完全長ＳｔｅＡと融合したマウスｔＢＩＤでは、ＳｐｉＩ Ｔ３ＳＳ誘導条件及びＳｐｉＩＩ Ｔ３ＳＳ誘導条件のどちらでもＨｅＬａ細胞におけるアポトーシス誘導が導かれ（図２０及び２１）、これは、ＳｔｅＡがどちらのＴ３ＳＳによっても輸送可能なものであることを反映する。ＳｐｉＩＩ Ｔ３ＳＳ誘導条件下でさえ、ＳｐｉＩＩ Ｔ３ＳＳ誘導条件でのＳｏｐＥ融合タンパク質の活性によって見られるように、ＳｐｉＩ Ｔ３ＳＳの部分的な活性が予測されることに留意しなければならない（図２１）。

【0155】

本明細書で機能的に詳述されている移行した真核生物タンパク質に加えて、いくつかの他の真核生物タンパク質が本明細書に記載のツールを使用して分泌されている。これは、細胞周期調節からのタンパク質（Ｍａｄ２（配列番号１５）、ＣＤＫ１（配列番号１４）、ＩＮＫ４Ａ（配列番号１６）、ＩＮＫ４Ｂ（配列番号１７）及びＩＮＫ４Ｃ（配列番号１８））並びにその一部（ＩＮＫ４Ａ ８４−１０３（配列番号１５８）、ｐ１０７ ６５７−６６２（配列番号１５９）、ｐ２１ １４１−１６０（配列番号１６０）、ｐ２１ １４５−１６０（配列番号１６１）、ｐ２１ １７−３３（配列番号１６２）及びサイクリンＤ２ １３９−１４７（配列番号１６３））、アポトーシス関連タンパク質（Ｂａｄ（配列番号２９）、ＦＡＤＤ（配列番号２８）、及びカスパーゼ３ ｐ１７（配列番号２２）及びｐ１２（配列番号２３）、ゼブラフィッシュＢｉｄ（配列番号１９）及びｔ−Ｂｉｄ（配列番号２０））並びにその一部（ｔＢｉｄ ＢＨ３（配列番号１３８）、Ｂａｘ ＢＨ３（配列番号１３９））、シグナル伝達タンパク質（マウスＴＲＡＦ６（配列番号１２）、ＴＩＦＡ（配列番号１３））、ＧＰＣＲ Ｇαサブユニット（ＧＮＡ１２、最も短いアイソフォーム、（配列番号３０））、ナノボディ（ｖｈｈＧＦＰ４、（配列番号３１））及び標的タンパク質分解のためのナノボディ融合構築物（Ｓｌｍｂ−ｖｈｈＧＦＰ４；（配列番号３２、３３、３４）［８７］）（図１３及び１４）並びに低分子ＧＴＰアーゼ（Ｒａｃ１ Ｑ６１Ｅ（配列番号２６及び１３７）及びＲｈｏＡ Ｑ６３Ｌ（配列番号２７）及びヒトＡｋｔ由来のプレクストリン相同性ドメイン（配列番号３５）のＹ．エンテロコリチカ（図１３、１４及び２３）による送達を含む。機能的に詳述されているアポトーシス関連タンパク質（マウスｔＢｉｄ、配列番号１４４−１４７）に加えて、これは、細胞周期調節からのタンパク質（Ｍａｄ２（配列番号１６８−１６９）、ＣＤＫ１（配列番号１７０−１７１）、ＩＮＫ４Ａ（配列番号１６４−１６５）及びＩＮＫ４Ｃ（配列番号１６６−１６７））のＳ．エンテリカによる送達をさらに含む（図２２）。これらのタンパク質は機能的に検証されてはいないが、多様な真核生物タンパク質のＴ３ＳＳ依存性分泌の可能性とＹｏｐＥ付属物の可能性のある除去との組み合わせにより、細胞生物学におけるＴ３ＳＳの広範な適用性に関する新しい展望が開かれる。

【0156】

ゼブラフィッシュ胚における切除されたＢｉｄのインビボでの移行により、アポトーシスが誘導される
この細菌ツールの興味深い特徴は、生きている動物における潜在的使用である。胎児性／胚性状態にあるゼブラフィッシュは透明性を維持することができ、それにより、蛍光染色及び顕微鏡観察が可能になる［５４、８８、８９］。いくつかのゼブラフィッシュアポトーシス誘導因子が詳細に記載されており、ｚ−ＢＩＭが最も強力である［９０］。したがって、ｚ−ＢＩＭを我々の系にクローニングすることに決めた。ヒトＢＩＭに対する相同性が弱いとしても、ヒト上皮細胞におけるＹｏｐＥ_{１−１３８}−ｚ−ＢＩＭ（配列番号２１）のアポトーシス誘導の力価をアッセイした。ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ｚ−ＢＩＭを移行させる株を１時間にわたって感染させたＨｅＬａ細胞では、細胞死の明らかな徴候が示された。次いで、受精後２日（ｄｐｆ）ゼブラフィッシュ胚を用い、局在感染モデルを使用して、後脳への細菌のマイクロインジェクションによってインビボ実験を実施した［５４］。５．５時間にわたる感染後、フィッシュを固定し、透過処理し、ＣＡＳＰ３ ｐ１７の存在について染色した。ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｍｙｃを発現する株を感染させると、後脳領域では細菌が目に見えたが（染色「ｂ」、図８Ａ Ｉ）、細菌の周囲でのアポトーシスの誘導は検出されなかった（染色「ｃ」、図８Ａ Ｉ）。対照的に、ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ｚ−ＢＩＭを送達する株を感染させると、細菌周囲の領域において、切断されたＣＡＳＰ３の存在の強力な増加が観察された（図８Ａ ＩＩ）。最大値ｚ投影に対する自動画像解析により、ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ｚ−ＢＩＭを移行させる細菌により、近くの細胞のアポトーシスがコントロール細菌によるものよりもはるかに多く誘導されることが確認される（図８Ｂ）。これにより、ｚ−ＢＩＭが、細菌による移行に際して、ゼブラフィッシュにおいて機能性であることが示される。これらの結果から、生きている動物における真核生物タンパク質送達のためのＴ３ＳＳの使用がさらに検証される。

【0157】

リン酸化プロテオミクスにより、タンパク質のリン酸化に対する移行したタンパク質の全体的な影響が示される
リン酸化は、生物学的プロセスを活性化するか又は不活化することが可能であり、したがって、試験シグナル伝達事象の適切な標的となる、広く拡散した翻訳後修飾である［９１、９２］。これにもかかわらず、現在アポトーシスにおけるリン酸化のシステムレベルの分析は利用可能になっていない。ＨｅＬａ細胞に送達されたヒトｔＢｉｄの影響を分析するために、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる、標識を用いないリン酸化プロテオミクス手法を使用した。３つの独立した実験において、細胞を無処理のままにしたか、又は、ΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｍｙｃ又はΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ｔＢｉｄを３０分にわたって感染させた。細胞を溶解させ、その後、酵素により消化し、リンペプチドを濃縮し、個々のリンペプチドを数量化及び同定した。ΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−Ｍｙｃを感染させた細胞とΔＨＯＰＥＭＴ ａｓｄ＋ＹｏｐＥ_{１−１３８}−ｔＢｉｄを感染させた細胞を比較し、それにより、３６３のｔＢｉｄ依存性リン酸化事象を同定することが可能になった。ｔＢｉｄ送達に際して、２８６のリンペプチドではリン酸化の増加が示され、７７ではリン酸化の減少が示され、これは、２４３の異なるタンパク質に対応し、これをｔＢｉｄリン酸化プロテオームとして定義した。ＳＴＲＩＮＧデータベースを使用して、ｔＢｉｄリン酸化プロテオームのタンパク質間相互作用ネットワークを創出した［９３］（図９Ａ）。さらに、ミトコンドリアでのアポトーシスに関連することが公知の２７のタンパク質をネットワークに追加し、中心的なクラスターを構築した。興味深いことに、ｔＢｉｄリン酸化プロテオームからの数種のタンパク質のみがこの中心的なクラスターとつながり、これにより、多くのタンパク質が、これまでアポトーシスタンパク質と直接関連づけられていなかったリン酸化の変化を受けることが示される。ｔＢｉｄリン酸化プロテオームによりカバーされる生物学的機能の特徴を明らかにするために、Ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＤＡＶＩＤ、ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／）［９４、９５］データベースの機能性アノテーションツールを使用した遺伝子オントロジー分析を実施した。同定された生物学的機能により、多様な細胞プロセスがｔＢｉｄの影響を受けることが示される。クロマチン再構成及び転写の調節に関与する多くのタンパク質がリン酸化の変化を受ける（すなわち、ＣＢＸ３、ＣＢＸ５、ＴＲＩＭ２８、ＨＤＡＣ１）。例えば、ＨＤＡＣ１は、転写の調節において役割を果たすヒストンデアセチラーゼである。ＨＤＡＣ１は、同じくアポトーシスに関与するタンパク質であるＮＦ−ｋＢの転写活性を調節することが可能であることが示されている。さらに、以前示されているＲＮＡプロセシングに関与するタンパク質のクラスターがアポトーシスの調節において重要な役割を果たすことを同定した［９６］。例えば、ＨＮＲＰＫは、ＤＮＡ損傷に対するｐ５３／ＴＰ５３応答を媒介し、アポトーシスの誘導に必要である［９７］。さらに、タンパク質翻訳に関与するタンパク質のリン酸化も影響を受けた。アポトーシス細胞において全体的なタンパク質合成が減少するという観察に沿って、いくつかの真核生物開始因子（すなわち、ＥＩＦ４Ｅ２、ＥＩＦ４Ｂ、ＥＩＦ３Ａ、ＥＩＦ４Ｇ２）がリン酸化の変化を受ける。興味深いことに、細胞骨格リモデリングに関与する多くのタンパク質のリン酸化（例えば、ＰＸＮ、ＭＡＰ１Ｂ９）がｔＢｉｄ送達に際して変更される。これは、ｔＢｉｄ送達に際して細胞の形態が劇的に変化するという観察と一致する（図９Ｂ）。細胞の縮小及び接触の喪失は、ＺＯ２及びパキシリンのような接着関連タンパク質のリン酸化が観察されたという事実により反映される。同様に、核の縮小には、ラミンＡ／Ｃ及びラミンＢ１のような層状タンパク質のリン酸化が伴う。総じて、ｔＢＩＤ送達により、ミトコンドリア完全性の破綻によっても示される迅速なアポトーシス応答が誘導される（図９Ｂ）。我々は、ｔＢｉｄにより誘導されるアポトーシスが、多様な細胞プロセスに関与する数百のリン酸化事象に影響を及ぼすことを示した。同定されたタンパク質の多くがアポトーシスに関係しているが、アポトーシス誘導に際してリン酸化されることが分かっているのはほんのわずかである。したがって、リン酸化プロテオミクス手法により、アポトーシスに関するさらなる試験のための有用なリソースがもたらされる。

【0158】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図15E】

【図15F】

【図15G】

【図15H】

【図15I】

【図15J】

【図15K】

【図15L】

【図15M】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]