特許 6797416 クロマトグラフィーのための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6797416

(24)【登録日】2020年11月20日

(45)【発行日】2020年12月9日

(54)【発明の名称】クロマトグラフィーのための方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/18 20060101AFI20201130BHJP

   C07K 14/745 20060101ALI20201130BHJP

   C07K 14/765 20060101ALI20201130BHJP

   C07K 14/755 20060101ALI20201130BHJP

   B01D 15/00 20060101ALI20201130BHJP

   B01D 15/36 20060101ALI20201130BHJP

   B01J 20/281 20060101ALN20201130BHJP

【ＦＩ】

   C07K1/18

   C07K14/745

   C07K14/765

   C07K14/755

   B01D15/00 M

   B01D15/36

   !B01J20/22 D

【請求項の数】13

【全頁数】9

(21)【出願番号】特願2017-550147(P2017-550147)

(86)(22)【出願日】2016年4月4日

(65)【公表番号】特表2018-512416(P2018-512416A)

(43)【公表日】2018年5月17日

(86)【国際出願番号】EP2016057356

(87)【国際公開番号】WO2016162310

(87)【国際公開日】20161013

【審査請求日】2019年2月27日

(31)【優先権主張番号】1506117.9

(32)【優先日】2015年4月10日

(33)【優先権主張国】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】516105833

【氏名又は名称】サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100154922

【弁理士】

【氏名又は名称】崔 允辰

(74)【代理人】

【識別番号】100207158

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 研二

(74)【代理人】

【識別番号】100137545

【弁理士】

【氏名又は名称】荒川 聡志

(74)【代理人】

【識別番号】100105588

【弁理士】

【氏名又は名称】小倉 博

(74)【代理人】

【識別番号】100129779

【弁理士】

【氏名又は名称】黒川 俊久

(74)【代理人】

【識別番号】100113974

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 拓人

(72)【発明者】

【氏名】ホール，マーティン

(72)【発明者】

【氏名】ブソン，カロリーナ

(72)【発明者】

【氏名】マロイセル，ジャン−リュク

(72)【発明者】

【氏名】スコグラー，ヘレナ

【審査官】 小金井 悟

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１１−５２５５２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５３７９６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５３７４７９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

血漿から治療用タンパク質を精製するためのクロマトグラフィー法であって、内部多孔質コアと外部多孔質リッドとを有する多孔質リッドビーズを含む樹脂を充填したクロマトグラフィーカラムに血漿を充填する工程であって、前記内部多孔質コアはアニオン交換リガンドを備え、前記リッドおよびコアの多孔度により５００ｋＤよりも大きい分子の進入を許容しない工程と、前記コアの前記アニオン交換リガンド上に第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を吸着する工程と、フロースルー中で分離された血漿タンパク質を収集する工程と、前記コアの前記リガンドからＦＩＸを溶出させる工程とを含むクロマトグラフィー法。

【請求項2】

前記アニオン交換リガンドが、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）または第四級アンモニウム（Ｑ）から選択される請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記アニオン交換リガンドが第四級アンモニウム（Ｑ）である請求項２に記載の方法。

【請求項4】

ＦＩＸ以外の他の血漿タンパク質が、前記コアとシェルとのふるい分け効果によって互いに分離された前記フロースルーで収集され、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）およびフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、ＩｇＧ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）および補体Ｃ３（Ｃ３）を含む請求項１、２または３に記載の方法。

【請求項5】

前記血漿の充填を１〜２０回反復した後、前記ＦＩＸが前記コアの前記リガンドから溶出される前に、ランニングバッファーを用いて対応する数のフロースルー（ＦＴ）を得る請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

それぞれのＦＴの特定の画分をプールして、それぞれＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ、ＩｇＧ／ＨＳＡおよびＣ３を得る請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記リッドビーズの総厚さが直径４０〜１００μｍであり、前記リッドの厚さが２〜１０μｍである請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記コアの前記リガンド濃度が５０〜２００μｍｏｌ／ｍＬである請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記リッドが、親和性リガンド、疎水性相互作用リガンド、ＩＭＡＣリガンド、カチオン交換リガンドまたはマルチモーダルリガンドを備え、ＦＩＸ以外の他の血漿タンパク質が、ＦＩＸが前記コアの前記リガンドに吸着されるのと同じ工程で前記リッドの前記リガンドに吸着され、血漿タンパク質が前記リッドの前記リガンドから順に溶出され、Ｆｉｘが前記コアのリガンドから溶出される請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記リッドの前記リガンドが、免疫グロブリン親和性を有するリガンドである請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記リッドおよびコアが同じ多孔度のアガロースから製造されている請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記リッドの前記多孔度が前記コアの前記多孔度よりも大きい請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記リッドの前記多孔度が前記コアの前記多孔度よりも小さい請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、クロマトグラフィーの分野に関する。さらに詳細には、本発明は、血漿タンパク質、例えば第ＶＩＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子および第ＩＸ因子の精製のためのクロマトグラフィー法に関する。クロマトグラフィー法は、内部多孔質コアと、該コアを取り囲む外部多孔質リッドとを含むマトリックス上で実施される。

【背景技術】

【0002】

血液は、重要な身体機能に必要な様々なタイプの細胞および分子を含み、したがって、例えば輸血のための治療目的で収集される。しかしながら、赤血球または無細胞血漿などの血液から様々な分画を分離して調製することが可能であり、これにより医学的状態をさらに直接的に治療処置することが可能になる。例えば、血液量を回復させるためにアルブミンが使用され、免疫不全のために免疫グロブリンが使用され、血液凝固障害のために凝固因子が使用されるなど、血漿中のいくつかのタンパク質をさらに分離して特定の治療処置に用いることができる。

【0003】

血漿は、例えば様々な機能、様々なサイズ、様々な量のタンパク質を含むことから、様々な血漿タンパク質を精製するための様々な方法がある。精製方法は、単一の血漿の出発プールからいくつかの標的タンパク質を得るように設計されることが多い。この方法は、典型的には、沈殿もしくはクロマトグラフィー法またはそれらの組合せを含む。クロマトグラフィーは、標的タンパク質の純度を高め、有害な副作用のリスクを低減するために使用されることが多い。多くの血漿タンパク質はきわめて強力な活性を示し、汚染物質として存在する場合、患者に投与すると、きわめて低量であっても有害反応を引き起こす可能性がある。

【0004】

収集されたヒト血漿は凍結保存され、血漿タンパク質精製方法の初期段階は、血漿の解凍およびプールである。典型的には１〜６℃の低温で解凍すると、一部の血漿タンパク質が沈殿し、例えば遠心分離によって収集することができる。収集された沈殿物は寒冷沈降物と呼ばれ、例えば凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）およびフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）の供給源として使用することができる。血漿中のＦＶＩＩＩの大部分は大きなｖＷＦ多量体との複合体として存在し、したがって２つのタンパク質は共精製されることが多い。寒冷沈降物を除去した後の残りの液体は低温消耗した（ｃｒｙｏｄｅｐｌａｔｅｄ）血漿または寒冷上清と呼ばれ、これは例えばアルブミン、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の供給源として使用することができる。

【0005】

多くの血漿タンパク質の精製は困難なことがある。これは、望ましくないが強力な活性を有する少量の汚染物質の存在によるものであり得るか、タンパク質が時にそれらの活性を失うかまたは望ましくない活性を獲得することによるものであり得る。例えば、ＦＶＩＩＩは容易に活性を失い、精製に使用される既知の方法は多くの点で満足できるものではない。したがって、良好な収率で血漿生成物を得るために、タンパク質がその活性を保持する条件下で操作することができる改善された方法が必要である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】米国特許出願公開第２０１６／０２４１８０号明細書

【発明の概要】

【0007】

本発明は、特にヒト血漿用途のために、血漿タンパク質を精製するためのクロマトグラフィー材料および方法を提供する。クロマトグラフィー材料は、様々な原理、例えば、サイズおよび結合／溶出に基づいて分離することができる。本発明の方法は、治療目的の大きなタンパク質（例えば、ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ）および比較的小さなタンパク質（ＨＳＡ、ＩｇＧ、ＦＩＸ）の両方を含む血漿サンプルの精製に特に適している。

【0008】

したがって、本発明は、血漿から治療用タンパク質を精製するためのクロマトグラフィー法であって、内部多孔質コアと外部多孔質シェルとを有する多孔質シェルビーズを含む樹脂を充填したクロマトグラフィーカラムに血漿を充填する工程と（内部コアはアニオン交換リガンドを備え、シェルは不活性であり（すなわちリガンドを備えない）、リッドおよびコアの多孔度によりＦＩＩＩ／ｖＷＦなどの５００ｋＤよりも大きい分子の進入を許容しない）、コアのアニオン交換リガンド上に第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を吸着する工程と、フロースルー中で分離された血漿タンパク質を収集する工程と、コアのリガンドからＦＩＸを溶出させる工程とを含む。クロマトグラフィー法におけるランニングバッファーおよび溶出バッファーの調整は当業者の知識の範囲内であり、以下の実験の項にその例が記載されている。

【0009】

アニオン交換リガンドは、任意のアニオン交換リガンドであってもよいが、好ましくはジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）または第四級アンモニウム（Ｑ）から選択され、最も好ましくはアニオン交換リガンドはＱリガンドである。

【0010】

好ましい実施形態では、ＦＩＸ以外の他の血漿タンパク質は、コアとシェルとのふるい分け効果によって互いに分離されたフロースルーで収集され、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）およびフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、ＩｇＧ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）および補体Ｃ３を含む。以下の図１Ｂのクロマトグラムを参照して、ピークＡ、ＢおよびＣを説明する。

【0011】

別の実施形態では、血漿の充填を１〜２０回、好ましくは５〜１０回反復した後、ＦＩＸがコアのリガンドから溶出される前に、ランニングバッファーを用いて対応する数のフロースルー（ＦＴ）を得る。各充填の後に約１カラム体積のランニングバッファーを用いて、充填の数に対応する数のＦＴを得る。これは、以下の図１Ａ〜１Ｂにおいてさらに詳細に説明される。

【0012】

別の実施形態では、それぞれのＦＴの特定の画分をプールして、それぞれＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ、ＩｇＧ／ＨＳＡおよびＣ３を得る。したがって、１つの同じクロマトグラフィーカラムで、ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ、ＩｇＧ／ＨＳＡ、Ｃ３およびＦＩＸのための分離した血漿画分が得られる。

【0013】

好ましくは、シェルビーズ（すなわち、シェル＋コア）の総厚さは直径４０〜１００μｍであり、リッドの厚さは好ましくは２〜１０μｍである。コアのリガンド濃度は、好ましくは５０〜２００μｍｏｌ／ｍＬである。

【0014】

さらなる実施形態では、シェルは親和性リガンド、疎水性相互作用リガンド、ＩＭＡＣリガンド、カチオン交換リガンドまたはマルチモーダルリガンド（またはアニオン交換リガンド以外の分離原理で応答する任意のリガンド）を備え、ＦＩＸ以外の他の血漿タンパク質、例えばＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ、ＩｇＧ、ＨＳＡ、Ｃ３は、ＦＩＸがコアのリガンドに吸着されるのと同じ工程でシェルのリガンドに吸着され、血漿タンパク質（選択されたタイプのリガンドに応じてＦＶＩＩＩ／ｖＷＦおよび／またはＩｇＧ、ＨＳＡ、Ｃ３）は、シェルのリガンドおよびコアのリガンド（ＦＩＸ）から順に溶出される。

【0015】

好ましくは、シェルのリガンドは、免疫グロブリン親和性を有するリガンド、例えば、タンパク質ＡもしくはＧまたは当該分野で公知のそれらの変異体である。

【0016】

本発明の方法に使用される多孔質材料は、好ましくはふるい分け材料、例えばクロマトグラフィーに一般的に使用されるゲル濾過材料などである。内部コアの多孔質材料は、リッドの多孔質材料と同じまたは異なる多孔度を有することができる。多孔質材料は、合成ポリマー材料、例えばスチレンもしくはスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、ビニルエステルおよびビニルアミド、または天然ポリマー材料、例えばアガロース、寒天、セルロース、デキストラン、キトサン、コンニャク、カラギーナン、ジェランおよびアルギン酸塩から選択される炭水化物材料に由来する。好ましい多孔質材料はアガロースである。

【0017】

シェルおよびコアは、同じ多孔度のアガロースから製造されてもよいが、異なる多孔度で作製されてもよい。

【0018】

第２の態様では、本発明は、上記の方法から得られた血漿タンパク質の治療のための使用に関する。例えば、血液量を回復させるためにアルブミンが使用され、免疫不全のために免疫グロブリンが使用され、血液凝固障害のために凝固因子が使用される。

【0019】

血漿タンパク質、特にＦＩＸは、汚染物質からさらに精製することなく、しかし生体適合性等のために必要な調節を伴って、治療のために使用され得ることが企図される。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1A】プロトタイプ９９カラムに適用された血漿のクロマトグラム。数字１〜６＝６つのサンプル適用からのフロースルー（ＦＴ）ピーク、Ｅ＝溶出ピーク、ＣＩＰ＝定置洗浄。

【0021】

吸光度２８０ｎｍ−実線、伝導率−点線、ｐＨ−破線。

【図1B】図１Ａによるプロトタイプ９９カラムに適用された血漿のクロマトグラムの部分拡大図であり、最終（６番目）のサンプル適用および溶出を示している。６＝６番目のサンプル適用からのフロースルーピーク；Ａ＝大きな分子、例えばＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ；Ｂ＝比較的小さな分子、例えばアルブミン、ＩｇＧ；Ｃ＝部分的に保持された材料；Ｅ＝溶出した分子、例えばＦＩＸ。

【0022】

吸光度２８０ｎｍ−実線、伝導率−点線、ｐＨ−破線。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本発明は、ここで、いくつかの非限定的な実施例および添付の図面に関連して、さらに詳細に記載される。

【0024】

実施例１：プロトタイプの合成
一般
マトリックスの容積は確定されたベッドボリュームを示し、グラムで示されたマトリックスの重量は吸入乾燥重量を示す。大規模な反応では、マグネットバースターラーを使用するとビーズの損傷を引き起こすため、撹拌とは、懸架式のモーター駆動の撹拌機を指している。従来の方法を使用して、機能性を分析し、アリル化の程度またはビーズ上のリガンド含量を決定した。

【0025】

担体粒子
使用した担体粒子は、米国特許第６，６０２，９９０号に記載の方法に従って調製された高架橋アガロースビーズであった。米国特許第６，６０２，９９０号はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ビーズは、８８マイクロメーターの体積加重平均直径（Ｄ５０、ｖ）および細孔容積の６９％がＭｗ１１０ｋＤａのデキストラン分子に利用可能であるような細孔サイズ分布を有していた。これは、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｃａｌｅ−Ｕｐ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ」（１９９７）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ．Ｇａｉｌ Ｓｏｆｅｒ＆Ｌａｒｓ Ｈａｇｅｌ編、ＩＳＢＮ ０−１２−６５４２６６−Ｘ、ｐ．３６８に記載の方法に従って測定した場合、ビーズ上のデキストラン１１０ｋＤａのＫｄが０．６９であるとも表現することができる。

【0026】

アリル化（プロトタイプ７６）
６ｘゲル容積（ＧＶ）の蒸留水を用いて２５０ｍＬ（ｇ）の担体粒子を洗浄し、次いで３ｘＧＶの５０％ＮａＯＨを用いて洗浄した。次いで、ゲルを吸引乾燥させ、２Ｌの丸底フラスコに移した。４８５ｍＬの５０％ＮａＯＨを添加し、機械的プロペラ撹拌を適用し、フラスコを５０℃の水浴に浸漬した。３０分後、８０ｍＬのアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）を添加した。１８．５時間反応を進行させた。１ｘＧＶの蒸留水、３ｘＧＶのエタノール、次いで８ｘＧＶの蒸留水を用いてゲルを洗浄した。

【0027】

滴定により、アリル含量、２７６μｍｏｌ／ｍＬを測定した。

【0028】

プロトタイプ９９
部分臭素化およびシェル不活性化
アリル化ゲルスラリー（プロトタイプ７６）１７１．８ｇをガラスフィルター（ｐｏｒ．２）に移し、吸引乾燥させた。乾燥したゲルを、機械的撹拌機を備えた１０００ｍＬの丸底フラスコに移す。５７１ｇの蒸留水を添加し、懸濁液を３００ｒｐｍで撹拌する。８３．７ｇの１．６％臭素溶液を１．５分かけて添加する。添加後、懸濁液は依然として白色である。室温で１５分間反応を進行させた。丸底フラスコを浴中に浸漬し、温度が５０℃に達した時点で５２ｇの５０％ＮａＯＨを添加した。１７時間反応を放置した。反応物をガラスフィルター（ｐｏｒ．２）に移し、１０×１ＧＶの蒸留水を用いて洗浄する。滴定により、残りのアリル含量、２１６μｍｏｌ／ｍＬを測定した。これは、理論上３．５μｍのシェルの厚さに相当する。

【0029】

コア臭素化およびＱカップリング
機械的撹拌機を備えた２５０ｍＬの丸底フラスコに、４１．５ｍＬ（ｇ）の部分的にアリル化された塩基性マトリックスを上から流した。１０．３７ｇの蒸留水および１．６６ｇの酢酸ナトリウムを添加した。数分間撹拌した後、０．６６ｍＬの臭素をピペットで添加し、反応物を３００ｒｐｍでさらに２０分間撹拌する。過剰の臭素は、４．１５ｍＬの４０％蟻酸ナトリウム溶液を添加することによって消費される。反応物は無色である。１５分後、８．３０ｍＬの塩化トリメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を添加し、５０％ＮａＯＨを添加することによってｐＨを１１〜１１．５に調整する。反応物を２５０ｒｐｍ、３０℃で１８時間撹拌する。ガラスフィルター（ｐｏｒ．３）に移す前に、６０％酢酸を添加することにより反応物をｐＨ５〜７に中和する。１０×１ＧＶの蒸留水、続いて２×１ＧＶの２０％ＥｔＯＨを用いてゲルを洗浄した。イオン交換基の滴定により１２５μｍｏｌ／ｍＬのＱリガンド密度を得た。

【0030】

表１は、プロトタイプ９９のリッドの厚さ、リガンドのタイプおよび濃度を示す。

【0031】

【表1】

実施例２：プロトタイプ９９に対する血漿のクロマトグラフィー
サンプル
サンプルはヒト血漿であった。凍結したヒト血漿を解凍し、綿で濾過し、カラムに適用した。

【0032】

バッファーおよび操作条件
カラム：プロトタイプ９９、ベッド高さ２８．６ｃｍ、カラム体積（ＣＶ）２２．５ｍＬのＴｒｉｃｏｒｎ１０／３００。

【0033】

クロマトグラフィー：サンプル体積６×５．２ｍＬ（６×０．２３ＣＶ）。流速５０ｃｍ／ｈ（０．６５ｍＬ／分）。

【0034】

ランニングバッファー：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２．６ｍＭ ＣａＣｌ₂、ｐＨ７．０。

【0035】

溶出バッファー：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２．６ｍＭ ＣａＣｌ₂、ｐＨ７．０。

【0036】

定置洗浄（ＣＩＰ）：０．５Ｍ ＮａＯＨ。

【0037】

最初のサンプル適用の前にカラムをランニングバッファーにより平衡化した。０．２３ＣＶの血漿をカラムに適用し、続いて１．８ＣＶのランニングバッファーを適用した。この手順、０．２３ＣＶの血漿の適用、続いて１．８ＣＶのランニングバッファーの適用を５回繰り返し、合計６回血漿サンプルを適用した。１．８ＣＶのランニングバッファーを最後に適用した後、１．５ＣＶの高塩溶出バッファーでカラムを溶出した。１．５ＣＶの０．５Ｍ ＮａＯＨを適用することによってカラムにＣＩＰを施した。最後に、４ＣＶのランニングバッファーによりカラムを再平衡化した。

【0038】

分析
ＳＤＳ ＰＡＧＥおよび液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）により、ＦＶＩＩＩ活性（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｍａｔｉｃ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩキット）、ｖＷＦ（Ｔｅｃｈｎｏｚｙｍ ｖＷＦ：Ａｇ ＥＬＩＳＡキット）、ＦＩＸ（ＲＯＸ Ｆａｃｔｏｒ ＩＸキット）について選択された画分を分析した。

【0039】

プロトタイプ９９をＴｒｉｃｏｒｎ１０／３００カラムに充填した。サイズに応じた群分離を可能にするために、ベッド高さを２８．６ｃｍ（ＣＶ２２．５ｍＬ）、流速を５０ｃｍ／ｈとした。実験は６つの血漿サンプル適用（６ｘ０．２３ＣＶ）からなり、６つの群分離をもたらし、コアのＱリガンドから１つの最終的な高塩溶出をもたらした。６つの群分離からの画分をプールして、きわめて大きな分子を有するプール画分Ａ、比較的小さなタンパク質を有するプール画分Ｂ、わずかに保持された比較的小さなタンパク質を有するプール画分Ｃをそれぞれ１つ得た。高塩溶出により、溶出画分Ｅを１つ得た。ＦＶＩＩＩ、ｖＷＦおよびＦＩＸについて全画分を分析した。クロマトグラムを図１Ａに示し、部分拡大を図１Ｂに示す。

【0040】

分析結果および収率計算については、下記の表２を参照する。画分Ａのプール中のＦＶＩＩＩおよびｖＷＦの収率は、それぞれ３７％および４０％であった。画分Ｂおよび画分Ｃのプールは、定量レベル未満のＦＶＩＩＩおよびｖＷＦ活性を有していた。溶出画分Ｅは、２２％のＦＶＩＩＩ活性および１３％のｖＷＦ活性を含んでいた。これにより、大きなＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の大部分がビーズに入らず、これらの条件のもとでビーズに入るがコアのＱリガンドに結合しない画分Ｂ中のアルブミンおよびＩｇＧなどの比較的小さな分子から分離されたフロースルーを通過することが示された。ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびＬＣ−ＭＳでは、アルブミンおよびＩｇＧが画分Ｂの主なタンパク質であることが示された。ＬＳ−ＭＣでは、画分Ｃの主要成分がＣ３およびアルブミンであることが示された。しかしながら、一部のＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体が細孔に入り、Ｑリガンドに結合するが、これはＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体のサイズの変化および低流量によるものであると考えられる。画分Ｅは、高塩で溶出した分子からなり、ＦＩＸ活性を有する唯一の画分であり、収率は９１％であった。これは、比較的小さなＦＩＸ分子がクロマトグラフィービーズに入り、コアのＱリガンドに結合することを示す。これにより、不活性リッドおよびリガンド含有コアを有するクロマトグラフィー媒体を使用することにより、大きなタンパク質をフロースルーで収集し比較的小さな分子を溶出によって収集することができることから、いずれもコアのリガンドに結合する大きな（ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ）血漿タンパク質および小さな（ＦＩＸ）血漿タンパク質を分離することが可能であることが実証される。

【0041】

表２：プロトタイプ９９上の血漿。ＦＶＩＩＩ、ｖＷＦおよびＦＩＸの活性。画分については、図１Ａおよび図１Ｂを参照のこと。

【0042】

Ｘ＝測定されない。ＬＯＱ＝定量レベル（ＦＶＩＩＩ：８ｍＵ／ｍＬ、ｖＷＦ：０．１０Ｕ／ｍＬ、ＦＩＸ：３０ｍＵ／ｍＬ）。

【0043】

【表2】

【図1A】

【図1B】