特許 6798085 糖化合物、糖化合物の製造方法、ＥＮＧａｓｅ活性検出用組成物、及びＥＮＧａｓｅ活性阻害剤のスクリーニング方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6798085

(24)【登録日】2020年11月24日

(45)【発行日】2020年12月9日

(54)【発明の名称】糖化合物、糖化合物の製造方法、ＥＮＧａｓｅ活性検出用組成物、及びＥＮＧａｓｅ活性阻害剤のスクリーニング方法

(51)【国際特許分類】

   C07H 15/04 20060101AFI20201130BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20201130BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20201130BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20201130BHJP

【ＦＩ】

   C07H15/04 ECSP

   G01N21/64 F

   G01N33/15 Z

   G01N33/50 Z

【請求項の数】4

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2016-118055(P2016-118055)

(22)【出願日】2016年6月14日

(65)【公開番号】特開2017-222590(P2017-222590A)

(43)【公開日】2017年12月21日

【審査請求日】2019年5月23日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１５ ＴＨＥ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯＮＧＲＥＳＳ ＯＦ ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＡＳＩＮ ＳＯＣＩＥＴＩＥＳ 開催日 平成２７年１２月１５〜２０日 日本農芸化学会 ２０１６年度大会 大会プログラム集 発行日 平成２８年２月２５日 日本農芸化学会 ２０１６年度大会 開催日 平成２８年３月２７〜３０日

(73)【特許権者】

【識別番号】504145364

【氏名又は名称】国立大学法人群馬大学

(74)【代理人】

【識別番号】100100549

【弁理士】

【氏名又は名称】川口 嘉之

(74)【代理人】

【識別番号】100126505

【弁理士】

【氏名又は名称】佐貫 伸一

(72)【発明者】

【氏名】松尾 一郎

(72)【発明者】

【氏名】吉村 弥生

(72)【発明者】

【氏名】石井 希実

(72)【発明者】

【氏名】須永 千恵

【審査官】 神谷 昌克

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１２−０２９５８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−２４１３８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 ChemBioChem，２０１８年，Vol.19，pp.660-663，DOI 10.1002/cbic.201700662

【文献】 PNAS，２０１５年，Vol.112, No.5，pp.1398-1403，DOI 10.1073/pnas.1414593112

【文献】 Rapid Communications in Mass Spectrometry，２０１１年，Vol.25，pp.2911-2922，DOI 10.1002/rcm.5190

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｈ

Ｇ０１Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（Ｉ）で表される糖化合物。

【化1】

（式（Ｉ）中、Ｒはそれぞれ独立して水素原子又はメチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基；アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基；トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、およびｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基から選択されるヒドロキシル基の保護基を、Ｒ’はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）；アセチル基、トリフルオロアセチル基（Ｔｆａ）；ｐ−トルエンスルホニル基（Ｔｓ）および２−ニトロベンゼンスルホニル基（Ｎｓ）から選択されるアミノ基の保護基を、Ｒ”はそれぞれ独立して単結合、第二級若しくは第三級アミノ基（−ＮＲ’−）、アミド基（−ＮＲ’ＣＯ−）、オキシ基（−Ｏ−）、カルボニル基（−ＣＯ−）、オキシカルボニル基（−ＯＣＯ−）、又は第二級若しくは第三級アミノ基（−ＮＲ’−）、オキシ基（−Ｏ−）、及びカルボニル基（−ＣＯ−）からなる群より選択される少なくとも１種の基を含んでいてもよい炭素原子数１〜６の２価の炭化水素基を、Ｚ^１及びＺ^２は何れか一方が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じる蛍光基を、もう一方が前記蛍光基に対応する消光基を表し、前記
蛍光基と前記消光基の組合せが、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の何れかである。）
（ｉ）下記式（ｄ−１）で表される蛍光基と下記式（ａ−１）で表される消光基の組合せ

【化2】

（式（ｄ−１）中、Ｒ’は水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）；アセチル基、トリフルオロアセチル基（Ｔｆａ）；ｐ−トルエンスルホニル基（Ｔｓ）および２−ニトロベンゼンスルホニル基（Ｎｓ）から選択されるアミノ基の保護基を表す。）
（ｉｉ）下記式（ｄ−２）で表される蛍光基と下記式（ａ−１）で表される消光基の組合せ

【化3】

（式（ｄ−２）中、Ｒは水素原子又はメチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基；アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基；トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、およびｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基から選択されるヒドロキシル基の保護基を表す。）
（ｉｉｉ）下記式（ｄ−３）で表される蛍光基と下記式（ａ−１）で表される消光基の組合せ

【化4】

（式（ｄ−３）中、Ｒは独立して水素原子又はメチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基；アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基；トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、およびｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基から選択されるヒドロキシル基の保護基を、Ｒ’は水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）；アセチル基、トリフルオロアセチル基（Ｔ
ｆａ）；ｐ−トルエンスルホニル基（Ｔｓ）および２−ニトロベンゼンスルホニル基（Ｎｓ）から選択されるアミノ基の保護基を表す。）
（ｉｖ）下記式（ｄ−４）で表される蛍光基と下記式（ａ−２）で表される消光基の組合せ

【化5】

（式（ｄ−４）及び（ａ−２）中、Ｒ’はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）；アセチル基、トリフルオロアセチル基（Ｔｆａ）；ｐ−トルエンスルホニル基（Ｔｓ）および２−ニトロベンゼンスルホニル基（Ｎｓ）から選択されるアミノ基の保護基を表す。）

【請求項2】

請求項１に記載の糖化合物を含むエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）活性検出用組成物。

【請求項3】

糖転移活性を有する酵素の存在下、下記式（ＩＩ）で表される化合物と下記式（ＩＩＩ）で表される化合物を反応させて下記式（Ｉ−１）で表される化合物を生成する糖転移反応工程を含む、糖化合物の製造方法。

【化6】

（式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、及び（Ｉ−１）中、Ｒはそれぞれ独立して水素原子又はメチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基；アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基；トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、およびｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基から選択されるヒドロキシル基の保護基を、Ｒ’はそれぞれ独立して水素原子、炭素原
子数１〜６の炭化水素基、又はｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）；アセチル基、トリフルオロアセチル基（Ｔｆａ）；ｐ−トルエンスルホニル基（Ｔｓ）および２−ニトロベンゼンスルホニル基（Ｎｓ）から選択されるアミノ基の保護基を、Ｒ”はそれぞれ独立して単結合、第二級若しくは第三級アミノ基（−ＮＲ’−）、アミド基（−ＮＲ’ＣＯ−）、オキシ基（−Ｏ−）、カルボニル基（−ＣＯ−）、オキシカルボニル基（−ＯＣＯ−）、又は第二級若しくは第三級アミノ基（−ＮＲ’−）、オキシ基（−Ｏ−）、及びカルボニル基（−ＣＯ−）からなる群より選択される少なくとも１種の基を含んでいてもよい炭素原子数１〜６の２価の炭化水素基を、Ｚ^１及びＺ^２は何れか一方が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じる蛍光基を、もう一方が前記蛍光基に対応する消光基を表し、前記蛍光基と前記消光基の組合せが、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の何れかである。）
（ｉ）下記式（ｄ−１）で表される蛍光基と下記式（ａ−１）で表される消光基の組合
せ

【化7】

（式（ｄ−１）中、Ｒ’は水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）；アセチル基、トリフルオロアセチル基（Ｔｆａ）；ｐ−トルエンスルホニル基（Ｔｓ）および２−ニトロベンゼンスルホニル基（Ｎｓ）から選択されるアミノ基の保護基を表す。）
（ｉｉ）下記式（ｄ−２）で表される蛍光基と下記式（ａ−１）で表される消光基の組合せ

【化8】

（式（ｄ−２）中、Ｒは水素原子又はメチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基；アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基；トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、およびｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基から選択されるヒドロキシル基の保護基を表す。）
（ｉｉｉ）下記式（ｄ−３）で表される蛍光基と下記式（ａ−１）で表される消光基の組合せ

【化9】

（式（ｄ−３）中、Ｒは独立して水素原子又はメチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基；アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基；トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、およびｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基から選択されるヒドロキシル基の保護基を、Ｒ’は水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）；アセチル基、トリフルオロアセチル基（Ｔｆａ）；ｐ−トルエンスルホニル基（Ｔｓ）および２−ニトロベンゼンスルホニル基（Ｎｓ）から選択されるアミノ基の保護基を表す。）
（ｉｖ）下記式（ｄ−４）で表される蛍光基と下記式（ａ−２）で表される消光基の組合せ

【化10】

（式（ｄ−４）及び（ａ−２）中、Ｒ’はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）；アセチル基、トリフルオロアセチル基（Ｔｆａ）；ｐ−トルエンスルホニル基（Ｔｓ）および２−ニトロベンゼンスルホニル基（Ｎｓ）から選択されるアミノ基の保護基を表す。）

【請求項4】

被検化合物をエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）に接触させる接触工程、及び前記被検化合物を接触させたエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）に下記式（Ｉ）で表される糖化合物を接触させて、前記糖化合物の分解活性を確認する活性確認工程を含む、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）活性阻害剤のスクリーニング方法。

【化11】

（式（Ｉ）中、Ｒはそれぞれ独立して水素原子又はメチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基；アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基；トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、およびｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基から選択されるヒドロキシル基の保護基を、Ｒ’はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）；アセチル基、トリフルオロアセチル基（Ｔｆａ）；ｐ−トルエンスルホニル基（Ｔｓ）および２−ニトロベンゼンスルホニル基（Ｎｓ）から選択されるアミノ基の保護基を、Ｒ”はそれぞれ独立して単結合、第二級若しくは第三級アミノ基（−ＮＲ’−）、アミド基（−ＮＲ’ＣＯ−）、オキシ基（−Ｏ−）、カルボニル基（−ＣＯ−）、オキシカルボニル基（−ＯＣＯ−）、又は第二級若しくは第三級アミノ基（−ＮＲ’−）、オキシ基（−Ｏ−）、及びカルボニル基（−ＣＯ−）からなる群より選択される少なくとも１種の基を含んでいてもよい炭素原子数１〜６の２価の炭化水素基を、Ｚ^１及びＺ^２は何れか一方が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じる蛍光基を、もう一方が前記蛍光基に対応する消光基を表し、前記蛍光基と前記消光基の組合せが、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の何れかである。）
（ｉ）下記式（ｄ−１）で表される蛍光基と下記式（ａ−１）で表される消光基の組合
せ

【化12】

（式（ｄ−１）中、Ｒ’は水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）；アセチル基、トリフルオロアセチル基（Ｔｆａ）；ｐ−トルエンスルホニル基（Ｔｓ）および２−ニトロベンゼンスルホニル基（Ｎｓ）から選択されるアミノ基の保護基を表す。）
（ｉｉ）下記式（ｄ−２）で表される蛍光基と下記式（ａ−１）で表される消光基の組合せ

【化13】

（式（ｄ−２）中、Ｒは水素原子又はメチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基；アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基；トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、およびｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基から選択されるヒドロキシル基の保護基を表す。）
（ｉｉｉ）下記式（ｄ−３）で表される蛍光基と下記式（ａ−１）で表される消光基の組合せ

【化14】

（式（ｄ−３）中、Ｒは独立して水素原子又はメチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基；アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基；トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、およびｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基から選択されるヒドロキシル基の保護基を、Ｒ’は水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）；アセチル基、トリフルオロアセチル基（Ｔｆａ）；ｐ−トルエンスルホニル基（Ｔｓ）および２−ニトロベンゼンスルホニル基（Ｎｓ）から選択されるアミノ基の保護基を表す。）
（ｉｖ）下記式（ｄ−４）で表される蛍光基と下記式（ａ−２）で表される消光基の組合せ

【化15】

（式（ｄ−４）及び（ａ−２）中、Ｒ’はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）；アセチル基、トリフルオロアセチル基（Ｔｆａ）；ｐ−トルエンスルホニル基（Ｔｓ）および２−ニトロベンゼンスルホニル基（Ｎｓ）から選択されるアミノ基の保護基を表す
。）

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、糖化合物に関し、より詳しくはエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）活性の検出に利用することができる糖化合物に関する。

【背景技術】

【0002】

「ペプチドＮ−グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅ）」や「エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）」は、真核細胞の細胞質に広く存在する糖鎖脱離酵素であり、小胞体における糖タンパク質の品質管理機構において重要な役割を担っていることが知られている。近年、ＰＮＧａｓｅ遺伝子（Ｎｇｌｙ１）の変異に基づいた遺伝子疾患「Ｎｇｌｙ１欠損症」の存在も明らかになり（非特許文献１参照）、生育遅延、四肢の筋力低下、不随意運動、肝機能異常、脳波異常等の重篤な症状を呈することも明らかになっている。また、ＰＮＧａｓｅの非存在下において、ＥＮＧａｓｅがＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を１つだけ残した「Ｎ−ＧｌｃＮＡｃタンパク質」を生成して、これが凝集体として蓄積する現象が確認されており（非特許文献２参照）、この現象がＮｇｌｙ１欠損症の病態発現に関与しているものと考えられている。一方で、ＰＮＧａｓｅとＥＮＧａｓｅの両方を欠いた細胞において、モデルタンパク質が正常に分解したことも報告されており、Ｎｇｌｙ１欠損症においてはＥＮＧａｓｅ活性を阻害することでその病態を改善できるのではないかと期待されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Need, A. C., et al., J. Med. Genet. 2012, 49, 353-361.

【非特許文献2】Chengcheng Huang, et al., “Endo-beta-N-acetylglucosaminidase forms N-GlcNAc protein aggregates during ER-associated degradation in Ngly1-defective cells”, PNAS. 2015, 112, 1398-1403.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

前述のようにＮｇｌｙ１欠損症に対して、ＥＮＧａｓｅ活性を阻害することでその病態を改善できるものと期待されており、ＥＮＧａｓｅ活性を簡易的に検出することができれば、ＥＮＧａｓｅ活性阻害剤等の開発に役立つ有効な手段になり得る。
本発明は、ＥＮＧａｓｅ活性の検出に利用することができる新規な化合物やＥＮＧａｓｅ活性阻害剤の開発に役立つスクリーニング方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明者らは、前記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じる蛍光基と消光基を特定の五糖構造に導入した糖化合物が、ＥＮＧａｓｅ活性の検出に有効であることを見出し、本発明を完成させた。

【0006】

即ち、本発明は、以下の通りである。
＜１＞ 下記式（Ｉ）で表される糖化合物。

【化1】

（式（Ｉ）中、Ｒはそれぞれ独立して水素原子又はヒドロキシル基の保護基を、Ｒ’はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はアミノ基の保護基を、Ｒ”はそれぞれ独立して単結合、第二級若しくは第三級アミノ基（−ＮＲ’−）、アミド基（−ＮＲ’ＣＯ−）、オキシ基（−Ｏ−）、カルボニル基（−ＣＯ−）、オキシカルボニル基（−ＯＣＯ−）、又は第二級若しくは第三級アミノ基（−ＮＲ’−）、オキシ基（−Ｏ−）、及びカルボニル基（−ＣＯ−）からなる群より選択される少なくとも１種の基を含んでいてもよい炭素原子数１〜６の２価の炭化水素基を、Ｚ^１及びＺ^２は何れか一方が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じる蛍光基を、もう一方が前記蛍光基に対応する消光基を表す。）
＜２＞ 前記蛍光基と前記消光基の組合せが、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の何れかである、請求項１に記載の糖化合物。
（ｉ）下記式（ｄ−１）で表される蛍光基と下記式（ａ−１）で表される消光基の組合せ

【化2】

（式（ｄ−１）中、Ｒ’は水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はアミノ基の保護基を表す。）
（ｉｉ）下記式（ｄ−２）で表される蛍光基と下記式（ａ−１）で表される消光基の組合せ

【化3】

（式（ｄ−２）中、Ｒは水素原子又はヒドロキシル基の保護基を表す。）
（ｉｉｉ）下記式（ｄ−３）で表される蛍光基と下記式（ａ−１）で表される消光基の組合せ

【化4】

（式（ｄ−３）中、Ｒは水素原子又はヒドロキシル基の保護基を、Ｒ’は水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はアミノ基の保護基を表す。）
（ｉｖ）下記式（ｄ−４）で表される蛍光基と下記式（ａ−２）で表される消光基の組合せ

【化5】

（式（ｄ−４）及び（ａ−２）中、Ｒ’はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はアミノ基の保護基を表す。）
＜３＞ ＜１＞又は＜２＞に記載の糖化合物を含むエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）活性検出用組成物。
＜４＞ 糖転移活性を有する酵素の存在下、下記式（ＩＩ）で表される化合物と下記式（ＩＩＩ）で表される化合物を反応させて下記式（Ｉ−１）で表される化合物を生成する糖転移反応工程を含む、糖化合物の製造方法。

【化6】

（式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、及び（Ｉ−１）中、Ｒはそれぞれ独立して水素原子又はヒド
ロキシル基の保護基を、Ｒ’はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はアミノ基の保護基を、Ｒ”はそれぞれ独立して単結合、第二級若しくは第三級アミノ基（−ＮＲ’−）、アミド基（−ＮＲ’ＣＯ−）、オキシ基（−Ｏ−）、カルボニル基（−ＣＯ−）、オキシカルボニル基（−ＯＣＯ−）、又は第二級若しくは第三級アミノ基（−ＮＲ’−）、オキシ基（−Ｏ−）、及びカルボニル基（−ＣＯ−）からなる群より選択される少なくとも１種の基を含んでいてもよい炭素原子数１〜６の２価の炭化水素基を、Ｚ^１及びＺ^２は何れか一方が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じる蛍光基を、もう一方が前記蛍光基に対応する消光基を表す。）
＜５＞ 被検化合物をエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）に接触させる接触工程、及び前記被検化合物を接触させたエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）に下記式（Ｉ）で表される糖化合物を接触させて、前記糖化合物の分解活性を確認する活性確認工程を含む、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）活性阻害剤のスクリーニング方法。

【化7】

（式（Ｉ）中、Ｒはそれぞれ独立して水素原子又はヒドロキシル基の保護基を、Ｒ’はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はアミノ基の保護基を、Ｒ”はそれぞれ独立して単結合、第二級若しくは第三級アミノ基（−ＮＲ’−）、アミド基（−ＮＲ’ＣＯ−）、オキシ基（−Ｏ−）、カルボニル基（−ＣＯ−）、オキシカルボニル基（−ＯＣＯ−）、又は第二級若しくは第三級アミノ基（−ＮＲ’−）、オキシ基（−Ｏ−）、及びカルボニル基（−ＣＯ−）からなる群より選択される少なくとも１種の基を含んでいてもよい炭素原子数１〜６の２価の炭化水素基を、Ｚ^１及びＺ^２は何れか一方が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じる蛍光基を、もう一方が前記蛍光基に対応する消光基を表す。）

【発明の効果】

【0007】

本発明によれば、ＥＮＧａｓｅ活性を簡易的に検出することができ、ＥＮＧａｓｅ活性阻害剤等を効率的にスクリーニングすることができる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】実施例１で得られたＭＡＮＴ−Ｍａｎ_３ＧＮ_２−ＤＮＰの^１ＨＮＭＲのチャートである。

【図2】実施例１で得られたＭＡＮＴ−Ｍａｎ_３ＧＮ_２−ＤＮＰのＥＳＩＭＳのスペクトルである。

【図3】実施例２で行った反応混合液のＨＰＬＣクロマトグラムである。

【図4】実施例２で行った酵素反応をマイクロプレートリーダーにより追跡した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明の詳細を説明するに当たり、具体例を挙げて説明するが、本発明の趣旨を逸脱しない限り以下の内容に限定されるものではなく、適宜変更して実施することができる。

【0010】

＜糖化合物＞
本発明の一態様である糖化合物（以下、「本発明の糖化合物」と略す場合がある。）は、下記式（Ｉ）で表される化合物である。

【化8】

（式（Ｉ）中、Ｒはそれぞれ独立して水素原子又はヒドロキシル基の保護基を、Ｒ’はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はアミノ基の保護基を、Ｒ”はそれぞれ独立して単結合、第二級若しくは第三級アミノ基（−ＮＲ’−）、アミド基（−ＮＲ’ＣＯ−）、オキシ基（−Ｏ−）、カルボニル基（−ＣＯ−）、オキシカルボニル基（−ＯＣＯ−）、又は第二級若しくは第三級アミノ基（−ＮＲ’−）、オキシ基（−Ｏ−）、及びカルボニル基（−ＣＯ−）からなる群より選択される少なくとも１種の基を含んでいてもよい炭素原子数１〜６の２価の炭化水素基を、Ｚ^１及びＺ^２は何れか一方が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じる蛍光基を、もう一方が前記蛍光基に対応する消光基を表す。）
本発明者らは、下記式で表される反応のように、ＥＮＧａｓｅが式（Ｉ）中の五糖構造に対して、特定の位置を選択的に切断する特異性があることを見出しており、切断によって分離される位置に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じる蛍光基（ドナー）と消光基（アクセプター）を配置した糖化合物を合成して、これがＦＲＥＴプローブとして実際に利用できることを確認したのである。例えば、下記式で表される反応中の糖化合物は、式（Ｉ）のＺ^１の位置に蛍光基としてＮ−メチルアントラニル基を、式（Ｉ）のＺ^２の位置に消光基として２，４−ジニトロフェニル基を有しており、ＥＮＧａｓｅによって糖鎖が切断されると、蛍光基と消光基の距離が離れて蛍光基の蛍光発光の強度変化等が生じるため、ＥＮＧａｓｅ活性が検出できることになるのである。

【化9】

なお、「蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じる蛍光基」と「蛍光基に対応する消光基」とは、蛍光基と消光基が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じる任意の組合せであることを意味する。

【0011】

本発明の糖化合物は、下記式（Ｉ）で表される化合物であるが、式（Ｉ）に該当するものであれば具体的種類は特に限定されず、使用目的等にあわせて適宜選択することができる。

【化10】

式（Ｉ）中のＲは、それぞれ独立して「水素原子」又は「ヒドロキシル基の保護基」を表しているが、ヒドロキシル基の保護基としては、メチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等のエーテル系保護基；アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基等のアシル系保護基；トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基等のシリルエーテル系保護基等が挙げられる。

【0012】

式（Ｉ）中のＲ’は、それぞれ独立して「水素原子」、「炭素原子数１〜６の炭化水素基」、又は「アミノ基の保護基」を表しているが、「炭化水素基」とは直鎖状の飽和炭化水素基に限られず、炭素−炭素不飽和結合、分岐構造、環状構造のそれぞれを有していてもよい炭素原子及び水素原子のみからなる基を意味するものとする。
炭化水素基としては、メチル基（−ＣＨ_３、−Ｍｅ）、エチル基（−Ｃ_２Ｈ_５、−Ｅｔ）、ｎ−プロピル基（−^ｎＣ_３Ｈ_７、−^ｎＰｒ）、ｉ−プロピル基（−^ｉＣ_３Ｈ_７、−^ｉＰｒ）、ｎ−ブチル基（−^ｎＣ_４Ｈ_９、−^ｎＢｕ）、ｔ−ブチル基（−^ｔＣ_４Ｈ_９、−^ｔ
Ｂｕ）、ｎ−ペンチル基（−^ｎＣ_５Ｈ_１１）、ｎ−ヘキシル基（−^ｎＣ_６Ｈ_１３，−^ｎＨｅｘ）、シクロヘキシル基（−^ｃＣ_６Ｈ_１１，−Ｃｙ）、フェニル基（−Ｃ_６Ｈ_５，−Ｐｈ）等が挙げられる。
アミノ基の保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）等のアルコキシカルボニル系保護基；アセチル基、トリフルオロアセチル基（Ｔｆａ）等のアシル系保護基；ｐ−トルエンスルホニル基（Ｔｓ）、２−ニトロベンゼンスルホニル基（Ｎｓ）等のアルキル（アリール）スルホニル基等が挙げられる。

【0013】

式（Ｉ）中のＲ”は、それぞれ独立して「単結合」、「第二級若しくは第三級アミノ基（−ＮＲ’−）」、「アミド基（−ＮＲ’ＣＯ−）」、「オキシ基（−Ｏ−）」、「カルボニル基（−ＣＯ−）」、「オキシカルボニル基（−ＯＣＯ−）」、又は「第二級若しくは第三級アミノ基（−ＮＲ’−）、オキシ基（−Ｏ−）、及びカルボニル基（−ＣＯ−）からなる群より選択される少なくとも１種の基を含んでいてもよい炭素原子数１〜６の２価の炭化水素基」を表しているが、「単結合」とは、下記式で表される構造のように後述するＺ^１やＺ^２が糖の六員環に直接結合していることを意味する。

【化11】

「第二級若しくは第三級アミノ基（−ＮＲ’−）」、「アミド基（−ＮＲ’ＣＯ−）」、「オキシ基（−Ｏ−）」、「カルボニル基（−ＣＯ−）」、「オキシカルボニル基（−ＯＣＯ−）」とは、下記式で表される構造のように後述するＺ^１やＺ^２がこれらの基を介して糖の六員環に結合していることを意味する。

【化12】

「２価の炭化水素基」とは、２つの結合位置を有する炭化水素基を意味し、直鎖状の飽和炭化水素基に限られず、炭素−炭素不飽和結合、分岐構造、環状構造のそれぞれを有していてもよいことを意味する。また、「第二級若しくは第三級アミノ基（−ＮＲ’−）、オキシ基（−Ｏ−）、及びカルボニル基（−ＣＯ−）からなる群より選択される少なくとも１種の基を含んでいてもよい」とは、下記式で表される構造のように、炭化水素基の炭素骨格の内部及び／又は末端にこれらの基を含んでもよいことを意味する。

【化13】

【0014】

Ｚ^１及びＺ^２は「何れか一方が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じる蛍光基」を、「もう一方が前記蛍光基に対応する消光基」を表しているが、蛍光基と消光基の組合せは、Ｂａｃｈｅｍ社等の「ＦＲＥＴ ＳＵＢＳＴＲＡＴＥＳ」やAngew. Chem. Int. Ed. 2006,45,4562-4588.に記載されている構造等が挙げられる。この中でも、蛍光基と消光基の組合せとしては、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のものが好ましい。
（ｉ）下記式（ｄ−１）で表される蛍光基と下記式（ａ−１）で表される消光基の組合せ

【化14】

（式（ｄ−１）中、Ｒ’は水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はアミノ基の保護基を表す。）
（ｉｉ）下記式（ｄ−２）で表される蛍光基と下記式（ａ−１）で表される消光基の組合せ

【化15】

（式（ｄ−２）中、Ｒは水素原子又はヒドロキシル基の保護基を表す。）
（ｉｉｉ）下記式（ｄ−３）で表される蛍光基と下記式（ａ−１）で表される消光基の組合せ

【化16】

（式（ｄ−３）中、Ｒは水素原子又はヒドロキシル基の保護基を、Ｒ’は水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はアミノ基の保護基を表す。）
（ｉｖ）下記式（ｄ−４）で表される蛍光基と下記式（ａ−２）で表される消光基の組合せ

【化17】

（式（ｄ−４）及び（ａ−２）中、Ｒ’はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はアミノ基の保護基を表す。）
なお、式（ｄ−１）〜（ｄ−４）及び式（ａ−１）及び（ａ−２）中のＲとＲ’としては、前述のものと同様のものが挙げられる。

【0015】

本発明の糖化合物としては、下記式で表されるものが挙げられる。

【化18】

【0016】

＜糖化合物の製造方法＞
本発明の糖化合物の製造方法は、特に限定されず、公知の有機合成反応、化学酵素法等を組み合せて製造してもよいが、糖転移活性を有する酵素の存在下、下記式（ＩＩ）で表される化合物と下記式（ＩＩＩ）で表される化合物を反応させて下記式（Ｉ−１）で表される化合物を生成する糖転移反応工程（以下、「糖転移反応工程」と略す場合がある。）を含む方法によって製造することが好ましい。なお、糖転移反応工程を含む糖化合物の製造方法も本発明の一態様である。

【化19】

（式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、及び（Ｉ−１）中、Ｒはそれぞれ独立して水素原子又はヒドロキシル基の保護基を、Ｒ’はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数１〜６の炭化水素基、又はアミノ基の保護基を、Ｒ”はそれぞれ独立して単結合、第二級若しくは第三級アミノ基（−ＮＲ’−）、アミド基（−ＮＲ’ＣＯ−）、オキシ基（−Ｏ−）、カルボニル基（−ＣＯ−）、オキシカルボニル基（−ＯＣＯ−）、又は第二級若しくは第三級アミノ基（−ＮＲ’−）、オキシ基（−Ｏ−）、及びカルボニル基（−ＣＯ−）からなる群より選択される少なくとも１種の基を含んでいてもよい炭素原子数１〜６の２価の炭化水素基を、Ｚ^１及びＺ^２は何れか一方が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じる蛍光基を、もう一方が前記蛍光基に対応する消光基を表す。）

【0017】

糖転移反応工程は、糖転移活性を有する酵素の存在下で行われる工程であるが、具体的な酵素は、特に限定されず、糖転移活性を有するものとして公知のものを適宜採用することができる。具体的な酵素としては、糖転移活性を有する糖加水分解酵素が好ましく、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）やその変異体が特に好ましい。ＥＮＧａｓｅとしては、Ｅｎｄｏ−Ａ、Ｅｎｄｏ−Ｍ、Ｅｎｄｏ−Ｄ、Ｅｎｄｏ−Ｓ、Ｅｎｄｏ−ＣＣ、Ｅｎｄｏ−Ｏｍ、Ｅｎｄｏ−ＣＥ、Ｅｎｄｏ−ＨＳ等、ＥＮＧａｓｅの変異体としては、Ｅｎｄｏ−Ａ（Ｎ１７１Ａ，Ｅ１７３Ｑ，Ｅ１７３Ｈ）、Ｅｎｄｏ−Ｍ（Ｎ１７５Ａ，Ｅ１７５Ｑ）、Ｅｎｄｏ−Ｄ（Ｎ３２２Ａ，Ｅ３２２Ｑ）、Ｅｎｄｏ−Ｓ（Ｎ２３３Ａ，Ｅ２３３Ｑ）、Ｅｎｄｏ−ＣＣ（Ｎ１８０Ｈ，Ｅ１８０Ｑ）等が挙げられる。

【0018】

糖転移反応工程における糖転移活性を有する酵素の使用量は、式（ＩＩ）で表される化合物に対して物質量換算で、通常０．００１ｍｏｌ％以上、好ましくは０．００３ｍｏｌ％以上であり、通常０．００７ｍｏｌ％以下、好ましくは０．００５ｍｏｌ％以下である。

【0019】

糖転移反応工程は、通常溶媒中で行われるものであるが、溶媒としては、リン酸緩衝液等の緩衝液（ｐＨ５〜７）、３０％以下のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）水溶液、３０％以下のメタノール水溶液、３０％以下のアセトン水溶液等が挙げられる。

【0020】

糖転移反応工程に使用する式（ＩＩ）で表される化合物の調製方法は、特に限定されないが、下記式で表される反応経路を辿る方法が挙げられる。

【化20】

上記式で表される反応経路は、ラクトサミン誘導体のガラクトース残基のＣ−３位とＣ−６位にマンノース残基を、Ｃ−４位にアジド基を経由してアミノ基を導入し、アミノ基に蛍光基としてＮ−メチルアントラニル基を導入して、還元末端基部分をオキサゾリン化することで式（ＩＩ）で表される化合物を調製している。

【0021】

糖転移反応工程に使用する式（ＩＩＩ）で表される化合物の調製方法は、それぞれ特に限定されないが、式（ＩＩＩ）で表される化合物の調製方法としては、下記式で表される反応経路を辿る方法が挙げられる。

【化21】

【0022】

＜エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）活性検出用組成物＞
前述のようにＥＮＧａｓｅには、式（Ｉ）中の五糖構造に対して、特定の位置を選択的
に切断する特異性があり、ＥＮＧａｓｅによって糖鎖が切断されると、蛍光発光の強度変化等が生じるため、ＥＮＧａｓｅ活性が検出できることになる。本発明の糖化合物の用途は、特に限定されないが、このようにＥＮＧａｓｅ活性の検出に利用することが挙げられる。なお、本発明の糖化合物を含むＥＮＧａｓｅ活性検出用組成物（以下、「本発明の組成物」と略す場合がある。）も本発明の一態様である。

【化22】

【0023】

本発明の組成物の式（Ｉ）で表される糖化合物の含有量は、対象となるＥＮＧａｓｅに対して物質量換算で、通常５００％以上、好ましくは２０００％以上であり、通常４００００％以下、好ましくは４０００％以下となる量である。

【0024】

本発明の組成物が対象とするＥＮＧａｓｅとしては、Glycobiology vol. 23 no. 6 pp.
736-744, 2013に記載のものが挙げられ、具体的にはＥｎｄｏ−Ｍ、Ｅｎｄｏ−Ａ、Ｅｎｄｏ−Ｄ、Ｅｎｄｏ−ＣＣ、ヒトＥＮＧａｓｅ、マウスＥＮＧａｓｅ、酵母ＥＮＧａｓｅ、担子菌類ＥＮＧａｓｅ等が挙げられる。

【0025】

＜エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）活性阻害剤のスクリーニング方法＞
前述のようにＮｇｌｙ１欠損症においては、ＥＮＧａｓｅが病態発現に関与しているものと考えられており、ＥＮＧａｓｅ活性を阻害することでＮｇｌｙ１欠損症の病態を改善できるものと考えられている。本発明の糖化合物は、ＥＮＧａｓｅ活性を簡易的に検出することができるため、被検化合物に接触させたＥＮＧａｓｅを本発明の糖化合物と接触させて、本発明の糖化合物の分解活性を確認することで、ＥＮＧａｓｅ活性阻害剤を効率的にスクリーニングすることができるのである。なお、被検化合物をＥＮＧａｓｅに接触させる接触工程（以下、「接触工程」と略場合がある。）、及び被検化合物を接触させたＥＮＧａｓｅに式（Ｉ）で表される糖化合物を接触させて、糖化合物の分解活性を確認する活性確認工程（以下、「活性確認工程」と略す場合がある。）を含むＥＮＧａｓｅ活性阻害剤のスクリーニング方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」と略す場合がある。）も本発明の一態様である。

【0026】

接触工程は、被検化合物をＥＮＧａｓｅに接触させる工程であるが、接触させる被検化合物の質量は、ＥＮＧａｓｅの１ｎｇに対して、通常７．５μｇ以上、好ましくは１５μｇ以上であり、通常１５０μｇ以下、好ましくは７５μｇ以下である。

【0027】

活性確認工程は、被検化合物を接触させたＥＮＧａｓｅに式（Ｉ）で表される糖化合物を接触させて、糖化合物の分解活性を確認する工程であるが、接触させる式（Ｉ）で表される糖化合物の質量は、ＥＮＧａｓｅの１ｎｇに対して、通常３μｇ以上、好ましくは３０μｇ以上であり、通常５００μｇ以下、好ましくは３００μｇ以下である。

【0028】

活性確認工程における式（Ｉ）で表される糖化合物の分解活性の確認方法は、特に限定されないが、式（Ｉ）で表される糖化合物の蛍光基に基づいた蛍光発光の強度変化を観測する方法、式（Ｉ）で表される糖化合物の消光基に基づいた紫外線（ＵＶ）の吸収波長等を観測する方法が挙げられる。例えば、被検化合物を接触させていないＥＮＧａｓｅの糖化合物の分解活性と、被検化合物を接触させたＥＮＧａｓｅの糖化合物の分解活性を比較し、被検化合物を接触させたＥＮＧａｓｅの方が糖化合物の分解活性が劣っていた場合に、被検化合物はＥＮＧａｓｅ活性の阻害作用がある（ＥＮＧａｓｅ活性阻害剤である。）と判断することができる。

【0029】

本発明のスクリーニング方法が対象とするＥＮＧａｓｅとしては、Glycobiology vol. 23 no. 6 pp. 736-744, 2013に記載のものが挙げられ、具体的にはＥｎｄｏ−Ｍ、Ｅｎｄｏ−Ａ、Ｅｎｄｏ−Ｄ、Ｅｎｄｏ−ＣＣ、ヒトＥＮＧａｓｅ、マウスＥＮＧａｓｅ、酵母ＥＮＧａｓｅ、担子菌類ＥＮＧａｓｅ等が挙げられる。

【実施例】

【0030】

以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。従って、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。

【0031】

＜実施例１：式（Ｉ）で表される糖化合物の製造＞
（Benzyl 4,6-O-benzylidene-2-O-tert-butyldimethylsilyl-3-O-pivaroyl-α-
D-mannopyranosyl-(1-3)-[4,6-O-benzylidene-2-O-tert-butyldimethylsilyl
-3-O-pivaroyl-α-D-mannopyranosyl-(1-6)]-β-D-galactopyranosyl
-(1-4)-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside (３)の合成）

【化23】

モレキュラーシーブズ４Ａ（７．８ｇ）とＮ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ，９３６ｍｇ，４．１６ｍｍｏｌ）存在下、化合物１（９４０ｍｇ，１．２６ｍｍｏｌ）と化合物２（１．５５ｇ，２．７７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１６ｍＬ）を加えた。−７８℃にてトリフルオロメタンスルホン酸（１２２μＬ，１．３９ｍｍｏｌ）を加え２日間撹拌した。トリエチルアミン（２９０μＬ）を加え、反応を停止した後、反応混合物を酢酸エチルで希釈、不溶物をセライトで濾過し、有機層をチオ硫酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水、１Ｍ塩酸溶液、飽和食塩水、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝９６／４〜６０／４０）にて精製し、化合物３（１．００ｇ，４８％）を得た。Ｒｆ＝０．２９（ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）。

【0032】

（Benzyl 4,6-O-benzylidene-2-O-tert-butyldimethylsilyl-3-O-pivaroyl-α-
D-mannopyranosyl-(1-3)-[4,6-O-benzylidene-2-O-tert-butyldimethylsilyl
-3-O-pivaroyl-α-D-mannopyranosyl-(1-6)]-2-O-acetyl-4-azide-4-deoxy-β-D-
mannopyranosyl-(1-4)-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-
D-glucopyranoside (４)の合成）

【化24】

化合物３（４５６ｍｇ，０．２７８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（６ｍＬ）に溶かし、０℃にてピリジン（６７２μＬ，８．３４ｍｍｏｌ）、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（４６８μＬ，２．７８ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２．５時間攪拌後、反応液を酢酸エチルにて希釈、有機層を飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン／酢酸エチル＝１００／０〜８３／１７）にて精製し、２，４−ジトリフルオロメタンスルホニル化合物（４１７ｍｇ，７９％）を得た。得られた化合物をトルエンにて共沸、真空乾燥した後に、トルエン（９ｍＬ）に溶かし、０℃にてテトラブチルアンモニウムアジド（７８ｍｇ，０．２６３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１．５時間撹拌した。反応液を酢酸エチルにて希釈、有機層を飽和食塩水、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン／酢酸エチル＝１００／０〜８３／１７）にて精製し、４−位がアジド化された化合物（３８４ｍｇ，９７％）を得た。得られた化合物をトルエン共沸、真空乾燥した後にトルエン（９ｍＬ）に溶かし、酢酸セシウム（４１０ｍｇ，２．１３ｍｍｏｌ）、１８−クラウン−６（５６２ｍｇ，２．１３ｍｍｏｌ）を加え、一晩超音波処理をおこなった。反応液を酢酸エチルで希釈後、有機層を順次、飽和食塩水、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムにて乾燥、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン／酢酸エチル＝９７／３〜８２／１８）にて精製し、化合物４（２９０ｍｇ，６１％ ｉｎ ３ ｓｔｅｐｓ）を得た。Ｒｆ＝０．３５（トルエン／酢酸エチル＝５／１）。

【0033】

（α-D-mannopyranosyl-(1-3)-[α-D-mannopyranosyl-(1-6)]
-4-amino-4-deoxy-β-D-mannopyranosyl-(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranose (５)の合成）

【化25】

化合物４（８２．５ｍｇ，４８．４μｍｏｌ）をＴＨＦ（１．４ｍＬ）に溶解させ、０℃にて１Ｍ ＴＢＡＦ／ＴＨＦ溶液（１４４μＬ，０．１４５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて一晩反応させた。反応液を減圧濃縮後、残渣にｎ−ブタノール（２ｍＬ）、エチレンジ
アミン（２００μＬ）を加え、アルゴンガス雰囲気下、９０℃にて一晩攪拌した。反応液を減圧濃縮後、残渣をピリジン（２ｍＬ）に溶かし、氷浴中、無水酢酸（５００μＬ）を加え、アルゴン雰囲気下、４０℃にて一晩攪拌した。メタノール（１ｍＬ）を加え反応を停止し、反応液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルにて希釈し、有機層を飽和重曹水、食塩水にて順次洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムにて乾燥し、減圧濃縮した。残渣をテトラヒドロフラン（１ｍＬ）に溶かし、氷浴中１Ｍ ナトリウムメトキシド/メタノール（５００μＬ）を加え、アルゴンガス雰囲気下、４０℃で一晩攪拌した。反応液をアンバーリスト（オルガノ株式会社製，登録商標）にて中和後、アンバーリストを濾別し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝１００／０〜９３／７）にて精製し、脱保護中間体（４４ｍｇ，７７％）を得た。得られた中間体（５８ｍｇ，４９．２μｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（５ｍＬ）に溶かし、水（５ｍＬ）を加えた。反応容器をアルゴンガスにて置換し、水酸化パラジウム（５０ｍｇ）を加え、再び反応容器をアルゴンガスで置換した。ついで反応容器を水素ガスで置換後、４０℃にて一晩攪拌した。セライト濾過にて水酸化パラジウムを除去した後、反応液を凍結乾燥した。残渣をＩＳＯＬＵＴ １８Ｃ（バイオタージ社製，登録商標，水１００％）にて精製後、凍結乾燥し、化合物５（３２ｍｇ，９３％）を得た。Ｒｆ＝０．１７（アセトニトリル／水＝２／１）。

【0034】

（α-D-mannopyranosyl-(1-3)-[α-D-mannopyranosyl-(1-6)]
-4-deoxy-4-N-methylanthraniloylamido-β-D-mannopyranosyl-(1-4)-
2-acetamido 2-deoxy-β-D-glucopyranose (６)の合成）

【化26】

化合物５（４．０ｍｇ，５．７μｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（３７０μＬ）に溶解し、ジメチルアミノピリジン（１．４ｍｇ，１１μｍｏｌ）、Ｎ−メチルアントラニル酸（１．０ｍｇ，８．４μｍｏｌ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（ＨＡＴＵ，４．１３ｍｇ，１０μｍｏｌ）を加え、室温にて５時間反応させた。反応液を水にて希釈、水層をジエチルエーテルにて洗浄後、水層を凍結乾燥した。得られた残渣をＩＳＯＬＵＴＥ
Ｃ１８（水〜メタノール）にて精製した。その後、ＨＰＬＣ（Ｉｍｔａｋｔ Ｕｎｉｓｏｎ ＵＳ−Ｃ１８，５μｍ，２０×２５０ｍｍ，水／アセトニトリル＝９７／３，０．１％ＴＦＡ溶液）により精製し、化合物６（３．５ｍｇ，７４％）を得た。Ｒｆ＝０．５（アセトニトリル／水＝３／１）。

【0035】

（2-Methyl-[α-D-mannopyranosyl-(1-3)-[α-D-mannopyranosyl
-(1-6)]-4-deoxy-4-N-methylanthraniloylamido-β-D-mannopyranosyl-(1-4)
-1,2-dideoxy-α-D-glucopyrano]-[2,1-d]-oxazoline (７)の合成）

【化27】

化合物６（１ｍｇ，１．２μｍｏｌ）と炭酸カリウム（６．２ｍｇ，４４．６μｍｏｌ）を重水（６０μＬ）に溶かし、０℃にて２−クロロ−１，３−ジメチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−３−イウム塩化物（ＣＤＭＢＩ，３．９ｍｇ，１７．８μｍｏｌ）を加え、２時間反応させた。反応液（５μＬ）を分注し、重水にて希釈後ＮＭＲを測定し、反応の終了を確認した。反応混合物から不溶性の塩を遠心ろ過により除去し、化合物７溶液（２０ｍＭ，５５μＬ）を得た。

【0036】

（3-N-benzyl-3-(N-benzyloxycarbonyl)aminopropyl
4-O-acetyl-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside (１０)の合成）

【化28】

モレキュラーシーブズ４Ａ（０．９ｇ）とＮ−ヨードスクシンイミド（６４ｍｇ，２８５μｍｏｌ）存在下、化合物８（５３ｍｇ，１７７μｍｏｌ）と化合物９（１１９ｍｇ，１９０μｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５ｍＬ）を加えた。−７８℃にてトリフルオロメタンスルホン酸（１７μＬ，１９０μｍｏｌ）を加え、−２０℃にて１時間撹拌した。反応混合物にトリエチルアミン（５０μＬ）を加え、反応を停止した後，酢酸エチルで希釈、不溶物をセライトで濾過した。得られたろ液をチオ硫酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水、１Ｍ塩酸溶液、飽和食塩水、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝７５／２５）にて精製し、化合物１０（９３ｍｇ，６３％）を得た。Ｒｆ＝０．４５（ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）。

【0037】

（3-Aminopropyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (１１)の合成）

【化29】

化合物１０（６６．０ｍｇ，７９．６μｍｏｌ）にｎ−ブタノール（１ｍＬ）、エチレ
ンジアミン（１００μＬ）を加え、アルゴンガス雰囲気下、８０℃にて一晩攪拌した。反応液を減圧濃縮後、残渣をピリジン（１ｍＬ）に溶かし、氷浴中、無水酢酸（５００μＬ）を加え、アルゴン雰囲気下４０℃にて一晩攪拌した。メタノール（１ｍＬ）を加え反応を停止し、反応液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルにて希釈し、有機層を飽和重曹水、食塩水にて洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムにて乾燥し、減圧濃縮した。残渣をテトラヒドロフラン（１ｍＬ）に溶かし、氷浴中１Ｍナトリウムメトキシド／メタノール（５００μＬ）を加え、アルゴンガス雰囲気下、４０℃で一晩攪拌した。反応液をアンバーリストにて中和後、アンバーリストを濾別し、溶液を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝１００／０〜９０／１０）にて精製し、脱保護中間体（４０ｍｇ，７２％ ｉｎ ３ ｓｔｅｐｓ）を得た。得られた中間体（４０ｍｇ，５７．２μｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２ｍＬ）に溶かし、水（２ｍＬ）を加えた。反応容器をアルゴンガスにて置換後、水酸化パラジウム（２０ｍｇ）を加えた。反応容器を水素ガスで置換後、室温にて一晩攪拌した。反応液に再度、水酸化パラジウム（２０ｍｇ）、水（２ｍＬ）を加え、一晩撹拌した。セライト濾過にて水酸化パラジウムを除去後、得られたろ液を凍結乾燥した。残渣をＩＳＯＬＵＴ １８Ｃ（水１００％）にて精製後、凍結乾燥し、化合物１１（１１．８ｍｇ，７４％）を得た。Ｒｆ＝０．１８（２−プロパノール／水＝２／１）。

【0038】

（3-N-2,4-di-nitrophenyl-3-aminopropyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (１２)の合成）

【化30】

化合物１１（８．７ｍｇ，３１．４μｍｏｌ）を飽和重曹水（２００μＬ）に溶解し、２，４−ジニトロフェニルフルオリド（８．９ｍｇ，４７．１μｍｏｌ）のメタノール溶液（１００μＬ）を加えた。１時間反応させた後、２，４−ジニトロフェニルフルオリド（８．９ｍｇ，４７．１μｍｏｌ）のメタノール溶液（１００μＬ）を再度加えた。１時間反応させた後、反応混合物を水で希釈し、ジエチルエーテルにて洗浄した。水層を凍結乾燥し、得られた残渣をＩＳＯＬＵＴＥ Ｃ１８（水〜メタノール）にて精製し、化合物１２（３．１９ｍｇ，２３％）を得た。Ｒｆ＝０．６２（アセトニトリル／水＝５／１）。

【0039】

（3-N-2,4-di-nitrophenyl-3-aminopropyl
α-D-mannopyranosyl-(1-3)-[α-D-mannopyranosyl-(1-6)]
-4-deoxy- 4-N-methylanthraniloylamido-β-D-mannopyranosyl
-(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (ＭＡＮＴ−Ｍａｎ_３ＧＮ_２−ＤＮＰ)の合成）

【化31】

２０ｍＭの糖供与体溶液７を５０μＬ、４０ｍＭの糖受容体溶液１２を５０μＬ、水９２μＬ、１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）を５０μＬ、Ｅｎｄｏ−Ｍ−Ｎ１７５Ｑ（４ｍＵ，東京化成工業株式会社）を８μＬを加えた（終濃度２００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）、全量２５０μＬに調製）。３７℃で２時間インキュベーションした後、アセトニトリルを１００μＬ加え、反応を停止した。反応混合液を凍結乾燥し、得られた残渣をＩＳＯＬＵＴＥ Ｃ１８にて精製（水〜６０％メタノール溶液）、生成物を含む画分を凍結乾燥した。得られた残渣をＨＰＬＣ（Ｉｍｔａｋｔ Ｕｎｉｓｏｎ ＵＳ−Ｃ１８，５μｍ，２０×２５０ｍｍ，水／アセトニトリル＝７３／２７，０．１％ＴＦＡ溶液）にて精製し、ＭＡＮＴ−Ｍａｎ_３ＧＮ_２−ＤＮＰ（０．２ｍｇ，１６％）を得た。得られたＭＡＮＴ−Ｍａｎ_３ＧＮ_２−ＤＮＰの^１ＨＮＭＲの測定結果（ＮＭＲチャート）を図１に、ＥＳＩＭＳの測定結果（スペクトル）を図２に示す。
¹H NMR (600 MHz, D₂O) δ 9.12 (d, 1H, J = 2.4 Hz, Ar-H), 8.30 (m, 1H, Ar-H), 7.53 (m, 2H, Ar-H), 7.11 (d, 1H, J = 9.6 Hz, Ar-H), 7.04 (d, 1H, J = 7.9 Hz, Ar-H),
6.97 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 4.95 (s, 1H, H-1), 4.85 (s, 1H, H-1), 4.60 (d, 1H, J = 7.6 Hz, H-1), 4.51 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H-1), 4.43-4.39 (m, 1H), 4.31 (d, 1H, J
= 2.7 Hz), 4.03 (m, 1H), 3.96-3.48 (m, 33H), 2.88 (s, 3H, -NHCH₃), 2.07 (s, 3H,
-COCH₃), 1.99 (m, 2H, -CH₂CH₂CH₂-), 1.91 (s, 3H, -COCH₃). ESI-MS: m/z: calcd for : C₅₁H₇₅N₇NaO₃₀: 1288.4455; found 1288.4434 [M+Na]⁺.

【0040】

＜実施例２：エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）の活性検出＞
（方法１：ＨＰＬＣを用いた加水分解反応の活性検出）
ＭＡＮＴ−Ｍａｎ_３ＧＮ_２−ＤＮＰプローブ溶液（５ｍＭ）を２μＬと、ＤＭＳＯを２μＬ、リン酸ナトリウムバッファー（２５０ｍＭ，ｐＨ６）を４μＬの混合溶液に酵素液を２μＬ（Ｅｎｄｏ−Ｍ，０．１ｍＵ，東京化成工業株式会社）加え、１０μＬの反応混合液（終濃度１ｍＭ ＭＡＮＴ−Ｍａｎ_３ＧＮ_２−ＤＮＰ，２０％ＤＭＳＯ，１００ｍＭリン酸バッファー）を３７℃で２時間インキュベートした。反応は、１５、３０、６０、１２０分ごとに反応液を２μＬずつ分注し、８μＬのアセトニトリルに加え、反応を停止した。反応混合液を３０μＬの水で希釈し、ＨＰＬＣ（ＴＯＳＯＨ ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−１００Ｖ，５μｍ，４．６ｍｍ×１５ｃｍ，水／アセトニトリル＝９７／３〜６０／４０，０．１％ＴＦＡ溶液，流速１ｍＬ／ｍｉｎ，１５分間、島津超高速液体クロマトグラフ Ｎｅｘｅｒａ）にて分析した。反応混合液のＨＰＬＣクロマトグラムの結果を図３に示す。

【0041】

（方法２：マイクロプレートリーダーを用いた加水分解反応の活性検出）
ＭＡＮＴ−Ｍａｎ_３ＧＮ_２−ＤＮＰプローブ溶液（２５μＭ）を２０μＬとＤＭＳＯを２０μＬ、リン酸ナトリウムバッファー（２５０ｍＭ，ｐＨ６）を４０μＬの混合溶液に酵素液を２０μＬ（Ｅｎｄｏ−Ｍ，０．０１、０．０２、０．０５、０．１ｍＵ，東京化成工業）加え、１００μＬの反応混合液（終濃度５μＭ ＭＡＮＴ−Ｍａｎ_３ＧＮ_２−ＤＮＰ，２０％ ＤＭＳＯ １００ｍＭ リン酸バッファー）を３７℃で２時間インキュベートした。反応は、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標
） Ｍ２００ ＰＲＯ）を使用し、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍにて追跡した。マイクロプレートリーダーにより反応混合液の蛍光強度変化を追跡した結果を図４に示す。酵素反応の進行に伴い、蛍光強度が上昇していることから，基質の切断を確認することができる。

【産業上の利用可能性】

【0042】

本発明の糖化合物は、Ｎｇｌｙ１欠損症の治療に役立つと考えられるＥＮＧａｓｅ活性阻害剤等をスクリーニングするために利用することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】