特許 6799101 クローディンを発現するガン疾患を処置するための剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6799101

(24)【登録日】2020年11月24日

(45)【発行日】2020年12月9日

(54)【発明の名称】クローディンを発現するガン疾患を処置するための剤

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20201130BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20201130BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20201130BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20201130BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20201130BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20201130BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20201130BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20201130BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20201130BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20201130BHJP

   G01N 33/531 20060101ALN20201130BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28ZNA

   C12N15/13

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12N1/15

   A61K39/395 N

   A61P35/00

   A61K48/00

   A61K31/7105

   !G01N33/531 A

【請求項の数】9

【全頁数】149

(21)【出願番号】特願2019-46753(P2019-46753)

(22)【出願日】2019年3月14日

(62)【分割の表示】特願2015-542186(P2015-542186)の分割

【原出願日】2013年11月12日

(65)【公開番号】特開2019-162104(P2019-162104A)

(43)【公開日】2019年9月26日

【審査請求日】2019年4月12日

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2012/004712

(32)【優先日】2012年11月13日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2013/002270

(32)【優先日】2013年7月30日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】509146023

【氏名又は名称】バイオエヌテック エスエー

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＮＴＥＣＨ ＳＥ

(73)【特許権者】

【識別番号】000006677

【氏名又は名称】アステラス製薬株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】515123258

【氏名又は名称】トロン− トランスラショナル オンコロジー アン デア ウニヴェリジテーツメディツィン デア ヨハネス グーテンベルク−ウニヴェルシテート マインツ ゲマインニューツィゲ ゲーエムベーハー

【氏名又は名称原語表記】ＴＲＯＮ− Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｅ Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ ａｎ ｄｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔｓｍｅｄｉｚｉｎ ｄｅｒ Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ｇｕｔｅｎｂｅｒｇ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｍａｉｎｚ ｇｅｍｅｉｎｎｕｅｔｚｉｇｅ ＧｍｂＨ

(74)【代理人】

【識別番号】100110928

【弁理士】

【氏名又は名称】速水 進治

(72)【発明者】

【氏名】サヒン， ウグル

(72)【発明者】

【氏名】テューレヒ， エズレム

(72)【発明者】

【氏名】シュタドラー， クリスティアーネ

(72)【発明者】

【氏名】ホラント， ユリア

(72)【発明者】

【氏名】ベーア−マハムッド， ハヤツ

(72)【発明者】

【氏名】バイセルト， ティム

(72)【発明者】

【氏名】プリューム， ラウラ

(72)【発明者】

【氏名】ル ギャル， ファブリス

(72)【発明者】

【氏名】イエンドレツキ， アルネ

(72)【発明者】

【氏名】フィードラー， マルクス

【審査官】 宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／０５７７８８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００７−５３０４３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５０８１６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５２８０７５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

２つの結合ドメインを含み、第１の結合ドメインがクローディン（ＣＬＤＮ）に結合し、かつ、第２の結合ドメインがＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、
当該二重特異性抗体が、配列番号４４、および配列番号４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
二重特異性抗体。

【請求項2】

当該二重特異性抗体がＴ細胞上のＣＤ３に結合することにより、前記Ｔ細胞の増殖および／または活性化を引き起こす、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項3】

請求項１または２のいずれかに記載の二重特異性抗体をコードする組換え核酸。

【請求項4】

ベクターの形態またはＲＮＡの形態である請求項３に記載の組換え核酸。

【請求項5】

請求項３または４に記載される組換え核酸を含む宿主細胞。

【請求項6】

治療において使用されるための、特に、ガンを処置することまたは防止することにおいて使用されるための、請求項１または２に記載の二重特異性抗体、請求項３または４に記載の組換え核酸、あるいは、請求項５に記載の宿主細胞。

【請求項7】

請求項１または２に記載の二重特異性抗体、請求項３または４に記載の組換え核酸、あるいは、請求項５に記載の宿主細胞を含む医薬組成物。

【請求項8】

ＣＬＤＮ６を発現するガン疾患を処置するか、または防止するための薬剤を製造するための、請求項１または２に記載の二重特異性抗体、請求項３または４に記載の組換え核酸、あるいは、請求項５に記載の宿主細胞の使用方法。

【請求項9】

前記ガンが、膀胱ガン、卵巣ガン（特に、卵巣腺ガンおよび卵巣奇形ガン）、肺ガン（小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）を含むが、特に、扁平上皮肺ガンおよび扁平上皮肺腺ガン）、胃ガン、乳ガン、肝ガン、膵臓ガン、皮膚ガン（特に、基底細胞ガンおよび扁平上皮ガン）、悪性メラノーマ、頭頸部ガン（特に、悪性多形性腺腫）、肉腫（特に、滑膜肉腫および滑膜ガン肉腫）、胆管ガン、膀胱のガン（特に、移行上皮ガンおよび移行上皮乳頭状ガン）、腎臓ガン（特に、腎明細胞ガンおよび乳頭状腎細胞ガンを含む腎細胞ガン）、結腸ガン、小腸ガン（回腸のガン、特に、小腸腺ガンおよび回腸の腺ガンを含む）、精巣胎児性ガン、胎盤性絨毛ガン、子宮頸ガン、精巣ガン（特に、精巣セミノーマ、精巣奇形腫および胎芽性精巣ガン）、子宮ガン、胚細胞腫瘍（例えば、奇形ガンまたは胚性ガン腫など、特に、精巣の胚細胞腫瘍）、および、それらの転移形態物からなる群から選択される、
請求項８に記載の使用方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

クローディンは、上皮および内皮のタイトジャンクションの内部に位置する内在性膜タンパク質である。クローディンは、２つの細胞外ループを伴う４つの膜貫通セグメント、ならびに、細胞質に位置するＮ末端およびＣ末端を有することが予測される。クローディン（ＣＬＤＮ）ファミリーの膜貫通タンパク質は、非常に重要な役割を上皮および内皮のタイトジャンクションの維持において果たしており、また、細胞骨格の維持および細胞のシグナル伝達においても役割を果たしているかもしれない。

【背景技術】

【0002】

クローディン１８（ＣＬＤＮ１８）分子は、４つの膜貫通する疎水性領域および２つの細胞外ループ（疎水性領域１および疎水性領域２によって囲まれるループ１；疎水性領域３および疎水性領域４によって囲まれるループ２）を有する内在性の膜貫通タンパク質（テトラスパニン）である。ＣＬＤＮ１８には、２つの異なるスプライス変化体が存在し、これらがマウスおよびヒトにおいて記載されている（Ｎｉｉｍｉ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２１：７３８０〜９０、２００１）。これらのスプライス変化体（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：スプライス変化体１（ＣＬＤＮ１８．１）：ＮＰ＿０５７４５３、ＮＭ＿０１６３６９、および、スプライス変化体２（ＣＬＤＮ１８．２）：ＮＭ＿００１００２０２６、ＮＰ＿００１００２０２６）は分子量がおよそ２７，９ｋＤ／２７，７２ｋＤである。スプライス変化体のＣＬＤＮ１８．１およびＣＬＤＮ１８．２は、最初の膜貫通（ＴＭ）領域およびループ１を含むＮ末端部分が異なり、これに対して、Ｃ末端の一次タンパク質配列は同一である。

【0003】

正常な組織では、ＣＬＤＮ１８．２の検出可能な発現は、ＣＬＤＮ１８．２が短寿命の分化した胃上皮細胞の表面にもっぱら発現される胃を除いて全く認められない。ＣＬＤＮ１８．２は、悪性形質転換の過程において維持されており、したがって、ヒト胃ガン細胞の表面にしばしば呈示される。そのうえ、この汎腫瘍抗原は、食道腺ガン、膵臓腺ガンおよび肺腺ガンにおいて顕著なレベルで異所性に活性化される。ＣＬＤＮ１８．２タンパク質はまた、胃ガン腺ガンのリンパ節転移物に、また、とりわけ卵巣内への遠位転移物（いわゆるクルケンベルグ腫瘍）に局在化する。

【0004】

ＣＬＤＮ６は、一連の異なるヒトガン細胞において発現し、一方、正常な組織における発現は胎盤に限定される。

【0005】

ガン細胞と正常な細胞との間における様々なクローディン（例えば、ＣＬＤＮ１８．２およびＣＬＤＮ６など）の示差的発現、それらの膜局在化、および、毒性と関連した正常な組織の大部分にはそれらが存在しないことにより、これらの分子がガン免疫療法のための魅力的な標的になっており、したがって、クローディンを標的化するための抗体に基づく治療学を使用することにより、高レベルの治療特異性が見込まれる。
Ｔ細胞の潜在能力をガンの処置のために使用する取り組みには、腫瘍由来のタンパク質、ＲＮＡまたはペプチド抗原を用いるワクチン接種、腫瘍由来のエクスビボ拡大されたＴ細胞の注入（これは養子移入と呼ばれる）、Ｔ細胞受容体遺伝子移入、あるいは、二重特異性抗体または三重特異性抗体によるＴ細胞の直接的関与が含まれる。同様に、Ｔ細胞応答の多くの刺激剤が併用で、または単独療法として臨床試験されており、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体のためのリガンド、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ−４を阻止する抗体、免疫刺激性サイトカイン、または、ガン細胞の免疫回避に関与する分子（例えば、ＴＧＦ−ベータまたはＢ７−Ｈ１など）を中和する抗体などが臨床試験されている。Ｔ細胞に基づく治療法の集中的な開発が、患者の腫瘍がＴ細胞によって浸潤されるならば、患者は有意に長く生存するようであるという所見によって動機づけられる。そのうえ、数多くのマウスモデルは、様々な手段によるＴ細胞の関与により、大きな腫瘍さえも根絶することができることを示しており、いくつかのＴ細胞治療法が近年では、著しい進歩を、様々なガン適応症を処置することにおいてもたらしている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｎｉｉｍｉ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２１：７３８０〜９０、２００１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ガン疾患の治療法のための新規な剤および方法を提供することが本発明の目的の１つであった。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の根底にある課題の解決策は、腫瘍に伴うクローディン分子に対して、すなわち、ガン細胞に対して特異的である結合ドメインを含有する結合剤を作製するという考えに基づく。他の結合ドメインが、Ｔ細胞に結合することを可能にするＣＤ３に対して特異的であり、かつ、Ｔ細胞を複合体の中に引き入れることを可能にし、したがって、これにより、Ｔ細胞の細胞傷害性影響を標的としてのガン細胞に向けさせることが可能になる。この複合体の形成は、細胞傷害性Ｔ細胞におけるシグナル伝達を自身で、または、補助細胞との組合せでのどちらかで誘導することができ、これにより、細胞傷害性媒介因子の放出が引き起こされる。

【0009】

本発明者らは、クローディンおよびＣＤ３を標的化する結合剤が、強力なＴ細胞媒介細胞溶解を誘導することができ、かつ、腫瘍疾患を処置することにおいて効果的であることを初めて報告する。

【0010】

１つの局面において、本発明は、少なくとも２つの結合ドメインを含み、第１の結合ドメインがクローディンに結合し、かつ、第２の結合ドメインがＣＤ３に結合する結合剤に関連する。本発明の結合剤は、（ＣＤ３受容体と会合することによって）細胞傷害性細胞に結合し、かつ、標的として破壊されることになる、ＣＬＤＮを発現するガン細胞に結合する場合がある。

【0011】

１つの実施形態において、前記結合剤は二重特異性分子であり、例えば、二重特異性抗体などであり、具体的には二重特異性単鎖抗体である。１つの実施形態において、前記クローディンはガン細胞において発現される。１つの実施形態において、前記クローディンはガン細胞の表面に発現される。１つの実施形態において、前記クローディンは、クローディン１８．２およびクローディン６からなる群から選択される。１つの実施形態において、前記第１の結合ドメインは前記クローディンの細胞外ドメインに結合する。１つの実施形態において、前記第１の結合ドメインは、生細胞の表面に存在するＣＬＤＮの生来型エピトープに結合する。１つの実施形態において、前記第１の結合ドメインはＣＬＤＮの最初の細胞外ループに結合する。１つの実施形態において、前記第２の結合ドメインはＣＤ３のイプシロン鎖に結合する。１つの実施形態において、前記ＣＤ３はＴ細胞の表面に発現される。１つの実施形態において、前記結合剤がＴ細胞上のＣＤ３に結合することにより、前記Ｔ細胞の増殖および／または活性化が引き起こされ、ただし、前記活性化されたＴ細胞により、細胞傷害性因子（例えば、パーフォリンおよびグランザイム）が好ましくは放出され、かつ、ガン細胞の細胞溶解およびアポトーシスが開始される。１つの実施形態において、クローディンに対する前記結合および／またはＣＤ３に対する前記結合は特異的な結合である。

【0012】

１つの実施形態において、前記結合剤は全長型抗体または抗体フラグメントの形式である。１つの実施形態において、前記結合剤は、少なくとも２つの結合ドメインを伴う４つの抗体可変ドメインを含み、ただし、少なくとも１つの結合ドメインがクローディンに結合し、かつ、少なくとも１つの結合ドメインがＣＤ３に結合する。１つの実施形態において、前記結合剤は、免疫グロブリンの重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）で、クローディン抗原に対する特異性を有する可変ドメイン（ＶＨ（ＣＬＤＮ））、免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）で、クローディン抗原に対する特異性を有する可変ドメイン（ＶＬ（ＣＬＤＮ））、免疫グロブリンの重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）で、ＣＤ３に対する特異性を有する可変ドメイン（ＶＨ（ＣＤ３））、および、免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）で、ＣＤ３に対する特異性を有する可変ドメイン（ＶＬ（ＣＤ３））を含む。

【0013】

１つの実施形態において、前記結合剤は、同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメインにつながれる重鎖可変ドメインを含むジアボディーの形式であり、その結果、これら２つのドメインが対形成しないようにされる。１つの実施形態において、前記ジアボディーは２つのポリペプチド鎖を含み、ただし、一方のポリペプチドがＶＨ（ＣＬＤＮ）およびＶＬ（ＣＤ３）を含み、他方のポリペプチド鎖がＶＨ（ＣＤ３）およびＶＬ（ＣＬＤＮ）を含む。

【0014】

１つの実施形態において、前記結合剤は、リンカーペプチドを介してつながれる２つのｓｃＦｖ分子からなる二重特異性単鎖抗体の形式であり、ただし、前記重鎖可変領域（ＶＨ）およびその対応する軽鎖可変領域（ＶＬ）が好ましくは、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ（ＣＬＤＮ）−ＶＬ（ＣＬＤＮ）−ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＤ３）の順、ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＤ３）−ＶＨ（ＣＬＤＮ）−ＶＬ（ＣＬＤＮ）の順、または、ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＬＤＮ）−ＶＨ（ＣＬＤＮ）の順で配置される。１つの実施形態において、前記重鎖可変領域（ＶＨ）およびその対応する軽鎖可変領域（ＶＬ）は、長いペプチドリンカーを介して、好ましくは、（ＧＧＧＧＳ）３またはＶＥ（ＧＧＧＧＳ）２ＧＧＶＤのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介してつながれる。１つの実施形態において、前記２つのＶＨ−ＶＬ型ｓｃＦｖユニットまたはＶＬ−ＶＨ型ｓｃＦｖユニットは、短いペプチドリンカーを介して、好ましくは、ＳＧＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介してつながれる。

【0015】

１つの実施形態において、前記ＣＬＤＮはＣＬＤＮ１８．２であり、前記ＶＨ（ＣＬＤＮ）は、配列番号８によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含み、かつ、前記ＶＬ（ＣＬＤＮ）は、配列番号１５によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含む。

【0016】

１つの実施形態において、前記ＣＬＤＮはＣＬＤＮ１８．２であり、前記ＶＨ（ＣＬＤＮ）は、配列番号６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含み、かつ、前記ＶＬ（ＣＬＤＮ）は、配列番号１１によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含む。

【0017】

１つの実施形態において、前記ＣＬＤＮはＣＬＤＮ６であり、前記ＶＨ（ＣＬＤＮ）は、配列番号２２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含み、かつ、前記ＶＬ（ＣＬＤＮ）は、配列番号２３によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含む。

【0018】

１つの実施形態において、前記ＣＬＤＮはＣＬＤＮ６であり、前記ＶＨ（ＣＬＤＮ）は、配列番号２２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含み、かつ、前記ＶＬ（ＣＬＤＮ）は、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９または配列番号１００によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含む。

【0019】

１つの実施形態において、前記ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号３６、配列番号９４または配列番号９５によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含み、かつ、前記ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号３７または配列番号９６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含む。

【0020】

１つの実施形態において、前記ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号３６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含み、かつ、前記ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号３７によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含む。

【0021】

１つの実施形態において、前記ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号９５によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含み、かつ、前記ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号９６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含む。

【0022】

１つの局面において、本発明の結合剤は、リンカーペプチドを介してつながれる２つのｓｃＦｖ分子を含む二重特異性単鎖抗体の形式であり、ただし、前記重鎖可変領域（ＶＨ）およびその対応する軽鎖可変領域（ＶＬ）がＮ末端からＣ末端に、ＶＨ（ＣＬＤＮ）−ＶＬ（ＣＬＤＮ）−ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＤ３）の順で配置される。１つの実施形態において、前記ＶＨ（ＣＤ３）およびＶＬ（ＣＤ３）は、１５個〜２０個、好ましくは１５個または２０個のアミノ酸（好ましくはグリシンおよび／またはセリン）からなるペプチドリンカーを介してつながれ、好ましくは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）４を含むペプチドリンカーを介してつながれる。１つの実施形態において、前記ＶＨ（ＣＬＤＮ）およびＶＬ（ＣＬＤＮ）は、１５個〜２０個、好ましくは１５個または２０個のアミノ酸（好ましくはグリシンおよび／またはセリン）からなるペプチドリンカーを介してつながれ、好ましくは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）４を含むペプチドリンカーを介してつながれる。１つの実施形態において、前記２つのＶＨ−ＶＬ型ｓｃＦｖユニットは、アミノ酸配列ＳＧＧＧＧＳを含むリンカーペプチドを介してつながれる。前記２つのＶＨ−ＶＬ型ｓｃＦｖユニットのうちの１つまたは両方が１つまたは複数の相互接続ジスルフィド架橋を含む場合がある。

【0023】

１つの局面において、本発明の結合剤は、リンカーペプチドを介してつながれる２つのｓｃＦｖ分子を含む二重特異性単鎖抗体の形式であり、ただし、前記重鎖可変領域（ＶＨ）およびその対応する軽鎖可変領域（ＶＬ）がＮ末端からＣ末端に、ＶＬ（ＣＬＤＮ）−ＶＨ（ＣＬＤＮ）−ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＤ３）の順で配置される。１つの実施形態において、前記ＶＨ（ＣＤ３）およびＶＬ（ＣＤ３）は、１５個〜２０個、好ましくは１５個または２０個のアミノ酸（好ましくはグリシンおよび／またはセリン）からなるペプチドリンカーを介してつながれ、好ましくは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）４を含むペプチドリンカーを介してつながれる。１つの実施形態において、前記ＶＬ（ＣＬＤＮ）およびＶＨ（ＣＬＤＮ）は、２０個〜２５個、好ましくは２０個または２５個のアミノ酸（好ましくはグリシンおよび／またはセリン）からなるペプチドリンカーを介してつながれ、好ましくは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）５を含むペプチドリンカーを介してつながれる。１つの実施形態において、前記ＶＬ−ＶＨ型ｓｃＦｖユニットおよびＶＨ−ＶＬ型ｓｃＦｖユニットは、アミノ酸配列ＳＧＧＧＧＳを含むリンカーペプチドを介してつながれる。前記２つのＶＬ−ＶＨ型ｓｃＦｖユニットまたはＶＨ−ＶＬ型ｓｃＦｖユニットのうちの１つまたは両方が１つまたは複数の相互接続ジスルフィド架橋を含む場合がある。

【0024】

１つの局面において、本発明の結合剤は、リンカーペプチドを介してつながれる２つのｓｃＦｖ分子を含む二重特異性単鎖抗体の形式であり、ただし、前記重鎖可変領域（ＶＨ）およびその対応する軽鎖可変領域（ＶＬ）がＮ末端からＣ末端に、ＶＨ（ＣＬＤＮ）−ＶＬ（ＣＬＤＮ）−ＶＬ（ＣＤ３）−ＶＨ（ＣＤ３）の順で配置される。好ましくは、前記ＶＬ（ＣＤ３）−ＶＨ（ＣＤ３）ｓｃＦｖユニットは１つまたは複数の相互接続ジスルフィド架橋を含む。１つの実施形態において、前記ＶＬ（ＣＤ３）およびＶＨ（ＣＤ３）は、２０個〜２５個、好ましくは２０個または２５個のアミノ酸（好ましくはグリシンおよび／またはセリン）からなるペプチドリンカーを介してつながれ、好ましくは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）５を含むペプチドリンカーを介してつながれる。１つの実施形態において、前記ＶＨ（ＣＬＤＮ）およびＶＬ（ＣＬＤＮ）は、１５個〜２０個、好ましくは１５個または２０個のアミノ酸（好ましくはグリシンおよび／またはセリン）からなるペプチドリンカーを介してつながれ、好ましくは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）４を含むペプチドリンカーを介してつながれる。１つの実施形態において、前記ＶＨ−ＶＬ型ｓｃＦｖユニットおよびＶＬ−ＶＨ型ｓｃＦｖユニットは、アミノ酸配列ＳＧＧＧＧＳを含むリンカーペプチドを介してつながれる。前記ＶＨ（ＣＬＤＮ）−ＶＬ（ＣＬＤＮ）ｓｃＦｖユニットは１つまたは複数の相互接続ジスルフィド架橋を含む場合がある。

【0025】

１つの局面において、本発明の結合剤は、リンカーペプチドを介してつながれる２つのｓｃＦｖ分子を含む二重特異性単鎖抗体の形式であり、ただし、前記重鎖可変領域（ＶＨ）およびその対応する軽鎖可変領域（ＶＬ）がＮ末端からＣ末端に、ＶＬ（ＣＬＤＮ）−ＶＨ（ＣＬＤＮ）−ＶＬ（ＣＤ３）−ＶＨ（ＣＤ３）の順で配置される。好ましくは、前記ＶＬ（ＣＤ３）−ＶＨ（ＣＤ３）ｓｃＦｖユニットは１つまたは複数の相互接続ジスルフィド架橋を含む。１つの実施形態において、前記ＶＬ（ＣＤ３）およびＶＨ（ＣＤ３）は、２０個〜２５個、好ましくは２０個または２５個のアミノ酸（好ましくはグリシンおよび／またはセリン）からなるペプチドリンカーを介してつながれ、好ましくは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）５を含むペプチドリンカーを介してつながれる。１つの実施形態において、前記ＶＬ（ＣＬＤＮ）およびＶＨ（ＣＬＤＮ）は、２０個〜２５個、好ましくは２０個または２５個のアミノ酸（好ましくはグリシンおよび／またはセリン）からなるペプチドリンカーを介してつながれ、好ましくは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）５を含むペプチドリンカーを介してつながれる。１つの実施形態において、前記２つのＶＬ−ＶＨ型ｓｃＦｖユニットは、アミノ酸配列ＳＧＧＧＧＳを含むリンカーペプチドを介してつながれる。前記ＶＬ（ＣＬＤＮ）−ＶＨ（ＣＬＤＮ）ｓｃＦｖユニットは１つまたは複数の相互接続ジスルフィド架橋を含む場合がある。

【0026】

上記局面のいずれかの１つの実施形態において、前記ＣＬＤＮはＣＬＤＮ１８．２である。好ましくは、前記ＶＨ（ＣＬＤＮ）は、配列番号８によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含み、かつ、前記ＶＬ（ＣＬＤＮ）は、配列番号１５によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含む。代替において、前記ＶＨ（ＣＬＤＮ）は、配列番号６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含み、かつ、前記ＶＬ（ＣＬＤＮ）は、配列番号１１によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含む。１つの実施形態において、前記ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号９５によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含み、かつ、前記ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号９６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含む。

【0027】

１つの局面において、本発明の結合剤は、リンカーペプチドを介してつながれる２つのｓｃＦｖ分子を含む二重特異性単鎖抗体の形式であり、ただし、前記重鎖可変領域（ＶＨ）およびその対応する軽鎖可変領域（ＶＬ）がＮ末端からＣ末端に、ＶＨ（ＣＬＤＮ）−ＶＬ（ＣＬＤＮ）−ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＤ３）の順またはＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＤ３）−ＶＨ（ＣＬＤＮ）−ＶＬ（ＣＬＤＮ）の順で配置される。１つの実施形態において、前記ＶＨ（ＣＬＤＮ）およびＶＬ（ＣＬＤＮ）は、１５個〜２０個、好ましくは１５個または２０個のアミノ酸（好ましくはグリシンおよび／またはセリン）からなるペプチドリンカーを介してつながれ、好ましくは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）３を含むペプチドリンカーを介してつながれる。１つの実施形態において、前記ＶＨ（ＣＤ３）およびＶＬ（ＣＤ３）は、１５個〜２０個、好ましくは１５個または２０個のアミノ酸（好ましくはグリシンおよび／またはセリン）からなるペプチドリンカーを介してつながれ、好ましくは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（ＧＧＳ）３ＧＧＧＳを含むペプチドリンカーを介してつながれる。１つの実施形態において、前記２つのＶＨ−ＶＬ型ｓｃＦｖユニットは、アミノ酸配列ＳＧＧＧＧＳを含むリンカーペプチドを介してつながれる。

【0028】

上記局面の１つの実施形態において、前記ＣＬＤＮはＣＬＤＮ６である。好ましくは、前記ＶＨ（ＣＬＤＮ）は、配列番号２２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含む。好ましくは、前記ＶＬ（ＣＬＤＮ）は、配列番号９８、配列番号９９または配列番号１００によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含む。最も好ましくは、前記ＶＬ（ＣＬＤＮ）は、配列番号９９によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含む。 １つの実施形態において、前記ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号９５によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含み、かつ、前記ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号９６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含む。

【0029】

１つの実施形態において、前記ＣＬＤＮはＣＬＤＮ１８．２であり、かつ、本発明の前記結合剤は、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいはそのフラグメントまたは変化体を含む。

【0030】

１つの実施形態において、前記ＣＬＤＮはＣＬＤＮ１８．２であり、かつ、本発明の前記結合剤は、配列番号１０３、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２および配列番号９３からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいはそのフラグメントまたは変化体を含む。１つの実施形態において、前記ＣＬＤＮはＣＬＤＮ１８．２であり、かつ、前記結合剤は、配列番号１０３、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２および配列番号９３からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいはそのフラグメントまたは変化体を含み、ただし、前記アミノ酸配列は、分泌シグナル、例えば、Ｎ末端の分泌シグナルなど、具体的には、分泌シグナルが存在するならば、配列番号５１による配列を欠いており、かつ／または、Ｈｉｓタグ、例えば、Ｃ末端のＨｉｓタグなど、具体的には、Ｈｉｓタグが存在するならば、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｈｉｓ）_６または配列（Ｈｉｓ）_６を欠いている。

【0031】

１つの実施形態において、前記ＣＬＤＮはＣＬＤＮ６であり、かつ、本発明の前記結合剤は、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいはそのフラグメントまたは変化体を含む。

【0032】

１つの実施形態において、前記ＣＬＤＮはＣＬＤＮ６であり、かつ、本発明の前記結合剤は、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４および配列番号６５からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいはそのフラグメントまたは変化体を含む。１つの実施形態において、前記ＣＬＤＮはＣＬＤＮ６であり、かつ、前記結合剤は、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４および配列番号６５からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいはそのフラグメントまたは変化体を含み、ただし、前記アミノ酸配列は、分泌シグナル、例えば、Ｎ末端の分泌シグナルなど、具体的には、分泌シグナルが存在するならば、配列番号５１による配列を欠いており、かつ／または、Ｈｉｓタグ、例えば、Ｃ末端のＨｉｓタグなど、具体的には、Ｈｉｓタグが存在するならば、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｈｉｓ）_６または配列（Ｈｉｓ）_６を欠いている。

【0033】

１つの実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２を発現する前記ガン細胞は、胃ガン、食道ガン、膵臓ガン、肺ガン（例えば、非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）など）、乳ガン、卵巣ガン、結腸ガン、肝ガン、頭頸部ガン、胆嚢のガン、ならびに、それらの転移物、クルケンベルグ腫瘍、腹膜転移物および／またはリンパ節転移物からなる群から選択されるガンのガン細胞である。

【0034】

１つの実施形態において、ＣＬＤＮ６を発現する前記ガン細胞は、膀胱ガン、卵巣ガン（特に、卵巣腺ガンおよび卵巣奇形ガン）、肺ガン（小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）を含むが、特に、扁平上皮肺ガンおよび扁平上皮肺腺ガン）、胃ガン、乳ガン、肝ガン、膵臓ガン、皮膚ガン（特に、基底細胞ガンおよび扁平上皮ガン）、悪性メラノーマ、頭頸部ガン（特に、悪性多形性腺腫）、肉腫（特に、滑膜肉腫および滑膜ガン肉腫）、胆管ガン、膀胱のガン（特に、移行上皮ガンおよび移行上皮乳頭状ガン）、腎臓ガン（特に、腎明細胞ガンおよび乳頭状腎細胞ガンを含む腎細胞ガン）、結腸ガン、小腸ガン（回腸のガン、特に、小腸腺ガンおよび回腸の腺ガンを含む）、精巣胎児性ガン、胎盤性絨毛ガン、子宮頸ガン、精巣ガン（特に、精巣セミノーマ、精巣奇形腫および胎芽性精巣ガン）、子宮ガン、胚細胞腫瘍（例えば、奇形ガンまたは胚性ガン腫など、特に、精巣の胚細胞腫瘍）、および、それらの転移形態物からなる群から選択されるガンのガン細胞である。

【0035】

１つの実施形態において、前記結合剤は、Ｎ末端の分泌シグナルおよび／またはＣ末端のヒスチジンエピトープタグ（好ましくはヒシジン（ｈｉｓｉｄｉｎ）が６個のエピトープタグ）を有する。

【0036】

１つの局面において、本発明は、本発明の結合剤をコードする組換え核酸に関連する。１つの実施形態において、組換え核酸はベクターの形態である。１つの実施形態において、組換え核酸はＲＮＡである。

【0037】

１つの局面において、本発明は、本発明の組換え核酸を含む宿主細胞に関連する。

【0038】

１つの局面において、本発明は、治療において使用されるための、特に、ガンを処置することまたは防止することにおいて使用されるための本発明の結合剤、本発明の組換え核酸または本発明の宿主細胞に関連する。

【0039】

１つの局面において、本発明は、本発明の結合剤、本発明の組換え核酸または本発明の宿主細胞を含む医薬組成物に関連する。

【0040】

１つの局面において、本発明は、本発明の医薬組成物を患者に投与することを含む、ガン疾患を処置するか、または防止する方法に関連する。

【0041】

１つの実施形態において、前記ガンの細胞は、前記結合剤が結合することができるクローディンを発現する。

【0042】

１つの実施形態において、前記クローディンはＣＬＤＮ１８．２であり、かつ、前記ガンは、胃ガン、食道ガン、膵臓ガン、肺ガン（例えば、非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）など）、乳ガン、卵巣ガン、結腸ガン、肝ガン、頭頸部ガン、胆嚢のガン、ならびに、それらの転移物、クルケンベルグ腫瘍、腹膜転移物および／またはリンパ節転移物からなる群から選択される。

【0043】

１つの実施形態において、前記クローディンはＣＬＤＮ６であり、かつ、前記ガンは、膀胱ガン、卵巣ガン（特に、卵巣腺ガンおよび卵巣奇形ガン）、肺ガン（小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）を含むが、特に、扁平上皮肺ガンおよび扁平上皮肺腺ガン）、胃ガン、乳ガン、肝ガン、膵臓ガン、皮膚ガン（特に、基底細胞ガンおよび扁平上皮ガン）、悪性メラノーマ、頭頸部ガン（特に、悪性多形性腺腫）、肉腫（特に、滑膜肉腫および滑膜ガン肉腫）、胆管ガン、膀胱のガン（特に、移行上皮ガンおよび移行上皮乳頭状ガン）、腎臓ガン（特に、腎明細胞ガンおよび乳頭状腎細胞ガンを含む腎細胞ガン）、結腸ガン、小腸ガン（回腸のガン、特に、小腸腺ガンおよび回腸の腺ガンを含む）、精巣胎児性ガン、胎盤性絨毛ガン、子宮頸ガン、精巣ガン（特に、精巣セミノーマ、精巣奇形腫および胎芽性精巣ガン）、子宮ガン、胚細胞腫瘍（例えば、奇形ガンまたは胚性ガン腫など、特に、精巣の胚細胞腫瘍）、および、それらの転移形態物からなる群から選択される。

【0044】

１つの態様において、本発明は、本明細書中に記載される処置方法において使用されるための本明細書中に記載されるような結合剤、または、該結合剤をコードする本明細書中に記載されるような核酸、または、本明細書中に記載されるような宿主細胞を提供する。１つの実施形態において、本発明は、本明細書中に記載される処置方法において使用されるための本明細書中に記載されるような医薬組成物を提供する。

【0045】

本発明によれば、ＣＬＤＮ１８．２は好ましくは、配列番号１によるアミノ酸配列を有し、ＣＬＤＮ６は好ましくは、配列番号２または配列番号３によるアミノ酸配列を有する。

【0046】

本発明の他の特徴および利点が下記の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【0047】

【図1】ＴＡＡ ＣＬＤＮ１８．２を標的化する組換えｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の設計を例示するモジュール配置図。 抗ＴＡＡ可変領域に関する（Ａ）Ｎ末端位置および（Ｂ）Ｃ末端位置におけるｂｉ−ｓｃＦｖの設計。抗ＣＬＤＮ１８．２のＶＨ領域およびＶＬ領域が、モノクローナルなＣＬＤＮ１８．２抗体（ｍＣＬＤＮ１８．２ａｂ）の配列から作製される。抗ＣＤ３は、下記のモノクローナルなＣＤ３抗体の配列から作製されるＶＨ領域およびＶＬ領域を包括的に表す：ＵＣＨＴ１−ＨＵ（ヒト化ｍＡＢ）、ＵＣＨＴ１、ＣＬＢ−Ｔ３、ＴＲ６６、１４５−２Ｃ１１。Ｂｉ−ｓｃＦｖは二重特異性の単鎖可変フラグメントを示す；Ｈｉｓはヘキサヒスチジルタグを示す；ＨＵは、ヒト化されたことを示す；ＬＬは、長いリンカー（１５個〜１８個のアミノ酸）を示す；Ｓｅｃは分泌シグナルを示す；ＳＬは、短いリンカー（５個〜６個のアミノ酸）を示す；ＴＡＡは腫瘍関連抗原を示す；Ｖは抗体の重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖の可変領域を示す。

【図2】特異的な標的細胞溶解に対するドメイン配向および抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ選抜の影響：５'−ｍＣＬＤＮ１８．２ａｂＶＨ−ＶＬ＿ＴＲ６６ＶＨ−ＶＬ−３'型ｂｉ−ｓｃＦｖの１ＢｉＭＡＢおよびｎｏ．１５が最も強力な変化体である。 ＣＬＤＮ１８．２およびＣＤ３に対して向けられるいくつかのｂｉ−ｓｃＦｖ変化体を、それらの効力を細胞傷害性アッセイにおいて比較するためにＨＥＫ２９３Ｔ細胞において一過性に発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いて小規模精製した。ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮｕｇＣ４細胞で、ルシフェラーゼを安定的に発現するＮｕｇＣ４細胞を標的細胞として選んだ。ヒトＴ細胞および標的細胞を９６ウエル形式において５ｎｇ／ｍｌのそれぞれのｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質とともに５：１のＥ：Ｔ比でインキュベーションした。陰性コントロールとして、発現されないＴＡＡを標的化するｎｏ．３５、ならびに、ｎｏ．１１およびｎｏ．１６（これらはともに、ヒトＴ細胞ではなく、マウスＴ細胞を標的化する）を選んだ。それぞれ試験サンプルを六連で置床し、Ｌ_ｍｉｎのためのコントロールサンプルを九連で置床した。分析前の共インキュベーション時間が、８時間、１６時間および２４時間であった。ルシフェリン溶液を所与の時点で加えた後、発光を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＴＥＣＡＮリーダーで測定した。特異的な標的細胞溶解を、コントロールｂｉ−ｓｃＦｖのｎｏ．３５（Ｌ_ｍｉｎ）を用いたサンプルに対する正規化によって計算した。最も強力なｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質、すなわち、１ＢｉＭＡＢおよびｎｏ．１５は、ドメイン配向およびｍＡＢ ＴＲ６６の抗ＣＤ３起源がともに同じであり、しかし、それらのコドン最適化（ＨＳおよびＣＨＯ、それぞれ）および長いリンカー配列において異なる。ＣＨＯはチャイニーズハムスター卵巣を示す；ｍＡＢはモノクローナル抗体を示す；ＨＵは、ヒト化されたことを示す；ＴＡＡは腫瘍関連抗原を示す。

【図3】ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢのクーマシーゲルおよびウエスタンブロット分析。 １ＢｉＭＡＢを安定的に発現するモノクローナルなＨＥＫ２９３細胞のＦＣＳ非含有上清をＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製した。種々の精製段階のアリコートを４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルに負荷した。（Ａ）細胞上清、溶出液の素通り画分および８個の分画物のクーマシー染色。最初に溶出されたピークの分画物を捨て、２番目に溶出されたピークの分画物をさらなる研究のためにプールし、ＰＢＳに対して透析し、続いて、２００ｍＭアルギニン緩衝液に対して透析した。（レーン１：ＨＥＫ２９３／１ＢｉＭＡＢ ＳＮ；レーン２：ＩＭＡＣ素通り画分；レーン３〜レーン４：溶出ピーク１の分画物（これらは捨てられた）；レーン５〜レーン１０：溶出ピーク２の分画物（これらはプールされた））（Ｂ）３回の独立した精製から得られる０．５μｇの１ＢｉＭＡＢのウエスタンブロット分析（レーン１、レーン２、レーン３）。検出を一次のモノクローナル抗Ｈｉｓ抗体および二次のペルオキシダーゼコンジュゲート化抗マウス抗体により行った。ＩＭＡＣは固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを示す；ＰＢＳはリン酸塩緩衝化生理的食塩水を示す；ＳＮは上清を示す；ＷＢはウエスタンブロットを示す。

【図4A】ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢはＣＬＤＮ１８．２発現標的細胞およびヒトＴ細胞に効率的かつ特異的に結合する。

【図4B】ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢはＣＬＤＮ１８．２発現標的細胞およびヒトＴ細胞に効率的かつ特異的に結合する。

【図4C】ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢはＣＬＤＮ１８．２発現標的細胞およびヒトＴ細胞に効率的かつ特異的に結合する。

【図4D】ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢはＣＬＤＮ１８．２発現標的細胞およびヒトＴ細胞に効率的かつ特異的に結合する。 （Ａ）ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する２．５×１０^５個のＮｕｇＣ４細胞を、５０μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢ、または、陽性コントロールとしての１０μｇ／ｍｌのｍＣＬＤＮ１８．２ａｂ、および、それらの対応するＡＰＣコンジュゲート化二次抗体とインキュベーションした。コントロール染色には、単独での二次のＡＰＣコンジュゲート化抗体（ｇ−ａ−ｈ、ｇ−ａ−ｍ）、抗Ｈｉｓおよびｇ−ａ−ｍ ＡＰＣ、または、１ＢｉＭＡＢおよびｇ−ａ−ｍ ＡＰＣが含まれた。分析をフローサイトメトリーにより行った。ＡＰＣシグナルのＭＦＩをＦｌｏｗＪｏソフトウエアによって計算した。（Ｂ）ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する１×１０^５個のＮｕｇＣ４細胞を、増大する１ＢｉＭＡＢ濃度（２０ｐｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ）、抗Ｈｉｓおよびｇ−ａ−ｍ ＡＰＣにより染色した。陰性コントロールとして、細胞を抗Ｈｉｓおよびｇ−ａ−ｍ ＡＰＣとインキュベーションした。陽性コントロールとして、ｍＣＬＤＮ１８．２ａｂおよびｇ−ａ−ｈ ＡＰＣを使用した。ＡＰＣシグナルのＭＦＩをＦｌｏｗＪｏソフトウエアによって計算した。（Ｃ）１×１０^６個のヒトＴ細胞を、増大する１ＢｉＭＡＢ濃度（２ｎｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌ）、抗Ｈｉｓおよびｇ−ａ−ｍ ＡＰＣとインキュベーションした。陰性コントロールとして、細胞を、抗Ｈｉｓおよびｇ−ａ−ｍ ＡＰＣ、または、単独でのｇ−ａ−ｍ ＡＰＣとインキュベーションした。ＡＰＣシグナルのＭＦＩをＦｌｏｗＪｏソフトウエアによって計算した。（Ｄ）１×１０^５個のＣＬＤＮ１８．２陰性ＰＡ−１細胞を、増大する１ＢｉＭＡＢ濃度（１０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）、抗Ｈｉｓおよびｇ−ａ−ｍ ＡＰＣとインキュベーションした。陰性コントロールとして、細胞を、抗Ｈｉｓおよびｇ−ａ−ｍ ＡＰＣ、または、単独でのｇ−ａ−ｈ ＡＰＣにより染色した。１０μｇ／ｍｌのｍＣＬＤＮ１８．２ａｂおよびｇ−ａ−ｈ ＡＰＣを使用して、細胞のＣＬＤＮ１８．２陰性を確認した。 ｇ−ａ−ｈはヤギ抗ヒトを示す；ｇ−ａ−ｍはヤギ抗マウスを示す；ＭＦＩは平均蛍光強度を示す；ＴＬはＴリンパ球を示す。

【図5】ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢはＴ細胞のクラスター化をＣＬＤＮ１８．２陽性標的細胞の表面で引き起こす。ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮｕｇＣ４細胞を６ウエルプレートにおいて、１ｎｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢ、ならびに、５：１のエフェクター対標的比でのヒトＴ細胞と２４時間インキュベーションした。単独でのＴ細胞（ＴＬ）、単独での標的細胞（ＮｕｇＣ４）、および、標的細胞を伴うヒトＴ細胞（−ｃｔｒｌ）をコントロールサンプルとして選んだ。２４時間後、サンプルを、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ顕微鏡で２００×の倍率により写真撮影した。白の矢印は標的細胞上のＴ細胞のクラスターを示す。ＴＬはＴリンパ球を示す。

【図6】１ＢｉＭＡＢはＴ細胞活性化を用量依存的様式で媒介する。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮｕｇＣ４細胞を２４ウエル形式において二連で、増大する濃度のｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢ（０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ）および５：１のエフェクター対標的比でのヒトＴ細胞と２４時間および４８時間インキュベーションした。コントロールとして、ヒトＴ細胞を、１ＢｉＭＡＢによって媒介されるＴ細胞の標的依存的活性化を確認するためにＮｕｇＣ４標的細胞を伴うことなく１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢとインキュベーションした。２４時間後（Ａ）および４８時間後（Ｂ）、Ｔ細胞を集め、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ２５−ＰＥおよび抗ＣＤ６９−ＡＰＣにより標識し、フローサイトメトリーによって分析した。ＴＬはＴリンパ球を示す。

【図7】１ＢｉＭＡＢは、ＣＬＤＮ１８．２の高発現細胞株、低発現細胞株および非発現細胞株との長期間のインキュベーションの後でさえ、厳密に標的依存的なＴ細胞活性化を媒介する。 （Ａ）６つの腫瘍細胞株の総ＲＮＡからもたらされるＲＴ−ＰＣＲデータが示される。ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴに対して正規化されるＣＬＤＮ１８．２発現のＣｔ値が２つの独立した実験から計算されている。乳ガン細胞株ＭＣＦ７（灰色棒）を陰性のＣＬＤＮ１８．２発現コントロール細胞株として選んだ。（Ｂ）（Ａ）からのガン細胞株を６ウエル形式において二連で、５：１のエフェクター対標的比でのヒトＴ細胞を伴って、または伴うことなく、５ｎｇ／ｍｌのｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢと１４４時間インキュベーションした。Ｔ細胞を、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ２５−ＰＥおよび抗ＣＤ６９−ＡＰＣにより標識して、全Ｔ細胞集団（ＣＤ３）、Ｔ細胞の初期活性化（ＣＤ６９）および後期活性化（ＣＤ２５）をフローサイトメトリーによって分析した。ＴＬはＴリンパ球を示す。

【図8】１ＢｉＭＡＢはＴ細胞の増殖およびグランザイムＢのアップレギュレーションをＣＬＤＮ１８．２陽性標的細胞の存在下でのみ誘導する。 （Ａ）ヒトＴ細胞をＣＦＳＥ染色し、単独で（ＴＬ）、あるいは、１ｎｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢの存在下（ＴＬ＋１ｎｇ／ｍｌ １ＢｉＭＡＢ）、ＮｕｇＣ４細胞の存在下（ＴＬ＋ＮｕｇＣ４）、または、ＮｕｇＣ４細胞および１ｎｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢの存在下（ＴＬ＋１ｎｇ／ｍｌ １ＢｉＭＡＢ＋ＮｕｇＣ４）で１２０時間培養した。５：１のエフェクター対標的比を選択した。Ｔ細胞の増殖を示すＣＦＳＥシグナルの低下をフローサイトメトリーによって分析した。（Ｂ）ヒトＴ細胞を、ＮｕｇＣ４標的細胞を伴って、または伴うことなく、かつ、５ｎｇ／ｍｌのｂｉ−ｓｃＦｖ １ＢｉＭＡＢタンパク質を伴って、または伴うことなくインキュベーションした。エフェクター対標的比が６ウエル形式において５：１であった。９６時間の共インキュベーションの後、Ｔ細胞を集め、抗ＧｒＢ−ＰＥにより細胞内染色し、フローサイトメトリーによって分析した。抗ＧｒＢ−ＰＥシグナルのＭＦＩをＦｌｏｗＪｏソフトウエアによって計算した。非染色サンプル（ＴＬ＋ＮｕｇＣ４＋５ｎｇ／ｍｌ １ＢｉＭＡＢ）のシグナルをすべてのサンプルから差し引いた。ＣＦＳＥはカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルを示す；ＧｒＢはグランザイムＢを示す；ＭＦＩは平均蛍光強度を示す；ＰＥはフィコエリトリンを示す；ＴＬはＴリンパ球を示す。

【図9】４８時間後における特異的な標的細胞溶解についての１ＢｉＭＡＢのＥＣ_５０はおよそ１０ｐｇ／ｍｌである。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮｕｇＣ４細胞で、ルシフェラーゼを安定的に発現するＮｕｇＣ４細胞を９６ウエル形式において三連で、５：１のエフェクター対標的比でのヒトＴ細胞を伴って、増大する濃度（０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ）でのｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢと２４時間および４８時間インキュベーションした。最小溶解（Ｌ_ｍｉｎ）コントロールとして、エフェクター細胞および標的細胞を、ｂｉ−ｓｃＦｖ １ＢｉＭＡＢを伴うことなく置床した。自然発光カウント数に対して正規化するための最大溶解（Ｌ_ｍａｘ）を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をルシフェリン添加の直前に、エフェクター細胞および標的細胞をｂｉ−ｓｃＦｖの非存在下で含有するコントロールウエルに加えることによって達成した。ルシフェリン溶液を加えた後、発光を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダーで２４時間後および４８時間後に測定した。特異的な標的細胞溶解を下記の式によって計算した：％特異的溶解＝［１−（発光試験サンプル−Ｌ_ｍａｘ）／（Ｌ_ｍｉｎ−Ｌ_ｍａｘ）］×１００。値を１ＢｉＭＡＢ濃度のｌｏｇ１０に対してプロットした。ＥＣ_５０は５０％最大有効濃度を示す；Ｌは溶解を示す。

【図10A】１ＢｉＭＡＢはインビボ治療効力を進行ＳＣ腫瘍モデルにおいて示す。

【図10B】１ＢｉＭＡＢはインビボ治療効力を進行ＳＣ腫瘍モデルにおいて示す。

【図10C】１ＢｉＭＡＢはインビボ治療効力を進行ＳＣ腫瘍モデルにおいて示す。

【図10D】１ＢｉＭＡＢはインビボ治療効力を進行ＳＣ腫瘍モデルにおいて示す。 ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに、ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現する１×１０^７個のＨＥＫ２９３をＳＣ注入した。５日後、２×１０^７個のヒトＰＢＭＣエフェクター細胞をＧ３群およびＧ４群にＩＰ注入し、コントロール群（Ｇ１およびＧ２）はＰＢＳのみを受けた。動物あたり５μｇのｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢ、または、コントロールとしてのビヒクルの毎日のＩＰ適用を翌日から開始した。治療を２２日間にわたって施し、腫瘍体積を、カリパスを使用して測定し、下記の式によって計算した：ｍｍ^３＝長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×（幅（ｍｍ）／２）。（Ａ）マウス個々の腫瘍体積および群あたりのメジアンが、０日目および１５日目の処置日（上段列）、ならびに、処置終了後の３日および１３日（下段列）について示される。（Ｂ）ヒトエフェクター細胞が移植される２つの処置群の平均腫瘍体積が示される。ダッシュ記号は、屠殺された動物を示す。（Ｃ）すべての群を腫瘍接種日から４１日目まで示すカプラン・マイヤー生存曲線。動物を、腫瘍体積が５００ｍｍ^３を超えるとすぐに屠殺した。４１日目の後、すべての残存動物を、マウスの脾臓におけるヒトエフェクター細胞の生着を分析するために屠殺した。（Ｄ）すべてのマウスの脾細胞を単離し、ヒトＴ細胞をフローサイトメトリーによって検出するために抗ＣＤ４５−ＡＰＣおよび抗ＣＤ３−ＦＩＴＣにより染色した。メジアン生着がボックスプロット図で示される。Ｇは群を示す；ＩＰは腹腔内を示す；ＰＢＭＣは末梢血単核細胞を示す；ＰＢＳはリン酸塩緩衝化生理的食塩水を示す；ＳＣは皮下を示す。

【図11】ＴＡＡ ＣＬＤＮ６を標的化する組換えｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の設計を例示するモジュール配置図。 抗ＴＡＡ可変領域に関する（Ａ）Ｎ末端位置および（Ｂ）Ｃ末端位置におけるｂｉ−ｓｃＦｖの設計。抗ＣＬＤＮ６のＶＨ領域およびＶＬ領域が、モノクローナルなＣＬＤＮ６抗体（ｍＣＬＤＮ６ａｂ）の配列から作製される。抗ＣＤ３のＶＨ領域およびＶＬ領域が、モノクローナルなＣＤ３抗体ＴＲ６６の配列から作製される。Ｂｉ−ｓｃＦｖは二重特異性の単鎖可変フラグメントを示す；Ｈｉｓはヘキサヒスチジルタグを示す；ＬＬは、長いリンカー（１５個〜１８個のアミノ酸）を示す；Ｓｅｃは分泌シグナルを示す；ＳＬは、短いリンカー（５個のアミノ酸）を示す；ＴＡＡは腫瘍関連抗原を示す；Ｖは抗体の重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖の可変領域を示す。

【図12】ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の６ＰＨＵ５および６ＰＨＵ３はＴ細胞のクラスター化をＣＬＤＮ６陽性標的細胞の表面で引き起こす。 ＣＬＤＮ６を内因的に発現するＰＡ−１細胞を６ウエルプレートにおいて、５０ｎｇ／ｍｌの６ＰＨＵ５または６ＰＨＵ３、および、５：１のエフェクター対標的比でのヒトＴ細胞と２４時間インキュベーションした。単独でのＴ細胞（ＴＬ）、単独での標的細胞（ＰＡ−１）、および、標的細胞を伴うヒトＴ細胞（−ｃｔｒｌ）をコントロールサンプルとして選んだ。２４時間後、サンプルを、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ顕微鏡で２００×の倍率により写真撮影した。白の矢印は標的細胞上のＴ細胞のクラスターを示す。ＴＬはＴリンパ球を示す。

【図13】効力に対するドメイン配向の影響：ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３は、Ｔ細胞活性化を誘導することにおいて６ＰＨＵ５よりもわずかに効率的である。 ＣＬＤＮ６を内因的に発現するＰＡ−１細胞を６ウエル形式において二連で、増大する濃度（５ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ）の６ＰＨＵ５または６ＰＨＵ３および５：１のエフェクター対標的比でのヒトＴ細胞と４４時間インキュベーションした。コントロールとして、ヒトＴ細胞を、標的細胞を伴うことなく、１００ｎｇ／ｍｌおよび２００ｎｇ／ｍｌの６ＰＨＵ５または６ＰＨＵ３とインキュベーションした。４４時間後、Ｔ細胞を集め、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ２５−ＰＥおよび抗ＣＤ６９−ＡＰＣにより標識した。用量依存的なＴ細胞活性化をフローサイトメトリーによって分析した。Ｈｕはヒトを示す；ＴＬはＴリンパ球を示す。

【図14】６ＰＨＵ３タンパク質のクーマシーゲルおよびウエスタンブロット分析。 ６ＰＨＵ３を安定的に発現するポリクローナルなＨＥＫ２９３細胞のＦＣＳ非含有上清をＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製した。種々の精製段階のアリコートを４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルに負荷した。（Ａ）細胞上清、溶出液の素通り画分および９個の分画物のクーマシー染色。最初に溶出されたピークの分画物を捨て、２番目および３番目に溶出されたピークの分画物をさらなる研究のためにプールし、ＰＢＳに対して透析し、続いて、２００ｍＭアルギニン緩衝液に対して透析した。（レーン１：ＨＥＫ２９３／６ＰＨＵ３ ＳＮ；レーン２：ＩＭＡＣ素通り画分；レーン３〜レーン５：溶出ピーク１の分画物（これらは捨てられた）；レーン６〜レーン１１：溶出ピーク２および溶出ピーク３の分画物（これらはプールされた））（Ｂ）２回の独立した精製から得られる０．５μｇの６ＰＨＵ３のウエスタンブロット分析。検出を一次のモノクローナル抗Ｈｉｓ抗体および二次のペルオキシダーゼコンジュゲート化抗マウス抗体により行った。ＩＭＡＣは固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを示す；ＰＢＳはリン酸塩緩衝化生理的食塩水を示す；ＳＮは上清を示す；ＷＢはウエスタンブロットを示す。

【図15A1】ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３はＣＬＤＮ６発現標的細胞およびヒトＴ細胞に効率的かつ特異的に結合する。

【図15A2】ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３はＣＬＤＮ６発現標的細胞およびヒトＴ細胞に効率的かつ特異的に結合する。

【図15B】ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３はＣＬＤＮ６発現標的細胞およびヒトＴ細胞に効率的かつ特異的に結合する。

【図15C】ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３はＣＬＤＮ６発現標的細胞およびヒトＴ細胞に効率的かつ特異的に結合する。 （Ａ）ＣＬＤＮ６を内因的に発現する１×１０^５個のＰＡ−１細胞およびＯＶ−９０細胞を、増大する濃度の６ＰＨＵ３またはコントロールｂｉ−ｓｃＦｖの１ＢｉＭＡＢ（１０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）および１０μｇ／ｍｌのｍＣＬＤＮ６ａｂまたはコントロールｍＡＢのｍＣＬＤＮ１８．２ａｂと、それらの対応するＡＰＣコンジュゲート化二次抗体を伴ってインキュベーションした。コントロール染色は単独での二次のＡＰＣコンジュゲート化抗体（ｇ−ａ−ｈ、ｇ−ａ−ｍ）であった。分析をフローサイトメトリーにより行った。ＡＰＣシグナルのＭＦＩをＦｌｏｗＪｏソフトウエアによって計算した。（Ｂ）５×１０^５個のヒトＴ細胞を、増大する６ＰＨＵ３濃度（１００ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）、抗Ｈｉｓおよびｇ−ａ−ｍＰＥとインキュベーションした。陰性コントロールとして、細胞を、抗Ｈｉｓおよびｇ−ａ−ｍＰＥ、または、単独でのｇ−ａ−ｍＰＥとインキュベーションした。ＰＥシグナルのＭＦＩをＦｌｏｗＪｏソフトウエアによって計算した。（Ｃ）１×１０^５個のＣＬＤＮ６陰性ＮｕｇＣ４細胞を、増大する６ＰＨＵ３濃度および１ＢｉＭＡＢ濃度（１０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）、抗Ｈｉｓおよびｇ−ａ−ｍ ＡＰＣとインキュベーションした。陰性コントロールとして、細胞を単独でのｇ−ａ−ｍ ＡＰＣとインキュベーションした。１０μｇ／ｍｌのｍＣＬＤＮ６ａｂおよびｇ−ａ−ｈ ＡＰＣを使用して、細胞のＣＬＤＮ６陰性を確認した。陽性コントロールとして、ｍＣＬＤＮ１８．２ａｂおよびｇ−ａ−ｈ ＡＰＣを使用した。ＡＰＣシグナルのＭＦＩをＦｌｏｗＪｏソフトウエアによって計算した。ＡＰＣはアロフィコシアニンを示す；ｇ−ａ−ｈはヤギ抗ヒトを示す；ｇ−ａ−ｍはヤギ抗マウスを示す；ｍＡＢはモノクローナル抗体を示す；ＭＦＩは平均蛍光強度を示す；ＰＥはフィコエリトリンを示す；ＴＬはＴリンパ球を示す。

【図16】６ＰＨＵ３はＴ細胞活性化を用量依存的様式で媒介する。 ＣＬＤＮ６を内因的に発現するＰＡ−１細胞を２４ウエル形式において二連で、増大する濃度のｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３（０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ）および５：１のエフェクター対標的比でのヒトＴ細胞と２４時間および４８時間インキュベーションした。コントロールとして、ヒトＴ細胞を、６ＰＨＵ３によって媒介されるＴ細胞の標的依存的活性化を確認するためにＰＡ−１標的細胞を伴うことなく１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの６ＰＨＵ３とインキュベーションした。２４時間後（Ａ）および４８時間後（Ｂ）、Ｔ細胞を集め、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ２５−ＰＥおよび抗ＣＤ６９−ＡＰＣにより標識し、フローサイトメトリーによって分析した。ＴＬはＴリンパ球を示す。

【図17】４８時間後における特異的な標的細胞溶解についての６ＰＨＵ３のＥＣ_５０がおよそ１０ｐｇ／ｍｌである。 ルシフェラーゼを安定的に発現する、ＣＬＤＮ６を内因的に発現するＰＡ−１細胞を９６ウエル形式において三連で、５：１のエフェクター対標的比でのヒトＴ細胞を伴って、増大する濃度（０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ）での６ＰＨＵ３タンパク質と２４時間および４８時間インキュベーションした。最小溶解コントロール（Ｌ_ｍｉｎ）として、エフェクター細胞および標的細胞を、ｂｉ−ｓｃＦｖ ６ＰＨＵ３を伴うことなく置床した。自然発光カウント数に対して正規化するための最大溶解（Ｌ_ｍａｘ）を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をルシフェリン添加の直前に、エフェクター細胞および標的細胞をｂｉ−ｓｃＦｖの非存在下で含有するコントロールウエルに加えることによって達成した。ルシフェリン溶液を加えた後、発光を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダーで２４時間後および４８時間後に測定した。特異的な標的細胞溶解を下記の式によって計算した：％特異的溶解＝［１−（発光試験サンプル−Ｌ_ｍａｘ）／（Ｌ_ｍｉｎ−Ｌ_ｍａｘ）］×１００。値を６ＰＨＵ３濃度のｌｏｇ１０に対してプロットした。ＥＣ_５０は５０％最大有効濃度を示す；Ｌは溶解を示す。

【図18A】６ＰＨＵ３はインビボ治療効力を進行ＳＣ腫瘍モデルにおいて示す。

【図18B】６ＰＨＵ３はインビボ治療効力を進行ＳＣ腫瘍モデルにおいて示す。

【図18C】６ＰＨＵ３はインビボ治療効力を進行ＳＣ腫瘍モデルにおいて示す。

【図18D】６ＰＨＵ３はインビボ治療効力を進行ＳＣ腫瘍モデルにおいて示す。 ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄ^ｓｃｉｄＩＬ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに、ＣＬＤＮ６を内因的に発現する１×１０^７個のＰＡ−１をＳＣ注入した。１５日後、２×１０^７個のヒトＰＢＭＣをＧ３群およびＧ４群にＩＰ注入し、コントロール群（Ｇ１およびＧ２）はＰＢＳのみを受けた。動物あたり５μｇの６ＰＨＵ３、あるいは、コントロールとしてのコントロールｂｉ−ｓｃＦｖの１ＢｉＭＡＢまたは単独でのビヒクルの毎日のＩＰ適用をＰＢＭＣ注入の５日後から開始した。治療を２５日間にわたって施し、腫瘍体積を、カリパスを使用して測定し、下記の式によって計算した：ｍｍ^３＝長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×（幅（ｍｍ）／２）。（Ａ）マウス個々の腫瘍体積および群あたりのメジアンが、０日目および１４日目の処置日（上段）ならびに２１日目および２５日目の処置日（下段）について示される。（Ｂ）すべての処置群の平均腫瘍体積が示される。ダッシュ記号は、屠殺された動物を示す。（Ｃ）腫瘍接種日から４５日目までのすべての群のカプラン・マイヤー生存曲線が示される。動物を、腫瘍体積が１５００ｍｍ^３を超えたときに屠殺した。４５日目の後、すべての残存動物を、マウスに脾臓におけるヒトエフェクター細胞の生着を分析するために屠殺した。（Ｄ）すべてのマウスの脾細胞を単離し、ヒトＴ細胞をフローサイトメトリーによって検出するために抗ＣＤ４５−ＡＰＣおよび抗ＣＤ３−ＦＩＴＣにより染色した。メジアン生着がボックスプロット図で示される。ＩＰは腹腔内を示す；ＰＢＭＣは末梢血単核細胞を示す；ＰＢＳはリン酸塩緩衝化生理的食塩水を示す；ＳＣは皮下を示す。

【図19AB】６ＰＨＵ３処置に対する応答における、ＳＣ ＰＡ−１腫瘍の中への高まったＴ細胞浸潤。

【図19CD】６ＰＨＵ３処置に対する応答における、ＳＣ ＰＡ−１腫瘍の中への高まったＴ細胞浸潤。

【図19E】６ＰＨＵ３処置に対する応答における、ＳＣ ＰＡ−１腫瘍の中への高まったＴ細胞浸潤。 ＮＳＧマウスに、ＣＬＤＮ６を内因的に発現する１×１０^７個のＰＡ−１をＳＣ注入した。１５日後、２×１０^７個のヒトＰＢＭＣをＧ３群およびＧ４群にＩＰ注入し、コントロール群（Ｇ１およびＧ２）はＰＢＳのみを受けた。動物あたり５μｇの６ＰＨＵ３、あるいは、コントロールとしてのコントロールｂｉ−ｓｃＦｖの１ＢｉＭＡＢまたは単独でのビヒクルの毎日のＩＰ適用をＰＢＭＣ注入の５日後から開始した。腫瘍を、サイズが１５００ｍｍ^３となったときまたは実験が終了したときに解剖し、パラフィン包埋化のために４％の緩衝化ホルムアルデヒド溶液において保存した。 ＳＣ ＰＡ−１腫瘍のパラフィン包埋された腫瘍組織を免疫組織化学的染色に供した。連続切片をポリクローナル一次抗体の抗クローディン６または抗ヒトＣＤ３のどちらかにより染色した。一次抗体を、二次のＨＲＰコンジュゲート化抗ウサギ抗体を使用して検出した。Ａ〜Ｅの上段列はＣＬＤＮ６染色を示し、下段列はＣＤ３染色を示す。画像を、Ｍｉｒａｘスキャナーを用いて取り込んだ。（Ａ）および（Ｂ）は、ヒトエフェクター細胞を全く受けず、かつ、ビヒクルまたはｂｉ−ｓｃＦｖ ６ＰＨＵ３を受けたＰＢＳコントロール群のＧ１およびＧ２をそれぞれ示す。（Ｃ）は、ヒトエフェクター細胞およびビヒクルを処置として受けたコントロール群Ｇ３を示す。（Ｄ）は、ヒトエフェクター細胞およびｂｉ−ｓｃＦｖ ６ＰＨＵ３を処置として受けた群Ｇ４を示す。（Ｅ）は、ヒトエフェクター細胞およびコントロールｂｉ−ｓｃＦｖ １ＢｉＭＡＢを受けたコントロール群Ｇ５を示す。陽性シグナルが赤色の染色として現れる。黒の矢印はＣＤ３シグナルの実例を示す。ＩＰは腹腔内を示す；ＰＢＭＣは末梢血単核細胞を示す；ＰＢＳはリン酸塩緩衝化生理的食塩水を示す；ＳＣは皮下を示す。

【図20】ＴＡＡ ＣＬＤＮ１８．２を標的化するｂｉ−ｓｃＦｖ抗体をコードするＩＶＴ−ＲＮＡ分子の概略的例示。 抗ＣＬＤＮ１８．２ｂｉ−ｓｃＦｖ抗体をコードするインビトロ転写されたＲＮＡ配列の略図。（Ａ）抗ＴＡＡ可変領域に関する５'側位置および３'側位置におけるＩＶＴ−ｍＲＮＡ。（Ｂ）抗ＴＡＡ可変領域に関する５'側位置におけるＩＶＴアルファウイルスレプリコン。抗ＣＬＤＮ１８．２のＶＨ領域およびＶＬ領域をモノクローナルなＣＬＤＮ１８．２抗体（ｍＣＬＤＮ１８．２ａｂ）の配列から作製した。"Ｃａｐ"が、ＡＲＣＡ、ベータ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）またはベータ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）に代わって一律に使用される。（Ａ）において、"ａｎｔｉ−ＣＤ３"は、下記のモノクローナルなＣＤ３抗体の配列から作製されるＶＨ領域およびＶＬ領域を包括的に表す：ＵＣＨＴ１−ＨＵ（ヒト化ｍＡＢ）、ＵＣＨＴ１、ＣＬＢ−Ｔ３、ＴＲ６６、１４５−２Ｃ１１。（Ｂ）において、"ａｎｔｉ−ＣＤ３"は、ＴＲ６６に由来するＶＨおよびＶＬのみを表す。Ａはアデニンを示す；ｂｉ−ｓｃＦｖは二重特異性の単鎖可変フラグメントを示す；ｈＡｇはヒトアルファグロビンの５'−ＵＴＲを示す；ｈＢｇはヒトベータグロビンの３'−ＵＴＲを示す；Ｈｉｓはヘキサヒスチジルタグを示す；ＩＶＴは、インビトロ転写されたことを示す；ＬＬは、長いリンカー（１５個〜１８個のアミノ酸）を示す；ｎｓＰ１〜４は非構造タンパク質１〜４を示す；Ｓｅｃは分泌シグナルを示す；ｓｇＰはサブゲノムプロモーターを示す；ＳＬは、短いリンカー（５個〜６個のアミノ酸）を示す；ＴＡＡは腫瘍関連抗原を示す；ＵＴＲは非翻訳領域を示す；Ｖは抗体の重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖の可変領域を示す。

【図21】標的依存的なＴ細胞活性化および特異的な標的細胞溶解に対するドメイン配向および抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ選抜の影響。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮｕｇＣ４細胞を、それらの効力を細胞傷害性アッセイにおいて比較するために、ＣＬＤＮ１８．２およびＣＤ３に対して向けられるいくつかのｂｉ−ｓｃＦｖ変化体により一過性にトランスフェクションした。変化体につき、５×１０^６個のＮｕｇＣ４細胞を２０μｇ／ｍｌのＩＶＴ−ｍＲＮＡによりエレクトロポレーションした。トランスフェクションされた標的細胞を計数し、１×１０^５個の細胞を６ウエルプレートあたり播種し、５：１のＥ：Ｔ比でヒト細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８^＋の選択されたＴ細胞）とインキュベーションした。陰性コントロールとして、発現されないＴＡＡを標的化するｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−ｍＲＮＡ（ｃｔｒｌ）と、ＣＬＤＮ１８．２を標的化し、しかし、Ｔ細胞を標的化しない元のＩｇＧ ｍＡＢのｃｈＣＬＤＮ１８．２ａｂ（ｃｔｒｌ ＩｇＧ）とを選んだ。１ＢｉＭＡＢタンパク質が５ｎｇ／ｍｌの濃度で陽性コントロールとして役立った。バックグラウンドでの死細胞の参照として、エレクトロポレーションされた標的細胞を、Ｔ細胞を伴うことなく播種し、また、バックグラウンドでの活性化の参照として、Ｔ細胞を、標的細胞を伴うことなく播種した。それぞれのサンプルを二連で播種した。４８時間後、Ｔ細胞および標的細胞を集め、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ２５−ＰＥ、抗ＣＤ６９−ＡＰＣおよび生死染色のための７−ＡＡＤにより標識し、フローサイトメトリーによって分析した。（Ａ）ＴＡＡ依存的なｂｉ−ｓｃＦｖ媒介のＴ細胞活性化がすべての抗ＣＬＤＮ１８．２ｂｉ−ｓｃＦｖ変化体により認められた。（Ｂ）特異的な標的細胞溶解を、７−ＡＡＤ参照集団を７−ＡＡＤサンプル標的細胞集団から差し引くことによって求めた。わずかなより大きい標的細胞溶解を引き起こすｂｉ−ｓｃＦｖ抗体、すなわち、１ＢｉＭＡＢおよびｎｏ．５は、ドメイン配向およびｍＡＢ ＴＲ６６の抗ＣＤ３起源がともに同じであり、しかし、それらのコドン最適化（ＨＳおよびＣＨＯ、それぞれ）および長いリンカー配列において異なる。ｂｉ−ｓｃＦｖは二重特異性単鎖可変フラグメントを示す；ｃｔｒｌはコントロールを示す；ＩｇＧは免疫グロブリンＧを示す；ＩＶＴは、インビトロ転写されたことを示す；ｍＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡを示す；ＴＬはＴリンパ球を示す。

【図22】１ＢｉＭＡＢのＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされる標的細胞とヒトＴ細胞との共インキュベーションはＴ細胞のクラスター化を引き起こす。ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮｕｇＣ４細胞を、８０μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡによりエレクトロポレーションによって一過性にトランスフェクションし、９６ウエルプレートにおいて５：１のエフェクター対標的比でのヒト細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８^＋の選択されたＴ細胞）と共インキュベーションした。陰性コントロールサンプルとして、発現されないＴＡＡを標的化するｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされたＮｕｇＣ４標的細胞（−ｃｔｒｌ）で、ヒト細胞傷害性Ｔ細胞と共インキュベーションされるものを使用した（上段列、左側）。下段列は、コントロールｂｉ−ｓｃＦｖのＩＶＴ−ｍＲＮＡ（左側）または１ＢｉＭＡＢのＩＶＴ−ｍＲＮＡ（右側）によりトランスフェクションされたＮｕｇＣ４細胞で、ヒトＴ細胞を伴わないものを示す。２４時間の共インキュベーションの後、サンプルを、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ顕微鏡により２００×の倍率で写真撮影した。白の矢印は標的細胞上のＴ細胞のクラスターを示す。ＣＴＬは細胞傷害性Ｔリンパ球を示す；ｃｔｒｌはコントロールを示す；ｈｕはヒトを示す。

【図23】ＩＶＴ−ｍＲＮＡによるトランスフェクションの後の標的細胞によって分泌される１ＢｉＭＡＢはＴ細胞の活性化を濃度依存的様式で媒介する。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮｕｇＣ４細胞を、０．４μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡおよび適量のルシフェラーゼＩＶＴ−ｍＲＮＡを含有する合計で４０μｇ／ｍｌのＩＶＴ−ｍＲＮＡによりエレクトロポレーションによって一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションされた標的細胞を６ウエルプレートにおいて二連で、５：１のエフェクター対標的比でのヒト細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８^＋の選択されたＴ細胞）と共インキュベーションした。Ｔ細胞活性化の参照として、ヒトＴ細胞を、４０μｇ／ｍｌのルシフェラーゼＩＶＴ−ｍＲＮＡ（０．０μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡ）によりトランスフェクションされるＮｕｇＣ４標的細胞と共インキュベーションした。２４時間後（Ａ）および４８時間後（Ｂ）、Ｔ細胞を集め、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ２５−ＰＥおよび抗ＣＤ６９−ＡＰＣにより標識し、フローサイトメトリーによって分析した。グラフは、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアを用いて求められる場合の陽性染色された細胞傷害性ヒトＴ細胞の百分率を明らかにする。ＩＶＴは、インビトロ転写されたことを示す；ｍＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡを示す；ＴＬはＴリンパ球を示す。

【図24】ＩＶＴ−ｍＲＮＡによるトランスフェクションの後の標的細胞によって分泌される１ＢｉＭＡＢは濃度依存的な標的細胞溶解を引き起こす。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮｕｇＣ４細胞を、０．４μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡおよび適量のルシフェラーゼＩＶＴ−ｍＲＮＡを含有する合計で４０μｇ／ｍｌのＩＶＴ−ｍＲＮＡにより、または、参照サンプルとしての４０μｇ／ｍｌのルシフェラーゼＩＶＴ−ｍＲＮＡのみによりエレクトロポレーションによって一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションされた標的細胞を５：１のエフェクター対標的比でのヒト細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８^＋の選択されたＴ細胞）とともに播種し、または、それぞれの個々のエレクトロポレーションによるバックグラウンドでの死んでいる標的細胞の百分率を求めるためにエフェクター細胞を伴うことなく播種した。すべてのサンプルを６ウエルプレートにおいて二連で培養した。２４時間後（Ａ）および４８時間後（Ｂ）、Ｔ細胞を集め、生死染色のためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により標識し、フローサイトメトリーによって分析した。死んでいる（ＰＩ^＋）標的細胞の百分率をＦｌｏｗＪｏソフトウエアにより求めた。値をさらに、それぞれの個々のバックグラウンドサンプルに対して、かつ、参照サンプルに対して正規化した。ＩＶＴは、インビトロ転写されたことを示す；ｍＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡを示す；ＴＬはＴリンパ球を示す。

【図25】Ｔ細胞の増殖がＣＬＤＮ１８．２の存在下において標的細胞による１ＢｉＭＡＢ分泌に応答して特異的に誘導される。 ヒトＴ細胞をアッセイのためにＣＦＳＥ染色した。Ｔ細胞を、標的細胞を伴うことなく（Ｔ細胞）、陽性の活性化コントロールとしての５μｇ／ｍｌのＯＫＴ３および２μｇ／ｍｌのαＣＤ２８との組合せで（＋ｃｔｒｌ）、または、５ｎｇ／ｍｌの標的化しないコントロールｂｉ−ｓｃＦｖとともに（−ｃｔｒｌタンパク質）、または、５ｎｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢタンパク質（１ＢｉＭＡＢタンパク質）とともに培養した。Ｔ細胞と、ＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＮｕｇＣ４標的細胞とを一緒に（Ｔ細胞＋ＣＬＤＮ１８．２陽性標的細胞）、何も伴うことなく（模擬）、または、５ｎｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢタンパク質（１ＢｉＭＡＢタンパク質）とインキュベーションした。ＩＶＴ−ｍＲＮＡを試験するために、ＮｕｇＣ４細胞を、２０μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡ（１ＢｉＭＡＢ ｍＲＮＡ）、または、発現されないＴＡＡを標的化するｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−ｍＲＮＡ（−ｃｔｒｌ ｍＲＮＡ）によりトランスフェクションし、Ｔ細胞とインキュベーションした。加えて、発現されないＴＡＡを標的化するｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされるＮｕｇＣ４細胞を、５ｎｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢタンパク質と組み合わせた（−ｃｔｒｌ ｍＲＮＡ＋１ＢｉＭＡＢタンパク質）。さらなる特異性コントロールとして、ＣＬＤＮ１８．２を発現しない標的細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１をＴ細胞と一緒に伴うサンプルを含めた（Ｔ細胞＋ＣＬＤＮ１８．２陰性標的細胞）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を処理しないで使用し、何も伴うことなく（模擬）、または、５ｎｇ／ｍｌのコントロールｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質（−ｃｔｒｌタンパク質）または５ｎｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢタンパク質（１ＢｉＭＡＢタンパク質）とインキュベーションしたか、あるいは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、２０μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡ（１ＢｉＭＡＢ ｍＲＮＡ）、または、発現されないＴＡＡを標的化するｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−ｍＲＮＡ（−ｃｔｒｌ ｍＲＮＡ）によりトランスフェクションした。アッセイを９６ウエルにおいて５：１のエフェクター対標的比で行い、それぞれのサンプルが三連であり、インキュベーション時間が７２時間であった。Ｔ細胞の増殖を示すＣＦＳＥシグナルの低下をフローサイトメトリーによって分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアによって計算し、％増殖性Ｔ細胞としてプロットした。ＣＦＳＥはカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルを示す；ＩＶＴは、インビトロ転写されたことを示す；ｍＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡを示す。

【図26】１ＢｉＭＡＢ分泌に対する応答におけるＴ細胞の活性化およびＴ細胞媒介の標的細胞溶解が０．３：１のエフェクター対標的比により始まる。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮｕｇＣ４細胞を、４０μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡによりエレクトロポレーションによって一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションされた標的細胞を６ウエルプレートにおいて二連で、０．３：１から１０：１までの示されたエフェクター対標的比でのヒト細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８^＋の選択されたＴ細胞）と共インキュベーションした。参照として、ヒトＴ細胞を標的細胞の非存在下で培養し（（Ａ）、１：０）、また、コントロールＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされる標的細胞をエフェクター細胞の非存在下で培養した（（Ｂ）、０：１）。陰性コントロールとして、ヒトＴ細胞を、４０μｇ／ｍｌのルシフェラーゼＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされるＮｕｇＣ４標的細胞（ｃｔｒｌ ＩＶＴ−ｍＲＮＡ）と、１０：１のＥ：Ｔ比で共インキュベーションした（（Ａ）および（Ｂ） ｃｔｒｌ ＩＶＴ−ｍＲＮＡ、１０：１）。４８時間後、細胞を集め、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ２５−ＰＥ、抗ＣＤ６９−ＡＰＣおよび生死染色のためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により標識し、フローサイトメトリーによって分析した。（Ａ）は、陽性染色された細胞傷害性ヒトＴ細胞の百分率を示す。（Ｂ）は、死んでいる（ＰＩ^＋）標的細胞の百分率を明らかにする。すべての値をＦｌｏｗＪｏソフトウエアにより求めた。Ｅ：Ｔはエフェクター対標的を示す；ＩＶＴは、インビトロ転写されたことを示す；ｍＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡを示す；ＴＬはＴリンパ球を示す。

【図27】ヒト細胞傷害性Ｔ細胞はｂｉ−ｓｃＦｖのＩＶＴ−ｍＲＮＡのレシピエント細胞および産生細胞として働くことができる。 ヒト細胞傷害性Ｔ細胞をＣＤ８陽性選択によってＰＢＭＣから新たに単離し、続いて、８０μｇ／ｍｌまたは２４０μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡによりエレクトロポレーションによって一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションされたエフェクター細胞を６ウエルプレートにおいて二連で、５：１のエフェクター対標的比で、ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮｕｇＣ４標的細胞と共インキュベーションした。参照として、処理されていないヒトＴ細胞を標的細胞とともに培養した。陰性コントロールとして、８０μｇ／ｍｌまたは２４０μｇ／ｍｌのｅＧＦＰコントロールＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされるヒトＴ細胞をＮｕｇＣ４標的細胞と共インキュベーションした。４８時間後、細胞を集め、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ２５−ＰＥ、抗ＣＤ６９−ＡＰＣおよび生死染色のためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により標識し、フローサイトメトリーによって分析した。（Ａ）は、陽性染色された細胞傷害性ヒトＴ細胞の百分率を示す。（Ｂ）において、参照サンプルに対して正規化される死んでいる（ＰＩ^＋）標的細胞の百分率がプロットされる。すべての値をＦｌｏｗＪｏソフトウエアにより求めた。ｃｔｒｌはコントロールを示す；ＩＶＴは、インビトロ転写されたことを示す；ｍＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡを示す；ＴＬはＴリンパ球を示す。

【図28】１ＢｉＭＡＢのＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされるＣＬＤＮ１８．２陰性標的細胞はＴ細胞によって溶解されない。 ルシフェラーゼを安定的に発現するＣＬＤＮ１８．２陰性細胞株ＰＡ−１は標的細胞株として役立った。５×１０^６個のＰＡ−１／ｌｕｃ細胞を合計で４０μｇ／ｍｌのＩＶＴ−ｍＲＮＡによりエレクトロポレーションによってトランスフェクションした。４μｇ／ｍｌおよび４０μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡ、または、陽性コントロールとしての、内因的に発現されるＣＬＤＮ６を標的化する６ＲＨＵ３をトランスフェクションした。ｂｉ−ｓｃＦｖ陰性コントロールとして、発現されないＴＡＡを標的化する４０μｇ／ｍｌのｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−ｍＲＮＡ（−ｃｔｒｌ）をトランスフェクションした。このＩＶＴ−ｍＲＮＡは４μｇ／ｍｌのＩＶＴ−ｍＲＮＡサンプルにおけるフィルアップ（ｆｉｌｌ−ｕｐ）用ＲＮＡとしてもまた役立った（ＩＶＴ−ｍＲＮＡ ４μｇ／ｍｌ １ＢｉＭＡＢ、ＩＶＴ−ｍＲＮＡ ４μｇ／ｍｌ ６ＲＨＵ３）。ｂｉ−ｓｃＦｖ陰性コントロールによりトランスフェクションされたＰＡ−１／ｌｕｃ細胞およびエフェクター細胞との組合せでの１ＢｉＭＡＢおよび６ＰＨＵ３を用いたタンパク質コントロールサンプルが含まれた。 トランスフェクションされた標的細胞を５：１のエフェクター対標的比でヒト細胞傷害性Ｔ細胞（汎Ｔ細胞）とともに播種した。すべてのサンプルを９６ウエル形式において三連で播種し、７２時間にわたって共インキュベーションした。最小溶解コントロール（Ｌ_ｍｉｎ）として、それぞれの個々のトランスフェクションされた標的細胞サンプルを、エフェクター細胞を伴うことなく播種した。自然発光カウント数に対して正規化するための最大溶解（Ｌ_ｍａｘ）を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をルシフェリン添加前に、エフェクター細胞および処理されていない標的細胞を含有するコントロールウエル（Ｌ_ｍａｘ１）、または、処理されていない標的細胞を単独で含有するコントロールウエル（Ｌ_ｍａｘ２）に加えることによって達成した。ルシフェリン溶液を加えた３０分後、発光を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダーで測定した。特異的な標的細胞溶解を下記の式によって計算した：％特異的溶解＝［１−（発光試験サンプル−Ｌ_ｍａｘ１）／（Ｌ_ｍｉｎ＿試験サンプル−Ｌ_ｍａｘ２）］×１００。ｃｔｒｌはコントロールを示す；ＩＶＴは、インビトロ転写されたことを示す；ｍＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡを示す。

【図29A】ｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−ｍＲＮＡまたはｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−レプリコンＲＮＡによりトランスフェクションされる哺乳動物細胞による１ＢｉＭＡＢ産生の証拠。

【図29B】ｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−ｍＲＮＡまたはｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−レプリコンＲＮＡによりトランスフェクションされる哺乳動物細胞による１ＢｉＭＡＢ産生の証拠。

【図29C】ｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−ｍＲＮＡまたはｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−レプリコンＲＮＡによりトランスフェクションされる哺乳動物細胞による１ＢｉＭＡＢ産生の証拠。 （Ａ）５×１０^６個のＢＨＫ２１細胞を、４０μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡまたは１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−レプリコンＲＮＡによりエレクトロポレーションによって一過性にトランスフェクションした。模擬コントロールとして、細胞を、ＲＮＡを伴うことなくエレクトロポレーションした。トランスフェクションの１８時間後、上清および細胞を集めた。細胞を溶解し、上清を約５０倍の濃縮に供した。処理されていない上清および濃縮された上清を、Ｎｉ−ＮＴＡプレート、抗ｃｈＣＬＤＮ１８．２ａｂイディオタイプｍＡＢおよび二次のＡＰコンジュゲート化抗体を使用してＥＬＩＳＡによって分析した。２倍ずつで２．３ｎｇ／ｍｌから３７．５ｎｇ／ｍｌにまで及ぶ希釈列における精製された１ＢｉＭＡＢタンパク質を標準物として使用した。（Ｂ）濃縮された上清、（Ａ）の細胞溶解物、および、陽性コントロールとしての０．１μｇの精製された１ＢｉＭＡＢタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウエスタンブロット分析を一次のモノクローナル抗Ｈｉｓ抗体および二次のペルオキシダーゼコンジュゲート化抗マウス抗体により行った。（Ｃ）５×１０^６個のＢＨＫ２１細胞を、４０μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡまたはｎｏ．２５ ＩＶＴ−ｍＲＮＡによりエレクトロポレーションによって一過性にトランスフェクションした。模擬コントロールとして、細胞を、ＲＮＡを伴うことなくエレクトロポレーションした。トランスフェクションの４８時間後、上清を集め、４０倍の濃縮に供した。ＳＮ、および、陽性コントロールとしての０．１μｇの精製された１ＢｉＭＡＢタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウエスタンブロット分析を一次のモノクローナル抗Ｈｉｓ抗体および二次のペルオキシダーゼコンジュゲート化抗マウス抗体により行った。ｃｔｒｌはコントロールを示す；ｍＡＢはモノクローナル抗体を示す；ＳＮは上清を示す；ＷＢはウエスタンブロットを示す。

【図30】１ＢｉＭＡＢのｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−ｍＲＮＡまたはＩＶＴ−レプリコンＲＮＡの注入はインビボ産生および検出可能な１ＢｉＭＡＢ ｂｉ−ｓｃＦｖ分子をマウスにおいて引き起こす。 １０μｇの１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡを、ＥＢＫのＩＶＴ−ｍＲＮＡを伴って、または伴うことなく、あるいは、１０μｇの１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−レプリコンを、ＮＳＧマウスにＩＭ注入した。注入の２日後、４日後および７日後に採取される血液からの血清をインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて適用した。ＣＬＤＮ１８．２およびルシフェラーゼを安定的に発現するＮｕｇＣ４−ＬＶＴ−ＣＬＤＮ１８．２／ｌｕｃ標的細胞を、２０μｌのサンプル上清とともに４８時間、３０：１のＥ：Ｔ比でのヒトＴ細胞と共インキュベーションした。標準物１ＢｉＭＡＢタンパク質コントロール、Ｌ_ｍｉｎおよびＬ_ｍａｘは、２０μｌのＮＳＧ模擬血清を含有した。ＥＢＫはワクシニアウイルスタンパク質カクテル（Ｅ３、Ｂ−１８Ｒ、Ｋ３）を示す；ＩＭは筋肉内を示す。

【図31】ＴＡＡ ＣＬＤＮ６を標的化するｂｉ−ｓｃＦｖ抗体をコードするＩＶＴ−ＲＮＡ分子の概略的例示。 抗ＣＬＤＮ６ ｂｉ−ｓｃＦｖ抗体をコードするインビトロ転写されたＲＮＡ配列の略図。（Ａ）抗ＴＡＡ可変領域に関する５'側位置および３'側位置におけるＩＶＴ ｍＲＮＡ。（Ｂ）抗ＴＡＡ可変領域に関する３'側位置におけるＩＶＴアルファウイルスレプリコン。抗ＣＬＤＮ６のＶＨ領域およびＶＬ領域が、モノクローナルなＣＬＤＮ６抗体（ｍＣＬＤＮ６ａｂ）の配列から作製される。"Ｃａｐ"が、ＡＲＣＡ、ベータ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）またはベータ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）に代わって一律に使用される。抗ＣＤ３のＶＨ領域およびＶＬ領域が、モノクローナルなＣＤ３抗体ＴＲ６６の配列から作製される。Ａはアデニンを示す；ｂｉ−ｓｃＦｖは二重特異性の単鎖可変フラグメントを示す；ｈＡｇはヒトアルファグロビンの５'−ＵＴＲを示す；ｈＢｇはヒトベータグロビンの３'−ＵＴＲを示す；Ｈｉｓはヘキサヒスチジルタグを示す；ＩＶＴは、インビトロ転写されたことを示す；ＬＬは、長いリンカー（１５個〜１８個のアミノ酸）を示す；ｎｓＰ１〜４は非構造タンパク質１〜４を示す；Ｓｅｃは分泌シグナルを示す；ｓｇＰはサブゲノムプロモーターを示す；ＳＬは、短いリンカー（５個〜６個のアミノ酸）を示す；ＴＡＡは腫瘍関連抗原を示す；ＵＴＲは非翻訳領域を示す；Ｖは抗体の重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖の可変領域を示す。

【図32】抗ＣＬＤＮ６ ｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされる標的細胞とヒトＴ細胞との共インキュベーションはＴ細胞のクラスター化を引き起こす。ＣＬＤＮ６を内因的に発現するＰＡ−１細胞を、２０μｇ／ｍｌの６ＲＨＵ５ ＩＶＴ−ｍＲＮＡまたは６ＲＨＵ３ ＩＶＴ−ｍＲＮＡによりエレクトロポレーションによって一過性にトランスフェクションし、６ウエルプレートにおいて５：１のエフェクター対標的比でのヒトＴ細胞（汎Ｔ細胞）と共インキュベーションした。陰性コントロールサンプルとして、発現されないＴＡＡを標的化するｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされたＰＡ−１標的細胞（−ｃｔｒｌ）で、ヒトＴ細胞と共インキュベーションされるものを使用した（上段列、左側写真）。中段列は、非処理のＰＡ−１細胞およびヒトＴ細胞で、陰性コントロールとして、タンパク質を伴わない場合（模擬、左側写真）、あるいは、陽性コントロールとして、５０μｇ／ｍｌの精製された抗ＣＬＤＮ６ ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の６ＰＨＵ５（中央）または６ＰＨＵ３（右側）を伴う場合を示す。下段列は単独での非処理のＰＡ−１細胞（左側）およびヒトＴ細胞（右側）を示す。２４時間の共インキュベーションの後、サンプルを、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ顕微鏡により２００×の倍率で写真撮影した。白の矢印は標的細胞上のＴ細胞のクラスターを示す。ｂｉ−ｓｃＦｖは二重特異性の単鎖可変フラグメントを示す；ｃｔｒｌはコントロールを示す；ｈｕはヒトを示す；ＩＶＴは、インビトロ転写されたことを示す；ｍＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡを示す；ＴＬはＴリンパ球を示す。

【図33】効力に対するドメイン配向の影響：抗ＣＬＤＮ６ ｂｉ−ｓｃＦｖ ６ＲＨＵ３による標的細胞のトランスフェクションは、６ＲＨＵ５による場合よりも大きい割合の活性化されたＴ細胞をもたらす。 ＣＬＤＮ６を内因的に発現するＰＡ−１細胞を、それらの効力をＴ細胞活性化アッセイにおいて比較するために、ＣＬＤＮ６およびＣＤ３に対して向けられる２つのｂｉ−ｓｃＦｖ変化体（６ＲＨＵ５および６ＲＨＵ３）により一過性にトランスフェクションした。変化体につき、５×１０^６個のＰＡ−１細胞を２０μｇ／ｍｌのＩＶＴ−ｍＲＮＡによりエレクトロポレーションした。トランスフェクションされた標的細胞を再計数し、１×１０^５個の細胞を６ウエルプレートあたり播種し、５：１のＥ：Ｔ比でヒト細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８^＋の選択されたＴ細胞）とインキュベーションした。陰性コントロールとして、処理されていない標的細胞（ｈｕ ＴＬ＋ＰＡ−１ 非処理）と、発現されないＴＡＡを標的化するｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされる標的細胞（ｈｕ ＴＬ＋ＰＡ−１ −ｃｔｒｌ）とを選んだ。６ＰＨＵ５タンパク質が５０ｎｇ／ｍｌの濃度で陽性コントロールとして役立った（ｈｕ ＴＬ＋ＰＡ−１タンパク質ｃｔｒｌ）。さらに、Ｔ細胞を、標的細胞を伴うことなく、バックグラウンドでの活性化の参照として、６ＰＨＵ５タンパク質を伴って、または伴うことなく播種した。それぞれのサンプルを二連で播種した。分析を２４時間後および４８時間後に行った：Ｔ細胞を集め、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ２５−ＰＥ、抗ＣＤ６９−ＡＰＣおよび生死染色のための７−ＡＡＤにより標識し、フローサイトメトリーによって分析した。ＴＡＡ依存的なｂｉ−ｓｃＦｖ媒介のＴ細胞活性化が、共インキュベーションの２４時間後（Ａ）および４８時間後（Ｂ）に両方の抗ＣＬＤＮ６ ｂｉ−ｓｃＦｖ変化体により認められた。ｂｉ−ｓｃＦｖ ６ＲＨＵ３によるトランスフェクションは、およそ２０％より大きいＴ細胞活性化を両方の時点で引き起こした。ｂｉ−ｓｃＦｖは二重特異性の単鎖可変フラグメントを示す；ｃｔｒｌはコントロールを示す；ｈｕはヒトを示す；ＩＶＴは、インビトロ転写されたことを示す；ｍＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡを示す；ＴＬはＴリンパ球を示す。

【図34】６ＲＨＵ３の分泌はＴ細胞活性化を濃度依存的様式で媒介する。 ＣＬＤＮ６を内因的に発現するＰＡ−１細胞を、０．２μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌの６ＲＨＵ３ ＩＶＴ−ｍＲＮＡと、発現されないＴＡＡを標的化する適量のｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−ｍＲＮＡとを含有する合計で２０μｇ／ｍｌのＩＶＴ−ｍＲＮＡによりエレクトロポレーションによって一過性にトランスフェクションした。発現されないＴＡＡを標的化する２０μｇ／ｍｌのｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−ｍＲＮＡ（０．０μｇ／ｍｌの６ＲＨＵ３ ＩＶＴ−ｍＲＮＡ）のトランスフェクションは、特異性コントロールとして役立った。トランスフェクションされた標的細胞を６ウエルプレートにおいて二連で、５：１のエフェクター対標的比でのヒト細胞傷害性Ｔ細胞（汎Ｔ細胞）と共インキュベーションした。Ｔ細胞活性化の参照として、ヒトＴ細胞を、６ＰＨＵ５タンパク質を伴うことなく単独で（ｈｕ ＴＬ−）、または、６ＰＨＵ５タンパク質とともに培養した（ｈｕ ＴＬタンパク質ｃｔｒｌ）。陰性コントロールとして、Ｔ細胞を、処理されていないＰＡ−１標的細胞と共インキュベーションした（ｈｕ ＴＬ＋ＰＡ−１ −ｃｔｒｌ）。６ＰＨＵ５タンパク質が５０ｎｇ／ｍｌの濃度で陽性コントロールとして役立った（ｈｕ ＴＬ＋ＰＡ−１タンパク質ｃｔｒｌ）。４８時間後、Ｔ細胞を集め、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ２５−ＰＥおよび抗ＣＤ６９−ＡＰＣにより標識し、フローサイトメトリーによって分析した。グラフは、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアにより求められる場合の陽性染色されたヒトＴ細胞の百分率を明らかにする。ｂｉ−ｓｃＦｖは二重特異性の単鎖可変フラグメントを示す；ｃｔｒｌはコントロールを示す；ｈｕはヒトを示す；ＩＶＴは、インビトロ転写されたことを示す；ｍＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡを示す；ＴＬはＴリンパ球を示す。

【図35】４８時間後における特異的な標的細胞溶解についての６ＲＨＵ３のＥＣ_５０がおよそ２００ｎｇ／ｍｌである。 ルシフェラーゼを安定的に発現する、ＣＬＤＮ６を内因的に発現するＰＡ−１細胞を、０．００４μｇ／ｍｌ〜１３．３μｇ／ｍｌの６ＲＨＵ３と、発現されないＴＡＡを標的化する適量のｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−ｍＲＮＡとを含有する合計で１３．３μｇ／ｍｌのｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−ｍＲＮＡの総濃度を用いたエレクトロポレーションによって一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションされた標的細胞を９６ウエル形式において三連で、５：１のエフェクター対標的比でのヒトＴ細胞とともに播種した。最小溶解コントロール（Ｌ_ｍｉｎ）として、それぞれの個々のトランスフェクションされた標的細胞サンプルを、エフェクター細胞を伴うことなく播種した。自然発光カウント数に対して正規化するための最大溶解（Ｌ_ｍａｘ）を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をルシフェリン添加の直前に、エフェクター細胞および処理されていない標的細胞を含有するコントロールウエルに加えることによって達成した。ルシフェリン溶液を加えた３０分後、発光を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダーで２４時間後および４８時間後に測定した。特異的な標的細胞溶解を下記の式によって計算した：％特異的溶解＝［１−（発光試験サンプル−Ｌ_ｍａｘ）／（Ｌ_ｍｉｎ＿試験サンプル−Ｌ_ｍａｘ）］×１００。値を６ＲＨＵ３濃度のｌｏｇ１０に対してプロットした。ＥＣ_５０は５０％最大有効濃度を示す；Ｌは溶解を示す。

【図36】Ｔ細胞の増殖がＣＬＤＮ６の存在下において標的細胞による６ＲＨＵ３分泌に応答して特異的に誘導される。 ヒトＴ細胞をアッセイのためにＣＦＳＥ染色した。Ｔ細胞を、標的細胞を伴うことなく（Ｔ細胞）、陽性の活性化コントロールとして５μｇ／ｍｌのＯＫＴ３および２μｇ／ｍｌのαＣＤ２８との組合せで（＋ｃｔｒｌ）、または、５ｎｇ／ｍｌの標的化しないコントロールｂｉ−ｓｃＦｖとともに（−ｃｔｒｌタンパク質）、または、５ｎｇ／ｍｌの６ＰＨＵ３タンパク質（６ＰＨＵ３タンパク質）とともに培養した。Ｔ細胞と、ＣＬＤＮ６を内因的に発現するＰＡ−１標的細胞とを一緒に（Ｔ細胞＋ＣＬＤＮ６陽性標的細胞）、何も伴うことなく（模擬）、または、５ｎｇ／ｍｌの６ＰＨＵ３タンパク質（６ＰＨＵ３タンパク質）とインキュベーションした。ＩＶＴ−ｍＲＮＡを試験するために、ＰＡ−１細胞を、２０μｇ／ｍｌの６ＲＨＵ３ ＩＶＴ−ｍＲＮＡ（６ＲＨＵ３ ｍＲＮＡ）、または、発現されないＴＡＡを標的化するｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−ｍＲＮＡ（−ｃｔｒｌ ｍＲＮＡ）によりトランスフェクションし、Ｔ細胞とインキュベーションした。加えて、発現されないＴＡＡを標的化するｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされるＰＡ−１細胞を、５ｎｇ／ｍｌの６ＰＨＵ３タンパク質と組み合わせた（−ｃｔｒｌ ｍＲＮＡ＋６ＰＨＵ３タンパク質）。さらなる特異性コントロールとして、ＣＬＤＮ６を発現しない標的細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１をＴ細胞と一緒に伴うサンプルを含めた（Ｔ細胞＋ＣＬＤＮ６陰性標的細胞）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を処理しないで使用し、何も伴うことなく（模擬）、または、５ｎｇ／ｍｌのコントロールｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質（−ｃｔｒｌタンパク質）もしくは５ｎｇ／ｍｌの６ＰＨＵ３（６ＰＨＵ３タンパク質）とインキュベーションしたか、あるいは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、２０μｇ／ｍｌの６ＲＨＵ３ ＩＶＴ−ｍＲＮＡ（６ＲＨＵ３ ｍＲＮＡ）、または、発現されないＴＡＡを標的化するｂｉ−ｓｃＦｖ ＩＶＴ−ｍＲＮＡ（−ｃｔｒｌ ｍＲＮＡ）によりトランスフェクションした。アッセイを９６ウエルにおいて５：１のエフェクター対標的比で行い、それぞれのサンプルが三連であり、インキュベーション時間が７２時間であった。Ｔ細胞の増殖を示すＣＦＳＥシグナルの低下をフローサイトメトリーによって分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアによって計算し、％増殖性Ｔ細胞としてプロットした。ＣＦＳＥはカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルを示す；ＩＶＴは、インビトロ転写されたことを示す；ｍＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡを示す。

【図37A】ｂｉ−ｓｃＦｖのＩＶＴ−ｍＲＮＡまたはＩＶＴ−レプリコンＲＮＡによりトランスフェクションされる哺乳動物細胞による６ＲＨＵ３翻訳の証拠。

【図37B】ｂｉ−ｓｃＦｖのＩＶＴ−ｍＲＮＡまたはＩＶＴ−レプリコンＲＮＡによりトランスフェクションされる哺乳動物細胞による６ＲＨＵ３翻訳の証拠。

【図37C】ｂｉ−ｓｃＦｖのＩＶＴ−ｍＲＮＡまたはＩＶＴ−レプリコンＲＮＡによりトランスフェクションされる哺乳動物細胞による６ＲＨＵ３翻訳の証拠。 （Ａ）５×１０^６個のＢＨＫ２１細胞を、４０μｇ／ｍｌの６ＲＨＵ３ ＩＶＴ−ｍＲＮＡまたは６ＲＨＵ３ ＩＶＴ−レプリコンＲＮＡによりエレクトロポレーションによって一過性にトランスフェクションした。４０μｇ／ｍｌのｎｏ．２５ ＩＶＴ−ｍＲＮＡのトランスフェクションを追加のサンプルとして含めた。模擬ｃｔｒｌとして、細胞を、ＲＮＡを伴うことなくエレクトロポレーションした。トランスフェクションの１８時間後、上清および細胞を集めた。細胞を溶解し、上清を約５０倍の濃縮に供した。非処理の上清および濃縮された上清を、Ｎｉ−ＮＴＡプレート、抗ｍＣＬＤＮ６ａｂイディオタイプｍＡＢおよび二次のＡＰコンジュゲート化抗体を使用してＥＬＩＳＡによって分析した。２倍ずつで２．３ｎｇ／ｍｌから１５０ｎｇ／ｍｌにまで及ぶ希釈列における精製された６ＰＨＵ３タンパク質を標準物として使用した。（Ｂ）濃縮された上清、（Ａ）の細胞溶解物、および、陽性コントロールとしての０．１μｇの精製された６ＰＨＵ３タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウエスタンブロット分析を一次のモノクローナル抗Ｈｉｓ抗体および二次のペルオキシダーゼコンジュゲート化抗マウス抗体により行った。（Ｃ）５×１０^６個のＢＨＫ２１細胞を、４０μｇ／ｍｌの６ＲＨＵ３ ＩＶＴ−ｍＲＮＡまたはｎｏ．２５ ＩＶＴ−ｍＲＮＡによりエレクトロポレーションによって一過性にトランスフェクションした。模擬コントロールとして、細胞を、ＲＮＡを伴うことなくエレクトロポレーションした。トランスフェクションの４８時間後、上清を集め、４０倍の濃縮に供した。ＳＮ、および、陽性コントロールとしての０．１μｇの精製された６ＰＨＵ３タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウエスタンブロット分析を一次のモノクローナル抗Ｈｉｓ抗体および二次のペルオキシダーゼコンジュゲート化抗マウス抗体により行った。ｃｔｒｌはコントロールを示す；ｍＡＢはモノクローナル抗体を示す；ＳＮは上清を示す；ＷＢはウエスタンブロットを示す。

【図38】６ＲＨＵ３ ｂｉ−ｓｃＦｖのＩＶＴ−ｍＲＮＡまたはＩＶＴ−レプリコンＲＮＡの注入はインビボ翻訳および検出可能なｂｉ−ｓｃＦｖ分子をマウスにおいて引き起こす。 １０μｇの６ＲＨＵ３ ＩＶＴ−ｍＲＮＡを、ＥＢＫのＩＶＴ−ｍＲＮＡを伴って、または伴うことなく、あるいは、１０μｇの６ＲＨＵ３ ＩＶＴ−レプリコンを、ＮＳＧマウスにＩＭ注入した。注入の７日後に採取される血液からの血清をインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて適用した。ＣＬＤＮ６を内因的に発現し、かつ、ルシフェラーゼを安定的に発現するＰＡ−１／ｌｕｃ標的細胞を、２０μｌのサンプル血清とともに４８時間、３０：１のＥ：Ｔ比でのヒトＴ細胞と共インキュベーションした。標準物６ＰＨＵ３タンパク質コントロール、Ｌ_ｍｉｎおよびＬ_ｍａｘは、２０μｌのＮＳＧ模擬血清を含有した。ＥＢＫはワクシニアウイルスタンパク質カクテル（Ｅ３、Ｂ−１８Ｒ、Ｋ３）を示す；ＩＭは筋肉内を示す。

【図39A】ｓｃＦｖ抗ＣＤ３結合ドメインをタンパク質のＣ末端部分に含有する抗ＣＬＤＮ１８．２ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の細胞傷害性結果。

【図39B】ｓｃＦｖ抗ＣＤ３結合ドメインをタンパク質のＣ末端部分に含有する抗ＣＬＤＮ１８．２ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の細胞傷害性結果。

【図39C】ｓｃＦｖ抗ＣＤ３結合ドメインをタンパク質のＣ末端部分に含有する抗ＣＬＤＮ１８．２ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の細胞傷害性結果。

【図39D】ｓｃＦｖ抗ＣＤ３結合ドメインをタンパク質のＣ末端部分に含有する抗ＣＬＤＮ１８．２ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の細胞傷害性結果。 ＣＬＤＮ１８．２およびＣＤ３に対して向けられるｂｉ−ｓｃＦｖ変化体を、それらの効力を細胞傷害性アッセイにおいて比較するためにＣＨＯ細胞において一過性に発現させ、プロテイン−Ｌ樹脂により精製した。ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮｕｇＣ４細胞で、ルシフェラーゼを安定的に発現するＮｕｇＣ４細胞を標的細胞として選んだ。ヒトＴ細胞および標的細胞を９６ウエル形式において、５０００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌおよび４０ｎｇ／ｍｌのそれぞれのｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質とともに５：１のＥ：Ｔ比でインキュベーションした。それぞれの試験サンプルを三連で置床し、Ｌ_ｍｉｎのためのコントロールサンプルを三連で置床した。分析前の共インキュベーション時間が２４時間および４８時間であった。ルシフェリン溶液を所与の時点で加えた後、発光を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＴＥＣＡＮリーダーで測定した。特異的な標的細胞溶解をそれぞれの濃度について計算し、特異的な標的細胞溶解が報告された。 ａ．抗ＣＤ３の可変ドメインがＶＨ−ＶＬのドメイン順序であり、ＬＬ４ペプチドリンカーによって隔てられる。 ｂ．抗ＣＤ３の可変ドメインがＶＨ−ＶＬの順序であり、ＬＬ４ペプチドリンカーによって隔てられる。ｓｃＦｖ抗ＣＤ３は相互接続ジスルフィド架橋をＶＨドメインとＶＬドメインとの間に含有する。 ｃ．抗ＣＤ３の可変ドメインがＶＬ−ＶＨの順序であり、ＬＬ５ペプチドリンカーによって隔てられる。 ｄ．抗ＣＤ３の可変ドメインがＶＬ−ＶＨの順序であり、ＬＬ５ペプチドリンカーによって隔てられる。ｓｃＦｖ抗ＣＤ３は相互接続ジスルフィド架橋をＶＬドメインとＶＨドメインとの間に含有する。

【図40】抗ＣＬＤＮ６ ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質を用いたルシフェラーゼ細胞傷害性アッセイで得られるＥＣ_５０値のアッセイ内比較。 ルシフェラーゼ細胞傷害性アッセイをＴ細胞調製のための３名の異なるドナーに関して行った。計算されたＥＣ_５０値（これらは、２４時間および４８時間のインキュベーションの後、６つの試験された抗ＣＬＤＮ６ ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質により計算される）が、それぞれの独立したアッセイについて報告される（Ａ、ＢおよびＣ）。ＣＬＤＮ６を内因的に発現するＰＡ−１細胞を９６ウエル形式において三連で、増大する濃度（ＡおよびＢについては０．０２５ｎｇ／ｍｌ〜５００００ｎｇ／ｍｌ、Ｃについては０．００２５ｎｇ／ｍｌ〜５０００ｎｇ／ｍｌ）の抗ＣＬＤＮ６ ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質および５：１のエフェクター対標的比でのヒトＴ細胞と２４時間および４８時間インキュベーションした。最小溶解コントロール（Ｌ_ｍｉｎ）として、エフェクター細胞および標的細胞を、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質を伴うことなく置床した。自然発光カウント数に対して正規化するための最大溶解（Ｌ_ｍａｘ）を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をルシフェリン添加の直前に、エフェクター細胞および標的細胞をｂｉ−ｓｃＦｖの非存在下で含有するコントロールウエルに加えることによって達成した。ルシフェリン溶液を加えた３０分後、発光を、２４時間および４８時間の標的細胞およびエフェクター細胞のインキュベーションの後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダーで測定した。特異的な標的細胞溶解を下記の式によって計算した：％特異的溶解＝［１−（発光試験サンプル−Ｌ_ｍａｘ）／（Ｌ_ｍｉｎ−Ｌ_ｍａｘ）］×１００。ＥＣ_５０は５０％最大有効濃度を示す；Ｌは溶解を示す；ＮＡは、適用されないことを示す。

【発明を実施するための形態】

【0048】

本発明は下記において詳しく記載されるにもかかわらず、本明細書中に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬は変化することがあるので、本発明は、本明細書中に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されないことを理解しなければならない。また、本明細書中で使用される術語は、特定の実施形態を記載するという目的のためだけであり、添付された特許請求の範囲によってのみ限定されることになる本発明の範囲を限定するために意図されないことも理解しなければならない。別途定義される場合を除き、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。

【0049】

下記において、本発明の構成要素が記載されるであろう。これらの構成要素が具体的な実施形態とともに列挙されており、しかしながら、これらは、さらなる実施形態を創出するために、どのような様式であれ、また、どのような数であれ、組み合わされ得ることが理解されなければならない。様々に記載されている実施例および好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載された実施形態のみに限定するために解釈してはならない。この記載は、明示的に記載された実施形態を開示されている構成要素および／または好ましい構成要素のいくつとでも組み合わせる実施形態を裏づけるために、また、包含するために理解されなければならない。そのうえ、本特許出願におけるすべての記載された構成要素のどのような並び替えおよび組合せも、文脈がそれ以外のことを示す場合を除き、本特許出願の記載によって開示されると見なされなければならない。

【0050】

好ましくは、本明細書中で使用される用語は、"Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）"（Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｂ．ＮａｇｅｌおよびＨ．Ｋｏｌｂｌ編、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、ＣＨ−４０１０ Ｂａｓｅｌ、スイス、（１９９５））に記載されるように定義される。

【0051】

本発明の実施では、別途示される場合を除き、この分野における文献において説明される、化学、生化学、細胞生物学、免疫学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法が用いられるであろう（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ他編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８９）を参照のこと）。

【0052】

本明細書および下記の特許請求の範囲の全体を通して、文脈が他のことを要求する場合を除き、単語"ｃｏｍｐｒｉｓｅ"（含む）および変化形（例えば、"ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ"および"ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ"など）は、言及されたある構成要素、整数または工程、あるいは複数の構成要素、複数の整数または複数の工程の群を包含し、しかし、何らかの他の構成要素、整数または工程、あるいは複数の構成要素、複数の整数または複数の工程の群を除外しないことを暗示することが理解されるであろう。だが、いくつかの実施形態では、そのような他の構成要素、整数または工程、あるいは複数の構成要素、複数の整数または複数の工程の群が除外される、すなわち、主題が、ある構成要素、整数または工程、あるいは複数の構成要素、複数の整数または複数の工程の群からなる場合がある。本発明を記載するという状況（とりわけ、特許請求の範囲の文脈）で使用される用語"ａ"および用語"ａｎ"および用語"ｔｈｅ"ならびに類似する言及は、本明細書中に別途示される場合または文脈によって明確に矛盾する場合を除き、単数および複数の両方を包含するように解釈されなければならない。本明細書中における値の範囲の列挙は、当該範囲に含まれるそれぞれの別個の値を個々に示す簡略的方法として役立つために単に意図されるだけである。本明細書中で別途示される場合を除き、それぞれの個々の値が、その値が本明細書中に個々に列挙されていたかのように本明細書に組み込まれる。本明細書中に記載されるすべての方法が、本明細書中に別途示される場合または文脈によって明確に矛盾する場合を除き、どのような順であれ、好適な順で行われることが可能である。ありとあらゆる例、または、例示的語法（例えば、"ｓｕｃｈ ａｓ"（例えば、・・・など））の使用は、本明細書中に提供される場合、単に発明をより良く例示することのみを意図し、本発明または特許請求の範囲に対し限定を置くものではない。本明細書における語法はどれも、どのような構成要素であれ、本発明の実施に不可欠である主張されていない構成要素を示すとして解釈してはならない。

【0053】

いくつかの文書が本明細書の本文を通して引用される。上記または下記のどちらにおいてであろうと、本明細書中に引用される文書（すべての特許、特許出願、科学的刊行物、製造者の仕様書、説明書などを含む）のそれぞれが本明細書により、それらの全体において参照によって組み込まれる。本明細書中には、本発明は、そのような開示に先行する資格が先行発明によってないということを認めるものとして解釈されるものは何もない。

【0054】

クローディンは、タイトジャンクションの最も重要な成分である一群のタンパク質であり、タイトジャンクションにおいて、これらのタンパク質は、上皮の細胞の間での細胞間隙における分子の流れを制御する傍細胞バリアを規定する。クローディンは、Ｎ端側末端およびＣ端側末端がともに細胞質に位置する、膜を４回またがる膜貫通タンパク質である。１番目の細胞外ループ（これはＥＣ１またはＥＣＬ１と呼ばれる）は平均して５３個のアミノ酸からなり、２番目の細胞外ループ（これはＥＣ２またはＥＣＬ２と呼ばれる）は２４個前後のアミノ酸からなる。クローディンファミリーの細胞表面タンパク質、例えば、ＣＬＤＮ６およびＣＬＤＮ１８．２などが、様々な起源の腫瘍において発現され、これらは、それらの選択的発現（毒性と関連した正常な組織では発現が認められない）および原形質膜への局在化のために抗体媒介のガン免疫療法に関連して標的構造物として特に適する。

【0055】

本発明との関連において、好ましいクローディンがＣＬＤＮ６およびＣＬＤＮ１８．２である。ＣＬＤＮ６およびＣＬＤＮ１８．２は、腫瘍組織において示差的に発現されるとして特定されており、ＣＬＤＮ１８．２を発現する唯一の正常な組織が胃であり、ＣＬＤＮ６を発現する唯一の正常な組織が胎盤である。

【0056】

ＣＬＤＮ１８．２は、胃粘膜の分化した上皮細胞における正常な組織において選択的に発現される。ＣＬＤＮ１８．２は、様々な起源のガンにおいて、例えば、膵臓ガン腫、食道ガン腫、胃ガン腫、気管支ガン腫、乳ガン腫およびＥＮＴ腫瘍などにおいて発現される。ＣＬＤＮ１８．２は原発性腫瘍の防止および／または処置のための有益な標的であり、例えば、胃ガン、食道ガン、膵臓ガン、肺ガン（例えば、非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）など）、卵巣ガン、結腸ガン、肝ガン、頭頸部ガンおよび胆嚢のガンならびにそれらの転移物（特に、胃ガン転移物、例えば、クルケンベルグ腫瘍、腹膜転移物およびリンパ節転移物など）などの防止および／または処置のための有益な標的である。

【0057】

ＣＬＤＮ６は、例えば、卵巣ガン、肺ガン、胃ガン、乳ガン、肝ガン、膵臓ガン、皮膚ガン、メラノーマ、頭頸部ガン、肉腫、胆管ガン、腎細胞ガンおよび膀胱ガンにおいて発現されることが見出されている。ＣＬＤＮ６は、卵巣ガン（特に、卵巣腺ガンおよび卵巣奇形ガン）、肺ガン（小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）を含むが、特に、扁平上皮肺ガンおよび扁平上皮肺腺ガン）、胃ガン、乳ガン、肝ガン、膵臓ガン、皮膚ガン（特に、基底細胞ガンおよび扁平上皮ガン）、悪性メラノーマ、頭頸部ガン（特に、悪性多形性腺腫）、肉腫（特に、滑膜肉腫および滑膜ガン肉腫）、胆管ガン、膀胱のガン（特に、移行上皮ガンおよび移行上皮乳頭状ガン）、腎臓ガン（特に、腎明細胞ガンおよび乳頭状腎細胞ガンを含む腎細胞ガン）、結腸ガン、小腸ガン（回腸のガン、特に、小腸腺ガンおよび回腸の腺ガンを含む）、精巣胎児性ガン、胎盤性絨毛ガン、子宮頸ガン、精巣ガン（特に、精巣セミノーマ、精巣奇形腫および胎芽性精巣ガン）、子宮ガン、胚細胞腫瘍（例えば、奇形ガンまたは胚性ガン腫など、特に、精巣の胚細胞腫瘍）、および、それらの転移形態物の防止および／または処置のための特に好ましい標的である。１つの実施形態において、ＣＬＤＮ６発現に伴うガン疾患が、卵巣ガン、肺ガン、転移性卵巣ガンおよび転移性肺ガンからなる群から選択される。好ましくは、卵巣ガンはガン腫または腺ガンである。好ましくは、肺ガンはガン腫または腺ガンであり、好ましくは細気管支ガンであり、例えば、細気管支ガン腫または細気管支腺ガンなどである。

【0058】

用語「ＣＬＤＮ」は本明細書中で使用される場合、クローディンを意味し、ＣＬＤＮ１８．２およびＣＬＤＮ６を包含する。好ましくは、クローディンはヒトのクローディンである。

【0059】

用語「ＣＬＤＮ１８」はクローディン１８を示し、これには、クローディン１８のスプライス変化体１（クローディン１８．１（ＣＬＤＮ１８．１））およびクローディン１８のスプライス変化体２（クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２））を含めて、どのような変化体も含まれる。

【0060】

用語「ＣＬＤＮ１８．２」は好ましくはヒトＣＬＤＮ１８．２に関連し、特に、配列表の配列番号１によるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変化体を含むタンパク質、好ましくは、配列表の配列番号１によるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変化体からなるタンパク質を示す。ＣＬＤＮ１８．２の１番目の細胞外ループは好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸２７〜アミノ酸８１を含み、より好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸２９〜アミノ酸７８を含む。ＣＬＤＮ１８．２の２番目の細胞外ループは好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１４０〜アミノ酸１８０を含む。前記１番目の細胞外ループおよび２番目の細胞外ループは好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２の細胞外部分を形成する。

【0061】

用語「ＣＬＤＮ６」は好ましくはヒトＣＬＤＮ６に関連し、特に、配列表の配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列あるいは前記アミノ酸配列の変化体を含むタンパク質、好ましくは、配列表の配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列あるいは前記アミノ酸配列の変化体からなるタンパク質を示す。ＣＬＤＮ６の１番目の細胞外ループは好ましくは、配列番号２に示されるアミノ酸配列または配列番号３に示されるアミノ酸配列のアミノ酸２８〜アミノ酸８０を含み、より好ましくは、配列番号２に示されるアミノ酸配列または配列番号３に示されるアミノ酸配列のアミノ酸２８〜アミノ酸７６を含む。ＣＬＤＮ６の２番目の細胞外ループは好ましくは、配列番号２に示されるアミノ酸配列または配列番号３に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１３８〜アミノ酸１６０を含み、好ましくは、配列番号２に示されるアミノ酸配列または配列番号３に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１４１〜アミノ酸１５９を含み、より好ましくは、配列番号２に示されるアミノ酸配列または配列番号３に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１４５〜アミノ酸１５７を含む。前記１番目の細胞外ループおよび２番目の細胞外ループは好ましくは、ＣＬＤＮ６の細胞外部分を形成する。

【0062】

本発明による用語「変化体」は特に、変異体、スプライス変化体、立体配座体、イソ型、対立遺伝子変化体、種変化体および種ホモログを示し、特に、天然に存在するそれらを示す。対立遺伝子変化体は、遺伝子の正常な配列における変化体に関連し、だが、その意味は多くの場合に不明である。完全な遺伝子配列決定により、多くの場合、数多くの対立遺伝子変化体が所与の遺伝子について特定される。種ホモログは、所与の核酸配列またはアミノ酸配列の起源の種とは異なる起源の種を有する核酸配列またはアミノ酸配列である。用語「変化体」は、翻訳後修飾された変化体および立体配座変化体のどのようなものも包含するものとする。

【0063】

本明細書中に記載される結合剤の第２の標的分子がＣＤ３（分化クラスター３）である。ＣＤ３複合体は、成熟型ヒトＴ細胞、胸腺細胞、および、ナチュラルキラー細胞のサブセットの表面に多分子のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の一部として発現される抗原を意味する。このＴ細胞共受容体はタンパク質複合体であり、４つの異なった鎖から構成される。哺乳動物において、この複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖および２つのＣＤ３ε鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られている分子およびζ鎖と会合して、活性化シグナルをＴリンパ球において生じさせる。ＴＣＲ、ζ鎖およびＣＤ３分子が一緒になって、ＴＣＲ複合体を構成する。

【0064】

ヒトＣＤ３イプシロンはＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００７３３で示され、配列番号４を含む。ヒトＣＤ３ガンマはＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００００７３で示される。ヒトＣＤ３デルタはＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００７３２で示される。ＣＤ３はＴＣＲのシグナル伝達に関わっている。ＬｉｎおよびＷｅｉｓｓ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１４、２４３〜２４４（２００１））によって記載されるように、ＭＨＣ提示された特異的な抗原エピトープが結合することによるＴＣＲ複合体の活性化はＳｒｃファミリーのキナーゼによる免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化をもたらし、これにより、Ｃａ２＋放出を含むＴ細胞活性化をもたらすさらなるキナーゼの動員が誘発される。Ｔ細胞上におけるＣＤ３のクラスター化、例えば、固定化された抗ＣＤ３抗体によるＣＤ３のクラスター化により、Ｔ細胞受容体の関与と類似するが、そのクローン典型的な特異性とは無関係なＴ細胞活性化が引き起こされる。

【0065】

本明細書中で使用される場合、「ＣＤ３」はヒトＣＤ３を包含し、多分子のＴ細胞受容体複合体の一部としてヒトＴ細胞の表面に発現される抗原を意味する。

【0066】

ＣＤ３に関して、本発明の結合剤は好ましくはＣＤ３のイプシロン鎖を認識し、特に、ＣＤ３イプシロンの最初の２７個のＮ末端アミノ酸またはこの２７アミノ酸範囲の機能的フラグメントに対応するエピトープを認識する。

【0067】

本発明によれば、用語「クローディン陽性ガン」または類似する用語は、クローディンを発現するガン細胞、好ましくは、クローディンをその表面に発現するガン細胞を伴うガンを意味する。

【0068】

「細胞表面」は、この技術分野におけるその通常の意味に従って使用され、したがって、タンパク質および他の分子による結合のために接触可能である細胞の外側を包含する。

【0069】

クローディンが細胞の表面に位置し、かつ、細胞に加えられるクローディン特異的な抗体による結合のために接触可能であるならば、クローディンは前記細胞の表面に発現している。

【0070】

用語「細胞外部分」は本発明との関連では、細胞の細胞外空間に面し、かつ、好ましくは、前記細胞の外側から、例えば、抗原結合分子（例えば、細胞の外側に位置する抗体など）によって接触可能である分子（例えば、タンパク質など）の一部分を示す。好ましくは、この用語は、１つまたは複数の細胞外ループまたは細胞外ドメインあるいはそれらのフラグメントを示す。

【0071】

用語「一部分」または用語「フラグメント」は本明細書中では交換可能に使用され、連続している構成要素を示す。例えば、構造物（例えば、アミノ酸配列またはタンパク質など）の一部分は、前記構造物の連続している構成要素を示す。構造物の部分、一部分またはフラグメントは好ましくは、前記構造物の１つまたは複数の機能的性質を含む。例えば、エピトープまたはペプチドの部分、一部分またはフラグメントは好ましくは、それらが由来するエピトープまたはペプチドと免疫学的に同等である。タンパク質配列の一部分またはフラグメントは好ましくは、当該タンパク質配列の少なくとも６個、特に、少なくとも８個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個または少なくとも１００個の連続するアミノ酸の配列を含む。

【0072】

本発明によれば、ＣＬＤＮ１８．２は、発現レベルが、胃の細胞または胃の組織における発現と比較してそれよりも低いならば、細胞において実質的に発現していない。好ましくは、発現レベルは胃の細胞または胃の組織における発現の１０％未満であり、好ましくは５％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満または０．０５％未満であり、あるいは、それよりも一層低い。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２は、発現レベルが胃以外の非ガン性組織における発現レベルを最大でも２倍しか超えていないならば、好ましくは最大でも１．５倍しか超えていないならば、好ましくは前記非ガン性組織における発現レベルを超えていないならば、細胞において実質的に発現していない。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２は、発現レベルが検出限界を下回っているならば、および／または、発現レベルが低すぎて、細胞に加えられるＣＬＤＮ１８．２特異的抗体による結合を可能にすることができないならば、細胞において実質的に発現していない。

【0073】

本発明によれば、ＣＬＤＮ１８．２は、発現レベルが胃以外の非ガン性組織における発現レベルを好ましくは２倍を超えて、好ましくは１０倍を超えて、１００倍を超えて、１０００倍を超えて、または１００００倍を超えて超えるならば、細胞において発現している。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２は、発現レベルが検出限界を上回っているならば、および／または、発現レベルが、細胞に加えられるＣＬＤＮ１８．２特異的抗体による結合を可能にするために十分に高いならば、細胞において発現している。好ましくは、細胞において発現されるＣＬＤＮ１８．２は前記細胞の表面に発現されるか、または露出する。

【0074】

本発明によれば、ＣＬＤＮ６は、発現レベルが、胎盤の細胞または胎盤の組織における発現と比較してそれよりも低いならば、細胞において実質的に発現していない。好ましくは、発現レベルは胎盤の細胞または胎盤の組織における発現の１０％未満であり、好ましくは５％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満または０．０５％未満であり、あるいは、それよりも一層低い。好ましくは、ＣＬＤＮ６は、発現レベルが胎盤以外の非ガン性組織における発現レベルを最大でも２倍しか超えていないならば、好ましくは最大でも１．５倍しか超えていないならば、好ましくは前記非ガン性組織における発現レベルを超えていないならば、細胞において実質的に発現していない。好ましくは、ＣＬＤＮ６は、発現レベルが検出限界を下回っているならば、および／または、発現レベルが低すぎて、細胞に加えられるＣＬＤＮ６特異的抗体による結合を可能にすることができないならば、細胞において実質的に発現していない。

【0075】

本発明によれば、ＣＬＤＮ６は、発現レベルが胎盤以外の非ガン性組織における発現レベルを好ましくは２倍を超えて、好ましくは１０倍を超えて、１００倍を超えて、１０００倍を超えて、または１００００倍を超えて超えるならば、細胞において発現している。好ましくは、ＣＬＤＮ６は、発現レベルが検出限界を上回っているならば、および／または、発現レベルが、細胞に加えられるＣＬＤＮ６特異的抗体による結合を可能にするために十分に高いならば、細胞において発現している。好ましくは、細胞において発現されるＣＬＤＮ６は前記細胞の表面に発現されるか、または露出する。

【0076】

本発明によれば、用語「疾患」は、どのような病理学的状態をも示し、これには、ガン、特に、本明細書中に記載されるガンのそのような形態が含まれる。ガンまたは特定の形態のガンに対する本明細書中での参照はどれも、そのガン転移物もまた包含する。好ましい実施形態において、本特許出願に従って処置されるための疾患は、クローディン（ＣＬＤＮ）を発現する細胞、例えば、ＣＬＤＮ１８．２および／またはＣＬＤＮ６などを発現する細胞を伴う。

【0077】

「ＣＬＤＮを発現する細胞に関連する疾患」または類似する表現は、本発明によれば、ＣＬＤＮが患部組織または患部器官の細胞において発現されることを意味する。１つの実施形態において、患部組織または患部器官の細胞におけるＣＬＤＮ発現が、健康な組織または器官における状態と比較して増大している。増大は、少なくとも１０％の増大を示し、特に、少なくとも２０％の増大、少なくとも５０％の増大、少なくとも１００％の増大、少なくとも２００％の増大、少なくとも５００％の増大、少なくとも１０００％の増大、少なくとも１００００％の増大またはそれよりも一層大きい増大を示す。１つの実施形態において、発現は患部組織において見出されるだけであり、一方、健康な組織における発現は抑制されている。本発明によれば、ＣＬＤＮを発現する細胞に関連する疾患には、ガン疾患が含まれる。そのうえ、本発明によれば、ガン疾患は好ましくは、ガン細胞がＣＬＤＮを発現するガン疾患である。

【0078】

本明細書中で使用される場合、「ガン疾患」または「ガン」には、異常に調節された細胞成長、細胞増殖、細胞分化、細胞接着および／または細胞遊走によって特徴づけられる疾患が含まれる。「ガン細胞」によって、急速な制御されない細胞増殖によって成長し、かつ、新しい成長を開始させた刺激が終わった後も成長し続ける正常でない細胞が意味される。好ましくは、「ガン疾患」は、ＣＬＤＮを発現する細胞によって特徴づけられ、ガン細胞がＣＬＤＮを発現する。ＣＬＤＮを発現する細胞は好ましくはガン細胞であり、好ましくは、本明細書中に記載されるガンのガン細胞である。

【0079】

用語「ガン」は本発明によれば、白血病、セミノーマ、メラノーマ、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸ガン、子宮内膜ガン、腎臓ガン、副腎ガン、甲状腺ガン、血液ガン、皮膚ガン、脳のガン、子宮頸ガン、腸ガン、肝臓ガン、結腸ガン、胃ガン、腸ガン、頭頸部ガン、胃腸ガン、リンパ節ガン、食道ガン、結腸直腸ガン、膵臓ガン、耳鼻咽頭（ＥＮＴ）ガン、乳ガン、前立腺ガン、子宮のガン、卵巣ガンおよび肺ガン、ならびに、それらの転移物を含む。その例が、肺ガン腫、乳房ガン腫、前立腺ガン腫、結腸ガン腫、腎細胞ガン腫、子宮頸ガン腫、あるいは、上記で記載されるガンタイプまたは腫瘍の転移物である。ガンの用語は本発明によれば、ガン転移物もまた含む。

【0080】

本発明によれば、「ガン（腫）」は、上皮細胞に由来する悪性腫瘍である。この一群は、乳ガン、前立腺ガン、肺ガンおよび結腸ガンの一般的な形態を含めて、最も一般的なガンを表す。

【0081】

「腺ガン」は、腺組織に起源を有するガンである。この組織はまた、上皮組織として知られているより大きい組織カテゴリーの一部である。上皮組織には、皮膚、腺、ならびに、身体の空洞および器官を裏打ちする様々な他の組織が含まれる。上皮は発生学的には、外胚葉、内胚葉および中胚葉に由来する。腺ガンとして分類されるためには、細胞は、分泌特性を有する限り、腺の一部分であることは必ずしも必要ない。この形態のガン腫が、ヒトを含めて、一部の高等哺乳動物において生じ得る。高分化型腺ガンは、それらが由来する腺組織に似る傾向があり、一方、低分化型腺ガンはそのような傾向を有しない場合がある。生検物からの細胞を染色することによって、病理学者は、腫瘍が腺ガンまたは何らかの他のタイプのガンであるかを決定するであろう。様々な腺ガンが、身体内の腺の遍在性のために身体の多くの組織において生じる可能性がある。それぞれの腺が同じ物質を分泌し続けないかもしれないが、細胞に対する外分泌機能が存在する限り、その細胞は腺であると見なされ、したがって、その悪性形態は腺ガンと呼ばれる。悪性の腺ガンは、そのための十分な時間が与えられるならば、他の組織に侵入し、多くの場合には転移する。卵巣の腺ガンは卵巣ガン腫の最も一般的なタイプである。これには、漿液性腺ガンおよび粘液性腺ガン、明細胞腺ガン、ならびに、類内膜腺ガンが含まれる。

【0082】

「転移」によって、ガン細胞がその最初の部位から身体の別の部分に広がることが意味される。転移の形成は非常に複雑なプロセスであり、原発性腫瘍からの悪性細胞の剥離、細胞外マトリックスへの侵入、体腔および血管に進入するための内皮基底膜への浸透、その後、血液によって運ばれた後では標的器官への浸潤に依存する。最後に、標的部位における新しい腫瘍の成長が血管形成に依存する。腫瘍転移は多くの場合、原発性腫瘍を除いた後でさえ生じる。なぜならば、腫瘍細胞または腫瘍成分が残存し、転移能を発達させる場合があるからである。１つの実施形態において、用語「転移」は本発明によれば、原発性腫瘍および局所リンパ節系から遠く離れている転移物に関連する「遠位転移」に関連する。１つの実施形態において、用語「転移」は本発明によれば、リンパ節転移に関連する。本発明の治療を使用して処置可能である転移の１つの特定の形態が、原発部位としての胃ガンに起源を有する転移である。好ましい実施形態において、そのような胃ガン転移は、クルケンベルグ腫瘍、腹膜転移および／またはリンパ節転移である。

【0083】

クルケンベルグ腫瘍は、すべての卵巣腫瘍の１％〜２％を占める卵巣の珍しい転移性腫瘍である。クルケンベルグ腫瘍の予後は依然として非常に不良であり、クルケンベルグ腫瘍のための確立された処置は存在しない。クルケンベルグ腫瘍は卵巣の転移性印環細胞腺ガンである。胃が、ほとんどのクルケンベルグ腫瘍症例における原発部位である（７０％）。結腸のガン腫、虫垂のガン腫および乳房のガン腫（主に浸潤性小葉ガン）が、次に最も一般的な原発部位である。胆嚢、胆道、膵臓、小腸、ファーター膨大部、子宮頸部および膀胱／尿膜管のガン腫に起源を有するクルケンベルグ腫瘍の希な症例が報告されている。

【0084】

「処置する」によって、腫瘍のサイズまたは腫瘍の数を被験体において縮小することを含めて、疾患を防止するか、または排除すること；疾患を被験体において停止させるか、または遅らせること；新しい疾患の発達を被験体において阻害するか、または遅らせること；症状の頻度もしくは重篤度および／または再発を、現時点で疾患を有する被験体において、または、以前に疾患を有したことがある被験体において低下させること；ならびに／あるいは、被験体の寿命を延ばすこと、すなわち、増大させることのために、化合物または組成物あるいは化合物または組成物の組合せを被験体に投与することが意味される。

【0085】

特に、用語「疾患の処置」には、疾患を治療すること、疾患の継続期間を短縮すること、疾患を改善すること、疾患を防止すること、疾患の進行または悪化を遅くするか、または阻害すること、あるいは、疾患の発症またはその症状を防止するか、または遅らせることが含まれる。

【0086】

本発明との関連において、「保護する」、「防止する」、「予防的」、「防止的」または「保護的」などの用語は、被験体における疾患の発生および／または伝播の防止または処置または両方に関連し、特に、被験体が疾患を発達させるであろう可能性を最小限に抑えること、または、疾患の発達を遅らせることに関連する。例えば、ガンの危険性がある人が、ガンを防止するための治療の候補であると考えられる。

【0087】

「危険性がある」によって、一般的な集団と比較して、疾患（特にガン）を発達させる可能性が通常よりも大きいとして特定される対象が意味される。加えて、疾患（特にガン）を有したことがある被験体、または、現時点で疾患（特にガン）を有する被験体は、疾患を発達させることについての増大した危険性を有する被験体である。なぜならば、そのような被験体は疾患を発達させ続けることがあるからである。現時点でガンを有する被験体、または、ガンを有したことがある被験体はまた、ガン転移についての増大した危険性を有する。

【0088】

用語「患者」は、本発明によれば、処置のための被験体、特に、疾患を有する被験体を意味し、これには、ヒト、ヒト以外の霊長類および別の動物、特に、哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたは齧歯類（例えば、マウスおよびラットなど）などが含まれる。特に好ましい実施形態において、患者はヒトである。

【0089】

「標的細胞」は、どのような細胞であれ、望まれない細胞（例えば、ガン細胞など）を意味するものとする。好ましい実施形態において、標的細胞はＣＬＤＮを発現する。

【0090】

用語「抗原」は、免疫応答が向けられ、かつ／または、向けられることになるエピトープを含む剤（例えば、タンパク質またはペプチドなど）に関連する。好ましい実施形態において、抗原は、腫瘍関連抗原（例えば、ＣＬＤＮ１８．２またはＣＬＤＮ６など）、すなわち、細胞質、細胞表面および細胞核に由来する場合があるガン細胞の構成成分であり、特に、好ましくは多量に、細胞内に、またはガン細胞上の表面抗原として産生されるそのような抗原である。

【0091】

本発明との関連において、用語「腫瘍関連抗原」は好ましくは、正常な状態のもとでは、限定された数の組織および／または器官において、あるいは、特定の発達段階において特異的に発現され、かつ、１つまたは複数の腫瘍組織またはガン組織において発現されるか、あるいは異常に発現されるタンパク質に関連する。本発明との関連において、腫瘍関連抗原は好ましくは、ガン細胞の細胞表面に関連し、正常な組織においては好ましくは発現されないか、または、ほんの希にしか発現されない。

【0092】

用語「エピトープ」は、分子における抗原決定基、すなわち、免疫系によって認識される分子における一部分、例えば、抗体によって認識される分子における一部分を示す。例えば、エピトープは、免疫系によって認識される抗原上の離れた三次元部位である。エピトープは通常の場合、分子（例えば、アミノ酸または糖側鎖など）の化学的に活性な表面群化からなり、通常の場合、特異的な三次元の構造的特徴、同様にまた、特異的な電荷特徴を有する。配座的エピトープおよび非配座的エピトープが、後者に対する結合ではなく、前者に対する結合が変性溶媒の存在下では失われるという点で区別される。タンパク質のエピトープは好ましくは、前記タンパク質の連続した部分または不連続な部分を含み、好ましくは、長さが５個〜１００個の間のアミノ酸であり、好ましくは５個〜５０個の間のアミノ酸であり、より好ましくは８個〜３０個の間のアミノ酸であり、最も好ましくは１０個〜２５個の間のアミノ酸であり、例えば、エピトープは長さが好ましくは、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個のアミノ酸である場合がある。

【0093】

用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互につながれる少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を示す。用語「抗体」には、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体が含まれる。それぞれの重鎖が重鎖可変領域（本明細書中ではＶＨと略記される）および重鎖定常領域から構成される。それぞれの軽鎖が軽鎖可変領域（本明細書中ではＶＬと略記される）および軽鎖定常領域から構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域はさらに、より保存されている領域（これはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる）が散らばる超可変性の領域（これは相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）に細かく分けることができる。それぞれのＶＨおよびＶＬが３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、これらがアミノ末端からカルボキシ末端に、下記の順で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンが、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の最初の成分（Ｃｌｑ）を含めて、宿主の組織または因子に結合することを媒介する場合がある。

【0094】

用語「モノクローナル抗体」は本明細書中で使用される場合、単一分子組成の抗体分子の調製物を示す。モノクローナル抗体は単一の結合特異性および親和性を呈示する。１つの実施形態において、モノクローナル抗体が、ヒト以外の動物（例えば、マウス）から得られるＢ細胞を不死化細胞に融合されて含むハイブリドーマによって産生される。

【0095】

用語「組換え抗体」は本明細書中で使用される場合、組換え手段によって調製される、発現される、作出される、または単離されるすべての抗体を包含する：例えば、（ａ）免疫グロブリン遺伝子について遺伝子組換えまたは染色体組換えである動物（例えば、マウス）から、あるいは、当該動物から調製されるハイブリドーマから単離される抗体；（ｂ）抗体を発現するように形質転換される宿主細胞から単離される抗体、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体；（ｃ）組換えのコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離される抗体；および（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを伴う何らかの他の手段によって調製される、発現される、作出される、または単離される抗体。

【0096】

用語「ヒト抗体」は本明細書中で使用される場合、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を包含することが意図される。ヒト抗体は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム変異誘発または部位特異的変異誘発によって、あるいは、インビボでの体細胞変異によって導入される変異）を含む場合がある。

【0097】

用語「ヒト化抗体」は、ヒト以外の種から得られる免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有する分子であって、当該分子の残る免疫グロブリン構造がヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく分子を示す。抗原結合部位は、定常ドメインに融合される完全な可変ドメイン、または、可変ドメインにおいて適切なフレームワーク領域にグラフト化される相補性決定領域（ＣＤＲ）のみのどちらかを含む場合がある。抗原結合部位は野生型である場合があり、あるいは、１つまたは複数のアミノ酸置換によって改変される場合があり、例えば、よりヒト免疫グロブリンに酷似するように改変される場合がある。いくつかの形態のヒト化抗体はすべてのＣＤＲ配列を保っている（例えば、マウス抗体に由来する６つすべてのＣＤＲを含有するヒト化されたマウス抗体）。他の形態は、元の抗体に関して変化させられる１つまたは複数のＣＤＲを有する。

【0098】

用語「キメラ抗体」は、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの１つの部分が、特定の種に由来する抗体または特定のクラスに属する抗体における対応する配列に対して相同的であり、一方、鎖の残るセグメントが別の抗体における対応する配列に対して相同的であるそのような抗体を示す。典型的には、軽鎖および重鎖の両方の鎖の可変領域が、哺乳動物の１つの種に由来する抗体の可変領域に似ており、一方、定常部分が、別の種に由来する抗体の配列に対して相同的である。そのようなキメラ形態に対する１つの明確な利点が、可変領域が好都合には、例えば、ヒト細胞調製物に由来する定常領域との組合せで、ヒト以外の宿主生物に由来する容易に入手可能なＢ細胞またはハイブリドーマを使用して、現在知られている供給源に由来し得るということである。可変領域は、調製が容易であるという利点を有しており、かつ、特異性が供給源によって影響されないが、定常領域がヒトであることは、抗体が注射されたときには、免疫応答をヒト被験体から誘発する可能性が、ヒト以外の供給源に由来する定常領域が誘発するであろうよりも低い。しかしながら、定義はこの特定の例に限定されない。

【0099】

抗体は、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびヒト（これらに限定されない）を含めて、種々の種に由来する場合がある。

【0100】

本明細書中に記載される抗体には、ＩｇＡ抗体（例えば、ＩｇＡ１抗体またはＩｇＡ２抗体など）、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＤ抗体が含まれる。様々な実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１抗体、より具体的にはＩｇＧ１カッパイソタイプまたはＩｇＧ１ラムダイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、κ、λ）、ＩｇＧ２ａ抗体（例えば、ＩｇＧ２ａ、κ、λ）、ＩｇＧ２ｂ抗体（例えば、ＩｇＧ２ｂ、κ、λ）、ＩｇＧ３抗体（例えば、ＩｇＧ３、κ、λ）またはＩｇＧ４抗体（例えば、ＩｇＧ４、κ、λ）である。

【0101】

本明細書中で使用される場合、「異種抗体」は、そのような抗体を産生する遺伝子組換え動物に関連して定義される。この用語は、遺伝子組換え生物からならない生物に見出されるアミノ酸配列またはこれに対応するコードする核酸配列を有し、かつ、一般には、遺伝子組換え生物以外の種に由来する抗体を示す。

【0102】

本明細書中で使用される場合、「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物起源の軽鎖および重鎖を有する抗体を示す。例えば、マウス軽鎖を伴うヒト重鎖を有する抗体がヘテロハイブリッド抗体である。

【0103】

本明細書中に記載される抗体は好ましくは単離される。「単離された抗体」は、本明細書中で使用される場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を示すことが意図される（例えば、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する単離された抗体は、ＣＬＤＮ１８．２以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＣＬＤＮ１８．２のエピトープ、イソ型または変化体に特異的に結合する単離された抗体は、例えば、他の種に由来する他の関連した抗原（例えば、ＣＬＤＮ１８．２の種ホモログ）に対する交差反応性を有する場合がある。そのうえ、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。本発明の１つの実施形態において、「単離された」モノクローナル抗体の組合せは、様々な抗体が異なる特異性を有し、かつ、十分に規定された組成物または混合物において組み合わされることに関連する。

【0104】

抗体の「抗原結合部分」（または単に「結合性部分」）または抗体の「抗原結合フラグメント」（または単に「結合性フラグメント」）の用語あるいは類似する用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数のフラグメントを示す。抗体の抗原結合機能が全長抗体のフラグメントによって果たされ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」の用語の範囲内に包含される結合性フラグメントの例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわち、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨドメインからなる一価のフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、すなわち、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体のただ１つだけのアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ他（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；ならびに（ｖｉｉ）合成リンカーによって必要に応じてつながれる場合がある２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せが含まれる。そのうえ、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、すなわち、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるにもかかわらず、それらは、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対形成して一価の分子（これは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている）を形成する単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を使用してつなぐことができる（例えば、Ｂｉｒｄ他（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６、および、Ｈｕｓｔｏｎ他（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３を参照のこと）。そのような単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合フラグメント」の用語の範囲内に包含されることが意図される。さらなる例が、（ｉ）免疫グロブリンのヒンジ領域ポリペプチドに融合される結合ドメインポリペプチド、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合される免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、および、（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合される免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む結合ドメイン・免疫グロブリン融合タンパク質である。結合ドメインポリペプチドは重鎖可変領域または軽鎖可変領域であることが可能である。結合ドメイン・免疫グロブリン融合タンパク質がさらに、米国特許出願公開第２００３／０１１８５９２号および同第２００３／０１３３９３９号に開示される。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られている従来の技術を使用して得られ、フラグメントは、無傷の抗体がスクリーニングされるのと同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。

【0105】

用語「結合ドメイン」は、本発明に関連して、所与の標的構造／抗原／エピトープに結合する／と相互作用する構造物（例えば、抗体の構造）を特徴とする。したがって、本発明による結合ドメインは「抗原相互作用部位」を示す。

【0106】

本発明の目的のために本明細書中に記載されるようなすべての抗体および抗体の誘導体（例えば、抗体フラグメントなど）が用語「抗体」によって包含される。用語「抗体誘導体」は抗体のどのような改変された形態をも示し、例えば、抗体と別の剤または抗体とのコンジュゲート、あるいは、抗体フラグメントを示す。さらに、本明細書中に記載されるような抗体および抗体の誘導体は、本発明の結合剤（例えば、抗体フラグメントなど）を製造するために有用である。

【0107】

天然に存在する抗体は一般に単一特異性である。すなわち、天然に存在する抗体はただ１つだけの抗原に結合する。本発明は、（ＣＤ３受容体と会合することによって）細胞傷害性細胞に結合し、かつ、（ＣＬＤＮと会合することによって）ガン細胞に結合する結合剤を提供する。本発明の結合剤は、少なくとも二重特異性または多特異性（例えば、三重特異性、四重特異性など）である。

【0108】

本発明の結合剤は、抗体分子の形式、または、抗体様分子の形式、または、抗体様性質を有するタンパク質足場の形式、または、少なくとも２つの結合特異性を有する環状ペプチドの形式である場合がある。したがって、結合剤は、本明細書中に記載されるような１つまたは複数の抗体あるいはそのフラグメントを含む場合がある。

【0109】

本発明によれば、二重特異性分子、特に、二重特異性タンパク質、例えば、二重特異性抗体などは、２つの異なる結合特異性を有し、したがって、２つの異なるタイプの抗原（例えば、ＣＬＤＮおよびＣＤ３など）に結合し得る分子である。特に、用語「二重特異性抗体」は、本明細書中で使用される場合、２つの抗原結合部位を含み、第１の結合部位が第１の抗原またはエピトープに対する親和性を有し、かつ、第２の結合部位が、第１の抗原またはエピトープと異なる第２の抗原またはエピトープに対する親和性を有する抗体を示す。具体的には、二重特異性抗体は、２つの異なる抗体のフラグメントから構成され（この場合、２つの異なる抗体の前記フラグメントにより、２つの結合ドメインが形成される）、かつ、その結果として、２つの異なるタイプの抗原に結合する人為的なタンパク質である。本発明による二重特異性抗体は、免疫細胞（例えば、免疫エフェクター細胞など）に対して、特に、（ＣＤ３に結合することによって）Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性細胞など）に対して、かつ、破壊されるために（腫瘍関連抗原ＣＬＤＮに結合することによって）ガン細胞のような標的細胞に対して同時に結合するために操作される。

【0110】

用語「二重特異性抗体」にはまた、ジアボディーが含まれる。ジアボディーは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖で発現させられ、しかし、同じ鎖にあるこれら２つのドメインの間における対形成を可能にするには短すぎるリンカーが使用され、それにより、これらのドメインが別の鎖の相補的なドメインと対形成することが強制させられ、２つの抗原結合部位がもたらされる二価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．他（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．他（１９９４）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２：１１２１〜１１２３を参照のこと）。

【0111】

「多特異性の結合剤」は、３つ以上の異なる結合特異性を有する分子である。

【0112】

本発明に従って特に好ましいものが、二重特異性抗体フラグメントを含む二重特異性抗体であり、特に、二重特異性単鎖抗体フラグメントを含む二重特異性単鎖抗体である。用語「二重特異性単鎖抗体」は、２つの結合ドメインを含む単一ポリペプチド鎖を意味する。特に、本発明による用語「二重特異性単鎖抗体」または用語「単鎖二重特異性抗体」あるいは関連する用語は好ましくは、少なくとも２つの抗体可変領域を、完全な免疫グロブリンには存在する定常部分および／またはＦｃ部分を欠く単一ポリペプチド鎖において連結することから生じる抗体構築物を意味する。

【0113】

例えば、二重特異性単鎖抗体は、合計で２つの抗体可変領域（例えば、２つのＶＨ領域、それぞれが別個の抗原に特異的に結合することができる）が、短いポリペプチドスペーサーを介して互いにつながれ、その結果、それらの間に置かれたスペーサーを伴うこれら２つの抗体可変領域が単一の連続したポリペプチド鎖として存在するようにされる構築物である場合がある。二重特異性単鎖抗体の別の一例が、３つの抗体可変領域を有する単一ポリペプチド鎖である場合がある。ここで、２つの抗体可変領域が、例えば、１つのＶＨおよび１つのＶＬが、これら２つの抗体可変領域が合成ポリペプチドリンカーを介して互いにつながれるｓｃＦｖを構成してもよく、ただし、この場合、後者は多くの場合、タンパク質分解に対して最大限に抵抗性のままでありながら、最小限に免疫原性であるように遺伝子操作される。このｓｃＦｖは特定の抗原に特異的に結合することができ、また、当該ｓｃＦｖが結合する抗原とは異なる抗原に結合することができるさらなる抗体可変領域（例えば、ＶＨ領域）につながれる。二重特異性単鎖抗体のさらに別の一例が、４つの抗体可変領域を有する単一ポリペプチド鎖である場合がある。ここで、第１の２つの抗体可変領域が、例えば、ＶＨ領域およびＶＬ領域が、１つの抗原に結合することができる１つのｓｃＦｖを形成する場合があり、これに対して、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域が、別の抗原に結合することができる第２のｓｃＦｖを形成する場合がある。単一の連続したポリペプチド鎖の内部において、１つの特異性の個々の抗体可変領域が好都合には、合成ポリペプチドリンカーによって隔てられる場合があり、これに対して、それぞれのｓｃＦｖが好都合には、上記で記載されるような短いポリペプチドスペーサーによって隔てられる場合がある。

【0114】

本発明の１つの実施形態によれば、二重特異性抗体の第１の結合ドメインは１つの抗体可変ドメインを含み、好ましくはＶＨＨドメインを含む。本発明の１つの実施形態によれば、二重特異性抗体の第１の結合ドメインは２つの抗体可変ドメインを含み、好ましくはｓｃＦｖ、すなわち、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨを含む。本発明の１つの実施形態によれば、二重特異性抗体の第２の結合ドメインは１つの抗体可変ドメインを含み、好ましくはＶＨＨドメインを含む。本発明の１つの実施形態によれば、二重特異性抗体の第２の結合ドメインは２つの抗体可変ドメインを含み、好ましくはｓｃＦｖ、すなわち、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨを含む。したがって、その最小形態において、本発明による二重特異性抗体における抗体可変領域の総数はほんの２にすぎない。例えば、そのような抗体は２つのＶＨドメインまたは２つのＶＨＨドメインを含むことができるかもしれない。

【0115】

本発明の１つの実施形態によれば、二重特異性抗体の第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインはそれぞれが１つの抗体可変ドメインを含み、好ましくはＶＨＨドメインを含む。本発明の１つの実施形態によれば、二重特異性抗体の第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインはそれぞれが２つの抗体可変ドメインを含み、好ましくはｓｃＦｖ、すなわち、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨを含む。この実施形態において、本発明の結合剤は好ましくは、（ｉ）ＣＬＤＮ抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、（ｉｉ）ＣＬＤＮ抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、（ｉｉｉ）ＣＤ３抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および、（ｉｖ）ＣＤ３抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。

【0116】

二重特異性の全長型抗体が、２つのモノクローナル抗体を共有結合により連結することによって、または、従来のハイブリッド−ハイブリドーマ技術によって得られる場合がある。２つのモノクローナル抗体を共有結合により連結することが、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｂｌｏｏｄ、８０（１９９２）、２８２６〜３４に記載される。本発明との関連において、これらの抗体の一方の抗体がＣＬＤＮに対して特異的であり、他方の抗体がＣＤ３に対して特異的である。

【0117】

１つの実施形態において、二重特異性の結合剤は、異なる特異性を有する２つの連続するＮ端側可変ドメインを含有する重鎖と、異なる特異性を有する２つの連続する可変ドメインを有する軽鎖とを有し、その結果、２つの異なる特異性を有する４つの結合ドメインをもたらす抗体様分子の形式であり（Ｗｕ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００７、２５（１１））、ただし、この場合、一方の特異性がＣＤ３であり、他方の特異性がＣＬＤＮである。

【0118】

好ましい実施形態において、本発明の二重特異性の結合剤は抗体フラグメントの形式である。

【0119】

１つの実施形態において、本発明による二重特異性分子は２つのＦａｂ領域を含み、この場合、一方が、ＣＬＤＮに対するものであり、他方が、ＣＤ３に対するものである。１つの実施形態において、本発明の分子は抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）２複合体である。Ｆａｂ２複合体は２つのＦａｂフラグメントから構成され、この場合、一方のＦａｂフラグメントが、ＣＤ３抗原に対して特異的なＦｖドメイン（すなわち、ＶＨドメインおよびＶＬドメイン）を含み、他方のＦａｂフラグメントが、ＣＬＤＮに対して特異的なＦｖドメインを含む。これらのＦａｂフラグメントのそれぞれが、２つの単一鎖から、すなわち、ＶＬ−ＣＬモジュールおよびＶＨ−ＣＨモジュールから構成される場合がある。代替において、個々のＦａｂフラグメントのそれぞれが単一鎖で配置される場合があり、好ましくはＶＬ−ＣＬ−ＣＨ−ＶＨで配置される場合があり、かつ、個々の可変ドメインおよび定常ドメインがペプチドリンカーによりつながれる場合がある。一般に、個々の単一鎖およびＦａｂフラグメントは、ジスルフィド結合、接着性ドメイン、化学的に連結されて、および／またはペプチドリンカーを介してつながれる場合がある。二重特異性分子はまた、３つ以上のＦａｂフラグメントを含む場合があり、特に、分子は、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の異なる抗原に対する特異性を有するＦａｂ３、Ｆａｂ４またはマルチマーＦａｂ複合体である場合がある。本発明にはまた、化学的に連結されたＦａｂが含まれる。

【0120】

１つの実施形態において、本発明による結合剤には、様々なタイプの二価および三価の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、すなわち、２つの抗体の可変ドメインを模倣する融合タンパク質が含まれる。単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域が１０個〜約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドによりつながれる融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンに富み、同様にまた、溶解性のためにセリンまたはトレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端とつなぐこと、または、逆に、ＶＬのＮ末端をＶＨのＣ末端とつなぐことのどちらも可能である。二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ、ｂｉｖａｌｅｎｔ）の単鎖可変フラグメント（ｄｉ−ｓｃＦｖ、ｂｉ−ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖを連結することによって操作することができる。これを、２つのＶＨ領域および２つのＶＬ領域を有する単一ペプチド鎖を作製することによって行うことができ、これにより、タンデム型ｓｃＦｖがもたらされる。本発明にはまた、３つ以上のｓｃＦｖ結合ドメインを含む多特異性分子が含まれる。このことは、分子が多数の抗原特異性を含み、三重特異性分子、四重特異性分子または多特異性分子であること、あるいは、分子が、同じ抗原に対する特異性を有する２つ以上のｓｃＦｖ結合ドメインを含む二重特異性分子であることのどちらも可能にする。特に、本発明の分子は多特異性単鎖Ｆｖである場合がある。

【0121】

別の可能性が、２つの可変領域が一緒に折り重なるには短すぎるリンカーペプチド（約５個のアミノ酸）を用い、これにより、ｓｃＦＶが二量体化することを強制するｓｃＦｖを作出することである。このタイプはジアボディーとして知られている。さらにより短いリンカー（１個または２個のアミノ酸）は、三量体（いわゆるトリアボディーまたはトリボディー）の形成を引き起こす。テトラボディーもまた作製されている。それらは、それらの標的に対して、ジアボディーよりも一層大きい親和性を示す。

【0122】

二重特異性抗体フラグメントの特に好ましい一例がジアボディー（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、７７（１９９８）、７６３〜７７２）であり、これは小さい二価かつ二重特異性の抗体フラグメントである。ジアボディーは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を、同じ鎖にある２つのドメインの間における対形成を可能にするには短すぎるペプチドリンカーによってつながれる同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）における軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）につながれて含む。このことは、別の鎖の相補的なドメインとの対形成を強制し、２つの機能的な抗原結合部位を有する二量体分子の組立てを促進させる。本発明の二重特異性ジアボディーを構築するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＬＤＮ抗体のＶドメインが、ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＬＤＮ）、ＶＨ（ＣＬＤＮ）−ＶＬ（ＣＤ３）の２つの鎖を作出するために融合される場合がある。それぞれの鎖は単独では、それぞれの抗原に結合することができず、しかし、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＬＤＮ抗体の機能的な抗原結合部位を、他方の鎖と対形成したときに再形成する。この目的を達成するために、同じ鎖にある２つのドメインの間における対形成を可能にするには短すぎるペプチドリンカーが使用される。分子内二量体化のためには短すぎる重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの間のリンカーとともに、これら２つのｓｃＦｖ分子は共発現され、自己集合して、２つの結合部位を反対側に有する二重特異性分子を形成する。

【0123】

１つの実施形態において、本発明による多特異性分子は免疫グロブリンの可変ドメイン（ＶＨ、ＶＬ）および定常ドメイン（Ｃ）を含む。１つの実施形態において、二重特異性分子はミニボディーであり、好ましくは、それぞれの鎖の定常ドメイン（Ｃ）を介して互いにつながれる２つの単一のＶＨ−ＶＬ−Ｃ鎖を含むミニボディーである。この局面によれば、対応する可変重鎖領域（ＶＨ）、対応する可変軽鎖領域（ＶＬ）、および、定常ドメイン（Ｃ）が、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ（ＣＬＤＮ）−ＶＬ（ＣＬＤＮ）−（Ｃ）およびＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｃ（式中、Ｃは好ましくはＣＨ３ドメインである）の順で配置される。定常ドメインの対形成により、ミニボディーの形成がもたらされる。

【0124】

別の特に好ましい局面によれば、本発明の二重特異性の結合剤は、少なくとも２つの結合ドメインを含むか、または、少なくとも２つの結合ドメインからなり、それにより、前記ドメインの一方がＣＬＤＮに結合し、第２のドメインがＣＤ３に結合する二重特異性単鎖抗体構築物の形式である。そのような分子は、「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）」（ＢｉＴＥ）とも呼ばれるものであり（用語ＢｉＴＥは、１つのアームがＣＤ３に対して特異的である二重特異性分子を示すだけである）、リンカーペプチドを介してつながれる２つのｓｃＦｖ分子からなる。

【0125】

本明細書中で使用される場合、「二重特異性単鎖抗体」は、２つの結合ドメインを含む単一ポリペプチド鎖を意味する。それぞれの結合ドメインが抗体重鎖からの可変領域（「ＶＨ領域」）を含み、ただし、この場合、第１の結合ドメインのＶＨ領域がＣＬＤＮに特異的に結合し、第２の結合ドメインのＶＨ領域がＣＤ３に特異的に結合する。これら２つの結合ドメインは必要に応じて、短いポリペプチドスペーサーによって互いに連結される。ポリペプチドスペーサーについての限定されない一例が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ）およびその反復体である。それぞれの結合ドメインはさらに、抗体軽鎖からの１つの可変領域（「ＶＬ領域」）を含む場合があり、この場合、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインのそれぞれの内部のＶＨ領域およびＶＬ領域が、第１の結合ドメインのＶＨ領域およびＶＬ領域ならびに第２の結合ドメインのＶＨ領域およびＶＬ領域が互いに対形成することを可能にするために十分に長いポリペプチドリンカーを介して互いに連結される。

【0126】

この局面によれば、対応する可変重鎖領域（ＶＨ）および対応する可変軽鎖領域（ＶＬ）が、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ（ＣＬＤＮ）−ＶＬ（ＣＬＤＮ）−ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＤ３）の順、ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＤ３）−ＶＨ（ＣＬＤＮ）−ＶＬ（ＣＬＤＮ）の順、または、ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＬＤＮ）−ＶＨ（ＣＬＤＮ）の順で配置される。しかしながら、本発明の二重特異性単鎖抗体は、他のドメイン配置、例えば、ＶＬ（ＣＬＤＮ）−ＶＨ（ＣＬＤＮ）−ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＤ３）、ＶＬ（ＣＬＤＮ）−ＶＨ（ＣＬＤＮ）−ＶＬ（ＣＤ３）−ＶＨ（ＣＤ３）、ＶＨ（ＣＬＤＮ）−ＶＬ（ＣＬＤＮ）−ＶＬ（ＣＤ３）−ＶＨ（ＣＤ３）、ＶＬ（ＣＤ３）−ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＨ（ＣＬＤＮ）−ＶＬ（ＣＬＤＮ）、ＶＬ（ＣＤ３）−ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＬＤＮ）−ＶＨ（ＣＬＤＮ）などを含むこともまた想定される。

【0127】

長いリンカーは一般には、対応する可変重鎖領域（ＶＨ）および対応する可変軽鎖領域（ＶＬ）をつないで、ｓｃＦｖ結合ドメインをもたらし、一方、短いリンカーは一般に、２つのｓｃＦｖ結合ドメインをつなぐ。リンカーは一般に、柔軟性およびプロテアーゼ抵抗性を提供するように設計され、好ましくは、リンカーはグリシンおよび／またはセリンのアミノ酸残基を含む。短いペプチドリンカーは、１２個以下のアミノ酸から、例えば、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個または２個のアミノ酸から、好ましくは５個または６個のアミノ酸からなる場合がある。短いペプチドリンカーは好ましくは、ＳＧＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳのアミノ酸配列を含む。長いペプチドリンカーは、１２個以上のアミノ酸から、例えば、１５個〜２５個のアミノ酸または１５個〜２０個のアミノ酸または１５個〜１８個のアミノ酸からなる場合がある。長いペプチドリンカーは好ましくは、（ＧＧＧＧＳ）３またはＶＥ（ＧＧＳＧＧＳ）２ＧＧＶＤのアミノ酸配列を含む。さらなる長いペプチドリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）４、（ＧＧＧＧＳ）５またはＧＧＧＧＳ（ＧＧＳ）３ＧＧＧＳのアミノ酸配列を含む場合がある。

【0128】

本発明による結合剤はまた、当該分子の分泌を容易にするためのアミノ酸配列（例えば、Ｎ末端の分泌シグナルなど）、および／あるいは、当該分子の結合、精製または検出を容易にする１つまたは複数のエピトープタグを含む場合がある。

【0129】

好ましくは、分泌シグナルは、分泌経路の十分な通過および／または細胞外環境への結合剤の分泌を可能にするシグナル配列（例えば、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５のいずれか１つから選択されるシグナル配列）である。好ましくは、分泌シグナル配列は切断可能であり、成熟型結合剤から除かれる。分泌シグナル配列は好ましくは、結合剤が産生される細胞または生物に関して選定される。

【0130】

エピトープタグのアミノ酸配列が、結合剤のアミノ酸配列の中のどのような位置に対してでも導入される場合があり、また、コードされたタンパク質構造の内部においてループの形態を取る場合があり、あるいは、結合剤にＮ末端またはＣ末端で融合される場合がある。好ましくは、エピトープタグは結合剤にＣ末端で融合される。エピトープタグは、当該タグを結合剤から除くことを可能にする切断部位を含有する場合がある。前記エピトープタグは、天然条件および／または変性条件のもとで機能的であるどのような種類のエピトープタグであることも可能であり、好ましくはヒスチジンタグであり、最も好ましくは６個のヒスチジンを含むタグである。

【0131】

本発明の二重特異性の結合剤は、前記第１の結合メインおよび第２の結合メインに加えて、例えば、腫瘍細胞に対する選択性を高めるために役立つさらなる結合ドメインを含有する場合がある。このことを、例えば、腫瘍細胞上に発現される他の抗原に結合する結合ドメインを提供することによって達成することができる。

【0132】

本発明との関連において、作製された結合剤は好ましくは、本明細書中に記載されるような免疫エフェクター機能を誘発することができる。好ましくは、前記免疫エフェクター機能は、腫瘍関連抗原ＣＬＤＮをその表面に有する細胞に対するものである。

【0133】

用語「免疫エフェクター機能」は本発明との関連では、例えば、腫瘍の播種および転移の阻害を含めて、腫瘍成長の阻害および／または腫瘍発達の阻害をもたらす、免疫系の成分によって媒介されるどのような機能をも含む。好ましくは、免疫エフェクター機能により、腫瘍細胞の殺傷がもたらされる。そのような機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、腫瘍関連抗原を有する細胞におけるアポトーシスの誘導、腫瘍関連抗原を有する細胞の細胞溶解、および／または、腫瘍関連抗原を有する細胞の増殖の阻害を含む。結合剤はまた、ガン細胞の表面の腫瘍関連抗原に単に結合することによって影響を及ぼす場合がある。例えば、抗体は、ガン細胞の表面の腫瘍関連抗原に単に結合することによって腫瘍関連抗原の機能を阻止するか、または、アポトーシスを誘導する場合がある。

【0134】

本明細書中に記載される結合剤は治療用の成分または薬剤にコンジュゲート化される場合があり、例えば、細胞毒、薬物（例えば、免疫抑制剤）または放射性同位体などにコンジュゲート化される場合がある。細胞毒または細胞毒性剤には、細胞にとって有害であり、かつ、特に細胞を殺すどのような薬剤も含まれる。例には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド類、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにそれらのアナログおよびホモログが含まれる。コンジュゲートを形成するための好適な治療用薬剤には、下記の薬剤が含まれるが、それらに限定されない：代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびに、ｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）（シスプラチン））、アントラサイクリン系薬剤（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに、有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）。好ましい実施形態において、治療用薬剤は細胞毒性剤または放射性毒性剤である。別の実施形態において、治療用薬剤は免疫抑制剤である。さらに別の実施形態において、治療用薬剤はＧＭ−ＣＳＦである。好ましい実施形態において、治療用薬剤は、ドキソルビシン、シスプラチン、ブレオマイシン、スルファート、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミドまたはリシンＡである。

【0135】

結合剤はまた、細胞傷害性の放射性医薬品を作製するために放射性同位体（例えば、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０またはインジウム−１１１）にコンジュゲート化することができる。

【0136】

そのような治療用成分を抗体にコンジュゲート化するための様々な技術が広く知られている。例えば、Ａｒｎｏｎ他、"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ"、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄ他（編）、２４３頁〜５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ他、"Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ"、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他（編）、６２３頁〜５３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、"Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ"、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ'８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａ他（編）、４７５頁〜５０６頁（１９８５）；"Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ"、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎ他（編）、３０３頁〜１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８５）、および、Ｔｈｏｒｐｅ他、"Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ"、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２（１９８２）、１１９〜５８を参照のこと。

【0137】

用語「結合（性）」は本発明によれば、好ましくは、特異的な結合に関連する。

【0138】

本発明によれば、抗体などの剤は、所定の標的に対する著しい親和性を有し、かつ、標準的なアッセイにおいてこの所定の標的に結合するならば、この所定の標的に結合することができる。「親和性」または「結合親和性」は多くの場合、平衡解離定数（ＫＤ）によって測定される。好ましくは、用語「著しい親和性」は、１０^−５Ｍ以下、１０^−６Ｍ以下、１０^−７Ｍ以下、１０^−８Ｍ以下、１０^−９Ｍ以下、１０^−１０Ｍ以下、１０^−１１Ｍ以下または１０−１２Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）により所定の標的に結合することを示す。

【0139】

剤は、標的に対する著しい親和性を全く有さず、かつ、標準的なアッセイにおいてこの標識に有意に結合しないならば、特に、検出可能なほどに結合しないならば、この標的に（実質的に）結合することができない。好ましくは、剤は、前記標的が２μｇ／ｍｌまでの濃度で存在するならば、好ましくは１０μｇ／ｍｌまでの濃度で存在するならば、より好ましくは２０μｇ／ｍｌまでの濃度で存在するならば、特に、５０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌまたはそれ以上までの濃度で存在するならば、前記標的に検出可能なほどに結合しない。好ましくは、剤は、この剤が結合することができる所定の標的に対する結合についてのＫＤよりも少なくとも１０倍大きいＫＤにより、１００倍大きいＫＤにより、１０^３倍大きいＫＤにより、１０^４倍大きいＫＤにより、１０^５倍大きいＫＤにより、または、１０^６倍大きいＫＤにより標的に結合するならば、この標的に対する著しい親和性を有していない。例えば、剤が、この剤が結合することができる標的に結合することについてのＫＤが１０^−７Ｍであるならば、この剤が著しい親和性を全く有しない標的に対する結合についてのＫＤは、少なくとも１０^−６Ｍ、１０^−５Ｍ、１０^−４Ｍ、１０^−３Ｍ、１０^−２Ｍまたは１０^−１Ｍであろうと思われる。

【0140】

抗体などの剤は、所定の標的に結合することができ、一方で、他の標的には結合することができないならば、すなわち、著しい親和性を他の標的に対して全く有さず、かつ、標準的なアッセイにおいて他の標的に有意に結合しないならば、この所定の標的に対して特異的である。本発明によれば、剤がＣＬＤＮに結合することができ、しかし、他の標的には（実質的に）結合することができないならば、この剤はＣＬＤＮに対して特異的である。好ましくは、そのような他の標的に対する親和性および結合が、ＣＬＤＮ非関連のタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはクローディン以外の膜貫通タンパク質（例えば、ＭＨＣ分子またはトランスフェリン受容体など）あるいは何らかの他の指定されたポリペプチドなど）に対する親和性または結合を有意に超えないならば、剤はＣＬＤＮに対して特異的である。好ましくは、剤は、この剤が特異的でない標的に対する結合についてのＫＤの少なくとも１０分の１であるＫＤにより、１００分の１であるＫＤにより、１０３分の１であるＫＤにより、１０４分の１であるＫＤにより、１０５分の１であるＫＤにより、または、１０６分の１であるＫＤにより所定の標的に結合するならば、この所定の標的に対して特異的である。例えば、剤が、この剤が特異的である標的に結合することについてのＫＤが１０^−７Ｍであるならば、この剤が特異的でない標的に対する結合についてのＫＤは、少なくとも１０^−６Ｍ、１０^−５Ｍ、１０^−４Ｍ、１０^−３Ｍ、１０^−２Ｍまたは１０^−１Ｍであろうと思われる。

【0141】

標的に対する剤の結合を、いずれかの好適な方法（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ他、"Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ"、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）を参照のこと）および本明細書中に記載される方法を使用して実験的に求めることができる。親和性が、従来の技術を使用して、例えば、平衡透析などによって；ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００装置を、製造者によって概略される一般的手順を使用して使用することによって；放射能標識された標的抗原を使用する放射免疫アッセイによって；または、当業者に知られている別の方法によって容易に求められる場合がある。親和性データは、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ他（Ａｎｎ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ、５１：６６０（１９４９））の方法によって分析される場合がある。特定の抗体−抗原相互作用の測定された親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）のもとで測定されるならば、異なる可能性がある。したがって、親和性および他の抗原結合パラメーター（例えば、ＫＤ、ＩＣ５０）の測定は好ましくは、抗体および抗原の標準化された溶液ならびに標準化された緩衝液を用いて行われる。

【0142】

本明細書中で使用される場合、「イソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を示す。

【0143】

本明細書中で使用される場合、「イソタイプスイッチング」は、抗体のクラス、すなわち、抗体のイソタイプが１つのＩｇクラスから他のＩｇクラスの１つに変化する現象を示す。

【0144】

用語「天然に存在する」は、対象物に適用されるように本明細書中で使用される場合、対象物が自然界に見出され得るという事実を示す。例えば、自然界の供給源から単離することができ、かつ、実験室において人によって意図的に改変されていない、生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に存在している。

【0145】

用語「再編成された」は本明細書中で使用される場合、Ｖセグメントが、本質的には完全なＶＨドメインまたはＶＬドメインをそれぞれコードする配座でＤ−ＪセグメントまたはＪセグメントにじかに隣接して配置される重鎖免疫グロブリン遺伝子座または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の配置を示す。再編成された免疫グロブリン（抗体）遺伝子の遺伝子座を、生殖系列のＤＮＡに対する比較によって特定することができる；再編成された遺伝子座は、少なくとも１つの組み換えられたヘプタマー／ノナマー相同性エレメントを有するであろう。

【0146】

用語「再編成されていない配置」または用語「生殖系列配置」は、Ｖセグメントに関連して本明細書中で使用される場合、Ｖセグメントが、ＤセグメントまたはＪセグメントにじかに隣接しているようには組み換えられない配置を示す。

【0147】

１つの実施形態において、本発明の結合剤は、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力、すなわち、ＣＬＤＮ１８．２に存在するエピトープに結合する能力、好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２の細胞外ドメイン（特に、１番目の細胞外ループ、好ましくはＣＬＤＮ１８．２のアミノ酸位置２９〜アミノ酸位置７８）の中に位置するエピトープに結合する能力を有する。特定の実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する剤は、ＣＬＤＮ１８．１の表面に存在しないＣＬＤＮ１８．２上のエピトープに結合する。

【0148】

ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する剤は好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２には結合するが、ＣＬＤＮ１８．１には結合しない。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する剤はＣＬＤＮ１８．２に対して特異的である。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する剤は、細胞表面に発現されるＣＬＤＮ１８．２に結合する。特定の好ましい実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する剤は、生細胞の表面に存在するＣＬＤＮ１８．２の生来型エピトープに結合する。

【0149】

好ましい実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する剤は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。

【0150】

好ましい実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する剤は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0151】

ある特定の好ましい実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する剤は、下記の可能性（ｉ）〜可能性（ｉｘ）から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の組合せを含む：
（ｉ）ＶＨは、配列番号５によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号１２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｉｉ）ＶＨは、配列番号６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号１１によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｉｉｉ）ＶＨは、配列番号７によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号１３によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｉｖ）ＶＨは、配列番号９によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号１６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｖ）ＶＨは、配列番号８によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号１５によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｖｉ）ＶＨは、配列番号１０によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号１４によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｖｉｉ）ＶＨは、配列番号１０によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号１７によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｖｉｉｉ）ＶＨは、配列番号１０によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号１８によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｉｘ）ＶＨは、配列番号１０によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号１９によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。

【0152】

特に好ましい実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する剤は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の下記の組合せを含む：
ＶＨは、配列番号８によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号１５によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。

【0153】

さらなる特に好ましい実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する剤は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の下記の組合せを含む：
ＶＨは、配列番号６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号１１によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。

【0154】

用語「フラグメント」は特に、重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つまたは複数を示し、好ましくは、少なくとも、重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ３可変領域を示す。１つの実施形態において、相補性決定領域（ＣＤＲ）の前記１つまたは複数は、一組の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）から選択される。特に好ましい実施形態において、用語「フラグメント」は、重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を示す。

【0155】

１つの実施形態において、１つまたは複数のＣＤＲ、一組のＣＤＲあるいは複数組のＣＤＲの組合せを含む本明細書中に記載されるような結合剤は、前記ＣＤＲをそれらの介在フレームワーク領域と一緒に含む。好ましくは、部分はまた、１番目および４番目のフレームワーク領域のどちらかまたは両方の少なくとも約５０％を含むであろうし、ただし、前記５０％は１番目のフレームワーク領域のＣ端側５０％および４番目のフレームワーク領域のＮ端側５０％である。組換えＤＮＡ技術によって作製される結合剤の構築は、本発明の可変領域を、免疫グロブリン重鎖、他の可変ドメイン（例えば、ジアボディーの製造において）またはタンパク質標識を含むさらなるタンパク質配列につなぐためのリンカーの導入を含めて、クローニング工程または他の操作工程を容易にするために導入されるリンカーによってコードされる可変領域のＮ端側またはＣ端側の残基の導入をもたらす場合がある。

【0156】

１つの実施形態において、１つまたは複数のＣＤＲ、一組のＣＤＲあるいは複数組のＣＤＲの組合せを含む本明細書中に記載されるような結合剤は、前記ＣＤＲをヒト抗体フレームワーク内に含む。

【0157】

１つの実施形態において、本発明の結合剤は、ＣＬＤＮ６に結合する能力、すなわち、ＣＬＤＮ６に存在するエピトープに結合する能力、好ましくは、ＣＬＤＮ６の細胞外ドメイン（特に、１番目の細胞外ループ、好ましくはＣＬＤＮ６のアミノ酸位置２８〜アミノ酸位置７６、または、２番目の細胞外ループ、好ましくはＣＬＤＮ６のアミノ酸位置１４１〜アミノ酸位置１５９）の中に位置するエピトープに結合する能力を有する。特定の実施形態において、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する剤は、ＣＬＤＮ９の表面に存在しないＣＬＤＮ６上のエピトープに結合する。好ましくは、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する剤は、ＣＬＤＮ４および／またはＣＬＤＮ３の表面に存在しないＣＬＤＮ６上のエピトープに結合する。最も好ましくは、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する剤は、ＣＬＤＮ６以外のＣＬＤＮタンパク質の表面に存在しないＣＬＤＮ６上のエピトープに結合する。

【0158】

ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する剤は好ましくは、ＣＬＤＮ６には結合するが、ＣＬＤＮ９には結合せず、かつ、好ましくは、ＣＬＤＮ４および／またはＣＬＤＮ３には結合しない。好ましくは、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する剤はＣＬＤＮ６に対して特異的である。好ましくは、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する剤は、細胞表面に発現されるＣＬＤＮ６に結合する。特定の好ましい実施形態において、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する剤は、生細胞の表面に存在するＣＬＤＮ６の生来型エピトープに結合する。

【0159】

好ましい実施形態において、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する剤は、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。

【0160】

好ましい実施形態において、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する剤は、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0161】

ある特定の好ましい実施形態において、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する剤は、下記の可能性（ｉ）〜可能性（ｘｉ）から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の組合せを含む：
（ｉ）ＶＨは、配列番号２０によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号２１によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｉｉ）ＶＨは、配列番号２２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号２３によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｉｉｉ）ＶＨは、配列番号２４によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号２５によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｉｖ）ＶＨは、配列番号２６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号２７によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｖ）ＶＨは、配列番号２２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号２１によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｖｉ）ＶＨは、配列番号２２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号２８によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｖｉｉ）ＶＨは、配列番号２２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号２９によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｖｉｉｉ）ＶＨは、配列番号２２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号９７によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｉｘ）ＶＨは、配列番号２２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号９８によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｘ）ＶＨは、配列番号２２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号９９によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｘｉ）ＶＨは、配列番号２２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号１００によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。

【0162】

特に好ましい実施形態において、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する剤は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の下記の組合せを含む：
ＶＨは、配列番号２２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号２３によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。

【0163】

さらなる特に好ましい実施形態において、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する剤は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の下記の組合せを含む：
ＶＨは、配列番号２２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号９７によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。

【0164】

さらなる特に好ましい実施形態において、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する剤は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の下記の組合せを含む：
ＶＨは、配列番号２２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号９８によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。

【0165】

さらなる特に好ましい実施形態において、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する剤は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の下記の組合せを含む：
ＶＨは、配列番号２２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号９９によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。

【0166】

さらなる特に好ましい実施形態において、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する剤は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の下記の組合せを含む：
ＶＨは、配列番号２２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号１００によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。

【0167】

用語「フラグメント」は特に、重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つまたは複数を示し、好ましくは、少なくとも、重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ３可変領域を示す。１つの実施形態において、相補性決定領域（ＣＤＲ）の前記１つまたは複数は、一組の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）から選択される。特に好ましい実施形態において、用語「フラグメント」は、重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を示す。

【0168】

１つの実施形態において、１つまたは複数のＣＤＲ、一組のＣＤＲあるいは複数組のＣＤＲの組合せを含む本明細書中に記載されるような結合剤は、前記ＣＤＲをそれらの介在フレームワーク領域と一緒に含む。好ましくは、部分はまた、１番目および４番目のフレームワーク領域のどちらかまたは両方の少なくとも約５０％を含むであろうし、ただし、前記５０％は１番目のフレームワーク領域のＣ端側５０％および４番目のフレームワーク領域のＮ端側５０％である。組換えＤＮＡ技術によって作製される結合剤の構築は、本発明の可変領域を、免疫グロブリン重鎖、他の可変ドメイン（例えば、ジアボディーの製造において）またはタンパク質標識を含むさらなるタンパク質配列につなぐためのリンカーの導入を含めて、クローニング工程または他の操作工程を容易にするために導入されるリンカーによってコードされる可変領域のＮ端側またはＣ端側の残基の導入をもたらす場合がある。

【0169】

１つの実施形態において、１つまたは複数のＣＤＲ、一組のＣＤＲあるいは複数組のＣＤＲの組合せを含む本明細書中に記載されるような結合剤は、前記ＣＤＲをヒト抗体フレームワーク内に含む。

【0170】

本発明による結合剤を提供するために有用である抗ＣＤ３抗体には、ＵＣＨＴ１−ＨＳ（ヒト化ｍＡＢ）、ＵＣＨＴ１−ＭＭ（マウスｍＡＢ）、ＣＬＢ−Ｔ３、ＴＲ６６、１４５−２Ｃ１１が含まれるが、これらに限定されない。

【0171】

ＵＣＨＴ１は、ＣＤ３をヒトおよび霊長類のサンプルタイプにおいて検出するモノクローナルなＩｇＧ１抗ＣＤ３モノクローナル抗体である。ＣＬＢ−Ｔ３は、ＣＤ３抗原に対して向けられ、かつ、８０％〜９０％のヒト末梢Ｔリンパ球および髄様胸腺細胞と反応するマウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体である。ＴＲ６６は、ヒトＣＤ３のイプシロン鎖を認識するマウスＩｇＧ１モノクローナル抗ＣＤ３抗体である。１４５−２Ｃ１１は、アルメニアンハムスターのモノクローナル抗マウスＣＤ３抗体である。

【0172】

好ましくは、ＣＤ３結合ドメインのＶＨ領域およびＶＬ領域は、ＴＣＲをその生来型配置で発現する活性化された初代ヒトＴ細胞の表面に存在するような他のＴＣＲサブユニットの状況においてヒトＣＤ３を特異的に認識することができる抗体／抗体分子および抗体様分子に由来する。ＣＤ３イプシロン鎖に対して特異的な抗体に由来するＶＨ領域およびＶＬ領域が最も好ましく、前記（親）抗体は、生来型またはほぼ生来型の構造を反映するエピトープ、あるいは、ＴＣＲ複合体の状況で提示されるヒトＣＤ３の配座的エピトープと特異的に結合しなければならない。本発明の好ましい実施形態において、ＣＤ３結合ドメインのＶＨ領域およびＶＬ領域は、ＵＣＨＴ１−ＨＳ、ＵＣＨＴ１−ＭＭ、ＣＬＢ−Ｔ３およびＴＲ６６からなる群から選択されるＣＤ３特異的抗体に由来し、好ましくは、ＴＲ６６に由来する。

【0173】

好ましい実施形態において、ＣＤ３に結合する能力を有する剤は、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号９４、配列番号９５およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。

【0174】

好ましい実施形態において、ＣＤ３に結合する能力を有する剤は、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号９６およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0175】

ある特定の好ましい実施形態において、ＣＤ３に結合する能力を有する剤は、下記の可能性（ｉ）〜可能性（ｉｘ）から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の組合せを含む：
（ｉ）ＶＨは、配列番号３０によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号３１によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｉｉ）ＶＨは、配列番号３２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号３３によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｉｉｉ）ＶＨは、配列番号３４によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号３４によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｉｖ）ＶＨは、配列番号３６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号３７によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｖ）ＶＨは、配列番号９４によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号３７によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｖｉ）ＶＨは、配列番号９５によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号３７によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｖｉｉ）ＶＨは、配列番号３６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号９６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｖｉｉｉ）ＶＨは、配列番号９４によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号９６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む；
（ｉｘ）ＶＨは、配列番号９５によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号９６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。

【0176】

特に好ましい実施形態において、ＣＤ３に結合する能力を有する剤は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の下記の組合せを含む：
ＶＨは、配列番号３６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号３７によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。

【0177】

さらなる特に好ましい実施形態において、ＣＤ３に結合する能力を有する剤は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の下記の組合せを含む：
ＶＨは、配列番号９４によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号３７によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。

【0178】

さらなる特に好ましい実施形態において、ＣＤ３に結合する能力を有する剤は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の下記の組合せを含む：
ＶＨは、配列番号９５によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、ＶＬは、配列番号９６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。

【0179】

用語「フラグメント」は特に、重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つまたは複数を示し、好ましくは、少なくとも、重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ３可変領域を示す。１つの実施形態において、相補性決定領域（ＣＤＲ）の前記１つまたは複数は、一組の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）から選択される。特に好ましい実施形態において、用語「フラグメント」は、重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を示す。

【0180】

１つの実施形態において、１つまたは複数のＣＤＲ、一組のＣＤＲあるいは複数組のＣＤＲの組合せを含む本明細書中に記載されるような結合剤は、前記ＣＤＲをそれらの介在フレームワーク領域と一緒に含む。好ましくは、部分はまた、１番目および４番目のフレームワーク領域のどちらかまたは両方の少なくとも約５０％を含むであろうし、ただし、前記５０％は１番目のフレームワーク領域のＣ端側５０％および４番目のフレームワーク領域のＮ端側５０％である。組換えＤＮＡ技術によって作製される結合剤の構築は、本発明の可変領域を、免疫グロブリン重鎖、他の可変ドメイン（例えば、ジアボディーの製造において）またはタンパク質標識を含むさらなるタンパク質配列につなぐためのリンカーの導入を含めて、クローニング工程または他の操作工程を容易にするために導入されるリンカーによってコードされる可変領域のＮ端側またはＣ端側の残基の導入をもたらす場合がある。

【0181】

１つの実施形態において、１つまたは複数のＣＤＲ、一組のＣＤＲあるいは複数組のＣＤＲの組合せを含む本明細書中に記載されるような結合剤は、前記ＣＤＲをヒト抗体フレームワーク内に含む。

【0182】

本発明によれば、ＣＬＤＮ１８．２を標的化する好ましい結合剤は、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその変化体を含む。

【0183】

本発明によれば、ＣＬＤＮ１８．２を標的化するさらなる好ましい結合剤は、配列番号１０３、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２および配列番号９３からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいはそのフラグメントまたは変化体を含む。１つの実施形態において、前記アミノ酸配列は、分泌シグナル、例えば、Ｎ末端の分泌シグナルなど、具体的には、分泌シグナルが存在するならば、配列番号５１による配列を欠いており、かつ／または、Ｈｉｓタグ、例えば、Ｃ末端のＨｉｓタグなど、具体的には、Ｈｉｓタグが存在するならば、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｈｉｓ）_６または配列（Ｈｉｓ）_６を欠いている。

【0184】

本発明によれば、ＣＬＤＮ６を標的化する好ましい結合剤は、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその変化体を含む。

【0185】

本発明によれば、ＣＬＤＮ６を標的化するさらなる好ましい結合剤は、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４および配列番号６５からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいはそのフラグメントまたは変化体を含む。１つの実施形態において、前記アミノ酸配列は、分泌シグナル、例えば、Ｎ末端の分泌シグナルなど、具体的には、分泌シグナルが存在するならば、配列番号５１による配列を欠いており、かつ／または、Ｈｉｓタグ、例えば、Ｃ末端のＨｉｓタグなど、具体的には、Ｈｉｓタグが存在するならば、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｈｉｓ）_６または配列（Ｈｉｓ）_６を欠いている。

【0186】

本明細書中に記載される結合剤は、当該剤をコードする核酸（例えば、ＲＮＡなど）を投与することによって、および／または、当該剤をコードする核酸（例えば、ＲＮＡなど）を含む宿主細胞を投与することによって患者に送達される場合があることを理解しなければならない。したがって、結合剤をコードする核酸は、患者に投与されたときには、ネイクド形態で、あるいは、好適な送達ビヒクルにおいて、例えば、リポソームまたはウイルス粒子などの形態で、すなわち、宿主細胞の中に存在する場合がある。提供される核酸は、上記剤を、治療用抗体（特に、二重特異性抗体）については少なくとも部分的に観測される不安定性を軽減する持続した様式で長期間にわたって産生することができる。患者に送達されるための核酸は組換え手段によって作製することができる。核酸が、宿主細胞内に存在することなく、患者に投与されるならば、核酸は好ましくは、核酸によってコードされる結合剤の発現のために患者の細胞によって取り込まれる。核酸が、宿主細胞内に存在しながら、患者に投与されるならば、核酸は好ましくは、核酸によってコードされる結合剤を産生するように患者体内の宿主細胞によって発現される。

【0187】

用語「組換え」は本発明との関連では、「遺伝子操作により作製された」ことを意味する。好ましくは、「組換え物」、例えば、本発明との関連での組換え核酸などは、天然に存在していない。

【0188】

用語「天然に存在する」は本明細書中で使用される場合、対象物が自然界に見出され得るという事実を示す。例えば、生物（ウイルスを含む）に存在しており、自然界の供給源から単離することができ、かつ、実験室において人によって意図的に改変されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在している。

【0189】

用語「核酸」は本明細書中で使用される場合、ＤＮＡおよびＲＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え産生された分子および化学合成された分子などを含むことが意図される。核酸が一本鎖または二本鎖である場合がある。ＲＮＡには、インビトロ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）または合成ＲＮＡが含まれる。

【0190】

核酸がベクターに含まれる場合がある。用語「ベクター」は、本明細書中で使用される場合、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター（例えば、ラムダファージなど）、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクターまたはバキュロウイルスベクターなど）または人工染色体ベクター（例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）またはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）など）を含めて、当業者に知られているどのようなベクターをも包含する。前記ベクターには、発現ベクター、同様にまた、クローニングベクターが含まれる。発現ベクターは、プラスミド、同様にまた、ウイルスベクターを含み、一般には、所望されるコード配列、および、機能的に連結されたコード配列を特定の宿主細胞（例えば、細菌、酵母、植物、昆虫または哺乳動物）において、または、インビトロ発現系において発現させるために必要である適切なＤＮＡ配列を含有する。クローニングベクターは、ある特定の所望されるＤＮＡフラグメントを操作するために、また、増幅するために一般に使用されており、所望されるＤＮＡフラグメントの発現のために必要とされる機能的な配列を欠いている場合がある。

【0191】

本発明との関連において、用語「ＲＮＡ」は、リボヌクレオチド残基を含む分子、好ましくは、リボヌクレオチド残基から全体が構成されるか、または実質的に構成される分子に関連する。「リボヌクレオチド」は、ヒドロキシル基をβ−Ｄ−リボフラノシル基の２'位に有するヌクレオチドに関連する。この用語には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ（例えば、部分精製されたＲＮＡなど）、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え産生されたＲＮＡ、同様にまた、１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変化によって天然に存在するＲＮＡとは異なる改変されたＲＮＡが含まれる。そのような変化は、非ヌクレオチド物質の付加で、例えば、ＲＮＡの末端への付加、あるいは、内部における、例えば、ＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチドにおける付加などを含むことができる。ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドはまた、非標準的なヌクレオチドを含むことができ、例えば、天然に存在しないヌクレオチドあるいは化学合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどを含むことができる。これらの変化したＲＮＡは、アナログまたは天然に存在するＲＮＡのアナログとして示すことができる。

【0192】

本発明によれば、用語「ＲＮＡ」は、「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、かつ、ＤＮＡをテンプレートして使用して産生させられる場合があり、ペプチドまたはタンパク質をコードする「転写物」に関連する「ｍＲＮＡ」を包含し、好ましくは、そのような「ｍＲＮＡ」に関連する。ｍＲＮＡは典型的には、５'非翻訳領域（５'−ＵＴＲ）、タンパク質またはペプチドのコード領域、および、３'非翻訳領域（３'−ＵＴＲ）を含む。ｍＲＮＡは細胞内およびインビトロでは限定された半減時間を有する。好ましくは、ｍＲＮＡは、ＤＮＡテンプレートを使用するインビトロ転写によって産生させられる。本発明の１つの実施形態において、ＲＮＡがインビトロ転写または化学合成によって得られる。インビトロ転写方法論は当業者には知られている。例えば、市販されている様々なインビトロ転写キットが存在する。

【0193】

本発明の１つの実施形態において、ＲＮＡは自己複製ＲＮＡであり、例えば、一本鎖の自己複製ＲＮＡなどである。１つの実施形態において、自己複製ＲＮＡは、プラス・センスの一本鎖ＲＮＡである。１つの実施形態において、自己複製ＲＮＡはウイルスＲＮＡまたはウイルスＲＮＡ由来のＲＮＡである。１つの実施形態において、自己複製ＲＮＡはアルファウイルスのゲノムＲＮＡであり、または、アルファウイルスのゲノムＲＮＡに由来する。１つの実施形態において、自己複製ＲＮＡはウイルス遺伝子発現ベクターである。１つの実施形態において、ウイルスはセムリキ森林ウイルスである。１つの実施形態において、自己複製ＲＮＡは１つまたは複数の導入遺伝子を含有し、ただし、この場合、前記導入遺伝子の少なくとも１つが、本明細書中に記載される結合剤をコードする。１つの実施形態において、ＲＮＡがウイルスＲＮＡまたはウイルスＲＮＡ由来であるならば、導入遺伝子は部分的または完全にウイルス配列（例えば、構造タンパク質をコードするウイルス配列など）に取って代わる場合がある。１つの実施形態において、自己複製ＲＮＡは、インビトロ転写されたＲＮＡである。

【0194】

アルファウイルスのゲノムは、大きいポリタンパク質のための２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするプラス・センスの一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ（＋））である。ゲノムの５'末端におけるＯＲＦは非構造タンパク質のｎＳＰ１〜ｎＳＰ４（ｎｓＰ１〜ｎｓＰ４）をコードしており、これらはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）に翻訳およびプロセシングされる；３'末端におけるＯＲＦは、構造タンパク質、すなわち、キャプシドおよび糖タンパク質をコードする。両方のＯＲＦは、この構造的ＯＲＦの転写を支配するいわゆるサブゲノムプロモーター（ＳＧＰ）によって隔てられている。遺伝子ベクターとして利用されるとき、ＳＧＰの後に続く構造タンパク質は一般には、導入遺伝子によって置き換えられる。そのようなベクターをウイルス粒子にパッケージングするために、構造タンパク質は一般に、ヘルパー構築物からトランスで発現される。アルファウイルスは、もっぱらＲＮＡレベルで感染細胞の細胞質において複製する。感染後、ｓｓＲＮＡ（＋）ゲノムが、ウイルスの生活環の初期段階では自己タンパク質分解的にｎｓＰ１２３およびｎｓＰ４のフラグメントにプロセシングされるｎｓＰ１２３４ポリタンパク質前駆体の翻訳のためのｍＲＮＡとして作用する。ｎｓＰ１２３およびｎｓＰ４のフラグメントは、（−）鎖のＲＮＡをゲノムＲＮＡテンプレートから転写する（−）鎖レプリカーゼ複合体を形成する。後期段階において、ｎｓＰ１２３４ポリタンパク質は、新しい（＋）鎖ゲノム、同様にまた、構造タンパク質または導入遺伝子をコードするサブゲノム転写物を合成する（＋）鎖レプリカーゼ複合体に集合する個々のタンパク質に完全に切断される。サブゲノムＲＮＡは、新しいゲノムＲＮＡと同様に、キャップ化およびポリアデニル化を受け、したがって、標的細胞感染後、ｍＲＮＡとして認識される。新しいゲノムＲＮＡのみが、出芽中のビリオンへのゲノムＲＮＡの排他的パッケージングを保証するパッケージングシグナルを含有する。ベクトロロジー（ｖｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙ）のためのアルファウイルスレプリコンの魅力は、キャップ化およびポリアデニル化を受けたＲＮＡゲノムがプラス配向であることに基づいている。翻訳可能なレプリコンＲＮＡを容易にインビトロ合成することができ、それにより、キャップ化が、インビトロ転写反応に加えられるキャップアナロガ（ｃａｐ−ａｎａｌｏｇａ）により達成される場合があり、また、ポリＡテールがプラスミドテンプレートにおいてポリＴ連続としてコードされる場合がある。インビトロ転写（ＩＶＴ）されたレプリコンは従来のトランスフェクション技術によってトランスフェクションされ、少量の開始時のＩＶＴ ＲＮＡでさえ迅速に増やされる。移入後数時間以内に、ＳＧＰの下流側に置かれている導入遺伝子が細胞あたり約４０．０００コピー〜２００．０００コピーのサブゲノムＲＮＡの非常に多数のコピー数にまで転写され、したがって、組換えタンパク質が強く発現されることは驚くべきことではない。具体的な目的に依存して、ＩＶＴレプリコンは標的細胞内に直接にトランスフェクションされる場合があり、または、構造遺伝子をトランスで提供するヘルパーベクターと一緒にアルファウイルス粒子内にパッケージングされる場合がある。皮膚内または筋肉内への移入により、大きい持続した局所的発現がもたらされ、この場合、これには、体液性免疫応答および細胞性免疫応答の強い誘導が並行する。

【0195】

本発明に従って使用されるＲＮＡの発現および／または安定性を増大させるために、ＲＮＡは改変される場合があり、好ましくは、発現されたペプチドまたはタンパク質の配列を変化させることなく改変される場合がある。

【0196】

用語「改変された」は、本発明に従って使用されるようなＲＮＡとの関連では、前記ＲＮＡに天然には存在していないＲＮＡのどのような改変をも包含する。

【0197】

本発明の１つの実施形態において、本発明に従って使用されるＲＮＡは、キャップ化されていない５'−三リン酸を有していない。そのようなキャップ化されていない５'−三リン酸の除去を、ＲＮＡをホスファターゼにより処理することによって達成することができる。

【0198】

本発明によるＲＮＡは、その安定性を増大させるために、および／または、細胞毒性を低下させるために、改変された天然に存在するリボヌクレオチドまたは合成リボヌクレオチドを有する場合がある。例えば、１つの実施形態において、本発明に従って使用されるＲＮＡでは、５−メチルシチジンが、部分的または完全に、好ましくは完全に、シチジンに代わって使用される。代替において、または、加えて、１つの実施形態において、本発明に従って使用されるＲＮＡでは、プソイドウリジンが、部分的または完全に、好ましくは完全に、ウリジンに代わって使用される。

【0199】

１つの実施形態において、用語「改変」は、ＲＮＡに５'−キャップまたは５'−キャップアナログを与えることに関連する。用語「５'−キャップ」は、ｍＲＮＡ分子の５'末端に見出されるキャップ構造を示し、一般には、普通でない５'から５'へのリン酸連結を介してｍＲＮＡにつながれるグアノシンヌクレオチドからなる。１つの実施形態において、このグアノシンは７位がメチル化される。用語「従来の５'−キャップ」は、天然に存在するＲＮＡの５'−キャップを示し、好ましくは７−メチルグアノシンキャップ（ｍ７Ｇ）を示す。本発明との関連において、用語「５'−キャップ」には、ＲＮＡキャップ構造に似ており、かつ、ＲＮＡに付け加えられるならば、好ましくは生体内および／または細胞内においてＲＮＡを安定化する能力を有するように改変される５'−キャップアナログが含まれる。

【0200】

ＲＮＡに５'−キャップまたは５'−キャップアナログを与えることが、前記５'−キャップまたは５'−キャップアナログの存在下におけるＤＮＡテンプレートのインビトロ転写によって達成される場合があり、ただし、この場合、前記５'−キャップは、生じたＲＮＡ鎖に共転写により取り込まれるか、または、ＲＮＡが、例えば、インビトロ転写によって生じる場合があり、そして、５'−キャップが、キャッピング酵素を使用して、例えば、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して転写後にＲＮＡに付け加えられる場合がある。

【0201】

ＲＮＡはさらなる改変を含む場合がある。例えば、本発明において使用されるＲＮＡのさらなる改変が、天然に存在するポリ（Ａ）テールの伸長または短縮化、あるいは、５'側または３'側の非翻訳領域（ＵＴＲ）の変化、例えば、前記ＲＮＡのコード領域に関連しないＵＴＲの導入など、例えば、グロビン遺伝子（例えば、アルファ２−グロビン、アルファ１−グロビン、ベータ−グロビンなど、好ましくはベータ−グロビン、より好ましくはヒトベータ−グロビン）に由来する３'−ＵＴＲの１コピーまたは複数コピーの挿入、好ましくは２コピーの挿入である場合がある。

【0202】

したがって、本発明に従って使用されるＲＮＡの安定性および／または発現を増大させるために、ＲＮＡは、ポリＡ配列と併せて存在するように、好ましくは１０個〜５００個のアデノシン残基を有するポリＡ配列、より好ましくは３０個〜３００個のアデノシン残基を有するポリＡ配列、一層より好ましくは６５個〜２００個のアデノシン残基を有するポリＡ配列、とりわけ１００個〜１５０個のアデノシン残基を有するポリＡ配列と併せて存在するように改変される場合がある。とりわけ好ましい実施形態において、ポリＡ配列は、およそ１２０個のアデノシン残基の長さを有する。加えて、２つ以上の３'非翻訳領域（ＵＴＲ）をＲＮＡ分子の３'非翻訳領域に組み込むことにより、翻訳効率における強化をもたらすことができる。１つの特定の実施形態において、３'−ＵＴＲはヒトβ−グロビン遺伝子に由来する。

【0203】

好ましくは、ＲＮＡは、細胞（特に、生体内に存在する細胞）に送達されるならば、すなわち、細胞（特に、生体内に存在する細胞）の中にトランスフェクションされるならば、ＲＮＡによってコードされるタンパク質、ペプチドまたは抗原を発現する。

【0204】

用語「トランスフェクション」は、核酸（特に、ＲＮＡ）を細胞に導入することに関連する。本発明の目的のために、用語「トランスフェクション」はまた、細胞内への核酸の導入、または、そのような細胞による核酸の取り込みを包含し、ただし、この場合、細胞は被験体（例えば、患者）に存在する場合がある。したがって、本発明によれば、本明細書中に記載される核酸のトランスフェクションのための細胞はインビトロまたはインビボにおいて存在することができ、例えば、細胞は、患者の器官、組織および／または有機体の一部を形成することができる。本発明によれば、トランスフェクションは一過性または安定的であることが可能である。トランスフェクションのいくつかの適用のために、トランスフェクションは、トランスフェクションされた遺伝物質が一過性にだけ発現されるならば、十分である。トランスフェクションプロセスで導入される核酸は通常、核ゲノムには組み込まれないので、外来核酸は有糸分裂を介して希釈されることになるか、または分解されることになる。核酸のエピソーム増幅を可能にする細胞では、希釈速度が大きく低下する。トランスフェクションされた核酸が実際に細胞およびその娘細胞のゲノムに留まることが所望されるならば、安定的なトランスフェクションが生じなければならない。ＲＮＡを、そのコードされたタンパク質を一過性に発現させるために細胞にトランスフェクションすることができる。

【0205】

ＲＮＡの用語「安定性」はＲＮＡの「半減期」に関連する。「半減期」は、分子の活性、量または数の半分を除くために必要とされる期間に関連する。本発明との関連では、あるＲＮＡの半減期は、前記ＲＮＡの安定性について示すものである。ＲＮＡの半減期は、当該ＲＮＡの「発現の持続期間」に影響を与える場合がある。長い半減期を有するＲＮＡは長期間にわたって発現されるであろうことが予想され得る。

【0206】

本発明との関連では、用語「転写」は、ＤＮＡ配列における遺伝暗号がＲＮＡに転写されるプロセスに関連する。続いて、そのＲＮＡはタンパク質に翻訳される場合がある。本発明によれば、用語「転写」は「インビトロ転写」を含み、ただし、この場合、用語「インビトロ転写」は、ＲＮＡ（特に、ｍＲＮＡ）が、無細胞系において、好ましくは、適切な細胞抽出物を使用してインビトロ合成されるプロセスに関連する。好ましくは、様々なクローニングベクターが転写物の生成のために適用される。これらのクローニングベクターは転写ベクターとして一般には示され、本発明によれば、用語「ベクター」によって包含される。

【0207】

用語「翻訳」は本発明によれば、メッセンジャーＲＮＡの鎖が、ペプチドまたはタンパク質を作製するためのアミノ酸の配列の組立てを導く細胞のリボソームにおけるプロセスに関連する。

【0208】

用語「発現」はその最も一般的な意味で本発明に従って使用され、ＲＮＡおよび／またはペプチドもしくはタンパク質を、例えば、転写および／または翻訳によって生じさせることを含む。ＲＮＡに関して、用語「発現」または用語「翻訳」は、特にペプチドまたはタンパク質を生じさせることに関連する。用語「発現」または用語「翻訳」はまた、核酸の部分的な発現を含む。そのうえ、発現は一過性または安定的であることが可能である。本発明によれば、発現の用語にはまた、「正常から外れた発現」または「正常でない発現」が含まれる。

【0209】

「正常から外れた発現」または「正常でない発現」は、本発明によれば、発現が、参照と比較して、例えば、ある特定のタンパク質（例えば、腫瘍抗原）の正常から外れた発現または正常でない発現に伴う疾患を有しない被験体における状態と比較して変化していること、好ましくは増大していることを意味する。発現における増大は、少なくとも１０％の増大を示し、特に、少なくとも２０％、少なくとも５０％または少なくとも１００％あるいはそれ以上の増大を示す。１つの実施形態において、発現は患部組織において見出されるだけであり、一方、健康な組織における発現は抑制されている。

【0210】

用語「特異的に発現される」は、タンパク質が特定の組織または器官において本質的に発現されるだけであることを意味する。例えば、胃粘膜において特異的に発現される腫瘍抗原は、前記タンパク質が主として胃粘膜において発現され、他の組織では発現されないか、あるいは、他の組織タイプまたは器官タイプでは顕著な程度に発現されないことを意味する。したがって、胃粘膜の細胞においてもっぱら発現され、かつ、どのような組織であれ、他の組織（例えば、精巣）では有意により少ない程度に発現されるタンパク質は、胃粘膜の細胞において特異的に発現される。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原はまた、２つ以上の組織タイプまたは器官において、例えば、２つまたは３つの組織タイプまたは器官において、しかし、好ましくは、３つを超えない異なる組織タイプまたは器官タイプにおいて正常な状態のもとで特異的に発現される場合がある。この場合において、腫瘍抗原はその場合にはこれらの器官において特異的に発現される。例えば、腫瘍抗原が、正常な状態のもと、肺および胃において、好ましくはおよそ等しい程度に発現されるならば、前記腫瘍抗原は肺および胃において特異的に発現される。

【0211】

本発明によれば、用語「ＲＮＡエンコーディング」は、ＲＮＡが適切な環境に存在するならば、好ましくは細胞内に存在するならば、ＲＮＡが、ＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドを産生するように発現され得ることを意味する。

【0212】

本発明のいくつかの局面は、核酸（例えば、本明細書中に記載される結合剤をコードするＲＮＡなど）によりインビトロでトランスフェクションされ、そして、低い前駆体頻度から臨床的に妥当な細胞数へのエクスビボ拡大の後であることが好ましいが、レシピエント（例えば、患者など）に移される宿主細胞の養子移入に依拠する。本発明による処置のために使用される宿主細胞は、処置されたレシピエントに対して自己、同種または同系である場合がある。

【0213】

用語「自己（の）」は、どのようなものであれ、同じ被験体に由来するものを表すために使用される。例えば、「自己移植片」は、同じ被験体に由来する組織または器官の移植片を示す。そのような手順は、他の場合には拒絶を生じさせる免疫学的バリアを克服するので、好都合である。

【0214】

用語「同種（の）」は、どのようなものであれ、同じ種の異なる個体に由来するものを表すために使用される。２つ以上の個体は、１つまたは複数の遺伝子座における遺伝子が同一でないときには互いに同種であると言われる。

【0215】

用語「同系（の）」は、どのようなものであれ、同一の遺伝子型を有する個体または組織に由来するもの、すなわち、同一の双子または同じ近交系統の動物あるいはそれらの組織に由来するものを表すために使用される。

【0216】

用語「異種（の）」は、多数の異なる要素からなる何かを表すために使用される。一例として、ある個体の骨髄を異なる個体に移すことは、異種移植を構成する。異種遺伝子は、被験体以外の供給源に由来する遺伝子である。

【0217】

用語「ペプチド」は本発明によれば、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、２個以上、好ましくは３個以上、好ましくは４個以上、好ましくは６個以上、好ましくは８個以上、好ましくは９個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１６個以上、好ましくは２１個以上で、好ましくは８個までのアミノ酸、１０個までのアミノ酸、２０個までのアミノ酸、３０個までのアミノ酸、４０個までのアミノ酸または５０個までのアミノ酸、特に１００個までのアミノ酸がペプチド結合による共有結合によって連結されて含まれる物質を示す。用語「タンパク質」は、大きいペプチドを示し、好ましくは、１００個を超えるアミノ酸残基を有するペプチドを示し、しかし、一般には、用語「ペプチド」および用語「タンパク質」は同義的であり、本明細書中では交換可能に使用される。

【0218】

特定のアミノ酸配列（例えば、配列表に示されるアミノ酸配列）に関して本明細書中において与えられる教示は、前記特定の配列と機能的に同等である配列をもたらす前記特定の配列の変化体、例えば、特定のアミノ酸配列の性質と同一であるか、または、特定のアミノ酸配列の性質に類似する性質を示すアミノ酸配列にもまた関連するように解釈されなければならない。１つの重要な性質は、標的に対する結合を保持すること、または、エフェクター機能を持続することである。好ましくは、特定の配列に関して変化体である配列は、その配列が抗体における特定の配列に取って代わるとき、前記抗体がＣＬＤＮおよび／またはＣＤ３に結合すること、ならびに、好ましくは、本明細書中に記載されるような前記抗体の機能、例えば、ＣＤＣ媒介溶解またはＡＤＣＣ媒介溶解を保持する。

【0219】

例えば、配列表に示される配列は、１つまたは複数のフリーのシステイン残基を、好ましくはすべてのフリーのシステイン残基を、特にこれらのシステイン残基をシステイン以外のアミノ酸によって置換することによって、好ましくは、セリン、アラニン、トレオニン、グリシン、チロシン、ロイシンまたはメチオニンによって置換することによって、最も好ましくはアラニンまたはセリンによって置換することによって除くように改変することができる。例えば、配列表の配列番号３６に示される配列の１０３位におけるシステイン、または、前記配列を含む配列における対応するシステインが、このように改変される場合がある。このように改変することができるさらなるシステインは、配列番号４２の１７８位におけるシステイン、配列番号４３の１９７位におけるシステイン、配列番号４４の４２７位におけるシステイン、または、配列番号４５の４４６位におけるシステインである。

【0220】

特に、ＣＤＲ領域、超可変領域および可変領域の配列が、ＣＬＤＮおよび／またはＣＤ３に結合する能力を失うことなく改変され得ることが、当業者によって理解されるであろう。例えば、ＣＤＲ領域は、本明細書中で指定される抗体の領域と同一であるか、または非常に相同的であるかのどちらかであろう。「非常に相同的」によって、１つ〜５つの置換、好ましくは、１つ〜４つの置換、例えば、１つ〜３つの置換、あるいは、１つまたは２つの置換などがＣＤＲにおいてなされる場合があることが意図される。加えて、超可変領域および可変領域が、本明細書中に具体的に開示される抗体の領域との実質的な相同性を示すように改変される場合がある。

【0221】

本発明の目的のために、アミノ酸配列の「変化体」は、アミノ酸挿入変化体、アミノ酸付加変化体、アミノ酸欠失変化体および／またはアミノ酸置換変化体を含む。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端における欠失を含むアミノ酸欠失変化体はまた、Ｎ末端短縮変化体および／またはＣ末端短縮変化体と呼ばれる。

【0222】

アミノ酸挿入変化体は、特定のアミノ酸配列における１個だけまたは２個以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変化体の場合、１つまたは複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列における特定の部位に挿入され、だが、生じた生成物の適切なスクリーニングを伴うランダム挿入もまた可能である。

【0223】

アミノ酸付加変化体は、１つまたは複数のアミノ酸（例えば、１個、２個、３個、５個、１０個、２０個、３０個、５０個またはそれ以上のアミノ酸など）のアミノ末端融合体および／またはカルボキシ末端融合体を含む。

【0224】

アミノ酸欠失変化体は、配列からの１つまたは複数のアミノ酸の除去によって、例えば、１個、２個、３個、５個、１０個、２０個、３０個、５０個またはそれ以上のアミノ酸の除去によって特徴づけられる。欠失はタンパク質のどのような位置であってもよい。

【0225】

アミノ酸置換変化体は、配列における少なくとも１つの残基が除かれ、別の残基がその場所に挿入されることによって特徴づけられる。改変が、相同的なタンパク質またはペプチドの間において保存されていないアミノ酸配列内の位置にあること、ならびに／あるいは、アミノ酸を、類似する性質を有する他のアミノ酸により置換することが好ましい。好ましくは、タンパク質変化体におけるアミノ酸変化は保存的なアミノ酸変化であり、すなわち、類似する荷電アミノ酸または非荷電アミノ酸を代わりに使用するものである。保存的なアミノ酸変化は、それらの側鎖において関連づけられるアミノ酸のファミリーのアミノ酸の置換を伴う。天然に存在するアミノ酸は一般には、下記の４つのファミリーに分けられる：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）および非荷電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンはときには、一緒にして芳香族アミノ酸として分類される。

【0226】

好ましくは、与えられたアミノ酸配列と、前記与えられたアミノ酸配列の変化体であるアミノ酸配列との間における類似性の程度、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であろう。類似性または同一性の程度は好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％であるアミノ酸領域について与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００アミノ酸からなるならば、類似性または同一性の程度は好ましくは、少なくとも約２０個、少なくとも約４０個、少なくとも約６０個、少なくとも約８０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１６０個、少なくとも約１８０個、または、約２００個のアミノ酸（好ましくは連続するアミノ酸）について与えられる。好ましい実施形態において、類似性または同一性の程度は参照アミノ酸配列の全長について与えられる。配列類似性を求めるためのアラインメントを、好ましくは、配列同一性を求めるためのアラインメントを、この技術分野で知られているツールを用いて、好ましくは、最良配列アライメントを使用して、例えば、Ａｌｉｇｎを使用して行うことができ、この場合、標準的な設定が使用され、好ましくは、ＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５が使用される。

【0227】

「配列類似性」は、同一であるアミノ酸、または、保存的なアミノ酸置換を表すアミノ酸のどちらであっても、これらのアミノ酸の百分率を示す。２つのアミノ酸配列の間における「配列同一性」は、配列間において同一であるアミノ酸の百分率を示す。

【0228】

用語「百分率同一性」は、最良アライメントの後で得られる、比較されるべき２つの配列の間において同一であるアミノ酸残基の百分率を意味することが意図され、ただし、この百分率は純粋に統計学的であり、これら２つの配列の間における違いが、ランダムに、かつ、それらの全長にわたって分布する。２つのアミノ酸配列の間における配列比較は従来的には、これらの配列を最適にアラインメントした後でこれらの配列を比較することによって行われ、ただし、この場合、前記比較は、配列類似性の局所的領域を特定し、比較するためにセグメントによって、または、「比較の窓」によって行われる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手作業によって行われるほかに、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１、Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．、２、４８２）の局所的相同性アルゴリズムによって、ＮｅｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８、４４３）の局所的相同性アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、２４４４）の類似性検索法によって、または、これらのアルゴリズムを使用するコンピュータープログラム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、および、ＴＦＡＳＴＡ、これらは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）に含まれる）によってもたらされる場合がある。

【0229】

百分率同一性は、比較されている２つの配列の間における同一位置の数を求め、この数を比較された位置の数によって除し、そして、得られた結果を１００倍して、これら２つの配列の間における百分率同一性を得るようにすることによって計算される。

【0230】

本発明の結合剤は細胞内に（例えば、細胞質ゾルにおいて、ペリプラズマ（ｐｅｒｉｐｌａｓｍａ）において、または、封入体で）生成させ、その後、宿主細胞から単離し、必要な場合にはさらに精製することができるか、あるいは、本発明の結合剤は細胞外に（例えば、宿主細胞が培養される培地に）生成させ、その後、培養培地から単離し、必要な場合にはさらに精製することができる。ポリペプチドの組換え産生のために使用される様々な方法および試薬、例えば、具体的な好適な発現ベクター、形質転換方法またはトランスフェクション方法、選択マーカー、タンパク質発現の誘導方法および培養条件などがこの技術分野において知られている。同様に、様々なタンパク質単離技術およびタンパク質精製技術が当業者には広く知られている。

【0231】

用語「細胞」または用語「宿主細胞」は好ましくは、無傷な細胞、すなわち、その正常な細胞内成分（例えば、酵素、オルガネラまたは遺伝物質など）を放出していない無傷の膜を有する細胞に関連する。無傷の細胞は好ましくは、生存可能な細胞、すなわち、その正常な代謝機能を行うことができる生細胞である。好ましくは、前記用語は本発明によれば、外因性核酸によりトランスフェクションすることができるどのような細胞にも関連する。好ましくは、細胞は、外因性核酸によりトランスフェクションされ、レシピエントに移されたとき、当該核酸をレシピエントにおいて発現することができる。用語「細胞」には、細菌細胞が含まれる；他の有用な細胞は、酵母細胞、真菌細胞または哺乳動物細胞である。好適な細菌細胞には、グラム陰性細菌菌株、例えば、大腸菌、プロテウス属およびシュードモナス属の菌株など、ならびに、グラム陽性細菌菌株、例えば、バシラス属、ストレプトミセス属、ブドウ球菌属およびラクトコッカス属の菌株などに由来する細胞が含まれる。好適な真菌細胞には、トリコデルマ属、アカパンカビ属およびアスペルギルス属の種に由来する細胞が含まれる。好適な酵母細胞には、サッカロミセス属の種（例えば、サッカロミセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、シゾサッカロミセス属の種（例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏ ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ））、ピキア属の種（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびピキア・メタノリクド（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｄ））およびハンセヌラ属の種に由来する細胞が含まれる。好適な哺乳動物細胞には、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３ＨＥＫなどが含まれる。しかしながら、異種タンパク質の発現のためにこの技術分野において使用される両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞およびどのような他の細胞も同様に使用することができる。哺乳動物細胞が養子移入のために特に好ましい（例えば、ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギおよび霊長類に由来する細胞など）。細胞は、非常に多くの組織タイプに由来する場合があり、初代細胞および細胞株、例えば、免疫系の細胞、特に、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびＴ細胞など）、幹細胞（例えば、造血幹細胞および間葉系幹細胞など）および他の細胞タイプなどを包含する。抗原提示細胞は、抗原をその表面において主要組織適合遺伝子複合体の状況で呈示する細胞である。Ｔ細胞は、この複合体を、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用して認識する場合がある。

【0232】

「減少させる」、「低下させる」または「阻害する」は本明細書中で使用される場合、レベルにおける、例えば、発現のレベルにおける、または、細胞の増殖のレベルにおける、好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上の全体的な低下、あるいは、そのような全体的な低下を生じさせることができることを意味する。

【0233】

「増大させる」または「高める」などの用語は好ましくは、約少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、一層より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも１００００％、または、それどころか、それ以上の増大または強化に関連する。

【0234】

抗体依存性細胞媒介性細胞傷害
ＡＤＣＣは、本明細書中に記載されるようなエフェクター細胞（特に、リンパ球）の細胞殺傷能を表し、ただし、これは好ましくは、標的細胞に印が抗体によってつけられることを必要とする。

【0235】

ＡＤＣＣは好ましくは、抗体が腫瘍細胞表面の抗原に結合し、かつ、抗体のＦｃドメインが免疫エフェクター細胞の表面のＦｃ受容体（ＦｃＲ）と会合するときに生じる。いくつかのファミリーのＦｃ受容体が特定されており、特異的な細胞集団が、規定されたＦｃ受容体を特徴的に発現する。ＡＤＣＣは、抗原提示および腫瘍に向けられたＴ細胞応答の誘導を引き起こす可変的な即時的腫瘍破壊を直接に誘導するための機構として見ることができる。好ましくは、ＡＤＣＣのインビボ誘導は、腫瘍に向けられたＴ細胞応答および宿主由来の抗体応答を引き起こすであろう。

【0236】

補体依存性細胞傷害
ＣＤＣは、抗体によって導かれ得る別の細胞殺傷法である。ＩｇＭは、補体活性化のための最も効果的なイソタイプである。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３はともにまた、古典的補体活性化経路を介してＣＤＣを導くことにおいて非常に効果的である。好ましくは、このカスケードにおいて、抗原−抗体複合体の形成により、多数のＣ１ｑ結合部位の露出が、関与している抗体分子（例えば、ＩｇＧ分子など）のＣＨ２ドメインの表面における極近傍においてもたらされる（Ｃ１ｑは補体Ｃ１の３つの副成分のうちの１つである）。好ましくは、これらの露出したＣ１ｑ結合部位は、以前には低親和性のＣ１ｑ−ＩｇＧ相互作用を高アビディティーの相互作用に転換し、これにより、一連の他の補体タンパク質を伴う事象のカスケードの引き金が引かれ、エフェクター細胞走化性因子／活性化因子のＣ３ａおよびＣ５ａのタンパク質分解的放出が引き起こされる。好ましくは、補体カスケードは、膜攻撃複合体の形成で終わり、これにより、水および溶質の細胞内および細胞外への自由な通過を容易にする細胞膜における細孔が生じる。

【0237】

本明細書中に記載される抗体、例えば、ＶＬ領域およびＶＨ領域を提供するための本明細書中に記載される抗体は、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５））の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含めて、様々な技術によって製造することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいにもかかわらず、原理的には、モノクローナル抗体を製造するための他の技術を用いることができ、例えば、Ｂリンパ球のウイルス形質転換または発ガン性形質転換、あるいは、抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージディスプレー技術を用いることができる。

【0238】

モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための好ましい動物系がマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ作製は、非常に十分に確立された手法である。様々な免疫化プロトコル、および、融合のための免疫化された脾細胞を単離するための技術がこの技術分野において知られている。様々な融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手法もまた知られている。

【0239】

モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための他の好ましい動物系がラット系およびウサギ系である（これらが、例えば、Ｓｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９２：９３４８（１９９５）に記載される。Ｒｏｓｓｉ他、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１２４：２９５（２００５）もまた参照のこと）。

【0240】

さらに別の好ましい実施形態において、ヒトモノクローナル抗体を、マウス系ではなく、むしろ、ヒト免疫系の一部を有する遺伝子組換えマウスまたは染色体組換えマウスを使用して生じさせることができる。これらの遺伝子組換えマウスおよび染色体組換えマウスには、ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスとしてそれぞれ知られているマウスが含まれ、これらはまとめて、本明細書中では「遺伝子組換えマウス」として示される。そのような遺伝子組換えマウスにおけるヒト抗体の製造を、国際公開ＷＯ２００４０３５６０７においてＣＤ２０について詳しく記載されるように行うことができる。

【0241】

モノクローナル抗体を生じさせるためのさらに別の戦略が、抗体をコードする遺伝子を、規定された特異性の抗体を産生するリンパ球から直接に単離することである。例えば、Ｂａｂｃｏｃｋ他（１９９６、Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ，ｉｓｏｌａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｆ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）を参照のこと。組換え抗体工学の詳細については、ＷｅｌｓｃｈｏｆおよびＫｒａｕｓ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ（ＩＳＢＮ−０−８９６０３−９１８−８）、ならびに、Ｂｅｎｎｙ Ｋ．Ｃ．Ｌｏ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＩＳＢＮ １−５８８２９−０９２−１）もまた参照のこと。

【0242】

抗体を生じさせるために、マウスを記載されるように、抗原配列、すなわち、抗体が向けられることになる配列に由来するキャリアコンジュゲート化ペプチド、組換え発現された抗原もしくはそのフラグメントの富化された調製物、および／または、抗原を発現する細胞により免疫化することができる。代替では、マウスを、抗原またはそのフラグメントをコードするＤＮＡにより免疫化することができる。抗原の精製された調製物または富化された調製物を使用する免疫化が抗体をもたらさない場合には、マウスはまた、免疫応答を促進させるために、当該抗原を発現する細胞（例えば、細胞株）により免疫化することができる。

【0243】

免疫応答を、血漿サンプルおよび血清サンプルが尾静脈採血または後眼窩採血によって得られる免疫化プロトコルの経過にわたってモニターすることができる。免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを融合のために使用することができる。マウスには、抗原発現細胞による腹腔内または静脈内への追加抗原刺激を、特異的抗体を分泌するハイブリドーマの割合を増大させるために、屠殺および脾臓取り出しの３日前に行うことができる。

【0244】

モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生じさせるために、免疫化マウスからの脾細胞およびリンパ節細胞を単離し、適切な不死化された細胞株（例えば、マウス骨髄腫細胞株など）に融合することができる。得られたハイブリドーマはその後、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングすることができる。その後、個々のウエルを抗体分泌ハイブリドーマについてＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることができる。抗原発現細胞を使用する免疫蛍光分析およびＦＡＣＳ分析によって、特異性を当該抗原について有する抗体を特定することができる。抗体分泌ハイブリドーマを再置床し、再びスクリーニングすることができ、そして、依然としてモノクローナル抗体について陽性であるならば、限界希釈によってサブクローン化することができる。その後、安定なサブクローンは、抗体を特徴づけのために組織培養培地において生じさせるためにインビトロ培養することができる。

【0245】

抗体はまた、例えば、この技術分野において広く知られているような組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組合せを使用して宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生させることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１２０２）。

【0246】

例えば、１つの実施形態において、目的とする遺伝子、例えば、抗体遺伝子を、発現ベクター（例えば、真核生物用発現プラスミド（例えば、国際公開ＷＯ８７／０４４６２、同ＷＯ８９／０１０３６および欧州特許ＥＰ３３８８４１に開示されるＧＳ遺伝子発現系によって使用される真核生物用発現プラスミドなど）、または、この技術分野において広く知られている他の発現系など）に連結することができる。クローン化された抗体遺伝子を有する精製されたプラスミドを、真核生物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨＥＫ２９３細胞など）に導入することができ、あるいは、代替では、植物由来細胞、真菌細胞または酵母細胞のような他の真核生物細胞に導入することができる。これらの遺伝子を導入するために使用される方法は、この技術分野において記載される方法が可能であり、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクチンまたはリポフェクタミンなどが可能である。これらの抗体遺伝子を宿主細胞に導入した後で、抗体を発現する細胞を特定し、選択することができる。これらの細胞は、次いでそれらの発現レベルについて増幅することができ、また、抗体を産生させるためにスケールアップすることができるトランスフェクトーマを表す。組換え抗体をこれらの培養上清および／または細胞から単離し、精製することができる。

【0247】

代替では、クローン化された抗体遺伝子を、原核生物細胞（例えば、微生物など）を含めて、他の発現系において、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させることができる。さらには、抗体を、ヒト以外の遺伝子組換え動物において、例えば、ヒツジおよびウサギから乳汁において、または、ニワトリから卵において、または、遺伝子組換え植物において産生させることができる；例えば、Ｖｅｒｍａ，Ｒ．他（１９９８）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、２１６：１６５〜１８１；Ｐｏｌｌｏｃｋ他（１９９９）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、２３１：１４７〜１５７；および、Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．他（１９９９）、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、３８０：８２５〜８３９を参照のこと。

【0248】

キメラ化
非標識のマウス抗体は、繰り返し適用されたときにはヒトにおいて非常に免疫原性であり、このことは治療効果の低下を引き起こす。主たる免疫原性が重鎖定常領域によって媒介される。それぞれの抗体がキメラ化またはヒト化されるならば、ヒトにおけるマウス抗体の免疫原性を低下させることができ、または、完全に回避することができる。キメラ抗体は、その種々の部分が異なる動物種に由来する抗体であり、例えば、マウス抗体に由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリンの定常領域とを有する抗体などである。抗体のキメラ化が、（例えば、Ｋｒａｕｓ他によって、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙシリーズ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ（ＩＳＢＮ−０−８９６０３−９１８−８）に記載されるように）マウス抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をヒトの重鎖および軽鎖の定常領域と連結することによって達成される。好ましい実施形態において、キメラ抗体が、ヒトカッパ軽鎖定常領域をマウス軽鎖可変領域に連結することによって作製される。同様に好ましい実施形態において、キメラ抗体を、ヒトラムダ軽鎖定常領域をマウス軽鎖可変領域に連結することによって作製することができる。キメラ抗体を作製するための好ましい重鎖定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。キメラ抗体を生じさせるための他の好ましい重鎖定常領域が、ＩｇＧ２、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＭである。

【0249】

ヒト化
抗体は、主には重鎖および軽鎖の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個々の抗体の間では、ＣＤＲの外側の配列よりも大きい多様性を有する。ＣＤＲ配列がほとんどの抗体−抗原相互作用に関わっているので、特定の天然に存在する抗体の性質を模倣する組換え抗体を、異なる性質を有する異なる抗体に由来するフレームワーク配列にグラフト化される特異的な天然に存在する抗体から得られるＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．他（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．他（１９８６）、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５；および、Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．他（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６：１００２９〜１００３３を参照のこと）。そのようなフレームワーク配列を、生殖系列の抗体遺伝子配列を含む公開されているＤＮＡデータベースから得ることができる。これらの生殖系列配列は、完全に組み立てられた可変遺伝子（これはＢ細胞成熟化の期間中にＶ（Ｄ）Ｊ連結によって形成される）を含まないであろうので、成熟型抗体の遺伝子配列とは異なるであろう。生殖系列の遺伝子配列はまた、可変領域全域にわたって一様に個々において高親和性の二次的なレパートリー抗体の配列と異なるであろう。

【0250】

抗原と結合する抗体および他の結合剤の能力は、標準的な結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ分析、ウエスタンブロット分析、免疫蛍光分析およびフローサイトメトリー分析）を使用して求めることができる。

【0251】

抗体を精製するために、選択された産生細胞株を組換え抗体の精製のために２リットルのスピナーフラスコにおいて成長させることができる。代替では、抗体を透析に基づくバイオリアクターにおいて産生させることができる。上清を、プロテインＬ−セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーの前にろ過し、必要ならば、濃縮することができる。溶出されたＩｇＧを、純度を保証するためにゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーによって調べることができる。緩衝液溶液をＰＢＳに交換することができ、濃度を、それぞれの吸光係数を使用してＯＤ２８０によって求めることができる。組換え抗体は小分けし、−８０℃で貯蔵することができる。

【0252】

抗原を発現する生細胞にモノクローナル抗体が結合することを明らかにするために、フローサイトメトリーを使用することができる。抗原を天然において、または、トランスフェクションの後で発現する細胞株、および、抗原発現を欠く陰性コントロール（これらは標準的な成長条件のもとで成長させられる）を、ハイブリドーマ上清において、または、１％のＦＢＳを含有するＰＢＳにおいて様々な濃度のモノクローナル抗体と混合することができ、４℃で３０分間インキュベーションすることができる。洗浄後、ＡＰＣまたはＡｌｅｘａ６４７により標識される抗ＩｇＧ抗体は、一次抗体染色と同じ条件のもと、抗原と結合したモノクローナル抗体に結合することができる。サンプルは、個々の生細胞に対してゲート開閉するために光および側方散乱特性を使用するＦＡＣＳ装置を用いてフローサイトメトリーによって分析することができる。抗原特異的なモノクローナル抗体をただ１回の測定で非特異的な結合体から識別するために、共トランスフェクションの方法を用いることができる。抗原および蛍光性マーカーをコードするプラスミドにより一過性にトランスフェクションされた細胞を上記のように染色することができる。トランスフェクションされた細胞を、抗体により染色された細胞とは異なる蛍光チャネルで検出することができる。トランスフェクションされた細胞の大部分が両方の導入遺伝子を発現するので、抗原特異的なモノクローナル抗体は優先的に蛍光マーカー発現細胞に結合し、これに対して、非特異的な抗体は、非トランスフェクション細胞に対して同程度の比率で結合する。蛍光顕微鏡法を使用する代わりのアッセイが、フローサイトメトリーアッセイに加えて、または、フローサイトメトリーアッセイの代わりに使用される場合がある。細胞は、まさに上記のように染色し、蛍光顕微鏡法によって調べることができる。

【0253】

抗原を発現する生細胞にモノクローナル抗体が結合することを明らかにするために、免疫蛍光顕微鏡法分析を使用することができる。例えば、抗原を自発的またはトランスフェクション後のどちらかで発現する細胞株、および、抗原発現を欠く陰性コントロールが、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補充されるＤＭＥＭ／Ｆ１２培地における標準的な成長条件のもと、チャンバースライドにおいて成長させられる。その後、細胞はメタノールまたはパラホルムアルデヒドにより固定することができ、あるいは、処理されないままにしておくことができる。その後、細胞は、２５℃で３０分間、抗原に対するモノクローナル抗体と反応させることができる。洗浄後、細胞は、同じ条件のもと、Ａｌｅｘａ５５５標識された抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と反応させることができる。その後、細胞を蛍光顕微鏡法によって調べることができる。

【0254】

抗原を発現する細胞から得られる細胞抽出物、および、適切な陰性コントロールを調製し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動後、分離された抗原はニトロセルロースメンブランに転写され、ブロッキング処理され、試験されるモノクローナル抗体によりプローブ探査されるであろう。ＩｇＧ結合を、抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼを使用して検出し、ＥＣＬ基質により発色させることができる。

【0255】

抗体はさらに、当業者に広く知られている様式で、例えば、常法的な手術手順の期間中に患者から、あるいは、抗原を自発的に、またはトランスフェクションの後で発現する細胞株が接種された異種移植腫瘍を有するマウスから得られる非ガン組織サンプルおよびガン組織サンプルに由来するパラホルムアルデヒド固定凍結切片またはアセトン固定凍結切片あるいはパラホルムアルデヒド固定されるパラフィン包埋組織切片を使用して免疫組織化学によって抗原との反応性について調べることができる。免疫染色のために、抗原に対する反応性を有する抗体をインキュベーションすることができ、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼがコンジュゲート化されたヤギ抗マウス抗体またはヤギ抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ）を供給者の説明書に従ってインキュベーションすることができる。

【0256】

前臨床研究
本明細書中に記載される結合剤はまた、ＣＬＤＮを発現する腫瘍細胞の成長を抑制することにおけるその効力を求めるために、インビボモデルにおいて、例えば、ＣＬＤＮを発現する細胞株が接種された異種移植腫瘍を有する免疫不全マウスにおいて試験することができる。

【0257】

ＣＬＤＮ発現腫瘍細胞を免疫低下したマウスまたは他の動物に異種移植した後のインビボ研究を、本明細書中に記載される結合剤を使用して行うことができる。結合剤を、腫瘍を有しないマウスに投与し、その後、腫瘍細胞を注入して、腫瘍の形成または腫瘍関連症状を防止するための結合剤の効果を測定することができる。結合剤を、腫瘍を有するマウスに投与して、腫瘍成長、転移または腫瘍関連症状を軽減するためのそれぞれの結合剤の治療効力を求めることができる。結合剤の適用を、細胞分裂抑制薬物、増殖因子阻害剤、細胞周期阻止剤、血管形成阻害剤または抗体のような他の物質の適用と組み合わせて、組合せ物の相乗的効力および潜在的毒性を求めることができる。結合剤によって媒介される毒性副作用を分析するために、動物には、結合剤またはコントロール試薬を接種することができ、そして、動物を、ＣＬＤＮ結合剤療法に関連づけられている可能性のある症状について入念に調査することができる。

【0258】

結合剤によって認識されるエピトープのマッピングを、"Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ"（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ、ＩＳＢＮ−０８９６０３−３７５−９）および"Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ"（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ ２４８、Ｏｌｗｙｎ Ｍ．Ｒ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ、Ｆｒａｎｋ Ｃ．Ｈａｙ）に詳しく記載されるように行うことができる。

【0259】

本明細書中に記載される化合物および薬剤は、どのような組成物であれ、好適な医薬組成物の形態で投与される場合がある。

【0260】

本発明の医薬組成物は好ましくは無菌であり、かつ、所望される反応または所望される効果を生じさせるために、効果的な量の本明細書中に記載される結合剤と、必要な場合には、効果的な量の本明細書中で議論されるようなさらなる薬剤とを含有する。

【0261】

医薬組成物は通常の場合には均一な投薬形体物で提供され、それ自体は知られている様式で調製される場合がある。医薬組成物は、例えば、溶液または懸濁物の形態である場合がある。

【0262】

医薬組成物は、塩、緩衝剤物質、保存剤、キャリア、希釈剤および／または賦形剤を含む場合があり、ただし、それらのすべてが好ましくは、医薬的に許容されるものである。用語「医薬的に許容される」は、医薬組成物の活性な成分の作用と相互作用しない材料の非毒性を示す。

【0263】

医薬的に許容されない塩が、医薬的に許容される塩を調製するために使用される場合があり、本発明において含まれる。この種の医薬的に許容される塩は、限定されない様式で、下記の酸から調製される塩を含む：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸およびコハク酸など。医薬的に許容される塩はまた、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩として、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩などとして調製される場合がある。

【0264】

医薬組成物において使用されるための好適な緩衝剤物質には、塩での酢酸、塩でのクエン酸、塩でのホウ酸、および、塩でのリン酸が含まれる。

【0265】

医薬組成物において使用されるための好適な保存剤には、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールが含まれる。

【0266】

注射用配合物は、医薬的に許容される賦形剤、例えば、リンゲル乳酸加（Ｒｉｎｇｅｒ Ｌａｃｔａｔｅ）などを含む場合がある。

【0267】

用語「キャリア」は、活性な成分が、適用を容易にするために、適用を高めるために、または、適用を可能にするために一緒にされる天然または合成の有機成分または無機成分を示す。本発明によれば、用語「キャリア」にはまた、患者への投与のために好適である１つまたは複数の適合性の固体または液体の増量剤、希釈剤またはカプセル化用物質が含まれる。

【0268】

非経口投与のための可能なキャリア物質が、例えば、無菌水、リンゲル、リンゲル乳酸加、無菌の塩化ナトリウム溶液、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレン、および、特に、生体適合性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーである。

【0269】

用語「賦形剤」は、本明細書中で使用される場合、医薬組成物に存在することがあり、かつ、有効成分でないすべての物質を示すことが意図される（例えば、キャリア、結合剤、滑剤、増粘剤、表面活性剤、保存剤、乳化剤、緩衝剤、香味矯臭剤または着色剤など）。

【0270】

本明細書中に記載される剤および組成物は、どのような経路であれ、従来の経路を介して、例えば、注射または注入による投与を含む非経口投与によって投与される場合がある。投与は好ましくは非経口であり、例えば、静脈内、動脈内、皮下、皮内または筋肉内である。

【0271】

非経口投与のために好適である組成物は通常、好ましくはレシピエントの血液に対して等張性である、活性な化合物の無菌の水性調製物または非水性調製物を含む。適合性のキャリアおよび溶媒の例が、リンゲル溶液および等張性の塩化ナトリウム溶液である。加えて、通常の場合には無菌である固定油が溶液媒体または懸濁媒体として使用される。

【0272】

本明細書中に記載される剤および組成物は効果的な量で投与される。「効果的な量」は、所望される反応または所望される効果を単独で達成するか、または、さらなる用量と一緒に達成する量を示す。特定の疾患または特定の状態を処置する場合、所望される反応は好ましくは、当該疾患の経過を阻害することに関連する。これは、疾患の進行を遅らせること、および、特に、疾患の進行を中断させること、または逆転させることを含む。疾患または状態の処置における所望される反応はまた、前記疾患または前記状態の発症を遅らせること、あるいは、前記疾患または前記状態の発症を防止することである場合がある。

【0273】

本明細書中に記載される剤または組成物の効果的な量は、処置されるべき状態、疾患の重篤度、患者の個々のパラメーター（年齢、生理学的状態、大きさおよび体重を含む）、処置の継続期間、付随する治療のタイプ（存在する場合）、具体的な投与経路および類似する様々な要因に依存するであろう。したがって、本明細書中に記載される剤の投与される用量は、様々なそのようなパラメーターに依存する場合がある。患者における反応が初期用量により不十分である場合には、より大きい用量（または、異なる、より限局的な投与経路によって達成される事実上より大きい用量）が使用される場合がある。

【0274】

本明細書中に記載される剤および組成物は、様々な障害（例えば、本明細書中に記載される障害など）を処置するために、または防止するために、患者に、例えば、インビボで投与することができる。好ましい患者には、本明細書中に記載される剤および組成物を投与することによって矯正され得るか、または改善され得る障害を有するヒト患者が含まれる。これには、ＣＬＤＮ（例えば、ＣＬＤＮ１８．２および／またはＣＬＤＮ６など）の変化した発現パターンによって特徴づけられる細胞を伴う障害が含まれる。

【0275】

例えば、１つの実施形態において、本明細書中に記載される剤は、ガン疾患を有する患者、例えば、ＣＬＤＮを発現するガン細胞の存在によって特徴づけられる本明細書中に記載されるものなどのガン疾患を有する患者を処置するために使用することができる。

【0276】

本発明に従って記載される医薬組成物および処置方法はまた、本明細書中に記載される疾患を防止するための免疫化またはワクチン接種のために使用される場合がある。

【0277】

本発明の医薬組成物は、免疫強化物質（例えば、１つまたは複数のアジュバントなど）を補うことと一緒に投与される場合があり、１つまたは複数の免疫強化物質を、その有効性をさらに増大させるために、好ましくは、免疫刺激の相乗効果を達成するために含む場合がある。用語「アジュバント」は、免疫応答を引き延ばすか、または高めるか、または促進させる化合物に関連する。様々な機構が、アジュバントの様々なタイプに依存して、この点において可能である。例えば、ＤＣの成熟化を可能にする化合物、例えば、リポ多糖またはＣＤ４０リガンドは、好適なアジュバントの第１の部類を形成する。一般にどのような剤であれ、「危険信号」のタイプの免疫系に影響を与える剤（ＬＰＳ、ＧＰ９６、ｄｓＲＮＡなど）、または、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦなど）を、免疫応答が、制御された様式で増強されることおよび／または影響されることを可能にするアジュバントとして使用することができる。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドもまた、必要に応じて、この関連において使用することができ、だが、上記で説明されるように、ある特定の状況のもとで生じるそれらの副作用が考慮されなければならない。特に好ましいアジュバントがサイトカインであり、例えば、モノカイン、リンホカイン、インターロイキンまたはケモカインなどであり、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＮＦα、ＩＮＦ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＴ−αまたは増殖因子（例えば、ｈＧＨ）である。さらなる知られているアジュバントが、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバント、または、オイル（例えば、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）など）であり、最も好ましいものがＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１である。リポペプチド、例えば、Ｐａｍ３Ｃｙｓなどもまた、本発明の医薬組成物におけるアジュバントとしての使用のために好適である。

【0278】

本明細書中に提供される剤および組成物は、単独で、または、従来の治療計画（例えば、手術、放射線、化学療法および／または骨髄移植（自己、同系、同種または非血縁）など）との組合せで使用される場合がある。

【0279】

ガンの処置は、高頻度で、２つ、３つ、４つ、または、それどころか、それ以上のガン薬物／治療法の組み合わされた作用により、単独療法アプローチの影響よりもかなり強い相乗効果がもたらされるので、併用戦略がとりわけ望ましい分野を表す。したがって、本発明の別の実施形態において、免疫またはワクチン接種に基づく機構を利用するガン処置、例えば、本発明の方法および医薬組成物などを利用するガン処置は、類似する特異的機構または他の特異的機構を標的化する様々な他の薬物および／または方法と効果的に組み合わされる場合がある。そのようなものには、例えば、従来の腫瘍治療法、多重エピトープ戦略、さらなる免疫療法、および、血管形成またはアポトーシスを標的化する処置アプローチとの組合せが含まれる（総説については、例えば、Ａｎｄｅｒｓｅｎ他、２００８、Ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ： ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、５７（１１）：１７３５〜１７４３を参照のこと）。異なる薬剤の逐次投与はガン細胞成長を異なるチェックポイントで阻害する場合があり、一方、他の薬剤は、例えば、血管新生、悪性細胞の生存または転移（これらは潜在的にはガンを慢性疾患に転換する）を阻害する場合がある。下記の列挙では、本発明との組合せで使用することができる抗ガン薬物および抗ガン治療法のいくつかの限定されない例が提供される：

【0280】

１．化学療法
化学療法は、多数のタイプのガンのための標準治療である。最も一般的な化学療法剤は、ガン細胞の主要な性質の１つである、速く分裂する細胞を殺すことによって作用する。したがって、従来の化学療法薬物との組合せ、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン系化合物、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、および、細胞分裂またはＤＮＡ合成のどちらかに影響を及ぼす他の抗腫瘍剤などとの組合せは、サプレッサー細胞を排除すること、すなわち、免疫系の再起動によって、または、腫瘍細胞を免疫媒介殺傷に対してより感受性にすることによって、または、免疫系の細胞のさらなる活性化によって本発明の治療効果を著しく改善する場合がある。化学療法薬物と、ワクチン接種に基づく免疫療法薬物との相乗的な抗ガン作用が、多数の研究において明らかにされている（例えば、Ｑｕｏｉｘ他、２０１１、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＴＧ４０１０ ａｎｄ ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ： ａ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｈａｓｅ ２Ｂ ｔｒｉａｌ、Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．、１２（１２）：１１２５〜３３を参照のこと；同様に、Ｌｉｓｅｔｈ他、２０１０、Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ： ｔｈｅ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０１０：６９２０９７９も参照のこと；同様に、Ｈｉｒｏｏｋａ他、２００９、Ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎｏｐｅｒａｂｌｅ ｌｏｃａｌｌｙ ａｄｖａｎｃｅｄ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ、Ｐａｎｃｒｅａｓ、３８（３）：ｅ６９〜７４も参照のこと）。併用療法のために基本的に好適である利用可能な数百の化学療法薬物が存在する。本発明と組み合わせることができる化学療法薬物のいくつかの（限定されない）例として、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ−ＡＱ）、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ、Ｎｅｏｓａｒ）、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、エトポシド（ＶｅＰｅｓｉｄ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、イマチニブメシラート（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ、Ｍｅｘａｔｅ、Ａｍｅｔｈｏｐｔｅｒｉｎ）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ、Ａｂｒａｘａｎｅ）、ソラフィニブ（ｓｏｒａｆｉｎｉｂ）（Ｎｅｘａｖａｒ）、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ、Ｖｉｎｃａｓａｒ ＰＦＳ）およびビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ）が挙げられる。

【0281】

２．手術
ガン手術、すなわち、腫瘍を取り除くための手術は、依然としてガン処置の基礎である。手術は、どのような腫瘍細胞であれ、残存する腫瘍細胞を除去するために他のガン処置と組み合わせることができる。外科的方法をその後の免疫療法処置と組み合わせることは、数え切れないほどにこれまで実証されている有望な取り組みである。

【0282】

３．放射線
放射線治療は依然としてガン処置の重要な構成要素であり、すべてのガン患者のおよそ５０％が放射線治療をその病気経過の期間中に受ける。放射線治療の主たる目標が、ガン細胞からその増殖（細胞分裂）能を奪うことである。ガンを処置するために使用される放射線のタイプには、光子放射線（Ｘ線およびガンマ線）および粒子放射線（電子ビーム、陽子ビームおよび中性子ビーム）がある。放射線をガンの場所に送達するための２つの方法がある。外部ビーム放射線は、高エネルギー線（光子、陽子または粒子放射線）を腫瘍の場所に向けることによって身体の外側から送達される。内部放射線または近接照射療法は、カテーテルまたはシードに密封される放射性線源によって身体の内部から、直接に腫瘍部位の中に送達される。本発明との組合せで適用可能である放射線治療技術が、例えば、分割（分割された治療計画で送達される放射線治療、例えば、数週間にわたって与えられる１．５Ｇｙ〜３Ｇｙの毎日の分割照射）、３Ｄ原体照射療法（３ＤＣＲＴ；これは放射線を肉眼的腫瘍体積に応じて送達する）；強度変調放射線治療（ＩＭＲＴ；多数の放射線ビームのコンピューター制御された強度変調）、画像誘導放射線治療（ＩＧＲＴ；補正について可能にする放射線療法前の画像化を含む技術）、および、定位身体放射線治療（ＳＲＢＴ、非常に大きい個々の線量の放射線をほんの数回の分割された処置にわたって送達する）である。放射線治療の総説については、Ｂａｓｋａｒ他、２０１２、Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ： ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ、Ｉｎｔ．Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．、９（３）：１９３〜１９９を参照のこと）。

【0283】

４．抗体
抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）は、ガン細胞に対するその治療効果を、様々な機構を介して達成する。抗体は、直接的な影響を、アポトーシス、すなわち、プログラム化された細胞死をもたらすことにおいて有することができる。抗体は、シグナル伝達経路の構成要素（例えば、増殖因子受容体など）を阻止し、これにより、腫瘍細胞の増殖を停止させることができる。モノクローナル抗体を発現する細胞において、細胞は抗イディオタイプ抗体の形成をもたらすことができる。間接的な影響には、細胞傷害性を有する細胞（例えば、単球およびマクロファージなど）を動員することが含まれる。このタイプの抗体媒介細胞殺傷は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と呼ばれる。抗体はまた、補体と結合し、これにより、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）として知られている直接的な細胞毒性を引き起こす。外科的方法を免疫療法薬物または免疫療法的方法と組み合わせることは、例えば、Ｇａｄｒｉ他、２００９、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉ−ＣＤ２０ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、３２（４）：３３３〜４０において明らかにされるように、成功している取り組みである。下記の列挙では、本発明との組合せで使用することができる抗ガン抗体および潜在的な抗体標的（括弧内）のいくつかの限定されない例が提供される：アバゴボマブ（Ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）（ＣＡ−１２５）、アブシキシマブ（ＣＤ４１）、アデカツムマブ（Ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）（ＥｐＣＡＭ）、アフツズマブ（ＣＤ２０）、アラシズマブペゴール（Ａｌａｃｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）（ＶＥＧＦＲ２）、アルツモマブペンテタート（Ａｌｔｕｍｏｍａｂ ｐｅｎｔｅｔａｔｅ）（ＣＥＡ）、アマツキシマブ（Ａｍａｔｕｘｉｍａｂ）（ＭＯＲＡｂ−００９）、アナツモマブマフェナトクス（Ａｎａｔｕｍｏｍａｂ ｍａｆｅｎａｔｏｘ）（ＴＡＧ−７２）、アポリズマブ（ＨＬＡ−ＤＲ）、アルシツモマブ（ＣＥＡ）、バビツキシマブ（Ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）（ホスファチジルセリン）、ベクツモマブ（Ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）（ＣＤ２２）、ベリムマブ（ＢＡＦＦ）、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ−Ａ）、ビバツズマブメルタンシン（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（ＣＤ４４ ｖ６）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）（ＣＤ１９）、ブレンツキシマブベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）（ＣＤ３０ ＴＮＦＲＳＦ８）、カンツズマブメルタンシン（ムチンＣａｎＡｇ）、カンツズマブラブタンシン（ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）（ＭＵＣ１）、カプロマブペンデチド（Ｃａｐｒｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）（前立腺ガン細胞）、カルルマブ（Ｃａｒｌｕｍａｂ）（ＣＮＴＯ８８８）、カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）（ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３）、セツキシマブ（ＥＧＦＲ）、シタツズマブボガトクス（Ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ ｂｏｇａｔｏｘ）（ＥｐＣＡＭ）、シクスツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）（ＩＧＦ−１受容体）、クロージキシマブ（Ｃｌａｕｄｉｘｉｍａｂ）（クローディン）、クリバツズマブテトラキセタン（Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）（ＭＵＣ１）、コナツムマブ（Ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ダセツズマブ（ＣＤ４０）、ダロツズマブ（Ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）（インスリン様増殖因子Ｉ受容体）、デノスマブ（ＲＡＮＫＬ）、デツモマブ（Ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）（Ｂ−リンパ腫細胞）、ドロジツマブ（Ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）（ＤＲ５）、エクロメキシマブ（Ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）（ＧＤ３ガングリオシド）、エドレコロマブ（ＥｐＣＡＭ）、エロツズマブ（ＳＬＡＭＦ７）、エナバツズマブ（Ｅｎａｖａｔｕｚｕｍａｂ）（ＰＤＬ１９２）、エンシツキシマブ（Ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）（ＮＰＣ−１Ｃ）、エプラツズマブ（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）（ＣＤ２２）、エルツマキソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ３）、エタラシズマブ（Ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）（インテグリンαｖβ３）、ファーレツズマブ（葉酸受容体１）、ＦＢＴＡ０５（ＣＤ２０）、フィクラツズマブ（Ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）（ＳＣＨ９００１０５）、フィギツムマブ（ＩＧＦ−１受容体）、フランボツマブ（Ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）（糖タンパク質７５）、フレソリムマブ（Ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）（ＴＧＦ−β）、ガリキシマブ（ＣＤ８０）、ガニツマブ（Ｇａｎｉｔｕｍａｂ）（ＩＧＦ−Ｉ）、ゲムツズマブオゾガミシン（ＣＤ３３）、ゲボキズマブ（ＩＬ−１β）、ギレンツキシマブ（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）（炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ））、グレムバツムマブベドチン（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）（ＧＰＮＭＢ）、イブリツモマブチウキセタン（ＣＤ２０）、イクルクマブ（Ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）（ＶＥＧＦＲ−１）、イゴボマ（Ｉｇｏｖｏｍａ）（ＣＡ−１２５）、インダツキシマブラブタンシン（Ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）（ＳＤＣ１）、インテツムマブ（Ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）（ＣＤ５１）、イノツズマブオゾガミシン（Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）（ＣＤ２２）、イピリムマブ（ＣＤ１５２）、イラツムマブ（Ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）（ＣＤ３０）、ラベツズマブ（ＣＥＡ）、レクサツムマブ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、リビビルマブ（Ｌｉｂｉｖｉｒｕｍａｂ）（Ｂ型肝炎表面抗原）、リンツズマブ（ＣＤ３３）、ロルボツズマブメルタンシン（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（ＣＤ５６）、ルカツムマブ（Ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）（ＣＤ４０）、ルミリキシマブ（ＣＤ２３）、マパツズマブ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）、マツズマブ（ＥＧＦＲ）、メポリズマブ（ＩＬ−５）、ミラツズマブ（ＣＤ７４）、ミツモマブ（Ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）（ＧＤ３ガングリオシド）、モガムリズマブ（ＣＣＲ４）、モクセツモマブパスドトクス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ ｐａｓｕｄｏｔｏｘ）（ＣＤ２２）、ナコロマブタフェナトクス（Ｎａｃｏｌｏｍａｂ ｔａｆｅｎａｔｏｘ）（Ｃ２４２抗原）、ナプツモマブエスタフェナトクス（Ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ ｅｓｔａｆｅｎａｔｏｘ）（５Ｔ４）、ナルナツマブ（Ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）（ＲＯＮ）、ネシツムマブ（ＥＧＦＲ）、ニモツズマブ（Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）（ＥＧＦＲ）、ニボルマブ（ＩｇＧ４）、オファツムマブ（ＣＤ２０）、オララツマブ（Ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）（ＰＤＧＦ−Ｒα）、オナルツズマブ（Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）（ヒト散乱因子受容体キナーゼ）、オポルツズマブモナトクス（Ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ ｍｏｎａｔｏｘ）（ＥｐＣＡＭ）、オレゴボマブ（ＣＡ−１２５）、オクセルマブ（Ｏｘｅｌｕｍａｂ）（ＯＸ−４０）、パニツムマブ（ＥＧＦＲ）、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）（ＨＥＲ３）、ペムツモマ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａ）（ＭＵＣ１）、ペルツズマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ピンツモマブ（Ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）（腺ガン抗原）、プリツムマブ（Ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）（ビメンチン）、ラコツモマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）（Ｎ−グリコリルノイラミン酸）、ラドレツマブ（Ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）（フィブロネクチンエクストラドメイン−Ｂ）、ラフィビルマブ（Ｒａｆｉｖｉｒｕｍａｂ）（狂犬病ウイルス糖タンパク質）、ラムシルマブ（ＶＥＧＦＲ２）、リロツムマブ（Ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）（ＨＧＦ）、リツキシマブ（ＣＤ２０）、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）（ＩＧＦ−１受容体）、サマリズマブ（Ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）（ＣＤ２００）、シブロツズマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）（ＦＡＰ）、シルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）（ＩＬ−６）、タバルマブ（Ｔａｂａｌｕｍａｂ）（ＢＡＦＦ）、タカツズマブテトラキセタン（Ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）（アルファ−フェトプロテイン）、タプリツモマブパプトクス（Ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ ｐａｐｔｏｘ）（ＣＤ１９）、テナツモマブ（Ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）（テネイシンＣ）、テプロツムマブ（Ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）（ＣＤ２２１）、チシリムマブ（Ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）（ＣＴＬＡ−４）、チガツズマブ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＴＮＸ−６５０（ＩＬ−１３）、トシツモマブ（ＣＤ２０）、トラスツズマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＴＲＢＳ０７（ＧＤ２）、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ−４）、ツコツズマブセルモロイキン（Ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ ｃｅｌｍｏｌｅｕｋｉｎ）（ＥｐＣＡＭ）、ウブリツキシマブ（Ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）（ＭＳ４Ａ１）、ウレルマブ（Ｕｒｅｌｕｍａｂ）（４−１ＢＢ）、ボロシキシマブ（インテグリンα５β１）、ボツムマブ（Ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）（腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８）、ザルツムマブ（ＥＧＦＲ）、ザノリムマブ（ＣＤ４）。

【0284】

５．サイトカイン、ケモカイン、共刺激性分子、融合タンパク質
本発明の抗原コード医薬組成物を、有益な免疫調節効果または腫瘍阻害効果を誘発するために、サイトカイン、ケモカイン、共刺激性分子および／またはそれらの融合タンパク質と一緒に併用使用することは、本発明の別の実施形態である。腫瘍内への免疫細胞の浸潤を増大させるために、また、腫瘍排出リンパ節への抗原提示細胞の動きを容易にするために、Ｃ構造、ＣＣ構造、ＣＸＣ構造およびＣＸ３Ｃ構造を有する様々なケモカインが使用される場合があるかもしれない。最も有望なケモカインのいくつかが、例えば、ＣＣＲ７ならびにそのリガンドのＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１、さらには、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５およびＣＣＬ１６である。他の例が、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７およびＣＸＣＬ１２である。さらには、共刺激性分子または調節性分子、例えば、Ｂ７リガンド（Ｂ７．１およびＢ７．２）などが有用である。同様に有用なものが他のサイトカインである：例えば、とりわけ、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ１７）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮａｌｐｈａ１〜ＩＦＮａｌｐｈａ８、ＩＦＮａｌｐｈａ１０、ＩＦＮａｌｐｈａ１３、ＩＦＮａｌｐｈａ１４、ＩＦＮａｌｐｈａ１６、ＩＦＮａｌｐｈａ１７、ＩＦＮａｌｐｈａ２１、ＩＦＮｂｅｔａ１、ＩＦＮＷ、ＩＦＮＥ１およびＩＦＮＫ）、造血因子、ＴＧＦ（例えば、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−βおよびＴＧＦファミリーの他のメンバー）、最後に、受容体の腫瘍壊死因子ファミリーのメンバーおよびそれらのリガンド、同様にまた、他の共刺激性分子、これらには、下記の分子が含まれるが、それらに限定されない：４−１ＢＢ、４−１ＢＢ−Ｌ、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＴＬＡ−４ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、Ｆａｓ、Ｆａｓ−Ｌ、ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ｐ７５ＮＧＦ−Ｒ、ＤＲ６、ＬＴ．ｂｅｔａ．Ｒ、ＲＡＮＫ、ＥＤＡＲ１、ＸＥＤＡＲ、Ｆｎ１１４、Ｔｒｏｙ／Ｔｒａｄｅ、ＴＡＪ、ＴＮＦＲＩＩ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＢＣＭＡ、ＲＥＬＴ、ならびに、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−１）、グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲ関連タンパク質、ＴＮＦ受容体関連アポトーシス媒介タンパク質（ＴＲＡＭＰ）および死受容体−６（ＤＲ６）。とりわけ、ＣＤ４０／ＣＤ４０ＬおよびＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌが、Ｔ細胞の生存および増殖に対するそれらの直接的な影響のために、組み合わされた免疫療法のための重要な標的である。総説については、Ｌｅｃｈｎｅｒ他、２０１１、Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ，ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、３（１１）、１３１７〜１３４０を参照のこと。

【0285】

６．細菌処置
研究者らは、酸素の乏しい腫瘍の内部を消耗させるために嫌気性細菌（例えば、クロストリジウム・ノーヴィ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ）など）を使用してきている。これらの嫌気性細菌はその場合、腫瘍の酸素化された面と接触したときには死滅するべきであり、このことは、これらの嫌気性細菌が身体の他の部分に対して無害であろうということを意味する。別の戦略は、非毒性のプロドラッグを毒性薬物に変換することができる酵素により形質転換されている嫌気性細菌を使用することである。腫瘍の壊死性領域および低酸素領域における細菌の増殖とともに、この酵素がもっぱら腫瘍において発現される。したがって、全身適用されたプロドラッグが腫瘍だけにおいて毒性薬物に代謝される。このことが、非病原性嫌気性菌クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）を用いて効果的であることが明らかにされている。

【0286】

７．キナーゼ阻害剤
補完的なガン治療のための可能性のある標的の別の大きな一群はキナーゼ阻害剤を含む。なぜならば、ガン細胞の成長および生存がキナーゼ活性の脱調節と密接に連動するからである。正常なキナーゼ活性を取り戻し、したがって、腫瘍成長を低下させるために、広範囲の様々な阻害剤が使用されている。標的化されたキナーゼの一群は、受容体チロシンキナーゼ、例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｂ−Ｒａｆ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２／ＥｒｂＢ２、ＩＧＦ−ＩＲ、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、ｃ−Ｋｉｔ、Ｆｌｔ−４、Ｆｌｔ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＣＳＦ１Ｒ、ｃ−Ｍｅｔ、ＲＯＮ、ｃ−Ｒｅｔ、ＡＬＫ、細胞質チロシンキナーゼ、例えば、ｃ−ＳＲＣ、ｃ−ＹＥＳ、Ａｂｌ、ＪＡＫ−２、セリン／トレオニンキナーゼ、例えば、ＡＴＭ、Ａｕｒｏｒａ Ａ＆Ｂ、様々なＣＤＫ、ｍＴＯＲ、ＰＫＣｉ、様々なＰＬＫ、ｂ−Ｒａｆ、Ｓ６Ｋ、ＳＴＫ１１／ＬＫＢ１、および、脂質キナーゼ、例えば、ＰＩ３Ｋ、ＳＫ１を含む。小分子のキナーゼ阻害剤として、例えば、ＰＨＡ−７３９３５８、ニロチニブ、ダサチニブ、ならびに、ＰＤ１６６３２６、ＮＳＣ７４３４１１、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ−１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、スーテント（Ｓｕｔｅｎｔ）（ＳＵ１１２４８）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）およびレフルノミド（ＳＵ１０１）が挙げられる。さらなる情報については、例えば、Ｚｈａｎｇ他、２００９、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ、９、２８〜３９を参照のこと。

【0287】

８．Ｔｏｌｌ様受容体
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリーのメンバーは、自然免疫と適応免疫との間をつなぐ重要なものであり、多くのアジュバントの効果がＴＬＲの活性化に依拠している。ガンに対する非常に多数の確立されたワクチンが、ワクチン応答を増強するためにＴＬＲに対するリガンドを組み込んでいる。ＴＬＲ２のほかに、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、とりわけ、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８が、受動免疫療法の取り組みにおけるガン治療のために調べられている。近縁関係にあるＴＬＲ７およびＴＬＲ８は、免疫細胞、腫瘍細胞および腫瘍微小環境に影響を与えることによって抗腫瘍応答に寄与しており、また、ヌクレオシドアナログ構造物によって活性化される場合がある。すべてのＴＬＲが単独型の免疫治療剤またはガンワクチンアジュバントとして使用されており、また、本発明の配合物および方法と相乗的に組み合わされる場合がある。さらなる情報については、ｖａｎ Ｄｕｉｎ他、２００５、Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ＴＬＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．｛ｊ｝Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２７（１）：４９〜５５を参照のこと。

【0288】

９．血管形成阻害剤
腫瘍媒介逃避機構および免疫抑制によって影響される免疫調節受容体を標的とする治療法に加えて、腫瘍環境を標的とする治療法がある。血管形成阻害剤は、腫瘍が生存のために必要とする血管の広範囲にわたる成長（血管形成）を妨げる。例えば、腫瘍細胞の増大する栄養分要求および酸素要求を満たすために腫瘍細胞によって促進される血管形成を、種々の分子を標的化することによって阻止することができる。本発明と組み合わされることがある血管形成媒介分子または血管形成阻害剤の限定されない例として、可溶性ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦイソ型のＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５、受容体のＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ならびに、共受容体のニューロピリン−１およびニューロピリン−２）１およびＮＲＰ−１、アンジオポイエチン２、ＴＳＰ−１およびＴＳＰ−２、アンギオスタチンおよび関連分子、エンドスタチン、バソスタチン、カルレチクリン、血小板因子−４、ＴＩＭＰおよびＣＤＡＩ、Ｍｅｔｈ−１およびＭｅｔｈ−２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γ、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８、プロトロンビン（クリングルドメイン−２）、アンチトロンビンＩＩＩフラグメント、プロラクチン、ＶＥＧＩ、ＳＰＡＲＣ、オステオポンチン、マスピン、カンスタチン（ｃａｎｓｔａｔｉｎ）、プロリフェリン（ｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ）関連タンパク質、レスチン（ｒｅｓｔｉｎ）、ならびに、薬物、例えば、ベバシズマブ、イトラコナゾール、カルボキシアミドトリアゾール、ＴＮＰ−４７０、ＣＭ１０１、ＩＦＮ−α、血小板因子−４、スラミン、ＳＵ５４１６、トロンボスポンジン、ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、血管新生抑制ステロイド＋ヘパリン、軟骨由来血管形成阻害因子、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、２−メトキシエストラジオール、テコガラン（ｔｅｃｏｇａｌａｎ）、テトラチオモリブデン酸塩、サリドマイド、トロンボスポンジン、プロラクチンαＶβ３阻害剤、リノミド（ｌｉｎｏｍｉｄｅ）、タスキニモド（ｔａｓｑｕｉｎｉｍｏｄ）が挙げられる。総説については、ＳｃｈｏｅｎｆｅｌｄおよびＤｒａｎｏｆｆ、２０１１、Ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ、（９）：９７６〜８１を参照のこと。

【0289】

１０．小分子により標的化される治療薬物
小分子により標的化される治療薬物は一般に、ガン細胞内の変異タンパク質、過剰発現タンパク質または他の場合には決定的なタンパク質における酵素ドメインの阻害剤である。突出した、限定されない例として、チロシンキナーゼ阻害剤のイマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ／Ｇｌｉｖｅｃ）およびゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）が挙げられる。小分子、例えば、いくつかのキナーゼを標的化するスニチニブリンゴ酸塩および／またはソラフェニブトシル酸塩をガン治療のためにワクチンとの併用で使用することがまた、以前の特許出願（米国特許出願公開第２００９００４２１３）に記載される。

【0290】

１１．ウイルス型ワクチン
組み合わされた治療的取り組みにおいて本発明の配合物と一緒に使用することができる利用可能であるか、または開発中であるウイルス型ガンワクチンがいくつか存在する。そのようなウイルスベクターを使用することの１つの利点が、ウイルス感染の結果として生じる炎症反応により、免疫活性化のために必要な危険信号がもたらされるとともに、免疫応答を開始させるその固有的能力である。理想的なウイルスベクターは安全でなければならず、かつ、抗腫瘍性の特異的な応答を増強することを可能にするために抗ベクター免疫応答を持ち込んではならない。組換えウイルス、例えば、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルスおよびアビポックスウイルスなどが、動物腫瘍モデルにおいて使用されており、そして、それらの勇気づける結果に基づいて、ヒト臨床試験が開始されている。とりわけ重要なウイルス型ワクチンが、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、すなわち、ウイルスの外被コートに由来するある特定のタンパク質を含有する小さい粒子である。ウイルス様粒子は、ウイルスに由来する遺伝物質を何ら含有せず、かつ、感染を引き起こすことができず、しかし、腫瘍抗原をそのコート表面に提示するように構築することができる。ＶＬＰは様々なウイルスに由来することができ、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、または、パルボウイルス科（例えば、アデノ関連ウイルス）、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ）およびフラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）を含む他のウイルス科などに由来することができる。一般的な総説については、ＳｏｒｅｎｓｅｎおよびＴｈｏｍｐｓｅｎ、２００７、Ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ： ｗｈａｔ ｄｏ ｗｅ ｋｎｏｗ ａｎｄ ｗｈｅｒｅ ａｒｅ ｗｅ ｇｏｉｎｇ？、ＡＰＭＩＳ、１１５（１１）：１１７７〜９３を参照のこと；ガンに対するウイルス様粒子が下記において総説される：Ｂｕｏｎａｇｕｒｏ他、２０１１、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、１０（１１）：１５６９〜８３、ならびに、Ｇｕｉｌｌｅｎ他、２０１０、Ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔｓ： ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｈｒｏｎｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ，ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ｐｒｏｃｅｄｉａ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ、２（２）、１２８〜１３３。

【0291】

１２．多重エピトープ戦略
多重エピトープの使用はワクチン接種についての有望な結果を示している。知的アルゴリズムシステムと組み合わされた高速配列決定技術は、腫瘍ミュータノーム（ｍｕｔａｎｏｍｅ）の利用を可能にしており、本発明と組み合わせることができる個別化ワクチンのための多数のエピトープを提供する場合がある。さらなる情報については、２００７、Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍａｔｕｒｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｌｏａｄｅｄ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、３０：７６２〜７７２、さらには、Ｃａｓｔｌｅ他、２０１２、Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｏｍｅ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、７２（５）：１０８１〜９１を参照のこと。

【0292】

１３．養子Ｔ細胞移入
例えば、腫瘍抗原ワクチン接種とＴ細胞移入との組合せが下記において記載される：Ｒａｐｏｐｏｒｔ他、２０１１、Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ−ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｈＴＥＲＴ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖｉｎ ａｆｔｅｒ ＡＳＣＴ ｆｏｒ ｍｙｅｌｏｍａ、Ｂｌｏｏｄ、１１７（３）：７８８〜９７。

【0293】

１４．ペプチドに基づく標的治療法
様々なペプチドが、細胞表面受容体、または、腫瘍を取り囲む冒された細胞外マトリックスに結合することができる。これらのペプチド（例えば、各種ＲＧＤ）に結合させられる放射性核種は、核種が細胞の近傍で崩壊するならば、最終的にはガン細胞を殺傷する。とりわけ、これらの結合モチーフのオリゴマーまたはマルチマーが非常に興味深い。なぜならば、これは、高まった腫瘍特異性およびアビディティーを引き起こすことができるからである。限定されない例については、Ｙａｍａｄａ、２０１１、Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ，ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ，ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａ、Ｎｉｈｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ、６９（９）：１６５７〜６１を参照のこと。

【0294】

１５．他の治療法
相乗効果をもたらすために本発明の配合物および方法と組み合わせることができる数多くの他のガン治療法がある。限定されない例として、アポトーシスを標的とする処置、温熱療法、ホルモン療法、テロメラーゼ療法、インスリン増強療法、遺伝子療法および光線力学的療法が挙げられる。
以下、参考形態の例を付記する。
１． 少なくとも２つの結合ドメインを含み、第１の結合ドメインがクローディン（ＣＬＤＮ）に結合し、かつ、第２の結合ドメインがＣＤ３に結合する結合剤。
２． 二重特異性分子である１．に記載の結合剤。
３． 前記二重特異性分子が二重特異性抗体である、２．に記載の結合剤。
４． 前記二重特異性抗体が二重特異性単鎖抗体である、３．に記載の結合剤。
５． 前記クローディンがガン細胞において発現される、１．〜４．のいずれか一つに記載の結合剤。
６． 前記クローディンがガン細胞の表面に発現される、１．〜５．のいずれか一つに記載の結合剤。
７． 前記クローディンが、クローディン１８．２およびクローディン６からなる群から選択される、１．〜６．のいずれか一つに記載の結合剤。
８． 前記第１の結合ドメインが前記クローディンの細胞外ドメインに結合する、１．〜７．のいずれか一つに記載の結合剤。
９． 前記第２の結合ドメインがＣＤ３のイプシロン鎖に結合する、１．〜８．のいずれか一つに記載の結合剤。
１０． 前記ＣＤ３がＴ細胞の表面に発現される、１．〜９．のいずれか一つに記載の結合剤。
１１． 当該結合剤がＴ細胞上のＣＤ３に結合することにより、前記Ｔ細胞の増殖および／または活性化が引き起こされ、ただし、前記活性化されたＴ細胞により、細胞傷害性因子（例えば、パーフォリンおよびグランザイム）が好ましくは放出され、かつ、ガン細胞の細胞溶解およびアポトーシスが開始される、１．〜１０．のいずれか一つに記載の結合剤。
１２． クローディンに対する前記結合および／またはＣＤ３に対する前記結合が特異的な結合である、１．〜１１．のいずれか一つに記載の結合剤。
１３． 全長型抗体または抗体フラグメントの形式である、１．〜１２．のいずれか一つに記載の結合剤。
１４． 少なくとも２つの結合ドメインを伴う一組の抗体可変ドメイン（好ましくは４つの抗体可変ドメイン）を含み、ただし、少なくとも１つの結合ドメインがクローディンに結合し、かつ、少なくとも１つの結合ドメインがＣＤ３に結合する、１．〜１３．のいずれか一つに記載の結合剤。
１５． 免疫グロブリンの重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）で、クローディン抗原に対する特異性を有する可変ドメイン（ＶＨ（ＣＬＤＮ））、免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）で、クローディン抗原に対する特異性を有する可変ドメイン（ＶＬ（ＣＬＤＮ））、免疫グロブリンの重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）で、ＣＤ３に対する特異性を有する可変ドメイン（ＶＨ（ＣＤ３））、および、免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）で、ＣＤ３に対する特異性を有する可変ドメイン（ＶＬ（ＣＤ３））を含む、１．〜１４．のいずれか一つに記載の結合剤。
１６． 同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメインにつながれる重鎖可変ドメインを含むジアボディーの形式であり、その結果、これら２つのドメインが対形成しないようにされる、１．〜１５．のいずれか一つに記載の結合剤。
１７． 前記ジアボディーが２つのポリペプチド鎖を含み、ただし、一方のポリペプチドがＶＨ（ＣＬＤＮ）およびＶＬ（ＣＤ３）を含み、他方のポリペプチド鎖がＶＨ（ＣＤ３）およびＶＬ（ＣＬＤＮ）を含む、１６．に記載の結合剤。
１８． リンカーペプチドを介してつながれる２つのｓｃＦｖ分子からなる二重特異性単鎖抗体の形式である、１．〜１５．のいずれか一つに記載の結合剤。
１９． 前記重鎖可変領域（ＶＨ）およびその対応する軽鎖可変領域（ＶＬ）が、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ（ＣＬＤＮ）−ＶＬ（ＣＬＤＮ）−ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＤ３）の順、ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＤ３）−ＶＨ（ＣＬＤＮ）−ＶＬ（ＣＬＤＮ）の順、または、ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＬＤＮ）−ＶＨ（ＣＬＤＮ）の順で配置される、１８．に記載の結合剤。
２０． 前記重鎖可変領域（ＶＨ）およびその対応する軽鎖可変領域（ＶＬ）が、長いペプチドリンカーを介して、好ましくは、（ＧＧＧＧＳ）３またはＶＥ（ＧＧＧＧＳ）２ＧＧＶＤのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介してつながれる、１９．に記載の結合剤。
２１． 前記２つのＶＨ−ＶＬ型ｓｃＦｖユニットまたはＶＬ−ＶＨ型ｓｃＦｖユニットが、短いペプチドリンカーを介して、好ましくは、ＳＧＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介してつながれる、１９．または２０．に記載の結合剤。
２２． 前記ＣＬＤＮがＣＬＤＮ１８．２であり、前記ＶＨ（ＣＬＤＮ）が、配列番号８によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含み、かつ、前記ＶＬ（ＣＬＤＮ）が、配列番号１５によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含む、１５．〜２１．のいずれか一つに記載の結合剤。
２３． 前記ＣＬＤＮがＣＬＤＮ６であり、前記ＶＨ（ＣＬＤＮ）が、配列番号２２によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含み、かつ、前記ＶＬ（ＣＬＤＮ）が、配列番号２３によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含む、１５．〜２１．のいずれか一つに記載の結合剤。
２４． 前記ＶＨ（ＣＤ３）が、配列番号３６によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含み、かつ、前記ＶＬ（ＣＤ３）が、配列番号３７によって表されるアミノ酸配列またはそのフラグメントあるいは前記アミノ酸配列またはフラグメントの変化体を含む、１５．〜２３．のいずれか一つに記載の結合剤。
２５． 前記ＣＬＤＮがＣＬＤＮ１８．２であり、かつ、当該結合剤が、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいはそのフラグメントまたは変化体を含む、１．〜２２および２４のいずれか一つに記載の結合剤。
２６． 前記ＣＬＤＮがＣＬＤＮ６であり、かつ、当該結合剤が、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいはそのフラグメントまたは変化体を含む、１．〜２１、２３および２４のいずれか一つに記載の結合剤。
２７． ＣＬＤＮ１８．２を発現する前記ガン細胞が、胃ガン、食道ガン、膵臓ガン、肺ガン（例えば、非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）など）、乳ガン、卵巣ガン、結腸ガン、肝ガン、頭頸部ガン、胆嚢のガン、ならびに、それらの転移物、クルケンベルグ腫瘍、腹膜転移物および／またはリンパ節転移物からなる群から選択されるガンのガン細胞である、５．〜２２、２４および２５のいずれか一つに記載の結合剤。
２８． ＣＬＤＮ６を発現する前記ガン細胞が、膀胱ガン、卵巣ガン（特に、卵巣腺ガンおよび卵巣奇形ガン）、肺ガン（小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）を含むが、特に、扁平上皮肺ガンおよび扁平上皮肺腺ガン）、胃ガン、乳ガン、肝ガン、膵臓ガン、皮膚ガン（特に、基底細胞ガンおよび扁平上皮ガン）、悪性メラノーマ、頭頸部ガン（特に、悪性多形性腺腫）、肉腫（特に、滑膜肉腫および滑膜ガン肉腫）、胆管ガン、膀胱のガン（特に、移行上皮ガンおよび移行上皮乳頭状ガン）、腎臓ガン（特に、腎明細胞ガンおよび乳頭状腎細胞ガンを含む腎細胞ガン）、結腸ガン、小腸ガン（回腸のガン、特に、小腸腺ガンおよび回腸の腺ガンを含む）、精巣胎児性ガン、胎盤性絨毛ガン、子宮頸ガン、精巣ガン（特に、精巣セミノーマ、精巣奇形腫および胎芽性精巣ガン）、子宮ガン、胚細胞腫瘍（例えば、奇形ガンまたは胚性ガン腫など、特に、精巣の胚細胞腫瘍）、および、それらの転移形態物からなる群から選択されるガンのガン細胞である、５．〜２１、２３、２４および２６のいずれか一つに記載の結合剤。
２９． Ｎ末端の分泌シグナルおよび／またはＣ末端のヒスチジンエピトープタグ（好ましくはヒスチジンが６個のエピトープタグ）を有する、１．〜２８．のいずれか一つに記載の結合剤。
３０． １．〜２９．のいずれか一つに記載される結合剤をコードする組換え核酸。
３１． ベクターの形態またはＲＮＡの形態である３０．に記載の組換え核酸。
３２． ３０．または３１．に記載される組換え核酸を含む宿主細胞。
３３． 治療において使用されるための、特に、ガンを処置することまたは防止することにおいて使用されるための、１．〜２９．のいずれか一つに記載の結合剤、３０．または３１．に記載の組換え核酸、あるいは、３２．に記載の宿主細胞。
３４． １．〜２９．のいずれか一つに記載される結合剤、３０．または３１．に記載される組換え核酸、あるいは、３２．に記載される宿主細胞を含む医薬組成物。
３５． ３４．に記載される医薬組成物を患者に投与することを含む、ガン疾患を処置するか、または防止する方法。
３６． 前記ガンの細胞が、前記結合剤が結合することができるクローディンを発現する、３３．に記載の結合剤、組換え核酸または宿主細胞、あるいは、３５．に記載の方法。
３７． 前記クローディンがＣＬＤＮ１８．２であり、かつ、前記ガンが、胃ガン、食道ガン、膵臓ガン、肺ガン（例えば、非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）など）、乳ガン、卵巣ガン、結腸ガン、肝ガン、頭頸部ガン、胆嚢のガン、ならびに、それらの転移物、クルケンベルグ腫瘍、腹膜転移物および／またはリンパ節転移物からなる群から選択される、３６．に記載の結合剤、組換え核酸、宿主細胞または方法。
３８． 前記クローディンがＣＬＤＮ６であり、かつ、前記ガンが、膀胱ガン、卵巣ガン（特に、卵巣腺ガンおよび卵巣奇形ガン）、肺ガン（小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）を含むが、特に、扁平上皮肺ガンおよび扁平上皮肺腺ガン）、胃ガン、乳ガン、肝ガン、膵臓ガン、皮膚ガン（特に、基底細胞ガンおよび扁平上皮ガン）、悪性メラノーマ、頭頸部ガン（特に、悪性多形性腺腫）、肉腫（特に、滑膜肉腫および滑膜ガン肉腫）、胆管ガン、膀胱のガン（特に、移行上皮ガンおよび移行上皮乳頭状ガン）、腎臓ガン（特に、腎明細胞ガンおよび乳頭状腎細胞ガンを含む腎細胞ガン）、結腸ガン、小腸ガン（回腸のガン、特に、小腸腺ガンおよび回腸の腺ガンを含む）、精巣胎児性ガン、胎盤性絨毛ガン、子宮頸ガン、精巣ガン（特に、精巣セミノーマ、精巣奇形腫および胎芽性精巣ガン）、子宮ガン、胚細胞腫瘍（例えば、奇形ガンまたは胚性ガン腫など、特に、精巣の胚細胞腫瘍）、および、それらの転移形態物からなる群から選択される、３６．に記載の結合剤、組換え核酸、宿主細胞または方法。

【0295】

本発明がさらに、本発明の範囲を限定するものとして解釈されない下記の実施例によって例示される。

【実施例】

【0296】

実施例１：ＣＬＤＮ１８．２およびＣＤ３を標的化する二重特異性結合剤の作製および試験
ａ．ｂｉ−ｓｃＦｖ構築物の配列起源、設計および発現ベクターへのクローニング
ヒトＴ細胞受容体成分ＣＤ３およびヒト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して特異的である結合ドメインを含有する二重特異性のタンデム型単鎖抗体構築物（ｂｉ−ｓｃＦｖ）を調製した。それぞれの構築物のための対応する可変重鎖領域（ＶＨ）および対応する可変軽鎖領域（ＶＬ）を具体的には、Ｎ末端からＣ末端に、下記の連続する順で配置した：

【化1】

【0297】

表１には、本発明の過程で作製された、ＴＡＡ ＣＬＤＮ１８．２およびＰＬＡＣ１に対して特異的であるすべてのｂｉ−ｓｃＦｖ構築物がまとめられる。これらのｂｉ−ｓｃＦｖ構築物を、対応する抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列を使用してＧｅｎｅＡｒｔ ＡＧ（ＧｅｎｅＡｒｔ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）による遺伝子合成によって作製した。コドン最適化、例えば、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（ＨＳ）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ＭＭ）またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）をＧｅｎｅＡｒｔ社のＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）ソフトウエアによって実行した。これらが表１に示される。特異性、モノクローナル抗体（ｍＡＢ）からの配列起源、コドン使用頻度、さらなる配列特徴、および、すべての適用されたドメインの参考文献に関する情報が表２にまとめられる。それぞれのＣＤ３抗体の可変ドメイン配列起源が表２に示される。ヒトＴＡＡおよびマウスＴＡＡの大きい相同性のために、同じ抗ＴＡＡ ＶＨ配列およびＶＬ配列を、マウス特異的な抗ＣＤ３抗体クローン１４５−２Ｃ１１のＶＨ配列、ＶＬ配列との組合せでの場合を除いて、マウスアッセイのためのｂｉ−ｓｃＦｖ構築物の作製のために使用することができた。
ＤＮＡクローニングおよび発現ベクター構築を、当業者によって広く知られている標準的な手順（Ｇｒｅｅｎ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、２０１２）に従って行った。簡単に記載すると、最初のｂｉ−ｓｃＦｖ ＤＮＡ配列には、５'側でのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位および３'側でのＸｈｏＩ制限部位（ｂｉ−ｓｃＦｖ １ＢｉＭＡＢの場合にはＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ）が発現プラスミドへのクローニングのために与えられた。分泌シグナル配列を細胞質から培養培地へのタンパク質分泌のために５'末端においてｂｉ−ｓｃＦｖ配列の上流側に導入した。１５個〜１８個のアミノ酸の柔軟なグリシン−セリンペプチドリンカーをコードする配列を、一方がＣＤ３に結合し、かつ、他方がＴＡＡに結合する単鎖可変抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を組み立てるためのＶＨドメインおよびＶＬドメインをつなぎ合わせるために挿入した。二重特異性単鎖抗体を形成するために、これら２つのｓｃＦｖドメイン配列を、短いペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ）をコードする配列によってつないだ。このリンカー配列と一緒に、ＢａｍＨＩ制限部位を、今後予定されているｂｉ−ｓｃＦＶ構築物のクローニングのためのｓｃＦｖドメイン交換のために導入した。詳細には、５'側のｓｃＦｖドメインをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩの制限によって交換することができ、３'側のｓｃＦｖドメインをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩの制限によって交換することができた。構築物の概要については、図１もまた参照のこと。
すべての使用されたｂｉ−ｓｃＦｖ抗体構築物を標準的な哺乳動物発現ベクターのｐｃＤＮＡ（商標）３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）にクローン化した。Ｃ末端の６×Ｈｉｓタグが、タンパク質の金属親和性精製のために、また、検出分析のために役立った。すべての構築物をＭＷＧの単回読み取り配列サービス（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、ドイツ）による配列決定によって確認した。

【0298】

【表1】

【0299】

【表2】

【0300】

ｂ．安定な産生細胞株の作製
ＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の安定な産生細胞クローンを作製するために、ヒト胚性腎臓細胞株ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）およびチャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）を使用した。

【0301】

ＨＥＫ２９３のトランスフェクション
１×１０^７個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションの２日前に、１４．５ｃｍの組織培養ディッシュに、２０ｍｌの完全ＤＭＥＭ培地（１０％の熱不活化ＦＢＳおよび０．５％のペニシリン−ストレプトマイシンが補充されるＤＭＥＭ／Ｆ−１２ ＧｌｕｔａＭａｘ；すべての試薬を、Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）から得た）において置床した。トランスフェクションの前に、細胞を、２ｍＭのＥＤＴＡが補充されるＤＰＢＳにより洗浄し、その後、ＦＢＳも抗生物質も含まない２０ｍｌの非補充ＤＭＥＭを加えた。実施例１．ａで記載される構築物の２０μｇの線状化ＤＮＡを０．５ｍｌの非補充ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で希釈した。１ｍｇ／ｍｌの線状ＰＥＩ溶液（ポリエチレンイミン；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ、ドイツ）の７５μｌを希釈されたＤＮＡに加え、激しくボルテックス撹拌した。ＲＴでの１５分間のインキュベーションの後、ＤＮＡ／ＰＥＩ複合物を細胞に滴下して加え、細胞培養ディッシュを穏やかに回転させ、その後、３７℃、５％ＣＯ_２においてインキュベーションした。トランスフェクション後２４時間で、培地を交換した。トランスフェクションされた細胞の選抜を、Ｇ４１８硫酸塩（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を０．８ｍｇ／ｍｌの最終濃度で用いてトランスフェクション後４８時間で開始した。Ｇ４１８を常時、細胞培養のために培養培地に加えた。

【0302】

ＣＨＯ−Ｋ１のトランスフェクション
１×１０^６個のＣＨＯ−Ｋ１細胞をトランスフェクションの１日前に、６ウエル組織培養プレートに、２ｍｌの完全ＤＭＥＭ培地（１０％の熱不活化ＦＢＳが補充され、抗生物質を含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２ ＧｌｕｔａＭａｘ；すべての試薬を、Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）から得た）において置床した。トランスフェクションの前に、細胞を、２ｍＭのＥＤＴＡが補充されるＤＰＢＳにより洗浄し、その後、ＦＣＳも抗生物質も含まない１．５ｍｌの非補充ＤＭＥＭを加えた。実施例１．ａで記載される構築物の４μｇの線状化ＤＮＡを０．２５ｍｌの非補充ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で希釈し、穏やか混合した。第２の反応チューブにおいて、２．５μｌのリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を０．２５ｍｌの非補充ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で希釈し、穏やかに混合し、ＲＴで５分間インキュベーションした。ＤＮＡミックスおよびリポフェクタミンミックスを１：１の比率で一緒にし、穏やかに混合し、ＲＴで２０分間インキュベーションした。ＤＮＡ／リポフェクタミン２０００複合物を細胞に滴下して加え、細胞培養ディッシュを穏やかに回転させ、その後、３７℃、５％ＣＯ_２においてインキュベーションした。トランスフェクション後６時間で、培地を完全ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に交換した。細胞を翌日、１：１０の比率で分割した。トランスフェクションされた細胞の選抜を、Ｇ４１８硫酸塩（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で用いてトランスフェクション後４８時間で開始した。Ｇ４１８を常時、細胞培養のために培養培地に加えた。

【0303】

ｃ．産生細胞としてのＨＥＫ２９３の選抜
実施例１．ｂで記載される安定的にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞株およびＣＨＯ−Ｋ１細胞株によるｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の発現を、ｂｉ−ｓｃＦｖ発現を標準的な手順（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１２）に従って検出するために免疫蛍光染色によって特徴づけた。簡単に記載すると、２×１０^５個の細胞をガラススライド上で２４時間成長させ、その後、細胞に２％ＰＦＡを浸透させた。５％のＢＳＡおよび０．２％のサポニンが補充されるＤＰＢＳをブロッキング緩衝液として使用した。ＤＰＢＳによる洗浄およびブロッキング緩衝液によるブロッキング処理の後、細胞を、ブロッキング緩衝液において１：５００で希釈される一次抗体のＡｎｔｉ−ＨＩＳ Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｔａｇ（Ｄｉａｎｏｖａ ＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）とＲＴで３０分間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液による洗浄の後、ブロッキング緩衝液において１：５００で希釈される二次のＣｙ３コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ、Ｓｕｆｆｏｌｋ、英国）を加え、ＲＴで３時間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液およびＨ２Ｏによる洗浄の後、細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２色素（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国）が補充されるＤＡＫＯ封入剤（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ、米国）に包埋した。スライドを、ｂｉ−ｓｃＦｖ陽性細胞の存在について、Ｎｉｋｏｎ−Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ蛍光顕微鏡を用いて調べ、写真撮影した（データは示されず）。ＨＥＫ２９３細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞よりも全体的に良好なｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の発現を示し、したがって、ＨＥＫ２９３細胞を産生細胞株として選んだ。

【0304】

ｄ．ＨＥＫ２９３クローン＃２８によるｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢの産生および検出
ｂｉ−ｓｃＦｖの１ＢｉＭＡＢを、様々なアッセイを確立するために産生され、精製され、また、使用されるための最初のｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質として選んだ。この目的のために、１ＢｉＭＡＢを安定的に発現するＨＥＫ２９３未分画（ｂｕｌｋ）細胞のクローン細胞株（実施例１．ｂを参照のこと）を、ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞選別器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を使用する単一細胞選別によって得た。ほぼ４０個のクローン株を拡大培養した後、最も良い産生体クローンを実施例１．ｃで記載されるように免疫蛍光によって選抜した。
選抜された産生体クローン＃２８を拡大培養し、１０層のＣｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）で、１０％のＦＢＳ、０．５％のペニシリン−ストレプトマイシンおよび０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８が補充されるＤＭＥＭ／Ｆ−１２ ＧｌｕｔａＭａｘ（すべての試薬を、Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）から得た）において製造者の指針に従って培養した。コンフルエントな段階で、細胞をＤＰＢＳにより洗浄し、培地を、抗生物質を含むが、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に変えた。ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢを含有する細胞上清を４週間までにわたって３日〜５日毎に集めた。上清を、５００ｍｌのＳｔｅｒｉｔｏｐ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、米国）を用いてろ過し、ＦＰＬＣ精製まで４℃で貯蔵した。
ＦＰＬＣ精製の前に、細胞培養上清におけるｂｉ−ｓｃＦｖの存在を、標準法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２）によって行われるポリアクリルアミドゲル電気泳動、続く、クーマシー染色およびウエスタンブロット分析によって調べた。上清を、製造者のプロトコルに従って、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ（１０Ｋ ＭＷＣＯ）（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、米国）によって５×〜１０×濃縮した。濃縮された上清および濃縮されていない上清を、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）で分離した。続いて、ゲルを、細胞培養上清に含有される５０ｋＤ〜６０ｋＤの間のｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢおよび他のタンパク質の間においてを検出するために標準的な手順に従ってクーマシーブリリアントブルー溶液により染色した。ウエスタンブロット分析を、ｂｉ−ｓｃＦｃタンパク質１ＢｉＭＡＢをその６×Ｈｉｓタグにより特異的に検出するために行った。簡単に記載すると、タンパク質をＰＶＤＦメンブランにブロットし、ブロッキング処理をＰＢＳＴ／３％粉乳により行った後、メンブランを、ブロッキング緩衝液において１：５００で希釈される一次抗体Ａｎｔｉ−ＨＩＳ Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｔａｇ（Ｄｉａｎｏｖａ ＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）と４℃で１時間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液による洗浄の後、メンブランを、ブロッキング緩衝液において１：１００００で希釈されるＦｃ特異的な二次のペルオキシダーゼコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）と４℃で１時間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液による洗浄の後、シグナルを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国）によって可視化し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００ Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）によって記録した。ｂｉ−ｓｃＦｖのシグナルが、内部分子量標準と比較した場合、５０ｋＤと６０ｋＤとの間に検出された（図３Ａおよび図３Ｂを参照のこと）。

【0305】

ｅ．ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢの精製および定量
ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢを含有するＨＥＫ２９３クローン＃２８の細胞培養上清（実施例１．ｄで記載されるもの）を、標準的な手順（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２）を使用する固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に供した。簡単に記載すると、ろ過された細胞培養上清を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ １０ ＦＰＬＣシステムにつながれるＨｉｓ Ｔｒａｐ ＦＦ（５ｍｌ）カラムに負荷した（ともに、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）。ＰＢＳ洗浄緩衝液は１０ｍＭのイミダゾールを含有し、ＰＢＳ溶出緩衝液は、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４および２５０ｍＭのイミダゾールを含有し、両方の緩衝液のｐＨを７．４に調節した。溶出を段階的勾配によって行った。溶出されたｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢを、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｇ２ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（１０Ｋ ＭＷＣＯ）（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国）を使用して１×ＰＢＳに対して直ちに透析した。１×ＰＢＳに対する透析の後、ｂｉ−ｓｃＦｖを、Ｈ２Ｏに基づく２００ｍＭアルギニン緩衝液（Ｌ−アルギニン一塩酸塩；Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）に対して透析した。
ｂｉ−ｓｃＦｖの濃度を、ＰｒｏｔＰａｒａｍツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）により求められるｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢの吸光係数および分子量の考慮のもと、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ｃを用いた２８０ｎｍでの測定によって求めた。精製されたタンパク質を小分けし、長期間の貯蔵のためには−８０℃で貯蔵し、直ちに使用するためには４℃で保った。
ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢの品質および純度を、実施例１．ｄで記載されるようにクーマシー染色およびウエスタンブロット分析によって調べた（図３Ａおよび図３Ｂもまた参照のこと）。ＢＳＡ標準物希釈物を、ＮａｎｏＤｒｏｐによって測定される濃度を大雑把に確認するためにクーマシー手法では含めた（データは示されず）。

【0306】

ｆ．ＥＬＩＳＡアッセイの確立
ＨＥＫ２９３細胞の細胞培養上清における１ＢｉＭＡＢの定量化のために、特異的なＥＬＩＳＡアッセイを確立しなければならなかった。この目的のために、実施例１．ｄからの上清と、実施例１．ｅで記載される精製されたｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢとを使用した。ＢＳＡで事前にブロッキング処理されたＮｉ−ＮＴＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国）を使用して、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢをその６×Ｈｉｓタグにより固定化した。すべての洗浄工程をウエルあたり２００μｌの１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（洗浄緩衝液）により３回行い、すべての工程を室温で実行した。標準物として、精製された１ＢｉＭＡＢタンパク質を使用し、これを１０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲内において１×ＰＢＳで希釈した。上清を１×ＰＢＳにおいて１：１０で希釈した。１００μｌの希釈タンパク質または上清をそれぞれのウエルに移し、振とうしながら１時間インキュベーションした。洗浄後、ｍＣＬＤＮ１８．２ａｂのＶＨ−ＶＬドメインに対する抗イディオタイプ抗体を１×ＰＢＳ／３％ＢＳＡにおいて０．５μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。１００μｌの抗ｍＣＬＤＮ１８．２ａｂ溶液をウエルあたり加え、振とうしながら１時間インキュベーションした。洗浄後、ＡＰコンジュゲート化抗マウスＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ、Ｓｕｆｆｏｌｋ、英国）を１×ＰＢＳ／３％ＢＳＡにおいて３００ｎｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。１００μｌのこの二次抗体溶液をウエルあたり加え、振とうしながらさらに１時間インキュベーションした。陰性コントロールとして、二次抗体のみ、１ＢｉＭＡＢ＋二次抗体、および、抗ｍＣＬＤＮ１８．２ａｂ＋二次抗体を使用した。加えて、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質を含まないＨＥＫ２９３細胞上液をアッセイに含めた。最後に、５０μｌのＡＰ基質溶液（１ｍｌの基質緩衝液あたり１．５ｍｇのｐＮＰＰ、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を洗浄後にウエルあたり加えた。暗所での５分、１５分および３０分のインキュベーションの後、４９２ｎｍの励起波長を用いた４０５ｎｍにおける吸収を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、スイス）を用いて測定した。上清由来のｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の濃度を標準物列に対する計算によって求めた（データは示されず）。

【0307】

ｇ．比較研究のためのＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の一過性トランスフェクション
好ましくは多量のＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質を一過性に生成させるために、ヒト胚性腎臓細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１２６８）をトランスフェクションのために使用した。
１×１０^７個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションの２日前に、１４．５ｃｍの組織培養ディッシュに、２０ｍｌの完全ＤＭＥＭ培地（１０％の熱不活化ＦＢＳおよび０．５％のペニシリン−ストレプトマイシンが補充されるＤＭＥＭ／Ｆ−１２ ＧｌｕｔａＭａｘ；すべての試薬を、Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）から得た）において置床した。トランスフェクションの前に、細胞を、２ｍＭのＥＤＴＡが補充されるＤＰＢＳにより洗浄し、その後、ＦＢＳも抗生物質も含まない２０ｍｌの非補充ＤＭＥＭを加えた。２０μｇの環状ＤＮＡ構築物（１ＢｉＭＡＢ、ｎｏ．１１〜ｎｏ．２０およびｎｏ．３５（これらは実施例１．ｂで記載される））を０．５ｍｌの非補充ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で希釈した。１ｍｇ／ｍｌの線状ＰＥＩ溶液（ポリエチレンイミン；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ、ドイツ）の７５μｌを希釈されたＤＮＡに加え、激しくボルテックス撹拌した。ＲＴでの１５分間のインキュベーションの後、ＤＮＡ／ＰＥＩ複合物を細胞に滴下して加え、細胞培養ディッシュを穏やかに回転させ、その後、３７℃、５％ＣＯ_２において２４時間インキュベーションした。非補充ＤＭＥＭ／Ｆ−１２による培地交換の後、細胞を、３３℃、５％ＣＯ_２においてさらに４８時間インキュベーションした。細胞上清をインキュベーション後に集め、０．２μｍのＭｉｎｉｓａｒｔシリンジフィルター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）により無菌ろ過した。続いて、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質を製造者のプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）に従ってＮｉ−ＮＴＡスピンカラムによって細胞培養上清から小規模で精製した。ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の濃度を、実施例１．ｆで記載されるようにＥＬＩＳＡによって見積もり、実施例１．ｅで記載されるようにウエスタンブロット分析によって確認した（データは示されず）。精製されたタンパク質を、直ちに使用するために４℃で貯蔵した。

【0308】

実施例２：ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質によって媒介される標的変更させられたＴ細胞による特異的なＴ細胞活性化および標的細胞溶解をモニターするための機能的アッセイの確立
ＦＰＬＣ精製されたｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢを使用して、ヒトエフェクター細胞をＴＡＡ陽性標的細胞に特異的に標的変更させるｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の能力をモニターするためのインビトロアッセイを確立した。この目的は、影響を可視化すること、ならびに、ヒトＴ細胞の活性化および特異的な標的細胞溶解を定量化することであった。

【0309】

ａ．ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質によって標的細胞に標的変更させられるＴ細胞の顕微鏡法分析
ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の機能性を可視化するためには、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質によるＣＬＤＮ１８．２発現標的細胞へのエフェクター細胞の標的変更を顕微鏡により示すためのアッセイを確立しなければならなかった。この目的のために、比較的高レベルのヒトＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する胃ガン細胞株ＮｕｇＣ４（Ｓａｈｉｎ Ｕ．他、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２００８（Ｄｅｃ １）、１４（２３）：７６２４〜３４）を標的細胞株として使用した。
ヒトエフェクター細胞を標準的な手順（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１２）に従って健康なドナーからのヒト血液から新たに単離した：簡単に記載すると、血液をＤＰＢＳにより希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）に重層し、遠心分離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を相間から回収し、２ｍＭのＥＤＴＡが補充される冷ＤＰＢＳにより洗浄し、計数した。続いて、ヒトＴ細胞を、ＰＢＭＣから、Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｔｅｔｅｒｏｗ、ドイツ）により製造者の指針に従って磁気活性化細胞分離（ＭＡＣＳ）によって分離した。
１×１０^５個のＮｕｇＣ４細胞を組織培養用６ウエルプレートにウエルあたり播種した。ヒト細胞を上記のように調製し、５：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で加えた。５％の熱不活化ヒトＡＢ血清、０．５％のペニシリン−ストレプトマイシン、１×ＮＥＡＡおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムが補充されるＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）をすべての細胞のために使用し、ウエルあたりの最終体積を２ｍｌ／ウエルに調節した。コントロールサンプルは、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質を伴って、また、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質を伴うことなく、単独での標的細胞またはＴ細胞を含んだ。組織培養プレートを続いて、３７℃、５％ＣＯ_２においてインキュベーションした。アッセイを、共インキュベーションの６時間から４８時間まで、Ｗｉｌｏｖｅｒｔ Ｓ倒立顕微鏡（Ｈｕｎｄ、Ｗｅｔｚｌａｒ、ドイツ）を用いて連続して観察した。ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢの存在下における標的細胞上でのＴ細胞クラスター化、免疫学的シナプスの形成および標的細胞の殺傷に関しての著しい影響が２４時間で認められた。４８時間後、生存可能な標的細胞をほとんど見出すことができなかった。写真を、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＳ１００倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、日本）を用いて２４時間において撮影した。図５もまた参照のこと。
このアッセイをさらには、様々なウエル形式でのすべての細胞傷害性アッセイにおいて可視性コントロールとして含めた。

【0310】

ｂ．ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢによる標的依存的なＴ細胞活性化
ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質によるヒトＴ細胞の特異的な活性化を検出するために、フローサイトメトリーアッセイを確立した。Ｔ細胞活性化を検出するために、初期活性化マーカーＣＤ６９および後期活性化マーカーＣＤ２５を蛍光コンジュゲート化抗体による染色のために選択した。標的細胞およびＴ細胞の混合物におけるヒトＴ細胞の検出のために、Ｔ細胞上のＣＤ３を染色した。
上記から設定されるアッセイを選んだ（実施例２．ａ）。簡単に記載すると、ＮｕｇＣ４標的細胞を２ｍｌの完全培地において５：１のＥ：Ｔ比でヒトＴ細胞と一緒に播種し、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢを０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で加えた。コントロールサンプルは、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢを伴って、また、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢを伴うことなく、単独での標的細胞またはＴ細胞を含有した。２４時間後および／または４８時間後（これは可視性コントロールの結果に依存した）、すべての細胞を、Ｃｅｌｌ Ｓｃｒａｐｅｒｓ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ ＡＧ＆Ｃｏ、Ｎｕｒｍｂｒｅｃｈｔ、ドイツ）を用いて穏やかにかき取ることによって集め、５ｍｌの丸底チューブ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）に移した。細胞を遠心分離し、ＤＰＢＳにより洗浄した。細胞染色のために、マウス抗ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣ、マウス抗ヒトＣＤ６９−ＡＰＣおよびマウス抗ヒトＣＤ２５−ＰＥ（すべての抗体が、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を使用した。細胞ペレットを、蛍光コンジュゲート化抗体を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（５％のＦＢＳが補充されるＤＰＢＳ）に再懸濁した。インキュベーションを暗所において４℃で２０分間行った後、サンプルを４ｍｌのＤＰＢＳにより洗浄し、細胞ペレットを、死細胞の検出のために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）または７−ＡＡＤ（ともに、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）を１：１０００の最終希釈度で含有する２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。サンプルを、測定期間中を通して氷上および暗所において保った。アッセイの確立を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて行い、その後の測定を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターを用いて行った（ともに、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）。分析をＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ、米国）によって評価した。
図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、１ＢｉＭＡＢ媒介のＴ細胞活性化が標的細胞の非存在下では全く検出できず、このことは、ｂｉ−ｓｃＦｖ機能性の厳密な標的依存性を強調している。標的細胞の存在下における著しいＴ細胞活性化が２４時間後にほんの０．０１ｎｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢにより生じた。最大効率には、１００ｎｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢを使用して達した。
Ｔ細胞活性化の研究のほかに、このアッセイはまた、標的細胞集団に対してゲート開閉し、ＰＩ陽性または７−ＡＡＤ陽性の標的細胞の割合を推定することによって標的細胞殺傷に対するｂｉ−ｓｃＦｖ媒介影響の定性的分析を可能にする（データは示されず）。すべての分析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ、米国）を用いて行った。

【0311】

ｃ．ルシフェラーゼ細胞傷害性アッセイ
ＣＬＤＮ１８．２およびＣＤ３に対して向けられるｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の標的細胞殺傷能におけるかすかな違いを明らかにするために、高感度アッセイを開発しなければならなかった。この目的は、標的細胞殺傷をハイスループット様式で定量的にモニターすることができるアッセイを確立することであった。このことを達成するために、ルシフェラーゼ細胞傷害性アッセイを選んだ。これとともに、生存可能な標的細胞によるルシフェラーゼ発現の測定は、抗体の存在下で細胞傷害性エフェクター細胞によって媒介される標的細胞溶解を間接的に求めることを可能にする。
最初に、ＮｕｇＣ４細胞（上記）を、ホタルルシフェラーゼ、ＥＧＦＰレポーター遺伝子および抗生物質選択マーカーを有するレンチウイルスベクターにより形質導入した。形質導入された細胞の抗生物質による選抜の後、ＥＧＦＰ高発現細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ細胞選別器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）によって選別し、ルシフェラーゼの高発現について分析し、続いて、さらなる研究のために拡大培養した。
ヒトエフェクター細胞を実施例２．ａで記載されるように調製した。アッセイの確立をｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢの１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲内で行い、それにより、５ｎｇ／ｍｌの濃度が非常に効率的かつ再現性のある影響をもたらすことが見出され、この濃度をさらには、標準濃度として使用した。ルシフェラーゼを安定的に発現するＮｕｇＣ４細胞（上記）を標的細胞として使用した。１×１０^４個の標的細胞を白色の平底９６ウエルプレートにウエルあたり播種した。ヒトＴ細胞（実施例２．ａで記載されるように調製されたもの）を５：１のＥ：Ｔ比で加えた。上記（実施例２．ａ）で記載される培地を使用し、ウエルあたりの最終体積を１００μｌに調節した。試験サンプルおよびコントロールサンプルを少なくとも三連で置床した。
細胞培養マイクロプレートを、３７℃、５％ＣＯ_２において２４時間および４８時間インキュベーションした。分析のために、１ｍｇ／ｍｌのルシフェリン（ＢＤ Ｍｏｎｏｌｉｇｈｔ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）および５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する水溶液の５０μｌをウエルあたり加え、続いて、プレートを３７℃において暗所で３０分間インキュベーションした。ルシフェラーゼを発現する生細胞によるルシフェリンの酸化から生じる発光をマイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００、Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、スイス）で測定した。特異的な標的細胞溶解の百分率を下記の式によって計算した：％特異的溶解＝［１−（発光試験サンプル−Ｌ_ｍａｘ）／（Ｌ_ｍｉｎ−Ｌ_ｍａｘ）］×１００、ただし、"Ｌ"は溶解を示す。Ｌ_ｍｉｎはｂｉ−ｓｃＦｖの非存在下における最小溶解を示し、Ｌ_ｍａｘは、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（２％の最終濃度）の添加によって達成されるｂｉ−ｓｃＦｖの非存在下における最大溶解（自然発光カウント数に等しい）を示す。
エフェクター細胞に依存しない標的細胞に対するｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の潜在的な直接的影響を、すべてのコントロール（例えば、Ｌ_ｍｉｎおよびＬ_ｍａｘなど）を含めて、ヒトＴ細胞を伴うことなく標的細胞を置床することによって求めた。
このアッセイを、標的細胞の特異的なＴ細胞媒介溶解を詳しく調べるためのさらなる研究のために使用した。様々な改変を、例えば、ｂｉ−ｓｃＦｖ濃度、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質、Ｅ：Ｔ比またはエフェクター細胞（ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＰＢＭＣ）を変更することによって実行した。

【0312】

実施例３：ＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖリード候補物の選択
最も強力なｂｉ−ｓｃＦｖ変化体を選択するための様々なＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質を用いたルシフェラーゼ細胞傷害性アッセイ
ＴＡＡ ＣＬＤＮ１８．２に対して特異的な１０個すべてのＣＨＯコドン最適化構築物（ｎｏ．１１〜ｎｏ．２０）を、ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現し、かつ、ルシフェラーゼを異所性に発現するＮｕｇＣ４標的細胞を用いたルシフェラーゼ細胞傷害性アッセイにおいてヒトコドン最適化ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢとの比較で試験した（実施例２．ｃもまた参照のこと）。使用されたｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の特徴が表２に詳しく示される。ＰＬＡＣ１がＮｕｇＣ４細胞によって発現されないので、ＴＡＡ ＰＬＡＣ１に対して特異的なｂｉ−ｓｃＦｖ ｎｏ．３５をイソタイプコントロールとして使用した。ヒトＴ細胞上のＣＤ３に対する結合活性がＦＡＣＳ結合アッセイで証明されていた（データは示されず）。すべてのｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質を、実施例１．ｇで記載されるように作製し、実施例２．ｃで記載されるように設定される細胞傷害性アッセイのために使用した。
すべてのｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質を５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。Ｌ_ｍｉｎの決定のために、コントロールのｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質ｎｏ．３５を標的細胞およびＴ細胞とともに九連で播種し、試験サンプルを六連で置床した。時点あたり１つのプレートを分析のために調製した。
それぞれの分析された時点（８ｈ、１６ｈ、２４ｈ）における特異的な溶解を、使用されたｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質に対してプロットした。ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の１ＢｉＭＡＢ（配列番号３９）およびｎｏ．１５（配列番号４１）（これらは、同じ配向で構築され、かつ、同じ抗ＣＤ３配列（ＴＲ６６）を含有しており、核酸レベルでのそれらのコドン使用頻度において、また、リンカー配列においてだけ異なる）は、標的細胞溶解を媒介することにおいて最も強力な抗体であることが判明した（図２を参照のこと）。１ＢｉＭＡＢおよびｎｏ．１５はそれらの効率において等しいので、これまでに比較的良好に調べられているｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢをすべてのその後のアッセイのために選択した。１８ＰＨＵ３および１８ＰＨＵ５の構築物（表１および表２を参照のこと）を１ＢｉＭＡＢに対してその後の時点で比較した。１８ＰＨＵ５の効率が１ＢｉＭＡＢと同等であり、１８ＰＨＵ３はそれほど強力でなかった（データは示されず）。

【0313】

実施例４：ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢの結合能
ＦＡＣＳに基づく結合アッセイの確立
ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質のＣＬＤＮ１８．２標的化成分およびＣＤ３標的化成分の結合能を評価するために、フローサイトメトリーアッセイを確立した。ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮｕｇＣ４細胞を、抗ＣＬＤＮ１８．２部位を詳しく調べるために使用し、ヒトＴ細胞を、抗ＣＤ３部位を詳しく調べるために使用した。
抗ＣＬＤＮ１８．２結合能を詳しく調べるために、ＮｕｇＣ４細胞をトリプシン処理し、完全ＲＰＭＩ１６４０培地により洗浄し、続いてＤＰＢＳにより洗浄した。すべての洗浄工程を４℃における６分間の１２００ｒｐｍでの遠心分離によって行った。２．５×１０^５個のＮｕｇＣ４細胞を５ｍｌの丸底チューブに移し、ＦＡＣＳ緩衝液における５０μｇ／ｍｌのＦＰＬＣ精製された１ＢｉＭＡＢタンパク質と４℃で３０分間インキュベーションした。細胞を２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液により洗浄し、続いて、３．３μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体Ａｎｔｉ−ＨＩＳ Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｔａｇ（Ｄｉａｎｏｖａ ＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）と４℃で３０分間インキュベーションした。２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液による洗浄の後、細胞ペレットを、ＦＡＣＳ緩衝液における１：２００の希釈度でのＡＰＣコンジュゲート化ヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ、Ｓｕｆｆｏｌｋ、英国）と暗所において４℃で２０分間インキュベーションした。細胞を２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液により２回洗浄し、最後に、１μｇ／ｍｌのＰＩ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）が補充される１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、死細胞を対比染色した。Ａｎｔｉ−ＨＩＳ Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｔａｇ抗体を用いないことを除いて同じ手順による別の染色が、５０μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢおよびＡＰＣコンジュゲート化ヤギ抗マウス二次抗体（１：２００）を使用して含まれた。陰性コントロールサンプルには、単独での二次のヤギ抗マウスＡＰＣ抗体、モノクローナル抗体Ａｎｔｉ−ＨＩＳ Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｔａｇ＋二次のヤギ抗マウスＡＰＣ抗体が含まれた。陽性コントロールとして、二次のヤギ抗ヒトＡＰＣ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ、Ｓｕｆｆｏｌｋ、英国）により染色される１０μｇ／ｍｌのモノクローナルなＣＬＤＮ１８．２特異的抗体ｍＣＬＤＮ１８．２ａｂ、および、その二次抗体のみのコントロールを実行した。
サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ、米国）によって分析した。強いシグナルが、１ＢｉＭＡＢ、Ａｎｔｉ−ＨＩＳ Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｔａｇおよびヤギ抗マウスＡＰＣによる逐次染色によって検出された。シグナル強度が、ヤギ抗ヒトＡＰＣを伴う陽性コントロールｍＣＬＤＮ１８．２ａｂと同程度であった。１ＢｉＭＡＢに対するヤギ抗マウスＡＰＣの低い直接的な結合が、Ａｎｔｉ−ＨＩＳ Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｔａｇを伴うことなく１ＢｉＭＡＢおよびヤギ抗マウスＡＰＣにより染色されるサンプルにおいて認められた（図４Ａを参照のこと）。
ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の結合能を詳しく調べるためのすべてのさらなるＦＡＣＳ結合アッセイのために、ｂｉ−ｓｃＦｖ、Ａｎｔｉ−ＨＩＳ Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｔａｇおよびヤギ抗マウスＡＰＣによる逐次染色プロトコルを使用した（図４Ｂ、図４Ｃおよび図４Ｄを参照のこと）。１ＢｉＭＡＢの非特異的な結合を除外するために、ＲＴ−ＰＣＲによって確認されるような、ＣＬＤＮ１８．２を発現しない標的細胞（データは示されず）を、ＦＡＣＳに基づいたこの結合アッセイに供した。１ＢｉＭＡＢの非特異的な結合が、図４Ｄに示されるように何ら検出されなかった。

【0314】

ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢの抗ＣＤ３アームの結合能を詳しく調べるために、ヒトＴ細胞を使用した。実施例２．ａにおいて記載されるように調製される１×１０^６個のＴ細胞を５ｍｌの丸底チューブに移し、ＦＡＣＳ緩衝液における０．００２μｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌの範囲内でのＦＰＬＣ精製された１ＢｉＭＡＢタンパク質と４℃で３０分間インキュベーションした。さらなる染色手順は上記の通りであった。コントロールサンプルには、単独での二次のヤギ抗マウスＡＰＣ抗体、および、モノクローナル抗体Ａｎｔｉ−ＨＩＳ Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｔａｇ＋二次のヤギ抗マウスＡＰＣ抗体が含まれた。測定および分析を上記のように行った。著しいシグナルが２μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢにより得られた（図４Ｃを参照のこと）。

【0315】

実施例５：ｂｉ−ｓｃＦｖの１ＢｉＭＡＢによる非常に特異的な標的依存的Ｔ細胞活性化の調査
高レベルまたは低レベルのＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するガン細胞株、および、ＣＬＤＮ１８．２を発現しないガン細胞株を、インビトロ細胞傷害性アッセイにおけるｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢの厳密な標的依存性を証明するために選んだ。選ばれた細胞株は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する２つの主要なガン腫タイプのものであった：胃ガン（ＮｕｇＣ４、ＭＫＮ７、ＳＮＵ−１）および膵臓ガン（ＤａｎＧ、ＫＰ−４）。乳ガン細胞株のＭＣＦ７を陰性コントロールとして使用した。

【0316】

ａ．ガン細胞株のＣＬＤＮ１８．２のＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡを製造者のプロトコル（Ｑｕｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）に従ってＲＮＥａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔの手順によって上述のガン腫細胞株から抽出した。５μｇ のＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）によるｃＤＮＡ合成のために使用した。
ＲＴ−ＰＣＲ分析を、Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ色素および下記のプライマーを使用して、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７３００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）で行った：
ＣＬＤＮ１８．２、順方向：ＴＧＧＣＴＣＴＧＴＧＴＣＧＡＣＡＣＴＧＴＧ；逆方向：ＧＴＧＴＡＣＡＴＧＴＴＡＧＣＴＧＴＧＧＡＣ
ＨＰＲＴ、順方向：ＴＧＡＣＡＣＴＧＧＣＡＡＡＡＣＡＡＴＧＣＡ；逆方向：ＧＧＴＣＣＴＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴ
デルタＣｔを、ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴのＣｔ値をＣＬＤＮ１８．２のＣｔ値から引くことによって計算した（結果については図７Ａを参照のこと）。

【0317】

ｂ．ＣＬＤＮ１８．２の存在下における排他的なＴ細胞活性化
細胞傷害性アッセイを実施例２．ａで記載されるように設定した。定量的ＲＴ−ＰＣＲにより実施例５．ａでＣＬＤＮ１８．２転写物について調べられるガン腫細胞株を標的細胞として使用した。このアッセイにおけるｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢの濃度を５ｎｇ／ｍｌに設定した。標的細胞をヒトＴ細胞および１ＢｉＭＡＢとともに二連で播種して、Ｔ細胞活性化を分析した。ｂｉ−ｓｃＦタンパク質１ＢｉＭＡＢに依存しない標的細胞に対するＴ細胞の何らかの潜在的な同種反応性をモニターするために、標的細胞およびＴ細胞を、１ＢｉＭＡＢを伴うことなく二連で播種した。細胞を、Ｔ細胞のクラスター化および標的細胞の結合を確認するために顕微鏡で継続的に観察した。ＣＬＤＮ１８．２高発現細胞株のＮｕｇＣ４の場合には、著しい影響が２４時間後に生じた；４８時間後では、生存可能な標的細胞がほとんど認められなかった。ＣＬＤＮ１８．２低発現細胞株のＤａｎＧの場合には、最初の影響が９６時間後に見られ、著しい影響が１２０時間後に見られた。ＣＬＤＮ１８．２陰性細胞株に関しては、何らかのＴ細胞活性化を示す影響を１４４時間後でさえ見ることができなかった。すべてのサンプルのＴ細胞を、初期Ｔ細胞活性化マーカーのＣＤ６９および後期活性化マーカーのＣＤ２５について実施例２．ａで記載されるようにフローサイトメトリーにより、標的細胞との１４４時間の共インキュベーションの後で分析し、Ｔ細胞集団についてはＣＤ３により対比染色し、死細胞についてはＰＩにより対比染色した。興味深いことに、ＮｕｇＣ４および１ＢｉＭＡＢと共インキュベーションされたＴ細胞の１００％までがＣＤ２５陽性であり、しかし、ＣＤ６９陰性であった。このことは、ＣＤ６９のダウンレギュレーションが既に生じたＴ細胞の長期間の活性化を示している。ＤａｎＧおよび１ＢｉＭＡＢと共インキュベーションされたＴ細胞の大雑把には７５％が活性化され、そのうちの約４０％がＣＤ２５およびＣＤ６９を同時に発現した。このことは、依然として継続中であるＴ細胞活性化を示している。ＣＬＤＮ１８．２陰性細胞株と共インキュベーションされたＴ細胞はＴ細胞活性化の兆候を何ら示さなかった：ＣＤ６９またはＣＤ２５のどちらの発現も、１ＢｉＭＡＢを伴わないサンプルのレベルと比較して著しく上昇しなかった（図７Ｂもまた参照のこと）。

【0318】

実施例６：ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢにより誘導されるＴ細胞機能の調査
ａ．Ｔ細胞増殖の誘導
Ｔ細胞増殖はＴ細胞活性化の指標である。Ｔ細胞増殖をＣＬＤＮ１８．２陽性標的細胞の存在下でのｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢに対する応答において示すために、フローサイトメトリーアッセイを使用した。簡単に記載すると、実施例２．ａで記載されるように単離された１×１０^６個のヒトＴ細胞を、ＤＰＢＳに溶解される０．５μＭのカルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、ドイツ）により暗所において３７℃で１０分間染色した。染色を、５体積の冷却された完全ＲＰＭＩ１６４０培地を加えることによって停止させた。細胞を氷上で５分間保ち、完全ＲＰＭＩ培地（５％の熱不活化ヒトＡＢ血清、０．５％のペニシリン−ストレプトマイシン、１×ＮＥＡＡおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウム）により３回洗浄し、続いて、１×１０^５細胞／ｍｌに再懸濁した。実施例２．ｂで記載されるような細胞傷害性アッセイを、ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮｕｇＣ４細胞と、エフェクター細胞としてのヒトＴ細胞とを用いて設定した。１ｍｌの培地あたり５０ＵのＩＬ−２を細胞に加えた。サンプルには、単独でのＴ細胞、１ｎｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢを伴うＴ細胞、Ｔ細胞およびＮｕｇＣ４細胞、ならびに、１ｎｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢおよびＮｕｇＣ４細胞を伴うＴ細胞が含まれた。１２０時間の共インキュベーションの後、Ｔ細胞を集め、５ｍｌの丸底チューブに採取し、洗浄し、死細胞を対比染色するために１：１０００での７−ＡＡＤのＤＰＢＳ溶液により４℃で１５分間線染色した。ＤＰＢＳによる洗浄の後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を用いて分析した。
Ｔ細胞の増殖が、標的細胞およびｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢの存在下のみにおける低下するＣＦＳＥシグナルによって検出された（図８Ａもまた参照のこと）。

【0319】

ｂ．セリンプロテアーゼのグランザイムＢの誘導
ＣＬＤＮ１８．２陽性標的細胞の存在下でｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢによって媒介されるＴ細胞活性化の後におけるタンパク質分解性分子のアップレギュレーションを明らかにするために、フローサイトメトリー分析によるセリンプロテアーゼのグランザイムＢの検出を選んだ。実施例２．ｂで記載されるような細胞傷害性アッセイを、ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮｕｇＣ４細胞と、エフェクター細胞としてのヒトＴ細胞とを用いて設定した。サンプルには、単独でのＴ細胞、５ｎｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢを伴うＴ細胞、Ｔ細胞およびＮｕｇＣ４細胞、ならびに、５ｎｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢおよびＮｕｇＣ４細胞を伴うＴ細胞が含まれた。９６時間の共インキュベーションの後、Ｔ細胞を集め、５ｍｌの丸底チューブに採取し、洗浄し、死細胞を対比染色するために１：１０００での７−ＡＡＤのＤＰＢＳ溶液により４℃で１５分間線染色した。ＤＰＢＳによる洗浄の後、細胞をＲＴで２０分間、１００μｌのＣｙｔｏｐｅｒｍ／Ｃｙｔｏｆｉｘ溶液により固定処理した。細胞を１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈにより洗浄し、続いて、ＰＥコンジュゲート化マウス抗ヒトグランザイムＢ抗体によりＲＴで２０分間染色した。洗浄後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩを用いて分析した（すべての試薬およびＦＡＣＳ装置が、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）。
Ｔ細胞におけるグランザイムＢのアップレギュレーションが、標的細胞およびｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢの存在下のみにおいて検出された（図８Ｂもまた参照のこと）。

【0320】

実施例７：インビトロ細胞傷害性アッセイにおけるｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢのＥＣ_５０の決定
ルシフェラーゼ細胞傷害性アッセイ
ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢの５０％最大有効用量を求めるために、１ＢｉＭＡＢの力価測定列を、主に実施例２．ｃで記載されるようにインビトロルシフェラーゼ細胞傷害性アッセイで試験した。
実施例２．ｃで記載される安定的にルシフェラーゼを発現するＮｕｇＣ４細胞を、ヒトＴ細胞および（１０倍ずつで）１ｐｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌまでの範囲におけるｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢ濃度とともに、または、Ｌ_ｍｉｎ値を求めるために、１ＢｉＭＡＢを伴うことなくインキュベーションした。生細胞の発光を、アッセイ設定後の２４時間および４８時間で、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｔｅｃａｎプレートリーダーを用いて測定した。特異的な標的細胞溶解を、実施例２．ｃで例示される式によって計算した。
最大溶解には、１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢにより４８時間後に達した。このアッセイにおける４８時間後での決定されたＥＣ_５０がおよそ１０ｐｇ／ｍｌである（図９もまた参照のこと）。このアッセイの結果は、他者によってもまた報告されるように（例えば、Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ，Ｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２０１０（Ｊｕｌ １３）、１０７（２８）：１２６０５〜１０）、ドナーの免疫状態に従って変化するヒトＴ細胞の効力に強く依存する。そのことに加えて、使用された標的細胞株ＮｕｇＣ４は、結果に同様に影響を与えるＣＬＤＮ１８．２の様々な発現を示す。したがって、１０ｐｇ／ｍｌ〜３００ｐｇ／ｍｌの範囲におけるｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢのＥＣ_５０値の変動が本発明の過程の期間中に観測されている。

【0321】

実施例８：マウス異種移植モデルにおける効力
ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢの治療可能能をインビボで詳しく調べるために、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄ^ｓｃｉｄＩＬ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪまたはｓｈｏｒｔ ＮＳＧのマウス系統（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｕｒ、ＭＥ、米国）を選んだ。 記載された研究のために、マウスにおけるヒトエフェクター細胞およびヒトＴリンパ球の生着が、Ｔ細胞と会合するｂｉ−ｓｃＦｖの影響をインビボで研究するためには不可欠である。Ｂ細胞、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を完全に欠いているので、マウス系統ＮＳＧがこの種の異種移植研究のためには好適である。ＰＢＭＣ注入後の生着したヒトＴ細胞を主に有するマウスモデルを発明の一部として確立した。

【0322】

ａ．ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢを用いたマウスにおける進行したＣＬＤＮ１８．２高発現腫瘍の後期開始処置
例示された研究において、８週齢での４０匹のメスＮＳＧマウスに、高レベルのヒトＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現する１×１０^７個のＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＣＬＤＮ１８．２）を皮下に接種した。腫瘍細胞接種後５日で、マウスをそれらの腫瘍体積に従って処置群に階層化し、腫瘍成長を有しないマウスは除外した。同じ日に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、実施例２．ａで記載されるようなＦｉｃｏｌｌ密度勾配技術によって健康なドナーのヒト血液から単離し、インビボでのエフェクター細胞として使用した。３００μｌのＤＰＢＳで希釈される２×１０^７個のＰＢＭＣを、"ＰＢＭＣ"により示される実験処置群に単離当日に腹腔内注入した。"ＰＢＳ"により示される処置群は３００μｌの非補充ＤＰＢＳを代わりに腹腔内に受け、ヒトエフェクター細胞を伴わないコントロールとして役立った。"ＰＢＳ"コントロール群により、１ＢｉＭＡＢ自体による腫瘍成長に対する潜在的影響、あるいは、マウス組織に対するヒトエフェクター細胞によってではなく、１ＢｉＭＡＢまたはビヒクルによって引き起こされる何らかの潜在的副作用（すなわち、マウス組織に対するヒトエフェクター細胞によって及ぼされる移植片対宿主反応）の調査を調べることができた。群"ＰＢＳ／ビヒクル"は４匹のマウスを含み（ｎ＝４）、群"ＰＢＳ／１ＢｉＭＡＢ"は５匹のマウスを含み（ｎ＝５）、群"ＰＢＭＣ／ビヒクル"は１３匹のマウスを含み（ｎ＝１３）、群"ＰＢＭＣ／１ＢｉＭＡＢ"は１５匹のマウスを含んだ（ｎ＝１５）。治療を、ＤＰＢＳまたはＰＢＭＣを適用した１日後に開始した：群"ＰＢＳ／１ＢｉＭＡＢ"および群"ＰＢＭＣ／１ＢｉＭＡＢ"は動物あたり、２００μｌのＤＰＢＳで希釈される５μｇの精製されたｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢを腹腔内に受けた。群"ＰＢＳ／ビヒクル"および群"ＰＢＭＣ／ビヒクル"は、ＤＰＢＳで希釈されるビヒクル緩衝液（Ｈ２Ｏに溶解される２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、無菌ろ過されたもの）の２００μｌを腹腔内に受けた。処置群が表３にまとめられる。治療を２２日間にわたって毎日行った。週に２回、腫瘍の大きさを校正済みのデジタル式カリパスにより測定し、腫瘍体積を下記の式に従って計算した：ｍｍ^３＝長さ×幅×（幅／２）。図１０Ａおよび図１０Ｂは、ヒトエフェクター細胞の存在下での抗体のみによる"ＰＢＭＣ／１ＢｉＭＡＢ"群のマウスの半数における腫瘍成長の阻害および腫瘍負荷の除去を例示する。マウスを、腫瘍体積が５００ｍｍ^３を超えたとき、または、重篤な病的状態の場合（移植片対宿主症状が一部のマウスにおいて認められた）には頸椎脱臼によって屠殺した。

【0323】

【表3】

【0324】

ｂ．体重に対する治療影響の決定
それぞれのマウスの体重を、実験室用はかりを使用して週に２回測定した。どの群のマウスも体重減少を処置期間にわたって示さなかった（データは示されず）。両方の"ＰＢＭＣ"群における一部のマウスが移植片対宿主反応の症状をＰＢＭＣ注入の４週間後および処置終了の数日後に示した。体重に対する１ＢｉＭＡＢ自体の影響、または、マウスの健康に関する何らかの他の副作用は認められなかった。

【0325】

ｃ．組織の保存および脾細胞の単離
マウスを殺した後、腫瘍を解剖し、組織を直ちに、免疫組織化学分析のために１０ｍｌのＲｏｔｉ−Ｈｉｓｔｏｆｉｘ ４％（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）において固定処理した。そのうえ、脾臓を、ヒト細胞の生着をフローサイトメトリー分析によって検出するために解剖した。脾細胞の単離を、脾臓を３ｍｌ〜５ｍｌのシリンジの無菌プランジャーによりすりつぶして、５０ｍｌの反応チューブの中に置かれる７０μｍの細胞ろ過器に通し、温ＤＰＢＳによる細胞ろ過器の反復したフラッシングを行うことによって脾臓解剖の直後に行った。単離された脾細胞を遠心分離し、ＤＰＢＳをデカンテーションによって除き、脾細胞のペレットを、１０％のＤＭＳＯが補充される１ｍｌの熱不活化ウシ胎児血清に再懸濁した。すべてのマウスからの脾細胞サンプルが完了するまで、サンプルを直ちに−８０℃で凍結し、貯蔵した。

【0326】

ｄ．マウス脾臓におけるヒトＴリンパ球の生着の分析
すべてのマウスからの脾細胞を実施例８．ｃで記載されるように集め、凍結した。脾細胞サンプルの完成した収集物を一度に解凍し、すべての細胞を温ＤＰＢＳにより２回洗浄し、サンプルあたり１×１０^６個の脾細胞を蛍光コンジュゲート化抗体と暗所において４℃で２０分間インキュベーションして、ヒト細胞の生着を抗ＣＤ４５染色によって検出し、ヒトＴ細胞の割合を、抗ＣＤ３染色、抗ＣＤ４染色および抗ＣＤ８染色によって検出した。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を用いて行った。両方の"ＰＢＭＣ"群におけるヒトＴ細胞の生着を、図１０Ｄに示されるように、ＣＤ４５−ＣＤ３の二重陽性脾細胞の大きい割合によって確認することができた。

【0327】

実施例９：ＣＬＤＮ６およびＣＤ３を標的化する二重特異性結合剤の作製および試験
ａ．ｂｉ−ｓｃＦｖ構築物の配列起源、設計および発現ベクターへのクローニング
二重特異性のタンデム型単鎖抗体構築物（ｂｉ−ｓｃＦｖ）は、ヒトＴ細胞受容体成分ＣＤ３およびヒト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して特異的である結合ドメインを含有した。対応する可変重鎖領域（ＶＨ）および対応する可変軽鎖領域（ＶＬ）が、それぞれの構築物について具体的には、Ｎ末端からＣ末端に、下記の連続する順で配置される：

【化2】

【0328】

表４には、本発明の過程で作製された、ＴＡＡ ＣＬＤＮ６に対して特異的であるすべてのｂｉ−ｓｃＦｖ構築物がまとめられる。ＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖ構築物１ＢｉＭＡＢをコントロール抗体として使用した。これらのｂｉ−ｓｃＦｖ構築物を、対応する抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列を使用してＧｅｎｅＡｒｔ ＡＧ（ＧｅｎｅＡｒｔ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）による遺伝子合成によって作製した。コドン最適化、例えば、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（ＨＳ）またはハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ＭＭ）をＧｅｎｅＡｒｔ社のＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）ソフトウエアによって実行した。これらが表５に示される。特異性、モノクローナル抗体（ｍＡＢ）からの配列起源、コドン使用頻度、さらなる配列特徴、および、すべての適用されたドメインの参考文献に関する情報が表５にまとめられる。それぞれのＣＤ３抗体の可変ドメイン配列起源が表５に示される。ヒトＴＡＡおよびマウスＴＡＡの大きい相同性のために、同じ抗ＴＡＡ ＶＨ配列およびＶＬ配列を、マウス特異的な抗ＣＤ３抗体クローン１４５−２Ｃ１１のＶＨ配列、ＶＬ配列との組合せでの場合を除いて、マウスアッセイのためのｂｉ−ｓｃＦｖ構築物の作製のために使用することができた。
ＤＮＡクローニングおよび発現ベクター構築を、当業者によって広く知られている標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９）に従って行った。簡単に記載すると、ｂｉ−ｓｃＦｖ ＤＮＡ配列には、５'側でのＨｉｎｄＩＩＩ制限および３'側でのＢａｍＨＩ制限が発現プラスミドへのクローニングのために与えられた。分泌シグナル配列を細胞質から培養培地へのタンパク質分泌のために５'末端においてｂｉ−ｓｃＦｖ配列の上流側に導入した。１５個〜１８個のアミノ酸の柔軟なグリシン−セリンペプチドリンカーをコードする配列を、一方がＣＤ３に結合し、かつ、他方がＴＡＡに結合する単鎖可変抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を組み立てるためのＶＨドメインおよびＶＬドメインをつなぎ合わせるために挿入した。二重特異性単鎖抗体を形成するために、これら２つのｓｃＦｖドメイン配列を、短いペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ）をコードする配列によってつないだ。このリンカー配列と一緒に、ＢａｍＨＩ制限部位を、今後予定されているｂｉ−ｓｃＦＶ構築物のクローニングのためのｓｃＦｖドメイン交換のために導入した。詳細には、５'側のｓｃＦｖドメインをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩの制限によって交換することができ、３'側のｓｃＦｖドメインをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩの制限によって交換することができた。
すべての使用されたｂｉ−ｓｃＦｖ抗体構築物を標準的な哺乳動物発現ベクターのｐｃＤＮＡ（商標）３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）にクローン化した。Ｃ末端の６×Ｈｉｓタグが、タンパク質の金属親和性精製のために、また、検出分析のために役立った。すべての構築物をＭＷＧの単回読み取り配列サービス（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、ドイツ）による配列決定によって確認した。構築物の概要については、図１１もまた参照のこと。

【0329】

【表4】

【0330】

【表5】

【0331】

ｂ．安定な産生細胞株の作製
ＣＬＤＮ６特異的ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の安定な産生細胞クローンを作製するために、ヒト胚性腎臓細胞株ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）を使用した。
１×１０^７個のＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションの２日前に、１４．５ｃｍの組織培養ディッシュに、２０ｍｌの完全ＤＭＥＭ培地（１０％の熱不活化ＦＢＳおよび０．５％のペニシリン−ストレプトマイシンが補充されるＤＭＥＭ／Ｆ−１２ ＧｌｕｔａＭａｘ；すべての試薬を、Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）から得た）において置床した。トランスフェクションの前に、細胞を、２ｍＭのＥＤＴＡが補充されるＤＰＢＳにより洗浄し、その後、ＦＢＳも抗生物質も含まない２０ｍｌの非補充ＤＭＥＭを加えた。ｐｃＤＮＡ３．１／６ＰＨＵ５およびｐｃＤＮＡ３．１／６ＰＨＵ３の構築物（これらは実施例９．ａで記載される）の２０μｇの線状化ＤＮＡを０．５ｍｌの非補充ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で希釈した。１ｍｇ／ｍｌの線状ＰＥＩ溶液（ポリエチレンイミン；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ、ドイツ）の７５μｌを希釈されたＤＮＡに加え、激しくボルテックス撹拌した。ＲＴ（室温）での１５分間のインキュベーションの後、ＤＮＡ／ＰＥＩ複合物を細胞に滴下して加え、細胞培養ディッシュを穏やかに回転させ、その後、３７℃、５％ＣＯ_２においてインキュベーションした。トランスフェクション後２４時間で、培地を交換した。トランスフェクションされた細胞の選抜を、Ｇ４１８硫酸塩（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を０．８ｍｇ／ｍｌの最終濃度で用いてトランスフェクション後４８時間で開始した。Ｇ４１８を常時、細胞培養のために培養培地に加えた。

【0332】

ｃ．ポリクローナルなＨＥＫ２９３細胞によるｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の６ＰＨＵ５および６ＰＨＵ３の小規模産生
ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の６ＰＨＵ５および６ＰＨＵ３をインビトロ比較のために小規模で産生させ、ポリクローナルなＨＥＫ２９３細胞の上清から精製した。
簡単に記載すると、コンフルエントな状態において、ＦＢＳを含まない上清を、実施例９．ｂで記載されるポリクローナルな細胞株から集め、０．２μｍのＭｉｎｉｓａｒｔシリンジフィルター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）によりろ過した。続いて、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質を製造者のプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）に従ってＮｉ−ＮＴＡスピンカラムによって細胞培養上清から小規模で精製した。ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の濃度を、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の６ＰＨＵ５および６ＰＨＵ３の吸光係数および分子量（これらはＰｒｏｔＰａｒａｍツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）により求められる）の考慮のもと、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ｃを用いた２８０ｎｍでの測定によって求めた。精製されたタンパク質を、直ちに使用するために４℃で貯蔵した。
ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質を、標準的な手順（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２）によって行われるポリアクリルアミドゲル電気泳動、続く、クーマシー染色およびウエスタンブロット分析によって試験した。小規模で精製されたタンパク質を、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）で分離した。続いて、ゲルを、細胞培養上清に含有されるｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の６ＰＨＵ５および６ＰＨＵ３ならびに他のタンパク質を検出するために標準的な手順（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２）に従ってクーマシーブリリアントブルー溶液により染色した。ウエスタンブロット分析を、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の６ＰＨＵ５および６ＰＨＵ３をそれらの６×Ｈｉｓタグにより特異的に検出するために行った。簡単に記載すると、タンパク質をＰＶＤＦメンブランにブロットし、ブロッキング処理をＰＢＳＴ／３％粉乳により行った後、メンブランを、ブロッキング緩衝液において１：５００で希釈される一次抗体Ａｎｔｉ−ＨＩＳ Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｔａｇ（Ｄｉａｎｏｖａ ＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）と４℃で１時間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液による洗浄の後、メンブランを、ブロッキング緩衝液において１：１００００で希釈されるＦｃ特異的な二次のペルオキシダーゼコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）と４℃で１時間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液による洗浄を再び行った後、シグナルを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国）によって可視化し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００ Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）によって記録した。ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質のシグナルが、内部分子量標準と比較した場合、５０ｋＤと６０ｋＤとの間に検出された。

【0333】

ｄ．ポリクローナルなＨＥＫ２９３細胞によるｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３の大規模産生
ポリクローナルな産生細胞株を、１０層のＣｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）で、１０％のＦＢＳ、５．０％のペニシリン−ストレプトマイシンおよび０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８が補充されるＤＭＥＭ／Ｆ−１２ ＧｌｕｔａＭａｘ（すべての試薬を、Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）から得た）において製造者の指針に従って培養した。コンフルエントな段階で、細胞をＤＰＢＳにより洗浄し、培地を、抗生物質を含むが、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に変えた。ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３を含有する細胞上清を３週間までにわたって３日〜５日毎に集めた。上清を、５００ｍｌのＳｔｅｒｉｔｏｐ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、米国）を用いてろ過し、ＦＰＬＣ精製まで４℃で貯蔵した。
ＦＰＬＣ精製の前に、細胞培養上清におけるｂｉ−ｓｃＦｖの存在を、実施例９．ｃで簡単に記載されるような標準的な手順によって行われるポリアクリルアミドゲル電気泳動、続く、クーマシー染色およびウエスタンブロット分析によって調べた。

【0334】

ｅ．ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３の精製および定量
ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３を含有するポリクローナルなＨＥＫ２９３細胞の細胞培養上清（実施例９．ｂで記載されるもの）を、標準的な手順（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２）を使用する固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に供した。簡単に記載すると、細胞培養上清を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ １０ ＦＰＬＣシステムにつながれるＨｉｓ Ｔｒａｐ ＦＦ（５ｍｌ）カラムに負荷した（ともに、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）。ＰＢＳ洗浄緩衝液は１０ｍＭのイミダゾールを含有し、ＰＢＳ溶出緩衝液は、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４および２５０ｍＭのイミダゾールを含有し、両方の緩衝液のｐＨを７．４に調節した。溶出を段階的勾配によって行った。溶出されたｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｇ２ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（１０Ｋ ＭＷＣＯ）（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国）を使用して１×ＰＢＳに対して直ちに透析した。ＰＢＳ透析の後、ｂｉ−ｓｃＦｖを、Ｈ２Ｏに基づく２００ｍＭアルギニン緩衝液（Ｌ−アルギニン一塩酸塩；Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）に対して透析した。
ｂｉ−ｓｃＦｖの濃度を、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３の吸光係数および分子量の考慮のもと、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ｃを用いた２８０ｎｍでの測定によって求めた。精製されたタンパク質を小分けし、長期間の貯蔵のためには−８０℃で貯蔵し、直ちに使用するためには４℃で保った。
ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３の品質および純度を、実施例９．ｃで記載されるようにクーマシー染色およびウエスタンブロット分析によって調べた。ＢＳＡ標準物希釈物を、ＮａｎｏＤｒｏｐによって測定される濃度を大雑把に確認するためにクーマシー手法では含めた（データは示されず）。

【0335】

実施例１０：ＣＬＤＮ６を標的化するｂｉ−ｓｃＦｖ候補物の６ＰＨＵ５および６ＰＨＵ３の効率
ａ．ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の６ＰＨＵ５および６ＰＨＵ３によって標的細胞に標的変更させられるＴ細胞の顕微鏡法分析
エフェクター細胞がｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質によってＣＬＤＮ６発現標的細胞に標的変更させられることを顕微鏡法分析により可視化するために、インビトロ細胞傷害性アッセイを行った。ＮｉＮＴＡカラムで精製されたｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の６ＰＨＵ３および６ＰＨＵ５（実施例９．ｃを参照のこと）を使用して、これら２つの変化体をそれらの効率に従って比較した。標的細胞株として、高レベルのヒトＣＬＤＮ６を内因的に発現する卵巣奇形ガン細胞株ＰＡ−１を使用した。
ヒトエフェクター細胞を標準的な手順（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２）に従って健康なドナーからのヒト血液から新たに単離した：簡単に記載すると、血液をＤＰＢＳにより希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）に重層し、遠心分離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を相間から回収し、２ｍＭのＥＤＴＡが補充される冷ＤＰＢＳにより洗浄し、計数した。続いて、ヒトＴ細胞を、ＰＢＭＣから、Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｔｅｔｅｒｏｗ、ドイツ）により製造者の指針に従って磁気活性化細胞分離（ＭＡＣＳ）によって分離した。
ウエルあたり１×１０^５個のＰＡ−１細胞を組織培養用６ウエルプレートに播種した。ヒト細胞を上記のように調製し、５：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で加えた。１０％の熱不活化ヒトＦＢＳ、０．５％のペニシリン−ストレプトマイシン、１×ＮＥＡＡ、１ｍＭの重炭酸ナトリウムおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムが補充されるＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）をすべての細胞のために使用し、ウエルあたりの最終体積を２ｍｌ／ウエルに調節した。使用されたｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質濃度はこのアッセイでは５０ｎｇ／ｍｌであった。コントロールサンプルは、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質を伴うことなく、単独での標的細胞またはＴ細胞を含んだ。組織培養プレートを続いて、３７℃、５％ＣＯ_２においてインキュベーションした。アッセイを、共インキュベーションの６時間から２４時間まで、Ｗｉｌｏｖｅｒｔ Ｓ倒立顕微鏡（Ｈｕｎｄ、Ｗｅｔｚｌａｒ、ドイツ）を用いて連続して観察した。ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の６ＰＨＵ５および６ＰＨＵ３の存在下における標的細胞上でのＴ細胞クラスター化、免疫学的シナプスの形成および標的細胞の殺傷に関しての著しい影響が２４時間で認められ、これらの影響を、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＳ１００倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、日本）を用いて写真撮影した。両方のｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質が、図１２に示されるような強いＴ細胞クラスター化および標的細胞殺傷を引き起こす。

【0336】

ｂ．ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の６ＰＨＵ５および６ＰＨＵ３により媒介されるＴ細胞活性化
Ｔ細胞活性化を検出するために、また、これら２つのＣＬＤＮ６特異的ｂｉ−ｓｃＦｖ変化体の効率における違いを明確にするために、ＦＡＣＳに基づくＴ細胞活性化アッセイを使用した。初期活性化マーカーＣＤ６９および後期活性化マーカーＣＤ２５を蛍光コンジュゲート化抗体による染色のために選択した。標的細胞およびＴ細胞の混合物におけるヒトＴ細胞の検出のために、Ｔ細胞上のＣＤ３を染色した。
一般には、上記から設定されるアッセイを選んだ（実施例１０．ａ）。簡単に記載すると、ＣＬＤＮ６を内因的に発現するＰＡ−１標的細胞を２ｍｌの完全培地において５：１のＥ：Ｔ比でヒトＴ細胞と一緒に播種し、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の６ＰＨＵ５または６ＰＨＵ３を５ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で加えた。コントロールサンプルは、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質を伴って、また、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質を伴うことなく、単独での標的細胞またはＴ細胞を含んだ。２４時間後および４８時間後、Ｔ細胞をフラッシングによって集め、５ｍｌの丸底チューブ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）に移した。細胞を遠心分離し、ＤＰＢＳにより洗浄した。細胞染色のために、マウス抗ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣ、マウス抗ヒトＣＤ６９−ＡＰＣおよびマウス抗ヒトＣＤ２５−ＰＥ（すべての抗体が、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を使用した。細胞ペレットを、蛍光コンジュゲート化抗体を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（５％のＦＢＳが補充されるＤＰＢＳ）および２μｌの７−ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）において再懸濁した。インキュベーションを暗所において４℃で２０分間行った後、サンプルを４ｍｌのＤＰＢＳにより洗浄し、細胞ペレットを２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。サンプルを、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ともに、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を用いた測定の期間中を通して氷上および暗所において保った。分析をＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ、米国）によって評価した。
両方のＣＤＬＮ６特異的ｂｉ−ｓｃＦｖ変化体が、６０％までの効率的なＴ細胞活性化をもたらした。変化体６ＰＨＵ３（ｂｉ−ｓｃＦｖ ＣＤ３×ＣＬＤＮ６）は５ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの低濃度範囲においてより強力であり（図１３もまた参照のこと）、したがって、さらなる研究のために選択された。

【0337】

実施例１１：ｂｉ−ｓｃＦｖ ６ＰＨＵ３の結合能
ＦＡＣＳ結合アッセイ
ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３のＣＬＤＮ６標的化成分およびＣＤ３標的化成分の結合能を評価するために、フローサイトメトリーアッセイを使用した。ＣＬＤＮ６を内因的に発現するＰＡ−１細胞およびＯＶ−９０細胞を、抗ＣＬＤＮ６部位を詳しく調べるために使用し、ヒトＴ細胞を、抗ＣＤ３部位を詳しく調べるために使用した。ＣＬＤＮ６陰性のＮｕｇＣ４細胞をコントロール細胞として使用した。
抗ＣＬＤＮ６結合能を詳しく調べるために、ＣＬＤＮ６陽性細胞（ＰＡ−１、ＯＶ−９０）およびＣＬＤＮ６陰性細胞（ＮｕｇＣ４）をトリプシン処理し、完全培地により洗浄し、続いてＤＰＢＳにより洗浄した。すべての洗浄工程を４℃における６分間の１２００ｒｐｍでの遠心分離によって行った。１×１０^５個の細胞を５ｍｌの丸底チューブに移し、ＦＡＣＳ緩衝液における０．０１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのＦＰＬＣ精製された６ＰＨＵ３タンパク質またはコントロールｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢと４℃で３０分間インキュベーションした。細胞を２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液により洗浄し、続いて、３．３μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体Ａｎｔｉ−ＨＩＳ Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｔａｇ（Ｄｉａｎｏｖａ ＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）と４℃で３０分間インキュベーションした。２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液による洗浄の後、細胞ペレットを、ＦＡＣＳ緩衝液における１：２００の希釈度でのＡＰＣコンジュゲート化ヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ、Ｓｕｆｆｏｌｋ、英国）と暗所において４℃で２０分間インキュベーションした。細胞を２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液により２回洗浄し、最後に、１μｇ／ｍｌのＰＩ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）が補充される１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、死細胞を対比染色した。陰性コントロールサンプルには、単独での二次のヤギ抗マウスＡＰＣ抗体が含まれていた。陽性コントロールとして、二次のヤギ抗ヒトＡＰＣ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ、Ｓｕｆｆｏｌｋ、英国）により染色される１０μｇ／ｍｌのモノクローナルなＣＬＤＮ６特異的抗体ｍＣＬＤＮ６ａｂ、および、その適切な二次抗体のみのコントロールを実行した。
サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ、米国）によって分析した。１０μｇ／ｍｌの６ＰＨＵ３のシグナル強度は陽性コントロールｍＣＬＤＮ６ａｂの１／４〜１／９であった（図１５Ａを参照のこと）。ＣＬＤＮ６陰性細胞株ＮｕｇＣ４に対する６ＰＨＵ３の非特異的な結合は検出されなかった（図１５Ｃ）。

【0338】

ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３の抗ＣＤ３アームの結合能を詳しく調べるために、ヒトＴ細胞を使用した。５×１０^５個のＴ細胞を５ｍｌの丸底チューブに移し、ＦＡＣＳ緩衝液における１００ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの範囲内でのＦＰＬＣ精製された６ＰＨＵ３タンパク質と４℃で３０分間インキュベーションした。さらなる染色手順は上記の通りであった。コントロールサンプルには、単独での二次のヤギ抗マウスＡＰＣ抗体、および、モノクローナル抗体Ａｎｔｉ−ＨＩＳ Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｔａｇ＋二次のヤギ抗マウスＰＥ抗体が含まれた。測定および分析を上記のように行った。著しいシグナルが１００ｎｇ／ｍｌの６ＰＨＵ３により得られた（図１５Ｂもまた参照のこと）。

【0339】

実施例１２：ｂｉ−ｓｃＦｖの６ＰＨＵ３による標的依存的Ｔ細胞活性化の調査
実施例１０．ａおよび実施例１０．ｂで記載されるような細胞傷害性アッセイを行った。簡単に記載すると、ＣＬＤＮ６を内因的に発現するＰＡ−１標的細胞を２ｍｌの完全培地において５：１のＥ：Ｔ比でヒトＴ細胞と一緒に播種し、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３を０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で加えた。ｂｉ−ｓｃＦｖ媒介のＴ細胞活性化についての標的依存性を分析するために、Ｔ細胞を、標的細胞を伴うことなく播種し、しかし、標的細胞＋Ｔ細胞のサンプルと同じ濃度のｂｉ−ｓｃＦｖ ６ＰＨＵ３とインキュベーションした。２４時間後および４８時間後、Ｔ細胞をフラッシングによって集め、５ｍｌの丸底チューブ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）に移した。細胞染色および分析を実施例１０．ｂで記載されるように行った。
図１６Ａおよび図１６Ｂに示されるように、６ＰＨＵ３媒介のＴ細胞活性化が標的細胞の非存在下では全く検出できず、このことは、ｂｉ−ｓｃＦｖ機能性の厳密な標的依存性を強調している。著しいＴ細胞活性化がほんの０．１ｎｇ／ｍｌの６ＰＨＵ３により４８時間後に生じた。

【0340】

実施例１３：インビトロ細胞傷害性アッセイにおけるｂｉ−ｓｃＦｖ ６ＰＨＵ３のＥＣ_５０の決定
ルシフェラーゼ細胞傷害性アッセイ
ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３の５０％最大有効用量を求めるために、６ＰＨＵ３の力価測定列をインビトロルシフェラーゼ細胞傷害性アッセイで試験した。
安定的にルシフェラーゼを発現するＰＡ−１細胞とヒトＴ細胞とを５：１のＥ：Ｔ比で、（１０倍ずつで）１ｐｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌまでの範囲におけるｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３濃度とともに、または、Ｌ_ｍｉｎ値を求めるために、６ＰＨＵ３を伴うことなくインキュベーションした。
細胞培養マイクロプレートを、３７℃、５％ＣＯ_２において２４時間および４８時間インキュベーションした。分析のために、１ｍｇ／ｍｌのルシフェリン（ＢＤ Ｍｏｎｏｌｉｇｈｔ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）および５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する水溶液の５０μｌをウエルあたり加え、続いて、プレートを３７℃において暗所で３０分間インキュベーションした。ルシフェラーゼを発現する生細胞によるルシフェリンの酸化から生じる発光を、Ｉｎｉｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、スイス）を用いて測定した。特異的な標的細胞溶解の百分率を下記の式によって計算した：％特異的溶解＝［１−（発光試験サンプル−Ｌ_ｍａｘ）／（Ｌ_ｍｉｎ−Ｌ_ｍａｘ）］×１００、ただし、"Ｌ"は溶解を示す。Ｌ_ｍｉｎはｂｉ−ｓｃＦｖの非存在下における最小溶解を示し、Ｌ_ｍａｘは、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（２％の最終濃度）の添加によって達成されるｂｉ−ｓｃＦｖの非存在下における最大溶解（自然発光カウント数に等しい）を示す。
最大溶解には、１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの６ＰＨＵ３により４８時間後に達し、４８時間後における決定されたＥＣ_５０がおよそ１０ｐｇ／ｍｌである（図１７もまた参照のこと）。このアッセイの結果は、他者によってもまた報告されるように（例えば、Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ，Ｒ他、２０１０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２０１０（Ｊｕｌ １３）、１０７（２８）：１２６０５〜１０を参照のこと）、ドナーの免疫状態に従って変化するヒトＴ細胞の効力に強く依存する。したがって、３倍の差でのｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３のＥＣ_５０値の変動が本発明の過程の期間中に観測されている。

【0341】

実施例１４：マウス異種移植モデルにおける効力
ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３の治療可能能をインビボで詳しく調べるために、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄ^ｓｃｉｄＩＬ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪまたはｓｈｏｒｔ ＮＳＧのマウス系統（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｕｒ、ＭＥ、米国）を選んだ。 記載された研究のために、マウスにおけるヒトエフェクター細胞およびヒトＴリンパ球の生着が、Ｔ細胞と会合するｂｉ−ｓｃＦｖの影響をインビボで研究するためには不可欠である。Ｂ細胞、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を完全に欠いているので、マウス系統ＮＳＧがこの種の異種移植研究のためには好適である。ＰＢＭＣ注入後の生着したヒトＴ細胞を主に有するマウスモデルを発明の一部として確立した。

【0342】

ａ．ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３によるマウスにおける進行したＣＬＤＮ６高発現腫瘍の後期開始処置
例示された研究において、８週齢〜１１週齢での２５匹のメスＮＳＧマウスおよび２５匹のオスＮＳＧマウスに、高レベルのヒトＣＬＤＮ６を内因的に発現する１×１０^７個のＰＡ−１細胞を皮下に接種した。腫瘍細胞接種後１５日で、マウスをそれらの腫瘍体積に従って処置群に階層化し、腫瘍成長を有しないマウスは除外した。同じ日に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ密度勾配技術によって健康なドナーのヒト血液から単離し、インビボでのエフェクター細胞として使用した。２００μｌのＤＰＢＳで希釈される２×１０^７個のＰＢＭＣを、"ＰＢＭＣ"により示される実験処置群に単離当日に腹腔内注入した。"ＰＢＳ"により示される処置群は２００μｌの非補充ＤＰＢＳを代わりに腹腔内に受け、ヒトエフェクター細胞を伴わないコントロールとして役立った。"ＰＢＳ"コントロール群により、６ＰＨＵ３自体による腫瘍成長に対する潜在的影響、あるいは、マウス組織に対するヒトエフェクター細胞によってではなく、６ＰＨＵ３またはビヒクルによって引き起こされる何らかの潜在的副作用（すなわち、マウス組織に対するヒトエフェクター細胞によって及ぼされる移植片対宿主反応）の調査を調べることができた。群"ＰＢＳ／ビヒクル"は８匹のマウスを含み（ｎ＝８）、群"ＰＢＳ／６ＰＨＵ３"は８匹のマウスを含み（ｎ＝８）、群"ＰＢＭＣ／ビヒクル"は７匹のマウスを含み（ｎ＝７）、群"ＰＢＭＣ／６ＰＨＵ３"は７匹のマウスを含み（ｎ＝７）群"ＰＢＭＣ／１ＢｉＭＡＢ"は８匹のマウスを含んだ（ｎ＝８）。治療を、ＤＰＢＳまたはＰＢＭＣを適用した７日後に開始した：群"ＰＢＳ／６ＰＨＵ３"、群"ＰＢＭＣ／６ＰＨＵ３"および群"ＰＢＭＣ／１ＢｉＭＡＢ"は動物あたり、２００μｌのＤＰＢＳで希釈される５μｇの精製されたｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３またはｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢを腹腔内に受けた。群"ＰＢＳ／ビヒクル"および群"ＰＢＭＣ／ビヒクル"は、ＤＰＢＳで希釈されるビヒクル緩衝液（Ｈ２Ｏに溶解される２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、無菌ろ過されたもの）の２００μｌを腹腔内に受けた。処置群が表６にまとめられる。治療を２６日間にわたって毎日行った。週に２回、腫瘍の大きさを校正済みのデジタル式カリパスにより測定し、腫瘍体積を下記の式に従って計算した：ｍｍ^３＝長さ×幅×幅／２。図１８Ａおよび図１８Ｂは、ヒトエフェクター細胞の存在下での抗体による"ＰＢＭＣ／６ＰＨＵ３"群のすべてのマウスにおける腫瘍成長の阻害を例示する。マウスを、腫瘍体積が１５００ｍｍ^３に達したとき、または、重篤な病的状態の場合（移植片対宿主症状が一部のマウスにおいて認められた）には頸椎脱臼によって屠殺した。

【0343】

【表6】

【0344】

ｂ．体重に対する治療影響の決定
それぞれのマウスの体重を、実験室用はかりを使用して週に２回測定した。どの群のマウスも体重減少を処置期間にわたって示さなかった（データは示されず）。

【0345】

ｃ．組織の保存および脾細胞の単離
マウスを殺した後、腫瘍を解剖し、組織を直ちに、免疫組織化学分析のために１０ｍｌのＲｏｔｉ−Ｈｉｓｔｏｆｉｘ ４％（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）において固定処理した。そのうえ、脾臓を、ヒト細胞の生着をフローサイトメトリー分析によって検出するために解剖した。脾細胞の単離を、脾臓を３ｍｌ〜５ｍｌのシリンジの無菌プランジャーによりすりつぶして、５０ｍｌの反応チューブの中に置かれる７０μｍの細胞ろ過器に通し、温ＤＰＢＳによる細胞ろ過器の反復したフラッシングを行うことによって脾臓解剖の直後に行った。単離された脾細胞を遠心分離し、ＤＰＢＳをデカンテーションによって除き、脾細胞のペレットを、１０％のＤＭＳＯが補充される１ｍｌの熱不活化ウシ胎児血清に再懸濁した。すべてのマウスからの脾細胞サンプルが完了するまで、サンプルを直ちに−８０℃で凍結し、貯蔵した。

【0346】

ｄ．マウス脾臓におけるヒトＴリンパ球の生着の分析
すべてのマウスからの脾細胞を実施例１４．ｃで記載されるように集め、凍結した。脾細胞サンプルの完成した収集物を一度に解凍し、すべての細胞を温ＤＰＢＳにより２回洗浄し、サンプルあたり１×１０^６個の脾細胞を蛍光コンジュゲート化抗体と暗所において４℃で２０分間インキュベーションして、ヒト細胞の生着を抗ＣＤ４５染色によって検出し、ヒトＴ細胞の割合を、抗ＣＤ３染色、抗ＣＤ４染色および抗ＣＤ８染色によって検出した。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を用いて行った。両方の"ＰＢＭＣ"群におけるヒトＴ細胞の生着を、図１８Ｄに示されるように、ＣＤ４５−ＣＤ３の二重陽性脾細胞の大きい割合によって確認することができた。

【0347】

ｅ．標的発現およびＴ細胞増殖を求めるための免疫組織化学
腫瘍を、解剖後、４％の緩衝化ホルムアルデヒド溶液（Ｒｏｔｉ−Ｈｉｓｔｏｆｉｘ、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）を使用して４℃で４８時間、固定処理した。固定処理された腫瘍を２つに分け、脱水のための自動化された真空組織処理装置ＡＳＰ２００（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ、Ｗｅｔｚｌａｒ、ドイツ）に移し、その後、パラフィン・ディスペンサー・ステーションＭＰＳ／Ｃ（Ｓｌｅｅ Ｍｅｄｉｃａｌ ＧｍｂＨ、Ｍａｉｎｚ、ドイツ）によりパラフィン（Ｐａｒａｐｌａｓｔ、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）に包埋した。免疫組織化学染色のために、ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織の３μｍ厚の切片を、回転ミクロトームＲＭ２２５５（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ、Ｗｅｔｚｌａｒ、ドイツ）を使用して作製した。脱パラフィン化および再水和を並行（ｂｉ−ｌｉｎｅａｒ）回分式染色装置ＳｔａｉｎＭａｔｅ Ｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国）で行い、その後、熱誘導によるエピトープ回復を、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を伴う１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）において１２０℃で１０分間行った。内因性ペルオキシダーゼを、続いてＰＢＳにおける０．３％のＨ２Ｏ２溶液（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）を１５分間使用して失活させ、その後、ＰＢＳにおける１０％のヤギ血清（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、オーストリア）とのインキュベーションを、非特異的な抗体結合部位を阻止するために３０分間行った。ＴＡＡクローディン６が、ポリクローナルな一次抗体の抗マウスクローディン６（Ｃ）ウサギ（ＩＢＬ−Ａｍｅｒｉｃａ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、米国）との４℃での一晩のインキュベーションによって検出された；Ｔ細胞が、ポリクローナルな抗ＣＤ３ＡＢ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）を４℃で一晩使用して、その後、ＢｒｉｇｈｔＶｉｓｉｏｎポリマーＨＲＰコンジュゲート化抗ウサギ二次抗体（ＩｍｍｕｎｏＬｏｇｉｃ、Ｄｕｉｖｅｎ、オランダ）とのインキュベーションによって連続切片において検出された。結合反応を、Ｖｅｃｔｏｒ ＮｏｖａＲＥＤキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．、Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ、英国）を製造者の説明書に従って使用して、その後、ヘマトキシリン対比染色（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）、脱水および固定を行って可視化した。分析および記録を、Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ２またはＭｉｒａｘスキャナーのどちらかを使用して行った（ともに、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＧｍｂＨ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）。
図１９に示されるように、最大のＴ細胞浸潤が、とりわけＣＬＤＮ６発現の境界領域において、ＣＤ３染色によって"ＰＢＭＣ／６ＰＨＵ３"群の腫瘍において検出された。コントロール群におけるＴＡＡ ＣＬＤＮ６の不均一な発現パターン（図１９Ａ、図１９Ｂ、図１９Ｃおよび図１９Ｄ）が、治療の結果として"ＰＢＭＣ／６ＰＨＵ３"群の腫瘍におけるＣＬＤＮ６発現のより密集した領域に変化した（図１９Ｄ）。

【0348】

実施例１５：ＣＬＤＮ１８．２およびＣＤ３を標的化する二重特異性結合剤の作製および試験
ａ．ｂｉ−ｓｃＦｖ構築物の配列起源、設計およびテンプレートべクターへのクローニング
ヒトＴ細胞受容体成分ＣＤ３イプシロンおよびヒト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して特異的である結合ドメインを含有する二重特異性のタンデム型単鎖抗体構築物（ｂｉ−ｓｃＦｖ）を調製した。それぞれの構築物のための対応する可変重鎖領域（ＶＨ）および対応する可変軽鎖領域（ＶＬ）を具体的には、５'末端から３'末端に、下記の連続する順で配置した：

【化3】

【0349】

表７には、本発明の過程で作製された、ＴＡＡ ＣＬＤＮ１８．２およびＰＬＡＣ１に対して特異的であるすべてのｂｉ−ｓｃＦｖ構築物がまとめられる。これらのｂｉ−ｓｃＦｖ構築物を、対応する抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列を使用してＧｅｎｅＡｒｔ ＡＧ（ＧｅｎｅＡｒｔ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）による遺伝子合成によって作製した。コドン最適化、例えば、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（ＨＳ）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ＭＭ）またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）をＧｅｎｅＡｒｔ社のＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）ソフトウエアによって実行した。これらが表７に示される。特異性、モノクローナル抗体（ｍＡＢ）由来の配列起源、コドン使用頻度、さらなる配列特徴、および、すべての適用されたドメインの参考文献に関する情報が表８にまとめられる。それぞれのＣＤ３抗体の可変ドメイン配列起源が表８に示される。ヒトＴＡＡおよびマウスＴＡＡの大きい相同性のために、同じ抗ＴＡＡ ＶＨ配列およびＶＬ配列を、マウス特異的な抗ＣＤ３抗体クローン１４５−２Ｃ１１のＶＨ配列、ＶＬ配列との組合せでの場合を除いて、マウスアッセイのためのｂｉ−ｓｃＦｖ構築物の作製のために使用することができた。
ＤＮＡクローニングおよび発現ベクター構築を、当業者によって広く知られている標準的な手順（Ｇｒｅｅｎ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、２０１２）に従って行った。簡単に記載すると、最初のｂｉ−ｓｃＦｖ ＤＮＡ配列には、５'側でのＢｓｍＢＩ制限部位および３'側でのＸｈｏＩ制限部位がｐＳＴ１プラスミドへのクローニングのために与えられた。分泌シグナル配列をｂｉ−ｓｃＦｖの分泌のために５'末端においてｂｉ−ｓｃＦｖ配列の上流側に導入した。１５個〜１８個のアミノ酸の柔軟なグリシン−セリンペプチドリンカーをコードする配列を、一方がＣＤ３に結合し、かつ、他方がＴＡＡに結合する単鎖可変抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を組み立てるためのＶＨドメインおよびＶＬドメインをつなぎ合わせるために挿入した。二重特異性単鎖抗体を形成するために、これら２つのｓｃＦｖドメイン配列を、短いペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ）をコードする配列によってつないだ。このリンカー配列と一緒に、ＢａｍＨＩ制限部位を、今後予定されているｂｉ−ｓｃＦｖ構築物のクローニングのためのｓｃＦｖドメイン交換のために導入した。簡単に記載すると、５'側のｓｃＦｖドメインをＢｓｍＢＩおよびＢａｍＨＩの制限によって交換し、３'側のｓｃＦｖドメインをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩの制限によって交換した。Ｃ末端の６×Ｈｉｓタグを、翻訳されたタンパク質の検出分析のために実行した。ｂｉ−ｓｃＦｖ配列のヒトアルファグロビンの５'側の非翻訳領域およびヒトベータグロビンの３'側の非翻訳領域がｐＳＴ１ベクターに存在した（詳細については、国際公開ＷＯ２００７／０３６３６６Ａ２；Ｗａｇｇｏｎｅｒ，Ｓ．他（２００３）、Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．（Ｍａｙｗｏｏｄ）、２２８（４）、３８７頁〜３９５頁を参照のこと）。
１ＢｉＭＡＢレプリコンベクターの作製のために、分泌シグナルおよび６×Ｈｉｓタグを含む完全な１ＢｉＭＡＢ配列を、Ｋ．Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍによって譲渡されたセムリキ森林ウイルスレプリコンベクター（ｐＳＦＶ）のサブゲノムプロモーターの３'側にサブクローン化した（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．他（２００１）、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１１５（１）、８３頁〜９１頁；Ｅｈｒｅｎｇｒｕｂｅｒ，Ｍ．Ｕ．他（１９９９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９６（１２）、７０４１頁〜７０４６頁）。
すべての構築物をＭＷＧの単回読み取り配列サービス（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、ドイツ）による配列決定によって確認し、正しい配列および１００個を超えるアデニンのポリ（Ａ）テールを有する構築物のみをインビトロＲＮＡ転写のために使用した。
構築物の概要については、図２０Ａもまた参照のこと。

【0350】

【表7】

【0351】

【表8】

【0352】

ｂ．ＩＶＴ−ＲＮＡ合成
抗ＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖのＩＶＴテンプレートを作製するために、プラスミドを、クラスＩＩｓのエンドヌクレアーゼを使用してポリ（Ａ）テールの下流側で線状化した。線状化されたテンプレートＤＮＡを、どこか他のところで記載されるようにフェノール／クロロホルム抽出および酢酸ナトリウム沈澱によって精製した（Ｈｏｌｔｋａｍｐ，Ｓ．他（２００６）、Ｂｌｏｏｄ、１０８（１３）、４００９頁〜４０１７頁）。
線状化されたＤＮＡテンプレートを、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｋｉｔｓ（Ａｍｂｉｏｎ ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を製造者の指針に従って使用するインビトロ転写に供した：ｐＳＴ１テンプレートを、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｋｉｔを用いて転写し、ｐＳＦＶテンプレートをＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ ＳＰ６ Ｋｉｔを用いて転写した。キャップアナロガとの反応のために、ＧＴＰ濃度を１．５ｍＭに下げ、６ｍＭのＡＲＣＡ、ｂｅｔａ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）またはｂｅｔａ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）（これらは、どこか他のところで記載されるように合成された；Ｋｏｗａｌｓｋａ，Ｊ．他（２００８）、ＲＮＡ、１４（６）、１１１９頁〜１１３１頁；Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，Ｅ．他（２００４）、ＲＮＡ、１０（９）、１４７９頁〜１４８７頁；Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，Ｊ．他（２００１）、ＲＮＡ、７（１０）、１４８６頁〜１４９５頁）を反応液に加えた。ＩＶＴ−ｍＲＮＡの精製を、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を用いてマニュアルに従って行った。ＩＶＴ−ＲＮＡの濃度および品質を、分光光度法、および、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、米国）での分析によって評価した。

【0353】

実施例１６：様々なＣＬＤＮ１８．２特異的ＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされた標的細胞によるｂｉ−ｓｃＦｖ分泌に対する応答でのＴ細胞活性化
ＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖのＩＶＴ−ＲＮＡの機能性を調べるために、比較的高レベルのヒトＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する胃ガン細胞株ＮｕｇＣ４（Ｓａｈｉｎ Ｕ．他（２００８）、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、１４（２３）、７６２４頁〜７６３４頁）を標的細胞株として使用した。
ＮｕｇＣ４標的細胞（これは、どのアッセイの前においてもＦＡＣＳ分析によってＴＡＡ発現について日常的に試験される）を、氷冷されたＸ−Ｖｉｖｏ１５培地（ＬＯＮＺＡ、Ｂａｓｅｌ、スイス）により２回洗浄し、２×１０７細胞／ｍｌの密度に再懸濁した。２５０μｌの細胞懸濁物を、事前に冷却された０．４ｃｍのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ／ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、ドイツ）に移し、２０μｇ／ｍｌのＩＶＴ−ｍＲＮＡを加えた。使用されたＩＶＴ−ｍＲＮＡは、１ＢｉＭＡＢ、ｎｏ．２、ｎｏ．３、ｎｏ．４、ｎｏ．５、ｎｏ．７、ｎｏ．８、ｎｏ．９およびｎｏ．１０であった。ｂｉ−ｓｃＦｖ変化体に関するさらなる情報については、表７および表８を参照のこと。注意深く混合した後、細胞を、ＢＴＸ ＥＣＭ ８３０エレクトロポレーター（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ、米国）を用いて、下記の条件を使用してトランスフェクションした：２５０Ｖ、２回のパルス、１２ｍｓのパルス長さ、４００ｍｓの間隔長さ。エレクトロポレーション後直ちに、キュベットを短時間氷上に置き、その後、細胞懸濁物を１５ｍｌのチューブにおけるＲＴの温かいアッセイ培地（５％の熱不活化ヒトＡＢ血清、０．５％のペニシリン−ストレプトマイシン、１×ＮＥＡＡおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムが補充されるＲＰＭＩ１６４０培地）（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）に移した。トランスフェクションされた標的細胞を計数し、１×１０^５細胞／ｍｌに調節した。
ヒトエフェクター細胞を標準的な手順（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１２）に従って健康なドナーのヒト血液から新たに単離した：簡単に記載すると、血液をＤＰＢＳにより希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）に重層し、遠心分離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を相間から回収し、２ｍＭのＥＤＴＡが補充される冷ＤＰＢＳにより洗浄し、計数した。ヒト細胞傷害性Ｔ細胞を、ＰＢＭＣから、ＣＤ８^＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ヒト）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｔｅｔｅｒｏｗ、ドイツ）により製造者の指針に従って磁気活性化細胞分離（ＭＡＣＳ）によって単離した。エフェクター細胞分離物を、ＦＡＣＳ分析（ＣＤ４染色、ＣＤ８染色）により、成功したＴ細胞単離について日常的に調べた。Ｔ細胞をアッセイ培地において５×１０^５細胞／ｍｌに調節した。
１×１０^５個の標的細胞を６ウエルプレートのウエルあたり播種し、ヒト細胞傷害性Ｔ細胞を５：１のＥ：Ｔ比に加えた。ウエルたりの最終体積が２ｍｌであった。エフェクター細胞および標的細胞を含有するコントロールサンプルは、ｎｏ．２５（親のＩｇＧ ｍＡＢ ｃｈＣＬＤＮ１８．２ａｂ）を分泌する標的細胞を含み、また、１ＢｉＭＡＢタンパク質を５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で陽性コントロールとして含んだ。コントロールには、単独でのエレクトロポレーション後の標的細胞または単独でのＴ細胞が、１ＢｉＭＡＢタンパク質を伴って、また、１ＢｉＭＡＢタンパク質を伴うことなく含まれた。４８時間後、Ｔ細胞および標的細胞を集め、標識し、フローサイトメトリーによって分析した。簡単に記載すると、すべての細胞を、Ｃｅｌｌ Ｓｃｒａｐｅｒｓ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ ＡＧ＆Ｃｏ、Ｎｕｒｍｂｒｅｃｈｔ、ドイツ）を用いて穏やかにかき取ることによって集め、５ｍｌの丸底チューブ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）に移した。細胞を遠心分離し、ＤＰＢＳにより洗浄した。細胞染色のために、マウス抗ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣ、マウス抗ヒトＣＤ６９−ＡＰＣおよびマウス抗ヒトＣＤ２５−ＰＥ（すべての抗体が、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を使用した。細胞ペレットを、蛍光コンジュゲート化抗体を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（５％のＦＢＳが補充されるＤＰＢＳ）に再懸濁した。インキュベーションを暗所において４℃で２０分間行った後、サンプルを４ｍｌのＤＰＢＳにより洗浄し、細胞ペレットを、死細胞の検出のために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）を１：１０００の最終希釈度で含有する２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。サンプルを、測定されるまで氷上および暗所において保った。アッセイの確立を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を用いて行った。分析をＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ、米国）によって評価した。
図２１Ａに示されるように、それぞれのＣＬＤＮ１８．２特異的なＩＶＴ−ｍＲＮＡが、効率的なＴ細胞活性化において見られるようなｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の分泌をもたらした。ほんのわずかな差をＴ細胞活性化において有する非常に強力な変化体が、大きい順に、ｎｏ．５ ＞ｎｏ．８＞ｎｏ．１０＞ｎｏ．３＞１ＢｉＭＡＢであった。これらの変化体のすべてが、５５％を超える総Ｔ細胞活性化を引き起こし、これに対して、ｎｏ．２、ｎｏ．４、ｎｏ．７およびｎｏ．９の変化体は４０％〜５０％の総Ｔ細胞活性化を引き起こした。
特異的な標的細胞溶解を下記の式によって計算した：％溶解＝（％ＰＩ^＋標的細胞サンプル−％ＰＩ^＋標的細胞ＥＰ参照）、ただし、"サンプル"は、共インキュベーションされたエフェクター細胞および標的細胞を示し、"ＥＰ参照"は、それぞれの個々のＩＶＴ−ｍＲＮＡエレクトロポレーションだけのエレクトロポレーションされた標的細胞を示す。図２１Ｂに示されるように、６５％を超える標的細胞溶解が、大きい順に、変化体１ＢｉＭＡＢ＞変化体ｎｏ．５＞変化体ｎｏ．８＞変化体ｎｏ．３によって達成された。他の変化体は５５％〜６４％の標的細胞溶解を媒介した。
最も強力なＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖはＴＲ６６のＶＨドメインおよびＶＬドメインを有し（１ＢｉＭＡＢ、ｎｏ．５、ｎｏ．１０）、または、ＵＣＨＴ１のＶＨドメインおよびＶＬドメインを有する（ｎｏ．３、ｎｏ．８）。ドメイン配向に関しては、タンパク質ｂｉ−ｓｃＦｖ変化体とは対照的に、著しい違いが何ら認められなかった（実施例３を参照のこと）。タンパク質研究に従って、１ＢｉＭＡＢをコードするＩＶＴ−ｍＲＮＡをさらなる研究のために選んだ。
１８ＲＨＵ５および１８ＲＨＵ３の構築物（表７および表８を参照のこと）を１ＢｉＭＡＢに対してその後の時点で比較した。１８ＲＨＵ５の効率が１ＢｉＭＡＢと同等であり、１８ＲＨＵ３はそれほど強力でなかった（データは示されず）。

【0354】

実施例１７：ＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖの１ＢｉＭＡＢを分泌する標的細胞に標的変更させられるＴ細胞の顕微鏡法分析
アッセイ設定は本質的には、実施例２．ａで記載される通りであった。
ヒト細胞傷害性Ｔ細胞を、新たに単離されたＰＢＭＣから、ＣＤ８^＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ヒト）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｔｅｔｅｒｏｗ、ドイツ）により製造者の指針に従ってＭＡＣＳによって単離した。
ＮｕｇＣ４標的細胞を調製し、そして、８０μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡまたは８０μｇ／ｍｌのｎｏ．２５ ｃｔｒｌ ＩＶＴ−ｍＲＮＡが使用されたことを除いて実施例１６で記載されるようにトランスフェクションした。トランスフェクションされた標的細胞を計数し、２×１０^５細胞／ｍｌに調節した。１×１０^４個の標的細胞を９６ウエルプレートのウエルあたり播種し、ヒト細胞傷害性Ｔ細胞を５：１のＥ：Ｔ比に従って加えた。ウエルたりの最終体積が１００μｌであった。コントロールサンプルは、単独でのトランスフェクション後の標的細胞を、エレクトロポレーション後の健常性を証明するために含み、また、コントロールｂｉ−ｓｃＦｖによりトランスフェクションされた標的細胞を、エフェクター細胞を伴って含んだ。組織培養プレートを続いて、３７℃、５％ＣＯ_２においてインキュベーションした。１ＢｉＭＡＢによりトランスフェクションされた標的細胞を含有するサンプルにおける標的細胞上でのＴ細胞クラスター化、免疫学的シナプスの形成および標的細胞の殺傷に関しての著しい影響が２４時間で認められ、これらの影響を、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＳ１００倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、日本）を用いて記録した。Ｔ細胞クラスター化または標的細胞溶解が、ｎｏ．２５によりトランスフェクションされた標的細胞を有するコントロールサンプルでは何ら認められず、このことは、Ｔ細胞の活性化を誘導するためのＴＡＡ発現に対する厳密な依存性を暗示していた。図２２もまた参照のこと。

【0355】

実施例１８：ＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖの１ＢｉＭＡＢによる濃度依存的なＴ細胞活性化のフローサイトメトリー分析
ＴＡＡ発現標的細胞の存在下におけるＴ細胞のｂｉ−ｓｃＦｖ濃度依存的な活性化を詳しく調べるために、３倍希釈系列をトランスフェクションプロセスに適用した。
ＮｕｇＣ４標的細胞を調製し、実施例１６で記載されるように、しかし、４０μｇ／ｍｌの最終ＩＶＴ−ｍＲＮＡ濃度によりトランスフェクションした。１ＢｉＭＡＢのＩＶＴ−ｍＲＮＡの濃度は０．４μｇ／ｍｌから４０μｇ／ｍｌにまで及び、これらには、適量のルシフェラーゼＩＶＴ−ｍＲＮＡが、すべてのサンプルをＩＶＴ−ｍＲＮＡ量に関して同じストレスレベルにさらすという目的により満たされた。
１×１０^５個のトランスフェクションされた標的細胞およびヒト細胞傷害性Ｔ細胞（実施例１６で記載されるように単離されたもの）を６ウエル形式における２ｍｌのアッセイ培地において１０：１のＥ：Ｔ比で播種した。コントロールサンプルは、１ＢｉＭＡＢのＩＶＴ−ｍＲＮＡによるのではなく、４０μｇ／ｍｌのルシフェラーゼＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされた標的細胞を含有した。標的細胞およびエフェクター細胞の２４時間および４８時間の共インキュベーションの後、細胞を、実施例１６で記載されるように集め、染色し、分析した。
図２３Ａおよび図２３Ｂに示されるように、著しいＴ細胞活性化が、４μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされた標的細胞を含有するサンプルにおいて認められた。このアッセイにおける最大のＴ細胞活性化には、４０μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡにより達した。ＣＤ６９およびＣＤ２５の発現が、共インキュベーション時間（図２３Ａ〜図２３Ｂ）およびＩＶＴ−ｍＲＮＡ濃度とともに変化した。１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡのより大きい量（１２μｇ／ｍｌおよび４０μｇ／ｍｌ）は、例えば、図２３ＢにおけるＣＤ６９の発現と比較してＣＤ２５の増大した発現においてはっきり見られるように、Ｔ細胞活性化機構のより速い開始を引き起こした。総Ｔ細胞活性化は約４０％を超えなかった。

【0356】

実施例１９：ＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖの１ＢｉＭＡＢによる濃度依存的なＴ細胞媒介の標的細胞溶解のフローサイトメトリー分析
ｂｉ−ｓｃＦｖ濃度依存的なＴ細胞媒介の標的細胞溶解を詳しく調べるために、実施例１８で記載される実験設定を使用した。エフェクター細胞および標的細胞の共インキュベーションサンプル（"サンプル"）のほかに、個々にエレクトロポレーションされた標的細胞もまた単独で播種した。後者は、エレクトロポレーションプロセス自体によって死んだ標的細胞をＴ細胞によって溶解された標的細胞から引くための参照サンプル（"ＥＰ参照"）として役立った。
採取および染色を実施例１８に従って行った。標的細胞を最後に、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を用いて、ヨウ化プロピジウムのそれらの取り込みにより分析した。
特異的な標的細胞溶解の割合をバックグラウンドでの死細胞の二段階の減算によって求めた：
１．％Ｔ細胞媒介溶解＝（％ＰＩ^＋標的細胞サンプル−％ＰＩ^＋標的細胞ＥＰ参照）
２．％特異的溶解＝（％Ｔ細胞媒介溶解サンプル−％Ｔ細胞媒介溶解ｃｔｒｌ）
"％Ｔ細胞媒介溶解ｃｔｒｌ"が、エフェクター細胞を伴う場合および伴わない場合のコントロールサンプル（４０μｇ／ｍｌのルシフェラーゼＩＶＴ−ｍＲＮＡのみ）のＰＩ^＋標的細胞の差から推定される。
この計算によって、５５．５％＋／−５．６％の最大特異的溶解には、この実験では１２μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡにより達する。エレクトロポレーションのストレスに対するＮｕｇＣ４標的細胞の感受性、および、それに加えて、差し引かれる避けらないバックグラウンドでの死んでいる標的細胞のために、プロットされた特異的標的細胞溶解は、この実験設定では、実際の溶解割合よりも低いかもしれない。

【0357】

実施例２０：１ＢｉＭＡＢのＩＶＴ−ｍＲＮＡによるトランスフェクションに対する応答におけるＴ細胞増殖
Ｔ細胞増殖はＴ細胞活性化の指標である。特異的なＴ細胞増殖をＣＬＤＮ１８．２陽性標的細胞の存在下でのｂｉ−ｓｃＦｖコードＩＶＴ−ｍＲＮＡ １ＢｉＭＡＢに対する応答において示すために、フローサイトメトリーアッセイを使用した。簡単に記載すると、実施例１６で記載されるように単離された１×１０^７個のヒトＴ細胞を、ＤＰＢＳに溶解される１μＭのカルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、ドイツ）により暗所においてＲＴで５分間染色した。細胞をＤＰＢＳ／５％ＦＣＳにより２回洗浄し、２×１０６細胞／ｍｌにアッセイ培地において再懸濁した。標的細胞として、ヒトＣＬＤＮ１８．２がレンチウイルスにより形質導入されるＮｕｇＣ４細胞、および、特異性試験のためにはＣＬＤＮ１８．２陰性乳ガン細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を選んだ。２０μｇ／ｍｌのＩＶＴ−ｍＲＮＡ １ＢｉＭＡＢまたは非標的化コントロールをエレクトロポレーションのために使用した。ＮｕｇＣ４のエレクトロポレーションを実施例１６で記載されるように行った。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のエレクトロポレーションを、下記の条件を使用して行った：４００Ｖ、３ｍｓのパルス長さ、１回のパルス、４００ｍｓの間隔長さ、０．４ｃｍのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ／ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、ドイツ）において。実施例１６で記載されるような細胞傷害性アッセイを、トランスフェクションされた標的細胞と、エフェクター細胞としてのＣＦＳＥ標識されたヒトＴ細胞とを用いて設定した。単独でのＴ細胞、および、トランスフェクションされていない標的細胞またはコントロールトランスフェクションされた標的細胞＋Ｔ細胞を陰性コントロールとして使用した。５μｇ／ｍｌのＯＫＴ３（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ、Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ、米国）および２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｆｅｌｌ、ドイツ）により刺激される単独でのＴ細胞が陽性コントロールとして役立った。５ｎｇ／ｍｌの濃度での１ＢｉＭＡＢタンパク質を、アッセイの妥当性を確認するために、トランスフェクションされていない標的細胞＋Ｔ細胞に適用した。非標的化ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質６ＰＨＵ３と一緒にされるサンプルを特異性コントロールとして含めた。すべてのサンプルを９６ウエルにおける０．２ｍｌのアッセイ培地の総体積において三連で設定した。７２時間の共インキュベーションの後、Ｔ細胞を集め、５ｍｌの丸底チューブに採取し、洗浄し、ヒトＴ細胞を腫瘍細胞から区別するために２μｌの抗ＣＤ４５−ＡＰＣにより、また、２００μｌのＤＰＢＳにおいて死細胞を対比染色するために０．２５μｌのｅＦｌｕｏｒ５０６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）により４℃で３０分間染色した。ＤＰＢＳによる洗浄の後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を用いて分析した。
Ｔ細胞の増殖が、ＣＬＤＮ１８．２陽性標的細胞およびｂｉ−ｓｃＦｖ １ＢｉＭＡＢの存在下のみにおける低下するＣＦＳＥシグナルによって検出された（図２５もまた参照のこと）。陽性コントロールのほかに、４２％〜４８％のＴ細胞増殖を、１ＢｉＭＡＢタンパク質との組合せでＣＤＬＮ１８．２陽性標的細胞の存在下で認めることができた。１ＢｉＭＡＢのＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされた標的陽性細胞は、２２％＋／−３％をもたらした。タンパク質に対する場合よりも低い、ＩＶＴ−ｍＲＮＡに対する応答における増殖はおそらくは、ＮｕｇＣ４標的細胞により達成可能である低いトランスフェクション効率のためである。ＣＬＤＮ１８．２陰性標的細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とインキュベーションされるＴ細胞は、どのような型においてであれ、同様にまた、陽性コントロールを除いて、標的細胞を伴わないＴ細胞において著しい増殖を示していない。

【0358】

実施例２１：効力のある比率を決定するためのエフェクター対標的比の用量設定
ＦＡＣＳ分析に基づくインビトロ細胞傷害性アッセイの状況における好適なＥ：Ｔ比を求めるために、３倍ずつで０．３：１から１０：１にまで及ぶＥ：Ｔ比を選んだ。
ＮｕｇＣ４標的細胞を調製し、４０μｇ／ｍｌのＩＶＴ−ｍＲＮＡ濃度を用いて実施例１６で記載されるようにトランスフェクションした。１ＢｉＭＡＢのＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされた細胞の１つの調製物をすべての試験サンプルのために使用した。４０μｇ／ｍｌのルシフェラーゼＩＶＴ−ｍＲＮＡのトランスフェクションを陰性コントロールとして選択した。
ヒト細胞傷害性Ｔ細胞を実施例１６で記載されるように、新たに単離されたＰＢＭＣから分離し、エフェクター細胞として扱った。１×１０^５個のトランスフェクションされた標的細胞を、６ウエルプレートにおいて二連で、下記のエフェクター対標的比で細胞傷害性Ｔ細胞と共インキュベーションした：０．３：１〜１：１〜３：１〜１０：１。加えて、ヒト細胞傷害性Ｔ細胞を、バックグラウンドでのＴ細胞活性化を求めるために標的細胞の非存在下で培養した。コントロールのＩＶＴ−ｍＲＮＡまたは１ＢｉＭＡＢのＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされる標的細胞はまた、エレクトロポレーションのストレスによるバックグラウンドでの死細胞を明確にするためにエフェクター細胞の非存在下で培養された。ルシフェラーゼ陰性コントロールは１０：１の最大Ｅ：Ｔ比で播種されただけであった。４８時間の共インキュベーションの後、細胞を、実施例１６で記載されるように集め、標識し、分析した。
図２６Ａは、ＮｕｇＣ４標的細胞による１ＢｉＭＡＢ分泌に対する応答における細胞傷害性Ｔ細胞の特異的な活性化を示す。サンプルにおけるＴ細胞の数に関係なく、５０％〜６０％の総活性化が検出された。そのうえ、サンプルにおけるＣＤ２５発現およびＣＤ６９発現の分布が非常に類似している。このことは、細胞傷害性Ｔ細胞の集団には、活性化され得るある特定の割合のＴ細胞が存在することを示している。
図２６Ｂでは、効率的な標的細胞溶解が細胞傷害性Ｔ細胞の数に依存することが明白になる。標的細胞がほんの０．３：１のＥ：Ｔ比で溶解されるとしても、強力な溶解が３：１の比により始まる。

【0359】

実施例２２：１ＢｉＭＡＢのＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされたエフェクター細胞を用いるＦＡＣＳ型アッセイにおけるＴ細胞活性化および標的細胞溶解の分析
この実験では、目的が、同様にヒトエフェクター細胞もＩＶＴ−ｍＲＮＡトランスフェクションの後で１ＢｉＭＡＢを産生し、かつ、分泌し得るかを試験することであった。この背後にある理論的根拠が、患者自身のＴ細胞をｂｉ−ｓｃＦｖによりトランスフェクションし、その後、患者に再移入することができるであろうという仮想上の患者状況であった。
ヒト細胞傷害性Ｔ細胞（実施例１６で記載されるように単離されたもの）をＸ−Ｖｉｖｏ１５培地（ＬＯＮＺＡ、Ｂａｓｅｌ、スイス）により２回洗浄し、２×１０７細胞／ｍｌの密度に再懸濁した。２５０μｌの細胞懸濁物を、事前に冷却された０．４ｃｍのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ／ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、ドイツ）に移し、８０μｇ／ｍｌまたは２４０μｇ／ｍｌのＩＶＴ−ｍＲＮＡを加えた。使用されるＩＶＴ−ｍＲＮＡは、１ＢｉＭＡＢと、コントロールとしてのｅＧＦＰとであった。注意深く混合した後、細胞を、ＢＴＸ ＥＣＭ ８３０（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ、米国）エレクトロポレーターを用いて、下記の条件を使用してエレクトロポレーションした：５００Ｖ、１回のパルス、３ｍｓのパルス長さ、４００ｍｓの間隔長さ。エレクトロポレーション後直ちに、キュベットを短時間氷上に置き、その後、細胞懸濁物を、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含有するアッセイ培地（５％の熱不活化ヒトＡＢ血清、０．５％のペニシリン−ストレプトマイシン、１×ＮＥＡＡおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムが補充されるＲＰＭＩ１６４０培地）（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）に移した。トランスフェクションされたエフェクター細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２において一晩培養した。翌日、トランスフェクション効率をＦＡＣＳによって分析し、これにより、７０％を超えるトランスフェクション効率が、ｅＧＦＰのＩＶＴ−ｍＲＮＡの両方の濃度について明らかにされた。それぞれのエフェクター細胞サンプルを計数し、５×１０^５細胞／ｍｌに調節した。ＮｕｇＣ４標的細胞をトリプシン処理によって集め、アッセイ培地により洗浄し、計数し、１×１０^５細胞／ｍｌに調節した。エフェクター細胞および標的細胞を混合し、５：１の最終Ｅ：Ｔ比および２ｍｌの最終体積を用いて６ウエルに二連で播種した。処理されていないＴ細胞を、バックグラウンドでの活性化シグナルを求めるために標的細胞を伴うことなく播種した。アッセイ分析を、３７℃、５％ＣＯ_２における４８時間の共インキュベーションの後、実施例１６で記載されるように行った。
１ＢｉＭＡＢのＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされ、かつ、標的細胞と共インキュベーションされる細胞傷害性Ｔ細胞の著しい活性化が、図２７Ａに示されるように達成された。１ＢｉＭＡＢのＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされたＴ細胞による標的細胞溶解が、図２７Ｂにプロットされるように６０％を超えていた。８０μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡの影響は、より大きいＲＮＡ量により増大させることができなかった。
この実験から結論づけると、エフェクター細胞を理論的には、ｂｉ−ｓｃＦｖを産生し、かつ、分泌するレシピエント細胞として使用することができるであろう。

【0360】

実施例２３：ＣＬＤＮ１８．２陰性標的細胞を使用するルシフェラーゼ型細胞傷害性アッセイにおける１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡの標的特異性の調査
厳密な標的特異性が、望まれない有害影響を患者において回避するための重要な検討事項である。この予備的研究では、ＣＬＤＮ１８．２陰性細胞株である奇形ガン細胞株ＰＡ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７２）が、ＩＶＴ−ｍＲＮＡとして導入される１ＢｉＭＡＢの非特異的な細胞溶解能を調べるために選ばれている。
使用されるＰＡ−１細胞株はレンチウイルスのルシフェラーゼベクターにより安定的に形質導入されており、したがって、ルシフェラーゼに基づく細胞傷害性アッセイにおいて適用することができた。ＰＡ−１／ｌｕｃ標的細胞を、実施例１６で記載されるようにエレクトロポレーションのために調製した。合計で４０μｇ／ｍｌのＩＶＴ−ｍＲＮＡをサンプルあたりトランスフェクションした。使用されるＩＶＴ−ｍＲＮＡは、１ＢｉＭＡＢ、ｎｏ．２５および６ＲＨＵ３であった。ｎｏ．２５は、発現されないＴＡＡ ＰＬＡＣ−１を標的とし、６ＲＨＵ３はＰＡ−１／ｌｕｃ細胞において高発現の標的ＣＬＤＮ６を標的とする。ｂｉ−ｓｃＦｖ変化体に関するさらなる情報については、表７および表８を参照のこと。ｎｏ．２５を、ＲＮＡトランスフェクションによって引き起こされる同じストレスレベルをすべての標的細胞サンプルについて保証するために、４μｇ／ｍｌのＩＶＴ−ｍＲＮＡによるエレクトロポレーションサンプルにおけるフィルアップ用ＩＶＴ−ｍＲＮＡとして使用した。注意深く混合した後、細胞を、ＢＴＸ ＥＣＭ ８３０エレクトロポレーター（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ、米国）を用いて、０．４ｃｍのキュベットのための下記の条件を使用してトランスフェクションした：２００Ｖ、２回のパルス、１２ｍｓのパルス長さ、４００ｍｓの間隔長さ。エレクトロポレーション後直ちに、キュベットを短時間氷上に置き、その後、細胞懸濁物を１５ｍｌのチューブにおけるＲＴの温かいＰＡ−１アッセイ培地（１０％の熱不活化ＦＣＳ、０．５％のペニシリン−ストレプトマイシン、１×ＮＥＡＡ、１．５ｇ／ｌの重炭酸ナトリウムおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムが補充されるＭＥＭ培地）（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）に移した。トランスフェクションされた標的細胞を計数し、１×１０^５細胞／ｍｌに調節した。
ヒトエフェクター細胞を実施例１６で記載されるように単離した。ヒト細胞傷害性Ｔ細胞を、ＰＢＭＣから、Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（ヒト）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｔｅｔｅｒｏｗ、ドイツ）により製造者の指針に従って磁気活性化細胞分離（ＭＡＣＳ）によって単離した。Ｔ細胞をＰＡ−１アッセイ培地において５×１０^５細胞／ｍｌに調節した。
１×１０^４個の標的細胞を９６ウエルプレートのウエルあたり播種し、ヒト細胞傷害性Ｔ細胞を５：１のＥ：Ｔ比に加えた。ウエルたりの最終体積が１００μｌであった。エフェクター細胞および標的細胞を含有するコントロールサンプルは、陰性コントロールとしての、ｎｏ．２５を分泌する標的細胞、陽性コントロールとしての６ＲＨＵ３タンパク質または６ＰＨＵ３タンパク質、および、１ＢｉＭＡＢタンパク質を含んだ。タンパク質濃度を１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度に設定し、ｎｏ．２５によりトランスフェクションされた標的細胞と一緒にして、同じ条件を使用された標的細胞について保証した。最小溶解コントロール（Ｌ_ｍｉｎ）には、それぞれのエレクトポレーションされた標的細胞サンプルが単独で含まれた。自然溶解コントロール（Ｌ_ｍａｘ）は、Ｌ試験サンプルからの減算のための非処理の標的細胞およびエフェクター細胞（Ｌ_ｍａｘ１）、または、Ｌ_ｍｉｎからの減算のための単独での処理されていない標的細胞の（Ｌ_ｍａｘ２）からなった。それぞれのサンプルを三連で播種した。アッセイ分析を、３７℃、５％ＣＯ_２における７２時間のインキュベーションの後で着手した。自然溶解コントロール（Ｌ_ｍａｘ）を、２％の最終濃度でのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により処理した。
分析のために、１ｍｇ／ｍｌのルシフェリン（ＢＤ Ｍｏｎｏｌｉｇｈｔ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）および５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する水溶液の５０μｌをウエルあたり加え、続いて、プレートを３７℃において暗所で３０分間インキュベーションした。ルシフェラーゼを発現する生細胞によるルシフェリンの酸化から生じる発光をマイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００、Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、スイス）で測定した。特異的な標的細胞溶解の百分率を下記の式によって計算した：％特異的溶解＝［１−（発光試験サンプル−Ｌ_ｍａｘ１）／（Ｌ_ｍｉｎ−Ｌ_ｍａｘ２）］×１００。
図２８は、特異的な標的細胞溶解の割合を示す。陰性コントロールｎｏ．２５または１ＢｉＭＡＢによりトランスフェクションされるＣＬＤＮ１８．２陰性のＰＡ−１／ｌｕｃ細胞は、著しい溶解を７２時間のインキュベーションの後さえ示さない。同様に、１００ｎｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢタンパク質は著しい溶解を生じさせておらず、これに対して、ＴＡＡを標的化する６ＲＨＵ３のｂｉ−ｓｃＦｖ分泌による溶解、または、１００ｎｇ／ｍｌの６ＰＨＵ３タンパク質による溶解は８５％〜９３％の間であった。２４時間および４８時間の時点を同様に分析した。これらの時点は、同等な結果を示す（データは示されず）。

【0361】

実施例２４：哺乳動物細胞のＩＶＴ−ＲＮＡトランスフェクションの後における１ＢｉＭＡＢタンパク質産生の定性的分析
タンパク質へのＲＮＡ翻訳を哺乳動物細胞において詳しく調べるために、細胞株ＢＨＫ２１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１３００１）を発現系として選んだ。２×１０^７個／ｍｌのＢＨＫ２１細胞を、すべての工程がＲＴで行われたという違いを伴って実施例１６で記載されるようにエレクトロポレーションによってトランスフェクションした。２５０μｌの細胞懸濁物を０．４ｃｍのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ／ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、ドイツ）に移し、４０μｇ／ｍｌの１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡまたはＩＶＴ−レプリコンＲＮＡを加えた。エレクトロポレーション条件は下記の通りであった：３００Ｖ、１６ｍｓのパルス長さ、１回のパルス、４００ｍｓの間隔長さ。
エレクトロポレーションされた細胞をＲＴでの培養培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＣＳ）に再懸濁し、１５ｃｍの培養ディッシュに移した。播種後５時間で、ＦＣＳを含有する培地をＦＣＳ非含有培地によって取り換えた。実施例２４ａおよび実施例２４ｂの場合には、細胞培養上清および細胞をエレクトロポレーション後１８時間で別々に集めた。細胞ペレットを１×ＬＤＳサンプル緩衝液（カタログ番号ＮＰ０００８；Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）において溶解し、７２℃で１５分間加熱した。ＥＬＩＳＡ分析のために、濃縮されていない上清およびおよそ５０倍濃縮された上清を使用した。濃縮を、Ａｍｉｃｏｎ ウルトラ−１５遠心ろ過ユニット（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、米国）を用いて製造者のプロトコルに従って行った。実施例２４ｃ（ＩＶＴ−ｍＲＮＡのみ）の場合には、上清をトランスフェクション後４８時間で集め、上記で記載されるように４０倍濃縮に供した。

【0362】

ａ．上清を使用するＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ分析のために、ニッケル被覆プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｎｎ、ドイツ）を、分析物をそのＨｉｓタグにより捕捉するために使用した。最初に、プレートをウエルあたり２００μｌの洗浄緩衝液（１×ＰＢＳにおける０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０）により３回洗浄した。標準物として、精製された１ＢｉＭＡＢタンパク質を１×ＰＢＳにおける１．７５％のＮａカゼイン（＝希釈液）に希釈した。希釈列は２倍ずつで２．３４ｎｇ／ｍｌから３７．５０ｎｇ／ｍｌにまで及んだ。標準希釈物あたり１００μｌをそれぞれの濃度の三連でウエルに移した。したがって、１００μｌのサンプルが三連で移された。プレートを接着性フィルムにより密封し、３７℃で３０分間インキュベーションした。その後、プレートをウエルあたり２００μｌの洗浄緩衝液により３回洗浄した。１ＢｉＭＡＢの検出のために、ｍＣＬＤＮ１８．２ａｂのＶＨ−ＶＬに特異的に結合し、したがって、１ＢｉＭＡＢにまた特異的に結合する抗イディオタイプのモノクローナルＩｇＧ ８Ｂ１Ｆ３を使用した。８Ｂ１Ｆ３を１μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈液に混合した。１００μｌの抗イディオタイプ抗体溶液をそれぞれのウエルに移し、その後には、３７℃での３０分のインキュベーション時間が続いた。続いて、プレートをウエルあたり２００μｌの洗浄緩衝液により３回洗浄し、１００μｌのＡＰコンジュゲート化抗マウス検出抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、米国）（希釈液で１：５００希釈されたもの）をそれぞれのウエルに加え、その後、３７℃で３０分のインキュベーションを行った。最後の洗浄工程（２００μｌの洗浄緩衝液、３回）の後、適切な基質緩衝液（１Ｍのジエタノールアミン、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０１％のアジ化Ｎａ、ｐＨ９．８）における１．５ｍｇ／ｍｌの基質ｐＮＰＰをそれぞれのウエルに加え、その後、インキュベーションを暗所においてＲＴで３０分間行った。１００μｌの３Ｍ ＫＯＨをそれぞれのウエルのために使用して、酵素反応を停止させた。吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００、Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、スイス）を用いて測定した。二重波長分析のために、４０５ｎｍを測定波長として設定し、４９２ｎｍを参照波長として設定した。吸光度値を、参照波長を測定波長から引くことによって計算した。
図２９Ａにおいて、標準偏差を含む４０５ｎｍにおける平均吸光度値がプロットされる。１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡおよびＩＶＴ−レプリコンによりトランスフェクションされた細胞から得られる濃縮された上清は、ｂｉ−ｓｃＦｖをコードするＩＶＴ−ＲＮＡの翻訳を証明する著しいシグナルを引き起こした。模擬トランスフェクションされた細胞から得られる濃縮された上清はシグナルを何ら生じさせなかった。実際のタンパク質濃度は、ＩＶＴ−ｍＲＮＡ構築物およびＩＶＴ−レプリコン構築物の異なる毒性ならびにわずかに異なるｘ倍濃縮物のために提案することができない。濃縮されていない上清における近似的タンパク質濃度の推定は、ＩＶＴ−レプリコンサンプルについては１．５ｎｇ／ｍｌの範囲であり、ＩＶＴ−ｍＲＮＡサンプルについては２．４ｎｇ／ｍｌの範囲であった。

【0363】

ｂ．上清および細胞溶解物（ＩＶＴ−ｍＲＮＡサンプルおよびＩＶＴ−レプリコンサンプル）のウエスタンブロット分析
ウエスタンブロットによる分析のために、濃縮上清および細胞溶解物を、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）で分離した。１ＢｉＭＡＢのＩＶＴ−ｍＲＮＡ、ＩＶＴ−レプリコンＲＮＡによりトランスフェクションされたＢＨＫ２１細胞または非処理細胞の上清および細胞溶解物、ならびに、陽性コントロール（０．１μｇの精製された１ＢｉＭＡＢタンパク質）を負荷した。ウエスタンブロット分析を標準的な手順（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２）によって行った。簡単に記載すると、タンパク質をＰＶＤＦメンブランにブロットし、ブロッキング処理をＰＢＳＴ／３％粉乳により行った後、メンブランを、ブロッキング緩衝液において１：５００で希釈される一次抗体Ａｎｔｉ−ＨＩＳ Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｔａｇ（Ｄｉａｎｏｖａ ＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）と４℃で１時間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液による繰り返された洗浄の後、メンブランを、ブロッキング緩衝液において１：１００００で希釈されるＦｃ特異的な二次のペルオキシダーゼコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）と４℃で１時間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液による繰り返された洗浄の後、シグナルを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国）によって可視化し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００ Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）によって記録した。１ＢｉＭＡＢのシグナルが、内部分子量標準と比較した場合、５０ｋＤと６０ｋＤとの間に検出された。
図２９Ｂに示されるように、弱いシグナルが、ＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされた細胞（レーン２）およびＩＶＴ−レプリコンＲＮＡによりトランスフェクションされた細胞（レーン３）において検出されたが、これに対して、上清が非処理細胞に由来するレーン４はシグナルを伴っていない。強いシグナルを、ＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされた細胞（レーン５）およびＩＶＴ−レプリコンＲＮＡによりトランスフェクションされた細胞（レーン６）の細胞溶解物により生じさせることができた。非処理細胞に由来する細胞溶解物（レーン７）は再度ではあるが、シグナルを全くもたらさなかった。すべてのシグナルが、精製された１ＢｉＭＡＢタンパク質コントロール（レーン８）と同じくらいの大きさで現れた。上清における弱いシグナル、および、それとともに、弱い１ＢｉＭＡＢ分泌はおそらくは、トランスフェクション後のインキュベーション時間が比較的短いためである。レプリコンＲＮＡの毒性影響のために、より長いインキュベーション時間は調べることができなかった。
両方の分析は定性的であり、タンパク質濃度の決定のためには役立たない。

【0364】

ｃ．上清（ＩＶＴ−ｍＲＮＡサンプル）のウエスタンブロット分析
トランスフェクション後４８時間で採取された上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、その後、ウエスタンブロット分析を実施例２４ｂで記載されるように行った。図２９Ｃに示されるように、ＩＶＴ−ｍＲＮＡから翻訳され、上清に分泌されたｎｏ．２５および１ＢｉＭＡＢがそれらのＨｉｓタグにより検出された。それに加えて、１ＢｉＭＡＢの産生および分泌、同様にまた、ｂｉ−ｓｃＦｖ特異性コントロールとして使用されているｎｏ．２５の産生および分泌を証明することができた。

【0365】

実施例２５：筋肉内ＲＮＡ注入の後におけるインビボ翻訳された機能的な１ＢｉＭＡＢタンパク質の検出
８週齢〜１６週齢でのメスおよびオスのＮＳＧマウスを選択し、５匹のマウスからなる４つの群に分けた。４０μｌのＲＮＡ溶液をマウスおよび大腿筋につき注入した。４０μｌのＲＮＡ溶液は、１×ＰＢＳ、５μｇのＤ２キャップ化１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡまたはＩＶＴ−レプリコン、２μｇのＤ１キャップ化ルシフェラーゼＩＶＴ−ｍＲＮＡ、および、０μｇまたは１５μｇのＤ１キャップ化ＥＢＫ ＩＶＴ−ｍＲＮＡからなった。ワクシニアウイルスタンパク質（Ｅ３Ｌ、Ｂ１８ＲおよびＫ３Ｌ）（ＥＢＫ）をコードするＥＢＫ ＩＶＴ−ｍＲＮＡを共注入して、ＩＦＮ応答を阻害し、かつ、ＰＫＲ活性化をＲＮＡ翻訳増強のために打ち消した（特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０４６７３）。ルシフェラーゼシグナルを、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ ２０００を用いて注入後２４時間でモニターして、シグナルを有しないマウスをサンプル集団から除いた。
血液を、注入の２日後、４日後および７日後に採取した。血清を集め、続いて−８０℃で凍結した。強い発光シグナルを有するマウスの筋肉をＲＮＡ注入の４日後に解剖し、ＩＨＣのために組織固定し、または、ウエスタンブロット分析のために急速凍結した。

【0366】

細胞傷害性アッセイ
ＮＳＧマウスの血清をインビトロ細胞傷害性アッセイで分析した。ホタルルシフェラーゼおよびより良好な標的発現のためのヒトＣＬＤＮ１８．２が安定的に形質導入されたＮｕｇＣ４標的細胞を、最大感受性のための３０対１のＥ：Ｔ比でのヒトＴ細胞（実施例１６で記載されるように単離されたもの）とともに播種した。アッセイ培地は、１０％の熱不活化ＦＣＳ、０．５％のペニシリン−ストレプトマイシン、１×ＮＥＡＡおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムが補充されるＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）からなった。２０μｌの解凍された試験血清を試験サンプルウエルあたり加えた。標準物１ＢｉＭＡＢタンパク質コントロールウエル、Ｌ_ｍｉｎウエルおよびＬ_ｍａｘウエルを、処置されていないＮＳＧマウスの２０μｌの血清により完成させた。ウエルたりの最終体積が１００μｌであった。Ｌ_ｍｉｎを二連で播種し、Ｌ_ｍａｘを六連で播種し、試験サンプルを三連で播種した。３７℃および５％ＣＯ_２における４８時間のインキュベーションの後、Ｌ_ｍａｘウエルを１０μｌの２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液と混合し、１０分間インキュベーションした。すべての他のウエルには１０μｌのアッセイ培地を加えた。５０μｌのルシフェリン溶液（実施例２３を参照のこと）を加え、プレートを、暗所における３７℃での３０分のインキュベーション工程の後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、スイス）で測定した。特異的な標的細胞溶解の計算を実施例２３で記載されるように行った。
図３０において、パーセント特異的溶解がプロットされる。著しい細胞傷害性影響がそれぞれの群において検出された。細胞溶解影響が、ＥＢＫおよび１ＢｉＭＡＢ ＩＶＴ−ｍＲＮＡが注入され、注入の２日後に集められるマウスの血清を含有するウエルにおいて１．７倍増大した。著しくより低い影響が、注入の４日後または７日後に集められるサンプルによって達成された。１ＢｉＭＡＢレプリコンサンプルの場合には、より遅い時点で集められる血清もまた、強い細胞溶解影響を生じさせた。
これらのデータにより、筋肉内注入の後におけるＩＶＴ−ｍＲＮＡまたはＩＶＴ−レプリコンからの１ＢｉＭＡＢのインビボ翻訳ならびに血流内への分泌が立証される。

【0367】

実施例２６：ＣＬＤＮ６およびＣＤ３を標的化する二重特異性結合剤の作製および試験
ａ．ｂｉ−ｓｃＦｖ構築物の配列起源、設計およびテンプレートべクターへのクローニング
ヒトＴ細胞受容体成分ＣＤ３およびヒト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して特異的である結合ドメインを含有する二重特異性のタンデム型単鎖抗体構築物（ｂｉ−ｓｃＦｖ）を調製した。それぞれの構築物のための対応する可変重鎖領域（ＶＨ）および対応する可変軽鎖領域（ＶＬ）を具体的には、５'末端から３'末端に、下記の連続する順で配置した：

【化4】

【0368】

表９には、本発明の過程で作製された、ＴＡＡ ＣＬＤＮ６に対して特異的であるすべてのｂｉ−ｓｃＦｖ構築物がまとめられる。ＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖ構築物１ＢｉＭＡＢをコントロール抗体として使用した。これらのｂｉ−ｓｃＦｖ構築物を、対応する抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列を使用してＧｅｎｅＡｒｔ ＡＧ（ＧｅｎｅＡｒｔ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）による遺伝子合成によって作製した。コドン最適化、例えば、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（ＨＳ）またはハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ＭＭ）をＧｅｎｅＡｒｔ社のＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）ソフトウエアによって実行した。これらが表９に示される。特異性、モノクローナル抗体（ｍＡＢ）からの配列起源、コドン使用頻度、さらなる配列特徴、および、すべての適用されたドメインの参考文献に関する情報が表１０にまとめられる。それぞれのＣＤ３抗体の可変ドメイン配列起源が表１０に示される。ヒトＴＡＡおよびマウスＴＡＡの大きい相同性のために、同じ抗ＴＡＡ ＶＨ配列およびＶＬ配列を、マウス特異的な抗ＣＤ３抗体クローン１４５−２Ｃ１１のＶＨ配列、ＶＬ配列との組合せでの場合を除いて、マウスアッセイのためのｂｉ−ｓｃＦｖ構築物の作製のために使用することができた。
ＤＮＡクローニングおよび発現ベクター構築を、当業者によって広く知られている標準的な手順（Ｇｒｅｅｎ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、２０１２）に従って行った。簡単に記載すると、最初のｂｉ−ｓｃＦｖ ＤＮＡ配列には、５'側でのＢｓｍＢＩ制限部位および３'側でのＸｈｏＩ制限部位がｐＳＴ１プラスミドへのクローニングのために与えられた。分泌シグナル配列をｂｉ−ｓｃＦｖの分泌のために５'末端においてｂｉ−ｓｃＦｖ配列の上流側に導入した。１５個〜１８個のアミノ酸の柔軟なグリシン−セリンペプチドリンカーをコードする配列を、一方がＣＤ３に結合し、かつ、他方がＴＡＡに結合する単鎖可変抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を組み立てるためのＶＨドメインおよびＶＬドメインをつなぎ合わせるために挿入した。二重特異性単鎖抗体を形成するために、これら２つのｓｃＦｖドメイン配列を、短いペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ）をコードする配列によってつないだ。このリンカー配列と一緒に、ＢａｍＨＩ制限部位を、今後予定されているｂｉ−ｓｃＦＶ構築物のクローニングのためのｓｃＦｖドメイン交換のために導入した。簡単に記載すると、５'側のｓｃＦｖドメインをＢｓｍＢＩおよびＢａｍＨＩの制限によって交換することができ、３'側のｓｃＦｖドメインをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩの制限によって交換することができた。Ｃ末端の６×Ｈｉｓタグが、翻訳されたタンパク質の検出分析のために役立った。６ＲＨＵ３レプリコンベクターの作製のために、分泌シグナルおよび６×Ｈｉｓタグを含む完全な６ＲＨＵ３配列を、Ｋ．Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍによって譲渡されたセムリキ森林ウイルスレプリコンベクター（ｐＳＦＶ）のサブゲノムプロモーターの３'側にサブクローン化した（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．他（２００１）、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１１５（１）、８３頁〜９１頁；Ｅｈｒｅｎｇｒｕｂｅｒ，Ｍ．Ｕ．他（１９９９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９６（１２）、７０４１頁〜７０４６頁）。
すべての構築物をＭＷＧの単回読み取り配列サービス（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、ドイツ）による配列決定によって確認し、正しい配列および１００個を超えるアデニンのポリ（Ａ）テールを有する構築物のみをインビトロＲＮＡ転写のために使用した。
構築物の概要については、図３１Ａもまた参照のこと。

【0369】

【表9】

【0370】

【表10】

【0371】

ｂ．ＩＶＴ−ＲＮＡ合成
抗ＣＬＤＮ６特異的ｂｉ−ｓｃＦｖのＩＶＴテンプレートを作製するために、プラスミドを、クラスＩＩｓのエンドヌクレアーゼを使用してポリ（Ａ）テールの下流側で線状化した。線状化されたテンプレートＤＮＡを、どこか他のところで記載されるようにフェノール／クロロホルム抽出および酢酸ナトリウム沈澱によって精製した（Ｈｏｌｔｋａｍｐ，Ｓ．他（２００６）、Ｂｌｏｏｄ、１０８（１３）、４００９頁〜４０１７頁）。
線状化されたＤＮＡテンプレートを、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｋｉｔｓ（Ａｍｂｉｏｎ ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を製造者の指針に従って使用するインビトロ転写に供した：ｐＳＴ１テンプレートを、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｋｉｔを用いて転写し、ｐＳＦＶテンプレートをＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ ＳＰ６ Ｋｉｔを用いて転写した。キャップアナロガとの反応のために、ＧＴＰ濃度を１．５ｍＭに下げ、６ｍＭのＡＲＣＡ、ｂｅｔａ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）またはｂｅｔａ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）（これらは、どこか他のところで記載されるように合成された）（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，Ｅ．他（２００４）、ＲＮＡ、１０（９）、１４７９頁〜１４８７頁；Ｋｏｗａｌｓｋａ，Ｊ．他（２００８）、ＲＮＡ、１４（６）、１１１９頁〜１１３１頁；Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，Ｊ．他（２００１）、ＲＮＡ、７（１０）、１４８６頁〜１４９５頁）を反応液に加えた。ＩＶＴ−ＲＮＡの精製を、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を用いてマニュアルに従って行った。ＩＶＴ−ＲＮＡの濃度および品質を、分光光度法、および、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、米国）での分析によって評価した。

【0372】

実施例２７：ＣＬＤＮ６特異的ｂｉ−ｓｃＦｖの１ＢｉＭＡＢを分泌する標的細胞に標的変更させられるＴ細胞の顕微鏡法分析
アッセイ設定は原理的には、実施例２．ａで記載される通りに行った。
標的細胞株として、高レベルのヒトＣＬＤＮ６を内因的に発現する卵巣奇形ガン細胞株ＰＡ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７２）のサブクローン物を使用した。ヒト細胞傷害性Ｔ細胞を、新たに単離されたＰＢＭＣから、Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（ヒト）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｔｅｔｅｒｏｗ、ドイツ）により製造者の指針に従ってＭＡＣＳによって単離した。
ＰＡ−１標的細胞（これは、どのアッセイの前においてもＦＡＣＳ分析によってＴＡＡ発現について日常的に試験される）を、氷冷されたＸ−Ｖｉｖｏ１５培地（ＬＯＮＺＡ、Ｂａｓｅｌ、スイス）により２回洗浄し、２×１０７細胞／ｍｌの密度に再懸濁した。２５０μｌの細胞懸濁物を、事前に冷却された０．４ｃｍのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ／ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、ドイツ）に移し、２０μｇ／ｍｌのＩＶＴ−ｍＲＮＡを加えた。ＢＴＸ ＥＣＭ ８３０エレクトロポレーター（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ、米国）を使用する条件は、２００Ｖ、１２ｍｓのパルス長さ、２回のパルス、４００ｍｓの間隔長さであった。使用されるＩＶＴ−ｍＲＮＡは、６ＲＨＵ５、６ＲＨＵ３、ｎｏ．２５であった（詳細については表９および表１０を参照のこと）。トランスフェクションされた標的細胞を計数し、１×１０^５細胞／ｍｌに調節した。１×１０^５個の標的細胞を６ウエルプレートのウエルあたり播種し、ヒト細胞傷害性Ｔ細胞を５：１のＥ：Ｔ比に従って加えた。ウエルたりの最終体積が２ｍｌであった。コントロールサンプルは、単独でのトランスフェクション後の標的細胞を、エレクトロポレーション後の健常性を証明するために含み、また、コントロールｂｉ−ｓｃＦｖによりトランスフェクションされた標的細胞を、エフェクター細胞を伴って含んだ。陽性コントロールとして、対応するＣＬＤＮ６特異的ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の６ＰＨＵ５および６ＰＨＵ３を５０μｇ／ｍｌの濃度で実行した。したがって、ヒトＴ細胞を伴う処理されていないＰＡ−１細胞が使用された。組織培養プレートを続いて、３７℃、５％ＣＯ_２においてインキュベーションした。６ＲＨＵ５または６ＲＨＵ３によりトランスフェクションされた標的細胞を含有するサンプルにおける標的細胞上でのＴ細胞クラスター化、免疫学的シナプスの形成および標的細胞の殺傷に関しての著しい影響が２４時間後に認められ、これらの影響を、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＳ１００倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、日本）を用いて記録した。図３２に示されるように、Ｔ細胞クラスター化または標的細胞溶解が、ｎｏ．２５によりトランスフェクションされた標的細胞を有するコントロールサンプルでは何ら認められず、このことは、Ｔ細胞の活性化を誘導するためのＴＡＡ発現に対する厳密な依存性を暗示していた。ｂｉ−ｓｃＦｖを伴わない模擬コントロールも同様に、Ｔ細胞のクラスター化を何ら示していない。代わりに、タンパク質コントロールでは、強いＴ細胞クラスター化および標的細胞溶解がもたらされた。

【0373】

実施例２８：ＣＬＤＮ６を標的化するｂｉ−ｓｃＦｖ候補物の６ＲＨＵ５および６ＲＨＵ３によって誘導されるＴ細胞活性化
Ｔ細胞活性化を検出するために、また、これら２つのＣＬＤＮ６特異的ｂｉ−ｓｃＦｖ変化体の効率における違いを明確にするために、ＦＡＣＳに基づくＴ細胞活性化アッセイを行った。初期活性化マーカーＣＤ６９および後期活性化マーカーＣＤ２５を蛍光コンジュゲート化抗体による染色のために選択した。標的細胞およびＴ細胞の混合物におけるヒトＴ細胞の検出のために、すべてのＴ細胞によって発現されるＣＤ３を染色した。
標的細胞およびエフェクター細胞を上記（実施例２７）で記載されるように調製した。簡単に記載すると、ＣＬＤＮ６を内因的に発現するＰＡ−１標的細胞を、２０μｇ／ｍｌの下記のＩＶＴ−ｍＲＮＡを用いたエレクトロポレーションによってトランスフェクションした：６ＲＨＵ５、６ＲＨＵ３およびｎｏ．２５。ｎｏ．２５（これは、発現されないＴＡＡを標的化する）が特異性コントロールとして役立ち、処理されていない標的細胞が模擬コントロールとして役立った。陽性コントロールとして、５０ｎｇ／ｍｌの６ＰＨＵ５タンパク質を使用した。さらに、Ｔ細胞を、標的細胞を伴うことなく、６ＰＨＵ５タンパク質を伴って、または、バックグラウンドの活性化の参照として、６ＰＨＵ５タンパク質を伴うことなく播種した。それぞれのサンプルを６ウエルプレートに二連で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２においてインキュベーションした。２４時間後および４８時間後、Ｔ細胞をかき取りによって集め、５ｍｌの丸底チューブ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）に移した。細胞を遠心分離し、ＤＰＢＳにより洗浄した。細胞染色のために、マウス抗ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣ、マウス抗ヒトＣＤ６９−ＡＰＣおよびマウス抗ヒトＣＤ２５−ＰＥ（すべての抗体が、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を使用した。細胞ペレットを、蛍光コンジュゲート化抗体を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（５％のＦＢＳが補充されるＤＰＢＳ）および２μｌの７−ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）において再懸濁した。インキュベーションを暗所において４℃で２０分間行った後、サンプルを４ｍｌのＤＰＢＳにより洗浄し、細胞ペレットを２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。サンプルを、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ともに、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を用いた測定の期間中を通して氷上および暗所において保った。分析をＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ、米国）によって評価した。
図３３Ａおよび図３３Ｂに示されるように、両方の変化体がＴ細胞活性化をもたらし、これに対して、陰性コントロールはどれもが、Ｔ細胞活性化マーカーのＣＤ６９またはＣＤ２５の著しい発現を示さなかった。
６ＲＨＵ３に対する応答における総Ｔ細胞活性化が、６ＲＨＵ５に対する応答の場合よりも、２４時間後（Ａ）では１．５３倍大きく、４８時間後（Ｂ）では１．３５倍大きかった。これらの発見に基づいて、すべてのさらなる研究を、変化体６ＲＨＵ３のみを用いて行った。

【0374】

実施例２９：６ＲＨＵ３によりトランスフェクションされた標的細胞との共インキュベーションによる濃度依存的なＴ細胞活性化
標的依存的なＴ細胞活性化を誘導するために必要である最小の６ＲＨＵ３ ＩＶＴ−ｍＲＮＡ濃度を求めるために、０．２μｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌまでのＩＶＴ−ｍＲＮＡの希釈範囲をＰＡ−１標的細胞にトランスフェクションした。すべてのサンプルをＲＮＡエレクトロポレーションによる同じストレスレベルにさらすために、２０μｇ／ｍｌのＩＶＴ−ｍＲＮＡの総濃度をトランスフェクションした。ｎｏ．２５（これは、発現されないＴＡＡを標的化する）をフィルアップ用のＩＶＴ−ｍＲＮＡとして使用した。したがって、０μｇ／ｍｌの６ＲＨＵ３は２０μｇ／ｍｌのｎｏ．２５に対応する。エレクトロポレーションを実施例２７で記載されるように行った。ヒトＴ細胞をエフェクター細胞として使用した。ＰＢＭＣからの単離を製造者のマニュアルに従って行った（Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｔｅｔｅｒｏｗ、ドイツ）。エフェクター細胞および標的細胞を５：１の比率で混合した。Ｔ細胞を伴う非処理の標的細胞が模擬コントロールとして役立った。さらに、Ｔ細胞を、標的細胞を伴うことなく、６ＰＨＵ５タンパク質を伴って、または、バックグラウンドの活性化の参照として、６ＰＨＵ５タンパク質を伴うことなく播種した。陽性コントロールとして、処理されていない標的細胞をＴ細胞および５０ｎｇ／ｍｌの６ＰＨＵ５タンパク質と混合した。すべてのサンプルを６ウエルプレートにおいて二連で調製した。
標的細胞およびエフェクター細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２において４８時間にわたって共インキュベーションした。サンプルを、実施例２８で記載されるようにフローサイトメトリー分析のために調製した。
図３４において、活性化マーカーを発現するＣＤ３陽性Ｔ細胞の割合がプロットされる。Ｔ細胞活性化がコントロールでは何ら認められなかった。著しいＴ細胞活性化の検出が、０．７μｇ／ｍｌの６ＲＨＵ３ ＩＶＴ−ｍＲＮＡの濃度で始まった。２．０μｇ／ｍｌの６ＲＨＵ３ ＩＶＴ−ｍＲＮＡに対する応答における影響が、５０ｎｇ／ｍｌの６ＰＨＵ５タンパク質コントロールによって媒介される影響と同程度であった。したがって、トランスフェクションされたＩＶＴ−ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳および分泌は効率的なプロセスであるようである。

【0375】

実施例３０：６ＲＨＵ３についてのＥＣ_５０の決定
ｂｉ−ｓｃＦｖをコードするＩＶＴ−ｍＲＮＡ ６ＲＨＵ３の５０％最大有効用量を求めるために、６ＲＨＵ３の力価測定列をインビトロルシフェラーゼ細胞傷害性アッセイで試験した。安定的にルシフェラーゼを発現するＰＡ−１細胞を、実施例２７で記載されるようにエレクトロポレーションによって一過性にトランスフェクションした。使用された６ＲＨＵ３ ＩＶＴ−ｍＲＮＡ濃度が、６つの希釈段階で０．００４μｇ／ｍｌから１３．３μｇ／ｍｌにまで及んだ。総ＩＶＴ−ｍＲＮＡ濃度は常に１３．３μｇ／ｍｌに設定し、ｎｏ．２５をフィルアップ用ＩＶＴ−ｍＲＮＡとして使用した。最小溶解コントロール（Ｌ_ｍｉｎ）として、すべてのトランスフェクションされた標的細胞サンプルを、エフェクター細胞を伴うことなく播種した。この手順によって、それぞれの個々のエレクトロポレーションサンプルのバックグラウンドでの死細胞が差し引かれ、Ｔ細胞媒介の溶解影響のみが得られることになる。
トランスフェクションされた標的細胞を、９６ウエル形式において三連で、５：１のエフェクター対標的比でのヒトＴ細胞とともに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２においてインキュベーションした。自然発光カウント数に対して正規化するための最大溶解（Ｌ_ｍａｘ）を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をルシフェリン添加の直前に、エフェクター細胞および処理されていない標的細胞を含有するコントロールウエルに加えることによって達成した。ルシフェリン溶液（ウエルあたり、１ｍｇ／ｍｌのルシフェリン（ＢＤ Ｍｏｎｏｌｉｇｈｔ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）および５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する水溶液の５０μｌ）を加えた後、発光を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダーを用いて２４時間後および４８時間後に測定した。特異的な標的細胞溶解を下記の式によって計算した：％特異的溶解＝［１−（発光試験サンプル−Ｌ_ｍａｘ）／（Ｌ_ｍｉｎ＿試験サンプル−Ｌ_ｍａｘ）］×１００。
図３５は、６ＲＨＵ３に対する応答における特異的な標的細胞溶解についての濃度依存的な曲線を示す。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍの式"ｌｏｇ（ａｇｏｎｉｓｔ） ｖｓ．ｒｅｓｐｏｎｓｅ−Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ"をＥＣ_５０値の計算にために使用することにより、ＥＣ_５０（２４ｈ）＝５４８．０ｎｇ／ｍｌ、および、ＥＣ_５０（４８ｈ）＝１９４．５ｎｇ／ｍｌが明らかにされた。このアッセイの結果は、他者によってもまた報告されるように（例えば、Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ，Ｒ他（２０１０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０７（２８）、１２６０５頁〜１２６１０頁を参照のこと）、ドナーの免疫状態に従って変化するヒトＴ細胞の効力に強く依存する。したがって、結果がそれぞれのドナーにより異なる可能性がある。

【0376】

実施例３１：６ＲＨＵ３ ＩＶＴ−ｍＲＮＡトランスフェクションに対する応答におけるＴ細胞増殖
Ｔ細胞増殖はＴ細胞活性化の指標である。 ｂｉ−ｓｃＦｖをコードするＩＶＴ−ｍＲＮＡ １ＢｉＭＡＢに対する応答における特異的なＴ細胞増殖をＣＬＤＮ６陽性標的細胞の存在下で示すために、フローサイトメトリー分析を使用した。簡単に記載すると、実施例１６で記載されるように単離された１×１０^７個のヒトＴ細胞を、ＤＰＢＳに溶解される１μＭのカルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、ドイツ）により暗所においてＲＴで５分間染色した。細胞をＤＰＢＳ／５％ＦＣＳにより２回洗浄し、２×１０６細胞／ｍｌにアッセイ培地において再懸濁した。標的細胞として、ＣＬＤＮ６を内因的に発現するＰＡ−１、および、特異的試験のためにはＣＬＤＮ６陰性乳ガン細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を選んだ。２０μｇ／ｍｌのＩＶＴ−ｍＲＮＡ ６ＲＨＵ３または非標的化コントロールをエレクトロポレーションのために使用した。ＰＡ−１のエレクトロポレーションを実施例２７で記載されるように行った。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のエレクトロポレーションを、下記の条件を使用して行った：４００Ｖ、３ｍｓのパルス長さ、１回のパルス、４００ｍｓの間隔長さ、０．４ｃｍのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ／ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、ドイツ）において。実施例２７で記載されるような細胞傷害性アッセイを、トランスフェクションされた標的細胞と、エフェクター細胞としてのＣＦＳＥ標識されたヒトＴ細胞とを用いて設定した。単独でのＴ細胞、および、トランスフェクションされていない標的細胞またはコントロールトランスフェクションされた標的細胞＋Ｔ細胞を陰性コントロールとして使用した。５μｇ／ｍｌのＯＫＴ３（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ、Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ、米国）および２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｆｅｌｌ、ドイツ）により刺激される単独でのＴ細胞が陽性コントロールとして役立った。５ｎｇ／ｍｌの濃度での６ＰＨＵ３タンパク質を、アッセイの妥当性を確認するために、トランスフェクションされていない標的細胞＋Ｔ細胞に適用した。非標的化ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質１ＢｉＭＡＢと一緒にされるサンプルを特異性コントロールとして含めた。すべてのサンプルを９６ウエルにおける０．２ｍｌのアッセイ培地の総体積において三連で設定した。７２時間の共インキュベーションの後、Ｔ細胞を集め、５ｍｌの丸底チューブに採取し、洗浄し、ヒトＴ細胞を腫瘍細胞から区別するために２μｌの抗ＣＤ４５−ＡＰＣにより、また、２００μｌのＤＰＢＳにおいて死細胞を対比染色するために０．２５μｌのｅＦｌｕｏｒ５０６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）により４℃で３０分間染色した。ＤＰＢＳによる洗浄の後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を用いて分析した。
Ｔ細胞の増殖が、ＣＬＤＮ６陽性標的細胞および抗ＣＬＤＮ６特異的ｂｉ−ｓｃＦｖの存在下のみにおける低下するＣＦＳＥシグナルによって検出された（図３６もまた参照のこと）。陽性コントロールのほかに、４９％〜６１％のＴ細胞増殖を、６ＰＨＵ３タンパク質との組合せでＣＤＬＮ６陽性標的細胞の存在下で認めることができた。６ＲＨＵ３のＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされた標的陽性細胞は、６２％＋／−２％をもたらした。ＣＬＤＮ６陰性標的細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とインキュベーションされるＴ細胞は、どのような型においてであれ、同様にまた、陽性コントロールを除いて、標的細胞を伴わないＴ細胞において著しい増殖を示していない。

【0377】

実施例３２：６ＲＨＵ３のＩＶＴ−ＲＮＡによる哺乳動物細胞のトランスフェクションの後におけるタンパク質産生の定性的分析
タンパク質へのＲＮＡ翻訳を哺乳動物細胞において詳しく調べるために、細胞株ＢＨＫ２１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１３００１）を発現系として選んだ。２×１０^７個／ｍｌのＢＨＫ２１細胞を、すべての工程がＲＴで行われたという違いを伴って実施例１６で記載されるようにエレクトロポレーションによってトランスフェクションした。２５０μｌの細胞懸濁物を０．４ｃｍのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ／ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、ドイツ）に移し、４０μｇ／ｍｌのｎｏ．２５ ＩＶＴ−ｍＲＮＡ、６ＲＨＵ３ ＩＶＴ−ｍＲＮＡまたは６ＲＨＵ３ ＩＶＴ−レプリコンＲＮＡを加えた。エレクトロポレーション条件は下記の通りであった：３００Ｖ、１６ｍｓのパルス長さ、１回のパルス、４００ｍｓの間隔長さ。
エレクトロポレーションされた細胞をＲＴでの培養培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＣＳ）に再懸濁し、１５ｃｍの培養ディッシュに移した。播種後５時間で、ＦＣＳを含有する培地をＦＣＳ非含有培地によって取り換えた。実施例３２ａおよび実施例３２ｂの場合には、エレクトロポレーション後１８時間で、細胞培養上清および細胞を別々に集めた。細胞ペレットを１×ＬＤＳサンプル緩衝液（カタログ番号ＮＰ０００８；Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）において溶解し、７２℃で１５分間加熱した。ＥＬＩＳＡ分析のために、濃縮されていない上清およびおよそ５０倍濃縮された上清を使用した。濃縮を、Ａｍｉｃｏｎ ウルトラ−１５遠心ろ過ユニット（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、米国）を用いて製造者のプロトコルに従って行った。実施例３２ｃ（ＩＶＴ−ｍＲＮＡのみ）の場合には、上清をトランスフェクション後４８時間で集め、上記で記載されるように４０倍濃縮に供した。

【0378】

ａ．上清を使用するＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ分析のために、ニッケル被覆プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｎｎ、ドイツ）を、分析物をそのＨｉｓタグにより捕捉するために使用した。最初に、プレートをウエルあたり２００μｌの洗浄緩衝液（１×ＰＢＳにおける０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０）により３回洗浄した。標準物として、精製された６ＰＨＵ３タンパク質を１×ＰＢＳにおける１．７５％のＮａカゼイン（＝希釈液）に希釈した。希釈列は２倍ずつで２．３４ｎｇ／ｍｌから１５０ｎｇ／ｍｌにまで及んだ。標準希釈物あたり１００μｌをそれぞれの濃度の三連でウエルに移した。したがって、１００μｌのサンプルが三連で移された。プレートを接着性フィルムにより密封し、３７℃で３０分間インキュベーションした。その後、プレートをウエルあたり２００μｌの洗浄緩衝液により３回洗浄した。６ＰＨＵ３／６ＲＨＵ３の検出のために、ｍＣＬＤＮ６ａｂのＶＨ−ＶＬに特異的に結合し、したがって、６ＰＨＵ３／６ＲＨＵ３にまた特異的に結合する抗イディオタイプのモノクローナルＩｇＧ ４Ｆ９を使用した。４Ｆ９を２．５μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈液に混合した。１００μｌの抗イディオタイプ抗体溶液をそれぞれのウエルに移し、その後には、３７℃での３０分のインキュベーション時間が続いた。続いて、プレートをウエルあたり２００μｌの洗浄緩衝液により３回洗浄し、希釈液で１：５００希釈されるＡＰコンジュゲート化抗マウス検出抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、米国）の１００μｌをそれぞれのウエルに加え、その後、３７℃で３０分のインキュベーションを行った。最後の洗浄工程（２００μｌの洗浄緩衝液、３回）の後、適切な基質緩衝液（１Ｍのジエタノールアミン、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０１％のアジ化Ｎａ、ｐＨ９．８）における１．５ｍｇ／ｍｌの基質ｐＮＰＰをそれぞれのウエルに加え、その後、インキュベーションを暗所においてＲＴで３０分間行った。１００μｌの３Ｍ ＫＯＨをそれぞれのウエルのために使用して、酵素反応を停止させた。吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００、Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、スイス）を用いて測定した。二重波長分析のために、４０５ｎｍを測定波長として選び、４９２ｎｍを参照波長として選んだ。吸光度値を、参照波長を測定波長から引くことによって計算した。
図３７Ａにおいて、標準偏差を含む平均吸光度値がプロットされる。６ＲＨＵ３ ＩＶＴ−ｍＲＮＡおよびＩＶＴ−レプリコンによりトランスフェクションされた細胞から得られる濃縮された上清は、ｂｉ−ｓｃＦｖをコードするＩＶＴ−ＲＮＡの翻訳を証明する著しいシグナルをもたらした。模擬トランスフェクション細胞およびｎｏ．２５コントロール（−ｃｔｒｌ）トランスフェクション細胞から得られる濃縮された上清は、予想されるように、シグナルを何ら生じさせなかった。実際のタンパク質濃度は、ＩＶＴ−ｍＲＮＡ構築物およびＩＶＴ−レプリコン構築物の異なる毒性ならびにわずかに異なるｘ倍濃縮物のために提案することができない。濃縮されていない上清における近似的タンパク質濃度の推定は、ＩＶＴ−レプリコンについては１．４ｎｇ／ｍｌの範囲であり、ＩＶＴ−ｍＲＮＡサンプルについては５．９ｎｇ／ｍｌの範囲であった。

【0379】

ｂ．上清および細胞溶解物（ＩＶＴ−ｍＲＮＡサンプルおよびＩＶＴ−レプリコンサンプル）のウエスタンブロット分析
ウエスタンブロットによる分析のために、濃縮上清および細胞溶解物を、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）で分離した。６ＲＨＵ３のＩＶＴ−ｍＲＮＡ、ＩＶＴ−レプリコンＲＮＡ、ｎｏ．２５のＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされたＢＨＫ２１細胞または非処理細胞の上清および細胞溶解物、ならびに、陽性コントロール（０．１μｇの精製された６ＰＨＵ３タンパク質）を負荷した。ウエスタンブロット分析を標準的な手順（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２）によって行った。簡単に記載すると、タンパク質をＰＶＤＦメンブランにブロットし、ブロッキング処理をＰＢＳＴ／３％粉乳により行った後、メンブランを、ブロッキング緩衝液において１：５００で希釈される一次抗体Ａｎｔｉ−ＨＩＳ Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｔａｇ（Ｄｉａｎｏｖａ ＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）と４℃で１時間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液による繰り返された洗浄の後、メンブランを、ブロッキング緩衝液において１：１００００で希釈されるＦｃ特異的な二次のペルオキシダーゼコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）と４℃で１時間インキュベーションした。再度、ブロッキング緩衝液による繰り返された洗浄の後、シグナルを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国）によって可視化し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００ Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）によって記録した。６ＰＨＵ３のシグナルが、内部分子量標準と比較した場合、５０ｋＤと６０ｋＤとの間に検出された。
図３７Ｂに示されるように、シグナルが、ｎｏ．２５のＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされた細胞（レーン１）、６ＲＨＵ３のＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされた細胞（レーン４）、および、６ＲＨＵ３のＩＶＴ−レプリコンＲＮＡによりトランスフェクションされた細胞（レーン５）において検出されたが、これに対して、上清が非処理細胞に由来するレーン６はシグナルを伴っていない。強いシグナルを、６ＲＨＵ３のＩＶＴ−ｍＲＮＡによりトランスフェクションされた細胞（レーン８）、および、６ＲＨＵ３のＩＶＴ−レプリコンＲＮＡによりトランスフェクションされた細胞（レーン９）の細胞溶解物により生じさせることができた。ｎｏ．２５によりトランスフェクションされた細胞に由来する細胞溶解物は非常に弱いシグナルをもたらし（レーン２）、非処理細胞（レーン１０）はシグナルを全く示さなかった。精製された６ＰＨＵ３タンパク質コントロール（レーン１１）を検出することができた。上清における比較的弱いシグナル、および、それとともに、弱い６ＲＨＵ３分泌はおそらくは、トランスフェクション後のインキュベーション時間が比較的短いためである。レプリコンＲＮＡの毒性影響のために、より長いインキュベーション時間は調べることができなかった。
両方の分析（ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）は定性的であり、タンパク質濃度の決定として役立たない。

【0380】

ｃ．上清（ＩＶＴ−ｍＲＮＡサンプル）のウエスタンブロット分析
トランスフェクション後４８時間で採取された上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、その後、ウエスタンブロット分析を実施例３２ｂで記載されるように行った。図３７Ｃに示されるように、ＩＶＴ−ｍＲＮＡから翻訳され、上清に分泌されたｎｏ．２５および６ＲＨＵ３がそれらのＨｉｓタグにより検出された。それに加えて、６ＲＨＵ３の産生および分泌、同様にまた、ｂｉ−ｓｃＦｖ特異性コントロールとして使用されているｎｏ．２５の産生および分泌を証明することができた。

【0381】

実施例３３：筋肉内ＲＮＡ注入の後におけるインビボ翻訳された機能的なＣＬＤＮ６特異的ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の検出
８週齢〜１６週齢でのメスおよびオスのＮＳＧマウスを選択し、５匹のマウスからなる４つの群に分けた。４０μｌのＲＮＡ溶液をマウスおよび大腿筋につき注入した。４０μｌのＲＮＡ溶液は、１×ＰＢＳ、５μｇのＤ２キャップ化６ＲＨＵ３ ＩＶＴ−ｍＲＮＡまたはＩＶＴ−レプリコン、２μｇのＤ１キャップ化ルシフェラーゼＩＶＴ−ｍＲＮＡ、および、０μｇまたは１５μｇのＤ１キャップ化ＥＢＫ ＩＶＴ−ｍＲＮＡからなった。ワクシニアウイルスタンパク質（Ｅ３Ｌ、Ｂ１８ＲおよびＫ３Ｌ）（ＥＢＫ）をコードするＥＢＫ ＩＶＴ−ｍＲＮＡを共注入して、ＩＦＮ応答を阻害し、かつ、ＰＫＲ活性化をＲＮＡ翻訳増強のために打ち消した（特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０４６７３）。ルシフェラーゼシグナルを、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ ２０００を用いて注入後２４時間でモニターして、シグナルを有しないマウスをサンプル集団から除いた。
血液を注入の７日後に採取した。血清を集め、続いて−８０℃で凍結した。

【0382】

細胞傷害性アッセイ
ＮＳＧマウスの血清をインビトロ細胞傷害性アッセイで分析した。ホタルルシフェラーゼが安定的に形質導入され、かつ、ＣＬＤＮ６を内因的に発現するＰＡ−１標的細胞を、最大感受性のための３０対１のＥ：Ｔ比でのヒトＴ細胞（実施例１６で記載されるように単離されたもの）とともに播種した。アッセイ培地は、１０％の熱不活化ＦＣＳ、０．５％のペニシリン−ストレプトマイシン、１×ＮＥＡＡおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムが補充されるＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）からなった。２０μｌの解凍された試験血清を試験サンプルウエルあたり加えた。６ＰＨＵ３タンパク質の標準物コントロールウエル、Ｌ_ｍｉｎウエルおよびＬ_ｍａｘウエルを、処置されていないＮＳＧマウスの２０μｌの血清により完成させた。ウエルたりの最終体積が１００μｌであった。Ｌ_ｍｉｎを二連で播種し、Ｌ_ｍａｘを六連で播種し、試験サンプルを三連で播種した。３７℃、５％ＣＯ_２における４８時間のインキュベーションの後、Ｌ_ｍａｘウエルを１０μｌの２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液と混合し、１０分間インキュベーションした。すべての他のウエルには１０μｌのアッセイ培地を加えた。５０μｌのルシフェリン溶液（実施例２３を参照のこと）を加え、プレートを、暗所における３７℃での３０分のインキュベーション工程の後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、スイス）で測定した。特異的な標的細胞溶解の計算を実施例２３で記載されるように行った。
図３８において、特異的溶解の割合がプロットされる。著しい細胞傷害性影響がそれぞれの群において検出された。ＣＬＤＮ６特異的ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の濃度が、６ＲＨＵ３ ＩＶＴ−ｍＲＮＡの場合にはＥＢＫ共注入によって著しく増大した。
これらのデータにより、筋肉内注入の後におけるＩＶＴ−ｍＲＮＡまたはＩＶＴ−レプリコンからの６ＲＨＵ３のインビボ翻訳ならびに血流内への分泌が立証される。

【0383】

実施例３４：ＣＬＤＮ１８．２またはＣＬＤＮ６およびＣＤ３を標的化する二重特異性結合剤の作製および試験
抗ＣＬＤＮ１８．２特異的および抗ＣＬＤＮ６特異的なｂｉ−ｓｃＦｖ抗体フラグメントのさらなる開発のために、元のタンパク質を最適化するための種々の局面を検討した。これらの局面は主として、組換えタンパク質産生のときに形成するかもしれない種々の折り畳み種、ジスルフィド異性体およびオリゴマーに関してのより大きい均質性を有する調製物を得ることに関連した。これらの改変は、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の機能的活性に対して不利であってはならない。

【0384】

ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の抗ＣＤ３結合ドメインにおける余分な（対形成していない）システイン残基の置換
Ｉｇドメインの一次配列の中に存在する対形成していないシステイン残基が、生じた抗体フラグメントの適正な折り畳みおよび安定性のために必須である鎖内および／または鎖間のジスルフィド結合の正しい形成を妨害することがあるか否かを詳しく調べるために、いくつかの合成構築物を作製した。そのような対形成していないシステインは、最終的なタンパク質産物の効力、均質性、生産性および安定性を損なう場合があるかもしれず、したがって、避けなければならない。ジスルフィド対形成に関与する"標準的な"一組のシステインに加えて、フリーのシステイン残基が可変ドメインに存在する可能性がある。
例えば、ＯＫＴ３抗体に由来するＶＨドメインにおいて、ＣＤＲ−Ｈ３が始まる３残基前には、Ｈ９２位における保存されたシステインが存在しており、Ｈ２２位との構造的なジスルフィド結合を形成する。しかし、この分子では、Ｈ１００Ａ位（ＣＤＲ−Ｈ３）において、別のシステイン（Ｃｙｓ）が、Ｈ１００ＡがＨ９２に代わってＨ２２とのジスルフィド結合を形成することに関与し、それにより、誤って折り畳まれた不溶性の非機能的な生成物を生じさせる誤った折り畳みを可能にし得るかもしれない。これらのシステイン残基のこの起こり得る誤った対形成を克服するために、フリーのシステインの部位特異的置換を行った（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０：４４５〜４５３、１９９７）。この単一置換によって、ＯＫＴ３に由来するｓｃＦｖの生産性および安定性の著しい増大が、全体的な結合活性を維持して達成された。
本研究で使用される抗ＣＤ３抗体ＴＲ６６のＶＨドメイン（配列番号３６）は、そのようなフリーのシステインを、配列番号３６に示されるような一次配列のＨ１０３位において含有する。抗ＣＤ３抗体ＴＲ６６のＶＨドメイン（配列番号３６）と抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＶＨドメインとの配列比較では、９６．６％の配列相同性が示される。
これらの結果に従って、このフリーのシステインを抗ＣＤ３抗体ＴＲ６６のＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ３の中においてセリン残基によって置換することを、ＣＤ３（配列番号９４）を標的化するｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質のために、かつ、ＣＬＤＮ１８．２またはＣＬＤＮ６のどちらかのために行った。そのような置換の導入により、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の１−ＢｉＭＡＢ−Ｓ（配列番号１０３）および６−ＰＨＵ３−Ｓ（配列番号１０１）の設計がもたらされる（表１１および表１２をそれぞれ参照のこと）。

【0385】

抗ＣＬＤＮ６ ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の余分な（対形成していない）システイン残基の置換
元の抗ＣＬＤＮ６抗体ｍＣＬＤＮ６ａｂ（その可変ドメインが、対応するｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の６ＰＨＵ３（配列番号４５）および６ＰＨＵ５（配列番号４３）の組立てのために使用された）は、対形成していないシステイン残基を、対応する一次配列の４６位においてＶＬドメインのＣＤＲ−Ｌ２の隣接領域の中に含有する。これは、ＶＬの最初のアミノ酸が除かれている配列番号２３の中の４５位に対応する。種々の置換を、このフリーのシステインを下記の残基によって置換するために行った：
・セリン残基、この場合は、抗ＣＤ３抗体ＴＲ６６のＶＨドメインにおける置換と同様である置換である（配列番号１００）。
・ロイシン残基、この場合は、他の抗ＣＬＤＮ６抗体のアミノ酸配列との比較による置換である（配列番号９７および配列番号９８）。
・トリプトファン残基、この場合は、生殖系列データベースとのアミノ酸配列比較による置換である（配列番号９９）。

【0386】

抗ＣＬＤＮ１８．２ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質におけるリンカー長さ、Ｖドメインの順序および人為的な相互接続ジスルフィド結合の評価
別の一例として、Ａｒｎｄｔ他（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３７：１２９１８〜１２９２６、１９９８）は、ｓｃＦｖフラグメントの非共有結合により連結されたオリゴマーの出現についての可能な説明として、いわゆるドメイン交換（ｄｏｍａｉｎ ｓｗａｐｐｉｎｇ）を記載する。このモデルのもとでは、タンパク質状態は、ＶＬ／ＶＨ相互接続接点の常に生じる分子内交換および分子間交換のために、モノマー形態とダイマー／オリゴマー形態との間における可能な熱力学的平衡に供される。これらのオリゴマーは、既に細胞培養上清に存在している可能性があるかもしれず、精製プロセスの期間中に除かれなければならない。しかしながら、これらの分子種はまた、精製されたモノマー種の貯蔵の期間中に形成される可能性があるかもしれない。
タンパク質の好ましいエネルギー状態は、その全体的な設計（一次配列、リンカー長さ、ＶＬ／ＶＨ配向など）によって強く影響される。
ＷｏｒｎおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（ＪＭＢ、３０５：９８９〜１０１０、１９９９）は、より大きい含有量のモノマー種を有する形態を、２０残基以上のリンカーを使用することによって得ることができたと述べた。Ｄｅｓｐｌａｎｃｑ他（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、７：１０２７〜１０３３、１９９４）は、可変ドメインの配向もまた、ダイマーおよび高分子形態の形成に対する影響を有する可能性があるかもしれないことを示した。同じ刊行物において、Ｄｅｓｐｌａｎｃｑは、２５個または３０個のアミノ酸（ａａ）のリンカーがそれらの特定の抗体についてモノマー／ダイマーの最良の比率を与えることを示した。ＶＬのＣ末端とＶＨのＮ末端との距離がおよそ３９Å〜４３Åであり、ＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端との距離が３２Å〜３４Åである（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ他、Ｆｒｏｍ ＰＣＲ ｔｏ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ（Ｊ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ、Ｈ．Ｒ．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ＆Ｄ．Ｊ．Ｃｈｒｉｓｗｅｌｌ編）、書名： （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、２０３頁〜２５２頁、１９９６））。類似する分子特性を得るために、ＶＬ−ＶＨを配向させるためのリンカーはＶＨ−ＶＬリンカーよりも長くなければならない。Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ他（Ｆｒｏｍ ＰＣＲ ｔｏ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ（Ｊ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ、Ｈ．Ｒ．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ＆Ｄ．Ｊ．Ｃｈｒｉｓｗｅｌｌ編）、書名： （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、２０３頁〜２５２頁、１９９６））は、ＶＨ／ＶＬの配向においては１５アミノ酸または２０アミノ酸の長さを有するリンカーを使用し、ＶＬ／ＶＨの配向においては２０アミノ酸または２５アミノ酸の長さを有するリンカーを使用することを推奨した。
モノマーの形成を強制させ、かつ、ＶＨ／ＶＬドメイン相互作用を安定化させるための別の可能性が、相互接続ジスルフィド結合をこれら２つのドメインの間の接触面の中に操作することである。ジスルフィド架橋をＨ４４−Ｌ１００の位置（Ｋａｂａｔ番号表記）において導入することが、ｓｃＦｖにおいては最も頻繁に使用されており、満足すべき結果が得られている（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ他、ＰＮＡＳ、９０：７５３８〜７５４２、１９９３；ＷｏｒｎおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８：８７３９〜８７５０、１９９９；Ｗｅａｔｈｅｒｉｌｌ他、ＰＥＤＳ、２５：３２１〜３２９、２０１２）。この戦略が、全長のＩｇＧに融合されるｓｃＦｖを組み合わせるＩｇＧ様二重特異性抗体を安定化させるために首尾良く使用されている（Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ他、ｍＡｂｓ、１：１２８〜１４１、２００９；Ｓｃｈａｎｚｅｒ他、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５５：２３６９〜２３７８、２０１１）。
Ｗｅａｔｈｅｒｉｌｌ他（ＰＥＤＳ、２５：３２１〜２３９、２０１２）は、ヒトｓｃＦｖの（ＶＨ−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＬおよびＶＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＨ）をＶＨ４４位とＶＬ−１００位との間のジスルフィド結合により安定化させた。そのうえ、この刊行物は、相互接続ジスルフィド結合を全く含有しないｓｃＦｖとの可能なドメイン交換の問題に、異なる負荷体積および濃度での異なるＳＥ−ＨＰＬＣ実験を行うことによって対処している。これらのアッセイは、安定化されていないｓｃＦｖのためのサンプル負荷条件に依存して、異なる結果を与え、しかし、使用された条件に関係なく、ジスルフィドにより安定化された分子はモノマーのように溶出した。Ｚｈａｏ他（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．、１２：１〜１１、２０１１）は、同じ変異をｓｃＦｖにおいて導入し、安定化された分子のより大きい安定性を３７℃での２０時間にわたる貯蔵の後で認めた。
全長ＩｇＧに融合されるｓｃＦｖを使用する二重特異性形式のために、Ｓｃｈａｎｚｅｒ他（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５５：２３６９〜２３７８、２０１１）はリンカー長さおよび相互接続ジスルフィド結合の影響を比較した。Ｓｃｈａｎｚｅｒ他は、元のｓｃＦｖまたはｓｃｄＦｖ（ＶＨ−（Ｇ４Ｓ）３−ＶＬ）を重鎖または軽鎖のＣ末端部分またはＮ末端部分のどちらかで融合した。異なるリンカー長さ（２０個、２５個および３０個のアミノ酸）について、Ｓｃｈａｎｚｅｒ他は元のｓｃＦｖを重鎖または軽鎖のどちらかのＣ末端部分に融合した。異なるリンカー長さに関して得られた結果により、３０ａａのペプチドが、安定なモノマーを製造するためのより好ましいリンカーとして特定された。４０℃での７日間の貯蔵の後における凝集物のレベルが、ｓｃＦｖ_１５については５０％であり、ｓｃＦｖ_２０については１８％であり、ｓｃＦｖ_２５については８％であり、ｓｃＦｖ_３０については６％であった。しかし、相互接続ジスルフィド結合により安定化されたジスルフィドｓｃＦｖ_１５はｓｃＦｖ_３０よりもわずかに優れていた。同じ取り組みがＭｉｃｈａｅｌｓｏｎ他（ｍＡｂｓ、１：１２８〜１４１、２００９）によって使用され、Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ他は、１５ａａのリンカーを有するｓｃＦｖをＶＨ／ＶＬ配向で含有するそれらの元のＩｇＧ様二重特異性抗体（これは４０％の凝集物を生じさせた）を、リンカー長さをｓｃＦｖの２０ａａに増大し、かつ、相互接続ジスルフィド結合をＶＨ４４位とＶＬ−１００位との間に導入することによって改善した。生じた分子は、４℃で３ヶ月の後で安定であった９８％超のモノマーをもたらした。著者らは、二重特異性形式に進む前にｓｃＦｖ分子の改善に取り組むことを決定した。
抗ＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の場合、ダイマーおよび高分子形態の形成が生じ得るか、また、抗クローディンおよび／または抗ＣＤ３のｓｃＦｖ分子に関しては何が関係するかは知られていない。抗ＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質のための最適な全体的分子をそれぞれの別個のｓｃＦｖについて評価するために、下記の改変が評価されている：
・ドメイン配向
・リンカー長さ
・相互接続ジスルフィド結合の導入
・これら３つの改変の組合せ

【0387】

抗クローディン１８．２結合ドメインについては、ｍＣＬＤＮ１８．２ａｂに由来する可変ドメイン（ＶＨ：配列番号８；ＶＬ：配列番号１５）に加えて、ｍＣＬＤＮ１８．２ａｂ１に由来する配列（ＶＨ：配列番号６；ＶＬ：配列番号１１）が抗ＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の構築のために使用されている。
節Ａ．ａ"３２個の抗ＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖ構築物の配列起源、設計および発現ベクターへのクローニング"における表１１はこれらの異なる構築物を記載する。

【0388】

Ａ．ＣＬＤＮ１８．２およびＣＤ３を標的化する二重特異性結合剤の作製および試験
ａ．３２個の抗ＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖ構築物の配列起源、設計および発現ベクターへのクローニング
本明細書中に示される二重特異性のタンデム型単鎖抗体構築物ｂｉ−ｓｃＦｖは、第１の結合ドメインがヒト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して特異的であり、これに対して、第２の結合ドメインがヒトＴ細胞受容体（ＣＤ３）のε鎖に対して特異的である２つの異なった結合ドメインを含有する。この二重特異性分子のこれら２つの結合ドメインのそれぞれが、ＶＨ−ＶＬ配向またはＶＬ−ＶＨ配向のどちらかでのｓｃＦｖ成分として配置される２つの抗体可変ドメインを含む。これらの抗体可変ドメインは、配向に依存してＧ４Ｓサブユニットの４個または５個の反復からなる柔軟なグリシン−セリンペプチドリンカーを介してつながれる。したがって、ＶＨ−ＶＬ配向で配置されるｓｃＦｖ成分は２０アミノ酸のリンカー（これは"ＬＬ４"と名づけられる）によってつながれ、ＶＬ−ＶＨは２５アミノ酸のリンカー（これは"ＬＬ５"と名づけられる）によってつながれる。他方で、これら２つのｓｃＦｖ成分は、６アミノ酸の長さのＳＧ４Ｓリンカー（これは"ＳＬ"と名づけられる）を介してつながれる。モノクローナル抗体（ｍＡＢ）からの配列起源に関する情報およびドメイン編成が表１１にまとめられる。
変化体の５５０４、５５０５、５５０６、５５０７、５５１２、５５１３、５５１４、５５１５、５５２０、５５２１、５５２２、５５２３、５５２８、５５２９、５５３０、５５３１、５５３６、５５３７、５５３８、５５３９、５５４４、５５４５、５５４６、５５４７、５５５２、５５５３、５５５４、５５５５、５５６０、５５６１、５５６２および５５６３は、配列番号９５によるＶＨ抗ＣＤ３と、配列番号９６によるＶＬ抗ＣＤ３とを含む。
１−ＢｉＭＡＢ−Ｓの具体的な場合には、ＶＨ抗ＣＤ３（配列番号９４）におけるセリンによるフリーのシステインの置換のみが、１−ＢｉＭＡＢ配列のアミノ酸配列（配列番号３９）に対する比較において行われる。配列番号３９は依然として、１−ＢｉＭＡＢ ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の細胞培養上清中への分泌を哺乳動物での発現のときに媒介するＮ末端シグナル配列のアミノ酸配列を含有することには留意しなければならない。このシグナル配列は、細網小胞体の内腔においてシグナルペプチダーゼによって切断されるので、分泌された組換えタンパク質の一部ではない。
これらのｂｉ−ｓｃＦｖ構築物をコードする遺伝子を、コドン使用頻度をＣＨＯ細胞における発現のために最適化するためにＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）ソフトウエアを使用してＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）遺伝子合成（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）により作製した。一般的な分泌シグナルのほかに、すべてのＤＮＡ構築物が、同じＫｏｚａｋ配列およびＨｉｎｄＩＩＩ制限を５'末端に含有する。３'末端において、ＢｓｉＷＩおよびＸｈｏＩの制限部位を、異なる発現ベクターへの柔軟なサブクローニングについて可能にするために加えた。優れたｐＣＥＰ４の発現ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）へのサブクローニングが、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩの制限部位を使用して、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって行われた。

【0389】

【表11】

【0390】

配列番号６６〜配列番号９３は依然として、１−ＢｉＭＡＢ ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の細胞培養上清中への分泌を哺乳動物での発現のときに媒介するＮ末端シグナル配列のアミノ酸配列を含有することには留意しなければならない。このシグナル配列は、小胞体の内腔においてシグナルペプチダーゼによって切断されるので、分泌された組換えタンパク質の一部ではない。

【0391】

ｂ．一過性トランスフェクションによる３２個の抗ＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の産生および精製
懸濁に適合化されたＣＨＯ細胞を加湿ＣＯ_２振とう機において血清非含有培地で継代培養した。トランスフェクションの前日に、細胞を振とうフラスコにおいて血清非含有培地に播種した。トランスフェクションの当日に、細胞を遠心分離し（２００×ｇで５分間）、振とうフラスコにおいて新鮮なＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、４１９６５−０３９）に再懸濁した。ＤＮＡおよびトランスフェクション試薬を細胞に加え、振とうによって穏やかに混合した。ＣＯ_２インキュベーターにおける静置インキュベーションの後、細胞を血清非含有の生育培地により希釈し、インキュベーション振とう機において発現のためにさらに培養した。細胞には、栄養要求に従って、ＣＨＯ ＣＤ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ（商標）Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１３２７５）を与えた。ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質を、細胞の生存性が低下し始めた後で集めた。抗体構築物を、Ｃａｐｔｏ Ｌセファロースによって精製した。タンパク質濃度を２８０ｎｍにおける吸光度によって求めた。

【0392】

ｃ．３２個の抗ＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質を用いたルシフェラーゼ細胞傷害性アッセイ
３２個の抗ＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の機能的スクリーニングのために、４点の力価測定点（５０００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌおよび４０ｎｇ／ｍｌ）を実施例２．ｃで記載されるようにインビトロルシフェラーゼ細胞傷害性アッセイで試験した。
実施例２．ｃで記載される安定なルシフェラーゼ発現ＮｕｇＣ４細胞をヒトＴ細胞およびｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質とともに、または、Ｌ_ｍｉｎ値を求めるために、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質を伴うことなくインキュベーションした。生細胞の発光を、アッセイ設定後の２４時間および４８時間で、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｔｅｃａｎプレートリーダーを用いて測定した。特異的な標的細胞溶解を、実施例２．ｃにおいて例示される式によって計算した。

【0393】

細胞傷害性結果（図３９ａ、図３９ｂ、図３９ｃおよび図３９ｄ）の定性的分析を、ｓｃＦｖの抗ＣＤ３ ＴＲ６６結合ドメインに基づいて行うことによって、下記の所見を引き出すことができた。
ルシフェラーゼ細胞傷害性アッセイにおける最も良く機能する抗ＣＬＤＮ１８．２特異的ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質は、抗ＣＤ３成分を、相互接続ジスルフィド架橋の有無によらず、"ＬＬ４"リンカーによってつながれるＶＨ／ＶＬドメイン配向で含有する（５５０４、５５０５、５５０６、５５０７、５５３６、５５３７、５５３８、５５３９、５５１２、５５１３、５５１４、５５１５、５５４４、５５４５、５５４６、５５４７；図３９ａおよび図３９ｂ）。より低い細胞傷害性活性が、抗ＣＤ３成分を、ペプチドリンカー"ＬＬ５"を伴うＶＬ／ＶＨドメイン配向で含有し、かつ、相互接続ジスルフィド架橋を含有する変化体により得られる（５５２８、５５２９、５５３０、５５３１、５５６０、５５６１、５５６２、５５６３；図３９ｄ）。最も低い細胞傷害性活性が、抗ＣＤ３成分を、相互接続ジスルフィド架橋を伴うことなくペプチドリンカー"ＬＬ５"を伴うＶＬ／ＶＨドメイン配向で含有する変化体により得られる（５５２０、５５２１、５５２２、５５２３、５５５２、５５５３、５５５４、５５５５；図３９ｃ）。

【0394】

Ｂ．ＣＬＤＮ６およびＣＤ３を標的化する二重特異性結合剤の作製および試験
ａ．ｂｉ−ｓｃＦｖ構築物の配列起源、設計および発現ベクターへのクローニング
本明細書中に示される二重特異性のタンデム型単鎖抗体構築物ｂｉ−ｓｃＦｖは、一方がヒト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して特異的であり、これに対して、他方がヒトＴ細胞受容体（ＣＤ３）のε鎖に対して特異的である２つの異なった結合ドメインを含有する。この二重特異性分子のこれら２つの結合ドメインのそれぞれが、ＶＨ−ＶＬ配向またはＶＬ−ＶＨ配向のどちらかでのｓｃＦｖ成分として配置される２つの抗体可変ドメインを含む。これらの抗体可変ドメインは、柔軟なグリシン−セリンペプチドリンカーを介してつながれる。ＴＡＡを標的化するｓｃＦｖ成分はＶＨ−ＶＬ配向で配置され、Ｇ４Ｓサブユニットの３つの同一反復からなる１５アミノ酸のリンカー（これは"ＬＬ３"と名づけられる）によってつながれる。ＣＤ３を標的化するｓｃＦｖ成分は、同様にＶＨ−ＶＬ配向で配置され、しかし、配列Ｇ_４Ｓ（Ｇ_２Ｓ）_３Ｇ_３Ｓを有する１８アミノ酸のリンカー（これはＬＬｖ１と名づけられる）によってつながれる。他方で、これら２つのｓｃＦｖ成分は、６アミノ酸の長さのＳＧ４Ｓリンカー（これは"ＳＬ"と名づけられる）を介してつながれる。モノクローナル抗体（ｍＡＢ）からの配列起源に関する情報およびドメイン編成が表１２にまとめられる。変化体の５４５４、５４５６、５４５８、５４６０、５４６２および５４６４は、抗ＣＤ３結合ドメインのために、配列番号９５によるＶＨ抗ＣＤ３と、配列番号９６によるＶＬ抗ＣＤ３とを含む。変化体の５４５４および５４５８は配列番号９８によるＶＬ抗ＣＬＤＮ６を含み、変化体の５４５６および５４６０は配列番号９９によるＶＬ抗ＣＬＤＮ６を含み、変化体の５４６２および５４６４は配列番号１００によるＶＬ抗ＣＬＤＮ６を含む。
６ＰＨＵ３−Ｓ（配列番号１０１）の具体的な場合には、ＶＨ抗ＣＤ３（配列番号９４）におけるセリン残基によるフリーのシステインの置換のみが、６ＰＨＵ３配列のアミノ酸配列（配列番号４５）に対する比較において行われる。配列番号４５は依然として、６ＰＨＵ−３ ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の細胞培養上清中への分泌を哺乳動物での発現のときに媒介するＮ末端シグナル配列のアミノ酸配列を含有することには留意しなければならない。このシグナル配列は、小胞体の内腔においてシグナルペプチダーゼによって切断されるので、分泌された組換えタンパク質の一部ではない。そのうえ、６ＰＨＵ３−ＳＬ（配列番号１０２）については、対応する一次配列の４６位でのＶＬ抗ＣＬＤＮ６（配列番号９７）におけるフリーシステインのロイシン残基による置換が、６ＰＨＵ３−Ｓのアミノ酸配列に対する比較において行われる。これは、ＶＬの最初のアミノ酸が除かれている配列番号２３の中の４５位に対応する。

【0395】

これらのｂｉ−ｓｃＦｖ構築物をコードする遺伝子を、コドン使用頻度をＣＨＯ細胞における発現のために最適化するためにＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）ソフトウエアを使用してＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）遺伝子合成（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）により作製した。一般的な分泌シグナルのほかに、すべてのＤＮＡ構築物が、同じＫｏｚａｋ配列およびＨｉｎｄＩＩＩ制限を５'末端に含有する。３'末端において、ＢｓｉＷＩおよびＸｈｏＩの制限部位を、異なる発現ベクターへの柔軟なサブクローニングについて可能にするために加えた。優れたｐＥＥ１２．４の発現ベクター（Ｌｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ、Ｂａｓｅｌ、スイス）へのサブクローニングを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｉＷＩの制限部位を使用する標準的な技術を使用して行った。

【0396】

【表12】

【0397】

ｂ．一過性トランスフェクションによる６個の抗ＣＬＤＮ６特異的ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の産生および精製
懸濁に適合化されたＣＨＯ細胞を加湿ＣＯ_２振とう機において血清非含有培地で継代培養した。トランスフェクションの前日に、細胞を振とうフラスコにおいて血清非含有培地に播種した。トランスフェクションの当日に、細胞を遠心分離し（２００×ｇで５分間）、振とうフラスコにおいて新鮮なＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、４１９６５−０３９）に再懸濁した。ＤＮＡおよびトランスフェクション試薬を細胞に加え、振とうによって穏やかに混合した。ＣＯ_２インキュベーターにおける静置インキュベーションの後、細胞を血清非含有の生育培地により希釈し、インキュベーション振とう機において発現のためにさらに培養した。細胞には、栄養要求に従って、ＣＨＯ ＣＤ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ（商標）Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１３２７５）を与えた。ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質を、細胞の生存性が低下し始めた後で集めた。抗体構築物を、Ｃａｐｔｏ Ｌセファロースを使用するＦＰＬＣによって精製した。タンパク質濃度を２８０ｎｍにおける吸光度によって求めた。

【0398】

ｃ．６個の抗ＣＬＤＮ６特異的ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質のＥＣ_５０の決定
抗ＣＬＤＮ６特異的ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の５０％最大有効用量を求めるために、ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質の力価測定列を実施例１３に記載されるようにインビトロルシフェラーゼ細胞傷害性アッセイで試験した。
安定的にルシフェラーゼを発現するＰＡ−１細胞とヒトＴ細胞とを５：１のＥ：Ｔ比で、（１０倍ずつで）２．５ｐｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌまでの範囲におけるｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質濃度とともに、または、Ｌ_ｍｉｎ値を求めるために、抗ＣＬＤＮ６特異的ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質を伴うことなくインキュベーションした。
３回の独立したアッセイを、ヒトＴ細胞を調製するための異なるヒトドナーに関して行った。結果が図４０に例示される。
細胞傷害性結果の定量的比較を、セリン、ロイシンまたはトリプトファンのいずれかによるＣＤＲ−Ｌ２の隣接領域の中におけるシステイン残基置換に基づいて、また、抗ＣＬＤＮ６結合ドメイン位置および抗ＣＤ３結合ドメイン位置に基づいて行うことによって、下記の所見を引き出すことができた。
ルシフェラーゼ細胞傷害性アッセイにおける最も良く機能する抗ＣＬＤＮ６特異的ｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質は、システインからトリプトファンへの置換をｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質のＮ末端部分における抗ＣＬＤＮ６結合ドメインとともに含有する（変化体５４５６）。わずかにより低い細胞傷害性活性が、抗ＣＬＤＮ６をＣ末端部分に含有する変化体で、システインのトリプトファンによる置換を有する変化体（変化体５４６０）、または、システインのセリンによる置換を有する変化体（変化体５４６４）のどちらに関してでも得られる。システインのロイシンによる置換を含有する変化体で、抗ＣＬＤＮ６をｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質のＮ末端部分（変化体５４５４）またはＣ末端部分（変化体５４５８）に有する変化体については、より低い細胞傷害性活性が前記変化体との比較で測定される。驚くべきことに、システインのセリンによる置換を含有する変化体で、抗ＣＬＤＮ６をｂｉ−ｓｃＦｖタンパク質のＮ末端部分に有する変化体（変化体５４６２）が、最も低い細胞傷害性活性を有する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A1】

【図15A2】

【図15B】

【図15C】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【図19AB】

【図19CD】

【図19E】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29A】

【図29B】

【図29C】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37A】

【図37B】

【図37C】

【図38】

【図39A】

【図39B】

【図39C】

【図39D】

【図40】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]