特許 6799230 非アルコール性脂肪性肝疾患の診断方法、又は診断用キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6799230

(24)【登録日】2020年11月25日

(45)【発行日】2020年12月16日

(54)【発明の名称】非アルコール性脂肪性肝疾患の診断方法、又は診断用キット

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/92 20060101AFI20201207BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20201207BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20201207BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20201207BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20201207BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/92 Z

   G01N33/50 B

   G01N33/50 D

   C12Q1/06

   C12Q1/68

   C12M1/00 A

【請求項の数】6

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2017-3327(P2017-3327)

(22)【出願日】2017年1月12日

(65)【公開番号】特開2018-112482(P2018-112482A)

(43)【公開日】2018年7月19日

【審査請求日】2019年10月3日

(73)【特許権者】

【識別番号】391015351

【氏名又は名称】ビオフェルミン製薬株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】505155528

【氏名又は名称】公立大学法人横浜市立大学

(74)【代理人】

【識別番号】100077012

【弁理士】

【氏名又は名称】岩谷 龍

(72)【発明者】

【氏名】田中 良紀

(72)【発明者】

【氏名】嶋川 真木

(72)【発明者】

【氏名】大野 裕史

(72)【発明者】

【氏名】結束 貴臣

(72)【発明者】

【氏名】中島 淳

【審査官】 海野 佳子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／０４９８７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１６／００１７４０９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Vincent Wai-Sun Wong，Molecular characterization of the fecal microbiota in patients with nonalcoholic steatohepatitis - A logitudinal study，PLOS ONE，米国，２０１３年，vol. 8. no. 4: e62885

【文献】 Katrien H. J. Gaens，Endogenous formation of N-(carboxymethyl)lysine is increased in fatty livers and induces inflammatory markers in an in vitro model of hepatic steatosis，Journal of Hepatology，米国，２０１２年，vol. 56: 647-655

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

糞便中のピリドキサミン、カルボキシメチルリジン、５−アミノ吉草酸、リノレオイルエタノールアミド、オレオイルエタノールアミド及びインドール−３−カルボアルデヒドからなる群より選択される少なくとも一種の量を測定することを特徴とする、非アルコール性脂肪性肝疾患の診断のための方法。

【請求項2】

さらに糞便中のフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌の占有率を測定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

糞便中のフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌の占有率が、４％以下である場合に、非アルコール性脂肪性肝疾患が重度であることを示すことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

糞便中のピリドキサミン、カルボキシメチルリジン、５−アミノ吉草酸、リノレオイルエタノールアミド、オレオイルエタノールアミド及びインドール−３−カルボアルデヒドからなる群より選択される少なくとも一種の量を測定するための試薬又は機器を含有することを特徴とする、非アルコール性脂肪性肝疾患の診断用キット。

【請求項5】

さらにフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌の占有率を測定するための試薬又は機器を含有することを特徴とする、請求項４に記載のキット。

【請求項6】

糞便中のフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌の占有率が、４％以下である場合に、非アルコール性脂肪性肝疾患が重度であると診断するための、請求項４又は５に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、糞便中の特定の物質の量及び／又は糞便中の菌の占有率を測定することを特徴とする非アルコール性脂肪性肝疾患の診断方法、又は診断用キットに関する。

【背景技術】

【0002】

肝臓における脂肪変化は、肝細胞内の脂質の過度の蓄積に起因する。脂肪肝は、肝細胞におけるトリグリセリド及び他の脂肪の蓄積である。脂肪性肝疾患は、脂肪肝単独（単純な脂肪肝、脂肪症）から肝臓炎症を伴う脂肪肝（脂肪性肝炎）にまでわたり得る。脂肪性肝炎は、肝繊維症及び硬変に進行する可能性があり、又は肝細胞癌を伴う恐れがあり、肝臓関連の病的状態及び死をもたらし得る。

【0003】

脂肪肝の主な原因は、大量飲酒と過栄養である。飲酒を経ずに肝疾患症状を呈する非アルコール性脂肪性肝疾患（Non-alcoholic fatty liver disease、以下ＮＡＦＬＤとも称する。）は、良性の病気で進行しないと軽視されていたが、肝炎、肝硬変、肝臓がん等を引き起こす例が増加し、看過できない疾患となっている。また、ＮＡＦＬＤの重症度については軽度から重度まで存在する。

【0004】

一般的に、肝疾患の診断方法は、血液検査、病理学的検査（肝生検）等侵襲的にバイオマーカーの増減等を調べることにより行われる（特許文献１）。ＮＡＦＬＤについての診断基準は、組織学的所見に依拠しており、その中でも肝生検は、依然として、ＮＡＦＬＤ等、肝疾患の病因及び程度を評価するときの標準的基準又は「ゴールドスタンダード」である。肝生検は一般に、安全であると考えられるが、潜在的に致死性である危険性を負う。肝生検の合併症のうちのほぼ３分の２が、２時間以内に生じている。肝生検を受ける患者のうちの約２％が、有害事象を管理するための入院を必要とする。生検を受ける患者のうちの約１％では、肝生検後において、顕著な出血が生じる。そこで、ＮＡＦＬＤを信頼できる形で効率的に診断し、軽症と重症のＮＡＦＬＤを識別するための、侵襲性が最小限の診断方法が必要である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開第２０１６−６５８７３号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の目的は、新規な非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の診断方法を提供することである。さらに本発明の目的は、非アルコール性脂肪性肝疾患の診断用キットを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、上記課題を解決するために糞便中に存在する１０００を超える腸内代謝物を検討した結果、糞便中のピリドキサミン（Pyridoxamine）、カルボキシメチルリジン（Carboxymethyllysine）等の量及び／又は糞便中のフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌の占有率を測定することで、ＮＡＦＬＤの有無、又はＮＡＦＬＤの重症度を診断できることを見出し、さらに検討を重ねて、種々の新知見を得て、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の発明に関する。
［１］糞便中のピリドキサミン、カルボキシメチルリジン、５−アミノ吉草酸、リノレオイルエタノールアミド、オレオイルエタノールアミド及びインドール−３−カルボアルデヒドからなる群より選択される少なくとも一種の量を測定することを特徴とする、非アルコール性脂肪性肝疾患の診断方法。
［２］さらに糞便中のフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌の占有率を測定することを特徴とする、前記［１］に記載の診断方法。
［３］糞便中のフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌の占有率が、４％以下である場合に、非アルコール性脂肪性肝疾患が重度であると診断することを特徴とする、前記［１］又は［２］に記載の診断方法。
［４］糞便中のピリドキサミン、カルボキシメチルリジン、５−アミノ吉草酸、リノレオイルエタノールアミド、オレオイルエタノールアミド及びインドール−３−カルボアルデヒドからなる群より選択される少なくとも一種の量を測定するための試薬又は機器を含有することを特徴とする、非アルコール性脂肪性肝疾患の診断用キット。
［５］さらにフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌の占有率を測定するための試薬又は機器を含有することを特徴とする、前記［４］に記載のキット。
［６］糞便中のフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌の占有率が、４％以下である場合に、非アルコール性脂肪性肝疾患が重度であると診断するための、前記［４］又は［５］に記載のキット。

【発明の効果】

【0008】

本発明は、新規な非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の診断方法を提供することができる。本発明の診断方法は、糞便中のピリドキサミン、カルボキシメチルリジン等の量又は糞便中のピリドキサミン、カルボキシメチルリジン等の量及び糞便中のフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌の占有率を測定することで、簡便に若しくは非侵襲的にＮＡＦＬＤの有無を診断できる点、又はＮＡＦＬＤの重症度を診断できる点等において、特に顕著な効果を有する。さらに本発明のキットは、診断用キット等（例えば、診断薬、検査キット）として利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、腸内菌叢のＰＣｏＡ（Principal Coordinates Analysis）解析結果を示す図である。検体間距離（bray-curtis distance）を元にＰＣｏＡ解析を用いて行った。健常者からＮＡＦＬＤの症状の悪化に従って遠い位置に分布する傾向が認められた。○（白色）：健常者（ＨＣ）、△（白色）：軽症ＮＡＦＬＤ患者、●（黒色）：重症ＮＡＦＬＤ患者。

【図2】図２は、ＮＡＦＬＤの進行程度とフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）占有率の関係を示す図である。ＮＡＦＬＤの症状が進展するにつれて、糞便中のフィーカリバクテリウムの占有率は有意に減少した。カラムは糞便中のフィーカリバクテリウムの占有率の平均値±S.E.を示す。ＨＣ：健常者、＊＊＊：p＜0.001 vs. HC、†††： p＜0.001 vs. 軽度ＮＡＦＬＤ。

【図3】図３は、代謝プロファイルにおける主成分分析の結果を示す図である。健常者及び重度ＮＡＦＬＤは異なるクラスターを形成する傾向が認められ、軽度ＮＡＦＬＤは健常者クラスターと重度患者クラスターのどちらにも分布することが確認された。各群間でプロットの差は、第１主成分（ＰＣ１）で明確な差が認められた。

【図4】図４は、内部標準物質に対するピリドキサミンの相対面積と糞便中のフィーカリバクテリウム属の菌の占有率との相関性を示す図である。

【図5】図５は、内部標準物質に対する５−アミノ吉草酸の相対面積と糞便中のフィーカリバクテリウム属の菌の占有率との相関性を示す図である。

【図6】図６は、内部標準物質に対するカルボキシメチルリジンの相対面積と糞便中のフィーカリバクテリウム属の菌の占有率との相関性を示す図である。フィーカリバクテリウム量とのスピアマン相関係数 < -0.45となったカルボキシルメチルリジンは、ＮＡＦＬＤ進展（軽症又は重症）に関与する可能性がある。

【図7】図７は、内部標準物質に対するリノレオイルエタノールアミドの相対面積と糞便中のフィーカリバクテリウム属の菌の占有率との相関性を示す図である。フィーカリバクテリウム量とのスピアマン相関係数 < -0.45となったリノレオイルエタノールアミドは、ＮＡＦＬＤ進展（軽症又は重症）に関与する可能性がある。

【図8】図８は、内部標準物質に対するオレオイルエタノールアミドの相対面積と糞便中のフィーカリバクテリウム属の菌の占有率との相関性を示す図である。フィーカリバクテリウム量とのスピアマン相関係数 < -0.45となったオレオイルエタノールアミドは、ＮＡＦＬＤ進展（軽症又は重症）に関与する可能性がある。

【図9】図９は、内部標準物質に対するインドール−３−カルボアルデヒドの相対面積と糞便中のフィーカリバクテリウム属の菌の占有率との相関性を示す図である。フィーカリバクテリウム量とのスピアマン相関係数 > 0.45となったインドール−３−カルボアルデヒドは、ＮＡＦＬＤ進展（軽症又は重症）に関与する可能性がある。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明は、糞便中のピリドキサミン、カルボキシメチルリジン、５−アミノ吉草酸、リノレオイルエタノールアミド、オレオイルエタノールアミド及び／又はインドール−３−カルボアルデヒドの量を測定することを特徴とする、非アルコール性脂肪性肝疾患の診断方法を提供する。

【0011】

本発明は、また、糞便中のピリドキサミン、カルボキシメチルリジン、５−アミノ吉草酸、リノレオイルエタノールアミド、オレオイルエタノールアミド及び／又はインドール−３−カルボアルデヒドの量並びに糞便中のフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌の占有率を測定することを特徴とする、非アルコール性脂肪性肝疾患の診断方法を提供する。

【0012】

本発明において、糞便は、動物より得られる排泄物である。糞便は、例えば、体外に排出されたものが、簡便性又は非侵襲性の点から好ましい。

【0013】

ピリドキサミンは、通常、ピリドキシンの４位ヒドロキシメチル基がアミノメチル基に置換している化合物で、ピリドキサール、ピリドキシンと同じビタミンB6作用をもつ。本発明において、ピリドキサミンは、例えば、塩、エステル等の形態をとってもよいし、又はそれらの代謝物（例えば、ピリドキサール−５−リン酸）等であってもよい。

【0014】

カルボキシメチルリジンは、通常、終末糖化産物（AGEs；Advanced Glycation End Products）の1種であり、アマドリ化合物の酸化的開裂によって生成される。また、脂質の過酸化等から生じるグリオキサール、あるいは次亜塩素酸とセリンから生じるグリコールアルデヒドとリジン残基の反応によっても生成される。本発明において、カルボキシメチルリジンは、例えば、塩、エステル等の形態をとってもよいし、又はそれらの代謝物等であってもよい。

【0015】

５−アミノ吉草酸は、通常、アミノカルボン酸の一種であって、ＧＡＢＡ(γ-アミノ酪酸)作動薬等として知られており、例えば、EC 1.21.4.1に分類されるD-プロリンレダクターゼを用いてD-プロリンを変換することによって生成できる。本発明において、５−アミノ吉草酸は、例えば、塩、エステル等の形態をとってもよいし、又はそれらの代謝物（例えば、Ｌ−グルタミン酸、５−オキソペンタン酸）等であってもよい。

【0016】

リノレオイルエタノールアミドは、通常、脂肪酸アルカノールアミドの一種であって、例えば、核受容体ペルオキシソーム増殖物質活性化受容体α(PPAR-α)を活性化することによって脂肪分解を促進することや、睡眠時の自律神経安定作用により睡眠関連呼吸障害を予防すること等が知られている。本発明において、リノレオイルエタノールアミドは、例えば、塩、エステル等の形態をとってもよいし、又はそれらの代謝物等であってもよい。

【0017】

オレオイルエタノールアミドは、通常、従来から食品として摂取されてきた天然成分の一種であり、人体に対する安全性が確認されている。さらに脂肪酸アルカノールアミドの一種であって、例えば、核受容体ペルオキシソーム増殖物質活性化受容体α(PPAR-α)を活性化することによって脂肪分解を促進すること、睡眠時の自律神経安定作用により睡眠関連呼吸障害を予防すること、及び炎症を抑制すること等が知られている。本発明において、オレオイルエタノールアミドは、例えば、塩、エステル等の形態をとってもよいし、又はそれらの代謝物等であってもよい。

【0018】

インドール−３−カルボアルデヒドは、通常、ヘテロ芳香族アルデヒドの一種であって、例えば、トリプトファンの代謝経路の中間体であり、インドール環を有すること等が知られている。本発明において、インドール−３−カルボアルデヒドは、例えば、塩、エステル等の形態をとってもよいし、又はそれらの代謝物等であってもよい。

【0019】

本発明において、塩としては、例えば、塩酸等の無機酸との塩、酢酸等の有機酸との塩、ナトリウム、カリウム、アンモニア等の無機塩基との塩等が挙げられ、エステルとしては、例えば、酢酸、エタノール等とのエステル等が挙げられる。

【0020】

ピリドキサミン、カルボキシメチルリジン、５−アミノ吉草酸、リノレオイルエタノールアミド、オレオイルエタノールアミド及び／又はインドール−３−カルボアルデヒドの量を測定する方法は、例えば、市販の試薬（抗体等）、測定機器（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ、薄層クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ等）、検査キット（ＥＬＩＳＡキット等）等をそれぞれ、又は組み合わせて用いて測定してもよいし、自体公知の方法又は公知の方法等により測定してもよい。

【0021】

ピリドキサミン、カルボキシメチルリジン、５−アミノ吉草酸、リノレオイルエタノールアミド、オレオイルエタノールアミド及び／又はインドール−３−カルボアルデヒドの量を測定する方法は、メタボローム解析法であってもよい。メタボローム解析法は、例えば、以下のようにして実施することができる。まず、糞便からイオン性低分子代謝物を水性溶媒で抽出する。抽出溶液に内部標準物質を添加して飛行時間質量分析装置（例えば、ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）等を用いて測定する。測定されたデータから所定のシグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比を超えるピークを抽出する。抽出したピークについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）と泳動時間の値から化合物を同定する。また、ピーク面積値から各化合物の存在量を算出する。当該存在量は、内部標準物質の面積値で規格化した相対面積値であってもよい。
また本発明において、メタボローム解析は、委託会社等に委託して解析等を行ってもよい。

【0022】

非アルコール性脂肪性肝疾患であると診断する場合、目的化合物（ピリドキサミン、カルボキシメチルリジン、５−アミノ吉草酸、リノレオイルエタノールアミド、オレオイルエタノールアミド及び／又はインドール−３−カルボアルデヒド、即ち上記６つの化合物の一種又は二種以上の混合物）が含まれていると考えられる試料中の、目的化合物の含有量は、目的ピークの面積値から下記式（１）を用いて算出してもよい。

【数1】

【0023】

式（１）における目的ピークの面積値は、内部標準物質のピーク面積との比をとることで標準化できる。本発明において、内部標準物質は、通常バイオマーカーである化合物の電気泳動及び質量分析の効率に影響を及ぼさないものであり、特に限定されないが、例えば、メチオニンスルホン、１０−カンファ−スルホン酸（１０−ｃａｍｐｈｏｒ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＣＳＡ）等が挙げられる。本発明において、試料量は、メタボローム解析（分析）を行う際に、実際に量った検体（糞便）の量の値を用いることが好ましい。

【0024】

本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）とは、著しいアルコール消費がない個体における脂肪肝から脂肪性肝炎及び肝硬変に及ぶ、脂肪性肝疾患の全範囲を包含する。この脂肪性肝疾患の重症度は、Brunt分類において、ステージ１〜４に評価、分類されている（Brunt EM et al., Am J Gastroenterol 94: 2467-2474, 1999）。Brunt分類を表１に示す。

【0025】

【表1】

【0026】

本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患が重度であるとは、例えば、表１に示す肝線維化のBrunt分類におけるステージが３又は４の状態等であることを包含する。
本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患が軽度であるとは、例えば、表１に示す肝線維化のBrunt分類におけるステージが１又は２の状態等であることを包含する。

【0027】

本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患であると診断する場合の、糞便中のピリドキサミンの量は、式（１）で求めた相対面積値が１．６×１０^−３以下、１．４×１０^−３以下、又は１．２×１０^−３以下等であってもよい。
本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患であると診断する場合の、糞便中のカルボキシメチルリジンの量は、式（１）で求めた相対面積値が５．０×１０^−４以上、６．０×１０^−４以上、又は７．０×１０^−４以上等であってもよい。
本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患であると診断する場合の、糞便中の５−アミノ吉草酸の量は、式（１）で求めた相対面積値が５．０×１０^−２以上、６．０×１０^−２以上、又は７．０×１０^−２以上等であってもよい。
本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患であると診断する場合の、糞便中のリノレオイルエタノールアミドの量は、式（１）で求めた相対面積値が２．０×１０^−１以上、３．０×１０^−１以上、又は４．０×１０^−１以上等であってもよい。
本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患であると診断する場合の、糞便中のオレオイルエタノールアミドの量は、式（１）で求めた相対面積値が１．０×１０^−１以上、１．５×１０^−１以上、又は２．０×１０^−１以上等であってもよい。
本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患であると診断する場合の、糞便中のインドール−３−カルボアルデヒドの量は、式（１）で求めた相対面積値が１．２×１０^−２以下、１．１×１０^−２以下、又は１．０×１０^−２以下等であってもよい。

【0028】

本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患が重度であると診断するピリドキサミンの量は、式（１）で求めた相対面積値が１．０×１０^−３以下、８．０×１０^−４以下、又は６．０×１０^−４以下等であってもよい。
本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患が軽度であると診断するピリドキサミンの量は、式（１）で求めた相対面積値が１．０×１０^−３を超えて１．６×１０^−３以下、１．０×１０^−３を超えて１．４×１０^−３以下、又は１．０×１０^−３を超えて１．２×１０^−３以下等であってもよい。

【0029】

本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患が重度であると診断するカルボキシメチルリジンの量は、式（１）で求めた相対面積値が１．５×１０^−３以上、１．７５×１０^−３以上、又は２．０×１０^−３以上等であってもよい。
本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患が軽度であると診断するカルボキシメチルリジンの量は、式（１）で求めた相対面積値が５×１０^−４以上１．５×１０^−３未満、６×１０^−４以上１．５×１０^−３未満、又は７×１０^−４以上１．５×１０^−３未満等であってもよい。

【0030】

本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患が重度であると診断する５−アミノ吉草酸の量は、式（１）で求めた相対面積値が１．０×１０^−１以上、１．２５×１０^−１以上、又は１．５×１０^−１以上等であってもよい。
本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患が軽度であると診断する５−アミノ吉草酸の量は、式（１）で求めた相対面積値が５．０×１０^−２以上１．０×１０^−１未満、６．０×１０^−２以上１．０×１０^−１未満、又は７．０×１０^−２以上１．０×１０^−１未満等であってもよい。

【0031】

本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患が重度であると診断するリノレオイルエタノールアミドの量は、式（１）で求めた相対面積値が４．０×１０^−１以上、６．０×１０^−１以上、又は８．０×１０^−１以上等であってもよい。
本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患が軽度であると診断するリノレオイルエタノールアミドの量は、式（１）で求めた相対面積値が２．０×１０^−１以上４．０×１０^−１未満、２．５×１０^−１以上４．０×１０^−１未満、又は３．０×１０^−１以上４．０×１０^−１未満等であってもよい。

【0032】

本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患が重度であると診断するオレオイルエタノールアミドの量は、式（１）で求めた相対面積値が２．０×１０^−１以上、２．５×１０^−１以上、又は３．０×１０^−１以上等であってもよい。
本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患が軽度であると診断するオレオイルエタノールアミドの量は、式（１）で求めた相対面積値が１．０×１０^−１以上２．０×１０^−１未満、１．２５×１０^−１以上２．０×１０^−１未満、又は１．５×１０^−１以上２．０×１０^−１未満等であってもよい。

【0033】

本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患が重度であると診断するインドール−３−カルボアルデヒドの量は、式（１）で求めた相対面積値が９．０×１０^−３以下、８．０×１０^−３以下、又は７．０×１０^−３以下等であってもよい。
本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患が軽度であると診断するインドール−３−カルボアルデヒドの量は、式（１）で求めた相対面積値が９．０×１０^−３を超えて１．２×１０^−２以下、９．０×１０^−３を超えて１．１×１０^−２以下、又は９．０×１０^−３を超えて１．０×１０^−２以下等であってもよい。

【0034】

本発明における別の態様において、非アルコール性脂肪性肝疾患が重度であると診断する場合、式（１）で求めたピリドキサミン及びカルボキシメチルリジンの相対面積値の比は、ピリドキサミン１に対してカルボキシメチルリジンが１．５以上３．３以下、１．７５以上２．９以下、又は２以上２．５以下等であってもよい。
本発明における別の態様において、非アルコール性脂肪性肝疾患が軽度であると診断する場合、式（１）で求めたピリドキサミン及びカルボキシメチルリジンの相対面積値の比は、ピリドキサミン１に対してカルボキシメチルリジンが０．３以上１．５未満、０．５以上１．５以下、又は０．９以上１．５以下等であってもよい。

【0035】

本発明における別の態様において、非アルコール性脂肪性肝疾患が重度であると診断する場合、式（１）で求めたピリドキサミン及び５−アミノ吉草酸の相対面積値の比は、ピリドキサミン１に対して５−アミノ吉草酸が１００以上２５０以下、１２５以上２０８以下、又は１５０以上１８７以下等であってもよい。
本発明における別の態様において、非アルコール性脂肪性肝疾患が軽度であると診断する場合、式（１）で求めたピリドキサミン及び５−アミノ吉草酸の相対面積値の比は、ピリドキサミン１に対して５−アミノ吉草酸が３１．３以上１００未満、４２．８以上８３．３以下、又は５８．３以上７１．４以下等であってもよい。

【0036】

本発明における別の態様において、非アルコール性脂肪性肝疾患が重度であると診断する場合、式（１）で求めたピリドキサミン及びリノレオイルエタノールアミドの相対面積値の比は、ピリドキサミン１に対してリノレオイルエタノールアミドが４００以上１３３３以下、５００以上１０００以下、又は６００以上８００以下等であってもよい。
本発明における別の態様において、非アルコール性脂肪性肝疾患が軽度であると診断する場合、式（１）で求めたピリドキサミン及びリノレオイルエタノールアミドの相対面積値の比は、ピリドキサミン１に対してリノレオイルエタノールアミドが１２５以上４００未満、１７８．６以上３３３以下、又は２５０以上３００以下等であってもよい。

【0037】

本発明における別の態様において、非アルコール性脂肪性肝疾患が重度であると診断する場合、式（１）で求めたピリドキサミン及びオレオイルエタノールアミドの相対面積値の比は、ピリドキサミン１に対してオレオイルエタノールアミドが２００以上５００以下、２５０以上４１６．６以下、又は３００以上３７５以下等であってもよい。
本発明における別の態様において、非アルコール性脂肪性肝疾患が軽度であると診断する場合、式（１）で求めたピリドキサミン及びオレオイルエタノールアミドの相対面積値の比は、ピリドキサミン１に対してオレオイルエタノールアミドが６２．５以上２００未満、８９．３以上１６６．７以下、又は１００以上１５０以下等であってもよい。

【0038】

本発明における別の態様において、非アルコール性脂肪性肝疾患が重度であると診断する場合、式（１）で求めたインドール−３−カルボアルデヒド及びカルボキシメチルリジンの相対面積値の比は、インドール−３−カルボアルデヒド１に対してカルボキシメチルリジンが０．１６７以上０．２８６以下、０．１８８以上０．２５以下、又は０．１９４以上０．２２２以下等であってもよい。
本発明における別の態様において、非アルコール性脂肪性肝疾患が軽度であると診断する場合、式（１）で求めたインドール−３−カルボアルデヒド及びカルボキシメチルリジンの相対面積値の比は、インドール−３−カルボアルデヒド１に対してカルボキシメチルリジンが０．１２５以上０．１６７未満、０．１３６以上０．１６７未満、又は０．１５以上０．１６７未満等であってもよい。

【0039】

本発明における別の態様において、非アルコール性脂肪性肝疾患が重度であると診断する場合、式（１）で求めたインドール−３−カルボアルデヒド及び５−アミノ吉草酸の相対面積値の比は、インドール−３−カルボアルデヒド１に対して５−アミノ吉草酸が１１．１以上２１．４以下、１２．５以上１８．８以下、又は１３．９以上１７．９以下等であってもよい。
本発明における別の態様において、非アルコール性脂肪性肝疾患が軽度であると診断する場合、式（１）で求めたインドール−３−カルボアルデヒド及び５−アミノ吉草酸の相対面積値の比は、インドール−３−カルボアルデヒド１に対して５−アミノ吉草酸が４．１７以上１１．１未満、５．４５以上１０以下、又は５．５６以上９．０９以下等であってもよい。

【0040】

本発明における別の態様において、非アルコール性脂肪性肝疾患が重度であると診断する場合、式（１）で求めたインドール−３−カルボアルデヒド及びリノレオイルエタノールアミドの相対面積値の比は、インドール−３−カルボアルデヒド１に対してリノレオイルエタノールアミドが４４．４以上１１４．３以下、５０以上１００以下、又は５７．１以上８８．９以下等であってもよい。
本発明における別の態様において、非アルコール性脂肪性肝疾患が軽度であると診断する場合、式（１）で求めたインドール−３−カルボアルデヒド及びリノレオイルエタノールアミドの相対面積値の比は、インドール−３−カルボアルデヒド１に対してリノレオイルエタノールアミドが１６．７以上４４．４未満、２２．２以上４０以下、又は２２．７以上３６．４以下等であってもよい。

【0041】

本発明における別の態様において、非アルコール性脂肪性肝疾患が重度であると診断する場合、式（１）で求めたインドール−３−カルボアルデヒド及びオレオイルエタノールアミドの相対面積値の比は、インドール−３−カルボアルデヒド１に対してオレオイルエタノールアミドが２２．２以上４２．９以下、２５．０以上３７．５以下、又は２７．８以上３５．７以下等であってもよい。
本発明における別の態様において、非アルコール性脂肪性肝疾患が軽度であると診断する場合、式（１）で求めたインドール−３−カルボアルデヒド及びオレオイルエタノールアミドの相対面積値の比は、インドール−３−カルボアルデヒド１に対してオレオイルエタノールアミドが８．３３以上２２．２未満、１１．１以上２０．０以下、又は１１．４以上１８．２以下等であってもよい。

【0042】

本発明において、診断とは、例えば、対象が前記疾患に罹っていること又は前記状態になっていることを特定、検出、判定するためのデータを収集すること、前記疾患又は前記状態の重症度を特定、検出、判定するためのデータを収集すること等をいう。

【0043】

本発明において、フィーカリバクテリウム属は、例えば、フィーカリバクテリウム プラウスニッツィイ（Faecalibacterium prausnitzii）等が挙げられる。

【0044】

本発明において、フィーカリバクテリウム属の菌の占有率とは、例えば、糞便あたりのフィーカリバクテリウム属の菌の質量、菌数、体積等を示す。さらに、フィーカリバクテリウム属の菌の占有率を測定する方法は、例えば、市販のキット等を用いて測定する方法、検査委託会社等に外注して測定する方法、又は自体公知の方法若しくは公知の方法（当該菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列情報を利用した遺伝子解析方法（定量ＰＣＲ法、末端標識制限酵素断片多型分析、メタゲノム解析等））等により測定してもよい。

【0045】

本発明において、フィーカリバクテリウム属の菌の占有率は、フィーカリバクテリウムのリード数から下記式（２）を用いて算出してもよい。

【数2】

【0046】

本発明において、フィーカリバクテリウムのリード数は、通常、次世代シーケンサーにて分析して出力されるフィーカリバクテリウム由来の遺伝子配列データのことをいい、例えば、次世代シーケンサーを用いてフィーカリバクテリウムのリード数の結果を取得することができる。本発明において、全リード数は、通常、次世代シーケンサーにて分析して出力される全遺伝子配列データのことをいい、例えば、次世代シーケンサーを用いて全リード数の結果を取得することができる。

【0047】

本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患であると診断する場合、式（２）で求めた糞便中のフィーカリバクテリウム属の菌の占有率は、糞便中の１０％以下が好ましく、糞便中の９％以下がより好ましく、糞便中の８％以下がさらに好ましい。

【0048】

本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患が重度であると診断する場合、式（２）で求めた糞便中のフィーカリバクテリウム属の菌の占有率は、６％以下が好ましく、５％以下がより好ましく、４％以下がより好ましく、３％以下がより好ましく、２％以下がさらに好ましい。
本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患が軽度であると診断する場合、式（２）で求めた糞便中のフィーカリバクテリウム属の菌の占有率は、１０％〜６％であることが好ましく、９％〜６％であることがより好ましく、８％〜７％であることがさらに好ましい。

【0049】

本発明における診断方法は、例えば、動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して使用することができる。

【0050】

本発明において、診断用キットは、本発明における診断方法を実施するために用いられ得る。本発明における診断用キットの態様は、上記本発明における診断方法を簡便に実施するために有用であることが好ましい。また、本発明における診断用キットは、ＮＡＦＬＤを発症していない動物又はＮＡＦＬＤを発症している動物から採取した糞便中のピリドキサミン、カルボキシメチルリジン、５−アミノ吉草酸、リノレオイルエタノールアミド、オレオイルエタノールアミド及び／又はインドール−３−カルボアルデヒドの量を測定するための試薬又は機器を含んでなる。さらに本発明における診断用キットは、糞便中のフィーカリバクテリウム属の菌の占有率を測定するための試薬及び／又は機器等を含んでいてもよい。本発明における診断用キットに含まれる試薬は、例えば、ＥＬＩＳＡ実験方法において用いられるピリドキサミン、カルボキシメチルリジン、５−アミノ吉草酸、リノレオイルエタノールアミド、オレオイルエタノールアミド又はインドール−３−カルボアルデヒドに対する抗体等、ＣＥ−ＴＯＦＭＳ，ＬＣ−ＴＯＦＭＳ測定に用いられる試薬等、高速液体クロマトグラフィ（high performance liquid chromatography; HPLC）、薄層クロマトグラフィ（thin-layer chromatography; TLC）測定に用いられる試薬等、フィーカリバクテリウム属の菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列情報を利用した遺伝子解析方法、例えば、定量ＰＣＲ法、末端標識制限酵素断片多型分析（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism; T-RFLP）、メタゲノム解析等による解析方法等に用いられる試薬等が挙げられる。本発明における診断用キットに含まれる機器は、例えば、ＣＥ−ＴＯＦＭＳ本体、ＬＣ−ＴＯＦＭＳ本体、ＨＰＬＣ又はＴＬＣ測定に用いられる器具又は装置等、ＰＣＲ装置、キャピラリー電気泳動装置、シーケンサー等が挙げられる。

【0051】

診断用キットはさらに、使用説明書を含んでいてもよい。使用説明書には、キットに含まれる試薬、機器等の使用方法、測定の手順等が記載されていてもよい。

【0052】

本発明における診断用キットにおける試薬、機器等は、糞便中のピリドキサミン、カルボキシメチルリジン、５−アミノ吉草酸、リノレオイルエタノールアミド、オレオイルエタノールアミド、インドール−３−カルボアルデヒド及び／又はフィーカリバクテリウム属の菌の量を測定するのに適したものを、上記本発明の診断方法に基づいて、それぞれ選択することができる。

【0053】

本発明において、診断用キットには、通常の診断用キットに含まれる試薬、機器等を必要に応じ本発明の効果を損なわない限りにおいて、その構成要素とすることができる。

【実施例】

【0054】

以下、実施例によって本発明を詳述するが、これらの実施例は本発明の一例であり、本発明の技術的範囲はこれらに限定されるものではない。

【0055】

［糞便試料］
健常ボランティア及びＮＡＦＬＤ患者の新鮮糞便を採取後すぐに凍結保存した。

【0056】

［測定］
（16SrRNA遺伝子配列の解析）
凍結保存した糞便検体２０ｍｇを粉砕処理（直径２ｍｍガラスビーズによる物理的破砕）した後、フェノール・クロロホルム抽出方法により腸内細菌由来のゲノムＤＮＡを抽出し、腸内細菌ゲノムＤＮＡから、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の可変領域Ｖ３及びＶ４を含む約４６０ｂｐの領域をＰＣＲにて増幅し、増幅反応後にＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓ（ベックマン コールター社製）を用いて精製した。各ＰＣＲ産物にサンプル固有の塩基配列（インデックス）を付与したプライマーを用いたＩｎｄｅｘ ＰＣＲを行い、各サンプルのＰＣＲ産物にサンプル識別用インデックスを付与した。ＰＣＲ反応後のインデックスを付与したＰＣＲ増幅産物（ライブラリ）は、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓ（ベックマン コールター社製）を用いて精製し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解した。
ライブラリの定量は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ ｄｓ ＤＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて行った。詳細には、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で５００倍希釈したライブラリをＰｉｃｏＧｒｅｅｎと反応させて、その蛍光強度を蛍光プレートリーダー（テカンジャパン社製）を用いて測定した。４ｎＭに希釈したライブラリ及び４ｎＭ ＰｈｉＸ ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡ（イルミナ株式会社製）を０．２Ｎ ＮａＯＨを用いて変性させた。変性させたライブラリを１０ｐＭに希釈し、そこへ１０ｐＭに希釈したＰｈｉＸを終濃度１２．５％になるように添加したものを、次世代シークエンサーＭｉｓｅｑ（イルミナ株式会社製）にて分析し、健常者及びＮＡＦＬＤ患者の腸内菌叢解析用の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列解析データを得た。

【0057】

（生物学的情報解析；Faecalibacterium）
・菌叢組成解析
Ｍｉｓｅｑから出力された配列データ（リード；Ｒｅａｄ）について、CLC Genomics Workbench（CLC bio）を用いて、配列の解析精度（ＱＣ）＞３０のリードのみを抽出し、さらに精度の低い配列末端のトリミング後に、ペアリードを合体（merge）させて得られた配列データを入手した。１６Ｓ ｒＲＮＡデータベースへの相同性検索を、local_RDP_classifier（World fusion）及びMetagenome@KIN（World fusion）を用いて行い菌属同定を行った。なお、RDP_classifierの菌属同定の際には、同定信頼度（Confidence value）が０．５以上となったリードのみを採用した。
各検体間の腸内菌叢プロファイルの非類似度（bray-curtis distance）の算出と主座標分析（PCoA解析）は、統計解析ソフトRを用いて行った。

【0058】

（腸内代謝物の測定）
凍結保存した糞便検体５０ｍｇに対して超純水４５０μＬ（糞便：超純水＝１：９となる比率）にてイオン性物質を抽出し、限外濾過フィルター（分画サイズ：５ｋＤａ、ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社製、型番：ＵＦＣ３ＬＣＣＮＢ−ＨＭＴ）を用いて限外濾過したろ液をキャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ（capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry））により測定した。ＣＥ−ＴＯＦＭＳでの測定は、カチオンモード及びアニオンモードで行った。また、凍結保存した糞便検体５０ｍｇに対してエタノール４５０μＬ（糞便：エタノール＝１：９となる比率）にて脂溶性物質を抽出し、限外濾過フィルター（分画サイズ：５ｋＤａ、ヒューマン メタボローム テクノロジー社製、型番：ＵＦＣ３ＬＣＣＮＢ−ＨＭＴ）を用いて限外濾過したろ液を液体クロマトグラフィ−飛行時間型質量分析計（ＬＣ−ＴＯＦＭＳ（liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry））により測定した。ＬＣ−ＴＯＦＭＳでの測定は、ポジティブモード及びネガティブモードで行った。なお、上記測定は、ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社に委託した。

【0059】

ＣＥ−ＴＯＦＭＳ又はＬＣ−ＴＯＦＭＳによる測定条件を以下に示す。
（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ（カチオンモード）の測定条件）
キャピラリー（Capillary）:Fused silica capillary i.d. 50μm×80 cm
泳動バッファー（Run buffer）: Cation Buffer Solution (p/n: H3301-1001)
洗浄バッファー（Rinse buffer）: Cation Buffer Solution (p/n: H3301-1001)
サンプルインジェクション（Sample injection）: Pressure injection 50 mbar, 10 sec.
ＣＥ電圧（CE voltage）: Positive, 27 kV
ＭＳイオン化（MS ionization）: ESI Positive
ＭＳキャピラリー電圧（MS capillary voltage）: 4000 V
シース液（Sheath liquid）: HMT Sheath Liquid (p/n: H3301-1020)

【0060】

（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ（アニオンモード）の測定条件）
キャピラリー（Capillary）:Fused silica capillary i.d. 50μm×80 cm
泳動バッファー（Run buffer）: Anion Buffer Solution (p/n: H3302-1021)
洗浄バッファー（Rinse buffer）: Anion Buffer Solution (p/n: H3302-1021)
サンプルインジェクション（Sample injection）: Pressure injection 50 mbar, 25 sec.
ＣＥ電圧（CE voltage）: Positive, 30 kV
ＭＳイオン化（MS ionization）: ESI Negative
ＭＳキャピラリー電圧（MS capillary voltage）: 3500 V
シース液（Sheath liquid）: HMT Sheath Liquid(p/n: H3301-1020)

【0061】

（ＬＣ−ＴＯＦＭＳ（ポジティブモード）の測定条件）
カラム（Column）: ODS column, 2×50 mm, 2μm
カラム温度（Column temp）: 40℃
移動相Ａ（Mobile phase A）: H₂O/0.1%HCOOH
移動相Ｂ（Mobile phase B）: Isopropanol:Acetonitrile:H₂O(65:30:5)/0.1%HCOOH, 2 mM HCOONH₄
流速（Flow rate）: 0.3 mL/min
実行時間（Run time）: 20 min
ポスト時間（Post time）: 7.5 min
グラジエント条件（Gradient condition）: 0-0.5 min: B 1%, 0.5-13.5 min: B 1-100%, 13.5-20 min: B 100%
ＭＳイオン化モード（MS ionization mode）: ESI Positive
ＭＳネビュライザー圧力（MS Nebulizer pressure）: 40 psi
ＭＳドライガス流量（MS dry gas flow）: 10 L/min
ＭＳキャピラリー電圧（MS capillary voltage）: 3500 V

【0062】

（ＬＣ−ＴＯＦＭＳ（ネガティブモード）の測定条件）
カラム（Column）: ODS column, 2×50 mm, 2μm
カラム温度（Column temp）: 40℃
移動相Ａ（Mobile phase A）: H₂O/0.1%HCOOH
移動相Ｂ（Mobile phase B）: Isopropanol:Acetonitrile:H₂O(65:30:5)/0.1%HCOOH, 2 mM HCOONH₄
流速（Flow rate）: 0.3 mL/min
実行時間（Run time）: 20 min
ポスト時間（Post time）: 7.5 min
グラジエント条件（Gradient condition）: 0-0.5 min: B 1%, 0.5-13.5 min: B 1-100%, 13.5-20 min: B 100%
ＭＳイオン化モード（MS ionization mode）: ESI Negative
ＭＳネビュライザー圧力（MS Nebulizer pressure）: 40 psi
ＭＳドライガス流量（MS dry gas flow）: 10 L/min
ＭＳキャピラリー電圧（MS capillary voltage）: 3500 V

【0063】

（ＮＡＦＬＤ特徴的腸内バイオマーカーの探索）
フィーカリバクテリウムと腸内代謝物との相関性について、スピアマン（spearman）相関係数が−０．５以下若しくは０．５以上の関係を相関性ありと判定した。なお、測定下限値以下（n.d.）であった検体の測定値を０として計算を行った。
軽度ＮＡＦＬＤ患者と重度ＮＡＦＬＤ患者間で統計的有意差があり、２種類の特徴的変数予測計算（LEfSe（Linear discriminant analysis（LDA）effect size）法及びRandom Forest法）のいずれにおいても特徴度が高く（いずれの計算でも特徴的変数と予測され）、かつフィーカリバクテリウムとの相関性の強い（スピアマン相関係数の絶対値＞０．４５）代謝物を特徴的変化を示した物質として判定した。LEfSe法では、効果量（LDA score）が２．５以上の代謝物をＮＡＦＬＤの重症度に応じた特徴的代謝物と判定し、ランダムフォレスト（Random Forest）法では特徴量（Gini係数）が０．２以上となる代謝物を採用した。

【0064】

（統計解析）
群間比較にはWelch’s t-test若しくはMann-Whitney U testを用い、Benjamini-Hochberg法にて多重検定補正を行った。他群検定にはKruskal wallis検定若しくはSteel-Dwass検定を用いた。

【0065】

［結果］
（腸内菌叢の比較）
PCoA解析の結果、ＮＡＦＬＤの症状の悪化とともに腸内菌叢が変化することが明らかとなった（図１）。そして、ＮＡＦＬＤの症状が軽度から重度に移行するにしたがって、糞便中におけるフィーカリバクテリウムの占有率が減少することが判明した（図２）。

【0066】

（腸内代謝物プロファイルの比較）
健常者、軽症及び重症ＮＡＦＬＤ患者の代謝物プロファイルをもとに主成分分析を行った結果、健常者と重症ＮＡＦＬＤ患者の代謝物プロファイルは異なるクラスターを形成することが確認された（図３）。また、軽症ＮＡＦＬＤ患者の代謝物プロファイルによるクラスターは健常者と重症ＮＡＦＬＤ患者のどちらにも分布する傾向が認められた（図３）。これは、各群の腸内菌叢プロファイルに関するPCoA解析においても同様の傾向が認められており（図１）、このことから腸内菌叢の変化と腸内代謝物の変化が相関することが確認された。
本主成分分析において、各群の検体分布は、x軸方向に沿って遷移している傾向が強く認められた。したがってＮＡＦＬＤでない状態から、軽度のＮＡＦＬＤへ、そして重度のＮＡＦＬＤへの病態進行には、第一主成分（PC1、x軸方向）における影響力の強い、すなわちPC1への因子負荷量の大きい代謝物が関わっている可能性が考えられる。

【0067】

（フィーカリバクテリウムとメタボロームデータの相関解析）
メタボローム解析で測定された代謝物の主成分分析のPC1における因子負荷量が上位であった代謝物の中でピリドキサミン及び５−アミノ吉草酸が、フィーカリバクテリウムの占有率と相関性があることが確認された（図４及び５）。代謝物の中でもピリドキサミンはフィーカリバクテリウムとの相関が最も高く、かつRandom forest法にて健常者と重度ＮＡＦＬＤ患者間で最も特徴量が高かった（データ示さず）。したがって、ピリドキサミン及び５−アミノ吉草酸がＮＡＦＬＤ病態やその進展を判断するためのマーカーとして有用であることが確認された。なお、図４及び５のＹ軸については、Relative area（相対面積）=（目的ピークの面積値）÷（内部標準物質の面積値×試料量）を用いて算出した。

【0068】

（軽症ＮＡＦＬＤ患者と重症ＮＡＦＬＤ患者間で特徴的な代謝物の抽出）
軽度ＮＡＦＬＤ患者と重度ＮＡＦＬＤ患者の腸内代謝物の比較を行い、LEfSe法とRandom forest法を用いて軽症ＮＡＦＬＤ患者と重症患者で特徴的に変化の認められる代謝物の抽出を行い、さらにフィーカリバクテリウムとの相関性の検証を行った。その結果、ウラシル、カルボキシメチルリジン、リノレオイルエタノールアミド、オレオイルエタノールアミド及びインドール−３−カルボアルデヒドが候補として挙げられた（図６、７、８及び９）。なお、オレオイルエタノールアミドを候補として選抜する際に、オレオイルエタノールアミドの他に２種類の化合物が候補化合物として挙げられた。代謝物の抽出工程において、オレオイルエタノールアミド及びその他の２種類の候補化合物のうち、オレオイルエタノールアミドの検出頻度が最も高かったので、これを候補化合物として選抜した。なお、オレオイルエタノールアミドは、抽出したピークの質量電荷比及び泳動時間の値に基づき挙げられた３つの候補化合物のうち、それらの値が小さい順に２つ目の候補化合物として得られたので、オレオイルエタノールアミド−２とも表記され得る。ウラシルは普遍的に存在する可能性が高いためＮＡＦＬＤ特異的な変化ではない可能性が考えられるが、カルボキシメチルリジン、リノレオイルエタノールアミド、オレオイルエタノールアミド及びインドール−３−カルボアルデヒドはＮＡＦＬＤの軽度から重度への病態及び症状進展（ＮＡＦＬＤにおける繊維化の進行）を判断するためのマーカーとして有用であることが確認された。なお、図６、７、８及び９のＹ軸については、Relative area（相対面積）=（目的ピークの面積値）÷（内部標準物質の面積値×試料量）から算出した。
なお、エチルアセチミデート、ホモアルゲニン、及びベトニシンは、ＮＡＦＬＤのバイオマーカーとして不適であることを確認した。

【産業上の利用可能性】

【0069】

本発明の診断方法は、非アルコール性脂肪性肝疾患の有無、又は非アルコール性脂肪性肝疾患の重症度を簡便に、効率的に、又は非侵襲的に診断できる点で非常に有用である。さらに本発明の診断方法を利用した診断用キットを使用することにより、難しい操作を必要としないので、専門技術を要さなくとも非アルコール性脂肪性肝疾患の有無、又は非アルコール性脂肪性肝疾患の重症度を簡便に、効率的に、又は非侵襲的に診断できる点で非常に有用である。さらに本発明の診断方法における糞便中のピリドキサミン、カルボキシメチルリジン、５−アミノ吉草酸、リノレオイルエタノールアミド、オレオイルエタノールアミド、インドール−３−カルボアルデヒド等の含有量及びフィーカリバクテリウム属の菌の占有率は、軽症ＮＡＦＬＤ患者及び重症ＮＡＦＬＤ患者間で最も特徴量が高いことにより、診断基準における信頼度が非常に高い点でも、非アルコール性脂肪性肝疾患の重症度を診断するのに非常に有用である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】