特許 6800984 軟骨傷害の検出及び処置のためのマイクロ並びにナノデバイス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6800984

(24)【登録日】2020年11月27日

(45)【発行日】2020年12月16日

(54)【発明の名称】軟骨傷害の検出及び処置のためのマイクロ並びにナノデバイス

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/36 20060101AFI20201207BHJP

   A61K 47/61 20170101ALI20201207BHJP

   A61K 31/728 20060101ALI20201207BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20201207BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20201207BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20201207BHJP

   A61K 51/06 20060101ALI20201207BHJP

   A61L 27/54 20060101ALI20201207BHJP

   A61L 27/20 20060101ALI20201207BHJP

   A61L 27/44 20060101ALI20201207BHJP

【ＦＩ】

   A61K47/36

   A61K47/61

   A61K31/728

   A61K31/519

   A61P19/02

   A61K49/00

   A61K51/06 100

   A61K51/06 200

   A61L27/54

   A61L27/20

   A61L27/44

【請求項の数】14

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2018-536714(P2018-536714)

(86)(22)【出願日】2016年10月5日

(65)【公表番号】特表2018-530607(P2018-530607A)

(43)【公表日】2018年10月18日

(86)【国際出願番号】US2016055552

(87)【国際公開番号】WO2017062493

(87)【国際公開日】20170413

【審査請求日】2018年6月29日

(31)【優先権主張番号】62/237,217

(32)【優先日】2015年10月5日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500039463

【氏名又は名称】ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム

(73)【特許権者】

【識別番号】518115023

【氏名又は名称】ボレリ ジョセフ

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100102255

【弁理士】

【氏名又は名称】小澤 誠次

(74)【代理人】

【識別番号】100096482

【弁理士】

【氏名又は名称】東海 裕作

(74)【代理人】

【識別番号】100188352

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 一弘

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(74)【代理人】

【識別番号】100150902

【弁理士】

【氏名又は名称】山内 正子

(74)【代理人】

【識別番号】100141391

【弁理士】

【氏名又は名称】園元 修一

(74)【代理人】

【識別番号】100198074

【弁理士】

【氏名又は名称】山村 昭裕

(74)【代理人】

【識別番号】100145920

【弁理士】

【氏名又は名称】森川 聡

(74)【代理人】

【識別番号】100096013

【弁理士】

【氏名又は名称】富田 博行

(72)【発明者】

【氏名】ボレリ ジョセフ

(72)【発明者】

【氏名】タン リピン

(72)【発明者】

【氏名】ゾウ ジュン

【審査官】 菊池 美香

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１１−５０６７３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−２３１４０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／０２７８５４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００７−５１７００１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５４４６９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−２３１４０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 J Biomed Mater Res, 2010, 94A, p.355-370

【文献】 ARTHRITIS & RHEUMATISM, 2002, Vol.46, No.7, pp.1947-1955

【文献】 J Biomed Mater Res Part A: 2015, 103A, p.371-383

【文献】 Clin Rheumatol, 2009, Vol.21, p.20-31

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ４７／３６

Ａ６１Ｋ ３１／５１９

Ａ６１Ｋ ３１／７２８

Ａ６１Ｋ ４７／６１

Ａ６１Ｋ ４９／００

Ａ６１Ｋ ５１／０６

Ａ６１Ｌ ２７／２０

Ａ６１Ｌ ２７／４４

Ａ６１Ｌ ２７／５４

Ａ６１Ｐ １９／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

損傷／傷害軟骨標的用プローブを含む、関節炎軟骨を標的とする及び／又は処置するための医薬であって、
前記損傷／傷害軟骨標的用プローブが、
ビニルスルホン架橋剤によって架橋されて架橋バイオポリマーを形成する生体適合性ヒアルロン酸ポリマーであって、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマーが、１０Ｋ〜１．５Ｍの分子量を有し、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマーと前記ビニルスルホン架橋剤とのモル比が、４：１〜１：４の間であり、前記架橋バイオポリマーが、内部移行を調節するために１５０超〜５００ｎｍの直径を有する、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマー；
前記架橋バイオポリマーと接触するリガンドであって、ＣＤ４４受容体と相互作用するヒアルロン酸、葉酸受容体と相互作用する葉酸、又は両方である、前記リガンド；並びに
前記ビニルスルホン架橋剤、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマー、前記リガンド、又はそれらの組合せと接触する、蛍光色素、放射性タグ、金属、ナノ粒子、又はそれらの組合せである、検出可能なタグ；
を含む、前記医薬。

【請求項2】

損傷／傷害軟骨標的用プローブが、
ビニルスルホン架橋剤によって架橋されて架橋バイオポリマーを形成する生体適合性ヒアルロン酸ポリマーであって、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマーが、１０Ｋ〜１．５Ｍの分子量を有し、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマーと前記ビニルスルホン架橋剤とのモル比が、４：１〜１：４の間であり、前記架橋バイオポリマーが、内部移行を調節するために１５０超〜５００ｎｍの直径を有する、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマー；
前記架橋バイオポリマーと接触するリガンドであって、１又は２以上の細胞表面標的と相互作用し、ＣＤ４４受容体と相互作用するヒアルロン酸、葉酸受容体と相互作用する葉酸、又は両方である、前記リガンド；並びに
前記ビニルスルホン架橋剤、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマー、前記リガンド、又はそれらの組合せと接触する、蛍光色素、放射性タグ、金属、ナノ粒子、又はそれらの組合せである、検出可能なタグ；
を含む、請求項１に記載の医薬。

【請求項3】

以下のステップを含む方法において使用される、請求項１又は２に記載の医薬。
ビニルスルホン架橋剤によって架橋されて架橋バイオポリマーを形成する生体適合性ヒアルロン酸ポリマーを含む損傷／傷害軟骨標的用プローブを用意するステップであって、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマーが、１０Ｋ〜１．５Ｍの分子量を有し、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマーと前記ビニルスルホン架橋剤とのモル比が、４：１〜１：４の間であり、前記架橋バイオポリマーが、内部移行を調節するために１５０超〜５００ｎｍの直径を有し、かつ、前記架橋バイオポリマーと接触するリガンドであって、１又は２以上の細胞表面標的と相互作用し、ＣＤ４４受容体と相互作用するヒアルロン酸、葉酸受容体と相互作用する葉酸、又は両方である前記リガンド；並びに、前記ビニルスルホン架橋剤、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマー、前記リガンド、又はそれらの組合せと接触する、蛍光色素、放射性タグ、金属、ナノ粒子、又はそれらの組合せである、検出可能なタグ；を有する、前記ステップ；
損傷していることが疑われる軟骨を前記損傷／傷害軟骨標的用プローブと接触させるステップ；並びに
前記損傷／傷害軟骨を検出するステップ；

【請求項4】

損傷／傷害軟骨標的用プローブが、
ビニルスルホン架橋剤によって架橋されて架橋バイオポリマーを形成する生体適合性ヒアルロン酸ポリマーであって、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマーが、１０Ｋ〜１．５Ｍの分子量を有し、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマーと前記ビニルスルホン架橋剤とのモル比が、４：１〜１：４の間であり、前記架橋バイオポリマーが、内部移行を調節するために１５０超〜５００ｎｍの直径を有する、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマー；
前記架橋バイオポリマーと接触するリガンドであって、１又は２以上の細胞表面標的と相互作用し、ＣＤ４４受容体と相互作用するヒアルロン酸、葉酸受容体と相互作用する葉酸、又は両方である前記リガンド；
ＣＣＬ２、ＳＤＦ、エリスロポエチン、ＶＥＧＦ及びＣＣＬ１６から選択され、前記損傷／傷害軟骨標的用プローブに結合する、１又は２以上のケモカインであって、骨髄ストローマ細胞を動員するために放出される、前記１又は２以上のケモカイン；並びに
前記ビニルスルホン架橋剤、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマー、前記リガンド、又はそれらの組合せと接触する、蛍光色素、放射性タグ、金属、ナノ粒子、又はそれらの組合せである、検出可能なタグ；
を含む、損傷／傷害軟骨に骨髄ストローマ細胞を動員するための請求項１〜３のいずれかに記載の医薬。

【請求項5】

損傷／傷害軟骨標的用プローブが、
ビニルスルホン架橋剤によって架橋されて架橋バイオポリマーを形成する生体適合性ヒアルロン酸ポリマーであって、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマーが、１０Ｋ〜１．５Ｍの分子量を有し、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマーと前記ビニルスルホン架橋剤とのモル比が、４：１〜１：４の間であり、前記架橋バイオポリマーが、内部移行を調節するために１５０超〜５００ｎｍの直径を有する、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマー；
前記架橋バイオポリマーと接触するリガンドであって、１又は２以上の細胞表面標的と相互作用し、ＣＤ４４受容体と相互作用するヒアルロン酸、葉酸受容体と相互作用する葉酸、又は両方である前記リガンド；
ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３から選択され、前記損傷／傷害軟骨標的用プローブに結合する、１又は２以上のＴＧＦ活性薬剤であって、より高い軟骨細胞への分化を惹起するために放出される、前記１又は２以上のＴＧＦ活性薬剤；並びに
前記ビニルスルホン架橋剤、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマー、前記リガンド、又はそれらの組合せと接触する、蛍光色素、放射性タグ、金属、ナノ粒子、又はそれらの組合せである、検出可能なタグ；
を含む、軟骨細胞への分化を増加させるための請求項１〜４のいずれかに記載の医薬。

【請求項6】

損傷／傷害軟骨が、機械的な外傷、物理的な外傷、圧迫性外傷、関節炎性損傷、炎症性損傷、又はそれらの組合せに由来する、請求項２〜５のいずれかに記載の医薬。

【請求項7】

損傷／傷害軟骨標的用プローブの分子量が、１０Ｋ、６０Ｋ、７００ｋ、又は１．５Ｍである、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬。

【請求項8】

損傷／傷害軟骨標的用プローブのモル比が、１：４、１：３、１：２、１：１、１：３．９、１：３．５、１：２．３、４：１、３：１、又は２：１である、請求項１〜７のいずれかに記載の医薬。

【請求項9】

損傷／傷害軟骨標的用プローブが、生分解性である、請求項１〜８のいずれかに記載の医薬。

【請求項10】

１若しくは２以上のケモカイン又は１若しくは２以上のＴＧＦ活性薬剤が、架橋バイオポリマーに結合している、放出可能に結合している、架橋バイオポリマー中に配置している、架橋バイオポリマー上にスプレー被覆されている、又はそれらの組合せである、請求項４又は５に記載の医薬。

【請求項11】

架橋バイオポリマーが１又は２以上の孔を含み、前記１又は２以上の孔に、１若しくは２以上のケモカイン又は１若しくは２以上のＴＧＦ活性薬剤が、時間と共に持続放出するように配置されており、前記１又は２以上の孔が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９ｎｍ、又は１ｎｍ未満の直径、若しくは２９ｎｍを超える直径を有する、請求項４又は５に記載の医薬。

【請求項12】

損傷／傷害軟骨標的用プローブが、１５分未満で１又は２以上の標的と接触して、１５分以内での迅速な検出を可能にする、請求項１〜１１のいずれかに記載の医薬。

【請求項13】

損傷／傷害軟骨標的用プローブが、
ビニルスルホン架橋剤によって架橋されて架橋バイオポリマーを形成する生体適合性ヒアルロン酸ポリマーであって、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマーが、１０Ｋ〜１．５Ｍの分子量を有し、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマーと前記ビニルスルホン架橋剤とのモル比が、４：１〜１：４の間であり、前記架橋バイオポリマーが、内部移行を調節するために１５０超〜５００ｎｍの直径を有する、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマー；
前記架橋バイオポリマーと接触するリガンドであって、ＣＤ４４受容体と相互作用するヒアルロン酸、葉酸受容体と相互作用する葉酸、又は両方である、前記リガンド；並びに
前記ビニルスルホン架橋剤、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマー、前記リガンド、又はそれらの組合せと接触する、検出可能なタグであって、前記損傷／傷害軟骨で検出することができ、前記損傷／傷害軟骨の画像を生成するために使用することができる、蛍光色素、放射性タグ、金属、ナノ粒子、又はそれらの組合せである、前記検出可能なタグ；
を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬。

【請求項14】

損傷／傷害軟骨標的用プローブが、
損傷／傷害軟骨を識別するための軟骨損傷イメージングプローブであって、前記軟骨損傷イメージングプローブが、ビニルスルホン架橋剤によって架橋されて架橋バイオポリマーを形成する生体適合性ヒアルロン酸ポリマーを含み、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマーが、１０Ｋ〜１．５Ｍの分子量を有し、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマーと前記ビニルスルホン架橋剤とのモル比が、４：１〜１：４の間であり、前記架橋バイオポリマーが、内部移行を調節するために１５０超〜５００ｎｍの直径を有し、前記架橋バイオポリマーと接触するリガンドであって、ＣＤ４４受容体と相互作用するヒアルロン酸、葉酸受容体と相互作用する葉酸、又は両方である、前記リガンド；並びに前記ビニルスルホン架橋剤、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマー、前記リガンド、又はそれらの組合せと接触する、検出可能なタグであって、損傷／傷害軟骨で検出することができ、前記損傷／傷害軟骨の画像を生成するために使用することができる、蛍光色素、放射性タグ、金属、ナノ粒子、又はそれらの組合せである、前記検出可能なタグ；を有する、前記軟骨損傷イメージングプローブ；並びに
前記損傷／傷害軟骨に骨髄ストローマ細胞を動員することによって損傷／傷害軟骨を処置する医薬として使用するための軟骨標的用プローブであって、前記軟骨標的用プローブが、ビニルスルホン架橋剤によって架橋されて架橋バイオポリマーを形成する生体適合性ヒアルロン酸ポリマーを含み、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマーが、１０Ｋ〜１．５Ｍの分子量を有し、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマーと前記ビニルスルホン架橋剤とのモル比が、４：１〜１：４の間であり、前記架橋バイオポリマーが、内部移行を調節するために１５０超〜５００ｎｍの直径を有し、かつ、前記架橋バイオポリマーと接触するリガンドであって、１又は２以上の細胞表面標的と相互作用し、ＣＤ４４受容体と相互作用するヒアルロン酸、葉酸受容体と相互作用する葉酸、又は両方である前記リガンド；ＣＣＬ２、ＳＤＦ、エリスロポエチン、ＶＥＧＦ及びＣＣＬ１６から選択され、前記損傷／傷害軟骨標的用プローブに結合する、１又は２以上のケモカインであって、骨髄ストローマ細胞を動員するために放出される、前記１又は２以上のケモカイン；を有し、かつ、任意で、前記ビニルスルホン架橋剤、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマー、前記リガンド、又はそれらの組合せと接触する第２の検出可能なタグを有する、前記軟骨標的用プローブ；
を含み、かつ
任意で、軟骨細胞への分化を増加させることによって前記損傷／傷害軟骨を処置する医薬として使用するための軟骨分化プローブを含み、前記軟骨分化プローブが、ビニルスルホン架橋剤によって架橋されて架橋バイオポリマーを形成する生体適合性ヒアルロン酸ポリマーを含み、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマーが、１０Ｋ〜１．５Ｍの分子量を有し、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマーと前記ビニルスルホン架橋剤とのモル比が、４：１〜１：４の間であり、前記架橋バイオポリマーが、内部移行を調節するために１５０超〜５００ｎｍの直径を有し、かつ、前記架橋バイオポリマーと接触するリガンドであって、１又は２以上の細胞表面標的と相互作用し、ＣＤ４４受容体と相互作用するヒアルロン酸、葉酸受容体と相互作用する葉酸、又は両方である前記リガンド；ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３から選択され、損傷／傷害軟骨標的用プローブに結合する、１又は２以上のＴＧＦ活性薬剤であって、より高い軟骨細胞への分化を惹起するために放出される、前記１又は２以上のＴＧＦ活性薬剤；並びに、前記ビニルスルホン架橋剤、前記生体適合性ヒアルロン酸ポリマー、前記リガンド、又はそれらの組合せと接触する、第３の検出可能なタグを有する、請求項１〜１３のいずれかに記載の医薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、傷害軟骨の検出及び処置のためのマイクロスキャフォールドの開発に関する。本発明者らの発明は、（１）活性化された／傷害を受けた細胞を標的とすることによって傷害軟骨を診断することができる、並びに（２）自己の幹細胞及び軟骨細胞応答（動員及び軟骨再生）を促進するため、生体分子を放出することによって傷害軟骨を修復することができる、マイクロ又はナノサイズのスキャフォールドの設計に基づく。

【背景技術】

【0002】

本発明の範囲を限定することなく、その背景は、傷害軟骨の検出及び処置のためのマイクロスキャフォールドの開発のための組成物及び方法に関連して記載される。

【0003】

スキャフォールドは、針注射を介して投与することができ、生体分子を放出する能力も有する、生分解性材料から作製される。細胞標的化に関しては、スキャフォールドが、活性化された／傷害を受けた／又はアポトーシス性の細胞に特有のリガンドを含有する。これらのリガンドには、ＣＤ４４受容体（活性化軟骨細胞上で上方制御される）に対するヒアルロン酸、活性化マクロファージに対する葉酸が含まれる。リガンドは、スキャフォールドの一部であってもよく、又はスキャフォールド上及び内側に被覆することもできる。

【0004】

幹細胞応答を促進するための生体分子には、エリスロポエチン、間質由来因子が含まれる。生体分子は、物理吸着又は化学的なコンジュゲーションを介してスキャフォールド担体に負荷することができる。

【発明の概要】

【0005】

外傷後骨関節炎（ＰＴＯＡ，Post-traumatic osteoarthritis）は、関節炎の最も一般的な形態の１つである。ＰＴＯＡは、関節軟骨傷害の結果であると信じられている。Ｘ線及びＭＲＩは、損傷軟骨において生じる解剖学的な変化を検査するために従来使用されてきた。残念ながら、早期の軟骨傷害を、特に細胞レベルで検出する方法は、存在しない。以前の研究により、ＰＴＯＡにおける軟骨細胞アポトーシスとプロテオグリカン欠乏の間に良好な関係性が存在することが示されている。

【0006】

関節炎は、炎症を特徴とする関節障害である。多くのタイプの関節炎が存在する。関節炎のタイプは、軟骨の摩耗及び断裂に関わるものから過敏性免疫応答から生じる炎症に関連するものまでにわたる。

【0007】

関節炎に関する標準的な処置は、減量、衝撃度の低い運動及び関節の周囲の筋肉の強化、並びに経口非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ，non-steroidal anti-inflammatory drug）で開始される。ＮＳＡＩＤ及びステロイドの慢性的使用にしばしば伴う全身合併症を減少させるために、コルチゾン又は滑りやすいポリマー（Hylamers）を関節内に注射する。それらが不快感及び多くの症状を減少させることに有効であるにもかかわらず、これらの薬理学的な処置は、関節炎の自然経過を変更させる上で無効である。これらの処置の失敗は、典型的には、擦り切れた関節表面の壊死組織切除、再構築及び人工的なインプラントでの置換が関与する手術を必要とする。薬理学的なアプローチと同様に、従来の外科療法は、軟骨関節の完全な機能を回復できない。加えて、関節補綴物は、天然組織との一体化が不十分であり、異物応答を誘発し、寿命が限られるため、１０〜１５年毎に外科的な介入が何回も必要となる恐れがある。有効で永続的な治療がないことから、関節の治癒を改善することができるが、炎症性応答は減少させる、新しい治療アプローチが必要とされる。本発明は、関節炎に関する永続的な治癒としてデザインされる。

【0008】

本発明は、損傷軟骨をイメージングするためのターゲティングプローブを提供する。ターゲティングプローブは、傷害を受けた組織を標的とし、次に健常組織から傷害を受けた組織への周囲の軟骨細胞の移動を惹起するケモカインを放出させることができる。ターゲティングプローブは、傷害を受けた組織を標的とし、次に滑膜幹細胞を動員するケモカインを放出させることができる。幹細胞は次に軟骨細胞に分化され、これが次に軟骨再生に関与する。いくつかの実施形態において、特許請求された発明は、これらの機能の３種全てを行ってもよく、他方、他の実施形態において、特許請求された発明は、これらの機能を全てで１又は２種行ってもよい。

【0009】

本発明は、ビニルスルホンによって架橋されて架橋バイオポリマーを形成する生体適合性ヒアルロン酸ポリマーであって、１０Ｋ〜１．５Ｍの分子量を有し、生体適合性ＨＡポリマー：ビニルスルホンの架橋比が４：１〜１：４の間であり、架橋バイオポリマーが内部移行を調節するために約２００ｎｍを超える直径を有する、生体適合性ヒアルロン酸ポリマー；架橋バイオポリマーと接触するリガンドであって、ＣＤ４４受容体と相互作用するヒアルロン酸、葉酸受容体と相互作用する葉酸又は両方である、リガンド；並びに架橋剤、第１の生体適合性ポリマー、リガンド又はそれらの組合せと接触する検出可能なタグを含む、関節炎軟骨を標的とする及び／又は処置する医薬として使用するための関節炎軟骨標的用プローブを提供する。

【0010】

本発明は、ビニルスルホンによって架橋されて架橋バイオポリマーを形成する生体適合性ヒアルロン酸ポリマーであって、１０Ｋ〜１．５Ｍの分子量を有し、生体適合性ＨＡポリマー：ビニルスルホンの架橋比が４：１〜１：４の間であり、架橋バイオポリマーが内部移行を調節するために約２００ｎｍを超える直径を有する、生体適合性ヒアルロン酸ポリマー；架橋バイオポリマーと接触するリガンドであって、１又は２以上の細胞表面標的と相互作用する、リガンド；並びに架橋剤、第１の生体適合性ポリマー、リガンド又はそれらの組合せと接触する検出可能なタグを含む、損傷軟骨を標的とする及び／又は処置する医薬として使用するための損傷軟骨標的用プローブを提供する。

【0011】

本発明は、ビニルスルホン架橋剤によって架橋されて架橋バイオポリマーを形成する生体適合性ヒアルロン酸ポリマーであって、１０Ｋ〜１．５Ｍの分子量を有し、生体適合性ポリマー：架橋剤の架橋比が４：１〜１：４の間であり、架橋バイオポリマーが内部移行を調節するために約２００ｎｍを超える直径を有する、生体適合性ヒアルロン酸ポリマー；架橋バイオポリマーと接触するリガンドであって、１又は２以上の細胞表面標的と相互作用する、リガンド；並びに架橋剤、第１の生体適合性ポリマー、リガンド又はそれらの組合せと接触する検出可能なタグを含む、損傷軟骨標的用プローブを用意するステップ；損傷されていることが疑われる軟骨を損傷軟骨標的用プローブと接触させるステップ；並びに損傷軟骨標的用プローブを検出するステップを含む、損傷軟骨を識別するための損傷軟骨標的用プローブの使用を提供する。

【0012】

本発明は、ビニルスルホン架橋剤によって架橋されて架橋バイオポリマーを形成する生体適合性ヒアルロン酸ポリマーであって、１０Ｋ〜１．５Ｍの分子量を有し、生体適合性ポリマー：架橋剤の架橋比が４：１〜１：４の間であり、架橋バイオポリマーは内部移行を調節するために約２００ｎｍを超える直径を有する、生体適合性ヒアルロン酸ポリマー；架橋バイオポリマーと接触するリガンドであって、１又は２以上の細胞表面標的と相互作用する、リガンド；ＳＤＦ１、ＳＤＦ１β、Ｅｐｏ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１６、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３から選択され、ポリマーターゲティングプローブに結合する、１又は２以上のケモカインであって、幹細胞、軟骨細胞又は両方を動員するため放出される、１又は２以上のケモカイン；並びに架橋剤、第１の生体適合性ポリマー、リガンド又はそれらの組合せと接触する検出可能なタグを含む、損傷軟骨に幹細胞、軟骨細胞又は両方を動員することによって損傷軟骨を処置する医薬として使用するための軟骨標的用プローブを提供する。

【0013】

本発明は、ビニルスルホン架橋剤によって架橋されて架橋バイオポリマーを形成する生体適合性ヒアルロン酸ポリマーであって、１０Ｋ〜１．５Ｍの分子量を有し、生体適合性ポリマー：架橋剤の架橋比が４：１〜１：４の間であり、架橋バイオポリマーが内部移行を調節するために約２００ｎｍを超える直径を有する、生体適合性ヒアルロン酸ポリマー；架橋バイオポリマーと接触するリガンドであって、１又は２以上の細胞表面標的と相互作用する、リガンド；ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３から選択され、ポリマーターゲティングプローブに結合する、１又は２以上のＴＧＦ活性薬剤であって、より高い軟骨細胞への分化を惹起するために放出される、１又は２以上のＴＧＦ活性薬剤；並びに架橋剤、第１の生体適合性ポリマー、リガンド又はそれらの組合せと接触する検出可能なタグを含む、軟骨細胞への分化を増加させることによって損傷軟骨を処置する医薬として使用するための軟骨標的用プローブを提供する。

【0014】

本発明は、ビニルスルホン架橋剤によって架橋されて架橋バイオポリマーを形成する生体適合性ヒアルロン酸ポリマーであって、１０Ｋ〜１．５Ｍの分子量を有し、生体適合性ポリマー：架橋剤の架橋比が４：１〜１：４の間であり、架橋バイオポリマーが内部移行を調節するために約２００ｎｍを超える直径を有する、生体適合性ヒアルロン酸ポリマー；架橋バイオポリマーと接触するリガンドであって、１又は２以上の細胞表面標的と相互作用する）；並びに架橋剤、第１の生体適合性ポリマー、リガンド又はそれらの組合せと接触する検出可能なタグを含む、損傷軟骨標的用プローブを用意するステップ；１ｍｍに至る小さい傷害を有することが疑われる軟骨を損傷軟骨標的用プローブと接触させるステップ；並びに損傷軟骨標的用プローブを検出するステップを含む、１ｍｍに至る小さい傷害を有する、損傷軟骨を識別するための損傷軟骨標的用プローブの使用を提供する。

【0015】

いくつかの実施形態において、リガンドはヒアルロン酸であり、１又は２以上の細胞表面標的はＣＤ４４受容体である。他の実施形態において、リガンドは葉酸であり、１又は２以上の細胞表面標的は葉酸受容体である。

【0016】

本発明は、損傷軟骨イメージングプローブが、ビニルスルホンによって架橋されて架橋バイオポリマーを形成する生体適合性ヒアルロン酸ポリマーであって、１０Ｋ〜１．５Ｍの分子量を有し、生体適合性ＨＡポリマー：ビニルスルホンの架橋比が４：１〜１：４の間であり、架橋バイオポリマーが内部移行を調節するために約２００ｎｍを超える直径を有する、生体適合性ヒアルロン酸ポリマー；架橋バイオポリマーと接触するリガンドであって、ＣＤ４４受容体と相互作用するヒアルロン酸、葉酸受容体と相互作用する葉酸又は両方である、リガンド；並びに、架橋剤、第１の生体適合性ポリマー、リガンド又はそれらの組合せと接触する、検出可能なタグであって、損傷軟骨で検出することができ、損傷軟骨の画像を生成するために使用することができる、検出可能なタグを含む、損傷軟骨を標的とする及び／又は処置する医薬として使用するための損傷／傷害軟骨イメージングプローブを提供する。

【0017】

軟骨に対する損傷は、機械的な（mechanical）外傷、物理的な外傷、圧迫性外傷、関節炎性損傷、炎症性損傷又はそれらの組合せを含む、いかなる原因からのものであってもよい。

【0018】

いかなる実施形態においても、ポリマーターゲティングプローブは、約１０Ｋ、６０Ｋ、７００ｋ、１．５Ｍ又はそれらの様々な増分（例えば、８Ｋ、９Ｋ、１０Ｋ、１１Ｋ、１２Ｋ、１３Ｋ、１４Ｋ、１５Ｋ、１６Ｋ、１７Ｋ、１８Ｋ、１９Ｋ、２０Ｋ、２１Ｋ、２２Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、２８Ｋ、２９Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、３４Ｋ、３５Ｋ、３６Ｋ、３７Ｋ、３８Ｋ、３９Ｋ、４０Ｋ、４１Ｋ、４２Ｋ、４３Ｋ、４４Ｋ、４５Ｋ、４６Ｋ、４７Ｋ、４８Ｋ、４９Ｋ、５０Ｋ、５１Ｋ、５２Ｋ、５３Ｋ、５４Ｋ、５５Ｋ、５６Ｋ、５７Ｋ、５８Ｋ、５９Ｋ、６０Ｋ、６１Ｋ、６２Ｋ、６３Ｋ、６４Ｋ、６５Ｋ、６６Ｋ、６７Ｋ、６８Ｋ、６９Ｋ、７０Ｋ、７１Ｋ、７２Ｋ、７３Ｋ、７４Ｋ、７５Ｋ、７６Ｋ、７７Ｋ、７８Ｋ、７９Ｋ、８０Ｋ、８１Ｋ、８２Ｋ、８３Ｋ、８４Ｋ、８５Ｋ、８６Ｋ、８７Ｋ、８８Ｋ、８９Ｋ、９０Ｋ、１００Ｋ、１１０Ｋ、１２０Ｋ、１３０Ｋ、１４０Ｋ、１５０Ｋ、１６０Ｋ、１７０Ｋ、１８０Ｋ、１９０Ｋ、２００Ｋ、２１０Ｋ、２２０Ｋ、２３０Ｋ、２４０Ｋ、２５０Ｋ、２６０Ｋ、２７０Ｋ、２８０Ｋ、２９０Ｋ、３００Ｋ、３１０Ｋ、３２０Ｋ、３３０Ｋ、３４０Ｋ、３５０Ｋ、３６０Ｋ、３７０Ｋ、３８０Ｋ、３９０Ｋ、４００Ｋ、４１０Ｋ、４２０Ｋ、４３０Ｋ、４４０Ｋ、４５０Ｋ、４６０Ｋ、４７０Ｋ、４８０Ｋ、４９０Ｋ、５００Ｋ、５１０Ｋ、５２０Ｋ、５３０Ｋ、５４０Ｋ、５５０Ｋ、５６０Ｋ、５７０Ｋ、５８０Ｋ、５９０Ｋ、６００Ｋ、６１０Ｋ、６２０Ｋ、６３０Ｋ、６４０Ｋ、６５０Ｋ、６６０Ｋ、６７０Ｋ、６８０Ｋ、６９０Ｋ、７００Ｋ、７１０Ｋ、７２０Ｋ、７３０Ｋ、７４０Ｋ、７５０Ｋ、７６０Ｋ、７７０Ｋ、７８０Ｋ、７９０Ｋ、８００Ｋ、８１０Ｋ、８２０Ｋ、８３０Ｋ、８４０Ｋ、８５０Ｋ、８６０Ｋ、８７０Ｋ、８８０Ｋ、８９０Ｋ、９００Ｋ、１Ｍ；１．２Ｍ；１．３Ｍ；１．４Ｍ；１．５Ｍ；１．６Ｍ；１．７Ｍ；１．８Ｍ；１．９Ｍ；１．１０Ｍ；１．１１Ｍ；１．１２Ｍ；１．１３Ｍ；１．１４Ｍ；１．１５Ｍ；１．１６Ｍ；１．１７Ｍ；１．１８Ｍ；１．１９Ｍ；１．２０Ｍ；１．２１Ｍ；１．２２Ｍ；１．２３Ｍ；１．２４Ｍ；１．２５Ｍ；１．２６Ｍ；１．２７Ｍ；１．２８Ｍ；１．２９Ｍ；１．３０Ｍ；１．３１Ｍ；１．３２Ｍ；１．３３Ｍ；１．３４Ｍ；１．３５Ｍ；１．３６Ｍ；１．３７Ｍ；１．３８Ｍ；１．３９Ｍ；１．４０Ｍ；１．４１Ｍ；１．４２Ｍ；１．４３Ｍ；１．４４Ｍ；１．４５Ｍ；１．４６Ｍ；１．４７Ｍ；１．４８Ｍ；１．４９Ｍ；１．５０Ｍ；１．５１Ｍ；１．５２Ｍ；１．５３Ｍ；１．５４Ｍ；１．５５Ｍ；１．５６Ｍ；１．５７Ｍ；１．５８Ｍ；１．５９Ｍ；１．６０Ｍ；１．６１Ｍ；１．６２Ｍ；１．６３Ｍ；１．６４Ｍ；１．６５Ｍ；１．６６Ｍ；１．６７Ｍ；１．６８Ｍ；１．６９Ｍ；又は１．７０Ｍ）の分子量を有し、その架橋比は１：４、１：３、１：２、１：１、１：３．９、１：３．５、１：２．３、４：１、３：１、２：１及びそれらの様々な増分（例えば、１：４；１．１：４；１．２：４；１．３：４；１．４：４；１．５：４；１．６：４；１．７：４；１．８：４；１．９：４；２：４；２．１：４；２．２：４；２．３：４；２．４：４；２．５：４；２．６：４；２．７：４；２．８：４；２．９：４；３：４；３．１：４；３．２：４；３．３：４；３．４：４；３．５：４；３．６：４；３．７：４；３．８：４；３．９：４；４：１；４：１．１；４：１．２；４：１．３；４：１．４；４：１．５；４：１．６；４：１．７；４：１．８；４：１．９；４：２；４：２．１；４：２．２；４：２．３；４：２．４；４：２．５；４：２．６；４：２．７；４：２．８；４：２．９；４：３．０；４：３．１；４：３．２；４：３．３；４：３．４；４：３．５；４：３．６；４：３．７；４：３．８；又は４：３．９）である生体適合性ヒアルロン酸ポリマーを含むことができる。

【0019】

検出可能なタグは、蛍光色素、放射性タグ、金属、ナノ粒子又はそれらの組合せであってもよい。いかなる実施形態においても、ポリマーターゲティングプローブは、生分解性又は部分的に生分解性であってもよい。

【0020】

ポリマーターゲティングプローブは、架橋バイオポリマーに結合している、放出可能に結合している（releasably associated）、架橋バイオポリマー中に配置している、架橋バイオポリマー上にスプレー被覆されている、又はそれらの組合せの、１若しくは２以上のケモカイン又は１若しくは２以上のＴＧＦ活性薬剤を含んでいてもよい。

【0021】

架橋バイオポリマーは、活性薬剤を保持するための１又は２以上の孔を形成してもよく、例えば、保持される活性薬剤及び所望の放出割合又はプロファイルに応じて、時間と共に持続放出させるための１若しくは２以上のケモカイン又は１若しくは２以上のＴＧＦ活性薬剤を保持するための１又は２以上の孔を形成してもよく、架橋は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９ｎｍ又は１ｎｍ未満又は２９ｎｍ超及びそれぞれに関して０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、又は０．９の様々な増分（例えば、Ｘ．１、Ｘ．２、Ｘ．３、Ｘ．４、Ｘ．５、Ｘ．６、Ｘ．７、Ｘ．８、又はＸ．９、式中のＸは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９；特定の例には３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、又は１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、１１．９又は２０．１、２０．２、２０．３、２０．４、２０．５、２０．６、２０．７、２０．８、２０．９が含まれる）の平均直径を有する孔を形成させるために変動させてもよい。

【0022】

ポリマーターゲティングプローブは、１５分未満で１又は２以上の標的と接触するために使用することができ、１５分以内での迅速な検出を可能にする。ポリマーターゲティングプローブは、関節内注射することができる。

【0023】

本発明は、損傷軟骨の指向的処置（directed treatment）のための組成物及び方法を提供する。本発明は、リガンドを使用して、軟骨損傷イメージングプローブを損傷軟骨及び第１の検出可能なタグに指し向けて、身体中の軟骨損傷イメージングプローブの位置を識別する、損傷軟骨を位置付ける識別機構として使用することができる。第２の軟骨標的用プローブは、損傷軟骨に幹細胞、軟骨細胞又は両方を動員することによって損傷軟骨を処置する医薬として使用することができる。リガンドを使用して、第２の軟骨標的用プローブを損傷軟骨に指し向けて、そこで１又は２以上のケモカインが第２の軟骨標的用プローブから放出されて、幹細胞、軟骨細胞又は両方が損傷軟骨に動員される。第２の軟骨標的用プローブは、第２の軟骨標的用プローブの位置を識別するための、第２の検出可能なタグを有し得る。第３の軟骨標的用プローブは、軟骨細胞への分化を増加させることによって損傷軟骨を処置する医薬として使用することができる。第３の軟骨標的用プローブは、第３の軟骨標的用プローブを損傷軟骨に指し向けるために使用されるリガンドを含み、そこで１又は２以上のＴＧＦ活性薬剤が第３の軟骨標的用プローブから放出されて、より高い軟骨細胞への分化が惹起される。第３の軟骨標的用プローブは、第２の軟骨標的用プローブの位置を識別するための、第３の検出可能なタグを有し得る。この例では、３つのプローブとともに３つの異なる検出可能なタグが存在して、位置及び送達に関して、それぞれをイメージングすること及び識別することが可能になる。しかし、いくつかの事例では、検出可能なタグは、それぞれについて同じであってもよい。同様に、個々のプローブを２つの又はそれどころか１つのプローブに組み合わせることによって、プローブの数が減少されてもよいことは明らかである。例えば、ケモカインを放出して幹細胞、軟骨細胞又は両方を損傷軟骨に動員する及び１又は２以上のＴＧＦ活性薬剤も放出してより高い軟骨細胞への分化を惹起する、第２のプローブの局所注射に続いて、単一のイメージングプローブを使用することができる。例えば、本発明は、ビニルスルホンによって架橋されて架橋バイオポリマーを形成する生体適合性ヒアルロン酸ポリマーであって、１０Ｋ〜１．５Ｍの分子量を有し、生体適合性ＨＡポリマー：ビニルスルホンの架橋比が４：１〜１：４の間であり、架橋バイオポリマーが内部移行を調節するために約２００ｎｍを超える直径を有する、生体適合性ヒアルロン酸ポリマー；架橋バイオポリマーと接触するリガンドであって、ＣＤ４４受容体と相互作用するヒアルロン酸、葉酸受容体と相互作用する葉酸又は両方である、リガンド；並びに、架橋剤、第１の生体適合性ポリマー、リガンド又はそれらの組合せと接触する、第１の検出可能なタグであって、損傷軟骨で検出することができ、損傷軟骨の画像を生成するために使用することができる、第１の検出可能なタグを含む、損傷軟骨を識別するための軟骨損傷イメージングプローブ；ビニルスルホン架橋剤によって架橋されて架橋バイオポリマーを形成する生体適合性ヒアルロン酸ポリマーであって、１０Ｋ〜１．５Ｍの分子量を有し、生体適合性ポリマー：架橋剤の架橋比が４：１〜１：４の間であり、架橋バイオポリマーが内部移行を調節するために約２００ｎｍを超える直径を有する、生体適合性ヒアルロン酸ポリマー；架橋バイオポリマーと接触するリガンドであって、１又は２以上の細胞表面標的と相互作用する、リガンド；ＳＤＦ１、ＳＤＦ１β、Ｅｐｏ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１６、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３から選択され、ポリマーターゲティングプローブに結合する、１又は２以上のケモカインであって、幹細胞、軟骨細胞又は両方を動員するために放出される、１又は２以上のケモカインを含み、架橋剤、第１の生体適合性ポリマー、リガンド又はそれらの組合せと接触する、第２の検出可能なタグを含んでいてもよい、損傷軟骨に幹細胞、軟骨細胞又は両方を動員することによって損傷軟骨を処置する医薬として使用するための軟骨標的用プローブを含み、ビニルスルホン架橋剤によって架橋されて架橋バイオポリマーを形成する生体適合性ヒアルロン酸ポリマーであって、１０Ｋ〜１．５Ｍの分子量を有し、生体適合性ポリマー：架橋剤の架橋比が４：１〜１：４の間であり、架橋バイオポリマーが内部移行を調節するために約２００ｎｍを超える直径を有する、生体適合性ヒアルロン酸ポリマー；架橋バイオポリマーと接触するリガンドであって、１又は２以上の細胞表面標的と相互作用する、リガンド；ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３から選択され、ポリマーターゲティングプローブに結合する、１又は２以上のＴＧＦ活性薬剤であって、より高い軟骨細胞への分化を惹起するために放出される、１又は２以上のＴＧＦ活性薬剤；並びに、架橋剤、第１の生体適合性ポリマー、リガンド又はそれらの組合せと接触する、第３の検出可能なタグを含む、軟骨細胞への分化を増加させることによって損傷軟骨を処置する医薬として使用するための軟骨分化プローブを含んでいてもよい、損傷軟骨の標的化処置（targeted treatment）に関する医薬として使用するための損傷軟骨プローブを提供する。

【図面の簡単な説明】

【0024】

本発明の特徴及び利点のより完全な理解のために、以下の添付の図面に従って発明の詳細な説明について以下に参照を作成する：

【図1】図１ＡはＤＬＳ（左）によるＨＡナノ粒子キャラクタリゼーションのサイズ分布のプロットであり、図１ＢはＳＥＭ画像である。

【図2】図２Ａ〜２Ｄは、正常及び活性化軟骨細胞を標的とするインビトロＣＤ４４標的用ＨＡ粒子を示す。図２Ａ及び２Ｃは、ＣＤ４４標的用プローブでインキュベートしたナイーブ及び活性化（ＬＰＳ処置）軟骨細胞を示す蛍光画像である。図２Ｂは、ＣＤ４４標的用プローブでインキュベートしたナイーブ及び活性化（ＬＰＳ処置）軟骨細胞の蛍光画像強度を示す。図２Ｄは、活性化軟骨細胞の数を示す。

【図3】図３Ａ〜３Ｄは、ヒト関節炎軟骨組織を診断するＣＤ４４標的用プローブのエクスビボ評価を示す。図３Ａは関節炎軟骨組織対健常軟骨組織の蛍光画像であり、図３Ｂは定量した組織関連蛍光強度を示す。図３Ｃは、関節炎軟骨組織対健常軟骨組織に関して、撮像した後、細胞核画像と重ね合わせた組織断面画像であり、図３Ｄは、関節炎軟骨組織及び健常軟骨組織の両方におけるＣＤ４４＋細胞の数の定量を示す。

【図4】図４Ａ及び４Ｂは、炎症性細胞を検出するＦＡ受容体標的用プローブのインビトロ評価を示す。図４Ａは、ナイーブ細胞を対照とするＬＰＳ処置活性化マクロファージにおけるＦＡ受容体標的用プローブの増加した蛍光強度を示す。図４Ｂは、細胞関連蛍光強度と活性化マクロファージの数の間の直線関係を示すプロットである。

【図5】図５は、関節炎組織を診断するＦＡ受容体標的用プローブの評価を示す画像である。本発明者らは、プローブでのインキュベーション後に、健常組織（右）においてよりも関節炎組織（左）において有意に高いプローブ蓄積を見出している。

【図6】図６Ａ及び６Ｂは、ＨＡ分子量の効果（図６Ａ架橋密度：１：１）；架橋密度の効果（図６Ｂ分子量：６０ｋ）を示す、ＨＡ粒子ベースのプローブのインビトロ細胞毒性を示すプロットである。

【図7】図７Ａ及び７Ｂは、マウス関節内注射モデルにおいて組織に対して最小毒性を惹起するＨＡ粒子ベースのプローブの画像である、Ｈ＆Ｅ染色（図７Ａ）及び炎症細胞数（図７Ｂ）。

【図8】図８Ａ及び８Ｂは、それぞれラット軟骨傷害のインビボイメージング及びその定量分析である。データは、ＨＡ粒子ベースのプローブ（ＣＤ４４標的用プローブ）が、対照（健常軟骨）に対するよりも機械的な外傷で傷害を受けた軟骨に対するより高い親和性を有することを支持している。

【図9】図９Ａ及び９Ｂは、ＨＡ粒子ベースのプローブのインビトロ分解を示す。ＨＡ分子量の効果（図９Ａ架橋密度：１：１）；架橋密度の効果（図９Ｂ分子量：６０ｋ）。

【図10】図１０Ａは、エクスビボでＣＤ４４標的用プローブが、傷害軟骨組織領域で優先的に蓄積することによって軟骨組織傷害及び損傷の領域を速やかに識別するために使用することができることを示す。図１０Ｂは、関節炎軟骨中に蓄積したプローブの量が、異なる時点で定量されたグラフである。

【図11】図１１Ａ及び１１Ｂは、ＦＡ受容体標的用プローブを使用する機械的傷害軟骨の診断を示す。図１１Ａは、ＦＡ受容体標的用プローブが、健常組織（下部）よりも機械的に傷害を受けた組織（上部）に優先的に蓄積することを示す画像である。図１１Ｂは、傷害を受けた組織及び健常組織の両方に蓄積したプローブの量が、定量され、次に比較（右）されたグラフである。

【図12】図１２Ａ〜１２Ｃは、ＣＤ４４標的用プローブを使用する機械的に傷害を受けた剣状突起の診断を示す。図１２Ａは、機械的傷害軟骨に蓄積するが、健常なものには蓄積しないＣＤ４４標的用プローブを示す（上部）。傷害を受けた組織及び健常組織の両方に蓄積したプローブの量を、定量し、次に比較した（下部）。図１２Ｂはエクスビボの結果を示し、図１２Ｃは蛍光の定量を示す。

【図13】図１３Ａは画像であり、図１３Ｂは１ｍｍ直径サイズの軟骨傷害のプロット定量である。ＣＤ４４標的用ＨＡ−ベースのプローブは、傷害を受けた部位で優先的に蓄積することが見出された。

【図14】図１４は、それらの内部移行される機会へのＣＤ４４標的用プローブのサイズの影響のグラフである。本発明者らのデータは、２５０ｎｍを超えるプローブが、大部分は受容体相互作用を介して関節炎組織に蓄積することを見出している。しかし、小さなプローブ（例えば、５０ｎｍ直径）は、内部移行を介して関節炎組織に蓄積し、これはＥＤＴＡ洗浄で除去することができない。

【図15】図１５は、放出されたＳＤＦ１、ＳＤＦ１β、及びＥｐｏにより誘導されたヒト軟骨細胞移動を示すプロットである。

【図16】図１６は、様々な増殖因子により誘導されたＢＭＳＣ移動及び定量分析を示すプロットである。

【図17】図１７は、それぞれ対照ＥＰＯ、ＨＡ粒子から放出されたＥＰＯ及び培地により誘導されたＢＭＳＣ移動のプロットである。

【図18】図１８Ａは放出されたＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３によって惹起されたＢＭＳＣ分化の画像であり、図１８Ｂはその定量分析である。

【図19】図１９Ａは、処置無しＨＡスキャフォールド／プローブの及び処置有りのヒト関節炎軟骨の画像である。図１９Ｂは、インビトロで２週間のＨＡスキャフォールド処置の有り又は無しの関節炎軟骨の修正Ｍａｎｋｉｎスコアのプロットである。

【図20】図２０Ａは、処置無し及びＥｐｏ負荷ＨＡスキャフォールド及び間葉系幹細胞の処置有りのヒト関節炎軟骨の画像である。図２０Ｂは、処置無し対インビトロで２週間のＥｐｏ負荷ＨＡスキャフォールド及び間葉系幹細胞の処置有りの関節炎軟骨の修正Ｍａｎｋｉｎスコアのプロットである。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本発明の様々な実施形態の作製及び使用が、以下に詳細に考察されると同時に、本発明が、多種多様な特定の関係において具体化され得る多くの適用可能な本発明の概念を提供することを認識すべきである。本明細書中に考察される特定の実施形態は、本発明を製造及び使用する特定の様式の単なる例示であり、本発明の範囲を限定しない。

【0026】

本発明の理解を促進するために、いくつかの用語が以下に定義される。本明細書中に定義される用語は、本発明と関連性のある領域における通常の当業者によって一般に理解されている意味を有する。「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その（the）」などの用語は、単数形の実体のみを指すことを意図するものではなく、特定の例が説明のために使用され得る一般的なクラスを含む。本明細書中の用語は、本発明の特定の実施形態を記載するために使用されるが、それらの使用は、特許請求の範囲に概説されるものを除いて本発明を限定しない。

【0027】

生体適合性及び分解性ポリマーは、ナノ又はマイクロスキャフォールドを製作するため使用することができる。このような能力を実証するために、ヒアルロン酸（ＨＡ，hyaluronic acid）を、スキャフォールド製作に関するモデル材料として使用した。

【0028】

そこで使用される、用語「マイクロ／ナノ粒子」、「ナノ粒子」、「マイクロ粒子」、「スキャフォールド」、「損傷／傷害軟骨標的用プローブ」、「ポリマーターゲティングプローブ」、「プローブ」、及びそのバリエイションは、交換可能であり、ビニルスルホンによって架橋される生体適合性ヒアルロン酸ポリマーを表すために使用され、いくつかの実施形態において、リガンド、検出可能なタグ及び／又は１若しくは２以上の活性薬剤を含み得る。

【0029】

ＨＡマイクロ／ナノ粒子の製作。ＨＡマイクロ／ナノ粒子は、マイクロエマルジョンシステムを使用して製作することができる。簡潔に述べると、水相を、ＨＡ（６０ｍｇ、７００Ｋ）を３ｍｌのＮａＯＨ（０．２Ｍ）溶液中に溶解することによって調製し；有機相を、０．２ＭエアロゾルＯＴ及び０．０４Ｍ １−ヘプタノールをイソオクタン（５０ｍｌ）に溶解することによって調製した。水溶液を有機相に滴下して加え、次に混合物を直ちに１０分間ホモジナイズした。ビニルスルホン（１００μｌ）を引き続いてマイクロエマルジョンに加え、混合物を再度ホモジナイズしてＤＶＳを分散させた。反応を、１時間、室温で激しく撹拌しながら進行させた。ＨＡ粒子を、アセトン中に沈殿することによって収集した。沈殿させたＨＡ粒子ペレットを、ＤＩ水に再分散し、続いて１０００ｒｐｍで１０分遠心分離してマイクロサイズＨＡを除去した。最終的に、ＨＡナノ粒子を、５０００ｒｐｍでの上清の遠心分離によって収集した。収集したＨＡナノ粒子を、水、エタノール及びアセトンで徹底的に洗浄した後、３７℃で一晩乾燥させた。ＣＤ４４標的用光学ナノプローブを調製するために、５０ｍｇの調製した状態のＨＡナノ粒子及び１ｍｇのＣＦ（商標）６４７色素（Biotium社、ＣＡ）を、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ：４．５；３．０ｍｌ）に順次分散し、次に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ，1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride）（色素とＥＤＣのモル比１：１０で）を混合物に加えて、ＨＡナノ粒子への色素コンジュゲーションを開始させた。２４時間後、反応溶液を、ＤＩ水に対して徹底して透析し、精製されたＣＦ（商標）６４７標識化ＨＡナノ粒子を、収集し、将来使用するために乾燥させた。色素のコンジュゲーション効率は、乾燥させたＨＡ粒子の１ミリグラム当たり１０ナノモルであるとＵＶ−ｖｉｓ分光計を使用して推定される。調製した状態のＣＤ４４標的用プローブ（又はＨＡ粒子）のサイズを、動的光散乱（ＤＬＳ，dynamic light scattering）及び走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ，scanning electron microscopy）（Ａｐｐ．１）によって特徴付けた。ＨＡ粒子の平均直径は、約５００ｎｍであった。ＨＡ粒子のゼータ電位は、約−４１ｍｖであった。ＳＥＭ画像は、ＳＥＭ測定についての試料調製の間に乾燥に関連する粒子の収縮に起因する粒子サイズの減少（約３００ｎｍ）を示す。サイズ及び表面特性などの粒子の物理化学的な特徴は、細胞取り込みにおいて重大な役割を担う。膜理論の「ラッピング時間」によると、より大きなサイズの粒子は、細胞内部移行プロセスにおいてより強力な推進力及び追加エネルギーを必要とし、より大きなサイズ（１５０ｎｍを超える）を有するものは、非食作用性の細胞内部移行から大部分は除外されるであろう。以前の研究は、非食作用性細胞がより小さい粒子の取り込みを好んだことを明らかにしている。他方、負に帯電した粒子は、ＮＰと細胞膜の間の静電気的な反発力が増加することに起因して、細胞取り込みを減少させた。したがって、調製した状態のＨＡ粒子プローブは、非標的化細胞／組織に対して非特異的に結合する機会が少なく、より高いイメージング解像度をもたらす。したがって、ここで使用されるＨＡ粒子プローブは、細胞膜におけるＣＤ４４受容体の標的化に適切である。

【0030】

図１ＡはＤＬＳ（左）によるＨＡナノ粒子キャラクタリゼーションのサイズ分布のプロットであり、図１ＢはＳＥＭ画像である。図２は、正常及び活性化軟骨細胞を標的とするインビトロＣＤ４４標的用ＨＡ粒子を示す。図２Ａ及び２Ｃは、ＣＤ４４標的用プローブでインキュベートしたナイーブ及び活性化（ＬＰＳ処置）軟骨細胞を示す蛍光画像である。図２Ｂは、ＣＤ４４標的用プローブでインキュベートしたナイーブ及び活性化（ＬＰＳ処置）軟骨細胞の蛍光画像強度を示す。図２Ｄは、細胞関連蛍光強度が、活性化軟骨細胞の増加ともに増加することを示す。インビトロで軟骨細胞におけるＣＤ４４受容体を標的とするＨＡ粒子の能力を、ウシ軟骨細胞を使用して調査した。ＬＰＳ処置（５０ｎｇ／ｍｌ、２４時間）を使用して、軟骨細胞を活性化して、ＣＤ４４受容体を発現させた。ナイーブ及び活性化軟骨細胞（２×１０^５／ウェル）を、１時間３７℃で、ＣＦ（商標）６４７色素標識化ＣＤ４４標的用ＨＡ粒子（０．１ｍｇ／ｍｌ）でインキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、細胞表面におけるＨＡナノ粒子蓄積を、蛍光顕微鏡を使用して観察し、細胞関連蛍光強度を、プレートリーダーを使用して記録した。蛍光画像（図２Ａ、２Ｃ）は、ＬＰＳ処置軟骨細胞が、多数のＣＤ４４標的用ＨＡ粒子に関連することを示した。定量分析は、ＬＰＳ処置軟骨細胞からの蛍光強度が、対照よりも約４倍高いことをさらに明らかにした（図２Ｂ）。これは、ＨＡ粒子が、活性化軟骨細胞において高度に上方制御されるＣＤ４４受容体と相互作用することが理由である（図２Ｄ）。さらにまた、蛍光強度と活性化軟骨細胞数の間に直線関係が存在する。本発明者らの結果は、ＨＡ粒子が、ＣＤ４４発現軟骨細胞を標的とするために使用され得ること及びＣＤ４４標的用プローブが、ＣＤ４４＋関節炎細胞の数を評価するために使用され得ることを支持している。

【0031】

図３は、ヒト関節炎軟骨組織を診断するＣＤ４４標的用プローブのエクスビボ評価を示す。図３Ａは関節炎軟骨組織対健常軟骨組織の蛍光画像であり、図３Ｂは定量した組織関連蛍光強度を示す。図３Ｃは、関節炎軟骨組織対健常軟骨組織に関して、撮像した後、細胞核画像と重ね合わせた組織断面画像であり、図３Ｄは、関節炎軟骨組織及び健常軟骨組織の両方におけるＣＤ４４＋細胞の数の定量を示す。炎症性、傷害を受けた又は関節炎軟骨が高レベルのＣＤ４４受容体を発現することが十分に確立されている。関節炎軟骨を標的とするＣＤ４４標的用プローブ（ＨＡ粒子）の能力を、インビトロで評価した。罹患した組織及び健常な組織の両方を、６ウェルプレートに配置した。ＣＦ（商標）６４７コンジュゲートＣＤ４４標的用プローブを、各ウェル（１．０ｍｇ／ｍｌ）に加え、次に３７℃で３０分間インキュベートした。全膝部又は臀部置換後に、廃棄したヒト関節炎及び炎症性軟骨を、この調査に使用した。関節炎及び炎症性軟骨を標的とするＣＤ４４標的用プローブの能力を、Ｋｏｄａｋイメージングシステムを使用して定量した。本発明者らのデータは、罹患した（関節炎）組織が、対照組織（健常軟骨）よりも４倍よりＣＤ４４標的用プローブを蓄積することを示した。ＩＨＣ染色（ＣＤ４４染色）は、関節炎軟骨組織における増強したＣＤ４４発現を明らかにした。健常軟骨組織におけるよりも、関節炎軟骨組織において約３．８倍高いＣＤ４４が存在する。これらの結果は、ＣＤ４４標的用プローブ（ＨＡ粒子）が、関節炎軟骨組織を検出するために使用することができるとの結論を支持している。

【0032】

関節炎軟骨を診断するための葉酸受容体標的用プローブ。多くの報告は、傷害を受けた軟骨、損傷された軟骨、又は罹患した軟骨が、葉酸（ＦＡ，folic acid）受容体の上方制御を有することを示している。ＦＡ受容体を標的とすることにより、本発明者らは、傷害を受けた軟骨、損傷された軟骨、又は罹患した軟骨を検出する新規プローブを開発した。軟骨組織における活性化マクロファージ及び炎症性細胞が、それらの表面に高レベルのＦＡ受容体発現を有していることを示している。ＦＡ受容体発現細胞の程度を検出することにより、我々は、関節炎軟骨を診断できる。ＦＡ受容体は、葉酸塩及びその断片に対して高親和性を有する。プローブは、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ポリエチレングリコールなどを含む多種多様な材料を使用して製作することができる。使用される粒子には、ヒアルロン酸マイクロ又はナノサイズ粒子、キトサン粒子、ゼラチン粒子、コラーゲン粒子、アルブミン粒子、ＰＬＧＡ／ＰＬＡ粒子及びポリエチレングリコールナノ粒子などが含まれるが、これらに限定されない。葉酸受容体標的化特性のために、プローブの表面は、葉酸塩／葉酸の全分子又は断片を保有しなければならない。可視化／視覚的な診断に関して、プローブは、ＦＩＴＣ、Ｆｌｕｏｒ（登録商標）及びＣＹ（登録商標）などの蛍光色素でコンジュゲートされるべきである。

【0033】

ＦＡ受容体陽性炎症性細胞を検出するイメージングプローブは、ＦＡ及びＦＡ誘導体をコンジュゲートさせた蛍光色素標識粒子で調製することができる。ＦＡ受容体標的用プローブを調製するために、ＦＡを、ＥＤＣ化学によってアミン−ＰＥＧ−アミン（Ｍ_ｗ：５Ｋ）の一端に最初にカップリングして得た。７０ｍｇのＦＡ−ＰＥＧ−ＮＨ_２及び１０ｍｇのＣＦ（商標）６４７標識化ＨＡナノ粒子を、５ｍｌのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ：４．５）に分散した。ＥＤＣ（ＦＡとＥＤＣのモル比：１：１０で）の付加により、ＣＦ（商標）６４７標識化ＨＡ粒子へのＦＡコンジュゲーションが開始した。２４時間後、反応溶液を、ＤＩ水に対して徹底して透析し、ＦＡ受容体標的用プローブを、収集し、将来使用するために乾燥させた。ＦＡのコンジュゲーション効率は、乾燥させたＨＡ粒子の１ミリグラム当たり０．１２マイクロモルであるとＵＶ−ｖｉｓ分光計を使用して推定される。

【0034】

図４Ａ及び４Ｂは、炎症性細胞を検出するＦＡ受容体標的用プローブのインビトロ評価を示す。図４Ａは、ナイーブ細胞を対照とするＬＰＳ処置活性化マクロファージにおけるＦＡ受容体標的用プローブの増加した蛍光強度を示す。図４Ｂは、細胞関連蛍光強度と活性化マクロファージの数の間の直線関係を示すプロットである。滑膜マクロファージは、早期段階の関節炎において、炎症及び軟骨傷害の媒介に重大な役割を担う。以前の調査は、軟骨の周囲のこれらの活性化マクロファージが、骨関節炎様病状の発生に関与することを示している。加えて、活性化マクロファージが、ＦＡ受容体を発現させることは公知である。したがって、本発明者らは、関節内空間での軟骨におけるＦＡ受容体発現細胞の測定が、早期段階の関節炎を診断する直接的な手段を提供するであろうことを信じている。この仮説を試験するために、本発明者らは、ＦＡ受容体標的用プローブ（ＦＡ−コンジュゲートＨＡ粒子）及びマウスＲａｗ２６４．７マクロファージを使用する。ＬＰＳ処置（１．０μｇ／ｍｌ、４時間）を使用してマクロファージを活性化し、ＰＢＳ培地を対照として使用した。ナイーブ及び活性化マクロファージ（６．０×１０^６／ウェル）を、１時間３７℃で、ＣＦ（商標）６４７色素標識化ＦＡ受容体標的用プローブ（０．１ｍｇ／ｍｌ）でインキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、細胞表面におけるＦＡ受容体標的用プローブの蓄積を、蛍光顕微鏡を使用して観察し、細胞関連蛍光強度を、プレートリーダーを使用して記録した。細胞関連蛍光強度を測定することにより、本発明者らは、ＬＰＳ処置マクロファージが、多数のＦＡ受容体標的用プローブに結合することを見出している（図４Ａ）。定量分析は、ＬＰＳ処置マクロファージからの蛍光強度が、ＰＢＳ処置マクロファージからのものよりも約１．５倍高いことをさらに明らかにした（図４Ｂ）。結果は、ＦＡの存在が、マクロファージ活性化に際して葉酸受容体の上方制御に起因する活性化マクロファージに対するＨＡ粒子の親和性を増強することを示す。さらにまた、ＦＡ受容体標的用プローブを様々な数の活性化マクロファージとインキュベートすることにより、活性化マクロファージの数と蛍光強度の間の直線関係を観察することができる（図４Ｂ）。これらの結果は、ＦＡ受容体標的用プローブは、インビトロで活性化ＭΦの数を定量するために使用することができることを示す。

【0035】

図５は、関節炎組織を診断するＦＡ受容体標的用プローブの評価を示す画像である。本発明者らは、プローブでのインキュベーション後に、健常組織（右）においてよりも関節炎組織（左）において有意に高いプローブ蓄積を見出している。さらにまた、全膝部置換の間に回復される、廃棄したヒト関節軟骨を利用して、関節炎軟骨組織を診断するＦＡ受容体標的用プローブの能力を探索した。罹患した軟骨及び健常組織の両方を、患者の身元と関連させることなく廃棄した組織から単離した。予想されたように、ＦＡ受容体標的用プローブは、健常組織（図５右）におけるものよりも関節炎組織（図５左）に対してより高い親和性を有する。これらの所見は、ＦＡ受容体標的用プローブが、関節炎軟骨組織（強い色素関連蛍光を伴う）を診断し、限局的及び標的化処置のため、関節炎軟骨の領域を識別するために使用することができることを支持している。

【0036】

イメージングプローブの関節内注射による関節炎軟骨の診断。関節内の軟骨表面における損傷又は傷害を診断するため開発されたイメージングプローブは存在しない。全ての以前のプローブは、血流を介してプローブを注射すること及び／又は送達することによって関節炎を検出するために開発された。それらの方法は、骨／軟骨界面で血管に近傍する炎症応答のみ検出することができる。軟骨組織は血管をほとんど有していないため、したがって、現在の方法は、関節内の軟骨組織の表面における細胞障害の程度を評価するために使用することができない。本発明者らのプローブは、軟骨組織の表面における傷害及び損傷を診断するために設計される。プローブが傷害軟骨表面組織のみを標的とすることを保証するために、プローブは、滑液に由来する又は滑膜細胞に対して生体適合性であるかのいずれかである全ての成分の関節内注射のため設計される。

【0037】

ＨＡ粒子を、プローブのベースとして製作した。簡潔に述べると、水相を、ＨＡ（６０ｍｇ、７００Ｋ）を３ｍｌのＮａＯＨ（０．２Ｍ）溶液中に溶解することによって調製し；有機相を、０．２Ｍエアロゾル ＯＴ及び０．０４Ｍ １−ヘプタノールをイソオクタン（５０ｍｌ）に溶解することによって調製した。水溶液を有機相に滴下して加え、次に混合物を直ちに１０分間ホモジナイズした。ビニルスルホン（１００μｌ）を引き続いてマイクロエマルジョンに加え、混合物を再度ホモジナイズしてＤＶＳを分散させた。反応を、１時間、室温で激しく撹拌しながら進行させた。ＨＡ粒子を、アセトン中に沈殿することによって収集した。沈殿させたＨＡ粒子ペレットを、ＤＩ水に再分散し、続いて１０００ｒｐｍで１０分遠心分離してマイクロサイズＨＡを除去した。最終的に、ＨＡナノ粒子を、５０００ｒｐｍでの上清の遠心分離によって収集した。収集したＨＡナノ粒子を、水、エタノール及びアセトンで徹底的に洗浄した後、３７℃で一晩乾燥させた。異なる製剤を、粒子サイズ、粘性、及び徐放性：ＨＡの分子量、及び架橋密度（ＨＡヒドロキシル基とＤＶＳのビニル基の比）及びＨＡ濃度におけるいくつかのパラメータの効果を研究するために使用した。

【0038】

図６Ａ及び６Ｂは、ＨＡ分子量の効果（図６Ａ架橋密度：１：１）；架橋密度の効果（図６Ｂ分子量：６０ｋ）を示すＨＡ粒子ベースのプローブのインビトロ細胞毒性を示すプロットである。これらのＨＡ粒子ベースのプローブの毒性を、インビトロ及びインビボで調査した。インビトロ試験において、ＨＡ粒子の細胞毒性を、Alamar Blueアッセイを使用してヒト軟骨細胞において評価した。簡潔に述べると、播種した細胞（１ウェル当たり５０００個細胞）を、２４時間Alamar Blueの存在下、異なる条件下で調製したプローブの異なる濃度でインキュベートした。本発明者らは、異なる分子量又は架橋密度のいずれかで調製したプローブが、５ｍｇ／ｍｌまでの濃度で細胞に対して明らかな毒性を示さないことを見出している。類似の実験が、ウサギ滑膜細胞において実施され、ヒト軟骨細胞において行ったのと同じ傾向を示した。これらの結果は、ＨＡ粒子ベースのプローブが、良好な細胞適合性を有することを示唆している。

【0039】

ＨＡ粒子ベースのプローブの組織適合性を評価するために、インビボ試験をマウス皮下移植モデル及びマウス関節内注射モデルを使用して実施した。マウス皮下移植モデルに関して、様々なＨＡ粒子及び対照として供されるＰＬＡＧ粒子を、Taconic Farms社（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）からのＢａｌｂ／ｃマウス（雄、約２０ｇ体重）の皮下に移植した。簡潔に述べると、粒子（１マウス当たり６ｍｇ／１００μｌ）を、背部における皮下空間に投与した。移植後３及び１４日、インプラント及び周囲組織を、回収し、凍結切片化し、次に組織学的に分析した。炎症細胞浸潤及びカプセル厚を、異なるプローブに対する組織反応の程度を評価するバイオマーカーとした。本発明者らは、分子量又は架橋密度と無関係に、全てのＨＡ粒子ベースのプローブの生体適合性が、ＰＬＧＡ粒子のものに匹敵する又はさらにより良好であることを見出している。ＰＬＧＡはＦＤＡ承認の材料であり、したがって、これらの調製した状態のＨＡ粒子は、動物のインビボ研究に使用され得る。

【0040】

図７Ａ及び７Ｂは、マウス関節内注射モデルにおいて組織に対して最小毒性を惹起するＨＡ粒子ベースのプローブの画像である、Ｈ＆Ｅ染色（図７Ａ）及び炎症細胞数（図７Ｂ）。さらに、ＨＡ粒子ベースのプローブに対する組織応答を、マウス関節内注射モデルを使用して実施した。本発明者らは、本発明者らが調製した全てのプローブが、関節の組織に対して毒性を示さない／最小の毒性を示すことを見出している。代表的な結果は、図７Ａ及び７Ｂに示される。Ｈ＆Ｅ染色から、様々な分子量で調製されたプローブは、生理食塩水が行うのと類似する炎症細胞動員を惹起する。インビトロ及びインビボの結果を一緒に考慮して、本発明者らは、ＨＡ粒子ベースのプローブが、細胞及び組織に対して安全であるとの結論を引き出すことができる。

【0041】

図８Ａは、ラット軟骨傷害のインビボイメージング及びその定量分析（図８Ｂ）である。データは、ＨＡ粒子ベースのプローブ（ＣＤ４４標的用プローブ）が、対照（健常軟骨）に対するよりも機械的な外傷で傷害を受けた軟骨に対するより高い親和性を有することを支持している。

【0042】

最終的に、軟骨傷害ラットモデルを、粒子プローブがインビボで軟骨傷害を検出するために使用することができるかどうかを調査するために利用した。第一に、ラット（ｎ＝３）の左膝部における大腿軟骨傷害が２２Ｇ針を使用して作り出され、右膝部は非傷害のまま対照として残存させた。１００μｌのＨＡ粒子ベースのプローブ（１ｍｇ／ｍｌ）を、関節内に注射した。３０分後、インビボイメージングを、Ｋｏｄａｋインビボイメージングシステムを使用して取得し、結果は図８に提示される。強い蛍光シグナルは機械的傷害軟骨に関連し、非常に弱いシグナルは対照膝部において可視化されることを観察することができる（図８Ａ）。定量分析は、傷害軟骨におけるおおよそ４倍高い粒子蓄積を示す（図８Ｂ）。結果は、ＨＡ粒子ベースのプローブ（ＣＤ４４標的用プローブ）が、インビボで軟骨傷害を検出するために、関節内に投与することができることを支持している。本発明者らのプローブは、血流を通過することなく、傷害及び損傷軟骨を検出することができる。

【0043】

分解性を有するプローブ。ヒトでの使用の安全性を保証するため及び潜在的な異物反応を回避するために、関節炎診断プローブは、生分解性材料を使用してプローブを製作することによって、生分解性を保有するように設計される。プローブは、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ポリエチレングリコール、キトサン粒子、ゼラチン粒子、コラーゲン粒子、アルブミン粒子、ＰＬＧＡ／ＰＬＡ粒子及びポリエチレングリコールナノ粒子などを含む、異なる生分解性材料を使用して製作される。

【0044】

図９Ａ及び９Ｂは、ＨＡ粒子ベースのプローブのインビトロ分解を示す。ＨＡ分子量の効果（図９Ａ架橋密度：１：１）；架橋密度の効果（図９Ｂ分子量：６０ｋ）。調製した状態のＨＡ粒子ベースのプローブの分解を、インビトロでヒアルロニダーゼ（５０単位／ｍｌ）の存在下で試験した。ヒアルロニダーゼの存在下でのＨＡ粒子ベースのプローブの分解プロファイルが、ＨＡ分子量又は架橋密度のいずれかに依存することを観察することができる。より高い分子量で調製されたＨＡプローブは、より低い分子量で調製されたものよりも迅速に分解し、架橋密度を増加させることにより、ＨＡ粒子ベースのプローブの分解速度は減少する。これは、より高い分子量又はより低い架橋密度で作製されたＨＡ粒子ベースのプローブが、より高い腫脹比を示し、これにより酵素がネットワークを切断するマイクロスキャフォールドにより容易に浸透することを可能にすることが理由であり得る。これらの結果は、本発明者らのイメージングプローブが身体内側で分解性であり得、複数の注射後に身体内側に本発明者らのプローブが蓄積するリスクは存在しないことを支持している。

【0045】

迅速な検出（１５分未満）のためのプローブ。関節炎診断プローブは、迅速な疾患診断を提供するために設計される。そのように行うために、プローブは、罹患した軟骨に対して高親和性を有させるため及び疾患組織の迅速な可視化を提供するために設計される。現在、１２時間未満の間に、軟骨傷害及び損傷を検出するために使用することができるイメージングプローブは存在しない。この弱点を克服するために、本発明者らのプローブは、関節内側に投与され、滑液中で循環し、最終的に傷害軟骨の表面に蓄積するものとして開発された。そのために、本発明者らはプローブの成分としてヒアルロン酸（ＨＡ）を選択したが、それは、ＨＡが、滑液中の主な成分の１つであるからである。

【0046】

図１０Ａは、エクスビボでＣＤ４４標的用プローブが、傷害軟骨組織領域で優先的に蓄積することによって軟骨組織傷害及び損傷の領域を速やかに識別するために使用することができることを示す。図１０Ｂは、関節炎軟骨中に蓄積したプローブの量が、異なる時点で定量されたグラフである。関節炎軟骨を診断するＨＡ粒子ベースのプローブ（ＣＤ４４標的用プローブ）の能力を調査した。そのために、ヒト関節炎軟骨組織を、６ウェルプレートに配置した。各ウェルに関して、ＣＦ（商標）６４７色素標識化ＣＤ４４標的用プローブ（終濃度：１００又は３００μｇ／ｍｌ）を含有する６ｍｌのＤＭＥＭ培地を、ウェルプレートに加え、３７℃でインキュベートした。様々な時点で、プレーティングしたウェルを、組織の蛍光強度（励起：６３０ｎｍ；発光：７００ｎｍ）を記録するために、携帯型の近赤外線イメージングシステムに配置した。結果は、プローブ濃度に関係なく、ＣＤ４４標的用プローブは、関節炎軟骨組織（組織の右上の隅）に迅速に蓄積することができることを示している（図１０Ａ）。インキュベーション１０分後、経時的に蛍光強度の有意な増加は存在しない。この時点で、関節炎軟骨組織は、健常組織よりも約３倍高いプローブ蓄積を惹起する。類似する結果が、葉酸受容体標的用プローブについて観察された。全体的に見て、本発明者らの結果は、本発明者らのプローブが、関節炎軟骨の領域を迅速（１５分未満）に識別することに使用することができることを示している。

【0047】

図１１Ａ及び１１Ｂは、ＦＡ受容体標的用プローブを使用する機械的傷害軟骨の診断を示す。図１１Ａは、ＦＡ受容体標的用プローブが、健常組織（下部）よりも機械的に傷害を受けた組織（上部）に優先的に蓄積することを示す画像である。図１１Ｂは、傷害を受けた組織及び健常組織の両方に蓄積したプローブの量が、定量され、次に比較（右）されたグラフである。

【0048】

機械的な又は圧迫性外傷のためのプローブ。関節炎は、異なる機構によって引き起こされ得る。いくつかの検出方法が関節炎症について開発されたにもかかわらず、機械的な及び／又は圧迫性外傷によって引き起こされる軟骨傷害を検出するために開発された方法は存在しない。そのようなギャップを克服するために、ここでのプローブ開発は、機械的及び／又は圧迫性傷害軟骨の特質である、ＣＤ４４及び／又は葉酸受容体を標的とするために設計される。

【0049】

ヒト関節における健常軟骨は、インビボで１５〜２０ＭＰａと同じ程度の強さまでの標準的な機械的衝撃を繰り返し受ける。より高い物理的な衝撃は、組織傷害をもたらし得、最終的には軟骨分解が引き起こされ得る。軟骨傷害の早期検出は、非外科的な処置を使用して不可逆的な軟骨分解を防止するために極めて重要である。ＦＡ受容体標的用プローブが、機械的な負荷によって生成される軟骨傷害を検出するために使用することができるかどうかを調査するために、以前の研究による、機械的に傷害を受けたウシ軟骨外植片のインビトロモデルを利用した。簡潔に述べると、軟骨外植片ディスク（８×４ｍｍ、１ｍｍ厚）を、２週齢子ウシの大腿膝蓋の溝から得た。その後、軟骨外植片を、ＤＭＥＭ培養培地中で７日間培養した。それらの中で、いくつかの外植片を、１４〜２０ＭＰａで２．０分、止血薬を使用して又は軟骨組織の上部にステンレスロッドを配置して、外植片をクランプすることによって傷害を受けた外植片を生成するために使用した。機械的に傷害を受けた組織及び対照健常組織を、１５分間、３７℃で、１ウェル当たり３ｍｌのＤＭＥＭ（ＣＦ（商標）６４７色素標識化ＦＡ受容体標的用プローブ、０．４ｍｇ／ｍｌ）を含有する６ウェルプレートのウェルに配置した。最終的に、これらの組織のエクスビボイメージングを、携帯型の撮像装置を使用して取得した。結果は、かなり強い蛍光強度が、傷害を受けていない組織からよりも傷害を受けた組織から観察されることを示している（図１１Ａ）。軟骨外植片に対する機械的な衝撃は、約４倍高いＦＡ受容体標的用プローブ蓄積を惹起する（図１１Ｂ）。類似する結果が、ＣＤ４４受容体標的用プローブについて観察される。これらの結果は、ＦＡ受容体標的用プローブ及びＣＤ４４標的用プローブ両方が、機械的な衝撃関連の軟骨傷害を検出するために使用することができることを主張する。

【0050】

図１２Ａ〜１２Ｃは、ＣＤ４４標的用プローブを使用する機械的に傷害を受けた剣状突起の診断を示す。図１２Ａは、機械的傷害軟骨に蓄積するが、健常なものには蓄積しないＣＤ４４標的用プローブを示す（上部）。傷害を受けた組織及び健常組織の両方に蓄積したプローブの量を、定量し、次に比較した（下部）。図１２Ｂはエクスビボの結果を示し、図１２Ｃは蛍光の定量を示す。機械的傷害軟骨を検出するＣＤ４４標的用プローブの能力を、確立された剣状突起傷害モデルを使用して試験した。剣状突起を、１４〜２０ＭＰａ、２．０分の圧迫止血で傷害を受けさせた。２４時間傷害を受けた後、ＣＤ４４標的用プローブを、腹膜空間（循環血液のない閉鎖空間）に注射した。２４時間プローブ注射後、動物を、次にＫｏｄａｋインビボイメージングシステムを使用してイメージングした。本発明者らの結果は、ＣＤ４４標的用プローブが、生きた動物の内側の機械的傷害軟骨組織を診断することができることを見出した。

【0051】

小さい傷害（１ｍｍ又はそれ以上）のためのプローブ。今までのところ、傷害又は損傷軟骨の小さい領域に関連する、関節炎の早期段階を検出し、次に処置する方法は、開発されていない。本発明者らのプローブは、機械的な又は圧迫性の力を介して軟骨に小さい及び局在型の傷害を受けたことによって引き起こされることが多い、関節炎の早期段階を診断するために設計される。機械的な力は、細胞障害及び活性化を引き起こして、異なる程度のＣＤ４４受容体及び／又は葉酸（ＦＡ，folate acid）受容体を発現させる。高レベルのＣＤ４４受容体又はＦＡ受容体を有する領域を識別することによって、本発明者らのプローブは、非常に小さい及び局在型の機械的な又は圧迫性の力で誘導された傷害を識別するために使用することができる。

【0052】

図１３Ａは画像であり、図１３Ｂは１ｍｍ直径サイズの軟骨傷害のプロット定量である。ＣＤ４４標的用ＨＡ−ベースのプローブは、傷害を受けた部位で優先的に蓄積することが見出された。ＣＤ４４受容体標的用プローブ（ＣＦ（商標）６４７色素標識化を有する）を、２０ＭＰａ、２分間で、ステンレススチールロッド（１ｍｍ直径）によって引き起こされる軟骨表面傷害を検出するために使用した。プローブ溶液（０．４ｍｇ／ｍｌ）を、次に１５分間、全組織の上部に配置した。組織の蛍光画像を、次に携帯型の撮像装置を使用して記録した。本発明者らは、軟骨の傷害を受けた部位において強い蛍光シグナルを観察することができることを見出している。本発明者らの結果は、本発明者らのプローブが、軟骨表面に１ｍｍ直径と同じ程度小さい傷害を検出できることを示している。この能力により、我々は、改善された治療転帰のために、傷害軟骨の領域にのみ処置を送達することが可能になる。

【0053】

最小の内部移行なしの表面分子のためのプローブ（２００ｎｍを超える）。全ての現存するプローブは、ナノメートルサイズ（１００ｎｍ未満）に製作される。残念ながら、そのような小さいサイズを有するプローブは、細胞によって容易に内部移行され得る。この特性は傷害診断の正確さに影響する、というのも、プローブの蓄積が、細胞表面の標的化又は細胞内部移行によって引き起こされるかどうかを区別することが困難であろうからである。そのような弱点を克服するために、本発明者らのプローブは、内部移行（又は細胞によって摂食される）される機会が実質的により少ない、サブマイクロメートルサイズに製作される。

【0054】

本発明者らは、粒子：細胞受容体相互作用を放出させるためにキレーター（ＥＤＴＡ）を使用した。しかし、プローブが細胞によって内部移行されると、そのような処置はプローブを洗浄して除去することができず、細胞はプローブの蛍光強度を保持する。

【0055】

図１４は、それらの内部移行される機会へのＣＤ４４標的用プローブのサイズの影響のグラフである。本発明者らのデータは、２５０ｎｍを超えるプローブが、大部分は受容体相互作用を介して関節炎組織に蓄積することを見出している。しかし、小さなプローブ（例えば、５０ｎｍ直径）は、内部移行を介して関節炎組織に蓄積し、これはＥＤＴＡ洗浄で除去することができない。ヒト関節炎軟骨組織を、６ウェルプレートに配置した。各ウェルに関して、２つの異なるサイズのＣＦ（商標）６４７色素標識化ＣＤ４４標的用プローブ（２５０ナノメートル直径対５０ナノメートル直径）を含有する６ｍｌのＤＭＥＭ培地を、３００μｇ／ｍｌ、３７℃で６０分インキュベートした。組織を、次に０．０５％ ＥＤＴＡを有するＤＭＥＭ培地でインキュベートした。様々な時点で、プレーティングしたウェルを、組織の蛍光強度（励起：６３０ｎｍ；発光：７００ｎｍ）を記録するために、Ｋｏｄａｋインビボイメージングシステムに配置し、結果を図１４に示した。

【0056】

本発明者らは、５０ｎｍサイズのプローブでインキュベートした組織が、２５０ｎｍプローブでインキュベートした組織よりも、それらの蛍光強度をかなり良好に保持していることを見出している。これらの結果は、より大きなサイズのプローブが、小さいサイズのプローブよりも、内部移行の機会を減少させることができ、関節炎診断についてより良い機会を有し得ることを支持している。したがって、全ての本発明者らのプローブは、２００ｎｍを超えるサイズで製作される。

【0057】

軟骨細胞を動員するためのプローブ。本発明者らのゴールは、軟骨傷害を受けた部位への軟骨細胞の動員を惹起することである。次に、軟骨細胞の存在が傷害軟骨組織及び細胞の修復の助けとなるであろう。傷害軟骨組織／細胞標的用ＨＡ粒子は、軟骨細胞特異的ケモカインを負荷される。傷害を受けた組織部位を放出することにより、放出されたケモカインは、軟骨組織傷害の部位に軟骨細胞の動員に指し向けるためのケモカイン勾配を生じる。

【0058】

ＨＡスキャフォールドからの放出された生体分子に関連した軟骨細胞移動の調査。図１５は、放出されたＳＤＦ１、ＳＤＦ１β、及びＥｐｏにより誘導されたヒト軟骨細胞移動を示すプロットである。放出されたＥＰＯ、ＳＤＦ−１α及びＳＤＦ−１βを、７００μｌの無血清軟骨細胞増殖培地（ＥＰＯ、ＳＤＦ−１α及びＳＤＦ−１βの最終濃度：１０単位／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌ）に加え、次に馴化培地を、transwellのボトムチャンバーに移した。２００μｌの無血清軟骨細胞増殖培地中の２×１０^５ヒト軟骨細胞を、トップチャンバーに配置した。２４時間インキュベーション後、移動した軟骨細胞を、Wright-Geimsaで染色し、顕微鏡下で計数した。結果を図１５に示した。興味深いことに、放出されたケモカインが、ヒト軟骨細胞の移動を促進することができることも発見された。定量分析により、対照培地よりも、おおよそ４．９、３．７及び４．２倍高い細胞移動が存在することが示された。これらの結果は、傷害軟骨細胞の部位でケモカインを放出することによって、ＨＡスキャフォールドが、傷害を受けた部位に幹細胞、軟骨細胞又は両方のタイプの細胞の動員を促進し得ることを示唆している。この「ボーナス」は、傷害軟骨組織の再生をさらに増強し得る。

【0059】

幹細胞を動員するためのプローブ。本発明者らのゴールは、軟骨傷害を受けた部位への幹細胞の動員を惹起することである。次に、幹細胞の存在が傷害軟骨組織及び細胞の修復の助けとなるであろう。傷害軟骨組織／細胞標的用ＨＡ粒子は、幹細胞特異的ケモカインを負荷される。傷害を受けた組織部位を放出することにより、放出されたケモカインは、軟骨組織傷害の部位に幹細胞の動員に指し向けるためのケモカイン勾配を生じる。

【0060】

様々な増殖因子によって惹起される幹細胞移動の調査。図１６は、様々な増殖因子により誘導されたＢＭＳＣ移動及び定量分析を示すプロットである。５種の増殖因子（ＳＤＦ、ＥＰＯ、ＶＥＧＦ、ＣＣＬ２及びＣＣＬ１６）を、使用した。調査を通して、大部分の量の幹細胞を動員することができる、２〜３つの増殖因子が、選択される。これを行うために、細胞移動アッセイを、Transwell（８μｍポリカーボネート、６．５ｍｍインサート、Costar社）を使用して行った。ヒト骨髄ストローマ細胞（ＢＭＳＣ，human bone marrow stromal）を、ＰＢＳで三度洗浄し、次にＲＰＭＩ中に一晩プレーティングした。全ての実験において、５×１０^４細胞を、ＲＰＭＩ（１００μｌ）中に再懸濁し、それぞれｒＨｕＥＰＯ（１００単位／ｍｌ）、ＣＣＬ２（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＣＬ１６（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＤＦ（９ｎｇ／ｍｌ）及びＶＥＧＦ（０．８μｇ／ｍｌ）でインキュベートした。細胞を、各移動チャンバーの上部に加え、下のチャンバー中に１０％ＦＣＳの存在下で１４ｈチャンバーの下面に移動させた。フィルターの上部表面を、細胞を拭き清浄にし、フィルターを次に１００％メタノール中に浸漬することによって固定し、ギムザで１５分間染色した。移動した細胞を、明視野で顕微鏡を使用して取得した。取得された画像から、移動した細胞を、ImageJソフトウェアを使用して計数した。結果をＡｐｐ．１６に示した。ＥＰＯ及びＳＤＦが、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ２及びＶＥＦＧよりも、かなりより多くのＢＭＳＣ移動を惹起することを観察することができる。定量分析は、対照と比較して、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ２、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ及びＥＰＯが、それぞれ５．２、７．６、７．８、１８及び１９倍高い細胞移動を惹起することを示す。したがって、ＥＰＯ及びＳＤＦ（１α及び１β）は、細胞移動を動員するために使用することができる。

【0061】

ＨＡスキャフォールドからの放出された生体分子に関連した幹細胞移動の調査。図１７は、それぞれ対照ＥＰＯ、ＨＡ粒子から放出されたＥＰＯ及び培地により誘導されたＢＭＳＣ移動のプロットである。生体分子を、物理吸着及び化学的なコンジュゲーションの２つの様式においてＨＡスキャフォールドに負荷した。物理吸着に関して、１ｍｇのＨＡスキャフォールド（直径５００ｎｍ）を、一晩、４℃で、２００μｌのＰＢＳ緩衝液中の７μｇのＥＰＯでインキュベートした。上清を遠心分離によって収集し、遊離ＥＰＯ量をＥＰＯの負荷効率を決定するために測定した。化学的なコンジュゲーションに関して、１．０ｍｇのＨＡスキャフォールド（直径５００ｎｍ）及び７μｇのＥＰＯを、２００μｌのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ：４．５）に順次分散し、次に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（ＥＰＯとＥＤＣのモル比１：１０で）を混合物に加えて、ＨＡスキャフォールドへのＥＰＯコンジュゲーションを開始させた。２４時間インキュベーション後、ＥＰＯ負荷ＨＡスキャフォールドを、ＤＩ水に対して徹底して透析することで精製した。ＳＤＦ−１α／ＳＤＦ−１β負荷ＨＡスキャフォールドも、類似する方法を使用して調製した。

【0062】

例として、ＥＰＯ負荷ＨＡ粒子を、幹細胞移動を惹起するために使用した。その目的のため、ＥＰＯを、物理的な方法によってＨＡ粒子に負荷した。２００単位のＥＰＯを含有する０．１ｍｇのＨＡ粒子をＲＰＭＩ培地に加え、次にＥＰＯ負荷ＨＡ培地を２日間、３７℃でインキュベートした。上清を、遠心分離によって収集し、transwell移動アッセイによる幹細胞移動研究のために使用した。新鮮なＥＰＯ（２００単位）及び培地を、対照として使用した。結果をＡｐｐ．１７に示した。放出されたＥＰＯが、幹細胞移動を惹起することができることを観察することができるが、新鮮なＥＰＯと比較して移動した幹細胞におけるわずかな減少（約８％）が存在する。この移動した幹細胞の減少は、ＨＡ粒子からの不完全なＥＰＯ放出に起因し得る。

【0063】

軟骨細胞への分化に指し向けるためのスキャフォールド。幹細胞を、異なる因子／カクテルを使用して軟骨細胞に分化させることができることは十分に確立されている。軟骨の傷害を受けた部位で軟骨形成因子を放出させることにより、傷害軟骨標的用プローブが、動員された幹細胞の軟骨細胞への分化を促進させるために作製される。傷害軟骨標的用プローブは、軟骨細胞への分化微小環境を作り出し、動員された幹細胞の軟骨細胞への分化を促進するために、軟骨細胞への分化因子で（物理的又は化学的に）負荷される。

【0064】

幹細胞分化の調査は、ＨＡスキャフォールドからの放出された生体分子に関連した。図１８Ａは放出されたＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３によって惹起されたＢＭＳＣ分化の画像であり、図１８Ｂはその定量分析である。さらなる研究も行って、ケモカイン負荷ＨＡスキャフォールドの能力を評価し、移動した幹細胞の軟骨細胞への分化を促進した。移動したＢＭＳＣを、対照としての培養培地、ＨＡ（直径５００ｎｍ）から放出された１０ｎｇ／ｍｌの濃度でのＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３でインキュベートした。３週間培養後、軟骨マトリックス形成の程度を、次にトルイジンブルー染色を使用して定量的に分析した。結果を図１８に示した。ＴＧＦ−β１は、ＴＧＦ−β３よりも、幹細胞のわずかに高い軟骨細胞への分化を惹起する。これらの結果は、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３のようなケモカイン因子を放出させることによって、軟骨又は滑膜幹細胞が、傷害軟骨に移動し、組織を再生することができることを示す。

【0065】

軟骨組織再生における傷害軟骨標的用ＨＡスキャフォールドの調査。関節炎軟骨組織を、ＨＡ粒子スキャフォールドで２週の期間にわたってインキュベートした。組織を、次に切片化し、サフラニン−Ｏで染色した。軟骨傷害の程度を、次に修正Ｍａｎｋｉｎ分類体系に基づいて定量した。図１９Ａは、対照の傷害を受けた組織の画像であり、ＨＡ粒子処置した傷害を受けた組織の画像である。画像は、ＨＡ粒子の処置が、軟骨細胞及び組織の再生を促進することができることを示す。修正Ｍａｎｋｉｎスコア（図１９Ｂ）は、ＨＡスキャフォールド処置が、おそらく軟骨再生を惹起することによって、傷害軟骨を有意に減少させることを支持している。傷害軟骨標的用ＨＡ粒子スキャフォールドの蓄積が、周囲の健常組織から傷害を受けた部位に移動する軟骨細胞の移入を促進し得る蓋然性が高い。

【0066】

軟骨組織再生における、ＥＰＯを負荷し、間葉系幹細胞（ＭＳＣ，mesenchymal stem cell）でインキュベートした、傷害軟骨標的用ＨＡスキャフォールドの調査。関節炎軟骨組織を、ＨＡ粒子スキャフォールドで２週の期間にわたってインキュベートした。組織を、次に切片化し、サフラニン−Ｏで染色した。軟骨傷害の程度を、次に修正Ｍａｎｋｉｎ分類体系に基づいて定量した。図２０Ａは、対照の傷害を受けた組織の画像であり、ＨＡ粒子処置した傷害を受けた組織の画像である。画像は、ＨＡ粒子の処置が、軟骨細胞及び組織の再生を促進することができることを示す。修正Ｍａｎｋｉｎスコア（図２０Ｂ）は、ＥＰＯ負荷ＨＡスキャフォールドとＭＳＣの組合せ処置が、おそらく幹細胞性の軟骨再生を惹起することによって、傷害軟骨を大幅に減少させることを支持している。ＨＡ粒子スキャフォールドが、傷害軟骨を標的とし、次にＥＰＯを放出し、これにより傷害軟骨におけるＭＳＣ蓄積をもたらし得る蓋然性が高い。結果として、処置は、幹細胞の軟骨細胞応答、次に軟骨再生を有意に改善する。

【0067】

本明細書及び特許請求の範囲に使用されるように、用語「含む（comprising）」及び含む（comprising）の任意の形態、例えば「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」）、「有する（having）」（及び有する（having）の任意の形態、例えば「有する（have）」及び「有する（has）」）、「含む（including）」（及び含む（including）の任意の形態、例えば「含む（includes）」及び「含む（include）」）又は「含有する（containing）」（及び含有する（containing）の任意の形態、例えば「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」）は、包括的又はオープンエンドであり、追加の、未記載の要素又は方法ステップを排除しない。本明細書中に提供される組成物及び方法のいずれかの実施形態において、「含む（comprising）」は、「から本質的になる（consisting essentially of）」又は「からなる（consisting of）」で置きかえてもよい。本明細書中に使用されるように、語句「から本質的になる（consisting essentially of）」は、特定の整数又はステップ並びに請求項に係る発明の形質（character）又は機能に実質的に影響しないものを必要とする。本明細書中に使用されるように、用語「からなる（consisting）」は、記載の整数（例えば、特徴、要素、特質（characteristic）、特性、方法／プロセスステップ又は限定）又は整数の群（例えば、複数の特徴、複数の要素、複数の特質、複数の特性、複数の方法／プロセスステップ又は限定）のみの存在を示すために使用される。

【0068】

本明細書中に使用されるように、限定されることなく、「約」、「実質的な」又は「実質的に」などの近似の用語は、そのように修飾されることが、必ずしも絶対的に又は完全に理解されないが、通常の当業者に対して、その条件が存在しているとして指定されることが保証されるほど十分に近いと考えられるであろう条件を指す。説明が変動し得る程度は、どれほど大きい変化が起こり得、当業者に、必要とされる特質及び未修飾の特徴の能力をなおも有しているとして、修飾される特徴がなおも認識されるかに依存する。先行する考察の対象であるが、一般に、「約」などの近似の用語によって修飾される、本明細書中の数値は、明記される値から少なくとも±１、２、３、４、５、６、７、１０、１２又は１５％まで変動し得る。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】