特許 6802167 リアーゼおよびリアーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するベクターおよび（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールの不斉合成方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6802167

(24)【登録日】2020年11月30日

(45)【発行日】2020年12月16日

(54)【発明の名称】リアーゼおよびリアーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するベクターおよび（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールの不斉合成方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/88 20060101AFI20201207BHJP

   C12N 15/60 20060101ALI20201207BHJP

   C12P 7/26 20060101ALI20201207BHJP

   C12P 41/00 20060101ALI20201207BHJP

   C12N 1/21 20060101ALN20201207BHJP

   C12N 1/15 20060101ALN20201207BHJP

【ＦＩ】

   C12N9/88ZNA

   C12N15/60

   C12P7/26

   C12P41/00 F

   !C12N1/21

   !C12N1/15

【請求項の数】16

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2017-533686(P2017-533686)

(86)(22)【出願日】2015年8月14日

(65)【公表番号】特表2017-530725(P2017-530725A)

(43)【公表日】2017年10月19日

(86)【国際出願番号】DE2015000407

(87)【国際公開番号】WO2016041533

(87)【国際公開日】20160324

【審査請求日】2018年4月10日

(31)【優先権主張番号】102014013644.2

(32)【優先日】2014年9月16日

(33)【優先権主張国】DE

(73)【特許権者】

【識別番号】390035448

【氏名又は名称】フォルシュングスツェントルム・ユーリッヒ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】100069556

【弁理士】

【氏名又は名称】江崎 光史

(74)【代理人】

【識別番号】100111486

【弁理士】

【氏名又は名称】鍛冶澤 實

(74)【代理人】

【識別番号】100139527

【弁理士】

【氏名又は名称】上西 克礼

(74)【代理人】

【識別番号】100164781

【弁理士】

【氏名又は名称】虎山 一郎

(72)【発明者】

【氏名】ローター・デルテ

(72)【発明者】

【氏名】ポール・マルティーナ

(72)【発明者】

【氏名】ゼール・トルステン

(72)【発明者】

【氏名】マルクス・リーザ

(72)【発明者】

【氏名】ヴェストファル・ローベルト

【審査官】 北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】 Angew. Chem. Int. Ed.，２０１４年 ７月１５日，Vol.53，p.9376-9379

【文献】 ChemCatChem，２０１１年，Vol.3，p.1587-1596

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ９／００−９／９９

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１、３または９のうちの一つのアミノ酸配列を有することを特徴とする、リアーゼ。

【請求項2】

配列番号２、４または１０のヌクレオチド配列を有することを特徴とする、リアーゼをコードするデオキシリボ核酸。

【請求項3】

請求項２に記載の配列を含むことを特徴とする、ベクター。

【請求項4】

プラスミドであることを特徴とする、請求項３に記載のベクター。

【請求項5】

請求項２に記載の配列が、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２４ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａ（＋）、ｐＥＴ−２９ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３４ｂ（＋）、ｐＥＴ−３５ｂ（＋）、ｐＥＴ−３６ｂ（＋）、ｐＥＴ−３７ｂ（＋）、ｐＥＴ−３８ｂ（＋）の群からの空のベクターに連結されていることを特徴とする、請求項４に記載のベクター。

【請求項6】

ベンズアルデヒドが、式（１）

【化1】

に従って、ピルビン酸またはアセトアルデヒドと共に変換される（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールの製造方法であって、変換が、請求項１に記載のリアーゼを用いて行われることを特徴とする、製造方法。

【請求項7】

ｐＨ値５〜９で行われることを特徴とする、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

緩衝液としてＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＡまたはＴＲＩＳ−ＨＣｌが使用されることを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。

【請求項9】

補因子としてチアミン二リン酸および硫酸マグネシウムが使用されることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか一つに記載の方法。

【請求項10】

変換が、ｉｎ ｖｉｖｏで行われることを特徴とする、請求項６〜９のいずれか一つに記載の方法。

【請求項11】

（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールの産生が、大腸菌、コリネバクテリウム、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム、または酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエの群からの産生生物において行われることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

請求項１１の生物が配列番号２、４または１０のうちの少なくとも一つのＤＮＡで形質転換され、かつ／または上記ＤＮＡがゲノムに組み込まれることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の方法。

【請求項13】

形質転換のために、請求項３〜５のいずれか一つに記載のベクターが使用されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

変換が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われることを特徴とする、請求項６〜９のいずれか一つに記載の方法。

【請求項15】

配列番号１、３または９のいずれか一つの単離された酵素が使用されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

産生生物からの粗製細胞抽出物が使用されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、リアーゼおよびリアーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するベクターおよび（Ｓ）−フェニルアセチル−カルビノールの不斉合成方法に関する。

【背景技術】

【0002】

（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールは、有機合成における貴重なキラル構成要素であり、ファインケミカルおよび医薬品を合成するために利用することができる。従来の技術水準によると、アキラルで安価な化合物から不斉合成により（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノール、すなわち（Ｓ）−ＰＡＣを光学純度＞８９％ｅｅで生成することができる方法は全く知られていない。しかしながら、高い光学純度は、ファインケミカルまたは医薬品を製造する場合に断然重要である。

【0003】

従来技術によると、（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールを製造する目的で、多様な方法が公知である。

【0004】

一つには、化学合成が公知である。
不斉化学合成に基づく（Ｓ）−ＰＡＣの製造方法は、６８％または８６％のｅｅを生じる。これらの方法は、刊行物Ｄａｖｉｓ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ａ．；Ｓｈｅｐｐａｒｄ， Ａｕｒｅｌｉａ Ｃ．；Ｌａｌ， Ｇ． Ｓａｎｋａｒ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８９年、３０巻、７ ７７９〜７８２頁（非特許文献１）およびＡｄａｍ， Ｗａｌｄｅｍａｒ；Ｆｅｌｌ， Ｒａｉｎｅｒ Ｔ．；Ｓｔｅｇｍａｎｎ， Ｖｅｉｔ Ｒ．；Ｓａｈａ−Ｍｏｅｌｌｅｒ， Ｃｈａｎｔｕ Ｒ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９９８年、１２０巻、４ ７０８〜７１４頁（非特許文献２）に記載されている。加えて、例えば以下の反応、例えば刊行物Ｔｏｕｋｏｎｉｉｔｔｙ， Ｅｓａ；Ｍａｅｋｉ−Ａｒｖｅｌａ， Ｐａｅｉｖｉ；Ｋｕｚｍａ， Ｍａｒｅｋ；Ｖｉｌｌｅｌａ， Ａｌｅｘａｎｄｒｅ；Ｋａｌａｎｔａｒ Ｎｅｙｅｓｔａｎａｋｉ， Ａｈｍａｄ；Ｓａｌｍｉ， Ｔａｐｉｏ；Ｓｊｏｅｈｏｌｍ， Ｒａｉｎｅｒ；Ｌｅｉｎｏ， Ｒｅｋｏ；Ｌａｉｎｅ， Ｅｎｓｉｏ；Ｍｕｒｚｉｎ， Ｄｍｉｔｒｙ Ｙｕ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ、２００１年、２０４巻、２ ２８１〜２９１頁（非特許文献３）に記載されている１−フェニルプロパン−１，２−ジオンの還元およびＦｌｅｍｉｎｇ， Ｓｔｅｖｅｎ Ａ．；Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｓｅａｎ Ｍ．；Ｈｉｒｓｃｈｉ， Ｊｅｎｎｉｆｅｒ；Ｌｉｕ， Ｒｅｎｍａｏ；Ｐａｃｅ， Ｊ． Ｌｅｅ；Ｒｅｄｄ， Ｊ． Ｔｙ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００４年、４５巻、１７ ３３４１〜３３４３頁（非特許文献４）によって記載されているベンズアルデヒドに基づく合成およびＢｒｕｓｓｅｅ， Ｊ．；Ｒｏｏｓ， Ｅ． Ｃ．；Ｇｅｎ， Ａ． Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８８年、２９巻、３５ ４４８５〜４４８８頁（非特許文献５）によって記載されている２−ヒドロキシ−２−フェニルアセトニトリルの反応におけるように、（Ｓ）−ＰＡＣが副生成物としてだけ生成し、（Ｒ）−ＰＡＣが鏡像体過剰で存在する方法がある。

【0005】

さらにまた、キラル構成要素１−フェニルプロパン−１，２−ジオールを（Ｓ）−ＰＡＣに酸化することができる合成が記載されている。（Ｓ）−ＰＡＣは、Ｚｉ−Ｑｉａｎｇ Ｒｏｎｇ、Ｈｕｉ−Ｊｉｅ Ｐａｎ、Ｈａｉ−Ｌｏｎｇ Ｙａｎ、およびＹｕ Ｚｈａｏ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２０１４年１６（１）、２０８〜２１１頁（非特許文献６）によって記載されたように鏡像体過剰率（ｅｅ）９１％で、またはＷａｌｄｅｍａｒ Ａｄａｍ、Ｃｈａｎｔｕ Ｒ． Ｓａｈａ−Ｍｏｅｌｌｅｒ、およびＣｏｎｇ−Ｇｕｉ Ｚｈａｏ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６４（２０）、７４９２〜７４９７頁；１９９９年（非特許文献７）によって記載されたように６９％で生成するが、加えて、手間をかけて除去しなければならない位置異性体が混入する。

【0006】

さらに、２０１３年のＡｌｖａｒｏ Ｇｏｍｅｚ Ｂａｒａｉｂａｒによる標題「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ （Ｓ）−ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙ ｋｅｔｏｎｅｓ」（非特許文献８）の論文に記載されている酵素的不斉合成が公知である。この論文に従って、細胞全体で合成させるために大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に異種発現させたこの酵素を使用すると、（Ｓ）−ＰＡＣの光学純度は、約４３％ｅｅになる。

【0007】

（Ｓ）−ＰＡＣのこの唯一の酵素的不斉合成は、ベンズアルデヒドおよびアセトアルデヒド、またはベンズアルデヒドおよびピルビン酸に基づく炭素連結反応において記載された。この反応は、４６９位のグルタミン酸がグリシンによって置換されている、アセトバクター・パストリアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）由来酵素ピルビン酸デカルボキシラーゼ変異体であるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇによって触媒される。その際、単離された酵素を用いて達成された最高の鏡像体過剰率は、Ｒｏｔｈｅｒ Ｎｅｅ Ｇｏｃｋｅ， Ｄｏｅｒｔｅ；Ｋｏｌｔｅｒ， Ｇｅｒａｌｄｉｎｅ；Ｇｅｒｈａｒｄｓ， Ｔｉｎａ；Ｂｅｒｔｈｏｌｄ， Ｃａｔｒｉｎｅ Ｌ．；Ｇａｕｃｈｅｎｏｖａ， Ｅｋａｔｅｒｉｎａ；Ｋｎｏｌｌ， Ｍｉｃｈａｅｌ；Ｐｌｅｉｓｓ， Ｊｕｅｒｇｅｎ；Ｍｕｅｌｌｅｒ， Ｍｉｃｈａｅｌ；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｇｕｎｔｅｒ；Ｐｏｈｌ， ＭａｒｔｉｎａによってＣｈｅｍＣａｔＣｈｅｍ、２０１１年、３巻、１０ １５８７〜１５９６頁（非特許文献９）での公表に記載されるように、８９％である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｄａｖｉｓ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ａ．；Ｓｈｅｐｐａｒｄ， Ａｕｒｅｌｉａ Ｃ．；Ｌａｌ， Ｇ． Ｓａｎｋａｒ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８９年、３０巻、７ ７７９〜７８２頁

【非特許文献2】Ａｄａｍ， Ｗａｌｄｅｍａｒ；Ｆｅｌｌ， Ｒａｉｎｅｒ Ｔ．；Ｓｔｅｇｍａｎｎ， Ｖｅｉｔ Ｒ．；Ｓａｈａ−Ｍｏｅｌｌｅｒ， Ｃｈａｎｔｕ Ｒ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９９８年、１２０巻、４ ７０８〜７１４頁

【非特許文献3】Ｔｏｕｋｏｎｉｉｔｔｙ， Ｅｓａ；Ｍａｅｋｉ−Ａｒｖｅｌａ， Ｐａｅｉｖｉ；Ｋｕｚｍａ， Ｍａｒｅｋ；Ｖｉｌｌｅｌａ， Ａｌｅｘａｎｄｒｅ；Ｋａｌａｎｔａｒ Ｎｅｙｅｓｔａｎａｋｉ， Ａｈｍａｄ；Ｓａｌｍｉ， Ｔａｐｉｏ；Ｓｊｏｅｈｏｌｍ， Ｒａｉｎｅｒ；Ｌｅｉｎｏ， Ｒｅｋｏ；Ｌａｉｎｅ， Ｅｎｓｉｏ；Ｍｕｒｚｉｎ， Ｄｍｉｔｒｙ Ｙｕ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ、２００１年、２０４巻、２ ２８１〜２９１頁

【非特許文献4】Ｆｌｅｍｉｎｇ， Ｓｔｅｖｅｎ Ａ．；Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｓｅａｎ Ｍ．；Ｈｉｒｓｃｈｉ， Ｊｅｎｎｉｆｅｒ；Ｌｉｕ， Ｒｅｎｍａｏ；Ｐａｃｅ， Ｊ． Ｌｅｅ；Ｒｅｄｄ， Ｊ． Ｔｙ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００４年、４５巻、１７ ３３４１〜３３４３頁

【非特許文献5】Ｂｒｕｓｓｅｅ， Ｊ．；Ｒｏｏｓ， Ｅ． Ｃ．；Ｇｅｎ， Ａ． Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８８年、２９巻、３５ ４４８５〜４４８８頁

【非特許文献6】Ｚｉ−Ｑｉａｎｇ Ｒｏｎｇ、Ｈｕｉ−Ｊｉｅ Ｐａｎ、Ｈａｉ−Ｌｏｎｇ Ｙａｎ、およびＹｕ Ｚｈａｏ、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２０１４年１６（１）、２０８〜２１１頁

【非特許文献7】Ｗａｌｄｅｍａｒ Ａｄａｍ、Ｃｈａｎｔｕ Ｒ． Ｓａｈａ−Ｍｏｅｌｌｅｒ、およびＣｏｎｇ−Ｇｕｉ Ｚｈａｏ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６４（２０）、７４９２〜７４９７頁；１９９９年

【非特許文献8】Ａｌｖａｒｏ Ｇｏｍｅｚ Ｂａｒａｉｂａｒ、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ （Ｓ）−ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙ ｋｅｔｏｎｅｓ」、２０１３年

【非特許文献9】Ｒｏｔｈｅｒ Ｎｅｅ Ｇｏｃｋｅ， Ｄｏｅｒｔｅ；Ｋｏｌｔｅｒ， Ｇｅｒａｌｄｉｎｅ；Ｇｅｒｈａｒｄｓ， Ｔｉｎａ；Ｂｅｒｔｈｏｌｄ， Ｃａｔｒｉｎｅ Ｌ．；Ｇａｕｃｈｅｎｏｖａ， Ｅｋａｔｅｒｉｎａ；Ｋｎｏｌｌ， Ｍｉｃｈａｅｌ；Ｐｌｅｉｓｓ， Ｊｕｅｒｇｅｎ；Ｍｕｅｌｌｅｒ， Ｍｉｃｈａｅｌ；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｇｕｎｔｅｒ；Ｐｏｈｌ， Ｍａｒｔｉｎａ、ＣｈｅｍＣａｔＣｈｅｍ、２０１１年、３巻、１０ １５８７〜１５９６頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

従来技術から出発して、本発明の課題は、（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールを不斉合成するための酵素的方法であって、（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールのより高い鏡像体過剰率を可能にする酵素的方法を提供することである。（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールの鏡像体過剰率は、８９％より高いべきである。細胞全体を用いて製造する場合、鏡像体過剰率は４３％を超えるべきである。さらに、副生成物も、位置異性体も形成すべきでない。その際、キラルではない安価な出発材料を使用できるべきである。（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールの不斉合成が可能になるべきである。キラル生成混合物の高価な分離は回避すべきである。
（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールをベンズアルデヒドおよびピルビン酸またはアセトアルデヒドから製造できる酵素ならびにその酵素をコードするＤＮＡおよび当該ＤＮＡを含有するベクターが提供されるべきである。
さらに、その酵素の製造方法が提供されるべきである。従来技術による目下の欠点および問題が、克服されるべきである。
粗製細胞抽出物または細胞全体を使用した場合にも高い鏡像体過剰率を可能にする、（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールの製造方法が提供されるべきである。
従来技術の欠点が、累積的に克服されるべきである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

この課題は、請求項１および他の独立請求項の前提部に基づき、本発明により、これらの請求項の特徴部分に示した特徴によって解決される。本発明によると、この課題は、５４３位のトリプトファンが、立体的により小さいかもしくはトリプトファンと比べて減少した嵩高さ（Ｒａｕｍｅｒｆｕｅｌｌｕｎｇ）を有するアミノ酸によって置換されているリアーゼＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇの変異体、ならびにそれをコードするデオキシリボ核酸およびこれらのデオキシリボ核酸を含有するベクターによって解決される。さらに、この課題は、独立請求項に従い、ベンズアルデヒドをピルビン酸またはアセトアルデヒドと共に変換して（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールにするためにこのリアーゼが使用されることによって解決される。

【0011】

本発明によるリアーゼ、それをコードするＤＮＡ、上記ベクターおよび（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールの製造方法を用いると、今や、単離した酵素を使用した場合に９７％ｅｅの鏡像体過剰率で、細胞全体を使用した場合に９５％ｅｅ、および粗製細胞抽出物を使用した場合に９４％ｅｅの（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールを製造することが可能である。副生成物、特に位置異性体は形成しない。合成をアキラル出発材料で済ませることによって、合成は格安になる。鏡像体の分割を省略することができる。（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールを製造する場合、粗製細胞抽出物または細胞全体を用いて高い鏡像体過剰率を達成することもできる。従来技術により記載されている全ての欠点が、累積的に取り除かれる。

【0012】

本発明の有利なさらなる発展形態は、従属請求項に記載される。

【0013】

本発明によると、アセトバクター・パストリアヌス由来の野生型と比べて改変されたタンパク質ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇにおける５４３位のトリプトファンが、トリプトファンよりも立体的に小さいかもしくはトリプトファンよりも嵩高さが低い（ｗｅｎｉｇｅｒ ｒａｕｍｅｒｆｕｅｌｌｅｎｄ）アミノ酸によって置き換えられているリアーゼが提供される。

【0014】

このリアーゼは、（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールを製造する場合に立体選択性の増大にプラスの影響を及ぼす。

【0015】

好ましくは、この要件を満たす、以下のリアーゼを挙げることができる：
− ５４３位にヒスチジンを有する、配列番号１によるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｈ
− ５４３位にフェニルアラニンを有する、配列番号３によるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｆ
− ５４３位にプロリンを有する、配列番号５によるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｐ
− ５４３位にイソロイシンを有する、配列番号７によるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｉ
− ５４３位にロイシンを有する、配列番号９によるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｌ
− ５４３位にメチオニンを有する、配列番号１１によるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｍ
− ５４３位にバリンを有する、配列番号１３によるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｖ
− ５４３位にアラニンを有する、配列番号１５によるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ａ
− ５４３位にチロシンを有する、配列番号１７によるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｙ
− ５４３位にトレオニンを有する、配列番号１９によるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｔ
− ５４３位にグリシンを有する、配列番号２１によるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｇ
− ５４３位にセリンを有する、配列番号２３によるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｓ
− ５４３位にシステインを有する、配列番号２５によるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｃ

【0016】

さらに、本発明によると、前記酵素をコードするデオキシリボ核酸が提供される。

【0017】

本発明によると、酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇの変異体をコードするデオキシリボ核酸であって、１６２７〜１６２９位にトリプトファンと比べて嵩高さが低いアミノ酸をコードするデオキシリボ核酸が対象となる。
好ましくは、上記デオキシリボ核酸は配列１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および２５のタンパク質をコードする。
例えば、以下のデオキシリボ核酸を挙げることができる。
− ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｈをコードする配列番号２
− ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｆをコードする配列番号４
− ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｐをコードする配列番号６
− ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｉをコードする配列番号８
− ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｌをコードする配列番号１０
− ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｍをコードする配列番号１２
− ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｖをコードする配列番号１４
− ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ａをコードする配列番号１６
− ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｙをコードする配列番号１８
− ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｔをコードする配列番号２０
− ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｇをコードする配列番号２２
− ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｓをコードする配列番号２４
− ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｃをコードする配列番号２６

【0018】

この位置にアミノ酸ヒスチジンをコードする、配列番号２による例について、１６２７〜１６２９位に例えば核酸ＴＧＧがあることができる。
本発明の１つの実施態様において、上記デオキシリボ核酸は、ベクター、好ましくはプラスミドに連結されている。
空ベクターとしては、例えば、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋），ｐＥＴ−２３ａ−ｄ（＋），ｐＥＴ−２４ａ−ｄ（＋），ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａ（＋）、ｐＥＴ−２９ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３４ｂ（＋）、ｐＥＴ−３５ｂ（＋）、ｐＥＴ−３６ｂ（＋）、ｐＥＴ−３７ｂ（＋）、ｐＥＴ−３８ｂ（＋）を使用することができ、これらに上記の適当な本発明ＤＮＡが連結される。
あるいは、上記デオキシリボ核酸は、ゲノムに連結されることもできる。
上記の連結されたデオキシリボ核酸は、酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇの変異体をコードし、１６２７〜１６２９位にトリプトファンと比べて減少した嵩高さを有するアミノ酸をコードするＤＮＡ配列である。
好ましくは、上記の連結されたデオキシリボ核酸は、配列１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および２５によるタンパク質をコードする。
例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２４および２６によるデオキシリボ核酸を挙げることができる。
本発明により、酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇの変異体をコードし、１６２７〜１６２９位にトリプトファンと比べて減少した嵩高さを有するアミノ酸をコードするデオキシリボ核酸を含むベクターが提供される。
好ましくは、上記ベクターは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２４または２６によるデオキシリボ核酸を含む。
好ましくは、上記ベクターはプラスミドである。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１は、本発明のプラスミド（ｐＥＴ２１ ａ（＋）ベクター地図）を示す。

【0020】

配列番号２７において、例えば、配列番号２のＤＮＡを含む本発明のプラスミドを表す。

【0021】

本発明による酵素をコードするＤＮＡは、当業者に公知の方法に従って定方向または非定方向変異誘発によって製造することができる。その際、定方向変異誘発が好ましい。これらの方法は、当業者に公知である。特定の明細書部分に、本発明の一実施形態についての一製造例を具体的に開示する。このアプローチは、基本的に全ての他の開示されたデオキシリボ核酸および酵素のためにも使用することができ、その結果、本発明による全ての酵素およびデオキシリボ核酸を類似の方法で製造することができる。

【0022】

本発明によると、式（１）に従って、５４３位にトリプトファンと比べて減少した嵩高さをもつアミノ酸を有する酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇの変異体、好ましくは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３または２５による群からの酵素を用いて、ベンズアルデヒドがピルビン酸またはアセトアルデヒドと共に変換されて、（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールにされる。

【0023】

【化1】

【0024】

変換は、好ましくは水溶液中で行われる。

【0025】

ｐＨ値は、５〜９、好ましくは６．５〜８、特に好ましくは６．５〜７の範囲である。

【0026】

そのために、緩衝液として例えばリン酸カリウム緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＡまたはＴＲＩＳ−ＨＣｌを使用することができる。

【0027】

さらに、補因子としてチアミン二リン酸および硫酸マグネシウムを使用することができる。

【0028】

反応は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。

【0029】

（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールのｉｎ ｖｉｖｏ産生のために、産生生物として例えば大腸菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｋｔｅｒｉｕｍ）、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｋｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈｅｒｏｍｙｃｉｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母を使用することができる。

【0030】

その際に、産生生物は、本発明によるＤＮＡまたはそのＤＮＡを含むベクターで形質転換される。

【0031】

ＤＮＡは、産生生物のゲノム内に導入することもできる。

【0032】

その際、本発明により組み込まれた遺伝子は、異種発現される。

【0033】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ産生のために、単離された酵素または産生生物の細胞抽出物のいずれかを使用することができる。

【0034】

典型的な温度は、２０℃〜４０℃であり、好ましくは２０℃〜３０℃であり、特に好ましくは、温度２０℃〜２５℃である。

【0035】

反応時間は、２ｈ〜４８ｈ、好ましくは６ｈ〜２４ｈ、特に好ましくは１２ｈとし得る。

【0036】

以下にいくつかの例を紹介するが、これらの例を限定的に解釈すべきではない。

【0037】

反応は、古典的な手法で反応フラスコ中で撹拌しながら行うことができる。

【0038】

実施例１：
２０ｍＭベンズアルデヒド、４００ｍＭピルビン酸、２．５ｍＭ硫酸マグネシウム、１００μＭチアミン二リン酸、５ｍｇ／ｍＬのＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｈ（ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｈが発現されて存在した大腸菌の細胞全体）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、２５℃、反応時間：４８時間。

【0039】

（Ｓ）−ＰＡＣの鏡像体純度：ｅｅ ９４％。

【0040】

実施例２：
２０ｍＭベンズアルデヒド、４００ｍＭピルビン酸、２．５ｍＭ硫酸マグネシウム、１００μＭチアミン二リン酸、２０ｍｇ／ｍＬ（湿重量）ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｈ（ＡｐＰＣＤ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｈが発現されて存在した大腸菌細胞全体）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、２５℃、反応時間：４８時間。

【0041】

（Ｓ）−ＰＡＣの鏡像体純度：ｅｅ ９５％。
収率：６８％。

【0042】

実施例３：
２０ｍＭベンズアルデヒド、４００ｍＭピルビン酸、２．５ｍＭ硫酸マグネシウム、１００μＭチアミン二リン酸、１ｍｇ／ｍＬ ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｈ（単離された酵素）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、２５℃、反応時間：４８時間。
（Ｓ）−ＰＡＣの鏡像体純度：ｅｅ ９７％。
収率：６４％。

【0043】

変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｈは、単離された酵素を使用して、９７％ｅｅの（Ｓ）−ＰＡＣを産生する。大腸菌で異種発現され、安価な全細胞−触媒として使用されるＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｈを使用して、９５％ｅｅの（Ｓ）−ＰＡＣを生成することができる。大腸菌で異種発現されたＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｈ変異体を有する細胞抽出物としての使用は、９４％のｅｅをもたらす。

【0044】

以下に、酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｈをコードするデオキシリボ核酸の、および当該酵素の製造をより詳細に説明する。

【0045】

遺伝子配列ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ（テンプレートＤＮＡ）から出発してＷ５４３位でアミノ酸置換を受けるために、Ｒｅｅｔｓら（Ｍ．Ｔ．Ｒｅｅｔｚ，Ｄ．Ｋａｈａｋｅａｗ ａｎｄ Ｒ．Ｌｏｈｍｅｒ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２００８（９）１７９７-１８０４）の変法によるいわゆる「部位飽和変異誘発」の方法を実施した。この方法の場合、２０種の天然アミノ酸のうち１２種をコードするＮＤＴコドンを使用する。

【0046】

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
最初の段階で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりテンプレートＤＮＡを増幅し、その際、同時にいわゆる縮重プライマーおよびＮＤＴコドンの使用により突然変異を挿入する。使用するプライマーは、「Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ」社（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｏｆｉｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｅｕ）に注文したものであり、以下の配列を有した：

【0047】

ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３ＮＤＴを製造するための部位飽和変異誘発用プライマー
順方向： ５’ ＧＧＡＴＡＴＧＣＴＧＧＴＴＣＡＡＮＤＴＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＴＴＧＣ ３’（配列番号３０）
逆方向： ５’ ＧＧＣＡＡＣＣＴＴＧＣＧＧＣＣＡＨＮＴＴＧＡＡＣＣＡＧＣＡＴＡＴＣ ３’（配列番号３１）

【0048】

まず、マスター溶液を製造し、続いて４つの開始液にそれぞれ５０μｌずつ分配した。反応を開始するために、「ＫＯＤホットスタートポリメラーゼ」１μｌを添加した。

【0049】

ＰＣＲ反応開始液：

【0050】

【表1】

【0051】

反応を以下の条件で行った：

【0052】

【表2】

【0053】

テンプレートＤＮＡを消化するために、酵素ＤｐｎＩ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）１μｌを溶液に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、さらに形質転換する前に混合物全体を「ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎｌｉｓｔｅ）で精製した。

【0054】

大腸菌ＢＬ２１−ＤＥ３および大腸菌ＤＨ５αの形質転換
大腸菌株ＢＬ２１−ＤＥ３および大腸菌株ＤＨ５αを、「部位飽和変異誘発」によって製造したＤＮＡで形質転換した。このために、コンピテント細胞５０μｌにＤＮＡ １００ｎｇを添加し、氷上で３０分間インキュベートした。続いて、４２℃で９０秒間、熱ショックを行った。３分後に、氷上でＳＯＣ培地５００μｌを添加し、溶液をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ中のポートで３５０ＲＰＭおよび３７℃で４５分間インキュベートした。インキュベーションを行った後、細胞懸濁物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ組織遠心分離機に入れて１３，０００ＲＰＭで３０秒間遠心分離し、続いてペレットを上清１００μｌ中に再懸濁した。１００μｌに濃縮した細胞懸濁物をＬＢ寒天プレート（１００μｇ／ｍｌアンピシリン入り）上に播種し、３７℃で１６時間、逆さにしてインキュベートした。

【0055】

酵素変異体の発現
形質転換した個別のコロニー４６個を爪楊枝でプレートから釣り上げ、４８ Ｎｅｒｂｅプレート（Ｎｅｒｂｅ Ｐｌｕｓ ＧｍｂＨ）のそれぞれのウェルの中でＬＢ培地１ｍｌと共に８５０ＲＰＭおよび２０℃で２４時間インキュベートした（「マスタープレート」）。別のウェルに、予め同様にＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９ＧテンプレートＤＮＡで形質転換した大腸菌ＢＬ２１−ＤＥ３細胞を接種した。インキュベートした後、４８ウェルＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅ^{（登録商標）}（ｍ２ｐ−ｌａｂｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の中の自己誘導培地１．５ｍｌにつき細胞懸濁物１０μｌを入れた。ＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅを２０℃および８５０ＲＰＭで４８時間インキュベートした。「マスタープレート」の残りの体積（９９０μｌ）をグリセリン３００μｌと混合し、−８０℃で保存した。

【0056】

細胞破壊および炭素連結
ＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅ^{（登録商標）}（４８ウェルプレートにおける花の形のバッフル（Ｓｃｈｉｋａｎｅｎ））中に発現された変異体を凍結した（４８ｈ、４℃）。再解凍後、９６ウェルプレートの２つのウェルに細胞懸濁物を５００μｌずつ移した（二重の測定）。プレートを４，０００ＲＰＭで３分間遠心分離し、１ｍｇ／ｍｌリゾチームを有するＫＰｉ緩衝液４２０μｌ中にペレットを再懸濁した。プレートを２０℃および４００ＲＰＭで１時間インキュベートし、続いて再度４，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。それぞれ上清２５０μｌをそれぞれ２ｍｌ−Ｎｅｒｂｅプレートのウェル一つにピペットで入れ、４０ｍＭベンズアルデヒド、４００ｍＭピルビン酸、４ｍＭ硫酸マグネシウムおよび４００μＭチアミン二リン酸からの反応溶液２５０μｌを添加した。プレートを再度２４時間インキュベートし、続いて反応溶液を分析した（ＨＰＬＣ分析を参照されたい）。

【0057】

ＨＰＬＣ分析
炭素連結反応溶液２００μｌをそれぞれヘプタン２００μｌと混合し、ボルテックス撹拌し、続いて上相１５０μｌをそれぞれＨＰＬＣバイアル中に移した。Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＩＣ−３カラム（Ｃｈｉｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて、以下の方法を使用して試料の分析を行った。

【0058】

ＨＰＬＣのプログラム

【0059】

【表3】

【0060】

定量のための典型的な保持時間および使用波長

【0061】

【表4】

【0062】

ＤＮＡの単離およびＤＮＡ配列決定による最良の酵素変異体の同定
炭素連結反応において（Ｓ）−ＰＡＣについて最高のｅｅ値をもたらした酵素のＤＮＡを、マスタープレートに基づき突然変異を同定するために配列決定した。そのために、まず、グリセリンと混合したマスタープレートから細胞を白金耳でＬＢ培地（＋５０μｇ／ｍｌアンピシリン）５０ｍＬ中に移植し、２５０ｍＬ三角フラスコ中に入れて３７℃でインキュベートした。１２時間インキュベーション後に、細胞懸濁物２０ｍＬを遠心分離した（４，０００ＲＰＭ、５分、４℃）。ペレット中の細胞のＤＮＡを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ Ｎ．Ｖ．）の指示と同様に、「ＱＩＡｐｒｅｐ^{（登録商標）}Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ」の方法に従い単離した。その際、ＤＮＡの濃度を１００ｎｇ／μｌに調整し、ＬＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨ社がそのＤＮＡを配列決定した。

【0063】

ＬＢ（溶原性ブロス）培地

【0064】

【表5】

【0065】

ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ^{（登録商標）}を用いて変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｈを製造する代替的な定方向方法
酵素変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ／Ｗ５４３Ｈを製造する別の方法は、例えばいわゆるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ^{（登録商標）}−ＰＣＲ法（米国特許第５，７８９，１６６号、同第５，９３２，４１９号、同第６，３９１，５４８号）である。ＰＣＲのこの変法では、置換すべきＤＮＡトリプレットコードの位置に、対応する配列変化を有するプライマー対が使用される。酵素変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ／Ｗ５４３Ｈを製造するために、変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇをコードする遺伝子を使用することができる。このいわゆるＤＮＡテンプレートは、ベクター（例えばｐＥＴ２２ａ）中にクローニングされて存在すべきであろう。位置Ｗ５４３にアミノ酸トリプトファンをコードするトリプレットコードの代わりに、この位置にヒスチジンをコードする突然変異（すなわち：ＣＡＣまたはＣＡＴ）を有するプライマーを使用しなければならない。このＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ^{（登録商標）}−ＰＣＲ法の全ての他のパラメータおよび必要なプライマーの選択は、製造業者（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）の指示と同様に、「ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ^{（登録商標）}Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」の使用説明書を用いて実施することができる。

【0066】

変異体ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ−Ｗ５４３Ｈを製造するためのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ^{（登録商標）}−ＰＣＲ法のＤＮＡ−テンプレート（ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇ）
ＡＴＧＡＣＣＴＡＴＡＣＴＧＴＴＧＧＣＡＴＧＴＡＴＣＴＴＧＣＡＧＡＡＣＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＧＡＴＣＧＧＧＣＴＧＡＡＧＣＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣＣＧＴＧＧＣＧＧＧＣＧＡＣＴＡＣＡＡＴＣＴＣＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＴＴＧＣＴＣＣＴＣＡＡＣＡＡＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＡＴＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＧＴＴＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＧＣＧＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＣＣＣＧＴＴＣＴＡＡＣＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＧＴＴＧＧＣＧＣＣＡＴＴＴＣＣＧＣＣＡＴＧＡＡＣＧＣＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＴＡＴＧＣＣＧＡＡＡＡＣＣＴＧＣＣＧＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡＴＴＴＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣＡＡＣＡＧＣＡＡＴＧＡＴＣＡＧＧＧＣＡＣＡＧＧＴＣＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＴＣＡＣＡＣＡＡＴＣＧＧＣＡＡＧＡＣＧＧＡＴＴＡＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＣＴＴＧＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＴＣＡＧＧＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＧＣＣＧＡＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＧＡＣＧＣＴＣＡＣＴＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＡＡＧＡＴＴＧＡＣＣＡＣＧＴＣＡＴＴＣＧＣＡＣＧＧＣＧＣＴＧＣＧＣＧＡＧＣＧＴＡＡＧＣＣＧＧＣＣＴＡＴＣＴＧＧＡＣＡＴＣＧＣＧＴＧＣＡＡＣＡＴＴＧＣＣＴＣＣＧＡＧＣＣＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＧＡＧＣＣＴＧＡＡＡＴＣＧＡＣＣＡＣＡＣＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＧＡＣＧＣＣＡＣＧＧＴＴＧＣＣＴＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＡＴＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＴＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧＣＣＡＡＣＧＣＡＣＴＧＧＣＣＧＣＡＡＣＣＧＡＡＡＣＧＣＴＧＧＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＡＴＧＣＧＣＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＡＧＧＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＧＧＧＴＴＴＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＧＡＡＧＴＣＴＣＧＡＡＣＣＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＣＣＴＣＣＧＡＣＧＣＡＣＴＧＣＴＧＴＧＣＡＴＣＧＣＣＣＣＣＧＴＡＴＴＣＡＡＣＧＡＣＴＡＴＴＣＡＡＣＡＧＴＣＧＧＣＴＧＧＴＣＧＧＣＡＴＧＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＧＴＡＡＣＧＧＴＣＧＡＴＧＧＣＣＧＣＧＣＣＴＡＴＧＡＣＧＧＣＴＴＴＡＣＣＣＴＧＣＧＣＧＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＡＡＡＡＧＣＣＣＣＣＧＣＧＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＣＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＧＣＡＧＣＧＴＣＣＣＧＡＣＧＴＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＣＧＣＧＡＣＡＴＣＣＧＡＴＧＡＡＧＣＣＧＧＴＣＴＧＡＣＧＡＡＴＧＡＣＧＡＡＡＴＣＧＴＣＣＧＴＣＡＴＡＴＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＴＣＡＡＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＧＧＴＧＧＣＡＧＡＡＡＣＣＧＧＣＧＡＴＴＣＡＴＧＧＴＴＣＡＡＴＧＣＣＡＴＧＣＧＣＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＧＣＧＧＴＧＣＧＣＧＣＧＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴ
ＧＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＴＡＴＣＧＧＣＴＧＧＴＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＧＣＣＴＴＣＧＧＣＡＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＣＴＣＧＣＡＧＧＡＣＣＧＣＣＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＡＧＧＣＧＡＴＧＧＣＴＣＣＴＴＣＣＡＧＣＴＴＡＣＣＧＣＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣＧＣＴＡＣＧＡＡＣＴＧＣＣＣＧＴＣＡＴＴＡＴＣＴＴＴＣＴＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＧＴＣＡＴＴＧＧＣＡＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＴＧＡＣＧＧＣＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＣＴＴＣＡＡＣＧＣＣＧＧＡＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＴＧＧＣＣＴＧＡＡＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡＣＴＧＡＣＡＧＡＡＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＧＧＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＴＡＣＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＡＣＧＣＴＧＡＴＣＧＡＡＴＧＣＣＡＧＡＴＣＧＡＣＣＧＣＡＣＧＧＡＣＴＧＣＡＣＧＧＡＴＡＴＧＣＴＧＧＴＴＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＴＴＧＣＣＴＣＡＡＣＣＡＡＣＧＣＧＣＧＣＡＡＧＡＣＣＡＣＴＣＴＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧ

【0067】

上記配列を、配列リストにおいて配列番号２８として記載する。ここで配列番号２８は、配列番号２９による、改変されるべきタンパク質をコードするＤＮＡを例示的に開示するものである。しかし本発明によると、改変されるべき酵素を製造するために、改変されるべき出発タンパク質をコードする全ての他のデオキシリボ核酸を使用することができる。それをコードするヌクレオチドは、当業者に公知である。
関連のタンパク質配列を、配列リストにおいて配列番号２９として記載する。

【0068】

「細胞全体」の形態での変異体の製造
細胞全体での１Ｌ規模での酵素の発現のために、まず、グリセリンと混合したマスタープレートから細胞を白金耳でＬＢ培地（＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン）５０ｍＬ中に移植し、２５０ｍＬ三角フラスコ中で１２０ＲＰＭおよび３７℃でインキュベートした。１６時間インキュベーション後に、培養物１０ｍＬを自己誘導培地１Ｌに入れ、５Ｌ三角フラスコ中で９０ＲＰＭおよび２０℃で７２時間インキュベートした。続いて細胞を遠心分離（４℃、６，０００ＲＰＭ、３０分）によって回収し、その後の使用まで−２０℃で保存した。

【0069】

自己誘導培地

【0070】

【表6】

【0071】

単離した酵素の形態での変異体の製造
１Ｌ規模で培養した細胞１０ｇを、４℃に冷却した破壊緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、１００μＭチアミン二リン酸、２ｍＭ硫酸マグネシウム）２５ｍＬと共に氷上で再懸濁した。続いて、再懸濁した細胞を超音波（ＳＤ１４−Ｓｏｎｏｔｒｏｄｅ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ ＧｍｂＨ）、２分処理を４回、それぞれ氷から１分冷却する）を用いて破壊した。細胞の破片を分離するために溶液を遠心分離し（４５分、１８，０００ＲＰＭ、４℃）、上清（「細胞抽出物」）を新しい容器に移した。

【0072】

固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを用いてＡｐＰＤＣ変異体を精製するために、とりわけタンパク質のＵＶ吸収（２８０ｎｍ）および電気伝導率を検出し、流速を調整する目的で、「Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ」社の「ＡＥＫＴＡ（商標）精製装置」を使用した。精製するために、予めローディング緩衝液１８０ｍＬで平衡化しておいた体積６０ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ−Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ Ｎ．Ｖ．）を有するカラムに、製造した細胞抽出物（約２５ｍＬ）を流速３ｍＬ／ｍｉｎでロードした。続いて、カラム材料と結合していないまたは非常に弱く結合しているタンパク質を除去するために、流速５ｍｌ／ｍｉｎのローディング緩衝液でさらに洗浄した。ＵＶ吸収（２８０ｎｍ）が安定なベースラインに再び達した後、カラム材料と弱く結合しているタンパク質を溶出するために洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、１００μＭチアミン二リン酸、２ｍＭ硫酸マグネシウム、５０ｍＭイミダゾール）を流速５ｍＬ／ｍｉｎで使用した。ＵＶ吸収（２８０ｎｍ）が再び安定化した後、目的タンパク質を溶出するために、溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、１００μＭチアミン二リン酸、２ｍＭ硫酸マグネシウム、２５０ｍＭイミダゾール）を流速５ｍＬ／ｍｉｎで使用した。

【0073】

緩衝液交換のために、予め緩衝液交換用緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、１００μＭチアミン二リン酸、２ｍＭ硫酸マグネシウム）２Ｌで洗浄したサイズ排除クロマトグラフィーカラム（カラム体積１Ｌ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にＩＭＡＣの溶出液を流速１０ｍＬ／ｍｉｎでロードした。高められたＵＶ吸収（２８０ｎｍ）を有する画分を合わせ、結晶皿中で凍結させた（−２０℃）。凍結乾燥するために、凍結したタンパク質溶液を０．２２ｍＢａｒの減圧下に３日間置いた。生成した粉末のタンパク質含量は２０％であった。純度（外来タンパク質に関する目的タンパク質の割合）は、＞９０％であった。
なお、本願は、特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
１．アセトバクター・パストリアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｉｓ）由来の野生型と比べて改変されたタンパク質ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇにおける５４３位のアミノ酸トリプトファンが、トリプトファンよりも嵩高さが低いアミノ酸によって置き換えられていることを特徴とする、リアーゼ。
２．配列１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３または２５のうちの一つのアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のリアーゼ。
３．酵素ＡｐＰＤＣ−Ｅ４６９Ｇの変異体をコードし、１６２７〜１６２９位のコドンが、トリプトファンよりも嵩高さが低いアミノ酸をコードするコドンによって置換されていることを特徴とする、リアーゼをコードするデオキシリボ核酸。
４．配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４または２６のヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項３に記載のデオキシリボ核酸。
５．請求項３または４に記載の配列を含むことを特徴とする、ベクター。
６．プラスミドであることを特徴とする、請求項５に記載のベクター。
７．請求項５に記載の配列が、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２４ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａ（＋）、ｐＥＴ−２９ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３４ｂ（＋）、ｐＥＴ−３５ｂ（＋）、ｐＥＴ−３６ｂ（＋）、ｐＥＴ−３７ｂ（＋）、ｐＥＴ−３８ｂ（＋）の群からの空のベクターに連結されていることを特徴とする、請求項６に記載のベクター。
８．ベンズアルデヒドが、式（１）

【化2】

に従って、ピルビン酸またはアセトアルデヒドと共に変換される（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールの製造方法であって、変換が、請求項１または２に記載のリアーゼを用いて行われることを特徴とする、製造方法。
９．ｐＨ値５〜９で行われることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
１０．緩衝液としてＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＡまたはＴＲＩＳ−ＨＣｌが使用されることを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
１１．補因子としてチアミンリン酸および硫酸マグネシウムが使用されることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか一つに記載の方法。
１２．変換が、ｉｎ ｖｉｖｏで行われることを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか一つに記載の方法。
１３．（Ｓ）−フェニルアセチルカルビノールの産生が、大腸菌、コリネバクテリウム、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム、または酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエの群からの産生生物において行われることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
１４．請求項１３の生物が配列２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４または２６のうちの少なくとも一つのＤＮＡで形質転換され、かつ／または上記ＤＮＡがゲノムに組み込まれることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の方法。
１５．形質転換のために、請求項５〜７のいずれか一つに記載のベクターが使用されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
１６．変換が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われることを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか一つに記載の方法。
１７．配列１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３または２５のいずれか一つの単離された酵素が使用されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
１８．産生生物からの粗製細胞抽出物が使用されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。

【図1】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]