特許 6803840 抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体、ＣＬＥＣ−２との結合に必要なＡｇｇｒｕｓの領域、及びＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤のスクリーニング方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6803840

(24)【登録日】2020年12月3日

(45)【発行日】2020年12月23日

(54)【発明の名称】抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体、ＣＬＥＣ−２との結合に必要なＡｇｇｒｕｓの領域、及びＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤のスクリーニング方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20201214BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20201214BHJP

   C12N 5/20 20060101ALI20201214BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20201214BHJP

   A61P 7/02 20060101ALI20201214BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20201214BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20201214BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20201214BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20201214BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20201214BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28ZNA

   C07K16/46

   C12N5/20

   A61K39/395 N

   A61K39/395 T

   A61P7/02

   A61P29/00

   A61P35/00

   A61P35/04

   !C12P21/08

   !C12N15/09 Z

【請求項の数】12

【全頁数】35

(21)【出願番号】特願2017-528677(P2017-528677)

(86)(22)【出願日】2016年7月11日

(86)【国際出願番号】JP2016070466

(87)【国際公開番号】WO2017010463

(87)【国際公開日】20170119

【審査請求日】2019年7月10日

(31)【優先権主張番号】特願2015-140998(P2015-140998)

(32)【優先日】2015年7月15日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2015-211883(P2015-211883)

(32)【優先日】2015年10月28日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２７年度 国立研究開発法人日本医療研究開発機構 科学技術試験研究委託事業「次世代がん研究シーズ戦略的育成プログラム」「がん微小環境を標的とした革新的治療法の実現」（血小板との相互作用によるがん微小環境制御機構の解析と新規治療薬の創製）に係る委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-03041

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-03042

【微生物の受託番号】IPOD  FERM BP-11446

【微生物の受託番号】IPOD  FERM BP-11447

【微生物の受託番号】IPOD  FERM BP-11448

【微生物の受託番号】IPOD  FERM BP-11449

(73)【特許権者】

【識別番号】000173588

【氏名又は名称】公益財団法人がん研究会

(74)【代理人】

【識別番号】100179431

【弁理士】

【氏名又は名称】白形 由美子

(72)【発明者】

【氏名】藤田 直也

(72)【発明者】

【氏名】関口 貴哉

(72)【発明者】

【氏名】高木 聡

【審査官】 宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１５／０５３３８１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／１２８０８２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 OKI H. et al，Monoclon. Antib. Immunodiagn. Immunother.，34(3)(2015.06)，p.174-180

【文献】 OKI H. et al，Monoclon. Antib. Immunodiagn. Immunother.，34(1)(2015.02)，p.44-50

【文献】 KATO Y. et al，Abstract 663: Development of a cancer-specific monoclonal antibody LpMab-2 specific for cancer-tye p，Cancer Research [online]，２０１４年１０月 １日，[retrieved on 2016.08.31]，Retrieved from the Internet，DOI: 10.1158/1538-7445.AM2014-663，ＵＲＬ，<http://cancerres.aacrjournals.org/content/74/19_Supplement/663>

【文献】 KATO Y. et al，Cancer Sci.，99(1)(2008)，p.54-61

【文献】 MATSUI K. et al，Epitope-Specific Antibodies to the 43-kD Glomerular Membrane Protein Podoplanin Cause Proteinuria an，J. Am. Soc. Nephrol.，１９９８年，9，p.2013-2026, ISSN: 1046-6673，要約、Fig.3

【文献】 ZIMMER G. et al，Biochem. J.，326 (1997)，p.99-108

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

Ｃ１２Ｎ １５／０９−１５／９０

Ｃ１２Ｎ ５／２０

Ｃ０７Ｋ １４／００−１４／８２５

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号３（ＲＩＥＤＬ）により表されるアミノ酸配列からなるＡｇｇｒｕｓの領域に結合し、Ａｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ−２結合阻害活性を有するモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片からなるフラグメント。

【請求項2】

７６番目のスレオニン残基から８９番目のスレオニン残基を抗原として免疫することにより得られたものである請求項１に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片からなるフラグメント。

【請求項3】

受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０３０４１（ＰＧ４Ｄ１）、又はＮＩＴＥ ＢＰ−０３０４２（ＰＧ４Ｄ２）のハイブリドーマにより産生される、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片からなるフラグメント。

【請求項4】

キメラ化又はヒト化された請求項１〜３いずれか１項記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片からなるフラグメント。

【請求項5】

受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０３０４１、又はＮＩＴＥ ＢＰ−０３０４２のハイブリドーマ。

【請求項6】

請求項１〜４いずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片からなるフラグメントを含むＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤。

【請求項7】

さらに配列番号２（ＧＡＥＤＤＶＶＴＰＧＴＳＥＤＲＹＫ）により表される領域に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗体、そのキメラ化抗体、そのヒト化抗体、及び／又はその抗原結合断片からなるフラグメントを少なくとも１つ含むことを特徴とする請求項６記載のＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤。

【請求項8】

前記配列番号２の領域に存在するエピトープを認識する前記モノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４４６（Ｐ２−０）、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４４７（ＭＳ−１）、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４４８（ＭＳ−３）、及び／又は受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４４９（ＭＳ−４）として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体であることを特徴とする請求項７記載のＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤。

【請求項9】

請求項１〜４いずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片からなるフラグメントを含む血小板凝集抑制、血栓抑制、がん進展・転移抑制、抗炎症のための医薬組成物。

【請求項10】

さらに配列番号２（ＧＡＥＤＤＶＶＴＰＧＴＳＥＤＲＹＫ）により表される領域に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗体、そのキメラ化抗体、そのヒト化抗体、及び／又はその抗原結合断片からなるフラグメントを少なくとも１つ含むことを特徴とする請求項９記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記配列番号２の領域に存在するエピトープを認識する前記モノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４４６（Ｐ２−０）、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４４７（ＭＳ−１）、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４４８（ＭＳ−３）、及び／又は受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４４９（ＭＳ−４）として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体であることを特徴とする請求項１０記載の医薬組成物。

【請求項12】

請求項１〜４いずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片からなるフラグメントを含むＡｇｇｒｕｓ発現を検出するための検査用試薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合に関与するＡｇｇｒｕｓの領域、及び該領域を認識する抗体に関する。また、該Ａｇｇｒｕｓの領域を含むペプチドやモノクローナル抗体を含むＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤、及びこれを含む医薬組成物に関する。さらに、該領域への結合を指標とする医薬のスクリーニング方法に関する。

【背景技術】

【0002】

がんは細胞が無秩序に増殖することを特徴とする疾患であるが、がんの致死率を規定する大きな要因は、がんが発生した原発巣での増殖というよりは、転移巣における増殖である。実際に転移がんであると診断された患者の５年生存率は２０％以下と言われており、がん転移の抑制は臨床上大きな課題となっている。

【0003】

がんの血行性転移には、がん細胞依存的な血小板凝集が関与していることが古くから臨床上認められていた。本発明者のグループは、血小板凝集誘導活性を示す高転移がん細胞株を樹立し、高転移がん細胞株の細胞膜表面上に発現している血小板凝集を誘導する因子Ａｇｇｒｕｓを同定した（特許文献１、非特許文献１）。

【0004】

血小板凝集促進因子Ａｇｇｒｕｓ（ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ、ｇｐ４４、Ｔ１α等としても知られる。）は、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、扁平上皮癌、中皮腫、カポジ肉腫、精巣腫瘍、脳腫瘍、又は膀胱癌といった様々ながんで発現が増加していることが知られている（非特許文献２〜１３）。

【0005】

最近、血小板上に発現しているＣ型レクチン様受容体（ＣＬＥＣ‐２）がＡｇｇｒｕｓのカウンターパート受容体の一つであることが同定された（非特許文献１４）。腫瘍細胞上で発現しているＡｇｇｒｕｓにＣＬＥＣ‐２が結合すると血漿成分がなくとも血小板で血小板凝集のシグナルが活性化され、血小板凝集が誘導されることが知られている。すなわち、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合を阻害する物質は、血小板凝集を抑制し、がんの転移を抑制すると考えられる。したがって、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合を阻害する物質は、がんや血栓症の治療への応用が期待される。実際に本発明者らは、Ａｇｇｒｕｓに対するモノクローナル抗体や低分子化合物によって、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の相互作用が阻害され、血小板凝集やがん転移が抑制されることを開示している(特許文献２、３、非特許文献１５）。

【0006】

モノクローナル抗体は、細胞表面抗原に特異的に結合することができ、標的細胞に免疫学的応答を引き起こすことができる。この反応を利用して、多くのモノクローナル抗体ががん治療や免疫疾患の治療に用いられている。モノクローナル抗体は、中和、抗体依存性細胞障害活性（antibody-dependent cellular cytotoxicity; ＡＤＣＣ）、及び補体依存性細胞障害活性（complement-dependent cytotoxicity; ＣＤＣ）の３つの代表的な作用様式を介して治療効果を示す。

【0007】

これまでに、本発明者らは、樹立したハイブリドーマが産生する抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体、Ｐ２−０、ＭＳ−１、ＭＳ−３、ＭＳ−４はいずれもＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２の結合を阻害する中和抗体であり、ＡＤＣＣ活性非依存的に血小板凝集抑制、がん転移抑制、腫瘍増殖抑制作用を示すことを明らかにしている（特許文献２）。

【0008】

これら４つの抗体のうちＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２の結合を阻害する活性の高いＰ２−０とＭＳ−１抗体は、いずれもＰＬＡＧドメイン（Platelet-Aggregation stimulating domain）領域内のアミノ酸をエピトープとして認識する抗体である。ＰＬＡＧドメインとは、ヒト、マウス、ラットと種を超えて保存されているＥＤＸＸＶＴＰＧを共通配列とするアミノ酸配列である。ＰＬＡＧドメインは、近接した領域にＰＬＡＧ１〜ＰＬＡＧ３まで３回繰り返し存在するアミノ酸配列であり、ヒトＡｇｇｒｕｓの場合、アミノ酸配列の２９〜５４番目の領域に存在する。

【0009】

ＰＬＡＧドメインは細胞外に存在し、血小板凝集活性に関わることが知られている。また、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２との共結晶構造解析の結果、Ａｇｇｒｕｓの４７番目のグルタミン酸と４８番目のアスパラギン酸に加え、５２番目のスレオニンに付加されているシアル酸がＣＬＥＣ‐２の１０７〜１５７番目の領域中に存在する４つのアルギニンと結合していることが示されている（非特許文献１６）。本発明者らが創製したＰ２−０とＭＳ−１抗体も、このＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２結合領域と重複するＡｇｇｒｕｓのアミノ酸配列の４５〜４９番目の領域をエピトープとして認識している。また、ＭＳ−３、ＭＳ−４抗体はＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２結合領域に近接するＡｇｇｒｕｓのアミノ酸配列の５４〜６１番目の領域をエピトープとして認識している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】特開２００４−３５０６７７号公報

【特許文献2】国際公開２０１２／１２８０８２号

【特許文献3】特開２０１３−７１９１６号公報

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Kato Y. et al., 2003, J. Biol. Chem., Vol.278, p.51599-51605.

【非特許文献2】Kato, Y. et al., 2005, Tumour. Biol. Vol.26, p.195-200.

【非特許文献3】Martin-Villar, E. et al., 2005, Int. J. Cancer, Vol.113, p.899-910.

【非特許文献4】Yuan P. et al., 2006, Cancer, Vol.107, p.563-569.

【非特許文献5】Wicki, A. et al., 2006, Cancer Cell, Vol.9, p.261-272.

【非特許文献6】Kimura, N. & Kimura, I., 2005, Pathol. Int., Vol.55, p.83-86.

【非特許文献7】Fukunaga, M., 2005, Histopathology, Vol.46, p.396-402.

【非特許文献8】Kato, Y. et al., 2004, Oncogene, Vol.23, p.8552-8556.

【非特許文献9】Mishima, K. et al., 2006, Acta Neuropathol., Vol.111, p.563-568.

【非特許文献10】Mishima, K. et al., 2006, Acta Neuropathol., Vol.111, p.483-488.

【非特許文献11】Yuan, P. et al., 2006, Cancer, Vol.107, p.563-569.

【非特許文献12】Kunita, A. et al., 2007, Am. J. Pathol., Vol.170, p.1337-1347.

【非特許文献13】Takagi, S. et al., 2014, Int. J. Cancer, Vol.134, p.2605-2614.

【非特許文献14】Suzuki-Inoue, K. et al. 2007, J. Biol. Chem., Vol.282, p.25993-26001.

【非特許文献15】Fujita N.& Takagi, S., 2012, J. Biochem., Vol.152, p.407-413.

【非特許文献16】Nagae, M. et al., 2014, Structure, Vol.22, p.1711-1721.

【非特許文献17】Morrison, S.L. et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.81,p.8651-6855.

【非特許文献18】Jones, P.T. et al., 1986, Nature, Vol.321, p.522-525.

【非特許文献19】Amano, K. et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.105,p.3232-3237.

【非特許文献20】Takagi, S. et al., 2013, PLoS One Vol. 8, e73609.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

しかしながら、以下に示すように、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２との共結晶構造解析の結果明らかとなっていたＣＬＥＣ‐２との結合に関わるＡｇｇｒｕｓの４８番目のアスパラギン酸をアラニン置換したＡｇｇｒｕｓ変異体でも、ＣＬＥＣ‐２に結合することが明らかとなった。また、Ａｇｇｒｕｓの４８番目のアスパラギン酸をアラニン置換したＡｇｇｒｕｓ変異体による血小板凝集に関しても、血小板凝集が開始するまでの時間の遅延が認められるものの、最終的には血小板凝集が起こることが確認された。

【0013】

さらに、本発明者らは、Ａｇｇｒｕｓに対するモノクローナル抗体や低分子化合物によって、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の相互作用が阻害され、血小板凝集が抑制され、さらにがん転移が抑制されることを開示しているが(特許文献２、３)、これらモノクローナル抗体や低分子化合物は血小板凝集開始時間の遅延効果はあるが、Ａｇｇｒｕｓによる血小板凝集を完全に抑制することはできなかった。すなわち、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合部位が既知のＰＬＡＧドメイン以外の領域にも存在する可能性が示唆される。

【0014】

本発明は、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合に関与する新たなドメインの探索を行い、当該ドメインに結合するモノクローナル抗体を得ることを課題とする。さらに、当該ドメインに結合する化合物を探索することにより、がんの増殖と転移、血小板凝集を抑制する化合物のスクリーニング方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明は以下に示すＡｇｇｒｕｓの領域を認識するモノクローナル抗体、これを産生するハイブリドーマ、ＣＬＥＣ−２との結合に必要なＡｇｇｒｕｓの領域、Ａｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤、医薬組成物、検査用試薬、Ａｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤のスクリーニング方法に関する。

【0016】

（１）配列番号１（ＧＩＲＩＥＤＬＰＴ）により表されるアミノ酸配列のうち少なくとも５残基の配列からなるＡｇｇｒｕｓの領域に結合するモノクローナル抗体、又はその機能的断片からなるフラグメント。
（２）受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０３０４１（ＰＧ４Ｄ１）、又はＮＩＴＥ ＢＰ−０３０４２（ＰＧ４Ｄ２）のハイブリドーマにより産生される、（１）記載のモノクローナル抗体、又はその機能的断片からなるフラグメント。
（３）キメラ化又はヒト化された（１）記載のモノクローナル抗体、又はその機能的断片からなるフラグメント。
（４）受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０３０４１、又はＮＩＴＥ ＢＰ−０３０４２のハイブリドーマ。
（５）（１）〜（３）のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメントを含むＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤。
（６）さらに配列番号２（ＧＡＥＤＤＶＶＴＰＧＴＳＥＤＲＹＫ）により表される領域に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗体、そのキメラ化抗体、そのヒト化抗体、及び／又はその機能的断片からなるフラグメントを少なくとも１つ含むことを特徴とする（５）記載のＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤。
（７）前記配列番号２の領域に存在するエピトープを認識する前記モノクローナル抗体が、Ｐ２−０、ＭＳ−１、ＭＳ−３、及び／又はＭＳ−４であることを特徴とする（６）記載のＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤。
（８）（１）〜（３）のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメントを含む血小板凝集抑制、血栓抑制、がん進展・転移抑制、抗炎症のための医薬組成物。
（９）さらに配列番号２（ＧＡＥＤＤＶＶＴＰＧＴＳＥＤＲＹＫ）により表される領域に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗体、そのキメラ化抗体、そのヒト化抗体、及び／又はその機能的断片からなるフラグメントを少なくとも１つ含むことを特徴とする（８）記載の医薬組成物。
（１０）前記配列番号２の領域に存在するエピトープを認識する前記モノクローナル抗体が、Ｐ２−０、ＭＳ−１、ＭＳ−３、及び／又はＭＳ−４であることを特徴とする（９）記載の医薬組成物。
（１１）（１）〜（３）のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメントを含むＡｇｇｒｕｓ発現を検出するための検査用試薬。
（１２）ＣＬＥＣ‐２の結合に必要なＰＬＡＧ４ドメインと重複するＡｇｇｒｕｓの領域であって、配列番号１（ＧＩＲＩＥＤＬＰＴ）により表されることを特徴とする領域。
（１３）（１２）記載のＣＬＥＣ‐２の結合に必要なＰＬＡＧ４ドメインと重複するＡｇｇｒｕｓの領域であって、前記アミノ酸配列が配列番号３（ＲＩＥＤＬ）により表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする領域。
（１４）（１２）、又は（１３）の領域を含むペプチドからなるＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤。
（１５）（１２）、又は（１３）の領域を含むペプチドを有効成分とする血小板凝集抑制、血栓抑制、がん進展・転移抑制、抗炎症のための医薬組成物。
（１６）ＣＬＥＣ‐２とＡｇｇｒｕｓの結合阻害剤のスクリーニング方法であって、配列番号１（ＧＩＲＩＥＤＬＰＴ）により表されるアミノ酸配列のうち少なくとも５残基の配列からなるＡｇｇｒｕｓエピトープへの結合を指標とすることを特徴とする阻害剤スクリーニング方法。
（１７）（１６）記載のスクリーニング方法であって、配列番号３（ＲＩＥＤＬ）により表されるアミノ酸配列への結合を指標とすることを特徴とする阻害剤スクリーニング方法。
（１８）ＣＬＥＣ‐２とＡｇｇｒｕｓの結合阻害剤のスクリーニング方法であって、配列番号４（ＥＤＸＸＴＳ）により表されるアミノ酸配列への結合を指標とすることを特徴とする阻害剤スクリーニング方法。

【発明の効果】

【0017】

本発明者らは、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合に必要な新たなＰＬＡＧドメインを見出したことにより、当該領域に結合する新たなモノクローナル抗体を得ることができた。当該領域に結合するモノクローナル抗体はＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合を強く阻害することから、がんや血栓症の治療に有効であることが期待される。さらに、新たなＰＬＡＧドメインを標的とする抗がん剤のスクリーニングも可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1A】Ａｇｇｒｕｓ変異体を用いた中和抗体の認識部位の検証結果を示す図。

【図1B】ヒトＡｇｇｒｕｓアミノ酸配列中のＰＬＡＧドメインを示す図。

【図2A】ＣＨＯ細胞に導入したＡｇｇｒｕｓ野生型、Ａｇｇｒｕｓ変異体タンパク質の発現量、及びＣＬＥＣ‐２タンパク質との結合を示す図。

【図2B】血小板凝集に対する４８番目のアミノ酸変異Ｄ４８Ａの効果を示す図。

【図3A】哺乳類Ａｇｇｒｕｓアミノ酸配列の相同性を示す図。

【図3B】ＰＬＡＧドメインのコンセンサス配列を示す図。

【図4A】Ａｇｇｒｕｓ変異体のタンパク質発現を示す図。

【図4B】ＣＨＯ細胞に導入したＡｇｇｒｕｓ野生型、Ａｇｇｒｕｓ変異体タンパク質の発現量、及びＣＬＥＣ‐２タンパク質との結合を示す図。

【図4C】血小板凝集に対する４８番目のアミノ酸変異Ｄ４８Ａ、８２番目のアミノ酸変異体Ｄ８２Ａ、４８番目と８２番目のアミノ酸の二重変異Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａの効果を示す図。

【図4D】ＰＬＡＧドメイン欠失変異体を模式的に示す図。

【図4E】ＣＨＯ細胞に導入したＡｇｇｒｕｓ欠失変異体タンパク質の発現量、及びＣＬＥＣ‐２タンパク質との結合を示す図。

【図5A】ＣＨＯ細胞に導入したＡｇｇｒｕｓ野生型、Ａｇｇｒｕｓ点変異体タンパク質の発現量、及びＣＬＥＣ‐２タンパク質との結合を定量的に示す図。

【図5B】ＣＨＯ細胞に導入したＡｇｇｒｕｓ野生型、Ａｇｇｒｕｓ欠失変異体タンパク質の発現量、及びＣＬＥＣ‐２タンパク質との結合を定量的に示す図。

【図5C】血小板凝集に対するＤ４８Ａ、Ｄ８２Ａ、Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａの効果を示す図。

【図6A-B】ＰＬＡＧ４ドメイン（ＥＤＸＸＴＳ）の８１番目のグルタミン酸、８２番目のアスパラギン酸、８５番目のスレオニンのＣＬＥＣ‐２結合への関与を示す図。

【図7A】抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体のエピトープ解析を示す図。

【図7B】哺乳類細胞に発現しているＡｇｇｒｕｓに対する抗体の反応性を示す図。

【図7C】Ａｇｇｒｕｓ発現細胞に対する抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体の反応性を示す図。

【図8A-B】ＰＧ４Ｄ１、ＰＧ４Ｄ２抗体の認識部位を検討した図。

【図8C】ＰＧ４Ｄ１抗体の反応性を検討した図。

【図8D】ＰＧ４Ｄ２抗体の反応性を検討した図。

【図9A-B】抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体によるＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２の結合阻害を示す図。

【図10A】抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体によるＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２の結合阻害を示す図。

【図10B】ＰＬＡＧ３とＰＬＡＧ４ドメインを各々認識する抗体がＡｇｇｒｕｓに結合する際に相互に干渉しないことを示す図。

【図10C】ＰＬＡＧ３とＰＬＡＧ４ドメインを各々認識する抗体により、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２との結合が完全に抑制されることを示す図。

【図11A】ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体によるＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２の結合阻害を示す図。

【図11B】ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体による血小板凝集の抑制を示す図。

【図12A】ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体とＰＬＡＧ３ドメインを認識する抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体による血小板凝集の抑制を示す図。

【図12B】ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体とＰＬＡＧ３ドメインを認識する抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体との併用による血小板凝集の抑制を示す図。

【図13A-B】ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体による肺への血行性転移の抑制を示す図。

【図14A-B】ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体による肺への血行性転移を抑制することを示す図。

【図15】ＬＣ-ＳＣＣ-０１５細胞の肺転移を抑制するＰＧ４Ｄ２抗体の効果を示す図。

【図16】肺扁平上皮がん細胞ＰＣ-１０の腫瘍増殖に対するＰＧ４Ｄ２抗体の抑制効果を示す図。

【図17A】キメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体のＡｇｇｒｕｓに対する結合を示す図。

【図17B】キメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体がＡｇｇｒｕｓ-ＣＬＥＣ-２結合を抑制することを示す図。

【図18A】骨肉腫切片のＨＥ染色図。

【図18B】ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体が、Ｄ２-４０抗体よりも感度よく骨肉腫を認識することを示す図。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明の抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体、又は機能的断片とは、新たに見出されたＡｇｇｒｕｓのＰＬＡＧ４ドメインと重複する領域をエピトープとして認識する抗体をいい、機能的断片とは元の抗体と実質的に同じ抗原特異性を有する抗体の断片をいうものとする。

【0020】

本発明のＡｇｇｒｕｓに対するモノクローナル抗体の好適な例としては、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＩＴＥ-ＮＰＭＤ（２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０３０４１、ＮＩＴＥ ＢＰ−０３０４２として２０１９年１０月３１日付で寄託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が挙げられる。また、これらと同等の結合特異性を備えた他の抗体も本発明の抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体として好ましい。

【0021】

また、本発明においてモノクローナル抗体とは、得られたハイブリドーマによって産生される抗体だけではなく、遺伝子組換え技術を利用して作製されたヒト型キメラ抗体（以下、キメラ化抗体と記載することもある。）、あるいはヒト型ＣＤＲ（相補性決定領域、Complementarity Determining Region）移植抗体（以下、ヒト化抗体と記載することもある。）等、ヒトに投与した場合安全性の担保されている抗体全般を含むものとする。

【0022】

ヒト型キメラ抗体とは、抗体の可変領域（以下、Ｖ領域ということもある。）がヒト以外の動物の抗体であり、定常領域（以下、Ｃ領域ということもある。）がヒト抗体である抗体をいう（非特許文献１７）。ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のＶ領域中のＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体の適切な位置に移植した抗体である（非特許文献１８）。キメラ化抗体やヒト化抗体は、ヒトに投与した場合、ヒト以外の動物の抗体に比べ、副作用が少なく、その治療効果が長期間持続する。また、キメラ化抗体やヒト化抗体は遺伝子組換え技術を利用して様々な形態の分子として作製することができる。モノクローナル抗体からキメラ化抗体やヒト化抗体を作製する方法は公知の方法を用いることができる。

【0023】

抗体の機能的断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）_２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）、もしくはＣＤＲを含むペプチドなどの抗体の機能的断片が含まれる。抗体の機能的断片は、ペプシン、又はパパインなどの酵素によって消化する等公知の方法によって得ることができる。

【0024】

本発明は、別の態様において、モノクローナル抗体、又はそのフラグメントを含むＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤、血小板凝集抑制剤、抗がん剤として用いる医薬組成物を提供することができる。血小板凝集抑制剤は、例えば、脳梗塞、又は心筋梗塞のような血栓症を処置するために用いることができる。抗がん剤としては、がん転移抑制剤としてだけではなく、がんの進展、がんに起因する炎症を抑制するために用いることができる。がん、又は腫瘍は、今までにＡｇｇｒｕｓ分子の発現の増加が認められているがん、すなわち扁平上皮癌、繊維肉腫、中皮腫、カポジ肉腫、精巣腫瘍、脳腫瘍、又は膀胱癌に対して好適に作用することが期待できる。

【0025】

本発明の医薬組成物の剤型の種類としては、ペプチド、抗体医薬の場合には、例えば、非経口剤である注射剤として用いるのが一般的である。また、スクリーニングにより得られた化合物等の場合には、注射剤だけではなく、経口剤、非経口剤として投与することができる。経口剤としては、例えば、錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等があげられる。また、非経口剤としては、注射剤の他に、坐剤、経皮剤、軟膏剤、外用液剤等を挙げることができる。しかし、ここに挙げた剤型に限ることはなく、当業者において投与経路、投与対象において適宜最適の剤型を選択することができる。また、有効成分として、本発明の抗Ａｇｇｒｕｓ抗体を用いる場合には、製剤中の０．１〜９９．９重量％含有することができる。

【0026】

薬剤の有効成分の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法によって適宜最適な投与量を判断することができる。経口投与の場合には、一般的には、患者に対して、１日につき０．１μｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１．０μｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは１．０ｍｇ〜５０ｍｇ投与するのが好ましい。非経口的に投与する場合には、その一回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形態で、一般的には、患者に対して、１日につき０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好適である。しかしながら、最終的には、患者の年齢や体重、症状等を考慮して医師の判断により決定することができる。

【0027】

また、ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗体と、ＰＬＡＧ２からＰＬＡＧ３にわたる領域を認識する抗体を併用して用いると、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２との結合をほぼ完全に阻害することが明らかとなった。したがって、これらＣＬＥＣ‐２とＡｇｇｒｕｓの結合に関わる２つの領域を認識する抗体を併用することによって、より強い血小板凝集抑制、がん転移抑制効果を期待することができる。

【0028】

本発明者らは、すでに、上述のようにＡｇｇｒｕｓのＰＬＡＧ２及びＰＬＡＧ３を含む領域であるＡｇｇｒｕｓの４５〜６１番目の領域（配列番号２）をエピトープとして認識するモノクローナル抗体を得ている。具体的には、Ａｇｇｒｕｓの４５〜４９番目の領域を認識するＰ２−０、及びＭＳ−１抗体、５３〜５８番目の領域を認識するＭＳ−３抗体、５３〜６１番目の領域を認識するＭＳ−４抗体である。すでに、本発明者らは、キメラ化したＰ２−０抗体がマウスモデルを用いた実験系でがん転移抑制作用を備えていることを開示しているが（特許文献２）、この領域を認識するモノクローナル抗体を臨床に応用する場合には、キメラ化、又はヒト化した抗体を用いればよい。これらモノクローナル抗体のうち少なくともいずれか１つと、本発明の抗体とを併用して用いることにより、より高い効果を奏することが期待できる。併用する２種の抗体をキメラ化抗体、ヒト化抗体として用いることにより、血栓症やがんの治療に適用した場合に、より強い効果を期待することができる。

【0029】

また、本発明のＡｇｇｒｕｓを認識する抗体は、がんの検査に用いることができる。Ａｇｇｒｕｓの発現が、がんの血行性転移に関与していることはすでに知られている。したがって、本発明の抗体を用いてがん組織、あるいは血中を循環するがん細胞のＡｇｇｒｕｓの発現を検出することによって、予後予測を行うことができる。がん組織、あるいはがん細胞でのＡｇｇｒｕｓ発現の確認は、本発明の抗体を用いたＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ等公知の免疫測定法を用いることができる。さらに、Ａｇｇｒｕｓを発現しているがんであれば、本発明の抗体を有効性分として含む医薬による治療効果を期待することができる。

【0030】

本発明のスクリーニング方法は、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２との結合を阻害する物質を探索し、血小板凝集やがんの転移を抑制する化合物を提供することを課題とする。例えば、本発明のスクリーニング方法は以下のようにして行うことができる。化合物アレイや化合物ライブラリを用いて、本発明において新たに同定されたＣＬＥＣ‐２との結合に関与するＡｇｇｒｕｓのアミノ酸配列と相互作用する化合物を探索する。スクリーニングに用いるＣＬＥＣ‐２との結合に関与するＡｇｇｒｕｓの領域としては、本発明の抗体が認識するＧＩＲＩＥＤＬＰＴ（配列番号１）のうち少なくとも５残基の配列、特に、高い結合力を示す抗体が得られた領域であるＲＩＥＤＬ（配列番号３）を用いることが好ましい。また、ＰＬＡＧ４ドメインのＰＬＡＧコンセンサス配列ＥＤＸＸＴＳ（配列番号４）を用いてもよい。ＣＬＥＣ‐２との結合に関与するＡｇｇｒｕｓの領域は短い領域であることから、合成ペプチドを用いても、当該領域を含む組換え体を大腸菌や動物細胞などで発現させて用いてもよい。

【0031】

さらには、本発明者らが発見し報告しているように、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の相互作用にはＡｇｇｒｕｓのアミノ酸４５〜６１のＰＬＡＧ２、ＰＬＡＧ３ドメインにわたる領域も関与している(特許文献２、３)。したがって、この部位を欠失あるいは変異させ、本発明に関わるＡｇｇｒｕｓの新規に見出されたＣＬＥＣ‐２結合領域のみでＣＬＥＣ‐２と結合する組換え体を大腸菌や動物細胞などで発現させて用いてもよい。

【0032】

また、大腸菌や動物細胞などで発現させた野生型のＡｇｇｒｕｓに、Ｐ２−０、ＭＳ−１、ＭＳ−３またはＭＳ−４抗体を反応させてこの部位をマスクし、本発明に関わるＡｇｇｒｕｓの新規に見出されたＣＬＥＣ‐２結合領域のみでＣＬＥＣ‐２と結合するようにしても良い。化合物に結合したペプチドや組換え体は、本発明の抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体を用いて検出することができる。上記方法は例示であり、これに限らず公知のスクリーニング方法を適用してよいことはいうまでもない。

【0033】

また、本発明の抗体が認識する領域（エピトープ）に糖鎖を付与して合成し投与することによって、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合を競合阻害することが期待できる。よって、抗体が認識する領域を含むペプチドに糖鎖を付与し、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２との結合阻害剤として用いることができる。これにより、ペプチド自体を血小板凝集の抑制剤、がん転移抑制剤として用いることも可能となる。なお、糖鎖の付与は、ヒト型の糖鎖を酵母を用いて付与する（非特許文献１９）等、公知の方法を用いて行うことができる。
以下、実施例を示しながら、本発明を詳細に説明する。

【実施例1】

【0034】

報告されている中和抗体の認識部位の検証
本発明者らはすでに、ＣＬＥＣ‐２との結合を阻害し、血小板凝集抑制作用、及びがん転移抑制作用のある抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体を開示している（特許文献２、非特許文献２０）。これらモノクローナル抗体のエピトープは、ＰＬＡＧ２、ＰＬＡＧ３ドメインにわたる領域を認識する抗体であった。

【0035】

まず、これら中和抗体の認識部位の検証を行った。Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）細胞に、以下のプラスミドを導入し、ヒトＡｇｇｒｕｓ、及びＡｇｇｒｕｓ変異体を発現させた。ヒトＡｇｇｒｕｓ遺伝子は野生型Ａｇｇｒｕｓ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ． ＡＢ１２７９５８．１）を用い、ベクターはｐｃＤＮＡ３（ライフテクノロジーズ社製）を用いて常法によりＰＣＲで増幅しクローニングした。

【0036】

中和抗体の認識部位の検討に用いたコンストラクトは以下のとおりである。遺伝子を組み込んでいないｐｃＤＮＡ３ベクターのみ（ｍｏｃｋ）、野生型ヒトＡｇｇｒｕｓ ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド（Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ）、４５番目のグリシンをアラニンに置換したＡｇｇｒｕｓ ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド（Ａｇｇｒｕｓ-Ｇ４５Ａ）、４８番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したＡｇｇｒｕｓ ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド（Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ）、４９番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したＡｇｇｒｕｓ ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド（Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４９Ａ）を構築しＣＨＯ細胞に導入し、タンパク質を安定的に発現させた。各プラスミドを導入したＣＨＯ細胞は以下、各々ＣＨＯ／ｍｏｃｋ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｇ４５Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４９Ａという。

【0037】

各細胞から細胞溶解液を調製し、Ｄ２−４０、ＭＳ−１、Ｐ２−０、ＮＺ-１の４種の抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体を用い、ウェスタンブロット分析を行った。Ｄ２-４０抗体（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ社製）は、Ａｇｇｒｕｓ中和活性の無いマウスモノクローナル抗体であり、ＭＳ−１抗体、Ｐ２−０抗体は本発明者らが創製した中和活性を有するマウスモノクローナル抗体である。また、ＮＺ-１抗体（ＡｎｇｉｏＢｉｏ社製）は、Ａｇｇｒｕｓ中和活性を有するラットモノクローナル抗体である。結果を図１Ａに示す。

【0038】

Ａｇｇｒｕｓ中和活性の無いＤ２-４０抗体は、導入した野生型及び１アミノ酸置換型のＡｇｇｒｕｓタンパク質をすべて認識した。すなわち、ＣＨＯ／ｍｏｃｋ以外の細胞でシグナルが認められる。また、Ａｇｇｒｕｓ野生型、Ａｇｇｒｕｓ変異体でタンパク質発現量がほぼ揃っていることが確認された。なお、泳動した細胞溶解液中のタンパク質量が同じであることは、α-ｔｕｂｕｌｉｎを認識する抗体を用いたウェスタンブロット分析の結果（図１Ａ）からも明らかである。

【0039】

ＭＳ-１抗体並びにＰ２-０抗体は、野生型のＡｇｇｒｕｓは認識するが１アミノ酸置換型のＡｇｇｒｕｓタンパク質、Ａｇｇｒｕｓ−Ｇ４５Ａ、Ａｇｇｒｕｓ−Ｄ４８Ａ、Ａｇｇｒｕｓ−Ｄ４９Ａの認識が弱く、これらアミノ酸部位が抗体認識に必須であることがわかる。特に、Ｐ２-０抗体もＭＳ-１抗体も、４８番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したＤ４８Ａは全く認識することができない。ＰＬＡＧドメイン中の４８番目のアスパラギン酸が、抗体による認識には重要であることが示唆された。

【0040】

また、Ａｇｇｒｕｓ中和活性があるラットモノクローナル抗体ＮＺ-１抗体も１アミノ酸置換型のＡｇｇｒｕｓタンパク質の認識が弱い。したがって、中和活性を発揮するためには、変異を導入したＡｇｇｒｕｓの４５番目から４９番目までの領域、すなわちＰＬＡＧ２からＰＬＡＧ３にかけての部位（図１Ｂ参照）が大事であることが示唆された。

【実施例2】

【0041】

ＣＬＥＣ‐２との相互作用ならびに血小板凝集誘導に関わるＡｇｇｒｕｓの部位の検討
（１）ＣＬＥＣ‐２結合におけるＡｇｇｒｕｓの４８番目のアスパラギン酸の役割検討
ＣＨＯ細胞に、ヒトＡｇｇｒｕｓ及びその変異体ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドを導入して、４８番目のアスパラギン酸の役割の検討を行った。上記で作製した野生型Ａｇｇｒｕｓ発現細胞株ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−ＷＴ及びその変異体発現ＣＨＯ細胞株ＣＨＯ／ＡｇｇｒｕｓＤ４８Ａ、及び４８番目のアスパラギン酸をグルタミン酸に置換したＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ｅ、アスパラギンに置換したＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ｎを用い、ＦＡＣＳ法によりＣＬＥＣ‐２との反応性を検討した。

【0042】

まず、遺伝子導入株、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ｅ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ｎ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８ＡにおけるＡｇｇｒｕｓ発現量を検討した。具体的には、これら遺伝子導入株を培養容器から回収し、ＰＢＳで洗浄した後に１．５×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調製し、Ｄ２-４０抗体を添加し、３０分間氷上で反応させた。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、二次抗体としてＡlｅｘａ４８８標識された抗マウスＩｇＧ抗体（ライフテクノロジーズ社製）を添加し、氷上でさらに３０分間反応させた。最後に、細胞を３回ＰＢＳで洗浄した後に、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で解析を行なった（図２Ａ左パネル、白抜きの山）。なお、コントロールは、Ｄ２-４０抗体の代わりにコントロールマウス抗体（シグマ社製）を各々の細胞に反応させ、上記と同様な操作を行なった結果である（図２Ａ左パネル、黒く塗りつぶした山）。

【0043】

ＣＬＥＣ‐２との反応性は、以下のようにして検討した。遺伝子導入株を同様にして１．５×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調製したところに、（Ｈｉｓ）_１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２タンパク質（ｒＣＬＥＣ‐２；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、３０分間氷上で反応させた。ＰＢＳで洗浄した後にＨｉｓタグを認識する蛍光標識された二次抗体（ＱＩＡＧＥＮ社製）を添加し、氷上でさらに３０分間反応させた。なお、（Ｈｉｓ）_１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２タンパク質は哺乳動物細胞から精製されたものであり、糖鎖により修飾されている。細胞を３回ＰＢＳで洗浄した後に、同様にＣｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００で解析を行なった（図２Ａ右パネル、白抜きの山）。なお、コントロールは、（Ｈｉｓ）_１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２タンパク質の代わりにＰＢＳのみを添加し、上記と同様な操作を行なった結果である（図２Ａ右パネル、黒く塗りつぶした山）。

【0044】

Ａｇｇｒｕｓ、及びＡｇｇｒｕｓ変異体タンパク質の発現は図２Ａ左パネルに、ＣＬＥＣ‐２との結合は図２Ａ右パネルに示す。図２Ａ左パネルの白抜きの山はＤ２-４０抗体によって、野生型Ａｇｇｒｕｓ、又はＡｇｇｒｕｓ変異体を染色した結果を示す。黒く塗りつぶした山はコントロールマウス抗体による結果を示す。図２Ａ左パネルの白抜きの山で示す頂点の位置の蛍光強度がほぼ同じであることから、Ａｇｇｒｕｓタンパク質の各遺伝子導入株における細胞膜上での発現レベルがほぼ一致していることが確認された。

【0045】

図２Ａ右パネルは、野生型又は１アミノ酸置換型のＡｇｇｒｕｓを発現している細胞に、組換えＣＬＥＣ‐２が結合するかを解析したものである。上述のように、白抜きの山は、ＣＨＯ細胞表面に発現している野生型Ａｇｇｒｕｓ、又はＡｇｇｒｕｓ変異体に結合している組換えＣＬＥＣ‐２を抗Ｈｉｓ抗体により検出した結果を示している。黒く塗りつぶした山はＣＬＥＣ‐２タンパク質の代わりにＰＢＳのみを添加したコントロールの結果を示している。

【0046】

４８番目のアスパラギン酸を同じ酸性アミノ酸であるグルタミン酸に置換したＤ４８Ｅ（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ｅ）は野生型（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ）とほぼ同じようにＣＬＥＣ‐２が結合する。しかし、中性アミノ酸に置換したＤ４８Ｎ（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ｎ）あるいはＤ４８Ａ変異体（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ）に対してはＣＬＥＣ‐２の結合力の減少が観察された。しかし、いずれの変異体も結合が完全に失われることはなく、ある程度ＣＬＥＣ‐２が結合することが明らかとなった。

【0047】

（２）Ａｇｇｒｕｓの４８番目のアスパラギン酸の血小板凝集における役割検討
上述のようにＣＬＥＣ‐２は、Ａｇｇｒｕｓと結合する血小板上のレセプターである。Ａｇｇｒｕｓは血小板上のＣＬＥＣ‐２と結合することで血小板凝集誘導シグナルを伝達する。ＣＬＥＣ‐２との結合が弱くなったＤ４８Ａ変異体（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ）は血小板凝集誘導活性が弱くなることが予想されたため、血小板凝集抑制試験で確認した。具体的には、ＭＣＭ ＨＥＭＡ ＴＲＡＣＥＲ ３１３Ｍ（エム・シー・メディカル社製）を用いて分析を行った。該分析法は光透過率のモニタリングによるマウス洗浄血小板を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ血小板凝集分析法である。

【0048】

図２Ｂに示すように、ＣＨＯ／ｍｏｃｋ細胞には血小板凝集を誘導する活性は認められないが、野生型Ａｇｇｒｕｓを発現させたＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴでは血小板と混ぜてから約６分後に凝集が開始された。一方で、ＣＬＥＣ‐２との結合力が弱まったＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａと血小板を混和した場合、約１４分後からしか凝集が認められず、血小板凝集の開始が約８分遅延する。この結果は、ＣＬＥＣ‐２との結合力が弱まったという図２Ａの結果を支持しているとともに、ＣＬＥＣ‐２との結合にはこれまで同定されていたＰＬＡＧ３のドメイン以外の部位が関与しており、その部位を介したＣＬＥＣ‐２との結合により血小板凝集が誘導されているという可能性を示唆するものである。

【実施例3】

【0049】

ＣＬＥＣ‐２との結合に関わる新規ＰＬＡＧ４ドメインの発見
哺乳類の系統樹（図３Ａ下パネル）から、ヒト（Homo sapiens、配列番号５）、ボノボ（Pan paniscus、配列番号６）、アカゲザル（Macaca mulatta、配列番号７）、ブタ（Sus scrofa、配列番号８）、マッコウクジラ（Physeter catodon、配列番号９）、ウシ（Bos Taurus、配列番号１０）、イヌ（Canis lupus familiaris、配列番号１１）、コウモリ（Myotis brandtii、配列番号１２）、ラット（Rattus norvengicus、配列番号１３）、マウス（Mus musculus、配列番号１４）のＡｇｇｒｕｓタンパク質のアミノ酸配列の相同性を検討した。

【0050】

図３Ａは、各動物のＡｇｇｒｕｓタンパク質の相同性の高い部分を並べたものである。なお、各動物のＡｇｇｒｕｓタンパク質の配列は図３Ａ下に示すＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．の配列による。その結果、これまでに報告のあるＰＬＡＧドメイン１〜３に類似した、哺乳類で高度に保存されているＰＬＡＧ４ドメインを見出した（図３Ａ）。図３ＢにＰＬＡＧドメインのコンセンサス配列（配列番号１５）及びＰＬＡＧ１〜ＰＬＡＧ４の配列（配列番号１６〜１９）を示す。ヒトＰＬＡＧ４は、ＣＬＥＣ‐２との結合に関わると報告されている高度に保存されているグルタミン酸とそれに続くアスパラギン酸のＥＤ配列、さらに糖鎖付加部位であるスレオニンＴが保存されていた。ただし、ＥＤ配列とＴの間のアミノ酸数は、ＰＬＡＧ４ドメインではこれまでに同定してきた３アミノ酸ではなく２アミノ酸になっているという違いが見出された。

【実施例4】

【0051】

新規ＰＬＡＧ４ドメインのＣＬＥＣ‐２との相互作用ならびに血小板凝集誘導能における役割の検討
（１）樹立したＡｇｇｒｕｓ変異体の発現量検討
新規のＰＬＡＧドメインであると推定されたＰＬＡＧ４ドメイン内にアミノ酸変異を有するＰＬＡＧ４変異体をＣＨＯ細胞に遺伝子導入した。具体的には、ｐｃＤＮＡ３ベクターにＰＬＡＧ４領域内のアミノ酸である８２番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したヒトＡｇｇｒｕｓ ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド（Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ８２Ａ）、４８番目のアスパラギン酸と８２番目のアスパラギン酸を共にアラニンに置換したヒトＡｇｇｒｕｓ ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド（Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａ）をＣＨＯ細胞に導入し、タンパク質を安定的に発現させた。各プラスミドを導入したＣＨＯ細胞は以下、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ８２Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａという。

【0052】

ＣＨＯ／ｍｏｃｋ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−ＷＴ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ８２Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａ細胞株より、それぞれ細胞溶解液を調製した。各細胞溶解液を用いてＤ２-４０抗体でウェスタンブロット分析を行なった。その結果、導入した野生型及び変異型のＡｇｇｒｕｓタンパク質の発現がＣＨＯ／ｍｏｃｋ以外の細胞で認められるとともに、その発現量がほぼ揃っていることが確認された（図４Ａ）。

【0053】

（２）ＰＬＡＧ３とＰＬＡＧ４のＣＬＥＣ‐２との結合における役割検討
これらＣＨＯの遺伝子安定発現株を用いて、実施例２と同様に、ＦＡＣＳ法によりＡｇｇｒｕｓ発現量の確認とＣＬＥＣ‐２との反応性を検討した。図４Ｂ左パネルは、図２Ａと同様に、白抜きの山がＤ２-４０抗体を反応させて野生型Ａｇｇｒｕｓ、又はＡｇｇｒｕｓ変異体を染色した結果を、黒く塗りつぶした山は、Ｄ２-４０抗体の代わりにコントロールマウス抗体（シグマ社製）を反応させた結果を示している。図４Ｂ（左パネル）に示すように、Ａｇｇｒｕｓタンパク質の各遺伝子導入株における細胞膜上での発現レベルがほぼ一致していることが、各パネルの白抜きの山で示す頂点の位置の蛍光強度がほぼ同じであることからも確認された。

【0054】

図４Ｂ右パネルは、実施例２と同様にしてＣＬＥＣ‐２との結合をＦＡＣＳ法により解析したものである。白抜きの山は、ＣＨＯ細胞表面に発現している野生型Ａｇｇｒｕｓ、又はＡｇｇｒｕｓ変異体に結合している（Ｈｉｓ）_１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２をＨｉｓタグを認識する蛍光標識された二次抗体により検出した結果を示している。なお、黒く塗りつぶした山は、（Ｈｉｓ）_１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２タンパク質の代わりにコントロールマウス抗体を添加し、上記と同様な操作を行なった結果である。

【0055】

８２番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したＤ８２Ａ変異体（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ８２Ａ）のＣＬＥＣ‐２との結合は、４８番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したＤ４８Ａ変異体（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ）との結合以上に減弱していることが明らかとなった（図４Ｂ、右パネル）。さらに、４８番目のアスパラギン酸と８２番目のアスパラギン酸を共にアラニンに置換したＤ４８Ａ／Ｄ８２Ａ二重変異体（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａ）は、全くＣＬＥＣ‐２と結合しないことが明らかとなった。これらの結果は、Ａｇｇｒｕｓ上の新たに見出されたＰＬＡＧ４ドメインが、ＰＬＡＧ３ドメインとともにＣＬＥＣ‐２との結合に重要な役割を果たしていることを示唆しているだけでなく、ＰＬＡＧ４がＰＬＡＧ３よりもＣＬＥＣ‐２との結合において主要な役割を果たしていることを示唆している。

【0056】

（３）ＰＬＡＧ３とＰＬＡＧ４の血小板凝集における役割検討
ＰＬＡＧ４ドメインがＣＬＥＣ‐２との結合に重要な役割を担っていることが明らかになったことから、次にＰＬＡＧ４ドメインの血小板凝集における役割を検討した。上述のように、Ａｇｇｒｕｓは血小板上のＣＬＥＣ‐２と結合することで血小板凝集誘導シグナルを伝達する。ＰＬＡＧ４ドメイン内のアミノ酸変異が血小板凝集を抑制するか、実施例２に記載の血小板凝集抑制試験によって、Ａｇｇｒｕｓ依存的な血小板凝集の誘導活性を検討した。結果を図４Ｃに示す。

【0057】

ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ８２Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａ変異体発現細胞を用い、実施例２と同様にして各変異体発現細胞の血小板凝集能を検討した。各変異体発現細胞の血小板凝集誘導活性は、ＣＬＥＣ‐２との結合力に比例し、Ｄ８２Ａ変異体はＤ４８Ａ変異体よりも血小板凝集誘導活性が弱く、Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａ二重変異体は血小板凝集誘導活性を示さないことが明らかとなった（図４Ｃ）。よって、新規に同定したＰＬＡＧ４は、Ａｇｇｒｕｓ依存的な血小板凝集に主要な役割を果たしていることが明らかとなった。

【0058】

ＰＬＡＧ４ドメインの重要性を確認するために、ＰＬＡＧ１、３、４ドメインを各々欠失した変異体をＣＨＯ細胞に遺伝子導入した。具体的には、ｐｃＤＮＡ３ベクターにＰＬＡＧ１領域内の２９から３４番目のアミノ酸を欠失したヒトＡｇｇｒｕｓ ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド（Ａｇｇｒｕｓ-Δ２９-３４）、ＰＬＡＧ３領域内の４７から５２番目のアミノ酸を欠失したヒトＡｇｇｒｕｓ ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド（Ａｇｇｒｕｓ-Δ４７-５２）、ＰＬＡＧ４領域内の８１から８５番目のアミノ酸を欠失したヒトＡｇｇｒｕｓ ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド（Ａｇｇｒｕｓ-Δ８１-８５）、ＰＬＡＧ３領域内の４７から５２番目とＰＬＡＧ４領域内の８１から８５番目のアミノ酸を両方欠失したヒトＡｇｇｒｕｓ ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド（Ａｇｇｒｕｓ-Δ４７-５２／Δ８１-８５）をＣＨＯ細胞に遺伝子導入し、タンパク質を安定的に発現させた（図４Ｄ参照）。各プラスミドを導入したＣＨＯ細胞は以下、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ２９-３４、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ４７-５２、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ８１-８５、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ４７-５２／Δ８１-８５という。

【0059】

ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ２９-３４、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ４７-５２、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ８１-８５、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ４７-５２／Δ８１-８５変異体発現細胞株を用い、実施例２と同様に、ＦＡＣＳ法によりＡｇｇｒｕｓ発現量の確認とＣＬＥＣ‐２との反応性を検討した（図４Ｅ）。なお本検討では、Ａｇｇｒｕｓ発現量の検討にＤ２-４０抗体ではなく、市販のＦＬ-１６２抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー社製）を使用した。また、二次抗体としてＡlｅｘａ４８８標識された抗ウサギＩｇＧ抗体（ライフテクノロジーズ社製）を用いた（図４Ｅ左パネル）。なお、コントロールとしては、ＦＬ-１６２抗体の代わりにコントロールウサギ抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー社製）を各々の細胞に反応させ、上記と同様な操作を行なった結果である。白抜きの山は、ＦＬ-１６２抗体を反応させてＰＬＡＧドメイン欠失Ａｇｇｒｕｓ変異体を染色した結果を、黒く塗りつぶした山は、ＦＬ-１６２抗体の代わりにコントロールウサギ抗体を反応させた結果を示している。図４Ｅ（左パネル）に示すように、Ａｇｇｒｕｓタンパク質の各遺伝子導入株における細胞膜上での発現レベルがほぼ一致していることが、各パネルの白抜きの山で示す頂点の位置の蛍光強度がほぼ同じであることからも確認された。

【0060】

図４Ｅ右パネルは、実施例２と同様にしてＣＬＥＣ‐２との結合をＦＡＣＳ法により解析したものである。白抜きの山は、ＣＨＯ細胞表面に発現しているＰＬＡＧドメイン欠失Ａｇｇｒｕｓ変異体に結合している（Ｈｉｓ）_１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２をＨｉｓタグを認識する蛍光標識された二次抗体により検出した結果を示している。なお、黒く塗りつぶした山は、（Ｈｉｓ）_１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２タンパク質の代わりにＰＢＳを添加し、上記と同様な操作を行なった結果である。

【0061】

ＣＬＥＣ‐２との相互作用は、図４Ｂに示す点変異体のデータと同じように、ＰＬＡＧ４ドメイン欠失変異体（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ８１-８５）のＣＬＥＣ‐２との結合は、ＰＬＡＧ３ドメイン欠失変異体（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ４７-５２）との結合以上に減弱していることが明らかとなった。さらに、ＰＬＡＧ３ドメインとＰＬＡＧ４ドメインを共に欠失した二重変異体（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ４７-５２／Δ８１-８５）は、全くＣＬＥＣ‐２と結合しないことが明らかとなった。

【0062】

これらの結果は、Ａｇｇｒｕｓ上の新たに見出されたＰＬＡＧ４ドメインが、ＰＬＡＧ３ドメインとともにＣＬＥＣ‐２との結合に重要な役割を果たしていることを示唆しているだけでなく、ＰＬＡＧ４がＰＬＡＧ３よりもＣＬＥＣ‐２との結合において主要な役割を果たしていることを再確認するものである。

【実施例5】

【0063】

新規ＰＬＡＧ４ドメインのＣＬＥＣ‐２との相互作用ならびに血小板凝集誘導能における役割の定量的解析
（１）ＰＬＡＧ３とＰＬＡＧ４のＣＬＥＣ‐２との結合における役割検討
Ａｇｇｒｕｓ発現量とＣＬＥＣ‐２との反応性を定量的に解析した。具体的には、実施例４（図４Ｂ参照）で行ったＦＡＣＳ法を用いたＡｇｇｒｕｓ発現量の確認とＣＬＥＣ‐２との反応性の検討を３回繰り返して行い平均化した。ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−ＷＴの白抜きの山で示す頂点の位置の蛍光強度の平均値を１とした時の、Ａｇｇｒｕｓ変異体タンパク質の発現量をグラフに示す。Ａｇｇｒｕｓ野生型の発現量と比較した統計解析の結果、Ａｇｇｒｕｓ変異体タンパク質（Ｄ４８Ａ、Ｄ８２Ａ、Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａ）の発現量に有意差はつかず（ｎｓと表記）、発現量がほぼ揃っていることが示された（図５Ａ、左パネル）。また、ＣＬＥＣ‐２との反応性を示す白抜きの山で示す頂点の位置の蛍光強度の平均値を１とした時のＡｇｇｒｕｓ変異体タンパク質のＣＬＥＣ‐２との反応性をグラフに示した。Ａｇｇｒｕｓ野生型のＣＬＥＣ‐２との反応性を１とすると、Ａｇｇｒｕｓ変異体タンパク質（Ｄ４８Ａ、Ｄ８２Ａ、Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａ）のＣＬＥＣ‐２との反応性は有意に減少（＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１）していることが示され（図５Ａ、右パネル）、実施例４の結果が再現された。

【0064】

Ａｇｇｒｕｓ欠失変異体についても、上記と同様にＡｇｇｒｕｓ発現量とＣＬＥＣ‐２との反応性を定量的に解析した（図５Ｂ）。実施例４（図４Ｅ参照）で行ったＦＡＣＳ法を用いたＡｇｇｒｕｓ発現量の確認とＣＬＥＣ‐２との反応性の検討を３回繰り返して行い平均化した。ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−ＷＴの白抜きの山で示す頂点の位置の蛍光強度の平均値を１とした時の、Ａｇｇｒｕｓ欠失変異体タンパク質の発現量をグラフに示す。Ａｇｇｒｕｓ野生型の発現量と比較した統計解析の結果、Ａｇｇｒｕｓ欠失変異体タンパク質（Δ２９-３４、Δ４７-５２、Δ８１-８５、Δ４７-５２／Δ８１-８５ ）の発現量に有意差はつかず（ｎｓと表記）、発現量がほぼ揃っていることが示された（図５Ｂ、左パネル）。一方、ＣＬＥＣ‐２との反応性は欠失変異体で有意に減少していることが確認された。図４Ｅ右パネルにおいて、ＣＬＥＣ‐２との反応性を示す白抜きの山で示す頂点の位置の蛍光強度の平均値を１とした時の、Ａｇｇｒｕｓ欠失変異体タンパク質のＣＬＥＣ‐２との反応性をグラフに示す。Ａｇｇｒｕｓ野生型のＣＬＥＣ‐２との反応性を１とすると、Ａｇｇｒｕｓ欠失変異体タンパク質（Δ２９-３４、Δ４７-５２、Δ８１-８５、Δ４７-５２／Δ８１-８５）のＣＬＥＣ‐２との反応性は、Δ２９-３４の場合を除き全て有意に減少（＊＊，Ｐ＜０．０１）していることが示され（図５Ｂ、右パネル）、実施例４の結果が再現された。

【0065】

（２）ＰＬＡＧ３とＰＬＡＧ４の血小板凝集における役割検討
次に、ＣＨＯ／ｍｏｃｋ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−ＷＴ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ８２Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａ変異体発現細胞を用い、実施例２と同様にして各変異体発現細胞の血小板凝集能を検討した。各変異体発現細胞の血小板凝集誘導活性は、ＣＬＥＣ‐２との結合力に比例し、Ｄ８２Ａ変異体はＤ４８Ａ変異体よりも血小板凝集誘導活性が弱いという図４Ｃの再現性が確認された。さらに、Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａ二重変異体発現細胞はＣＨＯ／ｍｏｃｋと同様に血小板凝集誘導活性を示さないことが明らかとなった（図５Ｃ）。よって、新規に同定したＰＬＡＧ４は、Ａｇｇｒｕｓ依存的な血小板凝集に主要な役割を果たしていることが再確認された。

【実施例6】

【0066】

ＰＬＡＧ４ドメイン中のＥ８１、Ｄ８２、Ｔ８５のＣＬＥＣ‐２結合への関与
新規に同定したＰＬＡＧ４ドメインには、ＰＬＡＧ３ドメインに類似したＥＤＸＸＴモチーフが存在する。ＰＬＡＧ４ドメイン中の８１番目のグルタミン酸（Ｅ）、８２番目のアスパラギン酸（Ｄ）、８５番目のスレオニン（Ｔ）（図６Ｂ（右パネル、下線を引いたアミノ酸））のＣＬＥＣ‐２との結合への直接的な関与を解析した。ｐｃＤＮＡ３ベクターに８１番目のグルタミン酸をアラニンに置換したヒトＡｇｇｒｕｓ ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドを導入したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−Ｅ８１Ａ）、８２番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したヒトＡｇｇｒｕｓ ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドを導入したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−Ｄ８２Ａ）、８５番目のスレオニンをアラニンに置換したヒトＡｇｇｒｕｓ ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドを導入したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−Ｔ８５Ａ）を用いてＦＡＣＳにより解析した。なお、コントロールとして、野生型ヒトＡｇｇｒｕｓ ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドを導入したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＡｇｇｒｕｓーＷＴ）、および、ＰＬＡＧ３ドメイン中の４７番目のグルタミン酸、４８番目のアスパラギン酸、５２番目のスレオニン（図６Ａ（右パネル、下線を引いたアミノ酸））を各々アラニンに置換したヒトＡｇｇｒｕｓ ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドを導入したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−Ｅ４７Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−Ｄ４８Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−Ｔ５２Ａ）も作製し、同様に解析した。

【0067】

野生型あるいは変異型Ａｇｇｒｕｓ発現ＣＨＯ細胞を用いて、実施例２と同様に、ＦＡＣＳ法によりＡｇｇｒｕｓ発現量の確認とＣＬＥＣ‐２との反応性を検討した。図２と同様に、白抜きの山がＤ２‐４０抗体を反応させて野生型Ａｇｇｒｕｓ、又はＡｇｇｒｕｓ変異体を染色した結果を、黒く塗りつぶした山は、Ｄ２‐４０抗体の代わりにコントロールマウス抗体（シグマ社製）を反応させた結果を示している。図６Ａ（左パネル）と図６Ｂ（左パネル）に示すように、Ａｇｇｒｕｓタンパク質の各遺伝子導入株における細胞膜上での発現レベルがほぼ一致していることが、各パネルの白抜きの山で示す頂点の位置の蛍光強度がほぼ同じであることからも確認された。

【0068】

図６Ａ（右パネル）と図６Ｂ（右パネル）は、実施例２と同様にして、各変異体のＣＬＥＣ‐２との結合をＦＡＣＳ法により解析したものである。白抜きの山は、ＣＨＯ細胞表面に発現している野生型Ａｇｇｒｕｓ、又はＡｇｇｒｕｓ変異体に結合している（Ｈｉｓ）_１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２をＨｉｓタグを認識する蛍光標識された二次抗体により検出した結果を示している。なお、黒く塗りつぶした山は、（Ｈｉｓ）_１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２タンパク質の代わりにコントロールマウス抗体を添加し、上記と同様な操作を行なった結果である。

【0069】

ＣＬＥＣ‐２との相互作用に関しては、ＰＬＡＧ３ドメイン中の４７番目のグルタミン酸、４８番目のアスパラギン酸、５２番目のスレオニンを各々アラニンに置換したヒトＡｇｇｒｕｓ変異体のＣＬＥＣ‐２との結合は、野生型に比べ同程度に減弱していた。したがって、これら３つのアミノ酸がＣＬＥＣ‐２との結合に関与していることが確認された（図６Ａ、右パネル）。さらにその相同部位であるＰＬＡＧ４ドメイン中の８１番目のグルタミン酸、８２番目のアスパラギン酸、８５番目のスレオニンを各々アラニンに置換したヒトＡｇｇｒｕｓ変異体のＣＬＥＣ‐２との結合は、野生型およびＰＬＡＧ３ドメイン中の４７番目のグルタミン酸、４８番目のアスパラギン酸、５２番目のスレオニンを各々アラニンに置換したヒトＡｇｇｒｕｓに比べても同程度以上に減弱していることが明らかとなった（図６Ｂ、右パネル）。

【0070】

これらの結果は、Ａｇｇｒｕｓ上に新たに見出されたＰＬＡＧ４ドメイン中の８１番目のグルタミン酸、８２番目のアスパラギン酸、８５番目のスレオニンが、ＰＬＡＧ３ドメイン中の４７番目のグルタミン酸、４８番目のアスパラギン酸、５２番目のスレオニンと同様にＣＬＥＣ‐２との結合に関与していることを示している。また、配列番号４で示すＥＤＸＸＴＳ（ＰＬＡＧ４ドメイン）がＣＬＥＣ‐２との結合に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。

【実施例7】

【0071】

新規ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗ヒトＡｇｇｒｕｓモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
以下のようにして、ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗ヒトＡｇｇｒｕｓモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製した。

【0072】

（１）免疫原
ヒトＡｇｇｒｕｓ ｃＤＮＡの７６番目のスレオニン残基から８９番目のスレオニン残基（配列：Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ）までの部位を１２回または４０回繰り返したものをｐＧＥＸ-６Ｐ３ベクター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にクローニングし、ＧＳＴタグ付きの免疫原を得た。このプラスミドで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、発現されたＧＳＴタグ融合組換えタンパク質をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにて精製した。

【0073】

（２）感作
６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバーより購入）に、得られた免疫原１００μｇ／匹とＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭａｘ ＵＳＡ社製）の混和溶液を頸部皮下投与した。追加免疫のために、隔週で免疫原１００μｇ／匹を腹腔内に計９回投与した。また、一部の感作においては、雌性ＢＤＦ−１マウス（日本クレアより購入）の尾根部に２回投与する方法で検討した。

【0074】

（３）ハイブリドーマの樹立
常法に従って、免疫したマウスより脾臓細胞または腸骨リンパ節細胞を採取し、ポリエチレングリコール４０００を用いて、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と融合させた。ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含むエスクローン クローニングメディュウム（エーディア株式会社製）中で培養することで、融合したハイブリドーマを増殖させ、ＰＬＡＧ４ドメイン領域に対する抗体を産生するＰＧ４Ｄ１とＰＧ４Ｄ２を含む複数個のハイブリドーマを樹立させることに成功した。腸骨リンパ節細胞からは、６Ｇ４２Ａ４と９Ｄ６２Ｄ６を含む複数個のハイブリドーマを樹立させることに成功した。

【実施例8】

【0075】

新規ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗ヒトＡｇｇｒｕｓモノクローナル抗体の性状解析
（１）エピトープの探索
ヒトＡｇｇｒｕｓ ｃＤＮＡからシグナルペプチド部位を含むアミノ末端２４アミノ酸を除去したものをｐＧＥＸ-６Ｐ-３ベクターへクローニングしてＧＳＴタグ付きの野生型Ａｇｇｒｕｓタンパク質発現ベクターを作製した。以下、発現した組換えタンパク質をΔＮ２４-ＷＴという。また、免疫原である７６から８９番目のアミノ酸に相当するコドンをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて１ヶ所ずつアラニンをコードするコドンへと置換し、アラニン変異型Ａｇｇｒｕｓ発現ベクターを作製した。以下、組換え変異体は、例えば７６番目のアミノ酸であるスレオニン（Ｔ）をアラニン（Ａ）に変異させたものであれば、ΔＮ２４−Ｔ７６Ａのように表記する。

【0076】

ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌を作製したプラスミドにより形質転換して培養した。大腸菌破砕液をサンプルとして用い、ウェスタンブロット法により、組換えヒトＡｇｇｒｕｓタンパク質に対するＭＳ-１、ＰＧ４Ｄ１、ＰＧ４Ｄ２、６Ｇ４２Ａ４、９Ｄ６２Ｄ６、抗ＧＳＴ（ａｌｐｈａ-ＧＳＴ）抗体（Ａｂｃａｍ社製）の反応性を検討した。その結果、図７Ａに示すように、ＭＳ-１抗体と抗ＧＳＴ抗体は変異体を含む全てのＡｇｇｒｕｓタンパク質を認識したが、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体は、７９番目のアルギニンから８３番目のロイシンにかけての５アミノ酸を各々アラニンに置換したＡｇｇｒｕｓ変異体に対しては低い反応性しか示さなかった。また、６Ｇ４２Ａ４抗体と９Ｄ６２Ｄ６抗体は、７７番目のグリシンから８３番目のロイシンにかけての７アミノ酸を各々アラニンに置換したＡｇｇｒｕｓ変異体に対して、８０番目のイソロイシンをアラニンに置換したものを除き、低い反応性しか示さなかった。さらに９Ｄ６２Ｄ６抗体は、８４番目のプロリンをアラニンに置換すると、認識能が減弱することが明らかとなった。

【0077】

よって、図７Ａの下段に示すように、作製された抗体の認識する領域は、白抜き文字で示した７７番目から８４番目までのペプチド部分（配列：Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｐｒｏ）であり、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体が認識する最小のエピトープは、７９番目から８３番目までのペプチド部分（配列：Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ）であり、図３Ｂに示したＰＬＡＧドメインにホモロジーのある新規のＰＬＡＧ４ドメイン（８１番目から８５番目の配列（図７Ａ中、点線で囲った配列：Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ）と一部オーバラップしていることが明らかとなった。

【0078】

（２）哺乳類細胞に発現しているＡｇｇｒｕｓへの反応性の検討
哺乳類細胞で発現しているヒトＡｇｇｒｕｓは、大腸菌に発現させたＡｇｇｒｕｓとは異なり、多数の糖鎖が付加されていることが知られている。新規に創製されたＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体の哺乳類細胞で発現しているヒトＡｇｇｒｕｓへの反応性を、表面プラズモン共鳴解析装置Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて検討した。カルボキシメチルデキストランコート処理が施されたセンサーチップＣＭ５上にアミンカップリング法にて哺乳動物細胞から市販の精製組換えＡｇｇｒｕｓタンパク質（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃタグ付きのタンパク質：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を固定化し、５２０ＲＵ（ＰＧ４Ｄ１抗体のアッセイ用）あるいは６００ＲＵ（ＰＧ４Ｄ２抗体のアッセイ用）相当の固定化量を得た。

【0079】

２５度、３０μＬ／分の流速の条件下で、ＨＢＳ−ＥＰ＋バッファー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を流路に満たして測定を行なった。具体的には、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体を６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭに希釈し、Ａｇｇｒｕｓタンパク質が固定化されたセンサーチップＣＭ５上に６０秒間流して結合反応を観察し、引き続きＨＢＳ−ＥＰ＋バッファーを１２０秒間流して解離反応を観察した。測定により得られたデータを図７Ｂに示す。

【0080】

創製された抗体はいずれもＡｇｇｒｕｓタンパク質を認識して結合すること（結合速度定数（ｋ_ａ）＝３×１０^４）、また洗浄用のＨＢＳ−ＥＰ＋バッファーを流しても解離反応がほとんど見られず、解離速度定数（ｋ_ｄ）は使用したＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００の計測限界以下、すなわちｋ_ｄ値は≦１０^−５であった。よって、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体の解離定数（Ｋ_Ｄ）は≦３×１０^−１０Ｍという値となり、非常に強い結合を示すことが明らかとなった。

【0081】

（３）Ａｇｇｒｕｓ発現細胞に対する認識能
ＭＳ-１抗体は、ｍＲＮＡレベルでのＡｇｇｒｕｓ発現が認められるヒト膀胱扁平上皮がん細胞株ＵＭ-ＵＣ-５細胞やヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０細胞などをほとんど認識できない。そのため、ＭＳ-１抗体で治療対象となるがんの種類は限定的である。新たに創製したＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体を用い、ＭＳ-１抗体が認識できないＵＭ-ＵＣ-５細胞、ＨＴ１０８０細胞表面に発現しているＡｇｇｒｕｓを認識できるか検討を行った。ＵＭ-ＵＣ-５細胞、ＨＴ１０８０細胞を、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体を一次抗体として用い、二次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識された抗マウスＩｇＧ抗体を用いＦＡＣＳにより解析した。その結果、ＰＧ４Ｄ１抗体、ＰＧ４Ｄ２抗体は、ＭＳ−１抗体では認識することのできなかったＵＭ-ＵＣ-５細胞、ＨＴ１０８０細胞をも認識できることが確認された（図７Ｃ）。

【実施例9】

【0082】

新規ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗ヒトＡｇｇｒｕｓモノクローナル抗体の認識部位の検討と反応性
実施例８（図７Ａ参照）では、大腸菌に発現させたヒトＡｇｇｒｕｓタンパク質に対する反応性を検討した。その結果、図７Ａの下段に示すように、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体の認識する領域は、白抜き文字で示した７７番目から８４番目までのペプチド部分（配列：Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｐｒｏ）であることが示されていた。そこで、哺乳類細胞に発現させた糖鎖を含むＡｇｇｒｕｓに対する認識能とその認識部位を確認するために、ＣＨＯ細胞に導入したＡｇｇｒｕｓ野生型、Ａｇｇｒｕｓ変異体タンパク質、Ａｇｇｒｕｓ欠失変異体タンパク質の細胞溶解液をサンプルとして用い、ウェスタンブロット法により、ＰＧ４Ｄ１抗体、ＰＧ４Ｄ２抗体の反応性を検討した。

【0083】

その結果、図８Ａに示すように、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体は、ＰＬＡＧ４ドメインに相当する８１番目から８５番目の５アミノ酸を欠失させたＡｇｇｒｕｓ変異体を認識しないことが確認された。また、図８Ｂに示すように、ＰＧ４Ｄ１抗体はＰＬＡＧ４ドメイン中の８２番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したＤ８２Ａ‐Ａｇｇｒｕｓ変異体を認識しないのに対し、ＰＧ４Ｄ２抗体はＤ８２Ａ-Ａｇｇｒｕｓ変異体を弱く認識することが確認された。これは図７Ａで示した大腸菌に発現させたヒトＡｇｇｒｕｓタンパク質に対する反応性を調べた結果でもＰＧ４Ｄ２抗体はＤ８２Ａ‐Ａｇｇｒｕｓ変異体を弱く認識する事実に符合していた。なお、泳動した細胞溶解液中のタンパク質濃度が同じであることは、α‐ｔｕｂｕｌｉｎを認識する抗体を用いたウェスタンブロット分析の結果（図８Ａ、８Ｂ）からも明らかである。

【0084】

実施例８（図７Ｂ参照）では、非特異的な結合か否かの検討が行われていなかったため、ＰＧ４Ｄ１抗体（サブクラスはマウスＩｇＧ１）とＰＧ４Ｄ２抗体（サブクラスはマウスＩｇＧ２ａ）のヒトＡｇｇｒｕｓへの反応性を表面プラズモン共鳴解析装置Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて検討する際に、コントロールマウスＩｇＧ１（シグマ社製）、コントロールマウスＩｇＧ２ａ（シグマ社製）も比較対象として加えて検討を行った（図８Ｃ、８Ｄ）。具体的には、カルボキシメチルデキストランコート処理が施されたセンサーチップＣＭ５上にアミンカップリング法にて市販の精製組換えＡｇｇｒｕｓタンパク質（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃタグ付きのタンパク質：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を固定化し、５６２．２ＲＵ（ＰＧ４Ｄ１抗体のアッセイ用）相当の固定化量を得た。２５度、３０μＬ／分の流速の条件下で、ＨＢＳ−ＥＰ＋バッファー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を流路に満たして測定を行なった。具体的には、コントロールマウスＩｇＧ１（Ｃｏｎｔｒｏｌ ＩｇＧ１）を３．７ｎＭ、１１．１ｎＭ、３３．３ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭに希釈し、Ａｇｇｒｕｓタンパク質が固定化されたセンサーチップＣＭ５上に６０秒間流して結合反応を観察し、引き続きＨＢＳ−ＥＰ＋バッファーを１８００秒間流して解離反応を観察した。引き続き、同じセンサーチップＣＭ５を用いてＰＧ４Ｄ１抗体を同条件で流して結合反応を観察した。測定により得られたデータを図８Ｃに示す。

【0085】

次に、５６２．６ＲＵ（ＰＧ４Ｄ２抗体のアッセイ用）相当の固定化量を得たセンサーチップＣＭ５に対して、最初にコントロールマウスＩｇＧ２ａ（Ｃｏｎｔｒｏｌ ＩｇＧ２ａ）、引き続きＰＧ４Ｄ２抗体を同条件で流して結合反応を観察した。測定により得られたデータを図８Ｄに示す。

【0086】

コントロールマウスＩｇＧ１とコントロールマウスＩｇＧ２ａはともにＡｇｇｒｕｓを固定化したセンサーチップに結合しないことが確認されたのに対し、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体はともに実施例８（図７Ｂ参照）と同様な強い結合が確認されたため、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体のＡｇｇｒｕｓ固定化センサーチップへの結合は非特異的な結合ではないことが証明された。また、本アッセイにおけるＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体の解離定数（Ｋ_Ｄ）も実施例８（図７Ｂ参照）と同じ、≦３×１０^-１０Ｍという値となり、非常に強い結合を示すことが明らかとなった。

【実施例10】

【0087】

ＰＧ４Ｄ１とＰＧ４Ｄ２抗体によるＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２との結合阻害
（１）アルファスクリーン法による検討
非放射性のホモジニアス近接アッセイであるアルファスクリーン（登録商標）法を用いて、本発明で得られたモノクローナル抗体ＰＧ４Ｄ１、ＰＧ４Ｄ２のＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２との結合に対する阻害効果を解析した。

【0088】

１ｎｇの精製組換えＡｇｇｒｕｓタンパク質（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃタグ付きのタンパク質、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）と３０ｎｇの精製組換えＣＬＥＣ‐２タンパク質（（Ｈｉｓ）_１０タグ付きのタンパク質；ｒＣＬＥＣ‐２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を９６穴プレートに分注し、そこにコントロールマウスＩｇＧ１（シグマ社製）、コントロールマウスＩｇＧ２ａ（シグマ社製）、ＭＳ-１、ＰＧ４Ｄ１、ＰＧ４Ｄ２、６Ｇ４２Ａ４、９Ｄ６２Ｄ６抗体を最終濃度が１２．５μｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬになるように添加した。添加後、２６度で１時間反応させ、その後にＡｌｐｈａＬＩＳＡ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｕｆｆｅｒで希釈したＮｉｃｋｅｌ Ｃｈｅｌａｔｅ ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｄｏｎｏｒ ＢｅａｄｓとＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ Ａｃｃｅｐｔｏｒ Ｂｅａｄｓを添加し、さらに２６度で１時間反応させた後に、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて６８０ｎｍの波長のレーザーで励起した。

【0089】

励起によりＤｏｎｏｒ Ｂｅａｄｓが酸素を一重項状態に変換し、この一重項状態の酸素が近接するアクセプタービーズに含まれる蛍光物質を活性化することで、６１５ ｎｍの蛍光シグナルが放出される。すなわち、Ｎｉｃｋｅｌ Ｃｈｅｌａｔｅ ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ Ｄｏｎｏｒ Ｂｅａｄｓに結合しているＨｉｓタグが付与されているＣＬＥＣ‐２タンパク質と、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ Ａｃｃｅｐｔｏｒ Ｂｅａｄｓに結合しているＦｃタグが付与されている組換えＡｇｇｒｕｓタンパク質が近接していれば蛍光シグナルが放出される。したがって、この蛍光シグナルを定量することで、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合状態を定量することが可能となる。

【0090】

抗体無添加時の蛍光シグナル強度を１００％とすると、図９Ａに示すように、添加したＰＧ４Ｄ１抗体、ＰＧ４Ｄ２抗体、ＭＳ-１抗体はすべて濃度依存的にＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合を阻害することが確認された。特にＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体はＭＳ-１抗体よりもその阻害活性が強いことが明らかとなった。また、６Ｇ４２Ａ４、９Ｄ６２Ｄ６抗体にもＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合を阻害する活性は認められたが、その効果はＭＳ-１抗体よりも弱かった（図９Ｂ）。

【0091】

この結果は、抗体がエピトープとして認識する領域である７７番目のから８４番目までのペプチド部分が、ＣＬＥＣ-２とＡｇｇｒｕｓとの結合に重要であることを示している。また、点変異体を用いた実施例６の解析から、８５番目のスレオニンがＣＬＥＣ−２とＡｇｇｒｕｓとの結合に重要であることは明らかである。したがって、７７番目から８５番目までのアミノ酸配列（配列番号１：ＧＩＲＩＥＤＬＰＴ）が、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ−２との結合に重要な配列であると結論付けられた。

【0092】

配列番号１で表される領域は、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ-２との結合に必要な領域であり、さらに、ＰＧ４Ｄ１抗体、ＰＧ４Ｄ２抗体が認識する配列番号３（ＲＩＥＤＬ）はそのコア領域であると考えられる。したがって、配列番号１、又は配列番号３を含むペプチドを合成し投与すれば、ＣＬＥＣ-２とＡｇｇｒｕｓの結合を阻害し、ＣＬＥＣ-２とＡｇｇｒｕｓの結合を阻害できる。ＣＬＥＣ-２とＡｇｇｒｕｓとの結合を阻害することができれば、血小板凝集を抑制し、がんの進展、転移を抑制することができるので当該領域を有効成分とする医薬組成物となる。

【0093】

競合阻害に必要なペプチドとしては、配列番号１、又は３を含むペプチドであればよいが、ペプチドの合成や作用を考慮するとあまり大きいペプチドではない方が好ましい。具体的には、配列番号１、又は３を含み、これらペプチドより数アミノ酸〜数１０アミノ酸程度長い配列のペプチドであることが好ましく、配列番号１又は３のペプチド配列そのものであることがより好ましい。

【0094】

（２）ＦＡＣＳ法による検討
ＰＧ４Ｄ１抗体、ＰＧ４Ｄ２抗体によるＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合阻害をＦＡＣＳにより解析した。ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−ＷＴ細胞と、組換えＣＬＥＣ‐２（ｒＣＬＥＣ‐２）との結合を抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体が阻害するか解析を行った。検出は組換えＣＬＥＣ‐２のＨｉｓタグを認識する抗体を用いて行っている。

【0095】

具体的には、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−ＷＴ細胞を培養容器から回収し、ＰＢＳで洗浄した後に１．５×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調製した。１００μＬの反応溶液に、マウスコントロールＩｇＧ（１００μｇ／ｍＬ：ｗ／ｏ ｒＣＬＥＣ‐２あるいはｒＣＬＥＣ‐２ ａｌｏｎｅのサンプル）、ＰＧ４Ｄ１抗体（１００μｇ／ｍＬ：ＰＧ４Ｄ１＋ｒＣＬＥＣ‐２サンプル）、ＰＧ４Ｄ２抗体（１００μｇ／ｍＬ：ＰＧ４Ｄ２＋ｒＣＬＥＣ‐２サンプル）、ＭＳ-１抗体（１００μｇ／ｍＬ：ＭＳ-１＋ｒＣＬＥＣ‐２サンプル）を添加し、３０分間氷上で反応させた。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、その後哺乳動物細胞から精製した０．４ μｇ／ｍＬ（Ｈｉｓ）_１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２タンパク質（ｒＣＬＥＣ‐２）をｗ／ｏ ｒＣＬＥＣ‐２以外のサンプルに添加し、３０分間氷上で反応させた。ＰＢＳで洗浄後に、蛍光標識されたＨｉｓタグを認識する二次抗体を添加し、氷上でさらに３０分間反応させた。最後に、細胞を３回ＰＢＳで洗浄した後に、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００で解析を行なった。その結果、図１０Ａに示すように、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体は、ＭＳ-１抗体と同様にｒＣＬＥＣ‐２のＡｇｇｒｕｓ発現細胞への結合を阻害するとともに、その阻害活性はＭＳ-１抗体よりも強いためにピークが大きく左にシフトしていることが確認された。

【0096】

ＭＳ-１抗体はＰＬＡＧ２からＰＬＡＧ３ドメインにわたる領域を認識するのに対し（図１参照）、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体はＰＬＡＧ４ドメイン近傍を認識する（図７参照）。そこで、ＰＧ４Ｄ１抗体あるいはＰＧ４Ｄ２抗体がＡｇｇｒｕｓに結合した際のＭＳ-１抗体のＡｇｇｒｕｓ認識能の変化を検討した。ＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識したＭＳ-１抗体とＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識したＰＧ４Ｄ２抗体を作製した。具体的には、ＤｙＬｉｇｈｔ ５９４ Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社製）の説明書に従って、ＭＳ-１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体に蛍光標識した。

【0097】

ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ細胞株を培養容器から回収し、ＰＢＳで洗浄した後に１．５×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調製し、ＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識したＭＳ-１抗体又はＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識したＰＧ４Ｄ２抗体を添加し、３０分間氷上で反応させた。一部のサンプルには、ＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識した抗体を添加する際に、無標識のＭＳ-１抗体又はＰＧ４Ｄ２抗体を添加した。その後に、細胞を３回ＰＢＳで洗浄した後に、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００で解析を行なった。なお、黒く塗りつぶした山は、蛍光標識した抗体の代わりに無標識のコントロールマウス抗体（シグマ社製）を各々の細胞に反応させ、上記と同様な操作を行なった結果である。

【0098】

図１０Ｂ（一番上のパネル）に示すように、ＭＳ-１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体のＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識は十分に行われているため、白抜きのピークが黒く塗りつぶした山より右にシフトしていた。ＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識したＭＳ-１抗体のＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ細胞への反応性は、無標識のＭＳ-１抗体を共存させるとその無標識のＭＳ-１抗体の濃度依存的に阻害されるが（図１０Ｂ左パネル、中段）、無標識のＰＧ４Ｄ２抗体を共存させても阻害されなかった（図１０Ｂ左パネル、下段）。また、ＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識したＰＧ４Ｄ２抗体のＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ細胞への反応性は、無標識のＰＧ４Ｄ２抗体を共存させるとその無標識のＰＧ４Ｄ２抗体の濃度依存的に阻害されるが（図１０Ｂ右パネル、下段）、無標識のＭＳ-１抗体を共存させても阻害されなかった（図１０Ｂ右パネル、中段）。よって、ＭＳ-１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体は各々ＰＬＡＧ３とＰＬＡＧ４ドメインを認識し、そのことによってＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合を阻害していること、言い換えるとＰＬＡＧ３とＰＬＡＧ４ドメインは独立してＣＬＥＣ‐２との結合に関与していることが示唆された。

【0099】

ＭＳ-１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体は、各々ＰＬＡＧ３とＰＬＡＧ４ドメインを認識してＣＬＥＣ‐２の結合を阻害しているのであれば、ＭＳ-１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体を併用することで、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合を完全に阻害できる可能性が考えられた。そこで、その可能性を検証するために、ＭＳ-１抗体単独とＭＳ-１抗体に加えＰＧ４Ｄ２抗体を併用した際のＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合をＦＡＣＳにより解析した。ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−ＷＴ細胞と、組換えＣＬＥＣ‐２（ｒＣＬＥＣ‐２）との結合をＭＳ-１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体が阻害するか解析を行った。検出は組換えＣＬＥＣ‐２をＨｉｓタグを認識する抗体を用いて行っている（図１０Ｃ）。

【0100】

具体的には、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−ＷＴ細胞を培養容器から回収し、ＰＢＳで洗浄した後に１．５×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調製した。１００μＬの反応溶液に、マウスコントロールＩｇＧ（１００μｇ／ｍＬ：ｗ／ｏ ｒＣＬＥＣ‐２あるいはｒＣＬＥＣ‐２ ａｌｏｎｅのサンプル）、ＰＧ４Ｄ２抗体（１００μｇ／ｍＬ：ＰＧ４Ｄ２＋ｒＣＬＥＣ‐２サンプル）、ＰＧ４Ｄ２抗体とＭＳ-１抗体（各１００μｇ／ｍＬ：ＰＧ４Ｄ２＋ＭＳ-１＋ｒＣＬＥＣ‐２サンプル）を添加し、３０分間氷上で反応させた。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、その後哺乳動物細胞から精製した０．４ μｇ／ｍＬ（Ｈｉｓ）_１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２タンパク質（ｒＣＬＥＣ‐２）をｗ／ｏ ｒＣＬＥＣ‐２以外のサンプルに添加し、３０分間氷上で反応させた。ＰＢＳで洗浄後に、蛍光標識されたＨｉｓタグを認識する二次抗体を添加し、氷上でさらに３０分間反応させた。最後に、細胞を３回ＰＢＳで洗浄した後に、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００で解析を行なった。その結果、図１０Ｃに示すように、ＰＧ４Ｄ２抗体とＭＳ-１抗体を併用することで、ＰＧ４Ｄ２抗体単独と比較して、ｒＣＬＥＣ‐２の結合が強く阻害され、ピークが大きく左にシフトしていることが確認された。

【0101】

したがって、ＰＧ４Ｄ１抗体あるいはＰＧ４Ｄ２抗体が認識するＰＬＡＧ４ドメインは、ＰＬＡＧ３ドメインとは独立してＣＬＥＣ‐２との結合に関与していること、ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗体とＰＬＡＧ３ドメインを認識する抗体を併用することで、より強力なＣＬＥＣ‐２結合の抑制が見られることが明らかとなった。

【実施例11】

【0102】

Ａｇｇｒｕｓ変異体を用いたＰＧ４Ｄ１とＰＧ４Ｄ２抗体によるＣＬＥＣ‐２結合の抑制と血小板凝集の抑制の解析
（１）ＣＬＥＣ‐２との結合の抑制
Ａｇｇｒｕｓは血小板上のＣＬＥＣ‐２と結合することで血小板凝集誘導シグナルを伝達する。ＰＧ４Ｄ１抗体あるいはＰＧ４Ｄ２抗体が認識するＰＬＡＧ４ドメインがＣＬＥＣ‐２との結合ならびに血小板凝集に直接的に関与していることを解析した。ｐｃＤＮＡ３ベクターにＰＬＡＧ３ドメイン内の４８番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したヒトＡｇｇｒｕｓ ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドを導入したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−Ｄ４８Ａ）を用いて検討した。Ａｇｇｒｕｓ−Ｄ４８Ａを発現する変異体を用いることによって、ＡｇｇｒｕｓのＰＬＡＧ３ドメインのＣＬＥＣ‐２に対する結合の関与を考慮する必要がなく、ＰＬＡＧ４ドメインとＣＬＥＣ‐２との結合を評価することができる。ＰＬＡＧ４ドメインがＣＬＥＣ‐２とＡｇｇｒｕｓとの結合に直接的に関与しているかＦＡＣＳにより解析した。

【0103】

ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−Ｄ４８Ａ細胞を培養容器から回収し、ＰＢＳで洗浄した後に１．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調製した。１００μＬの反応溶液に、ＰＢＳ（ｗ／ｏ ｒＣＬＥＣ‐２あるいはＡｄｄ ｎｏ ａｎｔｉｂｏｄｙのサンプル）、種々の濃度でＰＧ４Ｄ１抗体（図１１Ａ左パネル）、ＰＧ４Ｄ２抗体（図１１Ａ右パネル）を添加し、３０分間氷上で反応させた。その後に細胞をＰＢＳで洗浄し、哺乳動物細胞から精製した（Ｈｉｓ）_１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２タンパク質（ｒＣＬＥＣ‐２）０．４μｇ／ｍＬをｗ／ｏ ｒＣＬＥＣ‐２以外のサンプルに添加し、３０分間氷上で反応させた。ＰＢＳで洗浄後に、蛍光標識されたＨｉｓタグを認識する二次抗体を添加し、氷上でさらに３０分間反応させた。最後に、細胞を３回ＰＢＳで洗浄した後に、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００で解析を行なった。図１１Ａに示すように、ＰＧ４Ｄ１抗体あるいはＰＧ４Ｄ２抗体を添加することにより、ｒＣＬＥＣ‐２のＡｇｇｒｕｓ発現細胞への結合を濃度依存的に阻害するとともに、１００μｇ／ｍＬの濃度で添加した場合にはほぼ完全にｒＣＬＥＣ‐２の結合を阻害することが明らかとなった。よって、ＰＧ４Ｄ１抗体あるいはＰＧ４Ｄ２抗体が認識するＰＬＡＧ４ドメインがＣＬＥＣ‐２との結合に直接的に関与していることが明らかとなった。

【0104】

（２）血小板凝集の抑制
次に、血小板凝集抑制試験でＰＬＡＧ４ドメインのＣＬＥＣ‐２に対する結合を確認した。具体的には、ＭＣＭ ＨＥＭＡ ＴＲＡＣＥＲ ３１３を用いた光透過率のモニタリングによるマウス洗浄血小板を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ血小板凝集分析を行なった。図１１Ｂに示すように、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−Ｄ４８Ａ細胞は血小板凝集を誘導するが、５０ｎｇ／ｍＬのＰＧ４Ｄ２抗体を添加しておくと血小板凝集が起こらなくなることが観察された（図１１Ｂ）。また、ここでは示さないがＰＧ４Ｄ１抗体を事前に添加しておいても、ほぼ同様な血小板凝集阻害効果が確認された。よって、ＰＧ４Ｄ１抗体あるいはＰＧ４Ｄ２抗体が認識するＰＬＡＧ４ドメインが血小板凝集に直接的に関与していること、さらに新たに創製された抗体はＰＬＡＧ４ドメインに結合してそのドメインを覆うことで血小板凝集を阻害する中和抗体であることが明らかとなった。

【0105】

血小板凝集抑制試験で、ＰＬＡＧ４ドメインを認識するＰＧ４Ｄ１抗体あるいはＰＧ４Ｄ２抗体、ＰＬＡＧ３ドメインを認識するＭＳ-１抗体の差異の検討と、ＰＧ４Ｄ２抗体とＭＳ‐１抗体の併用効果を検討した。ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−ＷＴ細胞を用い、上記と同様にｉｎ ｖｉｔｒｏ血小板凝集分析を行なった。図１２Ａに示すように、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−ＷＴ細胞は血小板凝集を誘導するが、１０μｇ／ｍＬのＭＳ-１抗体、ＰＧ４Ｄ１抗体、ＰＧ４Ｄ２抗体を添加するとコントロール抗体（Ｃｏｎｔｒｏｌ ＩｇＧ）添加時に比べて血小板凝集が開始される時間が遅くなることが観察された（図１２Ａ）。また、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体の血小板凝集抑制活性はＭＳ‐１抗体の血小板凝集抑制活性よりも強く、そのために凝集開始までの時間が遅延していることが明らかとなった。

【0106】

さらに、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−ＷＴ細胞依存的な血小板凝集は、１０μｇ／ｍＬのＭＳ‐１抗体と１０μｇ／ｍＬのＰＧ４Ｄ２抗体を併用すると、ＰＧ４Ｄ２抗体単独添加時に比べ、ほぼ完全に血小板凝集を阻害することが確認された（図１２Ｂ）。よって、ＰＧ４Ｄ１抗体あるいはＰＧ４Ｄ２抗体が認識するＰＬＡＧ４ドメインとＭＳ-１抗体が認識するＰＬＡＧ３ドメインの両方が血小板凝集に関与していることが明らかとなった。

【実施例12】

【0107】

ＰＧ４Ｄ１とＰＧ４Ｄ２抗体による肺への血行性転移抑制
ヒトＡｇｇｒｕｓを発現しているＣＨＯ細胞をヌードマウスの尾静脈より導入すると、約２０日後に肺転移結節を形成することが知られている。また、本発明者らは、Ａｇｇｒｕｓ依存的な肺転移はＭＳ-１抗体により抑制されることをすでに開示している（特許文献２）。そこで、細胞移植１日前に、本発明の抗Ａｇｇｒｕｓ抗体を投与することにより、Ａｇｇｒｕｓ依存的な血行性転移を阻害するか解析した。

【0108】

６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕヌードマウス（チャールズリバージャパンより購入）を用いて解析を行った。腫瘍細胞であるＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−ＷＴ細胞移植１日前に、マウス尾静脈より、１０μｇ／マウスの用量でコントロールマウス抗体（シグマ社製）、ＭＳ−１抗体、ＰＧ４Ｄ１抗体、又はＰＧ４Ｄ２抗体を投与した。翌日、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−ＷＴ細胞を培養容器から回収し、ＰＢＳで洗浄した後に２．５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調製し、１００μＬ／マウスで尾静脈より移植した。図１３に示されるように、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体を腫瘍移植前日に投与することにより、ＭＳ−１抗体を腫瘍移植前日投与した場合と同様にＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−ＷＴ細胞の肺転移が顕著に抑制された。したがって、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体はＡｇｇｒｕｓ中和活性があるだけでなく、Ａｇｇｒｕｓ依存的な血行性転移を強く抑制することが示された。

【0109】

同様の検討を各抗体のサブクラスが一致しているアイソタイプマッチなコントロール抗体を用いて行った。また本検討では、５週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕヌードマウス（チャールズリバージャパンより購入）を各群８匹用いて行った。腫瘍細胞であるＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−ＷＴ細胞移植１日前に、マウス尾静脈より、１０μｇ／マウスの用量でコントロールマウスＩｇＧ１（Ｃｏｎｔｒｏｌ ＩｇＧ１、シグマ社製）、コントロールマウスＩｇＧ２ａ（Ｃｏｎｔｒｏｌ ＩｇＧ２ａ、シグマ社製）、ＰＧ４Ｄ１抗体、ＰＧ４Ｄ２抗体、ＭＳ−１抗体を投与した。翌日、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−ＷＴ細胞を培養容器から回収し、ＰＢＳで洗浄した後に２．５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調製し、１００μＬ／マウスで尾静脈より移植した。１９日後に肺を摘出し解析した。図１４Ａに示すようにピクリン酸を用いた染色後の写真を撮るとともに、肺表面の転移結節数のカウントを行った（図１４Ｂ）。ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体を腫瘍移植前日に投与することにより、ＭＳ−１抗体の場合と同様にＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ−ＷＴ細胞の肺転移が各アイソタイプマッチなコントロール抗体投与群と比較して、有意に抑制される（＊＊，Ｐ＜０．０１）ことが確認された。

【0110】

したがって、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体はＡｇｇｒｕｓ依存的な血小板凝集を中和する活性があるだけでなく、Ａｇｇｒｕｓ依存的な血行性転移を強く抑制することが示された。血小板凝集は、がん細胞の転移ニッチの形成（転移微小環境の形成）に関わることが報告されており、このことからＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体は転移に関わるニッチ形成の阻害効果があるものと考えられる。さらに血小板は原発巣における腫瘍増殖にも関わっていることが明らかとなっているため、転移がんの転移臓器内での増殖をＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体が抑制することで転移抑制効果を発揮していることが示唆される。

【実施例13】

【0111】

ＰＬＡＧ４ドメイン認識抗体ＰＧ４Ｄ２がＬＣ-ＳＣＣ-０１５細胞の肺転移を抑制する効果の実証
本発明者らが樹立したヒト肺扁平上皮がん細胞株ＬＣ-ＳＣＣ-０１５を、５週齢の雄性ＣＢ-１７ ＳＣＩＤマウス（チャールズリバージャパンより購入）に各群３匹移植して行った。具体的には、腫瘍細胞であるＬＣ-ＳＣＣ-０１５細胞移植１日前に、マウス尾静脈より、３０μｇ／マウスの用量でコントロールマウスＩｇＧ２ａ（Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ、シグマ社製）、ＰＧ４Ｄ２抗体を投与した。翌日、ＬＣ-ＳＣＣ-０１５細胞を培養容器から回収し、ＰＢＳで洗浄した後に２．５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調製し、１００μＬ／マウスで尾静脈より移植した。３１日後に肺を摘出し、ピクリン酸を用いた染色後に肺表面の転移結節数のカウントを行った（図１５）。ＰＧ４Ｄ２抗体を腫瘍移植前日に投与すると、コントロールマウスＩｇＧ２ａ抗体投与群と比較しても有意に肺転移を抑制することが確認された（＊， Ｐ＜０．０５）。

【0112】

ＰＧ４Ｄ２抗体はＡｇｇｒｕｓ依存的な血小板凝集を中和する活性があるだけではなく、樹立したヒト肺扁平上皮がん細胞株ＬＣ-ＳＣＣ-０１５の肺転移においてもＡｇｇｒｕｓ依存的な血小板凝集が血行性肺転移に関与していることが確認された。ＰＧ４Ｄ２抗体はＡｇｇｒｕｓ依存的な血行性転移を強く抑制することによりＬＣ-ＳＣＣ-０１５細胞の肺転移を抑制していることが示された。

【0113】

血小板凝集は、がん細胞の転移ニッチの形成（転移微小環境の形成）に関わることが報告されている。このことから、ＰＧ４Ｄ２抗体は転移に関わるニッチ形成の阻害効果もあるものと考えられる。さらに血小板は原発巣における腫瘍増殖にも関わっていることが明らかとなっているため、転移がんの転移臓器内での増殖をＰＧ４Ｄ２抗体が抑制することで転移抑制効果を発揮していることも示唆される。

【実施例14】

【0114】

ＰＬＡＧ４ドメイン認識抗体ＰＧ４Ｄ２によるＰＣ-１０細胞の腫瘍増殖を抑制する効果の検証
ヒト肺扁平上皮がん細胞株ＰＣ-１０を、５週齢の雄性ＮＯＤ ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７-Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ；チャールズリバージャパンより購入）に各群４または５匹に移植した。ＰＣ-１０細胞移植後１１日後の腫瘍体積がほぼ８０ ｍｍ^３前後となった時点で、各群の腫瘍体積の平均がほぼ均等となるようにマウスを振り分けた。その後、マウス尾静脈より、コントロールマウスＩｇＧ２ａ（Ｃｏｎｔｒｏｌ ＩｇＧ２ａ、シグマ社製）を２００ μｇ／ｍｏｕｓｅ（ｎ＝５）、ＰＧ４Ｄ２抗体を１００ μｇ／ｍｏｕｓｅ（ｎ＝４）、ＭＳ-１抗体を１００ μｇ／ｍｏｕｓｅ（ｎ＝５）、ＰＧ４Ｄ２抗体とＭＳ-１抗体を各１００ μｇで合計２００ μｇ／ｍｏｕｓｅ（ｎ＝４）の用量で投与した。抗体投与開始日を０日とし、その後の３、７、１０、１４、１７、２１、２４日に同量の抗体投与を行った。

【0115】

図１６に示すように、ＰＧ４Ｄ２抗体あるいはＭＳ-１抗体を投与した群は、コントロールマウス抗体投与群に比較して腫瘍増殖が抑制された。その傾向はＰＧ４Ｄ２抗体とＭＳ-１抗体を併用した場合も同様であった。また、併用による腫瘍抑制効果の増強がわずかに認められた。なお、ＰＧ４Ｄ２抗体を投与した群（ＰＧ４Ｄ２抗体投与群とＰＧ４Ｄ２抗体とＭＳ-１抗体の併用群）では、各群１匹ずつで腫瘍の完全な退縮が認められたが、これはＰＣ-１０細胞の特異性あるいはマウスの個体差によるものである可能性も考慮し、腫瘍体積の平均値などの算出には加えていない。ただ、ＰＧ４Ｄ２抗体を投与した群のみ腫瘍退縮が認められたことは、ＰＧ４Ｄ２抗体にはＭＳ-１抗体とは異なる強い抗腫瘍効果がある可能性もある。

【0116】

ここでは、重度複合免疫不全マウスであるＮＯＤ ＳＣＩＤマウスを使用して検討している。実施例１２で使用したヌードマウスや実施例１３で使用したＳＣＩＤマウスは、Ｔ細胞とＢ細胞が欠如しているマウスであるのに対し、ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスはＴ細胞とＢ細胞が欠如しているだけでなく、ＮＫ活性も低下している。したがって、ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスを用いた実施例１４の実験で認められたＡｇｇｒｕｓ中和抗体の抗腫瘍効果は、抗体のＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性に依存しているものではないと考えられる。ここで用いたＰＬＡＧ３、ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗体は、Ａｇｇｒｕｓの血小板凝集誘導活性を中和することで血小板からの各種増殖因子の遊離を阻害し、その結果増殖阻害を引き起こしていることが示唆された。よって、ＰＧ４Ｄ２抗体は直接的にＰＣ-１０細胞を殺しているのではなく、間接的に増殖因子を枯渇させることで原発巣の腫瘍増殖を抑制していることが示唆された。すなわち、ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗体は、実施例１２及び実施例１３で示したように血行性転移を抑制するだけでなく、原発巣の腫瘍増殖も抑制することが示された。

【実施例15】

【0117】

ヒト‐マウスキメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体によるＡｇｇｒｕｓ中和活性の検討
ＰＧ４Ｄ２抗体の抗原認識部位を遺伝子クローニングし、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部位をコードする遺伝子と連結することでＩｇＧ４タイプのヒト‐マウスキメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体（Ｃｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ４ＳＰ）を、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部位をコードする遺伝子と連結することでＩｇＧ１タイプのヒト‐マウスキメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体（Ｃｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ１）を作製した。

【0118】

図１７Ａは、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ細胞を用い、実施例２と同様に、各抗体のＡｇｇｒｕｓへの反応性を検討した結果を示す。左パネルは、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ細胞とキメラ化していないマウス抗体であるＰＧ４Ｄ２抗体を図中に示してある濃度で反応させ、ＰＢＳでの洗浄後に２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ（ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ-Ａｌｅｘａ４８８）を反応させた結果を示している。中央パネルは、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ細胞をＩｇＧ４タイプのヒト‐マウスキメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体（Ｃｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ４ＳＰ）を図中に示してある濃度で反応させ、ＰＢＳでの洗浄後に２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識抗ヒトＩｇＧ（ａｎｔｉ-ｈｕｍａｎ ＩｇＧ-Ａｌｅｘａ４８８）を反応させた結果を示している。右パネルは、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ細胞をＩｇＧ１タイプのヒト‐マウスキメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体（Ｃｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ１）を図中に示してある濃度で反応させ、ＰＢＳでの洗浄後に２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識抗ヒトＩｇＧを反応させた結果を示している。キメラ化したＣｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ４ＳＰとＣｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ１は、ともにＡｇｇｒｕｓへ反応性を示していることが確認された。

【0119】

図１７Ｂは、実施例１０と同様に、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ-２の結合阻害をＦＡＣＳにより解析した結果を示す。キメラ化していないマウス抗体であるＰＧ４Ｄ２抗体（図１７Ｂ上）、ＩｇＧ４タイプのヒト‐マウスキメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体（Ｃｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ４ＳＰ）（図１７Ｂ下左）、ＩｇＧ１タイプのヒト‐マウスキメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体（Ｃｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ１）（図１７Ｂ下右）を用いてアッセイを行った。なお、各アッセイにおいては、種及び抗体のサブクラスが同じ抗体をコントロール抗体として用いた。具体的には。Ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ（シグマ社製）、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４（シグマ社製）、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１（シグマ社製）を用いた。

【0120】

その結果、 ＩｇＧ４タイプのヒト‐マウスキメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体（Ｃｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ４ＳＰ）は元のキメラ化していないマウス抗体であるＰＧ４Ｄ２抗体とほぼ同等なＡｇｇｒｕｓ中和活性を示すが、ＩｇＧ１タイプのヒト‐マウスキメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体（Ｃｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ１）はＡｇｇｒｕｓ中和活性が少し弱かった。そのため、Ｃｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ１は、ＣＬＥＣ-２との結合阻害に元のＰＧ４Ｄ２抗体よりも多くの抗体量を必要としたが、Ｃｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ１を６０ μｇ／ｍＬで反応させればｒＣＬＥＣ-２のＡｇｇｒｕｓへの結合を十分に阻害できた。

【実施例16】

【0121】

骨肉腫組織切片を用いたＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体を用いた免疫染色
ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ社より、Ｂｏｎｅ ａｎｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ， ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ４ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒ （２ ｅａｃｈ ｏｆ ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ， ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ ａｎｄ Ｅｗｉｎｇ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ）， ｑｕａｄｒｕｐｌｅ ｃｏｒｅｓ ｐｅｒ ｃａｓｅ（製品番号Ｔ２６４ａ）を購入し、常法に従いＨＥ染色を行った（図１８Ａ）。

【0122】

このＴｉｓｓｕｅ ａｒｒａｙには、軟骨肉腫（Ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ）、骨肉腫（Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）、ユーイング肉腫（Ｅｗｉｎｇ’ｓ Ｓａｒｃｏｍａ）の組織サンプルが各２症例ずつ、１症例４つの切片と、組織マーカーとして褐色細胞腫（Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ）が配置されており、病期等が異なる患者の腫瘍組織でのタンパク質発現を免疫染色により解析することが可能である。このスライドに載っている骨肉腫２症例において、Ｄ２−４０、ＰＧ４Ｄ１、ＰＧ４Ｄ２の免疫染色法による骨肉腫認識能を検討した。

【0123】

一次抗体としてＤ２-４０抗体（ＤＡＫＯ社：製品番号Ｍ３６１９、Ａｎｔｉ-ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＰＧ４Ｄ１抗体（５ ｍｇ／ｍｌ）、ＰＧ４Ｄ２抗体（５ ｍｇ／ｍｌ）を用いて免疫染色を以下の方法にて行った。具体的には、脱パラフィン後に水洗し、０．３％過酸化水素水／メタノールに室温で１０分間浸し、ＰＢＳにて５分間洗浄することを３回繰り返した。その後にブロッキングワンＰ（ナカライテスク社製 ＃０５９９９-８４）に室温で１５分間浸したのちにＰＢＳにて５分間洗浄した。その後に一次抗体としてＤ２-４０抗体を使用する場合はＰＢＳで１／１００希釈したものを４度で１６時間反応させた。一次抗体としてＰＧ４Ｄ１あるいはＰＧ４Ｄ２抗体を使用する場合はＰＢＳで１／１０００希釈したもの（最終抗体濃度５ μｇ／ｍｌ）を４度で１６時間反応させた。Ｄ２-４０抗体は、培養上清であるためにグラム換算が困難であることから、下記に示すようにコントロール組織での染色度合いがすべての抗体で同等となるような抗体濃度を選択して染色を行っている。ＰＢＳにて５分間洗浄することを３回繰り返した後に、二次抗体としてＯｎｅ-Ｓｔｅｐ Ｐｏｌｙｍｅｒ-ＨＲＰ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ社製 ＃ＨＫ５９５-５０Ｋ）に室温で１５分間反応させた。ＰＢＳにて５分間洗浄することを３回繰り返した後に、ＤＡＢ（商品名Ｓｕｐｅｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＤＡＢ （Ｒｅａｄｙ ｔｏ ｕｓｅ）、ＢｉｏＧｅｎｅｘ社製 ＃ＨＫ５４２-ＸＡＫ）にて５分間発色させた。水洗した後に核をマイヤーヘマトキシリン溶液（武藤化学株式会社製 ＃３０００-２）に１分間漬けることで対比染色し、その後に水洗、脱水、透徹、封入を常法に従い行った。

【0124】

Ｔｉｓｓｕｅ ａｒｒａｙであるＴ２６４ａスライドには、上述のように骨肉腫２症例の腫瘍組織が載っており、図１８Ａに示すＡ３とＡ６の腫瘍組織は１番目の骨肉腫症例（１０歳男性）であり、Ｂ１とＢ４の腫瘍組織は２番目の骨肉腫症例（２１歳女性）に由来している。図１８Ｂに示すように、Ｄ７に位置するコントロール腫瘍組織（Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ）への染色度合いがほぼ一致している染色度合いで比較すると、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体を用いた免疫染色の染色度合いはＤ２-４０抗体の染色度合いと比較してよく染まっており、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体はＤ２-４０抗体よりも骨肉腫認識能が高いことがわかる。したがって、少なくとも骨肉腫の増殖阻害薬・転移阻害薬として有用であることが示唆される。

【0125】

ｍＲＮＡではＡｇｇｒｕｓの発現が確認できるにもかかわらず、抗体では検出されないことがあり、Ａｇｇｒｕｓ抗体の治療への応用が限定的なものであることが懸念されていた。例えば、本発明者らは、ＭＳ-１抗体が認識できないヒト膀胱扁平上皮がん細胞株ＵＭ-ＵＣ-５細胞や、ヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０細胞をＰＧ４Ｄ１抗体、ＰＧ４Ｄ２抗体が認識することを示している（図７Ｃ）。がんの種類等によって、Ａｇｇｒｕｓを認識できる場合とできない場合の機序は不明であるが、ＰＧ４Ｄ１抗体、ＰＧ４Ｄ２抗体は少なくともここで示した骨肉腫、細胞株を用いた実験系で結合が検証されている膀胱扁平上皮がん、線維肉腫、肺扁平上皮がんでは治療への適用が可能であると考えられる。

【0126】

以上示してきたように、配列番号１により表される領域に結合する抗Ａｇｇｒｕｓ抗体は、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ-２との結合を阻害し、血小板凝集を抑制し、がんの進展、転移を抑制する。さらに、この領域とＣＬＥＣ-２との結合を指標として、ＣＬＥＣ-２との結合を阻害する医薬をスクリーニングすることが可能となる。

【0127】

受託番号
ＮＩＴＥ ＢＰ−０３０４１
ＮＩＴＥ ＢＰ−０３０４２

【0128】

寄託機関の名称 ＮＰＭＤ （独）製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
寄託機関のあて名 日本国 〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室
寄託の日付 ２０１５年０６月２５日（２５．０６．２０１５）
受託番号 ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ Ｐ−０２０７１

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]