特許 6803856 循環系視覚化のための組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6803856

(24)【登録日】2020年12月3日

(45)【発行日】2020年12月23日

(54)【発明の名称】循環系視覚化のための組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 49/00 20060101AFI20201214BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20201214BHJP

   A61K 9/00 20060101ALI20201214BHJP

   A61M 37/00 20060101ALI20201214BHJP

   A61B 10/00 20060101ALI20201214BHJP

【ＦＩ】

   A61K49/00

   A61K47/34

   A61K9/00

   A61M37/00 530

   A61B10/00 E

【請求項の数】15

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2017-559581(P2017-559581)

(86)(22)【出願日】2016年5月10日

(65)【公表番号】特表2018-524278(P2018-524278A)

(43)【公表日】2018年8月30日

(86)【国際出願番号】EP2016060467

(87)【国際公開番号】WO2016180835

(87)【国際公開日】20161117

【審査請求日】2019年4月25日

(31)【優先権主張番号】15167160.9

(32)【優先日】2015年5月11日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】518363369

【氏名又は名称】ディクロニス サーグル

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ルルー， ジャン−クリストフ

(72)【発明者】

【氏名】デトマール， ミヒャエル

(72)【発明者】

【氏名】ブランビッラ， ダヴィデ

(72)【発明者】

【氏名】プルー， スティーヴン

【審査官】 佐々木 大輔

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００３／００６０７１８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０１２−５２９５００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−０２５７２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５２３７２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−０４７６８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０８７３００（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ４９／００−４９／２２

Ａ６１Ｋ ９／００− ９／７２

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／６９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び
（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）
を含む固体組成物であって、質量比ＩＣＧ：ＰＶＰが、１：１５０，０００−１：３７５、好ましくは１：１００，０００−１：３７５である、固体組成物。

【請求項2】

前記質量比ＩＣＧ：ＰＶＰが、１：５０，０００−１：３７５であり、さらに好ましくは前記質量比ＩＣＧ：ＰＶＰが、１：２０，０００−１：３７５である、請求項１に記載の固体組成物。

【請求項3】

前記ＰＶＰが、５０，０００ダルトン未満、好ましくは２０，０００ダルトン未満の重量平均分子量を有し、さらに好ましくは前記ＰＶＰが、５００−２０，０００、再度好ましくは５００−１２，０００、さらに好ましくは２，０００−１１，０００の重量平均分子量を有する、請求項１又は２に記載の固体組成物。

【請求項4】

請求項１から３の何れか一項に記載の前記固体組成物を、水、好ましくは滅菌水、さらに好ましくは注射用水（ＷＦＩ）に溶解させることによって得られる水性組成物。

【請求項5】

前記水性組成物中の前記ＩＣＧの濃度が、０．０２５ｍｇ／ｍＬ−９．８ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは前記水性組成物中の前記ＩＣＧの濃度が、０．０２５ｍｇ／ｍＬ−５ｍｇ／ｍＬであり、且つ前記水性組成物中の前記ＰＶＰの濃度が、０．５ｍｇ／ｍＬに等しいか又はそれを超え、好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ−１．５ｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは前記水性組成物中の前記ＰＶＰの濃度が、７．５ｍｇ／ｍＬ−１．５ｇ／ｍＬである、請求項４に記載の水性組成物。

【請求項6】

前記水性組成物中の前記ＩＣＧの濃度が、０．０５ｍｇ／ｍＬ−２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ−２０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ−５ｍｇ／ｍＬであり、且つ前記水性組成物中の前記ＰＶＰの濃度が、７５ｍｇ／ｍＬ−１．５ｇ／ｍＬである、請求項４又は５に記載の水性組成物。

【請求項7】

同じ濃度のＩＣＧを含むが、前記ＰＶＰを欠く対応する水性組成物と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも４５％の、前記ＩＣＧの蛍光の増加を示す、請求項４から６の何れか一項に記載の水性組成物。

【請求項8】

（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び
（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）
を含む水性組成物であって、前記水性組成物中の前記ＩＣＧの濃度は、０．０２５ｍｇ／ｍＬ−５ｍｇ／ｍＬであり、且つ前記水性組成物中の前記ＰＶＰの濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬに等しいか又はそれを超え、好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ−１．５ｇ／ｍＬであり、好ましくは前記水性組成物中の前記ＰＶＰの濃度は、７．５ｍｇ／ｍＬ−１．５ｇ／ｍＬである、水性組成物。

【請求項9】

好ましくは複数のマイクロニードルが、取り付けられる基材、又は一体的に形成される基材を含むマイクロニードルデバイスであって、質量比ＩＣＧ：ＰＶＰが、１：１５０，０００−１：３７５、好ましくは１：１００，０００−１：３７５である、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含む固体組成物からなる、マイクロニードルデバイス。

【請求項10】

請求項４から７の何れか一項に記載の水性組成物を生成させる方法であって、請求項１から３の何れか一項に記載の前記固体組成物を、水、好ましくは滅菌水、さらに好ましくは注射用水（ＷＦＩ）に溶解させることを含む方法。

【請求項11】

第１の容器及び第２の容器を備えるマルチチャンバ型槽であって、前記第１の容器は、請求項１から３の何れか一項に記載の固体組成物を含み、前記第２の容器は、生理学的に許容される水溶液又は滅菌水、好ましくは注射用水（ＷＦＩ）を含み、且つ好ましくはデュアルチャンバシリンジ又はバイアルであり、再度さらにデュアルチャンバシリンジであるマルチチャンバ型槽。

【請求項12】

請求項１から３の何れか一項に記載の固体組成物、又は請求項４から８の何れか一項に記載の水性組成物、好ましくは請求項１から３の何れか一項に記載の固体組成物を用いてマイクロニードルデバイスを作製する方法。

【請求項13】

脈管系を画像化する、好ましくはリンパ系を画像化する方法における、さらに好ましくはリンパ系を実時間定量画像化する方法における、請求項１から３の何れか一項に記載の固体組成物、請求項４から８の何れか一項に記載の水性組成物、又は請求項９に記載のマイクロニードルデバイスの使用であって、再度さらに好ましくは、前記画像化が近赤外（ＮＩＲ）画像化による、使用。

【請求項14】

組織の脈管造影画像を得る方法又は組織の灌流を画像化する方法における使用のための、請求項１から３の何れか一項に記載の固体組成物、又は請求項４から８の何れか一項に記載の水性組成物であって、好ましくは前記組織は、眼、肺、胃腸管、膀胱、膵臓、胆嚢、静脈洞、気管、肝臓、腎臓、心臓、頸部、脳、卵巣、前立腺、胃又は皮膚であり、さらに好ましくは前記組織は、眼、心臓、肝臓及び胃である、固体組成物又は水性組成物。

【請求項15】

脈管系をモニターする、好ましくはリンパ系をモニターする方法、さらに好ましくはリンパ系を実時間定量モニターする方法における使用のための、請求項１から３の何れか一項に記載の固体組成物、請求項４から８の何れか一項に記載の水性組成物、又は請求項９に記載のマイクロニードルデバイスであって、好ましくは前記モニターすることは、前記脈管系又は前記リンパ系の機能の評価を含む、固体組成物、水性組成物、又はマイクロニードルデバイス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、インドシアニングリーン及びポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）を含む組成物及びそれを製造する方法並びに診断及び療法上の使用のためのその適用について記載する。それらの適用の一つは、蛍光画像化によるリンパ系の構造的及び機能的評価である。

【背景技術】

【0002】

循環系は、脊椎動物の生命における中心的存在である。それは、身体に栄養分を与え、その温度及びｐＨを安定化し、及びその恒常性を維持するために、栄養素、細胞及び酸素を含むいくつかの構成要素を含有する血液を身体全体にわたって輸送することを担当している。多くの疾患が循環系に影響を及ぼすので、その構造及び機能のモニタリングは、いくつかの診断手順において基本的なステップである。特に、関心のある組織及び臓器の脈管機能及び灌流のモニタリングは、本明細書によって重要な役割を果たす。

【0003】

リンパ系は、脈管及び節の網状組織からなり、これらは、リンパ液を間質空間から血流に排出して戻すことによって、組織恒常性において不可欠の役割を果たす。リンパ機能が損なわれる場合、いくつかの病態、最も特にはリンパ浮腫が発症し得、これは、生活の質を著しく損ない得る罹患した肢における体液貯留を特徴とする。特に、リンパ浮腫は、乳癌の手術後にしばしば観察され、損なわれた創傷治癒は、損なわれたリンパ機能と関連し得る。最近、異なる病的状態（炎症、癌増殖及び転移など）が、リンパ系の変化と強く相関することが明らかになってきている。したがって、いくつかの疾患において、リンパ管の構造及び機能の評価を、療法及び診断上の目的のために利用することができる。

【0004】

例えば、リンパ系の視覚化は、早期皮膚癌ステージングを特徴付けするために及びリンパ性血管疾患におけるリンパ脈管系の構造及び機能の評価のために、センチネルリンパ節をマッピングするための臨床関連手段であり得る。コンピュータ断層撮影、超音波、リンパ節シンチグラフィ、磁気共鳴画像化及びポジトロン断層法を含む、多くの技術が、リンパのアーキテクチャ及び機能を視覚化するために使用されてきた。しかしながら、それらの法外なコスト、適切な空間分解能の欠如及び／又はコントラスト剤投与のためにリンパ管の位置を決め、それにカニューレを挿入することが困難なために、それらは日常的には用いられていない。最近、近赤外（ＮＩＲ）画像化が、高感度であることによりリンパのアーキテクチャ及び機能の非侵襲性評価が可能になることから台頭してきた。光子が生物組織によって最小限に散乱又は吸収される波長範囲（＞７５０ｎｍ）で、ＮＩＲ画像化及び断層法により、表在性脈管のための優れた空間分解能が実証されている（Nelson, TS等、Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 306: R281-R290、2014）。いくつかの有機及び無機ＮＩＲ色素が提案されてきたが、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）が唯一ＦＤＡ認可されたものとして残っている。

【0005】

インドシアニングリーン（ＩＣＧ）は、肝クリアランス、心臓血管機能及び網膜造影法の評価のために５０年以上の間臨床的に使用されてきた、負に荷電した、水溶性の暗緑色のトリカルボシアニン色素である。特に、ＦＤＡは、肝機能、心拍出量及び肝血流量を決定する際の使用のための、並びに眼科造影法のための注射可能コントラスト剤としてＩＣＧを認可した。例えば、眼科造影法では、ＩＣＧは、放射線によって蛍光に励起され、眼科脈管系の造影図が得られることを可能にする。さらに、ＩＣＧは、それが胆汁で専ら排泄され、静脈内投与後に３−４分の血清半減期を有するので、心拍出量及び肝機能の試験としての使用の長い歴史を有する。さらに、ＩＣＧ使用は、肝臓又は内臓灌流の非侵襲性モニタリングを可能にする（ＩＣＧ血漿消失速度の変化をモニタリングすることによって、集中治療手術患者の生存の確率を予測するためのパラメータとしてこの方法は適する）。

【0006】

クリニックでは、色素は通常、静脈内投与直前にｍｇ／ｍｌ範囲の濃度で注射可能な水中で復元される。その光学特性及びタンパク質結合特性のために、ＩＣＧ画像化は最近、リンパ液排出定量化／速度論、センチネルリンパ節マッピング、並びにリンパ脈管系構造の評価及び移植後の脈管修復のモニタリング、並びに腫瘍画像化のために用いられている。しかしながら、水に可溶性であるけれども、ＩＣＧは、劇的な蛍光自己クエンチングを示す。結果として、蛍光シグナルは、低いことがあり得、脱クエンチングが、一般にインビボでの投与後の最初の数時間以内に観察され、画像化アーチファクト、及び精密なクリアランス速度論定量化の困難性をもたらす。

【0007】

ＩＣＧ−水の制約を回避するために提案された種々の処方の中で、血清アルブミンへのＩＣＧの前吸収は、特定の注目を得てきている。事実、ＩＣＧの蛍光シグナルは、規定された最適モル比がほぼ１であるアルブミンの存在下で増加され、いくつかの刊行物は、この処方を使用しての改善されたリンパ画像化を報告した（Moody等、Journal of Chromatography B、729 (1999)、55-64; Ohnishi等、Molecular Imaging、4(3)、172-181、2005）。Ｍａｌｉｃｋａ等は、金属粒子（銀）の存在／近接が、放射崩壊の増加によってＩＣＧ−アルブミン複合体の蛍光強度をなおさらに増幅することができることを発見した（Malicka J.等、Journal of Biomedical Optics、2003、8(3)、472-8）。しかしながら、簡単ではあるが、ヒト血清アルブミンをベースとする処方は、いくつかの欠点を有する。これらには、潜在的に高い生産原価、特にマイクロニードルデバイスを調製するために使用される場合の非最適機械的特性、並びに特にガンマ照射又はオートクレーブによる滅菌後の、注射後の起こり得る免疫原性が含まれる。同時に、いくつかの他の戦略が提案されている。Ｄｅｖｏｉｓｅｌｌｅ等は、高濃度のリン脂質及び界面活性剤の存在下でのＩＣＧの蛍光の増加を観察した（Devoiselle等、SPIE、1997、2980、453-460)。米国特許第６９４４４９３号には、復元後のＩＣＧ溶液の安定性を改善し、ＩＣＧ濃度を増強するために、アルコール及び安定剤、例えば、非イオン性界面活性剤をさらに含む水性ＩＣＧ組成物が記載された。欧州特許第２７７４６２５号には、腫瘍検出及び光線力学的治療のための、スチレンマレイン酸（ＳＭＡ）コポリマーにより形成されたミセル内の蛍光プローブ、例えばＩＣＧのカプセル化が記載された。欧州特許第１６５５０４０号には、手術切除の前及び間にセンチネルリンパ節視覚化のための有利なツールとして可視性色素（例えば、ＩＣＧ）と組み合わせて気体充填マイクロバブルから作られている超音波コントラスト剤の設計が記載された。Ｐｒｏｕｌｘ等は、溶液中の改善された安定性及び増強された蛍光シグナルを有する、ＩＣＧのＰＥＧ化リポソーマル処方物を記載した。皮膚内に注射される場合、リポソームは、具体的にはリンパ管により吸収され、深リンパ節の改善された視覚化を可能にした（Proulx等、Cancer Research、2010;70(18):7053-62）。

【0008】

行われてきた開発にもかかわらず、依然として、迅速で信頼できる診断は、現代医学が必要な治療を敏速に適用し、より重症な疾患段階に悪化することを避けるための決定的な課題となっている。特に、リンパの流れを測定するための定量画像化方法が決定的に必要とされている。

【発明の概要】

【0009】

本発明者等は、意外なことに、Ｎ−ビニルピロリドンモノマーから作られた水溶性ポリマーである、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）と、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）との組み合わせが、ＩＣＧの蛍光シグナルにおいて有意な増加をもたらすことを見出した。意外なことに、これは、本発明の水性組成物についての場合だけでなく、本発明の固体組成物についての場合にも同様である。したがって、意外なことに、本発明の本発明組成物で調製されたマイクロニードルデバイスが、強い蛍光を示すことが見出された。これは特に、ＩＣＧが典型的にはその使用前に水に溶解されるので、注目に値する。さらに及び本発明組成物の診断上の適用にとって特に重要なことに、本発明ＩＣＧ−ＰＶＰ組成物の投与後の蛍光シグナルは、ＩＣＧ−水組成物の場合には生じる脱クエンチング、すなわち、早期時点にわたっての蛍光シグナルの増加を示さない。そして次に、これは、クリアランス速度論がリンパ機能と相関するので、精密な空間的及び時間的リンパクリアランス速度論の定量化を可能にする。したがって、本発明組成物は、脈管系、特にリンパ系の実時間定量画像化に特に有用である。注射部位における蛍光シグナルは、好ましくは、ＮＩＲカメラを使用して定量的に視覚化され得る。いくつかの病態、例えば、皮膚疾患又は癌の診断に本発明組成物を使用してのリンパ系の非侵襲性で、迅速な評価は、適切な療法設計のための決定的な工程にまさに相当する。さらに、ＩＣＧ蛍光シグナルを増加させ、脱クエンチングを回避する能力は別にして、本発明組成物、特にＮＩＲ蛍光リンパ系画像化のための賦形剤としてＰＶＰを使用する興味ある特徴には、その認められた安全性、注射可能グレードでの入手性、並びに濾過、オートクレーブ及びガンマ線を含めて様々な手段によって滅菌される能力が含まれる。さらに、ＰＶＰは、ＦＤＡ認可薬物における賦形剤として既に使用されている。さらに及び示されるとおりに、ＩＣＧは、ＦＤＡによりこれまで認可された唯一のＮＩＲ色素である。したがって、本発明組成物は、さらに、規制面を考慮に入れる場合、非常に有益である。さらに、それぞれ、他の従来記載されたＩＣＧ処方物及び組成物のすべてと比較して、本発明のＩＣＧ／ＰＶＰ組成物は、有害な材料、例えば、有機溶媒又は他の潜在的に毒性の分子の完全な非存在下で少数の調製工程しか含まれず、技術的に極度に簡単である。

【0010】

したがって、第１の態様において、本発明は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含む固体組成物であって、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：１５０，０００−１：１２．５であり、好ましくは前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：１００，０００−１：１２．５であり、さらに好ましくは前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：１００，０００−１：３７．５であり、さらに好ましくは前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：１００，０００−１：７５であり、再度さらに好ましくは前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：５０，０００−１：７５であり、再度さらに好ましくは前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：２０，０００−１：３７５である、固体組成物を提供する。好ましい実施態様において、ＰＶＰは、５０，０００ダルトン未満、好ましくは２０，０００ダルトン未満、さらに好ましくは５００−２０，０００ダルトン、再度好ましくは５００−１２，０００ダルトン、再度さらに好ましくは２，０００−１１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。

【0011】

第２の態様において、本発明は、本発明固体組成物を、水、好ましくは滅菌水、さらに好ましくは注射用水（ＷＦＩ）に溶解させることによって得られる水性組成物を提供する。好ましくは、前記水性組成物中の前記ＩＣＧの濃度は、０．０２５ｍｇ／ｍＬ−２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０２５ｍｇ／ｍＬ−９．８ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは、前記水性組成物中の前記ＩＣＧの濃度は、０．０２５ｍｇ／ｍＬ−５ｍｇ／ｍＬ、再度さらに好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ−５ｍｇ／ｍＬであり、且つ前記水性組成物中の前記ＰＶＰの濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬに等しいか又はそれを超え、好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ−１．５ｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは、前記水性組成物中の前記ＰＶＰの濃度は、７．５ｍｇ／ｍＬ−１．５ｇ／ｍＬ、再度さらに好ましくは７．５ｍｇ／ｍＬ−０．５ｇ／ｍＬである。別の好ましい実施態様において、前記水性組成物中の前記ＩＣＧの濃度は、０．０５ｍｇ／ｍＬ−２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ−２０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ−５ｍｇ／ｍＬであり、且つ前記水性組成物中の前記ＰＶＰの濃度は、７５ｍｇ／ｍＬ−１．５ｇ／ｍＬである。別の好ましい実施態様において、前記水性組成物中の前記ＩＣＧの濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬ−９．８ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ−５ｍｇ／ｍＬであり、且つ前記水性組成物中の前記ＰＶＰの濃度は、７５ｍｇ／ｍＬ−１．５ｇ／ｍＬ、好ましくは７５ｍｇ／ｍＬ−０．５ｇ／ｍＬである。

【0012】

さらなる態様において、本発明は、本発明の水性組成物を生成させる方法であって、本発明の固体組成物を、水、好ましくは滅菌水、さらに好ましくは注射用水（ＷＦＩ）に溶解させることを含む方法を提供する。

【0013】

別の態様において、本発明は、第１の容器及び第２の容器を備えるマルチチャンバ型槽であって、前記第１の容器は、本発明の固体組成物を含み、前記第２の容器は、生理学的に許容される水溶液又は滅菌水、好ましくは注射用水（ＷＦＩ）を含む、マルチチャンバ型槽を提供する。好ましくは、前記マルチチャンバ型槽は、デュアルチャンバシリンジである。代わりに好ましくは、マルチチャンバ型槽は、バイアルである。

【0014】

別の好ましい態様において、本発明は、マイクロニードルデバイスを作製する方法における本発明の固体組成物又は本発明の水性組成物の使用を提供する。

【0015】

別の態様において、本発明は、好ましくは複数のマイクロニードルが、取り付けられる基材、又は一体的に形成される基材を含むマイクロニードルデバイスであって、本発明の固体組成物によって調製されるマイクロニードルデバイスを提供する。

【0016】

別の態様において、本発明は、好ましくは複数のマイクロニードルが、取り付けられる基材、又は一体的に形成される基材を含むマイクロニードルデバイスであって、本発明の固体組成物を含む、好ましくはそれからなるマイクロニードルデバイスを提供する。

【0017】

本発明のさらなる態様は、循環系を画像化する、好ましくはリンパ系を画像化する方法における、さらに好ましくはリンパ系を実時間定量画像化する方法における、本発明の固体組成物又は本発明の水性組成物の使用を含む。

【0018】

別の態様において、本発明は、組織の脈管造影画像を得る方法における又は組織の灌流を画像化する方法における、好ましくは組織の脈管造影画像を得る方法における、本発明の固体組成物又は本発明の水性組成物の使用を提供する。好ましくは、組織は、眼、肺、胃腸管、膀胱、膵臓、胆嚢、静脈洞、気管、肝臓、腎臓、心臓、頸部、脳、卵巣、前立腺、胃又は皮膚であり、さらに好ましくは前記組織は、眼、心臓、肝臓及び胃である。

【0019】

別の態様において、本発明は、脈管系をモニターする、好ましくはリンパ系をモニターする方法における、さらに好ましくはリンパ系を実時間定量モニターする方法における、本発明の固体組成物又は本発明の水性組成物の使用であって、好ましくは前記モニタリングは、前記脈管系又は前記リンパ系の機能の評価を含む、使用を提供する。

【0020】

別の態様において、本発明は、組織の脈管造影画像を得る方法における又は組織の灌流を画像化する方法における使用のための固体組成物又は水性組成物であって、好ましくは前記組織は、眼、肺、胃腸管、膀胱、膵臓、胆嚢、静脈洞、気管、肝臓、腎臓、心臓、頸部、脳、卵巣、前立腺、胃又は皮膚であり、好ましくは前記組織は、眼、心臓、肝臓及び胃である、固体組成物又は水性組成物を提供する。

【0021】

別の態様において、本発明は、脈管系をモニターする方法、好ましくはリンパ系をモニターする方法、さらに好ましくはリンパ系を実時間定量モニターする方法における使用のための固体組成物、水性組成物又はマイクロニードルデバイスであって、好ましくは前記モニタリングは、前記脈管系又はリンパ系の機能の評価を含む、固体組成物、水性組成物又はマイクロニードルデバイスを提供する。

【0022】

さらに、本発明のさらなる態様は、哺乳動物、好ましくはヒトの療法における使用のための本発明組成物を含む。好ましくは、前記療法は、光線力学的療法（ＰＤＴ）、好ましくは皮膚腫瘍のためのＰＤＴである。

【0023】

本発明のさらなる態様は、この説明が進むにつれて明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1A】増加する濃度のＫｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）１２ＰＦの存在下でのＩＣＧのＮ−倍の蛍光シグナル増加（ＩＣＧ−水と比較して）を示す図である。

【図1B】単独及びＫｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）１２ＰＦの存在下での９．８ｍｇ／ｍＬの濃度を有する水性ＩＣＧの蛍光シグナルを示す図である。

【図2】水中及びＫｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）１７ＰＦの存在下での異なるＩＣＧ濃度の蛍光シグナルを示す図である。

【図3】Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）１２ＰＦ−ＩＣＧの注射後の皮膚輸入性集合リンパ管アーキテクチャの蛍光双眼実体顕微鏡視覚化を示す図である。

【図4】ＩＶＩＳスペクトル画像化システムによる本発明ＰＶＰ−ＩＣＧ組成物（左耳）及び水−ＩＣＧ（右耳）のマウス耳注射の代表的連続蛍光観察を示す図である。

【図5】水−ＩＣＧ及び本発明ＰＶＰ−ＩＣＧ組成物のマウス耳注射後の増加する経過時間での蛍光シグナル定量化を示す図である。

【図6】（Ａ）ＭＮ内にＩＣＧを含有する全体ＰＶＰ（Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）１２ＰＦ、ＢＡＳＦ）ＭＮデバイス、（Ｂ）少数のＭＮ上の拡大表示、及び（Ｃ）蛍光双眼実体顕微鏡観察（λ_{Ｅｘ／Ｅｍ}：７７０／８３２ｎｍ；露光時間：２０ミリ秒）の双眼実体顕微鏡画像を示す図である。スケールバー：５００μｍ。

【図7】ＭＮ適用後の皮膚輸入性リンパ管アーキテクチャの蛍光双眼実体顕微鏡視覚化を示す図である。

【図8】両方ともが同量のＩＣＧを含有するＰＶＰ（左）又はＨＡ（右）から作られたＭＮの蛍光双眼実体顕微鏡観察を示す図である。

【図9】集合リンパ管収縮波を示す図である。

【図10】ＩＶＩＳスペクトル画像化システムによるＩＣＧ負荷ＰＶＰ ＭＮの適用後のマウス耳（右耳）の代表的連続蛍光観察を示す図である。

【図11】異なる発明ＩＣＧ負荷ＰＶＰ ＭＮのマウス耳適用後の増加する経過時間での蛍光シグナル定量化を示す図である（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。

【図12】排出リンパ節及び鼠経リンパ節対腋窩リンパ節輸出性集合リンパ管の蛍光双眼実体顕微鏡視覚化を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0025】

特に規定のない限り、本明細書で使用される技術及び科学用語はすべて、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0026】

インドシアニングリーン（ＩＣＧ）：本明細書で使用される場合、「インドシアニングリーン（ＩＣＧ）」は、４−［２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｚ）−７−［１，１−ジメチル−３−（４−スルホナトブチル）ベンゾ［ｅ］インドール−２−イリデン］ヘプタ−１，３，５−トリエニル］−１，１−イメチルベンゾ［ｅ］−インドール−３−イウム−３−イル］ブタン−１−スルホン酸ナトリウム（ＩＵＰＡＣ名；ＣＡＳ登録番号３５９９−３２−４）を指す。したがって、ＩＣＧは、一ナトリウム塩である。

【0027】

ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）：本明細書で使用される場合、「ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）」は、モノマーＮ−ビニルピロリドンから作られたポリマーを指す。ＩＵＰＡＣ名は、１−エテニルピロリジン−２−オンであり、ＣＡＳ登録番号は、９００３−３９−８である。

【0028】

質量比：本明細書で使用される場合、用語「質量比」は、本発明の組成物中のＰＶＰの質量に比較してのＩＣＧの質量を指す。例えば、ＰＶＰの水溶液中濃度が１ｇ／ｍＬであり、ＩＣＧの同じ水溶液中濃度が０．１ｇ／ｍＬである場合、ＩＣＧ：ＰＶＰの質量比は、１：１０，０００である。

【0029】

第１の態様において、本発明は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含む固体組成物であって、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：１５０，０００−１：１２．５、好ましくは１：１００，０００−１：１２．５、さらに好ましくは１：１００，０００−１：３７．５、再度さらに好ましくは１：１００，０００−１：７５、再度さらに好ましくは１：５０，０００−１：７５であり、再度さらに好ましくは前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：２０，０００−１：３７５である、固体組成物を提供する。好ましい実施態様において、ＰＶＰは、５０，０００ダルトン未満、好ましくは２０，０００ダルトン未満、さらに好ましくは５００−２０，０００ダルトン、再度好ましくは５００−１２，０００ダルトン、再度さらに好ましくは２，０００−１１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。この分子量範囲におけるＰＶＰは、腎臓により排泄されることが知られている。

【0030】

別の態様において、本発明は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含む、好ましくはそれらからなる固体組成物であって、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：１５０，０００−１：１２．５、好ましくは１：１００，０００−１：１２．５、さらに好ましくは１：１００，０００−１：３７．５、再度さらに好ましくは１：１００，０００−１：７５、再度さらに好ましくは１：５０，０００−１：７５であり、再度さらに好ましくは前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：２０，０００−１：３７５であり、さらに好ましくは前記固体組成物は、（ｃ）任意選択的に緩衝剤、及び（ｄ）任意選択的に浸透剤をさらに含む、固体組成物を提供する。本明細書によるさらに好ましい実施態様において、前記ＰＶＰは、５０，０００ダルトン未満、好ましくは２０，０００ダルトン未満、さらに好ましくは５００−２０，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。本発明の別の好ましい実施態様において、前記ＰＶＰは、５００−１２，０００、好ましくは２，０００−１１，０００の重量平均分子量を有する。好ましい実施態様において、前記固体組成物は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）からなり、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：１５０，０００−１：１２．５、好ましくは１：１００，０００−１：１２．５、さらに好ましくは１：１００，０００−１：３７．５、再度さらに好ましくは１：１００，０００−１：７５、再度さらに好ましくは１：５０，０００−１：７５であり、再度さらに好ましくは前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：２０，０００−１：３７５であり、前記固体組成物は、（ｃ）任意選択的に緩衝剤、及び（ｄ）任意選択的に浸透剤をさらに含む。好ましくは本明細書によって、前記ＰＶＰは、５００−２０，０００ダルトン、さらには５００−１２，０００ダルトン、好ましくは２，０００−１１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。

【0031】

好ましい実施態様において、前記固体組成物は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含み、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：５０，０００−１：７５であり、好ましくは前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：２０，０００−１：３７５である。好ましくは、ＰＶＰは、５０，０００ダルトン未満、好ましくは２０，０００ダルトン未満の重量平均分子量を有する。

【0032】

好ましい実施態様において、前記固体組成物は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含み、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：５０，０００−１：７５であり、好ましくは前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する前記質量比は、１：２０，０００−１：３７５である。好ましくは、ＰＶＰは、２０，０００ダルトン未満、好ましくは５００−２０，０００ダルトン、さらに好ましくは２，０００−１１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。

【0033】

好ましい実施態様において、前記固体組成物は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含み、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：２０，０００−１：３７５である。好ましくは、ＰＶＰは、２０，０００ダルトン未満、好ましくは５００−２０，０００ダルトン、さらに好ましくは２，０００−１１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。

【0034】

用語「固体組成物」は、本明細書で使用される場合、ＩＣＧ及びＰＶＰを前記質量比で含み、ＮＴＰ（標準温度及び圧力、すなわち、２０℃及び１気圧）で固体状態である、本発明組成物を指す。典型的に及び好ましくは、固体組成物は、重量で５％未満、好ましくは重量で３％未満、さらに好ましくは重量で１％未満の含水量を有する。さらなる実施態様において、前記固体組成物は、本質的に水性である。固体組成物を調製するための様々な技術が、限定されないが、溶融押出し、噴霧乾燥、凍結乾燥、及び溶液蒸発を含めて、当技術分野で周知である。好ましくは、本発明の固体組成物は、最初に両方の成分を適当な溶媒、又は溶媒の混合物に溶解させ、次いで、溶媒を蒸発させることによって得られる。溶媒を蒸発させるために使用される方法には、試料を真空及び／又は熱下に置くこと、噴霧乾燥又は凍結乾燥が含まれてもよく、それらのすべては、周知の方法であり、当業者に公知である。溶媒を蒸発させるために本発明のために有用で、典型的に及び好ましく使用されるさらなる方法は、本発明組成物を室温及び大気圧、好ましくはＮＴＰで乾燥させることである。最も都合よくは、それは、典型的に及び好ましくは、乾燥箱で行われる。溶媒、例えば、水及びアルコール、本明細書によって、メタノール又はエタノールが、典型的に使用され得る。好ましくは、溶媒は、水、好ましくはＷＦＩである。本発明のさらに好ましい実施態様において、前記固体組成物は、ＩＣＧ及びＰＶＰを前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比１：１５０，０００−１：１２．５、好ましくは１：１００，０００−１：１２．５、さらに好ましくは１：１００，０００−１：３７．５、再度さらに好ましくは１：１００，０００−１：７５、再度さらに好ましくは１：５０，０００−１：７５で含む溶液を凍結乾燥させることによって得られる凍結乾燥組成物であり、再度さらに好ましくは、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する前記質量比は、１：２０，０００−１：３７５である。本発明の別の好ましい実施態様において、固体組成物は、ＩＣＧ及びＰＶＰを前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比１：１５０，０００−１：１２．５、好ましくは１：１００，０００−１：１２．５、さらに好ましくは１：１００，０００−１：３７．５、再度さらに好ましくは１：１００，０００−１：７５、再度さらに好ましくは１：５０，０００−１：７５で含む溶液を噴霧乾燥させることによって得られ、再度さらに好ましくは前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する前記質量比は、１：２０，０００−１：３７５である。示されるとおりに、噴霧乾燥及び凍結乾燥は、当技術分野で周知の方法であり、適当な噴霧乾燥又は凍結乾燥パラメータも当技術分野で公知であり、それは、そのために適切なパラメータを選択するための当業者の知識の範囲内である。

【0035】

別の態様において、本発明は、本発明の固体組成物を、水、好ましくは滅菌水、さらに好ましくは注射用水（ＷＦＩ）に溶解させることによって得られる水性組成物を提供する。好ましくは、前記水性組成物中の前記ＩＣＧの濃度は、０．０２５ｍｇ／ｍＬ−２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０２５ｍｇ／ｍＬ−９．８ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは、前記水性組成物中の前記ＩＣＧの濃度は、０．０２５ｍｇ／ｍＬ−５ｍｇ／ｍＬ、再度さらに好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ−５ｍｇ／ｍＬであり、且つ前記水性組成物中の前記ＰＶＰの濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬに等しいか又はそれを超え、好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ−１．５ｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは前記水性組成物中の前記ＰＶＰの濃度は、７．５ｍｇ／ｍＬ−１．５ｇ／ｍＬ、再度さらに好ましくは７．５ｍｇ／ｍＬ−０．５ｇ／ｍＬである。別の好ましい実施態様において、前記水性組成物中の前記ＩＣＧの濃度は、０．０５ｍｇ／ｍＬ−２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０５ｍｇ／ｍＬ−９．８ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ−９．８ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ−５ｍｇ／ｍＬであり、且つ前記水性組成物中の前記ＰＶＰの濃度は、７５ｍｇ／ｍＬ−１．５ｇ／ｍＬ、好ましくは７５ｍｇ／ｍＬ−０．５ｇ／ｍＬである。好ましい実施態様において、前記水性組成物は、同じ濃度のＩＣＧを含むが前記ＰＶＰを欠く対応する水性組成物と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも４５％の、前記ＩＣＧの蛍光の増加を示す。したがって、本発明の文脈において、用語「同じ濃度のＩＣＧを含むが前記ＰＶＰを欠く対応する水性組成物と比較しての前記ＩＣＧの蛍光の増加」は、前記増加を決定するための使用される機器及び条件と無関係である増加を指す。前記増加の例示的で、好ましい決定は、実施例の節、特に実施例１で提供される。

【0036】

好ましい実施態様において、前記水性組成物は、本発明の固体組成物をＷＦＩに溶解させることによって得られ、前記水性組成物中の前記ＩＣＧの濃度は、０．０２５ｍｇ／ｍＬ−２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０２５ｍｇ／ｍＬ−９．８ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．０２５ｍｇ／ｍＬ−５ｍｇ／ｍＬ、再度さらに好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ−５ｍｇ／ｍＬであり、且つ前記水性組成物中の前記ＰＶＰの濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬ−１．５ｇ／ｍＬ、好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ−０．５ｇ／ｍＬである。好ましくは、前記水性組成物は、同じ濃度のＩＣＧを含むが前記ＰＶＰを欠く対応する水性組成物と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも４５％の、前記ＩＣＧの蛍光の増加を示す。

【0037】

別の好ましい実施態様において、前記水性組成物は、本発明の固体組成物をＷＦＩに溶解させることによって得られ、前記水性組成物中の前記ＩＣＧの濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬ−２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０２５ｍｇ／ｍＬ−９．８ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．０２５ｍｇ／ｍＬ−５ｍｇ／ｍＬ、再度さらに好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ−５ｍｇ／ｍＬであり、且つ前記水性組成物中の前記ＰＶＰの濃度は、７５ｍｇ／ｍＬ−１．５ｇ／ｍＬ、好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ−０．５ｇ／ｍＬである。好ましくは、前記水性組成物は、同じ濃度のＩＣＧを含むが前記ＰＶＰを欠く対応する水性組成物と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも４５％の、前記ＩＣＧの蛍光の増加を示す。

【0038】

別の好ましい実施態様において、前記水性組成物は、本発明の固体組成物をＷＦＩに溶解させることによって得られ、前記水性組成物中の前記ＩＣＧの濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬ−２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０２５ｍｇ／ｍＬ−９．８ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．０２５ｍｇ／ｍＬ−５ｍｇ／ｍＬ、再度さらに好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ−５ｍｇ／ｍＬであり、前記水性組成物中の前記ＰＶＰの濃度は、７５ｍｇ／ｍＬ−１．５ｇ／ｍＬ、好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ−０．５ｇ／ｍＬであり、且つ前記水性組成物は、同じ濃度のＩＣＧを含むが前記ＰＶＰを欠く対応する水性組成物と比較して、少なくとも４５％の、前記ＩＣＧの蛍光の増加を示す。

【0039】

さらなる態様において、本発明は、（ａ）前記水性組成物中０．０２５ｍｇ／ｍＬ−５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ−５ｍｇ／ｍＬの濃度でインドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）前記水性組成物中０．５ｍｇ／ｍＬに等しいか又はそれを超える濃度、好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ−１．５ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは７．５ｍｇ／ｍＬ−１．５ｇ／ｍＬ、再度さらに好ましくは７．５ｍｇ／ｍＬ−０．５ｇ／ｍＬの濃度でポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、並びに（ｃ）任意選択的に緩衝剤、及び（ｄ）任意選択的に浸透剤を含み、好ましくはそれらからなる水性組成物を提供する。好ましくは、注射用水（ＷＦＩ）が、本発明の水性組成物のための水源として使用される。別の好ましい実施態様において、前記水性組成物中の前記ＩＣＧの濃度は、０．０５ｍｇ／ｍＬ−５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ−５ｍｇ／ｍＬであり、前記水性組成物中の前記ＰＶＰの濃度は、７５ｍｇ／ｍＬ−１．５ｇ／ｍＬ、好ましくは７５ｍｇ／ｍＬ−０．５ｇ／ｍＬである。本発明のために有用な緩衝剤には、クエン酸塩、酢酸塩、ヒスチジン及びリン酸塩からの緩衝剤が含まれる。好ましくは、前記水性組成物は、同じ濃度のＩＣＧを含むが前記ＰＶＰを欠く対応する水性組成物と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも４５％の、前記ＩＣＧの蛍光の増加を示す。

【0040】

したがって、本発明による組成物は、例えば、注射用の液体水性担体での使用前の復元のための、それぞれ、凍結乾燥調製物及び組成物として、固体の形態であってもよい。したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明の水性組成物を生成させるための方法であって、前記固体組成物を生理学的に許容される溶液又は滅菌水、好ましくは注射用水（ＷＦＩ）中で復元することを含む方法を提供する。代わりの態様において、本発明は、本発明の水性組成物を生成させるための方法であって、前記インドシアニングリーン（ＩＣＧ）を、前記ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）の水溶液、好ましくは生理学的に許容される溶液又は滅菌水、さらに好ましくは注射用水（ＷＦＩ）に溶解又は懸濁させることを含む方法を提供する。

【0041】

なおさらなる態様において、本発明は、本発明の水性組成物を生成させるための方法であって、本発明の固体組成物を、水、好ましくは滅菌水、さらに好ましくは注射用水（ＷＦＩ）に溶解又は懸濁させることを含む方法を提供する。

【0042】

本発明のさらに好ましい実施態様において、本発明組成物は、アルコールを含まない。別の実施態様において、本発明の本発明組成物は、ウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミンを含まない。別の実施態様において、本発明の本発明組成物は、いかなる種類の血清タンパク質も含まない。

【0043】

本発明組成物は、任意の適当な仕方、例えば、ガラス、プラスチック又は他の薬学的に許容される材料から作られたバイアル中に包装されてもよい。本発明組成物は、望ましくは光への曝露から保護される。好ましくは、本発明の固体組成物は、マルチチャンバ型槽中に包装される。したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明の固体組成物をそれが診断又は療法に必要とされるまで隔離する、マルチチャンバ型槽を提供する。適当なマルチチャンバ型槽の好ましい例は、デュアルチャンバシリンジ及びデュアルチャンバ型バイアルである。したがって、別の態様において、本発明は、第１の容器及び第２の容器を備えるマルチチャンバ型槽であって、前記第１の容器は、本発明の固体組成物を含み、且つ前記第２の容器は、生理学的に許容される水溶液又は滅菌水、好ましくは注射用水（ＷＦＩ）を含む、マルチチャンバ型槽を提供する。好ましくは、前記マルチチャンバ型槽は、デュアルチャンバシリンジである。代わりに好ましくは、マルチチャンバ型槽は、バイアルである。

【0044】

別の態様において、本発明は、マイクロニードルデバイス（ＭＮデバイス）を作製する方法における使用のための、本発明の水性組成物又は固体組成物、好ましくは前記固体組成物を提供する。別の非常に好ましい態様において、本発明は、マイクロニードルデバイスを作製する方法における、本発明の固体組成物又は本発明の水性組成物、好ましくは前記固体組成物の使用を提供する。

【0045】

再度別の態様において、本発明は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含む、好ましくはそれらからなるマイクロニードルデバイスであって、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：１５０，０００−１：１２．５、好ましくは１：１００，０００−１：１２．５、さらに好ましくは１：１００，０００−１：３７．５、再度さらに好ましくは１：１００，０００−１：７５、再度さらに好ましくは１：５０，０００−１：７５であり、再度さらに好ましくは、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：２０，０００−１：３７５であり、且つ前記マイクロニードルデバイスは、（ｃ）任意選択的に緩衝剤、及び（ｄ）任意選択的に浸透剤をさらに含む、マイクロニードルデバイスを提供する。さらに好ましい実施態様において、前記ＰＶＰは、５０，０００ダルトン未満、好ましくは２０，０００ダルトン未満、さらに好ましくは５００−２０，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。別の好ましい実施態様において、前記ＰＶＰは、５００−１２，０００ダルトン、好ましくは２，０００−１１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。

【0046】

マイクロニードルデバイスは、当業者に公知であり、典型的に及び好ましくは、例えば薬物送達のための組織バリアを横切っての療法的及び生物学的分子の輸送に使用される。マイクロニードルデバイス及びそれを作製する方法は、例えば、米国特許第３９６４４８２号；米国特許第６３３８５６号；米国特許第６５０３２３１号；米国特許第６６１１７０７号；米国特許第８７０８９６６号；米国特許出願公開第２０１２／０２６５１４５Ａ１号；Ｃｈｕ，ＬＹ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＶｏＬ．９９、４２２８−４２３８（２０１０）；Ｐａｒｋ，ＪＨ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０４（２００５）５１−６６；Ｌａｈｉｊｉ，ＳＦ等、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：７９１４；｜ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０７９１４（２０１５）；及びそれらの中に引用された参考文献に記載されている。

【0047】

マイクロニードルデバイスは、典型的には複数のマイクロニードルがそれに付着されるか、又は基材と一体的に形成される基材を含む。デバイスの基材は、金属、セラミック、半導体、有機物、ポリマー、及び複合材料を含めて、様々な材料から構築され得る。基材は、マイクロニードルがそれに付着されるか、又は一体的に形成される基部を含む。最近、生分解性又は溶解性生体適合性ポリマーから作られたマイクロニードルの形成が記載された。したがって、米国特許第８７０８９６６号には、生分解性ポリマー及びマイクロニードルの前記生分解性ポリマーに分散されている活性剤から形成されたマイクロニードルが記載された。次いで、活性剤の送達は、マイクロニードルの生分解性ポリマーの生分解によって行われる。米国特許出願公開第２０１２／０２６５１４５Ａ１号には、マルトース、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、又はヒアルロン酸などの材料でほとんど構成される可溶性マイクロニードルが記載された。材料は、薬物と混合され、次いで、混合物全体が、マイクロニードルを形成する。皮膚の中に入ると直ぐに、マイクロニードルは、分解／溶解し、そのようにして薬物を放出する。制御された薬物送達及び種々のマイクロニードル設計を使用しての送達のためにポリマーマイクロニードルをさらに溶解させることが、例として、Ｃｈｕ等（Chu, LY等、Journal of Pharmaceutical Sciences、Vol.99、4228-4238 (2010)）及びＰａｒｋ，ＪＨ等（Park JH等、Journal of Controlled Release 104 (2005)51-66）によって記載されている。

【0048】

したがって、別の態様において、本発明は、好ましくは複数のマイクロニードルが、取り付けられる基材、又は一体的に形成される基材を含むマイクロニードルデバイスであって、本発明の固体組成物で調製されるマイクロニードルデバイスを提供する。好ましくは、前記固体組成物は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含み、好ましくはそれらからなり、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：１５０，０００−１：１２．５、好ましくは１：１００，０００−１：１２．５、さらに好ましくは１：１００，０００−１：３７．５、再度さらに好ましくは１：１００，０００−１：７５、再度さらに好ましくは１：５０，０００−１：７５であり、再度さらに好ましくは、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：２０，０００−１：３７５であり、且つ前記マイクロニードルデバイスは、（ｃ）任意選択的に緩衝剤、及び（ｄ）任意選択的に浸透剤をさらに含む。さらなる好ましい実施態様において、前記ＰＶＰは、５０，０００ダルトン未満、好ましくは２０，０００ダルトン未満、さらに好ましくは５００−２０，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。別の好ましい実施態様において、前記ＰＶＰは、５００−１２，０００ダルトン、好ましくは２，０００−１１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。好ましい実施態様において、前記固体組成物は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含み、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：１５０，０００−１：７５であり、好ましくは前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：２０，０００−１：３７５である。好ましくは、ＰＶＰは、５０，０００ダルトン未満、好ましくは２０，０００ダルトン未満の重量平均分子量を有する。別の好ましい実施態様において、前記固体組成物は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含み、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：１５０，０００−１：７５であり、好ましくは前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：２０，０００−１：３７５である。好ましくは、ＰＶＰは、２０，０００ダルトン未満、好ましくは５００−２０，０００ダルトン、さらに好ましくは２，０００−１１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。別の好ましい実施態様において、前記固体組成物は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含み、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：２０，０００−１：３７５である。好ましくは、ＰＶＰは、２０，０００ダルトン未満、好ましくは５００−２０，０００ダルトン、さらに好ましくは２，０００−１１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。

【0049】

別の態様において、本発明は、マイクロニードルデバイスの形態での本発明の固体組成物の使用を提供する。

【0050】

別の態様において、本発明は、好ましくは複数のマイクロニードルが、取り付けられる基材、又は一体的に形成される基材を含むマイクロニードルデバイスであって、本発明の水性組成物で調製されるマイクロニードルデバイスを提供する。

【0051】

別の態様において、本発明は、好ましくは複数のマイクロニードルが、取り付けられる基材、又は一体的に形成される基材を含むマイクロニードルデバイスであって、本発明の固体組成物からなるマイクロニードルデバイスを提供する。好ましくは、前記固体組成物は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含み、好ましくはそれらからなり、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：１５０，０００−１：１２．５、好ましくは１：１００，０００−１：１２．５、さらに好ましくは１：１００，０００−１：３７．５、再度さらに好ましくは１：１００，０００−１：７５、再度さらに好ましくは１：５０，０００−１：７５であり、再度さらに好ましくは、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：２０，０００−１：３７５であり、且つ前記マイクロニードルデバイスは、（ｃ）任意選択的に緩衝剤、及び（ｄ）任意選択的に浸透剤をさらに含む。さらに好ましい実施態様において、前記ＰＶＰは、５０，０００ダルトン未満、好ましくは２０，０００ダルトン未満、さらに好ましくは５００−２０，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。別の好ましい実施態様において、前記ＰＶＰは、５００−１２，０００ダルトン、さらに好ましくは２，０００−１１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。好ましい実施態様において、前記固体組成物は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含み、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：５０，０００−１：７５であり、好ましくは前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：２０，０００−１：３７５である。好ましくは、ＰＶＰは、５０，０００ダルトン未満、好ましくは２０，０００ダルトン未満の重量平均分子量を有する。別の好ましい実施態様において、前記固体組成物は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含み、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：５０，０００−１：７５であり、好ましくは、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：２０，０００−１：３７５である。好ましくは、ＰＶＰは、２０，０００ダルトン未満、好ましくは５００−２０，０００ダルトン、さらに好ましくは２，０００−１１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。別の好ましい実施態様において、前記固体組成物は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含み、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：２０，０００−１：３７５である。好ましくは、ＰＶＰは、２０，０００ダルトン未満、好ましくは５００−２０，０００ダルトン、さらに好ましくは２，０００−１１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。

【0052】

別の態様において、本発明は、前記マイクロニードルデバイスの前記作製のための本発明の固体組成物の使用を含むマイクロニードルデバイスを作製する方法を提供する。好ましくは、前記固体組成物は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含み、好ましくはそれらからなり、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：１５０，０００−１：１２．５、好ましくは１：１００，０００−１：１２．５、さらに好ましくは１：１００，０００−１：３７．５、再度さらに好ましくは１：１００，０００−１：７５、再度さらに好ましくは１：５０，０００−１：７５であり、再度さらに好ましくは、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：２０，０００−１：３７５であり、且つ前記マイクロニードルデバイスは、（ｃ）任意選択的に緩衝剤、及び（ｄ）任意選択的に浸透剤をさらに含む。さらに好ましい実施態様において、前記ＰＶＰは、５０，０００ダルトン未満、好ましくは２０，０００ダルトン未満、さらに好ましくは５００−２０，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。別の好ましい実施態様において、前記ＰＶＰは、５００−１２，０００ダルトン、さらに好ましくは２，０００−１１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。好ましい実施態様において、前記固体組成物は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含み、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：５０，０００−１：７５であり、好ましくは前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：２０，０００−１：３７５である。好ましくは、ＰＶＰは、５０，０００ダルトン未満、好ましくは２０，０００ダルトン未満の重量平均分子量を有する。別の好ましい実施態様において、前記固体組成物は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含み、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：５０，０００−１：７５であり、好ましくは前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：２０，０００−１：３７５である。好ましくは、ＰＶＰは、２０，０００ダルトン未満、好ましくは５００−２０，０００ダルトン、さらに好ましくは２，０００−１１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。別の好ましい実施態様において、前記固体組成物は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含み、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：２０，０００−１：３７５である。好ましくは、ＰＶＰは、２０，０００ダルトン未満、好ましくは５００−２０，０００ダルトン、さらに好ましくは２，０００−１１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。

【0053】

したがって、この好ましい態様において、本発明組成物、好ましくは前記固体組成物は、マイクロニードルデバイスを作製するために使用され、したがって、本発明組成物、好ましくは前記固体組成物は、マイクロニードルのデバイスを形成することができる。別の好ましい態様において、本発明は、マイクロニードルデバイスを作製する方法における使用のための本発明組成物を提供し、好ましくは前記マイクロニードルデバイスは、脈管系、好ましくはリンパ系を画像化する方法、好ましくはリンパ系を実時間定量画像化する方法において使用される。本明細書による好ましい実施態様において、前記画像化は、近赤外（ＮＩＲ）画像化による。本発明の別の好ましい実施態様において、前記マイクロニードルデバイスは、脈管系、特にリンパ系を画像化する方法において使用され、前記リンパ系の画像化は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける腫瘍のセンチネルリンパ節（一又は複数）をマッピングするためである。

【0054】

好ましい実施態様において、前記マイクロニードルデバイスは、複数のマイクロニードルがそれに付着されるか、又は一体的に形成される基材を含む。好ましくは、ＩＣＧは、マイクロニードル（ＭＮ）によって唯一含まれ、基材は、前記ＩＣＧを含まない。代わりの実施態様において、前記ＭＮデバイスの前記ＭＮ及び前記基材は、ＩＣＧを含む。

【0055】

本発明によって作製されたＭＮデバイスの使用は、無痛の、慎重に深部に位置させる方式での画像化剤としてのＩＣＧの投与をもたらす。さらに、投与は、特定の技術又は専門職員を必要とせず、したがって、患者自身又は非専門介護者によって行うことができる。さらに、本発明によって作製されたＭＮデバイスの使用は、投与前のいかなる前処理も必要とせず、したがって、「直ぐに使え」、特別の廃棄を必要とする強烈（ｓｈａｒｐ）／危険な廃棄物を発生させることなく行うことができる。

【0056】

ＭＮは、異なる形状を有し得る。典型的に及び好ましくは、前記複数のマイクロニードルは、テーパ付きの又は平坦な壁；１ｍｍ未満の長さ／幅の、正方形、円形又は任意の他の２次元基準の周長、を有する。デバイスは、ｎが１に等しい、及び／又はそれを超える、任意の数のｎのＭＮをバッキング層上に有するように作製されてもよい。バッキング層は、適用表面に最もよく適合するように任意の３次元形状及びサイズを有し得る。ＭＮは、異なるＩＣＧ：ＰＶＰの質量比１：１５０，０００−１：１２．５、好ましくは１：１００，０００−１：１２．５、さらに好ましくは１：１００，０００−１：３７．５、再度さらに好ましくは１：１００，０００−１：７５、再度さらに好ましくは１：５０，０００−１：７５、再度さらに好ましくは１：２０，０００−１：３７５を使用して作製され得る。デバイスは、典型的に及び好ましくは１秒を超える、さらに好ましくは１秒−５分の異なる経過時間の間皮膚に適用され得る。好ましい実施態様において、前記ＭＮは、典型的に及び好ましくは１５０μｍ×１５０μｍの正方形底面；４００μｍの長さ；及び５００μｍの頂点間距離を有するテーパ付き錐体形状を有する。好ましくは、ＭＮデバイスは、ばね負荷アプリケータを使用して適用される。

【0057】

重要なことには、本発明の調製されたＭＮは、典型的に及び好ましくは表皮層の貫通を可能にする機械的特徴及び表皮層の下での画像化剤の視覚化を可能にする物理化学的特性を有する。

【0058】

別の態様において、本発明は、脈管系の画像化、好ましくはリンパ系の画像化のための処方物の調製における使用のための固体組成物又は水性組成物を提供する。さらなる態様において、本発明は、組織の脈管造影画像を得るための処方物の調製における使用のための固体組成物又は水性組成物を提供する。好ましくは、前記組織は、眼、肺、胃腸管、膀胱、膵臓、胆嚢、静脈洞、気管、肝臓、腎臓、心臓、頸部、脳、卵巣、前立腺、胃又は皮膚であり、好ましくは前記組織は、眼、心臓、肝臓及び胃である。なお別の態様において、本発明は、組織の灌流の画像化のための処方物の調製における使用のための固体組成物又は水性組成物を提供する。好ましくは、前記組織は、眼、肺、胃腸管、膀胱、膵臓、胆嚢、静脈洞、気管、肝臓、腎臓、心臓、頸部、脳、卵巣、前立腺、胃又は皮膚であり、好ましくは前記組織は、眼、心臓、肝臓及び胃である。

【0059】

別の態様において、本発明は、本発明の固体組成物又は本発明の水性組成物を含む処方物を提供する。したがって、別の態様において、本発明は、（ａ）インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及び（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含み、好ましくはそれらからなり、前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する質量比は、１：１５０，０００−１：１２．５、好ましくは１：１００，０００−１：１２．５、さらに好ましくは１：１００，０００−１：３７．５、再度さらに好ましくは１：１００，０００−１：７５、再度さらに好ましくは１：５０，０００−１：７５であり、再度さらに好ましくは前記前記ＩＣＧの前記ＰＶＰに対する前記質量比は、１：２０，０００−１：３７５であり、さらに好ましくは、（ｃ）任意選択的に緩衝剤、及び（ｄ）任意選択的に浸透剤をさらに含む処方物を提供する。本明細書によるさらに好ましい実施態様において、前記ＰＶＰは、５０，０００ダルトン未満、好ましくは２０，０００ダルトン未満、さらに好ましくは５００−２０，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。別の好ましい実施態様において、前記ＰＶＰは、５００−１２，０００ダルトン、好ましくは２，０００−１１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。

【0060】

なお別の態様において、本発明は、脈管系の画像化、好ましくはリンパ系の画像化のための処方物の調製の方法における、固体組成物又は水性組成物の使用を提供する。さらなる態様において、本発明は、組織の脈管造影画像を得るための処方物の調製の方法における、固体組成物又は水性組成物の使用を提供する。好ましくは、前記組織は、眼、肺、胃腸管、膀胱、膵臓、胆嚢、静脈洞、気管、肝臓、腎臓、心臓、頸部、脳、卵巣、前立腺、胃又は皮膚であり、好ましくは前記組織は、眼、心臓、肝臓及び胃である。なお別の態様において、本発明は、組織の灌流の画像化のための処方物の調製の方法における、固体組成物又は水性組成物の使用を提供する。好ましくは、前記組織は、眼、肺、胃腸管、膀胱、膵臓、胆嚢、静脈洞、気管、肝臓、腎臓、心臓、頸部、脳、卵巣、前立腺、胃又は皮膚であり、好ましくは前記組織は、眼、心臓、肝臓及び胃である。

【0061】

別の態様において、本発明は、診断における使用のための、好ましくは哺乳動物、好ましくはヒトの疾患又は機能不全の診断における使用のための固体組成物又は水性組成物を提供する。示されるとおりに、本発明組成物は、より高い初期の蛍光及びインビボでの投与後の発光期の非存在のためにリンパ機能及び構造の精密な定量評価を可能にする。

【0062】

示されるとおりに、ＦＤＡは、肝機能、心拍出量及び肝血流量の決定の際の使用、並びに眼科造影法のための注射可能なコントラスト剤としてＩＣＧを認可している。さらに、ＩＣＧの使用は、肝臓又は内臓灌流の非侵襲性モニタリングを可能にする（ＩＣＧ血漿消失速度の変化をモニターすることによって、この方法は、集中治療手術患者の生存の確率を予測するためのパラメータとして適する）。

【0063】

したがって、さらなる好ましい態様において、本発明は、脈管系の画像化、好ましくはリンパ系の画像化の方法における使用のための固体組成物又は水性組成物を提供する。さらに、別の好ましい態様において、本発明は、組織の脈管造影画像を得る方法における使用のための固体組成物又は水性組成物を提供する。さらに、再度別の好ましい態様において、本発明は、組織の灌流を画像化する方法における使用のための固体組成物又は水性組成物を提供する。好ましくは、組織は、眼、肺、胃腸管、膀胱、膵臓、胆嚢、静脈洞、気管、肝臓、腎臓、心臓、頸部、脳、卵巣、前立腺、胃又は皮膚であり、好ましくは前記組織は、眼、心臓、肝臓及び胃である。さらなる好ましい実施態様において、本発明は、リンパ系を実時間定量画像化する方法における使用のための固体組成物又は水性組成物を提供する。好ましい実施態様において、前記画像化は、近赤外（ＮＩＲ）画像化による。典型的に及び好ましくは、前記方法は、好ましくはヒトにおける前記本発明組成物の皮内投与による、哺乳動物、好ましくはヒトへの本発明組成物の皮内、皮下、静脈内、硝子体内又は筋内投与を含み、ここで、それは、前記ヒトのリンパ管によって吸収される。好ましい実施態様において、前記方法は、典型的に及び好ましくはレーザーダイオード又はＬＥＤによって、近赤外（ＮＩＲ）波長を適用すること、並びに画像を与えるデバイス、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）、又は適切な光学機器レンズ及びフィルター付き電子増倍（ＥＭ）−ＣＣＤカメラを使用して前記ヒトの前記リンパ系をさらに画像化することを含む。本発明の別の好ましい実施態様において、前記リンパ系の前記画像化は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける腫瘍のセンチネルリンパ節（一又は複数）のマッピングのためである。別の実施態様において、リンパ系の前記画像化は、インビボでのリンパポンピング能力の定量化、リンパ浮腫、皮膚癌の評価、乳癌手術後のセンチネルリンパ節マッピング等のためである。

【0064】

本発明のさらなる態様は、脈管系を画像化する、好ましくはリンパ系を画像化する方法における、さらに好ましくはリンパ系を実時間定量画像化する方法における、本発明の固体組成物又は本発明の水性組成物の使用を含む。

【0065】

別の態様において、本発明は、組織の脈管造影画像を得る方法又は組織の灌流を画像化する方法における、好ましくは組織の脈管造影画像を得る方法における、本発明の固体組成物又は本発明の水性組成物又は本発明のマイクロニードルデバイスの使用を提供する。好ましくは、組織は、眼、肺、胃腸管、膀胱、膵臓、胆嚢、静脈洞、気管、肝臓、腎臓、心臓、頸部、脳、卵巣、前立腺、胃又は皮膚であり、好ましくは前記組織は、眼、心臓、肝臓及び胃である。好ましい実施態様において、前記画像化は、近赤外（ＮＩＲ）画像化による。典型的に及び好ましくは、好ましくはヒトにおける前記本発明組成物の皮内投与による、哺乳動物、好ましくはヒトへの本発明組成物の皮内、皮下、静脈内、硝子体内又は筋内投与を含み、ここで、それは、前記ヒトのリンパ管によって吸収される。好ましい実施態様において、前記方法は、典型的に及び好ましくはレーザーダイオードによって、近赤外（ＮＩＲ）波長を適用すること、並びに画像を与えるデバイス、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）、又は適切な光学機器レンズ及びフィルター付き電子増倍（ＥＭ）−ＣＣＤカメラを使用して前記ヒトの前記リンパ系をさらに画像化することを含む。本発明の別の好ましい実施態様において、前記リンパ系の前記画像化は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける腫瘍のセンチネルリンパ節（一又は複数）のマッピングのためである。別の実施態様において、リンパ系の前記画像化は、インビボでのリンパポンピング能力の定量化、リンパ浮腫、皮膚癌の評価、乳癌手術後のセンチネルリンパ節マッピング等のためである。

【0066】

さらに、本発明のさらなる態様は、哺乳動物、好ましくはヒトの療法における使用のための、好ましくは、哺乳動物、好ましくはヒトの疾患又は機能不全の療法における使用のための本発明組成物を含む。より好ましくは、前記療法は、光線力学療法（ＰＤＴ）、好ましくは皮膚腫瘍のためのＰＤＴである。ＰＤＴ及びその適用は、当業者に公知であり、例えば、米国特許出願公開第２００５／０２６５５９４号に及びＩｓａｋａｕ等（Isakau, HA等; Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 92 (2008) 165-174）により記載されている。さらに、本発明は、毛細管奇形（ＣＭ）のための療法における使用のための前記本発明組成物又は前記固体組成物を提供し、前記本発明組成物又は前記固体組成物は、ダイオードレーザー療法と組み合わせて使用される。ＩＣＧの使用は、既にＣＭのダイオードレーザー療法について示唆されている（Klein, A等、Lasers in Surgery and Medicine 45:216-224 (2013)）。前記療法上の方法は、前記ヒトへ本発明組成物を投与すること、及び前記ヒトへの光線力学療法を提供する、好ましくは前記ヒトの皮膚腫瘍に光線力学療法を提供するのに有効なタイプの及び量での放射線の適用を含む。本発明組成物は、ＰＶＰの存在下でＩＣＧ蛍光のみならず、ＩＣＧ吸収の増加を提供するので、光−熱活性の効力は増加される一方で、必要とされる投与量は減少させることができる。

【0067】

さらに、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトの疾患又は機能不全の診断又は療法上の方法における使用のための本発明組成物及び本発明マルチチャンバ型槽を提供し、ここで、前記疾患は、新生物疾患であり、好ましくは前記新生物疾患は、肺癌、気管支内肺癌、膀胱癌、食道癌、皮膚癌、乳癌、脳腫瘍、大腸癌、胃癌、又は婦人科悪性腫瘍、より好ましくは皮膚癌由来である。

【0068】

さらに、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトの疾患又は機能不全の診断又は療法上の方法における使用のための本発明組成物及び本発明マルチチャンバ型槽を提供し、ここで、前記疾患は、皮膚疾患であり、好ましくは前記皮膚疾患は、乾癬、又はＵＶ線誘発皮膚角化症である。

【0069】

さらに、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトの疾患又は機能不全の診断又は療法上の方法における使用のための本発明組成物及び本発明マルチチャンバ型槽を提供し、ここで、前記疾患は、眼科疾患であり、好ましくは前記眼科疾患は、加齢筋変性又は加齢筋変性の滲出形態である。

【0070】

さらに、近赤外蛍光脈管造影に依存するいくつかの新規な手術上の適用は、形成外科−皮膚及び筋肉移植、及び切断レベルの決定；腹部外科−胃腸吻合；一般外科−創傷治癒及び潰瘍；内科学−糖尿病性四肢；心臓外科−冠動脈バイバス；神経学−脳灌流診断法におけるトレーサ；並びに脳卒中患者−モニタリングを含めて、本発明組成物に適する。

【0071】

典型的に及び好ましくは、本方法は、好ましくはヒトにおける前記発明組成物の皮内投与による、哺乳動物、好ましくはヒトへの本発明組成物の皮内、皮下、静脈内、硝子体内又は筋内投与を含む。

【実施例】

【0072】

実施例１
本発明ＰＶＰ−ＩＣＧ処方物の調製及びそれらのインビトロ蛍光定量化
この実験は、ＢＡＳＦから購入したＫｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）１２ＰＦを使用して行った。Ｋｏｌｌｏｉｄｏｎ（登録商標）１２ＰＦは、当業者に公知の光散乱法によって決定して２，０００−３，０００の重量平均分子量（Ｍ_ｗ）を有するポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）である。

【0073】

０．２５ｍＬのＰＶＰ−水（Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）１２ＰＦ、ＢＡＳＦ）及び０．２５ｍＬの新鮮に調製したＩＣＧ−水（ＩＲ−１２５、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）を、所望の最終濃度（ＰＶＰ：０、０．２５、０．７５、１．５、２．５、７．５、１５、２５、７５、１５０、２５０ｍｇ／ｍＬ；ＩＣＧ：０．２ｍｇ／ｍＬ、これはＩＣＧ：ＰＶＰの質量比：１：０、１：１．２５、１：３．７５、１：７．５、１：１２．５、１：３７．５、１：７５，１：１２５、１：３７５、１：７５０、１：１２５０に等価である）となるように混合した。この溶液をボルテックスすることによって激しく混合した。

【0074】

次いで、石英−９６ウェルプレートを使用してマイクロプレートリーダ（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ、ＴＥＣＡＮ Ｌｔｄ．、Ｍａｎｎｅｒｄｏｒｆ、スイス国）で測定した。λ_{ｅｘ／ｅｍ}＝７００／８２４ｎｍ。

【0075】

表１は、本発明水溶液内でのＩＣＧ：ＰＶＰの質量比との関連で、ＩＣＧ−水に対する、ＩＣＧの標準化蛍光シグナルによって、したがって、Ｎ倍蛍光シグナル増加として、得られた結果を列挙する。

【0076】

図１Ａは、得られた結果をさらに例示し、同様に、濃度依存的にＩＣＧ蛍光を増加させるＰＶＰの能力を示す。さらなる詳細において、ＩＣＧ蛍光は、ＩＣＧ：ＰＶＰの質量比１：１２．５で既に有意に増加しただけでなく、質量比がさらに増加された場合になおさらに非常に強い増加も示した。

【0077】

同じように、本発明ＰＶＰ−ＩＣＧ処方物を、９．８ｍｇ／ｍＬのＩＣＧ及び０．２５ｇ／ｍＬのＰＶＰ−水（Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）１２ＰＦ）の最終濃度で調製した（ＩＣＧ：ＰＶＰの質量比１：２５．５）。上に示したように、次いで、蛍光シグナルを測定した。図１Ｂは、ＰＶＰが、同様にこの濃度及び比でＩＣＧの蛍光を増加させることを示す。

【0078】

実施例２
本発明ＰＶＰ−ＩＣＧ処方物の調製及びそれらのインビトロ蛍光定量化
この実験は、ＢＡＳＦから購入したＫｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）１７ＰＦを使用して行った。Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）１７ＰＦは、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）である。Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）１７ＰＦは、当業者に公知の光散乱法によって決定して７，０００−１１，０００の重量平均分子量（Ｍ_ｗ）を有するポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）である。

【0079】

０．５ｇ／ｍＬでの０．２５ｍＬのＰＶＰ−水（Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）１７ＰＦ、ＢＡＳＦ）又は蒸留水を、０．２５ｍＬの新鮮に調製したＩＣＧの水溶液（０．０５、０．１２及び０．３ｍｇ／ｍＬ、ＩＲ−１２５、Ａｃｒｏｓｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｇｅｅｌ、ベルギー国）に添加して、以下の最終濃度を得た：ＰＶＰ：０．２５ｇ／ｍＬ；ＩＣＧ：０．０２５、０．０６及び０．１５ｍｇ／ｍＬ、これは、質量比：１：１０，０００、１：４，１６６及び１：１，６６６に等価である。この溶液をボルテックスすることによって激しく混合した。

【0080】

次いで、石英−９６ウェルプレートを使用してマイクロプレートリーダ（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ、ＴＥＣＡＮ Ｌｔｄ．、Ｍａｎｎｅｒｄｏｒｆ、スイス国）で測定した。λ_{ｅｘ／ｅｍ}＝７７０／８１８ｎｍ。

【0081】

図２は、ＩＣＧ蛍光を有意に増加させるＰＶＰの能力を示す。したがって、ＩＣＧ蛍光の強度は、水溶液に比較してＰＶＰの存在下で有意に増加される（０．０２５ｍｇ／ｍＬでのＩＣＧ １．３２のｎ倍増加、０．０６ｍｇ／ｍＬでのＩＣＧ １．６８のｎ倍増加、０．１５ｍｇ／ｍＬでのＩＣＧ ２．２のｎ倍増加）。

【0082】

実施例３
本発明ＰＶＰ−ＩＣＧ処方物の実時間輸入性リンパ管視覚化
３ｍＬのＰＶＰ−水（Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）１２ＰＦ、ＢＡＳＦ、０．４ｇ／ｍＬ）又は蒸留水を０．２５ｍｇの無水ＩＣＧ（ＩＲ−１２５、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）に添加し、前者はＩＣＧのＰＶＰに対する質量比１：４８００に対応し、ボルテックスすることによって激しく混合した。次いで、５μＬの得られた溶液を、２９Ｇ標準針を使用して麻酔（０．２ｍｇ／ｋｇのメデトミジン及び８０ｍｇ／ｋｇのケタミンの腹腔内注射）Ｐｒｏｘｌ−ＧＦＰトランスジェニックマウスの足に皮内注射した。注射直後に、動物を蛍光双眼実体顕微鏡下に置き、下肢集合リンパ管アーキテクチャを画像化した（λ_{Ｅｘ／Ｅｍ}：７７０／８３２ｎｍ、図３）。

【0083】

実施例４
本発明ＰＶＰ−ＩＣＧ処方物の実時間クリアランス評価
３ｍＬのＰＶＰ−水（Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）１２ＰＦ、ＢＡＳＦ、０．４ｇ／ｍＬ）又は蒸留水を０．２５ｍｇの無水ＩＣＧ（ＩＲ−１２５、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）に添加し、前者はＩＣＧのＰＶＰに対する質量比１：４８００に対応し、ボルテックスすることによって激しく混合した。次いで、３μＬの得られた溶液を、２９Ｇ標準針を使用してイソフルラン麻酔Ｐｒｏｘｌ−ＧＦＰトランスジェニックマウスの耳に皮内注射した。注射直後に、動物をＩＶＩＳシステム内に置き、観察した（ｔ＝０画像）。次いで、その後に動物を増加する経過時間（１、２、４、６及び２４時間）後に観察した。それぞれの観察中に、動物をイソフルランで麻酔したが、時点間では回復させ、自由に動くことを許した。ＩＶＩＳパラメータはすべて、実験全体を通して一定に維持した（λ_{Ｅｘ／Ｅｍ}：７４５／８００ｎｍ；曝露時間４秒；ビニング：２）。関心領域（ＲＯＩ）をインビボ画像でｔ＝０で慎重に引き出し、すべての時点の間一定に維持した。蛍光強度を、各画像についてＩＶＩＳ Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して自動的に得た。平均±ＳＤ（ｎ＝３）。（図４及び図５）。

【0084】

皮内に注射すると直ぐに、注射部位での蛍光シグナルを増加する経過時間後に定量的に視覚化することができ、リンパ機能と相関するクリアランス速度論（半減期、速度定数）の決定をもたらす。

【0085】

図４は、一つの代表的動物の画像を示す。水−ＩＣＧ溶液を、右耳に注射し、ＰＶＰ−ＩＣＧ水溶液を、左耳に注射した。蛍光シグナルを時間（０、１、２、４、６、及び２４時間）の関数として観察した。図５は、時間の関数としての耳ＲＯＩの蛍光強度定量化を示す。重要なことには、本発明ＩＣＧ−ＰＶＰ溶液の投与後の蛍光シグナルは、ＩＣＧ−水注射の場合におけるように脱クエンチング、すなわち、早期時点にわたってのシグナルの増加を示すことはない。

【0086】

実施例５
本発明ＰＶＰ−ＩＣＧ処方物からのマイクロニードルの調製
所望の数及び形状のマイクロニードルを有するＭＮメス型（Ｍｉｃｒｏｐｏｉｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、シンガポール国）を使用して前に記載されたプロトコルを修正して、型注型法によって、ＭＮデバイスを調製する。ＩＣＧ（０．０８２５ｍｇ／ｍＬ）を含有する脱イオン水中Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）１２ＰＦ溶液（０．９３７５ｇ／ｍＬ）およそ１００μＬ（ＩＣＧ：ＰＶＰの質量比１：１１，３６３）を、型に注型し、２３００×ｇ、１５℃で５分間遠心分離機にかけた。充填／遠心分離工程を３回繰り返し、毎回、型をプレートに対して垂直な平面で１８０だけ回転させた。最後の遠心分離後、型を清浄化して、過剰の溶液を除去した。次いで、型を減圧デシケータ（６０ミリバール）下に３０分間置いた。色素なしの、脱イオン水中ＰＶＰおよそ１００−２００μＬを型に注型し、遠心分離機にかけた。最後に、脱イオン水中ＰＶＰ１００−２００μＬを型に加え、室温で少なくとも１日間乾燥させた。次いで、得られたデバイスを型から慎重に取り出し、乾燥雰囲気で保存した。

【0087】

インビトロでの観察：得られたＭＮデバイスを、錐体形状ＭＮの配列の存在を示す明視野双眼実体顕微鏡下に観察した（図６Ａ−図６Ｂ）。蛍光双眼実体顕微鏡観察により、ＭＮマトリックス内の蛍光（ＩＣＧ）の存在が実証される（図６Ｃ）。（λ_{Ｅｘ／Ｅｍ}：７７０／８３２−７ｎｍ）。

【0088】

実施例６
本発明ＰＶＰ−ＩＣＧ処方物からのマイクロニードルの調製
ＰＶＰマイクロニードルベースの処方物：ＩＣＧ（０．８２５ｍｇ／ｍＬ）を含有するＫｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）１２ＰＦ水溶液（０．９３７５ｇ／ｍＬ）から出発すること以外は実施例５に記載したプロトコルに従って、ＰＶＰ−ＩＣＧ処方物ベースのＭＮデバイスを作製した。ＩＣＧ：ＰＶＰの質量比１：１，１３６。

【0089】

実時間輸入性リンパ管視覚化：ＩＣＧ負荷ＭＮデバイスを、市販のバネ負荷アプリケータ（Ｍｉｃｒｏｐｏｉｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、シンガポール国）を使用して麻酔（０．２ｍｇ／ｋｇのメデトミジン及び８０ｍｇ／ｋｇのケタミンの腹腔内注射）Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスの腰部に適用した。バネ解放後、アプリケータ及び関連ＭＮデバイスを３分間適切な位置に保った。直後に、注射部位の表面を慎重に清浄化し、適用の周辺の領域を蛍光双眼実体顕微鏡（λ_{Ｅｘ／Ｅｍ}：７７０／８３２ｎｍ）で視覚化した。図７は、適用範囲から広がる集合リンパ管アーキテクチャの視覚化を示す。

【0090】

実施例７
ヒアルロン酸（ＨＡ）ベースの処方物からのマイクロニードルの調製
ＩＣＧ（０．０８２５ｍｇ／ｍＬ）を含有する、脱イオン水中ヒアルロン酸（ＨＡ）（高分子量）溶液（１５ｍｇ／ｍＬ）（ＨＡ−ＩＣＧ）およそ１００μＬを、型に注型し、２３００×ｇ、１５℃で５分間遠心分離機にかけた。充填／遠心分離工程を３回繰り返し、毎回、型をプレートに垂直な平面で１８０℃だけ回転させた。最後の遠心分離後、型を清浄化して、過剰の溶液を除去した。次いで、型を減圧デシケータ（６０ミリバール）下に３０分間置いた。色素なしの、脱イオン水中ＨＡおよそ１００−２００μＬを型に注型し、遠心分離機にかけた。最後に、脱イオン水中ＨＡ１００−２００μＬを型に加え、室温で少なくとも１日間乾燥させた。次いで、得られたデバイスを型から慎重に取り出し、乾燥雰囲気で保存した。

【0091】

インビトロでの蛍光観察：図８は、同量のＩＣＧ（０．２５ １０Ｅ−３ｍｇ）を含有するＰＶＰ又はヒアルロン酸（高分子量）；ＩＣＧ：ＰＶＰの質量比１：１１，３６３及びＩＣＧ：ＨＡの質量比１：１，８１８に対応する、から作製されたＭＮの蛍光双眼実体顕微鏡画像を示す。一部の蛍光は、ＨＡから作製されたＭＮでも検出されるが、ＩＣＧ蛍光は、ＰＶＰベースの処方物で劇的により高い。

【0092】

実施例８
本発明ＰＶＰ−ＩＣＧ処方物からのマイクロニードルの調製
ＰＶＰマイクロニードルベースの処方物：ＩＣＧ（０．８２５ｍｇ／ｍＬ）を含有するＫｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）１２ＰＦ水溶液（０．９３７５ｇ／ｍＬ）から出発すること以外は実施例５に記載したプロトコルに従って、ＰＶＰ−ＩＣＧ処方物ベースのＭＮデバイスを作製した。ＩＣＧ：ＰＶＰの質量比１：１，１３６。
集合リンパ管ポンピング視覚化：ＩＣＧ負荷ＭＮデバイスを、市販のバネ負荷アプリケータ（Ｍｉｃｒｏｐｏｉｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、シンガポール国）を使用して麻酔（０．２ｍｇ／ｋｇのメデトミジン及び８０ｍｇ／ｋｇのケタミンの腹腔内注射）Ｐｒｏｘｌ−ＧＦＰマウスの耳に適用した。バネ解放後、アプリケータ及び関連ＭＮデバイスを３分間適切な位置に保った。直後に、注射部位の表面を慎重に清浄化し、適用の周辺の領域を蛍光双眼実体顕微鏡で視覚化して、集合リンパ管を特定した。ＲＯＩを視覚化管で引き出し、蛍光強度を時間（５００マイクロ秒枠、５分間）の関数として測定し（図９）、ポンピング周波数定量化（±７収縮／分）を可能にした。

【0093】

実施例９
本発明ＰＶＰ−ＩＣＧ処方物からのマイクロニードルの調製
ＰＶＰマイクロニードルベースの処方物：実施例５に記載したとおりに、且つ
Ａ）ＩＣＧ（０．０８２５ｍｇ／ｍＬ）を含有するＫｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）１２ＰＦ水溶液（０．９３７５ｇ／ｍＬ）から出発して（ＩＣＧ：ＰＶＰの質量比１：１１，３６３）；
Ｂ）ＩＣＧ（０．００８２５ｍｇ／ｍＬ）を含有するＫｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）１２ＰＦ水溶液（０．９３７５ｇ／ｍＬ）から出発して（ＩＣＧ：ＰＶＰの質量比１：１１３，６３６）、
ＰＶＰ−ＩＣＧ処方物ベースのＭＮデバイスを作製した。

【0094】

実時間クリアランス画像化：ＩＣＧ負荷ＭＮデバイスを、市販のばね負荷アプリケータ（Ｍｉｃｒｏｐｏｉｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、シンガポール国）を使用してイソフルラン麻酔Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスの耳に適用した。バネ解放後、アプリケータ及び関連ＭＮデバイスを適当な位置に５分間維持した。直後に、耳の表面を慎重に清浄化し、動物をＩＶＩＳシステム内に置き、観察した（ｔ＝０画像）。次いで、その後に動物を増加する経過時間（１、２、４、６及び２４時間）後に観察した。それぞれの観察中、動物をイソフルランで麻酔したが、時点間で回復させ、自由に動くことを許した。ＩＶＩＳパラメータはすべて、実験全体を通して一定に維持した（λ_{Ｅｘ／Ｅｍ}：７４５／８００ｎｍ；曝露時間：４秒；ビンニング：４）。関心領域（ＲＯＩ）をインビボ画像中ｔ＝０で慎重に引き出し、すべての時点について一定に維持した。図１０は、右耳への組成物Ａ）の適用による一つの代表的動物の画像を示す。蛍光強度は、各画像についてＩＶＩＳ Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して自動的に得た。次いで、値をｔ＝０画像に対して標準化し、時間に対してプロットした（Ａ）について図１１Ａ及びＢ）について図１１Ｂ）。

【0095】

実施例１０
本発明ＰＶＰ−ＩＣＧ処方物からのマイクロニードルの調製
ＰＶＰマイクロニードルベースの処方物：ＩＣＧ（０．８２５ｍｇ／ｍＬ）を含有するＫｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）１２ＰＦ水溶液（０．９３７５ｇ／ｍＬ）から出発すること以外は実施例５に記載したプロトコルに従って、ＰＶＰ−ＩＣＧ処方物ベースのＭＮデバイスを作製した。ＩＣＧ：ＰＶＰの質量比１：１，１３６。

【0096】

排出リンパ節特定及び画像化：ＩＣＧ負荷ＭＮデバイスを、市販のばね負荷アプリケータ（Ｍｉｃｒｏｐｏｉｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、シンガポール国）を使用して麻酔（０．２ｇｍｇ／ｋｇのメデトミジン及び８０ｍｇ／ｋｇのケタミンの腹腔内注射）Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスの腰部に適用した。バネ解放後、アプリケータ及び関連ＭＮデバイスを適当な位置に３分間維持した。輸入性管から来る蛍光シグナルを観察することによって、近位排出リンパ節（ここでは鼠径部）の位置を決め、視覚化した（図１２）。リンパ節を出る、輸出性リンパ管も特定した。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】