特許 6803934 トウガラシ植物体から分離したシュードザイマ・チュラシマエンシスＲＧＪ１菌株およびその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6803934

(24)【登録日】2020年12月3日

(45)【発行日】2020年12月23日

(54)【発明の名称】トウガラシ植物体から分離したシュードザイマ・チュラシマエンシスＲＧＪ１菌株およびその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/16 20060101AFI20201214BHJP

   A01P 3/00 20060101ALI20201214BHJP

   A01P 1/00 20060101ALI20201214BHJP

   A01N 63/32 20200101ALI20201214BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/16 GZNA

   A01P3/00

   A01P1/00

   A01N63/32

【請求項の数】5

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2018-567813(P2018-567813)

(86)(22)【出願日】2016年6月27日

(65)【公表番号】特表2019-527045(P2019-527045A)

(43)【公表日】2019年9月26日

(86)【国際出願番号】KR2016006818

(87)【国際公開番号】WO2018004016

(87)【国際公開日】20180104

【審査請求日】2019年6月12日

【微生物の受託番号】KCTC  KCTC 13051BP

(73)【特許権者】

【識別番号】515276624

【氏名又は名称】コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー

【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】チュン−ミン・リュ

(72)【発明者】

【氏名】カ−ヒョン・イ

【審査官】 坂井田 京

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１０−２１５５９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−１８２６６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５２３８５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１５−１９９７５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１６／０６２８８０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５２１２２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−２４６２５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５００９８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第２００１−００６９２３８（ＫＲ，Ａ）

【文献】 Omer Barda et al.，Plant Disease，２０１５年，Vol.99，p.621-626

【文献】 T.Morita et al，Isolation of Pseudozyma churashimaensis sp. Nov., a novel ustilaginomyceteous yeast species as a producer of glycolipid biosurfactants, mannosylerythritol lipids，Journal of Bioscience and Bioengineering，２０１１年，112(2)，137-144

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

Ａ０１Ｎ １／００−６５／４８

Ａ０１Ｐ １／００−２３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

トウガラシ植物体から分離した、トウガラシ植物体病原菌またはトウガラシ植物ウイルスに対して全身誘導抵抗性（ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を誘導するシュードザイマ・チュラシマエンシスＲＧＪ１（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｃｈｕｒａｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ ＲＧＪ１）菌株であって、前記トウガラシ植物体病原菌が、キサントモナス・アクソノポディス病原型ベシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ． Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）であり、前記シュードザイマ・チュラシマエンシスＲＧＪ１菌株は、寄託番号ＫＣＴＣ１３０５１ＢＰで寄託されている、菌株。

【請求項2】

請求項１に記載のシュードザイマ・チュラシマエンシスＲＧＪ１菌株またはその培養液を有効成分として含む、トウガラシ植物の病害防除用微生物製剤であって、前記トウガラシ植物の病害が、キサントモナス・アクソノポディス病原型ベシカトリアまたはトウガラシ植物ウイルスによって引き起こされる、微生物製剤。

【請求項3】

請求項１に記載のシュードザイマ・チュラシマエンシスＲＧＪ１菌株またはその培養液を有効成分として含む、トウガラシ植物の収穫量増加用微生物製剤。

【請求項4】

請求項１に記載のシュードザイマ・チュラシマエンシスＲＧＪ１菌株を培養するステップを含む、請求項２又は３に記載の微生物製剤を製造する方法。

【請求項5】

請求項１に記載のシュードザイマ・チュラシマエンシスＲＧＪ１菌株またはその培養液を植物の幼苗に浸漬処理、土壌灌注処理または地上部に茎葉処理するステップを含む、トウガラシ植物の病害を防除する方法であって、前記トウガラシ植物の病害が、キサントモナス・アクソノポディス病原型ベシカトリアまたはトウガラシ植物ウイルスによって引き起こされる、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、トウガラシ植物体から分離したシュードザイマ・チュラシマエンシスＲＧＪ１菌株およびその用途に関し、より詳しくは、トウガラシ植物体から分離した、植物体病原菌または植物ウイルスに対して全身誘導抵抗性（ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を誘導するシュードザイマ・チュラシマエンシスＲＧＪ１（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｃｈｕｒａｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ ＲＧＪ１）菌株、前記菌株またはその培養液を有効成分として含む植物の病害防除用または植物の収穫量増加用微生物製剤、前記菌株を培養するステップを含む微生物製剤を製造する方法、および前記菌株またはその培養液を植物の幼苗に浸漬処理、土壌灌注処理または地上部に茎葉処理するステップを含む植物の病害を防除する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

現在、植物病原菌の発生抑制および防除のために主に用いられる方法は化学的合成農薬である。しかし、このような合成農薬は、生態系を破壊し、残留による人体毒性の問題を引き起こし、発癌、奇形などの各種疾患を誘発する可能性が非常に高いため、その使用が制限されている。したがって、合成農薬を代替できる環境にやさしい生物農薬の開発に対する研究が活発に行われている実情である。化学的防除法の問題点を解決するために、多くの研究者によって試みられてきた方法のうちの一つが微生物を用いる生物的防除法である。このように微生物を用いる生物的防除法は、最近になって多くの消費者の食品安全性に対する認識が高まり、環境にやさしい農産物に対する好みが急増するにつれて、作物の病害を防除するための化学的防除法の代案として研究されている。

【0003】

トウガラシの重要な病害としては、土壌伝染性病害ある疫病をはじめとして、地上部で発生する炭疽病、うどん粉病、斑点細菌病などがトウガラシの生産を脅かす植物病として知られている。トウガラシは、栽培期間が長いだけでなく、気象の変化に応じて病害の発生様相が非常に異なるため、防除が難しくて、栽培期間中に殺菌剤の処理が非常に頻繁な作物のうちの一つである。したがって、環境にやさしく清潔なトウガラシを生産するためには、病害防除効果に優れた微生物を選抜して病害防除のために用いることが重要である。トウガラシの病害を防除するために開発された微生物は、主にトウガラシ疫病を防除するための目的で開発された。Ｓｈｅｎらは、セラチア・プリムシカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）がトウガラシ疫病の防除に効果があると報告した（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏ．Ｊ．，２１、６４−６７、２００５）。しかし、トウガラシの地上部の病害に対する防除効果に優れた微生物の報告は非常に少ない実情である。

【0004】

韓国公開特許第２００９−０１０５７２６号には「トウガラシの斑点細菌病と炭疽病を防除するバシラス・メガテリウム２２−５菌株」が開示されており、韓国公開特許第２０１２−００７５９３６号には「土壌由来のバシラス属ＰＢ２５菌株およびその用途」が開示されているが、本発明のように、トウガラシ植物体から分離した、植物体病原菌または植物ウイルスに対して全身誘導抵抗性（ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を誘導するシュードザイマ・チュラシマエンシスＲＧＪ１（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｃｈｕｒａｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ ＲＧＪ１）菌株に対しては明らかになったことが全くない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】韓国公開特許第２００９−０１０５７２６号

【特許文献2】韓国公開特許第２０１２−００７５９３６号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、前記のような要求によって導き出されたものであり、本発明は、トウガラシ植物体から分離同定したシュードザイマ・チュラシマエンシスＲＧＪ１（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｃｈｕｒａｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ ＲＧＪ１）菌株がトウガラシ植物体細菌性病原菌または植物ウイルスに対して全身誘導抵抗性（ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を誘導して植物病害の防除効果を有するようにすることを確認し、本発明を完成するに至った。

【課題を解決するための手段】

【0007】

前記課題を解決するために、本発明は、トウガラシ植物体から分離した、植物体細菌性病原菌または植物ウイルスに対して全身誘導抵抗性（ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を誘導するシュードザイマ・チュラシマエンシスＲＧＪ１（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｃｈｕｒａｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ ＲＧＪ１）菌株を提供する。

【0008】

また、本発明は、前記菌株またはその培養液を有効成分として含む植物の病害防除用微生物製剤を提供する。

【0009】

なお、本発明は、前記菌株またはその培養液を有効成分として含む植物の収穫量増加用微生物製剤を提供する。

【0010】

また、本発明は、前記菌株を培養するステップを含む微生物製剤を製造する方法を提供する。

【0011】

なお、本発明は、前記菌株またはその培養液を植物の幼苗に浸漬処理、土壌灌注処理または地上部に茎葉処理するステップを含む植物の病害を防除する方法を提供する。

【発明の効果】

【0012】

本発明のトウガラシ植物体から分離したシュードザイマ・チュラシマエンシスＲＧＪ１（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｃｈｕｒａｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ ＲＧＪ１）菌株は、トウガラシ植物体細菌性病原菌または植物ウイルスに対して全身誘導抵抗性（ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を誘導して植物病害の防除効果を引き起こすことを確認した。本発明の菌株は、農薬の副作用として発生する環境汚染および残留農薬による人体毒性の危険性のない環境にやさしい生物農薬として用いられることができ、トウガラシ植物の伝染病の菌類に対する防除効果および植物の病害抵抗性を増加させる効果があるため、産業的に有用に利用できると判断される。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】トウガラシで生存する酵母を分離するためにサンプリングした地域別の場所およびその場所で分離された酵母菌の種類を示す。

【図2】トウガラシで生存する酵母菌株に対する誘導抵抗性の１次分析結果を示す。ＲＧＪ１：シュードザイマ・チュラシマエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｃｈｕｒａｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ）、ＲＧＪ５：クリプトコッカス・マグナス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ）、ＧＳ５：シュードザイマ・アフィディス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｐｈｉｄｉｓ）、ＧＳ６：シュードザイマ・ツクバエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）

【図3】トウガラシから分離した酵母菌株であるＲＧＪ１に対する誘導抵抗性の２次分析結果を示す。ＢＴＨ（ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ）：誘導抵抗性の陽性対照群、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）：直接殺菌対照抗生剤

【図4】フィールドで本発明の酵母菌ＲＧＪ１を処理したトウガラシのキサントモナス・アクソノポディス病原型ベシカトリアに対する誘導抵抗性を確認した結果である。

【図5】フィールドで本発明の酵母菌ＲＧＪ１を処理したトウガラシのウイルスに対する誘導抵抗性を病徴で確認した結果である。

【図6】フィールドで本発明の酵母菌ＲＧＪ１を処理したトウガラシのウイルスに対する誘導抵抗性をｑRT-ＰＣＲを介したウイルスの定量で確認した結果である。ＣＭＶ：キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）、ＢＢＷＶ：ソラマメウイルトウイルス（Ｂｒｏａｄ Ｂｅａｎ Ｗｉｌｔ Ｖｉｒｕｓ）

【図7】フィールドで本発明の酵母菌ＲＧＪ１を処理したトウガラシのウイルスに対する誘導抵抗性をｑRT-ＰＣＲを介したウイルスの定量で確認した結果である。ＰｅｐＭｏＶ：ドウガラシモットルウイルス（Ｐｅｐｐｅｒ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）、ＰＭＭｏＶ：トウガラシマイルドモットルウイルス（Ｐｅｐｐｅｒ ｍｉｌｄ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）

【図8】本発明の酵母菌ＲＧＪ１を処理したトウガラシの病原菌侵入時における誘導抵抗性関連の遺伝子であるＰＲ４およびＰＲ５の発現量を分析した結果である。

【図9】フィールドで本発明の酵母菌ＲＧＪ１の処理に応じたトウガラシ収穫量の増加を示す。

【図10】温室内の酵母菌ＲＧＪ１の葉への定着能を確認した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明の目的を達成するために、本発明は、トウガラシ植物体から分離した、植物体病原菌または植物ウイルスに対して全身誘導抵抗性（ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を誘導するシュードザイマ・チュラシマエンシスＲＧＪ１（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｃｈｕｒａｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ ＲＧＪ１）菌株を提供する。前記シュードザイマ・チュラシマエンシスＲＧＪ１を韓国生命工学研究院に２０１６年０６月２４日付で寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ１３０５１ＢＰ）。

【0015】

本発明の一実現例に係る菌株において、前記植物体病原菌または植物ウイルスは、様々な植物に対する病原菌またはウイルスであり、好ましくはトウガラシ植物体病原菌またはトウガラシ植物ウイルスであるが、これらに制限されるものではない。前記植物体病原菌は、細菌性病原菌であり、好ましくはトウガラシ斑点細菌病（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｐｏｔ）原因菌であり、より好ましくはキサントモナス・アクソノポディス病原型ベシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）であるが、これらに制限されるものではない。前記トウガラシ植物ウイルスは、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、ソラマメウイルトウイルス（ＢＢＷＶ）、キク微斑ウイルス（ＣＭＭＶ）、ジャガイモＹウイルス（ＰＶＹ）、トマト黄化えそウイルス（ＴＳＷＶ）、ドウガラシモットルウイルス（ＰｅｐＭｏＶ）、トウガラシマイルドモットルウイルス（ＰＭＭｏＶ）などであり、好ましくはキュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）、ソラマメウイルトウイルス（Ｂｒｏａｄ Ｂｅａｎ Ｗｉｌｔ Ｖｉｒｕｓ、ＢＢＷＶ）、ドウガラシモットルウイルス（ＰｅｐＭｏＶ）、トウガラシマイルドモットルウイルス（ＰＭＭｏＶ）などであるが、これらに制限されるものではない。

【0016】

また、本発明は、前記菌株またはその培養液を有効成分として含む植物の病害防除用微生物製剤を提供する。前記植物病害は、植物体病原菌または植物ウイルスによって引き起こされたものであり、好ましくはトウガラシ植物体病原菌またはトウガラシ植物ウイルスによって引き起こされたものであるが、これらに制限されるものではない。トウガラシ植物体病原菌またはトウガラシ植物ウイルスは前述したとおりである。

【0017】

前記微生物製剤は、本発明のトウガラシ植物体から分離した、植物体病原菌または植物ウイルスに対して全身誘導抵抗性（ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を誘導するシュードザイマ・チュラシマエンシスＲＧＪ１（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｃｈｕｒａｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ ＲＧＪ１）菌株またはその培養液を有効成分として含むことができる。本発明による微生物製剤は、液相肥料の形態に製造されてもよく、それに希釈剤を添加して粉末の形態で利用するか、またはそれを剤形化して顆粒化してもよい。但し、その剤形に特に限定されるものではない。すなわち、化学肥料の供給が制限された環境にやさしい有機農業において、それを克服するための生物肥料への剤形化が可能である。

【0018】

また、本発明は、前記菌株またはその培養液を有効成分として含む植物の収穫量増加用微生物製剤を提供する。前記植物は、好ましくはトウガラシ植物であるが、これに制限されるものではない。本発明の菌株をトウガラシ植物に処理時、無処理群に比べて３０％程度のトウガラシ実の収穫量の増加を示した。

【0019】

なお、本発明は、前記菌株を培養するステップを含む微生物製剤を製造する方法を提供する。前記酵母菌株の培養方法は、当業界で公知の任意の方法を利用してもよく、特定の方法に特に制限されるものではない。

【0020】

また、本発明は、前記菌株またはその培養液を植物の幼苗に浸漬処理、土壌灌注処理または地上部に茎葉処理するステップを含む植物の病害を防除する方法を提供する。前記植物病害は、植物体病原菌または植物ウイルスによって引き起こされたものであり、好ましくはトウガラシ植物体病原菌またはトウガラシ植物ウイルスによって引き起こされたものであるが、これらに制限されるものではない。トウガラシ植物体病原菌またはトウガラシ植物ウイルスは前述したとおりである。

【0021】

前記植物の病害を防除する方法としては、前記菌株を培養した培養液および前記菌株を用いた微生物製剤を植物の幼苗に浸漬処理、土壌灌注処理または地上部に茎葉処理して行うことができる。浸漬する方法の場合、培養液および微生物製剤を植物体周辺の土壌に注ぐかまたは種子を培養液および製剤に入れておいてもよい。

【0022】

以下では本発明を実施例によって詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0023】

実施例１．トウガラシで生存する酵母菌株の分離

【0024】

トウガラシの葉で生存しつつトウガラシに有用な役割をする酵母菌を分離するために、韓国の忠南、全羅道地域のトウガラシ畑から葉を採集した。２０１３年９月から１１月まで、全羅道、巨済、固城、咸陽、鎭安、南海、順天などの地域で収穫終わりのトウガラシの中間部分の葉を採取して準備した。直径１０ｍｍのコルクボーラーを用いて円形ディスクに切り出し、滅菌水１ｍｌが入った１．５ｍｌチューブにトウガラシ葉ディスクを３枚ずつ入れ、ビーズ（Ｚｉｒｃｏｎｉａ Ｂｅａｄｓ；直径１ｍｍの小さい玉）を入れて葉表面に付着された微生物がさらによく分離されるようにして十分な時間でボルテックスをした。葉ディスクが入ったものを原液とみなし、それを１／１０、１／１００に順次薄めて各々１００μｌずつ寒天プレート培地に塗抹した。この時、用いた寒天培地は、酵母菌のみを分離するために酵母菌専用培地であるＹＰＤ培地に、細菌が育たないようにする抗生剤であるリファンピシン（リファンピンカプセル；Ｙｕｈａｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加して作った寒天培地を用いた。薄められて塗抹されたプレートから出た酵母菌コロニーを別に継代培養して純粋な単一細胞（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ）に育て、それを直接ＩＴＳシークエンシングを任せて（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ）分析して確認した。用いられたＩＴＳシークエンシングプライマーの配列は以下のとおりである（ＩＴＳ１（順方向）：５’−ＴＣＣ ＧＴＡ ＧＧＴ ＧＡＡ ＣＣＴ ＴＧＣ ＧＧ−３’（配列番号１）、ＩＴＳ４（逆方向）：５’−ＴＣＣ ＴＣＣ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＧＡ ＴＡＴ ＧＣ−３’（配列番号２））。

【0025】

その後、全羅道（鎭安−咸陽−固城−統營−巨済−南海−順天）地域のトウガラシ畑から葉を採取し、分離された酵母菌のシークエンシングを通じて同定された。様々な酵母菌がトウガラシの葉で生存しており、その中でもシュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属の酵母菌が若干優占して多量が生存していることが確認された（図１）。

【0026】

実施例２．トウガラシで生存する酵母菌株に対する誘導抵抗性の１次分析

【0027】

分離された酵母菌のトウガラシに誘導抵抗性能力を確認するために温室で１次菌株選抜実験を行った。播種してから７日になったトウガラシ（新しいＰＲトウガラシ；フンノン種苗）を５０穴ポットに移植し、３週後に子葉を除いて本葉が４葉まで出てきた時、分離された酵母菌株をトウガラシ苗の地上部にスプレー処理した。この時、処理した微生物は固体培地で３日ほど育てた酵母菌を滅菌水に懸濁してＯ．Ｄ．６００＝１（１０^６ＣＦＵ／ｍｌ）に合わせて、トウガラシ苗一つ当たりに５０ｍｌずつスプレーした。微生物を処理してから７日後にトウガラシのキサントモナス・アクソノポディス病原型ベシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）をＯ．Ｄ．６００＝０．０１に合わせて、トウガラシの葉裏面に注射器で刺して直接注入して接種した。トウガラシ苗一つ当たりに３枚の葉に病原菌を接種し、その後５〜７日の間病徴が表れ始まると、病徴を調査して病原菌に対する抵抗性を確認した。病徴調査は、病を接種した葉部分における病気の激しい程度（ｄｉｓｅａｓｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ）を０〜５まで任意に分けて調査をした（０：病徴が全く表れない、１：葉が本来の色より少し濁った黄緑色に変わる、２：葉が黄色くなる黄変現象が見られる、３：黄色くなった部分に黒い部分が少しずつ見られる、４：葉の１／３以上が黒く変わる、５：葉が全部黒色に変わってふにゃふにゃする）。トウガラシ苗一つ当たりに４個の葉を別に調査し、総５繰り返しによって２０個の病徴程度を調査して確認した。

【0028】

病原菌を接種してから７日後に病徴を調査した結果、巨済で分離された酵母菌であるシュードザイマ・チュラシマエンシスＲＧＪ１（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｃｈｕｒａｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ ＲＧＪ１）酵母菌が最も優れた病害抵抗性の効果を示した。水処理群と比較して病徴が７０％減少し、これは、陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）である化学物質ＢＴＨの処理群と同様な有意性を示した（図２）。

【0029】

実施例３．トウガラシから分離した酵母菌株に対する誘導抵抗性の２次分析

【0030】

１次誘導抵抗性の分析実験で用いられた種々の酵母分離菌のうち最も優れた効果を示した選抜菌株であるシュードザイマ・チュラシマエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｃｈｕｒａｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ ＲＧＪ１）を対象に処理方法の変化に応じた誘導抵抗性の差を確認した。酵母菌ＲＧＪ１を培養した培養液をＯ．Ｄ．６００＝１に合わせて、１次誘導抵抗性実験と同様な条件でトウガラシの地上部の葉面にスプレー処理した時、培養液を土壌に直接灌注をした時の差を比較し、陽性対照群として誘導抵抗性を引き起こす化学物質であるＢＴＨと対照群として水処理群を用いて温室で行った。また、この酵母菌ＲＧＪ１による直接的な殺菌作用があるか否かを確認するために、直径９０ｍｍのプレートにトウガラシキサントモナス・アクソノポディス病原型ベシカトリアであるＸａｖ．をＯ．Ｄ．６００＝０．５に合わせて予め塗抹した後、その上に直径１０ｍｍのペーパーディスクを置いておき、順に酵母菌ＲＧＪ１（Ｏ．Ｄ．６００＝１に合わせて２０マイクロリットル）、ＢＴＨ（１ｍＭ）、抗生剤カナマイシン２５、そして水処理を同じ量で処理し、３０℃で培養して殺菌効果が表れるクリア・ゾーンが現れることによって比較をした（図３）。

【0031】

１次抵抗性確認実験と類似した結果として、病害抵抗性が誘導され、葉にスプレー処理する時と土壌に直接灌注処理する時の差は見られなかった。また、対峙培養の結果、酵母菌ＲＧＪ１の周辺に透明環が発生しないことから、病原菌を直接殺す殺菌効果はなく、抵抗性を誘導することが確認された（図３）。

【0032】

実施例４．フィールドで本発明の酵母菌ＲＧＪ１を処理したトウガラシのキサントモナス・アクソノポディス病原型ベシカトリアに対する誘導抵抗性の確認

【0033】

実験室内と温室で確認して選抜された酵母菌株を対象にトウガラシ畑圃場において誘導抵抗性能力を検証した。忠清南道 錦山郡 郡北面 外釜里（３６° ８’ ５０．８１’’ Ｎ， １２７° ２９’ ２９．２０’’ Ｅ）に位置した面積２００坪のトウガラシ畑で行われた。２０１４年６月、畑に移植してから一ヶ月になったトウガラシの地上部に酵母菌ＲＧＪ１培養液を温室実験の時と同様の条件でＯ．Ｄ．６００＝１（１０^７ＣＦＵ／ｍｌ）の濃度でスプレー処理した。陽性対照群としては誘導抵抗性の効果のあるＢＴＨを１ｍＭの濃度でスプレーし、対照群としては水処理をした。ランダムに分けられた処理区域に一つの処理群の畝長さは８メートルであり、トウガラシとトウガラシ間の間隔は４０ｃｍであって一つの処理群当たりにトウガラシを２０株ずつ含む。一つの処理群当たりに培養液および対照群物質を２リットルずつ処理し、ランダムに分けられた処理群をもって４繰り返しに実行した。処理してから１０日後に、キサントモナス・アクソノポディス病原型ベシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）をＯ．Ｄ．６００＝０．０１に薄めてトウガラシの葉に半分程度入るように注射器を用いて葉の裏面に刺して接種をした。トウガラシ一つの個体当たりに５枚の葉に接種をして、一つの処理群当たりに総１０個のトウガラシに接種をし、その後、７日後から病徴を観察した。病徴調査は、前述の温室内の確認実験と同様の方法により病徴の程度を０〜５に分けて病気の激しい程度を確認した。

【0034】

フィールド実験の結果、温室内の実験と同様に酵母菌のスプレー処理によって抵抗性が誘導され、キサントモナス・アクソノポディス病原型ベシカトリアの病徴が５０％減少したことを確認した（図４）。

【0035】

実施例５．フィールドで本発明の酵母菌ＲＧＪ１を処理したトウガラシのウイルスに対する誘導抵抗性の確認

【0036】

野外フィールド実験で酵母菌を処理してから６０日が経過したトウガラシの新しく出た若葉を処理群当たりに５枚ずつ採取し、液体窒素に直ちに入れて急速冷凍をした後、乳鉢を用いて粉砕し、ＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出した。抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡに合成し、合成されたｃＤＮＡを用いてｑＰＣＲ（ＣＦＸ ｃｏｎｎｅｃｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ；ＢＩＯ−ＲＡＤ）でウイルス量を定量する方法であるＲＴ−ｑＰＣＲを行った。自然発生したキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ：Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）とソラマメウイルトウイルス（ＢＢＷＶ：Ｂｒｏａｄ Ｂｅａｎ Ｗｉｌｔ Ｖｉｒｕｓ）の特異的プライマーを用いて感染程度を定量だった。ｑＰＣＲと用いられたプライマーの条件は以下のとおりである。ＣＭＶ外皮（ｃｏａｔ）タンパク質順方向：５’−ＣＧＴＴＧＣＣＧＣＴＡＴＣＴＣＴＧＣＴＡＴ−３’（配列番号３）、ＣＭＶ外皮（ｃｏａｔ）タンパク質逆方向：５’−ＧＧＡＴＧＣＴＧＣＡＴＡＣＴＧＡＣＡＡＡＣＡ−３’（配列番号４）、ＢＢＷＶ順方向：５’−ＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＣＴＣＡＡＣＴＡＣＡＣＡ−３’（配列番号５）、ＢＢＷＶ逆方向：５’−ＴＴＴＴＧＧＡＧＣＡＴＴＣＡＡＣＣＡＴＴＴＧＧＡ−３’（配列番号６）。また、ドウガラシモットルウイルス（ＰｅｐＭｏＶ、Ｐｅｐｐｅｒ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）とトウガラシマイルドモットルウイルス（ＰＭＭｏＶ、Ｐｅｐｐｅｒ ｍｉｌｄ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）の特異的プライマーを用いて感染程度を定量した。ｑＰＣＲと用いられたプライマーの条件は以下のとおりである。ＰｅｐＭｏＶ順方向：５’−ＡＡＧＡＴＣＡＧＡＣＡＣＡＴＧＧＡ−３’（配列番号７）、ＰｅｐＭｏＶ逆方向：５’−ＣＡＡＧＣＡＡＧＧＧＴＡＴＧＣＡＴＧＴ−３’（配列番号８）、ＰＭＭｏＶ順方向：５’−ＡＣＡＧＴＴＴＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＴＣＡ−３’（配列番号９）、ＰＭＭｏＶ逆方向：５’−ＡＡＧＣＧＴＣＴＣＧＧＣＡＧＴＴＧ−３’（配列番号１０）。

【0037】

【表1】

【0038】

ウイルス病徴調査において、トウガラシの新しく出た葉を比較した結果、水処理群ではウイルス症状が激しいのに対し、酵母処理群では病徴が弱いことを確認することができた（図５）。また、ｑＰＣＲを介したウイルスの定量結果からも、代表的なＣＭＶおよびＢＢＷＶウイルスの両方とも水処理群に比べて１０倍程度ウイルスの量が減少したことから、酵母菌処理によってウイルスに少なく感染したことを確認した（図６）。また、ＰｅｐＭｏＶおよびＰＭＭｏＶウイルスの両方とも酵母菌処理によってウイルスに少なく感染したことを確認した（図７）。

【0039】

実施例６．本発明の酵母菌ＲＧＪ１を処理したトウガラシの病原菌侵入時における誘導抵抗性関連遺伝子の発現量の分析

【0040】

酵母菌の作用メカニズムを研究するための遺伝子発現量を調査するために、フィールド実験進行過程中、キサントモナス・アクソノポディス病原型ベシカトリアの接種の際、(1)病原菌を接種する前(2)病原菌を接種するや否や(3)病原菌を接種してから６時間後の三つのタイムポイントにトウガラシ葉を採取して直ちに液体窒素に急速冷凍した後、ウイルス定量法のような方法によりＲＮＡ抽出をし、ｃＤＮＡ合成、ｑＰＣＲを介してトウガラシの抵抗性関連遺伝子の発現量を調査した。代表的なトウガラシの誘導抵抗性関連遺伝子としてＰＲ遺伝子の発現を確認した。ｑＰＣＲの条件はウイルス定量と同様であり、用いられたプライマー情報は以下のとおりである。ＣａＰＲ４順方向：５’−ＡＡＣＴＧＧＧＡＴＴＴＧＡＧＡＡＣＴＧＣＣＡＧＣ−３’（配列番号１１）、逆方向：５’−ＡＴＣＣＡＡＧＧＴＡＣＡＴＡＴＡＧＡＧＣＴＴＣＣ−３’（配列番号１２）、ＣａＰＲ５順方向：５’−ＣＴＣＣＡＣＡＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡ−３’（配列番号１３）、逆方向：５’−ＧＴＡＣＧＡＡＧＣＡＣＧＣＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号１４）。

【0041】

酵母菌処理群において６時間目に抵抗性遺伝子であるＰＲ４とＰＲ５の発現量が大幅に増加したことから、病原菌の侵入に対応する時間が速くなる抵抗性プライミング効果が誘導されたことを確認することができた（図８）。

【0042】

実施例７．本発明の酵母菌ＲＧＪ１の処理に応じたフィールドトウガラシ収穫量の調査

【0043】

フィールドで誘導抵抗性を確認した後、各処理群の２０個体におけるトウガラシ収穫量を調査して個数を確認した。総４繰り返しに行われた。酵母菌ＲＧＪ１の処理群では、その収穫量が無処理群に比べて３０％程度数量が増加したことが確認された（図９）。

【0044】

実施例８．温室内の酵母菌ＲＧＪ１の葉への定着能の確認

【0045】

トウガラシ葉から分離した酵母菌株シュードザイマ・チュラシマエンシスＲＧＪ１の葉への定着能を再確認するために、温室内のトウガラシ苗を対象に実験を行った。発芽後移植してから３週になったトウガラシに酵母菌株をＯＤ_６００値を１と２の二つに合わせた菌懸濁液をトウガラシの地上部に５０ｍｌずつスプレー処理した後に葉をサンプリングして、直径１０ｍｍのコルクボーラーで切り出した葉ディスク３枚ずつを滅菌水１ｍｌが入った１．５ｍｌチューブに入れた後に十分にボルテックスをした。それを原液とし、１／１０ずつ薄めて酵母菌専用培地であるＹＰＤ寒天プレートに１００マイクロリットルずつ塗抹して出たコロニー数をカウントしてＣＦＵ値を測定した。スプレーの日（Ｄａｙ０）から１０日間隔にサンプリングして調査した（図１０）。初めにスプレーしたＯＤ_６００値に応じた差は大きくなかったし、１０ｍｍの葉ディスクに定着して生きていく酵母菌株は２０日目から３０日目まで１０^４以上に維持されることを確認した。このような結果は、分離された酵母菌株がトウガラシ葉によくついて生きていき、その密度は１０^４程度が最も適正な酵母菌株の生長濃度であると考えられる。また、このような優れた葉圏定着能により、作物への散布処理時、葉でよく生存しつつ長期間作物に誘導抵抗性を引き起こして、細菌病やウイルス病によくかからない結果を示すものとして分析された。

【0046】

［受託番号］
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１３０５１ＢＰ
受託日：２０１６０６２４

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]