特許 6804768 炎症性腸疾患の予防又は治療用薬剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6804768

(24)【登録日】2020年12月7日

(45)【発行日】2020年12月23日

(54)【発明の名称】炎症性腸疾患の予防又は治療用薬剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/44 20060101AFI20201214BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20201214BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20201214BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/44

   A61P1/04

   A61P43/00 111

【請求項の数】4

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2017-526409(P2017-526409)

(86)(22)【出願日】2016年6月29日

(86)【国際出願番号】JP2016069319

(87)【国際公開番号】WO2017002874

(87)【国際公開日】20170105

【審査請求日】2019年5月17日

(31)【優先権主張番号】特願2015-132090(P2015-132090)

(32)【優先日】2015年6月30日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504147243

【氏名又は名称】国立大学法人 岡山大学

(74)【代理人】

【識別番号】110002206

【氏名又は名称】特許業務法人せとうち国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】加来田 博貴

【審査官】 鳥居 福代

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１４−０７６９５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／１０５３８６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０９８１２５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 加来田博貴ほか，レチノイドＸ受容体パーシャルアゴニストNEt-4IBの創出と薬効・副作用評価，ビタミン，２０１３年 ４月，Vol.87, No.4，p.254 [2-III-28]

【文献】 加来田博貴，レチノイドＸ受容体を標的とした創薬に関する研究，ビタミン，２０１５年 ４月，Vol.89，p.177-178

【文献】 TAKAMATSU K. et al.，The First Potent Subtype-Selective Retinoid X Receptor (RXR) Agonist Possessing a 3-Isopropoxy-4-isopropylphenylamino Moiety, NEt-3IP(RXRα/β-dual agonist)，ChemMedChem，２００８年，Vol.3，p.780-787

【文献】 Biol. Pharm. Bull.，２０１２年，Vol.35, No.4，pp.629-633

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／３３−３３／４４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（２）で表される化合物であるＲＸＲアゴニストを有効成分とする、炎症性腸疾患の予防又は治療用薬剤。

【化1】

【請求項2】

式（２）で表される化合物が、上部消化管からの吸収がされないか若しくは吸収性が低く、下部消化管への移行性が高い、請求項１に記載の炎症性腸疾患の予防又は治療用薬剤。

【請求項3】

経口投与される、請求項１または２に記載の炎症性腸疾患の予防又は治療用薬剤。

【請求項4】

前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎又はクローン病である、請求項１〜３のいずれかに記載の炎症性腸疾患の予防又は治療用薬剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、炎症性腸疾患の予防又は治療用薬剤に関し、特に、経口投与により上部消化管吸収がされないかもしくは吸収性が低く、下部消化管への移行性が高い抗炎症薬物を有効成分とする炎症性腸疾患の予防および治療剤に関する。

【背景技術】

【0002】

炎症性腸疾患とは、消化管に原因不明の炎症をおこす慢性疾患の総称で、長期に下痢、血便が続く原因不明の難病であり、潰瘍性大腸炎、クローン病が知られる。通常の食中毒と異なり、病状は長期にわたり、緩解と悪化を繰り返す。

【0003】

炎症性腸疾患の治療法としては、栄養療法、薬物療法、外科療法及び炎症部位に集積する顆粒球を選択的に除去する顆粒球吸着療法などが挙げられる。薬物療法では，サラゾスルファピリジン、５−アミノサリチル酸（メサラジン系製剤）、ステロイド系抗炎症剤、免疫抑制剤などを用いるが、サラゾスルファピリジンでは、代謝産物のスルファピリジンによる頭痛や胃炎、ステロイド系抗炎症剤では、過剰な免疫抑制作用による感染症や副腎皮質機能不全などの副作用が問題となる。

【0004】

レチノイドX受容体（RXR）は、ステロイド系抗炎症剤の分子標的であるグルココルチコイド受容体とは独立して、抗炎症作用を示すペルオキシソーム増殖因子活性化受容体や肝臓X受容体とヘテロダイマーを構築し、炎症・免疫関連転写因子NF-κBの活性化抑制作用を通じた抗炎症作用を生じる。その効果として、炎症性腸疾患モデルでの治療効果も報告されている（非特許文献１）。しかし当該文献記載のRXRアゴニストをはじめ既知のRXRフルアゴニスト（RXRを完全に活性化する作動薬）は、肝肥大、血中トリグリセリド（TG）値上昇などの副作用が問題であった。

【0005】

潰瘍性大腸炎、クローン病などは、下部消化管において発症する疾患である。

【0006】

上述するように、下部消化管での疾患を治療もしくは緩解状態からの悪化を予防するためには、治療効果を示す薬物を下部消化管に優先して移行させればよい。また、肝肥大または血中トリグリセリド値などの副作用の発生を抑制するにも、それらの原因となりうる肝臓等への移行を抑制させれば良い。

【0007】

下部消化管へ抗炎症薬を移行させる方法としては、当該薬物を腸溶性製剤化することなどが行われる（例えば、特許文献１）。

【0008】

非特許文献２には、市販薬であるベキサロテン（bexarotene）、及び下記式（２）で表される化合物であるNEt-3IBの、RXRに対する転写活性化能（レポータージーンアッセイによる実験結果）について記載されている。

【0009】

【化1】

【0010】

本発明者は、抗炎症作用を示す薬物そのものの溶解性が低く、食道・胃・十二指腸からなる上部消化管での吸収性が低く、そのまま下部消化管へ移行する抗炎症薬物であれば、特殊な腸溶性製剤化を必要とせず、当該患部への移行性が期待できるものと考えた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】ＷＯ２０１４／１２９５６８Ａ１

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】J Exp Med. 2001, 193(7), pp 827-838

【非特許文献2】ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1 (9), pp 521-525

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、従来の方法に比べ副作用の発現を抑制しながら、強力に炎症性腸疾患を予防もしくは治療しうる薬剤を提供することを課題にする。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、経口投与により上部消化管吸収がされないもしくは吸収性が低く、下部消化管への移行性が高い抗炎症薬物を見出し、本発明を完成した。

【0015】

上記課題は、下記式（１）で表される化合物であるＲＸＲアゴニストを有効成分とする、炎症性腸疾患の予防又は治療用薬剤を提供することによって解決される。

【0016】

【化2】

【0017】

［式中、Ｒ¹は直線若しくは分岐状の、非置換若しくは置換の、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基からなる群から選択される。
Ｒ²は直線若しくは分岐状の、非置換若しくは置換の、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基及びアルコキシ基からなる群から選択される。
Ｗは、ＮＲ³又はＣＲ³₂であり、Ｒ³は水素、直線若しくは分岐状の、非置換若しくは置換の、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基からなる群から選択される。
Ｘ¹、Ｙ¹は、ＣＨ若しくはＮから選択される。
Ｘ²、Ｙ²は、ＣＨ、ＣＲ⁴、若しくはＮから選択され、Ｒ⁴は、直線若しくは分岐状の、非置換若しくは置換の、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基及びアミノ基から選択される。
Ｚは、直接、又はアルキレン基、アルケニレン基及びアルキニレン基からなる群から選択される連結基を介したカルボキシル基である。］

【0018】

このとき、Ｒ¹が直線若しくは分岐状の、非置換若しくは置換のアルキル基であり；Ｒ²が直線若しくは分岐状の、非置換若しくは置換のアルキル基であり；ＷがＮＲ³であり、Ｒ³が直線若しくは分岐状の、非置換若しくは置換のアルキル基であり；Ｘ¹がＣＨであり；Ｙ¹がＮであり；Ｘ²、Ｙ²がＣＨであり；Ｚがカルボキシル基であることが好ましい。さらに、式（１）で表される化合物が下記式（２）で表されることがより好ましい。

【0019】

【化3】

【0020】

式（１）で表される化合物が、上部消化管からの吸収がされないか若しくは吸収性が低く、下部消化管への移行性が高いことが好ましい。本発明の薬剤は、経口投与されることが好ましい。また、本発明の薬剤が、潰瘍性大腸炎又はクローン病の予防又は治療用薬剤であることも好ましい。

【発明の効果】

【0021】

本発明によれば、上部消化管における血中移行性が低いことによって、例えばRXRアゴニスト（フルアゴニスト）であっても、血中トリグリセリド上昇などの副作用を軽減し、炎症性腸疾患に対する予防もしくは治療の効果が得られる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】NEt-3IBの血中濃度を示した図である。

【図2】レポータージーンアッセイによるNEt-3IBのRXRに対する活性化能を示した図である。

【図3】DSS（２％水溶液）腸炎モデルにおける体重変化を示した図である。

【図4】DSS（２％水溶液）腸炎モデルにおける大腸長を示した図である。

【図5】DSS（２％水溶液）腸炎モデルにおける血中トリグリセリド（TG）濃度を示した図である。

【図6】DSS（２％水溶液）腸炎モデルにおける大腸及び脾臓の写真である。

【図7】DSS（３％水溶液）腸炎モデルにおける体重変化を示した図である。

【図8】DSS（３％水溶液）腸炎モデルにおける大腸長を示した図である。

【図9】DSS（２％水溶液）腸炎モデルにおける体重変化を示した図である。

【図10】LPS刺激NO産生に対する抑制効果を示した図である。

【図11】NFκB転写活性抑制能を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本発明の、炎症性腸疾患の予防又は治療用薬剤は、上部消化管からの吸収がされないかもしくは吸収性が低く、下部消化管への移行性が高い抗炎症薬物を有効成分とする炎症性腸疾患の予防又は治療用薬剤である。当該治療用薬剤は、懸濁液などの組成物であってもよい。ここで用いられる抗炎症薬物は、レチノイドX受容体（retinoid X receptor; RXR）に対し作動性を示す化合物、具体的には、下記式（１）で表される化合物である。

【0024】

【化4】

【0025】

［式中、Ｒ¹は直線若しくは分岐状の、非置換若しくは置換の、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基からなる群から選択される。
Ｒ²は直線若しくは分岐状の、非置換若しくは置換の、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基及びアルコキシ基からなる群から選択される。
Ｗは、ＮＲ³又はＣＲ³₂であり、Ｒ³は水素、直線若しくは分岐状の、非置換若しくは置換の、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基からなる群から選択される。
Ｘ¹、Ｙ¹は、ＣＨ若しくはＮから選択される。
Ｘ²、Ｙ²は、ＣＨ、ＣＲ⁴、若しくはＮから選択され、Ｒ⁴は、直線若しくは分岐状の、非置換若しくは置換の、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基及びアミノ基から選択される。
Ｚは、直接、又はアルキレン基、アルケニレン基及びアルキニレン基からなる群から選択される連結基を介したカルボキシル基である。］

【0026】

上記式（１）において、Ｒ¹が直線若しくは分岐状の、非置換若しくは置換のアルキル基であり；Ｒ²が直線若しくは分岐状の、非置換若しくは置換のアルキル基であり；ＷがＮＲ³であり、Ｒ³が直線若しくは分岐状の、非置換若しくは置換のアルキル基であり；Ｘ¹がＣＨであり；Ｙ¹がＮであり；Ｘ²、Ｙ²がＣＨであり；Ｚがカルボキシル基であることが好ましい。

【0027】

式（１）で表される化合物が下記式（２）で表されることがより好ましい。

【0028】

【化5】

【実施例】

【0029】

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例の範囲に限定されることはない。

【0030】

本実施例では、下記式（２）及び式（３）で表される２種類の化合物を用いた。

【0031】

【化6】

【0032】

式（２）で表される化合物NEt-3IBは、RXRフルアゴニストであり、既存のRXRフルアゴニストに比べ、肝肥大、トリグリセリド上昇を生じないことが報告されている。また、経口投与吸収性が低いことについても報告されている。

【0033】

NEt-3IBの経口投与吸収性が低いことに鑑み、炎症性腸疾患に対する効果は低いものと予想された。しかしながら驚くべきことに、以下の実施例に示されるように、NEt-3IBの大腸移行性が高いことを見出し、その結果、既存薬であるRXRフルアゴニストのbexaroteneに比べ、顕著な抗炎症作用を示しながらも、トリグリセリド上昇等の副作用を軽減できることを明らかにした。

【0034】

【化7】

【0035】

式（３）で表される化合物NEt-3MEは、NEt-3IBより受容体活性化が弱いRXRアゴニストである。

【0036】

[実施例１]薬物の血中濃度測定
1. 6週齢(体重15-25g)の雄性ICRマウスを、実験前日夕方より絶食させ、下記2で調製した化合物溶液を10mL/kgの容量で胃ゾンデによって経口投与し、投与後0，1，3，6時間後、エーテル麻酔を行い、腹部を切り開いて大静脈より血液を採取し、ヘパリン処理チューブに移し、5分間5000rpmで遠心分離を行って、血漿100μLを採取した。各投与群には５匹ずつのマウスを用いた。
2. 化合物投与量は、１匹あたり30、3、0.3mg/kgで行った。投与する化合物は、終濃度1%量のエタノールで溶かし、0.5%カルボキシメチルセルロース（CMC）溶液に懸濁することにより調製した。
3. 血漿100μLに酢酸アンモニウム緩衝液(酢酸アンモニウム5mMに酢酸を加え、pHを5に調整したもの)を100μL加え、酢酸エチルを1mL加えた。それを30秒間ボルテックスにかけ、室温で10分間放置したのち30秒間遠心し、上清液800μLを取り、遠心エバポレーターで濃縮した。残さは、-20℃で保存した。
4. -20℃で保存されたサンプルにメタノールを100μL加え、30秒間ボルテックスにかけ、30秒間遠心を行い、サンプル20μLの化合物濃度をHPLCもしくはLCMSにて測定した。

【0037】

得られた結果を、図１に示す。3mg/kgでの単回投与ではNEt-3IBの血中濃度はいずれの投与時間においても100nMに達せず、図２を参照すれば、RXRを50%程度しか活性化しなかったことがわかる。図２は、非特許文献２より引用した。

【0038】

[実施例２]糞便中の薬物濃度測定
1. 6週齢(体重35-40ｇ)の雄性ICRマウスを各投与群４匹ずつ用いた。
2. 経口投与溶液は、終濃度1%となる量のエタノールで溶解し、0.5%カルボキシメチルセルロース（CMC）溶液に懸濁することにより調製した。
3. 各マウスとも、１匹ずつケージにて飼育した。餌および水については、自由に摂食、飲水させた。
4. 毎朝10時に体重測定した後、評価薬物をゾンデにて強制経口投与した。
5. 翌日より３日間、各ケージの糞を回収した。
6. 40℃にて減圧乾燥させた糞100mgを乳鉢にてすりつぶした後、HPLC用メタノール1.5mLを加え、20分間超音波抽出した。
7. 抽出後、4℃にて1,500×ｇにて20分間遠心した。
8. 遠心後、上清1mLをシリンジフィルターにてろ過し、2mLエッペンチューブに注いだ。
9. LC/MS（API4000^TM）にて、上記メタノール抽出物中のNEt-3IBの濃度を測定した。これを糞100mgあたりの濃度に換算した。
10. 上記糞100mgを100μLと見なして、メタノール1.5mLでの抽出を施したことから、LC/MSによって得られたメタノール中濃度を16倍することによって、糞中濃度とした。

【0039】

[実施例３]大腸中の薬物濃度測定
1. [実施例２]にて用いたマウスについて、最後の投薬（投薬３日目）の翌日に、エーテルにて安楽死させた後、大腸を切り出した。
2. 切り出した大腸内の糞を取り除いた後、大腸内をPBSにて洗浄した。余分な水分をキムワイプにて除いた。
3. 上記大腸約200mgを正確に2mLエッペンチューブに投入した。
4. 上記エッペンチューブにHPLC用メタノール800μLを加えた後、ホモジナイザーで粉砕した。さらに、加えられたメタノールの全体積が大腸体積の5倍になるように、メタノールを追加した。
5. 20分間超音波抽出した。
6. 抽出後、4℃にて1,500×ｇにて20分間遠心した。
7. 遠心後、上清約1mLをシリンジフィルターにてろ過し、2mLエッペンチューブに注いだ。
8. LC/MS（API4000^TM）にて、上記メタノール抽出物中のNEt-3IBの濃度を測定した。
9. 上記大腸200mgを200μLと見なして、メタノール800mLでの抽出を施したことから、LC/MSによって得られたメタノール中濃度を5倍することによって、大腸中濃度とした。

【0040】

実施例２で得られた糞中のNEt-3IB濃度は、第１日目が40±6μM、第２日目が33±4μM、第３日目が22±1μMであった。また、実施例３で得られた３日間投与翌日の大腸中のNEt-3IBの濃度は2.7±0.3nMであった。これらの結果に示される通り、糞便中に顕著なNEt-3IBの存在が認められ、その濃度には反復投与による上昇は認められなかった。

【0041】

[実施例４]DSS大腸炎モデルマウスの作成ならびに薬効・副作用評価（１）
1. 6週齢(体重20g)の雄性C57BL/6マウスを購入し、5-7日間馴化させた。
2. 1群5-6匹で各群間の平均体重をそろえた。
3. DSS非投与群（normal）には、0.22μMメンブレンフィルターでろ過したミネラルウォーターを自由飲水させた。DSS非投与群（vehicle及び薬物投与群）には、0.22μMメンブレンフィルターでろ過した2％のデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を含有するミネラルウォーターを6日間自由飲水させ、その後は0.22μMメンブレンフィルターでろ過したミネラルウォーターを自由飲水させた。
4. DSS自由飲水開始時より、毎日体重を測定した後、評価薬物を経口投与した。
5. 評価薬物としては、5-アミノサリチル酸（5-ASA；100mg/kg/day）、RXRフルアゴニストであるbexarotene(10mg/kg/day)、RXRフルアゴニストであるNEt-3IBを10mg/kg/day、3mg/kg/day、1mg/kg/dayで投与した。
6. 経口投与溶液は、終濃度1%となる量のエタノールで溶解し、0.5%カルボキシメチルセルロース（CMC）溶液で懸濁することにより調整した。
7. 薬物の投与を11日間行い、その翌日に、マウスをジエチルエーテルにより安楽死させ、採血し、解剖した。大腸及び脾臓を摘出し、大腸長を測定し、大腸及び脾臓の写真を撮影した。大腸の一部は切片を作成して写真撮影した。
8. 採血された血液はヘパリン処理により血漿とし、血中トリグリセリド（TG）測定に用いた。

【0042】

図３に、マウスの体重変化を示す。図４に大腸長を示す。図５に血中TG濃度を示す。また図６に大腸と脾臓の写真及び大腸切片像を示す。5-アミノサリチル酸は100mg/kg/dayの投与にも関わらず、体重減少、大腸長の回復を見せなかった。NEt-3IBでは、Bexaroteneに比べ10mg/kg/dayの反復経口投与において顕著な体重減少に対する改善、および大腸長の回復を示した。またNEt-3IBでは、bexaroteneに比べ血中TGの上昇が抑制された。

【0043】

[実施例５]DSS大腸炎モデルマウスの作成ならびに薬効・副作用評価（２）
実施例４において、DSS濃度を3％とし、NEt-3IB（10mg/kg/day）に加えて、比較対照薬物としてステロイド系抗炎症薬であるprednisolone(10mg/kg/day)を投与した以外は実施例４と同様にして試験した。

【0044】

図７にマウスの体重変化を示し、図８に大腸長を示す。prednisoloneは10mg/kg/dayの経口投与では抗炎症作用が見られないのに対し、NEt-3IBは顕著な体重減少抑制に加えて、大腸長の回復も認められた。

【0045】

[実施例６] DSS大腸炎モデルマウスの作成ならびに薬効・副作用評価（３）
実施例４において、NEt-3IB（10mg/kg/day）に加えて、NEt-3ME（30mg/kg/day）、及び比較対照薬物として抗炎症薬であるサラゾスルファピリジン（SASP）(200mg×2/kg/day)を投与した以外は実施例４と同様にして試験した。

【0046】

図９にマウスの体重変化を示す。炎症性腸疾患の既存薬であるSASPでは、vehicleに比べて改善効果が認められないが、NEt-3IB、NEt-3MEともに体重減少が抑制され、腸炎が抑制されていることが示唆された。NEt-3MEは、NEt-3IBの３倍の量を用いた時に、NEt-3IBと同程度の効果を示した。

【0047】

[実施例７]LPS刺激NO産生に対する抑制効果（Griessアッセイ）
（１日目）96wellプレートに、Raw264.7細胞を1.0×10⁵cells/wellで播種した。
（２日目）LPS（リポポリサッカライド）(100ng/mL)と各RXRをDMSO（最終濃度0.1％）で添加し、48hインキュベートした。
（４日目）培養上清50μLをGriess法（PROMEGA G2930を利用）によりNO（一酸化窒素）濃度を測定した。

【0048】

結果を図１０に示す。図中記載のRUは、prednisoloneの標的分子であるグルココルチコイド受容体（GR）に対する拮抗薬であるRU486を1μM併用したことを意味する。Raw264.7細胞にLPS刺激することで生じるNOは、プレドニゾンロン、またRXRアゴニストであるNEt-3IBよっても阻害された。プレドニゾンロンによるNO産生抑制作用はGR拮抗薬であるRU486の併用により阻害されたのに対し、NEt-3IBのそれは阻害されなかった。このことから、NEt-3IBによるNO産生抑制作用はGRを分子標的としていないことが示唆された。したがって、GRを介することによる副作用である感染症誘発、ムーンフェイス、糖尿病などの発生を抑制できる可能性も示唆された。

【0049】

[実施例８] NFκB転写活性抑制（レポーターアッセイ）
NFκBの転写応答配列の下流に分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）遺伝子を組み込んだ組換えRAW264.7細胞を用いて、RXRアゴニストであるNEt-3IBならびにbexaroteneによるNFκB転写に対する抑制作用を調べた。実験には、Novus biologicals、LLCより販売されているNFκB/SEAPorter RAW Cell Lineを用いた。

【0050】

（１日目）96wellプレートに、RAW(NF-κB-SEAP)細胞を5×10⁵cells/wellで播種し、37℃で5%CO₂培養した。
（２日目）LPS(100ng/mL)及び試験化合物を添加し、37℃で5%CO₂培養した。このとき、LPSはPBS溶液として、試験化合物はDMSO溶液としてストックし、PBS及びDMSOの終濃度がいずれも0.5%になるように添加した。
（３日目）1. LPS及び試験化合物添加の24時間後、培養上清25μLを96穴白色プレートに分注し、SEAP活性の測定に使用した。このとき、バックグラウンドとして使用するため、培地のみ（細胞を播種しなかった）のウェルからも上清をとった。また、透明プレートに残った細胞でMTTアッセイを行い、SEAP活性を細胞数で補正した。
2. 分注した培養上清に1 x Dilution bufferを25μL/well加え、ウェルをテープで覆い、65℃に設定した乾燥機で30分インキュベートした。
3. プレートを乾燥機から取り出し、4℃にて15分インキュベートした。
4. テープをはがし、Substrate solutionを10μL/well加え、攪拌し、遮光して室温で60分インキュベートした。
5. 蛍光プレートリーダーでEx/Em = 360/465nmの蛍光を測定した。

【0051】

結果を図１１に示す。その結果、いずれのRXRアゴニストとも、0.1μM以上であれば、不完全ではあるがNFκB転写活性を抑制することが示された。

【0052】

いずれの動物実験とも、岡山大学動物実験委員会の審査を受け実施した。

【0053】

以上詳述したように、NEt-3IBは糞便中へ移行し、血中濃度がRXRに対するEC50値を下回る1mg/kg/dayでの反復経口投与においてもDSS腸炎において顕著な抗炎症効果を示した。また、当該薬物による血中トリグリセリド上昇は、既存薬であるRXRアゴニストbexaroteneやprednisoloneに比べ軽減した。以上から、炎症性腸疾患の予防および治療の有効成分としての作用が期待できるため、このような医薬として利用することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】