特許 6805142 ＣＤ７３に対する抗体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6805142

(24)【登録日】2020年12月7日

(45)【発行日】2020年12月23日

(54)【発明の名称】ＣＤ７３に対する抗体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20201214BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20201214BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20201214BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20201214BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20201214BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20201214BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20201214BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20201214BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20201214BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20201214BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20201214BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/13

   C07K16/28ZNA

   C07K16/46

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12P21/08

   A61P35/00

   A61K45/00

   A61K39/395 N

【請求項の数】31

【全頁数】246

(21)【出願番号】特願2017-527316(P2017-527316)

(86)(22)【出願日】2015年11月19日

(65)【公表番号】特表2017-537620(P2017-537620A)

(43)【公表日】2017年12月21日

(86)【国際出願番号】US2015061639

(87)【国際公開番号】WO2016081748

(87)【国際公開日】20160526

【審査請求日】2018年9月20日

(31)【優先権主張番号】62/083,056

(32)【優先日】2014年11月21日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】391015708

【氏名又は名称】ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー

【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ ＣＯＭＰＡＮＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100084146

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 宏

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(72)【発明者】

【氏名】ニルス・ロンバーグ

(72)【発明者】

【氏名】アラン・ジェイ・コーマン

(72)【発明者】

【氏名】ブライアン・シー・バーンハート

(72)【発明者】

【氏名】アーロン・ピー・ヤムニウク

(72)【発明者】

【氏名】モハン・スリニバサン

(72)【発明者】

【氏名】カーラ・エイ・ヘニング

(72)【発明者】

【氏名】ミン・レイ

(72)【発明者】

【氏名】エマヌエラ・セガ

(72)【発明者】

【氏名】アンジェラ・グッドイナフ

(72)【発明者】

【氏名】マリア・エヌ・ジュア−クンケル

(72)【発明者】

【氏名】グオドン・チェン

(72)【発明者】

【氏名】ジョン・サック

(72)【発明者】

【氏名】リチャード・ホアン

(72)【発明者】

【氏名】マーティン・ジェイ・コーベット

(72)【発明者】

【氏名】ジョセフ・イー・マイヤーズ・ジュニア

(72)【発明者】

【氏名】リアン・シュヴァイツァー

(72)【発明者】

【氏名】サンドラ・ブイ・ハッチャー

(72)【発明者】

【氏名】ハイチュン・ホアン

(72)【発明者】

【氏名】ピンピン・ジャン

【審査官】 市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／００３０２７３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／０４１６２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.，２０１０年，Vol.107, No.4，pp.1547-1552

【文献】 Clin. Cancer Res.，２０１３年，Vol.19, No.20，pp.5626-5635

【文献】 Mol. Cancer，２０１３年，12:11

【文献】 J. Immunol.，２０１３年，Vol.191，pp.4165-4173

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＣＤ７３に結合し、それぞれ配列番号５、６および７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、およびそれぞれ配列番号１３、１４および１５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、単離抗体であって、ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを含む重鎖定常領域を含む、単離抗体。

【請求項2】

ヒンジドメインが、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジドメイン（配列番号１３６）に対して、ＫａｂａｔシステムのＥＵ指数に従うＣ２１９Ｓのアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の単離抗体。

【請求項3】

重鎖定常領域が、
（ａ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＨ１ドメイン；および
（ｂ）配列番号１２３のアミノ酸配列を含むヒンジドメイン
を含む、請求項１または２に記載の単離抗体。

【請求項4】

抗体が配列番号１３５に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の単離抗体。

【請求項5】

抗体が配列番号１３３または１８９に示すアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号１０２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の単離抗体。

【請求項6】

重鎖および軽鎖がそれぞれ完全長重鎖および軽鎖である、請求項１〜３のいずれかに記載の単離抗体。

【請求項7】

ＩｇＧ抗体である、請求項６に記載の単離抗体。

【請求項8】

抗体が配列番号１３３に示すアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号１０２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の単離抗体。

【請求項9】

抗体が配列番号１８９に示すアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号１０２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の単離抗体。

【請求項10】

次の性質の一つ以上を示す、請求項１〜９のいずれかに記載の単離抗体：
（ａ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析で測定して１０ｎＭ以下のＫ_ＤでヒトＣＤ７３に結合；
（ｂ）ＣＤ７３酵素活性阻害；
（ｃ）細胞、例えば、腫瘍細胞への抗体介在ＣＤ７３内在化によるＣＤ７３内在化；および
（ｄ）ＦＡＣＳで測定して０．１〜１０ｎＭ以下のＥＣ_５０でヒトＣＤ７３に結合。

【請求項11】

野生型ＩｇＧ１抗体と比較して低減したエフェクター機能を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の単離抗体。

【請求項12】

請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体、および薬学的に許容される担体を含む、組成物。

【請求項13】

１以上のさらなる治療剤をさらに含む、請求項１２に組成物。

【請求項14】

さらなる治療剤が、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、またはリンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）アンタゴニストである、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

第二の結合特異性を有する分子に連結し、それによって二重特異性分子を形成する、請求項１に記載の抗体。

【請求項16】

第二の異なる薬剤に連結し、それによって免疫複合体を形成する、請求項１に記載の抗体。

【請求項17】

請求項１に記載の抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードする、単離核酸分子。

【請求項18】

請求項１７に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。

【請求項19】

請求項１８に記載の発現ベクターで形質転換した、細胞。

【請求項20】

請求項１５に記載の二重特異性分子または請求項１６に記載の免疫複合体を含む、組成物。

【請求項21】

請求項１に記載の抗体および使用指示を含む、キット。

【請求項22】

請求項１に記載の抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換した細胞で抗体を発現させ、該細胞から抗体を単離することを含む、抗ＣＤ７３抗体を製造する方法。

【請求項23】

請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体を含む、腫瘍におけるアデノシンレベルを低減するための組成物。

【請求項24】

請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体の有効量を含む、処置を必要とする対象における腫瘍に対して免疫応答を刺激するための組成物。

【請求項25】

請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体を含む、対象における免疫応答を刺激するための組成物。

【請求項26】

請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体を含む、対象における腫瘍増殖を阻止するための組成物。

【請求項27】

請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体の治療有効量を含む、対象における癌を処置するための組成物。

【請求項28】

癌が膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、消化器癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、胚細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫およびウイルス関連癌からなる群から選択される、請求項２７に記載の組成物。

【請求項29】

１以上のさらなる治療剤をさらに含む、請求項２７または２８に記載の組成物。

【請求項30】

さらなる治療剤が、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストまたはＬＡＧ−３アンタゴニストである、請求項２９に記載の組成物。

【請求項31】

請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体を含む、サンプルにおけるヒトＣＤ７３の存在を検出するための組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、引用によりその内容全体を本明細書に包含させる、２０１４年１１月２１日出願の“ＣＤ７３に対する抗体およびその使用”なる表題の米国仮出願番号６２／０８３,０５６号に基づく優先権を主張する。

【背景技術】

【0002】

背景
エクト５’−ヌクレオチダーゼ(エクト５’ＮＴ、EC 3.1.3.5)としても知られる表面抗原分類７３(ＣＤ７３)は、大部分の組織に見られるが、特に内皮細胞および造血細胞のサブセットで発現される、グリコシル−ホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)結合細胞表面酵素である(Resta et al., Immunol Rev 1998;161:95-109 and Colgan et al., Prinergic Signal 2006;2:351-60)。ＣＤ７３は、細胞外ヌクレオシド一リン酸の、アデノシンのようなヌクレオシドへの脱リン酸化を触媒することが知られている。アデノシンは、Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２ＢおよびＡ３を含む数受容体を経るその生物学的効果に介在する、広く研究されているシグナル伝達分子である。アデノシンは、多くの癌の増殖および遊走を制御し、抗腫瘍Ｔ細胞の制御により免疫抑制効果を有することが示されている(Zhang et al., Cancer Res 2010;70:6407-11)。

【0003】

ＣＤ７３は、結腸、肺、膵臓、卵巣、膀胱、白血病、神経膠腫、神経膠芽腫、黒色腫、甲状腺、食道、前立腺および乳癌を含む多くの種々の癌で発現されることが報告されている(Jin et al., Cancer Res 2010;70:2245-55およびStagg et al., PNAS 2010;107:1547-52)。さらに、癌におけるＣＤ７３発現は、増殖、遊走、血管新生、侵襲性、転移の増加および短い患者生存期間と関連している。ＣＤ７３活性はまた乳頭甲状腺癌における予後マーカーとしても提案されている。ＣＤ７３は腫瘍細胞の細胞−細胞および細胞−マトリクス相互作用を制御することが示されているが、ＣＤ７３発現および活性はまたＴ細胞応答の低減とも関係しており、薬物耐性と関連付けられている(Spychala et al., Pharmacol Ther 3000;87:161-73)。それゆえにＣＤ７３は、癌進行を、直接的および間接的の両者で制御でき、これは、新規治療標的としてのその可能性を強調する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

癌のような疾患を標的とする戦略の改善に対する継続的な要望を考慮して、複数機構を介して腫瘍進行を制御する方法ならびにＣＤ７３活性を制御する方法および関連治療剤が非常に期待されている。

【課題を解決するための手段】

【0005】

要約
ここに提供されるのは、ＣＤ７３に特異的に結合し、望ましい機能的性質を有する、モノクローナル抗体(その抗原結合部分)、特にヒトモノクローナル抗体のような単離抗体である。これらの性質は、ヒトＣＤ７３への高親和性結合、サルＣＤ７３(例えば、カニクイザルＣＤ７３)への結合およびＣＤ７３酵素活性阻害能を含む。ここに記載する抗体は、腫瘍増殖阻害、アデノシン産生低減、免疫応答刺激およびサンプル内のＣＤ７３タンパク質検出に使用できる。

【0006】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、次の性質の少なくとも一つを示す：
(ａ)ＣＤ７３酵素活性の阻害；
(ｂ)カニクイザルＣＤ７３への結合；
(ｃ)ＣＤ７３の細胞、例えば、腫瘍細胞への抗体介在内在化；および
(ｄ)ヒトＣＤ７３のアミノ酸６５〜８３および１５７〜１７２を含む立体エピトープへの結合。

【0007】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、例えば、BIACORE^{(登録商標)}SPR分析で測定して、ヒトＣＤ７３(単量体および／または二量体ＣＤ７３)に約１０nM〜０.１nMまたはそれ以下のＫ_Ｄで結合し、例えば、パルス・チェイスにより、そして実施例に記載するように測定して、１０分を超えないＴ_１／２で腫瘍細胞に内在化する。

【0008】

ある態様において、ヒトＣＤ７３の抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、領域FTKVQQIRRAEPNVLLLDA(配列番号９６)および／またはLYLPYKVLPVGDEVVG(配列番号９７)内に結合し、例えば、ここで、エピトープは、ヒトＣＤ７３のFTKVQQIRRAEPNVLLLDA(配列番号９６)および／またはLYLPYKVLPVGDEVVG(配列番号９７)に相当するかまたはそれと重複する。

【0009】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、アミノ酸残基FTKVQQIRRAEPNVLLLDA(配列番号９６)および／またはLYLPYKVLPVGDEVVG(配列番号９７)のすべてまたは一部を含む、ヒトＣＤ７３(配列番号１)上のエピトープと結合する。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分により結合されるエピトープは、例えば、ＨＤＸ−ＭＳおよび／または結晶解析により決定する。

【0010】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、３可変重鎖ＣＤＲおよび３可変軽鎖ＣＤＲを含み、これらは表３５における鎖、例えば、配列番号４と８；配列番号４と１２；配列番号１６と２０；配列番号１６と２４；配列番号１６と２８；配列番号３２と３６；配列番号４０と４４；配列番号４０と４８；配列番号５２と５６；配列番号６０と６４；配列番号６８と７２；配列番号６８と７６；配列番号８０と８４；配列番号８８と９２；配列番号１３５と８；または配列番号１３５と１２のような、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体の可変重鎖および可変軽鎖対にある。例えば、抗ＣＤ７３抗体は：
(ａ)それぞれ配列番号５、６および７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号９、１０および１１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｂ)それぞれ配列番号５、６および７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号１３、１４および１５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｃ)それぞれ配列番号１７、１８および１９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号２１、２２および２３を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｄ)それぞれ配列番号１７、１８および１９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号２５、２６および２７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｅ)それぞれ配列番号１７、１８および１９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号２９、３０および３１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｆ)それぞれ配列番号３３、３４および３５を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号３７、３８および３９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｇ)それぞれ配列番号４１、４２および４３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号４５、４６および４７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｈ)それぞれ配列番号４１、４２および４３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号４９、５０および５１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｉ)それぞれ配列番号５３、５４および５５を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号５７、５８および５９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｊ)それぞれ配列番号６１、６２および６３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６５、６６および６７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｋ)それぞれ配列番号６９、７０および７１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号７３、７４および７５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｌ)それぞれ配列番号６９、７０および７１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号７７、７８および７９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｍ)それぞれ配列番号８１、８２および８３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号８５、８６および８７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；または
(ｎ)それぞれ配列番号８９、９０および９１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号９３、９４および９５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
を含む。

【0011】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、それぞれ配列番号５、６および７の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号９、１０および１１の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。

【0012】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、それぞれ配列番号５、６および７の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号１３、１４および１５の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。

【0013】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、例えば、配列番号４、１６、３２、４０、５２、６０、６８、８０、８８、１３５、１７０〜１７７に示すアミノ酸配列を含む、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列および／または例えば、配列番号８、１２、２０、２４、２８、３６、４４、４８、５６、６４、７２、７６、８４または９２に示すアミノ酸配列を含む、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体の軽鎖可変領域と、少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一またはそれ以上同一である、アミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖可変領域を含む。

【0014】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、アミノ酸配列：配列番号１３５と８；配列番号１３５と１２；配列番号４と８；配列番号４と１２；配列番号１６と２０；配列番号１６と２４；配列番号１６と２８；配列番号３２と３６；配列番号４０と４４；配列番号４０と４８；配列番号５２と５６；配列番号６０と６４；配列番号６８と７２；配列番号６８と７６；配列番号８０と８４；配列番号８８と９２；配列番号１７０と配列番号２０、２４および２８のいずれか一つ；配列番号１７１〜１７６のいずれか一つと配列番号８または１２；または配列番号１７７と３６と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一またはそれ以上同一(例えば、１００％)である、重鎖および軽鎖可変領域配列を含む。

【0015】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１３５と８；配列番号１３５と１２；配列番号４と８；配列番号４と１２；配列番号１６と２０；配列番号１６と２４；配列番号１６と２８；配列番号３２と３６；配列番号４０と４４；配列番号４０と４８；配列番号５２と５６；配列番号配列番号６０と６４；配列番号６８と７２；配列番号６８と７６；配列番号８０と８４；配列番号８８と９２；配列番号１７０と配列番号２０、２４および２８のいずれか一つ；配列番号１７１〜１７６のいずれか一つと配列番号８または１２；または配列番号１７７と３６からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域を含む。

【0016】

ある態様において、抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１３５に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号８または配列番号１２に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。

【0017】

ここに提供されるのは、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体のいずれかのアミノ酸配列、例えば、配列番号１００および１０１；配列番号１００および１０２；配列番号１０３および１０４；配列番号１０３および１０５；配列番号１０３および１０６；配列番号１０７および１０８；配列番号１０９および１１０；配列番号１０９および１１１；配列番号１１２および１１３；配列番号１１４および１１５；配列番号１１６および１１７；配列番号１１６および１１８；配列番号１１９および１２０；配列番号１２１および１２２；配列番号１３３または１８９(Ｃ末端リシンを欠く)および１０１；配列番号１３３または１８９および１０２；配列番号１８９および１０１；配列番号１８９および１０２；配列番号１８４〜１８６のいずれか一つおよび配列番号１０４〜１０６のいずれか一つ；配列番号１８７〜２０７のいずれか一つおよび配列番号１０１または１０２；または配列番号２０８〜２１０のいずれか一つおよび配列番号１０８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、それぞれ、完全長重鎖および軽鎖配列を有する、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分である。

【0018】

ある態様において、抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１３３または１８９に示すアミノ酸配列を有する重鎖領域および配列番号１０１または配列番号１０２に示すアミノ酸配列を有する軽鎖領域を含む。

【0019】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体またはそのバリアントである。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤ７３上の、前記重鎖および軽鎖可変領域配列を有する抗体(例えば、抗体ＣＤ７３.４−１、ＣＤ７３.４−２、ＣＤ７３.３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１)と同一エピトープに結合する。

【0020】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、例えば、ＮからＣ末端方向の順にヒトＣＨ１ドメイン、ヒトヒンジドメイン、ヒトＣＨ２ドメインおよびヒトＣＨ３ドメインを含む、修飾重鎖定常領域を含み、ここで、少なくとも２ドメインが異なるアイソタイプ(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４アイソタイプ)のものである。例えば、ある態様において、修飾定常領域はヒトＩｇＧ２ヒンジを含み、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの少なくとも一つはＩｇＧ２アイソタイプのものではない。ある態様において、ＣＨ１は、例えば、アミノ酸配列ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV(配列番号１２４)を有する、ヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインである。修飾定常領域は、ヒトＩｇＧ２ヒンジドメイン、例えば、システイン結合における異種性を低減したヒトＩｇＧ２ヒンジドメイン、例えば、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジドメイン(配列番号１３６)に対して、Ｃ２１９にアミノ酸置換、例えば、Ｃ２１９Ｓを有するヒトＩｇＧ２ヒンジドメイン、例えば、アミノ酸配列ERKSCVECPPCPAPPVAG(配列番号１２３)を有するヒトＩｇＧ２ヒンジドメインを含み得る。修飾定常領域は、エフェクター機能を低減または排除したヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、例えば、野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン(配列番号１３７)に対してアミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、例えば、アミノ酸配列PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAK(配列番号１２５)を含むヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインを含み得る。修飾定常領域は、例えば、アミノ酸配列GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号１２８)を有する、野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含み得る。

【0021】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、(ｉ)ＩｇＧ２ヒンジまたは(ii)ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ ＣＨ１ドメインを含む修飾重鎖領域を含むが、ただし、該抗体はＩｇＧ２抗体ではない、例えば、抗体は野生型ＩｇＧ２重鎖定常領域を含まない。

【0022】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、ここに記載する定常領域のいずれか一つ、例えば、配列番号１２６、１２７、１２９、１３０、１６２〜１６９、１８０〜１８３、２６７〜２８２および３００〜３４７に示すアミノ酸配列を含む定常領域を含む。

【0023】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、１１Ｆ１１またはＣＤ７３.４のＶ_ＨおよびＶ_ＬドメインならびにＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域またはＩｇＧ２ヒンジとＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを含む重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域はＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆ(配列番号１６９)またはＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１ｆ(配列番号１６５)であってよく、ここで、“ＣＳ”は“Ｃ２１９Ｓ”をいう。

【0024】

ここに提供されるのは、第二の結合特異性を有する分子に結合した抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分を含む二重特異性分子ならびに薬剤に連結した抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体である。

【0025】

抗ＣＤ７３抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域配列をコードする核酸分子ならびに核酸分子を含む発現ベクターおよび発現ベクターでトランスフォームされた細胞も提供される。

【0026】

抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分を含む組成物およびキットも提供される。

【0027】

ここに提供されるのは、ここに開示する抗ＣＤ７３抗体を細胞で発現させ、抗体を細胞から単離することを含む、抗ＣＤ７３抗体の製造法である。

【0028】

ここに開示する抗ＣＤ７３抗体の使用法、例えば、ＣＤ７３を発現する、例えば、腫瘍、例えば、腫瘍細胞におけるまたはそれによるアデノシンレベルを低減する方法、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法、対象における免疫応答を刺激する方法、対象における腫瘍細胞増殖を阻止する方法、例えば、免疫療法により、癌を処置する方法も提供される。ある態様において、癌は、膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、消化器癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、胚細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫またはウイルス関連癌である。癌は、転移癌、難治性癌または再発性癌であり得る。

【0029】

ある態様において、ここに記載する方法は、さらに、１以上のさらなる治療剤、例えば、免疫系を刺激する治療剤、例えば、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＬＡＧ−３アンタゴニスト、ＧＩＴＲアンタゴニストおよび／または抗ＣＤ３９抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体またはＡ２ＡＲの化学阻害剤の投与を含む。

【0030】

本発明の他の特徴および利点は、次の詳細な記載および実施例から明らかであり、これらは限定的として解釈してはならない。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1A】ＣＤ７３.４−１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号２３７)およびアミノ酸配列(配列番号１３５)を示す。ＣＤＲ１(配列番号５)、ＣＤＲ２(配列番号６)およびＣＤＲ３(配列番号７)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0032】

【図1B】ＣＤ７３.４−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域(ＶＫ１)のヌクレオチド配列(配列番号１４０)およびアミノ酸配列(配列番号８)を示す。ＣＤＲ１(配列番号９)、ＣＤＲ２(配列番号１０)およびＣＤＲ３(配列番号１１)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0033】

【図2A】ＣＤ７３.４−２ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号２３７)およびアミノ酸配列(配列番号１３５)を示す。ＣＤＲ１(配列番号５)、ＣＤＲ２(配列番号６)およびＣＤＲ３(配列番号７)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0034】

【図2B】ＣＤ７３.４−２ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４１)およびアミノ酸配列(配列番号１２)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１３)、ＣＤＲ２(配列番号１４)およびＣＤＲ３(配列番号１５)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0035】

【図3A】１１Ｆ１１−１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１３９)およびアミノ酸配列(配列番号４)を示す。ＣＤＲ１(配列番号５)、ＣＤＲ２(配列番号６)およびＣＤＲ３(配列番号７)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0036】

【図3B】１１Ｆ１１−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４０)およびアミノ酸配列(配列番号８)を示す。ＣＤＲ１(配列番号９)、ＣＤＲ２(配列番号１０)およびＣＤＲ３(配列番号１１)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0037】

【図4A】１１Ｆ１１−２ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１３９)およびアミノ酸配列(配列番号４)を示す。ＣＤＲ１(配列番号５)、ＣＤＲ２(配列番号６)およびＣＤＲ３(配列番号７)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0038】

【図4B】１１Ｆ１１−２ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４１)およびアミノ酸配列(配列番号１２)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１３)、ＣＤＲ２(配列番号１４)およびＣＤＲ３(配列番号１５)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0039】

【図5A】４Ｃ３−１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４２)およびアミノ酸配列(配列番号１６)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１７)、ＣＤＲ２(配列番号１８)およびＣＤＲ３(配列番号１９)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0040】

【図5B】４Ｃ３−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４３)およびアミノ酸配列(配列番号２０)を示す。ＣＤＲ１(配列番号２１)、ＣＤＲ２(配列番号２２)およびＣＤＲ３(配列番号２３)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0041】

【図6A】４Ｃ３−２ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４２)およびアミノ酸配列(配列番号１６)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１７)、ＣＤＲ２(配列番号１８)およびＣＤＲ３(配列番号１９)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0042】

【図6B】４Ｃ３−２ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４４)およびアミノ酸配列(配列番号２４)を示す。ＣＤＲ１(配列番号２５)、ＣＤＲ２(配列番号２６)およびＣＤＲ３(配列番号２７)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0043】

【図7A】４Ｃ３−３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４２)およびアミノ酸配列(配列番号１６)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１７)、ＣＤＲ２(配列番号１８)およびＣＤＲ３(配列番号１９)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0044】

【図7B】４Ｃ３−３ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４５)およびアミノ酸配列(配列番号２８)を示す。ＣＤＲ１(配列番号２９)、ＣＤＲ２(配列番号３０)およびＣＤＲ３(配列番号３１)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0045】

【図8A】４Ｄ４−１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４６)およびアミノ酸配列(配列番号３２)を示す。ＣＤＲ１(配列番号３３)、ＣＤＲ２(配列番号３４)およびＣＤＲ３(配列番号３５)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0046】

【図8B】４Ｄ４−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４７)およびアミノ酸配列(配列番号３６)を示す。ＣＤＲ１(配列番号３７)、ＣＤＲ２(配列番号３８)およびＣＤＲ３(配列番号３９)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0047】

【図9A】１０Ｄ２−１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４８)およびアミノ酸配列(配列番号４０)を示す。ＣＤＲ１(配列番号４１)、ＣＤＲ２(配列番号４２)およびＣＤＲ３(配列番号４３)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0048】

【図9B】１０Ｄ２−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４９)およびアミノ酸配列(配列番号４４)を示す。ＣＤＲ１(配列番号４５)、ＣＤＲ２(配列番号４６)およびＣＤＲ３(配列番号４７)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0049】

【図10A】１０Ｄ２−２ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４８)およびアミノ酸配列(配列番号４０)を示す。ＣＤＲ１(配列番号４１)、ＣＤＲ２(配列番号４２)およびＣＤＲ３(配列番号４３)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0050】

【図10B】１０Ｄ２−２ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１５０)およびアミノ酸配列(配列番号４８)を示す。ＣＤＲ１(配列番号４９)、ＣＤＲ２(配列番号５０)およびＣＤＲ３(配列番号５１)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0051】

【図11A】１１Ａ６−１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１５１)およびアミノ酸配列(配列番号５２)を示す。ＣＤＲ１(配列番号５３)、ＣＤＲ２(配列番号５４)およびＣＤＲ３(配列番号５５)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0052】

【図11B】１１Ａ６−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１５２)およびアミノ酸配列(配列番号５６)を示す。ＣＤＲ１(配列番号５７)、ＣＤＲ２(配列番号５８)およびＣＤＲ３(配列番号５９)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0053】

【図12A】２４Ｈ２−１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１５３)およびアミノ酸配列(配列番号６０)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６１)、ＣＤＲ２(配列番号６２)およびＣＤＲ３(配列番号６３)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0054】

【図12B】２４Ｈ２−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１５４)およびアミノ酸配列(配列番号６４)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６５)、ＣＤＲ２(配列番号６６)およびＣＤＲ３(配列番号６７)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0055】

【図13A】５Ｆ８−１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１５５)およびアミノ酸配列(配列番号６８)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６９)、ＣＤＲ２(配列番号７０)およびＣＤＲ３(配列番号７１)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0056】

【図13B】５Ｆ８−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１５６)およびアミノ酸配列(配列番号７２)を示す。ＣＤＲ１(配列番号７３)、ＣＤＲ２(配列番号７４)およびＣＤＲ３(配列番号７５)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0057】

【図14A】５Ｆ８−２ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１５５)およびアミノ酸配列(配列番号６８)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６９)、ＣＤＲ２(配列番号７０)およびＣＤＲ３(配列番号７１)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0058】

【図14B】５Ｆ８−２ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１５７)およびアミノ酸配列(配列番号７６)を示す。ＣＤＲ１(配列番号７７)、ＣＤＲ２(配列番号７８)およびＣＤＲ３(配列番号７９)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0059】

【図15A】５Ｆ８−３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１５５)およびアミノ酸配列(配列番号６８)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６９)、ＣＤＲ２(配列番号７０)およびＣＤＲ３(配列番号７１)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0060】

【図15B】５Ｆ８−３ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号２４２)およびアミノ酸配列(配列番号２３８)を示す。ＣＤＲ１(配列番号２３９)、ＣＤＲ２(配列番号２４０)およびＣＤＲ３(配列番号２４１)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0061】

【図16A】６Ｅ１１−１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１５８)およびアミノ酸配列(配列番号８０)を示す。ＣＤＲ１(配列番号８１)、ＣＤＲ２(配列番号８２)およびＣＤＲ３(配列番号８３)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0062】

【図16B】６Ｅ１１−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１５９)およびアミノ酸配列(配列番号８４)を示す。ＣＤＲ１(配列番号８５)、ＣＤＲ２(配列番号８６)およびＣＤＲ３(配列番号８７)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0063】

【図17A】７Ａ１１−１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１６０)およびアミノ酸配列(配列番号８８)を示す。ＣＤＲ１(配列番号８９)、ＣＤＲ２(配列番号９０)およびＣＤＲ３(配列番号９１)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0064】

【図17B】７Ａ１１−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１６１)およびアミノ酸配列(配列番号９２)を示す。ＣＤＲ１(配列番号９３)、ＣＤＲ２(配列番号９４)およびＣＤＲ３(配列番号９５)領域を描出し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。

【0065】

【図18】抗ＣＤ７３抗体ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆの重鎖およびその可変領域、ＣＤＲ１、２および３、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのアミノ酸配列(配列番号１８９)を示す。

【0066】

【図19】２５℃で固定化プロテインＡ表面に捕捉したＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆに対する６００nM、２００nM、６６.７nM、２２.２nM、７.４nMおよび２.５nMヒト−ＣＤ７３−ｈｉｓ(太線)またはｃｙｎｏ−ＣＤ７３−ｈｉｓ(細線)の結合のＳＰＲセンサーグラムデータを示す。

【0067】

【図20A1-20A2】示す重鎖定常領域を有する１１Ｆ１１、ＣＤ７３.４およびＣＤ７３.１０抗体のヒトＣＤ７３陽性Ｃａｌｕ６細胞(ヒト肺腺癌細胞株)への結合を示す。

【0068】

【図20B1-20B2】示す重鎖定常領域を有する１１Ｆ１１、ＣＤ７３.４およびＣＤ７３.１０抗体のヒトＣＤ７３陰性ＤＭＳ１１４細胞(小肺細胞癌細胞株)への結合を示す。

【0069】

【図20C1-20C2】示す重鎖定常領域を有する１１Ｆ１１、ＣＤ７３.４およびＣＤ７３.１０抗体のｃｙｎｏ ＣＤ７３陽性ＣＨＯ細胞への結合を示す。

【0070】

【図20D1-20D2】示す重鎖定常領域を有する１１Ｆ１１、ＣＤ７３.４およびＣＤ７３.１０抗体のｃｙｎｏ ＣＤ７３陰性ＣＨＯ−Ｋ１細胞への結合を示す。

【0071】

【図20E】標記抗体のドナーＤ１およびＤ２からのＴ細胞への結合を示す。

【0072】

【図20F】標記抗体のドナーＤ１およびＤ２からのＴ細胞への結合を示す。

【0073】

【図21A1-21A2】示す重鎖定常領域を有する抗ＣＤ７３抗体１１Ｆ１１、ＣＤ７３.４およびＣＤ７３.１０によるビーズ結合ヒトＣＤ７３酵素活性の阻害を示す。すべての抗体がヒトＣＤ７３酵素活性を阻害した。

【0074】

【図21B1-21B2】示す重鎖定常領域を有する抗ＣＤ７３抗体１１Ｆ１１、ＣＤ７３.４およびＣＤ７３.１０によるビーズ結合ｃｙｎｏ ＣＤ７３酵素活性の阻害を示す。すべての抗体がｃｙｎｏ ＣＤ７３酵素活性を阻害した。

【0075】

【図22A1-22A2】示す重鎖定常領域を有する１１Ｆ１１、ＣＤ７３.４およびＣＤ７３.１０抗体によるヒトＣＤ７３陽性Ｃａｌｕ６細胞におけるＣＤ７３酵素阻害を示す。すべての抗体がこれらの細胞におけるＣＤ７３酵素活性を阻害した。

【0076】

【図22B1-22B2】示す重鎖定常領域を有する１１Ｆ１１、ＣＤ７３.４およびＣＤ７３.１０抗体によるヒトＣＤ７３陰性ＤＭＳ−１１４細胞におけるＣＤ７３酵素阻害を示す。

【0077】

【図22C】Ｃａｌｕ−６およびＨＥＫ／Ａ２Ｒ細胞を使用するｃＡＭＰアッセイで決定して、１１Ｆ１１および１１Ｆ１１ Ｆ(ａｂ’)_２フラグメントによる内在性ＣＤ７３活性の阻害のＥＣ_５０およびＹ_ｍａｘ値を示す。図２２ＣはまたＣａｌｕ−６内在化アッセイにおける１１Ｆ１１および１１Ｆ１１ Ｆ(ａｂ’)_２フラグメントのＥＣ_５０およびＹ_ｍａｘ値も示す。本図は、１１Ｆ１１ Ｆａｂフラグメントがこれらの２アッセイで不活性であることを示す。

【0078】

【図22D】ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで測定した、１１Ｆ１１または４Ｃ３抗体で処理したＣａｌｕ６細胞からのアデノシン産生の経時変化を示し、１１Ｆ１１抗体によるＣＤ７３酵素阻害が４Ｃ３抗体によるより速く生じることを示す。

【0079】

【図23A】Ｈ２２２８細胞における、次の抗体による、ＣＤ７３の抗体介在内在化の動態を示す：１１Ｆ１１、４Ｃ３、６Ｄ１１、４Ｃ３Ｖｋ１軽鎖を有するＣＤ７３.３−ＩｇＧ１.１ｆ(“３−Ｖｈ−ｈＨＣ−ＩｇＧ１.１ｆ／４Ｃ３Ｖｋ１”)、１１Ｆ１１ Ｖｋ２軽鎖を有するＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ(“４−Ｖｈ−ｈＨＣ−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ／１１Ｆ１１−Ｖｋ２”)、ＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳ(“ＣＤ７３.１０−Ｖｈ−ｈＨＣ−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ”)、ＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆ(“ＣＤ７３.１０−Ｖｈ−ｈＨＣ−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆ”)およびＣＤ７３.１０−ＩｇＧ１.１ｆ(“ＣＤ７３.１０−Ｖｈ−ｈＨＣ−ＩｇＧ１.１ｆ”)抗体。１１Ｆ１１(これはＩｇＧ２アイソタイプのものである)、ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ、ＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳおよびＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆ抗体は他の試験抗体より速くかつ高い程度で内在化しこれは、ＩｇＧ１アイソタイプのものである。

【0080】

【図23B】ＨＣＣ１５細胞(非小細胞肺癌細胞株)における、図２３Ａと同じ抗体の抗体介在ＣＤ７３内在化の動態を示し、Ｈ２２２８細胞(非小細胞肺癌細胞株)で得られたものに類する結果を示す。

【0081】

【図23C】Ｃａｌｕ６細胞における、図２３Ａおよび２３Ｂと同じ抗体ならびにＣＤ７３.１１−ＩｇＧ２ＣＳ(“１１−Ｖｈ−ｈＶＣ−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ”)の抗体介在ＣＤ７３内在化の動態を示し、Ｈ２２２８およびＨＣＣ１５細胞で得られたものに類する結果を示す。

【0082】

【図23D】ＮＣＩ−２０３０細胞(非小細胞肺癌細胞株)における、図２３Ｃと同じ抗体の抗体介在ＣＤ７３内在化の動態を示し、Ｈ２２２８、ＨＣＣ１５およびＣａｌｕ６細胞で得られたものに類する結果を示す。

【0083】

【図23E】フローサイトメトリーにより測定した、Ｃａｌｕ６細胞における標記抗体の抗体介在ＣＤ７３内在化の動態を示す。

【0084】

【図23F】フローサイトメトリーにより測定した、しかし、抗体を細胞と抗体の最初のインキュベーション後、洗い流さなかったときの、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞(粘膜表皮性肺癌細胞株)における、標記抗体の抗体介在ＣＤ７３内在化の動態を示す。

【0085】

【図23G】標記抗体で処理したＣａｌｕ６細胞に内在化したＣＤ７３のパーセンテージを示し、Ｃａｌｕ６細胞における、経時的な標記抗体の抗体介在ＣＤ７３内在化を示す。

【0086】

【図23H】標記抗体で処理したＮＣＩ−Ｈ２９２細胞に内在化したＣＤ７３の経時的パーセンテージを示し、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞における、経時的な標記抗体の抗体介在ＣＤ７３内在化を示す。

【0087】

【図23I】標記抗体で処理したＳＮＵ−Ｃ１細胞(結腸癌細胞株)に内在化したＣＤ７３の経時的パーセンテージを示し、ＳＮＵ−Ｃ１細胞における、経時的な標記抗体の抗体介在ＣＤ７３内在化を示す。

【0088】

【図23J】標記抗体で処理したＮＣＩ−Ｈ１４３７細胞(非小細胞肺癌細胞株)に内在化したＣＤ７３の経時的パーセンテージを示し、ＮＣＩ−Ｈ１４３７細胞における、経時的な標記抗体の抗体介在ＣＤ７３内在化を示す。

【0089】

【図23K】標記抗体で処理したＣａｌｕ６細胞に内在化したＣＤ７３の経時的パーセンテージを示し、Ｃａｌｕ６細胞における、経時的な標記抗体の抗体介在ＣＤ７３内在化を示す。

【0090】

【図23L】標記抗体で処理したＮＣＩ−Ｈ２９２細胞に内在化したＣＤ７３の経時的パーセンテージを示し、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞における、経時的な標記抗体の抗体介在ＣＤ７３内在化を示す。

【0091】

【図23M】５μg／mlの標記抗体で０分、５分、１５分または３０分処理したＣａｌｕ６細胞の表面のＣＤ７３レベルを示す。

【0092】

【図24A】動物を対照抗体で処置した４日後に採取し、ＣＤ７３酵素活性について染色した動物からの異種移植腫瘍切片を示す。切片は、ＣＤ７３酵素活性を示す濃い褐色を示す。

【0093】

【図24B】動物を１１Ｆ１１抗体で処置した１日後に採取し、ＣＤ７３酵素活性について染色した動物からの異種移植腫瘍切片を示す。切片は、図２４Ａに示す対照腫瘍切片に比して有意に褐色部分が少なく、処置開始１日後に早くもＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆによるインビボでのＣＤ７３酵素活性の阻害を示す。

【0094】

【図24C】動物をＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆで処置した２日後に採取し、ＣＤ７３酵素活性ついて染色した動物からの異種移植腫瘍切片を示す。切片は、図２４Ａに示す対照腫瘍切片およびＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆで１日処理後の腫瘍切片に比して有意に褐色が少なく、処置開始少なくとも２日後のＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆによるインビボでのＣＤ７３酵素活性の阻害を示す。

【0095】

【図24D】動物をＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆで処置した３日後に太守し、ＣＤ７３酵素活性について染色した動物からの異種移植腫瘍切片を示す。切片は、図２４Ａに示す対照腫瘍切片に比して有意に褐色が少なく、処置開始少なくとも３日後のＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆによるインビボでのＣＤ７３酵素活性の阻害を示す。

【0096】

【図24E】動物をＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆで処置した７日後に採取し、ＣＤ７３酵素活性について染色した動物からの異種移植腫瘍切片を示す。切片は、図２４Ａに示す対照腫瘍切片に比して有意に褐色が少なく、処置開始少なくとも７日後のＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆによるインビボでのＣＤ７３酵素活性の阻害を示す。

【0097】

【図24F】対照(非ＣＤ７３)抗体または１mg／kg、３mg／kgまたは１０mg／kg ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆで処置した異種移植マウスのＳＮＵＣ１腫瘍におけるヒトＣＤ７３の酵素活性の経時変化を示し、抗ＣＤ７３抗体が、異種移植マウスの腫瘍におけるＣＤ７３酵素活性を効率的に低減することを示す。

【0098】

【図25A】同系４Ｔ１腫瘍および対照ｍＩｇＧを担持するＢａｌｂ／ｃマウスからの対照腫瘍切片におけるマウスＣＤ７３酵素活性のレベルを示す。

【0099】

【図25B】抗マウスＣＤ７３抗体ＴＹ２３で皮下処置した同系４Ｔ１腫瘍を担持するＢａｌｂ／ｃマウスの腫瘍切片(４Ｔ１ １〜７日目)を示し、ＴＹ２３がインビボでＣＤ７３酵素を阻害することを示す。

【0100】

【図26A】フローサイトメトリーで測定して抗ＣＤ７３抗体４Ｃ３、７Ａ１１、６Ｅ１１、５Ｆ８、４Ｃ３、１１Ｆ１１および１１Ａ６による４Ｃ３の交差遮断のレベルを示す。

【0101】

【図26B】フローサイトメトリーで測定して抗ＣＤ７３抗体４Ｃ３、７Ａ１１、６Ｅ１１、５Ｆ８、４Ｃ３、１１Ｆ１１および１１Ａ６による１１Ｆ１１の交差遮断のレベルを示す。

【0102】

【図27A】ヒトＣＤ７３のアミノ酸配列(配列番号２８３)およびＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆとの相互作用領域を示しこれは、濃い灰色で表す。相互作用が強いほど、灰色が濃い。

【0103】

【図27B】二量体ヒトＣＤ７３タンパク質とＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆの相互作用のモデルを示す。

【0104】

【図28A】ヒトＣＤ７３と１１Ｆ１１Ｆａｂ’フラグメントの相互作用の結晶学的モデルを示す。

【0105】

【図28B】１１Ｆ１１との２個のヒトＣＤ７３複合体の複合構造のモデルを示す。

【0106】

【図28C】ヒトＣＤ７３と１１Ｆ１１抗体の相互作用のモデルを示す。

【0107】

【図28D】１１Ｆ１１とヒトＣＤ７３の相互作用のモデルを示す。

【0108】

【図29A】ヒトＣＤ７３および抗体複合体のＳＥＣ−ＭＡＬＳデータを示す。“ＣＤ７３.４−ハイブリッド”は、ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆをいう。

【0109】

【図29B】ヒトＣＤ７３および抗体複合体のＤＬＳデータを示す。

【0110】

【図30A】ｈＣＤ７３−ｈｉｓと種々の定常領域を含むＣＤ７３.４抗体の複合体のＳＥＣクロマトグラムデータを示し、抗体／抗原複合体のサイズに対するＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１ドメインの効果を示す。

【0111】

【図30B】ｈＣＤ７３−ｈｉｓと種々の定常領域を含むＣＤ７３.４抗体の複合体のＤＬＳデータを示し、抗体／抗原複合体のサイズに対するＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１ドメインの効果を示す。

【0112】

【図30C】ｈＣＤ７３−ｈｉｓと種々の定常領域を含むＣＤ７３.４抗体の複合体のＭＡＬＳデータを示し、抗体／抗原複合体のサイズに対するＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１ドメインの効果を示す。

【0113】

【図30D】図３０ＣのＭＡＬＳ決定質量に由来するｈＣＤ７３−ｈｉｓ／ｍＡｂ複合体の図式モデルを示す。

【0114】

【図30E】ＣＨ１領域により影響を受ける高次複合体を示す。ヒストグラムは、各構築物に関して、グラフに示す、ピーク１および２下面積％を示す。

【0115】

【図31】示す抗体の各々の添加１時間、４時間または２１時間後の抗体介在ＣＤ７３内在化のパーセンテージを示す。各抗体の棒を、２１時間(左側)、４時間(真ん中)および１時間(右側)の順に示す。

【0116】

【図32A】ｈＣＤ７３−ｈｉｓと、異なる定常領域配列を含む１６の異なるＣＤ７３.４抗体との１：１モル複合体のＳＥＣクロマトグラムデータの重層を示す。

【0117】

【図32B】示す４つの異なる溶出種を伴う、図３２Ａのクロマトグラムの１１〜１９.５分からのクロマトグラムデータの拡大図である。

【0118】

【図32C】１６の異なる抗体／ＣＤ７３−ｈｉｓ複合体についてプロットした、図３２Ｂのピーク２のＵＶクロマトグラムシグナル面積のパーセンテージを示す。データを、ピーク面積増加の順に左から右に整列させる。

【0119】

【図33】抗ｈｉｓ Ｆａｂ捕捉ＦｃγＲ−ｈｉｓタンパク質への抗体結合を示す。結合応答を、１：１ ｍＡｂ：ＦｃγＲ結合化学量論と仮定した、理論的Ｒ_ｍａｘのパーセンテージとしてプロットする。各抗体の棒は、スライド下部に色(パターン)の説明により提供した順に示す。

【0120】

【図34】抗ｈｉｓ Ｆａｂ捕捉ＦｃｇＲ−ｈｉｓタンパク質への抗体結合を示す。結合応答を、１：１ ｍＡｂ：ＦｃγＲ結合化学量論と仮定した、理論的Ｒ_ｍａｘのパーセンテージとしてプロットする。各抗体の棒は、スライド下部に色(パターン)の説明により提供した順に示す。

【0121】

【図35】種々の抗ＣＤ７３抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列のアライメントを示す。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を太字で示す。

【発明を実施するための形態】

【0122】

詳細な記載
ここに記載するのは、ＣＤ７３に特異的に結合し、それによりＣＤ７３活性を低減する、単離抗体、特にモノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体(“アンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体”)である。ある態様において、ここに記載する抗体は、特定の重鎖および軽鎖生殖系列配列由来であり、かつ／または特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域のような特定の構造的特徴を有する。ここに提供されるのは、単離抗体、このような抗体を製造する方法、このような抗体を含む免疫複合体および二重特異性分子および該抗体を含むように製剤した医薬組成物である。またここに提供されるのは、腫瘍増殖のために、抗体を、単独でまたは他の治療剤(例えば、抗体)および／または癌治療と組み合わせて使用する方法である。したがって、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体を、例えば、腫瘍増殖の阻止、転移の阻止および腫瘍に対する免疫応答の増強を含む、広範な治療適用における処置において使用し得る。

【0123】

定義
本記載がより容易に理解され得るために、いくつかの用語をまず定義する。さらなる定義は、明細書の記載の中に示す。

【0124】

ここで使用する用語“分類群（Cluster of Differentiation）７３”または“ＣＤ７３”は、細胞外ヌクレオシド５’一リン酸をヌクレオシドに、すなわちアデノシン一リン酸(ＡＭＰ)をアデノシンに変換できる酵素(ヌクレオチダーゼ)である。ＣＤ７３は、通常グリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)結合により細胞膜に固定された二量体として見られ、外酵素活性を有し、シグナル伝達に役割を有する。ＣＤ７３の主要機能は、細胞外ヌクレオチド(例えば、５’−ＡＭＰ)から、高度に免疫抑制性の分子であるアデノシンへの変換である。それゆえに、エクト５’−ヌクレオチダーゼは、プリンおよびピリミジンリボおよびデオキシリボヌクレオシド一リン酸の対応するヌクレオシドへの脱リン酸化を触媒する。ＣＤ７３は広い基質特異性を有するが、プリンリボヌクレオシドに優先的である。

【0125】

ＣＤ７３はまたエクト５’ヌクレアーゼ(エクト５’ＮＴ、ＥＣ ３.１.３.５)とも呼ばれる。用語“ＣＤ７３”は、細胞により天然で発現されるＣＤ７３のあらゆるバリアントまたはアイソフォームを含む。したがって、ここに記載する抗体は、ヒト以外の種からのＣＤ７３(例えば、カニクイザルＣＤ７３)と交差反応し得る。あるいは、抗体は、ヒトＣＤ７３に特異的であり、他の種と何ら交差反応性を示し得ない。ＣＤ７３またはそのあらゆるバリアントおよびアイソフォームは、それらを天然で発現する細胞または組織から単離されても、当分野における周知の技術および／またはここに記載する技術を使用して組み換え的に生産されてもよい。

【0126】

ヒトＣＤ７３の２個のアイソフォームが同定されており、その両者は、同一のＮ末端およびＣ末端部分を共有する。アイソフォーム１(Accession No. NP_002517.1；配列番号１)は、５７４アミノ酸および９エクソンからなる最長タンパク質を表す。アイソフォーム２(Accession No. NP_001191742.1；配列番号２)は、アミノ酸４０４〜４５３を欠く５２４アミノ酸からなる短いタンパク質をコードする。アイソフォーム２は、８エクソンのみを有するが、ＮおよびＣ末端配列は同一である転写物を生じる、交互インフレームエキソンを欠く。

【0127】

カニクイザル(ｃｙｎｏ)ＣＤ７３タンパク質配列を配列番号３として提供する。用語カニクイザルおよびｃｙｎｏは、いずれもMacaca fascicularis種をいい、明細書をとおして相互交換可能に使用される。

【0128】

ここで使用する用語“抗体”は、抗体全体およびその何らかの抗原結合フラグメント(すなわち、“抗原結合部分”)または単鎖を含み得る。“抗体”は、ある態様において、ジスルフィド結合により相互接続した少なくとも２個の重(Ｈ)鎖および２個の軽(Ｌ)鎖を含む糖タンパク質またはその抗原結合部分をいう。各重鎖は、重鎖可変領域(ここではＶ_Ｈと略す)および重鎖定常領域を含む。ある天然に存在するＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡ抗体において、重鎖定常領域は３ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。ある天然に存在する抗体において、各軽鎖は、軽鎖可変領域(ここではＶ_Ｌと略す)および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１ドメイン、ＣＬからなる。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、さらに、より保存的な、フレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる領域が散在する、相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれる超可変性の領域に細分され得る。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは３個のＣＤＲおよび４個のＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端で次の順に配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第１成分(Ｃｌｑ)を含む宿主組織または因子への結合に介在し得る。

【0129】

抗体の重鎖は、末端リシン(Ｋ)または末端グリシンおよびリシン(ＧＫ)を含んでも、含まなくてもよい。それゆえに、ここに提供する重鎖配列および重鎖定常領域配列のいずれかは、提供する配列の最後のアミノ酸が何であれ、ＧＫまたはＧで終わっても、ＫまたはＧＫを欠いてもよい。これは、末端リシンおよび時にはグリシンおよびリシンが、抗体の発現中に開裂されるからである。

【0130】

抗体は、一般にその同族抗原に高親和性で特異的に結合し、その親和性は１０^−７〜１０^−１１Ｍ以下の解離定数(Ｋ_Ｄ)により反映される。約１０^−６Ｍを超えるあらゆるＫ_Ｄは、一般に非特異的結合を表すと見なされる。ここで使用する抗原と“特異的に結合する”抗体は、該抗原および実質的に同一の抗原と、１０^−７Ｍ以下、好ましくは１０^−８Ｍ以下、よりさらに好ましくは５×１０^−９Ｍ以下、最も好ましくは１０^−８Ｍ〜１０^−１０Ｍ以下のＫ_Ｄを有することを意味する高親和性で結合するが、無関係の抗原と高親和性で結合しない抗体をいう。抗原は、ある抗原と高度な配列同一性を示すならば、例えば、その抗原の配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％以上の配列同一性を示すならば、その抗原と“実質的に同一”である。例として、ヒトＣＤ７３に特異的に結合する抗体はまたある非ヒト霊長類種(例えば、カニクイザル)からのＣＤ７３とも交差反応し得るが、他の種からのＣＤ７３とまたはＣＤ７３以外の抗原と交差反応し得ない。

【0131】

免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むが、これらに限定されない一般的に知られるアイソタイプのいずれか由来であり得る。ＩｇＧアイソタイプは、特定の種ではサブクラスに分割される：ヒトにおいてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ならびにマウスにおいてＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３。ある態様において、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブタイプのものである。免疫グロブリン、例えば、ヒトＩｇＧ１は、互いに最大で数アミノ酸異なる、いくつかのアロタイプで存在する。“抗体”は、例として、天然に存在するおよび天然に存在しない抗体の両者；モノクローナルおよびポリクローナル抗体；キメラおよびヒト化抗体；ヒトおよび非ヒト抗体；完全合成抗体；および単鎖抗体を含み得る。

【0132】

ここで使用する抗体の“抗原結合部分”なる用語は、抗原(例えば、ヒトＣＤ７３)に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上のフラグメントをいう。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントにより実施され得ることが示されている。抗体、例えば、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体の“抗原結合部分”なる用語に包含される結合フラグメントの例は、(ｉ)Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ(ａｂ’)_２フラグメント；(iii)Ｖ_ＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；(iv)抗体の単アームのＶ_ＬおよびＶ_ＨドメインからなるＦｖフラグメント；(ｖ)Ｖ_ＨドメインからなるｄＡｂフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)；および(vi)単離相補性決定領域(ＣＤＲ)または(vii)所望により合成リンカーで連結されていてよい、２以上の単離ＣＤＲの組み合わせを含む。さらに、Ｆｖフラグメント、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈの２個のドメインは別の遺伝子によりコードされるが、組み換え法を使用して、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域が単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られる一価分子を形成するように対形成する、単タンパク質鎖として製造されることを可能とする合成リンカーにより、連結できる(例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426; およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。このような単鎖抗体もまた、抗体の“抗原結合部分”なる用語に包含されることを意図する。これらおよび他の可能性のある構築物は、Chan & Carter (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301に記載されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られる慣用技術を使用して得られ、フラグメントは、インタクト抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技術またはインタクト免疫グロブリンの酵素もしくは化学開裂により生産される。

【0133】

“二特異性”または“二機能性抗体”は、異なる抗原に特異性を有する２抗原結合部位を生じる、２個の異なる重鎖／軽鎖対を有する人工的ハイブリッド抗体である。二特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメント連結を含む、多様な方法により産生できる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)参照。

【0134】

ここで使用する用語“モノクローナル抗体”は、特定のエピトープに単一結合特異性および親和性を示す抗体または抗体の組成物であって、その中の全抗体が特定のエピトープに単一結合特異性および親和性を示す組成物をいう。一般にこのようなモノクローナル抗体は、単一細胞または核酸コード化抗体に由来し、何らかの配列変更を意図的に導入することなく増殖される。したがって、用語“ヒトモノクローナル抗体”は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および所望により定常領域を有する、モノクローナル抗体をいう。ある態様において、ヒトモノクローナル抗体は、例えば、トランスジェニックまたは染色体導入非ヒト動物(例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウス)から得たＢ細胞を、不死化細胞に融合することにより得たハイブリドーマにより生産する。

【0135】

ここで使用する用語“組み換えヒト抗体”は、(ａ)ヒト免疫グロブリン遺伝子またはそれから製造したハイブリドーマに関してトランスジェニックまたは染色体導入である動物(例えば、マウス)から単離した抗体、(ｂ)抗体を発現するように形質転換した宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離した抗体、(ｃ)組み換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離した抗体および(ｄ)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含むあらゆる他の手段により製造、発現、創出または単離された抗体のような、組み換え手段により製造、発現、創出または単離されたすべてのヒト抗体を含む。このような組み換えヒト抗体は、特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を利用し、生殖系列遺伝子によりコードされるが、例えば、抗体成熟に、生じるその後の再配列および変異を含む、可変および定常領域を含む。当分野で知られるように(例えば、Lonberg (2005) Nature Biotech, 23(9):1117-1125参照)、可変領域は抗原結合ドメインを含み、これは、外来抗原に特異的な抗体を形成するように再配列される種々の遺伝子によりコードされる。再配列に加えて、可変領域は、複数の１アミノ酸変化(体細胞性変異または超変異と称する)によりさらに修飾されて、抗体の外来抗原に対する親和性が増加され得る。定常領域は、抗原に対するさらなる応答において変化する(すなわち、アイソタイプスイッチ)。それゆえに、抗原への応答において軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする再配列され、そして体細胞的に変異した核酸配列は、元の生殖系列配列と同一ではないかもしれないが、それでも実質的に同一または類似(すなわち、少なくとも８０％同一性を有する)している。

【0136】

“ヒト”抗体(ＨｕＭＡｂ)は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両者がヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である可変領域を有する抗体をいう。さらに、抗体が定常領域を含むならば、定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。ここに記載する抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含み得る(例えば、インビトロで無作為または部位特異的変異誘発によりまたはインビボで体細胞性変異により導入した変異)。しかしながら、ここで使用する用語“ヒト抗体”は、マウスのような他の哺乳動物種の生殖系列由来のＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。用語“ヒト”抗体および“完全ヒト”抗体は、同義的に使用される。

【0137】

“ヒト化”抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲドメイン外のアミノ酸のいくつか、大部分またはすべてが、ヒト免疫グロブリン由来の対応するアミノ酸で置き換えられる抗体をいう。抗体のヒト化形態のある態様において、ＣＤＲドメイン外のアミノ酸のいくつか、大部分またはすべてはヒト免疫グロブリンからのアミノ酸で置き換えられ、一方、１以上のＣＤＲ領域内のいくつか、大部分またはすべてのアミノ酸は未変化である。アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換または修飾は、それらが抗体の特定の抗原に結合する能力を消失させない限り、許容される。“ヒト化”抗体は、元の抗体に類似する抗原特異性を保持する。

【0138】

“キメラ抗体”は、可変領域がマウス抗体由来であり、定常領域がヒト抗体由来である抗体のような、可変領域がある種由来であり、定常領域が他の種由来である抗体をいう。

【0139】

“修飾重鎖定常領域”は、定常ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３を含む重鎖定常領域をいい、ここで、定常ドメインの１以上は異なるアイソタイプ(例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４)由来である。ある態様において、修飾定常領域は、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインおよびヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインに融合したヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインおよびヒトＩｇＧ２ヒンジを含む。ある態様において、このような修飾定常領域はまた、野生型アミノ酸配列に対して、ドメインの１以上においてアミノ酸修飾も含む。

【0140】

ここで、定常領域の同一性を示すことなく“ＣＤ７３.３”または“ＣＤ７３.４”として抗体をいうとき、特に断らない限り、ここに記載するいずれかの定常領域を有する、ＣＤ７３.３またはＣＤ７３.４の可変領域をそれぞれ有する抗体をいう。

【0141】

ここで使用する“アイソタイプ”は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体)をいう。

【0142】

“アロタイプ”は、特定のアイソタイプ群内の天然に存在するバリアントをいい、このバリアントは、数アミノ酸異なる(例えば、Jefferis et al., (2009) mAbs 1:1参照)。ここに記載する抗体は、任意のアロタイプであり得る。

【0143】

ここで特記しない限り、すべてのアミノ酸番号は、ＫａｂａｔシステムのＥＵ指数に従う(Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。

【0144】

用語“抗原を認識する抗体”および“抗原に特異的な抗体”は、ここでは、用語“抗原に特異的に結合する抗体”と相互交換可能に使用する。

【0145】

ここで使用する“単離抗体”は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいうことを意図する(例えば、ＣＤ７３に特異的に結合する単離抗体は、ＣＤ７３以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。ＣＤ７３のエピトープに特異的に結合する単離抗体は、しかしながら、異なる種由来の他のＣＤ７３タンパク質と交差反応性を有し得る。

【0146】

ここで使用する“ＣＤ７３を阻害する”抗体は、ＣＤ７３の生物学的および／または酵素機能を阻害する抗体をいう。これらの機能は、例えば、抗体がＣＤ７３酵素活性、例えば、アデノシンのＣＤ７３制御産生またはｃＡＭＰ産生減少を阻害する能力をいう。

【0147】

ここで使用する“内在化”抗体は、細胞表面抗原への結合により細胞膜を超える抗体をいう。内在化は、抗体が介在する受容体、例えば、ＣＤ７３の内在化を含む。ある態様において、抗体は、ＣＤ７３発現細胞へ約１０分以下のＴ_１／２の速度で“内在化”する。

【0148】

“エフェクター機能”は、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドの相互作用またはそれ由来の生化学的事象をいう。“エフェクター機能”の例は、Ｃｌｑ結合、補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞貪食(ＡＤＣＰ)のようなＦｃγＲ介在エフェクター機能ならびに細胞表面受容体(例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ)下方制御を含む。このようなエフェクター機能は、一般にＦｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と合わさることを必要とする。

【0149】

“Ｆｃ受容体”または“ＦｃＲ”は、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する受容体である。ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲは、対立遺伝子バリアントを含むＦｃγＲファミリーの受容体およびこれらの受容体の異接合型を含む。ＦｃγＲファミリーは、３個の活性化(マウスにおけるＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIIおよびＦｃγＲIV；ヒトにおけるＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲIIＡおよびＦｃγＲIIIＡ)および１個の阻害性(ＦｃγＲIIＢ)受容体からなる。ヒトＦｃγＲの種々の性質を表１に要約する。生得的エフェクター細胞型の大部分は、１以上の活性化ＦｃγＲおよび阻害性ＦｃγＲIIＢを共発現し、一方ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞は、マウスおよびヒトにおいて１活性化Ｆｃ受容体(マウスにおいてＦｃγＲIIIおよびヒトにおいてＦｃγＲIIIＡ)を選択的に発現するが、阻害性ＦｃγＲIIＢを発現しない。ヒトＩｇＧ１は大部分のヒトＦｃ受容体に結合し、それが結合する活性化Ｆｃ受容体のタイプに関して、マウスＩｇＧ２ａに対応すると考えられる。

【0150】

【表1】

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【0151】

“ヒンジ”、“ヒンジドメイン”または“ヒンジ領域”または“抗体ヒンジ領域”は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結する重鎖定常領域のドメインをいい、ヒンジの上部、中間部および下部部分を含む(Roux et al., J. Immunol. 1998 161:4083)。ヒンジは、抗体の結合領域とエフェクター領域の間に多様なレベルの柔軟性を提供し、また、２重鎖定常領域間の分子間ジスルフィド結合の部位も提供する。ここで使用するヒンジは、全ＩｇＧアイソタイプについてＧｌｕ２１６で始まり、Ｇｌｙ２３７で終わる(Roux et al., 1998 J Immunol 161:4083)。野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ヒンジの配列を表２および３１に示す。

【0152】

【表2】

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＊ ＣＨ１ドメインのＣ末端アミノ酸配列。

【0153】

用語“ヒンジ”は、野生型ヒンジ(例えば表２および３１に示すもの)ならびにそのバリアント(例えば、天然に存在しないヒンジまたは修飾ヒンジ)を含む。例えば、用語“ＩｇＧ２ヒンジ”は、表２に示すような野生型ＩｇＧ２ヒンジおよび１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５および／または最大５、４、３、２または１変異、例えば、置換、欠失または付加を有するバリアントを含む。ＩｇＧ２ヒンジバリアントの例は、１、２、３または全４システイン(Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｃ２２６およびＣ２２９)が他のアミノ酸に変えられているＩｇＧ２ヒンジを含む。特定の態様において、ＩｇＧ２はＣ２１９Ｓ置換を含む。ＩｇＧ２ヒンジは、またＣ２２０での置換またはＣ２１９およびＣ２２０両者での置換を含み得る。ＩｇＧ２ヒンジは、単独でまたは重鎖もしくは軽鎖の他の領域における１以上の置換と一体となって、抗体にＡまたはＢの形態を取らせる置換を含み得る(例えば、Allen et al., (2009) Biochemistry 48:3755参照)。ある態様において、ヒンジは、少なくとも２アイソタイプからの配列を含むハイブリッドヒンジである。例えば、ヒンジは、あるアイソタイプからの上部、中間部または下部ヒンジおよび１以上の他のアイソタイプからのヒンジの残り部分を含み得る。例えば、ヒンジはＩｇＧ２／ＩｇＧ１ヒンジであってよく、例えば、ＩｇＧ２の上部および中間部ヒンジならびにＩｇＧ１からの下部ヒンジを含み得る。ヒンジは、エフェクター機能を有しても、エフェクター機能を除かれてもよい。例えば、野生型ＩｇＧ１の下部ヒンジはエフェクター機能を提供する。

【0154】

用語“ＣＨ１ドメイン”は、重鎖定常ドメインにおける可変ドメインをヒンジに連結する重鎖定常領域をいう。ここで使用するＣＨ１ドメインは、Ａ１１８で始まり、Ｖ２１５で終わる。用語“ＣＨ１ドメイン”は、野生型ＣＨ１ドメイン(例えばＩｇＧ１について配列番号９８およびＩｇＧ２について配列番号１２４を有する)ならびにそのバリアント(例えば、天然に存在しないＣＨ１ドメインまたは修飾ＣＨ１ドメイン)を含む。例えば、用語“ＣＨ１ドメイン”は、野生型ＣＨ１ドメインおよびその１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５および／または最大５、４、３、２または１変異、例えば、置換、欠失または付加を有するバリアントを含む。ＣＨ１ドメインの例は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期のような抗体の生物学的活性を修飾する変異を伴うＣＨ１ドメインを含む。抗体の生物学的活性に影響するＣＨ１ドメインへの修飾がここで提供される。ＣＨ１ドメインは、置換Ｃ１３１Ｓを含んでよく、この置換は、ＩｇＧ２抗体またはヒンジおよび／またはヒンジとＣＨ１のようなＩｇＧ２抗体の少なくとも一部を含む抗体に、抗体のＡ形態ではなく、Ｂ形態を採らせる。

【0155】

用語“ＣＨ２ドメイン”は、重鎖定常ドメインにおけるヒンジをＣＨ３ドメインに連結する重鎖定常領域をいう。ここで使用するＣＨ２ドメインはＰ２３８で始まり、Ｋ３４０で終わる。用語“ＣＨ２ドメイン”は、野生型ＣＨ２ドメイン(例えばＩｇＧ１について配列番号１３７を有する；表３５)ならびにそのバリアント(例えば、天然に存在しないＣＨ２ドメインまたは修飾ＣＨ２ドメイン)を含む。例えば、用語“ＣＨ２ドメイン”は、野生型ＣＨ２ドメインおよびその１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５および／または最大５、４、３、２または１変異、例えば、置換、欠失または付加を有するバリアントを含む。ＣＨ２ドメインの例は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期のような抗体の生物学的活性を修飾する変異を伴うＣＨ２ドメインを含む。ある態様において、ＣＨ２ドメインは、エフェクター機能を低減させる置換Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓを含む。抗体の生物学的活性に影響するＣＨ２ドメインへの他の修飾がここで提供される。

【0156】

用語“ＣＨ３ドメイン”は、重鎖定常ドメインにおけるＣＨ２ドメインに対してＣ末端である重鎖定常領域である。ここで使用するＣＨ３ドメインはＧ３４１で始まり、Ｋ４４７で終わる。用語“ＣＨ３ドメイン”は、野生型ＣＨ３ドメイン(例えばＩｇＧ１について配列番号１３８を有する；表３５)ならびにそのバリアント(例えば、天然に存在しないＣＨ３ドメインまたは修飾ＣＨ３ドメイン)を含む。例えば、用語“ＣＨ３ドメイン”は、野生型ＣＨ３ドメインおよびその１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５および／または最大５、４、３、２または１変異、例えば、置換、欠失または付加を有するバリアントを含む。ＣＨ３ドメインの例は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期のような抗体の生物学的活性を修飾する変異を伴うＣＨ３ドメインを含む。抗体の生物学的活性に影響するＣＨ３ドメインへの修飾がここで提供される。

【0157】

“ＣＬドメイン”は、軽鎖の定常ドメインをいう。用語“ＣＬドメイン”は野生型ＣＬドメインおよびそのバリアント、例えば、Ｃ２１４Ｓを含むバリアント。

【0158】

“天然配列Ｆｃ領域”または“天然配列Ｆｃ”は、天然に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域；および天然配列ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ならびに天然に存在するそのバリアントを含む。天然配列Ｆｃは、Ｆｃの種々のアロタイプを含む(例えば、Jefferis et al., (2009) mAbs 1:1参照)。

【0159】

用語“エピトープ”または“抗原決定基”は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原(例えば、ＣＤ７３)上の部位をいう。タンパク質抗原内のエピトープは、隣接アミノ酸(通常直線状エピトープ)またはタンパク質の３次元折り畳みにより並置される非隣接アミノ酸(通常立体エピトープ)の両者から形成され得る。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは、一般に、しかし常にではないが、変性溶媒に曝されても保持され、一方３次元折り畳みから形成されるエピトープは、変性溶媒での処理により一般に失われる。エピトープは、一般に独特の空間的立体構造の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸を含む。どのエピトープがある抗体により結合されるかを決定する方法(すなわち、エピトープマッピング)は当分野で周知であり、例えば、免疫ブロット法および免疫沈降アッセイを含み、ここで、重複または隣接ペプチド(例えば、ＣＤ７３から)は、ある抗体(例えば、抗ＣＤ７３抗体)との反応性について試験される。エピトープの空間的立体構造を決定する方法は、文献におけるおよびここに記載する技術、例えば、ｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴およびＨＤＸ−ＭＳを含む(例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)参照)。

【0160】

用語“エピトープマッピング”は、抗体−抗原認識に関与する抗原の分子決定基を同定する工程をいう。

【0161】

２以上の抗体に関する“同一エピトープに結合する”なる用語は、これら抗体が、ある方法により決定して、アミノ酸残基の同一セグメントに結合することを意味する。抗体がここに記載する抗体と“ＣＤ７３上の同一エピトープ”に結合するか否かを決定する技術は、例えば、エピトープおよび水素／重水素交換マススペクトロメトリー(ＨＤＸ−ＭＳ)の原子分解能を提供する、抗原：抗体複合体の結晶のｘ線分析のようなエピトープマッピング法を含む。他の方法は、抗原フラグメント(例えばタンパク分解性フラグメント)へのまたは変異させた種々の抗原への抗体の結合をモニターし、ここで、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾による結合の消失がしばしばエピトープ構成成分と考えられる(例えばアラニンスキャニング変異誘発 − Cunningham & Wells (1985) Science 244:1081)。さらに、コンピューターによるエピトープマッピングのためのコンビナトリアル法も使用できる。これらの方法は、目的の抗体が、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから特異的短ペプチドを親和性単離する能力を利用する。

【0162】

“標的への結合について他の抗体と競合する”抗体は、標的への他方の抗体の結合を(部分的にまたは完全に)阻害する抗体をいう。２抗体が標的への結合について互いに競合するか、すなわち、ある抗体が他方の抗体の標的への結合を阻害するか否かかつどの程度阻害するかは、例えば、実施例に記載するような既知競合実験を使用して決定し得る。ある態様において、抗体は、他方の抗体の標的への結合と少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％競合し、阻害する。阻害または競合のレベルは、どの抗体が“遮断抗体”(すなわち、標的と最初にインキュベートする冷抗体)であるかにより変わり得る。競合アッセイは、例えば、Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277またはChapter 11 of “Using Antibodies” by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999に記載のように実施できる。競合抗体は、同一エピトープ、重複エピトープまたは隣接エピトープ(例えば、立体障害により証明されるように)に結合する。

【0163】

他の競合的結合アッセイは、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、固相直接または間接エンザイムイムノアッセイ(ＥＩＡ)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)参照)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)参照)；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)参照)；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ(Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)参照)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Cheung et al., Virology 176:546 (1990))；および直接標識ＲＩＡ(Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990))を含む。

【0164】

ここで使用する用語“特異的結合”、“選択的結合”、“選択的に結合する”および“特異的に結合する”は、所定の抗原上のエピトープに結合するが、他の抗原には結合しない抗体をいう。一般に、抗体は、(ｉ)例えば、所定の抗原、例えば、組み換えヒトＣＤ７３を検体として、かつ抗体をリガンドとして使用するＢＩＡＣＯＲＥ^{(登録商標)}２０００表面プラズモン共鳴装置における表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)テクノロジーでまたは抗体の抗原陽性細胞への結合のスキャッチャード分析により決定して、約１０^−７Ｍ未満、例えば、約１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍまたは１０^−１０Ｍ未満またはそれより小さい平衡解離定数(Ｋ_Ｄ)で結合するおよび(ii)所定の抗原に、所定の抗原または密接に関係する抗原以外の非特異的抗原(例えば、ＢＳＡ、カゼイン)への結合について親和性より少なくとも２倍大きい親和性で結合する。したがって、特に断らない限り、“ヒトＣＤ７３に特異的に結合する”抗体は、１０^−７Ｍ以下、例えば、約１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍまたは１０^−１０Ｍ未満またはそれより小さいＫ_Ｄで可溶性または細胞結合型ヒトＣＤ７３に結合する抗体をいう。“カニクイザルＣＤ７３と交差反応する”抗体は、１０^−７Ｍ以下、１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍまたは１０^−１０Ｍ未満またはそれより小さいＫ_ＤでカニクイザルＣＤ７３と結合する抗体をいう。ある態様において、非ヒト種由来のＣＤ７３と交差反応しない抗体は、標準結合アッセイにおいて、これらのタンパク質に対して本質的に検出不可能な結合を示す。

【0165】

ここで使用する用語“ｋ_{ａｓｓｏｃ}”または“ｋ_ａ”は、特定の抗体−抗原相互作用の結合速度定数をいうことを意図し、一方ここで使用する用語“ｋ_ｄｉｓ”または“ｋ_ｄ”は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数をいうことを意図する。ここで使用する用語“Ｋ_Ｄ”は、平衡解離定数をいうことを意図し、これはｋ_ｄ対ｋ_ａ比(すなわちｋ_ｄ／ｋ_ａ)から得られ、モル濃度(Ｍ)により表される。抗体のＫ_Ｄ値は、当分野で十分に確立されている方法を使用して決定できる。抗体のＫ_Ｄを決定するための好ましい方法は、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ(登録商標)表面プラズモン共鳴システムまたはフローサイトメトリーのようなバイオセンサーシステムを使用する、表面プラズモン共鳴およびスキャッチャード分析による。

【0166】

抗体またはその抗原結合フラグメントを使用するインビトロまたはインビボアッセイの文脈における用語“ＥＣ_５０”は、最大応答の５０％、すなわち、最大応答とベースラインの真ん中の応答を誘発する、抗体またはその抗原結合部分の濃度をいう。

【0167】

抗体、例えば、抗ＣＤ７３抗体が介在する、抗体または受容体、例えば、ＣＤ７３の“内在化の速度”は、例えば、実施例に示すように、例えば、内在化のＴ_１／２により表され得る。抗ＣＤ７３抗体の内在化の速度は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍以上増強または増大され得て、抗体の重鎖定常領域の修飾重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを含むものへの変更により、Ｔ_１／２の少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍以上の低減をもたらす。例えば、１０分のＴ_１／２を有する代わりに、修飾重鎖定常領域は内在化の速度を増大し、それゆえにＴ_１／２を５分に減少し得る(すなわち、内在化の速度の２倍増加またはＴ_１／２の２倍減少)。“Ｔ_１／２”は、抗体を細胞に添加してから測定して、最大内在化の半分が達成される時間として定義される。内在化の最大レベルは、抗体濃度に対してプロットした内在化を表すグラフでプラトーである内在化レベルであり得る。修飾重鎖定常領域は、抗体の内在化の最大レベルを、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍以上高め得る。修飾重鎖定常領域を伴う抗体と伴わない同一抗体のような異なる抗体の内在化有効性を比較する他の方法は、ある抗体濃度(例えば、１００nM)またはある時間(例えば、２分、５分、１０分または３０分)での内在化レベルの比較である。内在化レベルの比較はまた、内在化のＥＣ_５０レベル比較によっても実施できる。ある抗体の内在化のレベルを、ある(対照)抗体、例えば、ここに記載する抗体、例えば、１１Ｆ１１またはＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１またはＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆに対して定義でき、当該(対照)抗体により得られた値のパーセンテージとして示し得る。内在化の程度は、これらの方法のいずれかにより比較して、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍以上増強され得る。

【0168】

物体に対して適用するここで使用する用語“天然に存在する”は、物体が天然に見ることができるという事実をいう。例えば、天然源から単離でき、実験室で人間により意図的に修飾されていない生物(ウイルスを含む)に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。

【0169】

“ポリペプチド”は、少なくとも２個の連続的に連結されたアミノ酸残基を含む鎖をいい、鎖の長さの上限はない。タンパク質の１以上のアミノ酸残基は、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合のような、しかし、これらに限定されない修飾を含んでよい。“タンパク質”は、１以上のポリペプチドを含み得る。

【0170】

ここで使用する用語“核酸分子は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよく、そしてｃＤＮＡであり得る。

【0171】

また提供されるのは、ここに記載する配列番号で示す配列の“保存的配列修飾”、すなわち、該ヌクレオチド配列によりコードされるまたは該アミノ酸配列を含む抗体の抗原への結合を消失させないヌクレオチドおよびアミノ酸配列修飾である。このような保存的配列修飾は、保存的ヌクレオチドおよびアミノ酸置換、ならびに、ヌクレオチドおよびアミノ酸付加および欠失を含む。例えば、修飾は、ここに記載する配列番号に、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発のような当分野で知られる標準技術により導入され得る。保存的配列修飾は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる保存的アミノ酸置換を含む。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。それゆえに、抗ＣＤ７３抗体の予想される非必須アミノ酸残基を、好ましくは同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基に置き換える。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当分野で周知である(例えば、Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng, 12(10):879-884 (1999); およびBurks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)参照)。

【0172】

あるいは、他の態様において、変異を、飽和変異誘発によるような、抗ＣＤ７３抗体コード化配列のすべてまたは一部に添って導入でき、得られた修飾抗ＣＤ７３抗体を、結合活性の改善についてスクリーニングし得る。

【0173】

核酸について、用語“実質的相同性”は、２個の核酸またはその指定配列が、最適にアラインし、比較したとき、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴い、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常ヌクレオチドの少なくとも約９０％〜９５％以上、好ましくは少なくとも約９８％〜９９.５％が同一であることを示す。あるいは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で、鎖の相補体とハイブリダイズするとき、実質的相同性が存在する。

【0174】

ポリペプチドに関して、用語“実質的相同性”は、２個のポリペプチドまたはその指定配列が、最適にアラインし、比較したとき、適切なアミノ酸挿入または欠失を伴い、アミノ酸の少なくとも約８０％、通常アミノ酸少なくとも約９０％〜９５％以上、好ましくは少なくとも約９８％〜９９.５％が同一であることを示す。

【0175】

２配列間の同一性パーセントは、配列を最適にアラインしたとき、これら配列により共有される同一位置の関数であり(すなわち、相同性％＝同一位置の数／位置の総数×１００)、最適アラインメントは、２配列の最適アラインメントのために導入することが必要であったギャップ数および各ギャップの長さを考慮して決定する。配列の比較および２配列間の同一性パーセントの決定は、下の非限定的例に記載するような、数学的アルゴリズムを使用して達成できる。

【0176】

２ヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comから入手可能)におけるＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ.ＣＭＰマトリクスおよびギャップ荷重４０、５０、６０、７０または８０および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用して決定できる。２ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)に取り込まれているE. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989))のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０荷重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して、決定できる。さらに、２アミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comから入手可能)におけるＧＡＰプログラムに取り込まれているNeedleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかおよびギャップ荷重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用して決定できる。

【0177】

ここに記載する核酸およびタンパク質配列を、さらに“クエリー配列”として使用して、例えば、関連配列を同定するために公的データベースに対して検索を実施できる。このような検索は、Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(version 2.0)を使用して実施できる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ここに記載する核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、単語長＝１２で実施できる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ここに記載するタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、単語長＝３で実施できる。比較目的でギャップ付アラインメントを得るために、ギャップ付ＢＬＡＳＴを、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のように実施できる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付ＢＬＡＳＴプログラムを使用するとき、各プログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ)のデフォルトパラメータを使用できる。www.ncbi.nlm.nih.gov参照。

【0178】

核酸は細胞全体、細胞ライセートまたは一部精製したまたは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当分野で周知のその他を含む標準技術により、他の細胞成分または他の汚染物、例えば、他の細胞核酸(例えば、他の部分の染色体)またはタンパク質から精製されたとき、“単離された”または“実質的に純粋にされた”。F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)参照。

【0179】

核酸、例えば、ｃＤＮＡを、遺伝子配列を提供するために、標準技術により変異させ得る。コード化配列について、これらの変異は、所望によりアミノ酸配列に影響し得る。特に、天然Ｖ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチおよびここに記載する他のこのような配列と実質的に相同であるまたはそれに由来するＤＮＡ配列が企図される。

【0180】

ここで使用する用語“ベクター”は、それが連結している他の核酸の輸送が可能である核酸分子をいうことを意図する。ベクターの１タイプは“プラスミド”であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントをライゲートし得る環状二本鎖ＤＮＡループをいう。他のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。あるベクターは、それらが導入された宿主細胞内で自律増殖が可能である(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入により宿主細胞のゲノムに統合され得て、それゆえに宿主ゲノムと共に増殖される。さらに、あるベクターは、操作可能に連結している遺伝子の発現の指示が可能である。このようなベクターは、ここでは“組み換え発現ベクター”(または単に“発現ベクター”)を呼ぶ。一般に、組み換えＤＮＡ技術に有用である発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形である。本明細書において、“プラスミド”および“ベクター”は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるため、相互交換可能に使用され得る。しかしながら、また包含されるのは、等価な機能を提供するウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)のような他の形態の発現ベクターである。

【0181】

ここで使用する用語“組み換え宿主細胞”(または単に“宿主細胞”)は、細胞に天然では存在しない核酸を含む細胞およびおそらく組み換え発現ベクターが導入されている細胞をいうことを意図する。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫もいうことを意図することは理解すべきである。ある修飾が変異または環境の影響により次世代に生じ得ないため、このような子孫は、実際、親細胞と同一ではないかもしれないが、なお、ここで使用する用語“宿主細胞”の範囲内に包含される。

【0182】

ここで使用する用語“抗原”は、タンパク質、ペプチドまたはハプテンのようなあらゆる天然または合成免疫原性物質をいう。抗原は、ＣＤ７３またはそのフラグメントであり得る。

【0183】

“免疫応答”は、外来因子に対する脊椎動物内の生物学的応答をいい、該応答は、生物をこれらの因子およびそれが原因の疾患から守る。免疫応答は、免疫系の細胞(例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞または好中球)およびこれらの細胞のいずれかまたは肝臓により産生される可溶性巨大分子(抗体、サイトカインおよび補体を含む)の作用が介在し、侵入病原体、病原体に感染された細胞または組織、癌性のまたは他の異常細胞、または、自己免疫または病理学的炎症の場合、正常ヒト細胞または組織を選択的ターゲティングし、結合し、損傷し、破壊しおよび／または脊椎動物体内から排除する。免疫応答または反応は、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋ Ｔ細胞のようなエフェクターＴ細胞またはＴｈ細胞の活性化または阻害またはＴ_ｒｅｇ細胞の阻害を含む。

【0184】

“免疫調節剤”または“免疫調整剤”は、免疫応答の調節、制御または修飾に関与し得る、因子、例えば、シグナル伝達経路の成分をいう。免疫応答の“調節”、“制御”または“修飾”は、免疫系の細胞またはこのような細胞(例えば、エフェクターＴ細胞)の活性の何らかの変更をいう。このような調節は、種々の細胞型の数の増減、これらの細胞の活性の増減または免疫系内で生じ得る何らかの他の変化により顕在化し得る、免疫系の刺激または抑制を含む。阻害性および刺激性免疫調節剤の両者が同定されており、そのいくつかは、腫瘍微小環境において増強された機能を有し得る。免疫調節剤は、Ｔ細胞の表面に位置し得る。“免疫調節性標的”または“免疫調整性標的”は、物質、薬剤、成分、化合物または分子による結合のために標的化され、その活性が該結合により改変される、免疫調節剤である。免疫調節性標的は、例えば、細胞表面の受容体(“免疫調節性受容体”)および受容体リガンド(“免疫調節性リガンド”)を含む。

【0185】

免疫応答または免疫系を刺激する能力の増加は、Ｔ細胞共刺激性受容体のアゴニスト活性増強および／または阻害性受容体のアンタゴニスト活性増強に由来し得る。免疫応答または免疫系を刺激する能力の増加は、免疫応答を測定するアッセイ、例えば、サイトカインまたはケモカイン放出、細胞溶解性活性(標的細胞で直接的にまたはＣＤ１０７ａもしくはグランザイムの検出により間接的に決定)および増殖の変化を測定するアッセイにおける、ＥＣ_５０または最大レベルの活性の増加倍率により反映され得る。免疫応答または免疫系活性を刺激する能力は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍以上増強され得る。

【0186】

“免疫療法”は、免疫応答を誘発、増強、抑制または他に修飾することを含む方法による、疾患を有するまたはそれに罹患するもしくは再発するリスクのある対象の処置をいう。

【0187】

“免疫刺激療法”または“免疫刺激性療法”は、例えば、癌を処置するための、対象における免疫応答の増加(誘発または増強)を引き起こす治療をいう。

【0188】

“内在性免疫応答の増強”は、対象における既存の免疫応答の有効性または効力の増大を意味する。有効性および効力のこの増大は、例えば、内在性宿主免疫応答を抑制する機能を克服することによりまたは内在性宿主免疫応答を増強する機構を刺激することにより達成され得る。

【0189】

“Ｔエフェクター”(“Ｔ_ｅｆｆ”)細胞は、細胞溶解性活性を伴うＴ細胞(例えば、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞)ならびにサイトカインを分泌し、他の免疫細胞を活性化および指示するＴヘルパー(Ｔｈ)細胞をいうが、制御性Ｔ細胞(Ｔ_ｒｅｇ細胞)は含まない。

【0190】

ここで使用する用語“連結”は、２以上の分子の結合をいう。結合は共有結合でも非共有結合でもよい。結合は、また遺伝子的(すなわち、組換え融合)であり得る。このような結合は、化学的結合および組み換えタンパク質生産のような多種多様な当分野で認識される技術を使用して達成できる。

【0191】

ここで使用する“投与する”は、当業者に知られる種々の方法および送達系のいずれかを使用した、治療剤を含む組成物の対象への物理的導入をいう。ここに記載する抗体のための好ましい投与経路は、例えば注射または点滴による、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路を含む。ここで使用する用語“非経腸投与”は、経腸および局所投与以外の、通常注射による、投与方式をいい、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴、ならびにインビボエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない。あるいは、ここに記載する抗体は、局所、上皮または粘膜投与経路のような非経腸ではない経路、例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下にまたは局所的に投与され得る。投与はまた、例えば、１回、複数回および／または１回以上の長期にわたり実施してもよい。

【0192】

ここで使用する用語“Ｔ細胞介在応答”は、エフェクターＴ細胞(例えば、ＣＤ８^＋細胞)およびヘルパーＴ細胞(例えば、ＣＤ４^＋細胞)を含む、Ｔ細胞が介在する応答をいう。Ｔ細胞介在応答は、例えば、Ｔ細胞−細胞毒性および増殖を含む。

【0193】

ここで使用する用語“細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)応答”は、細胞毒性Ｔ細胞により誘発される免疫応答をいう。ＣＴＬ応答は、主にＣＤ８^＋ Ｔ細胞により介在される。

【0194】

ここで使用する用語“阻害”または“遮断”(例えば、ＣＤ７３結合または活性の阻害／遮断参照)は、相互交換可能に使用され、部分的および完全阻害／遮断の両者を含む。

【0195】

ここで使用する“癌”は、体内の異常細胞の無制御の増殖により特徴付けられる広い疾患群をいう。無制御の細胞分裂は、隣接組織に浸潤し、リンパ系または血流を介して体の離れた部分に転移し得る、悪性腫瘍または細胞の形成を引き起こし得る。

【0196】

ここで使用する用語“処置”および“処置する”は、症状、合併症、状態または疾患と関係する生化学的兆候の進行、進展、重症度または再発を逆転させる、軽減する、寛解させる、阻止するまたは減速させるまたは予防する目的で、対象に実施されるあらゆるタイプの介入または過程または活性剤の投与をいう。予防は、疾患が生じるのを予防する、または生じてもその影響を最小限にするための、疾患を有していない対象への投与をいう。

【0197】

“造血器腫瘍”は、リンパ腫、白血病、骨髄腫またはリンパ系悪性腫瘍ならびに脾臓およびリンパ節の癌を含む。リンパ腫の例は、Ｂ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫の両者を含む。Ｂ細胞リンパ腫は、ホジキンリンパ腫および大部分非ホジキンリンパ腫の両者を含む。Ｂ細胞リンパ腫の非限定的例は、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ性リンパ腫(慢性リンパ性白血病と重複)、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)、バーキットリンパ腫、縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾性辺縁帯リンパ腫、血管内大Ｂ細胞リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症を含む。Ｔ細胞リンパ腫の非限定的例は、節外性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚性Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫および血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫を含む。血液系腫瘍は、また、二次性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病のような、しかし、これらに限定されない白血病も含む。血液系腫瘍は、さらに、多発性骨髄腫およびくすぶり型多発性骨髄腫のような、しかし、これらに限定されない骨髄腫を含む。他の血液学的および／またはＢ細胞またはＴ細胞関連癌は、用語造血器腫瘍により包含される。

【0198】

用語“有効量”または“有効用量”は、所望の効果を達成するまたは少なくとも部分的に達成するのに十分な量として定義される。薬物または治療剤の“治療有効量”または“治療有効用量”は、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて使用したとき、疾患症状の重症度の軽減、無疾患症状期間の頻度および期間の増大または疾患罹患による機能障害もしくは身体障害の予防により証明される疾患退縮を促す、薬物の量である。薬物の“予防有効量”または“予防有効用量”は、疾患を発症するまたは疾患を再発するリスクのある対象に単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与したとき、疾患の発症または再発を阻止する、薬物の量である。治療剤または予防剤が疾患退縮を促すまたは疾患の発症または再発を阻止する能力は、臨床試験中ヒト対象において、ヒトでの有効性を予測する動物モデルシステムにおいてまたはインビトロアッセイにおける薬剤の活性のアッセイによるような、当業者に知られる多様な方法を使用して評価できる。

【0199】

例として、抗癌剤は、対象における癌進行を遅延させるまたは癌退縮を促す薬物である。好ましい態様において、薬物の治療有効量は、癌を排除するところまで、癌退縮を促す。“癌退縮を促す”は、薬物有効量の、単独または抗新生物剤と組み合わせた投与が、患者において、腫瘍増殖またはサイズの低減、腫瘍の壊死、少なくとも一つの疾患症状の重症度の低減、無疾患症状期間の頻度および期間の増大、疾患罹患による機能障害もしくは身体障害の予防または疾患症状の他の改善をもたらすことを意味する。薬理学的有効性は、薬物が患者における癌退縮を促す能力である。生理学的安全性は、薬物投与に起因する、細胞、臓器および／または生物レベルでの容認できる低レベルの毒性または他の有害生理作用(有害作用)をいう。

【0200】

腫瘍処置に関する例として、治療有効量または用量の薬物は、好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を、未処置対象と比較して少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、よりさらに好ましくは少なくとも約６０％、なお好ましくは少なくとも約８０％阻害する。最も好ましい態様において、治療有効量または用量の薬物は、細胞増殖または腫瘍増殖を完全に阻害する、すなわち、好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を１００％阻害する。化合物が腫瘍増殖を阻害する能力は、下記アッセイを使用して評価できる。あるいは、組成物のこの性質を、化合物が細胞増殖を阻害する能力を試験することにより評価でき、このような阻害は、当業者に知られるアッセイによりインビトロで測定できる。ここに記載する他の好ましい態様において、腫瘍退縮が観察でき、少なくとも約２０日、より好ましくは少なくとも約４０日またはよりさらに好ましくは少なくとも約６０日の期間継続し得る。

【0201】

用語“患者”および“対象”は、予防的または治療的処置を受けるあらゆるヒトまたは非ヒト動物をいう。例えば、ここに記載する方法および組成物を、癌を有する対象の処置に使用できる。用語“非ヒト動物”は、全脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などのような、哺乳動物および非哺乳動物を含む。

【0202】

ここに記載する種々の面を、次のサブセクションにおいてさらに詳細に記載する。

【0203】

Ｉ. 抗ＣＤ７３抗体
ここに記載するのは、特定の機能的特徴または性質により特徴付けられる抗体、例えば、完全ヒト抗体である。例えば、抗体は、ヒトＣＤ７３に特異的に結合する。さらに、抗体は、カニクイザルＣＤ７３のような１以上の非ヒト霊長類からのＣＤ７３と交差反応し得る。

【0204】

可溶性および／または膜結合型ヒトＣＤ７３への特異的結合に加えて、ここに記載する抗体は、次の機能的性質の１以上を示す：
(ａ)産生されるアデノシンを減少させる、ＣＤ７３酵素活性の阻害；
(ｂ)ｃｙｎｏ ＣＤ７３への結合；
(ｃ)細胞、例えば、腫瘍細胞への抗体介在ＣＤ７３内在化；および
(ｄ)ヒトＣＤ７３のアミノ酸６５〜８３および１５７〜１７２を含む立体エピトープへの結合。

【0205】

好ましくは、抗ＣＤ７３抗体は、ヒトＣＤ７３(単量体または二量体；アイソフォーム１または２)に、高親和性で、例えば、１０^−７Ｍ以下、１０^−８Ｍ以下、１０^−９Ｍ以下、１０^−１０Ｍ以下、１０^−１１Ｍ以下、１０^−１２Ｍ以下、１０^−１２Ｍ〜１０^−７Ｍ、１０^−１１Ｍ〜１０^−７Ｍ、１０^−１０Ｍ〜１０^−７Ｍ、１０^−９Ｍ〜１０^−７Ｍまたは１０^−１０Ｍ〜１０^−８ＭのＫ_Ｄで結合する。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、可溶性ヒトＣＤ７３に、例えば、BIACORE^{(登録商標)}SPR分析により決定して、１０^−７Ｍ以下、１０^−８Ｍ以下、１０^−９Ｍ(１nM)以下、１０^−１０Ｍ以下、１０^−１２Ｍ〜１０^−７Ｍ、１０^−１１Ｍ〜１０^−７Ｍ、１０^−１０Ｍ〜１０^−７Ｍ、１０^−９Ｍ〜１０^−７Ｍ、１０^−８Ｍ〜１０^−７Ｍまたは１０^−１０Ｍ〜１０^−８ＭのＫ_Ｄで結合する。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、結合型(例えば、細胞膜結合型、例えば、Ｃａｌｕ６細胞)ヒトＣＤ７３に、例えば、ここにさらに記載するように決定して、１nM未満のＥＣ_５０で結合する。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、結合型ヒトＣＤ７３、例えば、細胞膜結合型ヒトＣＤ７３に、例えば、フローサイトメトリーおよびスキャッチャードプロットで決定して、１０^−７Ｍ以下、１０^−８Ｍ以下、１０^−９Ｍ(１nM)以下、１０^−１０Ｍ以下、１０^−１２Ｍ〜１０^−７Ｍ、１０^−１１Ｍ〜１０^−８Ｍ、１０^−１０Ｍ〜１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ〜１０^−８Ｍ、１０^−１１Ｍ〜１０^−９Ｍ、１０^−１０Ｍ〜１０^−８Ｍまたは１０^−１０Ｍ〜１０^−９ＭのＫ_Ｄで結合する。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、可溶性ヒトＣＤ７３に、１０^−７Ｍ以下、１０^−８Ｍ以下、１０^−９Ｍ(１nM)以下、１０^−１０Ｍ以下、１０^−１２Ｍ〜１０^−７Ｍ、１０^−１１Ｍ〜１０^−７Ｍ、１０^−１０Ｍ〜１０^−７Ｍ、１０^−９Ｍ〜１０^−７Ｍ、１０^−１０Ｍ〜１０^−８Ｍまたは１０^−８Ｍ〜１０^−７ＭのＫ_Ｄでおよび結合型ヒトＣＤ７３、例えば、細胞膜結合型ヒトＣＤ７３に１０^−７Ｍ以下、１０^−８Ｍ以下、１０^−９Ｍ(１nM)以下、１０^−１０Ｍ以下、１０^−１２Ｍ〜１０^−７Ｍ、１０^−１１Ｍ〜１０^−８Ｍ、１０^−１０Ｍ〜１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ〜１０^−８Ｍ、１０^−１１Ｍ〜１０^−９Ｍまたは１０^−１０Ｍ〜１０^−９ＭのＫ_ＤまたはＥＣ_５０で結合する。

【0206】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、ｃｙｎｏ ＣＤ７３に高親和性で結合し、例えば、ｃｙｎｏ ＣＤ７３を発現するＣＨＯ細胞に、例えば、さらにここに記載するように決定して、０.１nM〜１０nMのＥＣ_５０で、例えば、１nM未満のＥＣ_５０で結合する。

【0207】

ある態様において、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体はまたカニクイザルＣＤ７３に結合し、例えば、膜結合型カニクイザルＣＤ７３に、例えば、ｃｙｎｏ ＣＤ７３を発現するＣＨＯ細胞に、例えば、実施例におけるように測定して、１００nM以下、１０nM以下、１nM以下、１００nM〜０.０１nM、１００nM〜０.１nM、１００nM〜１nMまたは１０nM〜０.１nMのＥＣ_５０で結合する。

【0208】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、ＳＥＣにより決定して、少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％単量体である。抗ＣＤ７３抗体はまた、ここに記載する抗体に類似するまたはその範囲内である、生物物理学的特徴も有し得る。

【0209】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、実施例においてさらに記載するように、例えば、ＣＤ７３ビーズ結合アッセイで決定してまたは細胞、例えば、Ｃａｌｕ６、ＳＫＭＥＬ２４もしくはＨ２９２細胞で決定してまたはインビボアッセイ、例えば、異種移植腫瘍モデルで決定して、ヒトおよび／またはｃｙｎｏ ＣＤ７３の酵素活性を阻害する。抗ＣＤ７３抗体は、ここに記載する抗体と少なくとも類似するまたはその範囲である阻害性活性を有し得る。例えば、抗ＣＤ７３抗体は、ヒトＣＤ７３(例えば、固体に結合したＣＤ７３)酵素活性(アデノシン産生)を、１０nM未満または５nM未満または１〜１０nMまたは５〜１０nMの範囲のＥＣ_５０で阻害し得る。抗ＣＤ７３抗体は、細胞、例えば、Ｃａｌｕ６細胞に対するヒトＣＤ７３の活性を、１０nM未満または１nM未満または０.１〜１０nM、０.１〜１nMまたは０.１〜０.５nMの範囲のＥＣ_５０で阻害する。

【0210】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、実施例においてさらに記載するように、例えば、高容量内在化アッセイまたはＦＡＣＳまたはフローサイトメトリーで決定して、それが結合する細胞により内在化される(そしてＣＤ７３内在化に介在する)。抗ＣＤ７３抗体は、実施例に記載する抗体と少なくとも類似するまたはその範囲内にある内在化特徴(ＥＣ_５０、Ｔ_１／２およびＹ_ｍａｘ)およびプラトーまでの時間を有し得る。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、高容量内在化アッセイ(実施例６Ａに記載)により決定して、１以上の細胞株、例えば、実施例で示すものにおいて、１時間未満、例えば、３０分未満、１５分未満、１２分未満、１０分未満、７分未満またはさらに５分未満である内在化のＴ_１／２を有する。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、例えば実施例６Ａに記載する、高容量内在化アッセイを使用してまたは、例えば実施例６Ｂに記載する、フローサイトメトリーを使用して、例えば、決定して、最大抗ＣＤ７３抗体介在内在化に、１０時間以下、６時間以下、５時間以下、４時間以下、３時間以下、２時間以下、１時間以下、例えば、１０分〜１０時間、１０分〜６時間、１時間〜１０時間または１時間〜６時間の範囲で到達する。ＣＤ７３の抗ＣＤ７３抗体介在内在化の最大レベルは、細胞型により、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％以上であり得る。例えば、Ｃａｌｕ６細胞におけるＣＤ７３の抗ＣＤ７３抗体介在内在化のＥＣ_５０は、実施例に記載する高容量内在化アッセイで測定して、１０nM未満、例えば、０.１〜１０nMまたは１〜１０nMまたは１〜５nMであり、少なくとも９０％または少なくとも９５％のＹ_ｍａｘであり得る。

【0211】

抗ＣＤ７３抗体、例えば、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインまたはＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを有する抗体は、例えば、実施例６Ａに記載する、高容量内在化アッセイで測定して、次のＣＤ７３内在化特徴に介在する：
− １０nM以下、５nM以下、１nM以下または０.１〜１０nMまたは０.１〜１nMのＥＣ_５０；Ｃａｌｕ６細胞における少なくとも９０％、９５％または９８％のＹ_ｍａｘ(内在化の最大パーセンテージ)およびＣａｌｕ６細胞における３０分未満または１０分未満のＴ_１／２；
− ヒト細胞、例えば、Ｃａｌｕ６細胞、ＨＣＣ４４細胞、Ｈ２０３０細胞、Ｈ２２２８細胞、ＨＣＣ１５細胞、ＳＫＬＵ１細胞、ＳＫＭＥＳ１細胞またはＳＷ９００細胞における３０分未満または１０分未満のＴ_１／２。

【0212】

抗ＣＤ７３抗体、例えば、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインまたはＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを有する抗体は、例えば、実施例６Ｂに記載する、フローサイトメトリーにより測定して、次のＣＤ７３内在化特徴に介在する：
− Ｃａｌｕ６細胞における１時間以下のＴ_１／２および少なくとも７０％のＹ_ｍａｘ；
− ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞における３０分以下のＴ_１／２および少なくとも７０％のＹ_ｍａｘ；
− ＳＮＵＣ１細胞における２時間以下のＴ_１／２および少なくとも３０％のＹ_ｍａｘ；および／または
− ＮＣＩ−Ｈ１４３７細胞における３０分以下のＴ_１／２および少なくとも６０％のＹ_ｍａｘ。

【0213】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、ビン１抗体であり、すなわち、ヒトＣＤ７３への結合について１１Ｆ１１と競合するが、４Ｃ３とはしない。

【0214】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、実施例においてさらに記載するように、例えば、ＨＤＸ−ＭＳにより決定して、ヒトＣＤ７３のＮ末端部分におけるエピトープ、例えば、立体エピトープ、例えば、ヒトＣＤ７３のアミノ酸６５〜８３内に位置するエピトープ(配列番号９６)と結合する。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、ＨＤＸ−ＭＳにより決定して、ヒトＣＤ７３のアミノ酸１５７〜１７２(配列番号９７)またはヒトＣＤ７３のアミノ酸１５７〜１７２内に位置するエピトープ(配列番号９７)に結合する。あるいは、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、ＨＤＸ−ＭＳにより決定して、ヒトＣＤ７３のＮ末端部分におけるエピトープ、例えば、不連続エピトープと結合する。

【0215】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、ＨＤＸ−ＭＳにより決定して、ヒトＣＤ７３のアミノ酸６５〜８３およびアミノ酸１５７〜１７２またはヒトＣＤ７３アイソフォーム１または２のアミノ酸６５〜８３およびアミノ酸１５７〜１７２内のエピトープ、すなわち、アミノ酸配列FTKVQQIRRAEPNVLLLDA(配列番号９６)およびLYLPYKVLPVGDEVVG(配列番号９７)と結合する。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、ＨＤＸ−ＭＳにより決定して、ヒトＣＤ７３のアミノ酸６５〜８３およびアミノ酸１５７〜１７２の全てまたは一部と結合する。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、グリコシル化および非グリコシル化両者のヒトＣＤ７３に結合する。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体はグリコシル化ＣＤ７３にのみ結合し、非グリコシル化ＣＤ７３に結合しない。

【0216】

抗ＣＤ７３抗体は、ここに記載するＣＤＲまたは可変領域、例えば、ＣＤ７３.４−１、ＣＤ７３.４−２、ＣＤ７３.３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１のものを含む抗ＣＤ７３抗体と、ＣＤ７３への結合について競合し得る(または結合を阻害する)。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤ７３.４−１、ＣＤ７３.４−２、ＣＤ７３.３、１１Ｆ１１、４Ｃ３、４Ｄ４、１０Ｄ２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８、６Ｅ１１および／または７Ａ１１のヒトＣＤ７３への結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。ある態様において、ＣＤ７３.４−１、ＣＤ７３.４−２、ＣＤ７３.３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１は、抗ＣＤ７３抗体のヒトＣＤ７３への結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤ７３.４−１、ＣＤ７３.４−２、ＣＤ７３.３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１のヒトＣＤ７３への結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害し、かつＣＤ７３.４−１、ＣＤ７３.４−２、ＣＤ７３.３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１は、抗ＣＤ７３抗体のヒトＣＤ７３への結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する(例えば、両方向での競合)。競合実験は、例えば、ここに、例えば、実施例にさらに記載するように、実施できる。

【0217】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、ＦｃＲ結合の必要性の欠如により決定して、多価架橋を必要とすることなく、ＣＤ７３酵素活性を阻害するおよび／または細胞に内在化する。

【0218】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、表３に挙げる特徴の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１を有する。

【0219】

表３：抗ＣＤ７３抗体の可能性のある特徴
(１)例えば、BIACORE^{(登録商標)}SPR分析により測定して、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＫ_Ｄで、ヒトＣＤ７３、例えば、ビーズ結合ヒト単量体および二量体ヒトＣＤ７３アイソフォーム１および２に結合する；
(２)例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＥＣ_５０で、膜結合型ヒトＣＤ７３に結合する；
(３)例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＥＣ_５０で、カニクイザルＣＤ７３に結合する、例えば、膜結合型カニクイザルＣＤ７３に結合する；
(４)例えば、１０nM以下のＥＣ_５０で、ヒトＣＤ７３酵素活性を阻害する；
(５)例えば、１０nM以下のＥＣ_５０で、ｃｙｎｏ ＣＤ７３酵素活性を阻害する；
(６)Ｃａｌｕ６細胞における内在性(細胞性)ヒトＣＤ７３酵素活性を、１０nM以下のＥＣ_５０で阻害する；
(７)インビボでヒトＣＤ７３酵素活性を阻害する；
(８)例えば、１時間未満、３０分未満または１０分未満のＴ_１／２および／または少なくとも７０％、８０％または９０％のＹ_ｍａｘで、細胞に内在化、例えば、抗体介在(または依存的)ＣＤ７３内在化する；
(９)ヒトＣＤ７３上の立体エピトープ、例えば、アミノ酸残基FTKVQQIRRAEPNVLLLDA(配列番号９６)および／またはLYLPYKVLPVGDEVVG(配列番号９７)の全てまたは一部を含むアミノ酸配列(配列番号１)内の不連続エピトープに結合する；
(１０)ヒトＣＤ７３への結合について、ＣＤ７３.４−１、ＣＤ７３.４−２、ＣＤ７３.３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１といずれかの方向でまたは両方向で競合する；および
(１１)Ｘ線結晶学により決定して、ＣＤ７３.４と類似するパターンでヒトＣＤ７３と相互作用する。

【0220】

当分野で知られるおよびここに記載する方法により決定して、これらの機能的性質(例えば、生化学的、免疫化学的、細胞学的、生理学的または他の生物学的活性など)の１以上を示す抗体活性は、抗体の非存在下(例えばまたは無関係の特異性の対照抗体が存在するとき)で見られるものに対して、特定の活性における統計学的に有意な差異と関係すると理解される。ある態様において、ここに開示する抗ＣＤ７３抗体は、測定されたパラメータ(例えば、腫瘍体積、腫瘍転移、アデノシンレベル、ｃＡＭＰレベル)を、測定されたパラメータの少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％、ある好ましい態様において、９２％、９４％、９５％、９７％、９８％または９９％を超えて減少させる。逆に、ここに開示する抗ＣＤ７３抗体は、測定されたパラメータを、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％(すなわち２倍)、３倍、５倍または１０倍増加させる。

【0221】

種々の種のＣＤ７３に対する抗体の結合能を評価する標準アッセイは当分野で知られ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよびＲＩＡを含む。適当なアッセイは、実施例に詳細に記載する。抗体の結合動態(例えば、結合親和性)も、BIACORE^{(登録商標)}SPR分析のような、当分野で知られる標準アッセイにより評価できる。ＣＤ７３の機能的性質(例えば、アデノシン産生、腫瘍増殖および転移、Ｔ細胞阻害)に対する抗体の効果を評価するアッセイは、下におよび実施例にさらに詳細に記載する。

【0222】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、天然抗体ではないかまたは天然に存在する抗体ではない。例えば、抗ＣＤ７３抗体は、翻訳後修飾が多い、少ないまたはタイプが異なるような、天然に存在する抗体と異なる翻訳後修飾を有する。

【0223】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、ＣＤ７３をＴ細胞表面から除去するおよび／またはその酵素活性を阻害することにより、Ｔ_ｅｆｆ(Ｔエフェクター)機能を刺激するおよび／またはＴ_ｒｅｇ機能を低減する。

【0224】

ある態様において、抗ＣＤ３抗体は、少なくともＩｇＧ２ヒンジおよび所望によりまたＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインまたはフラグメントまたはヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインの誘導体を含み、抗体は形態Ａである(例えば、Allen et al., (2009) Biochemistry 48:3755参照)。ある態様において、抗ＣＤ３抗体は、少なくともＩｇＧ２ヒンジおよび所望によりまたＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインまたはヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインのフラグメントもしくは誘導体を有し、抗体は、形態Ｂを採っている(例えば、Allen et al., (2009) Biochemistry 48:3755参照)。ある態様において、組成物は、形態Ａの抗ＣＤ７３抗体と形態Ｂの抗ＣＤ７３抗体の混合物を含む。

【0225】

ここに提供されるのは、(ｉ)１１Ｆ１１により結合されるのに類似するヒトＣＤ７３上の領域に結合するが、４Ｃ３により結合されるのに類似する領域に結合しない、可変領域を含む(すなわち、ビン１抗体である)；(ii)単量体および二量体ヒトＣＤ７３に１０nM以下のＫ_Ｄで結合する；(iii)例えば、細胞、例えば、Ｃａｌｕ６細胞における、ヒトＣＤ７３の酵素活性(ＡＭＰからアデノシンへの変換)を、１０nM未満のＥＣ_５０で阻害する；そして(iv)ヒト細胞、例えば、Ｃａｌｕ６細胞、Ｈ２２２８細胞、ＨＣＣ１５細胞、Ｈ２０３０細胞、ＳＮＵＣ１細胞において、例えば、１時間以下(または３０分以下または１０分以下)のＴ_１／２、５０％以上(または６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上)のＹ_ｍａｘで細胞への抗体依存的ＣＤ７３内在化を仲介する、抗ヒトＣＤ７３抗体である。ある態様において、抗体は、ＩｇＧ２ヒンジまたはＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを含む。ここに提供されるのは、(ｉ)１１Ｆ１１により結合されるのに類似するヒトＣＤ７３上の領域に結合するが、４Ｃ３により結合されるのに類似する領域に結合しない、可変領域を含む(すなわち、ビン１抗体である)；(ii)ＳＰＲ(Biacore)により決定して、単量体および二量体ヒトＣＤ７３に１０nM以下のＫ_Ｄで結合する；(iii)例えば、細胞、例えば、Ｃａｌｕ６細胞における、ヒトＣＤ７３の酵素活性(ＡＭＰからアデノシンへの変換)を、１０nM未満のＥＣ_５０で阻害する；そして(iv)実施例６Ａに記載する高容量内在化アッセイを使用して決定して、ヒトＣａｌｕ６、Ｈ２２２８、ＨＣＣ１５またはＨ２０３０細胞において、例えば、３０分以下のＴ_１／２、８０％以上のＹ_ｍａｘで細胞への抗体依存的ＣＤ７３内在化を仲介する、抗ヒトＣＤ７３抗体である。

【0226】

好ましい態様において、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体は、顕著に毒性ではない。例えば、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、臨床試験で決定して、ヒトの臓器、例えば、肝臓、腎臓、脳、肺および心臓の１以上に顕著に毒性ではない。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、望ましくない免疫応答、例えば、自己免疫または炎症を顕著に惹起しない。

【0227】

II. 抗ＣＤ７３抗体の例
抗ＣＤ７３抗体の可変領域
ここに記載する特定の抗体は、抗体１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１、７Ａ１１、ＣＤ７３.３−１、−２または−３、ＣＤ７３.４−１および−２、ＣＤ７３.４−２、ＣＤ７３.５−１および−２、ＣＤ７３.６−１および−２、ＣＤ７３.７−１および−２、ＣＤ７３.８−１および−２、ＣＤ７３.９−１および−２、ＣＤ７３.１０−１および−２およびＣＤ７３.１１のＣＤＲおよび／または可変領域配列を有する抗体、例えば、モノクローナル抗体ならびにこれらの可変領域またはＣＤＲ配列と少なくとも８０％同一性(例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一性)を有する抗体である。表４は、各抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域のＣＤＲのならびにＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域の配列番号を示す。実施例においてさらに記載するように、ある重鎖は１を超える軽鎖と共に存在でき、また軽鎖の配列番号も下記表に提供する。

【0228】

【表3】

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【0229】

ここに提供されるのは、重鎖および軽鎖可変領域を含む単離抗体またはその抗原結合部分であり、ここで、重鎖可変領域は、配列番号４、１６、３２、４０、５２、６０、６８、８０、８８、１３５および１７０〜１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0230】

また提供されるのは、重鎖および軽鎖可変領域を含む単離抗体またはその抗原結合部分であり、ここで、軽鎖可変領域は、配列番号８、１２、２０、２４、２８、３６、４４、４８、５６、６４、７２、７６、８４、９２および２３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0231】

ここに提供されるのは、
(ａ)それぞれ配列番号１３５および８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｂ)それぞれ配列番号１３５および１２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｃ)それぞれ配列番号４および８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｄ)それぞれ配列番号４および１２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｅ)それぞれ配列番号１６および２０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｆ)それぞれ配列番号１６および２４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｇ)それぞれ配列番号１６および２８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｈ)それぞれ配列番号３２および３６を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｉ)それぞれ配列番号４０および４４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｊ)それぞれ配列番号４０および４８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｋ)それぞれ配列番号５２および５６を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｌ)それぞれ配列番号６０および６４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｍ)それぞれ配列番号６８および７２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｎ)それぞれ配列番号６８および７６を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｏ)それぞれ配列番号６８および２３８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｐ)それぞれ配列番号８０および８４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｑ)それぞれ配列番号８８および９２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｒ)それぞれ配列番号１７０および２０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｓ)それぞれ配列番号１７０および２４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｔ)それぞれ配列番号１７０および２８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｕ)それぞれ配列番号１７１および８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｖ)それぞれ配列番号１７１および１２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｗ)それぞれ配列番号１７２および８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｘ)それぞれ配列番号１７２および１２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｙ)それぞれ配列番号１７３および８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｚ)それぞれ配列番号１７３および１２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ａ２)それぞれ配列番号１７４および８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｂ２)それぞれ配列番号１７４および１２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｃ２)それぞれ配列番号１７５および８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｄ２)それぞれ配列番号１７５および１２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｅ２)それぞれ配列番号１７６および８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｆ２)それぞれ配列番号１７６および１２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；または
(ｇ２)それぞれ配列番号１７７と３６を含む重鎖および軽鎖可変領域配列
を含む、単離抗体またはその抗原結合部分である。

【0232】

抗ＣＤ７３抗体は、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体、例えば、ＣＤ７３.４−１、ＣＤ７３.４−２、ＣＤ７３.３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、１１Ｆ１１、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、５Ｆ８−３、６Ｅ１１および７Ａ１１またはこれらの組み合わせの重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み得る。

【0233】

これらの抗体の各々がＣＤ７３に結合し、この抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、２および３領域により提供されることに鑑みて、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ１、２および３配列およびＶ_Ｌ ＣＤＲ１、２および３配列を、“混合および整合”(すなわち、各抗体はＶ_Ｈ ＣＤＲ１、２および３およびＶ_Ｌ ＣＤＲ１、２および３を含まなければならないが、異なる抗体からのＣＤＲを混合および整合できる)して、ここに記載する他の抗ＣＤ７３結合分子を創出できる。このような“混合および整合”抗体のＣＤ７３結合を、上におよび実施例(例えば、ＥＬＩＳＡ)に記載する結合アッセイを使用して、試験できる。好ましくは、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ配列を混合および整合するとき、特定のＶ_Ｈ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列と置き換える。同様に、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ配列を混合および整合するとき、好ましくは特定のＶ_Ｌ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列と置き換える。新規Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列を、１以上のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ ＣＤＲ領域配列を、モノクローナル抗体ＣＤ７３.４−１、ＣＤ７３.４−２、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１についてここに開示するＣＤＲ配列からの構造的に類似する配列と置換することにより、創出できることは、当業者には容易に明らかである。ここに開示する特定の抗体と同等なまたはそれより優れた結合親和性、生理活性および／または他の性質を有する“混合および整合”抗体本発明の方法において使用するために選択し得る。

【0234】

ここに提供されるのは、
(ａ)配列番号５、１７、３３、４１、５３、６１、６９、８１および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｂ)配列番号６、１８、３４、４２、５４、６２、７０、８２および９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
(ｃ)配列番号、７、１９、３５、４３、５５、６３、７１、８３および９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
(ｄ)配列番号９、１３、２１、２５、２９、３７、４５、４９、５７、６５、７３、７７、８５および９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｅ)配列番号１０、１４、２２、２６、３０、３８、４６、５０、５８、６６、７４、７８、８６および９４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
(ｆ)配列番号１１、１５、２３、２７、３１、３９、４７、５１、５９、６７、７５、７９、８７および９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
を含む単離抗体またはその抗原結合部分であり、ここで、該抗体は、ヒトＣＤ７３に特異的に結合する。

【0235】

ある態様において、抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は配列番号５〜７；１７〜１９；３３〜３５；４１〜４３；５３〜５５；６１〜６３；６９〜７１；８１〜８３；または８９〜９１を含み、ここで、該抗体は、ヒトＣＤ７３に特異的に結合する。

【0236】

ある態様において、抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は
配列番号９〜１１；１３〜１５；２１〜２３；２５〜２７；２９〜３１；３７〜３９；４５〜４７；４９〜５１；５７〜５９；６５〜６７；７３〜７５；７７〜７９；８５〜８７；または９３〜９５を含み、ここで、該抗体は、ヒトＣＤ７３に特異的に結合する。

【0237】

ある態様において、抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、
(ａ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号５〜７を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号９〜１１を含むか；
(ｂ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号５〜７を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１３〜１５を含むか；
(ｃ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１７〜１９を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２１〜２３を含むか；
(ｄ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１７〜１９を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２５〜２７を含むか；
(ｅ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１７〜１９を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２９〜３１を含むか；
(ｆ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３３〜３５を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３７〜３９を含むか；
(ｇ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４１〜４３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４５〜４７を含むか；
(ｈ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４１〜４３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４９〜５１を含むか；
(ｉ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号５３〜５５を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号５７〜５９を含むか；
(ｊ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６１〜６３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６５〜６７を含むか；
(ｋ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６９〜７１を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号７３〜７５を含むか；
(ｌ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６９〜７１を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号７７〜７９を含むか；
(ｍ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号８１〜８３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号８５〜８７を含むか；または
(ｎ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号８９〜９１を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号９３〜９５を含み；
ここで、該抗体はヒトＣＤ７３に特異的に結合し、所望により表３に挙げる特徴の１以上、例えば、ＡＭＰの脱リン酸化を阻害するおよび受容体依存的ＣＤ７３内在化に介在する能力を有する。

【0238】

ある態様において、抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、
(ａ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号５〜７からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号９〜１１からなるか；
(ｂ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号５〜７からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１３〜１５からなるか；
(ｃ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１７〜１９からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２１〜２３からなるか；
(ｄ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１７〜１９からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２５〜２７からなるか；
(ｅ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１７〜１９からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２９〜３１からなるか；
(ｆ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３３〜３５からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３７〜３９からなるか；
(ｇ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４１〜４３からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４５〜４７からなるか；
(ｈ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４１〜４３からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４９〜５１からなるか；
(ｉ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号５３〜５５からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号５７〜５９からなるか；
(ｊ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６１〜６３からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６５〜６７からなるか；
(ｋ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６９〜７１からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号７３〜７５からなるか；
(ｌ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６９〜７１からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号７７〜７９からなるか；
(ｍ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号８１〜８３からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号８５〜８７からなるか；または
(ｎ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号８９〜９１からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号９３〜９５からなり；
ここで、該抗体はヒトＣＤ７３に特異的に結合し、所望により表３に挙げる特徴の１以上、例えば、ＡＭＰの脱リン酸化を阻害するおよび受容体依存的ＣＤ７３内在化に介在する能力を有する。

【0239】

抗ＣＤ７３抗体の重鎖定常ドメイン
ここに記載する抗ＣＤ７３抗体の重鎖定常領域は、アイソタイプのいずれか、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４またはこれらの組み合わせおよび／またはその修飾体であり売る。抗ＣＤ７３抗体は、エフェクター機能を有しても、エフェクター機能が低減されていても失われていてもよい。ある態様において、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体は、抗体の性質を増強させる修飾重鎖定常領域を含む。実施例に示すように、１１Ｆ１１抗体の可変領域を有するもののような、ＩｇＧ２ヒンジおよび所望によりＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを有する抗ＣＤ７３抗体は、同一の可変領域を有するが、非ＩｇＧ２ヒンジまたはＣＨ１を有する抗体、例えば、ＩｇＧ１ヒンジまたはＩｇＧ１ヒンジおよびＩｇＧ１ ＣＨ１を有する抗体と比べて、良好にかつ速く内在化される。例えば１１Ｆ１１抗体の可変領域を含み、ＩｇＧ２ヒンジおよび所望によりＩｇＧ２ ＣＨ１およびＩｇＧ１ ＣＨ２およびＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含み、エフェクター機能を有するかまたは有さないいずれかである抗体は、ＩｇＧ１ヒンジまたはＩｇＧ１ヒンジおよびＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインを有する以外同一の抗体と比較して、細胞膜上のＣＤ７３への結合により、細胞により効率的に内在化される。ここでさらに示すように、ＩｇＧ２ヒンジを有し、抗体の残りがＩｇＧ１アイソタイプであるＣＤ７３抗体は、ヒンジがＩｇＧ１アイソタイプである同一抗体より効率的に内在化される。ＩｇＧ２ヒンジに加えて、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを有する抗体は、ＣＨ１ドメインがＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインである同一抗体よりもさらに効率的に内在化される。ここでさらに示すように、ＩｇＧ２ヒンジおよび所望によりＩｇＧ２ ＣＨ１を有する抗ＣＤ７３抗体は、ＩｇＧ１ヒンジまたはＩｇＧ１ヒンジおよびＩｇＧ１ ＣＨ１を有する抗体よりも大きな抗体／抗原複合体も形成する。内在化増加は、抗体／抗原複合体サイズの増加と相関するように見える。実施例においてさらに記載するように、内在化増強は、抗体の親和性の高低と関係しないように見える。したがって、ここに提供されるのは、抗体介在ＣＤ７３内在化に介在する修飾重鎖定常領域を有する抗ＣＤ７３抗体であり、ここで、該修飾重鎖定常領域を有する抗体は、異なる重鎖定常領域を有する以外、同一抗体と類似する親和性でＣＤ７３と結合する。

【0240】

ある態様において、ＣＤ７３抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジ(“ＩｇＧ２ヒンジ”)およびＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む修飾重鎖定常領域を含む。ある態様において、修飾重鎖定常領域はＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの少なくとも一つはＩｇＧ２アイソタイプのものではない。ある態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジ、ＩｇＧ２アイソタイプのＣＨ１を含み、ここで、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの少なくとも一つはＩｇＧ２アイソタイプのものではない。ＩｇＧ２ヒンジは、野生型ＩｇＧ２ヒンジ、例えば、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジ(例えば、配列番号１３６を有する)またはそのバリアントであってよいが、ただし、ＩｇＧ２ヒンジは、非ＩｇＧ２ヒンジおよび所望により非ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを含む同一抗体と比較して、抗体の活性を増強させる能力(例えば、増加した細胞による内在化；増強された酵素活性阻害；増加したアンタゴニストまたは遮断活性；大きな抗体／抗原架橋複合体を形成する能力；免疫応答を刺激または増強する高い能力；および／または増加した抗増殖性または抗腫瘍効果)を保持する。ある態様において、ＩｇＧ２ヒンジバリアントは、野生型ＩｇＧ２ヒンジと類似する強剛性または剛性を保持する。ヒンジまたは抗体の強剛性は、該ヒンジを含む抗体の旋回の半径を測定または比較するための、例えば、コンピューターモデリング、電子顕微鏡法、核磁気共鳴(ＮＭＲ)のようなスペクトロスコピー、Ｘ線結晶学(温度因子)または超遠心沈降速度法(ＡＵＣ)により決定できる。ヒンジまたは抗体は、該ヒンジを含む抗体から先の文章において記載した試験の一つで得られた値が、異なるヒンジ、例えば、ＩｇＧ１ヒンジを有する同一抗体と５％、１０％、２５％、５０％、７５％または１００％未満異なるならば、他のヒンジと比較して、同等のまたは高い強剛性を有し得る。当業者は、ヒンジまたは抗体が、それぞれ他のヒンジまたは抗体と少なくとも類似する強剛性を有するか否かを、これらの試験結果を解釈することにより決定することができる。ヒトＩｇＧ２ヒンジバリアントの例は、４システイン残基(すなわち、Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｃ２２６およびＣ２２９)の１以上の他のアミノ酸への置換を含むＩｇＧ２ヒンジである。システインはセリンで置き換えてよい。ＩｇＧ２ヒンジの例は、Ｃ２１９Ｘ変異またはＣ２２０Ｘ変異を含むヒトＩｇＧ２ヒンジであり、ここで、Ｘはセリン以外の任意のアミノ酸である。ある態様において、ＩｇＧ２ヒンジは、Ｃ２１９ＸおよびＣ２２０Ｘ置換のいずれも含まない。ある態様において、ＩｇＧ２ヒンジはＣ２１９ＳまたはＣ２２０Ｓを含むが、Ｃ２１９ＳおよびＣ２２０Ｓの両者は含まない。使用し得る他のＩｇＧ２ヒンジバリアントは、Ｃ２２０、Ｃ２２６および／またはＣ２２９置換、例えば、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６ＳまたはＣ２２９Ｓ変異を含むヒトＩｇＧ２ヒンジを含む(これは、Ｃ２１９Ｓ変異と組み合わせてよい)。ＩｇＧ２ヒンジはまた、ヒンジの一部が他のアイソタイプのものであるＩｇＧ２ヒンジ(すなわち、キメラまたはハイブリッドヒンジである)を含んでもよいが、ただし、該キメラヒンジの強剛性は、野生型ＩｇＧ２ヒンジと少なくとも類似する。例えば、ＩｇＧ２ヒンジは、下部ヒンジ(表２に定義)がＩｇＧ１アイソタイプのものであり、例えば、野生型ＩｇＧ１下部ヒンジである、ＩｇＧ２ヒンジであり得る。

【0241】

“ハイブリッド”または“キメラ”ヒンジは、ヒンジの連続アミノ酸の半分以上が、特定のアイソタイプ由来であるならば、そのアイソタイプのものと称する。例えば、ＩｇＧ２の上部および中間部ヒンジおよびＩｇＧ１の下部ヒンジを有するヒンジは、ＩｇＧ２ハイブリッドヒンジとして考える。

【0242】

ある態様において、ＣＤ７３抗体は、次のヒンジの一つを含むＩｇＧ２ヒンジを含む、修飾重鎖定常領域を含む：
ERKCCVECPPCPAPPVAG(配列番号３４８)；
ERKSCVECPPCPAPPVAG(配列番号３４９)；
ERKCSVECPPCPAPPVAG(配列番号３５０)；
ERKXCVECPPCPAPPVAG(配列番号３５１)；
ERKCXVECPPCPAPPVAG(配列番号３５２)；
ERKCCVECPPCPAPPVAGX(配列番号３５３)；
ERKSCVECPPCPAPPVAGX(配列番号３５４)；
ERKCSVECPPCPAPPVAGX(配列番号３５５)；
ERKXCVECPPCPAPPVAGX(配列番号３５６)；
ERKCXVECPPCPAPPVAGX(配列番号３５７)；
ERKCCVECPPCPAPELLGG(配列番号３５８)；
ERKSCVECPPCPAPELLGG(配列番号３５９)；
ERKCCSVECPPCPAPELLGG(配列番号３６０)；
ERKXCVECPPCPAPELLGG(配列番号３６１)；
ERKCXVECPPCPAPELLGG(配列番号３６２)；
ERKCCVECPPCPAPELLG(配列番号３６３)；
ERKSCVECPPCPAPELLG(配列番号３６４)；
ERKCCSVECPPCPAPELLG(配列番号３６５)；
ERKXCVECPPCPAPELLG(配列番号３６６)；
ERKCXVECPPCPAPELLG(配列番号３６７)；
ERKCCVECPPCPAP(配列番号３６８)；
ERKSCVECPPCPAP(配列番号３６９)；
ERKCSVECPPCPAP(配列番号３７０)；
ERKXCVECPPCPAP(配列番号３７１)；または
ERKCXVECPPCPAP(配列番号３７２)
(ここで、Ｘはシステイン以外の任意のアミノ酸である)
または、アミノ酸残基ＣＶＥとＣＰＰの間に１〜５、１〜３、１〜２または１アミノ酸が挿入されている、上記配列のいずれか。ある態様において、ＴＨＴまたはＧＧＧが挿入される。

【0243】

ある態様において、ヒンジは配列番号３４８、３４９、３５０、３５１または３５２を含み、ここで、アミノ酸Ｐ２３３、Ｖ２３４、Ａ２３５およびＧ２３７の１個、２個、３個または全４個(Ｃ末端４アミノ酸“ＰＶＡＧ”(配列番号３７３)に対応する)が、欠失しているか、他のアミノ酸、例えば、ＩｇＧ１ヒンジのＣ末端のアミノ酸(ELLG(配列番号３７４)またはELLGG(配列番号３７５))で置換されている。ある態様において、ヒンジは配列番号３４８、３４９、３５０、３５１または３５２を含み、ここで、Ｖ２３４、Ａ２３５およびＧ２３７は欠失しているか、他のアミノ酸で置換されている。ある態様において、ヒンジは配列番号３４８、３４９、３５０、３５１または３５２を含み、ここで、Ａ２３５およびＧ２３７は欠失しているか、他のアミノ酸で置換されている。ある態様において、ヒンジは配列番号３４８、３４９、３５０、３５１または３５２を含み、ここで、Ｇ２３７は欠失しているか、他のアミノ酸で置換されている。ある態様において、ヒンジは配列番号３４８、３４９、３５０、３５１または３５２を含み、ここで、Ｖ２３４およびＡ２３５は欠失しているか、他のアミノ酸で置換されている。例えば、上記の、ハイブリッドヒンジを得るための、ＩｇＧ２におけるPVAG(配列番号３７３)の、ＩｇＧ１ヒンジの対応するアミノ酸、すなわち、(ELLG(配列番号３７４)またはELLGG(配列番号３７５))での置換は、ＩｇＧ２ヒンジの利点とＩｇＧ１ヒンジのエフェクター機能を有するヒンジを提供する。

【0244】

ある態様において、修飾重鎖定常領域は、上記配列の一つ、例えば、配列番号３４８〜３７２のいずれか一つからなるまたは本質的にそれからなるヒンジを含み、例えば、さらなるヒンジアミノ酸残基を含まない。

【0245】

ある態様において、１または１〜２または１〜３アミノ酸がヒンジとＣＨ２ドメインの間に挿入され、例えば、さらなるグリシンが付加され得る。

【0246】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域を含む修飾重鎖定常領域を含み、ここで、ヒンジは、１〜１０アミノ酸の欠失を含む。実施例に示すように、アミノ酸残基SCDKTHT(Ｓ２１９、Ｃ２２０、Ｄ２２１、Ｋ２２２、Ｔ２２３、Ｈ２２４およびＴ２２５；配列番号３７６)を欠くＩｇＧ１抗体は、抗体介在ＣＤ７３内在化が、野生型ＩｇＧ１定常領域を有する同一抗体より効率的であった。同様に、ＩｇＧ２抗体の状況において、アミノ酸残基CCVE(Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｖ２２２およびＥ２２４；配列番号３７７)を欠くＩｇＧ２抗体は、抗体介在ＣＤ７３内在化が、野生型ＩｇＧ１定常領域を有する同一抗体より効率的であった。したがって、ここに提供されるのは、ヒンジが、ＩｇＧ１抗体について残基Ｓ２１９、Ｃ２２０、Ｄ２２１、Ｋ２２２、Ｔ２２３、Ｈ２２４およびＴ２２５およびＩｇＧ２抗体について残基Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｖ２２２およびＥ２２４から選択される１、２、３、４、５、６または７アミノ酸残基の欠失を含む、修飾重鎖定常領域である。

【0247】

ある態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプの野生型ＣＨ１ドメイン(それぞれ“ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン”または“ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン”)である、ＣＨ１ドメインを含む。アイソタイプＩｇＧ３およびＩｇＧ４のＣＨ１ドメイン(それぞれ“ＩｇＧ３ ＣＨ１ドメインおよび“ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン”)も使用し得る。ＣＨ１ドメインはまた、野生型ＣＨ１ドメインのバリアント、例えば、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインのバリアントでもあり得る。ＣＨ１ドメインのバリアントの例は、Ａ１１４Ｃ、Ｔ１７３Ｃおよび／またはＣ１３１、例えば、Ｃ１３１Ｓを含む。

【0248】

ＣＨ１ドメイン、例えば、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインは置換Ｃ１３１Ｓを含んでよく、この置換は、ＩｇＧ２抗体またはＩｇＧ２ ＣＨ１およびヒンジを含む抗体を、Ｂ形態(または立体構造)とする。

【0249】

ある態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ２アイソタイプのものであるＣＨ１ドメインを含む。ある態様において、ＣＨ１ドメインは、例えば、アミノ酸配列

【化1】

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を有する、野生型ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインである。ある態様において、ＣＨ１ドメインは、配列番号３７８のバリアントであり、配列番号３７８に対して、１〜１０、１〜５、１〜２または１アミノ酸置換または欠失を含む。実施例においてさらに記載するように、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインまたはそのバリアントが、ＩｇＧ１抗体に比して抗ＣＤ７３抗体の内在化性質を増強または改変させ、抗体がＩｇＧ２ヒンジも含むとき、内在化がさらに増強または改変されることが示されている。ある態様において、ＩｇＧ２ ＣＨ１バリアントは、次のアミノ酸残基Ｃ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７およびＳ１３８の１以上にアミノ酸置換または欠失を含まず、このアミノ酸残基は、上に示す配列番号３７８において太字および下線で示される。例えば、修飾重鎖定常領域は、Ｒ１３３、Ｅ１３７およびＳ１３８のいずれも他のアミノ酸で置換されていないまたは欠失されていないまたはＣ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７およびＳ１３８のいずれも他のアミノ酸で置換されていないまたは欠失されていない、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを含み得る。ある態様において、Ｃ１３１は、他のアミノ酸で置換され、例えば、Ｃ１３１Ｓであり、この置換は、抗体が立体構造Ｂを採ることを誘発する。修飾重鎖定常領域を有する立体構造Ａおよび立体構造Ｂ両者の抗体は、ＩｇＧ１定常領域を有する同一抗体に比して、活性が増強していることがここで示されている。

【0250】

ある態様において、Ｎ１９２および／またはＦ１９３(上記配列番号３７８において斜体および下線を引いた残基として示す)を、他のアミノ酸、例えば、ＩｇＧ１における対応するアミノ酸、すなわち、Ｎ１９２Ｓおよび／またはＦ１９３Ｌで置換する。

【0251】

ある態様において、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインの１以上のアミノ酸残基を、ＩｇＧ４における対応するアミノ酸残基で置換する。例えば、Ｎ１９２はＮ１９２Ｓであってよく；Ｆ１９３はＦ１９３Ｌであってよく；Ｃ１３１はＣ１３１Ｋであってよく；および／またはＴ２１４はＴ２１４Ｒであってよい。

【0252】

抗体は、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインまたはそのバリアントおよびＩｇＧ２ヒンジまたはそのバリアントを含む修飾重鎖定常領域を含み得る。ヒンジおよびＣＨ１ドメインは、ここに記載する任意のＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインの組み合わせであり得る。ある態様において、ＩｇＧ２ ＣＨ１およびヒンジは、次のアミノ酸配列

【化2】

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またはそれから最大１〜１０アミノ酸異なるアミノ酸配列を含み得る。アミノ酸バリアントは、ヒンジおよびＣＨ１ドメインについて上記したとおりである。

【0253】

ある態様において、抗体は、少なくともＩｇＧ２ヒンジおよび所望によりまたＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインまたはヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインのフラグメントもしくは誘導体を含み、該抗体は、(立体構造の)形態Ａを取っている(例えば、Allen et al., (2009) Biochemistry 48:3755参照)。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、少なくともＩｇＧ２ヒンジおよび所望によりまたＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインまたはヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインのフラグメントもしくは誘導体を含み、該抗体は、形態Ｂを取っている(例えば、Allen et al., (2009) Biochemistry 48:3755参照)。

【0254】

ある態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの野生型ＣＨ２ドメイン(それぞれ“ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン”、“ＩｇＧ２ ＣＨ２ドメイン”、“ＩｇＧ３ ＣＨ２ドメイン”または“ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン”)である、ＣＨ２ドメインを含む。ＣＨ２ドメインはまた野生型ＣＨ２ドメインのバリアント、例えば、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのバリアントであり得る。ＣＨ２ドメインのバリアントの例は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣのような抗体のＦｃ領域の生物学的活性を調節するまたは抗体の半減期またはその安定性を調節するバリアントを含む。ある態様において、ＣＨ２ドメインは、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインであり、ここで、ＣＨ２ドメインは、変異がない同一ＣＨ２変異と比較して、エフェクター機能が軽減している。ＣＨ２ドメインは、増強されたエフェクター機能を有し得る。ＣＨ２ドメインは、次の変異Ｅ(Ｓ２６７Ｅ)、ＳＥＬＦ(Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ)、ＳＤＩＥ(Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ)、ＳＥＦＦおよびＧＡＳＤＡＬＩＥ(Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ)の１以上および／または次のアミノ酸Ｅ２３３、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｈ２６８、Ｐ２７１、Ｌ３２８およびＡ３３０に１以上の変異を含み得る。他の変異は、本明細書の他の箇所にさらに示す。

【0255】

ある態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの野生型ＣＨ３ドメイン(それぞれ“ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン”、“ＩｇＧ２ ＣＨ３ドメイン”、“ＩｇＧ３ ＣＨ３ドメイン”または“ＩｇＧ４ ＣＨ３ドメイン”)である、ＣＨ３ドメインを含む。ＣＨ３ドメインは、野生型ＣＨ３ドメインのバリアント、例えば、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインのバリアントであり得る。ＣＨ３ドメインのバリアントの例は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣのような抗体のＦｃ領域の生物学的活性を調節するまたは抗体の半減期またはその安定性を調節するバリアントを含む。

【0256】

ある態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジおよびＩｇＧ２アイソタイプのＣＨ１領域を含む。ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１は、野生型ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１またはそのバリアントであってよいが、ただし、それらは所望の生物学的活性を有する。ある態様において、修飾重鎖定常領域は、Ｃ２１９Ｓ変異を含むＩｇＧ２ヒンジおよび野生型でも、最大１〜１０、１〜５、１〜３、１〜２または１アミノ酸置換、欠失または付加を含んでもよいＩｇＧ２ ＣＨ１を含む。修飾重鎖定常領域は、さらに野生型または変異ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み得る。例えば、ＣＤ７３抗体は、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン、Ｃ２１９Ｓを含んでよいＩｇＧ２ヒンジならびにＩｇＧ１ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む重鎖定常ドメインを含んでよく、ここで、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、変異Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含むような、エフェクターレスであり得る。

【0257】

一般に、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインのバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の変異および／または最大１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１変異また１〜１０または１〜５変異を含んでよく、または特定のバリアントを含む重鎖定常領域が必要な生物学的活性を保持する限り、対応する野生型ドメインと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列(それぞれＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン)を含む。

【0258】

表５は、ヒトＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含むヒト重鎖定常領域の例を示し、ここで、各ドメインは、所望の生物学的活性を重鎖定常領域に提供する野生型ドメインまたはそのバリアントである。表５における空欄は、ドメインが存在するかまたは存在せず、存在するならば、あらゆるアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であり得ることを示す。例えば、表５における重鎖定常領域１を含む抗体は、少なくともＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域を含む抗体であり、これはまたＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含んでよく、存在するならば、このＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのものである。表５の理解を深めるための他の例として、重鎖定常領域８を含む抗体は、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインおよびＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインを含む重鎖定常領域を含む抗体であり、これは、ＣＨ３ドメインを含んでも含まなくてもよく、これは、存在するならば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのものであり得る。

【0259】

【表4】

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＊ 修飾重鎖定常領域

【0260】

ある態様において、表５に示す重鎖定常領域を含む抗体は、特定の重鎖定常領域を含まない重鎖定常領域を含む同一抗体と比較してまたはＩｇＧ１定常領域を含む同一抗体と比較して、生物学的活性が増強されている。

【0261】

ある態様において、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを含むＣＤ７３抗体の生物学的活性を改善する方法は、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを含む抗ＣＤ７３抗体を提供し、該非ＩｇＧ２ヒンジおよび該非ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを、それぞれ、ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインに置き換えることを含む。修飾重鎖定常領域を含まないＣＤ７３抗体の生物学的活性を改善する方法は、修飾重鎖定常領域を含まない抗ＣＤ７３抗体を提供し、その重鎖定常領域を修飾重鎖定常領域に置き換えることを含み得る。

【0262】

抗ＣＤ７３可変領域、例えば、ここに記載のものと連結し得る修飾重鎖定常領域の例を表６に提供し、これは、ドメインの各々の身元を示す。

【表5】

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【0263】

ある態様において、抗体は、配列番号１２３、１３６、１７８、１７９または３４８〜３７２を含む修飾ＩｇＧ２ヒンジまたは(ｉ)配列番号１２３、１３６、１７８、１７９または３４８〜３７２と１、２、３、４または５アミノ酸置換、付加または欠失で異なる；(ii)配列番号１２３、１３６、１７８、１７９または３４８〜３７２と最大５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失で異なる；(iii)配列番号１２３、１３６、１７８、１７９または３４８〜３７２と１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５アミノ酸置換、付加または欠失で異なるおよび／または(iv)配列番号１２３、１３６、１７８、１７９または３４８〜３７２と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含むＩｇＧ２ヒンジのようなそのバリアントを含む重鎖定常領域を含み、ここで、(ｉ)〜(iv)のいずれかにおいて、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく、修飾重鎖定常領域は、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域と比較してまたは非ＩｇＧ２ヒンジを含む同一修飾重鎖定常領域と比較して、生物学的活性が増強されている。例えば、ヒンジは野生型でも、Ｃ２１９Ｓ、Ｃ２２０ＳまたはＣ２１９ＳおよびＣ２２０Ｓ置換を含んでもよい。

【0264】

ある態様において、抗体は、配列番号９８を含むＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインまたは配列番号１２４を含むＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインまたは配列番号９８または１２４のバリアントを含む修飾重鎖定常領域を含み、このバリアントは、(ｉ)配列番号９８または１２４と１、２、３、４または５アミノ酸置換、付加または欠失で異なる；(ii)配列番号９８または１２４を最大５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失で異なる；(iii)配列番号９８または１２４と１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５アミノ酸置換、付加または欠失で異なるおよび／または(iv)配列番号９８または１２４と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、(ｉ)〜(iv)のいずれかにおいて、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく、修飾重鎖定常領域は、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジまたは非ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖定常領域と比較してまたは非ＩｇＧ２ヒンジまたは非ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む同一修飾重鎖定常領域と比較して、生物学的活性が増強されている。ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインは、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１を含む抗体に、Ａ形態またはＢ形態を採らせる、Ｃ１３１Ｓまたは他の変異を含んでよい。

【0265】

ある態様において、抗体は、配列番号１３７または１２５または配列番号１３７または１２５のバリアントを含むＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインを含む修飾重鎖定常領域を含み、このバリアントは、(ｉ)配列番号１３７または１２５と１、２、３、４または５アミノ酸置換、付加または欠失で異なる；(ii)配列番号１３７または１２５を最大５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失で異なる；(iii)配列番号１３７または１２５と１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５アミノ酸置換、付加または欠失で異なるおよび／または(iv)配列番号１３７または１２５と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、(ｉ)〜(iv)のいずれかにおいて、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく、修飾重鎖定常領域は、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域と比較してまたは非ＩｇＧ２ヒンジを含む同一修飾重鎖定常領域と比較して、生物学的活性が増強されている。

【0266】

ある態様において、抗体は、配列番号１３８または配列番号１３８のバリアントを含むＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含む修飾重鎖定常領域を含み、このバリアントは、(ｉ)配列番号１３８と１、２、３、４または５アミノ酸置換、付加または欠失で異なる；(ii)配列番号１３８を最大５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失で異なる；(iii)配列番号１３８と１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５アミノ酸置換、付加または欠失で異なるおよび／または(iv)配列番号１３８と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、(ｉ)〜(iv)のいずれかにおいて、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく、修飾重鎖定常領域は、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域と比較してまたは非ＩｇＧ２ヒンジを含む同一修飾重鎖定常領域と比較して、生物学的活性が増強されている。

【0267】

修飾重鎖定常領域はまた上記ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの組み合わせも含み得る。

【0268】

ある態様において、ＣＤ７３抗体は、配列番号１６２〜１６９、１８０〜１８３、２６７〜２８２および３００〜３４７のいずれか一つまたは配列番号１６２〜１６９、１８０〜１８３、２６７〜２８２および３００〜３４７のいずれか一つのバリアントを含む修飾重鎖定常領域を含み、このバリアントは、(ｉ)配列番号１６２〜１６９、１８０〜１８３、２６７〜２８２および３００〜３４７と１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上アミノ酸置換、付加または欠失で異なる；(ii)配列番号１６２〜１６９、１８０〜１８３、２６７〜２８２および３００〜３４７と最大１０、９、８、７、６,５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失で異なる；(iii)配列番号１６２〜１６９、１８０〜１８３、２６７〜２８２および３００〜３４７と１〜５、１〜３、１〜２、２〜５、３〜５、１〜１０または５〜１０アミノ酸置換、付加または欠失で異なるおよび／または(iv)配列番号１６２〜１６９、１８０〜１８３、２６７〜２８２および３００〜３４７のいずれか一つと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、(ｉ)〜(iv)のいずれかにおいて、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく、修飾重鎖定常領域は、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジまたは非ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを含む重鎖定常領域と比較してまたは非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを含む同一修飾重鎖定常領域と比較して、生物学的活性が増強されている。

【0269】

修飾重鎖定常領域は、(ｉ)野生型重鎖定常領域と比較して、類似する、低減したまたは増加したエフェクター機能(例えば、ＦｃγＲ、例えば、ＦｃγＲIIＢへの結合)および／または(ii)野生型重鎖定常領域と比較して、類似する、短いまたは長い半減期(またはＦｃＲｎ受容体への結合)を有し得る。

【0270】

ここに記載する抗ＣＤ７３抗体のＶ_Ｈドメインは、ここに記載する重鎖定常領域に連結し得る。例えば、図１８は、重鎖定常領域ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆに連結した抗体ＣＤ７３.４のアミノ酸配列(配列番号１３３または１６９)を示す。またここに包含されるのは、ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆ(配列番号１３３または１８９)と最大１〜３０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２または１アミノ酸(置換、付加または欠失により)異なるおよび／またはＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆ重鎖の(配列番号１３３または１８９)のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、重鎖を含む、抗体である。例えば、ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆの重鎖(配列番号１３３または１８９)を含み、Ｃ末端ＫまたはＧＫまたはＰＧＫが欠失しているかまたは存在する抗体が包含される。ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆ(配列番号１３３または１８９)の他のバリアントは、異なるアロタイプのものであり、例えば、アミノ酸３５６および３５８がそれぞれＤおよびＬである重鎖を有するものを含む。バリアントは、ＩｇＧ２ヒンジに付加的システイン変異、例えば、Ｃ２２０を有する(またはＣ２１９ＳではなくＣ２２０Ｓを有する)ものおよび変異Ａ３３０Ｓおよび／またはＰ３３１Ｓを有しないものを含む。ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆ(配列番号１３３または１８９)のバリアントは、ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆ(配列番号１３３または１８９)と比較して、好ましくは少なくとも類似生化学的性質および／または生物学的活性、例えば、内在化の効率、ＣＤ７３酵素活性の阻害、ヒトＣＤ７３に対する親和性および同一または類似するエピトープへの結合を有する。

【0271】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、ここに記載する定常領域のいずれか一つ、例えば、配列番号１２６、１２７、１２９、１３０、１６２〜１６９、１８０〜１８３、２６７〜２８２および３００〜３４７に示すアミノ酸配列を含む定常領域を含む。

【0272】

抗ＣＤ７３抗体の軽鎖は、配列番号１３１または配列番号１３１のバリアントを含む軽鎖定常領域を含んでよく、このバリアントは、(ｉ)配列番号１３１と１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上アミノ酸置換、付加または欠失で異なる；(ii)配列番号１３１と最大１０、９、８、７、６,５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失で異なる；(iii)配列番号１３１と１〜５、１〜３、１〜２、２〜５、３〜５、１〜１０または５〜１０アミノ酸置換、付加または欠失で異なるおよび／または(iv)配列番号１３１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、(ｉ)〜(iv)のいずれかにおいて、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよい。ＣＬ変異の例は、Ｃ１２４Ｓを含む。

【0273】

ここに詳述するように、表３５に示す重鎖または軽鎖のいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または７０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖(またはその可変領域)を、所望の特徴、例えば、ここにさらに記載するものを有する抗ヒトＣＤ７３抗体の形成に使用し得る。バリアントの例は、例えば、定常ドメインに、アロタイプ変異を含むものである。ここに記載するように、表３５に示す重鎖または軽鎖のいずれかと最大１〜３０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２または１アミノ酸(置換、付加または欠失により)異なるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖(またはその可変領域)を、所望の特徴、例えば、ここにさらに記載するものを有する抗ヒトＣＤ７３抗体の形成に使用し得る。

【0274】

種々の態様において、上記抗体は、表３に挙げた機能的性質の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０または全てを示す。

【0275】

このような抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体を含む。

【0276】

ある態様において、ここに記載する抗ＣＤ７３抗は、グリコシル化(例えば、Ｎ結合またはＯ結合グリコシル化)および非グリコシル化の両者のヒトＣＤ７３に結合する。ある抗ＣＤ７３抗体はグリコシル化に結合するが、非グリコシル化ＣＤ７３には結合せずまたは非グリコシル化には結合するが、グリコシル化ＣＤ７３には結合しないことがある。

【0277】

ある態様において、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体は、立体エピトープに結合する。

【0278】

ある態様において、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体は、ヒトＣＤ７３の次の領域
FTKVQQIRRAEPNVLLLDA(配列番号９６)
内のアミノ酸残基に結合し、例えば、ＨＤＸ−ＭＳにより決定して、ヒトＣＤ７３(配列番号１または２)のアミノ酸残基６５〜８３に対応する。

【0279】

ある態様において、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体は、ヒトＣＤ７３における次のアミノ酸残基
FTKVQQIRRAEPNVLLLDA(配列番号９６)
の全てまたは部分と結合し、これは、例えば、ＨＤＸ−ＭＳにより決定して、ヒトＣＤ７３(配列番号１または２)のアミノ酸残基６５〜８３に対応する。

【0280】

ある態様において、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体は、ヒトＣＤ７３の次の領域
LYLPYKVLPVGDEVVG(配列番号９７)
内のアミノ酸残基に結合し、例えば、ＨＤＸ−ＭＳにより決定して、ヒトＣＤ７３(配列番号１または２)のアミノ酸残基１５７〜１７２に対応する。

【0281】

ある態様において、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体は、ヒトＣＤ７３における次のアミノ酸残基
LYLPYKVLPVGDEVVG(配列番号９７)
の全てまたは部分と結合し、これは、例えば、ＨＤＸ−ＭＳにより決定して、ヒトＣＤ７３(配列番号１または２)のアミノ酸残基１５７〜１７２に対応する。

【0282】

ある態様において、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体は、ヒトＣＤ７３(配列番号１または２)の次の領域
FTKVQQIRRAEPNVLLLDA(配列番号９６)およびLYLPYKVLPVGDEVVG(配列番号９７)
内の不連続アミノ酸残基と結合する。

【0283】

ある態様において、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体は、ヒトＣＤ７３(配列番号１または２)の次の領域
FTKVQQIRRAEPNVLLLDA(配列番号９６)およびLYLPYKVLPVGDEVVG(配列番号９７)
内の不連続アミノ酸残基の全てまたは部分と結合し、これは、例えば、ＨＤＸ−ＭＳにより決定して、ヒトＣＤ７３(配列番号１または２)のアミノ酸残基６５〜８３および１５７〜１７２に対応する。

【0284】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、Ｘ線結晶学で決定して、表３０に示すものに対応するヒトＣＤ７３と相互作用を有する。抗体は、表３０に示すヒトＣＤ７３と相互作用の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％を共有し得る。

【0285】

III. 特定の生殖系列配列を有する抗体
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子からの重鎖可変領域および／または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子からの軽鎖可変領域を含む。

【0286】

ここに示すように、ヒト生殖系列Ｖ_Ｈ ３−３３遺伝子、Ｖ_Ｈ ３−１０遺伝子、Ｖ_Ｈ ３−１５遺伝子、Ｖ_Ｈ ３−１６、ＪＨ６ｂ遺伝子、Ｖ_Ｈ ６−１９遺伝子、Ｖ_Ｈ ４−３４遺伝子および／またはＪＨ３ｂ遺伝子の産物であるまたはそれ由来である重鎖可変領域を含む、ＣＤ７３に特異的なヒト抗体が産生されている。したがって、ここに提供されるのは、Ｖ_Ｈ ３−３３、Ｖ_Ｈ ３−１０、Ｖ_Ｈ ３−１５、Ｖ_Ｈ ３−１６、Ｖ_Ｈ ６−１９およびＶ_Ｈ ４−３４からなる群から選択されるヒトＶ_Ｈ 生殖系列遺伝子の産物であるまたはそれ由来である重鎖可変領域を含む、ヒトＣＤ７３に特異的な単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。

【0287】

ヒト生殖系列ＶＫ Ｌ６遺伝子、ＶＫ Ｌ１８遺伝子、ＶＫ Ｌ１５遺伝子、ＶＫ Ｌ２０遺伝子、ＶＫ Ａ２７遺伝子、ＪＫ５遺伝子、ＪＫ４遺伝子、ＪＫ２遺伝子およびＪＫ１遺伝子の産物であるまたはそれ由来である軽鎖可変領域を含む、ＣＤ７３に特異的なヒト抗体は産生されている。したがって、ここに提供されるのは、ＶＫ Ｌ６、ＶＫ Ｌ１８、ＶＫ Ｌ１５、ＶＫ Ｌ２０およびＶＫ Ａ２７からなる群から選択されるヒトＶＫ 生殖系列遺伝子の産物であるまたはそれ由来である軽鎖可変領域を含む、ヒトＣＤ７３に特異的な単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。

【0288】

ここに記載する好ましい抗体は、上記ヒト生殖系列Ｖ_Ｈ 遺伝子の一つの産物であるまたはそれ由来である重鎖可変領域を含み、また上記ヒト生殖系列ＶＫ 遺伝子の一つの産物であるまたはそれ由来である軽鎖可変領域も含むものである。

【0289】

ここで使用するヒト抗体は、抗体の可変領域が、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用するシステムにより得られるならば、特定の生殖系列配列“の産物である”または“それに由来する”重鎖または軽鎖可変領域を含む。このようなシステムは、ヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスを目的の抗原で免疫化するまたはファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを目的の抗原でスクリーニングすることを含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列“の産物である”または“それに由来する”ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、ヒト抗体の配列と配列が最も近い(すなわち、最大％同一性)ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することなどにより、同定できる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列“の産物である”または“それに由来する”ヒト抗体は、例えば、天然に存在する体細胞性変異または部位特異的変異の意図的導入により、生殖系列配列と比較して、アミノ酸差異を含み得る。しかしながら、選択ヒト抗体は、一般にヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列(例えば、マウス生殖系列配列)と比較して、ヒト抗体をヒトとして特定するアミノ酸残基を含む。ある場合、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９５％またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。一般に、特定のヒト生殖系列配列由来のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と１０を超えるアミノ酸差異を示さない。ある場合、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と５を超えないまたはさらには４、３、２または１を超えないアミノ酸差異を示し得る。

【0290】

IV. 相同抗体
ここに記載する好ましい抗体のアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体が包含され、ここで、抗体は、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体の所望の機能的性質を保持する。

【0291】

例えば、単離抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んでよく、ここで、
(ａ)重鎖可変領域は配列番号４、１６、３２、４０、５２、６０、６８、８０、８８、１３５および１７０〜１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号４、１６、３２、４０、５２、６０、６８、８０、８８、１３５および１７０〜１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してそれぞれ１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５または１〜５０アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含む；
(ｂ)軽鎖可変領域は配列番号８、１２、２０、２４、２８、３６、４４、４８、５６、６４、７２、７６、８４、９２および１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号８、１２、２０、２４、２８、３６、４４、４８、５６、６４、７２、７６、８４、９２および２３８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してそれぞれ１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５または１〜５０アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含む；
(ｃ)抗体はＣＤ７３に特異的に結合する、かつ
(ｄ)抗体は、表３に挙げた機能的性質の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または全てを示す。

【0292】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、上(すなわち、(ａ)〜(ｄ))に記載した同一性パーセントおよび／またはアミノ酸変化および機能を含み、ここで、重鎖可変領域のＣＤＲ３は、配列番号７、１９、３５、４３、５５、６３、７１、８３および９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、所望により重鎖可変領域のＣＤＲ１は配列番号５、１７、３３、４１、５３、６１、６９、８１および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、所望により重鎖可変領域のＣＤＲ２は、配列番号６、１８、３４、４２、５４、６２、７０、８２および９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0293】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、上(すなわち、(ａ)〜(ｄ))に記載した同一性パーセントおよび／またはアミノ酸変化および機能を含み、ここで、軽鎖可変領域のＣＤＲ３は配列番号１１、１５、２３、２７、３１、３９、４７、５１、５９、６７、７５、７９、８７、９５および２４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、所望により軽鎖可変領域のＣＤＲ１は、配列番号９、１３、２１、２５、２９、３７、４５、４９、５７、６５、７３、７７、８５、９３および２３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、所望により軽鎖可変領域のＣＤＲ２は、配列番号１０、１４、２２、２６、３０、３８、４６、５０、５８、６６、７４、７８、８６、９４および２４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0294】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、上(すなわち、(ａ)〜(ｄ))に記載した同一性パーセントおよび／またはアミノ酸変化および機能を含み、ここで、重鎖可変領域のＣＤＲ３は、配列番号７、１９、３５、４３、５５、６３、７１、８３および９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、所望により重鎖可変領域のＣＤＲ１は配列番号５、１７、３３、４１、５３、６１、６９、８１および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、所望により重鎖可変領域のＣＤＲ２は、配列番号６、１８、３４、４２、５４、６２、７０、８２および９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、軽鎖可変領域のＣＤＲ３は配列番号１１、１５、２３、２７、３１、３９、４７、５１、５９、６７、７５、７９、８７、９５および２４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、所望により軽鎖可変領域のＣＤＲ１は、配列番号９、１３、２１、２５、２９、３７、４５、４９、５７、６５、７３、７７、８５、９３および２３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、所望により軽鎖可変領域のＣＤＲ２は、配列番号１０、１４、２２、２６、３０、３８、４６、５０、５８、６６、７４、７８、８６、９４および２４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0295】

種々の態様において、抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。

【0296】

単離抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、重鎖および軽鎖を含んでよく、ここで、
(ａ)重鎖は配列番号１００、１０３、１０７、１０９、１１２、１１４、１１６、１１９、１２１、１３３、１８４〜２１０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１００、１０３、１０７、１０９、１１２、１１４、１１６、１１９、１２１、１３３および１８４〜２１０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してそれぞれ１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５または１〜５０アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含む；
(ｂ)軽鎖は配列番号１０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０８、１１０、１１１、１１３、１１５、１１７、１１８、１２０および１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０８、１１０、１１１、１１３、１１５、１１７、１１８、１２０および１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してそれぞれ１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５または１〜５０アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含む；
(ｃ)抗体はＣＤ７３に特異的に結合する、かつ
(ｄ)抗体は、表３に挙げた機能的性質の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または全てを示す。

【0297】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体上(すなわち、(ａ)〜(ｄ))に記載した同一性パーセントおよび／またはアミノ酸変化および機能を有する重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖可変領域のＣＤＲ３は、配列番号７、１９、３５、４３、５５、６３、７１、８３および９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、所望により重鎖可変領域のＣＤＲ１は配列番号５、１７、３３、４１、５３、６１、６９、８１および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、所望により重鎖可変領域のＣＤＲ２は、配列番号６、１８、３４、４２、５４、６２、７０、８２および９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0298】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体上(すなわち、(ａ)〜(ｄ))に記載した同一性パーセントおよび／またはアミノ酸変化および機能を有する重鎖および軽鎖を含み、ここで、軽鎖可変領域のＣＤＲ３は配列番号１１、１５、２３、２７、３１、３９、４７、５１、５９、６７、７５、７９、８７、９５および２４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、所望により軽鎖可変領域のＣＤＲ１は、配列番号９、１３、２１、２５、２９、３７、４５、４９、５７、６５、７３、７７、８５、９３および２３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、所望により軽鎖可変領域のＣＤＲ２は、配列番号１０、１４、２２、２６、３０、３８、４６、５０、５８、６６、７４、７８、８６、９４および２４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0299】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体上(すなわち、(ａ)〜(ｄ))に記載した同一性パーセントおよび／またはアミノ酸変化および機能を有する重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖可変領域のＣＤＲ３は、配列番号７、１９、３５、４３、５５、６３、７１、８３および９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、所望により重鎖可変領域のＣＤＲ１は配列番号５、１７、３３、４１、５３、６１、６９、８１および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、所望により重鎖可変領域のＣＤＲ２は、配列番号６、１８、３４、４２、５４、６２、７０、８２および９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、軽鎖可変領域のＣＤＲ３は配列番号１１、１５、２３、２７、３１、３９、４７、５１、５９、６７、７５、７９、８７、９５および２４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、所望により軽鎖可変領域のＣＤＲ１は、配列番号９、１３、２１、２５、２９、３７、４５、４９、５７、６５、７３、７７、８５、９３および２３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、所望により軽鎖可変領域のＣＤＲ２は、配列番号１０、１４、２２、２６、３０、３８、４６、５０、５８、６６、７４、７８、８６、９４および２４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0300】

また提供されるのは、ＣＤ７３.４−１、ＣＤ７３.４−２、ＣＤ７３.３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１の対応するＣＤＲと１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)で異なる、Ｖ_ＨＣＤＲ１、Ｖ_ＨＣＤＲ２、Ｖ_ＨＣＤＲ３、Ｖ_ＬＣＤＲ１、Ｖ_ＬＣＤＲ２および／またはＶ_ＬＣＤＲ３を含む、抗ＣＤ７３抗体である。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤ７３.４−１、ＣＤ７３.４−２、ＣＤ７３.３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、１１Ｆ１１、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１における対応する配列と比較して、１個、２個、３個、４個、５個または６個のＣＤＲ各々に１〜５アミノ酸変化を含む。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤ７３.４−１、ＣＤ７３.４−２、ＣＤ７３.３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１におけるＣＤＲと比較して、全ＣＤＲにわたり、計１〜５アミノ酸変化を含む。

【0301】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤ７３.４−１またはＣＤ７３.４−２のものからなるＶ_ＨおよびＶ_Ｌ ＣＤＲを含み、ここで、１以上のＣＤＲにおけるアミノ酸の１以上は、他のここに開示する抗ＣＤ７３抗体の一つのものである。

【0302】

抗ＣＤ７３抗体の可変領域配列に付し得る変異(例えば、置換、付加、欠失)は、次のものに基づき決定できる：(ｉ)実施例に記載するように、抗体に導入された変異；および(ii)ここに記載する抗ＣＤ７３抗体の可変ドメインにおける各位置でのアミノ酸残基の比較(表３５および図３５参照)：抗ＣＤ７３抗体におけるある位置の異なるアミノ酸は、その位置のアミノ酸残基が抗体の活性に顕著に影響することなく他のアミノ酸残基に変更できることを示し得る；一方、同一アミノ酸残基が、抗ＣＤ７３抗体のいくつかまたは全ての同一位置で見られるならば、これは、この特定のアミノ酸を保持すべきであり、他の残基に変えるべきではないことを示唆し得る。例示的態様を下に提供する。

【0303】

ある態様において、フレームワーク置換を、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体の重鎖可変領域(例えば、ＳまたはＡへの、例えば、保存的置換)を２５位

【化3】

[この文献は図面を表示できません]

に導入し得る。例えば、この位置のアミノ酸がＴであるならば、ＡまたはＳへの置換が導入できる；この位置のアミノ酸がＡであるならば、ＳまたはＴへの置換が導入できる；およびこの位置のアミノ酸がＳであるならば、ＴまたはＡへの置換が導入できる。抗体２４Ｈ２、４Ｄ４、１０Ｄ２、６Ｅ１１、７Ａ１１、１１Ａ６および４Ｃ３はこの位置にＡを有し、１１Ｆ１１はこの位置にＴを有し、７３.５、７３.７および７３.９はこの位置にＳを有する。

【0304】

同様に、ある態様において、フレームワーク置換を、重鎖可変領域(例えば、ＶからＬまたはＬからＶ)の９４位

【化4】

[この文献は図面を表示できません]

のアミノ酸に導入し得る。例えば、抗体１１Ｆ１１、７３.３−７３.１０、２４Ｈ２、４Ｄ４、５Ｆ８および１０Ｄ２はこの位置にＶを有し、６Ｅ１１、７Ａ１１、１１Ａ６および４Ｃ３はこの位置にＬを有する。

【0305】

ある態様において、アミノ酸置換を、ここに開示する抗ＣＤ７３抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ２に対してなし得る。例えば、５２位

【化5】

[この文献は図面を表示できません]

のアミノ酸をＷに置換でき、またはこの位置のアミノ酸がＷであるならば、該アミノ酸をＬで置換できる(抗体１１Ｆ１１および７３.４−７３.７はこの位置にＬを有し、抗体７３.８−７３.１０、２４Ｈ２および４Ｄ４はこの位置にＷを有する)。

【0306】

同様に、ある態様において、５４位

【化6】

[この文献は図面を表示できません]

のアミノ酸をＳまたはＥで置換でき、またはこの位置のアミノ酸がＳであるならば、アミノ酸をＥで置換できる。抗体１１Ｆ１１、７３.４、７３.５、２４Ｈ２、１０Ｄ２および５Ｆ８はこの位置にＧを有し、抗体７３.６−７３.９、６Ｅ１１、７Ａ１１、４Ｃ３および７３.３はこの位置にＳを有し、抗体７３.１０および４Ｄ４はこの位置にＥを有する。

【0307】

可変領域における他の許容できる置換は、上記に準ずる原理を使用して、図３５における重鎖および軽鎖可変領域配列のアラインメントに基づき、決定できる。

【0308】

ＣＤ７３.３、ＣＤ７３.４、ＣＤ７３.５、ＣＤ７３.６、ＣＤ７３.７、ＣＤ７３.８、ＣＤ７３.９、ＣＤ７３.１０、ＣＤ７３.１１、１１Ｆ１１、４Ｃ３、４Ｄ４、１０Ｄ２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８、６Ｅ１１および／または７Ａ１１のものと相同性を有する配列、例えば、それぞれ配列番号４、１６、３２、４０、５２、６０、６８、８０、８８、１３５、１７０〜１７７および配列番号８、１２、２０、２４、２８、３６、４４、４８、５６、６４、７２、７６、８４、９２のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域またはそれぞれ配列番号１００、１０３、１０７、１０９、１１２、１１４、１１６、１１９、１２１、１３３および１８４〜２１０および配列番号１０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０８、１１０、１１１、１１３、１１５、１１７、１１８、１２０および１２２の重鎖および軽鎖またはＣＤＲを有する抗体を、核酸分子、例えば、配列番号１３９、１４２、１４６、１４８、１５１、１５３、１５５、１５８、１６０、２３７および／または配列番号１４０、１４１、１４３、１４４、１４５、１４７、１４９、１５０、１５２、１５４、１５６、１５７、１５９、１６１または配列番号１３４、２４３、２４６、２５０、２５２、２５５、２５７、２５９、２６２、２６４および／または配列番号２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５１、２５３、２５４、２５６、２５８、２６０、２６１、２６３、２６５、２６６の変異誘発(例えば、部位特異的またはＰＣＲ介在変異誘発)と、続くここに記載する機能的アッセイを使用するコードされた改変抗体の機能保持に関する試験により得ることができる。

【0309】

Ｖ. 保存的修飾を有する抗体
抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含んでよく、ここで、これらのＣＤＲ配列の１以上は、ここに記載する好ましい抗体、例えば、ＣＤ７３.４−１、ＣＤ７３.４−２、ＣＤ７３.３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１またはその保存的修飾に基づいて特定されたアミノ酸配列を含み、抗体は、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体の所望の機能的性質を保持する。したがって、単離抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含んでよく、ここで、
(ａ)重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号７、１９、３５、４３、５５、６３、７１、８３および９１およびその保存的修飾、例えば、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５保存的アミノ酸置換のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
(ｂ)軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号１１、１５、２３、２７、３１、３９、４７、５１、５９、６７、７５、７９、８７および９５およびその保存的修飾、例えば、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５保存的アミノ酸置換のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
(ｃ)抗体はＣＤ７３に特異的に結合する、かつ
(ｄ)抗体は、表３に挙げた機能的性質の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または全てを示す。

【0310】

好ましい態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号６、１８、３４、４２、５４、６２、７０、８２および９０およびその保存的修飾、例えば、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５保存的アミノ酸置換のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；そして軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号１０、１４、２２、２６、３０、３８、４６、５０、５８、６６、７４、７８、８６および９４およびその保存的修飾、例えば、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５保存的アミノ酸置換のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。他の好ましい態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号５、１７、３３、４１、５３、６１、６９、８１および８９およびその保存的修飾、例えば、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５保存的アミノ酸置換のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号９、１３、２１、２５、２９、３７、４５、４９、５７、６５、７３、７７、８５および９３およびその保存的修飾、例えば、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５保存的アミノ酸置換のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0311】

種々の態様において、抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。

【0312】

保存的アミノ酸置換は、抗体のＣＤＲ以外の部分またはＣＤＲに加えて他の部分にも実施されてよい。例えば、保存的アミノ酸修飾は、フレームワーク領域または定常領域、例えば、Ｆｃ領域で実施されてよい。ここに記載する置換のいずれも保存的置換であり得る。可変領域または重鎖または軽鎖は、ここに提供する抗ＣＤ７３抗体配列と比較して、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５または１〜５０保存的アミノ酸置換を含み得る。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、保存的および非保存的アミノ酸修飾の組み合わせを含む。

【0313】

VI. ここに記載する抗体とＣＤ７３上の同一エピトープに結合するまたはＣＤ７３の結合について競合する抗体
また提供されるのは、特定のここに記載する抗ＣＤ７３抗体(例えば、抗体ＣＤ７３.４、ＣＤ７３.３、１１Ｆ１１、４Ｃ３、４Ｄ４、１０Ｄ２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８、６Ｅ１１および７Ａ１１)とＣＤ７３の結合について競合する抗体である。このような競合抗体は、標準ＣＤ７３結合アッセイにおいてモノクローナル抗体１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１、７Ａ１１および／またはＣＤ７３.３またはＣＤ７３.４(これらの抗体についてここに記載したあらゆる定常領域および軽鎖を有する)の１以上のＣＤ７３の結合について競合的に阻害する能力に基づき、同定され得る。例えば、組み換えヒトＣＤ７３タンパク質をプレートに固定し、種々の濃度の非標識第一抗体を添加し、プレートを洗浄し、標識第二抗体を添加し、洗浄し、結合標識の量を測定する、標準ＥＬＩＳＡアッセイまたは競合的ＥＬＩＳＡアッセイを使用できる。非標識(第一)抗体(“遮断抗体”とも称する)の濃度の増加により、標識(第二)抗体の結合が阻害されるならば、第一抗体は、プレート上の標的への第二抗体の結合を阻害するまたは第二抗体の結合と競合すると言える。これに加えてまたはこれとは別に、BIACORE^{(登録商標)}SPR分析を、抗体が競合する能力の評価に使用できる。試験抗体がここに記載する抗ＣＤ７３抗体のＣＤ７３への結合を阻害する能力は、試験抗体が、ＣＤ７３への結合について該抗体と競合できることを示す。

【0314】

またここに提供されるのは、例えば、上の段落に記載したアッセイを使用するような、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳにより測定して、細胞、例えば、腫瘍細胞上のＣＤ７３へのここに記載する抗ＣＤ７３抗体の結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％阻害する抗ＣＤ７３抗体および／またはその細胞、例えば、腫瘍細胞上のＣＤ７３への結合が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％阻害される抗ＣＤ７３抗体である。

【0315】

ここに記載する抗ＣＤ７３抗体と結合について競合する抗体を、当分野で知られる方法を使用して同定できる。例えば、マウスをここに記載するヒトＣＤ７３で免疫化し、ハイブリドーマを産生し、得られたモノクローナル抗体を、ＣＤ７３への結合についてここに記載する抗体と競合する能力をスクリーニングし得る。また、マウスを、抗体が結合するエピトープを含むＣＤ７３の小フラグメントで免疫化し得る。エピトープまたはエピトープを含む領域を、例えば、ＣＤ７３にわたる一連の重複ペプチドへの結合についてスクリーニングすることにより、同定できる。あるいは、Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994の方法を、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体と同一エピトープを、それゆえに類似性質を有する抗体を選択する手引きとして使用し得る。ファージディスプレイを使用して、まず、抗ＣＤ７３抗体の重鎖を、(好ましくはヒト)軽鎖のレパートリーと対形成させてＣＤ７３結合抗体を選択し、次いで新規軽鎖を、(好ましくはヒト)重鎖のレパートリーと対形成させて、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体と同一エピトープまたはエピトープ領域を有する(好ましくはヒト)ＣＤ７３結合抗体を選択する。あるいはここに記載する抗体のバリアントを、抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡの変異誘発により得ることができる。

【0316】

ここに記載する抗体と“ＣＤ７３上の同一エピトープ”に結合する抗体を決定する技術は、例えば、エピトープの原子分解を提供する抗原：抗体複合体の結晶のｘ線分析のような、エピトープマッピング法を含む。他の方法は、抗体の抗原フラグメントまたは抗原の変異された変種への結合をモニターし、ここで、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾による結合の喪失は、しばしば、エピトープ構成成分の指標と考えられる。さらに、コンピューターによるエピトープマッピングのためのコンビナトリアル法も使用できる。方法は、また、目的の抗体が、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから、特異的短ペプチド(天然三次元形態または変性形態のいずれか)を親和性単離する能力も利用し得る。こうしてペプチドは、ペプチドライブラリーのスクリーニングに使用する抗体に対応するエピトープの定義のためのリードとして考慮される。エピトープマッピングについて、立体構造的不連続エピトープのマップを示しているコンピューターによるアルゴリズムも開発されている。

【0317】

Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085により記載されるアラニンスキャニング変異誘発またはＣＤ７３におけるアミノ酸残基の点変異誘発のある他の形態も抗ＣＤ７３抗体の機能的エピトープの決定に使用できる。しかしながら、変異誘発試験は、ＣＤ７３の全体的３次元構造には重要であるが、抗体−抗原接触に直接的は関与していないアミノ酸残基も露出させることがあり、それゆえに、この方法を使用して決定した機能的エピトープの確認に、他の方法が必要である可能性がある。

【0318】

特定の抗体により結合されるエピトープまたはエピトープ領域(“エピトープ領域”はエピトープを含むまたはエピトープと重複する領域である)はまたＣＤ７３のフラグメント、例えば、非変性または変性フラグメントを含むペプチドへの抗体の結合によっても決定し得る。ＣＤ７３(例えば、ヒトＣＤ７３)の配列を含む一連の重複ペプチドを合成し、例えば直接ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ(ペプチドが、マイクロタイタープレートのウェルに結合したＣＤ７３への抗体の結合を阻止する能力を評価する)またはチップ上で、結合についてスクリーニングし得る。このようなペプチドスクリーニング法は、ある不連続機能的エピトープ、すなわちＣＤ７３ポリペプチド鎖の一次配列に添って隣接していないアミノ酸残基を含む機能的エピトープを検出することはできないことがあり得る。

【0319】

エピトープはまた水素／重水素交換マススペクトロメトリー(ＨＤＸ−ＭＳ)およびタンパク質の急速光化学酸化(ＦＰＯＰ)のようなＭＳベースのタンパク質フットプリント法によっても同定され得る。ＨＤＸ−ＭＳは、例えば、実施例においておよびWei et al., (2014) Drug Discovery Today 19:95(その方法は、引用によりここに具体的に包含させる)にさらに記載されているように実施し得る。ＦＰＯＰは、例えば、Hambley and Gross (2005) J. American Soc. Mass Spectrometry 16:2057(その方法は、引用によりここに具体的に包含させる)に記載されているように実施し得る。

【0320】

抗ＣＤ７３抗体によるエピトープ結合はまた、ＣＤ７３における不安定アミド水素の、遊離時および目的の抗体との複合体で結合時のＨ−Ｄ交換率のＮＭＲ決定を含む、Ｘ線結晶構造決定(例えば、ＷＯ２００５／０４４８５３)、分子モデリングおよび核磁気共鳴(ＮＭＲ)スペクトロスコピーのような構造的方法によっても決定し得る(Zinn-Justin et al., (1992) Biochemistry 31, 11335-11347; Zinn-Justin et al., (1993) Biochemistry 32, 6884-6891)。

【0321】

Ｘ線結晶学に関して、結晶化は、マイクロバッチ(例えばChayen (1997) Structure 5:1269-1274)、ハンギングドロップ蒸気拡散(例えばMcPherson (1976) J. Biol. Chem. 251:6300-6303)、種晶添加および透析を含む、当分野で知られる方法のいずれかを使用して達成し得る(例えばGiege et al., (1994) Acta Crystallogr. D50:339-350; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189:1-23)。少なくとも約１mg／mL、好ましくは約１０mg／mL〜約２０mg／mLの濃度を有するタンパク質調製物の使用が望ましい。結晶化は、約１０％〜約３０％(ｗ／ｖ)の濃度範囲で、ポリエチレングリコール１０００〜２０,０００(ＰＥＧ；約１０００〜約２０,０００Da範囲の平均分子量)、好ましくは約５０００〜約７０００Da、より好ましくは約６０００Daを含む沈殿剤溶液を用いて最良に達成され得る。タンパク質安定化剤、例えばグリセロールを、約０.５％〜約２０％の濃度範囲で含むことが望ましいこともある。塩化ナトリウム、塩化リチウムまたはクエン酸ナトリウムのような適当な塩も、沈殿剤溶液に望ましいことがあり、好ましくは約１mM〜約１０００mMの濃度である。沈殿剤は、好ましくは約３.０〜約５.０、好ましくは約４.０のｐＨに緩衝化される。沈殿剤溶液において有用な特定の緩衝液は変わり得て、当分野で周知である(Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994) Springer-Verlag, New York)。有用な緩衝液の例は、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳおよび酢酸を含むが、これらに限定されない。結晶は、２℃、４℃、８℃および２６℃を含む広範な温度で成長し得る。

【0322】

抗体：抗原結晶は、周知のＸ線回折技術を使用して検討でき、Ｘ−ＰＬＯＲ(Yale University, 1992, distributed by Molecular Simulations, Inc.；例えばBlundell & Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press；米国特許出願公開２００４／００１４１９４参照)およびＢＵＳＴＥＲ(Bricogne(1993) Acta Cryst, D49:37-60; Bricogne (1997) Meth. Enzymol. 276A:361-423, Carter & Sweet, eds.; Roversi et al., (2000) Acta Cryst, D56:1313-1323)のようなコンピュータソフトウェアを使用して緻密化でる。これら文献の記載を引用によりその全体を本明細書に包含させる。

【0323】

抗ＣＤ７３抗体は、ここに記載する技術、すなわちエピトープマッピング技術により、ここに記載するアミノ酸配列を有する抗ＣＤ７３抗体のいずれかと同一エピトープに結合できることが確認できる。抗ＣＤ７３抗体はまたヒトＣＤ７３と類似する相互作用も有しており、例えば、表３０に示す相互作用の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上を有することがＸ線結晶学で確認できる。

【0324】

VII. 改変および修飾抗体
Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域
また提供されるのは、修飾抗体を作製するための出発物質としてここに開示するＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列の１以上を有する抗体を使用して製造できる、改変され、修飾された抗体であり、この修飾抗体は、出発抗体とは異なる性質を有し得る。抗体は、一方または両方の可変領域内(すなわち、Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ)、例えば１以上のＣＤＲ領域内および／または１以上のフレームワーク領域内の１以上の残基の修飾により改変され得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗体は、例えば、抗体のエフェクター機能を改変するために、定常領域内の残基の修飾により改変され得る。

【0325】

実施し得る可変領域エンジニアリングの１タイプは、ＣＤＲ移植である。抗体は、主に６重鎖および軽鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも、抗体毎に多様性に富む。ＣＤＲ配列が大部分の抗体−抗原相互作用を担うため、異なる性質を有する異なる抗体からのフレームワーク配列に移植された特定の参照抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の参照抗体の性質を模倣する組み換え抗体を発現させることが可能である(例えば、Riechmann, L. et al., (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al., (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al., (1989) Proc. Natl. Acad. See, U.S.A, 86:10029-10033；米国特許５,２２５,５３９(Winter)および米国特許５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２および６,１８０,３７０(Queen et al.)参照)。

【0326】

したがって、ここに記載する他の態様は、それぞれ配列番号５、１７、３３、４１、５３、６１、６９、８１および８９、配列番号６、１８、３４、４２、５４、６２、７０、８２および９０ならびに配列番号７、１９、３５、４３、５５、６３、７１、８３および９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、それぞれ配列番号９、１３、２１、２５、２９、３７、４５、４９、５７、６５、７３、７７、８５および９３、配列番号１０、１４、２２、２６、３０、３８、４６、５０、５８、６６、７４、７８、８６および９４ならびに配列番号１１、１５、２３、２７、３１、３９、４７、５１、５９、６７、７５、７９、８７および９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。それゆえに、このような抗体は、モノクローナル抗体ＣＤ７３.４−１、ＣＤ７３.４−２、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および７Ａ１１のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ ＣＤＲ配列を含み、さらにこれらの抗体の異なるフレームワーク配列を含み得る。

【0327】

このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的ＤＮＡデータベースまたは公開された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子に関する生殖系列ＤＮＡ配列は、“ＶＢａｓｅ”ヒト生殖系列配列データベース(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseでインターネット上で入手可能)ならびにKabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., (1992) “The Repertoire of Human Germline V_H Sequences Reveals about Fifty Groups of V_H Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol. Biol. 227:776-798; およびCox, J, P, L, et al., (1994) “A Directory of Human Germ-line V_H Segments Reveals a Strong Bias in their Usage” Eur. J. Immunol. 24:827-836に見ることができ；この各々の内容は、引用により明示的に本明細書に包含させる。

【0328】

ここに記載する抗体で使用するための好ましいフレームワーク配列は、ここに記載する抗体により使用されるフレームワーク配列と構造的に類似するものである。Ｖ_Ｈ ＣＤＲ１、２および３配列およびＶ_Ｌ ＣＤＲ１、２および３配列を、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子に見られるのと同一配列を有するフレームワーク領域に移植できまたはＣＤＲ配列を、生殖系列配列と比較して２０までの、好ましくは保存的な、アミノ酸置換を含むフレームワーク領域に移植できる。例えば、ある例において、抗体の抗原結合能を維持または増強するために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが判明している(例えば、米国特許５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２および６,１８０,３７０(Queen et al.)参照)。

【0329】

ここに記載する改変抗体は、例えば、抗体の性質を改善するために、Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ内のフレームワーク残基に修飾がなされているものを含む。一般に、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性の低減のために行う。例えば、一つの試みは、１以上のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に“復帰変異”させることである。より具体的に、体細胞性変異を受けている抗体は、抗体が由来した生殖系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列と、抗体が由来した生殖系列配列を比較することにより同定できる。フレームワーク領域配列を生殖系列配置に戻すことにより、体細胞性変異は、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ介在変異誘発により、生殖系列配列に“復帰変異”される。このような“復帰変異”抗体も、包含されると意図される。

【0330】

他のタイプのフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それゆえに抗体の可能性のある免疫原性を軽減するために、フレームワーク領域または１以上のＣＤＲ領域内内の１以上の残基を変異することを含む。この試みは、“脱免疫化”とも称され、米国特許公報２００３０１５３０４３(Carr et al.)に詳細に記載されている。

【0331】

他のタイプの可変領域修飾は、目的の抗体の１以上の結合性(例えば、親和性)を改善するための、ＣＤＲ領域内のアミノ酸残基の変異である。部位特異的変異誘発またはＰＣＲ介在変異誘発を、変異の導入に使用でき、抗体結合または他の目的の機能的性質に対する効果を、実施例に提供するようなインビトロまたはインビボアッセイで評価できる。好ましくは保存的修飾(上記のとおり)を導入する。変異は、アミノ酸付加でも、欠失でも、好ましくは置換でもよい。さらに、一般にＣＤＲ領域内は、１個、２個、３個、４個または５個を超える残基を改変させない。

【0332】

したがって、また提供されるのは、(ａ)配列番号５、１７、３３、４１、５３、６１、６９、８１および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号５、１７、３３、４１、５３、６１、６９、８１および８９と比較して、１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ１領域；(ｂ)配列番号６、１８、３４、４２、５４、６２、７０、８２および９０からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号６、１８、３４、４２、５４、６２、７０、８２および９０と比較して、１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ２領域；(ｃ)配列番号７、１９、３５、４３、５５、６３、７１、８３および９１からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号７、１９、３５、４３、５５、６３、７１、８３および９１と比較して、１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ３領域；(ｄ)配列番号９、１３、２１、２５、２９、３７、４５、４９、５７、６５、７３、７７、８５および９３からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号９、１３、２１、２５、２９、３７、４５、４９、５７、６５、７３、７７、８５および９３と比較して、１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ１領域；(ｅ)配列番号１０、１４、２２、２６、３０、３８、４６、５０、５８、６６、７４、７８、８６および９４からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１０、１４、２２、２６、３０、３８、４６、５０、５８、６６、７４、７８、８６および９４と比較して、１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ２領域；および(ｆ)配列番号１１、１５、２３、２７、３１、３９、４７、５１、５９、６７、７５、７９、８７および９５からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１１、１５、２３、２７、３１、３９、４７、５１、５９、６７、７５、７９、８７および９５と比較して、１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ３領域を含む、重鎖可変領域を含む、単離抗ＣＤ７３モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。

【0333】

抗体のＣＤＲにおけるメチオニン残基は、酸化され、化学分解の可能性とその後の抗体の効力の低減が起こり得る。したがって、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲにおける１以上のメチオニン残基が、酸化的分解を受けないアミノ酸残基で置換されている抗ＣＤ７３抗体も提供される。

【0334】

同様に、特にＣＤＲにおける、脱アミド化部位を抗ＣＤ７３抗体から除き得る。

【0335】

抗原結合ドメイン内のグリコシル化の可能性のある部位は、好ましくは抗原結合を妨害し得るグリコシル化を阻止するために排除する。例えば、米国特許５,７１４,３５０参照。

【0336】

標的化抗原結合
種々の態様において、本発明の抗体を、抗原結合が有害であろう組織および環境における抗原結合を選択的に遮断するが、有益であろう場所で抗原結合を可能とするよう、修飾する。ある態様において、抗体の抗原結合表面に異的に結合し、抗原結合を妨害する遮断ペプチド“マスク”が産生され、このマスクを、ペプチダーゼ開裂可能リンカーにより抗体の結合アームの各々に連結させる。例えば、米国特許８,５１８,４０４(CytomX)参照。このような構築物は、非腫瘍組織と比較して腫瘍微小環境においてプロテアーゼレベルが高度に上昇している癌の処置に有用である。腫瘍微小環境における開裂可能リンカーの選択的開裂は、抗原結合が望まない副作用を起こす末梢組織ではなく、腫瘍において選択的にマスキング／遮断ペプチドを解離させ、抗原結合させる。

【0337】

あるいは、関連する態様において、(二価)抗体の両抗原結合表面に結合し、抗原結合を妨害する２個の抗原結合ドメインを含む二価結合化合物(“マスキングリガンド”)が開発され、こいおで、２個の結合ドメインマスクは、例えばペプチダーゼにより開裂可能な、開裂可能リンカーで互いに(抗体ではない)連結されている。例えば、国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０７７６４３(Tegopharm Corp.)参照。マスキングリガンドは、抗体による結合が意図される抗原を含んでも、それ由来でもよくまたは独立して産生されてもよい。このようなマスキングリガンドは、非腫瘍組織と比較して、腫瘍微小環境においてプロテアーゼレベルが高度に上昇している癌の処置に有用である。腫瘍微小環境における開裂可能リンカーの選択的開裂は、２個の結合ドメインのお互いからの解離を可能にし、抗体の抗原結合表面に対するアビディティーを低減させる。マスキングリガンドの抗体からの結果的な解離は、抗原結合が望まない副作用を起こす末梢組織ではなく、腫瘍において選択的な抗原結合を可能とする。

【0338】

Ｆｃおよび修飾Ｆｃ
抗原結合ドメインの抗原への結合に起因する治療抗体の活性(例えばアンタゴニスト抗体の場合同族リガンドもしくは受容体タンパク質のまたはアゴニスト抗体の場合誘発シグナル伝達の遮断)に加えて、抗体のＦｃ部分は、多数の生物学的効果を惹起するために、一般に複雑な方法で免疫系と相互作用する。免疫グロブリンのＦｃ領域は、抗原依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)、補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)および抗体依存性細胞食作用(ＡＤＣＰ)のようなエフェクター機能のような多くの重要な抗体機能を担い、機能の違いはあれど、標的細胞を殺す。

【0339】

抗ＣＤ７３抗体は、ここに記載する抗体の可変ドメインと、意図する使用のために抗体の生物学的活性(もしあれば)に基づき選択した種々のＦｃ領域を含む定常ドメインを含む。Salfeld (2007) Nat. Biotechnol. 25:1369。ヒトＩｇＧは、例えば、４サブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に分類され、これらの各々が、Ｆｃγ受容体(活性化受容体ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲIIＡ、ＦｃγＲIIＣ(ＣＤ３２)；ＦｃγＲIIIＡおよびＦｃγＲIIIＢ(ＣＤ１６)および抑制性受容体ＦｃγＲIIＢ)の１以上との結合についておよび補体の第１成分(Ｃ１ｑ)について独特のプロファイルを有するＦｃ領域を含む。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、全Ｆｃγ受容体に結合する；ＩｇＧ２はＦｃγＲIIＡ_Ｈ１３１に、および親和性は低いがＦｃγＲIIＡ_Ｒ１３１ ＦｃγＲIIIＡ_Ｖ１５８に結合する；ＩｇＧ４はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIＡ、ＦｃγＲIIＢ、ＦｃγＲIIＣおよびＦｃγＲIIIＡ_Ｖ１５８に結合する；そして阻害性受容体ＦｃγＲIIＢは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３に他の全Ｆｃγ受容体より低い親和性を有する。Bruhns et al., (2009) Blood 113:3716。ＦｃγＲＩがＩｇＧ２に結合せず、ＦｃγＲIIIＢがＩｇＧ２またはＩｇＧ４に結合しないことを示す研究がある。Id。一般に、ＡＤＣＣ活性に関して、ヒトＩｇＧ１≧ＩｇＧ３>>ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２である。その結果、例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ではなく、ＩｇＧ１定常ドメインが、ＡＤＣＣが望まれるとき、薬物における使用のために選択されるはずである；ＦｃγＲIIIＡ発現ＮＫ細胞、単球またはマクロファージの活性化が望まれるならば、ＩｇＧ３が選択されるはずである；そして抗体がアレルギー患者の脱感作に使用されるならば、ＩｇＧ４が選択されるはずである。抗体が全エフェクター機能を欠くことが望ましいならば、ＩｇＧ４がまた選択され得る。

【0340】

したがって、ここに記載する抗ＣＤ７３可変領域は、Ｆｃ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃに連結(例えば、共有結合性に連結または融合)してよくく、これは、あらゆるアロタイプまたはイソアロタイプでよく、例えば、ＩｇＧ１に関して、：Ｇ１ｍ、Ｇ１ｍ１(ａ)、Ｇ１ｍ２(ｘ)、Ｇ１ｍ３(ｆ)、Ｇ１ｍ１７(ｚ)；ＩｇＧ２に関して：Ｇ２ｍ、Ｇ２ｍ２３(ｎ)；ＩｇＧ３に関して：Ｇ３ｍ、Ｇ３ｍ２１(ｇ１)、Ｇ３ｍ２８(ｇ５)、Ｇ３ｍ１１(ｂ０)、Ｇ３ｍ５(ｂ１)、Ｇ３ｍ１３(ｂ３)、Ｇ３ｍ１４(ｂ４)、Ｇ３ｍ１０(ｂ５)、Ｇ３ｍ１５(ｓ)、Ｇ３ｍ１６(ｔ)、Ｇ３ｍ６(ｃ３)、Ｇ３ｍ２４(ｃ５)、Ｇ３ｍ２６(ｕ)、Ｇ３ｍ２７(ｖ)であってよい(例えば、Jefferis et al., (2009) mAbs 1:1参照)。アロタイプの選択は、例えば抗薬物抗体の形成を最小とするための、可能性のある免疫原性の懸念により影響され得る。

【0341】

ここに記載する可変領域は、一般に、血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合および／または抗体依存性細胞傷害のような、抗体の機能的性質の１以上を改変するための、１以上の修飾を含むＦｃに連結され得る。さらに、ここに記載する抗体は、化学的に修飾されてよく(例えば、１以上の化学基を抗体に結合できる)またはグリコシル化を変えるために修飾して、抗体の機能的性質の１以上を変えるために修飾してもよい。これらの態様の各々を下にさらに詳述する。Ｆｃ領域における残基のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵ指数のものである。ここに開示する配列バリアントは、所望によりその位置にに天然に存在する残基が前にあり、残基番号とその後の天然に存在するアミノ酸の代わりに置換されるアミノ酸を参照して提供される。複数アミノ酸がある位置に存在し得るならば、例えば配列が天然に存在するアイソタイプ間で異なるならばまたは複数の変異がその位置で置換され得るならば、スラッシュで分ける(例えば“Ｘ／Ｙ／Ｚ”)。

【0342】

例えば、親Ｆｃと比較して、(ａ)増加したまたは低減した抗体依存性細胞介在細胞毒性(ＡＤＣＣ)、(ｂ)増加したまたは低減した補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)、(ｃ)増加したまたは低減したＣ１ｑに対する親和性および／または(ｄ)増加したまたは低減したＦｃ受容体に対する親和性を有するＦｃバリアントを産生するために、Ｆｃ領域に修飾を付し得る。このようなＦｃ領域バリアントは、一般にＦｃ領域に少なくとも１アミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾組み合わせは、特に望ましいと考えられる。例えば、バリアントＦｃ領域は、例えばここに同定する特定のＦｃ領域位置の、２、３、４、５等の置換をその中に含む。例示的Ｆｃ配列バリアントはここに開示され、米国特許５,６２４,８２１；６,２７７,３７５；６,７３７,０５６；６,１９４,５５１；７,３１７,０９１；８,１０１,７２０；ＰＣＴ特許公開ＷＯ００／４２０７２；ＷＯ０１／５８９５７；ＷＯ０４／０１６７５０；ＷＯ０４／０２９２０７；ＷＯ０４／０３５７５２；ＷＯ０４／０７４４５５；ＷＯ０４／０９９２４９；ＷＯ０４／０６３３５１；ＷＯ０５／０７０９６３；ＷＯ０５／０４０２１７、ＷＯ０５／０９２９２５およびＷＯ０６／０２０１１４に提供される。

【0343】

エフェクター機能低減
ＡＤＣＣ活性を、Ｆｃ領域の修飾により低減し得る。ある態様において、Ｆｃ受容体への結合に影響する部位、好ましくはサルベージ受容体結合部位以外の部位を除去してよい。他の態様において、Ｆｃ領域を修飾して、ＡＤＣＣ部位を除去し得る。ＡＤＣＣ部位は当分野で知られる；例えば、ＩｇＧ１におけるＡＤＣＣ部位に関して、Sarmay et al., (1992) Molec. Immunol. 29 (5): 633-9参照。ある態様において、ヒトＩｇＧ１のＧ２３６ＲおよびＬ３２８Ｒバリアントは、効率的にＦｃγＲ結合を排除する。Horton et al., (2011) J. Immunol. 186:4223およびChu et al., (2008) Mol. Immunol. 45:3926。他の態様において、ＦｃγＲへの結合が低減したＦｃは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａを含む。Gross et al., (2001) Immunity 15:289。

【0344】

ＣＤＣ活性もまたＦｃ領域の修飾により低減され得る。ＩｇＧ１位置Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９およびＰ３３１での変異、特にアラニン変異Ｄ２７０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９ＡおよびＰ３３１Ａは、対応する抗体がＣ１ｑと結合し、補体を活性化する能力を顕著に低減させる。Idusogie et al., (2000) J. Immunol. 164:4178；ＷＯ９９／５１６４２。ＩｇＧ１の３３１位の修飾(例えばＰ３３１Ｓ)は、補体結合を低減することが示されている。Tao et al., (1993) J. Exp. Med. 178:661およびCanfield &Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483。他の例において、アミノ酸２３１〜２３９位内の１以上のアミノ酸残基を変え、それにより抗体が補体を固定する能力を低減する。ＷＯ９４／２９３５１。

【0345】

ある態様において、補体固定が低減したＦｃは、アミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを有する。Gross et al., (2001) Immunity 15:289。

【0346】

エフェクター機能を完全に避けるべきであるとき、例えば抗原結合のみが、所望の治療利益を得るのみ十分であり、エフェクター機能は望まない副作用を誘発する(またはリスクを増やす)だけであるときの使用のために、ＩｇＧ４抗体を使用してよくまたは抗体またはＦｃ領域またはその実質的部分を欠くフラグメントを誘導体化できまたはＦｃを完全にグリコシル化を排除するように変異させ得る(例えばＮ２９７Ａ)。あるいは、エフェクター機能を欠き、ＦｃγＲへの結合能を欠き(ＩｇＧ２のように)、補体を活性化できない(ＩｇＧ４のように)、ヒトＩｇＧ２(Ｃ_Ｈ１ドメインおよびヒンジ領域)およびヒトＩｇＧ４(Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメイン)のハイブリッド構築物が産生されている。Rother et al., (2007) Nat. Biotechnol. 25:1256。Mueller et al., (1997) Mol. Immunol. 34:441; Labrijn et al., (2008) Curr. Op. Immunol. 20:479もまた参照(一般にエフェクター機能を低減させるためのＦｃ修飾が記載)。

【0347】

他の態様において、Ｆｃ領域を、少なくとも１アミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置換することにより置き換え、抗体の全エフェクター機能を低減する。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１以上のアミノ酸を、抗体のエフェクターリガンドに対する親和性が減少するが、親抗体の抗原結合能を保持するように、異なるアミノ酸残基で置き換え得る。親和性を変え得るエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体(残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７)または補体のＣ１構成成分(残基２９７、３１８、３２０、３２２)である。米国特許５,６２４,８２１および５,６４８,２６０(両者ともWinter et al.)。

【0348】

ＷＯ８８／００７０８９は、ＡＤＣＣを低減するためのＦｃγＲＩへの結合を低減するため(２３４Ａ；２３５Ｅ；２３６Ａ；Ｇ２３７Ａ)またはＣＤＣを排除するための補体構成成分Ｃ１ｑへの結合を遮断するため(Ｅ３１８ＡまたはＶ／Ｋ３２０ＡおよびＫ３２２Ａ／Ｑ)のＩｇＧ Ｆｃ領域における修飾を提案している。Duncan & Winter (1988) Nature 332:563; Chappel et al., (1991) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 88:9036;およびSondermann et al., (2000) Nature 406:267を参照のこと(ＦｃγＲIII結合におけるこれらの変異の効果を記載)。

【0349】

エフェクター機能を低減するＦｃ修飾は、２３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌおよび３２８Ｒのような２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２６７位、２６９位、３２５位および３２８位での置換、挿入および欠失を含む。Ｆｃバリアントは、２３６Ｒ／３２８Ｒを含み得る。ＦｃｙＲおよび補体相互作用を低減するための他の修飾は、置換２９７Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３７Ａ、３１８Ａ、２２８Ｐ、２３６Ｅ、２６８Ｑ、３０９Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２９Ｓ、２３８Ｓ、２３３Ｐおよび２３４Ｖを含む。これらおよび他の修飾は、Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691にレビューされている。ＩｇＧ１におけるＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、所望によりＧ２３６Δ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ；ＩｇＧ４におけるＥ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、所望によりＧ２３６Δ；およびＩｇＧ２におｋるＡ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓのような２３３〜２３６位および３２７〜３３１位の１以上のＩｇＧ残基の変異により、新生児ＦｃＲ結合(半減期を維持)を維持しながら、エフェクター機能(ＡＤＣＣおよび補体活性化の両者)を低減できる。Armour et al., (1999) Eur. J. Immunol. 29:2613；ＷＯ９９／５８５７２参照。エフェクター機能を低減させる他の変異は、ＩｇＧ１におけるＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ(Alegre et al., (1994) Transplantation 57:1537)；ＩｇＧ２におけるＶ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ(Cole et al., (1997) J. Immunol. 159:3613；米国特許５,８３４,５９７も参照)；およびＩｇＧ４のＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅ(Reddy et al., (2000) J. Immunol. 164:1925)を含む。ヒトＩｇＧ１におけるエフェクター機能を低減するための変異の他の組み合わせは、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５ＥおよびＰ３３１Ｓを含む。Oganesyan et al., (2008) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 64:700。一般にLabrijn et al., (2008) Curr. Op. Immunol. 20:479参照。Ｆｃ(ＩｇＧ１)融合タンパク質(アバタセプト)においてエフェクター機能を低減することが判明したさらなる変異は、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓである(ＥＵ残基ナンバリング)。Davis et al., (2007) J. Immunol. 34:2204。

【0350】

ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣが低減した他のＦｃバリアントは、Glaesner et al., (2010) Diabetes Metab. Res. Rev. 26:287(ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰを低減するためのＩｇＧ４におけるＦ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ)；Hutchins et al., (1995) Proc. Nat'l Acad. Sci, (USA) 92:11980(ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ、Ｇ２３７ＡおよびＥ３１８Ａ)；An et al., (2009) MAbs 1:572および米国特許出願公開２００７／０１４８１６７(ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ)；McEarchern et al., (2007) Blood 109:1185(ＩｇＧ１におけるＣ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ)；Vafa et al., (2014) Methods 65:114(ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ｖ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ)に開示されている。

【0351】

ある態様において、本質的にエフェクター機能を有しない、すなわち、ＦｃγＲへの結合が減少し、かつ補体固定が減少したＦｃを選択する。エフェクターレスであるＦｃ、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃの例は、次の５変異を含む：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ。Gross et al., (2001) Immunity 15:289。これらの変異ｗお含む重鎖の例は、表３５に詳述するように、配列表に示す。これらの５置換をＮ２９７Ａと組み合わせて、同様にグリコシル化を排除し得る。

【0352】

エフェクター機能増強
あるいは、ＡＤＣＣ活性を、Ｆｃ領域の修飾により増強させ得る。ＡＤＣＣ活性に関して、ヒトＩｇＧ１≧ＩｇＧ３>>ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２であり、ゆえにＩｇＧ２またはＩｇＧ４ではなく、ＩｇＧ１定常ドメインを、ＡＤＣＣが望ましいときの薬物における使用に選択すべきである。あるいは、次の位置の１以上のアミノ酸の修飾によりＦｃ領域を修飾して、抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)を増加および／またはＦｃγ受容体に対する親和性を増加し得る：２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６２、２６３、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１３、３１５、３２０、３２２、３２４、３２５、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８または４３９。ＷＯ２０１２／１４２５１５参照；またＷＯ００／４２０７２参照。置換の例は、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄおよび３３２Ｅを含む。バリアントの例は、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ａ／２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｆ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ、２６７Ｅ／３２４Ｔおよび２６７Ｅ／２６８Ｆ／３２４Ｔを含む。例えば、所望によりＩ３３２Ｅと組み合わせ得るＧ２３６Ａバリアントを含むヒトＩｇＧ１Ｆｃは、ＦｃγIIＡ／ＦｃγIIＢ結合親和性比の約１５倍の増加を示す。Richards et al., (2008) Mol. Cancer Therap. 7:2517; Moore et al., (2010) mAbs 2:181。ＦｃｙＲおよび補体相互作用を増強する他の修飾は、置換２９８Ａ、３３３Ａ、３３４Ａ、３２６Ａ、２４７Ｉ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、３９６Ｌ、３０５Ｉおよび３９６Ｌを含むが、これらに限定されない。これらおよび他の修飾は、Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691にレビューされている。特に、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの両者を、ＩｇＧ１のＥ３３３位の変化、例えばＥ３３３Ａにより増強し得る。Shields et al., (2001) J. Biol. Chem. 276：6591。ＩｇＧ１におけるエフェクター機能を増強するためのＰ２４７ＩおよびＡ３３９Ｄ／Ｑ変異の使用はＷＯ２００６／０２０１１４に開示され、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ±Ｓ２９８Ｄ／ＶはＷＯ２００４／０７４４５５。Ｋ３２６Ａ／Ｗに記載され、ヒトＩｇＧ１におけるＥ３３３Ａ／Ｓバリアント、ＩｇＧ２におけるＥ３３３Ｓは、エフェクター機能を増加することが示されている。Idusogie et al., (2001) J. Immunol. 166:2571。

【0353】

特に、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲII、ＦｃγＲIIIおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１の結合部位はマッピングされており、結合が改善したバリアントが記載されている。Shields et al., (2001) J. Biol. Chem. 276：6591-6604。２５６位、２９０位、２９８位、３３３位、３３４位および３３９位での特異的変異は、組み合わせ変異体Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａを含むＦｃγＲIIIへの結合を改善することが示されている(増強されたＦｃγＲIIIａ結合およびＡＤＣＣ活性を有する)。ＦｃγＲIIIａへの結合が強く増強された他のＩｇＧ１バリアントが同定されており、ＦｃγＲIIIａへの親和性における最大増加、ＦｃγＲIIｂ結合減少およびカニクイザルサルにおける強力な細胞毒性活性を示す、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ変異を有するバリアントを含む。Lazar et al.(2006) Proc. Nat'l Acad Sci. (USA) 103:4005; Awan et al., (2010) Blood 115:1204; Desjarlais & Lazar (2011) Exp. Cell Res. 317:1278。アレムツズマブ(ＣＤ５２特異的)、トラスツズマブ(ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的)、リツキシマブ(ＣＤ２０特異的)およびセツキシマブ(ＥＧＦＲ特異的)のような抗体への三重変異導入は、インビトロでのＡＤＣＣ活性の高度な増強に置き換えられ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅバリアントは、サルにおけるＢ細胞を枯渇する能力の増強を示した。Lazar et al. (2006) Proc. Nat'l Acad Sci. (USA) 103:4005。さらに、Ｂ細胞悪性腫瘍および乳癌のモデルにおけるヒトＦｃγＲIIIａを発現するトランスジェニックマウスにおいて、ＦｃγＲIIIａへの結合増強と同時にＡＤＣＣ活性増強を示す、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５ＩおよびＰ３９６Ｌ変異を含むＩｇＧ１変異体が同定されている。Stavenhagen et al., (2007) Cancer Res. 67:8882；米国特許８,６５２,４６６；Nordstrom et al., (2011) Breast Cancer Res. 13:R123。

【0354】

種々のＩｇＧアイソタイプは、区別的なＣＤＣ活性(ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞＞ＩｇＧ２≒ＩｇＧ４)を示す。Dangl et al., (1988) EMBO J. 7:1989。ＣＤＣの増強が望ましい使用について、Ｃ１ｑへの結合を増加する変異の導入も可能である。補体を補充する能力(ＣＤＣ)は、ＩｇＧ２におけるＫ３２６Ｗ(ＡＤＣＣ活性を低減させる)およびＥ３３３ＳのようなＫ３２６および／またはＥ３３３の変異により増強でき、補体カスケードの第１成分であるＣ１ｑへの結合を増加させる。Idusogie et al., (2001) J. Immunol. 166:2571。Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ(単独でまたは任意の組み合わせで)のヒトＩｇＧ１への導入は、Ｃ１ｑ結合を増強させる。Moore et al., (2010) mAbs 2:181。Natsume et al., (2008) Cancer Res. 68:3863ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッドアイソタイプ抗体“１１３Ｆ”のＦｃ領域(その中の図１)もＣＤＣの増強を提供する。Michaelsen et al., (2009) Scand. J. Immunol. 70:553およびRedpath et al., (1998) Immunology 93:595も参照のこと。

【0355】

ｅエフェクター機能を増強または低減し得るさらなる変異は、Dall'Acqua et al., (2006) J. Immunol. 177:1129に開示されている。Carter (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:343; Presta (2008) Curr. Op. Immunol. 20:460も参照のこと。

【0356】

阻害性受容体ＦｃｙＲIIｂへの親和性を増強するＦｃバリアントも、例えばアポトーシス誘発またはアジュバント活性の増強のために、使用できる。Li & Ravetch (2011) Science 333:1030; Li & Ravetch (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci (USA) 109:10966；米国特許出願公開２０１４／００１０８１２。このようなバリアントは、例えばＢ細胞および単球を含む、ＦｃｙＲｌｌｂ^＋細胞と関係する免疫調節性活性を有する抗体を提供し得る。ある態様において、Ｆｃバリアントは、１以上の活性化受容体に比して、ＦｃｙＲｌｌｂへの親和性の選択的増強を提供する。ＦｃｙＲｌｌｂへの結合改変のための修飾は、ＥＵ指数により２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８および３３２からなる群から選択される位置での１以上の修飾を含む。ＦｃｙＲｌｌｂ親和性増強のための置換の例は、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｆ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙおよび３３２Ｅを含むが、これらに限定されない。置換の例は、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗおよび３２８Ｙを含む。ＦｃｙＲｌｌｂへの結合を増強するための他のＦｃバリアントは、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅおよび２６７Ｅ／３２８Ｆを含む。特に、ヒトＩｇＧ１のＳ２６７Ｅ＋Ｌ３２８Ｆダブルバリアントを含むＳ２６７Ｅ、Ｇ２３６Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、Ｌ３２８ＦおよびＩ３３２Ｅバリアントは、阻害性ＦｃｙＲｌｌｂ受容体への親和性の特異的増強に特に価値がある。Chu et al., (2008) Mol. Immunol. 45:3926；米国特許出願公開２００６／０２４２９８；ＷＯ２０１２／０８７９２８。ＦｃγＲIIｂへの増強された特異性(ＦｃγＲIIａ^Ｒ１３１と区別して)は、Ｐ２３８Ｄ置換の付加により得ることができる。Mimoto et al., (2013) Protein. Eng. Des. & Selection 26:589；ＷＯ２０１２／１１５２４１。

【0357】

ある態様において、抗体を修飾して、その生物学的半減期を延長させる。種々の試みが可能である。例えば、これは、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合親和性を高めることにより行い得る。ある態様において、米国特許５,８６９,０４６および６,１２１,０２２(Presta et al.)に記載のように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２ループから採ったサルベージ受容体結合エピトープを含むように、抗体をＣＨ１またはＣＬ領域内で改変する。ＦｃＲｎへの結合が増加したおよび／または薬物動態性質が改善した他のＦｃバリアント例は、例えば２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙおよび４３４Ｍを含む、２５９位、３０８位および４３４位の置換を含む。ＦｃＲｎへのＦｃ結合が増加した他のバリアントは、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ(Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al., 2006 Journal of Immunology 176:346-356)、２５６Ａ、２７２Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ(Shields et al., Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604)、２５２Ｆ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、４３３Ｒ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ(Dall Acqua et al., Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)を含む。米国特許８,３６７,８０５参照。

【0358】

Ｎ４３４Ａバリアント(Yeung et al., (2009) J. Immunol. 182:7663)のような、ＩｇＧ Ｆｃにおけるある保存的残基(Ｉ２５３／Ｈ３１０／Ｑ３１１／Ｈ４３３／Ｎ４３４)の修飾が、ＦｃＲｎ親和性を増加し、そうして循環における抗体半減期を延長する手段として提案されている。ＷＯ９８／０２３２８９。Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを含む組み合わせＦｃバリアントは、最大５倍のＦｃＲｎ結合増加および血清半減期延長が示されている。Zalevsky et al., (2010) Nat. Biotechnol. 28:157。Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ修飾を含む組み合わせＦｃバリアントも、ＩｇＧ１抗体の半減期が延長する。Petkova et al., (2006) Int. Immunol. 18:1759。さらに、Ｍ２５２Ｙ／Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｆ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ａ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＭおよびＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含む組み合わせＦｃバリアントの半減期を延長することが示されている。ＷＯ２００９／０８６３２０。

【0359】

さらに、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅを含む組み合わせＦｃバリアントは、半減期を延長する − 約４倍。Dall'Acqua et al., (2006) J. Biol. Chem. 281:23514。ＦｃＲｎ親和性を増加させるが、ｐＨ依存性は低減する関連ＩｇＧ１修飾(Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ)が、ＦｃＲｎへの他の抗体のｔ結合を阻止するためのコンペティターとして使用するＩｇＧ１構築物(“ＭＳＴ−ＨＮ Ａｂｄｅｇ”)の創出に使用されており、内在性ＩｇＧ(例えば自己免疫性増強)または他の外来性(治療)ｍＡｂのいずれかにおいて当該他の抗体のクリアランスの増加を生じる。Vaccaro et al., (2005) Nat. Biotechnol. 23:1283；ＷＯ２００６／１３０８３４。

【0360】

ＦｃＲｎ結合を増加させる他の修飾は、Yeung et al., (2010) J. Immunol. 182:7663-7671；６,２７７,３７５；６,８２１,５０５；ＷＯ９７／３４６３１；ＷＯ２００２／０６０９１９に記載されている。

【0361】

ある態様において、ハイブリッドＩｇＧアイソタイプを使用してＦｃＲｎ結合を増加させ、おそらく半減期を延長させ得る。例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッドバリアントを、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるＩｇＧ１位置を、ＩｇＧ３からのアミノ酸で、これら２アイソタイプが異なる位置において置き換えることにより、構築し得る。それゆえに、１以上の置換、例えば、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２Ｉ、４３５Ｒおよび４３６Ｆを含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体を構築し得る。ここに記載する他の態様において、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッドバリアントを、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるＩｇＧ２位置を、ＩｇＧ１からのアミノ酸で、これら２アイソタイプが異なる位置において置き換えることにより、構築し得る。それゆえに、１以上の置換、例えば、次のアミノ酸置換２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ(２３６位へのグリシン挿入をいう)および３２７Ａの１以上を含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体を構築し得る。米国特許８,６２９,１１３参照。意図的に血清半減期延長および発現改善がされたＩｇＧ１／ＩｇＧ２／ＩｇＧ４配列のハイブリッドが産生されている。米国特許７,８６７,４９１(その中の配列番号１８)。

【0362】

本発明の抗体の血清半減期はまたペグ化により延長できる。抗体をペグ化して、例えば、抗体の生物学的(例えば、血清)半減期を延長できる。抗体をペグ化するために、抗体またはそのフラグメントを、一般にポリエチレングリコール(ＰＥＧ)試薬、例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１以上のＰＥＧ基が抗体または抗体フラグメントと結合するようになる条件下で反応させる。好ましくは、ペグ化を反応性ＰＥＧ分子(または類似反応性水可溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応により実施する。ここで使用する用語“ポリエチレングリコール”は、モノ(Ｃ１−Ｃ１０)アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドのような他のタンパク質の誘導体化に使用されているＰＥＧのあらゆる形態を含むことを意図する。ある態様において、ペグ化する抗体はグリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化する方法は当分野で知られ、ここに記載する抗体に適用できる。例えば、ＥＰ０１５４３１６(Nishimura et al.)およびＥＰ０４０１３８４(Ishikawa et al.)参照。

【0363】

あるいは、ある状況下では、本発明の抗体の半減期を、延長させるのではなく、短縮することが望ましいことがある。ヒトＩｇＧ１のＦｃにおけるＩ２５３Ａ(Hornick et al., (2000) J. Nucl. Med. 41:355)およびＨ４３５Ａ／Ｒ Ｉ２５３ＡまたはＨ３１０Ａ(Kim et al., (2000) Eur. J. Immunol. 29:2819)のような修飾は、医療造影のような迅速なクリアランスが好ましい状況において使用するために、ＦｃＲｎ結合を低減し、それゆえに半減期を延長し得る(クリアランス増加)。Kenanova et al., (2005) Cancer Res. 65:622もまた参照。クリアランスを増強する他の手段は、ＦａｂフラグメントのようなＦｃＲｎを結合する能力を欠く抗体フラグメントとして、本発明の抗原結合ドメインを形成することを含む。このような修飾は、抗体の循環半減期を、数週間からほんの数時間に減少できる。次いで、抗体フラグメントの選択的ペグ化を使用して、必要に応じて、抗体フラグメントの半減期を微調整(延長)できる。Chapman et al., (1999) Nat. Biotechnol. 17:780。抗体フラグメントをまた半減期を延長させるために、例えば、融合タンパク質構築物において、ヒト血清アルブミンと融合させ得る。Yeh et al., (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. 89:1904。あるいは、二特異性抗体を、本発明の第一抗原結合ドメインおよびヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)に結合する第二抗原結合ドメインで構築し得る。国際特許出願公開ＷＯ２００９／１２７６９１およびその中に引用された特許参考文献参照。あるいは、特殊化されたポリペプチド配列、例えば“ＸＴＥＮ”ポリペプチド配列を抗体フラグメントに付加して、半減期を延長できる。Schellenberger et al., (2009) Nat. Biotechnol. 27:1186；国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０９１１２２。

【0364】

さらなるＦｃバリアント
ＩｇＧ４定常ドメインを使用するとき、置換２２８Ｐを包含させることが通常好ましく、これは、ＩｇＧ１におけるヒンジ配列を模倣し、それゆえに、ＩｇＧ４分子を安定化し、例えば治療抗体と処置患者における内在性ＩｇＧ４の間のＦａｂアーム交換を減少させる。Labrijn et al., (2009) Nat. Biotechnol. 27:767; Reddy et al., (2000) J. Immunol. 164:1925。

【0365】

ＩｇＧ１構築物のヒンジにおけるプロテアーゼ開裂部位の可能性を、Ｄ２２１ＧおよびＫ２２２Ｓ修飾により排除し、抗体の安定性を増加させ得る。ＷＯ２０１４／０４３３４４。

【0366】

Ｆｃバリアントのそのリガンド(Ｆｃ受容体)に対する親和性および結合性質を、平衡方法(例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)またはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ))または動態(例えば、BIACORE^{(登録商標)}SPR分析)および間接的結合アッセイ、競合的阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー(例えば、ゲル濾過)のような他の方法を含むが、これらに限定されない、当分野で知られる多様なインビトロアッセイ法(生化学的または免疫学的ベースのアッセイ)により決定できる。これらおよび他の方法は、試験する構成成分の１以上の標識および／または発色標識、蛍光標識、発光標識または同位体標識を含むが、これらに限定されない多様な検出方法を用いることができる。結合親和性および動態の詳細な記載は、抗体−免疫原相互作用に焦点を絞る、Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)に見ることができる。

【0367】

さらに他の態様において、抗体のグリコシル化を、エフェクター機能の増強または低減のために修飾する。例えば、２９７位の保存的アスパラギン残基の変異(例えばＮ２９７Ａ)により、全エフェクター機能を欠き、ゆえに、補体およびＦｃγＲＩ結合が消失された非グリコシル化抗体を製造できる。Bolt et al., (1993) Eur. J. Immunol. 23:403。Tao & Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595も参照(２９７位のグリコシル化排除のためにＩｇＧ１におけるＮ２９７Ｑ使用)。

【0368】

非グリコシル化抗体は、一般にエフェクター機能を欠くが、その機能を保持させる変異が導入できる。非グリコシル化抗体、例えばＮ２９７Ａ／Ｃ／Ｄ／またはＨ変異由来またはタンパク質をグリコシル化しないシステム(例えば大腸菌)で産生させたものを、さらに変異、例えばＳ２９８Ｇおよび／またはＴ２９９Ａ／Ｇ／またはＨ(ＷＯ２００９／０７９２４２)またはＥ３８２ＶおよびＭ４２８Ｉ(Jung et al., (2010) Proc. Nat'l Acad. Sci (USA) 107:604)させて、ＦｃγＲ結合を保持し得る。

【0369】

さらに、ＡＤＣＣが増強された抗体は、グリコシル化の改変により製造できる。例えば、重鎖Ａｓｎ２９７結合オリゴ糖からのフコース除去は、ＦｃγＲIIIａへの結合の改善に基づき、ＡＤＣＣを増強することが示されている。Shields et al., (2002) JBC 277:26733; Niwa et al., (2005) J. Immunol. Methods 306: 151; Cardarelli et al., (2009) Clin. Cancer Res. 15:3376 (MDX-1401); Cardarelli et al., (2010) Cancer Immunol. Immunotherap. 59:257 (MDX-1342)。このような低フコース抗体は、例えば、フコシルトランスフェラーゼ(ＦＵＴ８)を欠くノックアウトチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞Yamane-Ohnuki et al., (2004) Biotechnol. Bioeng. 87:614)またはフコシル化抗体を産生する他の細胞で産生され得る(例えば、Zhang et al., (2011) mAbs 3:289およびLi et al., (2006) Nat. Biotechnol. 24:210(両者とも糖改変ピキア・パストリスにおける抗体産生を記載する)；Mossner et al., (2010) Blood 115:4393; Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733; Shinkawa et al., (2003) J. Biol. Chem. 278:3466；ＥＰ１１７６１９５Ｂ１。ＡＤＣＣはまた、ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５に記載のように増強でき、これは、同様に宿主細胞で発現される抗体の低フコシル化をもたらす、フコースのＡｓｎ(２９７)結合炭水化物への結合能が減少したバリアントＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃ１３を使用する(Shields, R.L. et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照)。あるいは、フコースアナログを、抗体の炭水化物へのフコース取り込みを阻害するために、抗体産生中培養培地に添加し得る。ＷＯ２００９／１３５１８１。

【0370】

抗体結合オリゴ糖における二分したＧｌｃＮａｃ構造の増加も、ＡＤＣＣを増強させる。ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２(Umana et al.)は、改変細胞株で発現された抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性を増加させる二分したＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、ベータ(１,４)−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(ＧｎＴIII))を発現するように改変した細胞株を記載する(Umana et al., (1999) Nat. Biotech. 17:176-180も参照)。

【0371】

ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰの増強を示すがＣＤＣは減少されるガラクトース、シアル酸、フコースおよびキシロース残基を欠く(いわゆるＧＮＧＮ糖形態)、ならびにＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣの増強を示すシアル酸、フコースおよびキシロースを欠くその他(いわゆるＧ１／Ｇ２糖形態)、さらなるグリコシル化バリアントが開発されている。米国特許出願公開２０１３／０１４９３００。これらのグリコシル化パターンを有する抗体は、内在性キシロシルおよびフコシルトランスフェラーゼ遺伝子がノックアウトされている、遺伝子修飾されたベンサミアナタバコ植物において最適に産生される。

【0372】

糖エンジニアリングを使用して、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７に結合した炭水化物鎖のα２,６シアリル含量の変化により、ＩｇＧ構築物の抗炎症性性質も修飾でき、ここで、α２,６シアル酸付加形態増加が抗炎症性効果増強に至る。Nimmerjahn et al., (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:513参照。逆に、α２,６シアル酸付加炭水化物を有する抗体の割合の減少が、抗炎症性性質が望まれない場合に有用であり得る。例えばα２,６シアル酸付加形態の選択的精製または酵素修飾により、抗体のα２,６シアル酸付加含量を修飾する方法が、米国特許出願公開２００８／０２０６２４６に提供される。他の態様において、Ｆｃ領域のアミノ酸配列を修飾して、例えば、Ｆ２４１Ａ修飾の導入により、α２,６シアル酸付加の効果を模倣し得る。ＷＯ２０１３／０９５９６６。

【0373】

VIII. 抗体物理的性質
ここに記載する抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかに１以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、抗原結合の改変により、抗体の免疫原性増加または抗体のｐＫの改変にいたり得る(Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J. Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al., (2000) Mol Immunol 37:697-706)。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフで生じることが知られている。ある状況において、可変領域グリコシル化を含まない抗ＣＤ７３抗体を有することが好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択するか、グリコシル化領域内の残基を変異させることにより、達成できる。

【0374】

ある態様において、ここに記載する抗体は、アスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンの脱アミド化はＮ−ＧまたはＤ−Ｇ配列で生じ得て、ポリペプチド鎖にねじれを導入し、安定性を低減し得るイソアスパラギン酸残基(イソアスパラギン酸効果)の創出に至り得る。例えば、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｇｌｙが抗体の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ配列に存在するならば、配列を、異性化を受けないアミノ酸配列に置換する。ある態様において、抗体は、配列番号６に示すが、Ａｓｐ−Ｇｌｙ配列

【化7】

[この文献は図面を表示できません]

におけるＡｓｐまたはＧｌｙが、異性化を受けないアミノ酸配列、例えば、Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＳｅｒ−Ｇｌｙ配列に置き換えられている、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列を含む。

【0375】

各抗体は、独特の等電点(ｐＩ)を有し、これは、一般に６〜９.５のｐＨ範囲に入る。ＩｇＧ１抗体のｐＩは、一般に７〜９.５のｐＨ範囲に入り、ＩｇＧ４抗体のｐＩは、一般に６〜８のｐＨ範囲に入る。正常範囲外のｐＩを有する抗体は、若干変性しており、インビボ条件下で不安定であり得ると推測される。それゆえに、正常範囲に入るｐＩ値を含む抗ＣＤ７３抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲のｐＩを有する抗体の選択または荷電表面残基の変異により達成される。

【0376】

各抗体は、特徴的融解温度を有し、高い融解温度は、インビボでの高い全体的安定性を示す(Krishnamurthy R and Manning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71)。一般に、Ｔ_Ｍ１(最初の変性温度)が６０℃より高いのが好ましく、好ましくは６５℃より高い、よりさらに好ましくは７０℃より高い。抗体の融点は、示差走査熱量測定(Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52)または円二色性(Murray et al., (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9)を使用して、測定できる。

【0377】

好ましい態様において、急速に分解しない抗体を選択する。抗体の分解は、キャピラリー電気泳動(ＣＥ)およびＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して、測定できる(Alexander A JおよびHughes D E (1995) Anal Chem 67:3626-32)。

【0378】

他の好ましい態様において、最小凝集効果を有する抗体を選択し、凝集効果は、望まない免疫応答の惹起および／または改変されたまたは不都合な薬物動態性質に至り得る。一般に、２５％以下、好ましくは２０％以下、よりさらに好ましくは１５％以下、よりさらに好ましくは１０％以下およびよりさらに好ましくは５％以下の凝集の抗体が許容される。凝集は、サイズ排除カラム(ＳＥＣ)、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)および光散乱を含む、いくつかの技術により測定できる。

【0379】

IX. 抗体をエンジニアリングする方法
上記のように、ここに開示するＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列を有する抗ＣＤ７３抗体を使用して、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列またはそれに結合した定常領域の修飾により、新規抗ＣＤ７３抗体を創出できる。それゆえに、ここに記載する他の面において、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体、例えばＣＤ７３.４、１１Ｆ１１、４Ｃ３、４Ｄ４、１０Ｄ２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８、６Ｅ１１および／または７Ａ１１の構造的特徴を使用して、ヒトＣＤ７３およびカニクイザルＣＤ７３への結合のような、ここに記載する抗体の機能的性質の少なくとも一つを保持する構造的に関連する抗ＣＤ７３抗体を創出する。例えば、１１Ｆ１１、４Ｃ３、４Ｄ４、１０Ｄ２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８、６Ｅ１１および／または７Ａ１１の１以上のＣＤＲ領域またはその変異を、既知フレームワーク領域および／または他のＣＤＲと遺伝子組み換え的に組み合わせて、上記のように、さらなる、組み換えによりエンジニアリングされた、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体を創出できる。他のタイプの修飾は、先のセクションに記載したものを含む。改変法のための出発物質は、１以上のここに提供するＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列または１以上のそのＣＤＲ領域である。改変抗体を創出するために、ここに提供するＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列または１以上のそのＣＤＲ領域の１以上を有する抗体を実際に製造する(すなわち、タンパク質を発現する)必要はない。むしろ、配列に含まれる情報を、元の配列に由来する“第二世代”配列の創出のための出発物質として使用し、次いで、“第二世代”配列を製造し、タンパク質として発現させる。

【0380】

したがって、ここに提供されるのは、抗ＣＤ７３抗体を製造する方法であって：
(ａ)(ｉ)配列番号５、１７、３３、４１、５３、６１、６９、８１および８９からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号６、１８、３４、４２、５４、６２、７０、８２および９０からなる群から選択されるＣＤＲ２配列および／または配列番号７、１９、３５、４３、５５、６３、７１、８３および９１からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域抗体配列；および(ii)配列番号９、１３、２１、２５、２９、３７、４５、４９、５７、６５、７３、７７、８５および９３からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１０、１４、２２、２６、３０、３８、４６、５０、５８、６６、７４、７８、８６および９４からなる群から選択されるＣＤＲ２配列および／または配列番号１１、１５、２３、２７、３１、３９、４７、５１、５９、６７、７５、７９、８７および９５からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供し；
(ｂ)重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１アミノ酸残基を改変して、少なくとも一つの改変抗体配列を創出し；そして
(ｃ)改変抗体配列をタンパク質として発現させる
ことを含む、方法である。

【0381】

標準分子生物学技術を、改変抗体配列の製造および発現に使用できる。
好ましくは、改変抗体配列によりコードされる抗体は、表３に挙げるものを含むここに記載する抗ＣＤ７３抗体の機能的性質の１個、数個または全てを保持する。

【0382】

改変抗体は、ここに記載する機能的アッセイを使用して、機能的性質の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０または全てを示し得る。改変抗体の機能的性質を、当分野で利用可能なおよび／または実施例に示すもののようなここに記載する標準アッセイ(例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ)を使用して、評価できる。

【0383】

ここに記載する抗体をエンジニアリングする方法のある態様において、抗ＣＤ７３抗体コード化配列の全てまたは一部に添って、無作為にまたは選択的に変異が導入でき、得られた修飾抗ＣＤ７３抗体を、ここに記載するように、結合活性および／または他の機能的性質についてスクリーニングできる。変異的方法は、文献に記載されている。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９２７８０(Short)は、飽和変異誘発、合成ライゲーションアッセンブリまたはこれらの組み合わせを使用する、抗体変異を創出およびスクリーニングする方法を記載する。あるいは、ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０７４６７９(Lazar et al.)は、抗体の生理化学的性質を最適化するための、コンピューターによるスクリーニング法を使用する方法を記載する。

【0384】

Ｘ. 核酸分子
ここに記載する他の面は、ここに記載する抗体をコードする核酸分子である。核酸は、細胞全体、細胞ライセートまたは一部精製したまたは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、他の細胞成分または他の汚染物、例えば、他の細胞核酸(例えば、他の染色体ＤＮＡ、例えば、天然で単離されたＤＮＡと連結している染色体ＤＮＡ)またはタンパク質から、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動および当分野で周知のその他を含む標準技術により精製されたとき、“単離”されまたは“実質的に純粋”である。F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York参照。ここに記載する核酸は、例えば、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、イントロン配列を含んでも、含んでいなくてもよい。ある態様において、核酸はｃＤＮＡ分子である。

【0385】

ここに記載する核酸を、標準分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ(例えば、さらに下に記載するような、ヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスから調製したハイブリドーマ)により発現される抗体に関して、ハイブリドーマにより産生された抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリー(例えば、ファージディスプレイ技術を使用)から得られた抗体に関して、抗体をコードする核酸をライブラリーから回収できる。

【0386】

ここに記載する好ましい核酸分子は、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体、例えば、ＣＤ７３.４ １１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１、７Ａ１１、ＣＤ７３.３および／またはＣＤ７３.４モノクローナル抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列をコードするものである。ＣＤ７３.４(ＣＤ７３.４−１およびＣＤ７３.４−２)、１１Ｆ１１(１１Ｆ１１−１および１１Ｆ１１−２)、４Ｃ３(４Ｃ３−１、４Ｃ３−２および４Ｃ３−３)、４Ｄ４、１０Ｄ２(１０Ｄ２−１および１０Ｄ２−２)、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８(５Ｆ８−１および５Ｆ８−２)、６Ｅ１１、７Ａ１１、ＣＤ７３.３およびＣＤ７３.４のＶ_Ｈ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号４、１６、３２、４０、５２、６０、６８、８０、８８、１３５および１７０に示される。１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１、７Ａ１１、ＣＤ７３.３および／またはＣＤ７３.４のＶ_Ｌ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号８、１２、２０、２４、２８、３６、４４、４８、５６、６４、７２、７６、８４および９２に示される。

【0387】

Ｖ_ＨおよびＶ_ＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたら、これらのＤＮＡフラグメントを、例えば可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂフラグメント遺伝子にまたはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準組み換えＤＮＡ技術によりさらにエンジニアリングし得る。これらのエンジニアリング、Ｖ_ＬまたはＶ_Ｈコード化ＤＮＡフラグメントは、抗体定常領域または可動性リンカーのような他のタンパク質をコードする他のＤＮＡフラグメントに操作可能に連結される。この文脈で使用する用語“操作可能に連結”は、２ＤＮＡフラグメントが、該２ＤＮＡフラグメントによりコードされるアミノ酸配列がフレーム内のままであるように連結されることを意味することを意図する。

【0388】

Ｖ_Ｈ領域をコードする単離ＤＮＡを、Ｖ_Ｈコード化ＤＮＡを、重鎖定常領域(ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３)をコードする他のＤＮＡ分子と操作可能に連結することにより、完全長重鎖遺伝子に変換できる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で知られ(例えば、Kabat, E. A., el al, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域、例えば、ＩｇＧ１領域であり得る。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子に関して、Ｖ_Ｈコード化ＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする他のＤＮＡ分子に操作可能に連結できる。

【0389】

Ｖ_Ｌ領域をコードする単離ＤＮＡは、軽鎖定常領域、ＣＬをコードする他のＤＮＡ分子にＶ_Ｌコード化ＤＮＡを操作可能に連結することにより、完全長軽鎖遺伝子(ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子)に変換できる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で知られ(例えば、Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であり得る。

【0390】

ｓｃＦｖ遺伝子を創出するために、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌコード化ＤＮＡフラグメントを、可動性リンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列(Ｇｌｙ_４−Ｓｅｒ)_３をコードする他のフラグメントと、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列が隣接一本鎖タンパク質として発現でき、Ｖ_Ｌ領域とＶ_Ｈ領域が可動性リンカーにより連結しているように、操作可能に連結される(例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554参照)。

【0391】

ここに提供されるのはまた、ここに記載する抗体、例えば、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１、７Ａ１１、ＣＤ７３.３および／またはＣＤ７３.４モノクローナル抗体のものと相同であるＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列または完全長重鎖および軽鎖をコードする、核酸分子である。例示的核酸分子は、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１、７Ａ１１、ＣＤ７３.３および／またはＣＤ７３.４モノクローナル抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列または完全長重鎖および軽鎖、例えば、表３５に示す配列をコードする核酸分子と、少なくとも７０％同一、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列をコードする。例えば、ここに提供されるのは、配列番号１３９および配列番号１４０または１４１；配列番号２３７および配列番号１４０または１４１；配列番号１４２および配列番号１４３、１４４または１４５；配列番号１４６および配列番号１４７；配列番号１４８および配列番号１４９または１５０；配列番号１５１および配列番号１５２；配列番号１５３および配列番号１５４；配列番号１５５および配列番号１５６または１５７または２４２；配列番号１５８および配列番号１５９；配列番号１６０および配列番号１６１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる、Ｖ_Ｈ鎖およびＶ_Ｌ鎖を含む抗ＣＤ７３抗体である。また提供されるのは、配列番号１３４、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２４３、２６６(重鎖)および配列番号２４４または２４５(軽鎖)；配列番号２１１、２１２、２１３または２４６および配列番号２４７、２４８または２４９；配列番号２３５、２３６または２５０および２５１；配列番号２５２および配列番号２５３または２５４；配列番号２５５および配列番号２５６；配列番号２５７および配列番号２５８；配列番号２５９および配列番号２６０または２６１；配列番号２６２および配列番号２６３；配列番号２６４および配列番号２６５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、ヌクレオチド配列によりコードされる重鎖および軽鎖を含む、抗ＣＤ７３抗体である。またここに提供されるのは、例えば、コドン最適化のために、サイレント変異(すなわち、核酸分子の翻訳により得られたアミノ酸配列を変えない塩基変化)を有する核酸分子である。

【0392】

XI. 抗体産生
多様な本発明の抗体、例えばここに開示する抗ヒトＣＤ７３抗体と競合するまたは同一エピトープに結合するものは、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)により記載された標準体細胞ハイブリダイゼーション技術のような、多様な既知技術を使用して、産生できる。体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、原則として、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換、ヒト抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージディスプレイ技術のような、モノクローナル抗体を産生する他の技術も使用できる。

【0393】

ハイブリドーマを産生する好ましい動物システムは、マウスシステムである。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、高度に確立されている方法である。融合のための免疫化プロトコールおよび免疫化脾細胞の単離のための技術は当分野で知られる。融合パートナー(例えば、マウス骨髄腫細胞)および融合法も知られている。

【0394】

ここに記載するキメラまたはヒト化抗体を、上記のように製造したマウスモノクローナル抗体の配列に基づき、製造できる。標準分子生物学技術を使用して、重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを、目的のマウスハイブリドーマから得て、非マウス(例えば、ヒト)免疫グロブリン配列を含むように改変できる。例えば、キメラ抗体を創出するために、マウス可変領域を当分野で知られる方法を使用してヒト定常領域に連結できる(例えば、米国特許４,８１６,５６７(Cabilly et al.)参照)。ヒト化抗体を創出するために、マウスＣＤＲ領域を、当分野で知られる方法を使用してヒトフレームワークに挿入できる(例えば、米国特許５,２２５,５３９(Winter)および米国特許５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２および６,１８０,３７０(Queen et al.)参照)。

【0395】

ある態様において、ここに記載する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなＣＤ７３に対するヒトモノクローナル抗体は、マウスシステムではなく、むしろヒト免疫系の一部を担持する、トランスジェニックまたは染色体導入マウスを使用して産生できる。これらのトランスジェニックおよび染色体導入マウスは、それぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと呼ばれるマウスを含み、ここでは、集合的に“ヒトＩｇマウス”と称する。

【0396】

ＨｕＭＡｂマウス(登録商標)(Medarex, Inc.)は、非再配列ヒト重(μおよびγ)およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を、内在性μおよびκ鎖遺伝子座を不活化する標的化変異と共に含む(例えば、Lonberg, et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859参照)。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現が減少し、免疫化に応答して、導入ヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチングおよび体細胞性変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを産生する(Lonberg, N. et al., (1994), supra; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93およびHarding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546にレビュー)。ＨｕＭａｂマウスの調製および使用ならびにこのようなマウスで実施するゲノム修飾は、さらにTaylor, L. et al., (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al., (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al., (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., (1994) International Immunology 6: 579-591;およびFishwild, D. et al., (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851により記載され、これら全ての内容を、その全体を引用により本明細書に特に包含させる。さらに、米国特許５,５４５,８０６；５,５６９,８２５；５,６２５,１２６；５,６３３,４２５；５,７８９,６５０；５,８７７,３９７；５,６６１,０１６；５,８１４,３１８；５,８７４,２９９；および５,７７０,４２９(全てLonbergおよびKay)；米国特許５,５４５,８０７(Surani et al.)；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７／１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２(全てLonbergおよびKay)；およびＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４(Korman et al.)も参照のこと。

【0397】

ある態様において、ここに記載する抗体を、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を担持するマウスのような、導入遺伝子および導入染色体にヒト免疫グロブリン配列を担持するマウスを使用して産生させる。このようなマウスは、ここでは“ＫＭマウス”と称し、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８(Ishida et al.)に詳述されている。

【0398】

なおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランスジェニック動物システムが当分野で利用可能であり、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体の産生に使用できる。例えば、XenoMouse(Abgenix, Inc.)と称する代替トランスジェニックシステムを使用でき、このようなマウスは、例えば、米国特許５,９３９,５９８；６,０７５,１８１；６,１１４,５９８；６、１５０,５８４および６,１６２,９６３(Kucherlapati et al.)に開示されている。

【0399】

さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替染色体導入動物システムが当分野で利用可能であり、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体の産生に使用できる。例えば、“ＴＣマウス”と称するヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両者を担持するマウスを使用でき、このようなマウスは、Tomizuka et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を担持するウシが文献に記載されており(Kuroiwa et al., (2002) Nature Biotechnology 20:889-894)、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体の産生に使用できる。

【0400】

ヒト抗体、例えば、ヒト抗ＣＤ７３抗体を産生するための、文献に記載されるさらなるマウスシステムは、(ｉ)キメラ抗体(ヒトＶ／マウスＣ)がマウスにおいて産生され、続いて標準組み換えＤＮＡ技術を使用して完全ヒト抗体に変換されるように、内在性マウス重鎖および軽鎖可変領域が、相同組換えにより、内在性マウス定常領域に操作可能に連結した、ヒト重鎖および軽鎖可変領域に置き換えられている、VelocImmune(登録商標)マウス(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)；および(ii)マウスが非再配列ヒト重鎖可変領域だけでなく、単一再配列ヒト共通軽鎖可変領域を含む、MeMo(登録商標)マウス(Merus Biopharmaceuticals, Inc.)を含む。このようなマウスおよび抗体産生のためのその使用は、例えば、ＷＯ２００９／１５７７７、ＵＳ２０１０／００６９６１４、ＷＯ２０１１／０７２２０４、ＷＯ２０１１／０９７６０３、ＷＯ２０１１／１６３３１１、ＷＯ２０１１／１６３３１４、ＷＯ２０１２／１４８８７３、ＵＳ２０１２／００７０８６１およびＵＳ２０１２／００７３００４に記載される。

【0401】

ここに記載するヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用しても製造できる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は当分野において確立されている。例えば、米国特許５,２２３,４０９；５,４０３,４８４；および５,５７１,６９８(Ladner et al.)；米国特許５,４２７,９０８および５,５８０,７１７(Dower et al.)；米国特許５,９６９,１０８および６,１７２,１９７(McCafferty et al.)；および米国特許５,８８５,７９３；６,５２１,４０４；６,５４４,７３１；６,５５５,３１３；６,５８２,９１５および６,５９３,０８１(Griffiths et al.)参照。

【0402】

ここに記載するヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫細胞が免疫化によりヒト抗体応答が産生されるように再構成されている、ＳＣＩＤマウスを使用しても製造できる。このようなマウスは、例えば、米国特許５,４７６,９９６および５,６９８,７６７(Wilson et al.)に記載されている。

【0403】

免疫化
ＣＤ７３への完全ヒト抗体を産生するために、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックまたは染色体導入マウス(例えば、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ７またはＫＭマウス)を、例えば、Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856859; Fishwild et al., (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびＷＯ９８／２４８８４により、他の抗原について記載されているように、ＣＤ７３抗原の精製または富化調製物および／またはＣＤ７３を発現する細胞で免疫化できる。あるいは、マウスを、ヒトＣＤ７３をコードするＤＮＡで免疫化できる。好ましくは、マウスは、最初の注入時６〜１６週齢である。例えば、組み換えＣＤ７３抗原の精製または富化調製物(５〜５０μg)を、腹腔内でのＨｕＭＡｂマウスの免疫化に使用できる。ＣＤ７３抗原の精製または富化調製物を使用する免疫化が抗体を生じない場合、マウスを、ＣＤ７３を発現する細胞、例えば、細胞株で免疫化して、免疫応答を促進し得る。細胞株の例は、ＣＤ７３過発現安定ＣＨＯおよびＲａｊｉ細胞株を含む。

【0404】

多様な抗原での経験の蓄積により、最初にRibiのアジュバント中の抗原で腹腔内(ＩＰ)または皮下(ＳＣ)的に免疫化し、続いて、Ribiのアジュバント中の抗原で隔週でＩＰ／ＳＣ免疫化したとき(計１０回まで)、ＨｕＭＡｂトランスジェニックマウスが最良に応答することが示されている。免疫応答を、免疫化プロトコールの進行中、後眼窩採血により得た血漿サンプルでモニターできる。血漿をＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ(下記のとおり)でスクリーニングし、十分な力価の抗ＣＤ７３ヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合に使用できる。マウスを、抗原の静脈内投与によりブーストし、３日後屠殺し、脾臓およびリンパ節を摘出し得る。各免疫化について２〜３融合を実施する必要があると予測される。６〜２４匹のマウスを、一般に各抗原に対する免疫化に使用する。通常、ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＫＭ系統を使用する。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２導入遺伝子の両者を、２個の異なるヒト重鎖導入遺伝子(ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２)を有する単一マウスで共に繁殖させ得る。

【0405】

ＣＤ７３に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの産生
ここに記載するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを産生するために、免疫化マウスからの脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株のような適切な不死化細胞株に融合し得る。得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングできる。例えば、免疫化マウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、Ｓｐ２／０非分泌性マウス骨髄腫細胞(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ １５８１)に５０％ＰＥＧを用いて融合させ得る。細胞を、平底マイクロタイタープレートに約２×１０^５で播種し、続いて１０％FetalClone血清、１８％“６５３”順化培地、５％ｏｒｉｇｅｎ(ＩＧＥＮ)、４mM Ｌ−グルタミン、１mM ピルビン酸ナトリウム、５mM ＨＥＰＥＳ、０.０５５mM ２−メルカプトエタノール、５０単位／ml ペニシリン、５０mg／mlストレプトマイシン、５０mg／ml ゲンタマイシンおよび１Ｘ ＨＡＴ(Sigma)含有選択培地で２週間インキュベーションする。約２週間後、細胞を、ＨＡＴがＨＴに置き換わった培地で培養できる。次いで、個々のウェルを、ヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡでスクリーニングできる。広範なハイブリドーマ増殖が生じたら、培地を、通常１０〜１４日後に得てよい。抗体分泌ハイブリドーマを再播種し、再スクリーニングし、なおヒトＩｇＧに陽性であるならば、該モノクローナル抗体を、少なくとも２回、限界希釈によりサブクローン化する。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴付けのために、組織培養培地で少量の抗体を産生させ得る。

【0406】

ヒトモノクローナル抗体を精製するために、選択ハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製用２リットルスピナーフラスコで増殖できる。上清を濾過し、濃縮し、その後プロテインＡ−セファロースを使用する親和性クロマトグラフィー(Pharmacia, Piscataway, N.J.)に付し得る。溶出ＩｇＧを、純度確認のためゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーで確認できる。緩衝液をＰＢＳに交換してよく、濃度を、１.４３消衰係数を使用してＯＤ_２８０により決定できる。モノクローナル抗体を小分けし、−８０℃で保存してよい。

【0407】

XII. 抗体製造
ＣＤ７３に対するモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの産生
配列が提供されている特定の抗体および他の関連抗ＣＤ７３抗体の両者を含む本発明の抗体を、当分野で周知のように、例えば、組み換えＤＮＡ技術と遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生させ得る(Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。

【0408】

例えば、抗体またはその抗体フラグメントを発現させるために、軽鎖および重鎖の一部または完全長をコードするＤＮＡを、標準分子生物学技術(例えば、目的の抗体を発現するハイブリドーマを使用するＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング)により得ることができ、ＤＮＡを、該遺伝子が転写および翻訳制御配列に操作可能に連結するように、発現ベクターに挿入できる。この文脈において、用語“操作可能に連結”は、抗体遺伝子が、ベクター内での転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を制御する意図する機能を発揮するように、ベクターにライゲートされることを意味することを意図する。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を、別々のベクターに挿入しても、両遺伝子同一発現ベクターに挿入してもよい。抗体遺伝子は、標準方法(例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補性制限部位のライゲーションまたは制限部位が存在しないならば平滑末端ライゲーション)により発現ベクターに挿入される。ここに記載する抗体の軽鎖および重鎖可変領域を使用して、Ｖ_Ｈセグメントがベクター内のＣ_Ｈセグメントに操作可能に連結し、Ｖ_Ｌセグメントがベクター内のＣ_Ｌセグメントに操作可能に連結するように、所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターにそれらを挿入することにより、あらゆる抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を創出できる。これに加えてまたはこれとは別に、組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子を、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端にフレーム内で連結されるように、ベクターにクローン化できる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド)であり得る。

【0409】

抗体鎖遺伝子に加えて、組み換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御配列を担持し得る。用語“制御配列”は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことを意図する。このような制御配列は、例えば、Goeddel (Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))に記載される。制御配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子により得ることは、当業者には認識される。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい制御配列は、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、サルウイルス４０(ＳＶ４０)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(ＡｄＭＬＰ))およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーのような、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を支持するウイルス要素を含む。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターのような非ウイルス制御配列を使用し得る。なおさらに、ＳＶ４０早期プロモーターおよびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の末端反復配列からの配列を含む、ＳＲαプロモーターシステムのような異なる源からの配列からなる制御要素を使用し得る(Takebe, Y. et al., (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。

【0410】

抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、組み換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列(例えば、複製起点)および選択可能マーカー遺伝子のようなさらなる配列を担持し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする(例えば、米国特許４,３９９,２１６、４,６３４,６６５および５,１７９,０１７(全てAxel et al.)参照)。例えば、一般に、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートのような薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)遺伝子(ｄｈｆｒ⁻宿主細胞とメトトレキサート選択／増幅を使用するために)およびｎｅｏ遺伝子(Ｇ４１８選択のために)を含む。

【0411】

軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを、標準技術により宿主細胞に遺伝子導入する。用語“トランスフェクション”の種々形態は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどの、原核または真核宿主細胞に外来性ＤＮＡを導入するのに一般に使用される多種多様な技術を含むことを意図する。ここに記載する抗体を原核または真核宿主細胞で発現させることが理論的には可能であるが、真核細胞および最も好ましくは哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が、このような真核細胞および特に哺乳動物細胞が原核細胞よりも適切に折りたたまれ、免疫学的に活性な抗体を構築し、分泌する可能性が高いため、最も好ましい。抗体遺伝子の原核細胞発現は、活性抗体の高収率での産生に無効であることが報告されている(Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13)。本発明の抗体はまた、酵母ピキア・パストリスの糖改変下部でも産生され得る。Li et al., (2006) Nat. Biotechnol. 24:210。

【0412】

ここに記載する組み換え抗体の発現に好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ細胞)(例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に記載のようにＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用する、Urlaub and Chasin. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220において記載のｄｈｆｒ⁻ ＣＨＯ細胞を含む)、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞と使用するために、他の好ましい発現システムは、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８,８４１に開示のＧＳ遺伝子発現システムである。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入されたとき、抗体は、宿主細胞における抗体の発現または、より好ましくは、宿主細胞が増殖している培養培地への抗体の分泌を可能とするのに十分な時間宿主細胞を培養することにより生産される。抗体を、標準タンパク質精製法を使用して、培養培地から回収できる。

【0413】

本発明の抗体ポリペプチド鎖のＮおよびＣ末端は、一般に観察される翻訳後修飾により、予想される配列と異なるかもしれない。例えば、Ｃ末端リシン残基は、しばしば抗体重鎖から欠失する。Dick et al., (2008) Biotechnol. Bioeng. 100:1132。Ｎ末端グルタミン残基および程度は少ないがグルタミン酸残基は、しばしば治療抗体の軽鎖および重鎖の両者でピログルタミン酸残基に変換される。Dick et al., (2007) Biotechnol. Bioeng. 97:544; Liu et al., (2011) JBC 28611211; Liu et al., (2011) J. Biol. Chem. 286:11211。

【0414】

XIII. アッセイ
ここに記載する抗体を、例えば、標準ＥＬＩＳＡにより、ＣＤ７３への結合について試験できる。簡潔にいうと、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中１〜２μg／mlの精製ＣＤ７３でコーティングし、次いでＰＢＳ中５％ウシ血清アルブミンで遮断する。抗体の希釈物(例えば、ＣＤ７３免疫化マウスの血漿の希釈物)を各ウェルに添加し、１〜２時間、３７℃でインキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)にコンジュゲートした二次試薬(例えば、ヒト抗体について、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬)と、１時間、３７℃でインキュベートする。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質(Moss Inc.、製品: ABTS-1000)で展開し、分光光度計でＯＤ４１５〜４９５で分析する。免疫化マウスからの血清を、次いで、ヒトＣＤ７３を発現する細胞株に結合するが、ＣＤ７３を発現しない対照細胞株に結合しないことについて、フローサイトメトリーによりさらにスクリーニングする。簡潔にいうと、抗ＣＤ７３抗体の結合を、ＣＤ７３発現ＣＨＯ細胞と、抗ＣＤ７３抗体を、１：２０希釈でインキュベートすることにより評価する。細胞を洗浄し、結合を、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ Ａｂを使用して検出する。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー(Becton Dickinson, San Jose, CA)を使用して行う。好ましくは、最高力価を発生させるマウスを、融合に使用する。

【0415】

上記のようなＥＬＩＳＡアッセイを使用して抗体を、それゆえに、ＣＤ７３免疫原と陽性反応性を示す抗体を生産するハイブリドーマをスクリーニングできる。好ましくは高親和性で、ＣＤ７３に結合する抗体を生産するハイブリドーマを、次いでサブクローン化し、さらに特徴付けし得る。親細胞の反応性を保持する(ＥＬＩＳＡによる)各ハイブリドーマからの１クローンを、次いで細胞バンクの製造および抗体精製のために選択できる。

【0416】

抗ＣＤ７３抗体を精製するために、選択ハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製のために２リットルスピナーフラスコで増殖できる。上清を濾過し、濃縮して、その後プロテインＡ−セファロースを用いる親和性クロマトグラフィー(Pharmacia, Piscataway, NJ)に付し得る。溶出ＩｇＧを、純度確認のためゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーで確認できる。緩衝液ＰＢＳに交換してよく、濃度を、１.４３消衰係数を使用してＯＤ_２８０により決定できる。モノクローナル抗体を小分けし、−８０℃で保存してよい。

【0417】

選択抗ＣＤ７３モノクローナル抗体が独特なエピトープに結合するかを決定するために、各抗体を、市販試薬(Pierce, Rockford, IL)を使用してビオチニル化できる。ビオチニル化ｍＡｂ結合を、ストレプトアビジン標識プローブで検出できる。非標識モノクローナル抗体およびビオチニル化モノクローナル抗体を使用する競合試験を、上記のようにＣＤ７３被覆ＥＬＩＳＡプレートを使用して、実施できる。

【0418】

精製抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡを、特定のアイソタイプの抗体に特異的な試薬を使用して、実施できおる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを決定するために、マイクロタイタープレートのウェルを、１μg／mlの抗ヒト免疫グロブリンで、一夜、４℃で被覆できる。１％ＢＳＡで遮断後、プレートを１μg／ml以下の試験モノクローナル抗体または精製アイソタイプ対照と、環境温度で１〜２時間反応させる。次いで、ウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼコンジュゲートプローブと反応させる。プレートを、上記のように展開し、分析する。

【0419】

ＣＤ７３を発現する生存細胞へのモノクローナル抗体の結合を試験するために、フローサイトメトリーを、実施例に記載するように使用できる。簡潔にいうと、膜結合ＣＤ７３を発現する細胞株(標準増殖条件下で増殖)を、０.１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中、種々の濃度のモノクローナル抗体と４℃で１時間混合する。洗浄後、細胞を、一次抗体染色と同一条件下、フルオレセイン標識抗ＩｇＧ抗体と反応させる。サンプルを、単一細胞をゲーティングする光および側方散乱性質を使用するＦＡＣＳｃａｎ装置により分析し、標識抗体の結合を決定する。蛍光顕微鏡を使用する代替アッセイを、フローサイトメトリーアッセイに加えてまたは代わりに使用し得る。細胞をまさに上記のように染色し、蛍光顕微鏡で試験できる。この方法は、個々の細胞の可視化を可能にするが、抗原の密度により感受性が低下し得る。

【0420】

抗ＣＤ７３抗体を、ウェスタンブロッティングによりＣＤ７３抗原との反応性についてさらに試験し得る。簡潔にいうと、ＣＤ７３発現細胞からの細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し得る。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロース膜に移し、２０％マウス血清で遮断し、試験するモノクローナル抗体でプローブする。ＩｇＧ結合を抗ＩｇＧアルカリホスファターゼを使用して検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤(Sigma Chem, Co., St. Louis, MO)で発色できる。

【0421】

多様な抗ＣＤ７３抗体の結合親和性、交差反応性および結合動態を分析する方法は、当分野で知られる標準アッセイ、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ^{(登録商標)}２０００ ＳＰＲ装置(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を使用する、ＢＩＡＣＯＲＥ^{(登録商標)}表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)分析を含む。

【0422】

XIV. 免疫複合体および抗体誘導体
ここに記載する抗体を、サンプル試験およびインビボ造影を含む診断目的で使用でき、この目的で、抗体(またはその結合フラグメント)を、適切な検出可能剤とコンジュゲートして、免疫複合体を形成できる。診断目的で、適切な薬剤は、全身造影のための放射性同位体ならびにサンプル試験のための放射性同位体、酵素、蛍光標識および他の適当な抗体標識を含む、検出可能標識である。

【0423】

検出可能標識は、金コロイドのような金属ゾル、例えばＮ_２Ｓ_２、Ｎ_３ＳまたはＮ_４タイプのペプチドキレート剤と提供されるＩ^１２５またはＴｃ^９９のような同位体、蛍光マーカー、ビオチン、発光マーカー、燐光マーカーなどを含む発色団を含む粒子標識、ならびにある基質を検出可能マーカーに変換する酵素標識およびポリメラーゼ鎖反応のような増幅後に露出されるポリヌクレオチド標識を含む、インビトロ診断分野で現在使用されている種々のタイプのいずれでもよい。次いで、ビオチニル化抗体は、アビジンまたはストレプトアビジン結合により検出可能である。適当な酵素標識は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどを含む。例えば、標識は、アダマンチルメトキシホスホリルオキシフェニルジオキセタン(ＡＭＰＰＤ)、ジナトリウム３−(４−(メトキシスピロ{１,２−ジオキセタン−３,２’−(５’−クロロ)トリシクロ{３.３.１.１^３,７}デカン}−４−イル)フェニルホスフェート(ＣＳＰＤ)のような１,２−ジオキセタン基質の変換後の化学発光の存在または形成の測定により検出する酵素アルカリホスファターゼならびにＣＤＰおよびＣＤＰ−ｓｔａｒ(登録商標)または当分野で周知の他の発光基質、例えばテルビウム(III)およびユウロピウム(III)のような適当なランタナイドのキレートであり得る。検出手段は、選択した標識により決定される。標識またはその反応産物の出現は、標識が粒子であり、適切なレベルで蓄積する場合は裸眼で、または分光光度計、ルミノメーター、フルオロメーターなどのような装置を使用して達成でき、全て、標準実務による。

【0424】

好ましくは、コンジュゲーション法は、実質的に(またはほぼ)非免疫原性の、例えば、ペプチド−(すなわちアミド−)、スルフィド−、(立体障害された)ジスルフィド−、ヒドラゾン−およびエーテル結合である結合を生じる。これらの結合はほぼ非免疫原性であり、血清内で合理的な安定性を示す(例えばSenter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244；ＷＯ２００９／０５９２７８；ＷＯ９５／１７８８６参照)。

【0425】

成分および抗体の生化学的性質により、種々のコンジュゲーション戦略を用い得る。成分が５０〜５００アミノ酸の天然に存在するまたは組み換えポリペプチドであるとき、タンパク質コンジュゲートの合成の化学を記載する教科書に標準法があり、当業者は容易にこれに従い得る(例えばHackenberger, C. P. R. and Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 47 (2008) 10030-10074)。ある態様において、抗体または成分内のシステイン残基を有するマレインイミド基の反応を使用する。これは、抗体の例えばＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントを使用する場合、特に適当なカップリング化学である。あるいはある態様において、抗体または成分のＣ末端へのカップリングを実施する。タンパク質、例えばＦａｂフラグメントのＣ末端修飾を、記載のように実施できる(Sunbul, M. and Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371)。

【0426】

一般に部位特異的反応および共有結合性カップリングは、天然アミノ酸の、存在する他の官能基の反応性と直交性である反応性を有するアミノ酸への変換に基づく。例えば、稀な配列構成内の特異的システインを、アルデヒドに酵素変換できる(Frese, M. A. and Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427)。ある配列構成における天然アミノ酸とのある酵素の特異的酵素反応性を利用して、所望のアミノ酸修飾を得ることも可能である(例えば、Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al., Chem. Biol. 15 (2008) 128-136参照)。Ｃ−Ｎ結合のプロテアーゼ触媒による形成は、Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403に記載されている。

【0427】

部位特異的反応および共有結合性カップリングは、末端アミノ酸と適切な修飾剤の選択的反応によっても達成できる。Ｎ末端システインとベンゾニトリルの反応性(Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662参照)を使用して、部位特異的共有結合性カップリングを達成できる。天然化学ライゲーションは、Ｃ末端システイン残基も利用する(Taylor, E, Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96)。ＥＰ１０７４５６３は、陽性荷電アミノ酸のストレッチに位置するシステインよりも、陰性荷電アミノ酸のストレッチに位置するシステインの反応が速いことに基づくコンジュゲーション法を記載する。

【0428】

成分はまた合成ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ポリペプチドが化学的に合成される場合、直交性化学反応性を有するアミノ酸を、このような合成中に取り込み得る(例えばde Graaf, A. J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295参照)。広範にわたる直交性官能基が問題となり、合成ペプチドに導入され得るため、このようなペプチドのリンカーへのコンジュゲーションは、標準化学である。

【0429】

一標識ポリペプチドを得るために、１：１化学量論を有するコンジュゲートを、クロマトグラフィーにより、他のコンジュゲーション副産物から分離できる。この工程は、色素標識結合対メンバーおよび荷電リンカーの使用により促進され得る。この種の標識および高度に陰性に荷電した結合対メンバーの使用により、モノコンジュゲートポリペプチドを、荷電および分子量差異を分離に使用できるため、非標識ポリペプチドおよび１個を超えるリンカーを有するポリペプチドから分離できる。蛍光色素は、標識一価結合剤のように、非結合構成成分から複合体を精製するのに有用であり得る。

【0430】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体に結合した成分を、結合成分、標識成分および生物学的活性成分からなる群から選択する。

【0431】

ここに記載する抗体を、抗体−薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)のような免疫複合体を形成するように、治療剤とコンジュゲートしてもよい。適当な治療剤は、代謝拮抗剤、アルキル化剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核輸出阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはII阻害剤、ヒートショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質および抗有糸分裂剤を含む。ＡＤＣにおいて、抗体および治療剤は、好ましくはペプチジル、ジスルフィドまたはヒドラゾンリンカーのような開裂可能リンカーによりコンジュゲートする。より好ましくは、リンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ(配列番号２１９)、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、ＳｅｒまたはＧｌｕのようなペプチジルリンカーである。ＡＤＣを、米国特許７,０８７,６００；６,９８９,４５２；および７,１２９,２６１；ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９６９１０；ＷＯ０７／０３８６５８；ＷＯ０７／０５１０８１；ＷＯ０７／０５９４０４；ＷＯ０８／０８３３１２；およびＷＯ０８／１０３６９３；米国特許公開２００６００２４３１７；２００６０００４０８１；および２００６０２４７２９５に開示のように製造でき；これらの内容を、引用により本明細書に包含させる。

【0432】

例えば、単剤療法としてのような抗ＣＤ７３抗体の他の使用は、本明細書の他の場所に、例えば、組み合わせ処置に関する部分に提供される。

【0433】

より具体的に、ＡＤＣにおいて、抗体を薬物とコンジュゲートさせ、ＡＤＣを、癌細胞のようなその抗原を発現する標的細胞に指向させるためのターゲティング剤として機能する抗体を用いる。好ましくは、抗原は、腫瘍関連抗原、すなわち、癌細胞により独特に発現されるまたは過発現されるものである。到達したら、薬物が、治療剤として働くために、標的細胞内またはその近位で放出されたる。癌治療におけるＡＤＣの作用機序および使用のレビューのために、Schrama et al., Nature Rev. Drug Disc. 2006, 5, 147参照。

【0434】

癌処置のために、薬物は、好ましくは標的化癌細胞を死滅させる、細胞毒性剤である。ＡＤＣにおいて使用できる細胞毒性剤は、次のタイプの化合物およびそのアナログおよび誘導体を含む：
(ａ)カリチアマイシン(例えば、Lee et al., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3464および3466参照)およびウンシアラマイシン(例えば、Davies et al.、ＷＯ２００７／０３８８６８Ａ２(２００７)およびChowdari et al., US8,709,431 B2 (2012)参照)のようなエンジイン類；
(ｂ)ツブリシン類(例えば、Domling et al., US7,778,814 B2 (2010); Cheng et al.、ＵＳ８,３９４,９２２Ｂ２(２０１３)；およびCong et al.、ＵＳ２０１４／０２２７２９５Ａ１参照)；
(ｃ)ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシン(例えば、Boger、ＵＳ６,５４５８,５３０Ｂ１(２００３)；Sufi et al.、ＵＳ８,４６１,１１７Ｂ２(２０１３)；およびZhang et al.、ＵＳ２０１２／０３０１４９０Ａ１(２０１２)参照)；
(ｄ)エポチロン類(例えば、Vite et al.、ＵＳ２００７／０２７５９０４Ａ１(２００７)およびＵＳＲＥ４２９３０Ｅ(２０１１)参照)；
(ｅ)オーリスタチン類(例えば、Senter et al.、ＵＳ６,８４４,８６９Ｂ２(２００５)およびDoronina et al.、ＵＳ７,４９８,２９８Ｂ２(２００９)参照)；
(ｆ)ピロロベンゾジアゼピン(ＰＢＤ)二量体(例えば、Howard et al.、ＵＳ２０１３／００５９８００Ａ１(２０１３)；ＵＳ２０１３／００２８９１９Ａ１(２０１３)；およびＷＯ２０１３／０４１６０６Ａ１(２０１３)参照)；および
(ｇ)ＤＭ１およびＤＭ４のようなマイタンシノイド類(例えば、Chari et al.、ＵＳ５,２０８,０２０(１９９３)およびAmphlett et al.、ＵＳ７,３７４,７６２Ｂ２(２００８)参照)。

【0435】

XV. 二重特異性分子
ここに記載する抗体を、二重特異性分子の形成に使用し得る。抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分を、他の官能性分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質(例えば、受容体に対する他の抗体またはリガンド)で誘導体化または連結して、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を産生できる。ここに記載する抗体は、実際１個を超える他の官能性分子で誘導体化または連結して、２つを超える異なる結合部位および／または標的分子と結合する多特異的分子を産生できる；このような多特異的分子も、ここで使用する用語“二重特異性分子”に包含されることを意図する。ここに記載する二重特異性分子を創出するために、ここに記載する抗体を、二重特異性分子が生じるように、他の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣剤のような１以上の他の結合分子と機能的に連結できる(例えば、化学カップリング、遺伝的融合、非共有結合的結合またはその他)。

【0436】

したがって、ここに提供されるのは、ＣＤ７３に対する少なくとも１個の第一結合特異性および第二の標的エピトープに対する第二結合特異性を含む、二重特異性分子である。二重特異性分子が多特異的であるここに記載する態様において、分子は、さらに第三結合特異性を含み得る。

【0437】

ある態様において、ここに記載する二重特異性分子は、結合特異性として、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)_２、Ｆｖまたは単鎖Ｆｖを含む、少なくとも１抗体または抗体そのフラグメントを含む。抗体はまた軽鎖または重鎖二量体または何らかのその最小フラグメント、例えば、Ladner et al., 米国特許４,９４６,７７８(その内容を引用により明示的に本明細書に包含させる)に記載のようなＦｖまたは単鎖構築物でもあり得る。

【0438】

二重特異性分子のその特異的標的への結合は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ(例えば、増殖阻害)またはウェスタンブロットアッセイのような当分野で認識される方法を使用して確認できる。これらのアッセイの各々は、一般に目的の複合体に特異的な標識剤(例えば、抗体)を用いることにより、特に興味深いタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。

【0439】

XVI. 組成物
さらに薬学的に許容される担体と共に製剤された、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分の１個または組み合わせを含む、組成物、例えば、医薬組成物が提供される。このような組成物は、ここに記載する抗体または免疫複合体または二重特異性分子の１個または組み合わせ(例えば、２以上の異なる)を含み得る。例えば、ここに記載する医薬組成物は、標的抗原の異なるエピトープに結合するまたは相補性活性を有する抗体の組み合わせ(または免疫複合体または二特異性)を含み得る。

【0440】

ある態様において、組成物は、抗ＣＤ７３抗体を少なくとも１mg／ml、５mg／ml、１０mg／ml、５０mg／ml、１００mg／ml、１５０mg／ml、２００mg／ml、１〜３００mg／mlまたは１００〜３００mg／mlの濃度で含む。

【0441】

ここに記載する医薬組成物は、組み合わせ治療で、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与もできる。例えば、組み合わせ治療では、少なくとも一つの他の抗癌および／またはＴ細胞刺激(例えば、活性化)剤と組み合わせて、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体を含み得る。組み合わせ治療で使用できる治療剤の例を、ここに記載する抗体の使用に関する下記の部分でより詳細に記載する。

【0442】

ある態様において、ここに開示する治療組成物は、癌の処置に使用する他の化合物、薬物および／または薬剤を含み得る。このような化合物、薬物および／または薬剤は、例えば、ある癌に対する免疫応答を刺激する化学療法剤、小分子薬物または抗体を含み得る。ある状況において、治療組成物は、例えば、組み合わせ治療に関する部分に挙げる薬剤の１以上を含み得る。

【0443】

ここで使用する“薬学的に許容される担体”は、生理学的に適合性である、任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄または上皮投与(例えば、注射または点滴による)に適する。投与経路により、活性化合物、すなわち、抗体、免疫複合体または二重特異性分子を、該化合物を不活化し得る酸および他の天然条件から該化合物を保護する物質でコートし得る。

【0444】

ここに記載する医薬化合物は、１以上の薬学的に許容される塩を含み得る。“薬学的に許容される塩”は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望まない毒性効果を何ら付与しない塩をいう(例えば、Berge, S.M., et al., (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19)。このような塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、塩酸塩、硝酸塩、リン酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、亜リン酸塩などのような非毒性無機酸ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などのような非毒性有機酸由来のものを含む。塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのようなアルカリ土類金属ならびにＮ,Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどのような非毒性有機アミン由来のものを含む。

【0445】

ここに記載する医薬組成物はまた薬学的に許容される抗酸化剤も含み得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例は、(１)アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどのような水可溶性抗酸化剤；(２)パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(ＢＨＡ)、ブチル化ヒドロキシトルエン(ＢＨＴ)、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどのような油可溶性抗酸化剤；および(３)クエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸(ＥＤＴＡ)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのような金属キレート剤を含む。

【0446】

ここに記載する医薬組成物で使用し得る適当な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)および適当なこれらの混合物、オリーブ油のような植物油およびオレイン酸エチルのような注射用有機エステルを含む。適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティング物質の使用により、分散製剤の場合必要な粒子径の維持により、そして界面活性剤の使用により維持できる。

【0447】

これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤のようなアジュバントも含み得る。微生物の存在の予防は、上記の滅菌法および種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含ませることの両者により確実にできる。組成物に糖、塩化ナトリウムなどのような等張剤を含ませることも望ましいことがある。さらに、注射用医薬形態の持続吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤を含ませることにより達成し得る。

【0448】

薬学的に許容される担体は、無菌水溶液または分散液および無菌注射用溶液または分散液の即座の調製のための無菌粉末を含む。薬学的に活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当分野で知られる。ある慣用の媒体または薬剤が活性化合物と非適合性ではない限り、ここに記載する医薬組成物におけるその使用が意図される。補足的活性化合物も組成物に包含させ得る。

【0449】

治療組成物は、一般に製造および保存条件下で、無菌かつ安定でなければならない。組成物を溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは他の高薬物濃度に適する規則的構造として製剤できる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)および適当なこれらの混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティング物質の使用により、分散製剤の場合必要な粒子径の維持によりおよび界面活性剤の使用により維持できる。多くの場合、組成物に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコールまたは塩化ナトリウムを包含させることが好ましい。注射用医薬形態の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンの包含により達成し得る。

【0450】

無菌注射用溶液を、必要な量の活性化合物を、適切な溶媒に、必要に応じて上記成分の１個または組み合わせと共に取り込み、続いて微粒子濾過により滅菌することにより製造できる。一般に、分散剤は、活性化合物を、塩基性分散媒体および上記のものからの必要な他の成分を含む、無菌媒体に取り込むことにより製造する。無菌注射用溶液を製造するための無菌粉末の場合、好ましい製造法は、予め無菌濾過した溶液からの活性成分とさらなる所望の成分の粉末を生産する、真空乾燥およびフリーズドライ(凍結乾燥)である。

【0451】

単一用量形態を生産するために担体物質と組み合わせ得る活性成分の量は、処置する対象および特定の投与方法により変わる。単一用量形態を生産するために担体物質と組み合わせ得る活性成分の量は、一般に治療効果を生じる組成物の量である。一般に、１００％中、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせた約０.０１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、好ましくは約０.１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント〜約３０パーセントの活性成分の範囲である。

【0452】

用量レジメンは、最適な所望の応答(例えば、治療応答)が提供されるように調節する。例えば、１回ボーラスを投与してよく、数分割用量を長い期間をかけて投与してよくまたは治療状況の緊急度により示されるように、用量を徐々に減らしても増やしてもよい。投与の容易さおよび用量の均一さのために、非経腸組成物を用量単位形態に製剤するのが特に有利である。ここで使用する用量単位形態は、処置する対象のための単位用量として適する物理的に分かれた単位であり、各単位は、必要な医薬担体と共に、所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を含む。ここに記載する用量単位形態の仕様は、(ａ)活性化合物の独特な特徴および達成すべき特定の治療効果および(ｂ)個々の感受性に対するこのような活性化合物の製造における当分野に固有の制限、によって定められ、直接的に依存する。

【0453】

抗体投与用の用量は、約０.０００１〜１００mg／宿主体重kgであり、より一般には０.０１〜５mg／宿主体重kgの範囲である。例えば用量は、０.３mg／kg体重、１mg／kg体重、３mg／kg体重、５mg／kg体重または１０mg／kg体重または１〜１０mg／kgの範囲内である。例示的処置レジメは、週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、月１回、３ヶ月に１回または３〜６ヶ月に１回の投与を必要とする。

【0454】

ある方法において、異なる結合特異性を有する２以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合、投与する各抗体の用量は、示された範囲内に入る。抗体は、通常複数回投与する。一用量の間の間隔は、例えば、週、月、３ヶ月または年であり得る。患者における標的抗原に対する抗体の血中レベルの測定により指示されるように、間隔は不規則でもよい。ある方法において、用量を、約１〜１０００μg／ml、ある方法において約２５〜３００μg／mlの血漿抗体濃度となるよう調節する。

【0455】

抗体を、持続放出製剤として製剤でき、この場合、必要な投与頻度は少ない。用量および頻度は、患者における抗体の半減期により変わる。一般に、ヒト抗体は、最長半減期を示し、続いてヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体である。投与用量および頻度は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかにより変わり得る。予防適用において、長期間にわたり、比較的低用量を、比較的低頻度の間隔で投与する。ある患者は、死ぬまで処置を受け続ける。治療適用において、比較的短い間隔で比較的高用量が、疾患の進行が低減するか停止するまで、好ましくは患者が疾患症の部分的なまたは完全な改善を示すまで、時には必要である。その後、患者に予防レジメで投与し得る。

【0456】

ここに記載する医薬組成物における活性成分の実際の用量レベルは、患者に毒性ではなく、特定の患者、組成物および投与方法で所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るように、変えてよい。選択用量レベルは、用いるここに記載する特定の組成物またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排泄速度、処置の期間、他の薬物、用いる特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、全般的体調および先の薬歴および医薬分野で周知の類似因子を含む、多様な薬物動態因子により変わる。

【0457】

ここに記載する抗ＣＤ７３抗体の“治療有効用量”は、好ましくは疾患症状の重症度の軽減、無疾患症状期間の頻度および期間の増大または疾患罹患による機能障害もしくは身体障害の予防をもたらす。癌の状況において、治療的有効用量は、好ましくは癌と関連する身体的症状のさらなる悪化を予防する。癌の症状は当分野で周知であり、例えば、異常な黒子特徴、非対称、境界、色および／または直径を含む黒子の見かけの変化、新たに着色された皮膚領域、異常黒子、爪の下の黒ずんだ領域、乳房腫瘤、乳頭変化、乳房嚢胞、乳房痛、死亡、体重減少、弱化、過度の疲労、摂食困難、食欲減退、慢性咳嗽、息切れ悪化、喀血、血尿、血便、悪心、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、鼓腸、腹水、膣出血、便秘、腹部膨張、結腸穿孔、急性腹膜炎(感染、発熱、疼痛)、疼痛、吐血、重度発汗、発熱、高血圧、貧血、下痢、黄疸、めまい、悪寒、筋肉痙攣、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝臓転移、骨転移、腎臓転移および膵臓転移、嚥下困難などを含む。

【0458】

治療的有効用量は、癌の発症を、該疾患の早期または先行徴候が存在するときに望まれるように、予防または遅延し得る。癌の診断に利用する臨床検査は、化学(ＣＤ７３レベル測定を含む)、血液学、血清学および放射線学を含む。したがって、前記のいずれかをモニターするあらゆる臨床的または生化学的アッセイを、特定の処置が、癌処置に治療的有効用量であるか否かを決定するために使用し得る。当業者は、対象の体格、対象の症状の重症度および選択した特定の組成物または投与経路のような因子に基づき、このような量を決定できる。

【0459】

ここに記載する組成物を、当分野で知られる１以上の多様な方法を使用して、１以上の投与経路で投与できる。当業者には明らかなとおり、投与経路および／または方法は、所望の結果による。ここに記載する抗体の好ましい投与経路は、例えば注射または点滴による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路を含む。ここで使用する用語“非経腸投与”は、通常注射による、経腸および局所投与以外の投与方式をいい、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴を含むが、これらに限定されない。

【0460】

あるいは、ここに記載する抗体を、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下または局所的のような非経腸ではない経路で投与できる。

【0461】

活性化合物を、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤のような、急速な放出から化合物を保護する担体と製造できる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生分解性、生体適合性ポリマーを使用できる。このような製剤の製造のための多くの方法が特許されまたは当業者に一般に知られる。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978参照。

【0462】

治療組成物を、当分野で知られる医療器具を用いて投与できる。例えば、好ましい態様において、ここに記載する治療組成物を、米国特許５,３９９,１６３；５,３８３,８５１；５,３１２,３３５；５,０６４,４１３；４,９４１,８８０；４,７９０,８２４；または４,５９６,５５６に開示のデバイスのような無針皮下組織注射器で投与できる。ここに記載する抗ＣＤ７３抗体で使用するための周知のインプラントおよびモジュールの例は、米国特許４,４８７,６０３(制御された速度で薬を分配するためのインプラント可能微量注入ポンプを記載)；米国特許４,４８６,１９４(皮膚から薬を投与するための治療デバイスを記載)；米国特許４,４４７,２３３(正確な注入速度で薬を送達するための投薬注入ポンプを記載)；米国特許４,４４７,２２４(連続的薬物送達のための可変流動インプラント可能注入装置を記載)；米国特許４,４３９,１９６(多チャンバー区画を有する浸透圧性薬物送達系を記載)；および米国特許４,４７５,１９６(浸透圧性薬物送達系を記載)を含む。これらの特許を、引用によりここに包含させる。多くの他のこのようなインプラント、送達系およびモジュールが当業者に知られる。

【0463】

ある態様において、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体を、インビボでの適切な分布を確実にするように製剤できる。例えば、血液−脳関門(ＢＢＢ)は、多くの高度に親水性の化合物を排除する。ここに記載する治療化合物がＢＢＢを通過することを確実にするために(望むのであれば)、例えば、リポソームに製剤できる。リポソームを製造する方法について、例えば、米国特許４,５２２,８１１；５,３７４,５４８；および５,３９９,３３１を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送され、そうして標的化薬物送達を増強する１以上の成分を含み得る(例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685参照)。例示的ターゲティング成分は、葉酸またはビオチン(例えば、米国特許５,４１６,０１６(Low et al.)参照)；マンノシド(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)；抗体(P.G. Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)；界面活性剤プロテインＡ受容体(Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134)；ｐ１２０(Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)を含む；K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照のこと。

【0464】

XVII. 使用および方法
ここに記載する抗体、抗体組成物および方法は、例えば、アデノシンシグナル伝達減少またはＣＤ７３検出により、多くのインビトロおよびインビボ適用、例えば、腫瘍増殖阻止、腫瘍転移阻止、免疫応答増強を有する。好ましい態様において、ここに記載する抗体はヒト抗体である。例えば、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体を、培養中の細胞に、インビトロまたはエクスビボでまたはヒト対象に、例えば、インビボで投与し、腫瘍細胞増殖を阻害できる。したがって、ここに提供されるのは、対象に、対象における腫瘍増殖が低減するように、ここに記載する抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、対象における腫瘍増殖を修飾する方法である。

【0465】

特定の態様において、方法は、インビボ癌処置に特に適する。腫瘍増殖の抗原特異的阻止を達成するために、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体を、目的の抗原または処置対象(例えば、腫瘍担持対象)に既に存在し得る抗原と共に糖衣よできる。ＣＤ７３に対する抗体を他の薬剤と投与するとき、２剤を別々に投与しても、一緒に投与してもよい。

【0466】

サンプルおよび対照サンプルと、ヒトＣＤ７３に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を、抗体またはその一部とヒトＣＤ７３の複合体の形成を可能にする条件下摂食させることを含む、サンプルにおけるヒトＣＤ７３抗原の存在を検出するまたはヒトＣＤ７３抗原の量を測定する方法も包含される。次いで、複合体の形成を検出し、ここで、対照サンプルと比較したサンプルとの間の複合体形成の差異が、サンプルにおけるヒトＣＤ７３抗原の存在の指標である。さらに、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体を、免疫親和性精製によるヒトＣＤ７３精製に使用できる。

【0467】

さらに対象における免疫応答(例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)が刺激されるように、対象にここに記載する抗ＣＤ７３抗体を投与することを含む、対象における免疫応答(例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)を刺激する方法が包含される。好ましい態様において、対象は腫瘍担持対象であり、腫瘍に対する免疫応答が刺激される。腫瘍は、固形腫瘍または液体腫瘍、例えば、造血器腫瘍であり得る。ある態様において、腫瘍は、免疫原性腫瘍である。ある態様において、腫瘍は、非免疫原性である。

【0468】

ここに記載するこれらおよび他の方法を、下にさらに詳細に記載する。

【0469】

癌
抗ＣＤ７３抗体によるＣＤ７３の阻害は、患者における腫瘍増殖および転移を低減する。抗ＣＤ７３抗体によるＣＤ７３の阻害は、患者における癌性細胞に対する免疫応答も増強し得る。ここに提供されるのは、対象が処置されるように、例えば、癌性腫瘍の増殖が阻止または低減するおよび／また腫瘍が退行するように、対象にここに記載する抗ＣＤ７３抗体を投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法である。抗ＣＤ７３抗体を、癌性腫瘍の増殖阻止に単独で使用できる。あるいは、抗ＣＤ７３抗体を、下記のように、他の薬剤、例えば、他の免疫原性薬剤、標準癌処置または他の抗体と組み合わせて使用できる。

【0470】

したがって、ここに提供されるのは、対象にここに記載する抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分の有効量を投与することを含む、対象における、例えば、腫瘍細胞の増殖阻止による、癌を処置する方法である。抗体はヒト抗ＣＤ７３抗体であり得る(例えばここに記載するヒト抗ヒトＣＤ７３抗体のいずれか)。これに加えてまたはこれとは別に、抗体は、キメラまたはヒト化抗ＣＤ７３抗体、例えば、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分を含むキメラまたはヒト化抗ＣＤ７３抗体であり得る。

【0471】

本発明の抗体を使用して増殖が阻害され得る癌は、一般に免疫療法に応答性の癌を含む。処置のための癌の非限定的例は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞性肺癌、扁平上皮非小細胞性肺癌(ＮＳＣＬＣ)、非ＮＳＣＬＣ、神経膠腫、消化器癌、腎臓癌(例えば明細胞癌)、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌(例えば、腎細胞癌(ＲＣＣ))、前立腺癌(例えばホルモン難治性前立腺腺癌)、甲状腺癌、神経芽腫、膵臓癌、神経膠芽腫(多形神経膠芽腫)、頸部癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌および頭頸部癌(または癌腫)、胃癌、胚細胞腫瘍、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、黒色腫(例えば、皮膚または眼内悪性黒色腫のような転移悪性黒色腫)、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門周辺癌、精巣癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、輸尿管癌、腎盂癌、中枢神経系の新生物(ＣＮＳ)、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘発されるものを含む環境誘発癌、ウイルス関連癌(例えば、ヒト乳頭腫ウイルス(ＨＰＶ)関連腫瘍)および２つの主要な血液細胞系統、すなわち、骨髄細胞株(顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージおよび肥満細胞を産生する)またはリンパ系細胞株(Ｂ、Ｔ、ＮＫおよび形質細胞を産生する)のいずれか由来の血液系腫瘍、例えば、全タイプの白血病、リンパ腫および骨髄腫、例えば、急性、慢性、リンパ性および／または骨髄性白血病、例えば急性白血病(ＡＬＬ)、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)および慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、未分化ＡＭＬ (Ｍ０)、骨髄芽球性白血病(Ｍ１)、骨髄芽球性白血病(Ｍ２；細胞成熟を伴う)、前骨髄球性白血病(Ｍ３またはＭ３バリアント[Ｍ３Ｖ])、骨髄単球性白血病(Ｍ４または好酸球増加症を伴うＭ４バリアント[Ｍ４Ｅ])、単球性白血病(Ｍ５)、赤白血病(Ｍ６)、巨核芽球性白血病(Ｍ７)、孤立性顆粒球性肉腫および緑色腫；リンパ腫、例えばホジキンリンパ腫(ＨＬ)、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ系組織(ＭＡＬＴ)リンパ腫、未分化(例えば、Ｋｉ １＋)大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸Ｔ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性；およびリンパ腫／白血病(Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ)、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、真性組織球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫(ＬＢＬ)、リンパ系造血性腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、汎発性組織球性リンパ腫(ＤＨＬ)、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚性Ｔ細胞リンパ腫(ＣＴＬＣ)(菌状息肉症またはセザリー症候群とも呼ばれる)およびワルデンシュトレーム高ガンマグロブリン血症を伴うリンパ形質細胞性リンパ腫(ＬＰＬ)；骨髄腫、例えば、ＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌型骨髄腫、くすぶり型骨髄腫(緩徐進行性骨髄腫とも呼ばれる)、孤立性形質細胞腫および多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、ヘアリー細胞リンパ腫；骨髄系造血性腫瘍、線維肉腫および横紋筋肉腫を含む間葉性起源の腫瘍；星状細胞腫、シュワン腫を含む、精上皮腫、奇形癌、中枢および末梢神経の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫および骨肉腫を含む、間葉性起源の腫瘍；および小細胞および大脳様細胞型を含むＴ前リンパ性白血病(Ｔ−ＰＬＬ)のようなＴ細胞障害を含むが、これに限定されない、黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞性癌および奇形癌、リンパ系造血性腫瘍、例えばＴ細胞およびＢ細胞腫瘍を含む、他の腫瘍；好ましくはＴ細胞型の大顆粒リンパ球白血病(ＬＧＬ)；ａ／ｄ Ｔ−ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫(多形性および免疫芽球性サブタイプ)；血管中心性(鼻)Ｔ細胞リンパ腫；頭頚部癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌；急性骨髄リンパ腫、ならびに該癌のあらゆる組み合わせを含む。ここに記載する方法は、転移癌、難治性癌(例えば、例えば、遮断ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１抗体での先の免疫療法に難治性の癌)および再発性癌の処置にも使用し得る。

【0472】

本方法は、ＣＤ７３陽性であるまたは高レベルのＣＤ７３を発現する腫瘍または癌の処置に使用し得る。方法は、まず腫瘍または腫瘍細胞におけるＣＤ７３のレベルを決定し、腫瘍または細胞がＣＤ７３、例えば、高レベルのＣＤ７３を発現するならば、例えば、ここに記載する、抗ＣＤ７３抗体で処置することを含み得る。

【0473】

抗ＣＤ７３抗体を、単剤療法としてまたは唯一の免疫刺激療法として投与し得る。ＣＤ７３に対する抗体、例えば、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体を、癌性細胞、精製腫瘍抗原(組み換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む)、細胞および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子を遺伝子導入された細胞のような免疫原性薬剤と組み合わせてもよい(He et al (2004) J. Immunol. 173:4919-28)。使用できる腫瘍ワクチンの非限定的例は、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチドのような黒色腫抗原のペプチドまたはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するように遺伝子導入された腫瘍細胞を含む(下にさらに記載)。

【0474】

ヒトにおいて、黒色腫のようなある腫瘍は免疫原性であることが示されている。ＣＤ７３阻害によりＴ細胞活性化の閾値を低下させることにより、宿主における腫瘍応答が活性化され、非免疫原性腫瘍または免疫原性が限定的であるものの処置を可能にすることができる。

【0475】

抗ＣＤ７３抗体、例えば、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体を、ワクチン接種プロトコールと組み合わせ得る。腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験的戦略が考案されている(Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738参照; Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch, 61, pp, 3023-3043 in DeVita et al., (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Editionもまた参照のこと)。これらの戦略の一つにおいて、ワクチンは、自己または同種腫瘍細胞を使用して調製されている。これらの細胞ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するように形質導入されたとき、最も有効であることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種のための抗原提示の強力なアクティベーターであることが示されている(Dranoff et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A, 90: 3539-43)。

【0476】

多様な腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンの研究により、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義が導かれている(Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7)。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍および腫瘍が発生した細胞において発現される分化抗原、例えばメラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原およびＴｒｐ−２である。より重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主に見られる腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であることが示されている。ＣＤ７３阻害を、腫瘍において発現される組み換えタンパク質および／またはペプチドのコレクションと共に、これらのタンパク質に対する免疫応答を産生するために使用してよい。これらのタンパク質は、通常免疫系により自己抗原と見なされ、それゆえにそれらに対して耐容性である。腫瘍抗原は、染色体のテロメアの合成に必要であり、８５％を超えるヒト癌で発現され、体細胞性組織では数が限定されている、タンパク質テロメラーゼを含み得る(Kim et al., (1994) Science 266: 2011-2013)。腫瘍抗原はまた、タンパク質配列を変えるまたは２つの無関係配列の融合タンパク質(すなわち、フィラデルフィア染色体におけるｂｃｒ−ａｂｌ)を創出する体細胞性変異のため、癌細胞において発現される“ネオ抗原”またはＢ細胞腫瘍からのイディオタイプでもあり得る。

【0477】

他の腫瘍ワクチンは、ヒト乳頭腫ウイルス(ＨＰＶ)、肝炎ウイルス(ＨＢＶおよびＨＣＶ)およびカポジヘルペス肉腫ウイルス(ＫＨＳＶ)のようなヒト癌と関与するウイルスからのタンパク質を含み得る。ＣＤ７３阻害と組み合わせて使用できる腫瘍特異的抗原の多の形態は、腫瘍組織自体から単離された精製ヒートショックタンパク質(ＨＳＰ)である。これらのヒートショックタンパク質は、腫瘍細胞からのタンパク質のフラグメントを含み、これらのＨＳＰは、腫瘍免疫の惹起のための抗原提示細胞の送達に極めて有効である(Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al., (1997) Science 278:117-120)。

【0478】

樹状細胞(ＤＣ)は、抗原特異的応答の誘発に使用できる強力な抗原提示細胞である。ＤＣは、エクスビボで産生され、多様なタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物を用いて充填される(Nestle et al., (1998) Nature Medicine 4: 328-332)。ＤＣはまた同様にこれらの腫瘍抗原を発現する遺伝的手段により形質導入もできる。ＤＣはまた免疫化の目的で腫瘍細胞に直接的に融合されている(Kugler et al., (2000) Nature Medicine 6:332-336)。ワクチン接種の方法として、ＤＣ免疫化を、ＣＤ７３阻害と効率的に組み合わせて、より強力な抗腫瘍応答を活性化できる。

【0479】

ＣＤ７３阻害をまた標準癌処置と組み合わせ得る(例えば、手術、放射線および化学療法)。ＣＤ７３阻害を、化学療法レジメと効率的に組泡es得る。これらの例において、投与する化学療法剤の用量を低減することが可能であり得る(Mokyr et al., (1998) Cancer Research 58: 5301-5304)。このような組み合わせの例は、黒色腫の処置のためのダカルバジンと組み合わせた抗ＣＤ７３抗体である。このような組み合わせの他の例は、黒色腫の処置のためのインターロイキン−２(ＩＬ−２)と組み合わせた抗ＣＤ７３抗体である。ＣＤ７３阻害と化学療法の組み合わせの裏にある科学的原理は、大部分の化学療法化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原レベルを増加させることにある。細胞死によりＣＤ７３阻害との相乗性をもたらし得る他の組み合わせ治療は、放射線、手術およびホルモン除去である。これらのプロトコールの各々は、宿主における腫瘍抗原の源を創出する。血管形成阻害剤も、ＣＤ７３阻害と組み合わせ得る。血管形成の阻害は、腫瘍細胞死をもたらし、これが宿主抗原提示経路に腫瘍抗原を供給し得る。

【0480】

このような組み合わせのさらに他の例は、抗ＣＤ３９、抗Ａ２ＡＲまたは化学阻害剤または抗Ａ２ＢＲ抗体または化学阻害剤と組み合わせた抗ＣＤ７３抗体である。ＣＤ７３阻害とＣＤ３９、Ａ２ＡＲまたはＡ２ＢＲの阻害の組み合わせの裏にある科学的根拠は、これらのタンパク質がＣＤ７３生物学的機能およびシグナル伝達とも連結していることである。特に、ＣＤ３９は、ＡＴＰまたはＡＤＰからＡＭＰへの変換を触媒し、そうして、ＣＤ７３酵素活性(すなわちＡＭＰからアデノシンへの変換)の基質(ＡＭＰ)を提供する。さらに、アデノシンは、Ａ１Ｒ、Ａ２ＡＲ、Ａ２ＢＲおよびＡ３を含む、４既知受容体のリガンドである。Ａ２ＡＲおよびＡ２ＢＲは、ｃＡＭＰシグナル伝達により、腫瘍環境における腫瘍細胞増殖、増殖、遊走および転移ならびにＴ細胞活性化を制御することが示されている。

【0481】

ここに記載する抗ＣＤ７３抗体をまたＦｃαまたはＦｃγ受容体発現エフェクター細胞を腫瘍細胞に標的化させる二特異性抗体とも組み合わせても使用し得る(例えば、米国特許５,９２２,８４５および５,８３７,２４３参照)。二特異性抗体を、２個の別々の抗原を標的化するために使用できる。例えば抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原(例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ)二特異性抗体は、マクロファージを腫瘍部位に標的化させるために使用されている。このターゲティングは、腫瘍特異的応答を効率的に活性化し得る。あるいは、抗原を、腫瘍抗原および樹状細胞特異的細胞表面マーカーに結合する二特異性抗体の使用により、ＤＣに直接的に送達させ得る。

【0482】

腫瘍は、多種多様な機構により宿主免疫監視を逃れる。これらの機構の多くが、腫瘍により発現され、免疫抑制性であるタンパク質の不活性化により克服され得る。これらは、とりわけＴＧＦ−β(Kehrl et al., (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050)、ＩＬ−１０(Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200)およびＦａｓリガンド(Hahne et al., (1996) Science 274: 1363-1365)を含む。これらの各々に対する抗体を、抗ＣＤ７３抗体と組み合わせて使用して、免疫抑制剤の作用を逆転し、宿主による腫瘍免疫応答を支持し得る。

【0483】

宿主免疫応答性を活性化する他の抗体を、抗ＣＤ７３抗体と組み合わせて使用しできる。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体はまた、Ｔ細胞ヘルパー活性に効率的に置き換わり(Ridge et al., (1998) Nature 393: 474-478)、抗ＣＤ７３抗体と組み合わせて使用できる。ＯＸ−４０(Weinberg et al., (2000) Immunol 164: 2160-2169)、４−１ＢＢ(Melero et al., (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997))およびＩＣＯＳ(Hutloff et al., (1999) Nature 397: 262-26)のようなＴ細胞共刺激性分子に対する活性化抗体も、Ｔ細胞活性化のレベル増加のために提供し得る。ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１またはＣＴＬＡ−４の阻害剤(例えば、米国特許５,８１１,０９７)もＣＤ７３抗体と組み合わせて使用し得る。

【0484】

他のここに記載する方法は、特定の毒素または病原体に曝されている患者の処置に使用される。したがって、ここに記載する他の面は、対象が感染性疾患について処置されるように、対象に抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、対象における感染性疾患を処置する方法である。これに加えてまたはこれとは別に、抗体はキメラまたはヒト化抗体であり得る。

【0485】

上記方法の全てにおいて、ＣＤ７３阻害を、腫瘍抗原に対する提示を増強する、サイトカイン処置(例えば、インターフェロンｓ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２)または二特異性抗体治療のような免疫療法の他の形態と組み合わせ得る(例えば、Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123参照)。

【0486】

組み合わせ治療
上記組み合わせ治療に加えて、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体は、下記のように、例えば、癌の処置のために、組み合わせ治療でも用い得る。

【0487】

さらにここに提供されるのは、抗ＣＤ７３抗体を、免疫応答の刺激に有効であり、それゆえに対象における免疫応答をさらに増強、刺激または上方制御する１以上のさらなる薬剤、例えば、抗体と共投与する、組み合わせ治療の方法である。

【0488】

一般に、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体を、(ｉ)共刺激性受容体のアゴニストおよび／または(ii)Ｔ細胞上の阻害性シグナルのアンタゴニストと組み合わせることができ、この両者とも、抗原特異的Ｔ細胞応答をもたらす(免疫チェックポイントレギュレーター)。共刺激性および共阻害性分子の大部分は、免疫グロブリンスーパーファミリー(ＩｇＳＦ)のメンバーであり、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体を、免疫応答増加のために、ＩｇＳＦファミリーのメンバーを標的とする薬剤と投与してよい。共刺激性または共阻害性受容体に結合する膜結合リガンドの一つの重要なファミリーは、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１(ＰＤ−Ｌ１)、Ｂ７−ＤＣ(ＰＤ−Ｌ２)、Ｂ７−Ｈ２(ＩＣＯＳ−Ｌ)、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５(ＶＩＳＴＡ)およびＢ７−Ｈ６を含むＢ７ファミリーである。共刺激性または共阻害性受容体に結合する膜結合リガンドの他のファミリーは、同族ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに結合する分子のＴＮＦファミリーであり、これは、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２−Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡＲ、ＥＤＡ１、ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンホトキシンα／ＴＮＦβ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＬＴβＲ、リンホトキシンα １β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹ、ＮＧＦＲを含む(例えば、Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1参照)。Ｔ細胞活性化は、可溶性サイトカインによっても制御される。それゆえに、抗ＣＤ７３抗体を、例えば、癌のような増殖性疾患の処置のための、免疫応答刺激のために、(ｉ)ＩｇＳＦファミリーまたはＢ７ファミリーまたはＴ細胞活性化を阻害するＴＮＦファミリーのタンパク質のアンタゴニスト(または阻害剤または遮断剤)またはＴ細胞活性化を阻害するサイトカイン(例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ；“免疫抑制性サイトカイン”)のアンタゴニストおよび／または(ii)ＩｇＳＦファミリー、Ｂ７ファミリーまたはＴＮＦファミリーの刺激性受容体またはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインのアゴニストと組み合わせでしよい得できる。

【0489】

例えば、Ｔ細胞応答は、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体、例えば、ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆおよび次の薬剤の１以上の組み合わせにより刺激され得る：
(１)上記のようなＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＬＡＧ−３ならびに次のタンパク質のいずれか：ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＣＤ７３、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、ＣＤ３９のような、Ｔ細胞活性化)を阻害するタンパク質(例えば、免疫チェックポイント阻害剤)のアンタゴニスト(阻害剤または遮断剤)。
(２)Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＤＲ３およびＣＤ２８ＨのようなＴ細胞活性化を刺激するタンパク質のアゴニスト。

【0490】

上記タンパク質の一つを調節し、癌の処置のために、アンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体、例えば、ここに記載のものと組み合わせ得る薬剤の例は、ヤーボイ^ＴＭ(イピリムマブに対する)またはトレメリムマブ(ＣＴＬＡ−４に対する)、ガリキシマブ(Ｂ７.１に対する)、ＢＭＳ−９３６５５８(ＰＤ−１に対する)、ＣＴ−０１１(ＰＤ−１に対する)、ＭＫ−３４７５(ＰＤ−１に対する)、ＡＭＰ２２４(Ｂ７ＤＣに対する)、ＢＭＳ−９３６５５９(Ｂ７−Ｈ１に対する)、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(Ｂ７−Ｈ１に対する)、ＭＥＤＩ−５７０(ＩＣＯＳに対する)、ＡＭＧ５５７(Ｂ７Ｈ２に対する)、ＭＧＡ２７１(Ｂ７Ｈ３に対する)、ＩＭＰ３２１(ＬＡＧ−３に対する)、ＢＭＳ−６６３５１３(ＣＤ１３７に対する)、ＰＦ−０５０８２５６６(ＣＤ１３７に対する)、ＣＤＸ−１１２７(ＣＤ２７に対する)、抗ＯＸ４０(Providence Health Services)、ｈｕＭＡｂＯＸ４０Ｌ(ＯＸ４０Ｌに対する)、アタシセプト(ＴＡＣＩに対する)、ＣＰ−８７０８９３(ＣＤ４０に対する)、ルカツムマブ(ＣＤ４０に対する)、ダセツズマブ(ＣＤ４０に対する)、ムロモナブ−ＣＤ３(ＣＤ３に対する)、イピリムマブ(ＣＴＬＡ−４に対する)を含む。

【0491】

癌の処置のために、アンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体と組み合わせ得る他の分子は、ＮＫ細胞上の阻害性受容体のアンタゴニストまたはＮＫ細胞上の活性化受容体のアゴニストを含む。例えば、抗ＣＤ７３アンタゴニスト抗体を、ＫＩＲのアンタゴニスト(例えば、リリルマブ)と組み合わせ得る。

【0492】

Ｔ細胞活性化はまた可溶性サイトカインにより制御され、抗ＣＤ７３抗体を、例えば、癌を有する、対象に、Ｔ細胞活性化を阻害するサイトカインのアンタゴニストまたはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインのアゴニストと投与し得る。

【0493】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体を、例えば、癌のような増殖性疾患の処置のために、免疫応答を刺激するために、(ｉ)Ｔ細胞活性化を阻害するＩｇＳＦファミリーまたはＢ７ファミリーまたはＴＮＦファミリーのタンパク質のアンタゴニスト(または阻害剤または遮断剤)またはＴ細胞活性化を阻害するサイトカインのアンタゴニスト(例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ；“免疫抑制性サイトカイン”)および／または(ii)ＩｇＳＦファミリー、Ｂ７ファミリーまたはＴＮＦファミリーの刺激性受容体またはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインのアゴニストと組み合わせて使用できる。

【0494】

組み合わせ治療のためのさらに他の薬剤は、ＲＧ７１５５（ＷＯ１１／７００２４、ＷＯ１１／１０７５５３、ＷＯ１１／１３１４０７、ＷＯ１３／８７６９９、ＷＯ１３／１１９７１６、ＷＯ１３／１３２０４４)またはＦＰＡ−００８（ＷＯ１１／１４０２４９；ＷＯ１３１６９２６４；ＷＯ１４／０３６３５７)のようなＣＳＦ−１Ｒアンタゴニストを含むＣＳＦ−１Ｒアンタゴニスト抗体を含むが、これらに限定されない、マクロファージまたは単球を阻害または枯渇する薬剤を含む。

【0495】

抗ＣＤ７３抗体を、ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する薬剤とも投与し得る。
抗ＣＤ７３抗体と組み合わせ得るさらなる薬剤は、腫瘍抗原提示を増強する薬剤、例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ分泌性細胞ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびイミキモドまたは腫瘍細胞の免疫原性を増強する治療(例えば、アントラサイクリン)を含む。

【0496】

抗ＣＤ７３抗体と組み合わせ得る他の治療は、Ｔ_ｒｅｇ細胞を枯渇または遮断する治療、例えば、ＣＤ２５に特異的に結合する薬剤を含む。

【0497】

抗ＣＤ７３抗体と組み合わせ得る他の治療は、インドールアミンジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼまたは一酸化窒素合成酵素のような代謝酵素を阻害する治療である。

【0498】

抗ＣＤ７３抗体と使用し得る他のクラスの薬剤は、アデノシンの形成を阻害するまたはアデノシンＡ２Ａ受容体を阻害する薬剤を含む。

【0499】

癌の処置のために抗ＣＤ７３抗体と組み合わせ得る他の治療は、Ｔ細胞アネルギーまたは消耗を回復／予防する治療および腫瘍部位の自然免疫活性化および／または炎症を誘発する治療を含む。

【0500】

抗ＣＤ７３抗体を１を超える免疫腫瘍学的薬剤と組み合わせてよく、例えば、次の１以上のような免疫経路の複数の要素を標的とするコンビナトリアルアプローチと組み合わせ得る：腫瘍抗原提示を増強する治療(例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ分泌性細胞ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、イミキモド)；例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２経路阻害および／またはＴ_ｒｅｇまたは他の免疫抑制細胞の枯渇または遮断により、陰性免疫制御を阻害する治療；例えば、ＣＤ−１３７、ＯＸ−４０および／またはＧＩＴＲ経路を刺激するおよび／またはＴ細胞エフェクター機能を刺激するアゴニストでの、陽性免疫制御を刺激する治療；抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身性に高める治療；例えば、ＣＤ２５のアンタゴニスト(例えば、ダクリズマブ)またはエクスビボ抗ＣＤ２５ビーズ枯渇を使用する、腫瘍におけるＴ_ｒｅｇのようなＴ_ｒｅｇを枯渇または阻害する治療；腫瘍におけるサプレッサー骨髄細胞の機能に影響する治療；腫瘍細胞の免疫原性を増強する治療(例えば、アントラサイクリン)；例えば、キメラ抗原受容体による細胞修飾のような、遺伝子修飾された細胞を含む、養子Ｔ細胞またはＮＫ細胞導入(ＣＡＲ−Ｔ治療)；インドールアミンジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼまたは一酸化窒素合成酵素のような代謝酵素を阻害する治療；Ｔ細胞アネルギーまたは消耗を回復／予防する治療；腫瘍部位の自然免疫活性化および／または炎症を誘発する治療；免疫刺激性サイトカインの投与；または免疫抑制性サイトカインの遮断。

【0501】

一般に、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体を、陽性共刺激性受容体を連結するアゴニスト薬剤、阻害性受容体を介するシグナル伝達を減弱する遮断剤、アンタゴニストおよび１以上の抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身性に高める薬剤、腫瘍微小環境内の多様な免疫抑制経路に打ち勝つ薬剤(例えば、阻害性受容体結合遮断(例えば、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用)、Ｔ_ｒｅｇ枯渇または阻害(例えば、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体(例えば、ダクリズマブ)またはエクスビボ抗ＣＤ２５ビーズ枯渇の使用)、ＩＤＯのような代謝酵素阻害またはＴ細胞アネルギーまたは消耗の回復／予防)および腫瘍部位で自然免疫活性化および／または炎症を誘発する薬剤の１以上と使用し得る。阻害性受容体の内在化の増加は、潜在的阻害剤のレベル低下に反映され得る(シグナル伝達が後続しないと仮定)。

【0502】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体を、対象がＢＲＡＦ Ｖ６００変異陽性であれば、ＢＲＡＦ阻害剤と共に対象に投与する。

【0503】

ここに提供されるのは、例えば、腫瘍増殖阻害または抗ウイルス応答刺激のために、対象における免疫応答が刺激されるように、対象にアンタゴニスト抗ＣＤ７３分子、例えば、抗体および１以上のさらなる免疫刺激性抗体、例えば、抗ＰＤ−１アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体、抗ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体および／または抗ＬＡＧ３アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体を投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法である。ある態様において、対象に、アンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体を投与する。ある態様において、対象に、アンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与する。ある態様において、対象に、アンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体およびアンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与する。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、ここに記載する抗体のようなヒト抗体である。あるいは、抗ＣＤ７３抗体は、さらにここに記載するもののような、例えば、キメラまたはヒト化抗体(例えば、マウス抗ＣＤ７３ ｍＡｂから製造)である。ある態様において、少なくとも一つのさらなる免疫刺激性抗体(例えば、アンタゴニスト抗ＰＤ−１、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４および／またはアンタゴニスト抗ＬＡＧ３抗体)はヒト抗体である。あるいは、少なくとも一つのさらなる免疫刺激性抗体は、例えば、キメラまたはヒト化抗体(例えば、マウス抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＬＡＧ３抗体から製造)であり得る。

【0504】

ここに提供されるのは、対象にアンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体およびアンタゴニストＰＤ−１抗体を投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)を処置する方法である。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は治療量以下の用量で投与され、抗ＰＤ−１抗体は治療量以下の用量で投与されまたは両者は治療量以下の用量で投与される。またここに提供されるのは、対象に抗ＣＤ７３抗体および治療量以下の抗ＰＤ−１抗体を投与することを含む、過増殖性疾患の免疫刺激剤での処置に関連する有害事象を変える方法である。ある態様において、対象はヒトである。ある態様において、抗ＰＤ−１抗体は、ここに記載する１１Ｆ１１、４Ｃ３、４Ｄ４、１０Ｄ２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８、６Ｅ１１、７Ａ１１、ＣＤ７３.３、ＣＤ７３.４、ＣＤ７３.５、ＣＤ７３.６、ＣＤ７３.７、ＣＤ７３.８、ＣＤ７３.９、ＣＤ７３.１０またはＣＤ７３.１１のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体またはここに記載する他のアンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体のような、ヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ＣＤ７３抗体はヒト配列モノクローナル抗体である。

【0505】

ここに記載する方法において使用するための適当なＰＤ−１アンタゴニストは、リガンド、抗体(例えば、モノクローナル抗体および二特異性抗体)および多価薬剤を含むが、これらに限定されない。ある態様において、ＰＤ−１アンタゴニストは、融合タンパク質、例えば、ＡＭＰ−２４４のようなＦｃ融合タンパク質である。ある態様において、ＰＤ−１アンタゴニストは、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。

【0506】

抗ＰＤ−１抗体の例は、ニボルマブ(ＢＭＳ−９３６５５８)またはＷＯ２００６／１２１１６８に記載する抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、７Ｄ３、５Ｆ４および４Ａ１１のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体である。ある態様において、抗ＰＤ１抗体は、ＷＯ２０１２／１４５４９３に記載のＭＫ−３４７５(ランブロリズマブ)；ＷＯ２０１２／１４５４９３に記載のＡＭＰ−５１４；およびＣＴ−０１１(ピディリズマブ；以前は、ＣＴ−ＡｃＴｉｂｏｄｙまたはＢＡＴ；例えば、Rosenblatt et al., (2011) J. Immunotherapy 34:409参照)である。さらに既知ＰＤ−１抗体および他のＰＤ−１阻害剤は、ＷＯ２００９／０１４７０８、ＷＯ０３／０９９１９６、ＷＯ２００９／１１４３３５、ＷＯ２０１１／０６６３８９、ＷＯ２０１１／１６１６９９、ＷＯ２０１２／１４５４９３、米国特許７,６３５,７５７および８,２１７,１４９および米国特許公報２００９／０３１７３６８に記載のものを含む。ＷＯ２０１３／１７３２２３に開示される抗ＰＤ−１抗体のいずれも使用し得る。これらの抗体のいずれかと、ＰＤ−１と結合について競合するおよび／または同一エピトープに結合する抗ＰＤ−１抗体も組み合わせ処置に使用し得る。

【0507】

ある態様において、抗ＰＤ−１抗体は、ヒトＰＤ−１に５×１０^-８Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトＰＤ−１に１×１０^-８Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトＰＤ−１に５×１０^-９Ｍ以下のＫ_Ｄで結合するまたはヒトＰＤ−１に１×１０^-８Ｍ〜１×１０^-１０Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。

【0508】

ここに提供されるのは、対象にアンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体およびアンタゴニストＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)を処置する方法である。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は治療量以下の用量で投与され、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は治療量以下の用量で投与されまたは両者は治療量以下の用量で投与される。ここに提供されるのは、対象に抗ＣＤ７３抗体および治療量以下の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを含む、過増殖性疾患の免疫刺激剤での処置と関連する有害事象を変える方法である。ある態様において、対象はヒトである。ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ここに記載する１１Ｆ１１、４Ｃ３、４Ｄ４、１０Ｄ２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８、６Ｅ１１、７Ａ１１、ＣＤ７３.３、ＣＤ７３.４、ＣＤ７３.５、ＣＤ７３.６、ＣＤ７３.７、ＣＤ７３.８、ＣＤ７３.９、ＣＤ７３.１０またはＣＤ７３.１１のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体またはここに記載する他のアンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体のような、ヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ＣＤ７３抗体はヒト配列モノクローナル抗体である。

【0509】

ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＢＭＳ−９３６５５９(ＷＯ２００７／００５８７４およびＵＳ特許７,９４３,７４３で１２Ａ４と称される)またはＰＣＴ公開ＷＯ０７／００５８７４およびＵＳ特許７,９４３,７４３に記載される、３Ｇ１０、１２Ａ４、１０Ａ５、５Ｆ８、１０Ｈ１０、１Ｂ１２、７Ｈ１、１１Ｅ６、１２Ｂ７および１３Ｇ４のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体である。ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＥＤＩ４７３６(別名抗Ｂ７−Ｈ１)またはＭＰＤＬ３２８０Ａ(別名ＲＧ７４４６)である。ＷＯ２０１３／１７３２２３、ＷＯ２０１１／０６６３８９、ＷＯ２０１２／１４５４９３、米国特許７,６３５,７５７および８,２１７,１４９および米国公報２００９／１４５４９３に開示の抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれも使用し得る。これらの抗体のいずれかと競合するおよび／または同一エピトープに結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体も組み合わせ処置に使用し得る。

【0510】

ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１に５×１０^-８Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトＰＤ−Ｌ１に１×１０^-８Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトＰＤ−Ｌ１に５×１０^-９Ｍ以下のＫ_Ｄで結合するまたはヒトＰＤ−Ｌ１に１×１０^-８Ｍ〜１×１０^-１０Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。

【0511】

ここに提供されるのは、対象にここに記載する抗ＣＤ７３抗体およびＣＴＬＡ−４アンタゴニスト抗体を投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)を処置する方法である。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は治療量以下の用量で投与され、抗ＣＴＬＡ−４抗体は治療量以下の用量で投与されまたは両者は治療量以下の用量で投与される。ここに提供されるのは、対象に抗ＣＤ７３抗体および治療量以下の抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与することを含む、過増殖性疾患の免疫刺激剤での処置と関連する有害事象を変える方法である。ある態様において、対象はヒトである。ある態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ヤーボイ^ＴＭ(イピリムマブまたはＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４に記載の抗体１０Ｄ１)、トレメリムマブ(以前はチシリムマブ、ＣＰ−６７５,２０６)、次の文献のＷＯ９８／４２７５２；ＷＯ００／３７５０４；米国特許６,２０７,１５６；Hurwitz et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067-10071; Camacho et al., (2004) J. Clin. Oncology 22(145): Abstract No. 2505(抗体ＣＰ−６７５２０６)；およびMokyr et al., (1998) Cancer Res. 58:5301-5304いずれかに記載のモノクローナルまたは抗ＣＴＬＡ−４抗体からなる群から選択される抗体である。ＷＯ２０１３／１７３２２３に開示の抗ＣＴＬＡ−４抗体のいずれも使用し得る。

【0512】

ある態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ヒトＣＴＬＡ−４に５×１０^-８Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトＣＴＬＡ−４に１×１０^-８Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトＣＴＬＡ−４に５×１０^-９Ｍ以下のＫ_Ｄで結合するまたはヒトＣＴＬＡ−４に１×１０^-８Ｍ〜１×１０^-１０Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。

【0513】

ここに提供されるのは、対象に抗ＣＤ７３抗体および抗ＬＡＧ−３抗体を投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)を処置する方法である。さらなる態様において、抗ＣＤ７３抗体は治療量以下の用量で投与され、抗ＬＡＧ−３抗体は治療量以下の用量で投与されまたは両者は治療量以下の用量で投与される。ここに提供するのは、対象に抗ＣＤ７３抗体および治療量以下の抗ＬＡＧ−３抗体を投与することを含む、過増殖性疾患の免疫刺激剤での処置と関連する有害事象を変える方法である。ある態様において、対象はヒトである。ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、１１Ｆ１１、４Ｃ３、４Ｄ４、１０Ｄ２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８、６Ｅ１１、７Ａ１１、ＣＤ７３.３、ＣＤ７３.４、ＣＤ７３.５、ＣＤ７３.６、ＣＤ７３.７、ＣＤ７３.８、ＣＤ７３.９、ＣＤ７３.１０またはＣＤ７３.１１またはここに記載する他のアンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体のような、ヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ＣＤ７３抗体はヒト配列モノクローナル抗体である。抗ＬＡＧ３抗体の例は、米国特許公報ＵＳ２０１１／０１５０８９２およびＷＯ２０１４／００８２１８に記載される、抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体を含む。ある態様において、抗ＬＡＧ−３抗体はＢＭＳ−９８６０１６である。使用できる他の当分野で認識される抗ＬＡＧ−３抗体は、ＵＳ２０１１／００７０２３に記載のＩＭＰ７３１を含む。ＩＭＰ−３２１も使用し得る。これらの抗体のいずれかと競合するおよび／または同一エピトープに結合する抗ＬＡＧ−３抗体も、組み合わせ処置において使用し得る。

【0514】

ある態様において、抗ＬＡＧ−３抗体は、ヒトＬＡＧ−３に５×１０^-８Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトＬＡＧ−３に１×１０^-８Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトＬＡＧ−３に５×１０^-９Ｍ以下のＫ_Ｄで結合するまたはヒトＬＡＧ−３に１×１０^-８Ｍ〜１×１０^-１０Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。

【0515】

ある態様において、抗ＣＤ７３抗体を、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、例えば、６Ｃ８のＣＤＲ配列を有する抗体、例えば、ＷＯ２００６／１０５０２１に記載のような、例えば、６Ｃ８のＣＤＲを有するヒト化抗体；ＷＯ２０１１／０２８６８３に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを有する抗体；ＪＰ２００８２７８８１４に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを有する抗体；またはＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３３９９１に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを有する抗体と共に投与する。

【0516】

ここに記載する抗ＣＤ７３抗体およびＬＡＧ−３および／またはＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１のような第二標的抗原の１以上に対するアンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体の投与は、患者における癌性細胞に対する免疫応答を増強できる。本発明の抗体を使用して増殖を阻害し得る癌は、一般に免疫療法に応答する癌を含む。本発明の組み合わせ治療で処置する癌の代表例は、抗ＣＤ７３抗体での単剤療法の上での記載で特に挙げた癌を含む。

【0517】

ある態様において、ここに記載する治療抗体の組み合わせを、薬学的に許容される担体中の単一組成物として同時にまたは薬学的に許容される担体中の各抗体を用いる別々の組成物として逐次的に投与してよい。他の態様において、治療抗体の組み合わせを逐次的に投与し得る。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体を最初に投与し、抗ＣＤ７３抗体を次にまたは抗ＣＤ７３抗体を最初に投与し、抗ＣＴＬＡ−４抗体を次にのように、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＣＤ７３抗体を逐次的に投与し得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗ＰＤ−１抗体を最初に投与し、抗ＣＤ７３抗体を次にまたは抗ＣＤ７３抗体を最初に投与し、抗ＰＤ−１抗体を次にのように、抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＤ７３抗体を逐次的に投与し得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を最初に投与し、抗ＣＤ７３抗体を次にまたは抗ＣＤ７３抗体を最初に投与し、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を次にのように、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＣＤ７３抗体を逐次的に投与し得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗ＬＡＧ−３抗体を最初に投与し、抗ＣＤ７３抗体を次にまたは抗ＣＤ７３抗体を最初に投与し、抗ＬＡＧ−３抗体を次にのように、抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＣＤ７３抗体を逐次的に投与し得る。

【0518】

さらに、組み合わせ治療の１回を超える用量を逐次的に投与するならば、逐次投与の順番は、各投与時に逆になっても同じ順番のままでもよく、逐次投与を、同時投与または任意のこれらの組み合わせと組み合わせ得る。例えば、組み合わせ抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＣＤ７３抗体の最初の投与は同時であってよく、二回目の投与は、抗ＣＴＬＡ−４抗体が先で、抗ＣＤ７３抗体がその次、三回目の投与は、抗ＣＤ７３抗体が先で、抗ＣＴＬＡ−４抗体がその次などであり得る。これに加えてまたはこれとは別に、組み合わせ抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＤ７３抗体の最初の投与は同時であってよく、二回目の投与は、抗ＰＤ−１抗体が最初で、抗ＣＤ７３抗体が次、三回目の投与は、抗ＣＤ７３抗体が最初で、抗ＰＤ−１抗体が次などであり得る。これに加えてまたはこれとは別に、組み合わせ抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＣＤ７３抗体の最初の投与は同時であってよく、二回目の投与は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が先で、抗ＣＤ７３抗体がその次、三回目の投与は、抗ＣＤ７３抗体が先で、抗ＰＤ−Ｌ１抗体がその次などであり得る。これに加えてまたはこれとは別に、組み合わせ抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＣＤ７３抗体の最初の投与は同時であってよく、二回目の投与は、抗ＬＡＧ−３抗体が先で、抗ＣＤ７３抗体がその次、三回目の投与は、抗ＣＤ７３抗体が先で、抗ＬＡＧ−３抗体がその次などであり得る。他の代表的投薬スキームは、先ず抗ＣＤ７３投与し、次いで抗ＣＴＬＡ−４抗体(および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体)の逐次の最初の投与を含み、その後の投与は同時であり得る。

【0519】

ある態様において、免疫系の刺激により利益を受け得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に免疫腫瘍学的薬剤および抗ＣＤ７３抗体を投与することにより処置し、ここで、免疫腫瘍学的薬剤はＣＤ１３７(４−１ＢＢ)アゴニスト、例えばアゴニストＣＤ１３７抗体である。適当なＣＤ１３７抗体は、例えば、ウレルマブまたはＰＦ−０５０８２５６６(ＷＯ１２／３２４３３)を含む。

【0520】

ある態様において、免疫系の刺激により利益を受け得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に免疫腫瘍学的薬剤および抗ＣＤ７３抗体を投与することにより処置し、ここで、免疫腫瘍学的薬剤は、ＯＸ４０アゴニスト、例えばアゴニストＯＸ４０抗体である。適当なＯＸ４０抗体は、例えば、ＭＥＤＩ−６３８３、ＭＥＤＩ−６４６９またはＭＯＸＲ０９１６(ＲＧ７８８８；ＷＯ０６／０２９８７９)を含む。

【0521】

ある態様において、免疫系の刺激により利益を受け得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に免疫腫瘍学的薬剤および抗ＣＤ７３抗体を投与することにより処置し、ここで、免疫腫瘍学的薬剤はＣＤ４０アゴニスト、例えばアゴニストＣＤ４０抗体である。ある態様において、免疫腫瘍学的薬剤はＣＤ４０アンタゴニスト、例えばアンタゴニストＣＤ４０抗体である。適当なＣＤ４０抗体は、例えば、ルカツムマブ(ＨＣＤ１２２)、ダセツズマブ(ＳＧＮ−４０)、ＣＰ−８７０,８９３またはＣｈｉ Ｌｏｂ ７／４を含む。

【0522】

ある態様において、免疫系の刺激により利益を受け得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に免疫腫瘍学的薬剤および抗ＣＤ７３抗体を投与することにより処置し、ここで、免疫腫瘍学的薬剤はＣＤ２７アゴニスト、例えばアゴニストＣＤ２７抗体である。適当なＣＤ２７抗体は、例えば、バルリルマブ(ＣＤＸ−１１２７)を含む。

【0523】

ある態様において、免疫系の刺激により利益を受け得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に免疫腫瘍学的薬剤および抗ＣＤ７３抗体を投与することにより処置し、ここで、免疫腫瘍学的薬剤はＭＧＡ２７１(Ｂ７Ｈ３に対する)(ＷＯ１１／１０９４００)。

【0524】

ある態様において、免疫系の刺激により利益を受け得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に免疫腫瘍学的薬剤および抗ＣＤ７３抗体を投与することにより処置し、ここで、免疫腫瘍学的薬剤はＫＩＲアンタゴニスト、例えばリリルマブである。

【0525】

ある態様において、免疫系の刺激により利益を受け得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に免疫腫瘍学的薬剤および抗ＣＤ７３抗体を投与することにより処置し、ここで、免疫腫瘍学的薬剤は、ＩＤＯアンタゴニストである。適当なＩＤＯアンタゴニストは、例えば、ＩＮＣＢ−０２４３６０(ＷＯ２００６／１２２１５０、ＷＯ０７／７５５９８、ＷＯ０８／３６６５３、ＷＯ０８／３６６４２)、インドキシモド、ＮＬＧ−９１９(ＷＯ０９／７３６２０、ＷＯ０９／１１５６６５２、ＷＯ１１／５６６５２、ＷＯ１２／１４２２３７)またはＦ００１２８７を含む。

【0526】

ある態様において、免疫系の刺激により利益を受け得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に免疫腫瘍学的薬剤および抗ＣＤ７３抗体を投与することにより処置し、ここで、免疫腫瘍学的薬剤はトール様受容体アゴニスト、例えば、ＴＬＲ２／４アゴニスト(例えば、カルメット・ゲラン桿菌)；ＴＬＲ７アゴニスト(例えば、Hiltonolまたはイミキモド)；ＴＬＲ７／８アゴニスト(例えば、レシキモド)；またはＴＬＲ９アゴニスト(例えば、ＣｐＧ７９０９)である。

【0527】

ある態様において、免疫系の刺激により利益を受け得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、免疫腫瘍学的薬剤および抗ＣＤ７３抗体を対象に投与することにより処置し、ここで、免疫腫瘍学的薬剤はＴＧＦ−β阻害剤、例えば、ＧＣ１００８、ＬＹ２１５７２９９、ＴＥＷ７１９７またはＩＭＣ−ＴＲ１である。

【0528】

ある面において、抗ＣＤ７３抗体を、第二剤、例えば、免疫腫瘍学的薬剤投与の前に逐次的に投与する。ある面において、抗ＣＤ７３抗体を、第二剤、例えば、免疫腫瘍学的薬剤と同時に投与する。さらにある面において、抗ＣＤ７３抗体を、第二剤の投与の後に逐次的に投与する。２剤の投与は、例えば、３０分、６０分、９０分、１２０分、３時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日、５日、７日または１週間以上離れて開始してよくまたは第二剤の投与は、第一剤が投与された後、例えば、３０分、６０分、９０分、１２０分、３時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日、５日、７日または１週間以上後に開始してよい。

【0529】

ある面において、抗ＣＤ７３抗体および第二剤、例えば、免疫腫瘍学的薬剤を同時に投与し、例えば、患者に、例えば、３０分または６０分かけて同時に点滴する。抗ＣＤ７３抗体を、第二剤、例えば、免疫腫瘍学的薬剤と共製剤し得る。

【0530】

所望により、唯一の免疫治療剤としての抗ＣＤ７３または抗ＣＤ７３抗体と１以上のさらなる免疫治療抗体(例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３遮断)の組み合わせを、さらに癌性細胞、精製腫瘍抗原(組み換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む)、細胞および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子を遺伝子導入された細胞のような免疫原性剤と組み合わせ得る(He et al., (2004) J. Immunol. 173:4919-2８)。使用できる腫瘍ワクチンの非限定的例は、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチドのような黒色腫抗原のペプチドまたはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するように遺伝子導入された腫瘍細胞(下にさらに記載)を含む。組み合わせたＣＤ７３阻害および１以上のさらなる抗体(例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断)を、さらに標準癌処置と組み合わせてもよい。例えば、組み合わせたＣＤ７３阻害および１以上のさらなる抗体(例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断)を、化学療法レジメと効率的に組み合わせ得る。これらの例において、本開示の組み合わせと投与する他の化学療法剤の用量を低減することが可能である(Mokyr et al., (1998) Cancer Research 58: 5301-5304)。このような組み合わせの例は、抗ＣＤ７３アンタゴニスト抗体と、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体のようなさらなる抗体を伴うかまたは伴わず、さらに黒色腫の処置のためのダカルバジンとの組み合わせを含む組み合わせである。他の例は、黒色腫の処置のための、抗ＣＤ７３抗体と、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはＬＡＧ−３抗体を伴うかまたは伴わず、さらにインターロイキン−２(ＩＬ−２)との組み合わせである。ＣＤ７３阻害およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断と化学療法の組み合わせ使用が依拠する科学的根拠は、大部分の化学療法化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原レベルを増加させることにある。細胞死によりＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断を伴いまたは伴わない組み合わせＣＤ７３阻害との相乗性をもたらし得る他の組み合わせ治療は、放射線、手術またはホルモン遮断を含む。これらのプロトコールの各々は、宿主における腫瘍抗原の源を創出する。血管形成阻害剤も、組み合わせＣＤ７３阻害およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断と組み合わせ得る。血管形成の阻害、腫瘍細胞死をもたらし、これが宿主抗原提示経路に腫瘍抗原を供給し得る。

【0531】

唯一の免疫治療剤としての抗ＣＤ７３アンタゴニスト抗体またはＣＤ７３アンタゴニストおよびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断抗体の組み合わせをまたＦｃαまたはＦｃγ受容体発現エフェクター細胞を腫瘍細胞に標的化させる二特異性抗体とも組み合わせても使用し得る(例えば、米国特許５,９２２,８４５および５,８３７,２４３参照)。二特異性抗体を、２個の別々の抗原を標的化するために使用できる。これらの応答のＴ細胞アームは、組み合わせＣＤ７３阻害およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断の使用により増強され得る。

【0532】

他の例において、唯一の免疫治療剤としての抗ＣＤ７３アンタゴニスト抗体または抗ＣＤ７３抗体およびさらなる免疫刺激剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはＬＡＧ−３剤、例えば、抗体の組み合わせを、リツキサン(登録商標)(リツキシマブ)、ハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)、ベキサール(登録商標)(トシツモマブ)、ゼヴァリン(登録商標)(イブリツモマブ)、キャンパス(登録商標)(アレムツズマブ)、Lymphocide(登録商標)(エプラツズマブ)、アバスチン(登録商標)(ベバシズマブ)およびタルセバ(登録商標)(エルロチニブ)などのような抗新生物抗体と組み合わせて使用できる。例として、理論に縛られることを望まないが、抗癌抗体または毒素にコンジュゲートした抗癌抗体での処置は癌細胞死(例えば、腫瘍細胞)を起こすことができ、これが、免疫刺激剤、例えば、ＣＤ７３、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＬＡＧ−３剤、例えば、抗体が介在する免疫応答を増強する。例示的態様において、過増殖性疾患(例えば、癌腫瘍)の処置は、同時または逐次的または任意のこれらの組み合わせでの、抗癌剤、例えば、抗体と抗ＣＤ７３および所望により付加的免疫刺激剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３剤、例えば、抗体の組み合わせを含んでよく、これは、宿主による抗腫瘍免疫応答を増強する。

【0533】

腫瘍は、多種多様な機構により宿主免疫監視を逃れる。これらの機構の多くが、腫瘍により発現され、免疫抑制性であるタンパク質の不活性化により克服され得る。これらは、とりわけＴＧＦ−β(Kehrl et al., (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050)、ＩＬ−１０(Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200)およびＦａｓリガンド(Hahne et al., (1996) Science 274: 1363-1365)を含む。これらの各々に対する抗体を、さらに抗体のような付加的免疫刺激剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３剤を伴いまたは伴わずに、抗ＣＤ７３抗体と組み合わせて使用して、免疫抑制剤の作用を逆転し、宿主による腫瘍免疫応答を支持し得る。

【0534】

宿主免疫応答性を活性可できる他の薬剤、例えば、抗体を、さらに抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体のような付加的免疫刺激剤を伴いまたは伴わずに、抗ＣＤ７３抗体と組み合わせて使用できる。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体(Ridge et al., supra)を、抗ＣＤ７３抗体および所望により付加的免疫刺激剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３剤、例えば、抗体と共に使用できる。Ｔ細胞共刺激性分子に対する他の活性化抗体(Weinberg et al., supra, Melero et al., supra, Hutloff et al., supra)も、Ｔ細胞活性化のレベルを高めるために提供し得る。

【0535】

上記のように、骨髄移植が、造血起源の多様な腫瘍の処置に現在使用されている。抗ＣＤ７３免疫療法単独またはＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断との組み合わせを、ドナーに移植した腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を高めるために使用できる。

【0536】

いくつかの実験的処置プロトコールは、腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞のために、エクスビボ活性化および抗原特異的Ｔ細胞の拡張およびこれらの細胞のレシピエントへの養子移入を含む(Greenberg & Riddell, supra)。これらの方法はまた、ＣＭＶのような感染因子に対するＴ細胞応答の活性化にも使用できる。付加的免疫刺激療法、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体を伴うまたは伴わない抗ＣＤ７３存在下のエクスビボ活性化は、養子移入Ｔ細胞の頻度および活性を増加することが期待され得る。

【0537】

ここに提供されるのは、対象に、抗ＣＤ７３抗体を治療量以下の抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３剤、例えば、抗体を伴いまたは伴わずに投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)の免疫刺激剤での処置に関連する有害事象を変える方法である。例えば、ここに記載する方法は、患者への非吸収性ステロイドの投与による、免疫刺激性治療抗体誘発大腸炎または下痢の事象を低減する方法を提供する。ここで使用する“非吸収性ステロイド”は、肝臓での代謝後のバイオアベイラビリティが低いステロイド、すなわち、約２０％未満であるような、強い初回通過代謝を示すグルココルチコイドである。ここに記載するある態様において、非吸収性ステロイドはブデソニドである。ブデソニドは、局所作用性グルココルチコステロイドであり、これは、経口投与後、主に肝臓で強く代謝される。エントコートＥＣ(登録商標)(Astra-Zeneca)は、回腸へのおよび結腸中の薬物送達を最適化するために開発された、ブデソニドのｐＨおよび時間依存的経口製剤である。エントコートＥＣ(登録商標)は、回腸および／または上行結腸が関与する軽度〜中程度クローン病の処置に米国で承認されている。クローン病処置のためのエントコートＥＣ(登録商標)の通常の経口用量は６〜９mg／日である。エントコートＥＣ(登録商標)は、吸収される前に腸で放出され、腸粘膜に保持される。腸粘膜標的組織を通過すると、エントコートＥＣ(登録商標)は肝臓のシトクロムＰ４５０システムで広く代謝されて、無視できるグルココルチコイド活性を有する代謝物となる。それゆえに、バイオアベイラビリティは低い(約１０％)。ブデソニドの低バイオアベイラビリティは、初回通過代謝があまり強くない他のグルココルチコイドと比較して、治療比を改善させる。ブデソニドは、全身作用性コルチコステロイドより、低視床下部視床下部−下垂体抑制を含む、有害作用が少ない。しかしながら、エントコートＥＣ(登録商標)の慢性投与は、副腎皮質機能亢進および副腎抑制のような全身性グルココルチコイド効果をもたらし得る。PDR 58^th ed. 2004; 608-610参照。

【0538】

なおさらなる態様において、非吸収性ステロイドと組み合わせた、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断(すなわち、免疫刺激性治療抗体抗ＣＤ７３および所望により抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体)を伴うまたは伴わないＣＤ７３阻害を、サリチレートとさらに組み合わせ得る。サリチレートは、例えば：スルファサラジン(アザルフィジン(登録商標)、Pharmacia & UpJohn)；オルサラジン(DIPENTUM(登録商標)、Pharmacia & UpJohn)；バルサラジド(COLAZAL(登録商標)、Salix Pharmaceuticals, Inc.)；およびメサラミン(アサコール(登録商標)、Procter & Gamble Pharmaceuticals；ペンタサ(登録商標)、Shire US；CANASA(登録商標)、Axcan Scandipharm, Inc.；ROWASA(登録商標)、Solvay)のような５−ＡＳＡ剤を含む。

【0539】

ここに記載する方法によって、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３抗体および非吸収性ステロイドを伴うまたは伴わない抗ＣＤ７３と組み合わせて投与されるサリチレートは、免疫刺激性抗体により誘発される大腸炎の発生を減少させる目的で、サリチレートおよび非吸収性ステロイドのあらゆる重複または逐次投与を含み得る。それゆえに、サリチレートおよび非吸収性ステロイドを同時にまたは逐次的に(例えば、サリチレートを非吸収性ステロイドの６時間後に投与する)または任意のこれらの組み合わせで投与することを包含する、例えば、ここに記載する免疫刺激性抗体により誘発される大腸炎の発生を減少させる方法に関する。さらに、サリチレートおよび非吸収性ステロイドを、同一の経路(例えば、両者とも経口投与)または異なる経路(例えば、サリチレートを経口投与および非吸収性ステロイドを直腸内投与)で投与してよく、これは、抗ＣＤ７３および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体の投与に使用する経路と異なってよい。

【0540】

ここに記載する抗ＣＤ７３抗体および組み合わせ抗体治療を、処置する適応症(例えば、癌)に対する特定の有用性について選択される他の周知治療と組み合わせても使用できる。ここに記載する抗ＣＤ７３抗体の組み合わせを、既知の薬学的に許容される薬剤と逐次的に使用できる。

【0541】

例えば、ここに記載する抗ＣＤ７３抗体および組み合わせ抗体治療を、照射、化学療法(例えば、カンプトテシン(ＣＰＴ−１１)、５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)、シスプラチン、ドキソルビシン、イリノテカン、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン−パクリタキセル(タキソール)、ドキソルビシン、５−ｆｕまたはカンプトテシン＋ａｐｏ２ｌ／ＴＲＡＩＬ(６Ｘコンボ)を使用)、１以上のプロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブまたはＭＧ１３２)、１以上のＢｃｌ−２阻害剤(例えば、ＢＨ３Ｉ−２’(ｂｃｌ−ｘｌ阻害剤)、インドールアミンジオキシゲナーゼ−１(ＩＤＯ１)阻害剤(例えば、ＩＮＣＢ２４３６０)、ＡＴ−１０１(Ｒ−(−)−ゴシポール誘導体)、ＡＢＴ−２６３(小分子)、ＧＸ−１５−０７０(オバトクラックス)またはＭＣＬ−１(骨髄白血病細胞分化タンパク質−１)アンタゴニスト)、ｉＡＰ(アポトーシスタンパク質阻害因子)アンタゴニスト(例えば、ｓｍａｃ７、ｓｍａｃ４、小分子ｓｍａｃ模倣剤、合成ｓｍａｃペプチド(Fulda et al., Nat Med 2002;8:808-15参照)、ＩＳＩＳ２３７２２(ＬＹ２１８１３０８)またはＡＥＧ−３５１５６(ＧＥＭ−６４０))、ＨＤＡＣ(ヒストンデアセチラーゼ)阻害剤、抗ＣＤ２０抗体(例えば、リツキシマブ)、血管形成阻害剤(例えば、ベバシズマブ)、抗血管形成因子ターゲティングＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ(例えば、アバスチン)、合成トリテルペノイド(Hyer et al., Cancer Research 2005;65:4799-808参照)、ｃ−ＦＬＩＰ(細胞ＦＬＩＣＥ−阻害性タンパク質)モジュレーター(例えば、ＰＰＡＲγ(ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ)の天然および合成リガンド、５８０９３５４または５５６９１００)、キナーゼ阻害剤(例えば、ソラフェニブ)、トラスツズマブ、セツキシマブ、テムシロリムス、ラパマイシンおよびテムシロリムスのようなｍＴＯＲ阻害剤、ボルテゾミブ、ＪＡＫ２阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ阻害剤、レナリドミド、ＧＳＫ３β阻害剤、ＩＡＰ阻害剤および／または遺伝毒性薬物のような付加的処置と組み合わせて(例えば、同時にまたは別々に)使用できる。

【0542】

ここに記載する抗ＣＤ７３抗体および組み合わせ抗体治療を、さらに１以上の抗増殖性細胞毒性薬剤と組み合わせて使用できる。抗増殖性細胞毒性薬剤として使用し得る化合群は、次のものを含むが、これらに限定されない：
アルキル化剤(窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア類およびトリアゼンを含むが、これらに限定されない)：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド(シトキサン^ＴＭ)、フォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホｒアミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジンおよびテモゾロミド。
代謝拮抗剤(葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含むが、これらに限定されない)：メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビンホスフェート、ペントスタチンおよびゲムシタビン。

【0543】

アンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体との組み合わせに適当な抗増殖性薬剤は、タキサン類、パクリタキセル(パクリタキセルはタキソール^ＴＭとして市販)、ドセタキセル、ディスコデルモライド(ＤＤＭ)、ジクチオスタチン(ＤＣＴ)、ペロルシドＡ、エポチロン類、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、エポチロンＥ、エポチロンＦ、フラノエポチロンＤ、デスオキシエポチロンＢｌ、[１７]−デヒドロデスオキシエポチロンＢ、[１８]デヒドロデスオキシエポチロンＢ、Ｃ１２,１３−シクロプロピル−エポチロンＡ、Ｃ６−Ｃ８架橋エポチロンＡ、ｔｒａｎｓ−９,１０−デヒドロエポチロンＤ、ｃｉｓ−９,１０−デヒドロエポチロンＤ、１６−デスメチルエポチロンＢ、エポチロンＢ１０、ディスコデルモライド、パツピロン(ＥＰＯ−９０６)、ＫＯＳ−８６２、ＫＯＳ−１５８４、ＺＫ−ＥＰＯ、ＡＢＪ−７８９、ＸＡＡ２９６Ａ(ディスコデルモライド)、ＴＺＴ−１０２７(ソブリドチン)、ＩＬＸ−６５１(塩酸タシドチン)、ハリコンドリンＢ、メシル酸エリブリン(Ｅ−７３８９)、ヘミアステリン(ＨＴＩ−２８６)、Ｅ−７９７４、クリプトフィシン、ＬＹ−３５５７０３、マイタンシノイド免疫複合体(ＤＭ−１)、ＭＫＣ−１、ＡＢＴ−７５１、Ｔ１−３８０６７、Ｔ−９００６０７、ＳＢ−７１５９９２(イスピネシブ)、ＳＢ−７４３９２１、ＭＫ−０７３１、ＳＴＡ−５３１２、エリュテロビン、１７ベータ−アセトキシ−２−エトキシ−６−オキソ−Ｂ−ホモ−エストラ−１,３,５(１０)−トリエン−３−オール、シクロストレプチン、イソラウリマライド、ラウリマライド、４−エピ−７−デヒドロキシ−１４,１６−ジデメチル−(＋)−ディスコデルモライドおよびクリプトチロン１と、さらに当分野で知られる他の微小管安定化剤であり、これらに限定されない。

【0544】

ここに記載する抗ＣＤ７３抗体の処置と組み合わせてまたはその前に異常に増殖性の細胞を静止状態にすることが望ましいとき、１７ａ−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、メチルプレドニゾロン、メチル−テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、リュープロリド、フルタミド、トレミフェン、ゾラデックス^ＴＭのようなホルモンおよびステロイド(合成アナログを含む)も患者に投与し得る。ここに記載する方法または組成物を使用するとき、抗模倣藥(antimimetics)のような臨床現場で腫瘍増殖または転移の制御に使用される他の薬剤も、所望により投与してよい。

【0545】

化学療法剤の安全かつ有効な投与の方法は当業者に知られる。さらに、その投与は、標準的文献に記載されている。例えば、化学療法剤の多くの投与は、Physicians' Desk Reference(PDR)、例えば、１９９６年版(Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, USA)に記載され、その開示を引用により本明細書に包含させる。

【0546】

化学療法剤および／または放射線治療を、当分野で周知の治療プロトコールにより適用できる。化学療法剤および／または放射線治療の適用が、処置する疾患および該疾患に対する化学療法剤および／または放射線治療の既知効果により変わり得ることは当業者には明らかである。また、熟練した臨床医の知識により、治療プロトコール(例えば、投与用量および投与回数)は、患者における投与治療剤で観察される効果の観点および投与治療剤に対する疾患の観察される応答の観点により変わり得る。

【0547】

例示的態様
１. ヒト表面抗原分類７３(ＣＤ７３)に結合し、次の性質の１以上を示す、単離ヒト抗体またはその抗原結合部分：
(ａ)ＣＤ７３酵素活性阻害；
(ｂ)腫瘍細胞への内在化または
(ｃ)ヒトＣＤ７３のアミノ酸６５〜８３および１５７〜１７２を含む立体構造エピトープに結合。

【0548】

２. 抗体が、パルス・チェイスで測定して、腫瘍細胞に１０分を超えないＴ_１／２で内在化する、態様１に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0549】

３. 抗体が、BIACORE^{(登録商標)}SPR分析により測定して、約０.１〜１０nM以下のＫ_Ｄで可溶性ヒトＣＤ７３に結合する、態様１または２に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0550】

４. 抗体が、ＦＡＣＳで測定して、０.１〜１０nM以下のＥＣ_５０でヒトＣＤ７３に結合する、前記の態様のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0551】

５. 抗体が、ＦＡＣＳで測定して、０.１〜１０nM以下のＥＣ_５０でカニクイザルＣＤ７３に結合する、前記の態様のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0552】

６. 抗体がヒトＣＤ７３(配列番号１)上のアミノ酸残基FTKVQQIRRAEPNVLLLDA(配列番号９６)および／またはLYLPYKVLPVGDEVVG(配列番号９７)を含むエピトープに結合する、前記の態様のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0553】

７. エピトープがアミノ酸残基FTKVQQIRRAEPNVLLLDA(配列番号９６)および／またはLYLPYKVLPVGDEVVG(配列番号９７)に及ぶまたは重複する、態様６に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0554】

８. 抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそのバリアントからなる群から選択される、前記の態様のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0555】

９. ヒトＣＤ７３に結合し、それぞれ次のものからなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域対である３重鎖可変領域ＣＤＲおよび３軽鎖可変領域ＣＤＲを含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(ａ)配列番号４と８
(ｂ)配列番号４と１２；
(ｃ)配列番号１６と２０；
(ｄ)配列番号１６と２４；
(ｅ)配列番号１６と２８；
(ｆ)配列番号３２と３６；
(ｇ)配列番号４０と４４；
(ｈ)配列番号４０と４８；
(ｉ)配列番号５２と５６；
(ｊ)配列番号６０と６４；
(ｋ)配列番号６８と７２；
(ｌ)配列番号６８と７６；
(ｍ)配列番号８０と８４；
(ｎ)配列番号８８と９２；
(ｏ)配列番号１３５と８；および
(ｐ)配列番号１３５と１２。

【0556】

１０. 次のものを含む、ヒトＣＤ７３に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(ａ)それぞれ配列番号５、６および７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号９、１０および１１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｂ)それぞれ配列番号５、６および７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号１３、１４および１５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｃ)それぞれ配列番号１７、１８および１９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号２１、２２および２３を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｄ)それぞれ配列番号１７、１８および１９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号２５、２６および２７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｅ)それぞれ配列番号１７、１８および１９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号２９、３０および３１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｆ)それぞれ配列番号３３、３４および３５を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号３７、３８および３９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｇ)それぞれ配列番号４１、４２および４３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号４５、４６および４７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｈ)それぞれ配列番号４１、４２および４３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号４９、５０および５１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｉ)それぞれ配列番号５３、５４および５５を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号５７、５８および５９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｊ)それぞれ配列番号６１、６２および６３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６５、６６および６７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｋ)それぞれ配列番号６９、７０および７１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号７３、７４および７５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｌ)それぞれ配列番号６９、７０および７１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号７７、７８および７９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｍ)それぞれ配列番号８１、８２および８３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号８５、８６および８７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；または
(ｎ)それぞれ配列番号８９、９０および９１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号９３、９４および９５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列。

【0557】

１１. 抗体がそれぞれ配列番号５、６および７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号９、１０および１１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、態様１０に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0558】

１２. 抗体がそれぞれ配列番号５、６および７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号１３、１４および１５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、態様１１に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0559】

１３. ヒトＣＤ７３と結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域が配列番号４、１６、３２、４０、５２、６０、６８、８０、８８および１３５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。

【0560】

１４. ヒトＣＤ７３と結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域が配列番号８、１２、２０、２４、２８、３６、４４、４８、５６、６４、７２、７６、８４および９２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。

【0561】

１５. ヒトＣＤ７３に結合し、次のものからなる群からそれぞれ選択される重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８５％同一である重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(ａ)配列番号４と８
(ｂ)配列番号４と１２；
(ｃ)配列番号１６と２０；
(ｄ)配列番号１６と２４；
(ｅ)配列番号１６と２８；
(ｆ)配列番号３２と３６；
(ｇ)配列番号４０と４４；
(ｈ)配列番号４０と４８；
(ｉ)配列番号５２と５６；
(ｊ)配列番号６０と６４；
(ｋ)配列番号６８と７２；
(ｌ)配列番号６８と７６；
(ｍ)配列番号８０と８４；
(ｎ)配列番号８８と９２；
(ｏ)配列番号１３５と８；および
(ｐ)配列番号１３５と１２。

【0562】

１６. 重鎖および軽鎖可変領域がそれぞれ(ａ)〜(ｐ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、態様１５に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0563】

１７. 重鎖および軽鎖可変領域がそれぞれ(ａ)〜(ｐ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、態様１６に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0564】

１８. 重鎖および軽鎖可変領域がそれぞれ(ａ)〜(ｐ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域を含む、態様１７に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0565】

１９. 配列番号１３５に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号８に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、態様１８に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0566】

２０. 配列番号１３５に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、態様１８に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0567】

２１. 態様１〜２０のいずれかの抗体とＣＤ７３上の同一エピトープに結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。

【0568】

２２. 次の性質のいずれか一つを示す、態様９〜２１のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分：
(１)可溶性ヒトＣＤ７３に、例えば、BIACORE^{(登録商標)}SPR分析で測定して、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＫ_Ｄで結合；
(２)膜結合型ヒトＣＤ７３に、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＥＣ_５０で結合；
(３)カニクイザルＣＤ７３に結合、例えば、膜結合型カニクイザルＣＤ７３に、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＥＣ_５０で結合；
(４)ヒトＣＤ７３酵素活性を、例えば、１０nM以下のＥＣ_５０で阻害；
(５)ｃｙｎｏ ＣＤ７３酵素活性を、例えば、１０nM以下のＥＣ_５０で阻害；
(６)インビボでヒトＣＤ７３酵素活性の阻害；
多価架橋を必要とすることなくＴ細胞活性化誘発または増強；
(７)例えば、１０分未満のＴ_１／２で細胞に内在化；
(８)ヒトＣＤ７３の立体エピトープ、例えば、アミノ酸残基FTKVQQIRRAEPNVLLLDA(配列番号９６)および／またはLYLPYKVLPVGDEVVG(配列番号９７)を含むアミノ酸配列(配列番号１)内の不連続エピトープに結合；
(９)非グリコシル化ヒトＣＤ７３ではなく、グリコシル化ヒトＣＤ７３に結合；および
(１０)ヒトＣＤ７３への結合について、ＣＤ７３.４−１、ＣＤ７３.４−２、ＣＤ７３.３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１といずれかの方向でまたは両方向で競合。

【0569】

２３. ＣＤ７３に結合し、次のものからなる群から選択される重鎖および軽鎖配列のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(ａ)それぞれ配列番号１００と１０１；
(ｂ)それぞれ配列番号１００と１０２；
(ｃ)それぞれ配列番号１０３と１０４；
(ｄ)それぞれ配列番号１０３と１０５；
(ｅ)それぞれ配列番号１０３と１０６；
(ｆ)それぞれ配列番号１０７と１０８；
(ｇ)それぞれ配列番号１０９と１１０；
(ｈ)それぞれ配列番号１０９と１１１；
(ｉ)それぞれ配列番号１１２と１１３；
(ｊ)それぞれ配列番号１１４と１１５；
(ｋ)それぞれ配列番号１１６と１１７；
(ｌ)それぞれ配列番号１１６と１１８；
(ｍ)それぞれ配列番号１１９と１２０；
(ｎ)それぞれ配列番号１２１と１２２；
(ｏ)それぞれ配列番号１３３と１０１；および
(ｐ)それぞれ配列番号１３３と１０２。

【0570】

２４. 重鎖および軽鎖が(ａ)〜(ｐ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖を含む、態様２３に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0571】

２５. 抗体が配列番号１３５に示すアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号１０１に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、態様２４に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0572】

２６. 抗体が配列番号１３５に示すアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号１０２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、態様２４に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0573】

２７. 次の性質のいずれか一つを示す、態様２３〜２６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分：
(ａ)ＣＤ７３酵素活性阻害；
(ｂ)腫瘍細胞への内在化または
(ｃ)ヒトＣＤ７３のアミノ酸６５〜８３および１５７〜１７２を含む立体構造エピトープに結合。

【0574】

２８. カニクイザルＣＤ７３に結合する、前記の態様のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0575】

２９. エフェクターレスＦｃを含む、態様１０〜２２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0576】

３０. 抗体がＮからＣ末端方向の順にヒトＣＨ１ドメイン、ヒトヒンジドメイン、ヒトＣＨ２ドメインおよびヒトＣＨ３ドメインを含む修飾重鎖定常領域を含む、態様１〜７および９〜２２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0577】

３１. 修飾定常領域がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなるアイソタイプ群から選択される異なるアイソタイプの少なくとも２ドメインを含む、態様３０に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0578】

３２. 修飾定常領域がヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを含み、ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジドメインの少なくとも一つがＩｇＧ２アイソタイプではない、態様３０または３１に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0579】

３３. ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインがアミノ酸配列ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV(配列番号１２４)を含む、態様３２に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0580】

３４. 修飾定常領域がシステイン結合における異種性を低減したヒトＩｇＧ２ヒンジドメインを含む、態様３０〜３３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0581】

３５. ヒンジドメインが野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジドメイン(配列番号１３６)に対してアミノ酸置換Ｃ２１９を含む、態様３４に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0582】

３６. ヒンジドメインがアミノ酸配列ERKSCVECPPCPAPPVAG(配列番号１２３)を含む、態様３５に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0583】

３７. 修飾定常領域がエフェクター機能を低減または排除したヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインを含む、態様３０〜３６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0584】

３８. ＣＨ２ドメインが野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン(配列番号１３７)に対してアミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む、態様３７に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0585】

３９. ＣＨ２ドメインがアミノ酸配列APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAK(配列番号１２５)を含む、態様３８に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0586】

４０. 修飾定常領域がヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含む、態様３０〜３９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0587】

４１. ＣＨ３ドメインがアミノ酸配列GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号１２８)を含む、態様４０に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0588】

４２. ヒトまたはヒト化抗体である、態様９〜２９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0589】

４３. ＣＤＲ領域におけるメチオニン残基が酸化を受けないアミノ酸残基に置き換えられている、態様１〜８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。

【0590】

４４. 第二の結合特異性を有する分子に連結した前記の態様のいずれかの抗体を含む、二重特異性分子。

【0591】

４５. 異なる薬剤に連結した態様１〜４３のいずれかの抗体を含む、免疫複合体。

【0592】

４６. 態様１〜４３のいずれかの重鎖および／または軽鎖抗体の可変領域またはその抗原結合部分をコードする、単離核酸分子。

【0593】

４７. 態様４６の核酸分子を含む、発現ベクター。

【0594】

４８. 態様４７の発現ベクターで形質転換した、細胞。

【0595】

４９. 態様１〜４５のいずれかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子または免疫複合体および担体を含む、組成物。

【0596】

５０. 態様１〜４５のいずれかの抗体またはその抗原結合部分または二重特異性分子または免疫複合体および使用指示を含む、キット。

【0597】

５１. 態様４８の細胞で抗体またはその抗原結合部分を発現させ、該細胞から抗体またはその抗原結合部分を単離することを含む、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分を製造する方法。

【0598】

５２. 細胞と態様１〜４５のいずれかの抗体、その抗原結合部分、二重特異性分子または免疫複合体を、アデノシンレベルが低減するように接触させることを含む、ＣＤ７３を発現する腫瘍細胞におけるアデノシンレベルを低減する方法。

【0599】

５３. 態様１〜４５のいずれかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子または免疫複合体の有効量を、Ｔ細胞応答が腫瘍細胞に対して刺激されるように投与することを含む、処置を必要とする対象における、ＣＤ７３を発現する腫瘍細胞に対してＴ細胞応答を刺激する方法。

【0600】

５４. 態様１〜４５のいずれかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子または免疫複合体を、対象における免疫応答が刺激されるように、対象に投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法。

【0601】

５５. 対象がＣＤ７３を発現する腫瘍細胞を有し、腫瘍に対する免疫応答細胞が刺激される、態様５４に記載の方法。

【0602】

５６. 態様１〜４５のいずれかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子または免疫複合体を、対象における腫瘍の増殖が阻害されるように、対象に投与することを含む、対象におけるＣＤ７３を発現する腫瘍細胞の増殖を阻止する方法。

【0603】

５７. 態様１〜４５のいずれかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子または免疫複合体の治療有効量を、癌を処置するために処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法。

【0604】

５８. 癌が膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、消化器癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、胚細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫およびウイルス関連癌からなる群から選択される、態様５７に記載の方法。

【0605】

５９. 癌が転移癌、難治性癌または再発性癌である、態様５７または５８に記載の方法。

【0606】

６０. １以上のさらなる治療剤を投与することをさらに含む、態様５３〜５９のいずれかに記載の方法。

【0607】

６１. さらなる治療剤が免疫増強分子(例えば、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＬＡＧ−３アンタゴニスト)、抗ＣＤ３９抗体または抗Ａ２ＡＲ抗体である、態様６０に記載の方法。

【0608】

６２. サンプルと態様１〜４５のいずれかの抗体またはその抗原結合部分を、抗体またはその抗原結合部分とＣＤ７３の間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させ、複合体の形成を検出することを含む、サンプルにおけるヒトＣＤ７３の存在を検出する方法。

【0609】

本発明を、さらなる限定として解釈してはならない、次の実施例によりさらに説明する。本明細書において引用している全ての図および全ての引用文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および公開特許出願は、引用により明示的に本明細書に包含させる。特に、ＰＣＴ公開ＷＯ０９／０４５９５７、ＷＯ０９／０７３５３３、ＷＯ０９／０７３５４６、ＷＯ０９／０５４８６３およびＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７２９１８および米国特許公報２０１１／０１５０８９２の開示を、明示的に引用により本明細書に包含させる。

【実施例】

【0610】

実施例１：ヒト抗ＣＤ７３抗体の産生
ヒト抗ヒトＣＤ７３モノクローナル抗体を、ＨμMＡｂ(登録商標)トランスジェニックマウス(“ＨμMＡｂ”は、Medarex, Inc., Princeton, New Jerseyの商標である)のＨｃｏ７、Ｈｃｏ２７、Ｈｃｏ２０、Ｈｃｏ１２、Ｈｃｏ１７およびＨｃ２系統ならびにＫＭマウス(ＫＭマウス^{(登録商標)}系統は、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に記載のようにＳＣ２０導入染色体を含む)において産生した。ＨＣ２／ＫＣｏ２７ ＨμMＡｂマウスおよびＫＭマウスを米国特許５,７７０,４２９および５,５４５,８０６に記載のように産生し、それらの開示全体を、引用により本明細書に包含させる。
種々の遺伝子型のトランスジェニックマウス(例えばＫＭ、Ｈｃｏ７、Ｈｃｏ２７、Ｈｃｏ２０、Ｈｃｏ１２、Ｈｃｏ１７およびＨｃ２)を含むマウスを、種々の免疫化戦略(種々の抗原、種々の用量、期間、投与経路(足蹠(ｆｐ)、腹腔内(ｉｐ)および皮下(ｓｃ)およびアジュバント(ＣＦＡ／ＩＦＡ、Ｒｉｂｉおよび抗体)など)で免疫化した。マウスからの融合を実施し、スクリーニングし、抗体をこれらの融合体から同定した。さらに特徴付けにより、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４−１、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６−１、２４Ｈ２−１、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１−１および７Ａ１１−１と命名した抗体を含む、特に興味深い抗体の単離に至った。表７(下記)は、各抗体についての重鎖のＩｇＧアイソタイプおよびアロタイプならびに軽鎖のタイプを提供する。軽鎖のみ異なる抗体は、ダッシュ記号の後の数字を変えることにより表す。例えば、１１Ｆ１１−１は、１１Ｆ１１−２と同一重鎖を有するが、１１Ｆ１１−１は軽鎖ＶＫ１を有し、一方１１Ｆ１１−２は軽鎖ＶＫ２を有する。特に断らない限り、表における抗体のＶ_Ｈ領域に基づく組み換え抗体を、優勢な軽鎖と共に製造した。

【0611】

【表6】

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各抗体の重鎖および軽鎖、Ｖ_ＨおよびＶ_ＬドメインおよびＣＤＲの完全長配列のアミノ酸およびヌクレオチド配列は配列表および表３５に提供する。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌアミノ酸配列を、図１Ａ〜１７Ｂにも示し、多様な抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌアミノ酸配列のアライメントを図３５に提供する(ＣＤＲ配列は太字)。

【0612】

実施例２：可変領域およびアイソタイプ差異におけるアミノ酸置換
抗体１１Ｆ１１のＶ_Ｈ領域のフレームワーク領域を、次のアミノ酸残基の変異の１以上の導入により変異させた(周辺のアミノ酸を示し、変異アミノ酸には下線を引く)：Ｔ２５(フレームワーク変異；… RLSCATSGFTF…)、Ｌ５２(ＣＤＲ２変異；…WVAVILYDGSN…)、Ｇ５４(ＣＤＲ２変異；…VILYDGSNKYY…)およびＶ９４(フレームワーク変異；…AEDTAVYYCAR…)。構築物の名称およびそれらの各々の置換を表８に示す。

【表7】

[この文献は図面を表示できません]

＊ ＣＤ７３.１１は４Ｄ４であり、これらのアミノ酸残基を単離時に含んだ。比較目的でこの表に挙げる。

【0613】

抗体１１Ｆ１１および４Ｄ４の定常領域も、Ｃ２１９Ｓ置換を有するＩｇＧ２定常領域(ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３)(“ＩｇＧ２ＣＳ”；配列番号２６７)、置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを有するエフェクターレスＩｇＧ１定常領域(“ＩｇＧ１.１ｆ”；配列番号２６８)またはＩｇＧ２からのＣＨ１およびヒンジ(Ｃ２１９Ｓを有する)ならびにＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３(Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓを有する)を含むエフェクターレスＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッド定常領域(“ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆ”または“ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆ”；配列番号１６９)にスイッチングすることにより、修飾した。製造した構築物を表９に挙げる。

【表8】

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ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ ＩｇＧ１.１ｆのアミノ酸配列は図１８(配列番号１８９)に示す。

【0614】

抗体ＣＤ７３.３〜ＣＤ７３.１１を次のように製造した。軽鎖ＶＫ２(配列番号１０２)を、１１Ｆ１１由来抗体のために使用した(ＣＤ７３.４、ＣＤ７３.６、ＣＤ７３.８およびＣＤ７３.１０)。重鎖および軽鎖をＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞で発現させ、培養培地をトランスフェクション５日後に採取した。
構築物のヒトＦｃγＲへの結合をＳＰＲで測定した。ＩｇＧ１.１分子およびＩｇＧ２分子のｈＣＤ６４およびｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１結合データは、異なるＦｃについて予測した値に一致した。ＩｇＧ１.１ｆは、最も不活性なＦｃである。ＩｇＧ２およびＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓは、ＩｇＧ２に典型的ＦｃＲ結合を示した。予想通り、ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−Ｇ１.１ｆのデータは、野生型ＩｇＧ１またはＩｇＧ２より結合が有意に弱いが、ＩｇＧ１.１ｆと比較して結合が増加していることを示した。ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−Ｇ１.１ｆは弱いｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１結合(２.３μMのＫ_Ｄ)を有し、他の全ＦｃγＲに対する結合親和性は５μMより低かった。ｃｙｎｏ ＦｃγＲに対するＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−Ｇ１.１ｆの結合親和性は、５μMより低かった。ヒトＦｃＲｎに対するＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−Ｇ１.１ｆ結合のＳＰＲ分析は、ｐＨ依存性結合を示した(ｐＨ６で強く、ｐＨ７.４で急速な解離を伴い弱い結合)。
組み換え調製物は、しばしば重鎖のＣ末端Ｌｙｓ欠失が判明した。例えば、Ａｂ ＣＤ７３.４.ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−Ｇ１.１ｆの重鎖の９７％がＣ末端リシンを欠失した。ある調製物は、重鎖のＮ末端Ｑ(グルタミン)にピロ−Ｑを有した。例えば、Ａｂ ＣＤ７３.４.ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−Ｇ１.１ｆの重鎖のＮ末端グルタミンの９４％はピロ−Ｑであった。

【0615】

実施例３：抗ＣＤ７３抗体の結合特徴
Ａ. 表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)
ＣＤ７３結合動態および親和性を、Biacore T100装置(GE Healthcare)を２５℃で使用する表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)により試験した。
ｈＣＤ７３のＮ末端ドメイン(ヒトＣＤ７３の残基２６〜３３６からなる；Ｎ−ｈＣＤ７３と呼ぶ)の抗体への結合を試験した一つの実験形式は、固定化プロテインＡ表面への捕捉であった。これらの実験のために、プロテインＡ(Pierce)を、０.０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、３mM ＥＤＴＡ、０.００５％ｖ／ｖ ｔｗｅｅｎ ２０のランニング緩衝液中、エタノールアミン遮断を用いて、標準エチル(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(ＥＤＣ)／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)化学を使用するＣＭ５センサーチップ(GE Healthcare)のフローセル１〜４上に３０００〜４０００RUの密度で固定化した。動態実験を、まず、１０μl／分で３０秒接触時間を使用して、抗体(５〜１０μg／ml)をプロテインＡ表面に捕捉させ、６００nM、２００nM、６６.７nM、２２.２nM、７.４nMおよび２.５nM Ｎ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓの結合を、３０μl／分の流速で、１８０秒結合時間および３６０秒解離時間を使用して実施した。動態実験のためのランニング緩衝液は、１０mM リン酸ナトリウム、１３０mM 塩化ナトリウム、０.０５％ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７.１であった。表面を、各サイクル後、３０μl／分の流速で１０mM グリシンｐＨ１.５の２回の３０秒パルスを使用して、再生させた。Sensogramデータを二重参照し、次いでBiacore T100評価ソフトウェアｖ２.０.４を使用して１：１ラングミュアモデルに適合させて、結合速度定数(ｋ_ａ)、解離速度定数(ｋ_ｄ)および平衡解離定数(Ｋ_Ｄ)を決定した。
結果を表１０に示す。本表は、種々の実験からのデータを編集している。２以上のセット数が示されている抗体について、各セットは、別々の実験で出たデータに対応する。

【表9】

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表のＫ_Ｄは一価Ｋ_Ｄであり、すなわち、一価である、ヒトＣＤ７３のＮ末端部分への抗体の結合のＫ_Ｄである。

【0616】

Ｇ５４Ｓ変異は耐容性であり、親和性をわずかに増加させるように見え、同時予想されるＤＧ異性化部位を除去する。Ｌ５２Ｗ変異は、親和性の約１０倍の低下を起こすように見える。４Ｄ４バリアントは、独特なＣＤＲ３配列を有し、動態が異なる(１１Ｆ１１分子と比較して遅い結合)。
ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆの１０実験の平均Ｋ_Ｄは１.１±０.４nMである。１１Ｆ１１と比較したＴ２５Ａ変異は、親和性に影響しない。
結果は、全抗ＣＤ７３抗体がヒトＣＤ７３に良好な親和性で結合し、解離速度が遅いことを示す。
結合試験の結果、結合活性は、１１Ｆ１１、４Ｃ３または４Ｄ４への変異導入またはアイソタイプスイッチ後維持されたが、いくつかの抗体では、元の抗体(すなわち、１１Ｆ１１、４Ｃ３または４Ｄ４)と比較して親和性が低下したことを示す。特に、ＣＤ７３.１０(Ｔ２５Ａ、Ｌ５２Ｗ、Ｇ５４Ｅ)は、ＣＤ７３.４(Ｔ２５Ａ)またはＣＤ７３.１１(４Ｄ４)より速い解離速度を有する。全ＩｇＧ２分子の比較は、１１Ｆ１１およびＣＤ７３.４(１１Ｆ１１−Ｔ２５Ａ)が、最高の一価ＣＤ７３親和性(Ｋ_Ｄ＝１.１nM±０.４nM)を有することを示す。ＣＤ７３.１０(１１Ｆ１１−Ｔ２５Ａ、Ｌ５２Ｗ、Ｇ５４Ｅ)は、１１Ｆ１１またはＣＤ７３.４より約１０倍低いＣＤ７３親和性を有した。これは、Ｌ５２ＷまたはＧ５４Ｅまたは両変異が、他の１１Ｆ１１配列と組み合わせたとき、ＣＤ７３親和性を低下させることを示唆する。４Ｄ４およびＣＤ７３.１１は、ＣＤ７３.１０と同等の親和性(Ｋ_Ｄ約５nM)を有したが、動態は異なった。４Ｃ３エピトープは、ＣＤ７３のＮおよびＣドメインの領域を含むと考えられ、それゆえに測定した単離Ｎドメインに対するＫ_Ｄは弱い(Ｋ_Ｄ＝１００〜２００nM)。

【0617】

ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆのｃｙｎｏ ＣＤ７３への結合も試験した。カニクイザルサルＣＤ７３結合についてのＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆの特異性は、２５℃でBiacore T100装置(GE Healthcare)を使用する表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)で、ヒトＣＤ７３に対する結合と同等であった。ヒトＣＤ７３(Ｈｉｓタグに連結したヒトＣＤ７３の残基２７〜５４７からなる、ｈＣＤ７３−ｈｉｓと呼ぶ)またはカニクイザルＣＤ７３(Ｈｉｓタグに連結したカニクイザルＣＤ７３の残基２７〜５４７からなる、ｃｙ−ＣＤ７３−ｈｉｓと呼ぶ)の完全長細胞外ドメインを、固定化プロテインＡ表面に捕捉された抗体への結合について試験した。これらの実験のために、プロテインＡ(Pierce)を、０.０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、３mM ＥＤＴＡ、０.００５％ｖ／ｖ ｔｗｅｅｎ ２０のランニング緩衝液中、エタノールアミン遮断を用いて、標準エチル(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(ＥＤＣ)／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)化学を使用するＣＭ５センサーチップ(GE Healthcare)のフローセル１〜４上に３０００〜４０００RUの密度で固定化した。実験をまず、抗体(５〜１０μg／ml)を、１０μl／分で３０秒接触時間を使用してプロテインＡ表面に捕捉させ、６００nM、２００nM、６６.７nM、２２.２nM、７.４nMおよび２.５nM ｈＣＤ７３−ｈｉｓまたはｃｙｎｏ−ＣＤ７３−ｈｉｓの結合を、３０μl／分の流速で、１８０秒結合時間および３６０秒解離時間を使用して実施した。これらの実験のランニング緩衝液は、１０mM リン酸ナトリウム、１３０mM 塩化ナトリウム、０.０５％ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７.１であった。表面を、各サイクル後、３０μl／分の流速で１０mM グリシンｐＨ１.５の２回の３０秒パルスを使用して、再生させた。
図１９に示す結果は、ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆが、類似する親和性および動態でｃｙｎｏおよびヒトＣＤ７３に結合することを示す。ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆは、完全長ヒトおよびｃｙｎｏ ＣＤ７３二量体に、１nM未満のＫ_Ｄで結合する。ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆ ｔｏマウスまたはラットＣＤ７３への顕著な交差反応性は観察されなかった。

【0618】

１１Ｆ１１抗体から単離したＦａｂフラグメントの動態および親和性もＳＰＲにより評価した。これらの実験において、マウス抗６ｘＨｉｓ抗体からのＦａｂドメインを、約３０００RUの密度で、ＥＤＣ／ＮＨＳを使用してＣＭ５センサーチップ上に固定化した。完全長ｈＣＤ７３−ｈｉｓ、１０μl／分での３０秒接触時間を使用してＦｃ２(１μg／ml ｈＣＤ７３−ｈｉｓ)に１０RU密度、Ｆｃ３(５μg／ml ｈＣＤ７３−ｈｉｓ)に４０RU密度およびＦｃ４(２０μg／ml ｈＣＤ７３−ｈｉｓ)に１６０RU密度で捕捉した。次に、１１Ｆ１１ Ｆａｂフラグメント(ペプシン開裂Ｌ−システイン還元１１Ｆ１１抗体から精製)を、１０mM リン酸ナトリウム、１３０mM 塩化ナトリウム、０.０５％ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７.１のランニング緩衝液中、３０μl／分で、１８０秒結合時間、６００秒解離時間を使用して、４００nM、１３５nM、４４.４nM、１４.８nM、４,９nM、１.７nM、０.５５nMでの結合について試験した。表面を、３０μl／分の流速で、１０mM グリシンｐＨ２.０の２回の１５秒パルスを使用して、再生させた。Sensogramデータを二重参照し、次いでBiacore T100評価ソフトウェアｖ２.０.４を使用して１：１ラングミュアモデルに適合させて、結合速度定数(ｋ_ａ)、解離速度定数(ｋ_ｄ)および平衡解離定数(Ｋ_Ｄ)を決定した。結果を下の表１１に示す。

【表10】

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それゆえに、結果は、１１Ｆ１１ Ｆａｂフラグメントが、ｈＣＤ７３に高親和性を有することを示す(Ｋ_Ｄ約０.７４nM)。

【0619】

Ｂ. ＣＤ７３抗体陽性細胞へのＣＤ７３の結合
タイトレーション結合曲線を、Ｃａｌｕ６細胞(ＣＤ７３内在性発現体；ヒト肺腺癌細胞株)、ＤＭＳ１１４細胞(ＣＤ７３陰性；ヒト小細胞肺癌細胞株)、ＣＨＯ−ｃｙｎｏＣＤ７３細胞(ｃｙｎｏＣＤ７３遺伝子導入)およびＣＨＯ−Ｋ１細胞(ｃｙｎｏＣＤ７３陰性)上のＣＤ７３抗体で、Alexa Fluor(登録商標)６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)(Invitrogen Cat#A-21445)を二次抗体として使用して、次の方法を使用して作成した。
１０００００細胞を、ウェルあたり１００μL ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ中で播種し、２０分遮断した。Ｕ底９６深ウェルプレートを使用して、抗体およびＰＢＳ＋２％ＦＢＳの体積を、下の表１２に示すように組み合わせた。

【表11】

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【0620】

８点連続希釈を、体積の１／６(９０μL)を４５０μL ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで希釈することにより実施した。細胞プレートを、５分、１５００rpmで遠沈させた。１００μLの希釈抗体を、プレートのウェルあたりに添加した。１００μL ＰＢＳ＋２％ＦＢＳを、全ての他のウェルに添加した。プレートを、氷上で４５分染色し、１５００rpmで５分遠沈し、ウェルあたり２００μL ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄した。非コンジュゲート抗体を入れたウェルと細胞株あたり１非染色ウェルを、１００μL ＡＰＣ抗ヒト二次抗体(２０μg／mL)に再懸濁した。１００μL ＰＢＳ＋２％ＦＢＳを他の全てのウェルに添加し、氷上で４５分染色した。プレートを１５００rpmで５分遠沈し、ウェルあたり２００μL ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄した。プレートを再び洗浄し、ウェルあたり２００μL ２％ＦＢＳのＰＢＳ溶液に再懸濁し、サンプルを流した。
図２０Ａ１、２０Ａ２、２０Ｂ１、２０Ｂ２、２０Ｃ１、２０Ｃ２、２０Ｄ１、２０Ｄ２および表１３に示す結果は、ＣＤ７３抗体全てが、ＣＤ７３を自然に発現する細胞(Ｃａｌｕ６細胞)およびｃｙｎｏ ＣＤ７３を発現するように遺伝子導入したＣＨＯ細胞に結合するが、これらの抗体は、ＣＤ７３を発現しない細胞(ＤＭＳ１１４およびＣＨＯ−Ｋ１)には結合しないことを示す。各抗体で得られた結合のＥＣ_５０を表１３に示す。

【表12】

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ヒト腫瘍細胞株へのＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−ＩｇＧ１.１ｆの結合のＥＣ_５０は０.５nMであった(０.３〜０.６７nM範囲)。ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−ＩｇＧ１.１ｆのｃｙｎｏ ＣＤ７３遺伝子導入ＣＨＯ細胞への結合のＥＣ_５０は、０.３nMであった(０.１〜０.５nM範囲)。

【0621】

ＣＤ７３.４抗体のヒトＢ細胞およびＴ細胞への結合も決定した。２ドナー、Ｄ３１６およびＤ３２９からのヒト血液を、Immunsciences, BMSから得た。末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)を、Lympholyte-H細胞分離勾配媒体で単離した。ＰＢＭＣを、連続希釈したＦＩＴＣ標識ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２、ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−ＩｇＧ１.１ｆまたはＣＤ７３.４−ＩｇＧ１.１ｆ抗体とインキュベートし、Ｔ細胞およびＢ細胞を、ＣＤ３およびＣＤ２０に対する蛍光色素標識抗体で同定した。両ドナーからの細胞を、非染色およびＦＭＯ(Fluorescence minus one)対照サンプルのためにプールした。図２０ＥおよびＦおよび表１４に示す結果は、抗体が特異的にヒトＢ細胞およびＴ細胞に結合することを示す。

【表13】

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【0622】

実施例４：生物物理学的特徴ｏｆ抗ＣＤ７３抗体
Ａ. 直列マルチアングル光散乱検出器と連結したサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ−ＭＡＬＳ)
ＣＤ７３ ｍＡｂのオリゴマー状態を、直列マルチアングル光散乱検出器と連結したサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ−ＭＡＬＳ)により試験した。定組成分離を、Prominence Shimadzu UFLCに連結したShodex PROTEIN KW-803カラムで、０.０２％Ｎａアジド(０.１μm濾過)含有２００mM Ｋ_２ＨＰＯ_４、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６.８を含む緩衝液中、０.５mL／分で流して実施した。サンプルを、SIL-20AC Prominence Shimadzuオートサンプラーを使用してカラムに注入し、データを、連続的にProminence SPD-20ADダイオードアレイUV/vis分光光度計、続いてWyatt miniDAWN^TM TREOSマルチアングル光散乱検出器、次いでWyatt Optilab T-rEX屈折率検出器に連結した３オンライン検出器から得た。データ(下の表１５に示す)を、Astra(Wyatt)およびLabsolutions(Shimadzu)ソフトウェアを使用して採取し、分析した。結果を表１５に示す。

【0623】

Ｂ. 示差走査熱量測定(ＤＳＣ)
ＣＤ７３ ｍＡｂの熱安定性を、MicroCal Capillary DSC装置(GE Healthcare)を使用して決定した。抗体ＰＢＳ ｐＨ７.１中、０.５〜０.７５mg／mlの濃度で分析した。ＤＳＣ装置ベースラインを安定させ、一貫した熱履歴を得るために、サンプルおよび対照細胞両者で緩衝液単独の複数スキャンを、サンプル分析前に記録した。サンプルスキャンは、サンプル細胞にｍＡｂおよび対照細胞にＰＢＳ ｐＨ７.１を含んだ。全スキャンを、１０〜１１０℃で、６０°／時間のスキャン速度で５分プレサイクルサーモスタット時間および無ポストサイクルサーモスタット時間で実施した。データ(下記表１５に示す)を、MicroCal Origin Cap DSC分析ソフトウェアを使用して分析した。適切な緩衝液−緩衝液ブランクスキャンをサンプル−緩衝液データから減じ、転移中点温度(Ｔｍ)値を、データをnon-2-stateモデルに適合させて決定した。結果を表１５に示す。Ｔｍ１、Ｔｍ２およびＴｍ３は、抗体の異なるドメインのＴｍである。

【表14】

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結果は、全抗体が大部分単量体であり、安定であることを示す。

【0624】

実施例５：抗ＣＤ７３ Ａｂによる酵素活性の阻害
Ａ. ビーズ結合ＣＤ７３酵素活性の阻害
抗ＣＤ７３抗体によるビーズ結合ＣＤ７３酵素活性阻害を評価するために、次の材料および方法を使用した。
材料
ＴＭ緩衝液：２５mM Ｔｒｉｓ、５mM ＭｇＣｌ_２の水溶液
０.５mM リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８.０
洗浄緩衝液(１０mL ０.５mM リン酸ナトリウム、ｐＨ８.０；１０mL ５Ｍ ＮａＣｌ；３４mL 水；１０μL Ｔｗｅｅｎ−２０)
アデノシン５’−一リン酸二ナトリウム塩、Sigma Cat#01930-%G、ＴＭ緩衝液中３００mM
アデノシン５’−三リン酸二ナトリウム塩水和物、Sigma Cat#A6419-1G、ＴＭ緩衝液中１００mM
ｒｈＣＤ７３、０.７８１mg／mL
ｃｙｎｏ ＣＤ７３、Ino Biological Inc Cat#90192-C08H
磁気ｈｉｓタグビーズ、Invitrogen Cat# 10103D
CellTiter-Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay, Promega Cat#G7572
ｍＡｂＯ、ＣＤ７３に結合しない無関係の抗体

【0625】

方法
表１６に記載する抗ＣＤ７３抗体の６点連続希釈(最高濃度１０μg／mL)を、表１６に示す体積の組み合わせにより実施し、３倍希釈した(２２５μLを４５０μL ＴＭ緩衝液に移した)。ＩｇＧ２ヒンジを有する全抗体はＣ２１９Ｓ変異を含んだ。

【表15】

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【0626】

磁気ビーズ(２μlビーズ／サンプル)を、微小遠心管中、１mL リン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。ビーズを磁石で引き下ろし、４００μL ＴＭ緩衝液に再懸濁した。ＣＤ７３の各種について：別のチューブで、ＣＤ７３(７５ng／サンプル)をＴＭと組み合わせて、体積を最大４００μLとした。第三チューブをブランクビーズ(無ＣＤ７３)のために調製した。ビーズ懸濁液をｒｈＣＤ７３溶液と組み合わせ、シェーカーで５分、室温で混合した。ビーズを磁石で引き下ろし、ビーズを１mL 洗浄緩衝液で洗浄した。ビーズを磁石で引き下ろし、ＴＭ緩衝液(４０μL／サンプル)に再懸濁した。ビーズをＰＣＲ ９６ウェルプレートに移した(４０μL／ウェル)。ウェルあたり２００μLの連続希釈したＣＤ７３ ＨμMａｂをプレートに添加し、ウェルを混合した。プレートを、３０分、室温でインキュベートした。各７００μLの４００μM ＡＴＰ(８Ｘ)および１.２mM ＡＭＰ(８Ｘ)を調製した。各６５０μLを組み合わせて、４Ｘ ＡＭＰ／ＡＴＰストックミックスを調製した。ビーズを引き下ろし、ウェルあたり２００μL ＴＭ緩衝液で２回洗浄した。ビーズを再び引き下ろし、３０μL ＴＭ緩衝液に再懸濁した。３０μLビーズを、９６ウェル黒色プレートに移した。ＡＭＰ／ＡＴＰの４ｘストック溶液の１０μL(最終濃度１５０μM ＡＭＰ／５０μM ＡＴＰ)を添加し、混合した。４０μL体積の対照ウェル(最終濃度１５０μM ＡＭＰおよび／または５０μM ＡＴＰ)を添加した。プレートを、１５分、３７℃でインキュベートした。

【0627】

結果を図２１Ａ１、２１Ａ２、２１Ｂ１および２１Ｂ２および表１７に示す。

【表16】

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【0628】

ｃｙｎｏ ＣＤ７３の酵素阻害の結果を表１８に示す。

【表17】

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結果は、抗体がヒトＣＤ７３の酵素活性を用量依存的に阻害することを示す。ＣＤ７３.４.ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆは、組み換えヒトＣＤ７３酵素阻害アッセイで２.９７(２.９〜３.１nM範囲)のＥＣ_５０を有する。ＣＤ７３.４.ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆは、組み換えｃｙｎｏ ＣＤ７３酵素阻害アッセイで３.７(１.６〜１２.６nM範囲)のＥＣ_５０を有する。それゆえに、試験した全てのＣＤ７３に対する抗体は、ビーズ結合ヒトおよびｃｙｎｏ ＣＤ７３酵素活性を阻害した。

【0629】

Ｂ. Ｃａｌｕ６細胞におけるＣＤ７３酵素活性の阻害
本実施例は、抗ＣＤ７３抗体で処理後のＡＭＰのＣＤ７３脱リン酸化に対するＣａｌｕ６(ＣＤ７３陽性)およびＤＭＳ−１１４(ＣＤ７３陰性)細胞の評価を記載する。
材料：
ＣＤ７３抗体；下記参照
ＭａｂＯ対照抗体、５.３８mg／mL
ＴＭ緩衝液：２５mM Ｔｒｉｓ、５mM ＭｇＣｌ_２の水溶液
アデノシン５’−一リン酸二ナトリウム塩、Sigma Cat#01930-5G、ＴＭ緩衝液中３００mM
アデノシン５’−三リン酸二ナトリウム塩水和物、Sigma Cat#A6419-1G、ＴＭ緩衝液中１００mM ｒｈＣＤ７３、０.７８１mg／mL
CellTiter-Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay, Promega Cat#G7572

【0630】

方法：
抗体を、下の表１９に示すように、Ｕ底９６ウェルプレートで精製抗体およびＰＢＳの体積を合わせることにより連続希釈した。抗体(最高濃度２５μg／mL、３００μL)および６０μLを２４０μL ＰＢＳに移した５倍希釈の６点連続希釈を実施した。ＩｇＧ２ヒンジを有する全抗体はＣ２１９Ｓ変異を含んだ。

【表18】

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【0631】

細胞をVerseneで採取し、計数した。プレートに播種し、１５００rpmで５分遠沈し、１００μL連続希釈抗体に再懸濁した。他の全ウェルを、１００μL ＰＢＳに再懸濁させた。インキュベーションは３７℃で２０分であった。ＡＭＰの１５mLの１８０μMストックをＴＭ緩衝液で調製した。
プレートを１５００rpmで５分遠沈し、２００μL ＰＢＳ／ウェルで１回洗浄した。プレートを再び遠沈し、１００μL ＡＭＰに再懸濁した。他の全ウェルを、１００μL ＴＭ緩衝液に再懸濁させた。細胞を、ＡＭＰと６０分、３７℃でインキュベートした。ＡＴＰのＴＭ緩衝液中の７.５mLの６０μMストックを調製した。プレートを、１５００rpmで５分遠沈し、５０μLの上清を黒色９６ウェルプレートに移した。５０μLのＡＴＰを添加した。ｒｈＣＤ７３を、陽性対照として、ウェルあたり７５ngであるウェルに添加した。ｒｈＣＤ７３を受けていないウェルをＴＭ緩衝液で１００μLとした。最終濃度は９０μM ＡＭＰ：３０μM ＡＴＰであった。インキュベーションは３７℃で１５分であった。CellTiterGloアッセイ(ＡＴＰを検出する)に関して、１００μLをウェルあたりに添加し、プレートを読んだ。

【0632】

図２２Ａ１、２２Ａ２、２２Ｂ１、２２Ｂ２および表２０に示す結果は、抗ＣＤ７３抗体がヒトＣＤ７３陽性Ｃａｌｕ６細胞におけるＡＭＰの脱リン酸化を阻害する(またはＡＭＰ処理を減らす)が、ＣＤ７３陰性ＤＭＳ１１４細胞には何ら影響がないことを示す。ヒト腫瘍細胞株Ｃａｌｕ６におけるＣＤ７３.４−ＩｇＧ２Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆ抗体の内因性細胞ＣＤ７３遮断のＥＣ_５０は０.３９nM(範囲０.３１〜０.４８nM)である。これらの実験をＮＣＩ−Ｈ２９２(粘膜表皮性癌細胞株)およびＳＫ−ＭＥＬ−２４(ヒト黒色腫細胞株)細胞で繰り返し、結果は類似した(表２０)。

【表19】

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^１内在性ＣＤ７３発現を有するＣａｌｕ６細胞での結合タイトレーション。抗体を２〜６回の独立した実験で試験しており、平均値を示す。
^２本実施例のセクションＡからのデータ。抗体を１〜５回の独立した実験で試験しており、平均値を示す。
^３記載した細胞株における細胞ＣＤ７３活性の阻害。抗体を２〜４回の独立した実験で試験しており、平均値を示す。

【0633】

Ｃ. デュアル細胞株ｃＡＭＰアッセイにおけるＣＤ７３酵素活性の阻害
均一性時間分解蛍光(ＨＴＲＦ)ｃＡＭＰアッセイ
ＣＤ７３抗体を、０.２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で連続希釈し、３８４ウェル白色底プロキシプレート(PerkinElmer, Waltham, MA)で５μl／ウェルで播種した。Ｃａｌｕ−６細胞を採取し、０.２％ＢＳＡ含有ＰＢＳに再懸濁し、次いで５μlの細胞(３００細胞／ウェル)をプレートに添加した。細胞を、抗体と１０分、３７℃、５％ＣＯ_２および９５％湿度でインキュベートし、続いて５μl／ウェル８０mM ＡＭＰを添加した。細胞をさらにＡＭＰと３０分、３７℃でインキュベートした。この間、ＨＥＫ２９３／Ａ２ＡＲ細胞を採取し、０.２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中４０万／mlに希釈した。それらを、アッセイプレートに５μl／ウェルで添加し、３７℃で１時間インキュベートを続けた。ＨＲＴＦアッセイを、製造業者の指示に従い、溶解緩衝液に１０μl／ウェルｃＡＭＰコンジュゲートｄ２および１０μl／ウェルユウロピウムクリプテートコンジュゲート抗ｃＡＭＰ抗体を添加することにより、均一性時間分解蛍光(ＨＴＲＦ)HiRange cAMP検出キット(Cisbio, Bedford, MA)を使用して実施した。プレートを、室温で６０分インキュベートし、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)シグナル(６６５および６１５nM)をEnVisionプレートリーダー(PerkinElmer, Waltham, MA)を使用して読んだ。ＦＲＥＴシグナルを、６６５nm(アクセプター)および６１５nm(ドナー)チャネルからのシグナルの比として計算し、１０,０００倍した。ＩＣ_５０およびＹ_ｍａｘを測定した。Ｙ_ｍａｘを、内部最大としての１００nM用量の１１Ｆ１１との比較により決定した。すべての計算を、１００％としたこの対照と比較した阻害のパーセンテージとして決定した。

【0634】

表２１に示す結果は、抗ＣＤ７３ ｍＡｂが、細胞株共培養システムを使用するこのｃＡＭＰアッセイで種々の有効性および抗力を示したことを示す。全Ａｂは、アデノシン産生のいくぶんかの減少を示し、阻害の程度は、スクリーニングした大部分のＡｂで類似した。最大阻害は、１１Ｆ１１、１１Ａ６、４Ｃ３および５Ｆ８で見られた。

【表20】

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【0635】

酵素阻害アッセイを、１１Ｆ１１ ＦａｂおよびＦ(ａｂ’)_２でも実施した。図２２Ｃに示す結果は、Ｆ(ａｂ’)_２フラグメントで酵素阻害が生じるが、Ｆａｂフラグメントでは生じないことを示した。それゆえに、Ｆｃ領域は１１Ｆ１１酵素阻害には必要ではないが、二価性は必要である。
Ｃａｌｕ６細胞における酵素阻害も、上記ｃＡＭＰアッセイを使用する、表２６に示す多様な重鎖定常領域を含むＣＤ７３.４抗体についても決定した。ＥＣ_５０および阻害レベル対背景(“Ｓ：Ｂ”)の観点での結果を、表２８の右端の２列に示す。結果は、全ＣＤ７３.４抗体がＣａｌｕ６細胞においてヒトＣＤ７３酵素活性を阻害することを示す。

【0636】

Ｄ. ＣＤ７３酵素活性阻害の経時変化
酵素活性の阻害を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるアデノシン産生の評価により、経時的にも評価した。Ｃａｌｕ６細胞を、５０μM ＡＭＰ添加後、１１Ｆ１１または４Ｃ３と３０分、２時間または４時間インキュベーションし、標準方法を使用するＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりアデノシン産生を評価した。

【0637】

マススペクトロメトリー条件(Xevo TQ-S)：
装置：Xevo TQ-S(Waters 2777Cと共に)

【表21】

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図２２Ｄに示す結果は、インキュベーション時間は、３０分時点で差異を生じ、１１Ｆ１１による阻害が４Ｃ３より速く生じることを示す。両抗体が後の時点では同等な阻害を達成するが、１１Ｆ１１抗体は、細胞においてＣＤ７３酵素活性をより速く阻害する。

【0638】

実施例６：ＣＤ７３の抗体介在内在化
ＣＤ７３の抗ＣＤ７３抗体介在内在化を、２つの異なるアッセイで測定した。

【0639】

Ａ. 高容量内在化アッセイ(２時間固定時間アッセイ)
抗ＣＤ７３抗体を、抗体インキュベーション２時間後の細胞発現を評価することにより、Ｃａｌｕ６細胞における抗ＣＤ７３抗体依存性ＣＤ７３内在化を試験した。２０μlの完全培地(１０％熱不活化ウシ胎児血清含有Gibco RPMI Media 1640)中の細胞(２,０００細胞／ウェル)を、384ウエルBD Falconプレートに播種し、一夜、３７℃、５％ＣＯ_２および９５％湿度で増殖させた。抗ＣＤ７３抗体を０.２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で連続希釈し、細胞プレートに５μl／ウェルで添加した。細胞を、抗体と２時間、３７℃、５％ＣＯ_２および９５％湿度でインキュベートし、続いてＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。ホルムアルデヒド(最終ＰＢＳ中４％)を、細胞プレートに２０μl／ウェルで添加し、プレートを室温で１０分インキュベートした。その後、全液体を吸引し、細胞を３０μl ＰＢＳで洗浄した。検出抗体(２.５μg／ウェルの抗ＣＤ７３ Ａｂ ＣＤ７３.１０.ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ)を、固定細胞プレートに１５μg／ウェルで添加した。細胞を４℃で一夜インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、続いてAlexa-488ヤギ抗ヒトおよびＤＡＰＩを含む二次抗体を添加し、１時間、室温で染色した。ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後、プレートをArrayscan Vti(Cellomics, Pittsburgh, PA)で洗浄した。ＩＣ_５０およびＹ_ｍａｘを測定した。Ｙ_ｍａｘは、内部最大としての１００nM用量の１１Ｆ１１との比較により決定した。全ての計算を、１００％としたこの対照と比較した内在化パーセンテージとして決定した。

【0640】

結果を表２２に提供する。

【表22】

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ＮＤ＝検出されず
ＮＡ＝適用せず

【0641】

それゆえに、結果は、ヒトＣＤ７３発現細胞株Ｃａｌｕ６におけるＣＤ７３.４.ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆが介在するＣＤ７３内在化のＥＣ_５０が１.２nMであり、該細胞株の内在化の最大レベルが９７.５％であることを示した。
内在化アッセイを１１Ｆ１１ ＦａｂおよびＦ(ａｂ’)_２でも実施した。図２２Ｃに示す結果は、Ｆ(ａｂ’)_２フラグメントで内在化が起こるが、Ｆａｂフラグメントでは起こらないことを示した。それゆえに、Ｆｃ領域は、１１Ｆ１１内在化に必要ではない。

【0642】

動的内在化試験を実施して、内在化の速度を評価した。２０μlの完全培地(１０％熱不活化ウシ胎児血清含有Gibco RPMI Media 1640)中の細胞(２,０００細胞／ウェル)を、384 BD Falconプレートに播種し、一夜、３７℃、５％ＣＯ_２および９５％湿度で増殖させた。ＣＤ７３抗体を、０.２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で１０μg／mlまで希釈し、細胞プレートに５μl／ウェルで添加した。細胞を、抗体と、０〜２時間タイムコースで３７℃でインキュベートし、次いでＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。続いて、細胞をホルムアルデヒド(最終ＰＢＳ中４％)で、室温で１０分固定し、次いで３０μl ＰＢＳで１回洗浄した。検出抗体(２.５μg／ウェル抗ＣＤ７３ Ａｂ ＣＤ７３.１０.ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ)を０.２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で希釈し、固定細胞プレートに１５μl／ウェルで添加した。プレートを、４℃で一夜インキュベートした。翌日、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後、二次抗体Ａｌｅｘａ４８８−ヤギ抗ヒトとＤＡＰＩを添加した。細胞を６０分、室温で染色し、３回洗浄後、Arrayscan Vti(Cellomics, Pittsburgh, PA)を使用して画像を得た。結果を図２３Ａ〜２３Ｄおよび表２３および２４に示す。表２４の値は、図２３Ａ〜Ｄに示すデータに由来する。

【表23】

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【0643】

【表24】

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【0644】

結果は、ビン１抗体(１１Ｆ１１およびその誘導体ＣＤ７３.４およびＣＤ７３.１０)が良好な内在化ＥＣ_５０および最大値(９７.５％)を示すが、ある抗体は、他者より内在化されることを示した。１１Ｆ１１は、最も活性であり、数分以内で内在化し、プラトーに３０分で達し、一方６Ｅ１１(ビン１抗体である、ＩｇＧ１)は、ゆっくり内在化し、プラトーに約１時間で到達した(図２３Ａ〜Ｄ)。ビン２抗体(５Ｆ８および４Ｃ３)は顕著な内在化はなかった。さらに、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１ドメインの存在は内在化の速度および程度を高めた。この傾向は、数細胞株(図２３Ａ〜Ｄおよび表２４)で見られた。

【0645】

Ｂ. フローサイトメトリーにより測定した内在化
ＣＤ７３の抗ＣＤ７３抗体介在内在化を、フローサイトメトリーでも試験した。記載する細胞を、１０μg／mLの標記抗体と３０分、氷上でインキュベートし、数回洗浄し、記載する時間、３７℃に移した。細胞を、示すインキュベーション時間後、同一時間で採取した。細胞を、一次抗体(最初のインキュベーションに使用したのと同じ抗体)で再び、続いて抗ヒト二次抗体で染色した。細胞を、次いで、ＣＤ７３の発現についてフローサイトメトリーでアッセイした。
図２３Ｅおよび表２５に示す結果は、上記内在化アッセイで得られたものに一致し、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１を有する全抗体が迅速かつ完全な内在化を誘発したことを示す。ＣＤ７３レベルは、洗い流した２２時間後低いままであり、内在化が持続性であることを示す。

【0646】

図２３Ｆおよび表２５に示すのと類似する結果がＮＣＩ−Ｈ２９２細胞株で得られ、この抗体は、インキュベーション時間の間培養において維持した(洗い流しなし)。再び、これらのデータは、迅速かつ顕著な内在化および内在性ＣＤ７３の下方制御の維持を示す。
内在化アッセイをヒトＳＮＵ−Ｃ１(結腸癌細胞株)およびＮＣＩ−Ｈ１４３７(非小細胞肺癌細胞株)細胞でも実施した。図２３ＩおよびＪおよび表２５に示す結果は、迅速なな内在化を示し、最大レベルに５時間いないに到達し、内在化の最大レベルはＣＤ７３.４.ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆについてＳＮＵ−Ｃ１で約５０％およびＮＣＩ−Ｈ１４３７細胞で６０％であった。図２３ＧおよびＨは、Ｃａｌｕ６およびＮＣＩ−Ｈ２９２細胞におけるＣＤ７３.４.ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆの内在化の類似する動態を示した。ＣＤ７３内在化％を示すグラフについて、この数値は次のようにして得た：

【数1】

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ここで、各抗体、ＭＦＩ_ｔ＝ｘは、ある時点のＭＦＩであり、ＭＦＩ_ｔ＝０はｔ＝０の最大蛍光であり、ＭＦＩ_背景は二次性ＡｂのみのＭＦＩである。

【0647】

【表25】

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【0648】

さらなる内在化アッセイをＣａｌｕ６およびＨ２９２細胞で行い、さらに内在化に対するアイソタイプの役割を区別した。内在化アッセイを上記のように実施し(抗体の洗い流し工程を含まないプロトコール)、表２６に示す種々のハイブリッドアイソタイプの抗体を、インキュベーション中培養において１０μg／mLに維持した。フローサイトメトリー実験のために、実施例６Ｂの方法を９６ウェルプレート(４８ウェルプレートではない)およびウェルあたり５０,０００細胞のハイスループット分析に適合させた。

【表26】

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【0649】

ＦｃγＲ結合は、予想通り各構築物について見られ、すなわち、ＦｃγＲ結合は下部ヒンジ／ＣＨ２領域により駆動された。
結果を図２３Ｋ、Ｌ、Ｍおよび表２７および２８に示す。表２７に示すデータは、実施例６Ｂに記載するのと同一のプロトコールを使用して作成した。表２８に示すデータは、実施例６Ａに記載するのと同一のプロトコールを使用して作成した。

【表27】

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【0650】

【表28】

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【0651】

図２３Ｋ、ＬおよびＭおよび表２７および２８は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジおよびＣＨ１ドメインを有する抗体がＣＤ７３内在化駆動に最も有効であり、一方ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１ドメインを有する抗体は、図の低い曲線に対応し、すなわち、内在化の程度が低い。さらに、ＩｇＧ２からのヒンジのみを有する抗体は、ヒトＩｇＧ１ヒンジと比較して内在化が増加している。それゆえに、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジおよびＣＨ１ドメインを有する抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプの抗体と比較して、優れた内在化特徴を有する。
それゆえに、抗ＣＤ７３抗体ｍＡｂ−ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆは、試験した細胞株より迅速な内在化を誘発する。内在化のＴ_１／２は、数分から１時間以内である。大部分の試験した細胞株は、１０分以内のＴ_１／２を有する。ほぼ完全な内在化がある細胞株で誘発され、試験した全て、表面ＣＤ７３発現が少なくとも５０％低下し、これは、一般に５時間までに到達される最大レベルであり、いくつかの例では遙かに短かった。
ＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳデータは、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１領域(ＩｇＧ１.１ｆ)を含むものと比較して、大きな複合体がｈＣＤ７３−ｈｉｓと、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１領域(ＩｇＧ２−Ｃ２１９ＳまたはＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆ)を含むｍＡｂで形成されることを示す。

【0652】

実施例７：異種移植動物モデルにおける腫瘍のＣＤ７３酵素阻害
皮下ヒトＣａｌｕ６腫瘍を担持するマウスを、７日飼育後、ＣＤ７３.１０−ＩｇＧ１.１、ＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳまたはＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１で処置した。抗体を１０mg／kg ＩＰで投与した。腫瘍を、抗体投与１日目、２日目、３日目および７日目に摘出し、ＯＣＴに包埋し、冷イソペンタンで急速凍結した。ＯＣＴ包埋腫瘍を５〜６μm切片に切り、一夜、ＲＴで乾燥させた。腫瘍切片を、２.５分、冷１０％リン酸緩衝化ホルマリンおよびアセトンの１：１混合物で固定し、１時間、ＲＴで２mM ＣａＣｌ_２および０.２５Ｍスクロース含有５０mM Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液、ｐＨ７.４でプレインキュベートした。１時間後、プレインキュベーション緩衝液を除き、５mM ＭｎＣｌ_２、２mM Ｐｂ(ＮＯ_３)_２、２.５％デキストランＴ２００、２.５mM レバミソールおよび１mM ＡＭＰを添加した同一緩衝液に置き換えた。酵素反応を、１時間、３７℃で実施した。ＤＩ水で濯いだ後、切片を正確に１分、１％(ＮＨ_４)_２Ｓとインキュベートし、ＤＩ水ですぐに濯いだ。切片を、ヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、キシレンベースのマウンティング培地にマウントとした。褐色は活性ＣＤ７３の存在を示し、一方褐色がないことは、ＣＤ７３酵素活性が抗体により阻害されたことを示した。
結果は、ＣＤ７３.１０−ＩｇＧ１.１、ＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳおよびＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１がインビボでＣＤ７３酵素活性を阻害することを示す。ＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１抗体で処置したマウスからの腫瘍の代表的染色切片を図２４Ａ〜Ｅに示す。他の２抗体で処置したマウスからの腫瘍の染色切片は類似であった。ＣＤ７３の阻害の程度は、抗体の血清レベルと相関した。それゆえに、３日目例で観察されたＣＤ７３活性のわずかに高いレベルは、７日目例より低い抗体血清レベルと相関した。

【0653】

上記と類似する実験を、皮下ヒトＳＮＵＣ１結腸腺癌由来異種移植腫瘍を担持マウスで実施し、抗ＣＤ７３抗体ＣＤ７３.４ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆで処置した。ＳＮＵＣ１腫瘍を有するマウスを、ＣＤ７３.４ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆで、０日目に１mg／kg、３mg／kgおよび１０mg／kg ＩＰで処置した。腫瘍を、投薬２４時間、４８時間、７２時間、９６時間および１６８時間後に採取した。ＣＤ７３酵素阻害アッセイを上記のように実施した。褐色染色の定量を、Image Pro Premierソフトウェア(Media Cybernetics)で実施した。
図２４Ｆのグラフに示す結果は、対照抗体処置マウスと比較したとき、抗ＣＤ７３抗体投与動物でＣＤ７３活性が顕著に低下し、全３濃度での抗体による強いＣＤ７３酵素阻害を示した。それゆえに、抗ＣＤ７３抗体ＣＤ７３.４ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆは、インビボで効率的にＣＤ７３酵素活性を阻害する。抗ＣＤ７３抗体によるＣＤ７３阻害の動態も、４Ｔ１同系腫瘍モデルで。ＴＹ／２３(ｒａｔ抗マウスＣＤ７３抗体)またはラットＩｇＧ対照(１０mg／kg)を、４Ｔ１腫瘍細胞注射７日後に注射した。腫瘍、脾臓、全血および血清を、Ａｂ処置１日、２日、３日、６日および７日後に採取した。ＣＤ７３活性の阻害を、上のセクションに記載のように、記載する日に測定した。代表的腫瘍切片を図２５ＡおよびＢに示す。データは、ＴＹ／２３がＣＤ７３活性をインビボで阻害することを示す。

【0654】

実施例８：エピトープビニングおよびフローサイトメトリベースの交差遮断
エピトープビニング試験を、Biolayer Interferometry(BLI) using an Octet RED装置(Pall Fortebio)で、２５℃で実施した。これらの試験のために、２０〜３０μg／ml ｈＣＤ７３−ｈｉｓを、９０〜１８０秒ローディング相を使用して抗ペンタ−ｈｉｓセンサー上に捕捉した。抗体競合を、ある抗体(ｍＡｂ１)をｈＣＤ７３−ｈｉｓ表面に１８０秒結合させ、直ぐに第二の抗体溶液(ｍＡｂ２)に１８０秒曝すことにより評価した。ｍＡｂ１の前結合後のｍＡｂ２の結合シグナルを、競合非存在下でのｍＡｂ２と比較し、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２が、ｈＣＤ７３−ｈｉｓ表面への結合について競合するか否かを決定した。これらの実験を、競合プロファイルおよびエピトープビンを確率するために、両方向(ｍＡｂ１、次いでｍＡｂ２およびｍＡｂ２、次いでｍＡｂ１)で多数のｍＡｂ対で実施した(下記表２９に要約のとおり)。

【0655】

表２９に示すように、エピトープビニング分析は、２エピトープビンを確認した。

【表29】

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【0656】

抗体を、フローサイトメトリベースの交差遮断にも付した。実験を、１セットの標識蛍光標識抗体および第二セットの非標識抗体を使用して、次のとおり実施した：ウェルあたり１０００００ ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を播種した。プレートを遠沈し、細胞を、ウェルあたり、１００μL ２％ＦＢＳのＰＢＳ溶液に再懸濁した。細胞を、氷上で２０分遮断した。示すように、２％ＦＢＳのＰＢＳ溶液中の非標識抗体を、各ウェルに添加した。プレートを遠沈し、細胞を、ウェルあたり１００μLの、ＦＩＴＣにコンジュゲートした、希釈、標識抗体(１０μg／mL)、すなわち、４Ｃ３または１１Ｆ１１に再懸濁した。細胞の６ウェルを抗体非存在下でインキュベートし、１００μL ２％ＦＢＳのＰＢＳ溶液のみに再懸濁した(対照として)。次いで、細胞を氷上で３０分インキュベートした。細胞を、２％ＦＢＳのＰＢＳ溶液で２回洗浄し、サンプルを１４０μL ２％ＦＢＳのＰＢＳ溶液に再懸濁し、FacsCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson)で分析した。
図２６ＡおよびＢに示すフローサイトメトリーベースの交差遮断の結果は、上に示すＳＰＲエピトープビニングデータを確認する。例えば、７Ａ１１は１１Ｆ１１と競合するが、４Ｃ３はしない。

【0657】

実施例９：ＨＤＸによるエピトープマッピング
本実施例は、ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆが結合するヒトＣＤ７３上のエピトープの同定のためのＨＤＸ−ＭＳを記載する。
水素／重水素交換マススペクトロメトリー(ＨＤＸ−ＭＳ)法は、タンパク質主鎖アミド水素原子(プロリン以外)の重水素交換の速度および程度をモニタリングすることにより、溶液中のタンパク質立体構造および立体構造的力学を探索する。ＨＤＸの交換レベルは、タンパク質溶媒近接性および水素結合により、ＨＤＸによるタンパク質質量増加は、ＭＳにより正確に測定できる。この技術を酵素消化と組み合わせたとき、ペプチドレベルでの構造特徴を解析でき、表面に露出しているペプチドを、内部に折りたたまれているものから区別することが可能となる。エピトープマッピング実験において、重水素標識および続く停止実験を、抗原および抗原／ｍＡｂ複合体で平行して実施し、続いてオンライン消化消化、ペプチド分離およびＭＳ分析を行う。
ＨＤＸ−ＭＳによるＣＤ７３におけるＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆのエピトープマッピング前に、非重水素化実験を実施して、組み換えヒト完全長ＥＣＤ二量体ＣＤ７３(１２μM)および組み換えヒトＣＤ７３とＣＤ７３ ｍＡｂのタンパク質複合体(１：１モル比、ＣＤ７３ ｍＡｂについて１２μM)の共通消化性ペプチドの一覧を作成し、完全長ＥＣＤ ＣＤ７３の８８％の配列カバー率を達成した。ＨＤＸ−ＭＳ実験において、５μLのＣＤ７３(配列番号９９)またはＣＤ７３とＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆ ｍＡｂを、５５μLのＤ_２Ｏ緩衝液(１０mM リン酸緩衝液、Ｄ_２Ｏ、ｐＤ７.０)で希釈し、室温で標識反応を開始させた。使用したＣＤ７３タンパク質は、配列番号９９を有するグリコシル化完全長二量体ｈＣＤ７３であった(また下にも示す)。反応を種々の時間実施した：２０秒、１分、１０分および２４０分。各標識反応時間の最後に、反応を停止緩衝液(１００mM リン酸緩衝液と４Ｍ ＧｄｎＣｌおよび０.４Ｍ ＴＣＥＰ、ｐＨ２.５、１：１、ｖ／ｖ)の添加により停止させ、５０μLの停止サンプを、分析のためにWaters HDX-MSシステムに注入した。共通消化性ペプチドの重水素取り込みレベルを、ＣＤ７３ ｍＡｂ非存在下／存在下でモニターした。

【0658】

使用したＣＤ７３タンパク質は、配列番号９９を有するアミノ酸配列を有した。
ＣＤ７３におけるＣＤ７３ ｍＡｂのＨＤＸ−ＭＳ測定は、ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆ ｍＡｂが、ＣＤ７３のＮ末端領域における２ペプチド領域からなる不連続エピトープを認識することを示す：
ペプチド領域１(６５−８３)：FTKVQQIRRAEPNVLLLDA(配列番号９６)
ペプチド領域２(１５７−１７２)：LYLPYKVLPVGDEVVG(配列番号９７)
相互作用の３次元図(図２７Ｂ)は、これら２領域が幾何的に近いことを示す。相互作用の詳細な地図を図２７Ａに示す。

【0659】

実施例１０：ＣＤ７３に結合する１１Ｆ１１の結晶構造
この実施例は、ＣＤ７３(２６−３３６)Ｈｉｓに結合する１１Ｆ１１のＦａｂ’の結晶構造を記載する。
ＣＤ７３(２６−３３６)Ｈｉｓを、標準プロトコールを使用して一過性に遺伝子導入したＨＥＫ−２９３ Ｅ細胞から精製し、そのまままたはＰＮＧａｓｅ Ｆ処理により脱グリコシル化し、１.２mg／mlに濃縮した。抗体１１Ｆ１１ Ｆａｂ’を、標準プロトコールを使用する１１Ｆ１１のペプシン消化により調製し、１.１mg／mlに濃縮した。
複合体を、等体積の脱グリコシル化ｈＣＤ７３(２６−３３６)Ｈｉｓおよび１１Ｆ１１ Ｆａｂ’と一夜、４℃でインキュベートすることにより形成させ、GE Superdex 200 26/60カラムを使用して精製し、10kMWCOスピンコンセントレータを使用して９.５mg／mlに濃縮した。
結晶を、蒸気拡散実験のシッティング・ドロップで成長させ、液滴は、０.２５μLリザーバー溶液と混合した０.２５μLタンパク質であった。７１００を超える結晶化実験を設定した。最初の結晶リードは約１０μmほど小さかった。最適化結晶は、２００〜３００μmサイズであった。結晶化最適化は、添加物、界面活性剤、沈殿剤、ｐＨ、温度および緩衝液タイプのスクリーニングを含んだ。結晶形成を可能にした条件は、次のとおりであった：３４％ポリプロピレングリコールＰ４００、０.１Ｍ Ｎａ／Ｋ ＰＯ_４ ｐＨ６.５および１５μM ＣＹＭＡＬ−７からなるリザーバー溶液；結晶化実験を室温で設定し、次いでインキュベートのために４℃に移した；そして４℃で７日インキュベーションした。結晶形成は、グリコシル化ＣＤ７３タンパク質でのみ観察された。
結晶を、結晶化滴から直接採取し、直接液体Ｎ_２に入れた。１００を超える結晶を、社内回折でスクリーニングした。

【0660】

データを、Rayonix MX-33HS高速ＣＣＤ検出器を伴うSER-CATビームライン22IDでの小さなビーム、微小の衰弱およびヘリカルデータコレクションを使用して採取した。データセットを４.１Å、３.８Å、３.５Å、そして最後に３.０５Åで採取した。ルーチンＨＫＬ２０００(Otwinowski Z., Minor W., Methods in Enzymology 276, 307-326 (1997))を使用して処理し、スケール調整したデータは、３.０４Å解像度に９６％完了した。
ＢＬＡＳＴ(Altschul et al. (1990) “Basic local alignment search tool.” J. Mol. Biol. 215:403-410)サーチに使用して、分子置換サーチに使用するＲＣＳＢタンパク質データバンクにおけるＣＤ７３ Ｎ末端ドメインおよびＦｃおよびＦｖドメインと最も近いモデルを発見した：ＣＤ７３モデルは、ＰＤＢエントリー４Ｈ１Ｓからであった(Heuts et al. Chembiochem. 2012 Nov 5;13(16):2384-91)。
これらを、ＰＨＡＳＥＲ(McCoy et al. J. Appl. Cryst. (2007). 40, 658-674)分子置換サーチの出発モデルとして使用した。ＣＤ７３サーチは、非対称単位に５分子を発見した。ＣＤ７３固定を維持して、重鎖サーチモデルは、非対称単位に２分子を発見した。ＣＤ７３および重鎖固定を維持して、軽鎖での第三のＰＨＡＳＥＲサーチもまた、非対称単位に２分子を発見した。５個の完全複合体の混成モデルを、５ＣＤ７３を重層し、重鎖および軽鎖を合わせることにより、部分溶液から製造した。これを、BUSTER(Bricogne et al. (2011) BUSTER version 2.11.6. Cambridge, United Kingdom: Global Phasing Ltd)改良の出発モデルとして使用した。
モデルは、改装され、アミノ酸は、１１Ｆ１１配列を反映するように帰られた。モデルは広範な手動モデル構築および改良に付された。計５個のＢＵＳＴＥＲ改良サイクルを、改良を完了するために行った。２７,４８４タンパク質原子および２４溶媒分子について、最終Ｒ−因子は２０.５９％(Ｒ−ｆｒｅｅ＝２４.５８％)であった。

【0661】

複合体の結晶構造を図２８Ａ〜Ｄに示す。
結晶構造は１個以外の全相互作用がＣＤＲ領域における残基由来であり、相互作用の大部分がＶ_Ｈドメイン由来で、Ｖ_Ｌドメインからのさらなる２つの相互作用を伴うことを示す(図２８Ａ)。ヒトＣＤ７３および１１Ｆ１１ Ｆａｂ’の相互作用残基を表３０に示す。

【表30】

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【表31】

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【0662】

ＣＤ７３二量体(ＰＤＢエントリー４Ｈ１Ｓ)に重ね合わせた２個のＣＤ７３(ＮＤＴ)／１１Ｆ１１複合体の複合構造に基づくモデルは、１１Ｆ１１が二量体境界面から離れたＣＤ７３上の表面に結合することを示唆し、Ｆａｂが二量体形成を妨害しないことを示唆する。
ｅ ＣＤ７３／１１Ｆ１１複合体のＨＤＸ−ＭＳマッピングおよびＸ線結果の比較は、ＣＤ７３(６５〜８３および１５７〜１７２)上の類似エピトープを示すという基本的一致があることを示す。しかしながら、Ｘ線構造は、Ｍｅｔ−１０５〜Ａｓｐ−１１１(Ｈ−結合〜Ａｒｇ−１０９およびＴｙｒ−１１０を含む)、Ｌｙｓ−１３５〜Ｐｒｏ−１３９およびＡｓｐ−３１７〜Ｉｌｅ−３２０(Ｈ−結合〜Ｓｅｒ−３１９を含む)の領域におけるさらなる相互作用(６Å未満)を示す。

【0663】

実施例１１：抗体／ＣＤ７３複合体のサイズに対する種々のヒンジ／Ｆｃの影響
上記実施例に示すように、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１を有する抗ＣＤ７３抗体は、細胞上のＣＤ７３酵素活性の良好な阻害剤であり、ＩｇＧ１ヒンジを有する同一抗体より良好に内在化する。この観察およびＩｇＧ２ヒンジがＩｇＧ１ヒンジより堅いとの事実に基づき、抗原とＩｇＧ２ヒンジを有する抗体の間で、ＩｇＧ１ヒンジを有する抗体に比して大きな複合体が形成されるとの仮説が立てられる。次の実験を、この仮説を分析するために実施した。
溶液中のＣＤ７３／抗体複合体の構造およびオリゴマー状態を、ＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳにより試験した。これらの実験に関して、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域を含む抗体を、種々のモル比で、Ｃ末端ポリヒスチジンタグを含むヒト−ＣＤ７３の完全長細胞外ドメイン(ヒト−ＣＤ７３のアミノ酸残基２６〜５４６、“ｈＣＤ７３−ｈｉｓ”と称す)またはヒト−ＣＤ７３のＮ末端ドメインに対応するフラグメント(アミノ酸残基２６〜３３６、“Ｎ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓ”と賞する)を含む組み換えタンパク質と混合した。
ＣＤ７３／抗体複合体のオリゴマー状態を、直列マルチアングル光散乱検出器と連結したサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ−ＭＡＬＳ)により試験した。定組成分離を、Prominence Shimadzu UFLCに連結したShodex PROTEIN KW-803カラムで、０.０２％Ｎａアジド(０.１μm濾過)を含む２００mM Ｋ_２ＨＰＯ_４、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６.８を含む緩衝液中、０.５mL／分で流して実施した。サンプルを、SIL-20AC Prominence Shimadzuオートサンプラーを使用してカラムに注入し、データを、連続的にProminence SPD-20ADダイオードアレイUV/vis分光光度計、続いてWyatt miniDAWN^TM TREOSマルチアングル光散乱検出器、次いでWyatt Optilab T-rEX屈折率検出器に連結した３オンライン検出器から得た。データを、Astra(Wyatt)およびLabsolutions(Shimadzu)ソフトウェアを使用して採取し、分析した。
動的光散乱(ＤＬＳ)試験を、Wyatt DynaProプレートリーダーで、３８４ウェルプレート中、２５℃で実施した。実験パラメータは、測定あたり各５秒の２０取得であり、測定値を４つ記録し、平均および標準偏差を報告する。強度自動補正機能を、力学ソフトウェア(Wyatt Technologies)における“正則化”アルゴリズムを使用して適合させた。

【0664】

ＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳの概要を図２９ＡおよびＢに示す。抗体単独の分析は、単量体モノクローナル抗体に典型的である、保持時間(約１６〜１７分)、質量(１４０〜１５０kDa)および流体力学的半径(５.０〜５.４nm)を各抗体について示した。ｈＣＤ７３−ｈｉｓタンパク質のデータは、溶液で予想される二量体構造を採るタンパク質と一致する；特に、ＳＥＣ−ＭＡＬＳデータ(１２０kDa)から決定された質量は、ＣＤ７３−ｈｉｓ二量体(１１７kDa)で予測されたものに一致し、ｈＣＤ７３−ｈｉｓモノマー(５８.５kDa)で予測されたものとは不一致である。Ｎ−ｈＣＤ７３のデータは、溶液で単量体である組み換えＮドメインタンパク質と一致し(ＳＥＣ−ＭＡＬＳ測定質量＝３８kDa、それに対する予測単量体質量＝３５.０kDa)、これは、タンパク質の二量体化を担う完全長ＣＤ７３細胞外ドメインの領域がＣ末端ドメイン内に含まれ、Ｎドメイン残基の寄与が無いことから予測される。
ある抗体とＮ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓの等モル量混合物は、ＳＥＣで単一種として溶出され、抗体またはＮ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓ単独よりも短い保持時間ならびにＤＬＳによる大きな流体力学的半径(Ｒｈ)を融資、これは、複合体の形成と一致する。ＭＡＬＳデータは、これらの複合体の質量を約２１０kDaと示す。これは、１Ｎ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓ分子がある抗体の２Ｆａｂドメインの各々に結合し、１：２抗体：Ｎ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓ複合体を形成することと一致する。

【0665】

抗ＣＤ７３抗体とｈＣＤ７３−ｈｉｓ二量体の混合物のＳＥＣ−ＭＡＬＳデータは、混合物がｈＣＤ７３−ｈｉｓまたは抗体単独より早く溶出し、複合体が形成されることを示唆する。同一可変領域を含むが、定常ドメインが異なるｍＡｂのデータの比較は、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ２定常ドメインを含むｍＡｂ(ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ、ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆ)の複合体の溶出時間が、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ１.１ｆ定常ドメインを含むｍＡｂの複合体より速いことを示す。さらに、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ２定常ドメインを含むｍＡｂの複合体のＭＡＬＳ決定質量は、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ１定常ドメインを含むｍＡｂの複合体より大きい。ＤＬＳデータは、さらにｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ２定常ドメインを含むｍＡｂの複合体の流体力学的半径が、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ１定常ドメインを含むｍＡｂの複合体より大きいことを示す。例えば、３個の異なる定常領域(ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ、ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆまたはＩｇＧ１.１ｆ)を有するＣＤ７３.４のＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳデータを図３０に示す。ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ２定常ドメインを含むＣＤ７３.４の複合体が、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＣＤ７３.４−ＩｇＧ１.１ｆの複合体と比較して、短い保持時間(図３０Ａ)、大きな流体力学的半径(図３０Ｂ)および大きなＭＡＬＳ決定質量(図３０Ｃ)を有することを示すことを見ることができる。ＭＡＬＳ質量に基づき、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとび抗体の間の複合体の構造および化学量論の図式モデルを図３０Ｄに示し、ここで、ＣＤ７３.４−ＩｇＧ１.１ｆを含む複合体が、小さな２：２(ピーク１＝〜５５０kDa)または４：４ ｍＡｂ／ＣＤ７３二量体複合体(ピーク２＝〜１３００kDa)を主に形成し、一方ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９ＳまたはＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆは、はるかに大きな複合体(＞３０００kDa)をｈＣＤ７３−ｈｉｓと形成しており、その厳密な構造および化学量論の信頼できるモデルはできなかった。

【0666】

表２６に示す重鎖定常領域を有するＣＤ７３.４抗体もまた形成複合体のサイズについて試験した。図３０Ｄに示すように、結果は、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインを有するものよりも、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを有する抗体と高次複合体が形成されることを示す。
ＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳデータをまとめると、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１領域(ＩｇＧ１.１ｆ)を含むものと比較して、ｈＣＤ７３−ｈｉｓと、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１領域(ＩｇＧ２−Ｃ２１９ＳまたはＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆ)を含むｍＡｂの間で大きな複合体が形成されることを示す。さらに、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを有する抗体は、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインより大きな複合体を形成する。

【0667】

実施例１２：抗体介在ＣＤ７３内在化の改善におけるＩｇＧ２ ＣＨ１およびヒンジにおけるあるアミノ酸残基の関連性
表３１に示す重鎖定常領域を有する抗ＣＤ７３抗体(ＣＤ７３.４)を製造し、上記抗体介在ＣＤ７３内在化アッセイにおけるように試験した。

【表32】

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【表33】

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【0668】

図３１に示す結果は、ＣＤ７３内在化に関して次の情報を提供する：
● ＣＨ２ドメインは、
○ ａ) 形式“ＫＨ”(ERKCCVECPPCPAPELLGG(配列番号２２))と比較して、形式“ＡＹ”(ＩｇＧ２ヒンジERKCCVECPPCPAPPVAG(配列番号８)を有する)を有する修飾重鎖定常領域を含む抗体で観察される内在化能の差異は微小であった(セット５、６および７)；
○ ｂ) ＣＨ２交換は、野生型Ｇ１またはＧ２で同等である(セット５および６)；および
○ ｃ)残基２３７は内在化に影響しない：ＩｇＧ２ヒンジへの“Ｇ”残基付加もＩｇＧ１ヒンジにおけるＣ末端“Ｇ”の欠失も、内在化に影響しない(セット９)
ことにより示されるように、影響を有しないように見える。

【0669】

これは、ＣＨ２ドメインは、内在化に影響しないことを示唆する(すなわち、ＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ１由来でもＩｇＧ２由来でもよい)；
● ＩｇＧ１におけるセット３(KRGEGSSNLF；KRGEGS；SNLF；ITNDRTPRおよびSNLFPR)に示されるＣＨ１領域のＩｇＧ２のものへの交換はほとんど利益を提供しない、すなわち、内在化は、ＩｇＧ１のものと類似のままである(セット３参照)；
● ＩｇＧ２におけるセット４(RKEGSGNSFL；RKEGSG；NSFL；TIDNTRRPおよびNSFLRP)に示されるＣＨ１領域のＩｇＧ１への交換の影響は、種々である：NSFLの交換は影響せず、一方他の２領域(RKEGSG＆RP)は、難解である(セット４参照)。セット３および４の結果に基づき、ＣＨ１領域とヒンジの間に相互作用があるように見栄、RKEGSGおよびRP領域がＮＳＦＬ領域よりも重要である；
● ヒンジ領域は内在化に影響する、すなわち、ＩｇＧ２のヒンジは、ＩｇＧ１のヒンジと比較して、良好な内在化を提供する(セット７および８参照)。さらに、欠失を有するＩｇＧ１(Ｇ１−デルタ−ヒンジ)は、ＩｇＧ１より内在化が改善される。欠失を有するＩｇＧ２(Ｇ２−デルタ−ヒンジ)は、ＩｇＧ２ヒンジと類似するレベルの内在化を提供する。これは、ヒンジ領域が内在化に影響し、この効果は、ＩｇＧ２ ＣＨ１により増強されることを示唆する(Ｇ２−Ｇ１−Ｇ２−Ｇ２−ＡＹはＧ１−Ｇ２−Ｇ１−Ｇ１−ＡＹと同等である)；
● ＩｇＧ２.４(Ｃ２２０Ｓ)は、ＩｇＧ２.３(Ｃ２１９Ｓ)と比較して、内在化が類似するか、減少する。ＩｇＧ２.３／４(Ｃ２１９Ｓ／Ｃ２２０Ｓ)は、ＩｇＧ２.３またはＩｇＧ２.４単独と比較して、内在化がはるかに減少する(セット１０参照)。これは、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣ２１９Ｓを有する抗体の内在化が、Ｃ２２０Ｓを有するＩｇＧ２ヒンジのものとほぼ同一であり、この両者が、Ｃ２１９ＳおよびＣ２２０Ｓの両者を有するＩｇＧ２ヒンジよりはるかに良好であることを示唆する；
● ＩｇＧ２.５(Ｃ１３１Ｓ変異)は、Ｃ１３１を有する構築物と比較して、内在化が減少している(セット１、６および７参照)。

【0670】

それゆえに、これらの結果は、ＣＨ１ドメインおよびヒンジが、両者とも抗体介在ＣＤ７３内在化に関係し、これらのドメインからのＩｇＧ２配列を有する抗体が、ＩｇＧ１からのこれらの領域を有する抗体と比較して、良好な有効性で内在化する。

【0671】

実施例１３：高分子量複合体からのＩｇＧ２ヒンジを有する抗体および／またはＣＨ１ドメイン
表２６に示す重鎖定常領域を有するＣＤ７３.４抗体も、実施例１１に記載のように、ＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳ実験により高分子量複合体の形成を試験した。
本研究における１６抗体中ＣＤ７３.４−ＩｇＧ１.１ｆ、ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ(ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２.３とも称す)およびＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆ(ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２.３Ｇ１.１ｆ−ＫＨとも称す)の３個は先に試験されていた。抗体単独のＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳデータは、単量体モノクローナル抗体で典型的な保持時間、質量および流体力学的半径を各抗体について示した。各抗体(５.５μM)とｈＣＤ７３−ｈｉｓ(５.５μM)の等モル量複合体は、抗体またはｈＣＤ７３−ｈｉｓ単独と比較して、全複合体で遅い保持時間を示し、複合体の形成を示す。１６複合体の各々のＳＥＣクロマトグラムデータの重層を、図３２Ａに示す。クロマトグラムデータを４つの別々のピークに分けることができ、これらを図３２Ｂに示す。ピーク１は、４：４ ｈＣＤ７３−ｈｉｓ：ｍＡｂ複合体より大きな質量当量を有する複合体を示唆するＭＡＬＳ決定質量を有する、最大種を示す。ピーク２は、約２：２ ｈＣＤ７３−ｈｉｓ：ｍＡｂ複合体の複合体を示唆するＭＡＬＳ決定質量をを有する、種を含む。ピーク３は、約１：１ ｈＣＤ７３−ｈｉｓ：ｍＡｂ複合体を示唆する低シグナルおよびＭＡＬＳ決定質量を有する小さい種である。ピーク４は、遊離抗体に一致するＭＡＬＳ決定質量を有するｍＡｂ単独の溶出に対応する。各種の相対的量を定量するために、各クロマトグラムの４ピークをピーク１(＜１２.９分)、ピーク２(１２.９〜１５.１分)、ピーク３(１５.１〜１６.７分)、ピーク４(１６.７〜１９.３分)として統合した。組込みはまた、あらゆる低分子量種を説明するために、ピーク５(＞１９.３分)と称する付加的な統合範囲も含み、これは、無視できることが判明した(全複合体の＜３.５％)。この組込みからの各種のパーセンテージを表３２にようやくする。全ての複合体は、類似する小さなパーセンテージのピーク３(約６〜９％)を含んだが、他のピークの量は種々であった。最も顕著なことは、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとｈＩｇＧ１からのＣＨ１ドメインを含む抗体の間の複合体が、小さな複合体(ピーク２)の顕著に大きなパーセンテージを占め、一方ｈＩｇＧ２からのＣＨ１ドメインを含むものは、大きな複合体(ピーク１)の大きなパーセンテージを占めることである(表３２および図３２Ｃ)。これは、高次複合体形成における、ヒンジ領域だけでなく、またＣＨ１ドメインの重要な役割を示唆する。

【0672】

【表34】

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【表35】

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【0673】

実施例１４：改変定常ドメインを有する抗体に対するＦｃ受容体結合
本実施例は、ＣＨ１およびＩｇＧ２のヒンジを含む修飾重鎖定常領域を有する抗体が、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むとき、ＦｃγＲに結合することを示す。
可変ドメインによる抗原結合に加えて、抗体は、Ｆｃガンマ受容体(ＦｃｇＲ)に、定常ドメインとの相互作用を介して結合できる。これらの相互作用は、抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)および抗体依存性細胞貪食(ＡＤＣＰ)のようなエフェクター機能に介在できる。エフェクター機能活性はＩｇＧ１アイソタイプで高いが、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４については、これらのアイソタイプがＦｃｇＲに親和性が低いため、エフェクター機能活性はきわめて低いかまたはない。さらに、ＩｇＧ１のエフェクター機能は、ＦｃｇＲ親和性および選択性を変えるために、定常領域内のアミノ酸残基の変異を介して修飾され得る。
Ｆｃガンマ受容体(ＦｃγＲまたはＦｃｇＲ)への抗体の結合を、Biacore表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)およびFortebio Biolayer Interferometry(ＢＬＩ)を含む、バイオセンサー技術を使用して試験した。ＳＰＲ試験を、Biacore T100装置(GE Healthcare)で２５℃で実施した。マウス抗６ｘＨｉｓ抗体からのＦａｂフラグメントを、約３０００RUの密度で、ＥＤＣ／ＮＨＳを使用してＣＭ５センサーチップ上に固定化した。種々のｈｉｓタグ付ＦｃｇＲ(７μg／ml)を、１０μl／分で３０秒の接触時間を使用してＣ末端ｈｉｓタグにより捕捉し、１.０μM抗体の結合を、１０mM ＮａＰＯ_４、１３０mM ＮａＣｌ、０.０５％ｐ２０(ＰＢＳ−Ｔ)、ｐＨ７.１のランニング緩衝液で評価した。これらの実験のために使用したＦｃｇＲは、ＣＤ６４(ＦｃｇＲＩ)、ＣＤ３２ａ−Ｈ１３１(ＦｃｇＲIIａ−Ｈ１３１)、ＣＤ３２ａ−Ｒ１３１(ＦｃｇＲIIａ−Ｒ１３１)、ＣＤ３２ｂ(ＦｃｇＲIIｂ)、ＣＤ１６ａ−Ｖ１５８(ＦｃｇＲIIIａ−Ｖ１５８)、ＣＤ１６ｂ−ＮＡ１(ＦｃｇＲIIIｂ−ＮＡ１)およびＣＤ１６Ｂ−ＮＡ２(ＦｃｇＲIIIｂ−ＮＡ２)を含む。ＢＬＩ実験を、Fortebio Octet RED装置(Pall, Fortebio)で、２５℃で、１０mM ＮａＰＯ_４、１３０mM ＮａＣｌ、０.０５％ｐ２０(ＰＢＳ−Ｔ)、ｐＨ７.１中実施した。抗体を、プロテインＡ被覆センサー上の非希釈発現上清から捕捉し、続いて１μM ｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８または０.１μM ｈＣＤ６４検体を結合した。

【0674】

まず、置換２６７Ｅ(ＳＥ)およびＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ(ＳＥＬＦ)、ならびにＶ４、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９およびＶ１２と称する変異Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７Ｄ、Ｅ２３３Ｄの種々の組み合わせを含む、修飾ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む抗体を製造した。これらの抗体の結合を、ＩｇＧ１ｆ、ＩｇＧ２.３(ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ)およびＩｇＧ４.１(ＩｇＧ４−Ｓ２２８Ｐ)抗体ならびに全てのＦｃｇＲへの結合を低減するように改変されているＩｇＧ１.１ｆ抗体との比較で、Biacore SPRにより試験した。図３３に示す結果は、ＩｇＧ１ｆ、ＩｇＧ２.３およびＩｇＧ４.１および変異ＩｇＧ１抗体の、ＳＥおよびＳＥＬＦへのＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ＣＤ３２ａ−Ｒ１３１およびＣＤ３２ｂ結合増加、ならびにＣＤ３２ａ−Ｈ１３１およびＣＤ３２ａ−Ｒ１３１を超えるＣＤ３２ｂへのＶ４、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９およびＶ１２変異体の増加した選択性を含む、予想されるＦｃｇＲ結合性質を示す(図３３)。
次セットの構築物を、エフェクター機能を、そうしなければエフェクター機能が陰性であるＩｇＧ２アイソタイプに操作するために使用した。この研究のために、上記変異を、ＩｇＧ２.３定常領域またはＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹと呼ばれるＩｇＧ２.３／ＩｇＧ１ｆハイブリッドにおいて導入した(表３３)。抗体を、上清として小規模で発現させ、Fortebio Octet BioLayer Interferometryバイオセンサーテクノロジーを使用して、ＦｃｇＲへの結合について試験した。抗体が上清に低濃度で存在するため、実験を、プロテインＡ被覆センサーを使用して上清から抗体を補足し、続いて溶液中のＦｃｇＲ検体を結合させることにより実施した。野生型ＩｇＧ１、ＳＥ、Ｐ２３８Ｄ、Ｖ４およびＶ１２抗体を含む精製および上清対照ＩｇＧ１ｆも比較のために入れ、これらの対照抗体の各々は、予想されるＦｃｇＲ結合性質を示した(図３４)。ＩｇＧ２.３抗体も予想される結合プロファイルを示し、ＣＤ３２ａ−Ｈ１３１にのみ明らかな結合を有した。しかしながら、ＩｇＧ２.３にＳ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７ＤまたはＥ２３３Ｄ変異を導入するための全変異は、対応する改変ＩｇＧ１ ｍＡｂのＦｃｇＲ親和性を反復できなかった(図３４)。対照的に、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ構築物は、ＩｇＧ２.３のＣＨ１およびヒンジ領域を保持しながら、野生型ＩｇＧ１のＦｃｇＲ結合性質を完全に保存できた。さらに、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７ＤおよびＥ２３３Ｄを含む全ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ変異体は、同一変異を含むＩｇＧ１版のｍＡｂと同等なＦｃｇＲ結合性質を示した(図３４)。これは、ＩｇＧ２のＣＨ１およびヒンジ領域を、野生型または変異体ＩｇＧ１のエフェクター機能と組み合わせて有する抗体のエンジニアリングが成功したことを示す。

【0675】

【表36】

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【0676】

このエンジニアリング戦略を、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ−Ｓ２６７Ｅ(ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７)、ならびにＩｇＧ２−Ｂ形態バリアント(ＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹおよびＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７)およびＩｇＧ１およびＩｇＧ２定常ドメインの種々の組み合わせを含む他のハイブリッド抗体で形式を合わせた他の抗体を産生し、Biacore SPRテクノロジーを使用してこれらの抗体の抗ｈｉｓ Ｆａｂ捕捉ｈｉｓタグ付ＦｃｇＲへの結合を試験することにより、さらに探索した。Octet上清データに一致して、ＳＰＲデータは、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹおよびＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７抗体が、Ａ形態ＩｇＧ２抗体(ＩｇＧ２.３)のＣＨ１およびヒンジ領域を含むにもかかわらず、それぞれＩｇＧ１ｆおよびＩｇＧ１ｆ−Ｓ２６７Ｅと同等なＦｃｇＲ結合性質を有することを示した(表３４)。同様のデータが、ＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹおよびＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７抗体を使用しても得られ、ＩｇＧ１ｆまたは修飾ＩｇＧ１ｆ様エフェクター機能を有する、Ｂ形態ＩｇＧ２抗体(Ｃ１３１Ｓ変異含有、ＩｇＧ２.５と称す)のエンジニアリングに成功したことを示した。ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７、ＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹまたはＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７定常領域を有するが、可変領域が異なる他のいくつかの抗体のデータは、このエンジニアリング戦略が、可変ドメインと無関係に広く他の抗体に適用可能であることを示した(表３４)。ＩｇＧ１ｆ様ＦｃｇＲ結合性質を示す他の構築物はＩｇＧ１−Ｇ２.３Ｇ１−ＡＹおよびＩｇＧ１デルタＴＨＴを含み、一方、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＫＨ、ＩｇＧ２.５Ｇ１−ＫＨ、ＩｇＧ２.３＋ＴＨＴ、ＩｇＧ２.５＋ＴＨＴおよびＩｇＧ２.３＋ＧＧＧ構築物を含む修飾定常領域構築物のいくつかは、ＩｇＧ１ｆ様ＦｃｇＲ結合性質を保持することができなかった(表３４)。

【0677】

【表37】

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【表38】

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【0678】

まとめて、これらのデータは、ヒンジ領域における保存的CPPCPAP(配列番号３８０)モチーフの直接的Ｃ末端のＩｇＧ１における配列が、ＦｃｇＲ介在エフェクター機能に寄与し、一方、ＩｇＧ１および修飾ＩｇＧ１のエフェクター機能と、ＩｇＧ２ ＣＨ１および／またはヒンジ領域を含む抗体の優れた内在化またはシグナル伝達性質を組み合わせることを可能とするために、抗体のＣＨ１およびヒンジの上部部分は、ＩｇＧ２または修飾ＩｇＧ２配列で置き換えてよい。

【0679】

均等物
当業者は、せいぜい日常的な実験を使用して、ここに記載の具体的態様の多くの均等物を認識し、または確認できる。このような均等物は、添付する特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【0680】

【表39】

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【表40】

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【0681】

【表41】

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【表42】

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【0682】

【表43】

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【表44】

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【0683】

【表45】

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【表46】

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【0684】

【表47】

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【表48】

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【0685】

【表49】

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【表50】

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【0686】

【表51】

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【表52】

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【0687】

【表53】

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【表54】

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【0688】

【表55】

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【表56】

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【0689】

【表57】

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【表58】

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【0690】

【表59】

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【表60】

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【0691】

【表61】

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【表62】

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【0692】

【表63】

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【表64】

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【0693】

【表65】

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【表66】

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【0694】

【表67】

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【表68】

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【0695】

【表69】

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【表70】

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【0696】

【表71】

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【表72】

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【0697】

【表73】

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【表74】

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【0698】

【表75】

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【表76】

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【0699】

【表77】

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【表78】

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【0700】

【表79】

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【表80】

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【0701】

【表81】

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【表82】

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【0702】

【表83】

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【表84】

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【0703】

【表85】

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【表86】

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【0704】

【表87】

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【表88】

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【0705】

【表89】

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【表90】

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【0706】

【表91】

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【表92】

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【0707】

【表93】

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【表94】

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【0708】

【表95】

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【表96】

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【0709】

【表97】

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【表98】

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【0710】

【表99】

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【表100】

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【0711】

【表101】

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【表102】

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【0712】

【表103】

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【表104】

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【表105】

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【0713】

配列表は、成熟可変領域および重鎖および軽鎖の配列を提供する(すなわち、配列はシグナルペプチドを含まない)。

【図1A】

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【図1B】

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【図2A】

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【図2B】

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【図3A】

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【図3B】

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【図4A】

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【図4B】

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【図5A】

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【図5B】

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【図6A】

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【図6B】

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【図7A】

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【図7B】

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【図8A】

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【図8B】

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【図9A】

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【図9B】

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【図10A】

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【図10B】

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【図11A】

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【図11B】

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【図12A】

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【図12B】

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【図13A】

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【図13B】

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【図14A】

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【図14B】

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【図15A】

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【図15B】

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【図16A】

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【図16B】

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【図17A】

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【図17B】

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【図18】

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【図19】

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【図20A1】

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【図20A2】

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【図20B1】

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【図20B2】

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【図20C1】

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【図20C2】

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【図20D1】

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【図20D2】

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【図20E】

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【図20F】

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【図21A1】

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【図21A2】

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【図21B1】

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【図21B2】

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【図22A1】

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【図22A2】

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【図22B1】

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【図22B2】

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【図22C】

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【図22D】

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【図23-1】

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【図23-2】

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【図23-3】

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【図23-4】

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【図23-5】

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【図23-6】

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【図23-7】

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【図23-8】

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【図24-1】

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【図24-2】

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【図24-3】

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【図24-4】

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【図25A】

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【図25B】

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【図26】

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【図27A】

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【図27B】

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【図28A】

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【図28B】

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【図28C】

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【図28D】

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【図29A】

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【図29B】

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【図30-1】

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【図30-2】

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【図31】

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【図32-1】

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【図32-2】

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【図33】

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【図34】

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【図35】

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【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]