特許 6805428 ＣＥＡＣＡＭ１に対するヒト化抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6805428

(24)【登録日】2020年12月8日

(45)【発行日】2021年1月6日

(54)【発明の名称】ＣＥＡＣＡＭ１に対するヒト化抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20201221BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20201221BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20201221BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20201221BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20201221BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20201221BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20201221BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20201221BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20201221BHJP

   A61P 13/10 20060101ALI20201221BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20201221BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20201221BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20201221BHJP

   A61P 13/08 20060101ALI20201221BHJP

   A61P 5/00 20060101ALI20201221BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20201221BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20201221BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20201221BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20201221BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20201221BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20201221BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20201221BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20201221BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20201221BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20201221BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28ZNA

   C07K16/18

   C12N15/13

   C07K16/46

   A61K39/395 N

   A61P43/00 111

   A61P35/00

   A61P17/00

   A61P1/04

   A61P13/10

   A61P11/00

   A61P1/18

   A61P15/00

   A61P13/08

   A61P5/00

   A61P19/00

   A61K47/18

   A61K47/26

   A61K45/00

   A61K38/00

   A61K39/395 D

   A61K35/17 Z

   A61P31/00

   A61K39/395 E

   A61K39/395 T

   G01N33/574 E

   !C12P21/08

   !C12N5/10

【請求項の数】19

【全頁数】51

(21)【出願番号】特願2016-560702(P2016-560702)

(86)(22)【出願日】2015年4月27日

(65)【公表番号】特表2017-522261(P2017-522261A)

(43)【公表日】2017年8月10日

(86)【国際出願番号】IL2015050433

(87)【国際公開番号】WO2015166484

(87)【国際公開日】20151105

【審査請求日】2018年3月29日

(31)【優先権主張番号】61/984,786

(32)【優先日】2014年4月27日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/099,155

(32)【優先日】2015年1月1日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】519449563

【氏名又は名称】フェイムウェイヴ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ベン‐モシェ，テヒラ

(72)【発明者】

【氏名】サピア，ヤイル

(72)【発明者】

【氏名】マンデル，イラナ

(72)【発明者】

【氏名】マーケル，ガル

(72)【発明者】

【氏名】シャハテル，ヤコブ

(72)【発明者】

【氏名】オルテンバーグ，ロナ

(72)【発明者】

【氏名】カー，フランシス ジョセフ

(72)【発明者】

【氏名】ホルゲート，ロバート ジョージ，イー

(72)【発明者】

【氏名】ジョーンズ，ティモシー デイビッド

【審査官】 太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／０５４３３１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／０５４３２０（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００

Ｃ１２Ｎ ５／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ａ６１Ｋ ３５／００

Ａ６１Ｋ ３８／００

Ａ６１Ｋ ３９／００

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｋ ４７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＣＥＡＣＡＭ１を特異的に認識し、
（ｉ）配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
（ｉｉ）配列番号３３、配列番号３４及び配列番号３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、
を含む、ヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその抗原結合断片。

【請求項2】

配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含む、請求項１に記載のヒト化ｍＡｂ。

【請求項3】

軽鎖カッパアイソタイプと、ＩｇＧ４アイソタイプ及びＩｇＧ１アイソタイプからなる群から選択される重鎖と、を含む、請求項１または２に記載のヒト化ｍＡｂ。

【請求項4】

配列番号５２に記載される軽鎖を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒト化ｍＡｂ。

【請求項5】

配列番号５３に記載される重鎖を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒト化ｍＡｂ。

【請求項6】

請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト化ｍＡｂ又はその抗原結合断片をコードする、単離ポリヌクレオチド。

【請求項7】

請求項６に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、プラスミド。

【請求項8】

治療有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト化ｍＡｂ又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と、を含む医薬組成物。

【請求項9】

ＣＥＡＣＡＭタンパク質の発現、活性化又は機能に関連する疾患又は障害の治療に使用するための、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記疾患又は障害が、細胞増殖性の疾患又は障害である、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記細胞増殖性の疾患又は障害が、黒色腫、結腸直腸癌、膀胱癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非小細胞肺腺癌（ＮＳＣＬＡ）、消化管癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌、胃癌、卵巣癌、骨髄腫及び子宮癌からなる群から選択される癌である、請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

（ｉ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト化ｍＡｂ、及び１〜１０ｍｇ／ｍｌの塩基性アミノ酸；
（ｉｉ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト化ｍＡｂ、及び１０〜１００ｍｇ／ｍｌの糖；
（ｉｉｉ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト化ｍＡｂ、及び０．０１〜１ｍｇ／ｍｌの界面活性剤；
（ｉｖ）１〜５０ｍｇ／ｍｌの請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト化ｍＡｂ、４〜６ｍｇ／ｍｌの塩基性アミノ酸、７０〜１００ｍｇ／ｍｌの糖及び０．１〜１ｍｇ／ｍｌの非アニオン性界面活性剤；又は
（ｖ）１０ｍｇ／ｍｌの請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト化ｍＡｂ、４．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン、８２ｍｇ／ｍｌのスクロース、及び０．２０ｍｇ／ｍｌのポリソルベート２０
を含む、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項13】

少なくとも１種類の追加の免疫調節物質をさらに含む、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項14】

請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト化ｍＡｂ又はその抗原結合断片を含む、癌の治療に使用するための医薬組成物であって、前記治療は、追加の免疫調節物質の投与を含む、医薬組成物。

【請求項15】

免疫調節物質を含む、癌の治療に使用するための医薬組成物であって、前記治療は、請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト化ｍＡｂ又はその抗原結合断片の投与を含む、医薬組成物。

【請求項16】

前記免疫調節物質が、抗ヒトプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ２抗体、活性化細胞傷害性リンパ球細胞、リンパ球活性化剤、並びにＲＡＦ／ＭＥＫ経路阻害剤からなる群から選択される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項17】

少なくとも１種類の請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト化ｍＡｂ又はその抗原結合断片を含む、診断用組成物。

【請求項18】

それを必要とする対象における癌を診断するための方法において使用するための請求項１７に記載の診断用組成物であって、
前記方法は、前記対象由来の生体試料又は前記対象から得られた生体試料を前記診断用組成物と接触させることを含み、
所定の閾値を超える複合体形成が前記対象における癌の指標となる、
診断用組成物。

【請求項19】

ＣＥＡＣＡＭ１の発現を決定するための方法であって、生体試料を請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト化ｍＡｂ又はその抗原結合断片と接触させることと、免疫複合体形成のレベルを測定することと、を含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、主に、ヒトＣＥＡＣＡＭ分子に特異的に結合することができるヒト化抗体に関する。より具体的には、本発明は、マウス由来のＣＤＲ並びに特定の復帰変異を有するヒト化重鎖領域及び軽鎖領域を含む、ＣＥＡＣＡＭ１に対する抗体に関する。

【背景技術】

【0002】

分化抗原群（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）６６ａ（ＣＤ６６ａ）としても知られている癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子ファミリーのメンバーであり、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属する。ＣＥＡＣＡＭ１は、活性化の際に、Ｔ細胞及びＮＫ細胞において上方制御され、その同種親和性相互作用は、リンパ球の細胞毒性作用の阻害につながる。いくつかのヒト腫瘍タイプの研究は、ＣＥＡＣＡＭ１経路の利用が腫瘍による免疫回避を可能にすることができることを示唆している。腫瘍の前臨床動物モデルにより、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によるＣＥＡＣＡＭ１相互作用の阻止が腫瘍に対する免疫反応を増強できることが示された。２０１３年に米国内で推定１，６６０，２９０人の新しい癌の症例及び５８０，３５０人の癌関連死が見られた。

【0003】

チェックポイント免疫療法の阻止は、癌治療のエキサイティングな新しい考えであると示されている。免疫チェックポイント経路は、自己寛容を維持し、生理的条件下で免疫系による損傷から組織を保護するために、連携して動作する共刺激分子及び阻害分子の範囲からなる。腫瘍は、免疫系を回避するために、特定のチェックポイント経路を利用する。したがって、かかる経路の阻害が、有望な抗癌治療戦略として浮上している（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．，２０１２，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，１２，２５２−２６４）。ＣＥＡＣＡＭ１阻止を介した抗腫瘍免疫療法は、原則的に任意の単一の腫瘍タイプに限定されるものではないが、いく種類かの組織学的に異なる腫瘍に対する治療的免疫反応を増強する活性を有し得る。

【0004】

抗細胞傷害性Ｔリンパ球４（ＣＴＬＡ−４）抗体のイピリムマブ（２０１１年に承認された）は、癌患者の治療に対する利点を示した最初の免疫療法剤であった（Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．３６４，ページ２５１７−２５２６）。この抗体は、Ｔ細胞への抗原提示中に阻害シグナルに干渉する。抗プログラム細胞死１（ＰＤ−１）抗体ペンブロリズマブ（２０１４年に承認された）は、Ｔ細胞が発現するＰＤ−１受容体の負の免疫調節シグナルを遮断する（Ｈａｍｉｄ，２０１３，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．２，ページ１３４−１４４）。ＰＤ−１／ＰＬ−Ｌ１軸の抗体を遮断することは、種々の腫瘍タイプを有する患者におけるいくつかの臨床試験で有望な結果を示している（Ｄｏｌａｎ ａｎｄ Ｇｕｐｔａ ２０１４，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｖｏｌ．２１，ページ２３１−２３７）。追加の抗ＰＤ−１剤が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療のために、２０１４年に規制当局の承認を求めて提出された。現在、多くの他の免疫チェックポイントを検討する研究が活発に行われており、その中には、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、ＣＤ １３７、ＯＸ４０（ＣＤ１３４とも呼ばれる）、及びキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）（Ｇｅｌａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｔｏｘｉｎｓ，Ｖｏｌ．６，ページ９１４−９３３）がある。

【0005】

ヒト化抗体は、そのタンパク質配列が、ヒトにおいて天然に産生された抗体変異体との類似性を高めるように改変された非ヒト種の抗体（例えば、マウスの抗体）である。「ヒト化」のプロセスは、通常、ヒトへの投与のために開発されたモノクローナル抗体に適用され、特異的な抗体を開発するプロセスが非ヒト（マウスなどの）免疫系での生成を伴う場合に実行される。このようにして産生された抗体のタンパク質配列は、ヒトにおいて天然に存在する抗体とは異なり、したがって、ヒト患者に投与した場合に免疫原性である。ヒト化抗体は、ヒト抗体に類似のタンパク質配列を有するが、非ヒトタンパク質の大きなストレッチを保有するキメラ抗体とは異なると考えられている。

【0006】

キメラ中間体を作製することなく、ヒト化抗体を産生することが可能である。ヒト化抗体の直接作製は、ヒト抗体の足場に適切なＣＤＲコードセグメント（所望の結合特性を担う）を挿入することによって達成することができ、このプロセスは、「ＣＤＲ移植」として知られている。一般的に、抗体が、マウス（又は別の非ヒト動物）において所望の特性を有するように開発された後に、その抗体のＣＤＲをコードするＤＮＡの配列を決定することができる。所望のＣＤＲの正確な配列が分かると、これらの配列は、ヒト抗体フレームワークのＤＮＡを含有する構築物に挿入される。

【0007】

本発明者らのＷＯ ２０１０／１２５５７１は、特定のハイブリドーマ細胞によって産生されるマウスモノクローナル抗体（ＭＲＧ−１）を開示している。ｍＡｂは、ＣＥＡＣＡＭ１に非常に選択的であり、ＣＥＡＣＡＭファミリーの他のメンバーと交差反応しない。本発明者らのＷＯ ２０１３／０５４３３１は、ＣＥＡＣＡＭ１にも非常に選択的なキメラ抗体（ＣＭ−１０）を開示している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

免疫療法の分野で進展はあるが、最終的には癌患者で持続する長期反応をもたらすために、より効果的で、より長く続き、新規標的を伴い、シグナル剤（ｓｉｇｎａｌ ａｇｅｎｔ）として、又は公知の療法と組み合わせて機能することができる新しい治療剤のニーズが絶えず存在する。より安全で、より強力であり、ＣＥＡＣＡＭタンパク質の発現又は活性化が関与する疾患の診断及び治療に使用することができる特定のＣＥＡＣＡＭタンパク質を認識するヒト化抗体を提供するニーズは満たされていない。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、ＣＥＡＣＡＭ１を認識したヒト化抗体を提供する。本発明の選択されたヒト化抗体は、その可変領域配列中の多数の特異的な「復帰変異」、すなわち、ヒト化配列からマウス配列に戻された変異を含有する。これらの復帰変異は、元の抗体の立体配座及び結合親和性の維持に重要な残基中で行われ、潜在的なＴ細胞エピトープの発生率が最も低いので、抗体に対する有害な免疫反応のリスクを最小限に抑える。

【0010】

所望の配向及び立体配座及びヒトフレームワークで、特定のＣＤＲ配列を有するＣＥＡＣＡＭ１を認識するヒト化ｍＡｂを産生するために、本発明の発明者らは、ＣＤＲ提示に影響を与える重要な残基をヒトフレームワーク内（ＣＤＲ配列の外）で同定し、抗体の免疫原性を最小限に抑えながら、ＣＤＲの正確な提示を回復するように、これらの重要な残基内に一連の変異を設計した。したがって、本発明は、初めて、ＣＥＡＣＡＭ１に対する高親和性、非免疫原性、高度に特異的なヒト化抗体を提供する。

【発明の効果】

【0011】

一態様によれば、本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ１を特異的に認識し、少なくとも抗原結合ドメインを含み、以下からなる群から選択される少なくとも１つの可変領域を含むヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片を提供する：（ｉ）それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに（ｉｉ）それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；その中の（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくとも１つは、ヒト配列からマウス配列への１〜２５個のアミノ酸残基の復帰変異を含有する。

【0012】

いくつかの実施形態によれば、本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ１を特異的に認識し、以下からなる群から選択される少なくとも１つの可変領域を含むヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片を提供する：（ｉ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３に記載のＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域アミノ酸配列、その中の重鎖可変領域アミノ酸配列は、フレームワーク配列中の１〜２５個のアミノ酸残基が配列番号５７と異なる；並びに（ｉｉ）配列番号４、配列番号５及び配列番号６に記載のＣＤＲ配列を含む軽鎖可変領域アミノ酸配列、その中の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、フレームワーク配列中の１〜１０個のアミノ酸残基が配列番号５８と異なる。

【0013】

特定の実施形態において、本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ１を特異的に認識し、以下を含むヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片を提供する：（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６に記載のＣＤＲ配列；（ｉｉ）３〜１３個のフレームワークアミノ酸残基が配列番号５７と異なる重鎖可変領域アミノ酸配列；並びに（ｉｉｉ）３〜５個のフレームワークアミノ酸残基が配列番号５８と異なる軽鎖可変領域アミノ酸配列。

【0014】

特定の実施形態によれば、重鎖可変領域アミノ酸配列は、フレームワーク配列中の３〜１３個のアミノ酸残基が配列番号５７と異なる。他の実施形態によれば、軽鎖可変領域アミノ酸配列は、フレームワーク配列中の３〜５個のアミノ酸残基が配列番号５８と異なる。

【0015】

他の実施形態によれば、本発明は、（ｉ）それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、かつ配列番号９に記載のアミノ酸配列と２〜９個のアミノ酸が異なるフレームワークアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；並びに／又は（ｉｉ）それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、かつ配列番号１３に記載のアミノ酸配列と２〜４個のアミノ酸が異なるフレームワークアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む非完全ヒト化モノクローナル抗体、並びにヒトＣＥＡＣＡＭ１を特異的に認識するその類似体、誘導体、及び抗原結合断片を提供する。

【0016】

いくつかの実施形態によれば、該ｍＡｂ配列は、マウス配列への１〜５０個の復帰変異を含む。他の実施形態によれば、該ｍＡｂ配列は、マウス配列への２〜３０個の復帰変異を含む。さらに他の実施形態によれば、該ｍＡｂ配列は、マウス配列への３〜２０個の復帰変異を含む。他の実施形態によれば、該ｍＡｂ配列は、マウス配列への４〜１５個の復帰変異を含む。他の実施形態によれば、該ｍＡｂ配列の重鎖は、マウス配列への１〜１５個の復帰変異を含む。他の実施形態によれば、該ｍＡｂ配列の軽鎖は、マウス配列への１〜１５個の復帰変異を含む。他の実施形態によれば、該ｍＡｂ配列の重鎖は、マウス配列への２〜９個の復帰変異を含み、該ｍＡｂ配列の軽鎖は、マウス配列への２〜４個の復帰変異を含む。

【0017】

いくつかの具体的な実施形態によれば、該ヒト化ｍＡｂは、配列番号５７に記載の重鎖配列中にヒト配列からマウス配列への１〜２５個の変異を含む。いくつかの実施形態によれば、該ヒト化ｍＡｂの重鎖は、配列番号５７のＶ１１、Ｒ３８、Ｍ４８、Ｖ６８、Ｍ７０、Ｒ７２、Ｔ７４、Ｓ７７、Ｒ８５、Ｒ８７、Ｔ９１、Ｙ９５及びＴ１１５からなる群から選択される残基に少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態によれば、配列番号５７中の少なくとも１つの復帰変異は、Ｖ１１Ｌ、Ｒ３８Ｋ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６８Ａ、Ｍ７０Ｌ、Ｒ７２Ａ、Ｔ７４Ｋ、Ｓ７７Ｎ、Ｒ８５Ｓ、Ｒ８７Ｔ、Ｔ９１Ｓ、Ｙ９５Ｆ及びＴ１１５Ｓからなる群から選択される。

【0018】

他のいくつかの具体的な実施形態によれば、該ヒト化ｍＡｂは、配列番号５８に記載の軽鎖配列中にヒト配列からマウス配列への１〜２５個の変異を含む。いくつかの実施形態によれば、該ヒト化ｍＡｂの軽鎖は、配列番号５８のＰ４４、Ｆ７１、Ｆ７３、Ｐ８０及びＹ８７からなる群から選択される残基中に少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態によれば、配列番号５８中の少なくとも１つの復帰変異は、Ｐ４４Ｖ、Ｆ７１Ｙ、Ｆ７３Ｌ、Ｐ８０Ｑ、及びＹ８７Ｆからなる群から選択される。

【0019】

いくつかの実施形態によれば、該ヒト化ｍＡｂの重鎖は、配列番号５７のＶ１１、Ｒ３８、Ｍ４８、Ｖ６８、Ｍ７０、Ｒ７２、Ｔ７４、Ｓ７７、Ｒ８５、Ｒ８７、Ｔ９１、Ｙ９５及びＴ１１５からなる群から選択される残基に少なくとも１つの変異を含み、該ヒト化ｍＡｂの軽鎖は、配列番号５８のＰ４４、Ｆ７１、Ｆ７３、Ｐ８０、及びＹ８７からなる群から選択される残基に少なくとも１つの変異を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0020】

いくつかの実施形態によれば、該ヒト化ｍＡｂの重鎖は、配列番号５７のＶ６８、Ｍ７０、Ｒ７２、Ｔ７４、Ｓ７７、Ｒ８５、Ｒ８７、Ｔ９１、及びＹ９５からなる群から選択される残基に少なくとも１つの変異を含み、該ヒト化ｍＡｂの軽鎖は、配列番号５８のＦ７１、Ｆ７３、Ｐ８０及びＹ８７からなる群から選択される残基に少なくとも１つの変異を含む。それぞれの可能性は本発明の別の実施形態を表す。

【0021】

いくつかの実施形態によれば、配列番号５７の少なくとも１つの復帰変異は、Ｖ１１Ｌ、Ｒ３８Ｋ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６８Ａ、Ｍ７０Ｌ、Ｒ７２Ａ、Ｔ７４Ｋ、Ｓ７７Ｎ、Ｒ８５Ｓ、Ｒ８７Ｔ、Ｔ９１Ｓ、Ｙ９５Ｆ及びＴ１１５Ｓからなる群から選択され、配列番号５８の少なくとも１つの復帰変異は、Ｐ４４Ｖ、Ｆ７１Ｙ、Ｆ７３Ｌ、Ｐ８０Ｑ、及びＹ８７Ｆからなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0022】

いくつかの実施形態によれば、配列番号５７の少なくとも１つの復帰変異は、Ｖ６８Ａ、Ｍ７０Ｌ、Ｒ７２Ａ、Ｔ７４Ｋ、Ｓ７７Ｎ、Ｒ８５Ｓ、Ｒ８７Ｔ、Ｔ９１Ｓ、及びＹ９５Ｆからなる群から選択され、配列番号５８の少なくとも１つの復帰変異は、Ｆ７１Ｙ、Ｆ７３Ｌ、Ｐ８０Ｑ、及びＹ８７Ｆからなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0023】

いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号１２、及び配列番号２３からなる群から選択される配列に記載の少なくとも１つの重鎖フレームワーク配列を含む。いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２からなる群から選択される配列に記載の重鎖フレームワーク配列を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0024】

いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号７又は配列番号１５；配列番号１６又は配列番号１７；配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１又は配列番号２２；及び配列番号１０又は配列番号２３に記載の重鎖フレームワーク配列を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0025】

いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択される配列に記載の重鎖可変領域配列を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの具体的な実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号３２に記載の重鎖可変領域配列を含む。

【0026】

いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７からなる群から選択される配列に記載の軽鎖フレームワーク配列を含む。

【0027】

いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７からなる群から選択される配列に記載の軽鎖フレームワーク配列を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0028】

いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号１１；配列番号２４；配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７；並びに配列番号１４からなる群から選択される配列に記載の軽鎖フレームワーク配列を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0029】

いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号３３、配列番号３４及び配列番号３５からなる群から選択される配列に記載の軽鎖可変領域配列を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの具体的な実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号３４に記載の軽鎖可変領域配列を含む。

【0030】

特定の実施形態において、該モノクローナル抗体は、（ｉ）配列番号７又は配列番号１５；配列番号１６又は配列番号１７；配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１又は配列番号２２；及び配列番号１０又は配列番号２３に記載の重鎖フレームワーク配列、並びに（ｉｉ）配列番号１１；配列番号２４；配列番号２５、配列番号２６又は配列番号２７；及び配列番号１４に記載の軽鎖フレームワーク配列を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0031】

いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１又は配列番号３２に記載の重鎖可変領域配列；及び配列番号３３、配列番号３４又は配列番号３５に記載の軽鎖可変領域配列を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号３２に記載の重鎖可変領域配列、及び配列番号３４に記載の軽鎖可変領域配列を含む。

【0032】

いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号２８に記載の重鎖可変領域配列、及び配列番号３３に記載の軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号２９に記載の重鎖可変領域配列、及び配列番号３３に記載の軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号３０に記載の重鎖可変領域配列、及び配列番号３３に記載の軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号３１に記載の重鎖可変領域配列、及び配列番号３３に記載の軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号３２に記載の重鎖可変領域配列、及び配列番号３３に記載の軽鎖可変領域配列を含む。

【0033】

いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号２８に記載の重鎖可変領域配列、及び配列番号３４に記載の軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号２９に記載の重鎖可変領域配列、及び配列番号３４に記載の軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号３０に記載の重鎖可変領域配列、及び配列番号３４に記載の軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号３１に記載の重鎖可変領域配列、及び配列番号３４に記載の軽鎖可変領域配列を含む。

【0034】

いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号２８に記載の重鎖可変領域配列、及び配列番号３５に記載の軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号２９に記載の重鎖可変領域配列、及び配列番号３５に記載の軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号３０に記載の重鎖可変領域配列、及び配列番号３５に記載の軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号３１に記載の重鎖可変領域配列、及び配列番号３５に記載の軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は、配列番号３２に記載の重鎖可変領域配列、及び配列番号３５に記載の軽鎖可変領域配列を含む。

【0035】

いくつかの実施形態によれば、該ヒト化ｍＡｂの重鎖は、ＩｇＧ４及びＩｇＧ１アイソタイプから選択される。いくつかの実施形態によれば、該ヒト化ｍＡｂの重鎖はＩｇＧ４アイソタイプである。いくつかの実施形態によれば、該ヒトｍＡｂの軽鎖はカッパアイソタイプである。いくつかの具体的な実施形態によれば、該ヒト化ｍＡｂは、軽鎖カッパアイソタイプ及び重鎖ＩｇＧ４アイソタイプを含む。他の具体的な実施形態によれば、該ヒト化ｍＡｂは、軽鎖カッパアイソタイプ及び重鎖ＩｇＧ１アイソタイプを含む。

【0036】

いくつかの実施形態によれば、該ｍＡｂは、配列番号５２に記載の軽鎖を含む。いくつかの実施形態によれば、該ｍＡｂは、配列番号５３又は配列番号５９に記載の重鎖を含む。いくつかの実施形態によれば、該ｍＡｂは、配列番号５２に記載の軽鎖及び配列番号５３に記載の重鎖を含む。いくつかの実施形態によれば、該ｍＡｂは、配列番号５２に記載の軽鎖及び配列番号５９に記載の重鎖を含む。

【0037】

いくつかの実施形態によれば、該ｍＡｂは、配列番号５８に記載の軽鎖可変領域及び配列番号５３に記載の重鎖を含む。いくつかの実施形態によれば、該ｍＡｂは、配列番号５８に記載の軽鎖可変領域及び配列番号５９に記載の重鎖を含む。いくつかの実施形態によれば、該ｍＡｂは、配列番号５２に記載の軽鎖及び配列番号５７に記載の重鎖可変領域を含む。

【0038】

本発明は、配列番号５８に記載の軽鎖可変領域及び配列番号５７に記載の重鎖可変領域を含むｍＡｂも提供する。

【0039】

いくつかの実施形態において、該ヒト化ｍＡｂ又はその抗原結合断片は、少なくとも約１０^−８Ｍの親和性でヒトＣＥＡＣＡＭ１タンパク質に結合することができる。いくつかの実施形態において、該ヒト化ｍＡｂ又はその抗原結合断片は、少なくとも約５×１０^−７Ｍの親和性で、ヒトＣＥＡＣＡＭ３及びヒトＣＥＡＣＡＭ５タンパク質のうちの少なくとも１つに結合することができる。

【0040】

本発明はさらに、別の態様において、上記モノクローナル抗体の抗原結合断片と少なくとも９０％の配列同一性を有する、上記のモノクローナル抗体の類似体及び／又は誘導体を提供する。

【0041】

ＣＥＡＣＡＭ１を認識し、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むｍＡｂの断片も、上記で定義されたＣＤＲ配列及びヒト配列からマウス配列への少なくとも１つの復帰変異を含む限り、本発明の範囲内に含まれる。

【0042】

本発明はさらに、別の態様において、ヒトＣＥＡＣＡＭ１を特異的に認識する、上記のモノクローナル抗体をコードする単離ポリヌクレオチド又はその断片を提供する。

【0043】

いくつかの実施形態において、該単離ポリヌクレオチド配列は、ヒト化ｍＡｂ可変領域をコードする配列番号４４〜５１のいずれか１つに記載のＤＮＡ配列、又は上記配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体を含む。いくつかの実施形態において、該単離ポリヌクレオチド配列は、ヒト化ｍＡｂの重鎖をコードする配列番号５４又は配列番号５５に記載のＤＮＡ配列、又は上記配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体を含む。いくつかの実施形態において、該単離ポリヌクレオチド配列は、ヒト化ｍＡｂの軽鎖をコードする配列番号５６に記載のＤＮＡ配列、又は上記配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体を含む。

【0044】

本発明はさらに、別の態様において、上記の単離ポリヌクレオチドを含むプラスミドを提供する。

【0045】

本発明はさらに、別の態様において、治療有効量の上記のモノクローナル抗体、及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

【0046】

いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は、１〜５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡＣＡＭ１に対するヒト化ｍＡｂを含む。いくつかの実施形態によれば、該該医薬組成物は、塩基性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は糖を含む。いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は界面活性剤を含む。いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は、塩基性アミノ酸、糖及び界面活性剤を含む。いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は、（ｉ）１〜１０ｍｇ／ｍｌの塩基性アミノ酸、（ｉｉ）１０／１００ｍｇ／ｍｌの糖、（ｉｉｉ）０．０１〜１ｍｇ／ｍｌの界面活性剤、（ｉｖ）１〜５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡＣＡＭ１に対するヒト化ｍＡｂ、４〜６ｍｇ／ｍｌの塩基性アミノ酸、７０〜１００ｍｇ／ｍｌの糖及び０．１〜１ｍｇ／ｍｌの非アニオン性界面活性剤、又は（ｖ）１０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡＣＡＭ１に対するヒト化ｍＡｂ、４．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン、８２ｍｇ／ｍｌのスクロース、及び０．２０ｍｇ／ｍｌのポリソルベート２０を含む。

【0047】

いくつかの実施形態によれば、該塩基性アミノ酸は、ヒスチジン、アルギニン、リジン及びオルニチンからなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、該組成物は、１〜１０、２〜９、３〜７又は４〜６ｍｇ／ｍｌの塩基性アミノ酸を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0048】

いくつかの実施形態によれば、該糖は、スクロース、トレハロース、グルコース、デキストロース及びマルトースからなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、該組成物は、１０〜２００、１０〜１００、５０〜１５０又は７０〜１００ｍｇ／ｍｌの糖を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0049】

さらに他の実施形態によれば、該組成物は、マンニトール及びソルビトールを含むがこれらに限定されないポリオールを含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0050】

いくつかの実施形態によれば、該界面活性剤は非アニオン性である。いくつかの実施形態によれば、該界面活性剤は、ポリソルベート、ソルビタンエステル及びポロキサマーからなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、該界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０からなる群から選択される。それぞれの可能性は本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、該組成物は、０．０１〜１０、０．０１〜１、０．０５〜５又は０．１〜１ｍｇ／ｍｌの界面活性剤を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は、４〜６ｍｇ／ｍｌの塩基性アミノ酸、７０〜１００ｍｇ／ｍｌの糖及び０．１〜１ｍｇ／ｍｌの界面活性剤を含む。

【0051】

いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は液体形態であり、マウス配列への少なくとも１つの復帰変異を含む、１〜５０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡＣＡＭ１に対するヒト化ｍＡｂを含む。他の実施形態によれば、該医薬組成物が凍結乾燥される。いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は、１０ｍｇ／ｍｌのＣＥＡＣＡＭ１に対するヒト化ｍＡｂ、４．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン、８２ｍｇ／ｍｌのスクロース及び０．２０ｍｇ／ｍｌのポリソルベート２０を含む。

【0052】

いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は、上記で定義された少なくとも１種類のヒト化ｍＡｂもしくは断片、及び追加の免疫調節物質又はキナーゼ阻害剤を含む。いくつかの実施形態によれば、上記で定義された少なくとも１種類のヒト化ｍＡｂもしくは断片を含む医薬組成物、及び追加の免疫調節物質又はキナーゼ阻害剤を含む医薬組成物は、別々の投与により癌の治療に使用される。

【0053】

いくつかの具体的な実施形態によれば、該追加の免疫調節物質は、抗ヒトプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２の抗体、活性化細胞傷害性リンパ球細胞、リンパ球活性化剤、並びにＲＡＦ／ＭＥＫ経路阻害剤からなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの具体的な実施形態によれば、該追加の免疫調節物質は、ＰＤ−１に対するｍＡｂ、ＰＤ−Ｌ１に対するｍＡｂ、ＰＤ−Ｌ２に対するｍＡｂ、インターロイキン２（ＩＬ−２）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞からなる群から選択される。

【0054】

いくつかの実施形態によれば、本発明は、別々の投与による癌の治療に使用するための、上記で定義された復帰変異を含有するヒト化ｍＡｂ又はその抗原結合断片を含む医薬組成物、並びにヒトプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２のうちの少なくとも１つに対するｍＡｂ又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を提供する。

【0055】

他の実施形態によれば、上記で定義したＣＥＡＣＡＭに対するヒト化ｍＡｂ又はその抗原結合断片、及び活性化細胞傷害性リンパ球細胞を含む医薬組成物が提供される。特定の実施形態において、該活性化細胞傷害性リンパ球細胞は、ＬＡＫ細胞、ＣＩＫ細胞、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。特定の実施形態において、該活性化細胞傷害性リンパ球細胞は、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞である。

【0056】

他の実施形態において、該医薬組成物は、ＣＥＡＣＡＭ１に対するヒト化ｍＡｂ又はその抗原結合断片、及びリンパ球活性化剤又はその断片、類似体もしくは融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、該リンパ球活性化剤は、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、抗ＣＤ３抗体及びその断片、類似体又は融合タンパク質からなる群から選択される。特定の実施形態において、該リンパ球活性化剤は、ＩＬ−２又はその断片、類似体もしくは融合タンパク質である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0057】

さらに他の実施形態において、該医薬組成物は、Ｂ−Ｒａｆキナーゼ変異体、ＭＥＫ１キナーゼ及びＭＥＫ２キナーゼ、並びに上記で定義されたヒトＣＥＡＣＡＭ１に対するヒト化ｍＡｂ又はその抗原結合断片からなる群から選択されるキナーゼの阻害剤を含む。

【0058】

いくつかの具体的な実施形態によれば、Ｂ−Ｒａｆキナーゼ阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆキナーゼ変異体によるＭＥＫ１もしくはＭＥＫ２のリン酸化を減弱するか、又は阻止する。特定の実施形態において、Ｂ−Ｒａｆキナーゼ阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆキナーゼ変異体の二量体化を減弱するか、又は阻止する。特定の実施形態において、ＭＥＫ１キナーゼ阻害剤は、ＭＥＫ１キナーゼによるＭＡＰＫのリン酸化を減弱するか、又は阻止する。特定の実施形態において、ＭＥＫ２キナーゼ阻害剤は、ＭＥＫ２キナーゼによるＭＡＰＫのリン酸化を減弱するか、又は阻止する。

【0059】

本発明はさらに、他の実施形態によれば、癌の治療に使用するためのＢ−Ｒａｆキナーゼ変異体、ＭＥＫ１キナーゼ及びＭＥＫ２キナーゼからなる群から選択されるキナーゼの阻害剤、並びにヒトＣＥＡＣＡＭ１に対するヒト化ｍＡｂ又はその抗原結合断片を提供する。２種類の活性成分は、１種類の医薬組成物、又は同時もしくは別々の投与によって投与することができる別々の医薬組成物の一部であり得る。

【0060】

本発明のＣＥＡＣＡＭ１に対するヒト化ｍＡｂ及び追加の免疫調節物質は、１種類の医薬組成物、又は同時もしくは別々の投与用の別々の組成物中に含有され得る。

【0061】

いくつかの実施形態において、該医薬組成物は、ＣＥＡＣＡＭ１を含むがこれに限定されない、ＣＥＡＣＡＭタンパク質ファミリーメンバーの発現、活性化又は機能に関連する疾患又は障害の治療のためのものである。それぞれの可能性は本発明の別の実施形態を表す。

【0062】

いくつかの実施形態において、該医薬組成物は、ＣＥＡＣＡＭ１の発現、活性化もしくは機能に関連する疾患又は障害の治療のためのものである。いくつかの実施形態において、この疾患又は障害は、細胞増殖性の疾患又は障害である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、この細胞増殖性の疾患又は障害は、癌である。

【0063】

いくつかの実施形態によれば、癌は、黒色腫、結腸直腸癌、膀胱癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非小細胞肺腺癌（ＮＳＣＬＡ）、消化管癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌、胃癌、卵巣癌、骨髄腫及び子宮癌からなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0064】

本発明はさらに、別の態様において、上記のように、ヒトＣＥＡＣＡＭ１を特異的に認識する少なくとも１種類のヒト化ｍＡｂ又はその断片を含む診断用組成物を提供する。

【0065】

本発明はさらに、別の態様において、ＣＥＡＣＡＭ１タンパク質の発現、活性化もしくは機能に関連する疾患又は障害を防止するか、減弱するか、又は治療する方法であって、上記の治療有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。

【0066】

いくつかの実施形態において、この疾患又は障害は癌である。いくつかの実施形態において、この疾患又は障害は、感染症、例えば、ウイルス感染症である。

【0067】

いくつかの実施形態において、該医薬組成物中に含有される単離抗体は、細胞傷害性部分に結合される。

【0068】

特定の実施形態において、上記の方法は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲のＣＥＡＣＡＭ１に対するヒト化ｍＡｂの少なくとも１用量を対象に投与することを含む。特定の実施形態において、上記の方法は、（ｉ）同一又は異なる複数用量のヒト化ｍＡｂ、（ｉｉ）複数の漸増用量；又は（ｉｉｉ）該医薬組成物を、週に１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、又は５週に１回投与することを含む。特定の実施形態において、上記の方法は、１〜１０回の投与サイクルを含み、各サイクルは、１〜４週ごとに２〜５回のヒト化ｍＡｂの注入を含み、各サイクルの間に２〜８週の間隔があく。

【0069】

特定の実施形態において、上記の方法はさらに、１つのリンパ球細胞又は複数のリンパ球細胞の投与を含む。いくつかの実施形態において、上記の方法はさらに、ＣＥＡＣＡＭ１発現リンパ球を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、リンパ球は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、リンパ球細胞はＣＥＡＣＡＭ１、ＰＤ−１、又はその両方を発現する。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。特定のこのような実施形態において、リンパ球細胞はＣＥＡＣＡＭ１及びＰＤ−１を発現する。いくつかの実施形態において、リンパ球細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、サイトカイン誘発性キラー（ＣＩＫ）細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。特定のこのような実施形態において、リンパ球細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）細胞及びリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞からなる群から選択される。特定のこのような実施形態において、リンパ球細胞は、１個の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）細胞又は複数のＴＩＬ細胞である。特定のこのような実施形態において、リンパ球細胞は、１個のリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞又は複数のＬＡＫ細胞である。特定の実施形態において、リンパ球細胞は活性化される。いくつかの実施形態において、リンパ球細胞は、癌細胞に対して細胞傷害性である。いくつかの実施形態において、癌細胞は、ＣＥＡＣＡＭ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、又はそれらの任意の組み合わせを発現する。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、癌細胞はＣＥＡＣＡＭ１、ＰＤ−Ｌ１、又はその両方を発現する。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、癌細胞は、ＣＥＡＣＡＭ１、ＰＤ−Ｌ２、又はその両方を発現する。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。特定のこのような実施形態において、癌細胞は、ＣＥＡＣＡＭ１及びＰＤ−Ｌ１並びにＰＤ−Ｌ２を発現する。

【0070】

特定の実施形態において、上記の方法はさらに、リンパ球活性化剤を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態によれば、リンパ球活性化剤は、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、及び抗ＣＤ３抗体からなる群から選択される。特定の実施形態において、上記の方法はさらに、追加の抗癌組成物を対象に投与することを含む。

【0071】

本発明はさらに、別の態様において、免疫調節の方法であって、上記の抗体又はその断片とＣＥＡＣＡＭ１発現リンパ球とを接触させることを含む方法を提供する。

【0072】

本発明はさらに、別の態様において、ＣＥＡＣＡＭ１発現腫瘍細胞の遊走を阻害する方法であって、上記の抗体又はその断片と上記ＣＥＡＣＡＭ１発現腫瘍細胞とを接触させ、それによって上記ＣＥＡＣＡＭ１発現腫瘍細胞の遊走を阻害することを含む方法を提供する。

【0073】

本発明はさらに、別の態様において、ＣＥＡＣＡＭ１の同型又は異型タンパク質間相互作用を阻害する方法であって、上記の抗体又はその断片とＣＥＡＣＡＭ１発現リンパ球とを接触させ、それによってＣＥＡＣＡＭ１の同型又は異型タンパク質間相互作用を阻害することを含む方法を提供する。

【0074】

本発明はさらに、別の態様において、癌を有する対象の反応もしくは生存の期間又は進行を増加させる方法であって、上記のモノクローナル抗体を含む有効量の組成物、及び抗腫瘍組成物を該対象に投与することを含み、上記抗腫瘍組成物は少なくとも１種類の化学療法剤を含み、それによって該抗体及び該抗腫瘍組成物の同時投与が、生存の期間又は進行を効率的に増加させることを含む方法を提供する。

【0075】

本発明の方法は、追加の抗癌組成物と共に上記で定義した医薬組成物を投与することを含み得る。特定の実施形態によれば、該抗癌組成物は、少なくとも１つの化学療法剤を含む。他の特定の実施形態によれば、該抗癌組成物は免疫調節剤を含む。本発明の抗体と共に又は別々に投与することができる抗癌剤は、抗癌活性を示す、当該技術分野で公知の任意のかかる薬剤を含み得る。

【0076】

いくつかの実施形態によれば、癌を治療する方法であって、ＣＥＡＣＡＭ１を認識し、マウス配列への復帰変異を含むヒト化抗体を含む医薬組成物、及び追加の免疫調節物質又はキナーゼ阻害剤を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。

【0077】

いくつかの実施形態によれば、該免疫調節物質は、ＰＤ−１に対するｍＡｂ、ＰＤ−Ｌ１に対するｍＡｂ、ＰＤ−Ｌ２に対するｍＡｂ、インターロイキン２（ＩＬ−２）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞からなる群から選択され、該キナーゼ阻害剤は、Ｂ−Ｒａｆ／ＭＥＫ阻害剤である。

【0078】

いくつかの実施形態において、本方法は、２種類以上の医薬組成物の投与を含む。いくつかの実施形態において、該医薬組成物の２種類以上の投与は同時に行われる。本方法のいくつかの実施形態において、該医薬組成物の２種類以上の投与は順次行われる。本方法のいくつかの実施形態において、追加の免疫調節物質は、ヒトＣＥＡＣＡＭ１に対するヒト化ｍＡｂ又はその抗原結合断片の前に投与される。本方法のいくつかの実施形態において、該免疫調節物質は、ヒトＣＥＡＣＡＭ１に対するｍＡｂ又はその抗原結合断片と同時に投与される。本方法のいくつかの実施形態において、該免疫調節物質は、ヒトＣＥＡＣＡＭ１に対するヒト化ｍＡｂ又はその抗原結合断片の後に投与される。

【0079】

いくつかの実施形態において、本方法は、ヒトＣＥＡＣＡＭ１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物、及びヒトＰＤ−１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を上記患者に投与することを含む。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0080】

さらに他の実施形態によれば、癌を有する患者を治療する上記の方法は、Ｂ−Ｒａｆキナーゼ変異体、ＭＥＫ１キナーゼ及びＭＥＫ２キナーゼからなる群から選択されるキナーゼの阻害剤を含む医薬組成物、並びにヒトＣＥＡＣＡＭ１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を該患者に投与し、その癌細胞がＢ−Ｒａｆキナーゼ変異体を発現することによって、癌を治療する工程を含む。

【0081】

いくつかの実施形態において、癌を治療するための上記の方法は、さらに、リンパ球細胞を含む医薬組成物を上記患者に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、リンパ球細胞を含む医薬組成物の投与は、抗体を含む医薬組成物のうちの少なくとも１種類と同時に行われる。本方法のいくつかの実施形態において、２種類以上の医薬組成物の投与は、順次行われる。

【0082】

いくつかの実施形態において、リンパ球細胞は、ヒトＣＥＡＣＡＭ１に対するヒト化ｍＡｂと、その抗原結合断片と、又は追加の免疫調節物質と予めインキュベートされる。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0083】

本発明の医薬組成物は、鼻腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、関節内投与、病巣内投与、経口投与、又は局所投与などの任意の適切な手段によって投与され得る。いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は、非経口投与される。いくつかの具体的な実施形態によれば、静脈内（ｉｖ）投与が利用される。

【0084】

癌又は他のＣＥＡＣＡＭ１関連疾患又は障害を治療する本発明の方法は、いくつかの実施形態によれば、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲のＣＥＡＣＡＭ１に対するヒト化ｍＡｂの少なくとも１用量を、それを必要とする対象に投与することを含む。

【0085】

いくつかの実施形態によれば、この少なくとも１用量は、０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ；１〜１０ｍｇ／ｋｇ；及び１０〜５０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される。

【0086】

いくつかの実施形態によれば、本方法はヒト化ｍＡｂの複数用量の投与を含み、この複数用量は同一又は異なる。いくつかの実施形態によれば、本方法は、複数の漸増用量を投与することを含む。いくつかの実施形態によれば、本方法は、少なくとも１２週間の投与の少なくとも１サイクルを含む。

【0087】

他の実施形態によれば、治療期間は１２〜５０週間である。いくつかの具体的な実施形態によれば、治療期間は、１２〜２０週、２０〜３０週及び３０〜５０週からなる群から選択される。さらに他の実施形態によれば、治療レジメンは、それぞれ少なくとも１２週間にいくつかの投与サイクルを含む。

【0088】

いくつかの実施形態によれば、該治療レジメンは、１〜８サイクルを含み、各サイクルは、少なくとも４週間にヒト化抗ＣＥＡＣＡＭのｍＡｂの４回の注入を含む。いくつかの実施形態によれば、該治療レジメンは、２〜６サイクルを含む。

【0089】

いくつかの実施形態によれば、投与は、週に１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、又は５週に１回である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。

【0090】

いくつかの実施形態によれば、治療レジメンは、１〜１０サイクルを含み、各サイクルは、１〜４週ごとに２〜５回の本発明のヒト化ｍＡｂの注入を含み、各サイクルの間に２〜８週の間隔があく。

【0091】

いくつかの実施形態によれば、０．０１ｍｇ／ｋｇから始めて、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇと続く投与を含む用量漸増レジメンが提供される。さらに他の実施形態によれば、該治療レジメンは、それぞれ２週間ごとに投与される４回の注入の６サイクルを含む。

【0092】

本発明はさらに、別の態様において、それを必要とする対象の癌を診断する方法であって、上記対象由来の、又は上記対象から得られた生体試料と上記の診断用組成物とを接触させることを含み、所定の閾値を超える複合体形成が上記対象の癌の指標となる方法を提供する。

【0093】

本発明はさらに、別の態様において、ＣＥＡＣＡＭ１の発現を決定する方法であって、上記の抗体又はその断片と生体試料とを接触させ、免疫複合体形成のレベルを測定することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本方法は、既知量のＣＥＡＣＡＭ１から得られた標準曲線と上記免疫複合体のレベルを比較することを含む。

【0094】

本発明はさらに、別の態様において、ＣＥＡＣＡＭタンパク質発現に関連する疾患又は障害を診断する方法であって、上記のようにモノクローナル抗体と生体試料をインキュベートする工程；検出可能なプローブを使用して結合したＣＥＡＣＡＭタンパク質を検出する工程；既知量のＣＥＡＣＡＭタンパク質を含有する参照試料から得られた標準曲線と結合ＣＥＡＣＡＭタンパク質の量を比較する工程；その標準曲線から生体試料中のＣＥＡＣＡＭタンパク質の量を計算する工程；かつ通常のＣＥＡＣＡＭタンパク質の量とＣＥＡＣＡＭタンパク質の量を比較する工程を含む方法を提供する。

【0095】

いくつかの実施形態によれば、本発明のヒト化ｍＡｂは、治療前の腫瘍標本中のＣＥＡＣＡＭ１の発現レベルに基づいて、抗ＣＥＡＣＡＭ１治療と関連する予測バイオマーカーとして使用される。ＣＥＡＣＡＭ１レベルの発現は、本発明のヒト化ｍＡｂを利用する、当技術分野で公知の方法を用いて決定される。

【0096】

本発明はさらに、一態様において、細胞増殖もしくは血管新生に関連する疾患もしくは障害もしくは感染の診断、予防又は治療のための、上記のモノクローナル抗体の使用を提供する。

【0097】

本発明はさらに、一態様において、ＣＥＡＣＡＭタンパク質の発現又は活性に関連する障害又は疾患の治療用の医薬の製造のための、上記のモノクローナル抗体の使用を提供する。

【0098】

本発明はさらに、一態様において、細胞増殖もしくは血管新生に関連する疾患又は障害又は感染の診断用の診断用組成物の調製のための、上記のモノクローナル抗体の使用を提供する。

【0099】

本発明はさらに、一態様において、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２２に記載のフレームワークアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は配列番号２５、配列番号２６もしくは配列番号２７に記載のフレームワークアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、部分的ヒト化モノクローナル抗体を提供する。

【0100】

本発明のさらなる実施形態及び適用性の完全な範囲は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の趣旨及び範囲内の種々の変更並びに改変が、発明を実施するための形態から当業者に明らかになるので、本発明の好ましい実施形態を示す発明を実施するための形態及び実施例は、単なる例示として与えられると理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【0101】

【図1A】タンパク質構造ホモロジーモデリングプログラムＳｗｉｓｓ ＰＤＢによって生成された上面図（Ａ）及び立体側面図（Ｂ）のキメラ抗ＣＥＡＣＡＭ−１抗体（ＣＭ−１０）Ｖ領域の構造モデルである。

【図1B】タンパク質構造ホモロジーモデリングプログラムＳｗｉｓｓ ＰＤＢによって生成された上面図（Ａ）及び立体側面図（Ｂ）のキメラ抗ＣＥＡＣＡＭ−１抗体（ＣＭ−１０）Ｖ領域の構造モデルである。

【図2】プロテインＡ精製抗体のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。約２μｇの各試料をＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のカタログ番号ＮＰ０３２２ＢＯＸ）にロードし、４０分間、２００Ｖで泳動した。（Ａ）ＩｇＧ１のＣＤＲ移植変異体；（Ｂ）ＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）ＣＤＲ移植変異体。Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製Ｐａｇｅｒｕｌｅｒ Ｐｌｕｓ（ＳＭ１８１１）を、分子量標準（１０、２５、及び７０ｋＤａの基準バンドを含有する）として使用した。試料を以下のように番号付けした：

【表1】

【図3】組換えヒトＣＥＡＣＡＭ−１の競合結合ＥＬＩＳＡアッセイの結果のグラフ図である。種々の濃度の精製ヒト化ＩｇＧ抗体変異体は、一定の濃度のビオチン化抗ＣＥＡＣＡＭ−１ ＩｇＧ（キメラＣＭ−１０ ＩｇＧ１）と競合した：（Ａ）ＩｇＧ１変異体；及び（Ｂ）ＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）変異体。結合したビオチン化キメラＣＭ−１０をストレプトアビジンＨＲＰ及びＴＭＢ基質を用いて検出した。

【図4】ヒト黒色腫細胞に対するヒトＴＩＬ細胞の細胞傷害性に対する抗ＣＥＡＣＡＭ１及び抗ＰＤ−１抗体の相乗効果を表す。ＴＩＬ細胞を、種々の濃度のヒトＣＥＡＣＡＭ１に対するヒト化ｍＡｂ（黒い破線、球のマーカー）、ヒトＰＤ−１に対するｍＡｂ（灰色の実線、長方形のマーカー）又は両方の抗体の組み合わせ（黒の実線、三角形のマーカー）とインキュベートした。ＩＦＮ−γで処理した黒色腫細胞を、一晩のインキュベーションの間添加した。結果は、処理あたり３連のウェルから古典的ＬＤＨ放出アッセイによって決定した時の％細胞傷害性の平均±標準誤差を表す。＊ Ｐ＜０．０５、ヒトＣＥＡＣＡＭ１単独に対するモノクローナル抗体と比較した対応のあるＴ検定。

【図5A】抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の添加前に抗ＰＤ−１抗体を添加した時の、グランザイムＢレベルに対する抗ＣＥＡＣＡＭ１及び抗ＰＤ−１抗体の相乗効果並びにヒト黒色腫細胞に対するヒトＴＩＬ細胞の細胞傷害性。ヒト黒色腫細胞を、ＰＤ−Ｌ１発現を誘導するＩＦＮ−αの存在下で増殖させた。ヒトＴＩＬ細胞を、培地のみ（黒）、非特異的ＩｇＧ抗体（白）、種々の濃度のヒトＣＥＡＣＡＭ１に対するモノクローナル抗体（垂直線）、ヒトＰＤ−１に対するモノクローナル抗体（水平ライン）又は両方の抗体の組み合わせ（ドット）とともにインキュベートした。（Ａ）結果は、処理あたり３連のウェルから古典的ＬＤＨ放出アッセイによって決定した時の％細胞傷害性の平均±標準誤差を表す。＊ Ｐ≦０．０５、ａ−ＰＤ−１単独と比較した対応のあるＴ検定。（Ｂ）結果は、処理あたり３連のウェルから市販のグランザイムＢ ＥＬＩＳＡキットによって決定した時のグランザイムＢレベル±標準誤差を表す。

【図5B】抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の添加前に抗ＰＤ−１抗体を添加した時の、グランザイムＢレベルに対する抗ＣＥＡＣＡＭ１及び抗ＰＤ−１抗体の相乗効果並びにヒト黒色腫細胞に対するヒトＴＩＬ細胞の細胞傷害性。ヒト黒色腫細胞を、ＰＤ−Ｌ１発現を誘導するＩＦＮ−αの存在下で増殖させた。ヒトＴＩＬ細胞を、培地のみ（黒）、非特異的ＩｇＧ抗体（白）、種々の濃度のヒトＣＥＡＣＡＭ１に対するモノクローナル抗体（垂直線）、ヒトＰＤ−１に対するモノクローナル抗体（水平ライン）又は両方の抗体の組み合わせ（ドット）とともにインキュベートした。（Ａ）結果は、処理あたり３連のウェルから古典的ＬＤＨ放出アッセイによって決定した時の％細胞傷害性の平均±標準誤差を表す。＊ Ｐ≦０．０５、ａ−ＰＤ−１単独と比較した対応のあるＴ検定。（Ｂ）結果は、処理あたり３連のウェルから市販のグランザイムＢ ＥＬＩＳＡキットによって決定した時のグランザイムＢレベル±標準誤差を表す。

【図6】抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の添加前に抗ＰＤ−１抗体を添加した時の、ヒト黒色腫細胞に対するヒトＬＡＫ細胞の細胞傷害性に対する抗ＣＥＡＣＡＭ１及び抗ＰＤ−１抗体の相乗効果。ヒト黒色腫細胞を、ＰＤ−Ｌ１発現を誘導するＩＦＮ−αの存在下で増殖させた。健康なヒトドナーからのＰＢＭＣのＩＬ−２での活性化によって作製されたヒトＬＡＫ細胞を、培地のみ（白）、非特異的ＩｇＧ抗体（黒）、種々の濃度のヒトＣＥＡＣＡＭ１に対するモノクローナル抗体（垂直線）、ヒトＰＤ−Ｌ１に対するモノクローナル抗体（水平線）、又は両方の抗体の組み合わせ（ドット）とインキュベートした。結果は、処理あたり３連のウェルから古典的ＬＤＨ放出アッセイによって決定した時の％細胞傷害性の平均±標準誤差を表す。＊ Ｐ≦０．０５、ａ−ＰＤ−Ｌ１単独と比較した対応のあるＴ検定。上記のように組み合わせ指数を計算した。

【図7】抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体での処理は、標的癌細胞上でのＰＤ−Ｌ１発現を増加させる。ＮＫ細胞（ＮＫ９２ＭＩ）を、ＣＭ−２４（１０μｇ／ｍｌ）を含む場合と、含まない場合でインキュベートし、その後、ヒト黒色腫細胞（ＳＫＭＥＬ２８）添加した。これらの細胞を２４時間、４８時間及び７２時間インキュベートし、ＰＤ−Ｌ１レベルを、ＦＡＣＳ分析により各時点で測定した。異なる時点で示した処理に適切なアイソタイプ対照と比較した抗ＰＤ−Ｌ１の平均の比率。

【図8】免疫コンピテントマウス（ｉｍｍｕｎｏ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｍｉｃｅ）の腫瘍進行に対する抗ＣＥＡＣＡＭ１及び抗ＰＤ−１抗体の相乗効果。マウスリンパ腫細胞を、ＢＡＬＢ／Ｃマウス（１日目）の腹部に皮下移植した。１０日、１５日及び２０日目に、マウスに、ＰＢＳ（黒い破線、白丸）、抗マウスＣＥＡＣＡＭ１抗体（灰色の実線、灰色の長方形）、抗マウスＰＤ−１抗体（灰色の実線、灰色の三角）又は両方の抗体の組み合わせ（黒の実線、黒球）のいずれかを静脈内投与した。

【図9】抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体は、ヒト黒色腫細胞に対するヒトＬＡＫ細胞の細胞傷害性を増加させる。ヒトＬＡＫ細胞を３７℃で３０分間、異なる濃度のＣＭ−２４とインキュベートした。ヒト黒色腫癌細胞（ＳＫＭＥＬ２８）を、２４時間のインキュベーションの間添加した。結果は、処理あたり３連のウェルから古典的ＬＤＨ放出アッセイによって決定した時の％細胞傷害性の平均±標準誤差を表す。＊ Ｐ≦０．０５、培地のみを有するエフェクター＋標的細胞と比較した対応のあるＴ検定。

【図10】抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体は、ヒト膵臓癌細胞Ｔ３Ｍ４に対するヒトＬＡＫ細胞の細胞傷害性を増加させる。ヒトＬＡＫ細胞を３７℃で３０分間、異なる濃度のＣＭ−２４とインキュベートした。ヒト膵臓癌細胞Ｔ３Ｍ４を、２４時間のインキュベーションの間添加した。結果は、処理あたり３連のウェルから古典的ＬＤＨ放出アッセイによって決定した時の％細胞傷害性の平均±標準誤差を表す。＊ Ｐ＜０．０５、培地のみを有するエフェクター＋標的細胞と比較した対応のあるＴ検定。

【図11A】抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体は、ヒト癌細胞の存在下で、ヒトＬＡＫ細胞のＩＦＮ−γ分泌を増強する。ヒトＬＡＫ細胞を３７℃で３０分間、異なる濃度のＣＭ−２４とインキュベートした。ヒト肺癌細胞Ｈ３５８（１１Ａ）又はＨ４６０（１１Ｂ）を、２４時間のインキュベーションの間添加した。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、処理あたり３回の反復のグランザイムＢの放出値の平均＋標準誤差を表す。＊ Ｐ＜０．０５、培地のみを有するエフェクター＋標的細胞と比較した対応のあるＴ検定。

【図11B】抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体は、ヒト癌細胞の存在下で、ヒトＬＡＫ細胞のＩＦＮ−γ分泌を増強する。ヒトＬＡＫ細胞を３７℃で３０分間、異なる濃度のＣＭ−２４とインキュベートした。ヒト肺癌細胞Ｈ３５８（１１Ａ）又はＨ４６０（１１Ｂ）を、２４時間のインキュベーションの間添加した。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、処理あたり３回の反復のグランザイムＢの放出値の平均＋標準誤差を表す。＊ Ｐ＜０．０５、培地のみを有するエフェクター＋標的細胞と比較した対応のあるＴ検定。

【図12A】癌細胞におけるＣＥＡＣＡＭ１の種類のＣＥＡＣＡＭ１−ロング（Ａ）とＣＥＡＣＡＭ１−ショート（Ｂ）の発現間の相関関係、及びＢ−Ｒａｆ変異体の阻害剤に対する耐性を示す。

【図12B】癌細胞におけるＣＥＡＣＡＭ１の種類のＣＥＡＣＡＭ１−ロング（Ａ）とＣＥＡＣＡＭ１−ショート（Ｂ）の発現間の相関関係、及びＢ−Ｒａｆ変異体の阻害剤に対する耐性を示す。

【図13A】図１３Ａは、黒色腫細胞を移植し、図中に示した治療グループに応じて処置したマウスから摘出した肺のピクトグラムを示し；図１３Ｂは、各治療グループの平均腫瘍重量を示し；図１３Ｃは、各治療グループのマウスあたりの病変数を示す。

【図13B】図１３Ａは、黒色腫細胞を移植し、図中に示した治療グループに応じて処置したマウスから摘出した肺のピクトグラムを示し；図１３Ｂは、各治療グループの平均腫瘍重量を示し；図１３Ｃは、各治療グループのマウスあたりの病変数を示す。

【図13C】図１３Ａは、黒色腫細胞を移植し、図中に示した治療グループに応じて処置したマウスから摘出した肺のピクトグラムを示し；図１３Ｂは、各治療グループの平均腫瘍重量を示し；図１３Ｃは、各治療グループのマウスあたりの病変数を示す。

【図14】肺病変モデルから単離したＴＩＬ細胞中のＣＥＡＣＡＭ１受容体占有率のパーセンテージを示す棒ヒストグラムである。

【図15A】図１５Ａ及び図１５Ｂは、現在臨床試験中のＣＭ−２４と命名された、復帰変異ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ１ ｍＡｂの軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を表す。図１５Ａは、軽鎖配列（配列番号５２）を含有し、アミノ酸残基１〜１０７はＣＤＲを含む可変領域であり、アミノ酸残基１０８〜２１４（太字）はκ軽鎖定常領域である。図１５Ｂは、重鎖配列（配列番号５３）を表し、アミノ酸残基１〜１２０は可変領域であり、アミノ酸残基１２１〜４４７（太字）はＩｇＧ４重鎖定常領域であり、予測されるＮ−グリコシル化部位（アスパラギン２９７）に下線が引かれている。図１５Ｃは、重鎖配列（配列番号５９）を表し、アミノ酸残基１〜１２１は可変領域であり、アミノ酸残基１２２〜４５０（太字）はＩｇＧ１重鎖定常領域であり、予測されるＮ−グリコシル化部位（アスパラギン３００）に下線が引かれている。

【図15B】図１５Ａ及び図１５Ｂは、現在臨床試験中のＣＭ−２４と命名された、復帰変異ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ１ ｍＡｂの軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を表す。図１５Ａは、軽鎖配列（配列番号５２）を含有し、アミノ酸残基１〜１０７はＣＤＲを含む可変領域であり、アミノ酸残基１０８〜２１４（太字）はκ軽鎖定常領域である。図１５Ｂは、重鎖配列（配列番号５３）を表し、アミノ酸残基１〜１２０は可変領域であり、アミノ酸残基１２１〜４４７（太字）はＩｇＧ４重鎖定常領域であり、予測されるＮ−グリコシル化部位（アスパラギン２９７）に下線が引かれている。図１５Ｃは、重鎖配列（配列番号５９）を表し、アミノ酸残基１〜１２１は可変領域であり、アミノ酸残基１２２〜４５０（太字）はＩｇＧ１重鎖定常領域であり、予測されるＮ−グリコシル化部位（アスパラギン３００）に下線が引かれている。

【図15C】図１５Ａ及び図１５Ｂは、現在臨床試験中のＣＭ−２４と命名された、復帰変異ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ１ ｍＡｂの軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を表す。図１５Ａは、軽鎖配列（配列番号５２）を含有し、アミノ酸残基１〜１０７はＣＤＲを含む可変領域であり、アミノ酸残基１０８〜２１４（太字）はκ軽鎖定常領域である。図１５Ｂは、重鎖配列（配列番号５３）を表し、アミノ酸残基１〜１２０は可変領域であり、アミノ酸残基１２１〜４４７（太字）はＩｇＧ４重鎖定常領域であり、予測されるＮ−グリコシル化部位（アスパラギン２９７）に下線が引かれている。図１５Ｃは、重鎖配列（配列番号５９）を表し、アミノ酸残基１〜１２１は可変領域であり、アミノ酸残基１２２〜４５０（太字）はＩｇＧ１重鎖定常領域であり、予測されるＮ−グリコシル化部位（アスパラギン３００）に下線が引かれている。

【発明を実施するための形態】

【0102】

本発明は、ＣＥＡＣＡＭ１を認識する非完全ヒト化モノクローナル抗体を開示する。有利なことに、本発明の抗体は、ほとんど完全にヒト化されているので、該抗体に対する有害な免疫反応のリスクを回避し、したがって、ヒトでのインビボ使用に安全である。本発明の抗体は、特有のＣＤＲ配列並びに新規な非完全ヒト化フレームワーク配列及び設計を有することを特徴とする。本発明のモノクローナル抗体の特有の性質は、さらなる種類の悪性腫瘍及び種々の感染症の治療並びに診断に関するそれらの治療的有用性を広げる。より具体的には、本発明により提供されるモノクローナル抗体は、ＣＤＲと非完全ヒト化フレームワーク配列の特定の組み合わせを有し、既知の非ヒト抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体を上回る特有の性質並びに改善された安全性及び効力を有する。

【0103】

他の非ヒト抗体が、その非ヒト抗体自体に対する免疫原性反応を誘発する恐れから投与できない場合に、本発明によって提供される抗体の特有の性質は、特に、長期投与又は反復投与を必要とする用途において、ヒトにおけるこれらの抗体の使用にいくつかの利点を付与する。治療される人が、患者の健康のさらなる悪化が回避されるべき疾患に罹患している患者である場合に、かかる免疫反応を回避することがより重要になる。本発明はその上さらに、別の態様において、（ｉ）それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、かつ配列番号９に記載のアミノ酸配列と２〜９個のアミノ酸が異なる非ＣＤＲ（フレームワーク）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；並びに／又は（ｉｉ）それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、かつ配列番号１３に記載のアミノ酸配列と２〜４個のアミノ酸が異なる非ＣＤＲアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む非完全ヒト化モノクローナル抗体；並びにヒトＣＥＡＣＡＭ１を特異的に認識するその類似体、誘導体及び抗原結合断片を提供する。

【0104】

明瞭にするために、本発明によって提供される抗体の可変領域は、（ａ）本発明の発明者らにより以前に説明されたＣＤＲ配列、及び（ｂ）本明細書で非ＣＤＲ配列とも命名されたフレームワーク配列を含み、そのうちの少なくとも１つは、対応する完全ヒトフレームワーク配列と少なくとも１つの残基が異なることが強調されるべきである。

【0105】

特定の実施形態において、本明細書で使用する「別の配列と異なる配列」という語句は、それぞれの配列と比較して少なくとも１個のアミノ酸の置換、少なくとも１個のアミノ酸の挿入、少なくとも１個のアミノ酸の欠失、又はそれらの任意の組み合わせを含有する配列を意味する。特定の実施形態において、本明細書で使用する「別の配列と異なる配列」という語句は、それぞれ配列と比較して少なくとも１個のアミノ酸の置換を含有する配列を意味する。本明細書で使用する「非ＣＤＲ配列」という用語は、本発明によって同定されたＣＤＲ配列ではないフレームワーク配列、すなわち、抗体の可変領域に含まれる任意のアミノ酸配列を指す。非ＣＤＲ配列の例として、ＣＤＲ１に先行するか又は隣接する配列、ＣＤＲ１とＣＤＲ２の間の配列、ＣＤＲ２とＣＤＲ３の間の配列、及びＣＤＲ３に続くか又は隣接する配列が挙げられる。

【0106】

本発明によって提供される抗体の可変領域は、完全ヒト抗体の可変領域と少なくとも１個のアミノ酸が異なるので、それらは、「非完全ヒト化」及び「非完全ヒト」抗体とも標識される。

【0107】

「ＣＥＡＣＡＭ１」という用語は、ＣＥＡＣＡＭ１遺伝子のタンパク質産物、例えば、ＮＰ＿００１０２００８３．１、ＮＰ＿００１７０３．２を指すために使用される。ヒトでは、１１種の異なるＣＥＡＣＡＭ１スプライス変異体がこれまでに検出されている。個々のＣＥＡＣＡＭ１アイソフォームは、細胞外免疫グロブリン様ドメインの数（例えば、４つの細胞外免疫グロブリン様ドメインを有するＣＥＡＣＡＭ１はＣＥＡＣＡＭ１−４として知られる）、膜足場及び／又はそれらの細胞質テールの長さ（例えば、長い細胞質テールを有するＣＥＡＣＡＭ１−４はＣＥＡＣＡＭ１−４Ｌとして知られ、短い細胞質テールを有するＣＥＡＣＡＭ１−４はＣＥＡＣＡＭ１−４Ｓとして知られる）に関して異なる。ＣＥＡＣＡＭ１のＮ末端ドメインは、シグナルペプチドの直後から始まり、その構造はＩｇＶ型とみなされる。例えば、ＣＥＡＣＡＭ１注釈Ｐ１３６８８において、Ｎ末端のＩｇＶ型ドメインは、アミノ酸３５〜１４２番目の１０８個のアミノ酸で構成されている。このドメインは、同種親和性結合活性に関与するものとして同定された（Ｗａｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｌｏｏｄ．９８，１４６９−７９）。これらのスプライスバリアントを含む全ての変異体は、「ＣＥＡＣＡＭ１」という用語の中に含まれる。

【0108】

「抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体」、「ＣＥＡＣＡＭ１を認識する抗体」、「ＣＥＡＣＡＭ１に対する抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ＣＥＡＣＡＭ１）」及び「ＣＥＡＣＡＭ１に対する抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ＣＥＡＣＡＭ１）」という用語は交換可能であり、十分な親和性及び特異性でＣＥＡＣＡＭ１タンパク質に結合する抗体を指すために本明細書で使用される。

【0109】

本明細書で使用する「抗原」という用語は、抗体形成を誘発し、抗体が結合することができる分子又は分子の部分を指す。抗原は、１つ又は２つ以上のエピトープを有し得る。上記で言及した特異的反応は、抗原が、その対応する抗体と高度に選択的な様式で反応し、他の抗原によって誘発され得る他の多数の抗体とは反応しないことを示すことを意味する。本発明の抗原は、ＣＥＡＣＡＭ１タンパク質又はその断片である。

【0110】

本明細書で使用する「抗原決定基」又は「エピトープ」という用語は、特定の抗体と特異的に反応する抗原分子の領域を指す。エピトープ由来のペプチド配列は、動物を免疫し、追加のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を産生するために、当技術分野で公知の方法を適用して、単独で、又は担体部分と組み合わせて使用することができる。エピトープ由来の単離ペプチドは、抗体を検出するための診断方法において使用し、かつ上記抗体の阻害が必要とされる場合に治療剤として使用することができる。

【0111】

抗体又は免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって共に連結された２つの重鎖及び２つの軽鎖を含み、各軽鎖は、「Ｙ」字形状でジスルフィド結合によってそれぞれの重鎖に連結されている。抗体のタンパク質分解による消化により、ＦＶ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ（可変断片））及びＦＣ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ（結晶性断片））ドメインが生成される。抗原結合ドメインのＦａｂは、ポリペプチド配列が変化する領域を含む。Ｆ（ａｂ’）_２という用語は、ジスルフィド結合によって共に連結された２つのＦａｂ’アームを表す。抗体の中心軸は、Ｆｃ断片と呼ばれる。各重鎖は、一端に可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を有し、その後にいくつかの定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）が続く。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）及びその他端に定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を有し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと一列に並んでおり、軽鎖定常ドメインは第１の重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１）と一列に並んでいる。軽鎖及び重鎖の各対の可変ドメインは、抗原結合部位を形成する。軽鎖及び重鎖上のドメインは同じ一般構造を有し、各ドメインは、配列が比較的保存されており、相補性決定領域（ＣＤＲ １〜３）として知られる３つの超可変ドメインによって結合されている４つのフレームワーク領域を含む。これらのドメインは、抗原結合部位の特異性及び親和性に寄与する。重鎖のアイソタイプ（ガンマ、アルファ、デルタ、イプシロン又はミュー）は、免疫グロブリンクラス（それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ）を決定する。軽鎖は、全ての抗体クラスで見られる２つのアイソタイプ（カッパ、κ又はラムダ、λ）のいずれかである。

【0112】

「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体（完全長又はインタクトなモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び所望の生物学的活性を示すのに十分な長さの抗体断片を含む。

【0113】

本発明の抗体は、少なくとも抗体の抗原結合部分を含む分子である。本発明の１つの抗体又は複数の抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）などのインタクトな抗体、及びＦａｂ又はＦ（ａｂ’）_２断片などのそのタンパク質分解断片を含む。一本鎖抗体もまた、本発明の範囲内に入る。

【0114】

「抗体断片」は、一般に、インタクトな抗体の抗原結合部位を含み、したがって、抗原に結合する能力を保持するインタクトな抗体の一部のみを含む。本発明の定義によって包含される抗体断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦａｂ断片；（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に１以上のシステイン残基を有するＦａｂ断片であるＦａｂ’断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；（ｉｖ）ＣＨ１ドメインのＣ末端にＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン並びに１以上のシステイン残基を有するＦｄ’断片；（ｖ）抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインを有するＦｖ断片；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９８９，３４１，５４４−５４６）；（ｖｉｉ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ’断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）_２断片；（ｉｘ）一本鎖抗体分子（例えば、一本鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８，２４２，４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）１９８８，８５，５８７９−５８８３）；（ｘ）同じポリペプチド鎖内に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する「ダイアボディ」（例えば、ＥＰ ４０４，０９７；ＷＯ ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，６４４４−６４４８を参照されたい）；（ｘｉ）相補性軽鎖ポリペプチドと共に、１対の抗原結合領域を形成する、１対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む「直鎖状抗体」（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１９９５，８，１０５７−１０６２；及び米国特許第５，６４１，８７０号）が挙げられる。

【0115】

一本鎖抗体は、抗原結合能力を有し、かつ免疫グロブリン軽鎖及び重鎖の可変領域に相同な又は類似のアミノ酸配列を含む一本鎖複合ポリペプチド、すなわち、連結されたＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌ又は一本鎖Ｆ_Ｖ（_ＳＣＦ_Ｖ）であり得る。

【0116】

本明細書で使用する「中和抗体」という用語は、仕様に従ってインビボ又はインビトロアッセイによって決定されるように、活性又は受容体を介したシグナル伝達を低減するか又は阻害（ブロッキング）することができる特異的受容体又はリガンド標的への抗原結合部位を有する分子を指す。

【0117】

本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る天然変異の可能性を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原に対して作製されている。さらに、典型的に異なる決定基（エピトープ）に対して作製された異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して作製されている。「モノクローナル」という修飾語は、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。モノクローナルＡｂは、当業者に公知の方法によって得ることができる。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９７５，２５６，４９５によって記載されたハイブリドーマ法によって作製するか、又は、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）によって作製してよい。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９１，３５２，６２４−６２８又はＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１，２２２：５８１−５９７に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。

【0118】

本発明のｍＡｂは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、又はＩｇＡを含む任意の免疫グロブリンクラスのものであり得る。ｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロ又はインビボで培養され得る。高力価のｍＡｂはインビボ産生によって得ることができ、個々のハイブリドーマからの細胞をプリスティン刺激した（ｐｒｉｓｔｉｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ）Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射すると、高濃度の所望のｍＡｂを含有する腹水液を産生する。アイソタイプＩｇＭ又はＩｇＧのモノクローナルＡｂは、当業者に周知のカラムクロマトグラフィー法を用いて、かかる腹水液から、又は培養上清から精製することができる。

【0119】

本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、かつ／又は本明細書に開示されるヒト抗体を作製する技術のいずれかを使用して作製された抗体を指す。このヒト抗体の定義は、特に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。ヒト抗体は、当技術分野で公知の種々の技術を用いて産生することができる。

【0120】

本明細書で使用する「抗体の抗原結合部分を有する分子」及び「抗原結合断片」という用語は、任意の動物細胞株又は微生物によって生成された任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリン分子だけでなく、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、その重鎖及び／又は軽鎖の可変部分、Ｆａｂミニ抗体（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ ９３／１５２１０、米国特許出願０８／２５６，７９０、ＷＯ ９６／１３５８３、米国特許出願０８／８１７，７８８、ＷＯ ９６／３７６２１、米国特許出願０８／９９９，５５４を参照されたい）、二量体の二重特異性ミニ抗体（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８を参照されたい）を含むが、これらに限定されないその抗原結合反応性部分並びにかかる反応性部分を組み入れた一本鎖抗体、及びかかる抗体反応性部分が物理的に挿入された任意の他の種類の分子も含むことが意図される。かかる分子は、酵素的切断、ペプチド合成又は組換え技術を含むがこれらに限定されない、任意の公知の技術によって提供されてよい。

【0121】

本発明は、本発明の抗体分子の保存的アミノ酸変異体も提供する。コードタンパク質の全体的な分子構造を保存する、本発明の変異体も作製され得る。開示されたタンパク質産物を含む個々のアミノ酸の性質を考慮すると、いくつかの合理的な置換が当業者によって認識されるであろう。アミノ酸置換、すなわち、「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質における類似性に基づいて行われ得る。本明細書で使用する「抗体類似体」という用語は、１以上の保存的アミノ酸置換による別の抗体由来の抗体を指す。

【0122】

本明細書で使用する「抗体変異体」という用語は、本発明の抗体を含む任意の分子を指す。例えば、抗体又はその抗原結合断片が別の化学実体に連結された融合タンパク質は、抗体変異体とみなされる。

【0123】

本明細書で使用する「非完全ヒト化モノクローナル抗体」という用語は、ＣＤＲに隣接するか、かつ／又はＣＤＲのすぐ隣のアミノ酸配列が完全なヒトではない、すなわち、天然ヒト抗体から取った任意の既知の相同配列もしくは対応する配列と同一ではない重鎖及び／又は軽鎖可変ドメインを有するモノクローナル抗体を指す。

【0124】

医薬品及び医薬製剤において、活性剤は、好ましくは、１以上の薬学的に許容される担体（複数可）及び必要に応じて、任意の他の治療成分と共に利用される。担体（複数可）は、製剤の他の成分と適合し、そのレシピエントに対して過度に有害でないという意味で、薬学的に許容されなければならない。活性剤は、上記のように、所望の薬理学的効果を達成するのに有効な量で、かつ所望の日用量を達成するのに適切な量で提供される。

【0125】

典型的には、抗体の抗原結合部分を含むか、又はペプチド模倣物を含む別のポリペプチドを含む本発明の分子は、治療用途のために滅菌生理食塩水に懸濁される。該医薬組成物は、代替的に、活性成分（抗体の抗原結合部分を含む分子）の放出を制御するように、又は患者のシステムにおけるその存在を延長するように製剤化され得る。多数の適切な薬物送達システムが知られており、例えば、移植可能な薬物放出システム、ヒドロゲル、ヒドロキシメチルセルロース、マイクロカプセル、リポソーム、マイクロエマルジョン、及び微小球などを含む。放出制御製剤は、複合体へのポリマーの使用を通じて調製されるか、又は本発明の分子を吸着することができる。例えば、生体適合性ポリマーとしては、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）のマトリックス及びステアリン酸二量体とセバシン酸のポリ無水物コポリマーのマトリックスが挙げられる。本発明の分子、すなわち、抗体又は抗体断片のかかるマトリックスからの放出速度は、分子の分子量、そのマトリックス内の分子の量、及び分散粒子のサイズに依存する。

【0126】

本発明の医薬組成物は、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、関節内投与、病巣内投与、非経口投与などの任意の適切な手段によって投与され得る。通常は、静脈内（ｉ．ｖ．）投与が使用される。

【0127】

本発明の分子の治療有効量は、とりわけ、投与スケジュール、投与される分子の単位用量、その分子が他の治療剤と組み合わせて投与されるか否か、患者の免疫状態及び健康状態、投与される分子の治療活性及び治療する医師の判断に依存することは当業者には明らかである。本明細書で使用する「治療有効量」は、ある期間にわたって治療される障害に関連する１以上の症状を軽減するのに必要な分子の量を指す。

【0128】

「治療有効量」という用語は、哺乳動物における疾患又は障害を治療するのに有効な薬物の量を指す。癌の場合、治療有効量の薬物は、癌細胞の数を減少させる；腫瘍サイズを減少させる；末梢器官への癌細胞浸潤を阻害する（すなわち、ある程度まで減速させ、好ましくは停止させる）；腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度まで減速させ、好ましくは停止させる）；腫瘍増殖をある程度まで阻害する；かつ／又は障害に関連する症状の１以上をある程度まで軽減することができる。薬物が増殖を防止するか、かつ／又は既存の癌細胞を殺すことができる程度まで、その薬物は細胞増殖抑制性及び／又は細胞傷害性であり得る。癌療法については、インビボでの有効性は、例えば、生存期間、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）、反応速度（ＲＲ）、奏効期間、及び／又は生活の質を評価することによって測定することができる。

【0129】

「糖」という用語は、単糖類、二糖類、及び多糖類を指す。糖の例としては、スクロース、トレハロース、及びデキストロースなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0130】

活性成分としての本発明の分子は、周知のとおり、薬学的に許容され、活性成分と適合性のある賦形剤に溶解されるか、分散されるか又は混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、デキストロース、グリセロール、又はエタノールなど及びそれらの組み合わせである。他の適切な担体は、当業者によく知られている。加えて、所望の場合、該組成物は、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含有することができる。

【0131】

本発明の医薬組成物は、抗腫瘍組成物と共に投与されてよい。具体的な実施形態によれば、抗腫瘍組成物は、少なくとも１種類の化学療法剤を含む。本発明の抗体と共に投与するか、又は別々に投与することができる化学療法剤は、以下のものを含むが、これらに限定されない抗癌活性を示す、当技術分野で公知の任意のかかる薬剤を含んでよい：ミトキサントロン、トポイソメラーゼ阻害剤、紡錘体毒ビンカ：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン（タキソール）、パクリタキセル、ドセタキセル；アルキル化剤：メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、イホスファミド；メトトレキサート；６−メルカプトプリン；５−フルオロウラシル、シタラビン、ゲムシタビン；ポドフィロトキシン：エトポシド、イリノテカン、トポテカン、ダカルバジン；抗生物質：ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ブレオマイシン、マイトマイシン；ニトロソウレア：カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン；無機イオン：シスプラチン、カルボプラチン；インターフェロン、アスパラギナーゼ；ホルモン類：タモキシフェン、ロイプロリド、フルタミド、及び酢酸メゲストロール。

【0132】

特定の実施形態によれば、該化学療法剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体及び関連阻害薬、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、抗生物質、Ｌ−スパラギナーゼ、トポイソメラーゼ阻害剤、インターフェロン、白金配位錯体、アントラセンジオン置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アドレノコルチコステロイド類、プロゲスチン類、エストロゲン類、抗エストロゲン、アンドロゲン類、抗アンドロゲン、及びゴナドトロピン放出ホルモン類似体からなる群から選択される。別の実施形態によれば、該化学療法剤は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン（ＬＶ）、イリノテカン、オキサリプラチン、カペシタビン、パクリタキセル及びドキセタキセルからなる群から選択される。２以上の化学療法剤は、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の投与と組み合わせて投与するためのカクテルで使用することができる。

【0133】

本明細書で使用する「治療」という用語は、治療的処置及び防止的又は予防的手段の両方を指す。治療を必要とするものには、すでに障害を有するもの及び障害が予防されるべきものが含まれる。

【0134】

「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すか、又は説明する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。かかる癌のより特定の例としては、黒色腫、肺癌、甲状腺癌、乳癌、結腸癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、子宮頸癌、膵臓癌、白血病、リンパ腫、骨髄癌、卵巣癌、子宮癌、肉腫、胆管癌、又は子宮内膜癌が挙げられる。

【0135】

「抗腫瘍組成物」という用語は、腫瘍の増殖もしくは機能を阻害するかもしくは防止し、かつ／又は腫瘍細胞の破壊を引き起こすことができる少なくとも１種類の活性治療剤を含む、癌の治療に有用な組成物を指す。抗腫瘍組成物中の癌を治療するのに適する治療剤には、化学療法剤、放射性同位体、毒素、インターフェロンなどのサイトカイン類、及び腫瘍細胞に関連するサイトカイン類、サイトカイン受容体又は抗原を標的にする拮抗薬が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、該治療剤は、化学療法剤である。

【0136】

本明細書で使用する「診断する」という用語は、病状の有無を決定すること、病状又は症状を分類すること、病状の重症度を決定すること、病状の進行を監視すること、病状の結果及び／又は回復の見通しを予測することを指す。

【0137】

本明細書で使用する「アミノ酸残基の変異」という用語は、単一アミノ酸残基の置換、挿入、又は欠失を指す。本明細書で使用する「アミノ酸残基の復帰変異」という用語は、マウス抗体のフレームワークに見られる対応するアミノ酸残基へのヒト抗体フレームワークに見られる単一アミノ酸残基の置換を指す。

【0138】

以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をより完全に例示するために提示される。しかし、それらは、決して、本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【0139】

実施例

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

【表6】

【0140】

復帰変異が導入される参照完全ヒト化重鎖配列（配列番号５７）は、以下のもので構成されている：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号７）−ＧＹＡＦＴＮＮＬＩＥ（配列番号１）−ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ（配列番号８）−ＶＩＮＰＧＳＧＤＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）−ＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号９）−ＧＤＹＹＧＧＦＡＶＤＹ（配列番号３）−ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１０）。

【0141】

復帰変異が導入される参照完全ヒト化軽鎖配列（配列番号５８）は、以下のもので構成されている：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１１）−ＲＴＳＱＤＩＧＮＹＬＮ（配列番号４）−ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１２）−ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号５）−ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣ（配列番号１３）−ＱＱＧＫＳＬＰＲＴ（配列番号６）−ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１４）。

【0142】

実施例１．ＣＤＲ移植抗体可変領域配列の設計
抗体の結合特性に重要であり得るＶ領域フレームワーク中のアミノ酸を同定するために、キメラ抗ＣＥＡＣＡＭ−１抗体Ｖ領域の構造モデルを、Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢを用いて作製し、分析した（図１）。これらのアミノ酸は、１以上の変異体ＣＤＲ移植抗体に組み込むために認められた。ＣＭ−１０のＶ_Ｈ及びＶ_κ配列の両方は、典型的なフレームワーク残基を含有し、ＣＤＲ１、２及び３のモチーフは多くのマウス抗体と同等である。これらのＣＤＲはマウス配列から直接取得した。次いで、Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢモデルを、ＣＤＲの提示に潜在的に影響を与える可能性があるフレームワーク領域及び個々の残基を強調するために、重要な位置でのマウス／ヒト相同性と共に分析した。

【0143】

変異体の設計
Ｖ領域フレームワークとして使用するための最高の相同性を有する重鎖及び軽鎖ヒト配列を同定するために、重鎖及び軽鎖Ｖ領域アミノ酸配列をヒト生殖細胞系Ｖ領域配列のデータベースと比較した。次いで、フレームワーク上にＣＤＲを移植することによって、必要に応じて、キメラ抗体結合効率の回復に潜在的に重要であると上記で同定された残基のマウス配列への復帰変異によって、一連の重鎖及び軽鎖Ｖ領域を設計した。少数のマウス残基が各変異体に保持される必要があると考えられた。次いで、Ａｎｔｉｔｏｐｅ社製のインシリコ技術であるｉＴｏｐｅ（商標）及びＴＣＥＤ（商標）（Ｔ細胞エピトープデータベース）（Ｐｅｒｒｙら２００８、Ｂｒｙｓｏｎら２０１０）の適用によって決定されるように、潜在的なＴ細胞エピトープの発生率が最も低い変異体配列を選択した。復帰変異の数を、出発マウス配列によって決定した。構造解析から、構造的に重要であり得る残基として、Ｖ_Ｈ中に最大１３か所を同定し、Ｖ_κ中に５か所を同定した。これらに優先順位をつけ、これらの数を変えて組み込む変異体を設計した。復帰変異の数に理論上の制限はないが、組み込まれる復帰変異が多いほど、ヒト配列は少なくなり得る。配列番号２８〜３５に記載の配列を用いて、５つのＶ_Ｈ鎖及び３つのＶ_κ鎖を設計した。

【0144】

ｉＴｏｐｅ（商標）及びＴＣＥＤ（商標）
ｉＴｏｐｅ（商標）ソフトウェアは、３４個のヒトＭＨＣクラスＩＩアレルの結合溝内に、ペプチドのアミノ酸側鎖と特異的結合ポケット（特に、ポケット位置；ｐ１、ｐ４、ｐ６、ｐ７及びｐ９）の間の良好な相互作用を予測する。重要な結合残基の位置は、試験タンパク質配列にまたがる１個のアミノ酸によって重複する９マーのペプチドのインシリコ生成によって達成される。物理的ＭＨＣクラスＩＩ結合実験とのインハウス比較により、ｉＴｏｐｅ（商標）を用いて、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドと結合しないペプチドの十分な区別を高精度に行うことができることが示された。しかし、これらの結果は、ＭＨＣクラスＩＩ結合の全ての予測方法が、タンパク質／ペプチドのプロセシング、Ｔ細胞受容体による認識又はペプチドに対するＴ細胞寛容などの、抗原提示中の他の重要なプロセスを可能にしないので、Ｔ細胞エピトープの数を本質的に過剰予測（ｏｖｅｒ−ｐｒｅｄｉｃｔ）するという事実に照らして評価されるべきである。

【0145】

ＴＣＥＤ（商標）は、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピングアッセイにおいて以前にスクリーニングされた全てのペプチド配列を含有する。ＴＣＥＤ（商標）は、Ｔ細胞反応を刺激しないことが以前に示されたセグメントを特異的に選択するために、ＢＬＡＳＴ検索によるペプチドの大規模（＞１０，０００ペプチド）データベースに対して任意の試験配列を検索するために使用される。加えて、データベース内のＴ細胞エピトープと顕著な相同性を有する任意の領域を排除した。

【0146】

ＣＤＲ移植変異体の構築
ＣＭ−１０の全ての変異体のＣＤＲ移植Ｖ_Ｈ領域及びＶ_κ領域の遺伝子は、一連の重複オリゴヌクレオチドを用い、それらをアニーリング、ライゲーション及びＰＣＲ増幅して合成され、完全長の合成Ｖ領域を得た。次いで、構築した変異体を、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）の両方のＶ_Ｈ鎖並びにＶ_κ鎖のための発現ベクター系に直接クローニングした。全ての構築物を配列決定により確認した。

【0147】

抗体の構築、発現及び精製
キメラ抗体遺伝子並びにＣＤＲ移植したＶ_Ｈ鎖及びＶ_κ鎖の全ての組み合わせ（すなわち、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）のそれぞれについて合計１５ペア）を、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１０８５２）細胞にリン酸カルシウムを用いて一過的にトランスフェクトした。上清の収集前に、一過性トランスフェクションを最大５日間インキュベートした。

【0148】

キメラ抗体及びＣＭ−１０のＣＤＲ移植変異体を、プロテインＡセファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのカタログ番号１１００３４−９３）上で、一過的細胞培養上清から精製し、１×ＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換し、予測されたアミノ酸配列に基づく吸光係数を用いて、ＯＤ_{２８０ｎｍ}によって定量化した（ＣＭ−１０キメラ抗体及び変異体のＥ_{Ｃ（０．１％）}＝約１．３７〜１．４０）。キメラ抗体及び主要ヒト化変異体を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｖ_Ｈ鎖及びＶ_κ鎖の予想サイズに対応するバンドが認められ、いかなる汚染の証拠も認められなかった（図２）。

【0149】

実施例２．ヒトＣＥＡＣＡＭ−１への精製抗体の競合結合
キメラ抗体及びＣＤＲ移植変異体のそれぞれと共に精製キメラＣＭ−１０抗体の組換えヒトＣＥＡＣＡＭ−１への結合を、競合ＥＬＩＳＡで評価した。キメラ又はヒト化抗体の２０μｇ／ｍｌから０．００９μｇ／ｍｌの希釈系列（３倍）を一定濃度のビオチン化キメラＣＭ−１０（０．００５μｇ／ｍｌ、最終濃度）と予備混合し、その後、１×ＰＢＳ ｐＨ７．４で希釈した０．５μｇ／ｍｌの組換えヒトＣＥＡＣＡＭ−１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓのカタログ番号２２４４−ＣＭ−０５０）でプレコーティングしたＮｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ９６ウェル平底マイクロタイタープレート（Ｆｉｓｈｅｒのカタログ番号ＤＩＳ−９７１−０３０Ｊ）上で、室温で１時間インキュベートした。ビオチン化抗体の結合を、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａのカタログ番号Ｓ５５１２）及びＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのカタログ番号００−２０２３）で検出した。反応を３Ｍ ＨＣｌで停止し、Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＭＲＸ ＴＣ ＩＩプレートリーダー上で、４５０ｎｍで吸光度を読み取り、結合曲線をプロットした。

【0150】

全てのヒト化変異体は、図３に示す結合曲線と同様のキメラＣＭ−１０への結合プロファイルを与えた。これらのデータを用いて、各抗体のＩＣ_５０値を計算し、各ＥＬＩＳＡに含まれるキメラＣＭ−１０のＩＣ_５０に対して正規化し、表６及び表７に示した。

【0151】

【表7】

【表8】

【0152】

正規化したＩＣ_５０データは、試験した全ての変異体について０．８４〜１．５６の範囲を示し、ヒトＣＥＡＣＡＭ−１に対する全てのＣＤＲ移植抗体の結合効率が、キメラＣＭ−１０結合効率と同等であることを示した。

【0153】

実施例３．ＣＥＡＣＡＭ１に対するヒト化ｍＡｂと抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ抗体の組合せ
Ａ．ヒト黒色腫細胞に対するヒトＴＩＬ細胞の細胞傷害性に対する抗ＣＥＡＣＡＭ１と抗ＰＤ−１抗体の相乗効果を実証した。ヒト黒色腫癌細胞（ＭＡＬＭＥ ３Ｍ）をＩＦＮ−αの存在下で増殖させ、ＰＤ−Ｌ１発現を誘導した。ヒトＴＩＬ細胞（ＴＩＬ１４）をヒトＣＥＡＣＡＭ１（ＣＭ−２４）（０．０１μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ）に対するモノクローナル抗体、ヒトＰＤ−１に対するモノクローナル抗体（クローンＥ１２．２Ｈ７）又はその両方の抗体の組み合わせ（各抗体０．００５、０．０２５、０．０５及び０．２５μｇ／ｍｌ）と３７℃で３０分間インキュベートした。細胞傷害性評価の前に、ＩＦＮ−α処理したヒト黒色腫癌細胞を、一晩のインキュベーションの間添加した。図４は、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体及び抗ＰＤ−１抗体の両方が、ＴＩＬ細胞などのヒトリンパ球上のそれらのそれぞれの標的に結合することができたこと、かつこの結合がヒト癌細胞に対するヒトＴＩＬ細胞の毒性を、単独の各単剤療法を上回って顕著に増強させたことを示す。したがって、標的癌細胞からの免疫抑制シグナルからリンパ球を保護すると、これらの癌細胞に対する実質的な細胞傷害性がもたらされると結論付けた。

【0154】

Ｂ．抗ＰＤ−１抗体を抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の添加前に添加した時の、グランザイムＢレベル及びヒト黒色腫細胞に対するヒトＴＩＬ細胞の細胞傷害性に対する抗ＣＥＡＣＡＭ１と抗ＰＤ−１抗体の相乗効果も示された：ヒト黒色腫癌細胞（ＭＡＬＭＥ ３Ｍ）をＩＦＮ−αの存在下で増殖させ、ＰＤ−Ｌ１の発現を誘導した。ヒトＴＩＬ細胞（ＴＩＬ１４）を、培地のみ（黒）、非特異的ＩｇＧ抗体（０．８μｇ／ｍｌ、白）、種々の濃度（０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ）のＣＭ−２４、ヒトＰＤ−１（クローンＥ１２．２Ｈ７）に対するｍＡｂ又は両方の抗体の組み合わせ（それぞれ０．０５μｇ／ｍｌ、それぞれ０．１μｇ／ｍｌ、それぞれ０．２μｇ／ｍｌ、それぞれ０．４μｇ／ｍｌ、それぞれ０．８μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。ヒトＰＤ−１に対するモノクローナル抗体を、最初に３７℃で３０分間添加し、その後、ヒトＣＥＡＣＡＭ１に対するｍＡｂを添加した。細胞傷害性評価前に、ＩＦＮ−α処理したヒト黒色腫癌細胞を一晩のインキュベーションの間添加した。組み合わせ指数（ＣＩ）は、０．１５であると計算された。同じアッセイにおいて、細胞傷害性細胞の活性化時に分泌される細胞傷害性タンパク質グランザイムＢのレベルを、市販のグランザイムＢ ＥＬＩＳＡキットにより評価した。図５は、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体及び抗ＰＤ−１抗体がＴＩＬ細胞などのヒトリンパ球上のそれらのそれぞれの標的に結合することができること、かつこの結合がグランザイムＢ分泌及びヒト癌細胞に対するヒトＴＩＬ細胞の毒性を増強させることを示す。図５は、標的癌細胞からの免疫抑制シグナルからリンパ球を保護すると、標的癌細胞に対する実質的な細胞傷害性がもたらされることを再び示し、併用療法においてタイミングが重要な因子であり得ることを示唆する。

【0155】

Ｃ．抗ＰＤ−１抗体を抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の添加前に添加した時の、グランザイムＢレベル及びヒト黒色腫細胞に対するヒトＴＩＬ細胞の細胞傷害性に対する抗ＣＥＡＣＡＭ１と抗ＰＤ−Ｌ１抗体の相乗効果（データ示さず）。ヒト黒色腫細胞（ＭＡＬＭＥ ３Ｍ）をＩＦＮ−αの存在下で増殖させ、ＰＤ−Ｌ１の発現を誘導した。ヒトＴＩＬ細胞（ＴＩＬ１４）を、培地のみ（黒）、非特異的ＩｇＧ抗体（０．８μｇ／ｍｌ、白）、種々の濃度（０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ）のヒトＣＥＡＣＡＭ１に対するモノクローナル抗体（ＣＭ−２４）、ヒトＰＤ−Ｌ１に対するモノクローナル抗体（クローン２９Ｅ．２Ａ３）又は両方の抗体の組み合わせ（それぞれ０．０５μｇ／ｍｌ、それぞれ０．１μｇ／ｍｌ、それぞれ０．２μｇ／ｍｌ、それぞれ０．４μｇ／ｍｌ、それぞれ０．８μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、最初に３７℃で３０分間添加し、その後、ヒトＣＥＡＣＡＭ１に対するモノクローナル抗体を添加した。細胞傷害性評価前に、ＩＦＮ−α処理したヒト黒色腫癌細胞を一晩のインキュベーションの間添加した。組み合わせ指数（ＣＩ）は、０．６７であると計算された。結果は、処理あたり３連のウェルから古典的ＬＤＨ放出アッセイによって決定した時の％細胞傷害性の平均±標準誤差を表す。＊Ｐ≦０．０５、ａ−ＰＤ−Ｌ１のみと比較した対応のあるＴ検定。同じアッセイにおいて、細胞傷害性細胞の活性化時に分泌される細胞傷害性タンパク質グランザイムＢのレベルを、市販のグランザイムＢ ＥＬＩＳＡキットにより評価した。結果は、処理あたり３連のウェルからの平均グランザイムＢレベルを表す。これらの結果は、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１の抗体が、（ＴＩＬ細胞などの）ヒトリンパ球及び（黒色腫細胞などの）ヒト癌細胞上のそれらのそれぞれの標的に結合することができること、かつこの結合がグランザイムＢ分泌及びヒト癌細胞に対するヒトＴＩＬ細胞の毒性を増強させることを示す。さらに、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１とＣＥＡＣＡＭ１／ＣＥＡＣＡＭ１の相互作用を阻止すると、相乗効果がもたらされ得ること、かつＰＤ−１^リンパ球／ＰＤ−リガンド^癌細胞の免疫抑制シグナルからリンパ球を保護すると、抗原標的化したＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２のいずれかに関わらず、これらの癌細胞に対する実質的な細胞傷害性がもたらされることが実証された。

【0156】

Ｄ．抗ＰＤ−１抗体を抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の添加前に添加した時の、ヒト黒色腫細胞に対するヒトＬＡＫ細胞の細胞傷害性に対する抗ＣＥＡＣＡＭ１と抗ＰＤ−１抗体の相乗効果。ヒト黒色腫細胞（ＳＫＭＥＬ２８、ＣＥＡＣＡＭ１陽性、ＰＤ−Ｌ１陽性）をＩＦＮ−αの存在下で増殖させ、ＰＤ−Ｌ１の発現を誘導した。健康なヒトドナーからのＰＢＭＣのＩＬ−２（５００ユニット／ｍｌ）による７日間の活性化によって作製したヒトＬＡＫ（リンホカイン活性化キラー）細胞を培地のみ（白）、非特異的ＩｇＧ抗体（０．８μｇ／ｍｌ、黒）、種々の濃度（０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ）のヒトＣＥＡＣＡＭ１に対するモノクローナル抗体（ＣＭ−２４）、ヒトＰＤ−１に対するモノクローナル抗体（クローンＥ１２．２Ｈ７）又は両方の抗体の組み合わせ（それぞれ０．１μｇ／ｍｌ、それぞれ０．２μｇ／ｍｌ、それぞれ０．４μｇ／ｍｌ、それぞれ０．８μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。ヒトＰＤ−１に対するモノクローナル抗体を、最初に３７℃で３０分間添加し、その後、ヒトＣＥＡＣＡＭ１に対するモノクローナル抗体を添加した。細胞傷害性評価前に、ＩＦＮ−α処理したヒト黒色腫細胞を２４時間のインキュベーションの間添加した。図６は、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体及び抗ＰＤ−１抗体がＬＡＫ細胞などの活性化ヒトリンパ球上のそれらのそれぞれの標的に結合することができること、かつこの結合がヒト癌細胞に対するヒトＬＡＫ細胞の毒性を増強させることを示す。組み合わせ指数（ＣＩ）は、０．８未満であると計算された。図６は、さらに、ＬＡＫ細胞へのこれらの抗体の結合が、幾分か相互関係し、その結合メカニズムのさらなる研究を正当化すること、かつこの機構が種々の活性化リンパ球に存在することを示す。

【0157】

Ｅ．抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体による治療は、標的癌細胞上のＰＤ−Ｌ１の発現を増加させる。ヒトＮＫ細胞（ＮＫ９２ＭＩ）を、ヒトＣＥＡＣＡＭ１に対するモノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌのＣＭ−２４）と共に、又は含めないでインキュベートし、その後、ヒト黒色腫癌細胞（ＳＫＭＥＬ２８）を添加した。これらの細胞を２４時間、４８時間及び７２時間インキュベートし、ＰＤ−Ｌ１レベルを、ＦＡＣＳ分析により各時点で測定した。異なる時点で示した処理について適切なアイソタイプ対照と比較した抗ＰＤ−Ｌ１の平均比率レベルを、癌細胞上のＣＥＡＣＡＭ１及びＰＤ−Ｌ１の発現が実際に相互に関係していることを示す図７に示す。抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の添加は、生存癌細胞上でのＰＤ−Ｌ１の発現を増加させ、したがって、両方の薬剤による併用治療に追加的サポートを提供する。癌細胞上のＰＤ−Ｌ１タンパク質の数は、比較的高いままであり、これらの細胞を抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の抗体治療により感受性にさせるので、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体を最初に投与し、次いで、さらに、抗ＰＤ−Ｌ１及び／又は抗ＰＤ−Ｌ２抗体を投与することによって癌を治療することは有益であり得、併用療法が臨床転帰を改善することができることを意味する。同時よりもむしろ、別々の時間での異なる抗体の投与は、癌細胞に対するリンパ球の細胞傷害性効果を最大にする。いかなる理論又は機構に縛られることなく、この知見は、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体による治療により、標的癌細胞上のＰＤ−Ｌ１発現を増加させることにしたがって、本発明の別の驚くべき知見と関係し得る。仮に、これは、細胞傷害性リンパ球のための改善された効力を得るために、複数の抗体の必要性を支持する。抗ＰＤ−１抗体の投与が、最初にリンパ球上のＰＤ−１分子を阻止し、その後の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の投与が、リンパ球及び／又は標的癌細胞上のＣＥＡＣＡＭ１分子を阻止し、標的癌細胞上のＰＤ−１リガンドの発現を増加させることが想定され得る。しかし、リンパ球上のＰＤ−１分子は既に阻止されているので、標的癌細胞上のＰＤ−１リガンドの発現レベルの上昇は、リンパ球が完全な細胞傷害能を効率的に発揮するのを妨げない。

【0158】

Ｆ．免疫コンピテントマウスにおける腫瘍進行に対する抗ＣＥＡＣＡＭ１と抗ＰＤ−１抗体の相乗効果。マウスリンパ腫細胞（５×１０^６、Ａ２０）を、１日目に皮下注射によりＢａｌｂ／Ｃマウスの腹部に同種移植した。１０日目に、腫瘍の平均体積は４５ｍｍ^３に達し、マウスを別々の４グループに無作為化し（１グループあたり１１〜１２匹）、ＰＢＳ、ＣＣ−１（抗マウスＣＥＡＣＡＭ１抗体、６ｍｇ／ｋｇ）、ＰＲＭ−１（抗マウスＰＤ−１抗体、６ｍｇ／ｋｇ）又はＣＣ−１とＰＲＭ−１の組み合わせ（それぞれ６ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを静脈内投与した。処置を１５日目及び２０日目に繰り返した。ヒトＣＥＡＣＡＭ１に対するモノクローナル抗体単独の効果、ヒトＰＤ−１に対するモノクローナル抗体単独の効果、腫瘍増殖阻害に対する両方の抗体の組み合わせの効果を観察した。インタクトな免疫系を有するマウスにおける抗マウスＣＥＡＣＡＭ１及び抗マウスＰＤ−１抗体の生物学的活性の評価を可能にし、かつマウス癌細胞に対する免疫系反応全体を評価するこの実験のために、免疫コンピテントＢａｌｂ／Ｃマウスを選択した。全体として、このモデルは、癌患者が抗ヒトＣＥＡＣＡＭ１及び抗ヒトＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体の組合せを受けとる、ヒトにおける治療をシミュレートする。いかなる理論又は機構にも束縛されないが、抗ＣＥＡＣＡＭ１及び抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体の組合せは、癌細胞が患者の免疫系の活性化及び細胞傷害性を回避するのを禁止するので、顕著な抗癌反応をもたらすと仮定される。図８は、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体及び抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体が、腫瘍細胞及び／又は免疫細胞上でそれらのそれぞれの標的にインビボで結合することができ、この組み合わされた結合が、各単剤療法と比較して顕著に腫瘍進行を減弱させることを示す。確立された腫瘍を有する患者が治療されている臨床設定を模倣する、かなりの体積の確立された腫瘍内で抗ＣＥＡＣＡＭ１と抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２の組み合わせの有効性及び使用の可能性も証明するので、この結果は非常に重要である。

【0159】

実施例４．ＣＥＡＣＡＭ１及びＬＡＫ細胞に対するヒト化ｍＡｂでの併用治療。
Ａ．抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体は、ヒト黒色腫細胞に対するヒトＬＡＫ細胞の細胞障害性を増加させる：ＰＢＭＣ細胞を健康なドナーから単離し、その後、３日間、ＩＬ−２（５００又は１０００ユニット／ｍｌ）で活性化し、ヒトＬＡＫ細胞集団を作製した。次いで、ヒトＬＡＫ細胞を、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌの抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体（ＣＭ−２４）と共に、３７℃で３０分間インキュベートした。ヒト黒色腫細胞（ＳＫＭＥＬ２８）を２４時間のインキュベーションの間添加し、その後、細胞傷害性を決定した。図９は、ヒトＬＡＫ細胞がそれ自体でヒト黒色腫癌細胞に対して細胞傷害性であるが（例えば、左の２つのバーと比較して）、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の添加がこれらのヒト黒色腫癌細胞に対する細胞傷害性を用量依存的に顕著に増強させることを示す。

【0160】

Ｂ．抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体は、多様なヒト膵臓癌細胞及び肺癌細胞に対するヒトＬＡＫ細胞の細胞傷害性を増強させる。ＰＢＭＣ細胞を健康なドナーから単離し、その後、７日間、ＩＬ−２（５００ユニット／ｍｌ）で活性化し、ヒトＬＡＫ細胞集団を作製した。次いで、ヒトＬＡＫ細胞を、示したように０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体（ＣＭ−２４）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。３種類の異なるヒト膵臓癌細胞のＴ３Ｍ４、ＳＵ８６８６及びＰＡＮＣ２、並びに２種類の異なるヒト肺癌細胞のＨ３５８及びＨ４６０を、２４時間のインキュベーションの間添加した。図１０は、ヒトＬＡＫ細胞がそれ自体でヒト膵臓Ｔ３Ｍ４癌細胞に対して細胞傷害性であるが、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の添加がこれらのヒト癌細胞に対する細胞傷害性を用量依存的に顕著に増強させることを示す。同様の結果が、他の膵臓癌細胞及び肺癌細胞について得られた。

【0161】

Ｃ．抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体は、ヒト膵臓癌細胞及び肺癌細胞の存在下で、ヒトＬＡＫ細胞のグランザイムＢ分泌を促進する。ヒトＬＡＫ細胞を、異なる濃度で抗ＣＥＡＣＡＭ−１抗体（ＣＭ−２４）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ヒト膵臓癌細胞Ｔ３Ｍ４（Ａ）又はヒト肺癌細胞Ｈ３５８（Ｂ）を、２４時間のインキュベーションの間添加した。グランザイムＢ分泌をＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、ヒトＬＡＫ細胞がそれ自体で高レベルのグランザイムＢを産生するが、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の添加はグランザイムＢレベルを用量依存的に顕著に増加させることを示す。

【0162】

Ｄ．抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体は、ヒト癌細胞の存在下で、ヒトＬＡＫ細胞のＩＦＮ−γ分泌を促進する。ヒトＬＡＫ細胞を、異なる濃度で抗ＣＥＡＣＡＭ−１抗体（ＣＭ−２４）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ヒト肺癌細胞Ｈ３５８又はＨ４６０を、２４時間のインキュベーションの間添加した。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡによって測定した。図１１は、ヒトＬＡＫ細胞がそれ自体で高レベルのＩＦＮ−γを産生するが、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の添加はＩＦＮ−γレベルを用量依存的に顕著に増加させることを示す。

【0163】

実施例５．ＣＥＡＣＡＭ１発現は癌細胞におけるＢ−Ｒａｆ変異の存在と相関する。
Ａ．ＣＥＡＣＡＭ１発現レベル及びＢＲＡＦ遺伝子型について、２４人の黒色腫癌患者からの生検試料を評価することにより、Ｂ−Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ変異とＣＥＡＣＡＭ１発現との間に統計的に有意な相関関係があることが明らかになった。より具体的には、野生型Ｂ−Ｒａｆを有する、すなわち、６００位がバリンである黒色腫細胞のわずか５０％（３／６）が検出可能なレベルのＣＥＡＣＡＭ１を発現し（３６以下のＣｔ）、変異Ｂ−Ｒａｆを有する、すなわち、６００位がグルタミン酸である黒色腫細胞の１００％（１８／１８）が検出可能なレベルのＣＥＡＣＡＭ１を発現した（３６以下のＣｔ）。

【0164】

Ｂ．Ｂ−Ｒａｆ又はＭＥＫ阻害剤で処理した癌細胞のＣＥＡＣＡＭ１細胞外染色。１．０×１０^６個の細胞のＢ−Ｒａｆ Ｗ．Ｔ．細胞試料（０７６ｍｅｌ）及び２種類のＢ−Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ細胞試料（５２６ｍｅｌ、６２４ｍｅｌ）を、異なる濃度のベムラフェニブ又はセルメチニブ（０．１μＭ又は１μＭ）と２〜４８時間インキュベートした。各時点で、これらの細胞上でのＣＥＡＣＡＭ１発現をＦＡＣＳにより決定した。等量のＤＭＳＯ（ビヒクル）を対照として使用した。結果は、０．１μＭ及び１μＭのベムラフェニブがＷ．Ｔ． Ｂ−Ｒａｆ（０７６ｍｅｌ）を有する細胞上でのＣＥＡＣＡＭ１発現レベルに影響を及ぼさなかったが、０．１μＭ及び１μＭのベムラフェニブは、変異Ｂ−Ｒａｆ（５２６ｍｅｌ、６２４ｍｅｌ）を有する細胞上でのＣＥＡＣＡＭ１発現レベルに用量依存的な効果を有していたことを示した。結果はさらに、セルメチニブが変異Ｂ−Ｒａｆ（５２６ｍｅｌ、６２４ｍｅｌ）を有する細胞上でベムラフェニブと同様の効果を有していたが、１μＭのセルメチニブは、Ｗ．Ｔ． Ｂ−Ｒａｆを有するがＮ−Ｒａｓが変異している（ｓｋ−ｍｅｌ−２）細胞上でのＣＥＡＣＡＭ１発現レベルを顕著に減少させ、１μＭのベムラフェニブは、ＣＥＡＣＡＭ１発現レベルに影響を及ぼさなかったことを示す。これらの結果は、さらに、この場合では、変異Ｎ−Ｒａｓでは促進されるが、変異Ｂ−Ｒａｆでは促進されない構成的活性化ＭＡＰＫ経路を介したＣＥＡＣＡＭ１の調節を支持する。

【0165】

Ｃ．阻害剤耐性癌細胞は、ＣＥＡＣＡＭ１発現の増加及びＭＡＰＫ経路の活性の回復を示す。２種類のベムラフェニブ感受性Ｂ−Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ細胞試料（５２６ｍｅｌ、６２４ｍｅｌ）及びそれ由来のベムラフェニブ耐性細胞株を、１μＭのベムラフェニブと共に２日間インキュベートした。次いで、上記のように、細胞を、ＦＡＣＳによってＣＥＡＣＡＭ１タンパク質発現について分析した。ベムラフェニブ耐性細胞株を、培養液中の阻害剤の濃度を０．３２μＭまで徐々に増加させることによって作製した。ベムラフェニブ耐性細胞株が、ベムラフェニブ感受性細胞株よりも高いレベルのＣＥＡＣＡＭ１を発現することが示された。ＭＡＰＫ活性を、１６０ｎＭのベムラフェニブへの曝露の２４時間後のリン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ、Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、全ＥＲＫ１／２及びアクチンについて免疫ブロット法により、ベムラフェニブ感受性及びベムラフェニブ耐性Ｂ−Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ（６２４ｍｅｌ）細胞試料中で測定した。ベムラフェニブ感受性Ｂ−Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ細胞において、ベムラフェニブはＥＲＫ１／２のリン酸化をほぼ完全に廃止し、その際、ＭＡＰＫ活性は、ベムラフェニブ耐性Ｂ−Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ細胞においてベムラフェニブによって実質的に中断されなかった。

【0166】

Ｄ．阻害剤耐性癌細胞はＣＥＡＣＡＭ１発現を上方制御する。Ｂ−Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ ５２６ｍｅｌ黒色腫細胞を、１μＭのベムラフェニブの存在下で培養した。培養を、１ｍＭのピルビン酸Ｎａ、１ｍＭのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、１ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭの非必須アミノ酸、及び１０％熱不活性化ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ １６４０中で行った。ベムラフェニブの初期濃度は、決定したＩＣ_５０（０．６４ｎＭ）の０．０１であった。各週、この濃度を５倍のＩＣ_５０（３２０ｎＭ）まで２倍にし、ベムラフェニブ耐性黒色腫細胞を作製した。次いで、上記のように、フローサイトメトリーでＭＲＧ１（ヒトＣＥＡＣＡＭ１に対するマウス抗体）を用いて、細胞をＣＥＡＣＡＭ１発現について試験した。一般的なプロトコルに従って、トータルＲＮＡをトリゾールで抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製した。ベムラフェニブは、Ｂ−Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ黒色腫細胞におけるＣＥＡＣＡＭ１発現を下方制御するが、これらの細胞はベムラフェニブに対する耐性を獲得する際にＣＥＡＣＡＭ１発現レベルを上方制御する。ベムラフェニブに対する耐性を獲得した後のＢ−Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ黒色腫細胞におけるＣＥＡＣＡＭ１レベルは、未処理（ベムラフェニブナイーブ）Ｂ−Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ黒色腫細胞におけるＣＥＡＣＡＭ１レベルよりも高いことに留意することが重要である。

【0167】

Ｅ．阻害剤耐性癌細胞は両方の種類のＣＥＡＣＡＭ１発現を上方制御する。上記のベムラフェニブ感受性及びベムラフェニブ耐性Ｂ−Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ ５２６ｍｅｌ黒色腫細胞を、ベムラフェニブに対する耐性を獲得する際に過剰発現したＣＥＡＣＡＭ１の種類についてｑＰＣＲにより試験した。図１２Ａ及び図１２Ｂに示すデータは、ＣＥＡＣＡＭ１の両方の種類のＣＥＡＣＡＭ１−ロング（１２Ａ）及びＣＥＡＣＡＭ１−ショート（１２Ｂ）の発現が、ベムラフェニブ感受性細胞と比較して、ベムラフェニブ耐性細胞において約３倍上方制御することを示す。

【0168】

Ｆ．Ｂ−Ｒａｆ／ＭＥＫ阻害剤は、Ｔ細胞に誘導される細胞傷害性を増加させる。２種類のベムラフェニブ感受性Ｂ−Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ細胞試料（５２６ｍｅｌ、６２４ｍｅｌ）を、細胞傷害性Ｔ細胞の存在下で１μＭのベムラフェニブを含む場合又は含まない場合の生存率について試験した。黒色腫細胞を、１μＭのベムラフェニブと予めインキュベートし、次いで、エフェクター−標的の比率を５：１で、ＨＬＡ−Ａ２整合抗原整合Ｔ細胞と一晩共培養した。細胞の死滅をＬＤＨ放出によって決定した。ベムラフェニブが、細胞傷害性Ｔ細胞に対する黒色腫細胞を顕著に感作することが示された。Ｂ−Ｒａｆ／ＭＥＫ阻害剤及びＣＥＡＣＡＭ１に対する抗体は、癌細胞に対するＴ細胞誘導性の細胞傷害性をインビトロで増加させる。

【0169】

実施例６．異なる用量でのＣＭ−２４のインビボ抗癌効果
図１３に示した治療グループに応じて、ＳＣＩＤ−ＮＯＤマウスに５×１０^６個の黒色腫細胞（細胞株ＭＥＬ５２６）をＩＶ移植し、４４日間治療した。抗体を、ＩＶ注入により週に２回投与し、１０×１０^６個のＴＩＬを１０日ごとにＩＶ投与した。４９日目にマウスを屠殺し、肺を摘出し、撮影し（図１３Ａ）、秤量し（図１３Ｂ）、病変を計数した（図１３Ｃ）。図１３Ａ−摘出直後のマウスの肺のデジタル写真。図１３Ｂ−腫瘍重量を、異なる治療グループの平均肺重量から未治療マウスの肺重量を差し引くことにより計算した。結果は、治療グループあたり７〜８匹のマウスの腫瘍重量の平均±標準誤差を表す。図１３Ｃ−種々のグループの個々のマウスにおける肺病変の数；黒い線は、グループの中央値を表す；無数の病変を有する肺を１００としてスコア化した。対応のあるＴ検定を用いて、グループ間の統計的有意性を計算した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０２５。

【0170】

肺の形態（図１３Ａ）、腫瘍重量（図１３Ｂ）及び肺病変の数（図１３Ｃ）によって理解できるように、ＴＩＬの存在下でのＣＭ−２４による治療はロバストな腫瘍増殖阻害をもたらしたが、ＩｇＧ対照で治療したマウスは、広範囲の腫瘍量及び多数の肺黒色腫病変を示した。中程度の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ ４７％）のみが、対照抗体（ＴＩＬ＋ＩｇＧ）と共に黒色腫に対するヒト反応性Ｔ細胞を投与したグループで観察されたが、ＣＭ−２４を添加した場合、試験した全ての用量で実質的かつ用量依存的な抗癌活性（それぞれ、１、３、６及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で、８４％、８７％、９０％及び９３％のＴＧＩ）が示され、６及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で統計的有意性があった（図１３Ｂ）。アッセイの終了日の肺のデジタル写真記録（図１３Ａ）は、ＴＩＬの存在下で、ＣＭ−２４で治療したマウスにおいてほぼ正常な肺の形態を示したので、ＴＩＬの存在下でのＣＭ−２４は、ほぼ完全に悪性細胞を排除することが示された。

【0171】

ＴＩＬ及びＩｇＧ対照を投与したグループでは、予想されたとおり、ある程度の抗腫瘍効果も観察された。しかし、ＴＧＩ、肺病変及び肺形態の数の点からその効果をＣＭ−２４治療マウスと比較した場合に、かなりの違いが観察された。

【0172】

肺病変の数の評価により、ＴＩＬ及び種々の用量のＣＭ−２４で治療した全マウスにおいて非常に少ない数の肺病変が明らかになり、これらの肺のいずれも１０個以上の病変を示さなかった。一方、ＩｇＧグループ又はＴＩＬ＋ＩｇＧグループにおいて、何匹かの動物は高い数の病変（＞１００）を示し、これらのグループの中央値はＣＭ−２４治療マウスよりもかなり高かった（図１３Ｃ）（ＣＭ−２４治療グループの５、６、３及び２と比較して、ＩｇＧグループ及びＴＩＬ＋ＩｇＧグループでは１００及び４５；Ｐ＜０．０２５）。

【0173】

これらの効果は、１ｍｇ／ｍｌほどの低い濃度で観察されたが、６及び１０ｍｇ／ｋｇのＣＭ−２４濃度では肺重量の点で統計的に有意であった。

【0174】

特記事項：ＩｇＧグループの１匹のマウスは、四肢麻痺を含む重篤な罹患性を示し、３３日目に屠殺した（肺に広範囲の腫瘍量が検出された）；ＴＩＬ＋ＩｇＧグループの１匹のマウスは、罹患性の兆候を示し、４９日目のアッセイ終了日に死亡した（いくつかの病変が検出された）；ＴＩＬ＋ＣＭ−２４グループの１匹のマウスは、重度の罹患性及び体重減少を示し、３９日目に屠殺した（病変の証拠は検出されなかった）；ＰＢＳグループの３匹のマウスは、実験中に重度の罹患性を示し、４２日目に屠殺し、他の２匹のマウスは４８日目に屠殺した（多数の肺病変を含む広範囲の腫瘍量が全マウスで検出された）。

【0175】

終了日に、治療マウスの肺から単離したヒトＴＩＬにおけるＣＭ−２４によるＣＥＡＣＡＭ１受容体占有率を決定するために、ＱｕａｎｔｉＢｒｉｔｅキットと組み合わせたフローサイトメトリーベースアッセイを用いた。種々のＣＭ−２４用量で治療したマウスにおける受容体占有率（ＲＯ）値は、５０％のＲＯが１ｍｇ／ｋｇ（血液中のＣＭ−２４血清レベル）の濃度に起因し得、９０％超のＲＯは３、６及び１０ｍｇ／ｋｇ（それぞれのＣＭ−２４血清レベル０．３、４８．５及び１１１μｇ／ｍｌ）の用量で示されたことを示した（図１４）。ＣＥＡＣＡＭ１ ＲＯ値の検査は、ＰＥ結合ＣＭ−２４抗体及びＱｕａｎｔｉＢｒｉｔｅキット（ＢＤ）を用いるフローサイトメトリーベースアッセイを用いて行った。結果は、治療グループあたり８〜９匹のマウスの肺から単離したＴＩＬにおけるＲＯ値の平均±標準誤差を表す。データはカルツァ（Ｋａｌｕｚａ）ソフトウェアを用いて分析した。

【0176】

上記のデータから、実質的な腫瘍成長阻害が、ＣＭ−２４で治療したマウスにおいて、悪性細胞のほぼ完全な排除をもたらすＴＩＬの存在下で観察されたことは明らかである。全てのＣＭ−２４の用量が有効な抗癌反応を示したが、漸増用量は、より高い値の腫瘍増殖阻害（それぞれ１、３、６及び１０ｍｇ／ｋｇの用量に相当する８４、８７、９０及び９３のＴＧＩ）との相関を示し、これも統計的に有意であった。生体外でのＲＯ結果は、３、６及び１０ｍｇ／ｋｇの用量でＲＯ＞９０％を示し（それぞれのＣＭ−２４血清レベル０．３、４８．５及び１１１μｇ／ｍｌ）、５０％のＲＯが１ｍｇ／ｋｇの用量で検出された。１ｍｇ／ｋｇの用量で、ＣＭ−２４で治療したマウスからのＲＯデータを評価した場合、ＣＭ−２４の血清濃度は非常に低いが、ＲＯデータはＣＭ−２４がまだ肺でＴＩＬに結合していることを示し、ＣＭ−２４が、腫瘍微小環境においてインビボで長く続く効果を媒介することができることを示唆する。

【0177】

これらの結果は、悪性細胞に対するエフェクター細胞の細胞傷害活性のエンハンサーとして、ＣＭ−２４の作用モードを支持し、ＣＭ−２４が強力な抗癌剤であることを示す。

【0178】

実施例７．プレ臨床データのまとめ
ＣＭ−２４は、ＣＥＡＣＡＭ１のＮ末端ドメインに結合するヒト化ＩｇＧ４抗ヒトＣＥＡＣＡＭ１モノクローナル抗体であり、活性化リンパ球と腫瘍細胞との間の細胞間ＣＥＡＣＡＭ１相互作用を阻止する；したがって、ＣＭ−２４によるＣＥＡＣＡＭ１相互作用の阻止は、リンパ球の殺傷活性を増強すると想定され、癌の免疫療法の追求のための有望な手段である。

【0179】

ＣＭ−２４は、活性化リンパ球又は腫瘍細胞が発現するヒトＣＥＡＣＡＭ１への高親和性で、選択的な結合を示す。インビトロ免疫調節モデルのデータは、ＣＭ−２４が、細胞間ＣＥＡＣＡＭ１−ＣＥＡＣＡＭ１相互作用の強力なブロッカーであり、ＣＥＡＣＡＭ１陽性ＮＫ細胞及びリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞並びに腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）による種々のヒトＣＥＡＣＡＭ１陽性腫瘍細胞の細胞傷害性死滅を増強することができることを実証した。種々のモデルで実証されたように、ＣＭ−２４によって誘導される殺傷活性の増強は、グランザイムＢ及びＩＦＮγ分泌によって媒介され得る。

【0180】

ＣＭ−２４は、ＣＥＡＣＡＭ１陽性腫瘍細胞の存在下で、かつ特定のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）によって制限されるＴ細胞反応との関連で、エフェクター細胞の細胞傷害活性を増強する。ＣＭ−２４は、ＣＥＡＣＡＭ１陽性非標的細胞（ヒト正常細胞）に対するエフェクターリンパ球の細胞傷害活性を増強しない。加えて、このデータは、ＣＭ−２４がリガンド様アゴニスト効果、Ｆｃ関連エフェクター機能又は直接的な効果を有していないことを示す。ＣＥＡＣＡＭ１に対するＣＭ−２４の結合は、アゴニスト活性を誘導せず、インビトロ機能アッセイで示されるように、標的細胞の非存在下では、エフェクター細胞上でのＣＭ−２４の効果は観察できなかった。ＩｇＧ４は補体成分Ｃ１ｑ及びＡＤＣＣメディエーター−Ｆｃγ−ＲＩＩＩａと結合できず、ＣＥＡＣＡＭ１陽性初代細胞（リンパ球、上皮細胞及び内皮細胞）の増殖率又は生存率に直接影響を及ぼさないので、ＣＭ−２４も、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導しないことが期待されている。

【0181】

種々のインビボ腫瘍異種移植片モデルは、ＣＭ−２４が、腫瘍内のＴ細胞の免疫学的活性の増強を伴う明確な抗癌活性を有することを示す。

【0182】

ＣＥＡＣＡＭ１阻止は、腫瘍微小環境内でＣＥＡＣＡＭ１陽性癌細胞に遭遇するＣＥＡＣＡＭ１陽性腫瘍浸潤リンパ球のＣＥＡＣＡＭ１媒介性阻害を軽減する。免疫学的効果は、腫瘍細胞に対する局所免疫反応の増強であると期待され、腫瘍細胞の除去及びその後の臨床的退行をもたらすことが期待される。

【0183】

ＣＭ−２４の安全性の前臨床評価には、Ｔ細胞増殖及び炎症促進性サイトカイン分泌に対するＣＭ−２４の効果の評価が含まれた。１０人の健康なドナーからのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び全血を評価し、該抗体は可溶性形態及び固定化形態の両方で提供された。可溶性形式又はドライコーティングされた固定化刺激形式で、明白なＣＭ−２４誘導性増殖及び顕著な炎症促進性サイトカイン分泌はなかった。

【0184】

６週間の反復投与試験をアカゲザルで行い、ＣＭ−２４の毒性及び毒物動態を評価した。ＣＭ−２４を、ヒトで計画される最大用量（１０ｍｇ／ｋｇ）の２．５倍（２５ｍｇ／ｋｇ）及び１０倍（１００ｍｇ／ｋｇ）を表す用量で、合計４用量（腫瘍患者における意図された治療サイクルを模倣する）を２週間に１回静脈内（ＩＶ）注射（意図される臨床の投与経路）を介して投与した。治療に関連する明らかな副作用も、肉眼又は顕微鏡での病理所見も、死亡も観察されなかった。検眼鏡検査及び心電図は、治療に関連する所見を示さなかった。加えて、全血検査及び尿検査は、アカゲザルの正常範囲内であることが判明した。まとめると、アカゲザルにおける重要なＧＬＰ反復投与毒性試験は、全ての用量レベルでいかなる治療関連毒性も示さず、無影響量（ＮＯＥＬ）は１００ｍｇ／ｋｇであると決定された。ＩＶ注入による投与の場合に、毒物動態評価は、ＣＭ−２４曝露に、用量比例的な増加を示した（Ｃｍａｘ、ＡＵＣ）。０日目と比較して、４２日目のＣｍａｘ及びＡＵＣのわずかな増加は、ｍＡｂがこれらの用量レベルでこのＲＯＡ及び投与レジメンによって投与される場合に、ある程度のＣＭ−２４蓄積の可能性を示唆しているかもしれない。グループ２（２５ｍｇ／ｋｇ）の中で１匹の動物だけが陽性の抗ＣＭ−２４抗体反応を示したことから、ＡＤＡ反応が薬物動態又は毒性試験のいずれにも影響を及ぼさない可能性が最も高いことが示唆された。この結果は、ＣＭ−２４の結果と反復投与に対する強い免疫原性反応を表すものではない。

【0185】

マウス腫瘍異種移植モデルの結果においてインビボ実験から決定した、ＭＡＢＥＬに基づくＣＭ−２４についての安全な臨床開始用量は、１０倍の安全率を含む、０．２〜１ｍｇ／ｋｇの範囲である。アカゲザルにおける重要なＧＬＰ反復投与毒性試験は、全ての用量レベルでいかなる治療関連毒性も示さず、無影響量（ＮＯＥＬ）は１００ｍｇ／ｋｇ（重量対重量ベースで１００ｍｇ／ｋｇのヒト等価用量（ＨＥＤ））であると決定され、ＭＡＢＥＬ評価によって決定される範囲を明らかに支持する。インビトロ／エクスビボでのＰＢＭＣ増殖及び炎症促進性サイトカイン産生のアッセイ結果は、Ｔ細胞の増殖及び炎症促進性サイトカイン産生の実質的なＣＭ−２４関連誘導を示さなかった。

【0186】

実施例８．選択された進行性又は再発性の悪性腫瘍を有する対象におけるＣＭ−２４のフェーズ１、非盲検、多施設、複数用量漸増試験
６種類の腫瘍タイプ−黒色腫、非小細胞肺腺癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌及び卵巣癌−これらは、新しい治療法の医学的必要性が高く、他の免疫療法に対する臨床反応の先例があり、ＣＥＡＣＡＭ１経路が腫瘍進行に重要であることを示唆する支持的相関病理学的データがある腫瘍の代表的なものであるので、本治験のために選択された。

【0187】

本治験は、２つのフェーズ：用量漸増部分及び拡大コホート部分を含む。用量漸増部分は、各対象について４回の注入（サイクル１）から始まって、少なくとも１２週続く。その他の点では臨床的に安定しているが、用量制限毒性（ＤＬＴ）がなく、臨床的有益性の証拠を示す対象（完全奏効−ＣＲ、部分奏効−ＰＲ、安定疾患−ＳＤ）及び画像診断評価において進行性疾患−ＰＲＤを有する対象を、最高で３８回の追加の治療週間及び少なくとも２５週間の経過観察（合計７５週間／約１５ヶ月）にわたる、最高で合計５回の追加サイクルの間治療した（継続治療期間）。拡大部分は、皮膚黒色腫対象において最高４６週間の治療週間及び少なくとも２５週間の経過観察（合計７１週間／約１４ヶ月にわたる。

【0188】

主要目的：
黒色腫、非小細胞肺腺癌、及び胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌及び卵巣癌を含む進行性又は再発性の悪性腫瘍を有する対象における、
１．ＣＭ−２４（静脈内投与）の漸増複数用量の安全性及び忍容性の評価、並びに
２．ＣＭ−２４の推奨されるフェーズ２用量の決定

【0189】

副次的目的に含まれるもの：
１．ＣＭ−２４の複数用量の薬物動態プロファイルの特徴づけ。
２．ＣＭ−２４の免疫原性の特徴づけ。
３．ＣＭ−２４で治療した対象における客観的な腫瘍反応及び奏効期間に基づく予備的有効性の評価。

【0190】

探索的目的に含まれるもの：
１．治療前の腫瘍標本におけるＣＥＡＣＡＭ１の発現レベルに基づくＣＭ−２４臨床活性に関連する潜在的な予測バイオマーカーの探索。
２．腫瘍及び末梢血中の選択された免疫細胞集団及び可溶性因子におけるＣＭ−２４の免疫調節活性の調査。
３．ＣＭ−２４で治療した対象の全生存期間の評価。

【0191】

用量漸増部分：試験薬投薬は、０．０１ｍｇ／ｋｇから始まり、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇへと続くシフト形式で投与されるように予定される。対象は、試験参加の順で用量レベルに割り当てられる。最初の２つの用量レベル（０．０１ｍｇ／ｋｇ及び０．０３ｍｇ／ｋｇ）については、各コホートに１人の患者が加速設計で登録され、その中で、単一のグレード２薬物関連毒性は、その用量及び以降の全ての用量で３＋３設計へと拡大する。より低い２つのコホート（０．０１ｍｇ／ｋｇ及び０．０３ｍｇ／ｋｇ）の対象については、第１の患者の単一低用量コホート（０．０１ｍｇ／ｋｇ）から次のコホート（０．０３ｍｇ／ｋｇ）、及び第２の単一用量コホート（０．０３ｍｇ／ｋｇ）から次のコホート（０．１ｍｇ／ｋｇ）への用量漸増は、グレード２以上の毒性が発生していない場合、６週間のＤＬＴウィンドウ後に始まる。０．１ｍｇ／ｋｇ及びそれを上回る用量レベルについては、ＤＬＴが発生しない限りは、コホートあたり少なくとも３人の患者が標準的な３＋３設計に登録され、その場合には、そのコホートは６人の患者に拡大される。次のコホートへの漸増は、各コホートの第１の対象の最初の試験薬投与から始まって、８週間のＤＬＴウィンドウ後にのみ始まる。

【0192】

投薬期間には、３期：スクリーニング、投薬及び経過観察が含まれる：１）最初のサイクルを含み、その後、６週間の観察期間が続く４回の反復用量）、２）継続治療期間（サイクル２〜６）及び３）全生存期間の評価を含む経過観察期間。各治療サイクルは、２週間ごとの４用量の試験薬投与で構成されている。コホートあたり少なくとも３人の対象は、標準的な３＋３設計に登録されている。この部分に登録された対象の最小計画数は、１７人であるが、用量制限毒性（ＤＬＴ）が発生した場合には増やすことができる。ＤＬＴが一定の用量レベルで発生した場合には、この用量レベルは６人の対象に拡大され、したがって、用量漸増部分の対象の最大人数は４２人である。

【0193】

登録された対象は、２週間に１回（サイクル１）４回の治療を受け、その後、６週間の観察ウィンドウが続き；その時に、適切な対象が継続治療期間に入って、追加のサイクル（２〜６）を受ける。この継続治療期間中、対象は、身体検査（体重、バイタルサイン及び酸素飽和度）、薬物動態及び薬力学、サイトカイン収集だけでなく、安全実験室試験及び免疫安全アッセイを含む臨床評価並びに実験室評価を受け、ＥＣＧが記録される。全対象は、画像診断評価及び臨床評価に基づいて、サイクル１後に１週間及び５週間の反応評価を受ける。試験を継続する資格が得られたら、次のサイクルの開始直前に、追加の反応評価が行われる。最後の継続治療サイクル後に、対象は、安全性、有効性及び生存について観察される。

【0194】

拡大部分：最大２０人の転移性皮膚黒色腫対象を登録し、推奨されるフェーズ２用量（ＲＰ２Ｄ）で治療される。これには、３期：スクリーニング、投薬及び経過観察が含まれる。投薬期間は、それぞれ２週間ごとに投与される４回の治療の６サイクルからなる。経過観察期間には、全生存期間を評価することが含まれる。

【0195】

登録された対象は、各サイクルで、２週間ごとに推奨されるフェーズ２用量を受け取る。４回の治療が施され、該対象は６サイクルまで治療を続ける。上記で詳述したように、投薬期間中、対象は、臨床評価及び実験室評価を受ける。

【0196】

対象は、最初の試験薬投与前の少なくとも４週間の、以前の全ての化学療法剤及び免疫調節物質（例えば、限定されないが、：抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−１抗体、ＩＬ−２）を除く実験用薬剤からの「ウォッシュアウト」期間を有する必要があり、最初の試験薬投与前の少なくとも６週間の「ウォッシュアウト」期間を有する必要があり、かつ全ての有害事象は、ベースラインに戻るか又はグレード１以下で安定していた。

【0197】

Ｂ−Ｒａｆ Ｖ６００Ｅ又はＶ６００Ｋ変異陽性黒色腫を有する黒色腫対象は、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤療法及び／又はＭＥＫ阻害剤療法において進展していなければならないか、又はそれらに不耐性であった。

【0198】

用量漸増部分
サイクル１は、６週間の反復投薬期間（４用量、それぞれ２週間間隔をあける）及び６週間の観察期間からなる。

【0199】

用量コホート内の任意の対象の最初の治療とその用量コホート内のその後の対象のための最初の治療との間に、最低限１週間は経過しなければならない。

【0200】

対象は、１２週間の初期試験期間中に入念に観察される。全対象は、臨床的有益性の証拠及び確認についてサイクル１の終了後１週間及び５週間の反応評価を受け、１２週までに安定疾患（ＳＤ）、部分奏効（ＰＲ）又は完全奏効（ＣＲ）として定義される。インフォームドコンセントフォーム（ＩＣＦ）で再び同意が得られた後、７週目又は１１週目のいずれかの画像診断において進行性疾患（ＰＲＤ）の証拠を有していた対象は、臨床悪化セクションの停止規則に基づき臨床的に保証されると研究者が考える場合には、試験参加を継続し、ＣＭ−２４治療を継続することができ、さらに１５週目に評価された。１５週目の経過観察の画像診断がＰＲＤを認める場合には、その対象は、確認された疾患進行により治療は継続されない。

【0201】

遅延ＤＬＴを含むＤＬＴを有する全対象は、ＣＭ−２４でのさらなる投薬は中止されるが、試験は中止されない。

【0202】

初期試験期間（サイクル１）に最初の３回の試験薬投与が完了する前に試験を中止されている対象は、置き換えられる。同意の撤回以外の他の任意の理由で中止されている対象は、６ヶ月の期間、４回を超える経過観察訪問で観察される。

【0203】

サイクル２〜６は、継続治療期間と呼ばれる。初期試験期間後に、変更されたＲＥＣＩＳＴ １．１基準に従ってＳＤ、ＰＲ又はＣＲとして定義された臨床的利点の証拠を有し、かつ１２週までに用量制限毒性（ＤＬＴ）の証拠がない対象は、５回の追加の治療サイクルの間に、初期試験期間中に受け取ったのと同一の用量レベルでのＣＭ−２４治療を継続することができる。確認されているが、悪化していないＰＲＤ、かつそうでなければ安定又は改善された臨床状態を有する対象は、さらなる進行又は臨床症状の悪化があるまで、試験薬での治療を継続すべきである。

【0204】

継続治療期間の各完全治療サイクルは、１日目、１５日目、２９日目、及び４３日目に、２週間間隔をあけて投与される試験薬の４用量を含む。反応評価は、各治療サイクルの５２日目と５６日目の間に行われる。次のサイクルの最初の用量が投与される前に、反応評価を完了しなければならない。

【0205】

継続治療期間中は、確認されているが、悪化していないＰＲＤを有する対象、かつそうでなければ臨床状態が安定しているか又は改善している対象は、さらなる進行又は臨床症状の悪化があるまで、試験薬での治療を継続すべきである。

【0206】

継続治療期間中のＣＭ−２４の最後の投与後、各対象は、６ヶ月の期間、４回を超える経過観察訪問で観察される。

【0207】

遅延ＤＬＴを含むＤＬＴを有する全対象は、ＣＭ−２４のさらなる投薬を中止したが、試験は中止されてはいない。

【0208】

全対象は、生存について無期限に観察される。

【0209】

コホートの拡大
最初の２用量レベル（０．０１ｍｇ／ｋｇ及び０．０３ｍｇ／ｋｇ）については、各コホートに１人の患者が加速設計に登録され、その中で、単一のグレード２薬物関連毒性は、その用量及びそれ以後の全ての用量で３＋３設計に拡大される。より低い２つのコホート（０．０１ｍｇ／ｋｇ及び０．０３ｍｇ／ｋｇ）の対象については、グレード２以上の毒性が発生しない場合に、患者の最初の単一低用量コホート（０．０１ｍｇ／ｋｇ）から次のコホート（０．０３ｍｇ／ｋｇ）、及び第２の単一用量コホート（０．０３ｍｇ／ｋｇ）から次のコホート（０．１ｍｇ／ｋｇ）の用量漸増が、６週間のＤＬＴウィンドウ後に始まる。０．１ｍｇ／ｋｇ及びそれ以上の用量レベルについては、ＤＬＴが発生しない限り、コホートあたり少なくとも３人の患者が標準的な３＋３設計に登録され、その場合、そのコホートは６人の患者に拡大される。次のコホートへの漸増は、各コホートの第１の対象の最初の試験薬投与から始まって、８週間のＤＬＴウィンドウ後にのみ始まる。

【0210】

６人の対象のコホートにおける追加の対象がＤＬＴを有していない場合、安全委員会による全対象の安全性データの審査後に、用量漸増を進めることができる。

【0211】

３人又は６人の対象用量コホートにおいて２人以上の対象がＤＬＴを発症する場合には、用量漸増は停止され、かつ：
前の用量レベルのコホートがすでに６人の対象に拡大されていなかった場合には、６人の対象に拡大し、
前の用量レベルのコホートがすでに６人の対象に拡大されていた場合には、安全委員会は、これまでの全安全性データの審査後に、
（前の）用量レベルを推奨されるフェーズ２用量（ＲＰ２Ｄ）とみなすか、又は
中間用量で新しいコホートの評価を推奨することができる。

【0212】

推奨されるフェーズ２用量（ＲＰ２Ｄ）は、６人の対象のうち１人以下がＤＬＴを経験する最高用量レベルとして定義される。

【0213】

用量漸増
いずれのＤＬＴも、より低い２つのコホートについては６週間のＤＬＴウィンドウに、かつ残りのコホートについては８週間のＤＬＴウィンドウに遭遇していない場合は、次のコホートが開始され、同じパターンが繰り返される。各コホートの用量レベル内の対象の登録の間に１週間の待機期間がある。用量漸増前に、現在のコホートを含む、これまでの試験で治療された全対象の利用可能な安全性データは、安全委員会によって評価される。

【0214】

前の用量コホートの全対象についての反復投薬（サイクル１）が完了した後にのみ、次の用量コホートの投薬（サイクル１）が開始される。安全委員会の審査のタイミングは、他の免疫調節物質で治療された患者においてｉｒＡＥが、投与後の５〜１０週間以内に起こることを示唆するデータに基づく。ＤＬＴが生じ、治療用量コホートの６人の対象への拡大が必要となった場合に、ＤＬＴウィンドウは全６人の対象の完全反復投薬（サイクル１）を包含するように拡大される。

【0215】

用量漸増後に、２以上の遅延ＤＬＴがより低い用量で生じ、かつＡＥがＣＭ−２４に関連する可能性のある遅延ＤＬＴであり得る場合に、自然増加は一時的に中断され、安全委員会は２４時間以内に通知される。安全委員会は、速やかにＰＫデータを含む事象及び関連情報を評価し、用量及び／又は用量漸増方式で任意の必要な調整を行う。２以上の遅延ＤＬＴが以前に試験した６人の対象の拡大コホート内で生じた場合に、同じ手順が行われる。

【0216】

遅延ＤＬＴは、ガイドラインに従って安全委員会によって審査され、ケースバイケースで決定が行われる。このような行動には、検査されている用量関連事象が用量漸増を停止するのに十分深刻でなく、現在の投薬が対象へのリスクになるとみなされない場合に、標準的なＤＬＴ漸増ルールを適用すること、より低い用量もしくは中間用量に戻すこと、又は何の行動も取らないことが含まれ得る。

【0217】

拡大部分
この試験の拡大部分には、進行性皮膚黒色腫を有する最大２０人の対象の登録が可能である。初期の有効性シグナルがこれを保証するものであれば、治験の用量漸増部分中に前もって調べられた適応症において、最大２０人の対象の他の拡大アームが展開され、プロトコルは改正されてよい。登録された対象は、最大６サイクルの間にＲＰ２Ｄで治療され、１日目、１５日目、２９日目及び４３日目に治療が施される。反応評価は５２日目〜５６日目の間に行われる。この反応評価は、次のサイクルの最初の用量投与前に完了しなければならない。

【0218】

ＤＬＴ率が３３％以上の場合に、登録は拡大部分で保持されてもよい。試験薬に忍容性を示す対象は、安全委員会が審査するまで継続投与から自動的に除外されず、安全審査の結果として特に指示がない限り、忍容される限り、投薬を継続することが可能である。安全解析後、登録を再開し、現在の用量で投薬を継続するか、又はより低い用量で、さらなる対象の登録を継続するか否かの判定が行われる。ＤＬＴの場合は、登録は安全委員会の審査に従って行われるか、かつ／又は再開される。

【0219】

治療決定ガイドライン
腫瘍反応は、固形腫瘍における反応評価基準（ＲＥＣＩＳＴ １．１）を用いて評価される。全対象のサイクル腫瘍反応評価の終了は、各治療サイクルの５２〜５６日以内に生じる（評価の結果は次のサイクルの最初の投薬前に審査され、文書化されなければならない）。対象が、さらなる治療を妨げるグレード３以上の（ＣＴＣＡＥ）有害事象又はＣＭ−２４に関連する他の有害事象を発症しない限り、各（継続又は拡大）治療サイクル後に、ＣＭ−２４の追加サイクルで対象を治療する決定は腫瘍評価に基づく。以下に記載するように、完全奏効（ＣＲ）又は確認された後にさらに進行する進行性疾患（ＰＲＤ）が確認されるまで、対象は治療される。確認されたが、悪化していないＰＲＤを有する対象、及びそうでなければ、臨床状態が安定しているか又は改善された（すなわち、ＥＣＯＧ全身状態において低減がない）対象は、以下にさらに詳しく述べるとおり、さらなる進行又は臨床症状の悪化があるまで、試験薬での治療を継続すべきである。

【0220】

ＣＲ、ＰＲ又はＳＤの最良総合効果（ＢＯＲ）を有する対象は、以下のいずれかが最初に生じるまでＣＭ−２４治療を受け続ける：
確認されたＣＲの達成；
治療からのさらなる利点が得られそうにないことを示唆する臨床症状の悪化；
試験治療の中止（ＤＬＴ）もしくは治療に対する他の不耐性の基準を満たすこと；又は
最大数のサイクルを受けること。

【0221】

経過観察期間
対象は、最後の治療注入から始まる少なくとも６ヶ月の期間観察される。第１の経過観察訪問は、最後のイメージングスキャンの７日以内に行われる。第２〜第４の経過観察訪問は、５６日の間隔で行われる。加えて、生存状況は、治療の完了又は中止後、かつ試験の経過観察中に電話コール又は対面接触のいずれかによって、約３ヶ月ごとに、無期限に評価される。死亡の日付は、亡くなった全対象について報告される。全生存期間の評価は、スポンサーによる試験の完了又は終了まで行われる。生存以外の他のデータ（例えば、その後の治療、全身状態など）は、これらのコール又は訪問時に収集されない。

【0222】

対象が試験薬治療を中止すると、試験薬中止の日付及び理由は、原文書に文書化されるべきであり、対象は経過観察期間に入るべきである。対象が試験を中止されると（治療又は経過観察期間中に）、その試験訪問に関連する全評価が行われ、試験中止の日付及び理由が原文書に文書化されることを確実にするために、全努力がなされるべきである。

【0223】

治療及び経過観察期間の完了後、全ての生存対象は３ヶ月ごとに生存状況について無期限に観察される。

【0224】

試験薬の物理的特性
ＣＭ−２４は、使い捨ての１０ｍＬバイアル中に供給される。各バイアルは、１００ｍｇと同等のＣＭ−２４の濃縮液（１０ｍｇ／ｍＬ）を含有する。

【0225】

ＣＭ−２４は、プロトコル指定の用量で、０．２ミクロンのインラインフィルターを用いて静脈内注入として投与される。

【0226】

異なる用量の調製のための指示：
０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ及び１．０ｍｇ／ｋｇの用量を受け取る対象については、５０ｍＬの０．９％塩化ナトリウムＩＶバッグが調製のために使用される。注入は、１．０ｍＬ／分の速度で進めるべきである。用量調製中のラウンディングは、どうしても必要なときだけに行われるべきであり、０．２５ｍｇ／ｍＬの最小濃度を維持することが可能となる方法でのみ行われるべきである。

【0227】

３ｍｇ／ｋｇの用量を受け取る対象については、１００ｍＬの０．９％塩化ナトリウムＩＶバッグが調製のために使用される。注入は２．０ｍＬ／分の速度で進めるべきである。用量調製中のラウンディングは、どうしても必要なときだけに行われるべきである。

【0228】

１０ｍｇ／ｋｇの用量を受け取る対象については、２５０ｍＬの０．９％塩化ナトリウムＩＶバッグが調製のために使用される。注入は３．０ｍＬ／分の速度で進めるべきである。用量調製中のラウンディングは、どうしても必要なときだけに行われるべきである。

【0229】

薬力学的（ＰＤ）マーカー
血液試料は、以下の時点：第１の試験薬投与の投薬前、サイクル１の試験薬投与の第１及び第４の投薬後４８時間、各完全サイクル（用量漸増のサイクル２〜６、及び拡大コホートの全サイクル）の第４（最後）の投薬の投薬前、第２〜第４の経過観察訪問時に採取され、免疫アッセイ及び他の評価について試験され、それには以下のものが含まれる：
・蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による活性化マーカー（ＣＤ６９、ＣＤ１０７ａ及びＨＬＡ−ＤＲ）と組み合わせたリンパ球サブタイプ（ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ５６）、調節性Ｔ細胞
・リンパ球サブタイプ中のＣＥＡＣＡＭ１発現
・血清中の可溶性ＣＥＡＣＡＭ１及びグランザイムＢ
・ＣＭ−２４によるＣＥＡＣＡＭ１受容体占有率
・骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）（ＣＤ１４＋、ＨＬＡＤＲ低、ＣＤ１１ｂ＋）
・免疫チェックポイントタンパク質、例えば、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ、Ｖｉｓｔａ

【0230】

薬物動態（ＰＫ）
薬物動態は、最初の注入（サイクル１の最初の投薬）中及び第４の注入（サイクル１の最後の投薬）中の用量漸増部分中に最初に試験される。投薬前レベルも、第１のサイクル中の各治療前に測定される。追加の用量拡大対象（最大６人）は、ＣＭ−２４のより強固なＰＫ特性評価が正当と認められる場合に、予備ＲＰ２ＤでＰＫ評価について試験され得る。

【0231】

血漿中のＣＭ−２４のＰＫプロファイルは、最初の投薬については投薬後１５日目までに、かつ第４の投薬については注入後３６日目に評価される。以下のＰＫパラメータ：Ｃ_ｍａｘ、ｔ_１／２、Ｔ_ｍａｘ、ＡＵＣ_０−ｔ、及びＡＵＣ_０−∞は、時間プロフィールに対する血漿濃度から導出される。

【0232】

試料は、第１及び第４の注入時、以下の時点：注入前（ベースライン）；注入の終了時及び注入後１時間、４時間、８時間、２４時間に採取される。第１及び第４の投薬のみについては、３日目、５日目、８日目、１５日目（又は次の治療の投薬前）、並びに第４の投薬については、さらに注入後２２日目及び３６日目。投薬前レベルは、第１サイクル中の各治療前に測定される。試料収集及び試料出荷のさらなる詳細については、イベントのスケジュール及び実験マニュアルを参照されたい。

【0233】

新鮮な腫瘍生検
腫瘍試料は、以下のこと：ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＦＯＸｐ３、ＣＥＡＣＡＭ１、グランザイムＢ、ＣＭ−２４、ＣＭ−２４によるＣＥＡＣＡＭ１受容体占有率について評価される。

【0234】

用量漸増部分：対象は、ベースライン及び第１のサイクルの第２の治療後１週間の時点で、任意の新鮮な生検組織（又は過去６ヶ月以内に採取された場合は記録される）試料を提供することを求められる。

【0235】

拡大部分：２つの新鮮な腫瘍試料が、スクリーニング時及び第１のサイクルの第２の投薬後１週間の時点で採取される。加えて、対象は、第１のサイクルの第４の治療後１週間の時点で追加の生検を提供するように促されるが、提供する必要はない。

【0236】

有効性エンドポイント
以下のエンドポイントは、予備的有効性を評価するために使用され、変更されたＲＥＣＩＳＴ １．１基準から導出される：
・客観的奏効率（ＯＲＲ）
・奏効期間（ＤＯＲ）
・腫瘍反応状態
・病勢制御率（ＤＣＲ）
・持続性反応（Ｄｕｒａｂｌｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ （ＤＲ））
・最良総合効果（ＢＯＲ）−完全奏効（ＣＲ）、部分奏効（ＰＲ）、安定疾患（ＳＤ）及び進行性疾患（ＰＲＤ）
・無増悪生存期間（ＰＦＳ）
・反応までの時間（ＴＴＲ）
・全生存期間（ＯＳ）
・ＣＴ又はＭＲＩによって評価される腫瘍量変化率（ＰＣＴＢ）。

【0237】

上に列挙した有効性エンドポイントは、以下の点で評価される：
用量漸増コホート：
・７週目、第１のサイクルの第４の投薬後１週間投与された。
・１１週目、第１のサイクルの第４の投薬後５週間投与された。
・追加の５サイクル後１８〜１９週、２６〜２７週、３４〜３５週、４２〜４３週、４８〜４９週及び５０〜５１週目、プラスの第２〜第４の経過観察訪問。
用量拡大コホート：
・７〜８週、１４〜１５週、２２〜２３週、３０〜３１週、３８〜３９週、４６〜４７週目、プラスの第２〜第４の経過観察訪問。

【0238】

免疫関連有効性エンドポイント
追加の予備的有効性評価は、ＲＥＣＩＳＴ １．１（ｉｒＲＥＣＩＳＴとも呼ばれる）への変更に基づく免疫関連反応基準（ｉｒＲＣ）の適用を含み、以下のエンドポイントを含み得る：
・反応カテゴリｉｒＣＲ、ｉｒＰＲ、ｉｒＳＤ、ｉｒＰＤでの免疫関連最良総合効果（ｉｒＢＯＲ）；
・全試験期間中の客観的免疫関連奏効率（ｉｒＯＲＲ）；
・ｉｒ−反応を有するそれらの対象のｉｒ奏効期間（ＤＯｉｒＲ）；
・任意の数のサイクル中のｉｒＢＯＲ結果に基づくｉｒＯＲＲも導出され得る。

【0239】

薬物動態（ＰＫ）エンドポイント
薬物動態は、以下のＰＫ時点の間の用量漸増部分中で試験される：試料は、第１、並びに第４の注入時、以下の時点：注入前（ベースライン）；注入の終了時及び注入後１、４、８、２４時間に採取される。第１及び第４の投薬については、３日目、５日目、８日目、１５日目（次の治療の投薬前）、並びに第４の投薬については、さらに注入後２２日目及び３６日目。投薬前レベルは、第１のサイクル中の各治療前に測定される。

【0240】

追加の用量拡大対象（最大６人）は、ＣＭ−２４のより強固なＰＫ特性評価が正当と認められる場合に、予備ＲＰ２ＤでＰＫ評価について試験され得る。

【0241】

実施例７．製剤
本発明のヒト化ｍＡｂの典型的な製剤は、以下のものを含む：

【表9】

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A-1】

【図3A-2】

【図3B-1】

【図3B-2】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]