特許 6805637 ヘマトクリット値の測定方法、ヘマトクリット値の測定装置、被測定物質の量の測定方法、および被測定物質の量の測定装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6805637

(24)【登録日】2020年12月8日

(45)【発行日】2020年12月23日

(54)【発明の名称】ヘマトクリット値の測定方法、ヘマトクリット値の測定装置、被測定物質の量の測定方法、および被測定物質の量の測定装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/49 20060101AFI20201214BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20201214BHJP

   G01N 33/553 20060101ALI20201214BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20201214BHJP

   G01N 11/08 20060101ALI20201214BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20201214BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/49 B

   G01N37/00 101

   G01N33/553

   G01N33/543 595

   G01N33/543 575

   G01N33/543 501L

   G01N11/08

   G01N21/64 G

   G01N21/64 F

【請求項の数】14

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2016-165649(P2016-165649)

(22)【出願日】2016年8月26日

(65)【公開番号】特開2018-31730(P2018-31730A)

(43)【公開日】2018年3月1日

【審査請求日】2019年3月27日

(73)【特許権者】

【識別番号】000001270

【氏名又は名称】コニカミノルタ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002952

【氏名又は名称】特許業務法人鷲田国際特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100155620

【弁理士】

【氏名又は名称】木曽 孝

(72)【発明者】

【氏名】青木 洋一

【審査官】 草川 貴史

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０００−１８０４４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１６／０３９１４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／０１１０４０５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１７／００６９６９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００５−５１８８７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０７４２６５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００６−３１７４３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５２９７５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−０３８０００（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

チップホルダーに保持された、流路を有する測定チップと、
ピペットチップと、前記ピペットチップ内の圧力を検出するための圧力センサーとを有し、前記圧力センサーにより前記ピペットチップ内の圧力を検出しつつ、前記ピペットチップから前記流路内に検体を注入するか、または前記流路から前記ピペットチップ内に検体を吸引するための液体取扱部と、
を用いて、血液を含む検体のヘマトクリット値を測定するための、ヘマトクリット値の測定方法であって、
前記液体取扱部において、前記検体が前記測定チップの前記流路の内壁面から受ける抵抗に応じて変化する前記ピペットチップ内の圧力を検出しつつ、前記ピペットチップから前記流路内に前記検体を注入するか、または前記流路から前記ピペットチップ内に前記検体を吸引したときの、前記検体が前記測定チップの前記流路の内壁面から受ける抵抗に応じて変化する前記ピペットチップ内の圧力の時間変化に関する情報を取得する工程と、
前記情報に基づいて、予め取得しておいた、ピペットチップ内の圧力の時間変化に関する情報とヘマトクリット値との関係から前記検体のヘマトクリット値を決定する工程と、
を含む、ヘマトクリット値の測定方法。

【請求項2】

前記流路は、天面と、底面と、前記天面および前記底面を接続する一対の側面と、を有し、
前記一対の側面の間の長さは、０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下であり、
前記天面および前記底面の間の長さは、０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下であり、
前記検体の流れ方向における前記流路の長さは、１０ｍｍ以上５０ｍｍ以下である、
請求項１に記載のヘマトクリット値の測定方法。

【請求項3】

前記流路内に前記検体を注入するか、または前記流路から前記検体を吸引するときの前記検体の流量は、１０μＬ／分以上１５０００μＬ／分以下である、請求項１または請求項２に記載のヘマトクリット値の測定方法。

【請求項4】

前記流路内に前記検体を注入するか、または前記流路から前記検体を吸引するときの前記検体の液量は、５０μＬ以上５００μＬ以下である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヘマトクリット値の測定方法。

【請求項5】

血液を含む検体中の被測定物質の量を測定するための、前記被測定物質の量の測定方法であって、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のヘマトクリット値の測定方法により、前記検体のヘマトクリット値を測定する工程と、
前記流路内に、前記検体中に含まれていた前記被測定物質が固定化され、かつ前記検体が存在しない状態で、前記検体中の前記被測定物質の量を示す測定値を取得する工程と、
前記ヘマトクリット値に基づいて前記測定値を補正する工程と、
を含む、被測定物質の量の測定方法。

【請求項6】

前記測定チップは、プリズムと、前記プリズム上に配置されている金属膜と、前記金属膜上に配置されている前記流路と、を有し、
前記測定値を取得する工程では、前記金属膜上に、前記検体中に含まれていた前記被測定物質が固定化され、かつ前記検体が存在しない状態で、前記プリズムを介して前記金属膜に、表面プラズモン共鳴が生じる入射角で光を照射したときに生じる、前記被測定物質の量を示すシグナルを検出して、前記測定値を取得する、
請求項５に記載の被測定物質の量の測定方法。

【請求項7】

前記シグナルは、前記被測定物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光である、請求項６に記載の被測定物質の量の測定方法。

【請求項8】

血液を含む検体のヘマトクリット値を測定するための、ヘマトクリット値の測定装置であって、
流路を有する測定チップを保持するためのチップホルダーと、
ピペットチップと、前記ピペットチップ内の圧力を検出するための圧力センサーとを有し、前記圧力センサーにより、前記検体が前記測定チップの前記流路の内壁面から受ける抵抗に応じて変化する前記ピペットチップ内の圧力を検出しつつ、前記ピペットチップから前記流路内に検体を注入するか、または前記流路から前記ピペットチップ内に検体を吸引するための液体取扱部と、
前記圧力センサーにより取得された、前記ピペットチップ内の圧力の時間変化に関する情報に基づいて、予め取得しておいた、ピペットチップ内の圧力の時間変化に関する情報とヘマトクリット値との関係から前記検体のヘマトクリット値を決定する処理部と、
を有する、ヘマトクリット値の測定装置。

【請求項9】

前記流路は、天面と、底面と、前記天面および前記底面を接続する一対の側面と、を有し、
前記一対の側面の間の長さは、０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下であり、
前記天面および前記底面の間の長さは、０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下であり、
前記検体の流れ方向における前記流路の長さは、１０ｍｍ以上５０ｍｍ以下である、
請求項８に記載のヘマトクリット値の測定装置。

【請求項10】

前記液体取扱部が前記流路内に前記検体を注入するか、または前記流路から前記検体を吸引するときの前記検体の流量は、１０μＬ／分以上１５０００μＬ／分以下である、請求項８または請求項９に記載のヘマトクリット値の測定装置。

【請求項11】

前記液体取扱部が前記流路内に前記検体を注入するか、または前記流路から前記検体を吸引するときの前記検体の液量は、５０μＬ以上５００μＬ以下である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のヘマトクリット値の測定装置。

【請求項12】

血液を含む検体中の被測定物質の量を測定するための、前記被測定物質の量の測定装置であって、
請求項８〜１１のいずれか一項に記載のヘマトクリット値の測定装置と、
前記チップホルダーに保持された前記測定チップの前記流路内に、前記検体中に含まれていた前記被測定物質が固定化され、かつ前記検体が存在しない状態で、前記検体中の前記被測定物質の量を示す測定値を取得するための測定値取得部と、
を有し、
前記処理部は、さらに、前記ヘマトクリット値に基づいて前記測定値を補正する、
被測定物質の量の測定装置。

【請求項13】

前記測定チップは、プリズムと、前記プリズム上に配置されている金属膜と、前記金属膜上に配置されている前記流路と、を有し、
前記測定値取得部は、
光を出射するための光出射部と、
前記金属膜上に、前記検体に含まれていた前記被測定物質が固定化され、かつ前記検体が存在しない状態で、前記光出射部が前記プリズムを介して前記金属膜に、表面プラズモン共鳴が生じる入射角で光を照射したときに生じる、前記被測定物質の量を示すシグナルを検出するためのシグナル検出部と、
を有し、
前記処理部は、前記シグナル検出部の検出結果に基づいて前記測定値を取得する、
請求項１２に記載の被測定物質の量の測定装置。

【請求項14】

前記シグナルは、前記被測定物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光である、請求項１３に記載の被測定物質の量の測定装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、血液を含む検体のヘマトクリット値を測定するための測定方法および測定装置、ならびに当該検体中の被測定物質の量を測定するための測定方法および測定装置に関する。

【背景技術】

【0002】

臨床検査において、タンパク質やＤＮＡなどの、検体中の微量の被測定物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。たとえば、血液中の抗原（被測定物質）を測定する場合、検体としては、患者から採取された全血、またはその全血から血球成分が分離された血漿もしくは血清が使用され得る。また、患者の状態を把握するためには、血漿または血清に対する被測定物質の量（濃度）を測定する必要がある。しかしながら、全血に対する血漿または血清の割合は患者ごとに異なるため、検体として全血を使用して被測定物質の量を示す測定値を取得した場合には、全血に対する血漿または血清の割合に応じて当該測定値を補正する必要がある。このとき、測定値の補正には、ヘマトクリット値が用いられ得る。

【0003】

最も古典的であり、かつ精度が高いヘマトクリット値の測定方法として、ミクロヘマトクリット法がある。しかし、ミクロヘマトクリット法は、使用される遠心分離装置が大型であり、かつ測定工程の自動化が困難という問題がある。そこで、ヘマトクリット値を測定するための様々な方法が開発されている（例えば、特許文献１〜３参照）。

【0004】

特許文献１には、検体のバルク電導度に基づいてヘマトクリット値を測定する方法が記載されている。また、特許文献２には、検体の吸光度に基づいてヘマトクリット値を測定する方法が記載されている。さらに、特許文献３には、検体の粘度に基づいてヘマトクリット値を測定する方法が記載されている。特許文献３に記載の方法では、電圧が印加された状態で、検体を毛管空隙に供給したときに、検体を介した電流が検出されるまでの時間に基づいて、検体のヘマトクリット値を決定することができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０１１−００２４６８号公報

【特許文献2】特開２００９−２３６４８７号公報

【特許文献3】特開２０１１−１３７８１６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

特許文献１および特許文献３に記載のヘマトクリット値の測定方法では、ヘマトクリット値を測定する際に電流値（伝導度）を測定するための測定系が必要となる。また、特許文献２に記載のヘマトクリット値の測定方法では、ヘマトクリット値を測定する際に吸光度を測定するための測定系が必要となる。また、血液を含む検体中の被測定物質の量を示す測定値をヘマトクリット値で補正する場合に、測定装置がヘマトクリット値を測定するための測定系を有していないときは、別途、測定系を追加する必要がある。しかしながら、別途、測定系を追加すると、測定装置のコストが高くなってしまい、かつ測定装置が大型化してしまうという問題がある。

【0007】

一方、液体を扱う測定装置は、通常、ピペットチップと、ピペットチップ内の圧力を検出するための圧力センサーとを有する。

【0008】

本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、ピペットチップ内の圧力を検出するための圧力センサーを利用して、血液を含む検体のヘマトクリット値を測定するための測定方法および測定装置を提供することを目的とする。また、本発明は、新たな測定系を別途追加することなく、検体のヘマトクリット値を測定し、検体中の被測定物質の量を高精度に測定できる測定方法および測定装置を提供することも目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係るヘマトクリット値の測定方法は、流路を有する測定チップを用いて、血液を含む検体のヘマトクリット値を測定するための、ヘマトクリット値の測定方法であって、ピペットチップ内の圧力を検出しつつ、前記ピペットチップから前記流路内に前記検体を注入するか、または前記流路から前記ピペットチップ内に前記検体を吸引したときの、前記ピペットチップ内の圧力の時間変化に関する情報を取得する工程と、前記情報に基づいて、前記検体のヘマトクリット値を決定する工程と、を含む。

【0010】

上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る被測定物質の量の測定方法は、血液を含む検体中の被測定物質の量を測定するための、前記被測定物質の量の測定方法であって、本発明に係るヘマトクリット値の測定方法により、前記検体のヘマトクリット値を測定する工程と、前記流路内に、前記検体中に含まれていた前記被測定物質が固定化され、かつ前記検体が存在しない状態で、前記検体中の前記被測定物質の量を示す測定値を取得する工程と、前記ヘマトクリット値に基づいて前記測定値を補正する工程と、を含む。

【0011】

上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係るヘマトクリット値の測定装置は、血液を含む検体のヘマトクリット値を測定するための、ヘマトクリット値の測定装置であって、流路を有する測定チップを保持するためのチップホルダーと、ピペットチップと、前記ピペットチップ内の圧力を検出するための圧力センサーとを有し、前記圧力センサーにより前記ピペットチップ内の圧力を検出しつつ、前記ピペットチップから前記流路内に検体を注入するか、または前記流路から前記ピペットチップ内に検体を吸引するための液体取扱部と、前記圧力センサーにより取得された、前記ピペットチップ内の圧力の時間変化に関する情報に基づいて、前記検体のヘマトクリット値を決定する処理部と、を有する。

【0012】

上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る被測定物質の量の測定装置は、血液を含む検体中の被測定物質の量を測定するための、前記被測定物質の量の測定装置であって、本発明に係るヘマトクリット値の測定装置と、前記チップホルダーに保持された前記測定チップの前記流路内に、前記検体中に含まれていた前記被測定物質が固定化され、かつ前記検体が存在しない状態で、前記検体中の前記被測定物質の量を示す測定値を取得するための測定値取得部と、を有し、前記処理部は、さらに、前記ヘマトクリット値に基づいて前記測定値を補正する。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、液体を扱う装置が有しているピペットチップと、ピペットチップ内の圧力を検出するための圧力センサーとを利用してヘマトクリット値を測定することができるため、測定装置の高コスト化および大型化を抑制することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、実施の形態に係るＳＰＦＳ装置の構成の一例を示す模式図である。

【図2】図２は、測定チップの構成の一例を示す断面図である。

【図3】図３は、実施の形態に係るＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。

【図4】図４は、図３に示される測定値の取得工程内の工程を示すフローチャートである。

【図5】図５は、図３に示されるヘマトクリット値の測定工程内の工程を示すフローチャートである。

【図6】図６Ａ、Ｂは、ヘマトクリット値を決定する方法について説明するためのグラフである。

【図7】図７は、検体を流路内に注入したときの、平衡状態に達するまでの時間からヘマトクリット値を決定するための検量線の一例を示すグラフである。

【図8】図８は、粘度法によって血漿中の被測定物質の量を決定したときの精度を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。ここでは、本発明に係る測定装置の代表例として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）を利用した測定装置（ＳＰＦＳ装置）について説明する。

【0016】

図１は、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００の構成の一例を示す模式図である。図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光出射部１１０、シグナル検出部１２０、液体取扱部１３０、搬送部１４０および制御処理部（処理部）１５０を有する。本実施の形態では、励起光出射部１１０およびシグナル検出部１２０は、ともに検体中の被測定物質の量を示す測定値を取得するための測定値取得部を構成する。

【0017】

ＳＰＦＳ装置１００は、搬送部１４０のチップホルダー１４２に測定チップ１０を装着した状態で使用される。そこで、先に測定チップ１０について説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００について説明する。なお、チップホルダー１４２、液体取扱部１３０および制御処理部１５０は、ともに検体のヘマトクリット値を測定するための、ヘマトクリット値の測定装置を構成する。

【0018】

（測定チップ）
図２は、測定チップ１０の構成の一例を示す断面図である。図２は、図１の紙面に垂直であり、かつ流路４１内の液体の流れ方向に沿う平面における断面図である。測定チップ１０は、プリズム２０、金属膜３０および流路蓋４０を有する。本実施の形態では、測定チップ１０の流路蓋４０は、後述の液体チップ５０と一体化されている。

【0019】

プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、励起光出射部１１０からの励起光αをプリズム２０の内部に入射させる。成膜面２２上には、金属膜３０が配置されている。プリズム２０の内部に入射した励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射されて反射光となる。出射面２３は、反射光をプリズム２０の外部に出射させる。

【0020】

プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。

【0021】

入射面２１は、励起光出射部１１０からの励起光αが入射面２１で反射して励起光出射部１１０に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード（以下「ＬＤ」ともいう）である場合、励起光αがＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な共鳴角または増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。

【0022】

ここで「共鳴角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、出射面２３から出射される反射光の光量が最小となるときの、入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、測定チップ１０の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）γの光量が最大となるときの、入射角を意味する。本実施の形態では、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。

【0023】

なお、測定チップ１０の設計により、共鳴角（およびその極近傍にある増強角）が概ね決まる。設計要素は、プリズム２０の屈折率や、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の厚み、金属膜３０の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜３０上に捕捉された被測定物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。

【0024】

プリズム２０は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム２０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０を構成する樹脂の例には、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、およびシクロオレフィン系ポリマーが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４〜１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。

【0025】

金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に配置されている。これにより、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を生じさせることができる。局在場光は、金属膜３０の表面から励起光αの波長程度離れた距離まで及ぶ。金属膜３０は、成膜面２２上の全面に形成されていてもよいし、成膜面２２上の一部に形成されていてもよい。本実施の形態では、金属膜３０は、成膜面２２の全面に形成されている。

【0026】

金属膜３０には、被測定物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。金属膜３０上において、捕捉体が固定化されている領域を、特に「反応場」という。本実施の形態では、捕捉体は、金属膜３０上に亘って略均一に固定化されている。したがって、反応場は、金属膜３０上に亘って形成されている。また、捕捉体は、被測定物質に特異的に結合する。このため、被測定物質は、捕捉体を介して金属膜３０上に固定化され得る。

【0027】

捕捉体の種類は、被測定物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体は、被測定物質に特異的に結合可能な抗体（１次抗体）またはその断片、被測定物質に特異的に結合可能な酵素などである。

【0028】

金属膜３０の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の材料の例には、金、銀、銅、アルミニウム、およびこれらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、ＳＰＲを効率的に発生させる観点から、２０〜６０ｎｍの範囲内が好ましい。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。

【0029】

流路蓋４０は、金属膜３０上に配置されている。金属膜３０がプリズム２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合、流路蓋４０は、成膜面２２上に配置されていてもよい。本実施の形態では、流路蓋４０は、金属膜３０の上に配置されている。金属膜３０上に流路蓋４０を配置することで液体を収容するための空洞である流路４１が形成される。本実施の形態では、流路４１は、底面と、天面と、当該底面および当該天面を接続する一対の側面とを有する。本明細書中、流路４１のプリズム２０側の面を「流路４１の底面」といい、流路４１の、流路４１の底面と対向する面を「流路４１の天面」という。詳細については後述するが、所望の流路抵抗を得る観点から、流路４１の一対の側面の間の長さは、０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下であることが好ましく、流路４１の天面と、流路４１の底面との間の長さは、０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下であることが好ましく、検体の流れ方向（流路４１の長手方向）における流路４１の長さは、１０ｍｍ以上５０ｍｍ以下であることが好ましい。

【0030】

図２に示されるように、流路蓋４０は、枠体４２、液体注入部被膜フィルム４３および液体貯蔵部被膜フィルム４４を有する。枠体４２には、２つの貫通孔が形成されている。枠体４２の裏面には、凹部（流路溝）が形成されている。金属膜３０（およびプリズム２０）上に流路蓋４０（枠体４２）が配置され、当該凹部の開口部が金属膜３０により閉塞されることで、流路４１が形成される。さらに、一方の貫通孔の開口部が液体注入部被膜フィルム４３により閉塞されることで、液体注入部４５が形成され、他方の貫通孔の開口部が液体貯蔵部被膜フィルム４４により閉塞されることで、液体貯蔵部４６が形成される。液体貯蔵部被膜フィルム４４には、通気孔４７が設けられている。

【0031】

局在場光が及ぶ領域を十分に確保する観点からは、流路４１の高さ（流路溝の深さ）は、ある程度大きいことが好ましい。流路４１内に混入する不純物の量を低減する観点からは、流路４１の高さ（流路溝の深さ）は、小さいことが好ましい。このような観点から、流路４１の高さは、０．０５〜０．１５ｍｍの範囲内であることが好ましい。流路４１の両端は、流路４１内と外部とを連通させるように、流路蓋４０に形成された液体注入部４５および液体貯留部４６とそれぞれ接続されている。

【0032】

枠体４２は、金属膜３０上から放出される光（蛍光βおよびプラズモン散乱光γ）に対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋４０の材料の例には、ガラスおよび樹脂が含まれる。当該樹脂の例には、ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）が含まれる。また、上記の光に対して透明であれば、枠体４２の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。枠体４２は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。

【0033】

液体注入部被覆フィルム４３は、ピペットチップ１３４を挿入可能であり、かつピペットチップ１３４を挿入した際には、ピペットチップ１３４の外周に隙間なく密着することが可能なフィルムである。たとえば、液体注入部被覆フィルム４３は、弾性フィルムおよび粘着フィルムの２層フィルムである。液体注入部被覆フィルム４３には、ピペットチップ１３４を挿入するための微細な貫通孔が設けられていてもよい。本実施の形態では、液体注入部被覆フィルム４３に、外径が１.２ｍｍのピペットチップ挿入用貫通孔４８が設けられている。液体注入部被膜フィルム４３がピペットチップ１３４の外周に隙間なく密着するように構成されていることにより、送液時において、液体注入部４２側の流路４１内を密封することができる。

【0034】

前述のとおり、液体貯留部被覆フィルム４４は、通気孔４７を有する。液体貯留部被覆フィルム４４の構成は、特に制限されない。たとえば、液体貯留部被覆フィルム４４は、前述の液体注入部被覆フィルム４３と同様の２層フィルムであってもよい。

【0035】

前述のとおり、本実施の形態では、測定チップ１０および液体チップ５０は、一体化されている（図１参照）。より具体的には、枠体４２および液体チップ５０が一体化されている。液体チップ５０は、液体を収容するためのウェルを有する。ウェルの開口部は、液体を収容した状態でフィルムなどにより閉塞されていてもよい。ウェルの開口部を閉塞するフィルムは、液体チップ５０の使用前にユーザーにより取り除かれてもよい。また、ピペットチップ１３４がフィルムを貫くことができる場合は、ウェルの開口部がフィルムで閉塞された状態で液体チップ５０が使用されてもよい。

【0036】

液体チップ５０に収容される液体の例には、血液を含む検体や、蛍光物質で標識された捕捉体を含む標識液、洗浄液（緩衝液）およびこれらの希釈液が含まれる。

【0037】

測定チップ１０および液体チップ５０は、通常、測定のたびに交換される。また、測定チップ１０は、好ましくは各片の長さが数ｍｍ〜数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。

【0038】

（ＳＰＦＳ装置）
次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光出射部１１０、シグナル検出部１２０、液体取扱部１３０、搬送部１４０および制御処理部（処理部）１５０を有する。

【0039】

励起光出射部１１０は、励起光αを出射する。蛍光βの検出時には、励起光出射部１１０は、金属膜３０で表面プラズモン共鳴が発生するように、金属膜３０に対するＰ波を入射面２１に向けて出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接もしくは間接に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム２０を介して金属膜３０に表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜３０の表面上に生じさせる光である。励起光出射部１１０は、光源ユニット１１１、角度調整機構１１２および光源制御部１１３を含む。

【0040】

光源ユニット１１１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の光を、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット１１１は、例えば、光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。

【0041】

光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオードや水銀灯などのレーザー光源が含まれる。光源から出射される励起光αの波長は、例えば、４００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である。光源から出射される励起光αがビームでない場合は、励起光αは、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される励起光αが単色光でない場合は、励起光αは、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される励起光αが直線偏光でない場合は、励起光αは、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。

【0042】

ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。

【0043】

コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。

【0044】

バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源から出射された励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。

【0045】

直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを直線偏光の光にする。

【0046】

半波長板は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように光の偏光方向を調整する。

【0047】

スリットおよびズーム手段は、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、光源から出射された励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。

【0048】

ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。

【0049】

温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源から出射された励起光αの波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源から出射された励起光αの波長およびエネルギーを一定に制御する。

【0050】

角度調整機構１１２は、金属膜３０（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））に対する励起光αの入射角を調整する。角度調整機構１１２は、プリズム２０を介して金属膜３０の所定の位置に向けて所定の入射角で光を照射するために、光源から出射された励起光αの光軸とチップホルダー１４２とを相対的に回転させる。たとえば、角度調整機構１１２は、金属膜３０上において励起光αの光軸と直交する軸（図１の紙面に対して垂直な軸）を中心として光源ユニット１１１を回動させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。特に、回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの光源から出射された励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。

【0051】

前述のとおり、光源から金属膜３０に対して出射された励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光γの光量が最大となる角度が増強角である。光源から出射された励起光αの入射角を増強角またはその近傍の角度に設定することで、高強度の蛍光βおよびプラズモン散乱光γを検出することが可能となる。プリズム２０の材料および形状、金属膜３０の厚み、流路４１内の液体の屈折率などにより、光源から出射された励起光αの基本的な入射条件が決まるが、流路４１内の捕捉体の種類および量、プリズム２０の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、測定ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。

【0052】

光源制御部１１３は、光源ユニット１１１に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット１１１からの励起光αの出射を制御する。光源制御部１１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

【0053】

シグナル検出部１２０は、金属膜３０上に、検体に含まれていた被測定物質が固定化され、かつ検体が存在しない状態で、励起光出射部１１０がプリズム２０を介して金属膜３０に、表面プラズモン共鳴が生じる入射角で励起光αを出射したときに、測定チップ１０で生じるシグナル（例えば、蛍光β、反射光またはプラズモン散乱光γ）を検出する。シグナル検出部１２０は、検出したシグナル量（例えば、蛍光βの光量、反射光の光量、またはプラズモン散乱光γの光量）を示す信号を制御処理部１５０に出力する。シグナル検出部１２０は、受光光学系ユニット１２１、位置切替え機構１２２およびセンサー制御部１２７を含む。

【0054】

受光光学系ユニット１２１は、測定チップ１０の金属膜３０の法線上に配置される。受光光学系ユニット１２１は、第１のレンズ１２３、光学フィルター１２４、第２のレンズ１２５および受光センサー１２６を含む。

【0055】

位置切替え機構１２２は、光学フィルター１２４の位置を、受光光学系ユニット１２１における光路上または光路外に切り替える。具体的には、第１の受光センサー１２６が蛍光βを検出するときには、光学フィルター１２４を受光光学系ユニット１２１の光路上に配置し、第１の受光センサー１２６がプラズモン散乱光γを検出するときには、光学フィルター１２４を受光光学系ユニット１２１の光路外に配置する。

【0056】

第１のレンズ１２３は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光（シグナル）を集光する。第２のレンズ１２５は、例えば、結像レンズであり、第１のレンズ１２３で集光された光を第１の受光センサー１２６の受光面に結像させる。両レンズの間において、光は、略平行の光束となっている。

【0057】

光学フィルター１２４は、第１のレンズ１２３および第２のレンズ１２５の間に配置されている。光学フィルター１２４は、蛍光検出時においては、光学フィルター１２４に入射する光のうち、蛍光成分のみを透過させ、励起光成分（プラズモン散乱光γ）を除去する。これにより、蛍光成分のみを第１の受光センサー１２６に導き、高いＳ／Ｎ比で蛍光βを検出することができる。光学フィルター１２４の種類の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１２４の例には、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルターと、所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターとが含まれる。

【0058】

受光センサー１２６は、蛍光βおよびプラズモン散乱光γを検出する。受光センサー１２６は、微量の被測定物質からの微弱な蛍光βを検出することが可能な、高い感度を有する。受光センサー１２６は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、シリコンフォトダイオード（ＳｉＰＤ）などである。

【0059】

センサー制御部１２７は、受光センサー１２６の出力値の検出や、当該出力値による受光センサー１２６の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１２６の感度の変更などを制御する。センサー制御部１２７は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

【0060】

液体取扱部１３０は、チップホルダー１４２に保持された測定チップ１０の流路４１内に、検体などの液体を供給する。また、液体取扱部１３０は、測定チップ１０の流路４１内から液体を除去する。液体取扱部１３０は、ピペット１３１およびピペット制御部１３６を含む。

【0061】

ピペット１３１は、シリンジポンプ１３２と、シリンジポンプ１３２に接続されたノズルユニット１３３と、ノズルユニット１３３の先端に装着されたピペットチップ１３４と、シリンジポンプ１３２とノズルユニット１３３との間に接続された圧力センサー１３５とを有する。

【0062】

シリンジポンプ１３２内のプランジャーの往復運動によって、ピペットチップ１３４における液体の吸引および排出が定量的に行われる。ピペットチップ１３４の開口部の開口面積は、液体の流れ方向に垂直な流路４１の断面積よりも大きい。流路４１の流路抵抗は、ピペットチップ１３４から流路４１内に注入されるときの抵抗と比較して、より大きくなる。これにより、流路４１の断面積に応じて、流路抵抗が、調整され得る。

【0063】

圧力センサー１３５は、ピペットチップ１３４内の圧力を検出する。圧力センサー１３５の種類は、圧力センサー１３５によりピペットチップ１３４内の圧力を検出することができれば特に限定されない。圧力センサー１３５の種類の例には、歪みゲージ抵抗式圧力センサー、半導体ピエゾ抵抗式圧力センサー、静電容量式圧力センサーおよびシリコンレゾナント式圧力センサーが含まれる。

【0064】

ピペット制御部１３６は、シリンジポンプ１３２の駆動装置、およびノズルユニット１３３の移動装置を含む。シリンジポンプ１３２の駆動装置は、シリンジポンプ１３２のプランジャーを往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ノズルユニット１３３の移動装置は、例えば、ノズルユニット１３３を、垂直方向に自在に動かす。ノズルユニット１３３の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。

【0065】

ピペット制御部１３６は、シリンジポンプ１３２を駆動して、液体チップ５０から各種液体をピペットチップ１３４内に吸引させる。そして、ピペット制御部１３６は、ノズルユニット１３３を移動させて、測定チップ１０の流路４１内にピペットチップ１３４を挿入させるとともに、シリンジポンプ１３２を駆動して、ピペットチップ１３４内の液体を流路４１内に注入させる。また、液体の導入後、ピペット制御部１３６は、シリンジポンプ１３２を駆動して、流路４１内の液体をピペットチップ１３４内に吸引させる。このように流路４１内の液体を順次交換することによって、反応場において捕捉体と被測定物質を反応させたり（１次反応）、被測定物質と蛍光物質で標識された捕捉体とを反応させたりする（２次反応）。ピペット制御部１３６は、圧力センサー１３５によりピペットチップ１３４内の圧力を検出しつつ、流路４１内に液体を注入するか、または流路４１から液体を吸引する。

【0066】

搬送部１４０は、測定チップ１０を設置位置、測定位置または送液位置に搬送し、固定する。ここで「設置位置」とは、測定チップ１０をＳＰＦＳ装置１００に設置するための位置である。また、「測定位置」とは、検体中の被測定物質の量を示す測定値を取得するための位置であり、励起光出射部１１０が測定チップ１０に向けて励起光αを出射したときに、測定チップ１０から放出されるシグナルをシグナル検出部１２０が検出する位置である。さらに、「送液位置」とは、液体取扱部１３０が測定チップ１０の流路４１内に液体を供給するか、または測定チップ１０の流路４１内の液体を除去する位置である。

【0067】

搬送部１４０は、搬送ステージ１４１およびチップホルダー１４２を含む。

【0068】

搬送ステージ１４１は、チップホルダー１４２を一方向およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ１４１も、励起光αや、励起光αの反射光、蛍光β、プラズモン散乱光γなどの光の光路を妨げない形状である。搬送ステージ１４１は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。

【0069】

チップホルダー１４２は、搬送ステージ１４１に固定されており、測定チップ１０を着脱可能に保持する。チップホルダー１４２の形状は、測定チップ１０を保持することができ、かつ励起光αや励起光αの反射光、蛍光β、プラズモン散乱光γなどの光の光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー１４２には、上記の光が通過するための開口が設けられている。

【0070】

制御処理部１５０は、角度調整機構１１２、光源制御部１１３、位置切替え機構１２２、センサー制御部１２７、ピペット制御部１３６および搬送ステージ１４１を制御する。制御処理部１５０は、シグナル検出部１２０（受光センサー１２６）および液体取扱部１３０（圧力センサー１３５）の検出結果を処理する処理部としても機能する。本実施の形態では、制御処理部１５０は、シグナル検出部１２０による蛍光βの検出結果に基づいて、検体中の被測定物質の量を示す測定値を決定する。また、制御処理部１５０は、液体取扱部１３０によるピペットチップ１３４内の圧力の時間変化に関する情報に基づいて、検体のヘマトクリット値を決定する。これとともに、制御処理部１５０は、ヘマトクリット値に基づいて上記測定値を補正する。これにより、制御処理部１５０は、血漿または血清中の被測定物質の量を決定する。

【0071】

また、制御処理部１５０には、上記の検出結果を処理する際に使用される所定の情報（例えば、種々の変換係数、検量線に関するデータ）などがあらかじめ記録されていてもよい。本実施の形態では、制御処理部１５０には、ピペットチップ１３４内の圧力の時間変化に関する情報に基づいてヘマトクリット値を決定するための検量線に関するデータがあらかじめ記録されている。制御処理部１５０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

【0072】

（ＳＰＦＳ装置における光路）
図１に示されるように、励起光αは、入射面２１からプリズム２０内に入射する。プリズム２０内に入射した励起光αは、金属膜３０に全反射角度（ＳＰＲが生じる角度）で入射する。このように、金属膜３０に対して励起光αをＳＰＲが生じる角度で照射することで、金属膜３０上に局在場光を発生させることができる。この局在場光により、金属膜３０上に存在する被測定物質を標識する蛍光物質が励起され、蛍光βが放出される。ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光物質から放出された蛍光βの光量（強度）を検出する。なお、特に図示していないが、金属膜３０での励起光αの反射光は、出射面２３でプリズム２０外に出射する。

【0073】

（ＳＰＦＳ装置の動作手順）
次に、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００の動作手順（本実施の形態に係る測定方法）について説明する。図３は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。本実施の形態では、検体中の被測定物質の量を示す測定値として、蛍光βの光量である蛍光値が測定される。図４は、図３に示される測定値を取得する工程（工程Ｓ１２０）内の工程を示すフローチャートである。図５は、図３に示されるヘマトクリット値を決定する工程（工程Ｓ１３０）内の工程を示すフローチャートである。

【0074】

本実施の形態に係る測定方法は、１）測定の準備をする工程（工程Ｓ１１０）と、２）測定値を取得する工程（工程Ｓ１２０）と、３）ヘマトクリット値を測定する工程（工程Ｓ１３０）と、４）測定値を補正する工程（工程Ｓ１４０）と、を含む。

【0075】

１）測定の準備
まず、測定の準備をする（工程Ｓ１１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００の設置位置に配置されたチップホルダー１４２に、測定チップ１０を設置する。測定チップ１０の金属膜３０上に保存試薬が存在する場合は、捕捉体が適切に被測定物質を捕捉できるように、金属膜３０上を洗浄して保存試薬を除去する。検体は、液体チップ５０内に収容される。

【0076】

２）測定値の取得
次いで、検体中の被測定物質の量を示す測定値を取得する（工程Ｓ１２０）。測定値を取得する工程（工程Ｓ１２０）は、入射角を増強角に設定する工程（工程Ｓ１２１）と、光学ブランク値を測定する工程（工程Ｓ１２２）と、１次反応を行う工程（工程Ｓ１２３）と、２次反応を行う工程（工程Ｓ１２４）と、蛍光値を測定する工程（工程Ｓ１２５）と、を含む。

【0077】

まず、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を増強角に設定する（工程Ｓ１２１）。具体的には、制御処理部１５０は、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を設置位置から送液位置に移動させる。制御処理部１５０は、ピペット制御部１３６を制御して、液体チップ５０内の測定用の緩衝液を流路４１内に提供する。制御処理部１５０は、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を送液位置から測定位置に移動させる。制御処理部１５０は、位置切替え機構１２２を制御して、光学フィルター１２４を受光光学系ユニット１２１の光路外に移動させる。制御処理部１５０は、光源制御部１１３、角度調整部１１２およびセンサー制御部１２７を制御して、光源ユニット１１１から励起光αを、金属膜３０の所定の位置に、金属膜３０に対する励起光αの入射角度を走査しながら照射するとともに、受光センサー１２６でプラズモン散乱光γを検出する。これにより、制御処理部１５０は、励起光αの入射角と、プラズモン散乱光γの光量との関係を含むデータを得る。得られたデータは、制御処理部１５０に記憶される。そして、制御処理部１５０は、データを解析して、プラズモン散乱光γの光量が最大となる入射角である増強角を決定する。最後に、制御処理部１５０は、角度調整部１１２を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を決定した増強角に設定する。

【0078】

なお、増強角は、プリズム２０の素材および形状、金属膜３０の厚み、流路４１内の液体の屈折率などにより決まるが、流路４１内の捕捉体の種類および量、プリズム２０の形状誤差などの各種要因によりわずかに変動する。このため、測定を行うたびに増強角を決定することが好ましい。増強角は、０．１°程度のオーダーで決定される。

【0079】

次いで、光学ブランク値を測定する（工程Ｓ１２２）。ここで、「光学ブランク値」とは、測定チップ１０の上方に放出される蛍光βと同じ波長の光の光量を意味する。

【0080】

制御処理部１５０は、位置切替え機構１２２を制御して、光学フィルター１２４を受光光学系ユニット１２１の光路上に移動させる。ついで、制御処理部１５０は、光源制御部１１３を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に向けて光源ユニット１１１から励起光αを出射させる。これと同時に、制御処理部１５０は、センサー制御部１２７を制御して、受光センサー１２６で蛍光βと同じ波長の光の光量を検出する。これにより、受光センサー１２６は、蛍光値の測定（工程Ｓ１２５）においてノイズとなる光の光量（光学ブランク値）を測定することができる。光学ブランク値は、制御処理部１５０に送信され、記録される。

【0081】

次いで、検体中の被測定物質と金属膜３０上の捕捉体とを反応させる（１次反応；工程Ｓ１２３）。具体的には、制御処理部１５０は、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を測定位置から送液位置に移動させる。この後、制御処理部１５０は、ピペット制御部１３６を制御して、流路４１内の緩衝液を排出した後に、液体チップ５０内の検体をピペットチップ１３４に採取し、採取した検体を流路４１内に注入する。これにより、検体中に被測定物質が存在する場合には、被測定物質の少なくとも一部は金属膜３０上の捕捉体により捕捉される。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄して、捕捉体に捕捉されなかった物質を除去する。

【0082】

次いで、金属膜３０上の捕捉体に捕捉された被測定物質を蛍光物質で標識する（２次反応；工程Ｓ１２４）。具体的には、制御処理部１５０は、ピペット制御部１３６を制御して、液体チップ５０内の蛍光標識液を流路４１内に注入する。これにより、被測定物質を蛍光物質で標識することができる。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された抗体（２次抗体）を含む緩衝液である。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄し、遊離の蛍光物質などを除去する。

【0083】

次いで、反応場の被測定物質を標識している蛍光物質から放出される蛍光βを検出して、蛍光値を測定する（工程Ｓ１２５）。具体的には、制御処理部１５０は、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を送液位置から測定位置に移動させる。この後、制御処理部１５０は、光源制御部１１３を制御して、検体中に含まれていた被測定物質が固定化され、かつ検体が存在しない状態で、励起光出射部１１０の光源ユニット１１１から励起光αを、プリズム２０を介して捕捉体が固定化されている領域に対応する金属膜３０の裏面に、表面プラズモン共鳴が生じる入射角で照射する。これとともに、制御処理部１５０は、センサー制御部１２７を制御して、測定チップ１０内で生じる蛍光β（シグナル）を受光センサー１２６で検出する。これにより、受光センサー１２６は、蛍光βの光量である蛍光値（測定値）を取得する。蛍光値は、制御処理部１５０に送信され、記録される。なお、本明細書中、「検体が存在しない状態」とは、流路４１内から検体を除去する操作が行われた状態をいう。すなわち、流路４１内に検体が実質的に存在していなければよく、流路４１内に除去しきれなかった検体がわずかに残存していてもよい。

【0084】

３）ヘマトクリット値の測定
次いで、ヘマトクリット値を測定する（工程Ｓ１３０）。ヘマトクリット値を決定する工程（工程Ｓ１３０）は、検体を流路内に注入したときの、ピペットチップ１３４内の圧力の時間変化を検出する工程（工程Ｓ１３１）と、ヘマトクリット値を決定する工程（工程Ｓ１３２）と、を含む。

【0085】

まず、検体を流路４１内に注入するとともにピペットチップ１３４内の圧力の時間変化を検出する（工程Ｓ１３１）。具体的には、制御処理部１５０は、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を測定位置から送液位置に移動させる。制御処理部１５０は、ピペット制御部１３６を制御して、液体チップ５０中の検体をピペットチップ１３４に採取する。本実施の形態では、制御処理部１５０は、液量１００μＬの検体をピペットチップ１３４に採取する。次いで、制御処理部１５０は、ピペット制御部１３６を制御して、ピペットチップ１３４の先端部の外周が液体注入部被膜フィルム４３に密着するように、ピペットチップ１３４を液体注入部４５に挿入する。次いで、採取した検体を、ピペットチップ１３４から流路４１内にピペットチップ１３４内の圧力を検出しつつ、流路４１内に注入する。このとき、ピペットチップ１３４および液体注入部皮膜フィルム４３が互いに密着しているため、液体注入部４５側の流路４１が密封される。これにより、検体は、流路４１内に入り込むことができる。圧力センサー１３５は、検体を流路４１内に注入したときの、ピペットチップ１３４内の圧力の時間変化に関する情報を取得する。当該情報は、制御処理部１５０に送信され、記録される。

【0086】

なお、圧力センサー１３５の測定レンジおよび分解能の観点から、液体取扱部１３０が検体を流路４１内に注入するときの検体の流量は、１０μＬ／分以上１５０００μＬ／分以下であることが好ましく、５００μＬ／分以上１００００μＬ／分以下であることがより好ましい。また、圧力センサー１３５の測定レンジおよびピペットチップ１３４の容量の観点から、液体取扱装置１３０が検体を流路４１内に注入するときの検体の液量は、５０μＬ以上５００μＬ以下であることが好ましく、１００μＬ以上２００μＬ以下であることがより好ましい。

【0087】

次いで、ヘマトクリット値を決定する（工程Ｓ１３２）。制御処理部１５０は、圧力センサー１３５により取得された、流路４１内に検体を注入したときの、ピペットチップ１３４内の圧力の時間変化に関する情報に基づいて検体のヘマトクリット値を決定する。

【0088】

図６Ａ、Ｂは、ヘマトクリット値を決定する方法について説明するためのグラフである。図６Ａ、Ｂにおいて、横軸は時間（秒）を示し、縦軸はピペットチップ１３４内の圧力（ｋＰａ）を示している。また、図６Ａ、Ｂは、大きさ２０ｍｍ×４．６ｍｍ×０．１ｍｍの流路４１内に検体（液量１００μＬ、ヘマトクリット値６８％）を注入したときの、ピペットチップ１３４内の圧力の時間変化を示すグラフである。図６Ａ、Ｂにおいて、横軸は時間であり、縦軸はピペットチップ１３４内の圧力である。図６Ａは、多い流量（１００００μＬ／分）で流路４１内に検体を注入したときのグラフであり、図６Ｂは、少ない流量（５００μＬ／分）で流路４１内に検体を注入したときのグラフである。

【0089】

ピペットチップ１３４から流路４１内に検体が注入されると、検体は流路４１の内壁面から抵抗（流路抵抗）を受ける。このため、図６Ａ、Ｂに示されるように、ピペットチップ１３４内の圧力は、高くなる。また、前述のとおり、ピペットチップ１３４の開口部の開口面積は、液体の流れ方向に垂直な流路４１の断面積よりも大きい。このため、上記流路抵抗の大きさは、検体の流れ方向に垂直な断面における流路４１の断面積の大きさに応じて決定される。すなわち、流路４１の断面積の大きさは、所望の流路４１の流路抵抗に応じて決定され得る。

【0090】

流路４１内に検体が注入されてから時間が経過するにつれて、ピペットチップ１３４内の圧力は低下し、平衡状態に達する。ピペットチップ１３４内の圧力がピークに達してから、平衡状態に達するまでの時間ｔは、検体の粘度が大きくなるほど長くなる。検体の粘度は、検体中の血球成分の割合が高くなるほど（ヘマトクリット値が大きくなるほど）高くなる。すなわち、時間ｔおよび検体のヘマトクリット値には相関がある。したがって、平衡状態に達するまでの時間ｔに基づいて、検体のヘマトクリット値を決定することができる。平衡状態に達したか否かを判断する基準は、必要に応じて適宜に決定され得る。たとえば、平衡状態に達するまでの時間ｔは、ピペットチップ１３４内の圧力がピーク値に達してから１％以下になるまでの時間であってもよいし、ピペットチップ１３４内の圧力の単位時間当たりの変化量がピーク値に対して２％以下になるまでの時間であってもよい。

【0091】

図７は、検体を流路４１内に注入したときの、平衡状態に達するまでの時間ｔからヘマトクリット値Ｈｃｔを決定するための検量線の一例を示すグラフである。図７において、横軸は平衡状態に達するまでの時間ｔ（秒）を示し、縦軸はヘマトクリット値を示している。図７に示される検量線は、大きさ２０ｍｍ×４．６ｍｍ×０．１ｍｍの流路４１内にヘマトクリット値Ｈｃｔが既知である検体（液量１００μＬ）を注入したときの、平衡状態に達するまでの時間ｔをそれぞれ測定し、時間ｔとヘマトクリット値Ｈｃｔとをプロットすることにより作成された。図７において、黒丸（●）は、多い流量（１００００μＬ／分）で流路４１内に検体を注入したときの結果を示し、白丸（○）は、少ない流量（５００μＬ／分）で流路４１内に検体を注入したときの結果を示している。図７に示されるように、ヘマトクリット値Ｈｃｔは、平衡状態に達するまでの時間ｔが長くなるほど大きくなる傾向がある。すなわち、測定された平衡状態に達するまでの時間ｔを測定することにより、測定された時間ｔとあらかじめ作成しておいた検量線とに基づいて、検体のヘマトクリット値Ｈｃｔを決定することができる。

【0092】

なお、検体の粘度は、検体における血球成分の割合以外の他の要因によっても変動し得るが、検体の希釈率を調整することで上記他の要因による影響を低減することができる。

【0093】

また、ピペットチップ１３４から流路４１内に検体を注入したとき、ピペットチップ１３４内の圧力がピークに達するまでの時間は、検体の流量が高いほど短くなることがわかる（図６Ａおよび図６Ｂを比較参照）。一方で、平衡状態に達するまでの時間ｔは、検体の流量が異なってもほとんど同じである。すなわち、検体のヘマトクリット値Ｈｃｔは、ピペットチップ１３４から流路４１内に検体を注入するときの流量によることなく、決定され得る。

【0094】

最後に、ヘマトクリット値に基づいて測定値を補正する（工程Ｓ１４０）。蛍光値は、被測定物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光成分（シグナル成分）と、蛍光物質以外の要因に起因するノイズ成分（光学ブランク値）とを含む。したがって、制御処理部１５０は、工程Ｓ１２５で得られた蛍光値から、工程Ｓ１２２で得られた光学ブランク値を引くことで、検体中の被測定物質の量を示す測定値（シグナル成分）を算出することができる。さらに、制御処理部１５０は、算出された測定値に以下の式（１）で表される変換係数ｃを掛けることで、算出された測定値を血漿中の被測定物質の量に変換する。

【数1】

［上記式（１）において、Ｈｃｔはヘマトクリット値（０〜１００％）であり、ｄｆは検体の希釈倍率である。］

【0095】

以上の手順により、血漿中の被測定物質の量（濃度）を決定することができる。

【0096】

なお、上記実施の形態では、入射角を増強角に設定する工程（工程Ｓ１２１）、光学ブランク値を測定する工程（工程Ｓ１２２）および１次反応を行う工程（工程Ｓ１２３）をこの順番に行う態様について説明した。しかし、本発明に係る測定方法および測定装置では、この順番に限定されない。たとえば、１次反応を行った後に入射角を増強角に設定してもよいし、光学ブランク値を測定した後に１次反応を行ってもよい。

【0097】

また、上記実施の形態では、１次反応（工程Ｓ１２３）の後に、２次反応（工程Ｓ１２４）を行った（２工程方式）。しかしながら、被測定物質を蛍光物質で標識するタイミングは、特に限定されない。たとえば、測定チップ１０の流路４１内に検体を導入する前に、検体に標識液を添加して被測定物質を予め蛍光物質で標識しておいてもよい。また、測定チップ１０の流路４１内に検体と標識液を同時に注入してもよい。前者の場合は、測定チップ１０の流路４１内に検体を注入することで、蛍光物質で標識されている被測定物質が捕捉体により捕捉される。後者の場合は、被測定物質が蛍光物質で標識されるとともに、被測定物質が捕捉体により捕捉される。いずれの場合も、測定チップ１０の流路４１内に検体を導入することで、１次反応および２次反応の両方を完了することができる（１工程方式）。

【0098】

（効果）
本実施の形態では、ピペットチップ１３４内の圧力を検出するための圧力センサー１３５を利用することで、ヘマトクリット値と相関がある検体の粘度に基づいて、ヘマトクリット値を測定することができる。通常、液体を取り扱う測定装置は、圧力センサーを有する。このため、本実施の形態に係る測定方法によれば、血液を含む検体中の被測定物質の量を示す測定値をヘマトクリット値で補正する場合に、測定装置がヘマトクリット値を測定するための測定系を有していないとしても、別途、測定系を追加する必要がない。このため、測定装置の高コスト化および大型化が抑制され得る。

【0099】

なお、上記実施の形態では、ピペットチップ１３４から流路４１内に検体を注入したときの、ピペットチップ１３４内の圧力の時間変化に関する情報に基づいて検体のヘマトクリット値を決定する態様について説明したが、本発明はこの態様に限定されない。たとえば、流路４１からピペットチップ１３４内に検体を吸引したときの、ピペットチップ１３４内の圧力の時間変化に関する情報に基づいて検体のヘマトクリット値を決定してもよい。

【0100】

また、上記実施の形態では、測定値の取得工程（工程Ｓ１２０）の後にヘマトクリット値の測定工程（工程Ｓ１３０）を行う態様について説明したが、本発明はこの態様に限定されない。たとえば、１次反応を行う工程（工程Ｓ１２３）において、検体を流路４１内に注入するときに、ピペットチップ１３４内の圧力の時間変化を検出してもよい。ピペットチップ１３４内の圧力の時間変化の検出と、１次反応とを同時に行うことで、測定時間を短縮化することができる。

【0101】

また、上記実施の形態では、ＳＰＦＳ法を利用し、測定値として蛍光物質からの蛍光βの蛍光値を測定する態様について説明したが、本発明はこの態様に限定されない。たとえば、ＳＰＲ法を利用し、測定値として励起光αの反射光の光量を測定してもよい。または、本発明は、ＥＬＩＳＡ法やＲＩｆＳ法、ＱＣＭ法などを利用して測定値を取得してもよい。

【実施例】

【0102】

以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例により限定されない。

【0103】

本実施例では、ミクロヘマトクリット法または粘度法（上記実施の形態に係るヘマトクリット値の測定方法）を利用して、ヘマトクリット値Ｈｃｔをそれぞれ測定し、あらかじめ取得しておいた被測定物質の量を示す測定値を当該ヘマトクリット値Ｈｃｔで補正し、それらの測定結果を比較した。

【0104】

１．測定値の取得
検体としては、ヘパリンが添加された、心筋トロポニン（ｃＴｎ）Ｉを含む２４種類の全血を使用した。高感度自動免疫測定装置（上記実施の形態に係るＳＰＦＳ装置）を用いて、検体中のｃＴｎＩの濃度を測定した。

【0105】

２．ミクロヘマトクリット法
上記検体をガラス製のキャピラリーに入れ、公知のヘマトクリット遠心分離機（センテック３２２０；株式会社久保田製作所製、「センテック」は同社の登録商標）を用いて、１２０００ｒｐｍで５分間、遠心した。ヘマトクリット遠心分離機に付属のヘマトクリット計測器を用いて、遠心後の検体のヘマトクリット値を測定した。次いで、測定したヘマトクリット値に基づいて、検体中のｃＴｎＩの濃度を、血漿中のｃＴｎＩの濃度に補正した。

【0106】

３．粘度法
高感度自動免疫測定装置を用いて、大きさが２０ｍｍ×４．６ｍｍ×０．１ｍｍの流路を有する測定チップの当該流路内に、開口径がφ１ｍｍの開口部を有するピペットチップから上記検体（流量１００００μＬ／分、液量１００μＬ）を注入した。このとき、ピペットチップ内の圧力の時間変化に基づいて、検体を流路内に注入したときの、ピペットチップ内の圧力がピークから１％以下になるときの時間を測定し、当該時間に基づいて検体のヘマトクリット値を決定した。次いで、測定したヘマトクリット値に基づいて、検体中のｃＴｎＩの濃度を、血漿中のｃＴｎＩの濃度に補正した。

【0107】

検体Ｎｏ．と、検体中のｃＴｎＩ濃度ＷＢ−ｃＴｎＩ、ミクロヘマトクリット法により得られたヘマトクリット値Ｈｃｔおよび血漿中のｃＴｎＩ濃度（補正値Ａ（基準値））と、粘度度法により得られた平衡状態に達するまでの時間ｔ、ヘマトクリット値Ｈｃｔ、血漿中のｃＴｎＩ濃度（補正値Ｂ）および基準値に対する補正値Ｂのずれ量ＢｉａｓＢと、を表１に示す。表１において、ＢｉａｓＢは、下記式（２）により算出された値である。

【数2】

【0108】

【表1】

【0109】

図８は、粘度法によって血漿中の被測定物質の量を決定したときの精度を示すグラフである。図８において、横軸は、平均ｃＴｎＩ濃度を示し、縦軸は、補正値Ａ（基準値）に対する補正値Ｂのずれ量であるＢｉａｓＢを示している。図８および表１に示されるように、ＢｉａｓＢは、本実施例で使用したいずれの検体においても５％以内であった。このように、粘度法によれば、ミクロヘマトクリット法と同等に血漿中の被測定物質の量を高精度に決定できることがわかる。ミクロヘマトクリット法と比較して、粘度法では、遠心分離装置のような装置を別途準備する必要がない。本発明によれば、ヘマトクリット値を測定するための装置を別途準備することなく、同一装置内で簡易に高精度なヘマトクリット値の測定が可能である。

【産業上の利用可能性】

【0110】

本発明によれば、ヘマトクリット値および被測定物質の量を高い信頼性で検出することができるため、例えば疾患の検査などに有用である。

【符号の説明】

【0111】

１０ 測定チップ
２０ プリズム
２１ 入射面
２２ 成膜面
２３ 出射面
３０ 金属膜
４０ 流路蓋
４１ 流路
４２ 枠体
４３ 液体注入部被膜フィルム
４４ 液体貯蔵部被膜フィルム
４５ 液体注入部
４６ 液体貯蔵部
４７ 通気孔
４８ ピペットチップ挿入用貫通孔
５０ 液体チップ
１００ ＳＰＦＳ装置
１１０ 励起光出射部
１１１ 光源ユニット
１１２ 角度調整機構
１１３ 光源制御部
１２０ シグナル検出部
１２１ 受光光学系ユニット
１２２ 位置切替え機構
１２３ 第１のレンズ
１２４ 光学フィルター
１２５ 第２のレンズ
１２６ 受光センサー
１２７ センサー制御部
１３０ 液体取扱部
１３１ ピペット
１３２ シリンジポンプ
１３３ ノズルユニット
１３４ ピペットチップ
１３５ 圧力センサー
１３６ ピペット制御部
１４０ 搬送部
１４１ 搬送ステージ
１４２ チップホルダー
１５０ 制御処理部
α 励起光
β 蛍光
γ プラズモン散乱光

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】