特許 6807535 線維芽細胞増殖剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6807535

(24)【登録日】2020年12月10日

(45)【発行日】2021年1月6日

(54)【発明の名称】線維芽細胞増殖剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/9789 20170101AFI20201221BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20201221BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20201221BHJP

   A61K 36/185 20060101ALI20201221BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20201221BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20201221BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20201221BHJP

   A61K 131/00 20060101ALN20201221BHJP

【ＦＩ】

   A61K8/9789

   A61Q19/00

   A61Q19/08

   A61K36/185

   A61P17/00

   A61P17/16

   A61P43/00 107

   A61K131:00

【請求項の数】7

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2017-20766(P2017-20766)

(22)【出願日】2017年1月20日

(65)【公開番号】特開2018-115143(P2018-115143A)

(43)【公開日】2018年7月26日

【審査請求日】2020年1月18日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 掲載年月日（ウェブサイトの掲載日） 平成２８年１１月１日 ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｓｍｅ２０１７．ｔｅｍｓ−ｓｙｓｔｅｍ．ｃｏｍ／ｅｘｈｉＳｅａｒｃｈ／ＣＴ／ｊｐ／Ｄｅｔａｉｌｓ？ｉｄ＝Ｃ％２Ｆ２Ｇ３Ｆｓ１８ＦＥ％３Ｄ＆ｔｙｐｅ＝８

(73)【特許権者】

【識別番号】500081990

【氏名又は名称】ビーエイチエヌ株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】512127073

【氏名又は名称】有限会社エール

(72)【発明者】

【氏名】田中 郁郎

(72)【発明者】

【氏名】野崎 勉

(72)【発明者】

【氏名】石原 健夫

(72)【発明者】

【氏名】倉本 哲

【審査官】 田中 雅之

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１１−５１９３５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００１−５１８９１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１４／１５７４８５（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ８／００− ８／９９

Ａ６１Ｑ １／００−９０／００

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）の完熟した種子の蛋白質分解酵素による加水分解物から得た水溶性成分を有効成分として含有してなる線維芽細胞増殖剤。

【請求項2】

蛋白質分解酵素がアルカリ性プロテアーゼ及び／又は中性プロテアーゼである請求項１に記載の線維芽細胞増殖剤。

【請求項3】

蛋白質分解酵素がアルカリ性プロテアーゼである請求項１に記載の線維芽細胞増殖剤。

【請求項4】

オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）の完熟した種子を蛋白質分解酵素で加水分解し、該加水分解物から採取した水溶性成分を含有せしめることを特徴とする線維芽細胞増殖剤の製造方法。

【請求項5】

蛋白質分解酵素がアルカリ性プロテアーゼ及び／又は中性プロテアーゼである請求項４に記載の製造方法。

【請求項6】

蛋白質分解酵素がアルカリ性プロテアーゼである請求項４に記載の製造方法。

【請求項7】

請求項１〜３のいずれか１項に記載の線維芽細胞増殖剤を皮膚に塗布又は経口で摂取することを特徴とする、皮膚のトラブル改善、老化症状回復及び／又は美肌促進のための美容方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、オクラの完熟種子を酵素処理した加工物を有効成分として含有してなる線維芽細胞増殖剤に関するものである。

【背景技術】

【0002】

皮膚は、表皮、真皮及び皮下組織から構成されている。表皮は、外界と接し、角質層、顆粒層、有棘層及び基底層からなり、基底層で産生された角化細胞（ケラチノサイト）が分裂を繰り返しながら有棘細胞、顆粒細胞を経て角質細胞となって皮膚表面を覆い、古くなった角質細胞は垢となって剥離する。角化細胞が基底層から角質層に至るまでの期間（約１４日間）及び角質細胞として皮膚表面を保護する期間（約１４日間）の合計を、皮膚の新陳代謝としてターンオーバーという。真皮組織は、細胞が少なく、主にコラーゲンやエラスチン等の蛋白質、ヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸等のムコ多糖類といった細胞外成分で占められており、マトリックス構造を形成して細胞及び皮膚組織の支持、細胞間隙における保水、皮膚の潤滑性と柔軟性の保持、紫外線、乾燥環境、機械的刺激や損傷、微生物感染等の外的因子から皮膚組織を保護する等の役割を担っている。これらの細胞外成分は線維芽細胞により産生される（非特許文献１）。

【0003】

線維芽細胞によって産生される前記細胞外マトリックス成分は、日常的に、活性酸素や微生物の影響あるいは紫外線照射を受けて変性し分解されて、肌のシワ、シミ、ソバカス、かさつき、肌荒れ等の皮膚トラブルを誘発する。又、加齢にともない生体の諸機能が低下し、組織は老化し、皮膚組織中のヒアルロン酸等の細胞外成分の含量も減少することが知られている（非特許文献２）。皮膚組織中のヒアルロン酸やコラーゲン等の含量が減少すると、乾燥肌、肌荒れ、弾力性や柔軟性の低下、張りや艶の減少、シワ・たるみ・くすみの増加等の皮膚トラブルや肌の老化症状をひき起こす。したがって、若々しく健康な肌（以下、美肌ということがある。）を保つためには前記細胞外マトリックス成分を補給することが必要であり、このためには真皮組織中の前記成分産生細胞である線維芽細胞を増強させることが望ましい。

【0004】

皮膚繊維芽細胞の増強物質を探索する試みとして、これまでにハイビスカス抽出物（特許文献１）、Ｌ−アスコルビン酸及びその誘導体（特許文献２）、アーモンド、セイヨウタンポポ、センブリ、ホップ等の抽出物（特許文献３）、コラーゲン加水分解トリペプチド（特許文献４）、ローズマリー抽出物（特許文献５）、α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール（特許文献６）、特定アミノ酸配列を有するポリペプチド（特許文献７）等が提案されている。

【0005】

これら成分や抽出物は、例えば、化粧料や外用剤に配合して皮膚に適用される可能性が開示されているが、経皮吸収の点で難点があり、皮膚洗浄時には容易に洗い流される等のために前記皮膚トラブルに対する効果が持続せず、皮膚組織の生理的機能を本質的に改善するものではなかった。又、ペプチド類を経口摂取する場合には胃腸内で変質や分解を受けるリスクがあり、実用面において有効性を発現し得るものは数少なかった。更には、併用する原料や成分によっては実用製品の色調、風味、物性等に影響を及ぼし、安定性や使用面、コスト面等の点でも必ずしも満足できるものではなかった。したがって、前述した皮膚トラブルや肌の老化症状を改善して美肌を促進し得る、実効性のある素材が求められていた。

【0006】

後述するオクラについては、次のようなことが知られている。すなわち、オクラ（学名：アオイ科トロロアオイ属に属する（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）は、「ｇａｍｂｏ（オクラ）」というスペイン語の名前で米国及び東インドにもたらされたアフリカ起源の植物である。２，０００年以上も前からその果実である莢（さや）を食用に供するために裁培されてきた歴史をもつ。

【0007】

オクラは、世界の数多くの地域、一般的には、インド、マレーシア、フィリピン、アメリカ（中西部）、地中海、アフリカ等の熱帯〜温帯地域で生育している。野菜として未熟なままで食べられる果実（莢）は、細長く、緑色で、先細り型のものである。これらは繊細な風味と粘液質の食感を有する。

【0008】

オクラを加工して得られるエキスや成分を産業的に利用する試みとして、オクラ抽出物を含むヒアルロン酸合成促進剤及び該剤を配合する化粧料や飲食品（特許文献８）、オクラ種子由来のオリゴペプチド及び特定植物抽出物を含有する老化防止用皮膚外用剤（特許文献９）、オクラ種子の抽出物の加水分解物を利用する皮膚化粧料（特許文献１０）等が提案されている。しかしながら、オクラの完熟種子を酵素処理して得られる水溶性成分が線維芽細胞を増強させることを記載したものは見当たらない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特開平９−２９５９２８号公報

【特許文献2】特表平１０−５０９７３５号公報

【特許文献3】特開平１０−３６２７９号公報

【特許文献4】特開２００２−２５５８４７号公報

【特許文献5】特開２００４−１３７２１７号公報

【特許文献6】特開２００４−３３１５７８号公報

【特許文献7】特開２００６−２６５２２１号公報

【特許文献8】特開２００４−５１５３３号公報

【特許文献9】特開２００８−７４７５７号公報

【特許文献10】特開２００７−１９７３２５号公報

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】服部道広、「スキンケアの科学」、第６頁〜第１４頁及び第１５頁〜第８３頁、（株）裳華房、１９９７年２月２５日発行

【非特許文献2】Ｍａｒｉａ Ｏ．Ｌｏｎｇａｓ等、“Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｄｅｒｍａｔａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ａｎｄ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｗｉｔｈ ａｇｉｎｇ”（オランダ）、１９８７年、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、第１５９巻、第１２７頁〜第１３６頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

かかる現状に鑑み、本発明は、紫外線、活性酵素、加齢等を起因とする代謝機能の低下によってもたらされる皮膚組織中のヒアルロン酸やコラーゲン等の低減を回復させ、皮膚組織の本来の機能を改善し、乾燥肌、肌荒れ、弾力性や柔軟性の低下、張りや艶の減少、シワ・たるみ・くすみの増加等の皮膚トラブルを予防及び／又は改善し、更には美肌を促進するための皮膚外用剤、飲食品、医薬品等の組成物に利用することができる、安全かつ安定な線維芽細胞増殖剤及びその製造方法を提供することを課題とした。

【課題を解決するための手段】

【0012】

前記課題を解決するために、本発明者らは、皮膚の線維芽細胞を増強する素材とその加工方法について鋭意検討を重ねた結果、完熟したオクラ種子を特定の酵素で加水分解処理した加工物が有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0013】

すなわち、本発明の特徴は、オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）の完熟した種子の蛋白質分解酵素による加水分解物から得た水溶性成分を有効成分として含有してなる線維芽細胞増殖剤にある。
ここで、前記蛋白質分解酵素は、アルカリ性プロテアーゼ及び／又は中性プロテアーゼであることが望ましく、更には、アルカリ性プロテアーゼであることがより望ましい。

【0014】

本発明の他の特徴は、オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）の完熟した種子を蛋白質分解酵素で加水分解し、該加水分解物から採取した水溶性成分を含有せしめる線維芽細胞増殖剤の製造方法にある。
なお、前記蛋白質分解酵素は、アルカリ性プロテアーゼ及び／又は中性プロテアーゼであることが望ましく、アルカリ性プロテアーゼであることがさらに望ましい。

【0015】

本発明のさらに他の特徴は、前記の線維芽細胞増殖剤を皮膚に塗布又は経口で摂取する、皮膚のトラブル改善、老化症状回復及び／又は美肌促進のための美容方法にある。

【発明の効果】

【0016】

本発明に係るオクラの完熟種子の酵素分解物から採取した水溶性成分は、品質安定性に優れ、皮膚の線維芽細胞に対して毒性が認められず安全性が高く、線維芽細胞の増殖を促進する効果を奏する。このため、皮膚組織の線維芽細胞によるコラーゲン及び／又はヒアルロン酸の産生を増強し、皮膚のターンオーバーを促して皮膚のシワ、シミ、くすみ、ソバカス及びたるみ等の皮膚トラブルを改善し、更には美肌を促進することが可能となる。又、損傷を受けた皮膚の再生を促進して肌の健康維持に寄与することが期待できる。
かかる効果は、本発明の線維芽細胞増殖剤を皮膚に塗布又は接触させること、或は、経口的に摂取又は投与することによって顕著に発現される。
したがって、本発明の線維芽細胞増殖剤はとりわけ皮膚外用剤、飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等の分野において、前記剤の態様のままで又は前記分野の従来の各種製品に配合した形態で、皮膚改善のために有効利用することが可能となる。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下に本発明を詳細に説明する。まず、本発明の線維芽細胞増殖剤は、生体組織とりわけ皮膚の真皮組織中に存在する線維芽細胞の増殖を促進させる作用を有するものであり、前記オクラの完熟した種子の酵素分解物から得られる水溶性成分を有効成分として含有してなることを特徴とする。

【0018】

オクラは、一般に、形状による分類では、アーリーファイブ、ベターファイブ、グリーンソード等と称せられる５角莢種、クリムソン、スパインレス等と呼ばれている８角莢種、エメラルド等として知られている丸オクラがあり、これらの他に、平城グリーン、ダビデの星、ピークファイブ、島オクラ、八丈オクラ、まるみちゃん、レディーフィンガー等の名称で流通しているものが知られている。色の分類では、緑色が最も多いが、紅色のベニー、白色の白オクラ等を例示することができる。本発明に係るオクラは、これらの種類に制限はなく、任意のものを使用することが可能である。

【0019】

本発明では、前記オクラの完熟した種子を原料とする。完熟した種子とは、植物体が成長した果実（莢）から収穫或いは自然発生的に飛散する種子を指し、濃緑色〜黒褐色で、大きさが直径５ｍｍ前後のもので、播種により発芽する能力を有するものである。これに対して、未熟な種子は、成長途上にある莢の中に包含されており、白色〜黄白色の約２〜４ｍｍ径のものであり、通常は、莢とともに食用に供せられる。オクラの完熟種子は、オクラを栽培するために種苗会社から市販されており、本発明ではこれを用いるのが簡便である。

【0020】

オクラの完熟種子は、粗粉砕ないしは微粉砕し、水を加えて分散液とした後、蛋白質分解酵素を添加（完熟種子に対して約０．１〜約５質量％、より好ましくは約０．５〜約２質量％）して、常温ないしは適宜に加熱（約３０〜約９０℃、より好ましくは約４０〜約６０℃）し、静置ないしは適宜に撹拌しながら、約１０分〜数日間、より好ましくは３０分〜数時間、加水分解処理を行わせる。次いで、この処理物を加熱処理して前記酵素を失活させ、遠心分離、濾過等の常法で処理して水不溶物を除去し、より望ましくは常温付近もしくはそれ以下の低温で濃縮及び乾燥処理あるいは凍結乾燥処理することにより、本発明に係る水溶性成分を製造することができる。なお、この水溶性成分を産業上利用するに当たって殺菌処理が必要な場合は、加熱にともない水不溶物を生じることがあるため、非加熱下でメンブレンフィルターによる濾過等の殺菌処理を選択することが望ましい。

【0021】

ここで、前記蛋白質分解酵素としては、基本的にはあらゆる種類やタイプのものを使用することができるが、とりわけアルカリ性プロテアーゼ及び／又は中性プロテアーゼであることが望ましく、更には、アルカリ性プロテアーゼであることがより一層望ましい。アルカリ性プロテアーゼは、概ねｐＨ８以上で活性を発現するものをいうが、ｐＨ６．５〜１２程度で作用を示すであれば使用することができる。中性プロテアーゼは、概ねｐＨ６〜８で活性を有するものをいうが、ｐＨ５〜８程度で作用を示すものであれば差し支えない。また、これらの両プロテアーゼは各々が１種のみならず２種以上を組み合わせて使用してもよい。

【0022】

アルカリ性プロテアーゼの例として「プロチンＳＤ−ＡＹ１０」、「プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ」、「プロレザー（登録商標）ＦＧ−Ｆ」（以上は天野エンザイム（株）製）、「アルカラーゼ（登録商標）２．４ＬＦＧ」（ノボザイムズ社製）、「オリエンターゼ（登録商標）２２ＢＦ」（エイチビィアイ（株）製）、「アロアーゼ（登録商標）ＸＡ−１０」（ヤクルト薬品工業（株）製）、「スミチーム（登録商標）ＭＰ」（新日本化学工業（株）製）、「ビオプラーゼＯＰ、ＳＰ−２０ＦＧ、ＡＬ−１５ＦＧ、３０Ｇ、ＡＰＬ−３０及び３０Ｌ」（ナガセケムテックス（株）製）、「ＯＰＴＩＭＡＳＥ（登録商標）ＰＲ８９Ｌ」、「ＭＡＬＴＩＦＥＣＴ（登録商標）ＰＲ６Ｌ」（以上はダニスコＵＳ社製）、「プロティナーゼＫ」、「キモトリプシン」（以上はロシュ社製）等を挙げることができる。なお、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0023】

中性プロテアーゼの例として「Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（登録商標）」、「ＰＲＯＴＡＭＥＸ（登録商標）ＭＧ」、「Ｎｅｕｔｒａｓｅ」（以上はノボザイムズ社製）、「パンチダーゼ（登録商標）Ｐ及びＭＰ」、「アロアーゼ（登録商標）ＡＰ−１０、ＮＰ−１０及びＮＳ」（以上はヤクルト薬品工業（株）製）、「ヌクレイシン（登録商標）」、「オリエンターゼ（登録商標）１０ＮＬ及び９０Ｎ」（以上はエイチビィアイ（株）製）、「プロチンＰ」（大和化成（株）製）、「プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ」、「パパインＷ４０」、「ブロメラインＦ」（以上は天野エンザイム（株）製）、「スミチーム（登録商標）ＬＰ及びＬＰＬ」（新日本化学工業（株）製）、「食品用精製パパイン」、「デナチームＡＰ」（以上はナガセケムテックス（株）製）、「トリプシン」（ロシュ社製）等を挙げることができる。本発明はこれらの例示に何ら制限されるものではない。

【0024】

前述のように処理して得られる本発明に係る水溶性成分は、オクラの完熟種子に含まれる蛋白質、多糖蛋白複合体、多糖等が加水分解を受けて生じた種々様々な成分（ペプチド類、アミノ酸類、オリゴ糖類、単糖ないしはオリゴ糖類とペプチド又はアミノ酸との結合体等）を含有する複雑な組成物である。これらの構成要素は、解析するには多大な労力と時間を必要とするため、現時点では明確ではない。

【0025】

本発明では、前記水溶性成分が、後述するように、皮膚の線維芽細胞を顕著に増殖する作用を有するため、これをそのまま、又は、適宜に公知の賦形剤（デキストリン、セルロース、微粒二酸化ケイ素、ゼラチン、低級アルコール、水等）を併用して液体状、粉末状、顆粒状、カプセル状の形態に加工処理することにより、本発明の線維芽細胞増殖剤を製造すればよい。この場合、前記水溶性成分と前記賦形剤の割合（質量比）は任意であるが、１００〜約２０：０〜約８０が望ましく、１００〜約５０：０〜約５０が更に望ましい。前記水溶性成分の割合が前記下限値を下回ると本発明の所望の効果を発現しないことがある。

【0026】

本発明の線維芽細胞増殖剤は、これを皮膚へ塗布又は外用する或いは経口で摂取又は投与して、皮膚の前記トラブルを改善し、老化症状を回復し、更には、美肌を促進するための美容方法として利用することができる。

【0027】

参考までに、この適切な態様は、本発明の線維芽細胞増殖剤を固体状、ゲル状、ペースト状又は液体状の形態となし、皮膚外用剤、飲食品、医薬品、医薬部外品等とすることが可能であり、あるいは、これらの製品を製造するために利用される公知の添加物（界面活性剤、結合剤、酸化防止剤、保湿剤、防腐剤、着色剤、香料等）や本発明の趣旨に反しない素材（線維芽細胞増殖促進作用、コラーゲン及び／又はヒアルロン酸産生促進作用、皮膚老化防止作用、美肌促進作用等が公知の素材）を適宜に併用して常法により前記各種製品とすることが可能である。

【実施例】

【0028】

次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。なお、以下において、特記しない限り部や％は質量基準である。

【0029】

製造例１
鹿児島県指宿産オクラの完熟種子をミルで粗粉砕し、この１００部に蒸留水３００部を加えて撹拌しながら５８℃に加熱して分散液（ｐＨ７．５）を調製し、これに蛋白質分解酵素として「オリエンターゼ２２ＢＦ」（エイチビィアイ（株）製、商品名、アルカリ性プロテアーゼ）１部を添加して５時間ゆるやかに撹拌を続けた。この後、酵素を失活させ（８０℃で３０分間）、不溶物を遠心分離で除去し、凍結乾燥して水溶性成分（試料１）を得た。

【0030】

比較製造例１
製造例１において、完熟種子を未熟種子に代えたことを除き同様に処理して水溶性成分（比較試料１）を得た。

【0031】

比較製造例２
製造例１において、酵素を失活させた後、更に、９０℃で１時間加熱処理を行ったことを除いて同様に処理して水溶性成分（比較試料２）を得た。

【0032】

製造例２
製造例１において、蛋白質分解酵素として「アロアーゼＸＡ−１０」（ヤクルト薬品工業（株）製、商品名、アルカリ性プロテアーゼ）を使用したこと以外は同様に処理して水溶性成分（試料２）を得た。

【0033】

製造例３
製造例１において、５５℃に加熱して分散液を調製したこと及び蛋白質分解酵素として「オリエンターゼ９０Ｎ」（エイチビィアイ（株）製、商品名、中性プロテアーゼ）を使用したこと以外は同様に処理して水溶性成分（試料３）を得た。

【0034】

製造例４
製造例１において、５５℃に加熱して分散液を調製したこと及び蛋白質分解酵素として「アロアーゼＮＰ−１０」（ヤクルト薬品工業（株）製、商品名、中性プロテアーゼ）を使用したこと以外は同様に処理して水溶性成分（試料４）を得た。

【0035】

製造例５
製造例１において、５５℃に加熱して分散液を調製したこと及び蛋白質分解酵素として「パパインＷ４０」（天野エンザイム（株）製、商品名、中性プロテアーゼ）を使用したこと以外は同様に処理して水溶性成分（試料５）を得た。

【0036】

製造例６
製造例１において、５０℃に加熱して分散液を調製したこと及び蛋白質分解酵素として「プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ」（天野エンザイム（株）製、商品名、中性プロテアーゼ）を使用したこと以外は同様に処理して水溶性成分（試料６）を得た。

【0037】

製造例７
製造例１において、４５℃に加熱して分散液を調製したこと及び蛋白質分解酵素として「パンチダーゼＰ」（ヤクルト薬品工業（株）製、商品名、中性プロテアーゼ）を使用したこと以外は同様に処理して水溶性成分（試料７）を得た。

【0038】

試験例
前記製造例で得た各試料が皮膚線維芽細胞の増殖作用に及ぼす影響を以下に述べる方法で調べた。

【0039】

試験例１：線維芽細胞増殖作用（その１）
ペトリディッシュ（φ１０ｃｍ）で、正常ヒト成人皮膚線維芽細胞（クラボウ（株）製、ＮＨＤＦ（ＮＢ）。以下、単に細胞という。）を１０％ウシ胎児血清（第一化学薬品（株）製）添加Ｄ−ＭＥＭ培地（シグマ社製、低グルコース）に２×１０^５個播き、サブコンフルエント（約８０％密度）になるまで４日間培養した。次いで、培地を除去し、細胞をＰＢＳ５ｍＬで２回洗浄し、更に０．０２％ＥＤＴＡ溶液５ｍＬで洗浄した後、０．２５％トリプシン溶液（ナカライテスク（株）製）５ｍＬを用いて細胞を回収し、遠心分離（４℃、１，０００ｒｐｍ、５分）して上清を除き、ＰＢＳで２回洗浄して細胞を得た。この細胞を前記条件下で繰り返し培養して継代培養した。

【0040】

９６穴細胞培養プレート（０．３２ｃｍ^２、旭テクノグラス（株）製）を用い、前記継代培養細胞をヒト皮膚線維芽細胞増殖用低血清培地（クラボウ（株）製、皮膚線維芽細胞基礎培地（１０６Ｓ）５００ｍＬに低血清増殖添加剤（ＬＳＧＳ）１０ｍＬを添加した培地）中に１×１０^４個／ウェル播種し、３７℃で２４時間培養した。次いで、培地を除去し、終濃度が３〜１，０００μｇ／ｍＬの設定値となるように各試験試料を加えたサンプル２００μＬを前記２％ＬＳＧＳ‐１０６Ｓ培地に添加して、５日間培養した。この後、ＭＴＴ溶液（チアゾリルブルーテトラゾリウムブロマイド（シグマ社製、試薬）を濃度５ｍｇ／ｍＬで溶解したＰＢＳ）を３０μＬ加えて３７℃で１時間培養した。培地をデカンテーションで完全に除去した後、ホルマザン溶液（２５％（ｖ／ｖ）０．４５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）、２５％（ｖ／ｖ）Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１０％（ｗ／ｖ）ｎ−ドデシル硫酸ナトリウムを含む。ｐＨ４．５）を１５０μＬ加えて撹拌した。室温で１夜放置後、５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。

【0041】

前記吸光度の値から細胞の増殖率（％）＝｛１−（試験試料を添加した場合の吸光度−ブランクの吸光度）／（試験試料を添加しない場合の吸光度−ブランクの吸光度）｝×１００を算出して細胞の増殖度合いを評価した。なお、前記方法において、Ｄ−ＭＥＭ培地及びヒト皮膚繊維芽細胞増殖用低血清培地はペニシリン（終濃度１００ＩＵ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ）を添加したものとし、細胞培養はすべてＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２強化気相下）で行った。試験試料は前記製造例で得た試料１、比較試料１及び比較試料２とした。

【0042】

この結果を表１に示す。同表において、皮膚繊維芽細胞の増殖度合は、同時に実施した対照試験（試料添加しない場合）の値を１００としたときの相対値で表した。同表のデータから、完熟種子を酵素処理した場合（試料１）は線維芽細胞の高い増殖促進活性を示したこと、しかし、同様に酵素処理後、更に加熱処理した場合（比較試料２）は増殖度合いが低下することを確認した。また、未熟種子を同様に酵素処理した場合（比較試料１）は、添加濃度が少ないときは僅かな増殖促進活性を認めたが、多くなると促進活性は認められず、線維芽細胞は死滅しており、同細胞に対する毒性が発現することが明らかになった。

【0043】

【表1】

【0044】

試験例２：線維芽細胞増殖作用（その２）
本試験例では、種々の蛋白質分解酵素で処理して得られた水溶性成分が皮膚線維芽細胞の増殖作用に及ぼす影響を調べた。ここで、線維芽細胞の増殖度合いの評価は試験例１と同じ方法で実施した。また、試験試料は前記製造例に記載の試料１、試料２〜７とし、比較試料３としてオクラ種子由来の市販品（商品名：「ＭＹＯＸＩＮＯＬ ＬＳ９７３６」、山川貿易（株）製）を用いた。

【0045】

この結果を表２に示す。同表において、皮膚繊維芽細胞の増殖度合は、同時に実施した対照試験（試料添加しない場合）の値を１００としたときの相対値で表した。同表のデータから、蛋白質分解酵素としてアルカリ性プロテアーゼを使用した場合（試料１、試料２）は、線維芽細胞の増殖促進作用が強く、中性プロテアーゼを使用した場合（試料３〜試料７）でも高い作用を示すことが明らかになった。一方、オクラ種子由来の市販品（比較試料３）そのものの線維芽細胞増殖促進作用は、試料１〜試料７と比較して小さかった。

【0046】

【表2】

【0047】

試作例１
前記水溶性成分（試料１）７０部とデキストリン３０部を常法により十分に撹拌混合し、均一な粉末状の線維芽細胞増殖剤を作成した。この剤は、経口摂取することにより、肌荒れ改善、肌のハリ、ツヤ等の向上のために使用することができる。

【0048】

試作例２
前記水溶性成分（試料４）５部を精製水２０部に溶解して液体状の線維芽細胞増殖剤を作成した。この剤とスクワラン５部、セチルアルコール２部、グリセリン５部、ソルビタンモノステアラート２部、ポリオキシレン（２０）ソルビタンモノオレアート４部及び精製水５７部を常法により均一に乳化してクリーム状組成物を作成した。この組成物は、皮膚に塗布することにより、乾燥肌の改善、肌の弾力性や柔軟性の向上等のために使用することができる。

【産業上の利用可能性】

【0049】

オクラの完熟種子から得られる水性成分は、安全性が高く、皮膚の線維芽細胞増殖促進作用を有するため、これを皮膚に塗布又は接触させることにより、皮膚の本来の生理機能を回復させ、皮膚トラブルの改善、美肌の促進、皮膚損傷の早期回復等に役立つ皮膚外用剤としての有効利用が可能となり、更には、経口的に摂取又は投与することによって、飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等の分野においても有効利用が可能となる。